CN109776683A

CN109776683A - 一种双特异性抗体及其制备方法与应用

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Publication number: CN109776683A
Application number: CN201910209330.4A
Authority: CN
Inventors: 袁清安; 孟庆武; 白丽莉; 赵立坤; 李延虎
Original assignee: Ikest (beijing) Pharmaceutical Science And Technology Development Co Ltd
Current assignee: Ikest (beijing) Pharmaceutical Science And Technology Development Co Ltd
Priority date: 2019-03-19
Filing date: 2019-03-19
Publication date: 2019-05-21
Anticipated expiration: 2039-03-19
Also published as: EP3882276A4; JP7262597B2; US20220002408A1; JP2022513383A; CN109776683B; WO2020186974A1; EP3882276A1

Abstract

本发明涉及一种双特异性抗体及其制备方法与应用。本发明的双特异性抗体包括单克隆抗体单元和单链抗体单元；其中，单克隆抗体单元为2个完整的轻链‑重链对，特异性结合肿瘤细胞表面抗原；单链抗体单元包括2个单链抗体，单链抗体包括重链可变区和轻链可变区，特异性结合免疫细胞表面抗原；本发明提供的双特异性抗体为通过如下任意一种方式连接而成的对称结构：(1)2个单链抗体的C端分别通过连接肽与单克隆抗体的2条重链的N端连接；(2)2个单链抗体的N端分别通过连接肽与单克隆抗体的2条重链的C端连接。本发明的双特异性抗体能够同时结合免疫细胞和肿瘤细胞，介导导向性免疫反应，有效杀伤肿瘤细胞。

Description

一种双特异性抗体及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物技术及免疫学技术领域，具体涉及一种结合CD19和CD3的双特异性抗体及其制备方法与应用。

背景技术

抗体药物是以细胞工程技术和基因工程技术为主体的抗体工程技术制备的生物大分子药物，具有特异性高、性质均一、可针对特定靶点定向制备等优点。单克隆抗体在临床上主要应用于以下三个方面：肿瘤治疗、免疫性疾病治疗以及抗感染治疗。其中，肿瘤治疗是目前单克隆抗体应用最为广泛的领域，目前已经进入临床试验和上市的单克隆抗体产品中，用于肿瘤治疗的产品数量占比大概为50％。单克隆抗体治疗肿瘤是一种针对病变细胞特异靶点刺激免疫系统杀伤靶细胞的免疫疗法，为了增强抗体的效应功能，特别是杀伤肿瘤细胞的效果，人们尝试多种方法改造抗体分子，双特异性抗体是改善抗体治疗效果的发展方向之一，现已成为抗体工程研究领域的热点。

双特异性抗体(bispecific antibody，BsAb)是含有两种能够特异性识别并结合不同抗原或不同抗原位点的人工抗体。如果这两种抗原位于不同的细胞表面，则这种双特异性抗体能在这两种抗原分子之间架起桥梁，从而形成细胞之间的交联，介导细胞产生导向性的效应功能。BsAb在生物医学、特别是在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景。用于免疫治疗的双特异性抗体(免疫双抗)是含有2种特异性细胞受体抗原结合位点的人工抗体，能在病变细胞(靶细胞)和功能细胞(免疫细胞)之间架起桥梁，激发具有导向性的免疫反应。通过BsAb介导免疫细胞(如T细胞，NK细胞等)杀死肿瘤细胞是目前免疫治疗应用研究的热点，其作用机理是BsAb能同时结合肿瘤相关抗原和免疫效应细胞上的靶分子，在活化免疫细胞的同时，直接导向免疫效应细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤。

双特异性抗体可通过多种途径获得，其制备方法主要有：化学偶联法、杂交-杂交瘤法和基因工程抗体制备法。化学偶联法是将2个不同的单克隆抗体用化学偶联的方式连接在一起，制备的双特异性单克隆抗体，这是最早的双特异性单克隆抗体。杂交-杂交瘤法是通过细胞杂交法或者三元杂交瘤的方式产生双特异性单克隆抗体，这些细胞杂交瘤或者三元杂交瘤是通过建成的杂交瘤融合，或者建立的杂交瘤和从小鼠的淋巴细胞融合而得到的，只能用于生产鼠源的双特异性抗体，因此，其应用受到了极大的限制。而随着分子生物学技术的迅速发展，出现了基因工程人源化或全人源的双特异性抗体的多种构建模式，主要包括双特异性微抗体、双链抗体、单链双价抗体、多价双特异性抗体四类。目前，国际上已有数种基因工程双特异性抗体药物进入临床试验阶段，并显示有较好的应用前景。

T细胞表面的CD3分子由4个亚基组成：δ、ε、γ、ζ，其分子质量分别为18.9k Da，23.1kDa，20.5kDa和18.7kDa，其长度分别为171、207、182、164个氨基酸残基。它们一起组成6条肽链，常与T细胞受体(T cell receptor，TCR)紧密结合形成含有8条肽链的TCR-CD3复合体，其结构示意图见图1。该复合体具有T细胞活化、信号转导以及稳定TCR结构的功能。CD3胞质段含有免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activationmotif，ITAM)，TCR识别并结合由MHC(major histo-compatibility complex)分子提呈的抗原肽，导致CD3的ITAM的保守序列中的酪氨酸残基被T细胞内的酪氨酸蛋白激酶p56lck磷酸化，然后募集其它含有SH2(Scr homology 2)结构域的酪氨酸蛋白激酶(如ZAP-70)。ITAM的磷酸化以及与ZAP-70的结合是T细胞活化信号传导过程早期阶段的重要生化反应之一。因此，CD3分子的功能是转导TCR识别抗原所产生的活化信号。

CD19又名B4或Leu-12，属于免疫球蛋白(Ig)超家族成员，其分子量为95kDa，位于16号染色体的短臂上，含有15个外显子，编码556个氨基酸的I型跨膜糖蛋白，免疫球蛋白基因重组时，其最早在晚期祖B细胞和早期前B细胞中表达。CD19在整个B细胞的发育和成熟过程中均高表达，直至B细胞分化为浆细胞时，表达量下调，其在成熟B细胞中的表达是未成熟细胞的3倍。

