CN108690138A

CN108690138A - 一种能与人cd19或cd20和人cd3结合的双特异性抗体及其应用

Info

Publication number: CN108690138A
Application number: CN201710236421.8A
Authority: CN
Inventors: 章华; 张�成; 范克索; 汪笑峰; 景书谦
Original assignee: Hongyun Huaning (hangzhou) Biological Medicine Co Ltd
Current assignee: Hongyun Huaning (hangzhou) Biological Medicine Co Ltd
Priority date: 2017-04-12
Filing date: 2017-04-12
Publication date: 2018-10-23
Also published as: WO2018188612A1

Abstract

本文公开了一种能够与人CD19或人CD20和人CD3结合的双特异性抗体。所述的双特异性抗体包含单链抗体结构域(scFv)、免疫球蛋白G结构域(IgG)和结构域间肽接头序列(Link₁)，这三者通过以下方式中的一种融合形成所述的双特异性抗体：通过Link₁将scFv的羧基端和IgG轻链的氨基端连接；通过Link₁将scFv的氨基端和IgG轻链的羧基端连接；通过Link₁将scFv的羧基端和IgG重链的氨基端连接；及Link₁将scFv的氨基端和IgG重链的羧基端连接。本文还公开了与所述双特异性抗体相关的多核苷酸、载体、宿主细胞、药用组合物，及其用途。

Description

一种能与人CD19或CD20和人CD3结合的双特异性抗体及其应用

技术领域

本文提供了一种抗体，特别是一种能够同时与人CD19或CD20和人CD3结合的双特异性抗体，还提供了它用于治疗由恶性或非正常B细胞所引起的相关疾病的方法。

背景技术

B细胞在人体的体液免疫反应和抗原递呈上发挥重要的作用。B细胞病变所带来的后果十分严重，其造成的疾病主要为两大类，第一类为恶性B细胞血液癌症，第二类则为非正常的B细胞识别自身抗原造成的自免疫类疾病(Janeway等，Immunobiology:The ImmuneSystem in Health and Disease.5th edition，New York:Garland Science(2001))。

CD19是一个95kDa大小的跨膜糖蛋白，参与B细胞自身免疫反应敏感性的调控(Tedder,Nat.Rev.Rheumatol.5:572-7(2009)；Stanciu-Herrera等,Leuk.Res.32:625-32(2008))，维持对外免疫和自身免疫反应之间的平衡。CD19表达于几乎所有类型和阶段的B细胞表面，包括大多数的恶性和非正常B细胞。针对CD19的抗体类药物(Katz等,Leuk.Lymphoma 55:999-1006(2014))包括2014年获批以B-ALL为适应症的Blinatumomab。Blinatumomab是一个T细胞双特异性抗体，由单条多肽链折叠形成，其包括由柔性肽接头序列连接的两个独立的结构域，一个是结合B细胞CD19的单链抗体可变区(scFv)结构域，而另一个是结合人T细胞表面受体CD3的scFv(Nagorsen等，Pharmacol Ther.136:334-42(20012))。

以CD20为靶点的利妥昔于1997年上市，一个传统的人鼠嵌合型抗体用于治疗非霍奇金淋巴瘤，通过ADCC和CDC作用对B细胞造成免疫伤害和凋亡(Smith，Oncogene 22,7359–7368(2003))。CD20与B细胞对非T细胞依赖的抗原的应答相关,其在B细胞表面的分布没有CD19广泛，主要为成熟B细胞类型，而pre-B细胞，非成熟B细胞和大多数的浆细胞不表达或低表达CD20，因此针对CD20的药物对这些特定类型的B细胞所引起的疾病的治疗效果不如以CD19为靶标的药物(Johnson等,Blood113:3773-3780(2009))，比如风湿性关节炎等自身免疫疾病。但在同时表达CD19和CD20的B细胞类型的表面，CD20的表达量明显大于CD19，且在各类型的慢性白血病的恶性B细胞表面，CD20的表达量高于正常的B细胞，而CD19的表达量在这些细胞上和正常B细胞相比均被下调(Ginaldi等，J.Clin.Pathol.51:364-369(1998))，因而治疗各类型的慢性白血病，CD20可能是更加好的选择。

发展至今，T细胞双特异性抗体在治疗肿瘤的原理应用上已经逐渐趋于同质化，更需要在抗体工程和分子设计上提高(Bano等，Antibodies 5:1-23(2016))，因为如Blinatumomab，虽然其分子结构带来了高活性，但也使这个分子有体内半衰期短、产率低和制备工艺复杂等缺点。本文所涉及新型双特异性抗体由一个完整的抗人CD19或人CD20的免疫球蛋白G(IgG)分子和两个相同的抗CD3的scFv形式的结构域组成，以克服Blinatumomab在稳定性和工艺方面的缺点，并同时保留足够高的靶细胞杀伤活性。就CD20和CD3的双特异性抗体而言，借助T细胞介导，以克服CD20单抗药物利妥昔的抗药性(Rezvani等，Best.Pract.Res.Clin.Haematol.24:203–216(2011))。

本文的双特异性抗体具有高效地借助T细胞介导的细胞毒性杀死恶性B细胞的活性，并且还具有结构稳定，表达量高，纯化工艺简单等优势。本文的双特异抗体可被用于治疗所有由恶性或非正常B细胞所引起的相关疾病。

发明内容

本文提供了一种新式的双特异性抗体。该抗体具有能够与人CD19或人CD20和人CD3特异性结合的能力。该双特异性抗体可介导T细胞毒性依赖的针对各类型和阶段的B细胞的免疫杀伤反应。该双特异性抗体可用于制备治疗由恶性或非正常B细胞所引起的相关疾病的药物。

在一个实施方案中，本文所提供的双特异性抗体是一种能够与人CD19或人CD20和人CD3结合的双特异性抗体，其结构特征在于：所述的双特异性抗体包含单链抗体结构域(scFv结构域)、免疫球蛋白G结构域(IgG)和结构域间肽接头序列(Link₁)，这三者通过以下方式中的一种融合形成：

a.通过结构域间肽接头序列将scFv的羧基端和IgG轻链的氨基端连接：N’-scFv-Link₁-V_L-C_L-C’；

b.通过结构域间肽接头序列将scFv的氨基端和IgG轻链的羧基端连接：N’-V_L-C_L-Link₁-scFv-C’；

c.通过结构域间肽接头序列将scFv的羧基端和IgG重链的氨基端连接：N’-scFv-Link₁-V_H-C_H1-C_H2-C_H3-C’；及

d.通过结构域间肽接头序列将scFv的氨基端和IgG重链的羧基端连接：N’-V_H-C_H1-C_H2-C_H3-Link₁-scFv-C’；

其中:N’代表多肽链的氨基端,C’代表多肽链的羧基端,scFv代表单链抗体结构域，IgG代表免疫球蛋白G结构域,V_L代表IgG结构域的轻链可变区,C_L代表IgG结构域的轻链恒定区,V_H代表IgG结构域的重链可变区,C_H1代表IgG结构域的重链恒定区1,C_H2代表IgG结构域的重链恒定区2,C_H3代表IgG结构域的重链恒定区3,及Link₁代表结构域间肽接头。

在一个实施方案中，在本文所提供的双特异性抗体中，所述的结构域间肽接头(Link₁)的序列选自以下序列之一：SEQ NO ID:1、SEQ NO ID:2、SEQ NO ID:3、SEQ NO ID:4、及SEQ NO ID:5。

在一个实施方案中，在本文所提供的双特异性抗体中，所述的scFv结构域包含轻链可变区、重链可变区和结构域内肽接头序列，这三者通过以下方式中的一种组合形成scFv结构域：

a.通过结构域内肽接头序列将轻链可变区的羧基端和重链可变区的氨基端连接：N’-V_SL-Link₂-V_SH-C’顺序排列；及

b.通过结构域内肽接头序列将重链可变区的羧基端和轻链可变区的氨基端连接：N’-V_SH-Link₂-V_SL-C’顺序排列；

其中:N’代表多肽链的氨基端,C’代表多肽链的羧基端,V_SL代表scFv结构域的轻链可变区,V_SH代表scFv结构域的重链可变区,及Link₂代表结构域内肽接头。

在一个实施方案中，在本文所提供的双特异性抗体中,所述结构域间内肽接头(Link₂)的序列选自以下序列之一：SEQ NO ID:6、SEQ NO ID:7、SEQ NO ID:8、SEQ NO ID:9、及SEQ NO ID:10。

在一个实施方案中，在本文所提供的双特异性抗体中,所述scFv结构域包含以下方案之一的氨基酸序列：

a.scFv结构域的轻链可变区序列选自以下序列之一：SEQ NO ID:11、SEQ NO ID:13、及SEQ NO ID:32；

b.scFv结构域的重链可变区序列选自以下序列之一：SEQ NO ID:12、SEQ NO ID:14、SEQ NO ID:33、及SEQ NO ID:34；及

c.(a)的轻链可变区序列和(b)的重链可变区序列的组合。

在一个实施方案中，在本文所提供的双特异性抗体中,所述抗体的scFv结构域包含以下方案之一的氨基酸序列组合方式：SEQ NO ID:11与SEQ NO ID:12的组合(L1H1)、SEQNO ID:13与SEQ NO ID:14的组合(L2L2)、SEQ NO ID:32与SEQ NO ID:33的组合(L9H9)、及SEQ NO ID:32与SEQ NO ID:34的组合(L9H10)。

在一个实施方案中，在本文所提供的双特异性抗体中,所述的抗体的IgG结构域包含以下方案之一的氨基酸序列：

a.IgG结构域的轻链可变区序列选自以下序列之一：SEQ NO ID:15、SEQ NO ID:17、SEQ NO ID:19、SEQ NO ID:21、SEQ NO ID:23、及SEQ NO ID:25；

b.IgG结构域的重链可变区序列选自以下序列之一：SEQ NO ID:16、SEQ NO ID:18、SEQ NO ID:20、SEQ NO ID:22、SEQ NO ID:24、及SEQ NO ID:26；及

c.(a)的轻链可变区序列和(b)的重链可变区序列的组合。

在一个实施方案中，在本文所提供的双特异性抗体中,所述抗体的IgG结构域包含以下方案之一的氨基酸序列组合方式：SEQ NO ID:15与SEQ NO ID:16的组合(L3H3)、SEQNO ID:17与SEQ NO ID:18的组合(L4H4)、SEQ NO ID:19与SEQ NO ID:20的组合(L5H5)、SEQNO ID:21与SEQ NO ID:22的组合(L6H6)、SEQ NO ID:23与SEQ NO ID:24的组合(L7H7)、及SEQ NO ID:25与SEQ NO ID:26的组合(L8H8)。

a.scFv结构域的轻链可变区序列选自以下序列之一：SEQ NO ID:15、SEQ NO ID:17、SEQ NO ID:19、SEQ NO ID:21、SEQ NO ID:23、及SEQ NO ID:25；

b.scFv结构域的重链可变区序列选自以下序列之一：SEQ NO ID:16、SEQ NO ID:18、SEQ NO ID:20、SEQ NO ID:22、SEQ NO ID:24、及SEQ NO ID:26；及

c.(a)的轻链可变区序列和(b)的重链可变区序列的组合。

在一个实施方案中，在本文所提供的双特异性抗体中,所述抗体的scFv结构域包含以下方案之一的氨基酸序列组合方式：SEQ NO ID:15与SEQ NO ID:16的组合(L3H3)、SEQNO ID:17与SEQ NO ID:18的组合(L4H4)、SEQ NO ID:19与SEQ NO ID:20的组合(L5H5)、SEQNO ID:21与SEQ NO ID:22的组合(L6H6)、SEQ NO ID:23与SEQ NO ID:24的组合(L7H7)、及SEQ NO ID:25与SEQ NO ID:26的组合(L8H8)。

a.IgG结构域的轻链可变区序列选自以下序列之一：SEQ NO ID:11、SEQ NO ID:13、及SEQ NO ID:32；

b.IgG结构域的重链可变区序列选自以下序列之一：SEQ NO ID:12、SEQ NO ID:14、SEQ NO ID:33、及SEQ NO ID:34；及

c.(a)的轻链可变区序列和(b)的重链可变区序列的组合。

在一个实施方案中，在本文所提供的双特异性抗体中，其中所述抗体的IgG结构域包含以下方案之一的氨基酸序列组合方式：SEQ NO ID:11与SEQ NO ID:12的组合(L1H1)、SEQ NO ID:13与SEQ NO ID:14的组合(L2L2)、SEQ NO ID:32与SEQ NO ID:33的组合(L9H9)、及SEQ NO ID:32与SEQ NO ID:34的组合(L9H10)。

