CN113061185A - 一种bcma抗体的制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种BCMA抗体的制备方法与应用。本发明通过基因工程和噬菌体表面展示文库技术，从非免疫的全人源序列的单链抗体库中筛选出抗人B细胞表面抗原BCMA的特异性单链抗体。通过亲和力成熟改造获得结合能力显著提高的多株Fab克隆，它们与人BCMA的亲和力在0.26nM–0.31nM之间。流式细胞仪测定的表观亲和力相对于亲本抗体提高了61‑97倍，证实了本发明的抗人BCMA抗体及优化的突变体都具有良好的结合BCMA的能力。本发明为研发针对BCMA靶标的抗肿瘤抗体药物、CAR‑T试剂开发、其它疾病如B细胞相关的炎症和自身免疫性疾病的预防和治疗提供了人BCMA特异性抗体候选分子。

Description

一种BCMA抗体的制备方法与应用
技术领域
本发明涉及治疗用人源基因工程抗体的制备及应用，主要是涉及特异性针对BCMA的抗体的制备方法与应用。
背景技术
BCMA(即B-细胞成熟抗原，TNFRSF17，CD269)是一种优先在分化的浆细胞中表达的属于肿瘤坏死(TNF)受体超家族成员的非糖基化I型跨膜蛋白，其参与B细胞成熟、生长和存活。BCMA是一种最初报道为人成熟B淋巴细胞的高尔基体内的整合膜蛋白，即作为细胞内蛋白，其表明BCMA看起来在B-细胞发育和稳态中具有重要作用。
BCMA的表达限于B-细胞谱系且主要存在于浆细胞和浆母细胞上，并在一定程度上存在于记忆B-细胞上，但是实际上不存在于外周B-细胞上。BCMA也在多发性骨髓瘤(MM)细胞上表达。BCMA与其家族成员跨膜激活剂及亲环蛋白配体作用因子(TACI)和TNF家族受体(BAFF-R)的B细胞活化因子一起调节体液免疫、B-细胞发育和稳态的不同方面。BCMA是TNF超家族的两种配体的受体：APRIL(增殖诱导配体，CD256，TNFSF13)，BCMA的高亲和力配体，以及B细胞活化因子BAFF(THANK，BlyS，B淋巴细胞刺激因子，TALL-1和zTNF4)，BCMA的低亲和力配体。APRIL和BAFF显示出结构相似性以及重叠但不同的受体结合特异性。负调控因子TACI也结合至BAFF和APRIL两者。APRIL和BAFF与BCMA和/或TACI的配位结合激活转录因子NF-κB并增加促存活Bcl-2家族成员(例如，Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Mcl-1、A1)的表达并下调促凋亡因子(例如，Bid、Bad、Bik、Bim等)的表达，从而抑制细胞凋亡并促进存活。该组合作用促进B细胞分化、增殖、存活和抗体产生。BCMA的表达出现在B-细胞分化作用的较后期并有利于浆母细胞和浆细胞在骨髓中的长期存活。小鼠中BCMA基因的靶向缺失不会影响成熟B-细胞的产生、体液免疫应答的质量和幅度、生发中心的形成以及短暂寿命的浆细胞的生成。然而，这种小鼠骨髓中长寿命浆细胞的数量显著降低，这表明了BCMA对其存活的重要性。
BCMA是一个极其重要的B细胞生物标志物，广泛存在于MM细胞表面，是MM和其他血液系统恶性肿瘤的热门免疫治疗靶点。在连续3届ASCO年会上，BCMA都是行业瞩目的焦点。美国癌症研究所(CRI)的最新分析显示，BCMA已成为继CD19之后第二大最受欢迎的抗癌细胞疗法靶点。MM是一种异质性疾病并且多数是由t(11；14)、t(4；14)、t(8；14)、del(13)、del(17)(除其他外)的染色体易位引起的。MM受累患者可能经历因骨髓浸润、骨质破坏、肾衰竭、免疫缺陷以及癌症诊断的心理负担而经历多种与疾病相关的症状。
令人振奋的新疗法，如化疗和干细胞移植的方法，能提高生存率，但是常常伴有有害的副作用，因此MM仍然难以治疗。尽管在化疗、蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂沙利度胺衍生物和CD38靶向抗体方面取得了很大进展，但几乎所有患者最终仍会复发。因此，该领域对新药的需求仍然迫切。迄今为止，对于多发性骨髓瘤患者而言两种最常用的治疗选择是类固醇、沙利度胺、来那度胺、硼替佐米或多种细胞毒素试剂的组合，和对于较年轻的患者采用高剂量化疗理念配合自体干细胞移植。
多数的移植为自体型，即使用患者自身的细胞。这种移植，尽管不具有治愈性，但其显示延长选定患者的生命。其可在新诊断的患者中作为初始疗法或在复发时进行。有时为了适当的控制疾病，可能会建议选定患者采用一种以上的移植。
用于治疗该疾病的化疗试剂是环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和美法仑，与免疫调节剂如沙利度胺来那度胺硼替佐米和皮质类固醇(如地塞米松)的组合疗法已经成为用于治疗新确诊患者和化疗或移植均失败的疾病晚期患者中骨髓瘤的重要选择。
目前所用疗法是通常非治愈性的。因为高龄、其它严重疾病的存在或其它身体上的限制，干细胞移植可能不适用于多数患者的选择。化疗仅能部分控制多发性骨髓瘤，且极少达到完全缓解。因此，迫切需要新的创新疗法。
拮抗型BCMA-特异性抗体可阻止与在正常和恶性B-细胞中强效促存活信号转导通路有关的NF-κB活化。
在对抗血源性肿瘤或自身免疫性障碍方面的其它方法专注于BAFF和APRIL(即TNF配体超家族的配体)与其由BAFF和/或APRIL活化的受体TACI、BAFF-R和BCMA之间的相互作用。例如，通过将人免疫球蛋白的Fc-结构域与Zymogenetics公司的TACI融合产生了阿塞西普(TACI-Ig)，来中和这两种配体并阻止受体的活化。阿塞西普目前正处于用于治疗系统性红斑狼疮(SLE，第III期)多发性硬化症(MS，第II期)及类风湿性关节炎(RA，第II期)的临床试验中，以及处于用于治疗B细胞恶性肿瘤慢性淋巴细胞白血病(CLL)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)及MM的第I期临床试验中。在临床前研究中，阿塞西普在体外和体内降低了初始MM细胞和MM细胞系的生长和存活，这表明了TACI配体对于MM细胞的相关性。由于多数MM细胞及其衍生的细胞系都表达BCMA和TACI，两者的受体可能有利于配体介导的生长与存活。这些数据表明，对BCMA和TACI的拮抗作用可能有益于浆细胞障碍的治疗。另外，已经描述了与TACI交叉反应的BCMA-特异性抗体(WO02/066516)。
人类基因组科学公司和葛兰素史克已经开发出一种称为贝利木单抗的靶向BAFF的抗体。贝利木单抗阻断可溶性BAFF与其受体BAFF-R、BCMA及TACI在B细胞上的结合。贝利木单抗不直接结合B细胞，但是通过结合BAFF，贝利木单抗抑制包括自体反应性B细胞的B细胞的存活，并减少B细胞分化为产生免疫球蛋白的浆细胞。
然而，尽管存在BCMA、BAFF-R和TACI(即属于TNF受体超家族的B细胞受体)及其配体BAFF和APRIL服从在对抗癌症和/或自身免疫性障碍中的治疗方案这一事实，仍然需要据用于治疗这种医学病症的其它可用选择。
发明内容