CD19通过同时调节B细胞受体(B cell receptor，BCR)依赖和非依赖信号建立B细胞信号阈值，对B细胞的发育、增殖和分化起着重要的调控作用。CD19作为成熟B细胞的表面多分子复合物的主要组成部分，与受体CD21(CD2)，CD81(TAPA-1)以及CD225共同形成复合体，通过调节内源性和受体诱导信号减少触发B细胞分裂及分化所需抗原浓度的阈值。CD81作为伴侣蛋白，提供信号传导途径的分子对接位点，并且调节CD19的表达。CD19通过招募和放大Src家族蛋白酪氨酸激酶的活化，使蛋白酪氨酸激酶(PTK)激活，激活BCR信号。同时当BCR信号激活时，CD19也可通过活化PI3K和下游的Akt激酶，增强BCR信号，促进B细胞的增殖。

CD19在正常及恶性B淋巴细胞中均有表达，被视为B细胞发育过程中一个涵盖阶段较长的最为可靠的表面标记物之一。在正常淋巴组织中，CD19在前B细胞、B细胞和滤泡树突状细胞、套细胞、滤泡间T细胞区的树突状大细胞中表达。此外，通过流式细胞学方法检测，CD19在人体组织分离得到的浆细胞中可以检测到。通常来说，CD19在B淋巴细胞瘤中表达，其中包括B淋巴细胞淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、边缘区淋巴。因此，CD19成为B细胞恶性肿瘤治疗的特异性分子靶点。近年来，靶向CD19的免疫治疗策略在临床前以及临床研究中广泛发展，包括单克隆抗体、双特异性抗体和嵌合抗原受体修饰T细胞(CAR-T)，并取得了显著优于常规小分子化疗方案的临床效果，推动了免疫治疗的进展。

肿瘤的过继免疫治疗是将自体或异体的免疫活性细胞经过体外扩增后输入患者体内，直接杀伤肿瘤细胞，调节和增强机体的免疫功能，主要包括LAK细胞、TIL细胞、激活的T淋巴细胞和CIK细胞的免疫治疗。而免疫疗法只能清除少量的、零散的肿瘤细胞，对于晚期的实体肿瘤疗效有限。故常将其作为一种辅助疗法与手术、化疗、放疗等常规方法联合应用：先用常规方法清扫大量的肿瘤细胞后，再用免疫疗法清除残存的肿瘤细胞，可提高肿瘤综合治疗的效果。过继免疫治疗作为肿瘤综合治疗中的一个新方法，已经与常规手术治疗、放疗、化疗及其他细胞和分子治疗广泛配合，在多种肿瘤的治疗中具有广泛的应用前景。然而，结合双特异性抗体，理想的肿瘤过继免疫治疗应为：双特异性抗体的一端结合免疫细胞的表面抗原(如CD3)，并随之一起输入体内，而双特异性抗体的另一端则能够很好地结合肿瘤细胞的表面抗原；这样，双特异性抗体就能在体内架起肿瘤细胞和免疫细胞之间的桥梁，使免疫细胞集中在肿瘤细胞周围，进而杀伤肿瘤细胞。通过这种方法可有效解决肿瘤细胞的转移和扩散，克服了手术、放化疗三大传统治疗方式后的“不彻底、易转移、副作用大”等弊端。因此，开发高效的、结合肿瘤细胞和免疫细胞的双特异性抗体具有重要意义。

发明内容

为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种结合CD19和CD3、具有特异的靶向作用、能够高效激发导向性免疫反应的双特异性抗体及其制备方法与应用。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：本发明通过对结合CD19和CD3的双特异性抗体的分子结构进行设计和筛选，创造性地发现具有如下对称结构的双特异性抗体与其对应的单克隆抗体和其它结构的双特异性抗体相比，能够更好地保留原抗体的特异性结合能力，同时具有两个单克隆抗体的生物学功能，在生产工艺和药用性能等方面具有明显优势：双特异性抗体包括(a)由2个完整的轻链-重链对组成的单克隆抗体单元，和(b)含有重链可变区和轻链可变区的2个完全相同的单链抗体的单链抗体单元，其中，单链抗体单元对免疫细胞的表面抗原CD3具有特异性结合能力，单克隆抗体单元对肿瘤细胞表面抗原CD19具有特异性结合能力；单链抗体单元通过连接肽连接于单克隆抗体单元的N端或C端。本发明开发了具有上述抗体分子结构的结合CD19和CD3的双特异性抗体，该双特异性抗体具有特异性的靶向作用，并能够高效激发具有导向性的免疫反应，杀伤肿瘤细胞。

具体地，首先，本发明提供一种双特异性抗体，所述双特异性抗体包括(a)单克隆抗体单元和(b)单链抗体单元；所述单克隆抗体单元为2个完整的轻链-重链对，能够特异性结合CD19；所述单链抗体单元包括2个单链抗体(ScFv)，所述单联抗体包括重链可变区和轻链可变区，能够特异性结合CD3；所述双特异性抗体为通过如下任意一种方式连接而成的对称结构：

(1)所述2个单链抗体的N端分别通过连接肽与所述单克隆抗体的2条重链的C端连接；

(2)所述2个单链抗体的C端分别通过连接肽与所述单克隆抗体的2条重链的N端连接。

作为优选，所述连接肽的氨基酸序列为(GGGGX)n，其中，X为Gly或Ser，n为1-4的自然数(即为1、2、3或4)。当采用上述序列的连接肽时，所述双特异性抗体能够更好的发挥抗原结合功能。

作为本发明的一种优选实施方式，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示。

作为优选，所述单链抗体的轻链序列如SEQ ID NO.5所示或如SEQ ID NO.9所示。

所述单链抗体的重链序列如SEQ ID NO.6所示或如SEQ ID NO.10所示。

所述单链抗体的轻链和重链均能够特异性结合免疫细胞表面抗原CD3。

本发明采用融合肽的形式表达单链抗体，通过特定的抗体结构和序列设计，发现当单链抗体与单克隆抗体的连接方式不同时，分别采用特定的单链抗体融合肽序列能够更好地提升抗体结构的稳定性以及与两种抗原的结合。

对于所述双特异性抗体的单链抗体单元，作为优选，所述单链抗体的轻链和重链组成融合肽，所述融合肽的序列为如下任意一种：

(1)当所述2个单链抗体的N端分别通过连接肽与所述单克隆抗体的2条重链的C端连接时，所述融合肽的序列如SEQ ID NO.17所示；

(2)当所述2个单链抗体的C端分别通过连接肽与所述单克隆抗体的2条重链的N端连接时，所述融合肽的序列如SEQ ID NO.16所示。

对于所述双特异性抗体的单克隆抗体单元，作为优选，所述单克隆抗体的轻链可变区的序列如SEQ ID NO.18所示或为如SEQ ID NO.18所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能多肽的氨基酸序列。

