CN113527501A - 抗cd73-抗pd-1双特异性抗体及其用途 - Google Patents

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李百勇
夏瑜
王忠民
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Abstract

本发明涉及抗CD73‑抗PD‑1双特异性抗体、其药物组合物及用途。

Description

抗CD73-抗PD-1双特异性抗体及其用途
技术领域
本发明属于肿瘤治疗和分子免疫学领域，涉及一种抗CD73-抗PD-1双特异性抗体、其药物组合物及其用途。
背景技术
胞外-5’-核苷酸酶(Ecto-5’-nucleotidase)，即CD73蛋白，是NT5E基因编码的一种蛋白分子量为70KD的多功能糖蛋白，其通过糖基磷脂酰肌醇(glyocsyl phosphatidylinositol，GPI)锚定于细胞膜上(Zimmermann H.5′-Nucleotidase：molecular structureand functional aspects.Biochem J.1992；285：345-365)。
CD73广泛分布在人体组织细胞表面，目前研究已经发现CD73高表达于多种实体肿瘤，如肿瘤微环境的癌细胞、树突细胞、调节型T细胞(Treg)、自然杀伤细胞(NK细胞)、髓系起源的抑制细胞(MDSC)、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)等。CD73的表达受到TGF-β、EGFR、AKT、β-catenin等分子的调控，特别是行使转录因子功能的HIF-1最为关键。肿瘤微环境的一个重要特征是低氧，低氧诱导因子-1(HIF-1)等分子的上调，进而导致CD73在肿瘤微环境广泛表达(Synnestvedt K，et al.Ecto-5′-nucleotidase(CD73)regulation by hypoxia-inducible factor-1 mediates permeability changes in intestinal epithelia.JClin Invest.2002；110：993-1002.)。对临床肿瘤样本的分析显示，CD73高表达是一种潜在的生物标志物，与多种类型肿瘤的不良预后密切相关，包括乳腺癌、肺癌、卵巢癌、肾癌、胃癌、头颈癌等。
CD73具有水解酶活性，又有非水解酶作用。CD73的酶与非酶功能同时存在于肿瘤的相关过程中，并且互相促进，维持肿瘤的演进。越来越多的研究发现，CD73是体外肿瘤细胞增殖、转移和侵袭，体内肿瘤血管生成和肿瘤免疫逃逸机制的关键调控分子，其中很重要的一个免疫抑制机制是由CD73-腺苷(Adenosine)代谢信号通路介导的，CD73上游的CD39可以催化ATP产生腺苷单磷酸(AMP)，所产生的AMP被CD73转化为腺苷，而腺苷会结合下游的腺苷受体(A2AR)，A2AR通过激活蛋白激酶A(PKA)和Csk激酶，抑制LCK、MAPK、PKC等一系列与免疫激活相关的信号通路，抑制T细胞的免疫杀伤作用，从而发挥免疫抑制作用，使肿瘤实现免疫逃逸(Antonioli L，et al.Immunity，inflammation and cancer：a leading rolefor adenosine.Nat Rev Cancer.2013；13：842-857)。临床前动物模型研究显示，免疫细胞和非免疫细胞表达的CD73均可以促进肿瘤的免疫逃逸，发展和转移，其中Treg细胞相关的CD73-腺苷信号对CTL(细胞毒性T细胞)和NK细胞功能的抑制最为明显。
对于实体瘤治疗而言，要克服耐药提高疗效，很重要的一个方面就是解除肿瘤微环境(Tumor micro environment，TME)对免疫效应细胞的抑制作用。TME是非常复杂的系统，由多种细胞、胞间质、酶、细胞因子、代射产物等构成，有显著的低氢、低pH和高压的特点，与正常组织差异巨大。放化疗杀伤肿瘤细胞所造成的低氧或ATP富集会促进CD39-CD73腺苷信号的级联反应，有利于各种促癌类细胞的增殖和功能，而不利于抑癌类细胞。(Regateiro，F.S.，Cobbold，S.P.&Waldmann，H.CD73 and adenosine generation in thecreation of regulatory microenvironments.Clin.Exp.Immunol.2013；171：1-7)。
在动物模型中使用靶向CD73的抗体或基因敲除CD73可以有效阻断肿瘤生长和转移。近来，利用CD73单克隆抗体、小干扰RNA技术、特异性抑制剂APCP等在动物实验的抗肿瘤治疗中取得了显著疗效，为抗肿瘤治疗提供了新的途径。体内试验的证据显示，对于肿瘤患者，靶向阻断CD73将成为有效的治疗手段。
CD73过表达与肿瘤亚型、预后及患者的药物反应之间的联系已经表明CD73可作为未来个体肿瘤治疗、检测的一个重要标志物。因此，对CD73靶点的研究是不可或缺的。
跨膜受体PD-1(程序性细胞死亡-1)是CD28家族成员之一，在活化的T细胞，B细胞以及骨髓系细胞都有表达。PD-1的受体PDL1和PDL2均属于B7超家族，其中PDL1多种细胞都有表达，包括T细胞，B细胞以及内皮细胞和上皮细胞，PDL2则仅表达于抗原呈递细胞如树突状细胞和巨噬细胞。
PD-1在负调节T细胞的活化过程中起着非常重要的作用，PD-1介导的对T细胞负调节作用是肿瘤免疫逃避的重要机制之一，肿瘤表面表达的PDL-1可与免疫细胞表面的PD-1结合，进而通过PD-1/PDL-1信号通路抑制免疫细胞对肿瘤组织的杀伤，高表达PD-L1的肿瘤伴随着很难被检测到的癌症(Hamanishi et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA2007；104：3360-5)。拮抗PD-1，从而抑制PD-1/PDL-1信号通路的一种有效方法是体内注射抗PD-1抗体。
PD-1抗体具有广谱抗肿瘤前景和惊人的药效，针对PD-1通路的抗体将带来治疗多种肿瘤治疗的突破性的进展：用于治疗非小细胞性肺癌，肾细胞癌，卵巢癌，黑色素瘤(Homet M.B.，Parisi G.，et al.，Anti-PD-1 Therapy in Melanoma.SeminOncol.2015Jun；42(3)：466-473)，血液肿瘤以及贫血(Held SA，Heine A，et al.，Advancesin immunotherapy of chronic myeloid leukemia CML.Curr Cancer DrugTargets.2013Sep；13(7)：768-74)。
双功能抗体亦称为双特异性抗体(Bispecific Antibody)，是同时靶向结合两种不同抗原的特异性抗体药物，其可通过免疫分选纯化生产，也可通过基因工程获得。基因工程在结合位点优化，合成形式的考量以及产量等方面都具有相应的灵活性，所以具有一定的优势。目前，双特异性抗体存在形式已被证明有超过45种(Müller D，KontermannRE.Bispecific antibodies for cancer immunotherapy：Currentperspectives.BioDrugs 2010；24：89-98)。IgG-ScFv形式即Morrison模式(Coloma MJ，Morrison SL.Design and production of novel tetravalent bispecificantibodies.Nat Biotechnol.Nature Biotechnology，1997；15：159-163)由于类似于天然存在的IgG的形式，在抗体工程、表达和纯化上具有优势，已被证明是双功能抗体的一种理想存在形式(Miller BR，Demarest SJ，et al.，Stability engineering of scFvs forthe development of bispecific and multivalent antibodies.Protein Eng Des Sel2010；23：549-57；Fitzgerald J，Lugovskoy A.Rational engineering of antibodytherapeutics targeting multiple oncogene pathways.MAbs 2011；3：299-309)。
ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)是抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用，是指抗体的Fab段结合病毒感染的细胞或肿瘤细胞的抗原表位，其Fc段与杀伤细胞(NK细胞、巨噬细胞等)表面的Fc受体(Fc Receptor，FcR)结合，介导杀伤细胞直接杀伤靶细胞。
CDC(complement dependent cytotoxicity)指补体依赖的细胞毒性。CDC作用是由抗体与细胞膜表面相应抗原结合后，进一步与补体C1q的首先结合引起的，接着C2-C9就被激活形成攻膜复合物对靶细胞发挥裂解效应。
IgG家族包含四个成员，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，它们重链恒定区的可结晶片段(fragment crystallizable，Fc)区域存在氨基酸的差异，导致它们与FcγRs的亲和力各不相同。野生型IgG1能够结合各种FcγRs，能够引发ADCC以及CDC效应。Zhang等人(Zhang T等人.Cancer ImmunolImmunother.2018；67(7)：1079-1090.)及Dahan等人(Dahan R等人。Cancer Cell.2015；28(3)：285-95.)的研究表明，靶向PD-1等免疫检查点的抗体的Fc段与Fc受体结合会对抗抗体介导的抗癌活性产生负面影响，这可能是由于Fc依赖性效应子功能诱导的免疫细胞受损，包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性是导致免疫细胞损伤的重要机制。
白细胞介素8(interleutin-8，IL-8)是一种趋化性细胞因子(Chemotacticcytokines)，主要是由单核细胞等分泌。IL-8在正常细胞和肿瘤细胞的增殖中有重要作用，尤其是对肿瘤的发生和发展具有重要的促进作用。研究表明IL-8可以促进肿瘤的发生；肿瘤细胞本身也可分泌IL-8，促进肿瘤的生长和转移(Lo MC et al.Cancer letters，2013，335(1)：81-92.)。因此，IL-8已成为肿瘤微环境之中不可缺少的一种重要的炎症因子。
IL-8作为一种促炎因子与肿瘤的发生发展密切相关。在甲基胂酸(methylarsonate)诱导非肾癌细胞的恶变过程中，IL-8基因的表达增加，IL-8基因沉默则可显著抑制小鼠体内移植瘤的生长，此外IL-8水平的降低可抑制与肿瘤的生长、转移相关的基质金属蛋白酶-9(Matrix metalloproteinase-9)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、促凋亡蛋白Bcl-2、血管内皮生长因子(VEGF)的表达(Escudero-Lourdes C et al.Toxicologyand applied pharmacology，2012，258(1)：10-18.)。Inoue等人的研究发现IL-8可诱导非肿瘤性膀胱细胞系(233JP)的恶变及侵袭性的增加，而在IL-8敲除鼠中233JP细胞发生恶性转化的几率明显减少(Inoue K et al.Cancer Res，2000，60(8)：2290-2299.)。此外，在前列腺癌中，IL-8可以促进患者去势抵抗性前列腺癌(CRPC)的发生(Chen K et al.Cancerresearch，2015，75(10)：1992-2004.)，并且与肿瘤治疗的抗药性有关(Araki S etal.Cancer Res，2007，67(14)：6854-6862.)；IL-8或其受体的基因沉默可诱导肿瘤细胞细胞周期阻滞，抑制肿瘤的增殖(Singh RK，Lokeshwar BL.Molecul Cancer，2009，8：57.)。上述研究表明IL-8的水平与肿瘤的发生发展密切相关。进一步的研究(Mian BM et al.ClinCancer Res，2003，9(8)：3167-3175.)表明IL-8可以作为肿瘤治疗新的靶点。在膀胱癌的肿瘤模型中，使用抗IL-8抗体可以明显的抑制抑制瘤的生长。
IL-6主要由巨噬细胞迅速产生，响应与病原体相关的分子模式(PAMP)或损伤相关分子模式(DAMP)，并通过除去感染因子，诱导急性期和免疫应答来治愈受损组织，起保护作用。IL-6虽然在感染和组织损伤的抵抗和修复中发挥重要作用，但是高水平的IL-6可以激活凝血途径和血管内皮细胞，进而抑制心肌功能，甚至可以引起“细胞因子风暴”，产生严重的急性全身炎症反应。细胞因子风暴是病毒感染、肿瘤免疫疗法等中一种致死性的并发症和不良反应。
免疫相关不良反应是免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitor，ICI)抗肿瘤治疗中一种常见而又危险的不良反应(Spain L et al.Cancer Treat Rev.2016；44：51-60.)。近年来，免疫检查点抑制剂在肿瘤免疫治疗方面取得了巨大成功，但也因为脱靶(off-target)效应导致了全新的毒性谱。其中尤其是主要器官(包括心脏、肺和脑)的严重免疫相关不良事件(irAE)可能危及生命(Bergqvist V，et al.Cancer ImmunolImmunother.2017；66(5)：581-592.；Gomatou G et al.Respiration.2020；1：1-11.；JoshiMN et al.Clin Endocrinol(Oxf).2016；85(3)：331-9.；Prieux-Klotz C et al.TargetOncol.2017；12(3)：301-308.；Tajiri K et al.Jpn J Clin Oncol.2018；48(1)：7-12.)。已有数据表明ICI可能通过4种机制诱导脱靶效应，包括直接结合正常细胞表面表达的免疫检查点分子，激活补体超敏反应；正常组织与肿瘤细胞存在同源抗原/表位；产生自身抗体；增加前炎症细胞因子的水平，如IL-6等(Martins F et al.，The Lancet Oncology，20(1)，e54-e64.)。
目前抗IL-6疗法，如托珠单抗，一种重组人源化抗IL-6R单克隆抗体，已被用于治疗急性期严重irAE、严重或难治性关节炎、大血管血管炎、葡萄膜炎、心肌炎、肺炎、重症肌无力等(Martins F et al.，The Lancet Oncology，20(1)，e54-e64.)。
巨噬细胞上的FcγRIa与野生型IgG1或者IgG4抗体的结合可由诱导其分泌IL-8和IL-6(Kinder M et al.，mAbs.2015)，而进行抗体Fc段的突变，消除其与FcγRIa的结合可以有效地抑制IL-8的分泌，进而增加抗体的安全性和有效性。
发明内容
本发明人利用哺乳动物细胞表达系统分别表达出重组的CD73和PD-1分别作为抗原免疫小鼠，经小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合获得杂交瘤细胞。发明人通过进行对大量样本的筛选，分别得到了如下的杂交瘤细胞株：
杂交瘤细胞株LT014(又称CD73-19F3)，其于2018年6月19日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：C2018137；以及
杂交瘤细胞株LT003(又称PD-1-14C12)，其于2015年6月16日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：C2015105。
本发明人惊奇地发现：
杂交瘤细胞株LT014能够分泌产生与人CD73特异性结合的特异性单克隆抗体(命名为19F3)，并且该单克隆抗体能够十分有效地以非底物竞争的方式抑制CD73的酶活反应，降低腺苷的产生，促进T细胞活性及肿瘤抑制效果。
杂交瘤细胞株LT003能够分泌产生与PD-1特异性结合的特异性单克隆抗体(命名为14C12)，并且该单克隆抗体能够十分有效地阻断PD-1与PDL1的结合。
进一步地，本发明人创造性地制得了抗CD73的人源化抗体(分别命名为19F3H2L2、19F3H2L3、19F3H2L3(hG1M)、19F3H2L3(hG1TM))和抗PD-1的人源化抗体(命名为14C12H1L1和14C12H1L1(hG1TM))。
进一步地，本发明人创造性地将两类人源化抗体进行蛋白重组融合成新的抗体，获得了能够结合CD73和PD-1，抑制CD73活性、阻断PD-1与PDL1的结合的人源化双功能抗体(分别命名为P1D7V01、P1D7V03、NTPDV1、NTPDV2、NTPDV3、NTPDV4(在本文及在申请号为202110270671.X的中国发明专利中又写为NTPDV1(hG1TM)、NTPDV2(hG1TM)、NTPDV3(hG1TM)、NTPDV4(hG1TM))，具有用于制备预防和治疗实体瘤和血液肿瘤的潜力。
由此提供了下述发明：
本发明的一个方面涉及一种抗CD73-抗PD-1双特异性抗体，其包括：
第一蛋白功能区，所述第一蛋白功能区靶向PD-1，和
第二蛋白功能区，所述第二蛋白功能区靶向CD73。
在本发明的一个实施方案中，所述双特异性抗体中
第一蛋白功能区包含氨基酸序列如SEQ ID NO：44所示的重链可变区所包含的HCDR1，HCDR2和HCDR3，优选HCDR1，HCDR2和HCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NOs：45-47所示的序列或与SEQ ID NOs：45-47所示的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，或与SEQ ID NOs：45-47所示的序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，和包含
氨基酸序列如SEQ ID NO：49所示的轻链可变区所包含的LCDR1，LCDR2和LCDR3，优选LCDR1，LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NOs：50-52所示的序列或与SEQ IDNOs：50-52所示的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NOs：50-52所示的序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列；
第二蛋白功能区包含氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的重链可变区所包含的HCDR1，HCDR2和HCDR3，优选HCDR1，HCDR2和HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NOs：3-5所示的序列或与SEQ ID NOs：3-5所示的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NOs：3-5所示的序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，和包含
氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示的轻链可变区所包含的LCDR1，LCDR2和LCDR3，优选LCDR1，LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NOs：8-10所示的序列或与SEQ IDNOs：8-10所示的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NOs：8-10所示的序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列。
在本发明的一个实施方案中，在所述抗CD73-抗PD-1双特异性抗体中：
所述第一蛋白功能区包含
氨基酸序列如SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：62所示的序列或与SEQ ID NOs：44或62所示的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ IDNOs：44或62所示的序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列；和包含
分别对应选自氨基酸序列如SEQ ID NO：49或SEQ ID NO：64所示的序列或与SEQID NOs：49或64所示的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NOs：49或64所示的序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列；
和/或，
所述第二蛋白功能区包含氨基酸序列选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：20所示的序列或与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：20所示的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：20所示的序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列；和包含
