CN112111012A - 共价多特异性抗体 - Google Patents

共价多特异性抗体 Download PDF

Info

Publication number
CN112111012A
CN112111012A CN201910535703.7A CN201910535703A CN112111012A CN 112111012 A CN112111012 A CN 112111012A CN 201910535703 A CN201910535703 A CN 201910535703A CN 112111012 A CN112111012 A CN 112111012A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
polypeptide
amino acid
acid sequence
target
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201910535703.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112111012B (zh
Inventor
周桢昊
张洁
王晓庆
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chimagen Biosciences Ltd
Zhejiang Borui Biopharmaceutical Co ltd
Original Assignee
Chimagen Biosciences Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chimagen Biosciences Ltd filed Critical Chimagen Biosciences Ltd
Priority to CN201910535703.7A priority Critical patent/CN112111012B/zh
Priority to CN202310708851.0A priority patent/CN116987197A/zh
Priority to US17/596,789 priority patent/US20230192898A1/en
Priority to PCT/CN2020/087668 priority patent/WO2020253393A1/zh
Priority to EP20826093.5A priority patent/EP3988575A4/en
Priority to JP2021576262A priority patent/JP2022537823A/ja
Publication of CN112111012A publication Critical patent/CN112111012A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112111012B publication Critical patent/CN112111012B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及双特异性工程化抗体和三特异性工程化抗体，其具有位于VH和VL之间的二硫键，并且VL和VH分别独立地包含引入带电荷的氨基酸的一个或多个取代，所述带电荷的氨基酸的取代对于同源二聚体的形成是静电学上不利的。本发明的双特异性工程化抗体和三特异性工程化抗体具有较高的稳定性并且其表现出对靶细胞的杀伤作用以及对肿瘤生长的显著抑制作用。