所述单克隆抗体的重链可变区的序列如SEQ ID NO.19所示或为如SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能多肽的氨基酸序列。

本发明中，所述双特异性抗体可以为鼠源抗体、人源化抗体、嵌合抗体或重组抗体。

作为本发明的一种实施方式，所述单克隆抗体的轻链和重链通过二硫键连接。所述单克隆抗体的Fc片段为人或人源化抗体的Fc片段。

作为优选，所述人或人源化抗体包括IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体、IgG4抗体中的一种。

作为本发明的一种优选实施方式，所述单克隆抗体的Fc片段为人或人源化IgG4抗体的Fc片段。

作为本发明的一种优选实施方式，所述单克隆抗体的轻链全长序列如SEQ IDNO.3所示；所述单克隆抗体的重链全长序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.20所示。

本发明中，上述“经一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的蛋白的氨基酸序列”是指在一个或多个氨基酸残基处不同于所示的序列但保留所得到的分子的生物学活性的序列，其可为“保守修饰的变体”或经“保守的氨基酸取代”改造得到的，“保守修饰的变体”或经“保守的氨基酸取代”是指本领域技术人员已知的氨基酸取代，进行这种取代通常不改变所得到的分子的生物学活性。一般而言，本领域技术人员公认在多肽非必需区的单个氨基酸取代基本上不改变生物学活性。示例性取代优选依照以下所示的取代进行：

表1例示性保守氨基酸取代表

作为上述双特异性抗体的示例，本发明提供针对人的CD3和CD19的双特异性抗体，在具有上述单联抗体重链可变区、轻链可变区以及单克隆抗体的重链和轻链结构和序列中，本发明筛选得到2个能够最大程度地保留对应单克隆抗体的生物学功能，且在生产工艺及药用性能等方面具有明显优势的结合CD3和CD19的双特异性抗体，其结构和序列如下：

(1)单链抗体的轻链和重链融合肽的序列如SEQ ID NO.16所示，单克隆抗体的轻链序列如SEQ ID NO.3所示，单克隆抗体的重链序列如SEQ ID NO.1所示；抗体结构为2个单链抗体融合肽的C端分别通过序列如SEQ ID NO.13所示的连接肽连接于单克隆抗体2条重链的N端的对称结构(如图2的A所示)；

(2)单链抗体的轻链和重链融合肽的序列如SEQ ID NO.17所示，单克隆抗体的轻链序列如SEQ ID NO.3所示，单克隆抗体的重链序列如SEQ ID NO.20所示；抗体结构为2个单链抗体融合肽的N端分别通过序列如SEQ ID NO.13所示的连接肽连接于单克隆抗体两条重链的C端的对称结构(如图2的B所示)。

在上述双特异性抗体氨基酸序列的基础上，本发明还提供编码所述双特异性抗体的基因。

根据密码子编码规则以及密码子的简并性和偏好性，本领域技术人员可以根据上述双特异性抗体的氨基酸序列设计编码基因。

作为本发明的一种优选实施方式，所述单克隆抗体的轻链全长的编码基因序列如SEQ ID NO.4所示。

作为本发明的一种优选实施方式，所述单克隆抗体的重链全长的编码基因序列如SEQ ID NO.2所示或如SEQ ID NO.21所示。

作为本发明的一种优选实施方式，当所述2个单链抗体的C端分别通过连接肽与所述单克隆抗体的2条重链的N端连接时，所述单链抗体的编码基因序列如SEQ ID NO.14所示；当所述2个单链抗体的N端分别通过连接肽与所述单克隆抗体的2条重链的C端连接时，所述单链抗体的编码基因序列如SEQ ID NO.15所示。

上述基因序列可以组合用于表达所述双特异性抗体或分别与所述双特异性抗体的其余单元的其它编码基因序列组合用于表达所述双特异性抗体。

进一步地，本发明还提供包含所述基因的生物材料。

本发明中，所述生物材料包括重组DNA、表达盒、载体、宿主细胞、工程菌或细胞系。

本发明还提供所述双特异性抗体的制备方法，包括：构建含有所述单链抗体和所述单克隆抗体的编码基因的表达载体；将所述表达载体导入宿主细胞，获得稳定表达所述双特异性抗体的宿主细胞；培养宿主细胞，经分离纯化获得所述双特异性抗体。

在制备所述双特异性抗体时，本领域技术人员可根据需要选择本领域常规的宿主细胞、表达载体、将表达载体导入宿主细胞的方法以及抗体的分离纯化方法。

作为本发明的一种实施方式，所述的宿主细胞为CHO-K1细胞。

作为本发明的一种实施方式，所述表达载体为pG4HK。

所述表达载体的构建可以采用本领域常规方法，作为本发明的一种优选实施方式，所述表达载体的构建方法包括：将所述抗CD19单克隆抗体的轻链编码基因，通过SalI与BsiWI双酶切连接到表达载体pG4HK，获得抗CD19轻链的表达载体，质粒命名为pG4HK19VL；通过Hind III与BstEII双酶切将抗CD3单链抗体编码基因和抗CD19单克隆抗体的重链基因的融合片段连接到载体pG4HK19VL，获得双特异性抗体表达载体。