分别对应选自SEQ ID NO：7，或SEQ ID NO：22或与SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：22所示的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ IDNO：7或SEQ ID NO：22所示的序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列；
或
所述第二蛋白功能区包含氨基酸序列如SEQ ID NO20所示的序列或与SEQ ID NO：20所示的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQID NO：20所示的序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，和包含
氨基酸序列如SEQ ID NO：24所示的序列或与SEQ ID NO：24示的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：24所示的序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列。
本发明的一个方面涉及一种抗CD73-抗PD-1双特异性抗体，其包括：
第一蛋白功能区，所述第一蛋白功能区靶向CD73，和
第二蛋白功能区，所述第二蛋白功能区靶向PD-1。
在本发明的一个实施方案中，在所述双特异性抗体中，
第一蛋白功能区包含氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的重链可变区所包含的HCDR1，HCDR2和HCDR3，优选HCDR1，HCDR2和HCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NOs：3-5所示的序列或与SEQ ID NOs：3-5所示的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，或与与SEQ ID NOs：3-5所示的序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，和包含
氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示的轻链可变区所包含的LCDR1，LCDR2和LCDR3，优选LCDR1，LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NOs：8-10所示的序列或与SEQ IDNOs：8-10所示的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NOs：8-10所示的序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列；
第二蛋白功能区包含氨基酸序列如SEQ ID NO：44所示的重链可变区所包含的HCDR1，HCDR2和HCDR3，优选HCDR1，HCDR2和HCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NOs：45-47所示的序列或与SEQ ID NOs：45-47所示的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NOs：45-47所示的序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，和包含
氨基酸序列如SEQ ID NO：49所示的轻链可变区所包含的LCDR1，LCDR2和LCDR3，优选LCDR1，LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NOs：50-52所示的序列或与SEQ IDNOs：50-52所示的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NOs：50-52所示的序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列。
在本发明的一个实施方案中，在所述抗CD73-抗PD-1双特异性抗体中：
所述第一蛋白功能区包含
氨基酸序列如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：20所示的序列或与SEQ ID NOs：2或20所示的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ IDNOs：2或20所示的序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列；和包含
分别对应选自氨基酸序列如SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：24所示的序列或与SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：24所示的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NOs：7，22或24所示的序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列；
和/或，
所述第二蛋白功能区包含氨基酸序列选自SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：62所示的序列或与SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：62所示的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：62所示所示的序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列；和包含
分别对应选自SEQ ID NOs：49或64或与SEQ ID NOs：49或64所示的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NOs：49或64所示的序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列。
在本发明的一个实施方案中，在所述抗CD73-抗PD-1双特异性抗体中，所述第一蛋白功能区和第二蛋白功能区直接连接或者通过连接片段连接；优选地，所述连接片段为(GGGGS)n，n为正整数，例如1、2、3、4、5或6。
在本发明的一个实施方案中，在所述抗CD73-抗PD-1双特异性抗体中的所述第一蛋白功能区和第二蛋白功能区独立地为免疫球蛋白或抗原结合片段，例如半抗体、Fab、F(ab’)2或单链抗体，优选地，所述第一蛋白功能区为免疫球蛋白，所述第二蛋白功能区为抗原结合片段；或者，所述第一蛋白功能区为抗原结合片段，所述第二蛋白功能区为免疫球蛋白。
在本发明的一个实施方案中，所述抗原结合片段的重链可变区N端直接(或通过连接片段)连接于所述免疫球蛋白的CH1的C端和所述抗原结合片段的轻链可变区N端直接(或通过连接片段)连接于所述免疫球蛋白的轻链可变区CL的C端；或者所述抗原结合片段的重链可变区N端直接(或通过连接片段)连接于所述免疫球蛋白的的轻链可变区CL的C端和所述抗原结合片段的轻链可变区N端直接(或通过连接片段)连接于所述免疫球蛋白的重链可变区CH1的C端。
在本发明的一个实施方案中，所述抗原结合片段的重链可变区C端直接(或通过连接片段)连接于所述免疫球蛋白的重链N端和所述抗原结合片段的轻链可变区C端直接(或通过连接片段)连接于所述免疫球蛋白的轻链N端；或者所述抗原结合片段的重链可变区C端直接(或通过连接片段)连接于所述免疫球蛋白的的轻链N端和所述抗原结合片段的轻链可变区的C端直接(或通过连接片段)连接于所述免疫球蛋白的重链N端。
在本发明的一个实施方案中，所述抗原结合片段是单链抗体，优选地，所述第一蛋白功能区为免疫球蛋白，所述第二蛋白功能区为单链抗体；或者，所述第一蛋白功能区为单链抗体，所述第二蛋白功能区为免疫球蛋白。
在本发明的一个实施方案中，所述的双特异性抗体，其中，所述第一蛋白功能区和第二蛋白功能区独立地为1个、2个或者2个以上。
在本发明的一个实施方案中，在所述抗CD73-抗PD-1双特异性抗体中，所述单链抗体为通过连接片段(Linker)连接抗体重链可变区(VH)和抗体轻链可变区(VL)的分子；优选地，可具有一般结构：NH2-VL-连接片段-VH-COOH或NH2-VH-连接片段-VL-COOH。
在本发明的一个实施方案中，在所述抗CD73-抗PD-1双特异性抗体中，所述单链抗体通过连接片段连接在免疫球蛋白的重链的C末端(CH)(或者重链的N端、重链可变区的CH1的C端)时，可以首先连接所述单链抗体的抗体重链可变区(VH)，或者，首先连接所述单链抗体的抗体轻链可变区(VL)；优选地，单链抗体可具有一般结构：CH-连接片段-VH-连接片段-VL-COOH，或者，CH-连接片段-VL-连接片段-VH-COOH，
优选地，
所述的免疫球蛋白，其重链可变区包含氨基酸序列为SEQ ID NO：3-5的CDR，其轻链可变区包含氨基酸序列为SEQ ID NO：8-10的CDR；
所述的单链抗体，其重链可变区包含氨基酸序列为SEQ ID NO：45-47的CDR，其轻链可变区包含氨基酸序列为SEQ ID NO：50-52的CDR，
优选地，所述单链抗体(例如NH2-VL-连接片段-VH-COOH或NH2-VH-连接片段-VL-COOH)通过连接片段连接在免疫球蛋白的重链的C末端时，可以首先连接所述单链抗体的包含氨基酸序列为SEQ ID NO：45-47的CDR的抗体重链可变区(VH)，或者，首先连接所述单链抗体的包含氨基酸序列为SEQ ID NO：50-52的CDR的抗体轻链可变区(VL)，
或者优选地，
所述的免疫球蛋白，其重链可变区包含氨基酸序列为SEQ ID NO：45-47的CDR，其轻链可变区包含氨基酸序列为SEQ ID NO：50-52的CDR；和/或，
所述的单链抗体，其重链可变区包含氨基酸序列为SEQ ID NO：3-5的CDR，其轻链可变区包含氨基酸序列为SEQ ID NO：8-10的CDR，
其中，所述单链抗体(例如NH2-VL-连接片段-VH-COOH或NH2-VH-连接片段-VL-COOH)通过连接片段连接在免疫球蛋白的重链的C末端时，可以首先连接所述单链抗体的包含氨基酸序列为SEQ ID NO：3-5的CDR的抗体重链可变区(VH)，或者，首先连接所述单链抗体的包含氨基酸序列为SEQ ID NO：8-10的CDR的抗体轻链可变区(VL)，
优选地，
一个免疫球蛋白分子连接有两个单链抗体分子，更优选地，两个单链抗体分子相同。
在本发明的一个实施方案中，在所述抗CD73-抗PD-1双特异性抗体中，所述免疫球蛋白为IgG、IgA、IgD、IgE或IgM；优选为IgG，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
在本发明的一个实施方案中，在所述抗CD73-抗PD-1双特异性抗体中，所述单链抗体连接在免疫球蛋白的重链的C末端。由于免疫球蛋白由两条重链组成，因此，一个免疫球蛋白分子连接有两个单链抗体分子。优选地，两个单链抗体分子相同。
在本发明的一个实施方案中，在所述抗CD73-抗PD-1双特异性抗体中：
所述的免疫球蛋白，其重链可变区包含氨基酸序列为SEQ ID NO：3-5的CDR，其轻链可变区包含氨基酸序列为SEQ ID NO：8-10的CDR；
和/或，
所述的单链抗体，其重链可变区包含氨基酸序列为SEQ ID NO：45-47的CDR，其轻链可变区包含氨基酸序列为SEQ ID NO：50-52的CDR，
优选地，所述单链抗体(例如NH2-VL-连接片段-VH-COOH或NH2-VH-连接片段-VL-COOH)通过连接片段连接在免疫球蛋白的重链的C末端时，可以首先连接所述单链抗体的包含氨基酸序列为SEQ ID NO：45-47的CDR的抗体重链可变区(VH)，或者，首先连接所述单链抗体的包含氨基酸序列为SEQ ID NO：50-52的CDR的抗体轻链可变区(VL)。
在本发明的另一个实施方案中，在所述抗CD73-抗PD-1双特异性抗体中：
所述的免疫球蛋白，其重链可变区包含氨基酸序列为SEQ ID NO：45-47的CDR，其轻链可变区包含氨基酸序列为SEQ ID NO：50-52的CDR；和/或，
所述的单链抗体，其重链可变区包含氨基酸序列为SEQ ID NO：3-5的CDR，其轻链可变区包含氨基酸序列为SEQ ID NO：8-10的CDR，
其中，所述单链抗体(例如NH2-VL-连接片段-VH-COOH或NH2-VH-连接片段-VL-COOH)通过连接片段连接在免疫球蛋白的重链的C末端时，可以首先连接所述单链抗体的包含氨基酸序列为SEQ ID NO：3-5的CDR的抗体重链可变区(VH)，或者，首先连接所述单链抗体的包含氨基酸序列为SEQ ID NO：8-10的CDR的抗体轻链可变区(VL)。
在本发明的一个实施方案中，在所述抗CD73-抗PD-1双特异性抗体中：
所述免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：20；所述免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列分别对应选自SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：22，或者所述免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：20所示的序列；所述免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：24所示的序列；
和/或，
所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：62；所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列分别对应选自SEQ ID NO：49或SEQ ID NO：64；
其中，所述单链抗体通过连接片段(Linker)连接在免疫球蛋白的重链的C末端时，可以首先连接所述单链抗体的抗体重链可变区(VH)，或者，首先连接所述单链抗体的抗体轻链可变区(VL)。
在本发明的另一个实施方案中，在所述抗CD73-抗PD-1双特异性抗体中：
所述免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：62；所述免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列对应选自SEQ ID NO：49或SEQ ID NO：64，或所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：20，所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列对应选自SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：22，或所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：20所示的序列，所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：24所示的序列。
本发明的另一方面涉及分离的核酸分子，其包含能够编码双特异性抗体重链可变区的核酸序列，其中，
所述抗体的重链可变区包含：
氨基酸序列为SEQ ID NO：3-5的CDR、氨基酸序列为SEQ ID NO：45-47的CDR和氨基酸序列为SEQ ID NO：50-52的CDR；
并且所述双特异性抗体重链可变区作为所述双特异性抗体的一部分，特异性结合CD73和PD-1抗原，所述双特异性抗体还包含轻链可变区，所述轻链可变区包含：
氨基酸序列为SEQ ID NO：8-10的CDR；
优选地，轻链可变区的CDR与重链可变区包含的CDR不相同。
在本发明的一个实施方案中，在所述的双特异性抗体中，
所述的免疫球蛋白包括非-CDR区，且所述非-CDR区来自不是鼠类的物种，例如来自人抗体。
在本发明的一个实施方案中，所述免疫球蛋白的恒定区是人源化的，例如，重链恒定区采用Ig gamma-1chain C region，ACCESSION：P01857；轻链恒定区采用Ig kappachain C region，ACCESSION：P01834。
在本发明的一个实施方案中，所述免疫球蛋白的恒定区是人源化的，例如，重链恒定区采用Ig gamma-1 chain C region，ACCESSION：P01857；轻链恒定区采用Ig kappachain C region，ACCESSION：P01834；其中，按照EU编号系统(EU numbering system)，所述免疫球蛋白的重链恒定区在234位点、235位点和237位点中的任意2个位点或3个位点发生突变，并且突变后，双特异性抗体与FcγRIa、FcγRIIIa和/或C1q的亲和力常数相比突变前降低；优选地，所述亲和力常数通过Fortebio Octet分子相互作用仪测得。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述的双特异性抗体，其中，按照EU编号系统，所述免疫球蛋白的重链恒定区在第234位点、235位点和/或237位点具有如下突变：
L234A和L235A；或者
L234A和G237A；或者
L235A和G237A；
或者
L234A、L235A、G237A。
本发明中，如果没有特别说明，位点之前的字母表示突变前的氨基酸，位点之后的字母表示突变后的氨基酸。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述的双特异性抗体，其中，按照EU编号系统，所述免疫球蛋白的重链恒定区还具有选自如下的一个或多个突变：
N297A、D265A、D270A、P238D、L328E、E233D、H268D、P271G、A330R、C226S、C229S、E233P、P331S、S267E、L328F、A330L、M252Y、S254T、T256E、N297Q、P238S、P238A、A327Q、A327G、P329A、K322A、T394D、G236R、G236A、L328R、A330S、P331S、H268A、E318A和K320A。
在具体的实施方案中，所述的抗CD73-抗PD-1双特异性抗体结构如重链-轻链-连接片段1-scFv所示，所述scFv选自14C12H1V-连接片段2-14C12L1V，14C12H1V-连接片段1-14C12L1V，14C12H1V-连接片段2-14C12L1V和14C12H1V-连接片段1-14C12L1V，具体选自以下各项组成的组：
(1)NTPDV1，其重链氨基酸序列如SEQ ID NO：85所示，轻链氨基酸序列如SEQ IDNO：28所示，连接片段1的氨基酸序列如SEQ ID NO：79所示，14C12H1V的氨基酸序列如SEQID NO：66所示，连接片段2的氨基酸序列如SEQ ID NO：81所示，14C12L1V的氨基酸序列如SEQ ID NO：68所示，
(2)NTPDV2，其重链氨基酸序列如SEQ ID NO：85所示，轻链氨基酸序列如SEQ IDNO：28所示，连接片段1的氨基酸序列如SEQ ID NO：79所示，14C12H1V的氨基酸序列如SEQID NO：66所示，连接片段1的氨基酸序列如SEQ ID NO：79所示，14C12L1V的氨基酸序列如SEQ ID NO：68所示，
(3)NTPDV3，其重链氨基酸序列如SEQ ID NO：85所示，轻链氨基酸序列如SEQ IDNO：96所示，连接片段1的氨基酸序列如SEQ ID NO：79所示，14C12H1V的氨基酸序列如SEQID NO：66所示，连接片段2的氨基酸序列如SEQ ID NO：81所示，14C12L1V的氨基酸序列如SEQ ID NO：68所示，和
(4)NTPDV4，其重链氨基酸序列如SEQ ID NO：85所示，轻链氨基酸序列如SEQ IDNO：96所示，连接片段1的氨基酸序列如SEQ ID NO：79所示，14C12H1V的氨基酸序列如SEQID NO：66所示，连接片段1的氨基酸序列如SEQ ID NO：79所示，14C12L1V的氨基酸序列如SEQ ID NO：68所示。
在本发明的一个实施方案中，所述的双特异性抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的KD结合CD73蛋白和/或PD-1蛋白。
本发明的再一方面涉及一种载体，其包含本发明的分离的核酸分子。
本发明的再一方面涉及一种宿主细胞，其包含本发明的分离的核酸分子，或者本发明的载体。
本发明的再一方面涉及制备本发明的双特异性抗体的方法，其包括在合适的条件下培养本发明的宿主细胞，以及从细胞培养物中回收所述双特异性抗体的步骤。
本发明的再一方面涉及偶联物，其包括双特异性抗体以及偶联部分，其中，所述双特异性抗体为本发明的双特异性抗体，所述偶联部分为可检测的标记；具体地，所述偶联部分为放射性同位素、荧光物质、化学发光物质、有色物质或酶。
本发明的再一方面涉及试剂盒，其包括本发明的双特异性抗体，或者包括本发明的偶联物；优选地所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别所述双特异性抗体；任选地，所述第二抗体还包括可检测的标记，例如放射性同位素、荧光物质、化学发光物质、有色物质或酶。
本发明的再一方面涉及本发明的双特异性抗体在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测CD73和/或PD-1在样品中的存在或其水平。
本发明的再一方面涉及一种药物组合物，其包含本发明的双特异性抗体或者本发明的偶联物；可选地，其还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。
本发明的再一方面涉及使用本发明的双特异性抗体或者本发明的偶联物在预防和/或治疗肿瘤或者贫血病中的用途，或者在诊断肿瘤或者贫血病的用途。