本发明提供了用于治疗和预防与BCMA表达相关的疾病，特别是表达BCMA的肿瘤和自身免疫性疾病的抗体治疗。
本发明的第一个目的在于提供一种人源抗BCMA抗体及其活性片段的氨基酸序列。
本发明的第二个目的在于提供编码上述抗体或其活性片段的基因。
本发明的第三个目的在于提供上述抗体及其活性片段在制备治疗高表达或过度表达BCMA的恶性肿瘤和自身免疫性疾病药物中的应用。
本发明从全合成单链人抗体库中筛选出抗BCMA的基因工程单链抗体，并获得其抗体的可变区基因序列，通过点突变试剂盒构建突变文库，获得亲和力高的克隆，将这些克隆的DNA混合，以重组方式组装单链抗体组合文库，筛选后获得与人BCMA结合的亲和力高的BCMA抗体。
本发明提供的抗体可变区氨基酸序列模式为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。在本申请中，FR和CDR的区域划分基于Kabat命名系统。在此，FR1～4代表4个框架区域，CDR1～3代表3个高变区。FR1～4可以是从恒定区序列分离而来(比如人免疫球蛋白轻重链类、亚类或亚家族最常用的氨基酸)，也可以是从个人抗体框架区分离而来或从不同的框架区基因组合而来。
本发明提供的人源BCMA抗体，其轻链可变区的CDR1含有如序列24、序列27所示的任一条氨基酸序列；其轻链可变区的CDR2含有如序列25所示的氨基酸序列；其轻链可变区的CDR3含有如序列26、序列28-30所示的任一条氨基酸序列；
所述的人源BCMA抗体，其重链可变区的CDR1含有如序列16、序列19、序列22、序列23所示的任一条氨基酸序列；其重链可变区的CDR2含有如序列17、序列20所示的任一条氨基酸序列；其重链可变区的CDR3含有如序列18、序列21所示的任一条氨基酸序列。
优选地，本发明提供的人源BCMA抗体，其轻链可变区如序列2、序列4-8所示的任一条氨基酸序列；其重链可变区如序列1、序列9-11所示的任一条氨基酸序列；
或者所述BCMA抗体的重链和轻链与前述序列相比满足以下二者中至少一个的序列：a)结合相同抗原表位；b)序列同一性大于70％、80％、85％、90％或97％。
本发明还提供了上述BCMA抗体的突变体，其突变信息为，序列2所示的轻链可变区的以下任一或多个位点的突变见表1。
表1：B10重链可变区CDR中对亲和力提高有益的突变
CDR区位置 亲本氨基酸 有益的突变氨基酸
H31 S P,K
H32 Y H,D,G,M,S
H33 A N
H35 S H,N,A,M
H50 G V,T
H52 I H
H53 I D,A
H54 F H
H56 T K
H98 F L
序列1所示的重链可变区的以下任一或多个位点的突变见表2。
表2：B10轻链可变区CDR中对亲和力提高有益的突变
CDR区位置 亲本氨基酸 有益的突变氨基酸
L28 S N,R,T
L97 L Q,V,A
L98 I S,A,R,P
L100 Y M,L,W,T
L101 V L,Q
进一步地，本发明提供一种BCMA抗体，其氨基酸序列含有如序列3、序列12-15所示的任一条氨基酸序列，序列3，序列12-15的氨基酸序列比对见图3。
或者所述BCMA抗体的氨基酸序列与前述序列相比满足以下二者中至少一个的序列：a)结合相同抗原表位；b)序列同一性大于70％、80％、85％、90％或97％。
本发明提供的BCMA抗体，其为单链抗体、Fab、微型抗体、嵌合抗体或全抗体免疫球蛋白IgG1、IgG2、IgA、IgE、IgM、IgG4、IgD。
本发明提供的人源抗人BCMA抗体以0.2nM-10nM的亲和力结合于人BCMA。该抗体抑制BCMA配体结合人BCMA。该抗体结合于表达BCMA的细胞，所述的细胞是人多发性骨髓瘤细胞或淋巴瘤细胞。
本发明提供了编码上述抗体的基因。
此外，考虑到密码子的简并性，编码本发明所述抗体的基因可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件下，对编码上述抗体的基因序列进行修改，获得编码相同抗体的基因。本领域技术人员可以根据表达抗体宿主的密码子偏爱性，人工合成改造基因，以提高抗体的表达效率。
本发明还提供了含有上述基因的生物材料，所述生物材料为表达盒、质粒、表达载体、宿主细胞或宿主菌。
本发明提供了上述BCMA抗体的制备方法，从全合成单链人抗体库中筛选出抗BCMA的基因工程单链抗体，并获得其抗体的可变区基因序列，通过点突变试剂盒构建突变文库，获得亲和力高的克隆，将这些克隆的DNA混合，以重组方式组装单链抗体组合文库，筛选后获得与人BCMA结合的亲和力高的BCMA抗体。
本发明提供了上述抗体的以下任一种应用，
(1)在制备以BCMA为靶标的疾病治疗药物中的应用，优选所述的药物为抗肿瘤药或治疗自身免疫性疾病的药物；
(2)在制备预防或治疗BCMA表达的B细胞相关疾病的药物中的应用；优选所述BCMA表达的B细胞相关疾病包括B细胞相关肿瘤、B细胞引起的自身免疫病；
(3)在制备用于杀伤BCMA表达细胞的药物中的应用；
(4)在制备BCMA的检测试剂中的应用；
(5)在制备适用于CAR-T疗法的相关试剂中的应用；
(6)在CAR-T中的应用。
含有本发明上述BCMA抗体的药物或检测试剂也属于本发明的保护范围。
本发明还提供一种免疫毒素，包含以各种形式连接于细胞毒性剂的上述BCMA抗体。
所述的各种连接形式为抗体被标记、体外交联或分子偶联。
所述的细胞毒性剂包括化学分子、放射性同位素、多肽、毒素及其他对细胞具有杀伤或诱导细胞死亡特性的物质。
本发明提供的抗体为全抗体或各种其他形式的基因工程抗体。如，抗BCMA抗体可以是全抗体或抗体片段。抗体分子本身可用于治疗和诊断。抗体可以被标记、交联或偶联及与其他蛋白或多肽分子融合表达形成复合物(如细胞毒性物质、放射性毒素和\或化学分子等)用于诊断和治疗。
本发明更进一步提供：编码抗体的独立基因，表达载体，载体转染宿主细胞相关控制技术及宿主细胞，抗体表达流程及在细胞培养上清中回收抗体。本发明同样提供含有抗体的组分和药理学上可接受的递送分子或溶液。本治疗用组分为无菌，可低温冻干。
本发明提供一种抗BCMA的抗体，该抗体可以抑制BCMA所诱导的一种或多种生物学活性。本抗体通过阻碍BCMA与其配体结合发挥作用，也可以通过杀伤BCMA高表达的细胞发挥作用，或者通过与BCMA结合后复合物被内化从而消耗细胞表面的BCMA而发挥作用。BCMA拮抗剂所具有的所有干扰功能均应平等地视为本发明的目的。
此处所公开和要求保护的序列1～15所示序列包括“保守序列修饰”，即不明显影响和改变所述抗体或含有所述氨基酸序列抗体的结合特征的核苷酸和氨基酸序列修饰。所述保守序列修饰包括核苷酸或氨基酸替换、添加或缺失。可以通过本领域的标准技术，如定点诱变和PCR介导的诱变等将修饰导入序列1～15中，保守氨基酸替换包括氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基或其他氨基酸残基代替。本领域中，已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(如天冬氨酸、谷氨酸)，具有不带电的极性侧链的氨基酸(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，具有β分支侧链的氨基酸(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，优选用来自于同一侧链家族的另一种氨基酸残基代替人抗BCMA抗体中的非必须氨基酸残基。