所述分离纯化可采用本领域常用的抗体分离纯化方法。

作为本发明的一种实施方式，所述的分离纯化包括如下步骤：

(1)通过重组rProtein A亲和层析柱从培养物上清中分离所有带Fc结构域的抗体；

(2)通过阴离子交换Q柱层析将双特异性抗体与副产物分离；

(3)通过分子筛层析纯化双特异性抗体。

在上述双特异性抗体的基础上，本发明还提供一种药物组合物，其包含本发明所述双特异性抗体。

作为优选，所述药物组合物还包括药学领域允许的其它有效成分或辅料。

进一步地，本发明提供所述双特异性抗体或所述双特异性抗体的编码基因或含有所述编码基因的生物材料的如下任一应用：

(1)在制备预防或治疗CD19表达的B细胞相关疾病的药物中的应用；

(2)在制备预防或治疗以CD19为靶标的疾病的药物中的应用；

(3)在制备用于杀伤CD19表达细胞的药物中的应用；

(4)在制备CD19和/或CD3的检测试剂中的应用。

本发明中，所述CD19表达的B细胞相关疾病包括但不限于B细胞相关肿瘤、B细胞引起的自身免疫病。

所述B细胞相关肿瘤但不限于B淋巴细胞瘤、B细胞性白血病。

本发明的有益效果如下：本发明利用基因工程和抗体工程方法构建包含单链抗体和完整单克隆抗体结构的结合CD19和CD3的双特异性抗体，该双特异性抗体融合蛋白保留了完整的单克隆抗体结构，而且具有高度稳定的对称结构，更好地保留了抗CD3单链抗体和抗CD19单克隆抗体的生物学功能，实现了一个双特异性抗体分子同时具有优异的抗CD19和抗CD3两个单克隆抗体的生物学功能，能够在肿瘤细胞和免疫效应细胞之间搭建桥梁，有效激活免疫效应细胞和导向性免疫反应，显著增强了免疫细胞杀伤肿瘤细胞的功效，同时最大程度地降低了ADCC效应，具有较高的安全性。此外，本发明提供的双特异性抗体由于具有结构完全对称的特点，在进行宿主表达时，不会产生其它结构的蛋白异构体，从而大大降低了提取和纯化工艺的难度，具有制备简单、产量高的优势，在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明背景技术中细胞表面抗原CD3分子的结构示意图。

图2为本发明实施例1中经筛选获得的2个双特异抗体YK001和YK002的分子结构示意图，其中，A为双特异抗体YK001；B为双特异抗体YK002。

图3为本发明实施例2中双特异抗体YK001和YK002的SDS-PAGE电泳图，其中，A和C为还原SDS-PAGE电泳检测；B和D为非还原SDS-PAGE电泳检测；A和B为YK001双特异抗体SDS-PAGE电泳结果；C和D为YK002双特异抗体SDS-PAGE电泳结果；M代表蛋白分子量标记，泳道1为目的蛋白。

图4为本发明实施例2中双特异抗体YK001和YK002的HPLC-SEC纯度峰形图，其中，A为双特异抗体YK001；B为双特异抗体YK002。

图5为本发明实施例3中基于流式细胞分析方法测定的双特异抗体YK001和YK002与Raji细胞的结合效率，其中，A为阴性对照NC；B为YK001双特异抗体；C为阳性对照抗体(PC)Anti-CD19；D为阴性对照NC；E为YK002双特异抗体；F为阳性对照抗体(PC)Anti-CD19。

图6为本发明实施例3中基于流式细胞分析方法测定的双特异抗体YK001和YK002与T细胞的结合效率，其中，A为阴性对照NC；B为YK001双特异抗体；C为YK002双特异抗体，D为阳性对照(PC)Anti-CD3)。

图7为本发明实施例4中双特异抗体YK001和YK002有效介导PBMC细胞杀伤Raji肿瘤细胞的结果图，其中，(▼)表示YK001双特异抗体，(▽)表示YK002双特异抗体，(■)表示Anti-CD19单克隆抗体(◇)表示无关对照0527×CD3双特异性抗体(Her2×CD3双特异性抗体)，(●)表示Anti-CD3单克隆抗体。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1CD19×CD3双特异性抗体的结构和序列设计

本实施例以肿瘤细胞表面抗原CD19和免疫细胞表面抗原CD3作为靶点，设计双特异性抗体。

结合蛋白质结构设计软件和大量的人工实验筛选，本发明在多种结合CD19和CD3的双特异性抗体结构中筛选确定了包括单链抗体单元和单克隆抗体单元的具有对称结构的双特异性抗体结构。其中，抗-CD19单克隆抗体单元为IgG抗体，包括2个完整的轻链-重链对(即含有完整的Fab和Fc结构域，重链和轻链之间通过二硫键连接)，抗-CD3单链抗体单元包括2个单链抗体(ScFv)，每个单链抗体均包含重链可变区和轻链可变区结构域，将重链可变区和轻链可变区经连接肽构建为融合肽。单链抗体和单克隆抗体之间采用连接肽连接，对于单链抗体和单克隆抗体的连接方式，设计2种不同的连接方式，由此获得两种不同对称结构的双特异性抗体：

(1)将抗-CD3单链抗体的C端与抗-CD19单克隆抗体的重链N端通过连接肽GGGGSGGGGSGGGGS(如SEQ ID NO.13所示)相连，获得双特异性抗体YK001(结构示意图如图2的A所示)；

(2)将抗-CD3单链抗体的N端与抗-CD19单克隆抗体的重链C端通过连接肽GGGGSGGGGSGGGGS(如SEQ ID NO.13所示)相连，获得双特异性抗体YK002(结构示意图如图2的B所示)。

上述双特异性抗体各结构域的氨基酸序列如下：

YK001的抗-CD19单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示，重链全长氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

YK002的抗-CD19单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示，重链全长氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示；

抗-CD19单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示，轻链全长氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示(YK001和YK002相同)；

YK001中抗-CD3单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示；

YK002中抗-CD3单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。

实施例2CD19×CD3双特异性抗体的制备

1、双特异性抗体编码基因设计与合成

根据实施例1中设计筛选得到的2个双特异性抗体YK001和YK002的氨基酸序列和宿主细胞的密码子偏好性，设计双特异性抗体的编码基因，具体序列如下：

YK001的抗-CD19单克隆抗体的重链编码核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

YK002的抗-CD19单克隆抗体的重链编码核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；

抗-CD19单克隆抗体的轻链编码核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示(YK001和YK002相同)；

YK001中抗-CD3单链抗体的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；

YK002中抗-CD3单链抗体的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。

为便于表达载体构建，合成抗-CD19单克隆抗体的轻链编码基因片段(YK001和YK002相同)以及抗CD3单链抗体编码基因-抗CD19单克隆抗体的重链编码基因的融合片段(YK001，即将抗-CD3单链抗体的C端与抗-CD19单克隆抗体的重链N端相连)和抗CD19单克隆抗体的重链编码基因-抗CD3单链抗体编码基因的融合片段(YK002，即将抗-CD3单链抗体的N端与抗-CD19单克隆抗体的重链C端相连)。