本发明的再一方面涉及本发明的双特异性抗体或者本发明的偶联物在制备预防和/或治疗肿瘤或者贫血病的药物中的用途，或者在制备诊断肿瘤或者贫血病的药物中的用途。
本发明的再一方面涉及本发明的双特异性抗体或者本发明的偶联物在制备如下药物中的用途：
检测样品中CD73水平的药物，
抑制CD73的酶活反应；
和/或
阻断PD-1与PDL1结合的药物，
调节(例如下调)PD-1活性或水平的药物，
解除PD-1对机体免疫抑制的药物，
提高T淋巴细胞中IL-2表达的药物，或者
提高T淋巴细胞中IFN-γ表达的药物。
本发明的再一方面涉及一种在体内或体外方法，包括施加细胞或者给予有需求的受试者以有效量的本发明的双特异性抗体或者本发明的偶联物的步骤，
本发明的所涉及的抗CD73-抗PD-1双特异性抗体均能抑制细胞膜表面CD73酶活性，并且均能诱导IFNγ、IL-2的分泌，激活免疫反应。
轻链和重链的可变区决定抗原的结合；每条链的可变区均含有三个高变区，称互补决定区(CDR)(重链(H)的CDR包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，轻链(L)的CDR包含LCDR1、LCDR2、LCDR3；其由Kabat等人命名，见Bethesda M.d.，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，Fifth Edition，NIH Publication 1991；1-3：91-3242。
优选地，CDR也可以由IMGT编号系统定义，请参见Ehrenmann F，Kaas Q，Lefranc MP.IMGT/3Dstructure-DB and IMGT/DomainGapAlign：a database and a tool forimmunoglobulins or antibodies，T cell receptors，MHC，IgSF and MhcSF[J].Nucleicacids research，2009；38(suppl_1)：D301-D307。
通过本领域技术人员所熟知的技术手段，例如根据IMGT定义分析下面的(1)-(11)项中的单克隆抗体序列的CDR的氨基酸序列，结果如下：
(1)19F3
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO：7所示。
其重链可变区的3个CDR的氨基酸序列如下：
HCDR1：GYSFTGYT(SEQ ID NO：3)，
HCDR2：INPYNAGT(SEQ ID NO：4)，
HCDR3：ARSEYRYGGDYFDY(SEQ ID NO：5)；
其轻链可变区的3个CDR的氨基酸序列如下：
LCDR1：QSLLNSSNQKNY(SEQ ID NO：8)，
LCDR2：FAS(SEQ ID NO：9)，
LCDR3：QQHYDTPYT(SEQ ID NO：10)。
(2)19F3H2L2
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO：22所示。
其重链可变区的3个CDR的氨基酸序列与19F3相同。
其轻链可变区的3个CDR的氨基酸序列与19F3相同。
(3)19F3H2L3
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO：24所示。
其重链可变区的3个CDR的氨基酸序列与19F3相同。
其轻链可变区的3个CDR的氨基酸序列与19F3相同。
(4)14C12
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：44所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO：49所示。
其重链可变区的3个CDR的氨基酸序列如下：
HCDR1：GFAFSSYD(SEQ ID NO：45)
HCDR2：ISGGGRYT(SEQ ID NO：46)
HCDR3：ANRYGEAWFAY(SEQ ID NO：47)
其轻链可变区的3个CDR区的氨基酸序列如下：
LCDR1：QDINTY(SEQ ID NO：50)
LCDR2：RAN(SEQ ID NO：51)
LCDR3：LQYDEFPLT(SEQ ID NO：52)
(5)14C12H1L1
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：62所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO：64所示。
其重链可变区的3个CDR的氨基酸序列与14C12相同。
其轻链可变区的3个CDR的氨基酸序列与14C12相同。
(6)NTPDV1、NTPDV2、NTPDV3、NTPDV4其重链所包含的9个CDR的氨基酸序列依照N端向C端顺序分别为与13F9重链，14C12重链和14C12轻链区域的CDR氨基酸序列一致，按照前述排列序列如下：
HCDR1：GYSFTGYT(SEQ ID NO：3)
HCDR2：INPYNAGT(SEQ ID NO：4)
HCDR3：ARSEYRYGGDYFDY(SEQ ID NO：5)
HCDR4：GFAFSSYD(SEQ ID NO：45)
HCDR5：ISGGGRYT(SEQ ID NO：46)
HCDR6：ANRYGEAWFAY(SEQ ID NO：47)
HCDR7：QDINTY(SEQ ID NO：50)
HCDR8：RAN(SEQ ID NO：51)
HCDR9：LQYDEFPLT(SEQ ID NO：52)
其轻链的3个CDR的氨基酸序列与19F3轻链三个CDR氨基酸序列一致，序列如下：
LCDR1：QSLLNSSNQKNY(SEQ ID NO：8)
LCDR2：FAS(SEQ ID NO：9)
LCDR3：QQHYDTPYT(SEQ ID NO：10)。
本发明的再一方面涉及杂交瘤细胞株LT014，其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：C2018137。
本发明的再一方面涉及杂交瘤细胞株LT003，其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：C2015105。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的，术语EC50是指半最大效应浓度(concentration for 50％ofmaximal effect)，是指能引起50％最大效应的浓度。
如本文中所使用的，术语“抗体”是指通常由两对多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循Bethesda M.d.，Kabat Sequences of Proteins ofImmunological Interest(National Institutes of Health，(1987and 1991))，或Chothia&Lesk J.Mol.Biol.1987；196：901-917；Chothia等人Nature 1989；342：878-883，或者IMGT编号系统定义，见Ehrenmann F，Kaas Q，Lefranc M P.IMGT/3Dstructure-DB andIMGT/DomainGapAlign：a database and a tool for immunoglobulins or antibodies，Tcell receptors，MHC，IgSF and MhcSF[J].Nucleic acids research，2009；38(suppl_1)：D301-D307的定义。
特别地，重链还可以包含3个以上CDR，例如6、9、或12个。例如在本发明的双特异性抗体中，重链可以是IgG抗体的重链的C端连接一个ScFv，这种情况下重链含有9个CDR。
术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。
如本文中所使用的，术语“单抗”和“单克隆抗体”是指，来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片段，也即除可能自发出现的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的，其通常包含至少2种或更多种的不同抗体，这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。单克隆抗体通常可采用Kohler等首次报道的杂交瘤技术获得(
Figure BDA0003034057890000231
G，MilsteinC.Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefinedspecificity[J].nature，1975；256(5517)：495)，但也可采用重组DNA技术获得(如参见U.S.Patent 4,816,567)。
如本文中所使用的，术语“人源化抗体”是指，人源免疫球蛋白(受体抗体)的全部或部分CDR区被一非人源抗体(供体抗体)的CDR区替换后得到的抗体或抗体片段，其中的供体抗体可以是具有预期特异性、亲和性或反应性的非人源(例如，小鼠、大鼠或兔)抗体。此外，受体抗体的构架区(FR)的一些氨基酸残基也可被相应的非人源抗体的氨基酸残基替换，或被其他抗体的氨基酸残基替换，以进一步完善或优化抗体的性能。关于人源化抗体的更多详细内容，可参见例如，Jones et al.，Nature 1986；321：522525；Reichmann et al.，Nature，1988；332：323 329；Presta，Curr.Op.Struct.Biol.1992；2：593-596；和Clark，Immunol.Today 2000；21：397402。在一些情况下，抗体的抗原结合片段是双抗体(Diabodies)，其中VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但使用太短的连接体以致不允许在相同链的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位(参见，例如，Holliger P.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1993；90：6444-6448和Poljak R.J.et al.，Structure 1994；2：1121-1123)。
如本文中所使用的，术语”单链抗体(single chain fragment variable，ScFv)”是指，包含通过连接体连接的抗体重链可变区(VH)和抗体轻链可变区(VL)的分子。其中VL和VH结构域通过使其能够产生为单个多肽链的连接体配对形成单价分子(参见，例如，Birdet al，Science 1988；242：423-426和Huston et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1988；85：5879-5883)。此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-连接片段-VH-COOH或NH2-VH-连接片段-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(GGGGS)4的接头，但也可使用其变体(Holliger et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1993；90：6444-6448)。可用于本发明的其他接头由Alfthan etal，Protein Eng.1995；8：725-731，Choi et al，Eur.J.Immunol.2001；31：94-106，Hu etal，Cancer Res.1996；56：3055-3061，Kipriyanov et al，J.Mol.Biol.1999；293：41-56和Roovers et al，Cancer Immunology，Immunotherapy，2001，50(1)：51-59.描述。
如本文中所使用的，术语“分离的”或“被分离的”指的是，从天然状态下经人工手段获得的。如果自然界中出现某一种“分离”的物质或成分，那么可能是其所处的天然环境发生了改变，或从天然环境下分离出该物质，或二者情况均有发生。例如，某一活体动物体内天然存在某种未被分离的多聚核苷酸或多肽，而从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为分离的。术语“分离的”或“被分离的”不排除混有人工或合成的物质，也不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。
如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草杆菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，GS细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。
如本文中使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的亲和力(KD)结合该抗原。
如本文中所使用的，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。通常，抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10- 9M或10-10M或更小的解离平衡常数(KD)结合抗原(例如，PD-1蛋白)。可以使用本领域技术人员知悉的方法测定KD，例如使用Fortebio分子相互作用仪测定。
如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”和“单抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“多克隆抗体”和“多抗”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。
如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington′s Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR，19thed.Pennsylvania：Mack Publishing Company，1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。
如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病(例如肿瘤)有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病(例如肿瘤)的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
发明的有益效果
本发明的单克隆抗体(例如13F9H2L3)能够很好地特异性与CD73结合，并且能够十分有效地，以非底物竞争的方式抑制CD73的酶活反应，降低腺苷的产生，促进T细胞活性及肿瘤抑制效果。
本发明涉及的双特异性抗体例如NTPDV1、NTPDV2、NTPDV3、NTPDV4能够很好地特异性与PD-1及CD73结合，并且能够十分有效地阻断PD-1与PDL1的结合，特异地解除PD-1对机体免疫抑制，以及抑制CD73的催化活性，解除腺苷对免疫细胞的抑制，激活T淋巴细胞，并且不引起细胞因子IL-8和IL-6的释放，有效地增加安全性和有效性。
本发明的双功能抗体具有应用于制备抗肿瘤的药物的潜力。
附图说明
图1.ELISA检测P1D7V01、P1D7V02R、P1D7V03、P1D7V04R、14C12H1L1、Nivolumab与PD-1-mFc的结合。
图2.ELISA检测P1D7V01、P1D7V02R、P1D7V03、P1D7V04R、19F3H2L3、MEDI9447与人NT5E-Biotin的结合。
图3.P1D7V01、P1D7V02R、P1D7V03、P1D7V04R、14C12H1L1和Nivolumab与人PD-L1-mFc竞争结合人PD-1-mFc-Biotin的活性检测结果。
图4.P1D7V01与PD-1-mFc亲和力常数测定。
图5. 14C12H1L1与PD-1-mFc亲和力常数测定
图6.Nivolumab与PD-1-mFc亲和力常数测定。
图7.P1D7V01与人NT5E(1-552)-his亲和力常数测定。
图8.MEDI 9447与人NT5E(1-552)-his亲和力常数测定。
图9.FACS检测P1D7V01、P1D7V02R、P1D7V03、P1D7V04R和14C12H1L1与293T-PD1细胞表面PD-1的结合活性。
图10.FACS检测P1D7V01、P1D7V03、MEDI9447和19F3H2L3与MDA-MB-231细胞表面CD73的结合活性
图11.抗CD73-抗PD-1双特异性抗体对MDA-MB-231膜表面CD73酶活性的抑制作用。
图12.抗CD73-抗PD-1双特异性抗体对U87-MG膜表面CD73酶活性的抑制作用。
图13.抗CD73-抗PD-1双特异性抗体促Raji-PDL1混合淋巴反应体系分泌IFN-γ的生物活性检测。
图14.抗CD73-抗PD-1双特异性抗体促Raji-PDL1混合淋巴反应体系分泌IL-2的生物活性检测。
图15.抗CD73-抗PD-1双特异性抗体促DC混合淋巴反应体系分泌IFN-γ的生物活性检测。
图16.抗CD73-抗PD-1双特异性抗体促DC混合淋巴反应体系分泌IL-2的生物活性检测。
图17. 14C12H1L1(hG1TM)与PD-1-mFc亲和力常数测定。
图18.Nivolumab与PD-1-mFc亲和力常数测定
图19.NTPDV1与PD-1-mFc亲和力常数测定。
图20.NTPDV2与PD-1-mFc亲和力常数测定。
图21.NTPDV3与PD-1-mFc亲和力常数测定。
图22.NTPDV4与PD-1-mFc亲和力常数测定。
图23. 19F3H2L3(hG1M)与人NT5E(1-552)-his亲和力常数测定。
图24.NTPDV1与人NT5E(1-552)-his亲和力常数测定。
图25.NTPDV2与人NT5E(1-552)-his亲和力常数测定。
图26.NTPDV3与人NT5E(1-552)-his亲和力常数测定。
图27.NTPDV4与人NT5E(1-552)-his亲和力常数测定。
图28.抗CD73-抗PD-1双特异性抗体抑制U87-MG细胞膜表面CD73酶活性的检测。
图29.混合淋巴细胞反应MLR检测抗CD73-抗PD-1双特异性抗体促IFN-γ和IL-2分泌的生物活性。
图30.同型对照、19F3H2L3(hG1M)、不同剂量NTPDV2对小鼠肿瘤体积的影响。
图31.同型对照、19F3H2L3(hG1M)、不同剂量NTPDV2对小鼠体重的影响。
图32.在CHO-K1-PD1细胞和人巨噬细胞共培养体系中，Fc段氨基酸突变有效消除由PD-1/CD73双特异性抗体介导的人巨噬细胞分泌IL-8。
图33.在CHO-K1-PD1细胞和人巨噬细胞共培养体系中，Fc段氨基酸突变有效消除由PD-1/CD73双特异性抗体介导的人巨噬细胞分泌IL-6。
图34.在U87-MG细胞和人巨噬细胞共培养体系中，Fc段氨基酸突变有效消除由PD-1/CD73双特异性抗体介导的人巨噬细胞分泌IL-8。
图35.在U87-MG细胞和人巨噬细胞共培养体系中，Fc段氨基酸突变有效消除由PD-1/CD73双特异性抗体介导的人巨噬细胞分泌IL-6。
生物材料保持信息：
杂交瘤细胞株LT003(又称PD-1-14C12)，其于2015年6月16日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：C2015105，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，邮编：430072。
杂交瘤细胞株LT014(又称CD73-19F3)，其于2018年6月21日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：C2018137，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，邮编：430072。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等泽的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，为可以通过市场购买获得的常规产品。例如MDA-MB-231细胞和U87-MG细胞可以购自ATCC。
在本发明的下述实施例中，使用的BALB/c小鼠购自广东省医学实验动物中心。
在本发明的下述实施例中，所用的阳性对照抗体MEDI9447(通用名：Oleclumab)，生产自中山康方生物医药有限公司，其序列与Medlmmune Limited公开专利，公开号：US20160129108Al中所述的抗体SEQ ID NOs：21-24相同。
在本发明的下述实施例中，所用的同靶点已上市药物抗体Nivolumab，商品名Opdivo，购自百时美施贵宝公司。
在本发明的下述实施例中，所用的293T-PD1细胞系由中山康方生物医药有限公司构建。293T-PD1细胞系由HEK293T细胞经病毒感染制得，病毒制备使用的是3rd GenerationLentiviral Systems，参见，例如A Third Generation Lentivirus Vector with aConditional Packaging System.Dull T，Zufferey R，Kelly M，Mandel RJ，Nguyen M，Trono D，and Naldini L.J Virol.1998.72(11)：8463-8471.其中所使用的慢病毒表达载体为pCDH-CMV-PD-1FL-Puro(其中PD1，Genebank ID：NM_005018；载体pCDH-CMV-Puro，购自优宝生物，产品编号：VT1480)。