Description

共价多特异性抗体
技术领域
本发明涉及具有较高的稳定性的新型共价多特异性抗体及其治疗用途。
背景技术
单克隆抗体(mAb)在针对癌症和其他疾病的临床实际应用方面具有广泛的诊断和治疗潜力。无论是以裸抗体的形式还是以与细胞毒性剂(例如，放射性同位素，药物，毒素或前药转化酶)结合的偶联物的形式，单克隆抗体均在癌症免疫疗法中发挥重要作用。这些方法均处于疗效评估过程中，具有不同程度的发展并获得不同程度的临床成功。裸mAb可通过在与癌细胞上过表达的细胞表面蛋白结合之后诱导细胞毒性作用而实现临床反应。已有研究表明，通过经由程序性细胞死亡(凋亡)来控制肿瘤生长或通过诱导抗肿瘤免疫反应来实现这些治疗作用。
由于抗体的特异性靶向并介导效应子功能这一独特性质，自1975年CesarMilstein和Georges J.F.Kohler的单克隆抗体技术的发明以来，已研发出用作针对疾病的靶向免疫疗法的抗体药物。目前已有超过60个被批准的基于抗体的生物药物，其全球年销售额超过50亿美元。当代抗体药物的成功应用已形成了药物产业并使得公共健康得到了很大改善。除了针对新型靶点的抗体药物的研发之外，最优的联合疗法和创新性的双特异性抗体的研发也有着广阔的前景。
治疗性抗体已在临床应用超过20年。目前，临床使用的抗肿瘤抗体药物包括：美罗华(Rituxan(1997))，赫赛汀(Herceptin(1998))，Mylotarg(2000)，Campath(2001)，Zevalin(2002)，Bexxer(2003)，阿瓦斯汀(Avastin(2004))，爱必妥(Erbitux(2004))，Vectibix(2006)；Arzerra(2009)；Benlysta(2011)；Yervoy(2011)；Adcetris(2011)；Perjeta(2012)；Kadcyla(2013)，Opdivo(2014)，Keytruda(2014)，Tecentriq(2016)。这些抗体主要靶向EGFR，Her2，CD20或VEGF，以及最近发现的PD1或PD-L1。
多功能抗体是基于传统抗体通过复杂的设计和分子工程而构建的，其具有多抗原结合能力。从实际应用方面来说，单个多功能抗体分子所产生的治疗效果与若干个传统抗体的组合所产生的治疗效果相同。然而，多功能抗体的优势远超过了若干个传统抗体的简单叠加。通过新的且独一无二的机理，所选择的多个靶点的同时接合可产生优于传统抗体的有益作用。例如，靶向CD3和CD19的博纳吐单抗(Blinatumomab，CD3 x CD19，Amgen)在杀伤表达CD19的肿瘤细胞方面可通过其CD3-识别Fv而有效接合T细胞，其在ALL(急性淋巴性白血病)等适应症上展现出了超越传统抗体的显著疗效。博纳吐单抗已于2014年被美国FDA批准上市用于治疗ALL。
双特异性抗体通过化学交联、杂交-杂交瘤或转染瘤，或在两个不同的Fab’的铰链处进行二硫化物的交换而产生。第一种方法生成异源性且难以界定的产品。第二种方法需要对由多种杂交抗体副产物得到的双特异性抗体进行大量纯化，该纯化步骤可能会影响细胞交联活性。二硫化物交换方法实质上仅仅应用于F(ab’)2并且因此受到单克隆抗体易受到酶消化裂解的影响的限制。而且，因为Fab’彼此几乎没有亲和性，所以，形成Fab’间二硫键需要非常高的蛋白质浓度。二硫化物交换方法已通过使用Ellman试剂进行了改良，以在氧化前采用Fab’中的一个修饰另一个，这样，降低了同源二聚化的发生。然而，即便进行了这样的改良，在高于50％的产率中，异二聚F(ab’)2也鲜有产生。然而，不利的安全问题，低反应速度和有限的有效性是目前抗体药物的现状。这些不利因素可能来自于由于抗体的表位来自自身抗原而产生的对正常组织/细胞的非靶效应，免疫效应子细胞的抑制性微环境，未预料到的Fc介导的效应子功能，等等。因此，本领域仍然需要具有良好治疗效用的高纯度多特异性(例如，三特异性)抗体。
发明内容
一方面，本发明提供一种工程化抗体，其包含：
(i)第一多肽，其在N-末端至C-末端的方向上包括：结合第二靶点的第二轻链可变结构域VL2和结合第一靶点的第一重链可变结构域VH1，其中，VL2和VH1通过连接体连接；
(ii)第二多肽，其在N-末端至C-末端的方向上包括：结合第一靶点的第一轻链可变结构域VL1和结合第二靶点的第二重链可变结构域VH2，包含半胱氨酸的铰链结构域以及IgG的CH2-CH3结构域，其中，VL1和VH2通过连接体连接；
(iii)第三多肽，其在N-末端至C-末端的方向上包括：包含半胱氨酸的铰链结构域以及IgG的CH2-CH3结构域，
其中：
VL1和VH1结合形成能够结合第一靶点的结构域，所述第一靶点是CD3；
VL2和VH2结合形成能够结合第二靶点的结构域，所述第二靶点是CD19；
VL2和VH2通过二硫键共价连接，并且，VL2和VH2分别独立地包含引入带电荷的氨基酸的一个或多个取代，所述带电荷的氨基酸的取代对于同源二聚体的形成是静电学上不利的；
所述第二多肽链的铰链结构域和所述第三多肽链的铰链结构域通过二硫键共价连接。
在上文所述的抗体中，VL1的氨基酸序列为SEQ ID NO.：1，VH1的氨基酸序列为SEQID NO.：2，VL2的氨基酸序列为SEQ ID NO.：3，VH2的氨基酸序列为SEQ ID NO.：4。所述第一多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.：5，所述第二多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.：6，所述第三多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.：7。
另一方面，本发明还提供一种工程化抗体，其包含：
(i)第一多肽，其在N-末端至C-末端的方向上包括：结合第二靶点的第二轻链可变结构域VL2和结合第一靶点的第一重链可变结构域VH1，其中，VL2和VH1通过连接体连接；
(ii)第二多肽，其在N-末端至C-末端的方向上包括：结合第一靶点的第一轻链可变结构域VL1和结合第二靶点的第二重链可变结构域VH2，包含半胱氨酸的铰链结构域以及IgG的CH2-CH3结构域，其中，VL1和VH2通过连接体连接；
(iii)第三多肽，其在N-末端至C-末端的方向上包括：结合第三靶点的第三重链可变结构域VH3，IgG的CH1结构域，包含半胱氨酸的铰链结构域以及IgG的CH2-CH3结构域，其中，VH3和CH1通过连接体连接；以及
(iv)第四多肽，其在N-末端至C末端的方向上包括：结合所述第三靶点的第三轻链可变结构域VL3和包含半胱氨酸的轻链恒定结构域CL，其中VL3和CL通过连接体连接；
其中，VL1和VH1结合形成能够结合第一靶点的结构域；
其中，VL2和VH2结合形成能够结合第二靶点的结构域；
其中，VL3和VH3结合形成能够结合第三靶点的结构域；