2、双特异性抗体表达载体构建

(1)通过SalI与BsiWI双酶切将抗-CD19单克隆抗体的轻链编码基因连接到表达载体pG4HK，获得抗-CD19单克隆抗体轻链的表达载体，质粒命名为pG4HK19VL。

(2)通过Hind III与BstE II双酶切将抗CD3单链抗体编码基因-抗CD19单克隆抗体的重链编码基因的融合片段连接到载体pG4HK19VL，获得YK001双特异性抗体表达载体，质粒命名为pG4HK-YK001。

(3)通过Hind III与BstE II双酶切将抗CD19单克隆抗体的重链编码基因-抗CD3单链抗体编码基因的融合片段连接到载体pG4HK19VL，获得抗YK002双特异性抗体表达载体，质粒命名为pG4HK-YK002。

3、双特异性抗体的表达

(1)利用无内毒素大提试剂盒(Tiagen，4991083)进行质粒大提，具体操作按照试剂盒说明书进行。

(2)转染用细胞准备

①复苏CHO-K1细胞，接种6×10⁶细胞到12ml CD-CHO培养基(含6mM GlutaMAX)中，密度为0.5×10⁶/ml，于5％CO₂，37℃，135rpm摇床培养。

②转染前一天，调整细胞密度到0.5×10⁶ml，于5％CO₂，37℃，135rpm摇床培养。

(3)电穿孔转染

①细胞计数测定细胞浓度，保证细胞活力95％以上。

②取1×10⁷细胞，1000rpm离心5分钟，弃上清，用新鲜的CD-CHO培养基悬浮细胞，1000rpm离心5分钟，弃上清。再重复洗一次。

③用0.7ml CD-CHO培养基悬浮细胞，并加入40μg表达载体，混合均匀，转移至0.4cm电转杯中，电击。

④将电击后细胞迅速转移到CD-CHO培养基(without GlutaMAX)中，铺于96孔板中，于5％CO₂，37℃培养。

⑤转染后24小时每孔补加MSX至终浓度为50μM，5％CO₂，37℃培养。

⑥挑取高表达双特异性抗体的单克隆细胞株，进行分批补液发酵培养，培养14天后收集上清。

4、双特异性抗体的纯化

(1)料液预处理

发酵培养的上清液通过2000rpm离心，10min，然后用0.22uM滤膜过滤处理。

(2)亲和层析

用Mabselect SuRe亲和层析柱(购自GE公司，货号18-5438-02)捕获经过预处理的发酵液中的抗体，用平衡缓冲液(10mM PB，0.1M NaCl，pH7.0)充分平衡层析柱后，过亲和层析柱，用洗脱缓冲液(0.1M柠檬酸酸，pH 3.0)洗脱。

(3)阳离子交换层析

经亲和层析制备的样品，进一步通过SP阳离子交换层析纯化，阳离子交换柱购自GE公司(17-1014-01，17-1014-03)，用平衡缓冲液(50mM PBS，pH 5.5)平衡层析柱后，过SP柱子结合后，用洗脱缓冲液(50mM PBS，1.0M NaCl，pH 5.5)20个柱体积线性洗脱。

(4)阴离子交换层析

经SP阳离子交换层析纯化后，再进一步经过离子交换Q柱(购自GE公司，货号：17-1153-01，17-1154-01)，所用的缓冲液为50mM PBS，pH 5.5。

经上述纯化后的双特异性抗体YK001和YK002进行SDS-PAGE和HPLC-SEC检测。SDS-PAGE的结果如图3所示，YK001的还原SDS-PAGE电泳检测结果如图3的A所示，非还原SDS-PAGE电泳检测结果如图3的B所示；YK002的还原SDS-PAGE电泳检测结果如图3的C所示，非还原SDS-PAGE电泳检测结果如图3的D所示。HPLC-SEC检测结果如图4所示，其中，YK001的SEC检测结果如图4的A所示，YK002的SEC检测结果如图4的B所示。检测结果表明，经表达和纯化成功制备得到了双特异性抗体YK001和YK002，经纯化后的双特异性抗体的纯度在95％以上。

实施例3双特异性抗体与肿瘤细胞和免疫细胞的结合活性测定

以Raji(购自ATCC，CCL-86)作为CD19阳性的细胞，T细胞作为CD3阳性的细胞，利用流式细胞分析法检测本发明的双特异性抗体与表达CD19的肿瘤细胞和表达CD3的免疫细胞的靶抗原的结合活性。

1、利用流式分析法检测双特异性抗体与Raji细胞的结合活性

(1)收集Raji细胞：收集1×10⁶cells/tube。

(2)漂洗细胞：用1ml staining buffer(含有0.5％w/v BSA+2mM EDTA的PBS)漂洗细胞一次，350×g，4℃离心5min，离心后用200μl staining buffer重悬细胞。

(3)Bs-antibody binding:分别加入双特异抗体YK001和YK002至5μg/ml，冰上孵育45min。

(4)漂洗细胞：在细胞悬液中加入1ml staining buffer，混匀，350×g，4℃离心5min，去上清，重新漂洗一次。离心后用100μl staining buffer重悬细胞。

(5)样品管加入biolegend抗体5μl(PE anti-human IgG Fc Antibody,Biolegend,409304)，同型对照管加入同型对照(PE Mouse IgG2a,κIsotype Ctrl(FC)Antibody，Biolegend,400213)，冰上避光孵育15min。

(6)漂洗细胞：在细胞悬液中加入1ml staining buffer，混匀，350×g，4℃离心5min，去上清，重新漂洗一次。

(7)上机检测：用200μl PBS重悬细胞后，流式细胞仪上机检测即可。

流式细胞检测结果如图5所示，其中，YK001结合Raji细胞的检测结果如图5的A、B和C所示，YK002结合Raji细胞的检测结果如图5的D、E和F所示，结果表明，双特异抗体YK001和YK002均能够特异性地结合Raji细胞，即双特异抗体融合蛋白保留了单克隆抗体Anti-CD19的结合功能。

2、利用流式分析法检测双特异性抗体与T细胞的结合活性.

(1)收集T细胞：收集1×10⁶cells/tube。

(4)漂洗细胞：在细胞悬液中加入1ml staining buffer，混匀，350×g 4℃离心5min，去上清，重新漂洗一次。离心后用100μl staining buffer重悬细胞。

(6)漂洗细胞：在细胞悬液中加入1ml staining buffer，混匀，350×g 4℃离心5min，去上清，重新漂洗一次。

(7)上机检测：用200μl PBS重悬细胞后，上机检测即可。

流式细胞检测结果如图6所示，其中，YK001结合T细胞的检测结果如图6的A和B所示，YK002结合T细胞的检测结果如图6的C和D所示，结果表明，双特异抗体YK001和YK002均能够特异性结合T细胞，即双特异抗体融合蛋白保留了单链抗体Anti-CD3的结合功能。

实施例4双特异性抗体介导的体外细胞杀伤效率检测

本实施例以Raji-Luc为靶细胞，以PBMC为免疫效应细胞，检测双特异性抗体YK001和YK002介导的靶细胞的杀伤作用，以抗-CD3单克隆抗体抗体和抗-CD19单克隆抗体以及0527×CD3双特异性抗体作为对照。

1、靶细胞准备

以Raji-Luc(荧光素酶标记的Raji细胞)为靶细胞，靶细胞吹匀后计数，1000rpm，离心5min，PBS洗涤一次。靶细胞离心洗涤后用GT-T551培养基调整密度为0.2×10⁶/ml,每孔加入50μl，则每孔中细胞为10000个。

2、PBMC准备

以PBMC为效应细胞。将冻存在液氮罐中的PBMC取出(参考细胞冻存与复苏)解冻，加入含有PBS或GT-T551培养基的15ml离心管中，1000rpm，离心5min，用PBS或GT-T551培养基洗涤两次，计细胞数、活度与密度，并调整活细胞密度为2×10⁶/ml，每孔加入50μl，则每孔中细胞为100000个。

3、抗体稀释

采用GT-T551培养基分别稀释双特异性抗体YK001和YK002，将抗体YK001和YK002的起始浓度调整到10nM。依次以1：5的比例稀释。将稀释好的抗体取100μl加入上述准备的细胞中，混匀，将96孔板放回培养箱，18小时后检测杀伤效果。

4、检测

由于Raji靶细胞携带Luciferase基因，故采用LUMINEX方法检测靶细胞杀伤效率。

以steay-GLO(promega公司)为底物，将试剂盒中的buffer解冻融化后加入底物粉末中，混匀，分装为每支5ml或10ml，完成steady-GLO底物重建。

将共培养的细胞吹匀后取100μl转移到不透明白板中，再加入100μl重建的steady-GLO底物，轻拍混匀，放置5min后读板，检测仪器为synergy HT。

5、数据处理

靶细胞杀伤比例的计算公式如下：

靶细胞杀伤比例＝100×(Only target-test well)/Only target；

将所有检测孔的靶细胞杀伤比例对应的抗体浓度转变为log10，以此作为横坐标、以杀伤比例作为纵坐标制作曲线图，结果如图7所示；通过软件Graphpad Prism 7.0分析结果，计算双特异性抗体的IC50，结果如表2所示。结果表明，与对照抗体(抗-CD3单克隆抗体和抗-CD19单克隆抗体以及0527×CD3双特异性抗体)相比，双特异抗体YK001和YK002均能够有效地介导PBMC杀伤肿瘤细胞系Raji-Luc，YK001和YK002单个分子都同时具有Anti-CD19和Anti-CD3单克隆抗体的生物学功能，YK001介导杀伤靶细胞的效力高于YK002。

表2双特异性抗体YK001和YK002介导的靶细胞杀伤的IC50

	Anti-CD3	Anti-CD19	YK001	YK002	0527×CD3
						IC50(nM)	0.02866	N/A	0.0004193	0.002445	～0.4051

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 益科思特（北京）医药科技发展有限公司

<120> 一种双特异性抗体及其制备方法与应用

<130> KHP191110744.8

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

115 120 125

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu

130 135 140

Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

145 150 155 160

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

165 170 175

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

180 185 190

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn

195 200 205

Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser

210 215 220

Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Lys

450

<210> 2

<211> 1353

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caagttcaac ttcagcagtc tggcgccgaa ctcgtgcggc ctggatctag cgtgaagatc 60

agctgtaaag ccagcggcta cgccttcagc agctactgga tgaactgggt caagcagagg 120

cctggacagg gcctcgaatg gatcggacaa atttggcctg gcgacggcga caccaactac 180

aacggcaagt tcaagggcaa agccacactg accgccgacg agtctagcag cacagcctac 240

atgcagctga gcagcctggc ctctgaagat agcgccgtgt acttctgcgc cagacgggaa 300

acaaccaccg tgggcagata ttactacgcc atggactact ggggccaggg caccacagtg 360

acagttagct ctgcgtcgac caagggcccc agcgtgttcc ccctggcccc ttgcagcaga 420

agcaccagcg agagcacagc cgccctgggc tgcctggtga aggactactt ccccgagccc 480

gtgaccgtgt cctggaacag cggcgctctg accagcggcg tgcatacctt ccccgccgtg 540

ctccagagca gcggactgta ctccctgagc agcgtggtga ccgtgccttc cagcagcctg 600

ggcaccaaga cctacacttg caacgtggac cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 660

agagtggaga gcaagtacgg ccccccatgc ccatcatgcc cagcacctga gttcctgggg 720

ggaccatcag tcttcctgtt ccccccaaaa cccaaggaca ctctcatgat ctcccggacc 780

cctgaggtca cgtgcgtggt ggtggacgtg agccaggaag accccgaggt ccagttcaac 840

tggtacgtgg atggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagttc 900

aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaacggc 960

aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa ggcctcccgt cctccatcga gaaaaccatc 1020

tccaaagcca aagggcagcc ccgagagcca caggtgtaca ccctgccccc atcccaggag 1080

gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta ccccagcgac 1140

atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200

gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaggc taaccgtgga caagagcagg 1260

tggcaggagg ggaatgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320

acacagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa 1353

<210> 3

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp

20 25 30

Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser Thr

85 90 95

Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 4

<211> 657

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gatatccagc tgacacagag ccctgccagc ctggccgttt ctctgggaca gagagccacc 60

atcagctgca aggccagcca gagcgttgac tacgacggcg acagctacct gaactggtat 120

cagcagatcc ccggccagcc tcctaagctg ctgatctacg atgccagcaa cctggtgtct 180

ggcatccctc ctagattttc cggcagcggc tctggcaccg acttcaccct gaatatccat 240

cctgtggaaa aggtggacgc cgccacctac cactgtcagc agtctacaga ggacccctgg 300

acatttggcg gaggcaccaa gctggaaatc aagcgtacgg tggctgcacc atctgtcttc 360

atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 420

aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 480

ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 540

agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 600

acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgttag 657

<210> 5

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr

85 90 95

Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 6

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

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Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 7