在本发明的下述实施例中，所用的Raji-PDL1细胞系由中山康方生物医药有限公司构建。Raji-PDL1细胞系由Raji细胞经病毒感染制得，病毒制备使用的是3rd GenerationLentiviral Systems，参见，例如A Third Generation Lentivirus Vector with aConditional Packaging System.Dull T，Zufferey R，Kelly M，Mandel RJ，Nguyen M，Trono D，and Naldini L.J Virol.1998.72(11)：8463-8471.其中所使用的慢病毒表达载体为plenti6.3-PDL1(其中PDL1，Genebank ID：NP_054862.1；载体plenti6.3，购自Invitrogen，货号：K5315-20)。
在本发明的下述实施例中，所用的CHO-K1-PD1细胞系由中山康方生物医药有限公司构建。CHO-K1-PD1细胞系由CHO-K1细胞经病毒感染制得，病毒制备使用的是3rdGeneration Lentiviral Systems，参见，例如A Third Generation Lentivirus Vectorwith a Conditional Packaging System.Dull T，Zufferey R，Kelly M，Mandel RJ，Nguyen M，Trono D，and Naldini L.J Virol.1998.72(11)：8463-8471.其中所使用的慢病毒表达载体为pCDH-CMV-PD-1FL-Puro(其中PD1，Genebank ID：NM_005018；载体pCDH-CMV-Puro，购自优宝生物，产品编号：VT1480)。
实验例中采用携带有S228P突变的IgG4亚型抗PD-1抗体Nivolumab(商品名Opdivo)作为对照抗体，均购自百时美施贵宝公司。
在本发明的下述实验例中，所用到同型对照抗体，即hIgG1均为靶向为人抗鸡蛋溶酶体(HEL)的抗体，抗体的可变区序列来自于Acierno等人发表的Affinity maturationincreases the stability and plasticity of the Fv domain of anti-proteinantibodies(Acierno等人.J Mol Biol.2007；374(1)：130-46.)，hIgG1的恒定区片段采用Ig gamma-1chain C region，ACCESSION：P01857作为重链恒定区，Ig kappa chain Cregion，ACCESSION：P01834为轻链恒定区；hIgG1为在中山康方生物医药有限公司的实验室制得。
实施例1：抗CD73抗体19F3的制备
1.杂交瘤细胞株LT014的制备
制备抗CD73抗体所用的抗原为人NT5E-his(NT5E为GenbankID：NP_002517.1，位置：1-552)。取免疫后小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，制成杂交瘤细胞，以人NT5E(NT5E为GenbankID：NP_002517.1，位置：1-552)-Biotin作为抗原，对杂交瘤细胞进行间接ELISA法筛选，获得能够分泌与CD73特异性结合的抗体的杂交瘤细胞。对ELISA法筛选得到的杂交瘤细胞，经过有限稀释法得到稳定的杂交瘤细胞株。将以上杂交瘤细胞株命名为杂交瘤细胞株LT014，其分泌的单克隆抗体命名为19F3。
杂交瘤细胞株LT014(又称CD73-19F3)，其于2018年6月21日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：C2018137，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，邮编：430072。
2.抗CD73抗体19F3的制备
用CD培养基(Chemical Defined Medium)对上面制得的LT014细胞株进行培养(CD培养基，内含1％青链霉素，于5％CO2，37℃细胞培养箱中进行培养)，7天后收集细胞培养上清，通过高速离心、微孔滤膜抽真空过滤以及HiTrap protein A HP柱进行纯化，制得抗体19F3。
实施例2：抗CD73的抗体19F3的序列分析
按照培养细胞细菌总RNA提取试剂盒(Tiangen，货号DP430)的方法，分别从实施例1中培养的LT014细胞株中提取mRNA。
按照Invitrogen
Figure BDA0003034057890000311
III First-Strand Synthesis System for RT-PCR试剂盒说明书合成cDNA，并进行PCR扩增。
PCR扩增产物直接进行TA克隆，具体操作参考pEASY-T1 Cloning Kit(TransgenCT101)试剂盒说明书进行。
将TA克隆的产物直接进行测序，测序结果如下：
19F3重链可变区的核酸序列(363bp)如SEQ ID NO：1所示，其编码的氨基酸序列(121aa)如SEQ ID NO：2所示。
根据IMGT编号系统，其中重链CDR1的序列如SEQ ID NO：3所示，重链CDR2的序列如SEQ ID NO：4所示，重链CDR3的序列如SEQ ID NO：5所示。
19F3轻链可变区的核酸序列(339bp)如SEQ ID NO：6所示，其编码的氨基酸序列(113aa)如SEQ ID NO：7所示。
根据IMGT编号系统，其中轻链CDR1的序列如SEQ ID NO：8所示，轻链CDR2的序列如SEQ ID NO：9所示，轻链CDR3的序列如SEQ ID NO：10所示。
19F3重链4个骨架区(Framework region)(FR-H1至FR-H4)氨基酸序列分别如SEQID NO：11至SEQ ID NO：14所示；19F3轻链4个骨架区(Framework region)(FR-H1至FR-H4)氨基酸序列分别如SEQ ID NO：15至SEQ ID NO：18所示。
实施例3：抗人CD73的人源化抗体的设计、制备和检测
1.人源化抗体19F3H2L3和19F3H2L2的轻链和重链序列的设计
根据人CD73蛋白的三维晶体结构(Hage T，Reinemer P，Sebald W.Crystals of a1：1complex between human interleukin-4and the extracellular domain of itsreceptor alpha chain.Eur J Biochem.1998；258(2)：831-6)以及实施例2获得的抗体鼠源抗体19F3的序列，通过计算机模拟抗体模型，根据模型设计突变，得到抗体19F3H1L1、19F3H2L3和19F3H2L3的可变区序列，其相应的重链可变区序列分别为19F3H1、19F3H2(氨基酸序列分别如SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：97所示)，轻链可变区序列分别为和19F3L1、19F3L2、19F3L3(氨基酸序列分别如SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：99所示)，抗体恒定区序列，来自NCBI的数据库，重链恒定区采用Ig gamma-1chain C region，ACCESSION：P01857；轻链恒定区为Ig kappa chain C region，ACCESSION：P01834。其中，19F3H2L3在申请号为202110270671.X的中国发明专利中又写为19F3H2L3(hG1WT)，其中19F3H1L1，19F3H2L2，19F3H2L3的轻、重链可变区又可记为19F3H1V(或者19F3H1V)，19F3H2V(或者19F3H2V)，19F3L1V(或者19F3L1V)，19F3L2V(或者19F3L2V)，19F3L3V(或者19F3L3V)。
(1)人源化单克隆抗体19F3H1L1的重链可变区和轻链可变区序列
重链可变区的核酸序列(363bp)如SEQ ID NO：92所示，其编码的氨基酸序列(121aa)如SEQ ID NO：93所示。
轻链可变区的核酸序列(339bp)如SEQ ID NO：94所示，其编码的氨基酸序列(113aa)如SEQ ID NO：95所示。
(2)人源化单克隆抗体19F3H2L2的重链可变区和轻链可变区序列如下：
重链可变区19F3H2的核酸序列(363bp)如SEQ ID NO：19所示，其编码的氨基酸序列(121aa)如SEQ ID NO：20所示。
轻链可变区19F3L3的核酸序列(339bp)如SEQ ID NO：21所示，其编码的氨基酸序列(113aa)如SEQ ID NO：22所示。
(3)人源化单克隆抗体19F3H2L3的重链可变区和轻链可变区序列如下：
重链可变区19F3H2的核酸序列(363bp)如SEQ ID NO：19所示，其编码的氨基酸序列(121aa)如SEQ ID NO：20所示。
轻链可变区19F3L3的核酸序列(339bp)如SEQ ID NO：23所示，其编码的氨基酸序列(113aa)如SEQ ID NO：24所示。
2.人源化抗体19F3H1L1、19F3H2L2和19F3H2L3的制备
重链恒定区采用Ig gamma-1 chain C region，ACCESSION：P01857；轻链恒定区采用Ig kappa chain C region，ACCESSION：P01834。
分别将19F3H1L1、19F3H2L2和19F3H2L3的重链cDNA和轻链的cDNA，分别克隆到pUC57simple(金斯瑞公司提供)载体中，分别获得pUC57simple-19F3H1、pUC57simple-19F3L1，pUC57simple-19F3H2、pUC57simple-19F3L2和pUC57simple-19F3L3。参照《分子克隆实验指南(第二版)》介绍的标准技术，EcoRI&HindIII酶切合成的重、轻链全长基因，通过限制酶(EcoRI&HindIII)的酶切亚克隆到表达载体pcDNA3.1中获得表达质粒pcDNA3.1-19F3H1，pcDNA3.1-19F3L1，pcDNA3.1-19F3H2，pcDNA3.1-19F3L2，和pcDNA3.1-19F3L3，并进一步对重组表达质粒的重轻链基因进行测序分析。随后将含有相应的轻、重链重组质粒设计基因组合(pcDNA3.1-19F3H1/pcDNA3.1-19F3L1，pcDNA3.1-19F3H2/pcDNA3.1-19F3L2，pcDNA3.1-19F3H2/pcDNA3.1-19F3L3)分别共转染293F细胞后收集培养液进行纯化。测序验证正确后，制备去内毒素级别的表达质粒并将质粒瞬时转染HEK293细胞进行抗体表达，培养7天后收集细胞培养液，采用Protein A柱进行亲和纯化获得人源化抗体。
3.人源化抗体19F3H2L3(hG1M)和19F3H2L3(hG1TM)的轻链和重链序列的设计
本发明人在实施例3的1中所获得的19F3H2L3的基础上，通过在其重链的第234号位点引进了亮氨酸到丙氨酸的点突变(L234A)，第235号位点引进了亮氨酸到丙氨酸的点突变(L235A)，得到了19F3H2L3(hG1M)，19F3H2L3(hG1M)重链核苷酸及氨基酸序列分别如SEQID NO：25和SEQ ID NO：26所示；19F3H2L3(hG1M)轻链恒定区为Ig kappa chain C region，ACCESSION：P01834，19F3H2L3(hG1M)轻链核苷酸及基酸序列分别如SEQ ID NO：27和SEQ IDNO：28所示。
本发明人在实施例3的1中所获得的19F3H2L3的基础上，通过在其重链的第234号位点引进了亮氨酸到丙氨酸的点突变(L234A)，第235号位点引进了亮氨酸到丙氨酸的点突变(L235A)，第237号位点引进了甘氨酸到丙氨酸的点突变(G237A)，得到了19F3H2L3(hG1TM)，其重链氨核苷酸及基酸序列分别如SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30所示；其轻链与19F3H2L3(hG1M)一致。
19F3H2的4个骨架区(Framework region)(FR-H1至FR-H4)氨基酸序列分别如SEQID NO：31至SEQ ID NO：34所示；
19F3L2轻链4个骨架区(Framework region)(FR-H1至FR-H4)氨基酸序列分别如SEQ ID NO：35至SEQ ID NO：38所示；
19F3L3轻链4个骨架区(Framework region)(FR-H1至FR-H4)氨基酸序列分别如SEQ ID NO：39至SEQ ID NO：42所示。
4.人源化抗体19F3H2L3(hG1M)的制备
分别将19F3H2L3(hG1M)的重链cDNA和轻链的cDNA，分别克隆到pUC57simple(金斯瑞公司提供)载体中，分别获得pUC57simple-19F3H2(hG1M)、pUC57simple-19F3L3。参照《分子克隆实验指南(第二版)》介绍的标准技术，EcoRI&HindIII酶切合成的重、轻链全长基因，通过限制酶(EcoRI&HindIII)的酶切亚克隆到表达载体pcDNA3.1中获得表达质粒pcDNA3.1-19F3H2(hG1M)和pcDNA3.1-19F3L3，并进一步对重组表达质粒的重轻链基因进行测序分析。随后将含有相应的轻、重链重组质粒设计基因组合pcDNA3.1-19F3H2(hG1M)/pcDNA3.1-19F3L3共转染293F细胞后收集培养液进行纯化。测序验证正确后，制备去内毒素级别的表达质粒并将质粒瞬时转染HEK293细胞进行抗体表达，培养7天后收集细胞培养液，采用Protein A柱进行亲和纯化获得人源化抗体19F3H2L3(hG1M)。
实施例4：抗PD-1的抗体14C12的制备
1.杂交瘤细胞株LT003的制备
用PD-1-mFc融合蛋白(PD-1 GenBank：NM_005018，mFc SEQ ID NO：89)作为抗原，取免疫BALB/c小鼠(购自广东医学实验动物中心)的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞，参考目前已确立的方法(例如，Stewart，S.J.，“Monoclonal AntibodyProduction”，in Basic Methods in antibody Production and Characterization，Eds.G.C.Howard and D.R.Bethell，Boca Raton：CRC Press，2000)。
用PD-1-hFc(PD-1 Genbank ID：NM_005018，hFc为人IgG Fc纯化标签，具体为Iggamma-1 chain C region，GenbankID：P01857位置114-330)作为抗原包被酶标板，进行间接ELISA法筛选，得到分泌与PD-1特异性结合的新的抗体的杂交瘤细胞。
通过竞争ELISA筛选出能够分泌与配体PD-L1-hFc(PD-L1 Genbank ID：NP_054862.1)竞争结合PD-1的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，经过有限稀释法得到稳定的杂交瘤细胞株，并经过有限稀释法得到LT003稳定细胞株(PD-1-14C12)，其分泌的单克隆抗体命名为14C12。
杂交瘤细胞株LT003(又称PD-1-14C12)，其于2015年6月16日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：C2015105，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，邮编：430072。
2.抗PD-1的抗体14C12的制备
用含10％的低IgG胎牛血清的IMDM培养基对上面制得的LT003细胞株进行培养(IMDM培养基，内含1％青链霉素，于5％CO2，37℃细胞培养箱中进行培养)，7天后收集细胞培养上清进行纯化，制得抗体14C12。
实施例5：抗PD-1抗体14C12的序列分析
按照培养细胞细菌总RNA提取试剂盒(Tiangen，货号DP430)的方法，从实施例1制得的杂交瘤细胞株LT003中提取mRNA。
按照Invitrogen
Figure BDA0003034057890000361
III First-Strand Synthesis System for RT-PCR试剂盒说明书合成cDNA，并进行PCR扩增。
PCR扩增产物直接进行TA克隆，具体操作参考pEASY-T1 Cloning Kit(TransgenCT101)试剂盒说明书进行。
将TA克隆的产物直接进行测序，测序结果如下：
重链可变区的核酸序列(354bp)如SEQ ID NO：43所示，其编码的氨基酸序列(118aa)如SEQ ID NO：44所示。
根据IMGT编号系统，其中重链CDR1的序列如SEQ ID NO：45所示，重链CDR2的序列如SEQ ID NO：46所示，重链CDR3的序列如SEQ ID NO：47所示。
轻链可变区的核酸序列(321bp)如SEQ ID NO：48所示，其编码的氨基酸序列(107aa)如SEQ ID NO：49所示。
根据IMGT编号系统，其中轻链CDR1的序列如SEQ ID NO：50所示，轻链CDR2的序列如SEQ ID NO：51所示，轻链CDR3的序列如SEQ ID NO：52所示。
14C12重链4个骨架区(Framework region)(FR-H1至FR-H4)氨基酸序列分别如SEQID NO：53至SEQ ID NO：56所示；14C12轻链4个骨架区(Framework region)(FR-H1至FR-H4)氨基酸序列分别如SEQ ID NO：57至SEQ ID NO：60所示。
实施例6：抗PD-1的人源化抗体14C12H1L1及的14C12H1L1(hG1TM)设计和制备
1.抗PD-1的人源化抗体14C12H1L1的设计
人源化抗体14C12H1L1的轻链和重链序列的设计，根据PD-1蛋白的三维晶体结构(Shinohara T，et al.，Structure and chromosomal localization of the human PD-1gene(PDCD1).Genomics 1995，23(3)：704-6)以及实施例5获得的抗体14C12的序列，通过计算机模拟抗体模型，根据模型设计突变，得到抗体14C12H1L1的可变区序列。
设计的可变区序列如下：
人源化单克隆抗体14C12H1L1的重链可变区14C12H1的核酸序列(354bp)如SEQ IDNO：61所示，其编码的氨基酸序列(118aa)如SEQ ID NO：62所示。
人源化单克隆抗体14C12H1L1的轻链可变区14C12L1的核酸序列(321bp)如SEQ IDNO：63所示，其编码的氨基酸序列(107aa)如SEQ ID NO：64所示。
抗体14C12H1L1的抗体恒定区序列，来自NCBI的数据库，重链恒定区采用Iggamma-1 chain C region，ACCESSION：P01857；轻链恒定区为Ig kappa chain C region，ACCESSION：P01834)，14C12H1L1重链的核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO：65和66所示，14C12H1L1轻链的核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO：67和68所示。其中，14C12H1L1在本文及申请号为202110270671.X的中国发明专利中又写为14C12H1L1(hG1WT)，其中，14C12H1L1的重链可变区和轻链可变区在本文在申请号为202110270671.X的中国发明专利中又写为14C12H1V(或者14C12H1V)，和14C12L1V(或者14C12L1V)。
2.人源化抗体14C12H1L1(hG1TM)轻链和重链序列的设计
本发明人在实施例6的1中所获得的14C12H1L1的基础上，通过在其重链的第234号位点引进了亮氨酸到丙氨酸的点突变(L234A)，第235号位点引进了亮氨酸到丙氨酸的点突变(L235A)，第237号位点引进了甘氨酸到丙氨酸的点突变(G237A)得到了抗体14C12H1L1(hG1TM)。14C12H1L1(hG1TM)的重链核苷酸及氨基酸序列分别入SEQ ID NO：69和SEQ IDNO：70所示；其轻链可变区氨基酸序列与抗体14C12H1L1的轻链可变区一致。
14C12H1的4个骨架区(Framework region)(FR-H1至FR-H4)氨基酸序列分别如SEQID NO：71至SEQ ID NO：74所示；
14C12L1轻链4个骨架区(Framework region)(FR-H1至FR-H4)氨基酸序列分别如SEQ ID NO：75至SEQ ID NO：78所示；
3.人源化抗体14C12H1L1，14C12H1L1(hG1TM)的制备
分别将14C12H1L1(hG1TM)和14C12H1L1的重链cDNA和轻链的cDNA，分别克隆到pUC57simple(金斯瑞公司提供)载体中，分别获得pUC57simple-14C12H1、pUC57simple-14C12L1和pUC57simple-14C12H1(hG1TM)。参照《分子克隆实验指南(第二版)》介绍的标准技术，EcoRI&HindIII酶切合成的重、轻链全长基因，通过限制酶(EcoRI&HindIII)的酶切亚克隆到表达载体pcDNA3.1中获得表达质粒pcDNA3.1-14C12H1，pcDNA3.1-14C12L1，和pcDNA3.1-14C12H1(hG1TM)，并进一步对重组表达质粒的重轻链基因进行测序分析。随后将含有相应的轻、重链重组质粒设计基因组合(pcDNA3.1-14C12H1(hG1TM)/pcDNA3.1-14C12L1，pcDNA3.1-14C12H1/pcDNA3.1-14C12L1)分别共转染293F细胞后收集培养液进行纯化。测序验证正确后，制备去内毒素级别的表达质粒并将质粒瞬时转染HEK293细胞进行抗体表达，培养7天后收集细胞培养液，采用Protein A柱进行亲和纯化获得人源化抗体。