因此，此处公开的氨基酸序列编码的抗体和/或含有此处公开的氨基酸序列的抗体包括基本上由经保守序列修饰的相似序列编码的，或含有经保守序列修饰的相似序列的抗体，均应视为本发明的范畴。
本发明提供一种双特异性或多特异性分子，包含本发明提供的上述抗体或抗体的抗原结合部位的分子。
本发明提供一种抗体与其他蛋白或\和多肽的融合蛋白，包含本发明提供的上述抗体和具有某种功能的其他蛋白或多肽分子的复合物。
进一步地，所述的融合蛋白为将抗体基因与免疫毒素或细胞因子基因连接构建重组表达载体，通过哺乳动物细胞或其他表达系统获得重组融合蛋白分子。
本发明描述的BCMA抗体具有良好的治疗应用前景，主要表现为与人BCMA具有特异性结合活性，且与H929、RPMI8226细胞表面的BCMA特异性结合。该抗体经ELISA检测及流式细胞仪检测，表明靶标特异性良好。
采用流式细胞仪(FACS)检测本发明的BCMA抗体与不同细胞株的BCMA结合能力进行检测，结果表明，亲本抗体B10与BCMA的表观亲和力KD为0.3nM；亲和力提高的多株抗体(B10.3，B10.4，B10.5，B10.9)在流式细胞分析中表现出显著提高的表观亲和力，它们的数值在1-3pM之间。ELISA检测表明，亲本抗体B10的内在亲和力约10nM，而突变体B10.3，B10.4，B10.5，B10.9的内在亲和力分别是0.26nM，0.31nM，0.27nM，0.29nM。
附图说明
图1为抗体B10结合H929的流式细胞图。FACS检测BCMA候选抗体对H929的结合；候选抗体B10转化为scFv-Fc形式并表达纯化，按5μg/ml终浓度加入到200,000个H929细胞中孵育。荧光二抗是488-标记的抗人Fc。把细胞悬浮于含7-AAD的溶液中以区别死细胞和活细胞。以Guava Easycyte分析，左上角细胞百分数显示阳性结合群体。
图2A-图2E为在细胞系H929上进行流式细胞仪检测B10及其亲和力成熟突变体B10.3、B10.4、B10.5、B10.9对BCMA的结合示意图，图2F-图2J为在RPMI8226细胞系上流式细胞仪检测B10及其亲和力成熟突变体B10.3、B10.4、B10.5、B10.9对BCMA的结合示意图。
图3为序列3，序列12-15的氨基酸序列比对图。
图4为ELISA检测B10及其亲和力成熟突变体B10.3、B10.4、B10.5、B10.9对BCMA的结合能力示意图。
图5为FACS检测不同浓度梯度的B10及其亲和力成熟突变体B10.3、B10.4、B10.5、B10.9对RPMI8226细胞系的结合能力示意图。
具体实施方式
以下实施实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1从天然人抗体噬菌体表面呈现文库中筛选抗人BCMA抗体
抗体库技术是一种将某种动物(包括人)的所有抗体可变区基因克隆到质粒或噬菌体中，后者感染大肠杆菌后，抗体片段表达于噬菌体颗粒表面，或者大肠杆菌周质、包浆中。然后用靶标抗原从抗体库中筛选出携带特异抗体基因的克隆，从而获得相应的特异性抗体的技术。从抗体库中已经筛选多种基础研究和临床研发中需要的的抗体，如肿瘤相关的膜蛋白抗原、与自身免疫病相关的自身抗原、抵抗病毒性疾病的病毒抗原的抗体。这些显示出抗体库技术在基础研究和抗体药物研发中的巨大应用潜力。特别的，从人的抗体库中得到全人源的单克隆抗体，克服了难以用鼠杂交瘤技术获得人源单抗的障碍；由于人抗体序列的高度保守性，这些抗体对人体自身免疫系统的免疫原性远低于来源于动物的抗体，因此更安全。
非免疫的人天然抗体库以健康人为抗体基因来源，这些人称之为供体。由于使用全天然人抗体序列，获得的抗体对人体免疫系统具有极低的免疫原性。采用分子生物学和DNA操作技术，以RNA抽提试剂盒(例如QIAGEN的RNeasy Mini Kit，目录号74104)，把全部RNA从供体的外周血单核细胞(PBMC)中提取出来以后，从每一份RNA样品中取等量后合并，以反转录试剂盒(例如ThermoFisher Scientific的cDNA合成试剂盒(SuperScriptTM IVReverse Transcriptase)进行轻重链基因cDNA的合成。以这些抗体cDNA为模板，在第一轮扩增中，在以各个亚组特异性的上游引物和恒定区引物配合下进行PCR扩增，获得各个亚组的全部成员基因。在第二轮PCR中，带有搭桥的重链可变区(VH)3’-端引物组和带有搭桥的轻链可变区(VL)5’-端引物组分别与各自的另一端引物(包含有特异性的限制性内切酶位点)配合，使得获得的VH和VL能够搭头链接，形成单链抗体(scFv)基因。利用这些单链抗体的基因在5’-端和3’-端的特异性酶切位点，将这些scFv基因克隆至溶源性的噬菌粒(phagemid，如M13 phagemid)载体中，构建抗体文库。该文库的大小达到了50亿个集落形成单位(cfu)。
生物淘选指的是用特异性靶标从抗体中筛选获得特异性克隆的过程。为了获得人BCMA抗原特异性的人抗体，用液相筛选法进行淘选。液相淘选法的一般步骤是：首先把商品化的BCMA抗原(BCMA-Fc融合蛋白，Acrobiosystems，目录号BC7-H5254)经生物素修饰，让每个分子交联上3-5个生物素分子，去除游离的生物素。合适量的生物素标记的BCMA抗原结合到链亲和素偶联的磁珠上(例如DynabeadsTM M-280Streptavidin,ThermoFisherScientific，目录号11205D)。解冻一份人抗体库，其中包含100亿个表达有不同抗体的噬菌体颗粒。磁珠和抗体库都以4％的脱脂奶粉溶液(4％MPBS)封闭，以消除非特异性作用位点。由于磁珠上可能还有未被亲和素结合的链亲和素，同时由于BCMA抗原分子是由人Fc构成的融合蛋白，因此需要在解冻的抗体库中同时添加足量(50-100倍过量于所用的靶标蛋白的量)的链亲和素和人抗体Fc，以去除结合它们的抗体克隆。封闭好的抗体库溶液与磁珠一起(总体积<1ml)加到1.5ml的Eppendorf管中，在室温旋转混合孵育2小时，以便让BCMA特异性的噬菌体抗体结合。孵育完成后把Eppendorf管置于磁力架上静置1分钟，分离磁珠和溶液。用移液枪尽量完全去除溶液部分，换上新的枪头(tip)，加入1ml洗涤液PBST(磷酸缓冲液(PBS)溶液中加入终浓度为0.05％的Tween 20)至Eppendorf管中，远离磁力架，以移液枪轻轻悬浮磁珠，重新置于磁力架上分离磁珠和溶液。去除溶液，如此重复三次。然后把洗涤液改成PBS，洗涤磁珠3次。经过洗涤，非特异性和低亲和力的噬菌体抗体被大部分去除，特异性的噬菌体抗体就留在磁珠上。向磁珠中加入洗脱液(10mM Glycine，pH2.0)，重悬磁珠，室温静置10分钟，以磁力架分离磁珠和溶液，吸取溶液至一个干净的Eppendorf管中，加入1/10 1M Tris溶液(pH8.0)以中和溶液，这就是洗脱液，其中包含了成千上万的不同的结合BCMA抗原的噬菌体抗体，如此就完成了第一轮淘选。