<211> 318

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cagatcgtgc tgacacagag ccccgccatc atgagtgcta gccctggcga gaaagtgacc 60

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acaagcccca agcggtggat ctacgataca agcaagctgg cctctggcgt gcccgctcac 180

tttagaggat ctggcagcgg caccagctac agcctgacaa tctctggcat ggaagccgag 240

gatgccgcca cctactattg ccagcagtgg tccagcaatc ccttcacctt tggctgtggc 300

accaagctgg aaatcaaa 318

<210> 8

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

caggttcagc tgcaacagtc tggcgccgaa cttgctagac caggcgccag cgtgaagatg 60

agctgtaaag ccagcggcta caccttcacc agatacacca tgcactgggt caagcagagg 120

cccggacagt gccttgagtg gatcggctac atcaacccca gccggggcta caccaactac 180

aaccagaagt tcaaggacaa ggccacactg accaccgaca agagcagcag cacagcctac 240

atgcagctga gcagcctgac cagcgaagat agcgccgtgt actactgcgc ccggtactac 300

gacgatcact actgcctgga ttactggggc cagggcacaa ccctgacagt gtcatct 357

<210> 9

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 10

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 11

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gatatccaga tgacacagag ccctagcagc ctgtctgcca gcgtgggaga cagagtgacc 60

atcacctgta gagccagcca ggacatccgg aactacctga actggtatca gcagaagccc 120

ggcaaggccc ctaagctgct gatctactac accagcagac tggaaagcgg cgtgcccagc 180

agattttctg gcagcggcag cggaaccgac tacaccctga ccatatctag cctgcagcct 240

gaggacttcg ccacctacta ttgccagcag ggcaacaccc tgccttggac ctttggctgt 300

ggcaccaagg tggaaatcaa a 321

<210> 12

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gaagtgcagc tggttgaatc aggcggaggc ctggttcagc caggcggatc tctgagactg 60

tcttgtgccg cctccggcta cagctttacc ggctacacca tgaattgggt ccgacaggcc 120

cctggcaagt gcctggaatg ggttgccctg atcaacccct acaagggcgt gaccacatac 180

gccgactctg tgaagggcag attcaccatc agcgtggaca agagcaagaa caccgcctac 240

ctgcagatga acagcctgag agccgaggac accgccgtgt attattgcgc cagaagcggc 300

tactacggcg acagcgactg gtactttgat gtgtggggac agggaaccct ggtcaccgtg 360

tctagc 366

<210> 13

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 14

<211> 735

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cagatcgtgc tgacacagag ccccgccatc atgagtgcta gccctggcga gaaagtgacc 60

atgacctgta gcgccagcag cagcgtgtcc tacatgaact ggtatcagca gaagtccggc 120

acaagcccca agcggtggat ctacgataca agcaagctgg cctctggcgt gcccgctcac 180

tttagaggat ctggcagcgg caccagctac agcctgacaa tctctggcat ggaagccgag 240

gatgccgcca cctactattg ccagcagtgg tccagcaatc ccttcacctt tggctgtggc 300

accaagctgg aaatcaaagg cggaggcgga agtggcggcg gaggtagcgg tggtggtgga 360

agcggtggcg gaggatctca ggttcagctg caacagtctg gcgccgaact tgctagacca 420

ggcgccagcg tgaagatgag ctgtaaagcc agcggctaca ccttcaccag atacaccatg 480

cactgggtca agcagaggcc cggacagtgc cttgagtgga tcggctacat caaccccagc 540

cggggctaca ccaactacaa ccagaagttc aaggacaagg ccacactgac caccgacaag 600

agcagcagca cagcctacat gcagctgagc agcctgacca gcgaagatag cgccgtgtac 660

tactgcgccc ggtactacga cgatcactac tgcctggatt actggggcca gggcacaacc 720

ctgacagtgt catct 735

<210> 15

<211> 732

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gatatccaga tgacacagag ccctagcagc ctgtctgcca gcgtgggaga cagagtgacc 60

atcacctgta gagccagcca ggacatccgg aactacctga actggtatca gcagaagccc 120

ggcaaggccc ctaagctgct gatctactac accagcagac tggaaagcgg cgtgcccagc 180

agattttctg gcagcggcag cggaaccgac tacaccctga ccatatctag cctgcagcct 240

gaggacttcg ccacctacta ttgccagcag ggcaacaccc tgccttggac ctttggctgt 300

ggcaccaagg tggaaatcaa aggtggtggc ggatctggtg gtggtggaag tggcggtggc 360

ggttctgaag tgcagctggt tgaatcaggc ggaggcctgg ttcagccagg cggatctctg 420

agactgtctt gtgccgcctc cggctacagc tttaccggct acaccatgaa ttgggtccga 480

caggcccctg gcaagtgcct ggaatgggtt gccctgatca acccctacaa gggcgtgacc 540

acatacgccg actctgtgaa gggcagattc accatcagcg tggacaagag caagaacacc 600

gcctacctgc agatgaacag cctgagagcc gaggacaccg ccgtgtatta ttgcgccaga 660

agcggctact acggcgacag cgactggtac tttgatgtgt ggggacaggg aaccctggtc 720

accgtgtcta gc 732

<210> 16

<211> 245

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr

85 90 95

Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly

100 105 110

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val

115 120 125

Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val

130 135 140

Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met

145 150 155 160

His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Ile Gly Tyr

165 170 175

Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp

180 185 190

Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln

195 200 205

Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

210 215 220

Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

225 230 235 240

Leu Thr Val Ser Ser

245

<210> 17

<211> 244

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys

130 135 140

Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg

145 150 155 160

Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val Ala Leu Ile Asn Pro Tyr

165 170 175

Lys Gly Val Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile

180 185 190

Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu

195 200 205

Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr

210 215 220

Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

225 230 235 240

Thr Val Ser Ser

<210> 18

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp

20 25 30

Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser Thr

85 90 95

Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 19

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 20

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

115 120 125

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu

130 135 140

Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

145 150 155 160

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

165 170 175

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

180 185 190

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn

195 200 205

Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser

210 215 220

Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Leu Gly Lys

450

<210> 21

<211> 1353

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

caagttcaac ttcagcagtc tggcgccgaa ctcgtgcggc ctggatctag cgtgaagatc 60

agctgtaaag ccagcggcta cgccttcagc agctactgga tgaactgggt caagcagagg 120

cctggacagg gcctcgaatg gatcggacaa atttggcctg gcgacggcga caccaactac 180

aacggcaagt tcaagggcaa agccacactg accgccgacg agtctagcag cacagcctac 240

atgcagctga gcagcctggc ctctgaagat agcgccgtgt acttctgcgc cagacgggaa 300

acaaccaccg tgggcagata ttactacgcc atggactact ggggccaggg caccacagtg 360

acagttagct ctgcgtcgac caagggcccc agcgtgttcc ccctggcccc ttgcagcaga 420

agcaccagcg agagcacagc cgccctgggc tgcctggtga aggactactt ccccgagccc 480

gtgaccgtgt cctggaacag cggcgctctg accagcggcg tgcatacctt ccccgccgtg 540

ctccagagca gcggactgta ctccctgagc agcgtggtga cggtgccttc cagcagcctg 600

ggcaccaaga cctacacttg caacgtggac cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 660

agagtggaga gcaagtacgg ccctccctgc cccccttgcc ctgcccccga gttcctgggc 720

ggacctagcg tgttcctgtt cccccccaag cccaaggaca ccctgatgat cagcagaacc 780

cccgaggtga cgtgcgtggt ggtggacgtg tcccaggagg accccgaggt ccagtttaat 840

tggtacgtgg acggcgtgga agtgcataac gccaagacca agcccagaga ggagcagttc 900

aacagcacct acagagtggt gtccgtgctg accgtgctgc accaggactg gctgaacggc 960

aaggaataca agtgcaaggt ctccaacaag ggcctgccta gcagcatcga gaagaccatc 1020

agcaaggcca agggccagcc acgggagccc caggtctaca ccctgccacc tagccaagag 1080

gagatgacca agaaccaggt gtccctgacc tgtctggtga aaggcttcta tcccagcgat 1140

atcgccgtgg agtgggagag caacggccag cccgagaaca actacaagac caccccccct 1200

gtgctggaca gcgacggcag cttcttcctg tactccagac tgaccgtgga caagtccaga 1260

tggcaggagg gcaacgtctt cagctgctcc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1320

acccagaagt ccctgagcct gagcctgggc aag 1353

Claims

1.一种结合CD19和CD3的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体包括(a)单克隆抗体单元和(b)单链抗体单元；所述单克隆抗体单元为2个完整的轻链-重链对，能够特异性结合CD19；所述单链抗体单元包括2个单链抗体；所述单链抗体包括重链可变区和轻链可变区，能够特异性结合CD3；所述双特异性抗体为通过如下任意一种方式连接而成的对称结构：

(1)所述2个单链抗体的C端分别通过连接肽与所述单克隆抗体的2条重链的N端连接；

(2)所述2个单链抗体的N端分别通过连接肽与所述单克隆抗体的2条重链的C端连接。

2.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述连接肽的氨基酸序列为(GGGGX)n，其中，X为Gly或Ser，n为1-4的自然数；

优选地，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示。

3.根据权利要求1或2所述的双特异性抗体，其特征在于，

所述单链抗体的轻链序列如SEQ ID NO.5所示或如SEQ ID NO.9所示；

所述单链抗体的重链序列如SEQ ID NO.6所示或如SEQ ID NO.10所示；

优选地，所述单链抗体的轻链和重链组成融合肽，所述融合肽的序列为如下任意一种：

(1)当所述2个单链抗体的C端分别通过连接肽与所述单克隆抗体的2条重链的N端连接时，所述融合肽的序列如SEQ ID NO.16所示。

(2)当所述2个单链抗体的N端分别通过连接肽与所述单克隆抗体的2条重链的C端连接时，所述融合肽的序列如SEQ ID NO.17所示。

4.根据权利要求3所述的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体为鼠源抗体、人源化抗体、嵌合抗体或重组抗体。

5.根据权利要求3或4所述的双特异性抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的轻链和重链通过二硫键连接；

所述单克隆抗体的Fc片段为人或人源化抗体的Fc片段，所述人或人源化抗体为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中的一种；

优选地，所述单克隆抗体的Fc片段为人或人源化IgG4抗体的Fc片段；

更优选地，所述单克隆抗体的轻链全长序列如SEQ ID NO.3所示；重链全长序列如SEQID NO.1或SEQ ID NO.20所示。

6.编码权利要求1～5任一项所述双特异性抗体的基因；

优选地，所述单克隆抗体的轻链全长的编码基因序列如SEQ ID NO.4所示；

和/或，

所述单克隆抗体的重链全长的编码基因序列如SEQ ID NO.2所示或如SEQ ID NO.21所示；

和/或，

当所述2个单链抗体的C端分别通过连接肽与所述单克隆抗体的2条重链的N端连接时，所述单链抗体的编码基因序列如SEQ ID NO.14所示；当所述2个单链抗体的N端分别通过连接肽与所述单克隆抗体的2条重链的C端连接时，所述单链抗体的编码基因序列如SEQ IDNO.15所示。

7.包含权利要求6所述基因的生物材料，所述生物材料包括重组DNA、表达盒、载体、宿主细胞、工程菌或细胞系。

8.权利要求1～5任一项所述双特异性抗体的制备方法，其特征在于，包括：构建含有所述单链抗体和单克隆抗体的编码基因的表达载体；将所述表达载体导入宿主细胞，获得稳定表达所述双特异性抗体的宿主细胞；培养宿主细胞，经分离纯化获得所述双特异性抗体。

9.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1～5任一项所述双特异性抗体。

10.权利要求1～5任一项所述双特异性抗体或权利要求6所述基因或权利要求7所述生物材料的如下任一应用：

(2)在制备预防或治疗以CD19为靶标的疾病的药物中的应用；

(3)在制备用于杀伤CD19表达细胞的药物中的应用；

(4)在制备CD19和/或CD3的检测试剂中的应用；

优选地，所述CD19表达的B细胞相关疾病包括B细胞相关肿瘤、B细胞引起的自身免疫病。