实施例7：抗PD-1/CD73双功能抗体的序列设计、表达
1.序列设计
本发明中的双功能抗体的结构模式属于Morrison模式(IgG-scFv)，即在一个IgG抗体的两条重链的C端均连接另一个抗体的scFv片段，其重链和轻链的主要组成设计如下面的表1。表1表1：P1D7V01、P1D7V02R、P1D7V03、P1D7V04R、P1D7V07、P1D7V08的重链和轻链的组成设计
Figure BDA0003034057890000381
Figure BDA0003034057890000391
上面的表1中：
(1)右下角标注“V”的，是指相应重链的可变区或者相应轻链的可变区。没有标注“V”的，相应重链或者轻链为包含恒定区的全长。这些可变区或者全长的氨基酸序列及其编码核酸序列均参照上面的实施例中记载的相应序列。
(2)Linker1的氨基酸序列为(GGGGS)4((核苷酸序列SEQ ID NO：80，氨基酸序列SEQ ID NO：79)，Linker2的氨基酸序列为(GGGGS)3((核苷酸序列SEQ ID NO：82，氨基酸序列SEQ ID NO：81)。
2.抗体的表达和纯化
分别将P1D7V01的重链cDNA序列和轻链的cDNA序列克隆到pUC57simple(金斯瑞公司提供)载体中，分别获得pUC57simple-VP101H和pUC57simple-VP101L质粒。
分别将质粒pUC57simple-VP101H和pUC57simple VP101L进行酶切(HindIII&EcoRI)，电泳回收得到的重链轻链分别亚克隆到pcDNA3.1载体中，提取重组质粒共转染293F细胞。细胞培养7天后，将培养液通过高速离心、上清浓缩后上样至HiTrap MabSelectSuRe柱，用Elution Buffer一步洗脱蛋白并回收目标样品并换液至PBS。
按照上述P1D7V01的表达和纯化方法获得纯化的抗体P1D7V02R、P1D7V03、P1D7V04R、P1D7V07、P1D7V08。
实施例8：ELISA方法测定抗CD73-抗PD-1双特异性抗体与抗原的结合活性
1.ELISA方法分别测定P1D7V01、P1D7V02R、P1D7V03、P1D7V04R与抗原PD-1-mFc的结合活性。具体方法如下：
将PD-1-mFc，0.5μg/ml包被酶标板置于4℃孵育过夜，然后使用PBST洗板包被了抗原的酶标板1次，再使用1％BSA的PBS溶液作为封闭液在37℃下对酶标板进行封闭2小时。酶标板封闭结束后用PBST洗板3次，加入PBST溶液梯度稀释的抗体(抗体稀释梯度详见表2)，加入待测抗体的酶标板置于37℃条件下孵育30分钟，孵育完成后用PBST洗板3次。洗板后加入1：5000比例稀释的HR标记羊抗人IgG(H+L)(Jackson，货号：109-035-088)二抗工作液，然后置于37℃条件下孵育30分钟。孵育完成后使用PBST洗板4次，后加入TMB(Neogen，308177)避光显色5min，加入终止液终止显色反应。立即把酶标板放入酶标仪中，选择450nm光波长读取酶标板各孔的OD数值。用SoftMax Pro 6.2.1软件对数据进行分析处理。
检测结果如表2和图1所示。由图可知，P1D7V01、P1D7V02R、P1D7V03、P1D7V04R与抗原PD-1-mFc能够有效的结合，并且其结合效率呈剂量依赖关系，各剂量的吸光度强度见表2，通过对结合的抗体进行吸光度定量分析，曲线模拟计算获得抗体P1D7V01、P1D7V02R、P1D7V03、P1D7V04R、14C12H1L1和Nivolumab(作为对照)的结合效率EC50分别为0.078nM、0.078nM、0.075nM和0.089nM、0.033nM、0.051nM。
以上实验结果表明，在相同实验条件下，P1D7V01、P1D7V02R、P1D7V03、P1D7V04R结合PD-1-mFc的活性与同靶点阳性药14C12H1L1、Nivolumab相当，提示P1D7V01、P1D7V02R、P1D7V03、P1D7V04R具有有效结合PD-1-mFc的活性。
表2：ELISA检测P1D7V01、P1D7V02R、P1D7V03、P1D7V04R。14C12H1L1、Nivolumab与PD-1-mFc的结合
Figure BDA0003034057890000401
Figure BDA0003034057890000411
2.ELISA方法分别测定P1D7V01、P1D7V02R、P1D7V03、P1D7V04R与抗原人NT5E-Biotin的结合活性
将链霉亲和素，2μg/ml包被酶标板后置于4℃孵育过夜。孵育结束后使用PBST对包被了链霉亲和素的酶标板洗板1次，1％BSA的PBS溶液作为酶标板封闭液，对酶标板在37℃进行封闭2小时。酶标板封闭结束后用PBST洗板3次。再加入抗原人NT5E-Biotin 0.5μg/ml并置于37℃条件下孵育30分钟，然后用PBST洗板3次。在酶标板孔内加入PBST溶液梯度稀释的抗体(抗体稀释梯度详见表3)，加入待测抗体的酶标板置于37℃条件下孵育30分钟，孵育完成后用PBST洗板3次。洗板后加入1∶5000比例稀释的HR标记羊抗人IgG(H+L)(Jackson，货号：109-035-088)二抗工作液，置于37℃条件下孵育30分钟。孵育完成后使用PBST洗板4次，后加入TMB(Neogen，308177)避光显色5min，加入终止液终止显色反应。立即把酶标板放入酶标仪中，选择450nm光波长读取酶标板各孔的OD数值。用SoftMax Pro 6.2.1软件对数据进行分析处理。
检测结果如表3和图2所示。由图可知，P1D7V01、P1D7V02R、P1D7V03、P1D7V04R与抗原人NT5E-Biotin能够有效的结合，并且其结合效率呈剂量依赖关系(各剂量的吸光度强度见表3)。通过对结合的抗体进行吸光度定量分析，曲线模拟计算获得抗体P1D7V01、P1D7V02R、P1D7V03、P1D7V04R、19F3H2L3和MEDI9447(作为对照抗体)的结合效率EC50分别为0.063nM、0.230nM、0.068nM和0.439nM、0.045nM、0.042nM。
以上实验结果表明，在相同实验条件下，双特异抗体P1D7V01、P1D7V02R、P1D7V03、P1D7V04R结合人NT5E-Biotin的活性与同靶点阳性药19F3H2L3、MEDI9447相当，提示P1D7V01、P1D7V02R、P1D7V03、P1D7V04R具有有效结合人NT5E-Biotin的活性。
表3：ELISA检测P1D7V01、P1D7V02R、P1D7V03、P1D7V04R、19F3H2L3、MEDI9447与人NT5E-Biotin的结合
Figure BDA0003034057890000421
实施例9：竞争ELISA方法分别测定抗体抗CD73-抗PD-1双特异性抗体与人PD-L1-mFc竞争结合人PD-1-mFc-Biotin的活性
将人PD-L1-mFc(PD-L1 Genbank ID：NP_054862.1，mFc SEQ ID NO：143)以2μg/mL包被酶标板后，4℃孵育过夜。孵育结束后用1％BSA的PBS溶液在37℃条件下对酶标板进行封闭2小时，封闭结束后洗板三次并拍干。在稀释板上以10μg/mL作为起始浓度按照1：3的稀释比例将抗体进行梯度稀释至7个浓度，并设空白对照，然后加入等体积的0.3μg/mL的人PD-1-mFc-Biotin溶液，混匀后在室温孵育20分钟。然后将反应后混合液加入到包被好的酶标板，在37℃条件下孵育30分钟。孵育结束用PBST洗板三次并拍干，加入SA-HRP(KPL，14-30-00)工作液，在37℃条件下孵育30分钟。孵育完成后洗板四次拍干，后加入TMB(Neogen，308177)避光显色5min，加入终止液终止显色反应。立即把酶标板放入酶标仪中，选择450nm光波长读取酶标板各孔的OD数值，用SoftMax Pro 6.2.1软件对数据进行分析处理。
检测结果如图3所示。各剂量的OD值见表4。通过对结合的抗体进行吸光强度定量分析，曲线模拟抗体的结合效率获得结合EC50(表4)。
结果表明，P1D7V01、P1D7V02R、P1D7V03、P1D7V04R、14C12H1L1和Nivolumab(作为对照)能有效地阻断抗原人PD-1-mFc-Biotin与其受体人PD-L1-mFc的结合，且阻断效率呈现剂量依赖关系，P1D7V01、P1D7V02R、P1D7V03、P1D7V04R、14C12H1L1和Nivolumab阻断人PD-1-mFc-Biotin与其配体人PD-L1-mFc结合的EC50分别为1.115nM、1.329nM、1.154nM、1.339nM、1.459nM、1.698nM。
表4：P1D7V01、P1D7V02R、P1D7V03、P1D7V04R、14C12H1L1和Nivolumab与人PD-L1-mFc竞争结合人PD-1-mFc-Biotin的活性检测结果
Figure BDA0003034057890000431
实施例10：使用Fortebio分子相互作用仪测定抗CD73-抗PD-1双特异性抗体与抗原人PD-1-mFc结合的动力学参数
样品稀释缓冲液为PBST，0.1％BSA，pH7.4。将抗体以5μg/mL的浓度固定于AHC传感器上，固定高度约为0.4nm，传感器在缓冲液中平衡60s，固定在传感器上的抗体与抗原PD-1-mFc结合，抗原浓度为0.6-50nM(三倍稀释)，结合时间为120s，蛋白在缓冲液中解离，时间180s。检测温度为37度，检测频率为0.3Hz，样品板震动速率为1000rpm。数据以1∶1模型拟合分析，得到亲和力常数。
人源化抗体P1D7V01、14C12H1L1和Nivolumab(作为对照抗体)与人PD-1-mFc的亲和力常数测定结果见表5，检测结果如图4、图5和图6所示。人源化抗体P1D7V01、14C12H1L1和Nivolumab与人PD-1-mFc的亲和力常数依次为1.76E-10M，1.64E-10M，2.32E-10M。以上实验结果表明：P1D7V01与14C12H1L1、Nivolumab的结合能力相当，提示人源化抗体P1D7V01与人PD-1-mFc有较强的结合能力。
表5：P1D7V01、14C12H1L1、Nivolumab、与PD-1-mFc亲和力常数测定
待测抗体 KD(M) kon(1/Ms) SE(kon) kdis(1/s) S E(kdis) Rmax(nm)
P1D7V01 1.76E-10 4.19E+05 1.52E+04 7.37E-05 3.12E-05 0.13-0.17
14C12H1L1 1.64E-10 4.55E+05 1.61E+04 7.47E-05 2.98E-05 0.24-0.28
Nivolumab 2.32E-10 5.85E+05 2.03E+04 1.36E-04 3.47E-05 0.02-0.14
KD为亲和力常数；KD＝kdis/kon
实施例11：使用Fortebio分子相互作用仪测定抗CD73-抗PD-1双特异性抗体与抗原人NT5E(1-552)-his结合的动力学参数。
样品稀释缓冲液为PBST，pH7.4。将抗体以5μg/mL的浓度固定在Protein A传感器上，固定时间为15s，传感器在缓冲液中平衡120s，固定在传感器上的抗体与抗原人NT5E(1-552)-his结合，抗原浓度为3.125-200nM(两倍稀释)，结合时间为120s，蛋白在缓冲液中解离，时间600s。传感器采用10mM Gly，pH1.5溶液再生。检测温度为37度，检测频率为0.6Hz，样品板震动速率为1000rpm。数据以1∶1模型拟合分析，得到亲和力常数
人源化抗体P1D7V01、MEDI 9447(作为对照抗体)与人NT5E(1-552)-his的亲和力常数测定结果见表6，检测结果如图7和图8所示。人源化抗体P1D7V01和MEDI 9447与人NT5E(1-552)-his的亲和力常数依次为2.29E-10M，1.04E-10M。
以上实验结果表明：P1D7V01与MEDI 9447的结合能力相当，提示人源化抗体P1D7V01与人NT5E(1-552)-his有较强的结合能力。
表6：P1D7V01、MEDI 9447与人NT5E(1-552)-his亲和力常数测定
待测抗体 KD(M) kon(1/Ms) S E(kon) kdis(1/s) S E(kdis) Rmax(nm)
P1D7V01 2.29E-10 1.81E+05 2.30E+03 4.13E-05 4.54E-06 0.47-0.57
MEDI 9447 1.04E-10 2.34E+05 3.20E+03 2.44E-05 5.02E-06 0.59-0.82
KD为亲和力常数；KD＝kdis/kon
实施例12：FACS检测抗CD73-抗PD-1双特异性抗体的结合活性
1.FACS检测抗CD73-抗PD-1双特异性抗体与293T-PD1膜表面PD-1的结合活性
收集对数生长期293T-PD1细胞，按3x105个细胞/管将细胞转移到1.5ml离心管，加入500μL PBSA，5600rpm离心5min，去上清；加入PBSA稀释的抗体100μL(终浓度分别为100，33.33，11.11，3.7，1.23，0.41，0.14，0.05nM)，轻柔混匀后于冰上孵育1h；加入500μL PBSA，5600rpm离心5min，去上清；加入500倍稀释的FITC标记羊抗人IgG二抗(Jackson，货号：109-095-098)重悬混匀，冰上避光孵育0.5h；加入500μLPBSA，5600rpm离心5min，去上清；加入200μLPBSA重悬细胞沉淀，并转移至流式管，FACSCalibur检测。
实验结果如表7和图9所示，P1D7V01、P1D7V02R、P1D7V03、P1D7V04R均可特异性与293T-PD1膜表面PD-1结合，且呈剂量依赖关系，与PD1单靶点对照抗体14C12H1L1相比，均强于14C12H1L1。
在相同实验条件下，P1D7V01、P1D7V02R、P1D7V03、P1D7V04R与293T-PD1结合的EC50分别为1.000nM、1.075nM、1.377nM、1.57nM，14C12H1L1与293T-PD1结合的EC50为2.111nM。
以上实验结果表明，在相同实验条件下P1D7V01、P1D7V02R、P1D7V03、P1D7V04R与293T-PD1结合活性均优于PD1单靶点对照抗体14C12H1L1，提示P1D7V01、P1D7V02R、P1D7V03、P1D7V04R具有有效结合293T-PD1膜表面PD-1的活性。
表7：FACS检测P1D7V01、P1D7V02R、P1D7V03、P1D7V04R和14C12H1L1与293T-PD1细胞表面PD-1的结合活性
浓度(nM) 0.05 0.14 0.41 1.23 3.70 11.11 33.33 100.00 EC50
14C12H1L1 35.69 57.70 129.42 437.62 974.97 1384.91 1174.75 1500.20 2.111
P1D7V01 26.65 58.65 150.57 307.19 530.77 577.76 479.34 531.15 1.000
P1D7V02R 23.44 42.98 108.44 217.56 404.33 426.06 405.29 301.40 1.075
P1D7V03 24.05 49.21 118.03 289.08 384.62 459.40 808.38 343.48 1.377
P1D7V04R 24.79 52.43 112.56 288.79 466.72 1284.73 400.33 360.79 1.57.0
2.FACS检测抗CD73-抗PD-1双特异性抗体与MDA-MB-231膜表面CD73的结合活性
常规胰酶消化对数期MDA-MB-231细胞，按3x105个细胞/管将细胞转移到1.5ml离心管，加入500μL PBSA，5600rpm离心5min，去上清；加入PBSA稀释的抗体100μL(终浓度分别为100，33.33，11.11，3.7，1.23，0.41，0.14，0.05nM)，轻柔混匀后于冰上孵育1h；加入500μLPBSA，5600rpm离心5min，去上清；加入500倍稀释的FITC标记羊抗人IgG二抗(Jackson，货号：109-095-098)重悬混匀，冰上避光孵育0.5h；加入500μLPBSA，5600rpm离心5min，去上清；加入200μLPBSA重悬细胞沉淀，并转移至流式管，FACSCalibur检测。
实验结果如表8和图10所示，与MDA-MB-231膜表面CD73的结合活性，P1D7V01和P1D7V03优于19F3H2L3，其中P1D7V01优于同靶点阳性药MEDI9447。在相同实验条件下，P1D7V01、P1D7V03与MDA-MB-231膜表面CD73结合的EC50分别为1.384nM、2.009nM，MEDI9447和19F3H2L3与MDA-MB-231膜表面CD73结合的EC50分别为1.589nM、2.773nM。
以上实验结果表明，P1D7V01、P1D7V03、19F3H2L3和同靶点阳性药MEDI9447均可呈剂量依赖性与MDA-MB-231膜表面CD73特异性结合，P1D7V01和P1D7V03的结合活性优于19F3H2L3，P1D7V01优于同靶点阳性药MEDI9447。提示P1D7V01、P1D7V03具有有效结合MDA-MB-231膜表面CD73的活性。
表8：FACS检测P1D7V01、P1D7V03、MEDI9447和19F3H2L3与MDA-MB-231细胞表面CD73的结合活性。
浓度(nM) 0.05 0.14 0.41 1.23 3.70 11.11 33.33 100.00 EC50
MEDI9447 32.59 64.38 157.75 388.51 697.80 829.29 930.26 878.04 1.589
19F3H2L3 25.95 45.13 102.56 189.07 466.87 658.72 843.09 639.57 2.773
P1D7V01 23.37 38.02 76.84 271.72 571.56 560.81 525.91 705.50 1.384
P1D7V03 16.96 44.05 106.39 233.32 457.61 525.37 576.19 677.66 2.009
实施例13：抗CD73-抗PD-1双特异性抗体抑制细胞膜表面CD73酶活性的检测
1.检测抗CD73-抗PD-1双特异性抗体对MDA-MB-231细胞膜表面CD73酶活性的抑制
实验步骤如下：取状态良好的对数期MDA-MB-231细胞，用无血清的RPMI-1640培养液将细胞重悬、计数；将MDA-MB-231细胞接种至96孔板，2x104个细胞/100μL/孔；用无血清RPMI-1640培养液按2.5倍进行梯度稀释抗体；将抗体加入96孔板，每孔50μL，37℃孵育1小时，1小时后，每孔加入50μL 1200μM RPMI-1640稀释的AMP(TCL，货号：A0157)；3小时后取25μL细胞培养上清，转移至新96孔板，每孔加入25μL 100μM的ATP(TCL，货号：A0158)；每孔加入50μL CTG(CellTiterGlo，Promega，货号：G8641)显色液，进行显色，于多标记微孔板检测仪(PerkinElmer 2140-0020)读取相对荧光强度RLU。
实验结果如图11所示，P1D7V01、P1D7V02R、P1D7V03、P1D7V04R与阳性对照药MEDI9447的AMP含量相当，并且呈浓度依赖关系。
以上实验结果说明加入的AMP，在无抗体情况下，可被MDA-MB-231细胞表面CD73的酶活性催化而转化为腺苷A，而加入抗体后，由于P1D7V01、P1D7V02R、P1D7V03、P1D7V04R抗体与CD73结合而降低了其酶催化的活性，使AMP不会转化为腺苷A。提示抗体以非底物竞争的方式有效抑制其酶活反应，降低腺苷的产生。
2.检测抗CD73-抗PD-1双特异性抗体对U87-MG细胞膜表面CD73酶活性的抑制
取状态良好的对数期U87-MG细胞，用无血清的RPMI-1640培养液将细胞重悬、计数；将U87-MG细胞接种至96孔板，2x104个细胞/100μL/孔；用无血清RPMI-1640培养液按2.5倍进行梯度稀释抗体，将抗体加入96孔板，每孔50μL，37℃孵育1小时；1小时后，每孔加入50μL 1200uM RPMI-1640稀释的AMP；3小时后取25μL细胞培养上清，转移至新96孔板，每孔加入25μL 100μM的ATP；每孔加入50μl CTG(CellTiterGlo)显色液，进行显色后于多标记微孔板检测仪(PerkinElmer 2140-0020)读取相对荧光强度RLU。
实验结果如图12所示，P1D7V01、P1D7V02R、P1D7V03、P1D7V04R与阳性对照药MEDI9447的AMP含量相当，并且呈浓度依赖关系。
以上实验结果说明加入的AMP，在无抗体情况下，可被U87-MG细胞表面CD73的酶活性催化而转化为腺苷A，而加入抗体后，由于P1D7V01、P1D7V02R、P1D7V03、P1D7V04R抗体与CD73结合而降低了其酶催化的功能，使AMP不会转化为腺苷A。提示抗体以非底物竞争的方式有效抑制其酶活反应，降低腺苷的产生。
实施例14：混合淋巴细胞反应MLR检测抗CD73-抗PD-1双特异性抗体促IFN-γ和IL-2分泌的生物活性
1.抗CD73-抗PD-1双特异性抗体促Raji-PDL1混合淋巴反应体系分泌IFN-γ的生物活性检测
Raji-PDL1细胞正常传代培养；复苏PBMC，用10mL 1640完全培养基培养，0.5μg/mL的SEB(德诺泰克，货号：S010201)刺激两天；Raji-PDL1细胞用25μg/mL的MMC(Sigma，货号：M4287)处理，置于37℃培养箱中1小时；收集SEB刺激2天后PBMC和经MMC处理1小时的Raji-PDL1细胞，PBS洗涤两次，完全培养基重悬计数，分别加入到U型96孔板，100000个细胞/孔；按实验设计加入抗体，于培养箱共培养3天；3天后，收集细胞培养上清，ELISA法进行IFN-γ检测。