在一个实施方案中，在本文所提供的双特异性抗体中,所述的抗体蛋白质的IgG分子进一步包含以下方案之一的氨基酸序列：

a.选自以下序列之一的轻链恒定区氨基酸序列：SEQ NO ID:27及SEQNO ID:28；

b.选自以下序列之一的重链恒定区氨基酸序列：SEQ NO ID:29、SEQNO ID:30、及SEQ NO ID:31；

c.(a)的轻链恒定区序列和(b)的重链恒定区序列的组合。

在一个实施方案中，本文所提供的双特异性抗体是一种能够与人CD19和人CD3结合的双特异性抗体。

在一个实施方案中，本文所提供的双特异性抗体是一种能够与人CD20和人CD3结合的双特异性抗体。

在一个实施方案中，本文所提供的双特异性抗体是鼠源抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、重组抗体、IgGl抗体、IgG2抗体、IgG3抗体、或IgG4抗体。

在一个实施方案中，本文提供了一种多核苷酸，其编码本文所提供的双特异性抗体。

在一个实施方案中，本文提供了一种载体，其包含本文所提供的多核苷酸。

在一个实施方案中，本文提供了一种宿主细胞，其包含本文所提供的载体。在一个实施方案中，本文提供了一种药用组合物，其包含与药用可接受载体混合的本文所提供的双特异性抗体。

在一个实施方案中，本文提供了本文所述的双特异性抗体在制备用于预防或治疗B细胞白血病的药物中的用途。在一个实施方案中，本文所述的B细胞白血病是急性B细胞白血病。在一个实施方案中，本文所述的B细胞白血病是慢性B细胞白血病。

在一个实施方案中，本文提供了本文所述的双特异性抗体在制备用于预防或治疗非霍奇金淋巴瘤的药物中的用途。

在一个实施方案中，本文提供了本文所述的双特异性抗体在制备用于预防或治疗B细胞引起的自体免疫疾病的药物中的用途。在一个实施方案中，本文所述的B细胞引起的自体免疫疾病是风湿性关节炎、多发性硬化症、或系统性红斑狼疮。

在一个实施方案中，本文提供了本文所述的双特异性抗体在制备用于预防或治疗器官移植带来的排异反应及其相关症状的药物中的用途。

附图说明

图1是αCD19/αCD3双特异性抗体的SDS-PAGE图。M泳道代表标准蛋白，分子量如图所示。#1和#2泳道均为该αCD19/αCD3双特异性抗体(不同上样量)，结果显示其分子量为55Kd左右。

图2是流式细胞术(FACS)检测重组表达的αCD19/αCD3双特异性抗体(实线双峰并箭头指示)与Raji肿瘤细胞的特异性结合，阳性对照为αCD19单抗(虚线双峰并箭头指示)，阴性对照为抗体溶剂(虚线单峰)。该结果显示该αCD19/αCD3双特异型抗体很好地保留αCD19针对CD19的亲和力。

图3是不同浓度的αCD19/αCD3双特异性抗体介导下的CIK对Raji肿瘤细胞的杀伤曲线，E:T为10：1。Y轴代表固定细胞总量中剩余存活的Raji细胞的数量，X轴代表了抗体的浓度。该结果提示了在E:T为10：1的情况下，CIK对Raji的杀伤力随着抗体浓度上升而提升，成正相关。其对Raji细胞的半杀伤浓度为1ng/mL。

发明详述

定义

除非另外指明，本文使用标准的单字母或三字母缩写表明多聚核苷酸和多肽序列。多肽序列的氨基端(N’)在左羧基端(C’)在右，单链核酸序列和双链核酸序列的上游链的5’端在左而它们的3’端在右。多肽的具体部分可由氨基酸残基编号表示，例如氨基酸80至130，或由该位点的实际残基表示例如Lys80至Lys130或K80至K130。也可通过解释其与参比序列的差异来描述具体的多肽或多聚核苷酸序列。

除非本文另外定义，与本文相关的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员所理解的含义。进一步，除非上下文另有要求，单数术语应包括复数并且复数含义术语应包括单数含义。通常，与本文所述细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质核酸化学以及杂交相关的命名法和技术为本领域熟知和经常使用的。本文的方法和技术通常根据本领域已知的常规方法以及本说明书引用和讨论的各种普通和更具体的参考文献所描述的进行，除非另外说明。参见，例如，Sambrook等，Molecular Cloning:ALaboratory Manual，第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)和Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates(1992)，以及Harlow and Lane Antibodies:A Laboratory Manual Cold Spring HarborLaboratory Press(1990)，均以参考形式并于本文。酶反应和纯化技术根据操作说明进行，如本领域通常完成或本文所述。与本文描述的分析化学、合成有机化学和医学和药学化学相关的术语以及实验操作和技术均为本领域熟知和普遍使用者。标准技术可用于化学合成、化学分析、药物制备、制剂和给药以及患者的治疗。

术语“肽”、“多肽”和“蛋白”均指包含两个或多个通过肽健相互连接的氨基酸的分子。这些术语涵盖例如天然和人工蛋白、蛋白片段和蛋白序列的多肽类似物(例如突变蛋白、变异体和融合蛋白)。

如本文使用的术语“多肽片段”指与对应的全长蛋白相比具有氨基端和/或羧基端缺失的多肽。片段长度可为例如至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、50、70、80、90、100、150或200个氨基酸。片段长度可为例如最多1000、750、500、250、200、175、150、125、100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、14、13、12、11或10个氨基酸。片段可在其一端或两端进一步包含一个或多个附加氨基酸，例如，来自不同天然蛋白质的氨基酸序列(例如，Fc或亮氨酸拉链结构域)或人工氨基酸序列(例如，人工接头序列)。

本文所述的多肽包括以任何原因和经任何方法修饰的多肽，例如，以：(1)降低蛋白水解敏感性，(2)降低氧化敏感性，(3)改变形成蛋白复合物的亲和性，(4)改变结合亲和性以及(4)赋予或修饰其它物理化学或功能性质。类似物包含多肽的突变蛋白。例如，可在天然序列(例如在形成分子内接触的结构域之外的多肽部分)中进行单个或多个氨基酸替换(例如，保守氨基酸替换)。“保守氨基酸替换”为不显著改变母体序列结构特性者(例如，替换氨基酸不应破坏母体序列中出现的螺旋或干扰其它赋予母体序列特性或对其功能是必须的二级结构类型)。领域公认的多肽二级和三级结构的实例描述于Proteins,Structures and Molecular Principles(Creighton编辑，W.H.Freeman and Company(1984))；Introduction to Protein Structure(Branden and Tooze编辑,GarlandPublishing(1991))；和Thornton等，1991，Nature 354:105-106，均以参考形式并于本文。

本文也包含抗体的非肽类似物。非肽类似物普遍用于提供与模板肽具有相似性质的药物。这些非肽化学物类型被称作“模拟肽(peptide mimetics)”或“拟肽(peptidomimetics)”。Fauchere，1986，Adv.Drug Res.15:29-69；Veber和Freidinger，1985，Trends Neurosci.8:392-396；Evans等，1987，J.Med.Chem.30:1229-1239，均以参考形式并于本文。与治疗用肽结构相似的模拟肽可用于产生相等的治疗或预防效果。通常，拟肽与范例多肽的结构相似(即具有期望生物化学性质或药理学活性的多肽)，例如人类抗体，但是具有一个或多个任选被选自-CH₂NH-、-CH₂S-、-CH₂-CH₂-、-CH＝CH-(顺式和反式)、-COCH₂-、-CH(OH)CH₂-、和-CH₂SO-的连接通过本领域熟知的方法取代的肽连接。用相同类型的D-氨基酸系统取代一致序列的一个或多个氨基酸(例如，D-赖氨酸取代L-赖氨酸)也可用于生成更稳定的肽。此外，可通过本领域已知的方法(Rizo and Gierasch，1992，Annu.Rev.Biochem.61:387-418)，以参考形式并于本文)例如通过添加可形成将肽环化的分子间二硫键的内部半胱氨酸残基生成包含一致序列或基本相同的一致序列变异体的拘束肽(constrained peptides)。

多肽的“变异体”包含相对于另一多肽序列在氨基酸序列中插入、缺失和/或替换了一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

多肽的“衍生物”为经化学修饰的多肽(例如，抗体)，例如通过与其它化学部分例如聚乙二醇、白蛋白(例如人血清白蛋白)结合、磷酸化和糖基化。

术语“结构域”为生物大分子中具有特异结构、独立功能的区域，其具有相当的结构独立性，有在同类型生物大分子中完整得、重复得出现的特性，本文中特别指肽、多肽或者蛋白中这样的区域，例如轻链可变区(V_L)结构域，单链抗体(scFv)结构域。小的结构域可以组合形成更大的结构域，例如单链抗体结构域由轻链可变区结构域和重链可变区(V_H)结构域通过肽接头序列组合形成。

术语“亚基”为一个由一条以上多肽组成的蛋白质或者蛋白复合物所包含的其中一个具有独立序列和三级结构的结构域或结构组分，例如完整的人CD3分子包含CD3γ，CD3ε和CD3δ三种亚基。