其中，VL2和VH2通过二硫键共价连接，并且，VL2和VH2分别独立地包含引入带电荷的氨基酸的一个或多个取代，所述带电荷的氨基酸的取代对于同源二聚体的形成是静电学上不利的；
其中，CH1和CL通过二硫键共价连接；
其中，所述第二多肽链的铰链结构域和所述第三多肽链的铰链结构域通过二硫键共价连接。
在上文所述的抗体的一种实施方式中，所述第一靶点为CD3，所述第二靶点为CD19，所述第三靶点为CD20。VL1的氨基酸序列为SEQ ID NO.：1，VH1的氨基酸序列为SEQ IDNO.：2，VL2的氨基酸序列为SEQ ID NO.：3，VH2的氨基酸序列为SEQ ID NO.：4，VL3的氨基酸序列为SEQ ID NO.：8，VH3的氨基酸序列为SEQ ID NO.：9。所述第一多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.：10，所述第二多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.：11，所述第三多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.：12，所述第四多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.：13。
在上文所述的抗体的一种实施方式中，所述第一靶点为CD20，所述第二靶点为CD19，所述第三靶点为CD3。VL1的氨基酸序列为SEQ ID NO.：8，VH1的氨基酸序列为SEQ IDNO.：9，VL2的氨基酸序列为SEQ ID NO.：3，VH2的氨基酸序列为SEQ ID NO.：4，VL3的氨基酸序列为SEQ ID NO.：1，VH3氨基酸序列为SEQ ID NO.：2。所述第一多肽的氨基酸序列为SEQID NO.：14，所述第二多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.：15，所述第三多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.：16，所述第四多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.：17。
附图说明
本发明的新特征在所附的权利要求中具体列出。通过参考下文的具体实施方式部分以及附图将会更好地理解本发明的特征和优势，下文的具体实施方式部分列出了示例性的实施方式，其中应用了本发明的原理，本发明的附图如下：
图1是根据本发明的一种实施方式的双特异性抗体的结构示意图。
图2显示了本发明的抗体A对Raji细胞的杀伤效果。
图3显示了给药本发明的抗体A对肿瘤的抑制作用。
图4显示了给药本发明的抗体A对小鼠体重的影响。
图5是根据本发明的一种实施方式的三特异性抗体的结构示意图。
图6显示了本发明的抗体#1和抗体#2对Raji细胞的杀伤效果。
图7显示了本发明的抗体#1和抗体#2对K562细胞的杀伤效果。
图8显示了本发明的抗体#1和抗体#2在不同浓度条件下对小鼠体重的影响。
图9显示了本发明的抗体#1和抗体#2在不同浓度条件下的肿瘤抑制作用。
具体实施方式
总体上，本发明提供双特异性工程化抗体和三特异性工程化抗体，其具有位于VH和VL之间的二硫键，基于它们的静电性质而在所选择的氨基酸上出现的突变以及位于Fc片段中的榫卯(knob-in-hole)结构。
一方面，本发明提供一种双特异性工程化抗体，其包含：
(i)第一多肽，其在N-末端至C-末端的方向上包括：结合第二靶点的第二轻链可变结构域VL2和结合第一靶点的第一重链可变结构域VH1，其中，VL2和VH1通过连接体连接；
(ii)第二多肽，其在N-末端至C-末端的方向上包括：结合第一靶点的第一轻链可变结构域VL1和结合第二靶点的第二重链可变结构域VH2，包含半胱氨酸的铰链结构域以及IgG的CH2-CH3结构域，其中，VL1和VH2通过连接体连接；
(iii)第三多肽，其在N-末端至C-末端的方向上包括：包含半胱氨酸的铰链结构域以及IgG的CH2-CH3结构域，
其中：
VL1和VH1结合形成能够结合第一靶点的结构域，所述第一靶点是CD3；
VL2和VH2结合形成能够结合第二靶点的结构域，所述第二靶点是CD19；
VL2和VH2通过二硫键共价连接，并且，VL2和VH2分别独立地包含引入带电荷的氨基酸的一个或多个取代，所述带电荷的氨基酸的取代对于同源二聚体的形成是静电学上不利的；
所述第二多肽链的铰链结构域和所述第三多肽链的铰链结构域通过二硫键共价连接。
在一些实施方式中，所述第一多肽在N-末端至C-末端的方向上具有如下结构：VL2-连接体-VH1。
在一些实施方式中，所述第二多肽在N-末端至C-末端的方向上具有如下结构：VL1-连接体-VH2-铰链区-CH2-CH3。
在一些实施方式中，所述第三多肽在N-末端至C-末端的方向上具有如下结构：铰链区-CH2-CH3。
所述第一多肽中的连接体、所述第二多肽中的连接体和所述第三多肽中的连接体具有如下序列：RTVAA，或GGGGS，或GGSGGS，或GGSGGSGGS。
所述第二多肽中的铰链区和所述第三多肽中的铰链区包含来自IgG1，IgG2，IgG3，IgG4或IgA的铰链。
在本发明的一种示例性的实施方式中，VL2包括下列氨基酸取代：Cys取代Gln100，Lys取代Gln38，VH2包括下列氨基酸取代：Asp取代Gln39，Cys取代Gly44。所述第二多肽的CH3结构域和所述第三多肽的CH3结构域中的一个包含Trp取代Thr366，另一个CH3结构域包含Ser，Ala和Val分别取代Thr366，Leu368，Tyr407。
本发明的双特异性抗体能够同时识别两个个抗原，其具有位于VH和VL之间的二硫键以及基于它们的静电性质而在所选择的氨基酸上出现的突变，在一些实施方式中，第二多肽链的CH2CH3结构域和第三多肽链的CH2CH3结构域形成榫卯结构。
另一方面，本发明提供三特异性工程化抗体，其包含：
(i)第一多肽，其在N-末端至C-末端的方向上包括：结合第二靶点的第二轻链可变结构域VL2和结合第一靶点的第一重链可变结构域VH1，其中，VL2和VH1通过连接体连接；
(ii)第二多肽，其在N-末端至C-末端的方向上包括：结合第一靶点的第一轻链可变结构域VL1和结合第二靶点的第二重链可变结构域VH2，包含半胱氨酸的铰链结构域以及IgG的CH2-CH3结构域，其中，VL1和VH2通过连接体连接；
(iii)第三多肽，其在N-末端至C-末端的方向上包括：结合第三靶点的第三重链可变结构域VH3，IgG的CH1结构域，包含半胱氨酸的铰链结构域以及IgG的CH2-CH3结构域，其中，VH3和CH1通过连接体连接；以及
(iv)第四多肽，其在N-末端至C末端的方向上包括：结合所述第三靶点的第三轻链可变结构域VL3和包含半胱氨酸的轻链恒定结构域CL，其中，VL3和CL通过连接体连接；
其中，VL1和VH1结合形成能够结合第一靶点的结构域；