为了进一步收获亲和力比较高的特异性抗体克隆，需要进行更多轮淘选。为此，以第一轮淘选洗脱的噬菌体抗体溶液感染对数期的、能被M13噬菌体侵染的大肠杆菌(如TG1菌株)，得到感染液，取少量进行一系列10倍梯度稀释(通常稀释至原液的百万分之一，并取最后三个梯度进行涂布)以测定第一轮产出洗脱液(output)的滴度(titer)，该titer又称为第一轮最大多样性，通常第一轮淘选后的产出滴度在10E6个cfu以下。把其余感染液全部涂布于含有相应抗生素的细菌培养板上过夜培养，以获取菌落；刮下菌落层并以培基重悬，取足量包含第一轮output多样性的重悬液至含足量液体培基(2YT-CG，2YT培基中加入Carbenicillin和葡萄糖，终浓度分别是100μg/ml和2％)的摇瓶中，使重悬液稀释至0.1OD600以下并开始培养，直到对数期，即OD600达到0.5左右。为使第一轮淘选获取的这些抗体再次呈现于噬菌体颗粒表面，取10ml菌液，加入辅助噬菌体M13K07，使感染复数为20:1，静置于37℃,保持30分钟(这个阶段称之为噬菌体拯救)。离心，以50ml表达培养基(2YT-AK，2YT培基中加入Carbenicillin和Kanamycin，终浓度分别是100μg/ml和30μg/ml)重悬菌体，置于30℃，200转/分培养过夜。次日离心收获培养上清，加入1/5体积的PEG8000/NaCl(PEG-8000 20％,NaCl 2.5M)，充分混匀，置于冰上孵育1小时。高速离心(11500×g)30分钟以收获噬菌体抗体颗粒。以1ml PBS溶液重悬沉淀，再次置于高速离心以去除细菌碎片。上清液即为第一轮淘选后的扩增液，其中包含的每个抗体克隆都被扩增了上万倍以上。这个扩增液即可用于第二轮的淘选实验。第二轮淘选的操作除了在PBST/PBS时，增加至各做6次(6/6)之外，其余和第一轮操作方法完全相同。在第三轮中，可以进一步增加洗涤次数至10/10。多轮淘选通常会有效地富集特异性的克隆，多样明显减少但它们的亲和力比较高，便于后续的单克隆筛选。
为了获取特异性的单克隆抗体，需要进行单克隆噬菌体酶联实验(MonophageELISA)。为此，把在第二轮和/或第三轮的梯度稀释中会得到分离良好的单菌落单独地接种这些菌落至含2YT-AG的96-孔培养板中(每板接种93个菌落，留下三个孔作为阴性对照)，过夜培养，这就是母板(master plate)。将母板中每孔的菌液接种至新的培养板中生长至对数期，进行上述的噬菌体拯救，使每个克隆的抗体表达于噬菌体表面。在普通的96-孔酶联板上包被BCMA抗原(1μg/ml),同时以同样浓度的人Fc包被另一块酶联板。每个单独表达的单克隆噬菌体抗体菌液分别加入到BCMA板和Fc板对应孔，后接合适的二抗及辣根过氧化物酶(HRP)偶联的三抗，底物显色，读取吸光值(450nM)。BCMA阳性克隆的判断方法是：在Fc板上为阴性(不超过其所在板阴性孔吸收值1.5倍)，在BCMA板上为阳性(高于所在板阴性孔吸收值3倍以上)，并且其孔吸收值高于Fc板上对应孔之吸收值上的克隆。经过分析，10个孔对应的克隆显示仅对BCMA抗原阳性，而对Fc为阴性，这些克隆统称为hit。
从母板对应孔上将这些hit菌液分别接种至3ml 2YT-CG，置于37℃，200转/分培养过夜。次日抽提噬菌粒DNA，以特异性引物测定包含每个hit的单链抗体区的序列。取编码区DNA序列翻译成氨基酸序列，对它们进行多重序列比较(CLUSTALW，网站链接https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw)以判断克隆特异性。经过分析，这十个hit在序列上属于两个不同的克隆，其中一个命名为B10，由此获得了抗人BCMA抗原的全人抗体可变区序列。B10的重链可变区序列如序列1所示，其轻链可变区序列如序列2所示。
实施例2抗体功能验证
为了验证获得的BCMA抗体克隆是否结合纯化的BCMA抗原以及细胞膜表面表达的BCMA，B10单链抗体的基因被克隆至真核表达载体pFH(益科思特公司制备)，得到质粒pFH-B10。在该载体中，scFv基因和人IgG4的Fc基因融合，表达出scFv-Fc形式的蛋白，它可以用Potein-A进行亲和纯化，也可以用(HRP或荧光素)标记抗人Fc抗体进行检测。
获得了B10的scFv-Fc蛋白后，以Octet RED检测了这株抗体对BCMA的结合情况，证实了B10对BCMA的特异性结合。
以流式细胞仪检测了B10对表达BCMA的细胞系H929(NCI-H929，
Figure BDA0002353883580000101
CRL-9068TM)，表明了B10特异性结合细胞膜表面的BCMA抗原(见图1)。在此FACS分析中，四分区左上角百分数(阳性百分数)代表了每个单链抗体对细胞表面抗原的结合强弱。克隆B10的阳性百分数为48.96％，由此验证了该抗人BCMA抗原的抗体的结合能力。
实施例3抗体亲和力成熟
抗体亲和力指的是某个抗体和其特异性抗原之间的相互作用强度，更准确的说是抗体与其特异性抗原上对应的抗原决定簇(或称表位)之间的结合强度。这种相互作用是非共价键性质的，由抗体-抗原双方的一些位置的氨基酸直接接触，通过氢键、疏水力，离子键或/和范德华力，将抗体-抗原紧紧束缚，形成抗体-抗原复合物。严格意义的亲和力(又称内在亲和力，intrinsic affinity，KD)是指以抗体-抗原按照1：1的单价结合具有的强度，例如抗原结合片段(Fab)或单链抗体(scFv)对单体抗原的相互作用。由于经典抗体的Y字形对称结构，在当抗体对细胞表面的相应抗原进行识别而结合时表现的结合强度称为表观亲和力(apparent affinity),也称功能亲和力(functional affinity)，通常通过流式细胞仪(FACS)进行测定。已经发现具有相同KD的抗体其表观亲和力不一定相同。在临床上，治疗性抗体的亲和力影响到它的多个方面：治疗效价、毒副反应、半衰期、药动和药代等。为了使B10抗体具有理想的临床表现，就要对其亲和力进行调适，也就是体外亲和力成熟(affinity maturation)。
体外亲和力成熟是一种快速的定向分子进化操作：在DNA水平上引入突变，在蛋白结合的水平上进行筛选。对于B10抗体而言，为了避免引入可能增强免疫原性的突变或者明显改变抗体的结构，突变位点局限于CDR区的序列，而且每个位置都分别进行饱和突变，每一种突变分别表达，分别检测。