术语“抗体”为包含与抗原结合部分并任选为允许抗原结合部分采取促进该抗体与该抗原结合的构象的支架或框架部分的蛋白，即包括除包含两个全长重链和两个全长轻链的抗体外的其衍生物，变异体、片段、突变蛋白和融合蛋白，例如本文的双特异性抗体。抗体的实例包括抗体、抗体片段(例如抗体的抗原结合部分)、抗体衍生物和抗体类似物。该抗体可包含例如可选择的蛋白支架或具有移植CDRs或CDRs衍生物的人工支架。该支架包括但不限于包含被引入的例如以稳定化该抗体的三维结构的抗体衍生支架以及包含例如生物相容性多聚体的全合成支架。参见，例如，Korndorfer等，2003，Proteins:Structure，Function and Bioinformatics 53:121-129；Roque等，2004,Biotechnol.Prog.20:639-654。此外，可使用模拟肽抗体(“PAMs”)以及基于模拟抗体的支架，其如支架一样利用纤维蛋白连接素。

抗体可具有例如天然免疫球蛋白的结构。“免疫球蛋白”为四聚体分子。在天然的免疫球蛋白中，各四聚体由两个相同的多肽链对组成，各对具有一个“轻”(约25kDa)和一个“重”链(约50-70kDa)。各链的氨基端包括约100至110或更多氨基酸的可变区结构域，主要与抗原识别相关。各链的羧基端部分确定了主要与效应器作用相关的恒定区。人的轻链分为κ和λ轻链。重链为γ，并确定了抗体为IgG。在轻链和重链中，可变和恒定区由约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链也包括约10多个氨基酸的“D”区。参见，FundamentalImmunology Ch.7(Paul编辑，第2版，Raven Press，1989)(其完整内容以参考形式并于本文用于任何目的)。各轻/重链对的可变区形成抗体结合位点，这样一个完整的免疫球蛋白具有两个结合位点。

天然免疫球蛋白链显示出由三个高度可变区连接的相对保守骨架区(FR)的相同基本结构，也被称作互补决定区或CDRs。从N端到C端，轻和重链均包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。各结构域氨基酸的分配与Kabat等在Sequences of Proteinsof Immunological Interest，第5版，US Dept.of Health and Human Services,PHS，NIH，NIH Publication No.91-3242，1991中的定义一致。

单链抗体(scFv)为其中的V_L和V_H区由肽接头(合成的氨基酸残基序列)连接以形成连续蛋白质的抗体，其中该肽接头足够长以允许该蛋白链折叠回自身并形成单价抗原结合位点(参见，例如，Bird等，1988，Science242:423-26and Huston等，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-83)。

可使用Kabat等在Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版,US Dept.of Health and Human Services,PHS,NIH,NIH Publication No.91-3242，1991中描述的方法鉴定给定抗体的互补决定区(CDRs)和骨架区(FR)。可向分子中共价或非共价并入一个或多个CDRs使其成为抗体。抗体可以较大多肽链并入CDR(s)。可将CDR(s)共价连接至另一乡肽链，或非共价并入CDR(s)。CDRs允许抗体与具体的相关抗原特异性结合。

抗体可有一个或多个结合位点。如果多于一个结合位点，该结合位点可与另一个具有相同或不同的特异性。例如，天然人免疫球蛋白G通常具有两个相同的结合位点，而“双特异性”或“双功能”抗体可以具有两个或者以上的结合位点，并且这些位点分属于两种具有不同特异性的结合位点，例如本文的T细胞双特异性抗体具有四个结合位点，其中两个位点识别CD3阳性的T细胞，剩余两个位点结合CD19阳性或者CD20阳性的B细胞。术语“T细胞双特异性抗体”或“双特异性抗体”为能够识别T细胞和一个额外靶点的双特异性抗体。

术语“鼠源抗体”包括具有一个或多个来源于小鼠免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的所有抗体。

术语“人源化抗体”是将小鼠抗体分子的互补决定区序列移植到人抗体可变区框架中而制成的抗体。

“抗原结合结构域”、“抗原结合区”或“抗原结合位点”为包含与抗原相互作用的氨基酸残基(或其它部分)并有助于抗体对抗原的特异性和亲和力的抗体的部分。对与其抗原特异性结合的抗体而言，这将包括至少部分的至少一个其CDR结构域。

“表位”为与抗体(例如，通过抗体)结合的分子部分。表位可包含分子的非连续部分(例如，在多肽中，在多肽的一级序列中不连续的氨基酸残基在该多肽的三级和四级结构中相互足够接近以致于被一个抗体结合)。

两个多聚核苷酸或两个多肽序列的“相同百分比”由使用GAP计算机程序(GCGWisconsin Package；version 10.3(Accelrys，San Diego，CA)的一部分)使用其默认参数比较序列测定。

术语“多聚核苷酸”、“寡聚核苷酸”和“核酸”可在全文中交替使用并包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如mRNA)、使用核苷酸类似物(例如，肽核酸和非天然核苷酸类似物)生成的DNA或RNA类似物及其杂交体。核酸分子可为单链或双链。在一个实施方案中，本文的核酸分子包含编码本文的抗体或其片段、衍生物、突变蛋白或变异体连续的开放阅读框。

如果它们的序列可反向平行排列则两个单链多聚核苷酸是相互“互补的”，这样一个多聚核苷酸中的各核苷酸与另一多聚核苷酸中的互补核苷酸相反，不会引入空隙并且各序列的5’或3’端没有未配对的核苷酸。如果两个多聚核苷酸可在中等严格条件下相互杂交那么一个多聚核苷酸与另一多聚核苷酸“互补”。因此，一个多聚核苷酸可与另一多聚核苷酸互补，但并不是它的互补序列。

“载体”为可用于将与其相连的另一核酸引入细胞的核酸。载体的一种类型为“质粒”，其指可连接附加核酸区段的线性或环状双链DNA分子。载体的另一类型为病毒载体(例如，复制缺陷逆转录病毒、腺病毒和腺病毒伴随病毒)，其中可将附加DNA区段引入病毒基因组。某些载体可在它们被引入的宿主细胞中自主复制(例如，包含细菌复制起点的细菌载体以及游离型哺乳动物载体)。其它载体(例如，非游离型哺乳动物载体)在引入宿主细胞时整合入宿主细胞的基因组中并因此与宿主基因组一起复制。“表达载体”为可引导所选多聚核苷酸表达的载体类型。

如果调控序列影响核苷酸序列的表达(例如，表达水平、时间或位点)那么核苷酸序列与调控序列“可操作地相连”。“调控序列”为可影响与其可操作相连的核酸的表达(例如，表达水平、时间或位点)的核酸。调控基因，例如，直接对受调控核酸发挥作用或通过一个或多个其它分子(例如，与调控序列和/或核酸结合的多聚核苷酸)的作用。调控序列的实例包括启动子、增强子和其它表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。调控序列的进一步实例描述于例如Goeddel，1990,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology,Volume 185,Academic Press,San Diego,CA and Baron等,1995,Nucleic Acids Res.23:3605-06。

“宿主细胞”为用于表达核酸例如本文的核酸的细胞。宿主细胞可为原核生物，例如大肠杆菌，或者其可为真核生物，例如单细胞真核生物(例如，酵母或其它真菌)、植物细胞(例如烟草或番茄植物细胞)、动物细胞(例如，人细胞、猴细胞、仓鼠细胞、大鼠细胞、小鼠细胞或昆虫细胞)或杂交瘤。通常，宿主细胞为可用多肽编码核酸转化或转染的培养细胞，其可接着在宿主细胞中表达。短语“重组宿主细胞”可用于表述用预期表达的核酸转化或转染的宿主细胞。宿主细胞也可为包含该核酸但是不以期望水平表达的细胞，除非向该宿主细胞引入了调控序列这样其与核酸可操作地相连。应理解的是术语宿主细胞不仅指具体的受试者细胞也指该细胞的子代或可能的子代。由于例如突变或环境影响后续世代会出现某些修饰，该子代事实上可能与母体细胞不同但是仍然属于本文使用的术语范围。

CD3、CD19和CD20

T细胞表面的分化簇3(CD3)是T细胞受体的共受体，协助细胞毒性T细胞的激活。哺乳动物T细胞的CD3分子由四个亚基(一个γ亚基，一个δ亚基和两个ε亚基)共同组成。本文的T细胞双特异性抗体主要通过针对ε亚基的特异性来结合CD3分子阳性的T细胞，但其它亚基也有可能参与抗体表位的形成。B细胞表面的分化簇19(CD19)能够与B细胞受体结合，降低B细胞响应抗原依赖性激活的门槛，参与B细胞的成熟和分化。B细胞表面的分化簇20(CD20)参与B细胞免疫应答。本文的T细胞双特异性抗体通过针对CD19或者CD20的特异性来结合B细胞。小鼠、猕猴和人的CD3ε、CD19、CD20的氨基酸序列在Uniprot蛋白数据库(UniProt,Consortium.“UniProt:a hub for protein information.”.Nucleic acidsresearch.43)中的登录号如下：小鼠CD3ε登录号：P22646；猕猴CD3ε登录号：H9FCI9；人CD3ε登录号：P07766；小鼠CD19登录号：P25918；猕猴CD19登录号：F7F486；人CD19登录号：P15391；小鼠CD20登录号：P19437；猕猴CD20登录号：H9YXP1；人CD20登录号：P11836。

双特异性抗体

本文所涉及的抗体属于T细胞依赖的双特异型抗体，能够特异性得识别人B细胞表面的CD19或CD20之一和T细胞表面的CD3。施用时能够招募T细胞攻击CD19或CD20阳性的恶性或者非正常B细胞，起到治疗由此类B细胞引起的相关疾病的作用，包括了各种B细胞性白血病、B细胞性自体免疫类疾病和器官移植引起的排异反应等症状。此类双特异性抗体所引起的细胞杀伤不依赖于IgG分子的Fc片段所介导的细胞毒性作用，并且比传统抗体起效更快，活性更高，用量更少。

双特异性抗体具有各种不同的分子构造，且具有各自的优缺点。具有代表性的Triomab和BiTEs形式的抗体已有Catumaxomab和Blinatumomab被批准上市，分别用于恶性腹水和B-ALL的治疗，后者还正尝试用于NHL的治疗。但前者因为使用大鼠/小鼠嵌合抗体的构造免疫源性很高，且制备得率很低，而后者使用单链抗体串联的分子形式因而具有体内半衰期短，产率低和生产工艺复杂等缺点。

本文所涉及的双特异性抗体蛋白质选用新的构造形式，在一个实施方案中，这些双特异性抗体由一个完整的抗人CD19或CD20的IgG分子和两个相同的抗CD3的scFv形式的结构域组成。在一个实施方案中，这些双特异性抗体由一个完整的抗人CD3IgG分子和两个相同的抗CD19或CD20的scFv形式的结构域组成。两个scFv结构域通过柔性肽接头序列与IgG分子的轻链或者重链的氨基端(N’)或者羧基端(C’)进行融合表达。这样的分子设计是基于对IgG分子的优秀性质加以最大保留的意愿。作为融合蛋白质的一个融合组件，IgG分子已经被证明可以在保留其自身的亲和力的同时有效得提高整个融合蛋白质的稳定性和体内半寿期(CN 105854000A)。同时，基于Protein A对IgG分子的高亲和力而建立的IgG制备工艺流程已经非常成熟和平台化，借助IgG分子，我们可以用类似于传统抗体的纯化工艺来制备这些双特异性抗体，降低工艺成本。再者，得益与其分子构造和保守的序列，IgG是一个低免疫源性的分子，而本文涉及的双特异性抗体蛋白质虽然进行了分子构造上的人为改造，却大体上仍然是基于IgG分子的，有利于减少因为分子构造过度变更带来的稳定性和免疫源性上的不确定性。

基于以上的考虑，我们设计了本文涉及的双特异型抗体，一种由scFv搭配IgG分子形成的T细胞双特异型抗体。其IgG分子部分可以选自以下不同的抗体形式之一：鼠源抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、重组抗体、IgGl抗体、IgG2抗体、IgG3抗体、IgG4抗体等的不同形式，并且可以包含本领域已知的任何恒定区。轻链恒定区可为例如κ或λ型轻链恒定区，例如人的κ或λ型轻链恒定区(SEQ NO.27和SEQ NO.27)。重链恒定区为γ型重链恒定区，例如人γ型重链恒定区(SEQ NO.29、SEQ NO.30和SEQ NO.31)。在一个实施方案中，该轻链或重链恒定区为天然恒定区的片段、衍生物、变异体或突变蛋白。也可应用重组DNA技术。可在该操作中应用编码具体抗体多的已克隆DNA，例如编码期望同种型的抗体恒定结构域的DNA。也可参见Lanitto等，2002，Methods Mol.Biol.178:303-16。而与IgG分子组合形成本文双特异性抗体的scFv结构域不包含有任何恒定区，其由轻链可变区结构域、重链可变区结构域由肽接头氨基酸序列连接而成，三者的排列方式选自以下的一种：

a.以N’-Vs_L-Link₂-Vs_H-C’顺序排列；及

b.以N’-Vs_H-Link₂-Vs_L-C’顺序排列；

其中:Vs_L为scFv结构域的轻链可变区氨基酸序列，Vs_H为scFv结构域的重链可变区氨基酸序列，N’代表多肽链的氨基端，C’代表多肽链的羧基端，Link₂为结构域内肽接头氨基酸序列，序列选自：SEQ NO ID:6、SEQ NO ID:7、SEQ NO ID:8、SEQ NO ID:9、SEQ NO ID:10。我们选择scFv结构域来提供针对第二个抗原的亲和力的原因是其保留了与IgG可变区(Fab)相类似的结构，并且单链的构造易于和IgG分子进行融合表达。该scFv结构域与IgG的进行融合表达后将形成对称的结构，即IgG分子的两条轻链或两条重链都连接一个scFv结构域，其链接方式按照以下的方式中的其中一种进行：

a.通过肽接头将scFv的羧基端和IgG轻链的氨基端链接：N’-scFv-Link₁-V_L-C_L-C’；

b.通过肽接头将scFv的氨基端和IgG轻链的羧基端链接：N’-V_L-C_L-Link₁-scFv-C’；

c.通过肽接头将scFv的羧基端和IgG重链的氨基端链接：N’-scFv-Link₁-V_H-C_H1-C_H2-C_H3-C’；及

d.通过肽接头将scFv的氨基端和IgG重链的羧基端链接：N’-V_H-C_H1-C_H2-C_H3-Link₁-scFv-C’；

其中:scFv为单链抗体可变区片段，V_H为IgG结构域重链可变区，C_L为IgG结构域轻链恒定区结构域，C_H1为IgG结构域重链恒定区结构域1，C_H2为IgG结构域重链恒定区结构域2，C_H3为IgG结构域重链恒定区结构域3，N’代表多肽链的氨基端，C’代表多肽链的羧基端。Link₁为结构域间肽接头序列，序列选自：SEQ NO ID:1、SEQ NO ID:2、SEQ NO ID:3、SEQ NOID:4、SEQ NO ID:5。

如上所述的本文的双特异性抗体共有四个结合位点和两种不同特异性，分别来自于IgG分子和scFv结构域，并按照以下的方式之一进行分配：

a.IgG分子识别CD19；scFv结构域识别CD3；

b.IgG分子识别CD20；scFv结构域识别CD3；

c.IgG分子识别CD3；scFv结构域识别CD19；及

d.IgG分子识别CD3；scFv结构域识别CD20。

针对人CD19或人CD20的特异性可以来自选自包括2H7、IDEC-C2B8、4G7、B4、HD37、FMC63等的抗体克隆，其对人CD19或人CD20的亲和力要求在10^-9/M以上，更高的亲和力具有更优秀的细胞杀伤活性。针对人CD3的特异性来自选自包括OKT3和UCHT-1等的抗体克隆，其对CD3的亲和力要求在10^-5/M到10^-7/M之间，低于或者高于此亲和力的scFv不适用于本文所述的双特异型抗体。以上所述的拥有不同特异性的IgG结构域或者scFv结构域可通过不同的轻重链可变区的组合方式来表示，例如选用L1H1组合的IgG结构域代表该IgG结构域选用L1的轻链可变区搭配H1的重链可变区组合形成。本文所涉及到的不同轻重链可变区氨基酸序列如下表总结：

数个针对T细胞的抗体，如OKT3，TGN1412以及针对B细胞的Rituximab均会引起人体的细胞激素释放效应(Cytokine release syndrome)，而过度的释放被称作细胞激素风暴(Cytokine storm)，是一种可能危及生命的急性输液反应。因为本文所涉及的T细胞双特异性抗体牵涉到与T细胞和B细胞两种免疫细胞同时结合，产生Cytokine storm的几率更高。因此，规避施用这些双特异性抗体施用时的细胞激素风暴尤为重要。可以通过两个方面来减少该风险：第一，因为T细胞是细胞激素释放的主要贡献者，因此限制针对CD3的抗体的亲和力是降低细胞激素释放的一个重要方面，本文中的抗体针对CD3的亲和力必须保持在10^-5/M到10^-7/M之间，维持其招募T细胞活性和刺激细胞激素释放之间的平衡。第二，因为针对人CD19或者人CD20的双特异型抗体无需借用Fc介导的ADCC和CDC免疫反应来起作用(如Blinatumomab不含有Fc)，而且IgG的Fc部分保留的效应子功能将会引入更多的T细胞和B细胞以外的免疫细胞，如NK细胞，巨噬细胞，中性粒细胞，嗜酸性和嗜碱性粒细胞等的参与，增加细胞激素风暴的风险，所以本文通过对IgG部分的重链恒定区进行突变，消除其与Fcreceptor的亲和力已减少细胞激素风暴的风险。经过改造的IgG重链恒定区序列为：SEQ NOID:29、SEQ NO ID:30、SEQ NO ID:31。

抗体类药物的免疫源性是开发阶段非常重要的考虑项，IgG分子得益于其结构和序列的保守性，是一个低免疫源性的分子，本文的双特异性抗体在结构上基于IgG的经典分子结构设计而成，其IgG部分无需累述，其两个scFv结构域也拥有接近IgG可变区的分子结构，这样的设计减少了因为分子结构过度人为化引入结构性的新免疫位点的风险。但是，在构建这个分子时，无论是在组成scFv结构域或者连接scFv和IgG结构域时，肽接头序列是必须要添加的人为序列部分。为尽可能的减少引入的结构不确定性，同时保持IgG和scFv两者的自由度，肽接头部分优选富含甘氨酸和丝氨酸的序列。因为甘氨酸和丝氨酸带有较小的侧链，使肽接头序列具有相当的灵活性，减少了scFv和IgG结构域之间相对位置的刚性，使两者可以自由得与各自的靶标结合。同时，甘氨酸和丝氨酸交替出现避免过度重复向双特异性抗体中引入不必要的免疫源性。优选肽接头长度，平衡结构柔度和免疫源性很重要，所以本文优选了以下的几个肽接头序列用于scFv和IgG结构域的连接：SEQ NO ID:1、SEQ NOID:2、SEQ NO ID:3、SEQ NO ID:4、SEQ NO ID:5；以及scFv的构建：SEQ NO ID:6、SEQ NOID:7、SEQ NO ID:8、SEQ NO ID:9、SEQ NO ID:10。

本文中，编码scFv的DNA与所述IgG结构域的轻链或重链DNA通过编码肽接头序列的DNA连接成融合轻链或融合重链DNA，同时在轻链DNA的5’末端还将引入编码信号引导肽的DNA来形成基因，并可以此基因基础连接scFv和IgG序列。本文通过基因合成的方法得到scFv的序列，并通过PCR的方法将其与编码肽接头序列的DNA相连接。本文也是通过基因合成的方法得所述IgG结构域的轻链可变区和重链可变区DNA序列，并与特定抗体亚型的恒定区DNA相连接组成得到完整的IgG轻链和重链的DNA序列。野生型抗体亚型的恒定区DNA可以通过从特定的文库克隆得到并作为序列优化的基础。在此所述的用于表达双特异性抗体的基因，通过克隆方式放入表达载体中用于双特异性抗体的产生和表达。在表达过程中，轻链和重链表达载体搭配后，用共转染或者转化的方式将带有其基因的DNA引入宿主细胞中，并用优化适应诱导启动子，选择转化子或者扩增编码所希望序列的基因的培养基在适宜的pH，温度中培养。DNA引入方式选用普遍使用的CaPO₄，电穿孔和PEI等方式。将这些载体引入大肠杆菌、酵母或哺乳动物为基础的表达系统后可使用这些方法生产大量本文所述的双特异性抗体。

适于表达此处所述载体中核酸的合适宿主细胞包括高等真核细胞，哺乳动物宿主细胞系表达的实例包括了中国仓鼠卵巢细胞系(CHO)和人胚胎肾脏细胞(HEK293或者悬浮培养的HEK293细胞系)，位于轻链N末端的信号引导肽指导双特异性抗体的从哺乳动物宿主细胞系中的分泌。用于表达和克隆的载体上带有能够使载体在宿主细胞中不断复制的选择标记，用于筛选有能力吸收编码双特异性抗体的核酸的细胞并且带有与双特异性抗体编码序列有效连接并指导mRNA合成的启动子。其中一个实例是用带有抗生素抗性以及乙型肝炎病毒和猿病毒启动子(SV40)的载体优选稳定表达双特异性抗体的CHO宿主细胞。

本领域技术人员应理解的是一些蛋白质，例如抗体，可能进行多种转录后修饰。这些修饰的类型和程度取决于用于表达该蛋白的宿主细胞系以及培养条件。该类修饰包括糖基化作用、甲硫氨酸氧化、二酮哌嗪形成、天冬氨酸异构化和天冬酰胺脱酰胺作用的变化。由于羧肽酶的作用频繁修饰导致羧端碱性残基(例如赖氨酸或精氨酸)的丢失(如Harris，1995，Journal of Chromatography 705:129-134中所述)。

可通过多种已确立的技术分离和纯化单克隆抗体。该类分离技术包括使用蛋白A-琼脂糖的亲和色谱法、分子排阻色谱法和高子交换色谱法，参见，例如，Coligan第2.7.1-2.7.12页和第2.9.1-2.9.3页；Baines等，“Purification of Immunoglobulin G(IgG),”Methods in Molecular Biology，第10卷，第79-104页(The Humana Press，Inc.，1992)。可使用基于抗体的特殊性质(例如，重链或轻链同种型、结合特异性等)筛选的适当配基通过亲和色谱法纯化单克隆抗体。固定化于固体载体的适当配基的实例包括蛋白A、蛋白G、抗恒定区(轻链或重链)抗体、抗独特型抗体以及TGF-p结合蛋白或其片段或变异体。本文在宿主细胞系表达双特异型抗体蛋白质后，用亲和层析的方法将其分泌在细胞培养上清中的部分纯化。本文中的实例包括用蛋白A/蛋白G的亲和层析柱捕获融合有全长抗体的双特异性抗体，然后用低pH将其从层析柱料上洗脱后再收集。温和的洗脱条件有助于防止蛋白的变性。

可使用抗体结合位点中央的互补决定区(CDRs)的分子进化分离亲和性增加的抗体，例如对c-erbB-2亲和性增加的抗体，如Schier等，1996，J.Mol.Biol.263:551-567所述。当需要提高根据本文所述的双特异性抗体的针对其某一个靶点的亲和性时，可通过多种亲和成熟方案包括维持CDRs(Yang等，1995，J.Mol.Biol.254:392-403)、链替换(Marks等，1992，Bio/Technology 10:779-783)、使用大肠杆菌的突变株(Low等，1996，J.Mol.Biol.250:350-368)DNA重排(Patten等，1997，Curr.Opin.Biotechnol.8:724-733)、噬菌体展示(Thompson等，1996，J.Mol.Biol.256:7-88)以及其它PCR技术(Crameri等，1998，Nature 391：288-291)。所有这些亲和力成熟方法讨论于Vaughan等，1998，NatureBiotechnology 16:535-539中。

可以用一种或多种赋形剂配制本文的双特异性抗体。本文的双特异性抗体可以与可药用的缓冲液、经调节提供可接受的稳定性的pH、以及可施用(例如胃肠外施用)的pH组合。任选地，可以添加一种或多种可药用的抗微生物剂。间甲酚和苯酚是优选的可药用抗微生物剂。可以添加一种或多种可药用盐溶液以调节离子强度或张力。可以添加一种或多种赋形剂以进一步调节制剂的等渗性。甘油是等渗性调节赋形剂的实例。可药用意味着适于施用于人类或其他动物，因此不含有毒性成分或不希望的污染物，并且不干扰其中活性化合物的活性。

可以以溶液制剂或能够用合适的稀释剂重构的冻干粉配制本文的双特异性抗体。冻干剂型是其中双特异性抗体稳定的一种剂型，具有或不具有重构产品在预期的使用货架期内保持pH的缓冲能力。包含在此讨论的双特异性抗体的溶液在冻干前优选是等渗的，使之重构后能够形成等渗溶液。

本文的双特异性抗体的可药用盐溶液形式在本文范围内。常用于形成酸加成盐的酸为无机酸，例如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸等，以及有机酸，例如对甲苯磺酸、甲磺酸、草酸、对溴苯基一磺酸、碳酸、琥珀酸、柠檬酸、苯甲酸、乙酸等。优选的酸加成盐是与无机酸，例如盐酸和氢溴酸形成的盐。

碱加成盐包括从无机碱，例如铵、碱或碱土金属氢氧化物衍生的那些盐、碳酸盐、碳酸氢盐等。在制备本文的盐溶液中有用的这类碱因此包括氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、碳酸钾等。

核酸和宿主细胞

本文也提供分离的核酸分子，该核酸分子包含例如编码全部或部分抗体的多聚核苷酸，例如本文所述的双特异性抗体的一条链或两条链，或其片段、衍生物、突变蛋白或变异体；足以用作杂交探针的多聚核苷酸；PCR引物或用于鉴定、分析、突变或扩增编码多肽的多聚核苷酸的测序引物；用于抑制多聚核苷酸表达的反义核酸以及其互补序列。该核酸可为任何长度。例如它们的长度可为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、750、1000、1500、3000、5000或更多个核苷酸，和/或包含一个或多个附加序列，例如调控序列，和/或是较大核酸例如载体的一部分。该核酸可为单链或双链并包含RNA和/或DNA核苷酸以及其人工变异体(例如，肽核酸)。熟练的技术人员可理解由于遗传密码的简并性，本文公开的各多肽序列可由更多数量的其他核酸序列编码。

本文进一步提供在具体杂交条件下与其他核酸(例如，包含任何A-1/A-2的核苷酸序列的核酸)杂交的核酸。杂交核酸的方法为本领域熟知。参见，例如，Current Protocolsin Molecular Biology，John Wiley&Son(1989)，6.3.1-6.3.6。如本文定义，例如，中等严格条件使用包含5X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)的预洗溶液、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0)、约50％甲酰胺的杂交缓冲液、6X SSC和55℃的杂交温度(或其他相似的杂交溶液，例如包含绚50％甲酰胺的，以42℃杂交)，并且洗脱条件为60℃，使用0.5X SSC、0.1％SDS。严格杂交条件在6X SSC中于45℃杂交，然后于68℃在0.1X SSC、0.2％SDS中洗涤一次或多次。此外，本领域技术人员可操作杂交和/或洗涤条件以增加或降低杂交严格度这样包含相互之间至少65、70、75、80、85、90、95、98或99％同源的核苷酸序列的核酸通常仍可以相互杂交。影响杂交条件选择的基本参数和设计适当条件的指导列于例如Sambrook，Fritsch和Maniatis，1989，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress，第9和11章；Current Protocols in Molecular Biology，1995，Ausubel等编辑，John Wiley&Sons，Inc.，第2.10和6.3-6.4节)并可由具有本领域普通技术的人员基于例如DNA的长度和/或碱基组成轻松确定。可通过突变在核酸中引入变化，藉此导致其编码的多肽(例如，抗原结舍蛋白)氨基酸序列的变化。可使用本领域已知的任何技术引入突变。在一个方面，可以使用例如定点诱变方案改变一个或多个具体氨基酸残基。在另一个方面，也可以使用例如随机诱变方案改变一个或多个随机选择的残基。无论其如何生成，可表达突变多肽并筛选期望性质。该突变可在数量上或性质上改变生物学活性。量变的实例包括增加、降低或消除该活性。质变的实例包括改变抗体的抗原特异性。也可将突变引入核酸而不显著改变其编码多肽的生物学活性。例如，可进行引起非必需氨基酸残基处氨基酸替换的核苷酸替换。

在另一方面本文提供包含编码本文多肽或其部分的核酸的载体。载体的实例包括但是不限于质粒、病毒载体、非游离基因哺乳动物载体和表达载体，例如重组表达载体。

本文的重组表达载体可包含适于该核酸在宿主细胞中表达的形式的本文编码双特异性抗体的核酸。该重组表达载体包括一个或多个调控序列，基于用于表达的宿主细胞进行筛选，其与该预表达的核酸序列可操作性相连。调控序列包括引导核苷酸序列在多个种类宿主细胞中组成型表达的(例如，SV40早期基因增强剂、劳斯氏肉瘤病毒启动子和细胞巨化病毒启动子)，引导仅在某些宿主细胞中核苷酸序列的表达的(例如，组织特异调控序列，参见Voss等，1986，Trends Biochem.Sci.11:287，Maniatis等，1987，Science 236:1237，其完整内容以参考形式并于本文)以及引导核苷酸序列响应具体处理或条件的诱导型表达的(例如，哺乳动物细胞中的金属硫堇启动子和原核和真核系统二者中的四环霉素反应(tet-sesponsive)启动子和/或链霉素反应启动子(同前))。本领域技术人员应理解表达载体的设计取决于例如用于转化的宿主细胞的选择、所需蛋白表达水平等因素。本文的表达载体可引入宿主细胞，藉此生产由本文所述核酸编码的蛋白或肽，包括融合蛋白或肽。

另一方面，本文提供可引入本文表达载体的宿主细胞。宿主细胞可为任何原核或真核细胞。原核宿主细胞包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如大肠杆菌或杆菌。更高级的真核细胞包括昆虫细胞、酵母细胞以及哺乳动物源的确立细胞系。适当哺乳动物宿主细胞系的实例包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或它们的衍生物例如Veggie CHO和在无血清培养基中生长的相关细胞系(参见Rasmussen等，1998，Cytotechnology 28:31)或CHO株DXB-11，其缺失DHFR(参见Urlaub等，1980，Proc.Natl.Acad,Sci.USA 77:4216-20)。其它CHO细胞系包括CHO-K1(ATCC#CCL-61)、EM9(ATCC#CRL-1861)，和UV20(ATCC#CRL-1862)，其它宿主细胞包括猴肾细胞的COS-7系(ATCC#CRL-1651)(参见Gluzman等，1981，Cell 23:175)、L细胞、C127细胞、3T3细胞(ATCC CCL-163)，AM-1/D细胞(描述于美国专利序列号6210924)、HeLa细胞、BHK(ATCC CRL-10)细胞系、来源于非洲绿猴肾细胞系CV1的CV1/EBNA细胞系(ATCC CCL-70)(参见McMahan等，1991，EMBO J.10:2821)、人胚肾细胞例如293，293EBNA或MSR 293、人上皮A431细胞、人C010205细胞、其它经转化灵长动物细胞系、正常二倍体细胞、来源于初生组织体外培养物的细胞株、初移植体、HL-60、U937、HaK或Jurkat细胞。用于细菌、真菌、酵母和哺乳细胞宿主的适当克隆和表达载体描述于Pouwels等(CloningVectors:A Laboratory Manual,Elsevier,1985)。

可通过传统转化或转染技术将载体DNA引入原核或真核细胞中。对于稳定的哺乳动物转染而言，取决于使用的表达载体和转染技术，已知只有一小部分细胞可将外源DNA鏊合入它们的基因组中。为了鉴定和筛选这些整合子，通常将编码筛选标记(例如抗生素抗性)的基因与所关注基因一起引入宿主细胞。优选的筛选标记包括可赋予药物(如G418、潮霉素和甲氨喋呤)抗性的那些。在其它方法中可通过药物筛选鉴别包含被引入核酸的稳定转染细胞(例如，整合了筛选基因的细胞可存活，而其它细胞则死亡)。

可在提高多肽表达的条件下培养已转化细胞，可通过常规蛋白纯化方法回收多肽。一种该纯化方法描述于下文实施例。预用于本文的多肽包括基本同源的重组哺乳动物细胞表达的双特异性抗体，其基本不含污染性内源材料。

适应症

本文的双特异性抗体可以用于治疗多种与非正常和恶化B细胞相关疾病和病症。因为本文的双特异性抗体通过招募T细胞攻击人CD19或人CD20阳性的B细胞起作用，所以由B细胞诱发的多种疾病均在其适用范围内，包括但不局限于以下三大类。第一类：恶性B细胞引起的白血病，此类疾病以B细胞增殖、凋亡、分化失控为特征，包括B细胞急性白血病、B细胞慢性白血病、非霍奇金淋巴瘤、毛细胞性淋巴瘤等等。这些疾病都是潜在的本文的双特异性抗体适应症。第二类：非正常B细胞引起的自体免疫类疾病。此类疾病中非正常的B细胞丧失了正常的抗原耐受性，异常的表达针对自体分子的抗体(auto antibody),这些B细胞还可以通过释放促炎症的细胞激素和化学激素，诱发人体的验证反应。此类型的疾病有超过80种，包括了为人熟知的多发性硬化症，风湿性关节炎，系统性红斑狼疮等等，这些疾病也在本文的双特异性抗体潜在适应症的范围内。第三类：器官移植引起的慢性排异反应，此病症来源于器官接收者的免疫系统持续排斥接受的器官，选择性对B细胞进行耗竭治疗有利于缓解这种排异反应，因此也是本文的双特异性抗体的潜在适应症。

治疗方法

一方面，治疗受试者的方法，包括给予治疗剂量的本文提供的双特异性抗体。本文中，术语“受试者”指哺乳动物，包括人类，可与术语“患者”交替使用。鼠源抗体或其人源化抗体可用于治疗和控制患者体内与非正常和恶化B细胞相关的疾病或症状。术语“治疗”包括减轻或预防至少一种症状或病症的其它方面，或者减轻疾病严重性，等等。本文的双特异性抗体不需要产生完全治愈的效果，或根除疾病的所有症状或表现，即可构成有效治疗剂。如相关领域所公认，作为治疗剂的药物可减少给定疾病状态的严重程度，但不需消除疾病的所有表现即可被认为是有效的治疗剂。相似地，预防给药治疗不需在预防症状出现上完全有效即可构成有效预防剂。只减少疾病的影响(例如，通过减少其症状的数量或严重度，或通过提高另一治疗效果，或通过产生另一有效作用)，或者减少受试者中疾病发生或加重的可能性就已经足够。本文的一个实施方案涉及包含以足以诱导反应具体病症严重性的指示剂高于基线水平的持续改善的量和时间给予患者抗体的方法。

如相关领域所理解，将包含本文的抗体的药用组合物以对适应症恰当的方式给予病人。药物组合物可采用任意适当技术包括但不限于肠道外、局部或吸入给药。如果是注射，可通过例如关节内、静脉内、肌肉内、损伤区内、腹膜内或皮下途径，以快速注射或连续输注给予药用组合物。可考虑例如在疾病或损伤部位局部给药，如透皮给药和埋植剂持续释放给药。吸入给药包括例如鼻腔或口腔吸入、采用喷雾剂、以气雾剂形式吸入抗体等等。其它选择包括口腔制剂包括片剂、糖浆剂或锭剂。

以包含一个或更多其它组分例如生理学可接受载体、辅料或稀释剂的组合物形式给予本文的抗体是有利的。组合物可任选额外包含一个或更多如下所述的生理学活性剂。在多个具体实施方案中，组合物包含除一个或更多本文的T细胞双特异性抗体之外的一个、两个、三个、四个、五个或六个生理学活性剂。

在一个实施方案中，药物组合物包含本文的双特异性抗体以及一个或更多选自以下的物质：pH适合于抗体的缓冲液、抗氧化剂例如抗坏血酸、低分子量多肽(例如含少于10个氨基酸的多肽)、蛋白质、氨基酸、糖例如糊精、络合物例如EDTA、谷胱甘肽、稳定剂和辅料。根据适当工业标准，也可加入防腐剂。可使用适当辅料溶液作为稀释剂将组合物配制成冻干粉末。适当组分在所用剂量和浓度下对受者无毒。可用于药物处方组分的进一步实例见Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版(1980)和20版(2000)，MackPublishing Company提供医学从业者使用的试剂盒，其包括一种或更多本文的抗体以及治疗本文讨论任何病症的标签或其它说明。在一个实施方案中，试剂盒包括以上述组合物形式装在一个或多个管型瓶中的一种或多种抗体的无菌制剂。

给药剂量和频率可根据以下因素而改变：给药途径、所用具体抗体、所治疾病的性质和严重度、症状为急性还是慢性以及患者的体积和总体症状。可通过本领域熟知的方法确定适当剂量，例如在临床试验中包括剂量放大研究。

本文所述的双特异性抗体可在例如一段时间内按规律间隔给药一次或多次。对于治疗慢性症状，长期治疗通常最有效。但是，对于治疗急性症状，短期给药例如从一周至六周就已足够。通常，给予人类抗体直至患者表现出所选体征或指示剂高于基线水平的医学相关改善度为止。

本文提供的治疗方案的一个实例包括以适当剂量一周一次皮下注射抗体治疗B细胞相关病症。可持续每周或每月给予抗体直到达到所需结果例如病人症状消退。可按需要重新治疗，或者，可选择地，给予维持剂量。

本文方法和组合物的具体实施方案涉及使用例如一个本文的双特异性抗体、两个或更多本文双特异性抗体、本文的双特异性抗体和其它非本文的抗体、或者本文的双特异性抗体和体外培养的各类型细胞(例如体外培养的CIK细胞)等不同情形。在进一步的实施方案中，单独或与其它用于治疗使患者痛苦的症状的药剂组合给予抗体，这些药剂的实例包括蛋白质以及非蛋白质药物。当联合给予多种药物时，如本领域所熟知其剂量应相应调整。“联合给药”组合疗法不限于同时给药，也包括在涉及给予患者至少一种其它治疗剂的疗程中至少给予一次抗原和蛋白的治疗方案。

另一方面，本文提供制备治疗B细胞相关病症药剂的方法，其包含施用本文所说双特异性抗体与药学可接受辅料中的混合物。药剂制备方法如上所述。可以通过具有普通技能的内科医生已知有效的任意途径施用本文的双特异性抗体。外周肠胃外属于其中一种此类方法。医学文献中通常将肠胃外施用理解为通过消毒注射器或一些其他机械装置例如注射泵向机体注射剂型。外周肠胃外可以包括静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用途径。本文的双特异性抗体也可以进行经口、直肠、经鼻或下呼吸道途径施用，它们是非肠胃外途径。这些非肠胃外途径中，优选下呼吸道途径和经口途径。

具体实施方式

下面通过具体实施例，并结合附图，对本文的技术方案作进一步的具体说明。

本文中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

步骤一：双特异性抗体的轻重链基因合成及亚克隆

编码IgG分子抗体轻重链的可变区DNA序列以及编码scFv结构域的DNA序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。运用Overlapping PCR的方法，将IgG抗体轻链或者重链的可变区与scFv结构域DNA序列通过多肽接头DNA序列连接，形成的完整的编码融合后轻重链的DNA序列两端通过设计酶切位点Nhe1和Not1的，连接到已装入人轻链或者重链恒定区表达载体PTM5中。上述DNA序列的完整性通过测序验证后，该PTM5质粒可与对应的未融合轻链或者重链质粒组合用于转染。

步骤二：在悬浮HEK293或者CHO宿主细胞系中瞬时表达双特异性抗体

接种悬浮HEK293或者CHO表达细胞系至转瓶中，经过24h at 37℃旋转培养后被用于转染。转染过程中使用Polyethylenimine(PEI)作为转染介质，将其与DNA混合后加入到细胞培养中。PEI和DNA的混合优选配比为1:1至5:1。细胞在接受PEI与DNA混合物后继续37℃旋转培养96h以上以表达抗原结合蛋白，其间向细胞培养中加入0.5％的胰蛋白胨作为表达需要的氨基酸源，最后收集细胞上清用于双特异性抗体的纯化分离。

步骤三：从细胞培养上清中的纯化和制备双特异性抗体

将细胞培养离心去除其中细胞，其上清经过偶联蛋白A配基的亲和层析柱后，用pH2.5-3.5的洗脱液将表达的双特异性抗体从层析柱上洗脱。洗脱管中预置中和缓冲液及时中和洗脱液的低pH值。洗脱后收集的蛋白质溶液对PBS透析。

步骤四：流式细胞仪分析鉴定(FACS)双特异性抗体与人B淋巴细胞瘤Raji细胞的结合

收集10⁵个Raji细胞，加入1.5mL EP管，离心后弃上清，阴性对照样本用流式上样缓冲液(PBS，2％FBS)重悬。阳性处理组细胞每管加200μl，共1μg抗体上清，室温孵育；1500rpm离心，弃上清，用流式上样缓冲液洗一次，再离心，重悬，每孔加入1:50稀释的FITC标记的羊抗人荧光抗体(BD Pharmingen)200μl，室温避光孵育30min；离心，弃上清，再用流式上样缓冲液洗一次，离心，最后用流式上样缓冲液重悬，上机检测。

步骤五：通过酶联免疫反应检测双特异性抗体与CIK细胞的结合

将10⁵个/孔的CIK细胞除去细胞培养上清，PBS洗两遍，加入到96孔板中，100μl100％甲醇4℃固定10min(就写成细胞包被，这不用改)。再加入100μl新鲜配制的0.6％H₂O₂-PBS，室温处理20min，PBS洗涤2遍。经过PBS-1％BSA封闭后，加入T细胞双特异性抗体100μl(3.3μg/孔，1.1μg/孔，0.33μg/孔，0.11μg/孔，0.033μg/孔)，37℃孵育90min。多次洗涤后，每孔加入1：5000稀释的GxH-HRP二抗(Sigma，市售)100μl，阳性对照组每孔加入1：5000稀释的GxM-HRP二抗(Sigma，市售)100μl，37℃孵育30min。洗涤5次后,每孔加入100μl TMB显色底物，37℃反应15min，加入50ul 2M H₂SO₄终止，读取OD450值。阳性对照为OKT3(Abcam，市售)；阴性对照为PBS。

步骤六：PBMC细胞的分离

取新鲜抗凝血，2000rpm离心10min，留上清自体血浆，56℃水浴45分钟后3000rmp20分钟去沉淀置4℃待用。补加同等体积PBS于剩余细胞液中，轻轻吹打混匀后小心的加在淋巴细胞分离液上(不能将分离层打破，红细胞夜：分离液＝5:3)，600g离心20分钟。细胞液分为4层，吸取其中的白膜层置于50mL的离心管中，加入PBS至50mL,混匀后离心，1800rpm6分钟，去上清，重复洗涤2遍。根据实验需要用适当PBS重悬细胞沉淀后即可进行计数等后续实验。

步骤七：CIK细胞的培养

用CIK细胞启动培养液(无血清X-Vivo细胞培养液+1000U/mL IFN-γ)将每份新分离的PBMC细胞补满30mL，加到75cm²培养瓶中，置于饱和湿度、37℃、5.0％CO₂培养箱培养。培养24小时后，加入CIK细胞刺激因子混合液1mL(无血清X-Vivo细胞培养液+50ng/mL CD3单克隆抗体、300U/mL IL-2、100U/mL IL-1α)，继续置于饱和湿度、37℃、5.0％CO₂培养箱内培养。接下来的步骤根据CIK细胞的生长情况决定补液(无血清X-Vivo培养液+300U/mL IL-2±2％自体血浆)、分瓶的事宜，基本上要维持细胞在1-2×10⁶的浓度左右生长。最后用流式细胞仪FC500对收集的CIK细胞进行表型检测，包括：CD3，CD4，检测这些细胞表面抗原在CIK细胞的表达情况。

步骤八：双特异性抗体介导的CIK或者PBMC细胞杀伤肿瘤细胞的检测

收集Raji单细胞悬液于无菌1.5mL EP管中，1000rpm，4min离心去上清，1mL PBS洗一遍，加终浓度为100nM的Calcein AM(货号C1430，ThermoFisher)1mL，37℃细胞培养箱孵育30min后，离心去上清，1mL PBS洗一遍，再加2.5mL完全培养基重悬，50μl/well(即2×10⁴cell/well)加至96孔细胞培养板中培养过夜。按实验设计的效靶比加入培养的CIK或PBMC细胞，100μl/孔，设置对照孔，无需加入CIK或PBMC细胞的孔则用相同体积的培养基补入。加入杀伤细胞的同时按实验设计加入相应抗体，50μl/孔，无需加入抗体的孔则用相同体积的培养基补入，继续共培养。根据实验的选择，8h至48h(时间因需而定)内取出96孔板，将每孔细胞均转入96孔U型板，1200rpm，3min离心去上清，加200μl 2％FBS-PBS重悬，在流式细胞仪Guava 6HT上读取数据。每孔读取50000个细胞，计算Calcein AM阳性细胞的个数及其与阴性对照的百分比。检测结果见图1，结果显示双特异性抗体介导CIK或PBMC细胞杀伤肿瘤细胞具有良好的杀伤效果，其最大杀伤效率和半杀伤浓度都明显强于抗CD19的单克隆抗体。

步骤九：检测双特异性抗体刺激PBMC中T细胞增殖的能力

根据步骤七分离新鲜的PBMC细胞，用无血清X-Vivo细胞培养液(含有1000U/mLIFN-γ)稀释1×10⁶/mL的密度，共2mL接种于六孔板中。实验分为三组，每组为复孔。培养24小时后，实验组加入用无血清X-Vivo细胞培养液稀释的50ng/mL的T细胞双特异型抗体，阳性对照组加入无血清X-Vivo细胞培养液稀释的50ng/mL CD3单克隆抗体、300U/mL IL-2、100U/mL IL-1α，阴性对照组加入等体积的无血清X-Vivo细胞培养液。在培养4天和7天后，对细胞密度计数，并在7天后从每孔中取样根据与步骤四描述的流式细胞仪荧光检测法检测每孔中CD3阳性细胞的比例并对比。

步骤十：双特异性抗体对人B淋巴细胞瘤Raji细胞皮下异种移植肿瘤模型的体内药效学研究

将将1×10⁷个/0.2mL Raji细胞皮下接种于每只NOD/SCID小鼠的右上背，共接种16只。肿瘤平均体积达到约100-200mm³时开始分组给药。实验分为三个组开始，以每周三次的频率共给药四次，通过I.V.注射，对照组一每只小鼠给予0.2mL的PBS，对照组二每只小鼠给予1×10⁷个CIK细胞，体积0.2mL，实验组每只小鼠给予1×10⁷个CIK细胞、0.125nmol的T细胞双特异性抗体，体积0.2mL。每周两次观察肿瘤的生长情况并量取肿瘤的长径和短径以V＝0.5a×b²计算肿瘤的体积，a和b分别表示肿瘤的长径和短径。实验结束时，剥瘤、称重和拍照。化合物的抑瘤疗效用相对肿瘤增殖率T/C(％)、肿瘤消退率TRR(％)及肿瘤生长抑制率IR(％)评价，反映肿瘤生长抑制情况，并总结作图。

步骤十一：双特异性抗体对人B淋巴细胞瘤Raji细胞原位异种移植肿瘤模型的体内药效学研究

将将1×10⁶个/0.2mL Raji细胞通过尾静脉给予每只NOD/SCID小鼠，共接种16只。待肿瘤细胞适应48h后开始分组给药。实验分为三个组开始，以每天一次的连续共给药七次，通过I.V.注射，对照组一每只小鼠给予0.2mL的PBS，对照组二每只小鼠给予1×10⁷个CIK细胞，体积0.2mL，实验组每只小鼠给予1×10⁷个CIK细胞、0.125nmol的双特异性抗体，体积0.2mL。每天监测动物的健康状况及死亡情况，例行检查包括观察肿瘤细胞对动物日常行为表现的影响如毛发，行为活动(瘫痪等)，摄食摄水量，体重变化(前期每周测量2次体重，后期隔天或者每天测量)，外观体征或其它不正常情况。实验指标是考察肿瘤细胞在动物体内的生长情况。定义接种后到小鼠死亡的天数为其生存期。记录每只小鼠的生存期，做Kaplan-Meier生存曲线并算出每组的生存中位数(Median Survival Time,MST)，以及给药组相对对照组所延长的生存期(Increase in Life Span,MST)。

以上所述的实施例只是本文的一种较佳的方案，并非对本文作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

本文的双特异性抗体能够顺利在哺乳细胞表达系统如HEK293或CHO中表达，分子量大小符合预期，无明显的降解(图1)。这些双特异性抗体具有与人CD3和人CD19或人CD20两者之一结合的能力，图2(实验步骤参照步骤四)提供了其与Raji细胞表面的CD19分子结合的流式细胞仪的荧光显色数据，其中Raji细胞是一个B细胞淋巴瘤细胞株。实验步骤五提供其与CIK细胞表面的CD3分子结合的酶联免疫反应的数据。其中CIK细胞为细胞激素诱导的杀伤型T细胞，其诱导和扩培如步骤六中所述。这些数据显示了这些双特异性抗体针对两个抗原的亲和力的完整性。然后，通过针对Raji细胞的T细胞毒性实验(实验步骤参照步骤八)，显示以不同E:T(效应细胞对靶细胞的比例)将CIK细胞与Raji细胞混合培养，加入不同浓度本文的双特异性抗体后CIK细胞将对Raji细胞造成杀伤效果。在E:T为10：1的情况下，双特异性抗体的半杀伤浓度约为1ng/mL(图3)。在新鲜提取的PBMC中，我们加入本文的双特异性抗体对其刺激T细胞增殖的作用进行检测(步骤九)。在接下来的实验中，本文的双特异性抗体被连同CIK细胞同时施用于皮下接种Raji细胞成瘤的NOD/SCID小鼠中(步骤十)，以对其对抗肿瘤生长的能力进行考察。在另一个体内药效实验中(步骤十一)，Raji细胞通过原位注射接种于NOD/SCID小鼠体内，以此小鼠模型检测双特异型抗体的抗肿瘤生长的能力。综上所述，本文的双特异型抗体分子构型稳定，并在体外和体内均显示了优越的T细胞依赖的针对B细胞的细胞毒性，并且在同浓度下刺激细胞激素的释放的能力要低于如OKT3和Rituxan等已经药用的成熟抗体，处于可接受范围。

<110> 杭州鸿运华宁生物医药工程有限公司

<120> 一种能与人CD19或CD20和人CD3结合的双特异性抗体及其应用

<130> 2017

<160> 31

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> Synthetic (人工序列）

<400> 1

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 2

<211> 15

<212> PRT

<213> Synthetic (人工序列）

<400> 2

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 3

<211> 20

<212> PRT

<213> Synthetic (人工序列）

<400> 3

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser

20

<210> 4

<211> 25

<212> PRT

<213> Synthetic (人工序列）

<400> 4

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

20 25

<210> 5

<211> 22

<212> PRT

<213> Synthetic (人工序列）

<400> 5

Ser Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ala Ser Ser Gly Ser

1 5 10 15

Gly Ser Ala Thr Gly Ser

20

<210> 6

<211> 15

<212> PRT

<213> Synthetic (人工序列）

<400> 6

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 7

<211> 18

<212> PRT

<213> Synthetic (人工序列）

<400> 7

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Ser

<210> 8

<211> 18

<212> PRT

<213> Synthetic (人工序列）

<400> 8

Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly

1 5 10 15

Val Asp

<210> 9

<211> 20

<212> PRT

<213> Synthetic (人工序列）

<400> 9

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser

20

<210> 10

<211> 22

<212> PRT

<213> Synthetic (人工序列）

<400> 10

Ser Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ala Ser Ser Gly Ser

1 5 10 15

Gly Ser Ala Thr Gly Ser

20

<210> 11

<211> 108

<212> PRT

<213> Mus musculus （小鼠）

<400> 11

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Ala Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 12

<211> 122

<212> PRT

<213> Mus musculus （小鼠）

<400> 12

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp

100 105 110

Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 13

<211> 106

<212> PRT

<213> Mus musculus （小鼠）

<220>

<221> 可突变位置

<222> (87)..(87)

<223> 第87位的Xaa可以是Cys或Ser

<400> 13

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Xaa Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr

85 90 95

Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn

100 105

<210> 14

<211> 119

<212> PRT

<213> Mus musculus （小鼠）

<400> 14

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 15

<211> 107

<212> PRT

<213> Mus musculus （小鼠）

<220>

<221> 可突变位置

<222> (107)..(107)

<223> 第107位的Xaa可以是Thr或Lys

<400> 15

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Xaa

100 105

<210> 16

<211> 120

<212> PRT

<213> Mus musculus （小鼠）

<400> 16

Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr

20 25 30

Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 17

<211> 106

<212> PRT

<213> Mus musculus （小鼠）

<400> 17

Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 18

<211> 122

<212> PRT

<213> Mus musculus （小鼠）

<400> 18

Gln Ala Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Arg Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp

100 105 110

Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala

115 120

<210> 19

<211> 107

<212> PRT

<213> Mus musculus （小鼠）

<400> 19

Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile

20 25 30

His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 20

<211> 121

<212> PRT

<213> Mus musculus （小鼠）

<400> 20

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly

100 105 110

Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala

115 120

<210> 21

<211> 111

<212> PRT

<213> Mus musculus （小鼠）

<220>

<221> 可突变位置

<222> (3)..(3)

<223> 第3位的Xaa可以是Leu或Gln

<400> 21

Asp Ile Xaa Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp

20 25 30

Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser Thr

85 90 95

Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 22

<211> 124

<212> PRT

<213> Mus musculus （小鼠）

<220>

<221> 可突变位置

<222> (119)..(119)

<223> 第119位的Xaa可以是Ser或Thr

<400> 22

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Xaa Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 23

<211> 112

<212> PRT

<213> Mus musculus （小鼠）

<400> 23

Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Ile Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His

85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105 110

<210> 24

<211> 121

<212> PRT

<213> Mus musculus （小鼠）

<400> 24

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Ile Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Arg Val Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 25

<211> 104

<212> PRT

<213> Mus musculus （小鼠）

<400> 25

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Gly Val Asn Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Gly Ser Tyr Thr Phe Gly

85 90 95

Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100

<210> 26

<211> 120

<212> PRT

<213> Mus musculus （小鼠）

<400> 26

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Arg Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Asn

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Val Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ser Asn Pro Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 27

<211> 106

<212> PRT

<213> Homo sapiens（人）

<400> 27

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

1 5 10 15

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

20 25 30

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

35 40 45

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

50 55 60

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

65 70 75 80

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

85 90 95

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 28

<211> 106

<212> PRT

<213> Homo sapiens（人）

<400> 28

Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser

1 5 10 15

Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp

20 25 30

Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro

35 40 45

Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn

50 55 60

Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys

65 70 75 80

Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val

85 90 95

Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

100 105

<210> 29

<211> 330

<212> PRT

<213> Homo sapiens （人）

<220>

<221> 可突变位置

<222> (116)..(116)

<223> 第116位的Xaa可以是Glu或Pro

<220>

<221> 可突变位置

<222> (117)..(117)

<223> 第117位的Xaa可以是Leu或Val

<220>

<221> 可突变位置

<222> (118)..(118)

<223> 第118位的Xaa可以是Leu或Ala

<220>

<221> 可突变位置

<222> (133)..(133)

<223> 第133位的Xaa可以是Gln或者Thr

<220>

<221> 可突变位置

<222> (180)..(180)

<223> 第180位的Xaa可以是Asn或者Ala

<220>

<221> 可突变位置

<222> (216)..(216)

<223> 第216位的Xaa可以是Glu或者Ala

<220>

<221> 可突变位置

<222> (311)..(311)

<223> 第311位的Xaa可以是Met或者Leu

<220>

<221> 可突变位置

<222> (330)..(330)

<223> 第330位的Xaa可以是Lys或者缺失

<400> 29

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Xaa Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Xaa Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Xaa Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Xaa Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Xaa His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Xaa

325 330

<210> 30

<211> 326

<212> PRT

<213> Homo sapiens （人）

<220>

<221> 可突变位置

<222> (147)..(147)

<223> 第147位的Xaa可以是His或Gln；

<220>

<221> 可突变位置

<222> (176)..(176)

<223> 第176位的Xaa可以是Asn或Ala；

<220>

<221> 可突变位置

<222> (188)..(188)

<223> 第188位的Xaa可以是Val或Leu；

<220>

<221> 可突变位置

<222> (209)..(209)

<223> 第209位的Xaa可以是Ala或Ser；

<220>

<221> 可突变位置

<222> (210)..(210)

<223> 第210位的Xaa可以是Pro或Ser；

<220>

<221> 可突变位置

<222> (326)..(326)

<223> 第326位的Xaa可以是Lys或者缺失

<400> 30

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

115 120 125

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

130 135 140

Val Ser Xaa Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

145 150 155 160

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Xaa

165 170 175

Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Xaa His Gln Asp Trp

180 185 190

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

195 200 205

Xaa Xaa Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu

210 215 220

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

225 230 235 240

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

245 250 255

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

260 265 270

Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

275 280 285

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

290 295 300

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

305 310 315 320

Ser Leu Ser Pro Gly Xaa

325

<210> 31

<211> 327

<212> PRT

<213> Homo sapiens （人）

<220>

<221> 可突变位置

<222> (108)..(108)

<223> 第108位的Xaa可以是Ser或Pro；

<220>

<221> 可突变位置

<222> (114)..(114)

<223> 第114位的Xaa可以是Phe或Ala；

<220>

<221> 可突变位置

<222> (115)..(115)

<223> 第115位的Xaa可以是Leu或Ala；

<220>

<221> 可突变位置

<222> (177)..(177)

<223> 第177位的Xaa可以是Aln或Ala；

<220>

<221> 可突变位置

<222> (327)..(327)

<223> 第327位的Xaa可以是Lys或者缺失

<400> 31

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Xaa Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Glu Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Xaa Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

195 200 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

225 230 235 240

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Xaa

325

<210> 32

<211> 107

<212> PRT

<213> Synthetic (人工序列）

<400> 32

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

Asn Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65 70 75 80

Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr Arg

100 105

<210> 33

<211> 119

<212> PRT

<213> Synthetic (人工序列）

<400> 33

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Val

50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Thr Asp Lys Ser Lys Ser Thr Ala Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 34

<211> 119

<212> PRT

<213> Synthetic (人工序列）

<400> 34

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Val

50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Thr Asp Lys Ser Lys Ser Thr Ala Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115

Claims

1.一种能够与人CD19或人CD20和人CD3结合的双特异性抗体，其结构特征在于：所述的双特异性抗体包含单链抗体结构域(scFv结构域)、免疫球蛋白G结构域(IgG)和结构域间肽接头序列(Link₁)，这三者通过以下方式中的一种融合形成所述的双特异性抗体：

其中:N’代表多肽链的氨基端,C’代表多肽链的羧基端,scFv代表单链抗体结构域，IgG代表免疫球蛋白G结构域,V_L代表免疫球蛋白G结构域的轻链可变区,C_L代表免疫球蛋白G结构域的轻链恒定区,V_H代表免疫球蛋白G结构域的重链可变区,C_H1代表免疫球蛋白G结构域的重链恒定区1,C_H2代表免疫球蛋白G结构域的重链恒定区2,C_H3代表免疫球蛋白G结构域的重链恒定区3,及Link₁代表结构域间肽接头。

2.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述的结构域间肽接头(Link₁)的序列选自以下序列之一：SEQ NO ID:1、SEQ NO ID:2、SEQ NO ID:3、SEQ NO ID:4、及SEQ NO ID:5。

3.根据权利要求1或2所述的双特异性抗体，其中所述的scFv结构域包含轻链可变区、重链可变区和结构域内肽接头序列，这三者通过以下方式中的一种组合形成scFv结构域：

a.通过结构域内肽接头序列将轻链可变区的羧基端和重链可变区的氨基端连接：N’-V_SL-Link₂-V_SH-C’；及

b.通过结构域内肽接头序列将重链可变区的羧基端和轻链可变区的氨基端连接：N’-V_SH-Link₂-V_SL-C’；

4.根据权利要求3所述的双特异性抗体，其中所述结构域间内肽接头(Link₂)的序列选自以下序列之一：SEQ NO ID:6、SEQ NO ID:7、SEQ NO ID:8、SEQ NO ID:9、及SEQ NO ID:10。

5.根据权利要求1至4中任一项的双特异性抗体，其中所述scFv结构域包含以下方案之一的氨基酸序列：

c.(a)的轻链可变区序列和(b)的重链可变区序列的组合。

6.根据权利要求5所述的双特异性抗体，其中所述抗体的scFv结构域包含以下方案之一的氨基酸序列组合方式：SEQ NO ID:11与SEQ NO ID:12的组合(L1H1)、SEQ NO ID:13与SEQ NO ID:14的组合(L2L2)、SEQ NO ID:32与SEQ NO ID:33的组合(L9H9)、及SEQ NO ID:32与SEQ NO ID:34的组合(L9H10)。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的双特异性抗体，其中所述的抗体的IgG结构域包含以下方案之一的氨基酸序列：

a.IgG结构域的轻链可变区序列选自以下序列之一：SEQ NO ID:15、SEQ NO ID:17、SEQNO ID:19、SEQ NO ID:21、SEQ NO ID:23、及SEQ NO ID:25；

b.IgG结构域的重链可变区序列选自以下序列之一：SEQ NO ID:16、SEQ NO ID:18、SEQNO ID:20、SEQ NO ID:22、SEQ NO ID:24、及SEQ NO ID:26；及

c.(a)的轻链可变区序列和(b)的重链可变区序列的组合。

8.根据权利要求7所述的双特异性抗体，其中所述抗体的IgG结构域包含以下方案之一的氨基酸序列组合方式：SEQ NO ID:15与SEQ NO ID:16的组合(L3H3)、SEQ NO ID:17与SEQNO ID:18的组合(L4H4)、SEQ NO ID:19与SEQ NO ID:20的组合(L5H5)、SEQ NO ID:21与SEQNO ID:22的组合(L6H6)、SEQ NO ID:23与SEQ NO ID:24的组合(L7H7)、及SEQ NO ID:25与SEQ NO ID:26的组合(L8H8)。

9.根据权利要求1至4中任一项的双特异性抗体，其中所述scFv结构域包含以下方案之一的氨基酸序列：

c.(a)的轻链可变区序列和(b)的重链可变区序列的组合。

10.根据权利要求9所述的双特异性抗体，其中所述抗体的scFv结构域包含以下方案之一的氨基酸序列组合方式：SEQ NO ID:15与SEQ NO ID:16的组合(L3H3)、SEQ NO ID:17与SEQ NO ID:18的组合(L4H4)、SEQ NO ID:19与SEQ NO ID:20的组合(L5H5)、SEQ NO ID:21与SEQ NO ID:22的组合(L6H6)、SEQ NO ID:23与SEQ NO ID:24的组合(L7H7)、及SEQ NOID:25与SEQ NO ID:26的组合(L8H8)。

11.根据权利要求1至4,9及10中任一项所述的双特异性抗体，其中所述的抗体的IgG结构域包含以下方案之一的氨基酸序列：

b.IgG结构域的重链可变区序列选自以下序列之一：SEQ NO ID:12、SEQ NO ID:14、SEQNO ID:33、及SEQ NO ID:34；及

c.(a)的轻链可变区序列和(b)的重链可变区序列的组合。

12.根据权利要求11所述的双特异性抗体，其中所述抗体的IgG结构域包含以下方案之一的氨基酸序列组合方式：SEQ NO ID:11与SEQ NO ID:12的组合(L1H1)、SEQ NO ID:13与SEQ NO ID:14的组合(L2L2)、SEQ NO ID:32与SEQ NO ID:33的组合(L9H9)、及SEQ NO ID:32与SEQ NO ID:34的组合(L9H10)。

13.根据权利要求7,8,11及12中任一项所述的双特异性抗体，其中所述的抗体蛋白质的IgG分子进一步包含以下方案之一的氨基酸序列：

a.选自以下序列之一的轻链恒定区氨基酸序列：SEQ NO ID:27及SEQ NO ID:28；

b.选自以下序列之一的重链恒定区氨基酸序列：SEQ NO ID:29、SEQ NO ID:30、及SEQNO ID:31；及

c.(a)的轻链恒定区序列和(b)的重链恒定区序列的组合。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的双特异性抗体，其中所述的双特异性抗体是一种能够与人CD19和人CD3结合的双特异性抗体。

15.根据权利要求1至13中任一项所述的双特异性抗体，其中所述的双特异性抗体是一种能够与人CD20和人CD3结合的双特异性抗体。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的双特异性抗体，其中所述的双特异性抗体是鼠源抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、重组抗体、IgGl抗体、IgG2抗体、IgG3抗体、或IgG4抗体。

17.一种多核苷酸，其编码权利要求1至16中任一项所述的双特异性抗体。

18.一种载体，其包含权利要求17所述的多核苷酸。

19.一种宿主细胞，其包含权利要求18所述的载体。

20.一种药用组合物，其包含与药用可接受载体混合的权利要求1至16中任一项所述的双特异性抗体。

21.权利要求1至16中任一项所述的双特异性抗体在制备用于预防或治疗B细胞性白血病的药物中的用途。

22.根据权利要求21所述的用途,其中所述的白血病是急性白血病。

23.根据权利要求21所述的用途,其中所述的白血病是慢性白血病。

24.权利要求1至16中任一项所述的双特异性抗体在制备用于预防或治疗非霍奇金淋巴瘤的药物中的用途。

25.权利要求1至16中任一项所述的双特异性抗体在制备用于预防或治疗B细胞引起的自体免疫疾病的药物中的用途。

26.根据权利要求25所述的用途,其中所述的自体免疫疾病是风湿性关节炎、多发性硬化症、或系统性红斑狼疮。

27.权利要求1至16中任一项所述的双特异性抗体在制备用于预防或治疗器官移植带来的排异反应及其相关症状的药物中的用途。