其中，VL2和VH2结合形成能够结合第二靶点的结构域；
其中，VL3和VH3结合形成能够结合第三靶点的结构域；
其中，VL2和VH2通过二硫键共价连接，并且，VL2和VH2独立地包含引入带电荷的氨基酸的一个或多个取代，所述带电荷的氨基酸的取代对于同源二聚体的形成是静电学上不利的；
其中，CH1和CL通过二硫键共价连接；
其中，所述第二多肽链的铰链结构域和所述第三多肽链的铰链结构域通过二硫键共价连接。
在一些实施方式中，所述第一多肽在N-末端至C-末端的方向上具有如下结构：VL2-连接体-VH1。
在一些实施方式中，所述第二多肽在N-末端至C-末端的方向上具有如下结构：VL1-连接体-VH2-铰链区-CH2-CH3。
在一些实施方式中，所述第三多肽在N-末端至C-末端的方向上具有如下结构：VH3-连接体-CH1-铰链区-CH2-CH3。
在一些实施方式中，所述第四多肽在N-末端至C-末端的方向上具有如下结构：VL3-连接体-CL。
所述第一多肽中的连接体、所述第二多肽中的连接体、所述第三多肽中的连接体和所述第四多肽中的连接体具有如下序列：RTVAA，或GGGGS，或GGSGGS，或GGSGGSGGS。
所述第二多肽中的铰链区和所述第三多肽中的铰链区包含来自IgG1，IgG2，IgG3，IgG4或IgA的铰链。
在本发明的一种示例性的实施方式中，VL2包括下列氨基酸取代：Cys取代Gln100，Lys取代Gln38，VH2包括下列氨基酸取代：Asp取代Gln39，Cys取代Gly44。所述第二多肽的CH3结构域和所述第三多肽的CH3结构域中的一个包含Trp取代Thr366，另一个CH3结构域包含Ser，Ala和Val分别取代Thr366，Leu368，Tyr407。
本发明的三特异性抗体能够同时识别三个抗原，其具有位于VH和VL之间的二硫键以及基于它们的静电性质而在所选择的氨基酸上出现的突变，在一些实施方式中，第二多肽链的CH3结构域和第三多肽链的CH3结构域形成榫卯结构。
二硫键
在本发明的一些实施方式中，VL2和VH2通过二硫键共价连接。在一些实施方式中，VL2的FR和VH2的FR通过二硫键共价连接。在VL-VH界面上引入半胱氨酸突变，从而在VL和VH之间形成二硫键，这样使VL和VH共价连接，从而改善了抗体的稳定性。
VL2的位置100和VH2的位置44被半胱氨酸取代。取代的半胱氨酸形成连接双特异性抗体和三特异性抗体的VL2和VH2的二硫键。
采用带电荷的氨基酸的取代
除了在VL2和VH2之间引入二硫键之外，本发明的双特异性抗体和三特异性抗体的VL2和VH2上还具有不同电荷性质的一个或多个氨基酸的取代。
早期研究显示，二硫键的引入大大提高了抗体的稳定性，但是仍然会有部分比例的轻重链之间会以非共价的方式结合，从而会影响产物的纯度。在本发明的三特异性抗体中，考虑到了区域静电作用力的影响，在VH2和VL2上分别引入具有不同电荷性质的一个或多个氨基酸的取代，这样使不期望的非共价结合方式最小化，进一步改善产物的稳定性和纯度。
在本发明的一些实施方式中，VL2被带负电荷的氨基酸取代，VH2被带正电荷的氨基酸取代。在本发明的一些实施方式中，VL2被带正电荷的氨基酸取代，VH2被带负电荷的氨基酸取代。带负电荷的氨基酸是天冬氨酸或谷氨酸，带正电荷的氨基酸是赖氨酸或精氨酸。
在本发明的一种示例性的实施方式中，VL2上的Gln38被Lys取代，VH2上的Gln39被Asp取代，从而形成带电荷的氨基酸的取代。
榫卯结构(knobs-in-hole)
在本发明的双特异性抗体和三特异性抗体中，所述第二多肽链的铰链结构域和所述第三多肽链的铰链结构域通过二硫键共价连接。在一些实施方式中，第二多肽链的CH2CH3结构域和第三多肽链的CH2CH3结构域形成榫卯结构。
榫卯结构也称为“凸起-进入-内腔(protuberance-into-cavity)”策略，其用于设计异源寡聚的第二和第三多肽之间的界面。
总体而言，优选的界面包含抗体恒定结构域的CH3结构域的至少一部分。“凸起”通过采用较大的侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)取代所述第二多肽的界面中的小氨基酸侧链来构建。与凸起的尺寸相同或类似的互补性“内腔”通过用较小的氨基酸(例如，丙氨酸或苏氨酸)取代较大的氨基酸侧链任选地建立在第三多肽的界面上。在定位和尺寸合适的凸起或内腔存在于第二或第三多肽的界面上时，仅需要在邻近的界面上分别设计对应的内腔或凸起。参见美国专利US8,216,805，其公开的内容通过引用并入本文。
在一种示例性的实施方式中，第二多肽的CH3结构域包含Trp取代Thr366，第三多肽的CH3结构域中包含Ser，Ala和Val分别取代Thr366，Leu368，Tyr407，从而形成榫卯结构。
在另一种示例性的实施方式中，第二多肽的CH3结构域包含Ser，Ala和Val分别取代Thr366，Leu368，Tyr407，第三多肽的CH3结构域中包含Trp取代Thr366，从而形成榫卯结构。
抗体的制备
抗体的所有形式均基于IgG抗体的重链和轻链，其可使用本领域已知的方法制备，所述方法通常包括如下步骤：构建重链基因和轻链基因的表达盒，将两个基因共转染至合适的细胞系统以生成重组抗体并制备稳定的且高产率的细胞克隆，细胞发酵生成cGMP最终抗体产物。
实施例
本发明进一步通过下文的实施例来举例说明，但不限于此。下文的实施例部分举例说明了本发明的工程化抗体的制备。
实施例1.双特异性抗体的构建
本实施例举例说明CD3 X CD19双特异性抗体的构建方式。在构建本实施例的双特异性抗体的过程中，CD3和CD19的VH和VL的氨基酸序列在SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4中列出(CD3 VL：SEQ ID NO.：1，CD3 VH：SEQ ID NO.：2，CD19 VL：SEQ ID NO.：3，CD19 VH：SEQID NO.：4)。
构建方法：使用OptimumGene对密码子的序列进行优化。首先在pUC57载体中构建目标基因，随后再亚克隆至pTGE5载体中。通过Maxiprep制备DNA用于转染。培养CHO3E7细胞并将其以0.3 x 106个细胞/ml的浓度进行传代。当细胞密度达到1.8-2.5 x 106个细胞/ml时进行转染。首先，分别将300μl DNA重链和轻链添加至50ml Freestyle CHO培养基中并轻摇混合。随后加入3mg PEI转染试剂并轻摇混合3分钟以上。将混合物在37℃下静置7分钟，随后将其加至450ml细胞悬浮液中，得到总体积500ml。24小时后，将25ml TN1(母液浓度200g/L)加至混合物中。转然后第1天、第3天和第5天分别取1ml悬浮液进行检测。取50μl样品进行细胞计数，剩余样品在3000rpm条件下离心处理5分钟，随后将上清液留于-20℃。第6天，收获培养物并且在5500rpm条件下离心处理30分钟。分离上清液、通过0.22μm过滤器过滤并进一步纯化蛋白质。层析柱：5ml Monofinity A树脂(GenScript，批号L00433)层析柱；平衡缓冲液A：20mM PB，150mM NaCl，pH7.2；洗涤缓冲液B：50mM柠檬酸，pH3.5；中和缓冲液C：1M Tris-HCl，pH9.0；流速：2ml/min；梯度：100％梯度洗脱。分离之后，将0.155ml中和缓冲液C加至各个1ml组分中。收集的蛋白质溶液在4℃下PBS(pH7.2)中进行透析持续16小时。