如图13所示，人PBMC和Raji-PDL1细胞混合培养后对PBMC的IFN-γ的分泌具有显著促进作用，在混合培养体系中同时加入抗体能显著诱导PBMC进一步分泌IFN-γ，促IFN-γ分泌活性水平方面，P1D7V01、P1D7V02R、P1D7V03、P1D7V04R抗体与其母版PD-1单靶点抗体14C12H1L1活性相当。
2.抗CD73-抗PD-1双特异性抗体促Raji-PDL1混合淋巴反应体系分泌IL-2的生物活性检测
Raji-PDL1细胞正常传代培养；复苏PBMC，用10mL 1640完全培养基培养，SEB(0.5μg/mL)刺激两天；Raji-PDL1细胞用25μg/mL的MMC处理，置于37℃培养箱中1小时；收集SEB刺激2天后的PBMC和经MMC处理1小时的Raji-PDL1细胞，PBS洗两次，完全培养基重悬计数，分别加入到U型96孔板，100000个细胞/孔；按实验设计加入抗体，共培养3天；收集细胞培养上清，ELISA法进行IL-2检测。
如图14所示，人PBMC和Raii-PDL1细胞混合培养后对PBMC的IL-2的分泌有一定的促进作用，在混合培养体系中同时加入抗体能显著诱导PBMC进一步分泌IL-2，具有显著剂量依赖关系，促IL-2分泌活性水平方面，双功能抗体P1D7V01、P1D7V02R、P1D7V03、P1D7V04R在低浓度活性略低于其母版PD-1单靶点抗体14C12H1L1，而中高浓度与其相当，与PD1靶点阳性对照药Nivolumab相比，P1D7V01、P1D7V02R、P1D7V03、P1D7V04R在三个不同抗体浓度水平都具更佳的促IL-2分泌潜能。
3.抗CD73-抗PD-1双特异性抗体促DC混合淋巴反应体系分泌IFN-γ的生物活性检测
分离正常人外周血PBMC，完全培养基重悬，接种于培养皿，置于培养箱过夜培养后，收集去除悬浮的PBMC，皿底贴壁细胞用PBS缓冲液洗涤后进行DC成熟诱导：每皿加入含GM-CSF和IL-4的RPMI1640完全培养基10mL，GM-CSF和IL-4浓度均为1000U/mL，置于37℃，5％二氧化碳培养箱中培养三天；半量换液，补加GM-CSF、IL-4各1000U/mL，置于37℃，5％二氧化碳培养箱中继续培养三天；三天后再次半量换液，加入GM-CSF、IL-4各1000U/mL，TNF-α100U/mL，继续培养两天；新鲜分离另外供者的PBMC，细胞计数后接种至96孔板，100000个细胞/孔；收集诱导成熟的DC细胞，用完全培养基洗涤一次，细胞计数，接种至含PBMC的96孔板，10000个细胞/孔；按实验设计加入抗体，混匀后置于37℃，5％二氧化碳培养箱中共培养5天；5天后，收集细胞培养上清，ELISA法进行IFN-γ定量检测。
结果如图15所示，相比单独DC或PBMC培养，DC与PBMC的混合培养可显著促进IFN-γ的分泌；与同型对照相比，在DC与PBMC二者混合培养的基础上加入抗CD73-抗PD-1双特异性抗体，可见IFN-γ分泌水平进一步显著提高。
抗CD73-抗PD-1双特异性抗体促DC混合淋巴反应体系分泌IL-2的生物活性检测分离正常人外周血PBMC，完全培养基重悬，接种于培养皿，置于培养箱过夜培养后，收集去除悬浮的PBMC，皿底贴壁细胞用PBS缓冲液洗涤后进行DC成熟诱导；每皿加入含GM-CSF和IL-4的RPMI1640完全培养基10mL，GM-CSF和IL-4浓度均为2000U/mL，置于37℃，5％二氧化碳培养箱中培养三天；半量换液，加入50ng/mL的IFN-γ和100ng/mL的LPS，继续培养两天；复苏另外供者的PBMC，细胞计数后接种至96孔板，100000个细胞/孔；收集诱导成熟的DC细胞，用完全培养基洗涤一次，细胞计数，接种至含PBMC的96孔板，10000个细胞/孔；按实验设计加入抗体，混匀后置于37℃，5％二氧化碳培养箱中共培养5天；5天后，收集细胞培养上清，ELISA法进行IL-2定量检测。结果如图16所示，相比单独DC或PBMC培养，DC与PBMC的混合培养可显著促进IL-2的分泌；与同型对照相比，在DC与PBMC二者混合培养的基础上加入抗CD73-抗PD-1双特异性抗体，可见IL-2分泌水平进一步显著提高。
实施例15：抗PD-1/CD73双特异性抗体NTPDV1、NTPDV2、NTPDV3、NTPDV4的制备
双特异性抗体NTPDV1、NTPDV2、NTPDV3、NTPDV4的结构模式属于Morrison模式(IgG-scFv)，即在一个IgG抗体的两条重链的C端均通过连接片段连接另一个抗体的scFv片段，其重链和轻链的设计组成如下面的表9。
由于其免疫球蛋白部分的恒定区区域引入了氨基酸突变以消除其与FcγR的结合活性，因此NTPDV1、NTPDV2、NTPDV3、NTPDV4在本文及在申请号为202110270671.X的中国发明专利中又写为NTPDV1(hG1TM)、NTPDV2(hG1TM)、NTPDV3(hG1TM)、NTPDV4(hG1TM)。
表9：NTPDV1、NTPDV2、NTPDV3、NTPDV4的序列设计
Figure BDA0003034057890000511
上面的表9中：
右下角标注“V”的，是指相应重链的可变区或者相应轻链的可变区。没有标注“V”的，相应重链或者轻链为包含恒定区的全长。这些可变区或者全长的氨基酸序列及其编码核酸序列均参照上面的实施例中记载的相应序列。
Linker1的氨基酸序列为(GGGGS)结构重复4次，即(GGGGS)4或者(G4S)4(核苷酸序列SEQ ID NO：80，氨基酸序列SEQ ID NO：79)；
Linker2的氨基酸序列为(GGGGS)结构重复3次，即(GGGGS)4或者(G4S)3(核苷酸序列SEQ ID NO：82，氨基酸序列SEQ ID NO：81)。
NTPDV1、NTPDV2、NTPDV3、NTPDV4中免疫球蛋白部分中的轻链19F3L2和19F3L3的3个CDR序列为和19F3中轻链CDR序列一致。
NTPDV1、NTPDV2、NTPDV3、NTPDV4中免疫球蛋白部分中的19F3H2(hG1TM)的3个CDR序列为和19F3中重链CDR序列一致。
NTPDV1、NTPDV2、NTPDV3、NTPDV4中的scFv部分的14C12H1V-Linker2-14C12L1V和14C12H1V-Linker1-14C12L1V的CDR序列和14C12中的重链CDR和轻链CDR一致。
NTPDV2和NTPDV4重链的氨基酸序列一致，记为NTPDH2/4(SEQ ID NO：83)，NTPDV2、NTPDV4的重链的核苷酸序列为SEQ ID NO：84。
NTPDV1和NTPDV3的重链的氨基酸序列一致，记为NTPDH1/3(SEQ ID NO：85)，NTPDV1和NTPDV3的重链的核苷酸序列为SEQ ID NO：86。
NTPDV1、NTPDV2、NTPDV3、NTPDV4中免疫球蛋白部分中的19F3L3和19F3L2的3个CDR序列和抗体19F3轻链三个CDR一致。
NTPDV1、NTPDV2中的免疫球蛋白部分的轻链19F3L3的氨基酸序列和抗体19F3H2L3(G1M)的轻链序列一致(SEQ ID NO：28)，NTPDV1、NTPDV2中的免疫球蛋白部分的轻链19F3L3的核苷酸序列为SEQ ID NO：27。NTPDV3、NTPDV4中的免疫球蛋白部分的轻链19F3L2的氨基酸序列为SEQ ID NO：96)，NTPDV3、NTPDV4中的免疫球蛋白部分的轻链19F3L2的核苷酸序列为SEQ ID NO：100。
(1)NTPDV1，其重链氨基酸序列如SEQ ID NO：85所示，轻链氨基酸序列如SEQ IDNO：28所示，连接片段1的氨基酸序列如SEQ ID NO：79所示，14C12H1V的氨基酸序列如SEQID NO：66所示，连接片段2的氨基酸序列如SEQ ID NO：81所示，14C12L1V的氨基酸序列如SEQ ID NO：68所示，
(2)NTPDV2，其重链氨基酸序列如SEQ ID NO：85所示，轻链氨基酸序列如SEQ IDNO：28所示，连接片段1的氨基酸序列如SEQ ID NO：79所示，14C12H1V的氨基酸序列如SEQID NO：66所示，连接片段1的氨基酸序列如SEQ ID NO：79所示，14C12L1V的氨基酸序列如SEQ ID NO：68所示，
(3)NTPDV3，其重链氨基酸序列如SEQ ID NO：85所示，轻链氨基酸序列如SEQ IDNO：96所示，连接片段1的氨基酸序列如SEQ ID NO：79所示，14C12H1V的氨基酸序列如SEQID NO：66所示，连接片段2的氨基酸序列如SEQ ID NO：81所示，14C12L1V的氨基酸序列如SEQ ID NO：68所示，和
(4)NTPDV4，其重链氨基酸序列如SEQ ID NO：85所示，轻链氨基酸序列如SEQ IDNO：96所示，连接片段1的氨基酸序列如SEQ ID NO：79所示，14C12H1V的氨基酸序列如SEQID NO：66所示，连接片段1的氨基酸序列如SEQ ID NO：79所示，14C12L1V的氨基酸序列如SEQ ID NO：68所示。
抗体的表达和纯化
分别将NTPDV1、NTPDV3的重链cDNA和NTPDV2、NTPDV4的重链cDNA序列，以及其轻链的cDNA序列克隆到pUC57simple(金斯瑞公司提供)载体中，分别获得pUC57simple-NTPDH2/4，pUC57simple-NTPDH1/3和pUC57simple-19F3L3质粒和pUC57simple-19F3L2质粒。
分别将质粒pUC57simple-NTPDH2/4和pUC57simple-19F3L3质粒、pUC57simple-NTPDH2/4和pUC57simple-19F3L2质粒、pUC57simple-NTPDH1/3和pUC57simple-19F3L3质粒、pUC57simple-NTPDH1/3和pUC57simple-19F3L2质粒进行酶切(HindIII&EcoRI)，电泳回收得到的重链轻链分别亚克隆到pcDNA3.1载体中，得到pcDNA3.1-NTPDH2/4和pcDNA3.1-19F3L3质粒、pcDNA3.1-NTPDH2/4和pcDNA3.1-19F3L2质粒、pcDNA3.1-NTPDH1/3和pcDNA3.1-19F3L3质粒、pcDNA3.1-NTPDH1/3和pcDNA3.1-19F3L2质粒，提取重组质粒共转染293F细胞。细胞培养7天后，将培养液通过高速离心、上清浓缩后上样至HiTrap MabSelectSuRe柱，用Elution Buffer一步洗脱蛋白并回收目标样品并换液至PBS。
按照前述制备例中提及的表达和纯化方法获得纯化的抗体NTPDV1、NTPDV2、NTPDV3、NTPDV4。
实施例16：ELISA方法测定抗CD73-抗PD-1双特异性抗体与抗原的结合活性
1.ELISA方法分别测定NTPDV1、NTPDV2、NTPDV3、NTPDV4与抗原PD-1-mFc的结合活性。
将PD-1-mFc(0.5μg/ml)包被酶标板置于4℃孵育过夜，然后使用PBST洗板包被了抗原的酶标板1次，再使用1％BSA的PBS溶液作为封闭液在37℃下对酶标板进行封闭2小时。酶标板封闭结束后用PBST洗板3次，加入PBST溶液梯度稀释的抗体(抗体稀释梯度详见表2)，加入待测抗体的酶标板置于37℃条件下孵育30分钟，孵育完成后用PBST洗板3次。洗板后加入1：5000比例稀释的HR标记羊抗人IgG Fc(Jackson，货号：109-035-098)二抗工作液，然后置于37℃条件下孵育30分钟。孵育完成后使用PBST洗板4次，后加入TMB(Neogen，308177)避光显色8min，加入终止液终止显色反应。立即把酶标板放入酶标仪中，选择450nm光波长读取酶标板各孔的OD数值。用SoftMax Pro 6.2.1软件对数据进行分析处理。
检测结果如表10所示。可知，NTPDV1、NTPDV2、NTPDV3、NTPDV4与抗原PD-1-mFc能够有效的结合，并且其结合效率呈剂量依赖关系，各剂量的吸光度强度见表10，通过对结合的抗体进行吸光度定量分析，曲线模拟计算获得抗体NTPDV1、NTPDV2、NTPDV3、NTPDV4、14C12H1L1(hG1TM)(作为对照)的结合效率EC50分别为0.101nM、0.119nM和0.110nM、0.123nM、0.031nM。
以上实验结果表明，在相同实验条件下，NTPDV1、NTPDV2、NTPDV3、NTPDV4结合PD-1-mFc的活性与同靶点阳性药14C12H1L1(hG1TM)相当，提示NTPDV1、NTPDV2、NTPDV3、NTPDV4具有有效结合PD-1-mFc的活性。
表10：ELISA检测NTPDV1、NTPDV2、NTPDV3、NTPDV4、14C12H1L1(hG1TM)与PD-1-mFc的结合
Figure BDA0003034057890000541
Figure BDA0003034057890000551
2.ELISA方法分别测定NTPDV1、NTPDV2、NTPDV3、NTPDV4与抗原人NT5E-Biotin的结合活性
将链霉亲和素SA(2μg/ml)包被酶标板后置于4℃孵育过夜。孵育结束后使用PBST对包被了链霉亲和素的酶标板洗板1次，1％BSA的PBS溶液作为酶标板封闭液，对酶标板在37℃进行封闭2小时。酶标板封闭结束后用PBST洗板3次。再加入抗原人NT5E-Biotin 0.5μg/ml并置于37℃条件下孵育30分钟，然后用PBST洗板3次。在酶标板孔内加入PBST溶液梯度稀释的抗体(抗体稀释梯度详见表11)，加入待测抗体的酶标板置于37℃条件下孵育30分钟，孵育完成后用PBST洗板3次。洗板后加入1∶5000比例稀释的HR标记羊抗人IgG Fc(Jackson，货号：109-035-098)二抗工作液，置于37℃条件下孵育30分钟。孵育完成后使用PBST洗板4次，后加入TMB(Neogen，308177)避光显色7min，加入终止液终止显色反应。立即把酶标板放入酶标仪中，选择450nm光波长读取酶标板各孔的OD数值。用SoftMax Pro6.2.1软件对数据进行分析处理。
检测结果如表11所示。可知，NTPDV1、NTPDV2、NTPDV3、NTPDV4、19F3H2L3(hG1M)与抗原人NT5E-Biotin能够有效的结合，并且其结合效率呈剂量依赖关系(各剂量的吸光度强度见表11)。通过对结合的抗体进行吸光度定量分析，曲线模拟计算获得抗体NTPDV1、NTPDV2、NTPDV3、NTPDV4、19F3H2L3(hG1M)(作为对照抗体)的结合效率EC50分别为0.079nM、0.082nM和0.084nM、0.077nM、0.029nM。
以上实验结果表明，在相同实验条件下，双特异抗体NTPDV1、NTPDV2、NTPDV3、NTPDV4结合人NT5E-Biotin的活性与同靶点阳性药19F3H2L3(hG1M)相当，提示NTPDV1、NTPDV2、NTPDV3、NTPDV4具有有效结合人NT5E-Biotin的活性。
表11：ELISA检测NTPDV1、NTPDV2、NTPDV3、NTPDV4、19F3H2L3(hG1M)与人NT5E-Biotin的结合
Figure BDA0003034057890000561
实施例17：竞争ELISA方法分别测定抗CD73-抗PD-1双特异性抗体与人PD-L1-mFc竞争结合人PD-1-mFc-Biotin的活性
将人PD-L1-mFc(PD-L1 Genbank ID：NP_054862.1，mFc SEQ ID NO：89)以2μg/mL包被酶标板后，4℃孵育过夜。孵育结束后用1％BSA的PBS溶液在37℃条件下对酶标板进行封闭2小时，封闭结束后洗板一次并拍干。在稀释板上以10μg/mL作为起始浓度按照1：3的稀释比例将抗体进行梯度稀释至7个浓度，并设空白对照，然后加入等体积的0.3μg/mL的人PD-1-mFc-Biotin溶液，混匀后在室温孵育10分钟。然后将反应后混合液加入到包被好的酶标板，在37℃条件下孵育30分钟。孵育结束用PBST洗板三次并拍干，加入SA-HRP(KPL，14-30-00)工作液，在37℃条件下孵育30分钟。孵育完成后洗板四次拍干，后加入TMB(Neogen，308177)避光显色5min，加入终止液终止显色反应。立即把酶标板放入酶标仪中，选择450nm光波长读取酶标板各孔的OD数值，用SoftMax Pro 6.2.1软件对数据进行分析处理。
各剂量的OD值见表12。通过对结合的抗体进行吸光强度定量分析，曲线模拟抗体的结合效率获得结合EC50(表12)。
结果表明，NTPDV1、NTPDV2、NTPDV3、NTPDV4、14C12H1L1(hG1TM)(作为对照)能有效地阻断抗原人PD-1-mFc-Biotin与其受体人PD-L1-mFc的结合，且阻断效率呈现剂量依赖关系，NTPDV1、NTPDV2、NTPDV3、NTPDV4、14C12H1L1(hG1TM)阻断人PD-1-mFc-Biotin与其配体人PD-L1-mFc结合的EC50分别为2.249nM、2.253nM、2.332nM、2.398nM、2.216nM、2.231nM。
表12：NTPDV1、NTPDV2、NTPDV3、NTPDV4、14C12H1L1(hG1TM)与人PD-L1-mFc竞争结合人PD-1-mFc-Biotin的活性检测结果
Figure BDA0003034057890000571
实施例18：使用Fortebio分子相互作用仪测定抗CD73-抗PD-1双特异性抗体与抗原人PD-1-mFc结合的动力学参数
样品稀释缓冲液为PBS，0.02％Tween-20，0.1％BSA，pH7.4。将PD1-mFc以5μg/mL的浓度固定于AMC传感器上，固定高度约为0.1nm(时间60s)，传感器在缓冲液中平衡60s，固定在传感器上的PD1-mFc与抗体结合，浓度为0.62-50nM(三倍稀释)，时间120s，蛋白在缓冲液中解离，时间300s。检测温度为30度，检测频率为0.3Hz，样品板震动速率为1000rpm。数据以1∶1模型拟合分析，得到亲和力常数。
人源化抗体NTPDV1、NTPDV2、NTPDV3、NTPDV4和Nivolumab(作为对照抗体)与人PD-1-mFc的亲和力常数测定结果见表13，检测结果如图19、图20、图21、图22和图18所示。人源化抗体NTPDV1、NTPDV2、NTPDV3、NTPDV4和Nivolumab与人PD-1-mFc的亲和力常数依次为1.40E-10M，7.39E-11M，1.25E-10M、1.13E-11M、2.26E-10M。以上实验结果表明：NTPDV1、NTPDV3、Nivolumab的结合能力相当，NTPDV2、NTPDV4的结合能力优于Nivolumab，提示人源化抗体NTPDV1、NTPDV2、NTPDV3、NTPDV4与人PD-1-mFc有较强的结合能力。
表13：14C12H1L1(hG1TM)、NTPDV1、NTPDV2、NTPDV3、NTPDV4、Nivolumab与PD-1-mFc亲和力常数测定
Figure BDA0003034057890000581
KD为亲和力常数；KD＝kdis/kon
实施例19：使用Fortebio分子相互作用仪测定抗CD73-抗PD-1双特异性抗体与抗原人NT5E(1-552)-his结合的动力学参数。
样品稀释缓冲液为PBS，0.02％Tween-20，0.1％BSA，pH7.4。将HNT5E(1-552)-His以5μg/mL的浓度固定于HIS1K传感器上，固定高度约为0.4nm(时间50s)，传感器在缓冲液中平衡60s，固定在传感器上的HNT5E(1-552)-His与抗体结合，浓度为0.31-25nM(三倍稀释)，时间100s，蛋白在缓冲液中解离，时间180s。检测温度为30度，检测频率为0.3Hz，样品板震动速率为1000rpm。数据以1∶1模型拟合分析，得到亲和力常数。
人源化抗体19F3H2L3(hG1M)(作为对照抗体)、NTPDV1、NTPDV2、NTPDV3、NTPDV4与人NT5E(1-552)-his的亲和力常数测定结果见表14，检测结果如图24-27所示。人源化抗体NTPDV1、NTPDV2、NTPDV3、NTPDV4与人NT5E(1-552)-his的亲和力常数依次为3.29E-11M，2.88E-11M、7.92E-11M、5.77E-11M。
以上实验结果表明：19F3H2L3(hG1M)、NTPDV1、NTPDV2、NTPDV3、NTPDV4的结合能力相当，提示人源化抗体NTPDV1、NTPDV2、NTPDV3、NTPDV4与人NT5E(1-552)-his有较强的结合能力。
表14：19F3H2L3(hG1M)、NTPDV1、NTPDV2、NTPDV3、NTPDV4与人NT5E(1-552)-his亲和力常数测定
Figure BDA0003034057890000591
KD为亲和力常数；KD＝kdis/kon
实施例20：抗CD73-抗PD-1双特异性抗体抑制U87-MG细胞膜表面CD73酶活性的检测
取状态良好的对数期U87-MG细胞，用无血清的RPMI-1640培养液将细胞重悬、计数；将U87-MG细胞接种至96孔板，2.5x104个细胞/60μL/孔；用无血清RPMI-1640培养液按实验设计浓度进行梯度稀释抗体，将抗体加入96孔板，每孔60μL，37℃孵育1小时；1小时后，每孔加入60μL 600uM RPMI-1640稀释的AMP；3小时后取100μL细胞培养上清，转移至新96孔板，每孔加入40μL CTG(CellTiterGlo)显色液，室温避光放置5min；5min后，每孔加入10μL300μM的ATP，进行显色后于多标记微孔板检测仪(PerkinElmer 2140-0020)读取相对荧光强度RLU。
实验结果如表15和图28所示，NTPDV2与阳性对照药MEDI9447的AMP含量相当。
以上实验结果说明加入的AMP，在无抗体情况下，可被U87-MG细胞表面CD73的酶活性催化而转化为腺苷A，而加入抗体后，由于NTPDV2抗体与CD73结合而降低了其酶催化的功能，使AMP不会转化为腺苷A。提示抗体以非底物竞争的方式有效抑制其酶活反应，降低腺苷的产生。
表15抗CD73-抗PD-1双特异性抗体抑制U87-MG细胞膜表面CD73酶活性的检测
抗体名称 MEDI9447 19F3H2L3(hG1M) NTPDV2
IC50(nM) 0.1189 0.3647 0.5551
实施例21：混合淋巴细胞反应MLR检测抗CD73-抗PD-1双特异性抗体促IFN-γ和IL-2分泌的生物活性
1.抗CD73-抗PD-1双特异性抗体促Raji-PDL1混合淋巴反应体系分泌IFN-γ的生物活性检测
Raji-PDL1细胞正常传代培养；复苏PBMC，用10mL 1640完全培养基培养，0.5μg/mL的SEB(德诺泰克，货号：S010201)刺激两天；Raji-PDL1细胞用25μg/mL的MMC(丝裂霉素C，Stressmarq，目录：SIH-246，批号：SM286474)处理，置于37℃培养箱中1小时；收集SEB刺激2天后PBMC和经MMC处理1小时的Raji-PDL1细胞，PBS洗涤两次，完全培养基重悬计数，分别加入到U型96孔板，1x105个细胞/孔；按实验设计加入抗体，于培养箱共培养3天；3天后，收集细胞培养上清，ELISA法进行IFN-γ检测。
如图29所示，人PBMC和Raji-PDL1细胞混合培养后对PBMC的IFN-γ的分泌具有显著促进作用，在混合培养体系中同时加入抗体能显著诱导PBMC进一步分泌IFN-γ，促IFN-γ分泌活性水平方面，NTPDV2抗体与其母版PD-1单靶点抗体14C12H1L1活性相当。
2.抗CD73-抗PD-1双特异性抗体促Raji-PDL1混合淋巴反应体系分泌IL-2的生物活性检测
Raji-PDL1细胞正常传代培养；复苏PBMC，用10mL 1640完全培养基培养，SEB(0.5μg/mL)刺激两天；Raji-PDL1细胞用25μg/mL的MMC处理，置于37℃培养箱中1小时；收集SEB刺激2天后的PBMC和经MMC处理1小时的Raji-PDL1细胞，PBS洗两次，完全培养基重悬计数，分别加入到U型96孔板，1x105个细胞/孔；按实验设计加入抗体，共培养3天；收集细胞培养上清，ELISA法进行IL-2检测。
如图29所示，人PBMC和Raji-PDL1细胞混合培养后对PBMC的IL-2的分泌有一定的促进作用，在混合培养体系中同时加入抗体能显著诱导PBMC进一步分泌IL-2，具有显著剂量依赖关系，促IL-2分泌活性水平方面，双功能抗体NTPDV2在低浓度活性与其母版PD-1单靶点抗体14C12H1L1相当，而中高浓度略低于母版PD-1单靶点抗体14C12H1L1。
实施例22：抗CD73-抗PD-1双特异性抗体体内抑制肿瘤生长实验
为检测抗CD73-抗PD-1双特异性抗体的体内抑瘤活性，首先用MC38-hPDL1/hCD73细胞(来源于江苏集萃药康生物科技有限公司)，皮下接种到5-7周龄的雌性C57BL6-hPDlhPDL1hCD73三转基因小鼠(来源于江苏集萃药康生物科技有限公司)，造模与具体的给药方式见表16。给药后测量各组肿瘤的长宽，计算肿瘤体积。
表16：实验设计。
Figure BDA0003034057890000611
Figure BDA0003034057890000621
实验结果如图30、图31所示，结果表明：相比同型对照抗体hIgG，19F3H2L3(hG1M)，不同剂量NTPDV2均能有效抑制小鼠肿瘤的生长，且高剂量NTPDV2对肿瘤的抑制优于低剂量NTPDV2。此外，NTPDV2对荷瘤小鼠体重无影响。
实验例23：Fc段突变可有效消除由双特异性免疫检查点抑制剂PD-1/CD73双特异性抗体介导的IL-8和IL-6的分泌
HPMM由PBMC诱导而来。本研究中所使用的PBMC均为在中山康方生物医药有限公司分离制备，且经提供者知情同意。
Ficoll-Paque PLUS淋巴细胞分离液(GE，货号：17-1440-03)；RPMI 1640(Gibco，货号：22400-105)；CHO-K1-PD1细胞(中山康方生物医药有限公司构建)；U87-MG细胞(细胞来源于ATCC，购自北京中原领先科技有限公司)；FBS(Fetal Bovine Serum，Excell bio，货号：FSP500)；人IFN-γ蛋白(sinobio，货号：11725-HNAS-100)；LPS(Lipopolysaccharides)，脂多糖(sigma，货号：L4391)；96孔细胞培养板(康宁)。
按照分离液Ficoll-PaqueTM Plus试剂说明书分离健康人PBMC并用含2％FBS的1640培养基重悬，在37℃，5％CO2细胞培养箱中放置。2h后去除上清，贴壁细胞用PBS洗涤2次，加入1640完全培养基(含10％FBS)以及100ng/mL人M-CSF诱导7天。第3天和第5天换液并补充M-CSF以诱导HPMM。第7天HPMM诱导完成后收集，用完全培养基调整浓度为10万/mL并分装至96孔板中，并加入重组人IFN-γ(50ng/mL)，放置培养箱孵育24h。24h后收集对数期的表达人PD-1的CHO-K1-PD1细胞或者组成性表达人CD73的U87-MG细胞，重悬后用完全培养基调整浓度为30万/mL。抗体用完全培养基稀释至工作浓度为25nM、2.5nM、0.25nM。并同时设计同型对照抗体和空白对照。将96孔板中上清去掉，加入CHO-K1-PD1或者U87-MG细胞悬液和抗体(终体积200μL)混匀，放置培养箱孵育24h。500xg离心5min后收集上清并用达科为试剂盒检测IL-8、IL-6分泌量。LPS作为阳性对照药物，实验中由完全培养基调整浓度为100ng/mL。
本实施例中，CHO-K1-PD1及U87-MG细胞细胞作为靶细胞与HPMM共培养可诱导HPMM活化，活化的HPMM通过抗体Fab链接靶细胞后，抗体Fc段与HPMM上的FcγR作用，引起HPMM分泌细胞因子。
3.实验结果
如图32-图35所示。
结果显示，相较于野生型IgG1亚型的PD-1抗体或者CD73抗体，携带有Fc段突变的抗PD-1/CD73双特异性抗体能够有效地消除免疫细胞的IL-6和/或IL-8的分泌。
以上对本发明的较佳实施方式进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明精神的前提下还可做出种种的等同变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
序列表
19F3的重链可变区核苷酸序列：
Figure BDA0003034057890000644
(SEQ ID NO：1，下划线表示CDR序列)
19F3的重链可变区氨基酸序列：
Figure BDA0003034057890000641
(SEQ ID NO：2，下划线表示CDR序列)
19F3的HCDR1：GYSFTGYT
(SEQ ID NO：3)
19F3的HCDR2：INPYNAGT
(SEQ ID NO：4)
19F3的HCDR3：ARSEYRYGGDYFDY
(SEQ ID NO：5)
19F3轻链可变区的核苷酸序列：
Figure BDA0003034057890000642
(SEQ ID NO：6，下划线表示CDR序列)
19F3轻链可变的氨基酸序列：
Figure BDA0003034057890000643
(SEQ ID NO：7，下划线表示CDR序列)
19F3的LCDR1氨基酸序列：QSLLNSSNQKNY
(SEQ ID NO：8)
19F3的LCDR2氨基酸序列：FAS
(SEQ ID NO：9)
19F3的LCDR3氨基酸序列：QQHYDTPYT
(SEQ ID NO：10)
19F3重链的骨架区氨基酸序列：
FR-H1：EVQLQQSGPELVKPGASMRMSCKAS(SEQ ID NO：11)
FR-H2：MNWVKQSHGKNLEWIGL(SEQ ID NO：12)
FR-H3：SYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYC(SEQ ID NO：13)
FR-H4：WGQGTTLTVSS(SEQ ID NO：14)
19F3轻链的骨架区氨基酸序列：
FR-L1：DIVMTQSPSSLAMSVGQKVTMSCKSS(SEQ ID NO：15)
FR-L2：LAWYQQKPGQSPKLLVY(SEQ ID NO：16)
FR-L3：TRESGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLADYFC(SEQ ID NO：17)
FR-L4：FGGGTKLEIK(SEQ ID NO：18)
19F3H2的核苷酸序列：(SEQ ID NO：19，下划线表示CDR序列)
Figure BDA0003034057890000651
19F3H2的氨基酸序列：(SEQ ID NO：20，下划线表示CDR序列)
Figure BDA0003034057890000652
19F3L2的核苷酸序列：(SEQ ID NO：21，下划线表示CDR序列)
Figure BDA0003034057890000653
19F3L2的氨基酸序列：(SEQ ID NO：22，下划线表示CDR序列)
Figure BDA0003034057890000654
19F3L3的核苷酸序列：(SEQ ID NO：23，下划线表示CDR序列)
Figure BDA0003034057890000655
19F3L3的氨基酸序列：(SEQ ID NO：24，下划线表示CDR序列)
Figure BDA0003034057890000661
19F3H2L3(G1M)的重链核苷酸(SEQ ID NO：25，下划线区域是非可变区序列)
Figure BDA0003034057890000662
19F3H2L3(G1M)的重链氨基酸(SEQ ID NO：26，下划线区域是非可变区序列)
Figure BDA0003034057890000663
19F3H2L3(G1M)的轻链核苷酸(SEQ ID NO：27，下划线区域是非可变区序列)
Figure BDA0003034057890000664
Figure BDA0003034057890000671
19F3H2L3(G1M)的轻链氨基酸(SEQ ID NO：28，下划线区域是非可变区序列)
Figure BDA0003034057890000672
19F3H2L3(hG1TM)的重链核苷酸(SEQ ID NO：29，下划线区域是非可变区序列)
Figure BDA0003034057890000673
19F3H2L3(hG1TM)的重链氨基酸序列：(SEQ ID NO：30)
Figure BDA0003034057890000674
19F3H2的骨架区氨基酸序列：
FR-H1：QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKAS(SEQ ID NO：31)
FR-H2：MNWVRQAPGQNLEWIGL(SEQ ID NO：32)
FR-H3：SYNQKFQGKVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYC(SEQ ID NO：33)
FR-H4：WGQGTTLTVSS(SEQ ID NO：34)
19F3L2的骨架区氨基酸序列：
FR-L1：DIVMTQSPSSLAVSVGERVTISCKSS(SEQ ID NO：35)
FR-L2：LAWYQQKPGQAPKLLIY(SEQ ID NO：36)
FR-L3：TRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVADYYC(SEQ ID NO：37)
FR-L4：FGGGTKLEIK(SEQ ID NO：38)
19F3L3的骨架区氨基酸序列：
FR-L1：DIVMTQSPSSLAVSVGERVTISCKSS(SEQ ID NO：39)
FR-L2：LAWYQQKPGQAPKLLIY(SEQ ID NO：40)
FR-L3：TRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC(SEQ ID NO：41)
FR-L4：FGGGTKLEIK(SEO ID NO：42)
14C12重链可变区核苷酸序列：(SEQ ID NO：43)
Figure BDA0003034057890000681
14C12重链可变区氨基酸序列：(SEQ ID NO：44)
Figure BDA0003034057890000682
14C12的HCDR1氨基酸序列：GFAFSSYD
(SEQ ID N0：45)
14C12的HCDR2氨基酸序列：ISGGGRYT
(SEQ ID NO：46
14C12的HCDR3氨基酸序列：ANRYGEAWFAY
(SEQ ID NO：47)
14C12轻链可变区核苷酸序列：(SEQ ID NO：48)
Figure BDA0003034057890000683
14C12轻链可变区氨基酸序列：(SEQ ID NO：49)
Figure BDA0003034057890000684
14C12的LCDR1氨基酸序列：QDINTY(SEQ ID NO：50)
14C12的LCDR2氨基酸序列：RAN(SEQ ID NO：51)
14C12的LCDR3氨基酸序列：LQYDEFPLT(SEQ ID NO：52)
14C12重链骨架区氨基酸序列：
FR-H1：EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAAS(SEQ ID NO：53)
FR-H2：MSWVRQTPEKRLEWVAT(SEQ ID NO：54)
FR-H3：YYPDSVKGRFTISRDNARNTLYLQMSSLRSEDTALYYC(SEQ ID NO：55)
FR-H4：WGQGTLVTVSA(SEQ ID NO：56)
14C12轻链骨架区氨基酸序列：
HR-L1：DIKMTQSPSSMYASLGERVTFTCKAS(SEQ ID NO：57)
HR-L2：LSWFQQKPGKSPKTLIY(SEQ ID NO：58)
HR-L3：RLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYC(SEQ ID NO：59)
HR-L4：FGAGTKLELK(SEQ ID NO：60)
14C12H1的核苷酸序列：(SEQ ID NO：61)
Figure BDA0003034057890000691
14C12H1的氨基酸序列：(SEQ ID NO：62)
Figure BDA0003034057890000692
14C12L1的核苷酸序列：(SEQ ID NO：63)
Figure BDA0003034057890000693
14C12L1的氨基酸序列：(SEQ ID NO：64)
Figure BDA0003034057890000694
14C12H1L1的重链核苷酸(SEQ ID NO：65)
Figure BDA0003034057890000695
Figure BDA0003034057890000701
14C12H1L1的重链氨基酸序列：(SEQ ID NO：66)
Figure BDA0003034057890000702
14C12H1L1的轻链核苷酸序列：(SEQ ID NO：67)
Figure BDA0003034057890000703
14C12H1L1的轻链氨基酸序列：(SEQ ID NO：68)
Figure BDA0003034057890000704
14C12H1L1(G1TM)的重链核苷酸序列(SEQ ID NO：69)
Figure BDA0003034057890000705
Figure BDA0003034057890000711
14C12H1L1(G1TM)的重链氨基酸(SEQ ID NO：70)
Figure BDA0003034057890000712
14C12H1的重链骨架区氨基酸序列：
FR-H1：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO：71)
FR-H2：MSWVRQAPGKGLDWVAT(SEQ ID NO：72)
FR-H3：YYPDSVKGRFTISRDNSKNNLYLQMNSLRAEDTALYYC(SEQ ID NO：73)
FR-H4：WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：74)
14C12L1的轻链骨架区氨基酸序列：
FR-L1：DIQMTQSPSSMSASVGDRVTFTCRAS(SEQ ID NO：75)
FR-L2：LSWFQQKPGKSPKTLIY(SEQ ID NO：76)
FR-L3：RLVSGVPSRFSGSGSGQDYTLTISSLQPEDMATYYC(SEQ ID NO：77)
FR-L4：FGAGTKLELK(SEQ ID NO：78)
Linker1的氨基酸序列：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：79)
Linker1的核苷酸序列：(SEQ ID NO：80)
Figure BDA0003034057890000713
Linker2的氨基酸序列：GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：81)
Linker2的核苷酸序列：(SEQ ID NO：82)
Figure BDA0003034057890000714
NTPDV2和NTPDV4的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：83)：其中的免疫球蛋白部分中的19F3H2(hG1TM)的CDR区域用下划线加粗标识，scFv部分中的14C12H1V-Linker1-14C12L1V的CDR区域用分别用下划线加粗标识，重链区突变氨基酸用斜体加粗标识，linker区域用加粗标识：
Figure BDA0003034057890000721
NTPDV2和NTPDV4的重链的核苷酸序列：(SEQ ID NO：84)
Figure BDA0003034057890000722
Figure BDA0003034057890000731
NTPDV1和NTPDV3的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：85)：其中的免疫球蛋白部分中的19F3H2(hG1TM)的CDR区域用下划线加粗标识，scFv部分中的14C12H1V-Linker2-14C12L1V的CDR区域用分别用下划线加粗标识，重链区突变氨基酸用斜体加粗标识，linker区域用加粗标识：
Figure BDA0003034057890000732
NTPDV1和NTPDV3的重链的核苷酸序列：(SEQ ID NO：86)
Figure BDA0003034057890000733
Figure BDA0003034057890000741
NT5E(1-552)-his的氨基酸序列(SEQ ID NO：87)
Figure BDA0003034057890000742
NT5E(1-552)-his的核苷酸序列(SEQ ID NO：88)
Figure BDA0003034057890000743
Figure BDA0003034057890000751
mFc的氨基酸序列：(SEQ ID NO：89)
Figure BDA0003034057890000752
19F3H1V-Linker-19F3L2V的氨基酸序列：(SEQ ID NO：90)
Figure BDA0003034057890000753
19F3H1V-Linker2-19F3L2V的核苷酸序列：(SEQ ID NO：91)
Figure BDA0003034057890000754
19F3H1的核苷酸序列：(SEQ ID NO：92)
Figure BDA0003034057890000755
19F3H1的氨基酸序列：(SEQ ID NO：93)
Figure BDA0003034057890000756
19F3L1的核苷酸序列：(SEQ ID NO：94)
Figure BDA0003034057890000761
19F3L1的氨基酸序列：(SEQ ID NO：95)
Figure BDA0003034057890000762
19F3L2的轻链氨基酸(全长)(SEQ ID NO：96，下划线区域是非可变区序列)
Figure BDA0003034057890000763
19F3H2可变区的氨基酸序列，下划线表示CDR序列：(SEQ ID NO：97)
Figure BDA0003034057890000764
19F3L2可变区的氨基酸序列，下划线表示CDR序列：(SEQ ID NO：98)
Figure BDA0003034057890000765
19F3L3可变区的氨基酸序列，下划线表示CDR序列：(SEQ ID NO：99)
Figure BDA0003034057890000766
19F3L2的轻链核苷酸(全长)(SEQ ID NO：100)
Figure BDA0003034057890000767

Claims (31)

1.抗CD73-抗PD-1双特异性抗体，其包括：
第一蛋白功能区，所述第一蛋白功能区靶向PD-1，和
第二蛋白功能区，所述第二蛋白功能区靶向CD73，
其中
第一蛋白功能区包含氨基酸序列如SEQ ID NO:44所示的重链可变区所包含的HCDR1，HCDR2和HCDR3，优选HCDR1，HCDR2和HCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NOs:45-47所示的序列或与SEQ ID NOs:45-47所示的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NOs:45-47所示的序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，和包含
氨基酸序列如SEQ ID NO:49所示的轻链可变区所包含的LCDR1，LCDR2和LCDR3，优选LCDR1，LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NOs:50-52所示的序列或与SEQ ID NOs:50-52所示的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NOs:50-52所示的序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列；
或第二蛋白功能区包含氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的重链可变区所包含的HCDR1，HCDR2和HCDR3，优选HCDR1，HCDR2和HCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NOs:3-5所示的序列或与SEQ ID NOs:3-5所示的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NOs:3-5所示的序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，和包含
氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的轻链可变区所包含的LCDR1，LCDR2和LCDR3，优选LCDR1，LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NOs:8-10所示的序列或与SEQ ID NOs:8-10所示的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQID NOs:8-10所示的序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列。
2.权利要求1所述的抗CD73-抗PD-1双特异性抗体，其中：
所述第一蛋白功能区包含
氨基酸序列如SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:62所示的序列或与SEQ ID NOs:44或62所示的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NOs:44或62所示的序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列；和包含
分别对应选自氨基酸序列如SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:64所示的序列或与SEQ IDNOs:49或64所示的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NOs:49或64所示的序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，
和/或，
所述第二蛋白功能区包含氨基酸序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:20所示的序列或与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:20所示的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:20所示的序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列；和包含
分别对应选自SEQ ID NO:7，或SEQ ID NO:22或与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:22所示的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:22所示的序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列；
或
所述第二蛋白功能区包含氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示的序列或与SEQ ID NO:20所示的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ IDNO:20所示的序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，和包含
氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示的序列或与SEQ ID NO:24示的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO:24所示的序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列。
3.权利要求1或2所述的抗CD73-抗PD-1双特异性抗体，其中：所述第一蛋白功能区和第二蛋白功能区独立地为1个或者2个以上。
4.权利要求1-3任一项所述的抗CD73-抗PD-1双特异性抗体，其中：所述第一蛋白功能区和第二蛋白功能区直接连接或者通过连接片段连接；优选地，所述连接片段为(GGGGS)n，n为正整数，例如1、2、3、4、5或6。
5.权利要求1-4任一项所述的抗CD73-抗PD-1双特异性抗体，其中：所述第一蛋白功能区和第二蛋白功能区独立地为免疫球蛋白或抗原结合片段，例如半抗体、Fab、F(ab’)2或单链抗体，优选地，所述第一蛋白功能区为免疫球蛋白，所述第二蛋白功能区为抗原结合片段；或者，所述第一蛋白功能区为抗原结合片段，所述第二蛋白功能区为免疫球蛋白。
6.权利要求1-5任一项所述的抗CD73-抗PD-1双特异性抗体，其中：所述抗原结合片段的重链可变区N端直接(或通过连接片段)连接于所述免疫球蛋白的CH1的C端和所述抗原结合片段的轻链可变区N端直接(或通过连接片段)连接于所述免疫球蛋白的轻链可变区CL的C端；或者所述抗原结合片段的重链可变区N端直接(或通过连接片段)连接于所述免疫球蛋白的的轻链可变区CL的C端和所述抗原结合片段的轻链可变区N端直接(或通过连接片段)连接于所述免疫球蛋白的重链可变区CH1的C端。或者
所述抗原结合片段的重链可变区C端直接(或通过连接片段)连接于所述免疫球蛋白的重链N端和所述抗原结合片段的轻链可变区C端直接(或通过连接片段)连接于所述免疫球蛋白的轻链N端；或者所述抗原结合片段的重链可变区C端直接(或通过连接片段)连接于所述免疫球蛋白的的轻链N端和所述抗原结合片段的轻链可变区的C端直接(或通过连接片段)连接于所述免疫球蛋白的重链N端。
7.权利要求1-6任一项所述的抗CD73-抗PD-1双特异性抗体，其中：所述抗原结合片段是单链抗体，优选地，所述第一蛋白功能区为免疫球蛋白，所述第二蛋白功能区为单链抗体；或者，所述第一蛋白功能区为单链抗体，所述第二蛋白功能区为免疫球蛋白。
8.权利要求7所述的抗CD73-抗PD-1双特异性抗体，其中：所述单链抗体为通过连接片段连接抗体重链可变区(VH)和抗体轻链可变区(VL)的分子；优选地，所述单链抗体具有结构：NH2-VL-连接片段-VH-COOH或NH2-VH-连接片段-VL-COOH。
9.权利要求7或8所述的抗CD73-抗PD-1双特异性抗体，其中：所述单链抗体通过连接片段连接在免疫球蛋白的重链的C末端(CH)(或者重链的N端、重链可变区的CH1的C端)时，首先连接所述单链抗体的抗体重链可变区(VH)，或者，首先连接所述单链抗体的抗体轻链可变区(VL)；优选地，单链抗体可具有结构：连接片段-VH-连接片段-VL-COOH，或者，连接片段-VL-连接片段-VH-COOH，
优选地，
所述的免疫球蛋白，其重链可变区包含氨基酸序列为SEQ ID NO:3-5的CDR，其轻链可变区包含氨基酸序列为SEQ ID NO:8-10的CDR；
所述的单链抗体，其重链可变区包含氨基酸序列为SEQ ID NO:45-47的CDR，其轻链可变区包含氨基酸序列为SEQ ID NO:50-52的CDR，
优选地，所述单链抗体(例如NH2-VL-连接片段-VH-COOH或NH2-VH-连接片段-VL-COOH)通过连接片段连接在免疫球蛋白的重链的C末端时，可以首先连接所述单链抗体的包含氨基酸序列为SEQ ID NO:45-47的CDR的抗体重链可变区(VH)，或者，首先连接所述单链抗体的包含氨基酸序列为SEQ ID NO:50-52的CDR的抗体轻链可变区(VL)，
或者优选地，
所述的免疫球蛋白，其重链可变区包含氨基酸序列为SEQ ID NO:45-47的CDR，其轻链可变区包含氨基酸序列为SEQ ID NO:50-52的CDR；和/或，
所述的单链抗体，其重链可变区包含氨基酸序列为SEQ ID NO:3-5的CDR，其轻链可变区包含氨基酸序列为SEQ ID NO:8-10的CDR，
其中，所述单链抗体(例如NH2-VL-连接片段-VH-COOH或NH2-VH-连接片段-VL-COOH)通过连接片段连接在免疫球蛋白的重链的C末端时，可以首先连接所述单链抗体的包含氨基酸序列为SEQ ID NO:3-5的CDR的抗体重链可变区(VH)，或者，首先连接所述单链抗体的包含氨基酸序列为SEQ ID NO:8-10的CDR的抗体轻链可变区(VL)，
优选地，
一个免疫球蛋白分子连接有两个单链抗体分子，更优选地，两个单链抗体分子相同。
10.权利要求1或2所述的抗CD73-抗PD-1双特异性抗体，其中：
所述免疫球蛋白为IgG、IgA、IgD、IgE或IgM；优选为IgG，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
11.权利要求1或2所述的抗CD73-抗PD-1双特异性抗体，其中：所述单链抗体连接在免疫球蛋白的重链的C末端，优选地，一个免疫球蛋白分子连接有两个单链抗体分子，更优选地，两个单链抗体分子相同。
12.权利要求1或2所述的抗CD73-抗PD-1双特异性抗体，其中：所述的免疫球蛋白，其重链可变区包含氨基酸序列为SEQ ID NO:45-47的CDR，其轻链可变区包含氨基酸序列为SEQID NO:50-52的CDR；
和/或，
所述的单链抗体，其重链可变区包含氨基酸序列为SEQ ID NO:3-5的CDR，其轻链可变区包含氨基酸序列为SEQ ID NO:8-10的CDR，
优选地，所述单链抗体通过连接片段连接在免疫球蛋白的重链的C末端时，可以首先连接所述单链抗体的包含氨基酸序列为SEQ ID NO:3-5的CDR的抗体重链可变区(VH)，或者，首先连接所述单链抗体的包含氨基酸序列为SEQ ID NO:8-10的CDR的抗体轻链可变区(VL)。
13.权利要求1或2所述的抗CD73-抗PD-1双特异性抗体，其中：
所述的免疫球蛋白，其重链可变区包含氨基酸序列为SEQ ID NO:3-5的CDR，其轻链可变区包含氨基酸序列为SEQ ID NO:8-10的CDR；和/或，
所述的单链抗体，其重链可变区包含氨基酸序列为SEQ ID NO:45-47的CDR，其轻链可变区包含氨基酸序列为SEQ ID NO:50-52的CDR，
其中，所述单链抗体通过连接片段连接在免疫球蛋白的重链的C末端时，可以首先连接所述单链抗体的包含氨基酸序列为SEQ ID NO:45-47的CDR的抗体重链可变区(VH)，或者，首先连接所述单链抗体的包含氨基酸序列为SEQ ID NO:50-52的CDR的抗体轻链可变区(VL)。
14.权利要求1或2所述的抗CD73-抗PD-1双特异性抗体，其中：所述免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:62；所述免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列分别对应选自SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:64；
和/或，
所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO:2、或SEQ ID NO:20；所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列分别对应选自SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:22；或所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:20，所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:24；
其中，所述单链抗体通过连接片段连接在免疫球蛋白的重链的C末端时，可以首先连接所述单链抗体的抗体重链可变区(VH)，或者，首先连接所述单链抗体的抗体轻链可变区(VL)。
15.权利要求1或2所述的抗CD73-抗PD-1双特异性抗体，其中：所述免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:20；所述免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:22，或所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:20，所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:24；
和/或，
所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:62；所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:64，
其中所述单链抗体通过连接片段连接在重链的C末端时，可以首先连接所述单链抗体的抗体重链可变区(VH)，或者，首先连接抗体轻链可变区(VL)。
16.权利要求5-14任一项所述的抗CD73-抗PD-1双特异性抗体，其中：所述的免疫球蛋白包括非-CDR区，且所述非-CDR区来自不是鼠类的物种，例如来自人抗体，更优选地，所述免疫球蛋白的恒定区是人源化的，例如，重链恒定区采用Ig gamma-1 chain C region，ACCESSION:P01857；轻链恒定区采用Ig kappa chain C region，ACCESSION:P01834，或者
所述免疫球蛋白的重链恒定区在Ig gamma-1 chain C region，ACCESSION:P01857的基础上，在234位点、235位点和237位点中的任意2个位点或3个位点发生突变，并且突变后，所述双特异性抗体与FcγRIa、FcγRIIIa和/或C1q的亲和力常数相比突变前降低；
更优选地，按照EU编号系统，在Ig gamma-1 chain C region，ACCESSION:P01857的基础上，在第234位点、235位点和/或237位点具有如下突变：
L234A和L235A；或者
L234A和G237A；或者
L235A和G237A；
或者
L234A、L235A、G237A，
进一步优选地，所述免疫球蛋白的重链恒定区还具有选自如下的一个或多个突变：
N297A、D265A、D270A、P238D、L328E、E233D、H268D、P271G、A330R、C226S、C229S、E233P、P331S、S267E、L328F、A330L、M252Y、S254T、T256E、N297Q、P238S、P238A、A327Q、A327G、P329A、K322A、T394D、G236R、G236A、L328R、A330S、P331S、H268A、E318A和K320A，优选地，所述的抗CD73-抗PD-1双特异性抗体结构如重链-轻链-连接片段1-scFv所示，所述scFv选自14C12H1V-连接片段2-14C12L1V，14C12H1V-连接片段1-14C12L1V，14C12H1V-连接片段2-14C12L1V和14C12H1V-连接片段1-14C12L1V，具体选自以下各项组成的组：
(1)NTPDV1，其重链氨基酸序列如SEQ ID NO:85所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示，连接片段1的氨基酸序列如SEQ ID NO:79所示，14C12H1V的氨基酸序列如SEQ ID NO:66所示，连接片段2的氨基酸序列如SEQ ID NO:81所示，14C12L1V的氨基酸序列如SEQ IDNO:68所示，
(2)NTPDV2，其重链氨基酸序列如SEQ ID NO:85所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示，连接片段1的氨基酸序列如SEQ ID NO:79所示，14C12H1V的氨基酸序列如SEQ ID NO:66所示，连接片段1的氨基酸序列如SEQ ID NO:79所示，14C12L1V的氨基酸序列如SEQ IDNO:68所示，
(3)NTPDV3，其重链氨基酸序列如SEQ ID NO:85所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:96所示，连接片段1的氨基酸序列如SEQ ID NO:79所示，14C12H1V的氨基酸序列如SEQ ID NO:66所示，连接片段2的氨基酸序列如SEQ ID NO:81所示，14C12L1V的氨基酸序列如SEQ IDNO:68所示，和
(4)NTPDV4，其重链氨基酸序列如SEQ ID NO:85所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:96所示，连接片段1的氨基酸序列如SEQ ID NO:79所示，14C12H1V的氨基酸序列如SEQ ID NO:66所示，连接片段1的氨基酸序列如SEQ ID NO:79所示，14C12L1V的氨基酸序列如SEQ IDNO:68所示。
17.权利要求1-16任一项所述的抗CD73-抗PD-1双特异性抗体，其中：所述的抗CD73-抗PD-1双特异性抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的KD结合CD73蛋白和/或PD-1蛋白。
18.分离的核酸分子，其包含能够编码双特异性抗体重链可变区的核酸序列，其中，
所述抗体的重链可变区包含：
氨基酸序列为SEQ ID NO:3-5的CDR、氨基酸序列为SEQ ID NO:45-47的CDR和氨基酸序列为SEQ ID NO:50-52的CDR；
或者
氨基酸序列为SEQ ID NO:45-47的CDR、氨基酸序列为SEQ ID NO:3-5的CDR和氨基酸序列为SEQ ID NO:8-10的CDR；
并且所述双特异性抗体重链可变区作为所述双特异性抗体的一部分，特异性结合CD73和PD-1抗原，所述双特异性抗体还包含轻链可变区，所述轻链可变区包含：
氨基酸序列为SEQ ID NO:8-10的CDR；
或者，氨基酸序列为SEQ ID NO:50-52的CDR。
优选地，轻链可变区的CDR与重链可变区包含的CDR不相同。
19.载体，其包含权利要求18所述分离的核酸分子。
20.宿主细胞，其包含权利要求18所述分离的核酸分子，或者权利要求19所述的载体。
21.制备权利要求1-17任一项所述的抗CD73-抗PD-1双特异性抗体的方法，其包括在合适的条件下培养权利要求20的宿主细胞，以及从细胞培养物中回收所述双特异性抗体的步骤。
22.偶联物，其包括权利要求1-17任一项所述的抗CD73-抗PD-1双特异性抗体以及偶联部分，其中，所述偶联部分为可检测的标记；具体地，所述偶联部分为放射性同位素、荧光物质、化学发光物质、有色物质或酶。
23.试剂盒，其包括权利要求1-17任一项所述的抗CD73-抗PD-1双特异性抗体，或者权利要求22所述的偶联物；优选地所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别所述双特异性抗体；任选地，所述第二抗体还包括可检测的标记，例如放射性同位素、荧光物质、化学发光物质、有色物质或酶。
24.权利要求1-17任一项所述的抗CD73-抗PD-1双特异性抗体在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测CD73和/或PD-1在样品中的存在或其水平。
25.药物组合物，其包含权利要求1-17任一项所述的抗CD73-抗PD-1双特异性抗体或者权利要求22所述的偶联物；可选地，其还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。
26.权利要求1-17任一项所述的抗CD73-抗PD-1双特异性抗体或者权利要求22所述的偶联物在预防和/或治疗肿瘤或者贫血病中的用途，或者在诊断肿瘤或者贫血病的用途。
27.权利要求1-17任一项所述的抗CD73-抗PD-1双特异性抗体或者权利要求22所述的偶联物在制备预防和/或治疗肿瘤或者贫血病的药物中的用途，或者在制备诊断肿瘤或者贫血病的药物中的用途。
28.权利要求1-17任一项所述的抗CD73-抗PD-1双特异性抗体或者权利要求22所述的偶联物在制备如下药物中的用途：
检测样品中CD73水平的药物，
抑制CD73的酶活反应；
和/或
阻断PD-1与PDL1结合的药物，
调节(例如下调)PD-1活性或水平的药物，
解除PD-1对机体免疫抑制的药物，
提高T淋巴细胞中IL-2表达的药物，或者
提高T淋巴细胞中IFN-γ表达的药物。
29.在体内或体外方法，包括施加细胞或者给予有需求的受试者以有效量的权利要求1-17任一项所述的抗CD73-抗PD-1双特异性抗体或者权利要求22所述偶联物的步骤，
30.杂交瘤细胞株，其选自：
杂交瘤细胞株LT014(又称CD73-19F3)，其于2018年6月19日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:C2018137；或
杂交瘤细胞株LT003(又称PD-1-14C12)，其于2015年6月16日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:C2015105。
31.抗CD73单克隆抗体，其为19F3H2L3(hG1TM)，其重链氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：28所示。
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