亲和力成熟的操作过程是：首先把单价性质的Fab基因的轻重链可变区基因分别克隆至pUFL载体上(pUFL是一种可以在大肠杆菌中表达抗体Fab的质粒，由益科思特公司制备)。选择Fab是因为其单价结构便于基因操作和亲和力比较。设计全套CDR区随机突变引物，以点突变试剂盒(QuikChange Lightning Multi Site-Directed Mutagenesis Kit，Agilent目录号210515)分别对每个CDR位置进行PCR突变，分别转化BL21(DE3)感受态细菌，分别制备单克隆菌落平板，这些突变统称为单点突变文库。同时把亲本B10的Fab载体也进行转化。挑取>30个菌落制备DNA对突变区进行序列分析以评估突变效率。当突变效率合适时(大于80％)按每个CDR位置挑取92个菌落至含有相应培基(2YT中含100μg/mlCarbenicillin+0.1％葡萄糖)的96-孔培养板中，另外挑取3个亲本菌落，留下三个孔为空白对照。平板置于37℃中，300转/分培养6小时，加入IPTG至终浓度1mM，转入30℃中，300转/分培养过夜，Fab片段表达并分泌至培养基中。
通过预实验，优化酶联反应条件，使得B10亲本抗体Fab对抗原BCMA-Fc的结合A450吸收值略高于本底信号的3倍左右。提前一天在酶联板上按0.25μg/ml包被BCMA-Fc抗原，次日按孔加入分泌表达的突变Fab，以HRP偶联的抗人Fab作为二抗，底物显色，读取A450，获得信号高于亲本孔最高值1.5倍的孔对应的克隆，这些克隆称之为hit。收集轻重链可变区所有的hit，重新进行诱导表达以及酶联实验以验证它们确实具有高于亲本抗体的亲和力。对重复阳性的克隆的质粒进行突变区序列分析，获取CDR氨基酸的突变信息。这个过程称之为初级筛选(primary screening)，目的是获取CDR区所有有益于亲和力提高的突变信息：重链可变区CDR中对亲和力有提供的突变位点见表1，轻链可变区CDR中对亲和力有提供的突变位点见表2。
从初级文库中通过酶联实验筛选获得了整个CDR区有益于亲和力提高的所有单个突变信息后，重新设计新的多点突变引物，使其包含主要的有益突变，再次以点突变试剂盒构建突变文库，这个文库称为组合文库。为了尽可能筛选轻重链可变区中所有的突变组合，分别构建及筛选包含各自多个突变的轻重链可变区的组合文库。获得了轻链可变区组合文库中亲和力最高的前5个克隆,它们的轻链可变区氨基酸序列包含5种突变序列，如序列4-8所示。
在重链可变区组合文库中进行酶联筛选，获得了重链可变区组合文库中亲和力最高的前3个克隆的氨基酸序列，它们的重链可变区的氨基酸序列包含了3种突变序列，分别如序列9-11所示。分别将上述轻重链可变区亲和力最高的前5个克隆的DNA混合，以酶切、链接的重组方式组装成最终的单链抗体组合文库。对这个文库进行筛选，挑取信号最高的前3位，分析其DNA序列，得到四株不同的单链抗体克隆分别命名为B10.3，B10.4，B10.5和B10.9，对应的氨基酸序列如序列12-15所示。
为了验证获得的突变体的亲和力得到了提高，分别表达并纯化B10亲本抗体以及最后获得的4个突变体(氨基酸序列分别如序列12-15所示)，在两株不同表达水平的BCMA阳性细胞系H929和RPMI8226上进行流式细胞仪检测。与H929细胞结合百分率分别是：亲本B10为75.31％，突变体B10.3提高到97.96％，突变体B10.4提高到97.89％，突变体B10.5提高到97.17％，突变体B10.9提高到91.61％；与RPMI8226细胞结合百分率分别是：亲本B10为5.54％，突变体B10.3提高到54.89％，突变体B10.4提高到57.51％，突变体B10.5提高到58.18％，突变体B10.9提高到42.89％。结果表明所有四个突变体对BCMA的结合均有显著的提高(见图2A-图2J)。
为了了解获得B10及其衍生抗体IgG的亲和力，将B10亲本抗体以及最后获得的4个突变体与已知亲和力的BCMA抗体J6(即克隆J6M0,根据专利[WO2012163805A1]记录，其亲和力约为0.2nM)，分别通过ELISA进行比较实验，梯度-信号曲线见图4，表3。
表3 ELISA检测B10及其亲和力成熟突变体对BCMA的结合
Ab J6 B10 B10.3 B10.4 B10.5 B10.9
EC50 26.54 n/a 34.3 41.12 35.78 37.94
Fold of J6 1.00 n/a 1.29 1.55 1.35 1.43
nM 0.20 n/a 0.26 0.31 0.27 0.29
结果表明，就内在亲和力而言，由于亲本B10对人BCMA的结合显著弱于J6，S行曲线未能获得，故其亲和力数值无法产生。其它，B10.3亲和力约为0.26nM,B10.4亲和力约为0.31nM,B10.5亲和力约为0.27nM,B10.9亲和力约为0.29nM。
为了了解获得抗体表观亲和力，将B10亲本抗体以及最后获得的4个突变体与GSK的J6分别通过与表达BCMA的细胞系RPMI8226结合的流式细胞术进行比较实验(见图5及表4)。结果表明，在细胞水平上，亲本B10的EC50比J6(EC50为2.741μg/ml)提高约1.5倍，为1.5752.741μg/ml。B10.3、B10.4、B10.5以及B10.9的EC50分别是0.02822μg/ml、0.03429μg/ml、0.04063μg/ml及0.04514μg/ml，相对于J6，EC50提高倍数分别为97.13、79.94、67.46及60.72。
表4 FACS检测不同浓度梯度的B10及其亲和力成熟突变体对RPMI8226细胞系的结合
抗体 B10.3 B10.4 B10.5 B10.9 J6 B10
EC50(ug/ml) 0.02822 0.03429 0.04063 0.04514 2.741 1.575
相对于J6提高倍数 97.13 79.94 67.46 60.72 1.00 1.74
序列表
<110> 益科思特（北京）医药科技发展有限公司
<120> 一种BCMA抗体的制备方法与应用
<130> KHP191115646.4
<160> 30
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Gly Tyr
20 25 30
Ser Val Asn Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Ala Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Ile Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 3
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser
130 135 140
Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser
145 150 155 160
Asn Ile Gly Gly Tyr Ser Val Asn Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Thr
165 170 175
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val
180 185 190
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ala Ser Ala Ser Leu Ala
195 200 205
Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala
210 215 220
Trp Asp Asp Ser Leu Ile Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Gln Leu
225 230 235 240
Thr Val Leu
<210> 4
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Asn Asn Ile Gly Gly Tyr
20 25 30
Ser Val Asn Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Ala Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Val
85 90 95
Ile Gly Trp Leu Phe Gly Thr Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 5
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Asn Asn Ile Gly Gly Tyr
20 25 30
Ser Val Asn Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Ala Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Val
85 90 95
Ile Gly Leu Leu Phe Gly Thr Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 6
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
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Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Gly Tyr
20 25 30
Ser Val Asn Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
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Gly Ser Lys Ser Gly Ala Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Val Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Ile Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
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Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Asn Asn Ile Gly Gly Tyr
20 25 30
Ser Val Asn Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
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Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
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Gly Ser Lys Ser Gly Ala Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
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Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Glu
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Ile Gly Trp Leu Phe Gly Thr Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Asn Asn Ile Gly Gly Tyr
20 25 30
Ser Val Asn Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Ala Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Val
85 90 95
Ile Gly Leu Leu Phe Gly Thr Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Lys Ser
20 25 30
Ala Ile Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Val Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Trp Tyr Leu Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser
115
<210> 10
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Lys Ser
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Gly Gly Val Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Trp Tyr Leu Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser
115
<210> 11
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Lys Ser
20 25 30
Ala Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Val Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Trp Tyr Leu Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser
115
<210> 12
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Lys Ser
20 25 30
Ala Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Val Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Trp Tyr Leu Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser
130 135 140
Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Asn
145 150 155 160
Asn Ile Gly Gly Tyr Ser Val Asn Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Thr
165 170 175
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val
180 185 190
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ala Ser Ala Ser Leu Ala
195 200 205
Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala
210 215 220
Trp Asp Asp Ser Val Ile Gly Trp Leu Phe Gly Thr Gly Thr Gln Leu
225 230 235 240
Thr Val Leu
<210> 13
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Lys Ser
20 25 30
Ala Ile Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Val Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Trp Tyr Leu Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser
130 135 140
Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Asn
145 150 155 160
Asn Ile Gly Gly Tyr Ser Val Asn Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Thr
165 170 175
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val
180 185 190
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ala Ser Ala Ser Leu Ala
195 200 205
Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala
210 215 220
Trp Asp Asp Ser Val Ile Gly Trp Leu Phe Gly Thr Gly Thr Gln Leu
225 230 235 240
Thr Val Leu
<210> 14
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Lys Ser
20 25 30
Ala Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Val Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Trp Tyr Leu Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser
130 135 140
Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser
145 150 155 160
Asn Ile Gly Gly Tyr Ser Val Asn Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Thr
165 170 175
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val
180 185 190
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ala Ser Ala Ser Leu Ala
195 200 205
Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Val Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala
210 215 220
Trp Asp Asp Ser Leu Ile Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Gln Leu
225 230 235 240
Thr Val Leu
<210> 15
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Lys Ser
20 25 30
Ala Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Val Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Trp Tyr Leu Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser
130 135 140
Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Asn
145 150 155 160
Asn Ile Gly Gly Tyr Ser Val Asn Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Thr
165 170 175
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val
180 185 190
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ala Ser Ala Ser Leu Ala
195 200 205
Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala
210 215 220
Trp Asp Asp Ser Glu Ile Gly Trp Leu Phe Gly Thr Gly Thr Gln Leu
225 230 235 240
Thr Val Leu
<210> 16
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser
1 5 10
<210> 17
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 18
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Gly Trp Tyr Phe Asp Leu
1 5
<210> 19
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Lys Ser Ala Ile Met
1 5
<210> 20
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Gly Val Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 21
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Gly Trp Tyr Leu Asp Leu
1 5
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Lys Ser Ala Ile Gln
1 5
<210> 23
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Lys Ser Ala Ile His
1 5
<210> 24
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Gly Tyr Ser Val Asn
1 5 10
<210> 25
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser
1 5
<210> 26
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ile Gly Tyr Val
1 5 10
<210> 27
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
Ser Gly Ser Ser Asn Asn Ile Gly Gly Tyr Ser Val Asn
1 5 10
<210> 28
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Val Ile Gly Trp Leu
1 5 10
<210> 29
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Val Ile Gly Leu Leu
1 5 10
<210> 30
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Glu Ile Gly Trp Leu
1 5 10

Claims (13)

1.一种BCMA抗体，其特征在于，其轻链可变区的CDR1含有如序列24、序列27所示的任一条氨基酸序列；其轻链可变区的CDR2含有如序列25所示的氨基酸序列；其轻链可变区的CDR3含有如序列26、序列28-30所示的任一条氨基酸序列；
其重链可变区的CDR1含有如序列16、序列19、序列22、序列23所示的任一条氨基酸序列；其重链可变区的CDR2含有如序列17、序列20所示的任一条氨基酸序列；其重链可变区的CDR3含有如序列18、序列21所示的任一条氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的BCMA抗体，其特征在于，其轻链可变区含有如序列2、序列4-8所示的任一条氨基酸序列；其重链可变区含有如序列1、序列9-11所示的任一条氨基酸序列；
或者所述BCMA抗体的重链和轻链与前述序列相比满足以下二者中至少一个的序列：a)结合相同抗原表位；b)序列同一性大于70％、80％、85％、90％或97％。
3.一种BCMA抗体，其特征在于，其为权利要求1或2所述BCMA抗体的突变体，其突变信息为，序列1所示的重链可变区CDR的以下任一或多个位点的突变；
Figure FDA0002353883570000011
序列2所示的轻链可变区CDR的以下任一或多个位点的突变：
Figure FDA0002353883570000012
4.一种BCMA抗体，其特征在于，其氨基酸序列含有如序列3、序列12、序列13、序列14、序列15所示的任一条氨基酸序列；
或者所述BCMA抗体的氨基酸序列与前述序列相比满足以下二者中至少一个的序列：a)结合相同抗原表位；b)序列同一性大于70％、80％、85％、90％或97％。
5.如权利要求1-3任一所述的BCMA抗体，其特征在于，以其为单元构建的单链抗体、Fab、微型抗体、嵌合抗体或全抗体免疫球蛋白IgG1、IgG2、IgA、IgE、IgM、IgG4或IgD。
6.编码权利要求1～5任一项所述BCMA抗体的基因。
7.含有权利要求6所述基因的生物材料，所述生物材料为表达盒、质粒、表达载体、宿主细胞或宿主菌。
8.如权利要求1～5任一所述的BCMA抗体，其特征在于，该抗体以至少10nM的亲和力结合于人BCMA，该抗体抑制BCMA配体结合人BCMA；其结合于表达BCMA的细胞；所述的细胞是人多发性骨髓瘤细胞或淋巴瘤细胞。
9.权利要求1～5或8任一所述抗体的以下任一种应用，
(1)在制备以BCMA为靶标的疾病治疗药物中的应用，优选所述的药物为抗肿瘤药或治疗自身免疫性疾病的药物；
(2)在制备预防或治疗BCMA表达的B细胞相关疾病的药物中的应用；优选所述BCMA表达的B细胞相关疾病包括B细胞相关肿瘤、B细胞引起的自身免疫病；
(3)在制备用于杀伤BCMA表达细胞的药物中的应用；
(4)在制备BCMA的检测及诊断试剂中的应用；
(5)在制备适用于以BCMA为靶标的CAR-T疗法的相关试剂中的应用；
(6)在以BCMA为靶标的CAR-T中的应用。
10.含有权利要求1～5或8任一所述BCMA抗体的药物或检测试剂。
11.一种免疫毒素，包含以各种形式连接于细胞毒性剂的权利要求1～5或8任一所述BCMA抗体；优选所述的各种连接形式为抗体被标记、体外交联或分子偶联。
12.一种双特异性或多特异性分子，其特征在于，包含权利要求1～5或8任一所述BCMA抗体或抗体的抗原结合部位的分子。
13.一种抗体与其他蛋白和/或多肽的融合蛋白，其特征在于，包含权利要求1～5或8任一所述BCMA抗体和具有某种功能的其他蛋白或多肽分子的复合物。
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