根据上述方法构建得到包括如下三条多肽链的CD3 X CD19双特异性抗体(抗体A，结构示意图如图1所示)：
第一多肽(SEQ ID NO.5)：CD19 VL-连接体-CD3 VH
第二多肽(SEQ ID NO.6)：CD3 VL-连接体-CD19 VH-铰链区-CH2CH3
第三多肽C(SEQ ID NO.7)：铰链区-CH2CH3
得到的抗体A通过尺寸排阻(SEC)进行纯化，其纯度在95％以上。
实施例2.亲和力测试
使用BIAcore方法，对抗体A与人CD3ε抗原和人CD19抗原的结合亲和力进行测试，计算ka，kd和KD值。本实施例使用捕获法进行亲和力评价。通过将人CD19作为配体，使其捕获于偶联有抗组胺抗体的芯片上。随后将5个不同浓度的候选药物作为分析物进样，进行亲和力分析。将CD3ε抗原和CD19抗原固化在芯片上，采用BIAcore方法对抗体A进行亲合力测试，结果如下：
抗原 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
CD3 4.876E+5 0.01530 3.137E-8
CD19 3.653E+5 6.686E-4 1.830E-9
实施例3.针对Raji细胞的细胞杀伤分析
使用淋巴细胞作为效应细胞，分析对靶细胞(Raji细胞)的抗体介导的杀伤作用。操作规程如下描述。
准备效应细胞：通过密度梯度离心从血液中新鲜分离外周血单核细胞(PBMC)。使用Stemcell分离试剂盒从PBMC中进一步分别分离CD4+T细胞和CD8+T细胞。将PBMC，CD4+T细胞和CD8+T细胞分别重悬于细胞培养基中并且检测细胞密度和细胞存活率。细胞培养基用于将细胞密度调节至6 X 106个活细胞/mL，随后将50μL/孔的细胞悬浮液加至平底96孔板中。效应细胞与靶细胞的比例(E/T)为20∶1，用于实验。细胞培养基：悬浮有10％HI-FBS和1％青霉素-链霉素的RPMI 1640。
准备靶细胞：Raji细胞的传代密度为2 x 105个细胞/mL，并在传代生长4天后开始用于实验。将适当量的细胞悬浮液转移至50ml离心管中并在室温、200g条件下离心处理5分钟。将细胞重悬于细胞培养基中并检测细胞密度和细胞存活率。用细胞培养基调节细胞密度为3 x 105个活细胞/mL，随后将50μL/孔的细胞悬浮液加至其中已存在Raji细胞的平底96孔板中。
抗体的准备：在细胞培养基中将抗体A以及作为对照的博纳吐单抗(blinatumomab)，MGD011及RG6026稀释至不同浓度。将50μL细胞培养基或稀释的溶液加至指示的孔中以得到最终浓度0pM，1pM或100pM。
将带有抗体、靶细胞和效应细胞的平底96孔板放置于37℃、5％CO2的孵育器中，在4小时、20小时和40小时取样进行检测。在350g条件下对样品进行离心处理持续5分钟，将细胞重悬并用PI染色。向每个孔中加入10μL计数珠，随后通过流式细胞仪对样品进行分析。分析结果显示，抗体A的EC50值为1.086pM，博纳吐单抗(blinatumomab)EC50值为5.476pM，MGD011EC50值为1.721pM，RG6026的EC50值为0.6701pM。抗体A对靶细胞的杀伤作用如图2所示。
实施例3.体内药效评价
在Jeko-1/NCG Mixeno模型中测试抗体A的体内抗肿瘤作用。在最开始(第0天)，将悬浮于100μL 1∶1 PBS/凝胶的5 x 106个Jeko-1细胞接种于动物右侧背部皮下。接种后3天(第3天)，将1 x 107/0.1ml PBMC注射至动物腹腔。当肿瘤的平均体积达到100mm3时，给药抗体样品。对四种抗体(博纳吐单抗@0.5mg/kg，抗体A@0.3mg/kg，MGD011@0.3mg/kg，RG6026@0.7mg/kg)以及一个对照组(pH 6.0PBS)进行测试，6个动物/组。所有样品通过尾静脉进行静脉注射给药。所有抗体和载剂每周给药两次，连续给药3周。基于相对肿瘤抑制(TGIRTV)进行疗效评价，根据动物体重变化和死亡情况进行安全性评价。
相对肿瘤生长抑制率TGIRTV(％)：TGIRTV＝1-TRTV/CRTV(％)。TRTV/CRTV(％)是相对肿瘤生长速率，即，在某一时间点，接受治疗组的肿瘤体积与接受PBS的对照组的肿瘤体积之间的比值。TRTV和CRTV分别是某一时间点治疗组和对照组的肿瘤体积(TV)。
接种后40天结束实验。如图3所示，所有治疗(抗体)组显示出对肿瘤生长的显著抑制。并且，如图4所示，所有治疗(抗体)组均未显示出显著的体重降低，这也说明，治疗用抗体没有显著的体内毒性作用。
实施例4.三特异性抗体的构建
本实施例举例说明CD3 X CD19 X CD20三特异性抗体的构建方式。在构建本实施例的三特异性抗体的过程中，CD3，CD19和CD20的VH和VL序列在SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4以及SEQ ID NO.：8和SEQ ID NO.：9中列出(CD3 VL：SEQ ID NO.：1，CD3 VH：SEQ ID NO.：2，CD19 VL：SEQ ID NO.：3，CD19 VH：SEQ ID NO.：4，CD20 VL：SEQ ID NO.：8，CD20 VH：SEQ IDNO.：9)。
根据实施例1记载的构建方法构建得到包括如下四条多肽链的CD3 X CD19 XCD20三特异性抗体(抗体#1)：
多肽A(SEQ ID NO.10)：CD19 VL-连接体-CD3 VH
多肽B(SEQ ID NO.11)：CD3 VL-连接体-CD19 VH-铰链区-CH2CH3
多肽C(SEQ ID NO.12)：CD20 VH-CH1-铰链区-CH2CH3
多肽D(SEQ ID NO.13)：CD20 VL-CL
采用上述相同的方法，仅对CD3，CD19和CD20的位置进行交换，构建得到包括如下四条多肽链的CD3 X CD19 X CD20三特异性抗体(抗体#2)：
多肽E(SEQ ID NO.14)：CD19 VL-连接体-CD20 VH
多肽F(SEQ ID NO.15)：CD20 VL-连接体-CD19 VH-铰链区-CH2CH3
多肽G(SEQ ID NO.16)：CD3 VH-CH1-铰链区-CH2CH3
多肽H(SEQ ID NO.17)：CD3 VL-CL
得到的抗体#1和抗体#2通过尺寸排阻(SEC)进行纯化，其纯度均在90％以上。
实施例5.亲和力测试
使用BIAcore方法，对抗体#1与人CD3ε抗原和人CD19抗原的结合亲和力进行测试，计算ka，kd和KD值。本实施例使用捕获法进行亲和力评价。通过将人CD19作为配体，使其捕获于偶联有抗组胺抗体的芯片上。随后将5个不同浓度的候选药物作为分析物进样，进行亲和力分析。将CD3ε抗原和CD19抗原固化在芯片上，采用BIAcore方法对抗体#1进行亲合力测试，结果如下：
抗原 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
CD3 3.342E+5 0.008349 2.498E-8
CD19 2.068E+5 2.727E-4 1.319E-9
实施例6.针对Raji细胞的细胞杀伤分析
使用淋巴细胞作为效应细胞，分析对靶细胞(Raji细胞)的抗体介导的杀伤作用。操作规程如下描述。
准备效应细胞：通过密度梯度离心从血液中新鲜分离外周血单核细胞(PBMC)。使用Stemcell分离试剂盒从PBMC中进一步分别分离CD4+T细胞和CD8+T细胞。将PBMC，CD4+T细胞和CD8+T细胞分别重悬于细胞培养基中并且检测细胞密度和细胞存活率。细胞培养基用于将细胞密度调节至6X 106个活细胞/mL，随后将50μL/孔的细胞悬浮液加至平底96孔板中。效应细胞与靶细胞的比例(E/T)为20∶1，用于实验。细胞培养基：悬浮有10％HI-FBS和1％青霉素-链霉素的RPMI 1640。
准备靶细胞：Raji细胞的传代密度为2 x 105个细胞/mL，并在传代生长4天后开始用于实验。将适当量的细胞悬浮液转移至50ml离心管中并在室温、200g条件下离心处理5分钟。将细胞重悬于细胞培养基中并检测细胞密度和细胞存活率。用细胞培养基调节细胞密度为3 x 105个活细胞/mL，随后将50μL/孔的细胞悬浮液加至其中已存在Raji细胞的平底96孔板中。
抗体的准备：在细胞培养基中将抗体#1、抗体#2以及作为对照的双特异性抗体CD3X CD19稀释至不同浓度。将50μL细胞培养基或稀释的溶液加至指示的孔中以得到最终浓度0pM，1pM或100pM。
将带有抗体、靶细胞和效应细胞的平底96孔板放置于37℃、5％CO2的孵育器中，在4小时、20小时和40小时取样进行检测。在350g条件下对样品进行离心处理持续5分钟，将细胞重悬并用PI染色。向每个孔中加入10μL计数珠，随后通过流式细胞仪对样品进行分析。分析结果显示，抗体#2的EC50值为971.8pM，抗体#1的EC50值为1.423pM，并且抗体#1和抗体#2对靶细胞的杀伤作用如图6所示。
实施例7.针对K562细胞的细胞杀伤分析
为了观察CD3XCD19XCD20不依赖CD19的细胞杀伤作用，在CD19-CD20-双阴细胞K562上稳转入CD20作为靶细胞，使用淋巴细胞作为效应细胞，来分析针对靶细胞(K562细胞)的抗体介导的杀伤作用。
将K562-CD20细胞离心后用1640+2％FBS培养基重悬，1000rpm离心5分钟，计数，在96孔细胞培养板中每孔种10000cells/100ul。取PBMC，1000rpm离心5分钟，用1640+2％FBS重悬计数，在上述细胞板中每孔再加入100000cells/100ul。用PBS分别稀释抗体，10倍梯度稀释8个点，每孔分别加入10ul到细胞培养板中，每个浓度两复孔，37℃，5％CO2培养箱中培养4h。取出检测试剂盒中的底物，每瓶加入12ml buffer重悬。将培养板1500rpm离心5分钟，每孔取上清50uL至新的培养板中，每孔在分别加入50ul新配置的底物，室温避光孵育10min，酶标仪检测OD490。分析结果显示，抗体#1的EC50值为1.222pM，并且抗体#1和对照抗体对靶细胞的杀伤作用如图7所示。
实施例8.体内药效评价
在Jeko-1/NCG Mixeno模型中测试抗体#1和抗体#2的体内抗肿瘤作用。在最开始(第0天)，将悬浮于100μL 1∶1 PBS/凝胶的5x 106个Jeko-1细胞接种于动物右侧背部皮下。接种后3天(第3天)，将1 x 107/0.1ml PBMC注射至动物腹腔。当肿瘤的平均体积达到100mm3时，给药抗体#1和抗体#2。对四种抗体(CD3 X CD19 @0.5mg/kg，抗体#1@0.5mg/kg，抗体#1@3mg/kg，抗体#2@0.5mg/kg)以及一个对照组(pH 6.0PBS)进行测试，6个动物/组。所有样品通过尾静脉进行静脉注射给药。所有抗体和载剂每周给药两次，连续给药3周。基于相对肿瘤抑制(TGIRTV)进行疗效评价，根据动物体重变化和死亡情况进行安全性评价。
相对肿瘤生长抑制率TGIRTV(％)：TGIRTV＝1-TRTV/CRTV(％)。TRTV/CRTV(％)是相对肿瘤生长速率，即，在某一时间点，接受治疗组的肿瘤体积与接受PBS的对照组的肿瘤体积之间的比值。TRTV和CRTV分别是某一时间点治疗组和对照组的肿瘤体积(TV)。
接种后28天结束实验。如图9所示，所有治疗(抗体)组显示出对肿瘤生长的显著抑制。并且，如图8所示，所有治疗(抗体)组均未显示出显著的体重降低，这也说明，治疗用抗体没有显著的体内毒性作用。
虽然本文描述并显示了本发明的示例性的实施方式，但是对于本领域技术人员而言显而易见的是，这些实施方式仅仅是举例说明。本领域技术人员可对这些实施方式作出多种改变、修改和替换，而不背离本发明。通过所附的权利要求来限定本发明的范围，并且这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物也被所附的权利要求涵盖。
Figure ISA0000184822530000011
Figure ISA0000184822530000021
Figure ISA0000184822530000031
Figure ISA0000184822530000041
Figure ISA0000184822530000051
Figure ISA0000184822530000061
Figure ISA0000184822530000071
Figure ISA0000184822530000081
Figure ISA0000184822530000091
Figure ISA0000184822530000101
Figure ISA0000184822530000111
Figure ISA0000184822530000121
Figure ISA0000184822530000131
Figure ISA0000184822530000141
Figure ISA0000184822530000151
Figure ISA0000184822530000161
Figure ISA0000184822530000171
Figure ISA0000184822530000181
Figure ISA0000184822530000191
Figure ISA0000184822530000201

Claims (10)

1.一种工程化抗体，其包含：
(i)第一多肽，其在N-末端至C-末端的方向上包括：结合第二靶点的第二轻链可变结构域VL2和结合第一靶点的第一重链可变结构域VH1，其中，VL2和VH1通过连接体连接；
(ii)第二多肽，其在N-末端至C-末端的方向上包括：结合第一靶点的第一轻链可变结构域VL1和结合第二靶点的第二重链可变结构域VH2，包含半胱氨酸的铰链结构域以及IgG的CH2-CH3结构域，其中，VL1和VH2通过连接体连接；
(iii)第三多肽，其在N-末端至C-末端的方向上包括：包含半胱氨酸的铰链结构域以及IgG的CH2-CH3结构域，
其中：
VL1和VH1结合形成能够结合第一靶点的结构域，所述第一靶点是CD3；
VL2和VH2结合形成能够结合第二靶点的结构域，所述第二靶点是CD19；
VL2和VH2通过二硫键共价连接，并且，VL2和VH2分别独立地包含引入带电荷的氨基酸的一个或多个取代，所述带电荷的氨基酸的取代对于同源二聚体的形成是静电学上不利的；
所述第二多肽链的铰链结构域和所述第三多肽链的铰链结构域通过二硫键共价连接。
2.如权利要求1所述的抗体，其中，VL1的氨基酸序列为SEQ ID NO.：1，VH1的氨基酸序列为SEQ ID NO.：2，VL2的氨基酸序列为SEQ ID NO.：3，VH2的氨基酸序列为SEQ ID NO.：4。
3.如权利要求1所述的抗体，其中，所述第一多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.：5，所述第二多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.：6，所述第三多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.：7。
4.一种工程化抗体，其包含：
(i)第一多肽，其在N-末端至C-末端的方向上包括：结合第二靶点的第二轻链可变结构域VL2和结合第一靶点的第一重链可变结构域VH1，其中，VL2和VH1通过连接体连接；
(ii)第二多肽，其在N-末端至C-末端的方向上包括：结合第一靶点的第一轻链可变结构域VL1和结合第二靶点的第二重链可变结构域VH2，包含半胱氨酸的铰链结构域以及IgG的CH2-CH3结构域，其中，VL1和VH2通过连接体连接；
(iii)第三多肽，其在N-末端至C-末端的方向上包括：结合第三靶点的第三重链可变结构域VH3，IgG的CH1结构域，包含半胱氨酸的铰链结构域以及IgG的CH2-CH3结构域，其中，VH3和CH1通过连接体连接；以及
(iv)第四多肽，其在N-末端至C末端的方向上包括：结合所述第三靶点的第三轻链可变结构域VL3和包含半胱氨酸的轻链恒定结构域CL，其中VL3和CL通过连接体连接；
其中，VL1和VH1结合形成能够结合第一靶点的结构域；
其中，VL2和VH2结合形成能够结合第二靶点的结构域；
其中，VL3和VH3结合形成能够结合第三靶点的结构域；
其中，VL2和VH2通过二硫键共价连接，并且，VL2和VH2分别独立地包含引入带电荷的氨基酸的一个或多个取代，所述带电荷的氨基酸的取代对于同源二聚体的形成是静电学上不利的；
其中，CH1和CL通过二硫键共价连接；
其中，所述第二多肽链的铰链结构域和所述第三多肽链的铰链结构域通过二硫键共价连接。
5.如权利要求4所述的抗体，其中，所述第一靶点为CD3，所述第二靶点为CD19，所述第三靶点为CD20。
6.如权利要求4所述的抗体，其中，所述第一靶点为CD20，所述第二靶点为CD19，所述第三靶点为CD3。
7.如权利要求5所述的抗体，其中，VL1的氨基酸序列为SEQ ID NO.：1，VH1的氨基酸序列为SEQ ID NO.：2，VL2的氨基酸序列为SEQ ID NO.：3，VH2的氨基酸序列为SEQ ID NO.：4，VL3的氨基酸序列为SEQ ID NO.：8，VH3的氨基酸序列为SEQ ID NO.：9。
8.如权利要求6所述的抗体，其中，VL1的氨基酸序列为SEQ ID NO.：8，VH1的氨基酸序列为SEQ ID NO.：9，VL2的氨基酸序列为SEQ ID NO.：3，VH2的氨基酸序列为SEQ ID NO.：4，VL3的氨基酸序列为SEQ ID NO.：1，VH3氨基酸序列为SEQ ID NO.：2。
9.如权利要求5所述的抗体，其中，所述第一多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.：10，所述第二多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.：11，所述第三多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.：12，所述第四多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.：13。
10.如权利要求6所述的抗体，其中，所述第一多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.：14，所述第二多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.：15，所述第三多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.：16，所述第四多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.：17。
CN201910535703.7A 2019-06-20 2019-06-20 共价多特异性抗体 Active CN112111012B (zh)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910535703.7A CN112111012B (zh) 2019-06-20 2019-06-20 共价多特异性抗体
CN202310708851.0A CN116987197A (zh) 2019-06-20 2019-06-20 共价多特异性抗体
US17/596,789 US20230192898A1 (en) 2019-06-20 2020-04-29 Covalent multi-specific antibody
PCT/CN2020/087668 WO2020253393A1 (zh) 2019-06-20 2020-04-29 共价多特异性抗体
EP20826093.5A EP3988575A4 (en) 2019-06-20 2020-04-29 COVALENT MULTISPECIFIC ANTIBODIES
JP2021576262A JP2022537823A (ja) 2019-06-20 2020-04-29 共有結合型多重特異性抗体

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910535703.7A CN112111012B (zh) 2019-06-20 2019-06-20 共价多特异性抗体

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310708851.0A Division CN116987197A (zh) 2019-06-20 2019-06-20 共价多特异性抗体

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112111012A true CN112111012A (zh) 2020-12-22
CN112111012B CN112111012B (zh) 2023-07-04

Family

ID=73795815

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910535703.7A Active CN112111012B (zh) 2019-06-20 2019-06-20 共价多特异性抗体
CN202310708851.0A Pending CN116987197A (zh) 2019-06-20 2019-06-20 共价多特异性抗体

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310708851.0A Pending CN116987197A (zh) 2019-06-20 2019-06-20 共价多特异性抗体

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20230192898A1 (zh)
EP (1) EP3988575A4 (zh)
JP (1) JP2022537823A (zh)
CN (2) CN112111012B (zh)
WO (1) WO2020253393A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024027828A1 (en) * 2022-08-05 2024-02-08 Chimagen Biosciences, Ltd Multi-specific antibodies targeting a dimerizable tumor antigen and an immunostimulatory antigen

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014047231A1 (en) * 2012-09-21 2014-03-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-cd3 antibodies, bispecific antigen-binding molecules that bind cd3 and cd20, and uses thereof
TW201439117A (zh) * 2013-03-15 2014-10-16 Amgen Inc 異二聚雙特異性抗體
CN107484416A (zh) * 2014-09-26 2017-12-15 宏观基因有限公司 能够结合cd19和cd3的双特异性单价双抗体及其用途
CN108690138A (zh) * 2017-04-12 2018-10-23 鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司 一种能与人cd19或cd20和人cd3结合的双特异性抗体及其应用
CN109476732A (zh) * 2016-04-13 2019-03-15 赛诺菲 三特异性和/或三价结合蛋白

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
RU2663123C2 (ru) * 2010-11-30 2018-08-01 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Индуцирующий цитотоксичность терапевтический агент
JP6339015B2 (ja) * 2011-08-23 2018-06-06 ロシュ グリクアート アーゲー 二重特異性ｔ細胞活性化抗原結合分子
US10273303B2 (en) * 2013-11-13 2019-04-30 Zymeworks Inc. Monovalent antigen binding constructs targeting EGFR and/or HER2 and uses thereof
SG10202008629XA (en) * 2014-03-28 2020-10-29 Xencor Inc Bispecific antibodies that bind to cd38 and cd3
TWI707872B (zh) * 2014-05-29 2020-10-21 美商宏觀基因股份有限公司 特異性結合多種癌症抗原的三特異性結合分子和其使用方法
EP3356407B1 (en) * 2015-10-02 2021-11-03 F. Hoffmann-La Roche AG Bispecific anti-cd19xcd3 t cell activating antigen binding molecules
CN109706163A (zh) * 2017-10-26 2019-05-03 深圳新诺微环生物科技有限公司 微环dna表达连接人与动物靶细胞与效应细胞的桥接分子及其应用
CN109957026A (zh) * 2017-12-22 2019-07-02 成都恩沐生物科技有限公司 共价多特异性抗体
AU2018414456A1 (en) * 2018-03-22 2020-10-15 Universität Stuttgart Multivalent binding molecules

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014047231A1 (en) * 2012-09-21 2014-03-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-cd3 antibodies, bispecific antigen-binding molecules that bind cd3 and cd20, and uses thereof
TW201439117A (zh) * 2013-03-15 2014-10-16 Amgen Inc 異二聚雙特異性抗體
CN107484416A (zh) * 2014-09-26 2017-12-15 宏观基因有限公司 能够结合cd19和cd3的双特异性单价双抗体及其用途
CN109476732A (zh) * 2016-04-13 2019-03-15 赛诺菲 三特异性和/或三价结合蛋白
CN108690138A (zh) * 2017-04-12 2018-10-23 鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司 一种能与人cd19或cd20和人cd3结合的双特异性抗体及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
范冬梅等: "双功能抗体抗CD3/抗CD19介导T细胞对靶细胞的杀伤作用", 《中国癌症杂志》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024027828A1 (en) * 2022-08-05 2024-02-08 Chimagen Biosciences, Ltd Multi-specific antibodies targeting a dimerizable tumor antigen and an immunostimulatory antigen

Also Published As

Publication number Publication date
EP3988575A1 (en) 2022-04-27
EP3988575A4 (en) 2023-08-16
JP2022537823A (ja) 2022-08-30
CN112111012B (zh) 2023-07-04
WO2020253393A1 (zh) 2020-12-24
CN116987197A (zh) 2023-11-03
US20230192898A1 (en) 2023-06-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111944050B (zh) 一种抗b7-h3抗体及其应用
US20220002408A1 (en) Bispecific antibody, preparation method thereof and application thereof
CN107488229B (zh) Pd-l1抗体及其用途
CN110799546B (zh) 重组双特异性抗体
WO2018176992A1 (zh) 新型双特异性抗体及其用途
JP7365654B2 (ja) 抗ｃｌｄｎ４－抗ｃｄ１３７二重特異性抗体
JP2022521958A (ja) 抗ｐｄ－ｌ１抗体及びその応用
TWI806087B (zh) 免疫細胞銜接多特異性結合蛋白及其製備和應用
JP2023534738A (ja) ＴＧＦ－β ＲＩＩ突然変異体及びその融合タンパク質
CN112111012B (zh) 共价多特异性抗体
WO2023273595A1 (zh) 一种结合trop2的抗体及靶向trop2和cd3的双特异性抗体及其制备方法与应用
CN115197321B (zh) 靶向cd25的抗体及其用途
WO2022267702A1 (zh) 结合bcma和cd3的双特异性抗体及其制备方法与应用
KR102291725B1 (ko) 항-cntn4 항체 및 그의 용도
CN111848806B (zh) Egfr-cd3双功能抗体及其应用
CN110872356B (zh) 双特异性抗体及其使用方法
CN114573696B (zh) 一种结合程序性死亡受体1(pd-1)的抗体及其用途
CN115038718B (zh) 抗人程序性死亡配体-1（pd-l1）的抗体及其用途
CN113004416B (zh) 靶向her2-cd137双特异性抗体的构建及其应用
US20230374132A1 (en) Anti-cd3 antibody and uses thereof
WO2022002006A1 (zh) Fab-HCAb结构的结合蛋白
WO2023187460A1 (en) Human antibody or antigen binding fragment thereof specific against pd-l1 to enhance t-cell function
CN118290582A (zh) 抗人Claudin18.2抗体及其应用
CN118085092A (zh) 分离的抗人Claudin18.2抗体及其应用
CN115991771A (zh) 抗pd-1纳米抗体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20221220

Address after: No.1, 9 / F, building 1, No.5, Keyuan South Road, Chengdu hi tech Zone, Chengdu, Sichuan 610041

Applicant after: CHIMAGEN BIOSCIENCES, Ltd.

Applicant after: Zhejiang Borui biopharmaceutical Co.,Ltd.

Address before: No.1, 9 / F, building 1, No.5, Keyuan South Road, Chengdu hi tech Zone, Chengdu, Sichuan 610041

Applicant before: CHIMAGEN BIOSCIENCES, Ltd.

TA01 Transfer of patent application right
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant