CN109476732A - 三特异性和/或三价结合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明提供包含4条多肽链的三特异性和/或三价结合蛋白，所述4条多肽链形成特异性结合一个或多个靶蛋白的3个抗原结合位点，其中形成该结合蛋白的第一对多肽具有双重可变域，其具有交叉(cross‑over)取向，且其中形成该结合蛋白的第二对多肽具有单一可变域。本文还提供用于制备三特异性和/或三价结合蛋白的方法和此类结合蛋白的用途。

Description

三特异性和/或三价结合蛋白
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年4月13日提交的美国临时申请序列号62/322，036；2016年5月3日提交的美国临时申请序列号62/331,191；2016年10月24日提交的美国临时申请序列号62/412,187；及2017年3月17日提交的欧洲申请EP17305298.6号的优先权权益，所述申请通过提述以其整体并入本文。
以ASCII文本文件提交的序列表
以ASCII文本文件的如下提交内容在此通过提述以其整体并入本文：计算机可读形式(CRF)的序列表(文件名183952027140SEQLISTING.txt，记录日期：2017年4月11日，大小：200KB)。
发明领域
本发明涉及包含4条多肽链的三特异性和/或三价结合蛋白，所述4条多肽链形成特异性结合一个或多个靶蛋白的3个抗原结合位点，其中形成该结合蛋白的第一对多肽具有双重可变域，其具有交叉(cross-over)取向，且其中形成该结合蛋白的第二对多肽具有单一可变域。本发明还涉及用于制备三特异性和/或三价结合蛋白的方法及此类结合蛋白的用途。
背景技术
基于生物治疗剂的单克隆抗体已成为新药开发的重要途径。单克隆抗体技术通过其Fc功能提供特异性靶向、精确信号传送和/或对特定细胞群体的有效负载，并提供长效生物效应。抗体工程中的努力允许开发组合两种单克隆抗体的特异性的双特异性抗体用于多种生物学应用，这拓宽了抗体药物开发的范围。新发现的具有改进的广度和效力的中和抗体可以提供更多选择用于开发生物治疗剂以治疗复杂疾病(如癌症、关节炎和/或炎性病症)。
发明内容
本发明提供形成3个抗原结合位点的多特异性结合蛋白(例如抗体)。这些结合蛋白能特异性结合一个、两个或三个抗原靶标或靶蛋白。
在一个实施方案中，本发明提供一种结合蛋白，其包含形成3个抗原结合位点的4条多肽链，所述3个抗原结合位点特异性结合一个或多个抗原靶标或靶蛋白，其中第一多肽链具有如下式表示的结构：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]；
且第二多肽链具有如下式表示的结构：
VH1-L3-VH2-L4-CH1 [II]；
且第三多肽链具有如下式表示的结构：
VH3-CH1 [III]；
且第四多肽链具有如下式表示的结构：
VL3-CL [IV]；
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变域；
VL3是第三免疫球蛋白轻链可变域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变域；
VH3是第三免疫球蛋白重链可变域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定域；且
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
且其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对。
在一些实施方案中，所述第二和/或第三多肽链还包含连接至CH1的Fc区，所述Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域。
在另一个实施方案中，本发明提供一种结合蛋白，其包含形成3个抗原结合位点的4条多肽链，所述3个抗原结合位点特异性结合一个或多个靶蛋白，其中第一多肽链包含如下式表示的结构：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽链包含如下式表示的结构：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-铰链-CH2-CH3 [II]
且第三多肽链包含如下式表示的结构：
VH3-CH1-铰链-CH2-CH3 [III]
且第四多肽链包含如下式表示的结构：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变域；
VL3是第三免疫球蛋白轻链可变域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变域；
VH3是第三免疫球蛋白重链可变域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定域；
CH2是免疫球蛋白CH2重链恒定域；
CH3是免疫球蛋白CH3重链恒定域；
铰链是连接CH1和CH2域的免疫球蛋白铰链区；且
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
且其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对。
在一些实施方案中，结合蛋白是三特异性的且能够特异性结合3个不同的抗原靶标。在一些实施方案中，结合蛋白是三价但双特异性的，并且能够特异性结合3个抗原靶标，其中两个是相同的。在一些实施方案中，本发明的结合蛋白是三价但单特异性的，并且能够特异性结合3个抗原靶标，其全都是相同的。在一些实施方案中，结合蛋白能够抑制一个或多个靶蛋白的功能。在一些实施方案中，结合蛋白是三特异性的且能够特异性结合3个不同的抗原靶标。
在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含一个、两个或三个抗原结合位点，其特异性结合选自下组的靶蛋白：A2AR、APRIL、ATPD酶(ATPDase)、BAFF、BAFFR、BCMA、BlyS、BTK、BTLA、B7DC、B7H1、B7H4(也称为VTCN1)、B7H5、B7H6、B7H7、B7RP1、B7-4、C3、C5、CCL2(也称为MCP-1)、CCL3(也称为MIP-1a)、CCL4(也称为MIP-1b)、CCL5(也称为RANTES)、CCL7(也称为MCP-3)、CCL8(也称为mcp-2)、CCL11(也称为嗜酸性粒细胞趋化因子(eotaxin))、CCL15(也称为MIP-1d)、CCL17(也称为TARC)、CCL19(也称为MIP-3b)、CCL20(也称为MIP-3a)、CCL21(也称为MIP-2)、CCL24(也称为MPIF-2/嗜酸性粒细胞趋化因子-2)、CCL25(也称为TECK)、CCL26(也称为嗜酸性粒细胞趋化因子-3)、CCR3、CCR4、CD3、CD19、CD20、CD23(也称为FCER2，IgE的受体)、CD24、CD27、CD28、CD38、CD39、CD40、CD70、CD80(也称为B7-1)、CD86(也称为B7-2)、CD122、CD137(也称为41BB)、CD137L、CD152(也称为CTLA4)、CD154(也称为CD40L)、CD160、CD272、CD273(也称为PDL2)、CD274(也称为PDL1)、CD275(也称为B7H2)、CD276(也称为B7H3)、CD278(也称为ICOS)、CD279(也称为PD-1)、CDH1(也称为E-钙粘素)、壳多糖酶、CLEC9、CLEC91、CRTH2、CSF-1(也称为M-CSF)、CSF-2(也称为GM-CSF)、CSF-3(也称为GCSF)、CX3CL1(也称为SCYD1)、CXCL12(也称为SDF1)、CXCL13、CXCR3、DNGR-1、外核苷三磷酸盐二磷酸水解酶1(ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1)、EGFR、ENTPD1、FCER1A、FCER1、FLAP、FOLH1、Gi24、GITR、GITRL、GM-CSF、Her2、HHLA2、HMGB1、HVEM、ICOSLG、IDO、IFNα、IgE、IGF1R、IL2Rβ、IL1、IL1A、IL1B、IL1F10、IL2、IL4、IL4Ra、IL5、IL5R、IL6、IL7、IL7Ra、IL8、IL9、IL9R、IL10、rhIL10、IL12、IL13、IL13Ra1、IL13Ra2、IL15、IL17、IL17Rb(也已知作为IL25的受体)、IL18、IL22、IL23、IL25、IL27、IL33、IL35、ITGB4(也称为b4整合素)、ITK、KIR、LAG3、LAMP1、瘦素、LPFS2、II类MHC、NCR3LG1、NKG2D、NTPD酶-1、OX40、OX40L、PD-1H、血小板受体、PROM1、S152、SISP1、SLC、SPG64、ST2(也已知作为IL33的受体)、STEAP2、Syk激酶、TACI、TDO、T14、TIGIT、TIM3、TLR、TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、TMEF1、TNFa、TNFRSF7、Tp55、TREM1、TSLP(也已知作为IL7Ra的辅助受体(co-receptor))、TSLPR、TWEAK、VEGF、VISTA、Vstm3、WUCAM和XCR1(也称为GPR5/CCXCR1)。在一些实施方案中，一个或多个上述抗原靶标为人抗原靶标。在一些实施方案中，本发明的结合蛋白是三特异性的且能够特异性结合选自上文列表的3个不同的抗原靶标。在一些实施方案中，本发明的结合蛋白是三价但双特异性的，且能够特异性结合选自上文列表的3个抗原靶标，其中两个是相同的。在一些实施方案中，本发明的结合蛋白是三价但单特异性的，且能够特异性结合选自上文列表的3个抗原靶标，其全部是相同的。在一些实施方案中，结合蛋白特异性结合3个靶蛋白，所述靶蛋白对应于T细胞上的2个靶蛋白以及1个肿瘤靶蛋白。在一些实施方案中，T细胞上的所述靶蛋白之一是CD3。在一些实施方案中，T细胞上的所述靶蛋白之一是CD28。在一些实施方案中，所述肿瘤靶蛋白是CD38。在一些实施方案中，结合蛋白特异性结合3个靶蛋白，所述靶蛋白对应于T细胞上的2个靶蛋白以及1个选自下组的靶蛋白：A2AR、APRIL、ATPD酶、BAFF、BAFFR、BCMA、BlyS、BTK、BTLA、B7DC、B7H1、B7H4、B7H5、B7H6、B7H7、B7RP1、B7-4、C3、C5、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL15、CCL17、CCL19、CCL20、CCL21、CCL24、CCL25、CCL26、CCR3、CCR4、CD3、CD19、CD20、CD23、CD24、CD27、CD28、CD38、CD39、CD40、CD70、CD80、CD86、CD122、CD137、CD137L、CD152、CD154、CD160、CD272、CD273、CD274、CD275、CD276、CD278、CD279、CDH1、壳多糖酶、CLEC9、CLEC91、CRTH2、CSF-1、CSF-2、CSF-3、CX3CL1、CXCL12、CXCL13、CXCR3、DNGR-1、外核苷三磷酸盐二磷酸水解酶1、EGFR、ENTPD1、FCER1A、FCER1、FLAP、FOLH1/Gi24、GITR、GITRL、GM-CSF、Her2、HHLA2、HMGB1、HVEM、ICOSLG、IDO、IFNα、IgE、IGF1R、IL2Rβ、IL1、IL1A、IL1B、IL1F10、IL2、IL4、IL4Ra、IL5、IL5R、IL6、IL7、IL7Ra、IL8、IL9、IL9R、IL10、rhIL10、IL12、IL13、IL13Ra1、IL13Ra2、IL15、IL17、IL17Rb、IL18、IL22、IL23、IL25、IL27、IL33、IL35、ITGB4、ITK、KIR、LAG3、LAMP1、瘦素、LPFS2、II类MHC、NCR3LG1、NKG2D、NTPD酶-1、OX40、OX40L、PD-1H、血小板受体、PROM1/S152、SISP1、SLC、SPG64、ST2、STEAP2、Syk激酶、TACI、TDO、T14、TIGIT、TIM3、TLR、TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、TMEF1、TNFa、TNFRSF7、Tp55、TREM1、TSLP、TSLPR、TWEAK、VEGF、VISTA、Vstm3、WUCAM和XCR1。
在另一个实施方案中，本发明提供一种结合蛋白，其包含形成3个抗原结合位点的4条多肽链，其中第一多肽链具有如下式表示的结构：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽链具有如下式表示的结构：
VH1-L3-VH2-L4-CH1 [II]
且第三多肽链具有如下式表示的结构：
VH3-CH1 [III]
且第四多肽链具有如下式表示的结构：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变域；
VL3是第三免疫球蛋白轻链可变域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变域；
VH3是第三免疫球蛋白重链可变域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定域；且
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对；
其中：
(a)VL1、VL2和VL3各自独立地是源自如SEQ ID NO：2、4、10、14、18、22、115任一项所示氨基酸序列的可变域；
(b)VL1、VL2和VL3各自独立地包含可变域的轻链互补决定区，所述可变域包含如SEQID NO：43-59、123-125的任一项所示的氨基酸序列；
(c)VL1、VL2和VL3各自独立地包含如SEQ ID NO：151、153、155、157、159、161、163、165和167的任一项所示的可变域序列；
(d)VL1、VL2和VL3各自独立地包含轻链互补决定区，其包含如SEQ ID NO：43-59、123-125、138-140和149的任一项所示的氨基酸序列；或
(e)VL1、VL2和VL3各自独立地包含如表2-5所示的轻链互补决定区和/或可变域序列；且
其中：
(a)VH1、VH2和VH3各自独立地是源自如SEQ ID NO：1、3、9、13、17、21、114任一项所示氨基酸序列的可变域；
(b)VH1、VH2和VH3各自独立地包含可变域的重链互补决定区，所述可变域包含如SEQID NO：25-42、120-122的任一项所示的氨基酸序列；
(c)VH1、VH2和VH3各自独立地包含如SEQ ID NO：150、152、154、156、158、160、162、164和166的任一项所示的可变域序列；
(d)VH1、VH2和VH3各自独立地包含重链互补决定区，其包含如SEQ ID NO：25-42、120-122和126-128任一项所示的氨基酸序列；或
(e)VH1、VH2和VH3各自独立地包含如表2-5所示的重链互补决定区和/或可变域序列。
在一些实施方案中，第二和/或第三多肽链还包含连接至CH1的Fc区，所述Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域。
在另一个实施方案中，本发明提供一种结合蛋白，其包含形成3个抗原结合位点的4条多肽链，其中第一多肽链包含如下式表示的结构：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽链包含如下式表示的结构：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-铰链-CH2-CH3 [II]
且第三多肽链包含如下式表示的结构：
VH3-CH1-铰链-CH2-CH3 [III]
且第四多肽链包含如下式表示的结构：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变域；
VL3是第三免疫球蛋白轻链可变域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变域；
VH3是第三免疫球蛋白重链可变域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定域；
CH2是免疫球蛋白CH2重链恒定域；
CH3是免疫球蛋白CH3重链恒定域；
铰链是连接CH1和CH2域的免疫球蛋白铰链区；且
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对；
其中：
(a)VL1、VL2和VL3各自独立地是源自如SEQ ID NO：2、4、10、14、18、22、115的任一项所示氨基酸序列的可变域；
(b)VL1、VL2和VL3各自独立地包含可变域的轻链互补决定区，所述可变域包含如SEQID NO：43-59、123-125的任一项所示的氨基酸序列；
(c)VL1、VL2和VL3各自独立地包含如SEQ ID NO：151、153、155、157、159、161、163、165和167的任一项所示的可变域序列；
(d)VL1、VL2和VL3各自独立地包含轻链互补决定区，其包含如SEQ ID NO：43-59、123-125、138-140和149的任一项所示的氨基酸序列；或
(e)VL1、VL2和VL3各自独立地包含如表2-5所示的轻链互补决定区和/或可变域序列；且
其中：
(a)VH1、VH2和VH3各自独立地是源自如SEQ ID NO：1、3、9、13、17、21、114的任一项所示氨基酸序列的可变域；
(b)VH1、VH2和VH3各自独立地包含可变域的重链互补决定区，所述可变域包含如SEQID NO：25-42、120-122的任一项所示的氨基酸序列；
(c)VH1、VH2和VH3各自独立地包含如SEQ ID NO：150、152、154、156、158、160、162、164和166的任一项所示的可变域序列；
(d)VH1、VH2和VH3各自独立地包含重链互补决定区，其包含如SEQ ID NO：25-42、120-122和126-128任一项所示的氨基酸序列；或
(e)VH1、VH2和VH3各自独立地包含如表2-5所示的重链互补决定区和/或可变域序列。
在一些实施方案中，VL1、VL2和VL3各自独立地包含如SEQ ID NO：151、153、155、157、159、161、163、165和167的任一项所示的可变域序列；且VH1、VH2和VH3各自独立地包含如SEQID NO：150、152、154、156、158、160、162、164和166的任一项所示的可变域序列。在一些实施方案中，VL1、VL2和VL3各自独立地包含轻链互补决定区，所述轻链互补决定区包含如SEQ IDNO：43-59、123-125、138-140和149的任一项所示的氨基酸序列；且(d)VH1、VH2和VH3各自独立地包含重链互补决定区，所述重链互补决定区包含如SEQ ID NO：25-42、120-122和126-128的任一项所示的氨基酸序列。
在本文所述的任一结合蛋白的一些实施方案中，(a)VH1包含：包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：47的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：48的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ IDNO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ IDNO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列的CDR-L3；(b)VH1包含含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQID NO：43的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ IDNO：45的氨基酸序列的CDR-L3；(c)VH1包含：包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：47的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：48的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：55的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：56的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：57的氨基酸序列的CDR-L3；(d)VH1包含：包含SEQID NO：31的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ IDNO：33的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQID NO：50的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：55的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：56的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：57的氨基酸序列的CDR-L3；(e)VH1包含：包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：47的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：48的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ IDNO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：58的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：59的氨基酸序列的CDR-L3；(f)VH1包含：包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ IDNO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：58的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：59的氨基酸序列的CDR-L3；(g)VH1包含：包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：47的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：48的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ IDNO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ IDNO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：126的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：127的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：128的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：138的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：139的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：140的氨基酸序列的CDR-L3；(h)VH1包含：包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ IDNO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ IDNO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：126的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：127的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：128的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：138的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：139的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：140的氨基酸序列的CDR-L3；(i)VH1包含：包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：47的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：48的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQID NO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ IDNO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：120的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：121的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：122的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：123的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：124的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：125的氨基酸序列的CDR-L3；或(j)VH1包含：包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ IDNO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ IDNO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：120的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：121的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：122的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：123的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：124的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：125的氨基酸序列的CDR-L3。在一些实施方案中，(a)VH1包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些实施方案中，结合蛋白包含一个特异性结合T细胞表面蛋白的抗原结合位点和另一个特异性结合抗原靶标(例如肿瘤靶蛋白)的抗原结合位点。在一些实施方案中，结合蛋白包含特异性结合CD3的抗原结合位点，特异性结合CD28的抗原结合位点，和特异性结合选自下组的肿瘤靶蛋白的抗原结合位点：CD19、CD20、CD38、Her2和LAMP1。在一些实施方案中，VH1和VL1形成特异性结合人CD3的第一抗原结合位点，VH2和VL2形成特异性结合人CD28的第二抗原结合位点，且VH3和VL3形成特异性结合人肿瘤靶蛋白的第三抗原结合位点。在一些实施方案中，VH1和VL1形成特异性结合人CD28的第一抗原结合位点，VH2和VL2形成特异性结合人CD3的第二抗原结合位点，且VH3和VL3形成特异性结合人肿瘤靶蛋白的第三结合位点。在一些实施方案中，所述抗原结合位点特异性结合选自下组的人肿瘤靶蛋白：CD19、CD20、CD38、Her2和LAMP1。在一些实施方案中，特异性结合CD3的抗原结合位点包含：(a)包含SEQ ID NO：152的氨基酸序列的重链可变域和包含SEQ ID NO：153的氨基酸序列的轻链可变域；或(b)包含SEQ ID NO：154的氨基酸序列的重链可变域和包含SEQ ID NO：155的氨基酸序列的轻链可变域。在一些实施方案中，特异性结合CD3的抗原结合位点包含6个CDR，或重链和轻链可变域，其示于表2-5。在一些实施方案中，特异性结合CD28的抗原结合位点包含：(a)包含SEQ ID NO：160的氨基酸序列的重链可变域和包含SEQ ID NO：161的氨基酸序列的轻链可变域；或(b)包含SEQ ID NO：162的氨基酸序列的重链可变域和包含SEQ IDNO：163的氨基酸序列的轻链可变域。在一些实施方案中，特异性结合CD28的抗原结合位点包含6个CDR，或重链和轻链可变域，其示于表2-5。在一些实施方案中，特异性结合肿瘤靶蛋白的抗原结合位点包含：(a)包含SEQ ID NO：156的氨基酸序列的重链可变域和包含SEQ IDNO：157的氨基酸序列的轻链可变域；(b)包含SEQ ID NO：158的氨基酸序列的重链可变域和包含SEQ ID NO：159的氨基酸序列的轻链可变域；(c)包含SEQ ID NO：164的氨基酸序列的重链可变域和包含SEQ ID NO：165的氨基酸序列的轻链可变域；(d)包含SEQ ID NO：150的氨基酸序列的重链可变域和包含SEQ ID NO：151的氨基酸序列的轻链可变域；或(e)包含SEQ ID NO：166的氨基酸序列的重链可变域和包含SEQ ID NO：167的氨基酸序列的轻链可变域。在一些实施方案中，特异性结合肿瘤靶蛋白的抗原结合位点包含6个CDR，或重链和轻链可变域，其示于表2-5。在一些实施方案中，特异性结合肿瘤靶蛋白的所述抗原结合位点包含表2-5所示的抗-Her2、抗-CD19、抗-CD20、抗-CD38或抗-LAMP1结合域的六个CDR，或重链和轻链可变域。
在另一个实施方案中，本发明提供一种结合蛋白，其包含形成3个抗原结合位点的4条多肽链，其中第一多肽链具有如下式表示的结构：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽链具有如下式表示的结构：
VH1-L3-VH2-L4-CH1 [II]
且第三多肽链具有如下式表示的结构：
VH3-CH1 [III]
且第四多肽链具有如下式表示的结构：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变域；
VL3是第三免疫球蛋白轻链可变域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变域；
VH3是第三免疫球蛋白重链可变域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定域；且
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对；
其中：
(a)VL1、VL2和VL3各自独立地是源自如SEQ ID NO：61、63、69、71、74、76、82、86、88、94任一项所示氨基酸序列的可变域；或
(b)VL1、VL2和VL3各自独立地包含可变域的轻链互补决定区，所述可变域是如SEQID NO：61、63、69、71、74、76、82、86、88、94的任一项所示的至少一个氨基酸序列；
(c)VL1、VL2和VL3各自独立地包含如SEQ ID NO：169、171和173的任一项所示的可变域序列；
(d)VL1、VL2和VL3各自独立地包含轻链互补决定区，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：141-147、178和179；或
(e)VL1、VL2和VL3各自独立地包含如表2-5所示的轻链互补决定区和/或可变域序列；且
其中：
(a)VH1、VH2和VH3各自独立地是源自如SEQ ID NO：60、62、68、73、75、81、85、87、93的任一项所示氨基酸序列的可变域；或
(b)VH1、VH2和VH3各自独立地包含可变域的重链互补决定区，所述可变域是SEQ IDNO：60、62、68、73、75、81、85、87、93的任一项所示的至少一个氨基酸序列；
(c)VH1、VH2和VH3各自独立地包含如SEQ ID NO：168、170和172的任一项所示的可变域序列；
(d)VH1、VH2和VH3各自独立地包含重链互补决定区，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：129-137；或
(e)VH1、VH2和VH3各自独立地包含如表2-5所示的重链互补决定区和/或可变域序列。
在一些实施方案中，第二和/或第三多肽链还包含连接至CH1的Fc区，所述Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域。
在另一个实施方案中，本发明提供一种结合蛋白，其包含形成3个抗原结合位点的4条多肽链，其中第一多肽链包含如下式表示的结构：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽链包含如下式表示的结构：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-铰链-CH2-CH3 [II]
且第三多肽链包含如下式表示的结构：
VH3-CH1-铰链-CH2-CH3 [III]
且第四多肽链包含如下式表示的结构：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变域；
VL3是第三免疫球蛋白轻链可变域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变域；
VH3是第三免疫球蛋白重链可变域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定域；
CH2是免疫球蛋白CH2重链恒定域；
CH3是免疫球蛋白CH3重链恒定域；
铰链是连接CH1和CH2域的免疫球蛋白铰链区；且
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对；
其中：
(a)VL1、VL2和VL3各自独立地是源自如SEQ ID NO：61、63、69、71、74、76、82、86、88、94的任一项所示氨基酸序列的可变域；
(b)VL1、VL2和VL3各自独立地包含可变域的轻链互补决定区，所述可变域是如SEQID NO：61、63、69、71、74、76、82、86、88、94的任一项所示的至少一个氨基酸序列；
(c)VL1、VL2和VL3各自独立地包含如SEQ ID NO：169、171和173的任一项所示的可变域序列；
(d)VL1、VL2和VL3各自独立地包含轻链互补决定区，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：141-147、178和179；或
(e)VL1、VL2和VL3各自独立地包含如表2-5所示的轻链互补决定区和/或可变域序列；且
其中：
(a)VH1、VH2和VH3各自独立地是源自如SEQ ID NO：60、62、68、73、75、81、85、87、93的任一项所示氨基酸序列的可变域；
(b)VH1、VH2和VH3各自独立地包含可变域的重链互补决定区，所述可变域是SEQ IDNO：60、62、68、73、75、81、85、87、93的任一项所示的至少一个氨基酸序列；
(c)VH1、VH2和VH3各自独立地包含如SEQ ID NO：168、170和172的任一项所示的可变域序列：
(d)VH1、VH2和VH3各自独立地包含重链互补决定区，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：129-137；
(e)VH1、VH2和VH3各自独立地包含如表2-5所示的重链互补决定区和/或可变域序列。
在一些实施方案中，VL1、VL2和VL3各自独立地包含如SEQ ID NO：169、171和173的任一项所示的可变域序列；且VH1、VH2和VH3各自独立地包含如SEQ ID NO：168、170和172的任一项所示的可变域序列。在一些实施方案中，VL1、VL2和VL3各自独立地包含轻链互补决定区，所述轻链互补决定区包含如SEQ ID NO：141-147、178和179的任一项所示的氨基酸序列；且VH1、VH2和VH3各自独立地包含重链互补决定区，所述重链互补决定区包含如SEQ ID NO：129-137的任一项所示的氨基酸序列。
在本文所述的任一结合蛋白的一些实施方案中，(a)VH1包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ IDNO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：129的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：130的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：131的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：141的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：178的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：142的氨基酸序列的CDR-L3；(b)VH1包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ IDNO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：129的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：130的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：131的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：141的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ IDNO：178的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：142的氨基酸序列的CDR-L3；(c)VH1包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：129的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：130的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：131的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：141的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：178的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：142的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ IDNO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；(d)VH1包含：包含SEQ ID NO：129的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：130的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：131的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：141的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：178的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：142的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ IDNO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；(e)VH1包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：129的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQID NO：130的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：131的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：141的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：178的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：142的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3；(f)VH1包含：包含SEQ IDNO：129的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：130的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ IDNO：131的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：141的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：178的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：142的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ IDNO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ IDNO：144的氨基酸序列的CDR-L3；(g)VH1包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ IDNO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ IDNO：137的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；(h)VH1包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3：(i)VH1包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；或(j)VH1包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ IDNO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ IDNO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3。在一些实施方案中，VH1、VL1、VH2、VL2、VH3和VL3的一项或多项包含表2-5所示抗体的一个、两个或三个CDR序列。
在一些实施方案中，结合蛋白包含3个抗原结合位点，其中所述抗原结合位点的一个、两个或三个特异性结合选自下组的细胞因子靶蛋白：IL-4、IL-13和TNFa。在一些实施方案中，(a)VH1和VL1形成特异性结合人TNFa的第一抗原结合位点VH2和VL2形成特异性结合人IL13的抗原结合位点，且VH3和VL3形成特异性结合人IL4的抗原结合位点；(b)VH1和VL1形成特异性结合人TNFa的第一抗原结合位点，VH2和VL2形成特异性结合人IL4的第二抗原结合位点，且VH3和VL3形成特异性结合人IL13的第三抗原结合位点；(c)VH1和VL1形成特异性结合人IL4的第一抗原结合位点，VH2和VL2形成特异性结合人TNFa的第二抗原结合位点，且VH3和VL3形成特异性结合人IL13的第三抗原结合位点；(d)VH1和VL1形成特异性结合人IL4的第一抗原结合位点，VH2和VL2形成特异性结合人IL13的抗原结合位点，且VH3和VL3形成特异性结合人TNFa的第三抗原结合位点；(e)VH1和VL1形成特异性结合人IL13的第一抗原结合位点，VH2和VL2形成特异性结合人IL4的第二抗原结合位点，且VH3和VL3形成特异性结合人TNFa的第三抗原结合位点；或(f)VH1和Vk1形成特异性结合人IL13的第一抗原结合位点，VH2和VL2形成特异性结合人TNFa的第二抗原结合位点，且VH3和VL3形成特异性结合人IL4的第三抗原结合位点。在一些实施方案中，特异性结合人TNFa的抗原结合位点包含重链可变域和轻链可变域，所述重链可变域包含SEQ ID NO：168的氨基酸序列，所述轻链可变域包含SEQ ID NO：169的氨基酸序列。在一些实施方案中，特异性结合人IL4的抗原结合位点包含重链可变域和轻链可变域，所述重链可变域包含SEQ ID NO：170的氨基酸序列，所述轻链可变域包含SEQ IDNO：171的氨基酸序列。在一些实施方案中，特异性结合人IL13的抗原结合位点包含重链可变域和轻链可变域，所述重链可变域包含SEQ ID NO：172的氨基酸序列，所述轻链可变域包含SEQ ID NO：173的氨基酸序列。
在本文所述的任一结合蛋白的一些实施方案中，所述第二和/或第三多肽链还包含连接至CH1的Fc区，所述Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域。在一些实施方案中，L1、L2、L3、或L4的至少一个独立地长度为0个氨基酸。在一些实施方案中，L1、L2、L3、或L4各自独立地长度为至少1个氨基酸。在一些实施方案中，所述结合蛋白是三特异性的且能够特异性结合3个不同的抗原靶标。在一些实施方案中，所述结合蛋白是三特异性的且能够特异性结合3个不同的抗原靶标。在一些实施方案中，所述结合蛋白能够抑制一个或多个靶蛋白的功能。
在本文所述的任一结合蛋白的一些实施方案中，L1、L2、L3、或L4的至少一个独立地长度为0个氨基酸。在一些实施方案中，L1、L2、L3、或L4各自独立地长度为至少1个氨基酸。在一些实施方案中，L1、L2、L3和L4的一项、两项、三项或全部四项的长度为0至15个氨基酸。在一些实施方案中，L1、L2、L3和L4的至少两项的长度为1至15个氨基酸。在一些实施方案中，(a)L1、L2、L3和L4各自独立地长度为0个氨基酸或包含选自由下列组成的组的序列：GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：104)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：105)、S、RT、TKGPS(SEQ IDNO：106)、GQPKAAP(SEQ ID NO：175)和GGSGSSGSGG(SEQ ID NO：148)；或(b)L1、L2、L3和L4各自独立地包含选自由下列组成的组的序列：GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：104)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：105)、S、RT、TKGPS(SEQ ID NO：106)、GQPKAAP(SEQ ID NO：175)和GGSGSSGSGG(SEQ ID NO：148)。在一些实施方案中，L1包含序列GQPKAAP(SEQ ID NO：175)，L2包含序列TKGPS(SEQ ID NO：106)，L3包含序列S，且L4包含序列RT；L1包含序列GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：104)，L2包含序列GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：104)，L3长度为0个氨基酸，且L4长度为0个氨基酸；L1包含序列GGSGSSGSGG(SEQ ID NO：148)，L2包含序列GGSGSSGSGG(SEQ ID NO：148)，L3长度为0个氨基酸，且L4长度为0个氨基酸；或L1包含序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：105)，L2长度为0个氨基酸，L3包含序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQID NO：105)，且L4长度为0个氨基酸。
在本文所述的任一结合蛋白的一些实施方案中，所述第二多肽链还包含连接至CH1的第一Fc区，所述第一Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域，其中所述第一Fc区包含与人IgG1或IgG4的位置354和366对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为S354C和T366W；且其中所述第三多肽链还包含连接至CH1的第二Fc区，所述第二Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域，其中所述第二Fc区包含与人IgG1或IgG4的位置349、366、368和407对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为Y349C、T366S、L368A和Y407V。在一些实施方案中，所述第二多肽链还包含连接至CH1的第一Fc区，所述第一Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域，其中所述第一Fc区包含与人IgG1或IgG4的位置349、366、368和407对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为Y349C、T366S、L368A和Y407V；且其中所述第三多肽链还包含连接至CH1的第二Fc区，所述第二Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域，其中所述第二Fc区包含与人IgG1或IgG4的位置354和366对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为S354C和T366W。在一些实施方案中，所述第二多肽链还包含连接至CH1的第一Fc区，所述第一Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域，且其中所述第三多肽链还包含连接至CH1的第二Fc区，所述第二Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域；其中所述第一和/或第二Fc区包含与人IgG1或IgG4的位置428和434对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为M428L和N434S。在一些实施方案中，所述第二多肽链的CH3域包含与人IgG1或IgG4的位置354和366对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为S354C和T366W；且其中所述第三多肽链的CH3域包含与人IgG1或IgG4的位置349、366、368和407对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为Y349C、T366S、L368A和Y407V。在一些实施方案中，所述第二多肽链的CH3域包含与人IgG1或IgG4的位置349、366、368和407对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为Y349C、T366S、L368A和Y407V且其中所述第三多肽链的CH3域包含与人IgG1或IgG4的位置354和366对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为S354C和T366W。在一些实施方案中，所述第二和第三多肽链二者的CH3域包含与人IgG1或IgG4的位置428和434对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为M428L和N434S。在一些实施方案中，所述第二多肽链还包含连接至CH1的第一Fc区，所述第一Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域；其中所述第三多肽链还包含连接至CH1的第二Fc区，所述第二Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域；且其中所述第一和第二Fc区仅有一个包含与人IgG1或IgG4的位置435和436对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为H435R和Y436F。在一些实施方案中，所述第二和第三多肽链的CH3域是人IgG1 CH3域，且其中所述CH3域仅有一个包含与人IgG1或IgG4的位置435和436对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为H435R和Y436F。在一些实施方案中，所述第二多肽链还包含连接至CH1的第一Fc区，所述第一Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域；其中所述第三多肽链还包含连接至CH1的第二Fc区，所述第二Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域；其中所述第一和/或第二Fc区是人IgG4 Fc区；且其中所述第一和第二Fc区各自包含与人IgG4的位置228和409对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为S228P和R409K。在一些实施方案中，所述第二和第三多肽链的CH3域是人IgG4 CH3域，且其中所述CH3域各自包含与人IgG4的位置228和409对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为S228P和R409K。在一些实施方案中，所述第二多肽链还包含连接至CH1的第一Fc区，所述第一Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域；其中所述第三多肽链还包含连接至CH1的第二Fc区，所述第二Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域；其中所述第一和/或第二Fc区是人IgG4 Fc区；且其中所述第一和第二Fc区各自包含与人IgG4的位置234和235对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为F234A和L235A。在一些实施方案中，所述第二和第三多肽链的CH3域是人IgG4 CH3域，且其中所述CH3域各自包含与人IgG4的位置234和235对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为F234A和L235A。在一些实施方案中，所述第二多肽链还包含连接至CH1的第一Fc区，所述第一Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域；其中所述第三多肽链还包含连接至CH1的第二Fc区，所述第二Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域；其中所述第一和/或第二Fc区是人IgG1 Fc区；且其中所述第一和第二Fc区各自包含与人IgG1的位置234和235对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为L234A和L235A。在一些实施方案中，所述第二和第三多肽链的CH3域是人IgG1 CH3域，且其中所述CH3域各自包含与人IgG1的位置234和235对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为L234A和L235A。在一些实施方案中，所述第一和/或第二Fc区是人IgG1 Fc区。在一些实施方案中，所述第一和/或第二Fc区是人IgG4 Fc区。
在本文所述的任一结合蛋白的一些实施方案中，所述第一多肽链的CL域是人κCL域，且第四多肽链的CL域是人λCL域；或所述第一多肽链的CL域是人λCL域，且第四多肽链的CL域是人κCL域。在一些实施方案中，第一多肽链包含λCL域；其中第二多肽链的CH3域包含与人IgG1或IgG4的位置354和366对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为S354C和T366W；其中所述第三多肽链的CH3域包含与人IgG1或IgG4的位置349、366、368、407、435和436对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为Y349C、T366S、L368A、Y407V、H435R和Y436F；且其中第四多肽链包含κCL域。在一些实施方案中，第一多肽链包含λCL域；其中第三多肽链的CH3域包含与人IgG1或IgG4的位置354和366对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为S354C和T366W；其中第二多肽链的CH3域包含与人IgG1或IgG4的位置349、366、368、407、435和436对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为Y349C、T366S、L368A、Y407V、H435R和Y436F，且其中第四多肽链包含κCL域。在一些实施方案中，第一多肽链包含λCL域；其中第二多肽链的CH3域包含与人IgG1或IgG4的位置354、366、435和436对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为S354C、T366W、H435R和Y436F；其中第三多肽链的CH3域包含与人IgG1或IgG4的位置349、366、368和407对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为Y349C、T366S、L368A和Y407V；且其中第四多肽链包含κCL域。在一些实施方案中，第一多肽链包含κCL域；其中第二多肽链的CH3域包含与人IgG1或IgG4的位置354和366对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为S354C和T366W；其中第三多肽链的CH3域包含与人IgG1或IgG4的位置349、366、368、407、435和436对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为Y349C、T366S、L368A、Y407V、H435R和Y436F；且其中第四多肽链包含λCL域。在一些实施方案中，第二和/或第三多肽链包含人IgG1或IgG4 Fc区。
在另一个实施方案中，本发明提供一种结合蛋白，其包含第一多肽链、第二多肽链、第三多肽链和第四多肽链，其中：
(a)所述第一多肽链包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列或与SEQ ID NO：4的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列或与SEQID NO：3的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列或与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或与SEQ ID NO：2的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；
(b)所述第一多肽链包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列或与SEQ ID NO：10的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列或与SEQID NO：9的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列或与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或与SEQ ID NO：2的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；
(c)所述第一多肽链包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列或与SEQ ID NO：4的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列或与SEQID NO：3的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列或与SEQ ID NO：13的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列或与SEQ ID NO：14的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；
(d)所述第一多肽链包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列或与SEQ ID NO：10的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列或与SEQID NO：9的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列或与SEQ ID NO：13的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列或与SEQ ID NO：14的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；
(e)所述第一多肽链包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列或与SEQ ID NO：4的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列或与SEQID NO：3的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列或与SEQ ID NO：17的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列或与SEQ ID NO：18的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；
(f)所述第一多肽链包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列或与SEQ ID NO：10的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列或与SEQID NO：9的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列或与SEQ ID NO：17的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列或与SEQ ID NO：18的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；
(g)所述第一多肽链包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列或与SEQ ID NO：4的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列或与SEQID NO：3的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列或与SEQ ID NO：21的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列或与SEQ ID NO：22的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；
(h)所述第一多肽链包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列或与SEQ ID NO：10的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列或与SEQID NO：9的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列或与SEQ ID NO：21的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列或与SEQ ID NO：22的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；
(i)所述第一多肽链包含SEQ ID NO：63的氨基酸序列或与SEQ ID NO：63的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：62的氨基酸序列或与SEQ ID NO：62的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：60的氨基酸序列或与SEQ ID NO：60的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：61的氨基酸序列或与SEQ ID NO：61的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；
(j)所述第一多肽链包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列或与SEQ ID NO：69的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列或与SEQ ID NO：68的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：60的氨基酸序列或与SEQ ID NO：60的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：61的氨基酸序列或与SEQ ID NO：61的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；
(k)所述第一多肽链包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列或与SEQ ID NO：69的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列或与SEQ ID NO：68的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：60的氨基酸序列或与SEQ ID NO：60的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：71的氨基酸序列或与SEQ ID NO：71的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列：
(1)所述第一多肽链包含SEQ ID NO：76的氨基酸序列或与SEQ ID NO：76的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：75的氨基酸序列或与SEQ ID NO：75的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列或与SEQ ID NO：73的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：74的氨基酸序列或与SEQ ID NO：74的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；
(m)所述第一多肽链包含SEQ ID NO：82的氨基酸序列或与SEQ ID NO：82的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：81的氨基酸序列或与SEQ ID NO：81的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列或与SEQ ID NO：73的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：74的氨基酸序列或与SEQ ID NO：74的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；
(n)所述第一多肽链包含SEQ ID NO：88的氨基酸序列或与SEQ ID NO：88的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：87的氨基酸序列或与SEQ ID NO：87的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：85的氨基酸序列或与SEQ ID NO：85的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：86的氨基酸序列或与SEQ ID NO：86的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；
(o)所述第一多肽链包含SEQ ID NO：94的氨基酸序列或与SEQ ID NO：94的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：93的氨基酸序列或与SEQ ID NO：93的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：85的氨基酸序列或与SEQ ID NO：85的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：86的氨基酸序列或与SEQ ID NO：86的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；
(p)所述第一多肽链包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列或与SEQ ID NO：69的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列或与SEQ ID NO：68的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列或与SEQ ID NO：73的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：74的氨基酸序列或与SEQ ID NO：74的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；
(q)所述第一多肽链包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列或与SEQ ID NO：69的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列或与SEQ ID NO：68的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：85的氨基酸序列或与SEQ ID NO：85的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：86的氨基酸序列或与SEQ ID NO：86的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；
(r)所述第一多肽链包含SEQ ID NO：63的氨基酸序列或与SEQ ID NO：63的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：62的氨基酸序列或与SEQ ID NO：62的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列或与SEQ ID NO：73的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：74的氨基酸序列或与SEQ ID NO：74的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；
(s)所述第一多肽链包含SEQ ID NO：63的氨基酸序列或与SEQ ID NO：63的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：62的氨基酸序列或与SEQ ID NO：62的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：85的氨基酸序列或与SEQ ID NO：85的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：86的氨基酸序列或与SEQ ID NO：86的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；
(t)所述第一多肽链包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列或与SEQ ID NO：4的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列或与SEQID NO：3的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：114的氨基酸序列或与SEQ ID NO：114的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：115的氨基酸序列或与SEQ ID NO：115的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；或
(u)所述第一多肽链包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列或与SEQ ID NO：10的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列或与SEQID NO：9的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：114的氨基酸序列或与SEQ ID NO：114的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：115的氨基酸序列或与SEQ ID NO：115的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，本发明提供分离的核酸分子，其包含编码根据任何上述实施方案的结合蛋白或其多肽的核苷酸序列。在另一个实施方案中，本发明提供包含根据上述实施方案之一的核酸分子的表达载体。在另一个实施方案中，本发明提供分离的宿主细胞，其包含根据任何上述实施方案的核酸分子。在另一个实施方案中，本发明提供宿主细胞，其包含根据任何上述实施方案的表达载体。在一些实施方案中，所述分离的宿主细胞是哺乳动物细胞或昆虫细胞。在另一个实施方案中，本发明提供一种载体系统，其包含编码根据任何上述实施方案的结合蛋白的第一、第二、第三和第四多肽链的一个或多个载体。在一些实施方案中，载体系统包含编码所述结合蛋白的第一多肽链的第一载体、编码所述结合蛋白的第二多肽链的第二载体、编码所述结合蛋白的第三多肽链的第三载体和编码所述结合蛋白的第四多肽链的第四载体。在一些实施方案中，载体系统包含编码所述结合蛋白的第一和第二多肽链的第一载体，及编码所述结合蛋白的第三和第四多肽链的第二载体。在一些实施方案中，所述一个或多个载体是表达载体。在一个实施方案中，本发明提供分离的宿主细胞，其包含根据任何上述实施方案的载体系统。在一个实施方案中，本发明提供生产结合蛋白的方法，该方法包括：a)在使得该宿主细胞表达所述结合蛋白的条件下培养根据上述任何实施方案的宿主细胞；和b)从该宿主细胞分离所述结合蛋白。在一个实施方案中，本发明提供包含根据任何上述实施方案的结合蛋白及药学上可接受的载剂的药物组合物。
在另一个实施方案中，本发明提供在患者中预防和/或治疗癌症的方法，包括对该患者施用治疗有效量的根据任何上述实施方案的至少一种结合蛋白或药物组合物。在另一个实施方案中，本发明提供根据任何上述实施方案的结合蛋白或药物组合物，其用于在患者中预防和/或治疗癌症的用途。在另一个实施方案中，本发明提供根据任何上述实施方案的结合蛋白，其用于制造用于在患者中预防和/或治疗癌症的药物。在一些实施方案中，所述结合蛋白包含一个特异性结合T细胞表面蛋白的抗原结合位点和另一个特异性结合肿瘤靶蛋白的抗原结合位点。在一些实施方案中，所述结合蛋白包含特异性结合CD3的抗原结合位点、特异性结合CD28的抗原结合位点和特异性结合选自下组的肿瘤靶蛋白的抗原结合位点：CD19、CD20、CD38、Her2和LAMP1。在一些实施方案中，所述至少一个结合蛋白与化疗剂共同施用。在一些实施方案中，所述患者是人。在一些实施方案中，所述结合蛋白能够抑制一个或多个选自下组的靶蛋白的功能：A2AR、APRIL、ATPD酶、BAFF、BAFFR、BCMA、BlyS、BTK、BTLA、B7DC、B7H1、B7H4、B7H5、B7H6、B7H7、B7RP1、B7-4、C3、C5、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL15、CCL17、CCL19、CCL20、CCL21、CCL24、CCL25、CCL26、CCR3、CCR4、CD3、CD19、CD20、CD23、CD24、CD27、CD28、CD38、CD39、CD40、CD70、CD80、CD86、CD122、CD137、CD137L、CD152、CD154、CD160、CD272、CD273、CD274、CD275、CD276、CD278、CD279、CDH1、壳多糖酶、CLEC9、CLEC91、CRTH2、CSF-1、CSF-2、CSF-3、CX3CL1、CXCL12、CXCL13、CXCR3、DNGR-1、外核苷三磷酸盐二磷酸水解酶1、EGFR、ENTPD 1、FCER1A、FCER1、FLAP、FOLH1、Gi24、GITR、GITRL、GM-CSF、Her2、HHLA2、HMGB1、HVEM、ICOSLG、IDO、IFNα、IgE、IGF1R、IL2Rβ、IL1、IL1A、IL1B、IL1F10、IL2、IL4、IL4Ra、IL5、IL5R、IL6、IL7、IL7Ra、IL8、IL9、IL9R、IL10、rhIL10、IL12、IL13、IL13Ra1、IL13Ra2、IL15、IL17、IL17Rb、IL18、IL22、IL23、IL25、IL27、IL33、IL35、ITGB4、ITK、KIR、LAG3、LAMP1、瘦素、LPFS2、II类MHC、NCR3LG1、NKG2D、NTPD酶-1、OX40、OX40L、PD-1H、血小板受体、PROM1、S152、SISP1、SLC、SPG64、ST2、STEAP2、Syk激酶、TACI、TDO、T14、TIGIT、TIM3、TLR、TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、TMEF1、TNFa、TNFRSF7、Tp55、TREM1、TSLP、TSLPR、TWEAK、VEGF、VISTA、Vstm3、WUCAM和XCR1。
在另一个实施方案中，本发明提供在患者中预防和/或治疗炎性疾病或病症的方法，包括对该患者施用治疗有效量的根据任何上述实施方案的至少一种结合蛋白或药物组合物。在另一个实施方案中，本发明提供根据任何上述实施方案的结合蛋白或药物组合物，其用于在患者中预防和/或治疗炎性疾病或病症的方法的用途。在另一个实施方案中，本发明提供根据任何上述实施方案的结合蛋白，其用于制造在患者中预防和/或治疗炎性疾病或病症的药物。在一些实施方案中，所述结合蛋白包含3个抗原结合位点，其各自特异性结合选自下组的细胞因子靶蛋白：IL-4、IL-13和TNFa。在一些实施方案中，所述3个结合位点中的2个特异性结合细胞因子靶蛋白选自下组的细胞因子靶蛋白：IL-4、IL-13和TNFa。在一些实施方案中，所述至少一种结合蛋白与抗炎剂共同施用。在一些实施方案中，所述患者是人。在一些实施方案中，所述结合蛋白能够抑制一个或多个选自下组的靶蛋白的功能：A2AR、APRIL、ATPD酶、BAFF、BAFFR、BCMA、BlyS、BTK、BTLA、B7DC、B7H1、B7H4、B7H5、B7H6、B7H7、B7RP1、B7-4、C3、C5、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL15、CCL17、CCL19、CCL20、CCL21、CCL24、CCL25、CCL26、CCR3、CCR4、CD3、CD19、CD20、CD23、CD24、CD27、CD28、CD38、CD39、CD40、CD70、CD80、CD86、CD122、CD137、CD137L、CD152、CD154、CD160、CD272、CD273、CD274、CD275、CD276、CD278、CD279、CDH1、壳多糖酶、CLEC9、CLEC91、CRTH2、CSF-1、CSF-2、CSF-3、CX3CL1、CXCL12、CXCL13、CXCR3、DNGR-1、外核苷三磷酸盐二磷酸水解酶1、EGFR、ENTPD1、FCER1A、FCER1、FLAP、FOLH1、Gi24、GITR、GITRL、GM-CSF、Her2、HHLA2、HMGB1、HVEM、ICOSLG、IDO、IFNα、IgE、IGF1R、IL2Rβ、IL1、IL1A、IL1B、IL1F10、IL2、IL4、IL4Ra、IL5、IL5R、IL6、IL7、IL7Ra、IL8、IL9、IL9R、IL10、rhIL10、IL12、IL13、IL13Ra1、IL13Ra2、IL15、IL17、IL17Rb、IL18、IL22、IL23、IL25、IL27、IL33、IL35、ITGB4、ITK、KIR、LAG3、LAMP1、瘦素、LPFS2、II类MHC、NCR3LG1、NKG2D、NTPD酶-1、OX40、OX40L、PD-1H、血小板受体、PROM1、S152、SISP1、SLC、SPG64、ST2、STEAP2、Syk激酶、TACI、TDO、T14、TIGIT、TIM3、TLR、TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、TMEF1、TNFa、TNFRSF7、Tp55、TREM1、TSLP、TSLPR、TWEAK、VEGF、ⅥSTA、Vstm3、WUCAM和XCR1。
在另一个实施方案中，本发明提供纯化通过宿主细胞产生的结合蛋白的方法，包括：
(a)在宿主细胞中产生包含4条多肽链的结合蛋白，所述4条多肽链形成特异性结合一个或多个抗原靶或靶蛋白的3个抗原结合位点，其中第一多肽链包含如下式表示的结构：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽链包含如下式表示的结构：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-铰链-CH2-CH3 [II]
且第三多肽链包含如下式表示的结构：
VH3-CH1 [III]
且第四多肽链包含如下式表示的结构：
VL3-CL [IV]
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变域；
VL3是第三免疫球蛋白轻链可变域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变域；
VH3是第三免疫球蛋白重链可变域；
CL，是免疫球蛋白轻链恒定域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定域；
CH2是免疫球蛋白CH2重链恒定域；
CH3是免疫球蛋白CH3重链恒定域；
铰链是连接CH1和CH2域的免疫球蛋白铰链；且
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对；其中所述第二多肽链的CH3域和第三多肽链的CH3域包含与人IgG1或IgG4的位置435和436对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代是H435R和Y436F：
(b)使(a)中产生的结合蛋白与蛋白A接触；和
(c)在适于从包含0或2个CH3域的结合蛋白分离出结合蛋白的条件下从蛋白A洗脱所述结合蛋白，所述CH3域包含为H435R和Y436F的氨基酸取代。
在一些实施方案中，所述第一多肽链的CL域是人κCL域，且所述第四多肽链的CL域是人λCL域；或所述第一多肽链的CL域是人λCL域，且所述第四多肽链的CL域是人κCL域，且该方法还包括：(d)使(c)中洗脱的结合蛋白与κ轻链亲和介质接触；和(e)在适于从仅包含λCL域的结合蛋白分离出结合蛋白的条件下从所述κ轻链亲和介质洗脱结合蛋白。在一些实施方案中，所述方法在(e)之后还包括：(f)使(e)中洗脱的结合蛋白与λ轻链亲和介质接触；和(g)在适于从仅包含κCL域的结合蛋白分离出结合蛋白的条件下从所述λ轻链亲和介质洗脱洗脱结合蛋白。在一些实施方案中，所述第一多肽链的CL域是人κCL域，且所述第四多肽链的CL域是人λCL域；或所述第一多肽链的CL域是人λCL域，且所述第四多肽链的CL域是人κCL域，且所述方法进一步包括：(d)使(c)中洗脱的结合蛋白与λ轻链亲和介质接触；和(e)在适于从仅包含κCL域的结合蛋白分离出所述结合蛋白的条件下从所述λ轻链亲和介质洗脱结合蛋白。在一些实施方案中，所述方法在(e)之后进一步包括：(f)使(e)中洗脱的结合蛋白与κ轻链亲和介质接触；和(g)在适于从仅包含λCL域的结合蛋白分离出所述结合蛋白的条件下从所述κ轻链亲和介质洗脱结合蛋白。在一些实施方案中，第一多肽链包含λCL域；其中第二多肽链的CH3域包含与人IgG1的位置354和366对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为S354C和T366W；其中所述第三多肽链的CH3域包含与人IgG1的位置349、366、368、407、435和436对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为Y349C、T366S、L368A、Y407V、H435R和Y436F；且其中第四多肽链包含κCL域。在一些实施方案中，在(c)和(e)的一项或多项中使用疏水作用色谱(HIC)来检测所述结合蛋白。在一些实施方案中，所述第二和第三多肽链的CH3域和/或Fc区是人IgG1或IgG4 CH3域和/或Fc区。
应当理解的是，本文描述的各种实施方案的一个、一部分、或全部特征可以进行组合以形成本发明的其他实施方案。本发明的这些及其他态样对于本领域技术人员而言是明显的。本发明的这些和其他实施方案在下文进一步详述。
附图简述
图1A-C显示了三特异性结合蛋白的示意图，所述结合蛋白包含形成3个抗原结合位点的4条多肽链，所述3个抗原结合位点特异性结合3个靶蛋白，其中第一对多肽具有双重可变域(其具有交叉取向(VH1-VH2和VL2-VL1))，形成2个抗原结合位点，且其中第二对多肽具有形成单一抗原结合位点的单一可变域(VH3和VL3)。图1A显示了包含“杵臼(knobs-into-holes)”突变的三特异性结合蛋白，其中所述杵在具有单一可变域的第二对多肽上。图1B显示了包含“杵臼”突变的三特异性结合蛋白，其中所述杵在具有交叉取向的第一对多肽上。图1C显示了表1-3中所示结合蛋白的多肽链上可变域的取向，以及杵/臼取向。“重链A”(例如本发明的第三多肽链)指重链A的可变域。“轻链A”(例如本发明的第四多肽链)指轻链A的可变域。“重链B”(例如本发明的第二多肽链)指重链B的可变域1和可变域2。“轻链B”(例如本发明的第一多肽链)指轻链B的可变域1和可变域2。
图2显示了用于确定抗Her2 x CD28 x CD3 IgG4三特异性抗体(结合蛋白1)或同种型对照抗体与人CD3、CD28和Her2的结合的ELISA测定的结果。使用缀合有辣根过氧化物酶(HRP)的抗Fab二抗来检测结合的抗体。
图3A-3C显示了Her2+乳腺癌细胞的抗体介导的特异性杀伤的结果，其使用抗Her2x CD28 x CD3 IgG4三特异性抗体(本文称为“结合蛋白1”)、抗CD28 x CD3 IgG4双特异性抗体(huCD28 x CD3)、抗Her2 IgG1抗体、或对照抗体(人-IgG1)来进行，其使用E：T＝10处的人PBMC。图3A显示了ZR-75-1细胞的三特异性抗体介导的特异性杀伤的结果。图3B显示了AU565细胞的三特异性抗体介导的特异性杀伤的结果。图3C显示了用于确定ZR-75-1和AU565细胞上的指定标志物的细胞表面表达的FACS分析的结果。
图4和5显示了Her2+乳腺癌细胞的抗体介导的特异性杀伤的结果，其使用抗Her2x CD28 x CD3 IgG4三特异性抗体(结合蛋白1)、抗CD28 x CD3 IgG4双特异性抗体(huCD28x CD3)、抗Her2 IgG1抗体、或对照抗体(人-IgG1)来进行。图4显示了ZR-75-1细胞的抗体介导的特异性杀伤的结果，其使用来自供体KP45926的人外周血单核细胞(PBMC)以E：T＝10进行。图5显示了AU565细胞的抗体介导的特异性杀伤的结果，其使用来自供体KP45944的人PBMC以E：T＝10进行。图4和图5证实了与图3A-3C(其使用来自不同供体的PBMC)相似的细胞杀伤结果。
图6A和6B显示了用抗Her2 x CD28 x CD3 IgG4三特异性结合蛋白(HER2/CD28supxCD3mid；本文称为“结合蛋白1”)、缺乏抗CD28结合域的抗Her2 x CD28 x CD3 IgG4三特异性结合蛋白(HER2/ΔCD28supxCD3mid)、缺乏抗CD3结合域的抗Her2 x CD28 x CD3IgG4三特异性结合蛋白(HER2/CD28supxΔCD3mid)、缺乏抗CD28结合域和抗CD3结合域二者的抗Her2 x CD28 x CD3 IgG4三特异性结合蛋白(HER2/Δ(CD28supxΔCD3mid)、对照抗CD3单克隆抗体、或对照IgG4抗体处理的人T细胞的活化(CD69+)和增殖。图6A显示了来自三种供体的人CD4+T细胞的活化(CD69+)。图6B显示了来自三种供体的人CD8+T细胞的活化(CD69+)。CD28sup：抗CD28超激动剂抗体。CD3mid：抗CD3抗体。
图7A-C显示了经由抗CD3和抗CD28信号传导的IL-2、NFκB和活化T细胞的核因子(NFAT)通路激活，如通过荧光素酶测定法使用带有IL-2启动子-荧光素酶构建体(图7A)，NFκB启动子-荧光素酶构建体(图7B)、或NFAT启动子-荧光素酶构建体(图7C)的人Jurkat T细胞所测量的。测试的抗体是上文关于图6A-6D所述的那些。
图8显示了ELISA测定的结果，所述测定用于确定抗CD19 x CD28 x CD3 IgG4三特异性抗体(本文称为“结合蛋白3”)，或同种型对照抗体，与CD3、CD28和CD19的结合。用缀合有辣根过氧化物酶(HRP)的抗Fab二抗来检测结合的抗体。
图9A-9N显示了CD19+人GCB淋巴瘤细胞的抗体介导的特异性杀伤的结果，其使用抗CD19 x CD28 x CD3 IgG4三特异性抗体(本文称为“结合蛋白3”)，或指定的对照，用人PBMC作为效应细胞以E：T＝10来进行。图9A显示了OCI-LY19细胞的抗体介导的特异性杀伤的结果。图9B显示了FACS分析的结果，所述FACS分析用于确定指定标志物在OCI-LY1细胞上的细胞表面表达。图9C显示了OCI-LY19细胞的抗体介导的特异性杀伤的结果，其使用来自供体KP48572的PBMC以E：T＝10来进行。图9D显示了OCI-LY19细胞的抗体介导的特异性杀伤的结果，其使用来自供体KP48573的PBMC以E：T＝10来进行。图9E显示了人淋巴瘤KARPASS-42细胞的抗体介导的特异性杀伤的结果，其使用来自供体KP48572的PBMC以E：T＝10来进行。图9F显示了KARPASS-422细胞的抗体介导的特异性杀伤的结果，其使用来自供体KP48573的PBMC以E：T＝10来进行。图9G显示了人慢性B细胞白血病MeC1细胞的抗体介导的特异性杀伤的结果，其使用来自供体KP48572的PBMC以E：T＝10来进行。图9H显示了人多发性骨髓瘤RPMI8226细胞的抗体介导的特异性杀伤的结果，其使用来自供体KP48775的PBMC以E：T＝10来进行。图9I显示了人伯基特氏淋巴瘤(Burkitt′s 1ymphoma)Raji细胞的抗体介导的特异性杀伤的结果，其使用来自供体KP48572的PBMC以E：T＝10来进行。图9J显示了弥散性大B细胞淋巴瘤HBL1细胞的抗体介导的特异性杀伤的结果，其使用来自供体KP48775的PBMC以E：T＝10来进行。图9K显示了大细胞淋巴瘤SUDHL8细胞的抗体介导的特异性杀伤的结果，其使用来自供体KP48572的PBMC以E：T＝10来进行。图9L显示了SUDHL8细胞的抗体介导的特异性杀伤的结果，其使用来自供体KP48573的PBMC以E：T＝10来进行。图9M显示了人B细胞淋巴瘤ARH77细胞的抗体介导的特异性杀伤的结果，其使用来自供体KP48775的PBMC以E：T＝10来进行。图9N显示了OCI-Ly3细胞的抗体介导的特异性杀伤的结果，其使用来自供体KP48775的PBMC以E：T＝10来进行。
图10显示了ELISA测定的结果，所述ELISA测定用于确定抗CD38 x CD28x CD3IgG4三特异性抗体(结合蛋白5)，或同种型对照抗体，对CD3、CD28和CD38的结合。用缀合有辣根过氧化物酶(HRP)的抗Fab二抗来检测结合的抗体。
图11A-11D显示了CD38+人多发性骨髓瘤癌细胞的抗体介导的特异性杀伤的结果，其使用抗CD38 x CD28 x CD3 IgG4三特异性抗体(结合蛋白5)、抗CD28 x CD3 IgG4双特异性抗体(huCD28 x CD3)、抗CD38 IgG1抗体、或对照抗体(人IgG1)来进行。图11A显示了MOLP-8细胞的抗体介导的特异性杀伤的结果，其使用人PBMC作为效应细胞以E：T＝10进行。图11B显示了RPMI-8226细胞的抗体介导的特异性杀伤的结果，其使用人PBMC作为效应细胞以E：T＝10进行。图11C显示了KMS-12-BM细胞的抗体介导的特异性杀伤的结果，其使用人PBMC作为效应细胞以E：T＝10进行。图11D显示了FACS分析的结果，所述FACS分析用于确定指定标志物在MOLP-8、RPMI-8226和KMS-12-BM细胞上的细胞表面表达。
图12A-12D显示了CD38+人多发性骨髓瘤癌细胞的抗体介导的特异性杀伤的结果，其使用抗CD38 x CD28 x CD3 IgG4三特异性抗体(结合蛋白5)、抗CD28 x CD3 IgG4双特异性抗体(huCD28 x CD3)、抗CD38 IgG1抗体、或对照抗体(人IgG1)，用PBMC作为效应细胞以E：T＝10来进行。图12A显示了NCI-H929细胞的抗体介导的特异性杀伤的结果。图12B显示了MM.1S细胞的抗体介导的特异性杀伤的结果。图12C显示了MM.1R细胞的抗体介导的特异性杀伤的结果。图12D显示了FACS分析的结果，所述FACS分析用于确定指定标志物在NCI-H929、MM.1S和MM.1R细胞上的细胞表面表达。
图13A-13D显示了CD38+人多发性骨髓瘤癌细胞的抗体介导的特异性杀伤的结果，其使用抗CD38 x CD28 x CD3 IgG4三特异性抗体(结合蛋白5)、抗CD28 x CD3 IgG4双特异性抗体(huCD28 x CD3)、抗CD38 IgG1抗体、或对照抗体(人IgG1)，用PBMC作为效应细胞以E：T＝10来进行。图13A显示了OPM-2细胞的抗体介导的特异性杀伤的结果。图13B显示了KMS-26细胞的抗体介导的特异性杀伤的结果。图13C显示了U266细胞的抗体介导的特异性杀伤的结果。图13D显示了FACS分析的结果，所述FACS分析用于确定指定标志物在OPM-2、KMS-26和U226细胞上的细胞表面表达。
图14A-14C显示了CD38+人多发性骨髓瘤癌细胞的抗体介导的特异性杀伤的结果，其使用抗CD38 x CD28 x CD3 IgG4三特异性抗体(结合蛋白5)、抗CD28 x CD3 IgG4双特异性抗体(huCD28 x CD3)、抗CD38 IgG1抗体、或对照抗体(人IgG1)，用PBMC作为效应细胞以E：T＝10来进行。图14A显示了SUDHL-8细胞的抗体介导的特异性杀伤的结果。图14B显示了OCI-LY19细胞的抗体介导的特异性杀伤的结果。图14C显示了FCS分析的结果，所述FACS分析用于确定指定标志物在SUDHL-8和OCI-LY19细胞上的细胞表面表达。
图15A-15D显示了CD38+ALL癌细胞的抗体介导的特异性杀伤的结果，其使用抗CD38 x CD28 x CD3 IgG4三特异性抗体(结合蛋白5)、抗CD28 x CD3 IgG4双特异性抗体(huCD28 x CD3)、抗CD38 IgG1抗体、或对照抗体(人IgG1)，用PBMC作为效应细胞以E：T＝10来进行。图15A显示了KOPN-8细胞的特异性杀伤的结果。图15B显示了HAL-1细胞的特异性杀伤的结果。图15C显示了CCRF-SB细胞的特异性杀伤的结果。图15D显示了FACS分析的结果，所述FACS分析用于确定指定标志物在KOPN-8、HAL-1和CCRF-SB细胞上的细胞表面表达。
图16显示了CD38+骨髓瘤癌细胞的抗体介导的特异性杀伤的结果，其使用抗CD38x CD28 x CD3 IgG4三特异性抗体(称为“结合蛋白5”和“结合蛋白6”，取决于所用的具体抗CD28结合域)、抗CD28 x CD3 IgG4双特异性抗体(huCD28 x CD3)、抗CD38 IgG1抗体、对照抗CD38 IgG1抗体、或对照抗体(人IgG1)，用来自供体PK45926的PBMC以E：T＝10来进行。
图17A和17B显示了经由抗CD3和抗CD28信号传导的IL-2、NFκB和活化T细胞的核因子(NFAT)通路激活，如通过荧光素酶测定法使用带有IL-2启动子-荧光素酶构建体(图17A)或NFAT启动子-荧光素酶构建体(图17B)的人Jurkat T细胞所测量的。测试的抗体是抗CD38x CD28 x CD3 IgG4三特异性IgG4抗体(结合蛋白5，标记为“Tri-Ab”)、缺乏CD28结合域的抗CD38 x CD28 x CD3 IgG4三特异性IgG4抗体(标记为“Tri-Ab(ΔCD28)”)、缺乏CD3结合域的抗CD38 x CD28 x CD3 IgG4三特异性IgG4抗体(标记为“Tri-Ab(ΔCD3)”)和缺乏CD3和CD28结合域的抗CD38 x CD28 x CD3 IgG4三特异性IgG4抗体(标记为“Tri-Ab(ΔCD28xΔCD3)”)。对每个指定的Tri-Ab一式两份进行荧光素酶测定。
图18A-18E显示了在非人灵长类中使用抗Her2 x CD28 x CD3 IgG4三特异性抗体(本文称为“结合蛋白1”)的剂量递增毒性研究(剂量从0.1、0.5、2.5、5、10、递增至100μg/kg；动物标记为“409”和“410”)。图18A显示了施用抗Her2 x CD28 x CD3三特异性抗体之后6小时，各动物中的循环CD4+T细胞百分比的结果。图18B显示了施用抗Her2 x CD28 x CD3三特异性抗体之后6小时，各动物中的循环CD8+T细胞百分比的结果。图18C显示了施用后6小时循环CD4+T细胞的(CD69+)的结果。图18D显示了施用后6小时循环CD8+T细胞的(CD69+)的结果。图18E显示了以各个剂量施用抗Her2 x CD28 x CD3三特异性抗体之后6小时观察到的炎性细胞因子释放。
图19A-B显示了移植了BT474细胞的CD34+脐带血细胞人源化NSG小鼠模型中，抗Her2 x CD28 x CD3 IgG4三特异性抗体(本文称为“结合蛋白1”)的体内抗肿瘤活性。图19A显示了用指定浓度的抗Her2 x CD28 x CD3三特异性结合蛋白或PBS对照处理的小鼠的体重的变化。图19B显示了用指定浓度的抗Her2 x CD28 x CD3三特异性结合蛋白或PBS对照处理的小鼠中肿瘤体积变化。
图20A-20H显示了移植了BT474细胞的人PMBC人源化的NSG小鼠模型中抗Her2 xCD28 x CD3 IgG4三特异性抗体(本文称为“结合蛋白1”)的体内抗肿瘤活性。图20A显示了施用指定浓度的抗Her2 x CD28 x CD3三特异性结合蛋白、指定浓度的赫赛汀(Herceptin)、或介质对照对小鼠体重的效果。图20B显示了抗Her2 x CD28 x CD3三特异性结合蛋白、赫赛汀或指定对照的剂量依赖性抗肿瘤活性，如个体小鼠中的。图20C显示了施用指定浓度的抗Her2 x CD28 x CD3三特异性结合蛋白或PBS之后小鼠中的平均肿瘤体积。图20D显示了施用指定浓度的赫赛汀或PBS对照后小鼠中的平均肿瘤体积。图20E显示了施用指定浓度的抗Her2 x CD28 x CD3三特异性结合蛋白、指定浓度的赫赛汀或PBS对照后第34天小鼠中的平均肿瘤体积。图20F显示了施用指定浓度的抗Her2 x CD28 x CD3三特异性结合蛋白、指定浓度的赫赛汀或PBS对照后第34天小鼠中的平均肿瘤重量。图20G显示了研究结束时小鼠血液中的人CD45+、CD3+、CD4+、CD8+细胞。图20H显示了研究结束时小鼠脾脏中的人CD45+、CD3+、CD4+、CD8+细胞。
图21A-F显示了非人灵长类中使用抗CD38 x CD28 x CD3 IgG4三特异性抗体(结合蛋白5)的剂量递增毒性研究的结果(剂量从0.1、0.5、2.5、5、10、递增至100μg/kg)。图21A显示了施用抗CD38 x CD28 x CD3三特异性抗体后的T细胞活化(CD69+)(线状图)和循环CD4+T细胞的增殖(柱状图)。图21B显示了施用抗CD38 x CD28 x CD3三特异性抗体后的T细胞活化(CD69+)(线状图)和循环CD8+T细胞的增殖(柱状图)。图21C显示了接受抗CD38 xCD28 x CD3三特异性抗体的动物在通过个体动物每次施用后6小时的IL6释放。图21D显示了接受抗CD38 x CD28 x CD3三特异性抗体的动物在通过个体动物每次施用后6小时的IL10释放。图21E显示了接受抗CD38 x CD28 x CD3三特异性抗体的动物中的TNFα释放。图21F显示了接受抗CD38 x CD28 x CD3三特异性抗体的动物在通过个体动物每次施用后6小时的IFNγ释放。
图22A-22C显示了CD34+脐带血细胞人源化的NSG小鼠模型中抗CD38 x CD28 xCD3 IgG4三特异性抗体(结合蛋白5)的体内抗肿瘤活性，所述模型移植了用CD38和PD-L1转导的RPMI-8226多发性骨髓瘤细胞。作为先导性研究，该实验确定了结合蛋白5的工作剂量范围。图22A显示了指定浓度的抗CD38 x CD28 x CD3三特异性结合蛋白或对照的组中的体内肿瘤生长曲线。图22B显示施用了抗CD38 x CD28 x CD3三特异性结合蛋白或指定对照的小鼠中的肿瘤浸润性人CD8+T细胞。图22C显示施用了抗CD38 x CD28 x CD3三特异性结合蛋白或指定对照的小鼠中的肿瘤浸润性人CD4+T细胞。
图23A-23D显示了CD34+脐带血细胞人源化NSG小、鼠模型中的抗CD38 x CD28 xCD3 IgG4三特异性抗体(结合蛋白5)的体内活性，所述模型移植了用CD38和PD-L1转导的RPMI-8226细胞。图23A显示了用指定浓度的抗CD38 x CD28 x CD3三特异性结合蛋白或PBS对照处理的小鼠的体重变化。图23B显示了用指定浓度的抗CD38 x CD28 x CD3三特异性结合蛋白或PBS对照处理的小鼠中的肿瘤体积变化。图23C显示了在第19天各组中的肿瘤体积。所有处理组中的肿瘤体积都显示出显著降低，这与PBS对照组在统计学上是不同的。图23D显示了在第一次施用指定浓度的抗CD38 x CD28 x CD3三特异性结合蛋白或PBS对照后4小时小鼠中炎性细胞因子IFN-g、TNF和IL-2的浓度。
图24和25显示了CD34+脐带血细胞人源化的NSG小鼠模型中的T细胞体内活化，其通过确定CD69+T细胞的百分比增加来进行，所述活化是通过施用抗CD38 x CD28 x CD3IgG4三特异性抗体(结合蛋白5；三角形)、抗CD28 x CD3 IgG4双特异性抗体(正方形)、或抗CD28 IgG4抗体(圆形)来进行的。图24显示了CD4+T细胞的体内活化。图25显示了CD8+T细胞的体内活化。
图26A-26C显示了CD34+脐带血细胞人源化的NSG小鼠模型中的T细胞体内活化，其通过确定炎性细胞因子的血清水平来进行，所述活化是通过施用抗CD38 x CD28 x CD3IgG4三特异性抗体(结合蛋白5；三角形)、抗CD28 x CD3 IgG4双特异性抗体(正方形)、或抗CD28 IgG4抗体(圆形)来进行的。图26A显示了IL-2的血清水平。图26B显示了TNF的血清水平。图26C显示了IFN-γ的血清水平。
图27A和27B显示了通过大小排阻色谱对指定蛋白的纯化。图27A显示了通过大小排阻色谱对结合蛋白9-15的纯化。图27B显示了通过大小排阻色谱对结合蛋白16-19的纯化。
图28A描绘了用于优化纯化策略的实验中使用的三特异性结合蛋白和可选的结合蛋白特征的构型(例如κ/λ轻链、杵/臼突变和H435R/Y436F突变)。图28B显示了测试的构型。
图29显示了来自分析型疏水相互作用色谱(HIC)的代表性的色谱图，证明了三特异性结合蛋白与错配的种类是可区分的。
图30A和30B显示了结合蛋白的成功纯化，其针对CODV组采用λ轻链、针对Fab组采用κ轻链、在CODV组有杵突变，在Fab组有臼突变、及在Fab组有RF突变，其通过蛋白A纯化，然后是KappaSelect(GE Healthcare)纯化步骤。通过疏水作用色谱(HIC；图30A)和SDS-PAGE(图30B)，证明了从错配的种类成功纯化结合蛋白。
【实施方式】
本发明提供三特异性和/或三价结合蛋白，其包含形成3个抗原结合位点的4条多肽链，所述3个抗原结合位点特异性结合至一个或多个靶蛋白，其中形成所述结合蛋白的第一对多肽具有双重可变域，其具有交叉取向，且其中形成所述结合蛋白的第二对多肽具有单一可变域。
一般定义
如本发明所使用的，下列术语除非另有说明，否则应理解为具有下列含义。除非文中另有要求，否则单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。
本文所用术语“多核苷酸”是指长度为至少10个核苷酸的单链或双链核酸聚合物。在一些实施方案中，包含多核苷酸的核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任一核苷酸类型的修饰形式。所述修饰包括碱基修饰例如溴尿苷、核糖修饰例如阿拉伯糖苷和2′，3′-双脱氧核糖及核苷酸间键修饰例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯、苯胺基硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯胺基磷酸酯(phoshoraniladate)和氨基磷酸酯(phosphoroamidate)。术语“多核苷酸”明确包括DNA的单链和双链形式。
“分离的多核苷酸”是基因组、cDNA或合成来源的或其一些组合的多核苷酸，其：(1)不与分离的多核苷酸天然存在于其中的多核苷酸的全部或部分缔合，(2)与其天然不与其连接的多核苷酸连接，或(3)不作为较大序列的部分天然存在。
“分离的多肽”是这样的多肽：(1)不含正常与其一起存在的至少一些其它多肽，(2)基本不含来自相同来源(例如来自相同物种)的其它多肽，(3)由来自不同物种的细胞表达，(4)已从其与之天然缔合的多核苷酸、脂质、碳水化合物或其它物质的至少约50％分离，(5)不与“分离的多肽”天然与之缔合的多肽的部分缔合(通过共价或非共价相互作用)，(6)与其与之天然不缔合的多肽可操作地缔合(通过共价或非共价相互作用)，或(7)天然不存在。所述分离的多肽可由合成来源的基因组DNA、cDNA、mRNA或其它RNA或其任何组合编码。优选地，分离的多肽基本不含在其自然环境中存在的可能干扰其用途(治疗、诊断、预防、研究或其它)的多肽或其它污染物。
天然存在的抗体通常包含四聚体。每个此种四聚体通常由两个相同的多肽链对组成，每对具有一条全长“轻”链(通常分子量为约25kDa)和一条全长“重”链(通常分子量为约50-70kDa)。本文所用术语“重链”和“轻链”是指任何具有足以赋予针对靶抗原的特异性的可变域序列的免疫球蛋白多肽。各轻链和重链的氨基端部分通常包括约100-110个或更多个氨基酸的可变结构域，其通常负责抗原识别。各链的羧基端部分通常限定负责效应子功能的恒定域。因此，在天然存在的抗体中，全长重链免疫球蛋白多肽包含可变域(VH)和3个恒定域(CH1、CH2和CH3)，其中VH域位于多肽的氨基端，CH3域位于羧基端，而全长轻链免疫球蛋白多肽包含可变域(VL)和恒定域(CL)，其中VL域位于多肽的氨基端，CL域位于羧基端。
人轻链通常分类为κ和λ轻链，人重链通常分类为μ、δ、γ、α或ε，分别限定抗体的同种型为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有若干亚类，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM具有亚类，包括但不限于IgM1和IgM2。IgA同样被细分为亚类，包括但不限于IgA1和IgA2。在全长轻链和重链内，可变域和恒定域通常通过约12个或更多个氨基酸的“J”区连接，其中重链还包含多出约10个氨基酸的“D”区。参见例如FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY(Paul，W编，Raven Press，第二版，1989)，其通过提述以其整体并入用于所有目的。各轻链/重链对的可变区通常形成抗原结合位点。天然存在的抗体的可变域通常显示出由3个高变区(亦称互补决定区或CDR)连接的相对保守的框架区(FR)的同样的通用结构。来自每对的两条链的CDR通常通过框架区对齐，这可以使得能够结合特定的表位。从氨基端到羧基端，轻链和重链可变域二者通常包含域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。
术语“CDR组”意指在能够结合抗原的单个可变区中存在的一组3个CDR。这些CDR的确切边界已根据不同系统进行了不同定义。由Kabat描述的系统(Kabat等，SEQUENCES OFPROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST(National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1987)和(1991))不仅提供了可应用于抗体的任何可变区的明确残基编号系统，而且还提供了限定3个CDR的精确残基边界。这些CDR可以被称为Kabat CDR。Chothia和同事(Chothia和Lesk，1987，J.Mol.Biol.196：901-17；Chothia等，1989，Nature 342：877-83)发现在Kabat CDR内的某些亚部分采用几乎相同的肽主链构象，尽管在氨基酸序列水平上具有很大的多样性。这些亚部分指定为L1、L2和L3或H1、H2和H3，其中“L”和“H”分别指定轻链和重链区。这些区域可以称为Chothia CDR，其具有与Kabat CDR重叠的边界。限定与Kabat CDR重叠的CDR的其他边界已由Padlan，1995，FASEBJ.9：133-39；MacCallum，1996，J.Mol.Biol.262(5)：732-45；和Lefranc，2003，Dev.Comp.Immunol.27：55-77描述。另外其他的CDR边界定义可能不严格遵循上述系统之一，但仍会与Kabat CDR重叠，尽管它们可以按照下述预测或实验发现来加以缩短或延长：特定残基或残基组或甚至整个CDR不显著影响抗原结合。本文使用的方法可以利用根据这些系统中任一种定义的CDRs，尽管具体实施方案使用Kabat或Chothia定义的CDR。使用所述氨基酸序列鉴定预测的CDR是本领域所熟知的，如Martin，A.C.″Protein sequence and structure analysis of antibody variabledomains，″In Antibody Engineering，Vol.2.Kontermann R.，Dübel S编.Springer-Verlag，Berlin，p.33-51(2010)中所述。还可以通过其他常规方法来检查重链和/或轻链可变域的氨基酸序列以鉴定CDR的序列，所述其他常规方法例如通过与已知的其他重链和轻链可变区的氨基酸序列进行比较以确定序列高变性的区域。编号的序列可以通过肉眼进行比对，或者通过采用比对程序如CLUSTAL程序套件中之一来比对，如Thompson，1994，Nucleic Acids Res.22：4673-80中所述。惯常使用分子模型来正确地描绘框架区和CDR区，并因而对基于序列的指定加以校正。
本文所用术语“Fc”是指这样的分子，其包含因抗体消化得到的或通过其它方法产生的非抗原结合片段的序列，不论呈单体还是多聚体形式，并可含有铰链区。天然Fc的原始免疫球蛋白来源优选为人源的，并可以是任何的免疫球蛋白，尽管优选的是IgG1和IgG2。Fc分子由单体多肽组成，所述单体多肽可通过共价(即二硫键)和非共价缔合连接成为二聚或多聚体形式。天然Fc分子单体亚单元之间的分子间二硫键的数量范围为1-4，这取决于类别(例如IgG、IgA和IgE)或亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgA1和IgGA2)。Fc的一个实例是自木瓜蛋白酶消化IgG所得的二硫键键合的二聚体。本文所用术语“天然Fc”是单体、二聚和多聚体形式的通称。
F(ab)片段通常包含一条轻链及一条重链的VH和CH1域，其中F(ab)片段的VH-CH1重链部分无法与另一重链多肽形成二硫键。本文所用的F(ab)片段还可包含一条轻链(其含有被氨基酸接头分隔开的2个可变域)和一条重链(其含有被氨基酸接头分隔开的2个可变域和CH1域)。
F(ab′)片段通常包含一条轻链和含有多个恒定区(在CH1与CH2域之间)的一条重链的一部分，从而可在两条重链间形成链间二硫键以形成F(ab′)2分子。
本文使用的术语“结合蛋白”意指这样的非天然存在的(或是重组的或工程化的)分子，其特异性结合至少一个靶抗原，并且其包含形成3个抗原结合位点的4条多肽链，其中第一多肽链具有下式表示的结构：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽链具有下式表示的结构：
VH1-L3-VH2-L4-CH1 [II]
且第三多肽链具有下式表示的结构：
VH3-CH1 [III]
且第四多肽链具有下式表示的结构：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变域；
VL3是第三免疫球蛋白轻链可变域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变域；
VH3是第三免疫球蛋白重链可变域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定域；且
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
且其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对。
“重组的”分子是通过重组方法制备、表达、产生或分离的分子。
本发明的一个实施方案提供了具有生物学和免疫学特异性的结合蛋白，所述特异性是针对1至3个靶抗原。本发明的另一个实施方案提供了包含核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列编码形成此类结合蛋白的多肽链。本发明的另一个实施方案提供了包含核酸分子的表达载体，所述核酸分子包含编码形成此类结合蛋白的多肽链的核苷酸序列。本发明的又一个实施方案提供了表达此类结合蛋白(即包含编码形成此类结合蛋白的多肽链的核酸分子或载体)的宿主细胞。
本文所用术语“可交换性”是指结合蛋白形式内的且保持折叠和最终结合亲和力的可变域的可互换性。“完全可交换性”是指在式I的多肽链或式II的多肽链中交换VH1和VH2域两者的顺序并因此交换VL1和VL2域的顺序(即将顺序颠倒)，同时保持所述结合蛋白的完整功能性的能力，这通过结合亲和力的保留来证实。而且，应注意的是，标识VH和VL仅是指最终形式中特定蛋白质链上的域位置。例如，VH1和VH2可来源于亲本抗体中的VL1和VL2域，并被置于结合蛋白中的VH1和VH2位置中。同样地，VL1和VL2可来源于亲本抗体中的VH1和VH2域，并被置于结合蛋白中的VH1和VH2位置中。因此，VH和VL标识是指现在的位置，而非亲本抗体中的原始位置。VH和VL域因而是“可交换的”。
本文所用的术语“抗原”或“靶抗原”或“抗原靶标”是指这样的分子或分子的部分，其能够被结合蛋白结合，且额外能够用于动物以产生能与该抗原的表位结合的抗体。靶抗原可具有一个或多个表位。关于被结合蛋白识别的各个靶抗原，结合蛋白能够与识别靶抗原的完整抗体竞争。
术语“Her2”意指人表皮生长因子受体2，其是表皮生长因子受体家族的成员。
“CD3”是分化因子簇3多肽且是T细胞表面蛋白，其通常是T细胞受体(TCR)复合体的一部分。
“CD28”是分化簇28多肽并且是T细胞表面蛋白，其提供协同刺激信号用于T细胞激活和存活。
“CD19”是分化簇19多肽并且定位在B细胞上。
“CD20”是分化簇20多肽并且是活化的糖基化磷蛋白，其在B细胞表面表达。
“CD38”是分化簇38多肽并且是见于许多免疫细胞表面的糖蛋白。
“LAMP1”是溶酶体相关膜蛋白1。
“IL-4”是白介素4并且是诱导天然辅助T细胞分化的细胞因子。
“IL-13”是白介素13并且是一种由许多细胞类型(如T细胞)分泌的细胞因子。
“TNFa”是肿瘤坏死因子α并且是涉及全身性炎症的细胞因子。
术语“T细胞衔接体”是指针对宿主免疫系统(更具体而言是T细胞的胞毒活性)以及针对肿瘤靶蛋白的结合蛋白。
术语“单特异性结合蛋白”是指特异性结合至一个抗原靶标的结合蛋白。
术语“单价结合蛋白”是指具有一个抗原结合位点的结合蛋白。
术语“双特异性结合蛋白”是指特异性结合至两个不同抗原靶标的结合蛋白。
术语“二价结合蛋白”是指具有两个结合位点的结合蛋白。
术语“三特异性结合蛋白”是指特异性结合至三个不同抗原靶标的结合蛋白。
术语“三价结合蛋白”是指具有三个结合位点的结合蛋白。在特定的实施方案中，三价结合蛋白能结合至1个抗原靶标。在其他实施方案中，三价结合蛋白能结合至2个抗原靶标。在其他实施方案中，三价结合蛋白能结合至3个抗原靶标。
“分离的”结合蛋白指已从其天然环境的污染组分中鉴定和分离和/或回收的多肽。其天然环境的污染组分是干扰多肽的诊断或治疗用途的材料，其可包括酶、激素和其他蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在一些实施方案中，将所述多肽纯化达到：(1)通过Lowry法测得的以抗体重量计大于95％，最优选的是以重量计大于99％，(2)通过使用转杯式(spinning cup)测序仪测得的足以获得至少15个N-末端或内部氨基酸序列残基的程度，或者(3)通过使用考马斯蓝或优选的银染色法在还原或非还原条件下的SDS-PAGE测得的同质性。分离的结合蛋白包括在重组细胞内原位的结合蛋白，因为结合蛋白天然环境中的至少一种污染组分是不存在的。
本文所用术语“基本纯的”或“基本纯化的”是指是存在的主要种类的任何化合物或种类(即以摩尔浓度基础计，比组合物中的任何其它各个种类丰富)。在一些实施方案中，基本纯化的部分是其中所述种类包含存在的所有大分子种类的至少约50％(以摩尔浓度基础计)的组合物。在其它实施方案中，基本纯的组合物包含存在于组合物中的所有大分子种类的大于约80％、85％、90％、95％或99％。在另外其它的实施方案中，该种类被纯化至基本同质性(通过常规检测方法无法在组合物中检出污染种类)，其中组合物基本由单一大分子种类组成。
本文所用的“中和”结合蛋白意指能阻遏或显著降低其结合的靶抗原的效应子功能的分子。本文所用的“显著降低”意指靶抗原的效应子功能至少约60％、优选为至少约70％、更优选为至少约75％、更优选为至少约80％、更优选为至少约85％、最优选为至少约90％的降低。
术语“表位”包括任何决定簇，优选为能够与免疫球蛋白或T细胞受体特异性结合的多肽决定簇。在一些实施方案中，表位决定簇包括例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基等分子的化学活性表面群聚，并且在一些实施方案中，可具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。表位是被抗体或结合蛋白结合的抗原的区域。在一些实施方案中，当结合蛋白优先识别其在蛋白质和/或大分子的复杂混合物中的靶抗原时，称为与抗原特异性结合。在一些的实施方案中，当平衡解离常数≤10-8M、更优选当平衡解离常数≤10-9M、最优选当解离常数≤10-10 M时，结合蛋白被称为与抗原特异性结合。
可通过例如表面等离振子共振来测定结合蛋白的解离常数(KD)。一般而言，通过采用BIAcore系统(Pharmacia Biosensor；Piscataway，NJ)的表面等离振子共振(SPR)，表面等离振子共振分析测量配体(生物传感器基质上的靶抗原)和分析物(溶液中的结合蛋白)之间的实时结合相互作用。表面等离振子分析也可通过固定分析物(将结合蛋白固定在生物传感器基质上)和呈现配体(靶抗原)来进行。本文所用术语“KD”是指具体结合蛋白和靶抗原间的相互作用的解离常数。
本文所用术语“特异性结合”是指结合蛋白或其抗原结合片段以至少约1 x 10-6M、1 x 10-7M、1 x 10-8M、1 x 10-9M、1 x 10-10 M、1 x 10-11M、1 x 10-12M或更大的Kd与含有表位的抗原结合和/或以其对非特异性抗原的亲和力至少2倍大的亲和力与表位结合的能力。
本文所用术语“接头”是指插入免疫球蛋白域中为轻链和重链的域提供足够的可动性以折叠成交叉双重可变区免疫球蛋白的一个或多个氨基酸残基。在序列水平上，接头分别在可变域之间或可变和恒定域之间的转换处插入。可鉴定域之间的转换，因为已完全了解免疫球蛋白域的近似大小。域转换的确切位置可通过定位不形成二级结构元件如β-片层或α-螺旋的肽段来确定，其通过实验数据证实或可通过建模技术或二级结构预测来假设。本文所述接头称为L1，其位于VL2的C端和VL1域的N端之间的轻链上；以及L2，其位于VL1的C端和CL域的N端之间的轻链上。重链接头称为L3，其位于VH1的C和VH2域的N端之间；和L4，其位于VH2的C端和CH1域的N端之间。
本文所用术语“载体”是指用于将编码信息转移至宿主细胞中的任何分子(例如核酸、质粒或病毒)。术语“载体”包括能够将其已连接的另一个核酸转运的核酸分子。载体的一个类型是“质粒”，其是指可向其中插入另外的DNA区段的环状双链DNA分子。载体的另一个类型是病毒载体，其中另外的DNA区段可插入病毒基因组中。某些载体能够在其所导入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型(episomal)哺乳动物载体)。其它载体(例如非附加型哺乳动物载体)可在导入宿主细胞中时整合到宿主细胞的基因组中，由此与宿主基因组一起复制。此外，一些载体能够指导其与之有效连接的基因的表达。此类载体在本文称为“重组表达载体”(或简称“表达载体”)。一般而言，在重组DNA技术中实用的表达载体常常为质粒的形式。术语“质粒”和“载体”在本文可互换使用，因为质粒是最常使用的载体形式。然而，本发明意欲包括表达载体的其它形式，例如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，其起等同功能的作用。
本文所用短语“重组宿主细胞”(或“宿主细胞”)是指其中已导入重组表达载体的细胞。重组宿主细胞或宿主细胞不仅意指特定的受试细胞，而且还指这类细胞的子代。由于因其突变或环境影响所致某些修饰可发生在后代中，因此尽管这样的后代实际上可不与亲本细胞相同，但这样的细胞仍包括在本文所用术语“宿主细胞”的范围内。可使用各种宿主细胞表达系统来表达结合蛋白，包括细菌、酵母、杆状病毒和哺乳动物表达系统(以及噬菌体展示表达系统)。合适细菌表达载体的一个实例为pUC19。为了重组表达结合蛋白，用一个或多个携带编码结合蛋白的多肽链的DNA片段的重组表达载体转化或转染宿主细胞，使得多肽链在宿主细胞中表达，并优选分泌到其中培养宿主细胞的培养基中，可从所述培养基中回收结合蛋白。
本文所用术语“转化”是指细胞遗传特性的改变，当细胞被修饰以含有新的DNA时，细胞被转化。例如，当细胞自其天然状态被遗传修饰时，细胞被转化。在转化后，转化的DNA可通过物理上(physically)整合至细胞染色体中而与细胞的重组，或可瞬时保持为附加型元件而不被复制，或可作为质粒独立复制。当DNA随细胞分裂而复制时，细胞被视为已稳定转化。本文所用术语“转染”是指外来或外源DNA被细胞摄取，当外源DNA被导入细胞膜内时，细胞被“转染”。多种转染技术是本领域所熟知的。可采用这类技术将一个或多个外源DNA分子导入合适的宿主细胞中。
本文所用和应用于客体的术语“天然存在的”是指该客体可存在于大自然中并且未经人为操作的事实。例如，存在于可从天然来源分离的生物(包括病毒)中且未被人为有意修饰的多核苷酸或多肽是天然存在的。类似地，本文所用的“非天然存在的”是指自然中不存在或已人为进行结构修饰或合成的客体。
如本文所用，20个常规氨基酸及其缩写按照常规用法。20个常用氨基酸的立体异构体(例如D-氨基酸)；非天然氨基酸例如α-、α-二取代的氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其它非常规氨基酸也可以是结合蛋白的多肽链的合适组分。非常规氨基酸的实例包括：4-羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰基赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸和其它类似氨基酸和亚氨基酸(例如4-羟脯氨酸)。在本文所用多肽表示法中，按照标准用法和惯例，左侧方向为氨基端方向，右侧方向为羧基端方向。
可基于共同的侧链性质，将天然存在的残基分类：
(1)疏水：Met、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Tyr、Pro；
(2)极性亲水：Arg、Asn、Asp、G1n、Glu、His、Lys、Ser、Thr；
(3)脂肪族：Ala、Gly、Ile、Leu、Val、Pro；
(4)脂肪族疏水：Ala、Ile、Leu、Val、Pro；
(5)中性亲水：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(6)酸性：Asp、Glu；
(7)碱性：His、Lys、Arg；
(8)影响链取向的残基：Gly、Pro；
(9)芳香族：His、Trp、Tyr、Phe；和
(10)芳香族疏水：Phe、Trp、Tyr。
保守氨基酸取代可涉及这些类别之一的成员与同一类别的另一成员的交换。非保守取代可涉及这些类别之一的成员与另一类别的成员的交换。
采用众所周知的技术，技术人员会能够确定结合蛋白的多肽链的合适变体。例如，通过靶向被视为对活性不重要的区域，本领域的技术人员可鉴定可被改变而不破坏活性的多肽链的合适区域。或者，本领域的技术人员可鉴定在类似多肽中保守的残基和分子部分。此外，甚至可将对生物活性或对结构可能是重要的区域进行保守氨基酸取代而不破坏生物活性或对多肽结构没有不利影响。
本文所用术语“患者”包括人和动物受试者。
本文所用术语“治疗(treatment)”或“治疗(treat)”是指任何治疗性治疗和预防或预防性措施二者。需要治疗的受试者包括患有病症的受试者以及易患病症的受试者或要对其病症进行预防的受试者。在具体的实施方案中，结合蛋白可用于治疗患有癌症的人，或对癌症易感的人，或在人受试者中减轻癌症。结合蛋白还可用于在人患者中预防癌症。在具体的实施方案中，所述癌症为多发性骨髓瘤、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、淋巴瘤、乳腺癌(如Her2+乳腺癌)、生发中心B细胞淋巴瘤或B细胞急性成淋巴细胞性白血病，在其他实施方案中，结合蛋白可用于治疗患有炎性病症的人，或对炎性病症易感的人，或在人受试者中减轻炎性病症。
本文所用术语“药物组合物”或“治疗组合物”是指当适当地施用于患者时能够引起所需治疗效果的任何化合物或组合物。
本文所用术语“药学上可接受的载剂”或“生理学上可接受的载剂”是指适于实现或增强结合蛋白的递送的一种或多种制剂材料。
术语“有效量”和“治疗有效量”在用于修饰包含一种或多种结合蛋白的药物组合物时，是指足以产生所需治疗结果的量或剂量。更具体地说，治疗有效量是足以抑制与待治疗病况相关的一个或多个临床上确定的病理过程达一定时间的结合蛋白的量。有效量可随所使用的具体结合蛋白而变化，也可取决于与受治疗患者相关的各种因素和状况和病症的严重程度。例如，如果结合蛋白是进行体内施用，则因素如患者的年龄、体重和健康状况以及在临床前动物研究中获得的剂量反应曲线和毒性数据会是需要考虑的因素。对给定药物组合物的有效量或治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内。
本发明的一个实施方案提供包含药学上可接受的载剂和治疗有效量的结合蛋白的药物组合物。
三特异性和/或三价结合蛋白
在一些实施方案中，本发明的结合蛋白是三特异性和/或三价结合蛋白，其包含形成3个抗原结合位点的4条多肽链，所述3个抗原结合位点特异性结合一个或多个(例如3个)不同的抗原靶标或靶蛋白，其中第一多肽链包含如下式表示的结构：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽链包含如下式表示的结构：
VH1-L3-VH2-L4-CH1 [II]
且第三多肽链包含如下式表示的结构：
VH3-CH1 [III]
且第四多肽链包含如下式表示的结构：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变域；
VL3是第三免疫球蛋白轻链可变域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变域；
VH3是第三免疫球蛋白重链可变域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定域；且
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
且其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对。
在一些实施方案中，本发明的结合蛋白是三特异性和/或三价结合蛋白，其包含形成3个抗原结合位点的4条多肽链，所述3个抗原结合位点特异性结合一个或多个(例如3个)抗原靶标或靶蛋白，其中第一多肽链包含如下式表示的结构：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽链包含如下式表示的结构：
VH1-L3-VH2-L4-CH1 [II]
且第三多肽链包含如下式表示的结构：
VH3-CH1 [III]
且第四多肽链包含如下式表示的结构：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变域；
VL3是第三免疫球蛋白轻链可变域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变域；
VH3是第三免疫球蛋白重链可变域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定域；且
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
且其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对。
在一些实施方案中，本发明的结合蛋白是三特异性和/或三价结合蛋白，其包含形成3个抗原结合位点的4条多肽链，所述3个抗原结合位点特异性结合一个或多个(例如3个)不同的抗原靶标或靶蛋白，其中第一多肽链包含如下式表示的结构：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽链包含如下式表示的结构：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-铰链-CH2-CH3 [II]
且第三多肽链包含如下式表示的结构：
VH3-CH1-铰链-CH2-CH3 [III]
且第四多肽链包含如下式表示的结构：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变域；
VL3是第三免疫球蛋白轻链可变域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变域；
VH3是第三免疫球蛋白重链可变域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定域；
CH2是免疫球蛋白CH2重链恒定域；
CH3是免疫球蛋白CH3重链恒定域；
铰链是连接CH1和CH2域的免疫球蛋白铰链区；且
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
且其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对。
在一些实施方案中，本发明的结合蛋白是三特异性和/或三价结合蛋白，其包含形成3个抗原结合位点的4条多肽链，所述3个抗原结合位点特异性结合一个或多个(例如3个)抗原靶标或靶蛋白，其中第一多肽链包含如下式表示的结构：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽链包含如下式表示的结构：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-铰链-CH2-CH3 [II]
且第三多肽链包含如下式表示的结构：
VH3-CH1-铰链-CH2-CH3 [III]
且第四多肽链包含如下式表示的结构：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变域；
VL3是第三免疫球蛋白轻链可变域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变域；
VH3是第三免疫球蛋白重链可变域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定域；
CH2是免疫球蛋白CH2重链恒定域；
CH3是免疫球蛋白CH3重链恒定域；
铰链是连接CH1和CH2域的免疫球蛋白铰链区；且
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
且其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对。
在一些实施方案中，所述第一多肽链和第二多肽链具有交叉取向，其形成两个不同的抗原结合位点。在一些实施方案中，VH1和VL1形成结合对并形成第一抗原结合位点。在一些实施方案中，VH2和VL2形成结合对并形成第二抗原结合位点。在一些实施方案中，所述第三和第四多肽形成第三抗原结合位点。在一些实施方案中，VH3和VL3形成结合对并形成第三抗原结合位点。
在一些实施方案中，本发明的结合蛋白是三特异性和/或三价结合蛋白，其包含形成3个抗原结合位点的4条多肽链，所述3个抗原结合位点特异性结合一个或多个(例如3个)抗原靶标或靶蛋白，其中第一多肽链包含如下式表示的结构：
VD1-L1-VD2-L2-CL [I]
且第二多肽链包含如下式表示的结构：
VD3-L3-VD4-L4-CH1-铰链-CH2-CH3 [II]
且第三多肽链包含如下式表示的结构：
VH3-CH1-铰链-CH2-CH3 [III]
且第四多肽链包含如下式表示的结构：
VL3-CL [IV]
其中：
VD1是第一免疫球蛋白的重链或轻链的可变域；
VD2是第二免疫球蛋白的重链或轻链的可变域；
VD3是第三免疫球蛋白的重链或轻链的可变域；
VD4是第四免疫球蛋白的重链或轻链的可变域；
VH3是免疫球蛋白重链可变域；
VL3是免疫球蛋白轻链可变域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定域；
CH2是免疫球蛋白CH2重链恒定域；
CH3是免疫球蛋白CH3重链恒定域；
铰链是连接CH1和CH2域的免疫球蛋白铰链区；且
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
且其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对。
在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含特异性结合一个、两个或三个抗原靶标或靶蛋白的3个抗原结合位点。在一些实施方案中，结合蛋白结合3个抗原靶标。在一些实施方案中，结合蛋白结合3个不同的抗原靶标。在一些实施方案中，所述抗原结合位点的2个结合相同的抗原靶标。在那些实施方案中，结合蛋白包含两个相同的结合域，或不同的结合域，和/或特异性结合相同抗原靶标上不同的抗原或表位。在一些实施方案中，所述抗原结合位点的3个结合相同的抗原靶标。在那些实施方案中，结合蛋白包含3个相同的结合域，或不同的结合域，和/或特异性结合相同抗原靶标上不同的抗原或表位。
在一些实施方案中，VL1、VL2和VL3各自独立地是源自如SEQ ID NO：2、4、10、14、18、22或115任一项所示氨基酸序列的可变域；且VH1、VH2和VH3各自独立地是源自如SEQ ID NO：1、3、9、13、17、21或114任一项所示氨基酸序列的可变域。在其他实施方案中，VL1、VL2和VL3各自独立地是源自如SEQ ID NO：61、63、69、71、74、76、82、86、88或94任一项所示氨基酸序列的可变域；且VH1、VH2和VH3各自独立地是源自如SEQ ID NO：60、62、68、73、75、81、85、87或93任一项所示氨基酸序列的可变域。在其他实施方案中，VL1、VL2和VL3各自独立地包含可变域的轻链互补决定区，所述可变域包含如SEQ ID NO：43-59、123-125任一项所示的氨基酸序列；且VH1、VH2和VH3各自独立地包含可变域的重链互补决定区，所述可变域包含如SEQ IDNO：25-42、120-122任一项所示的氨基酸序列。在其他实施方案中，VL1、VL2和VL3各自独立地包含可变域的轻链互补决定区，所述可变域包含如SEQ ID NO：61、63、69、71、74、76、82、86、88或94任一项所示的氨基酸序列；且VH1、VH2和VH3各自独立地包含可变域的重链互补决定区，所述可变域包含如SEQ ID NO：60、62、68、73、75、81、85、87或93任一项所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH1、VH2和VH3各自独立地包含如表2-5中所示的重链互补决定区和/或可变域序列。
在一些实施方案中，VL1、VL2和VL3各自独立地包含如SEQ ID NO：169、171和173任一项所示的可变域序列；和/或VH1、VH2和VH3各自独立地包含如SEQ ID NO：168、170和172任一项所示的可变域序列。在一些实施方案中，VL1、VL2和VL3各自独立地包含轻链互补决定区，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：141-147、178和179；和/或VH1、VH2和VH3各自独立地包含重链互补决定区，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：129-137。在一些实施方案中，VL1、VL2和VL3各自独立地包含如SEQ ID NO：151、153、155、157、159、161、163、165和167任一项所示的可变域序列；和/或VH1、VH2和VH3各自独立地包含如SEQ ID NO：150、152、154、156、158、160、162、164和166的任一项所示的可变域序列。在一些实施方案中，VL1、VL2和VL3各自独立地包含轻链互补决定区，其包含如SEQ ID NO：43-59、123-125、138-140和149任一项所示的氨基酸序列；和/或VH1、VH2和VH3各自独立地包含可变域的重链互补决定区，其包含如SEQ ID NO：25-42、120-122和126-128任一项所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，VL1、VL2和VL3各自独立地包含如表2-5中所示的轻链互补决定区和/或可变域序列。
在具体的实施方案中，式I的多肽链或式II的多肽链中VH1和VH2域的顺序是互相调换的(即顺序颠倒)，并且因此VL1和VL2的顺序也是互相调换的。
在一些实施方案中，所述第一多肽链包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列或与SEQ IDNO：4的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：4的多肽链的CDR 100％相同的CDR；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列或与SEQ ID NO：3的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：3的多肽链的CDR100％相同的CDR；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列或与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：1的多肽链的CDR 100％相同的CDR；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或与SEQ ID NO：2的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：2的多肽链的CDR 100％相同的CDR。
在一些实施方案中，所述第一多肽链包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列或与SEQ IDNO：10的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：10的多肽链的CDR 100％相同的CDR；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列或与SEQ ID NO：9的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：9的多肽链的CDR100％相同的CDR；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列或与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：1的多肽链的CDR 100％相同的CDR；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或与SEQ ID NO：2的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：2的多肽链的CDR 100％相同的CDR。
在一些实施方案中，所述第一多肽链包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列或与SEQ IDNO：4的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：4的多肽链的CDR 100％相同的CDR；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列或与SEQ ID NO：3的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：3的多肽链的CDR100％相同的CDR；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列或与SEQ ID NO：13的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：13的多肽链的CDR100％相同的CDR；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列或与SEQ ID NO：14的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEO ID NO：14的多肽链的CDR100％相同的CDR。
在一些实施方案中，所述第一多肽链包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列或与SEQ IDNO：10的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：10的多肽链的CDR 100％相同的CDR；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列或与SEQ ID NO：9的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：9的多肽链的CDR100％相同的CDR：所述第三多肽链包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列或与SEQ ID NO：13的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：13的多肽链的CDR100％相同的CDR；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列或与SEQ ID NO：14的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：14的多肽链的CDR100％相同的CDR。
在一些实施方案中，所述第一多肽链包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列或与SEQ IDNO：4的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：4的多肽链的CDR 100％相同的CDR；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列或与SEQ ID NO：3的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：3的多肽链的CDR100％相同的CDR；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列或与SEQ ID NO：17的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：17的多肽链的CDR100％相同的CDR；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列或与SEQ ID NO：18的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：18的多肽链的CDR100％相同的CDR。
在一些实施方案中，所述第一多肽链包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列或与SEQ IDNO：10的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：10的多肽链的CDR 100％相同的CDR；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列或与SEQ ID NO：9的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：9的多肽链的CDR100％相同的CDR；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列或与SEQ ID NO：17的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：17的多肽链的CDR100％相同的CDR；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列或与SEQ ID NO：18的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：18的多肽链的CDR100％相同的CDR。
在一些实施方案中，所述第一多肽链包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列或与SEQ IDNO：4的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：4的多肽链的CDR 100％相同的CDR；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列或与SEQ ID NO：3的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：3的多肽链的CDR100％相同的CDR；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列或与SEQ ID NO：21的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：21的多肽链的CDR100％相同的CDR；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列或与SEQ ID NO：22的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：22的多肽链的CDR100％相同的CDR。
在一些实施方案中，所述第一多肽链包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列或与SEQ IDNO：10的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：10的多肽链的CDR 100％相同的CDR；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列或与SEQ ID NO：9的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：9的多肽链的CDR100％相同的CDR；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列或与SEQ ID NO：21的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：21的多肽链的CDR100％相同的CDR；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列或与SEQ ID NO：22的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：22的多肽链的CDR100％相同的CDR。
在一些实施方案中，所述第一多肽链包含SEQ ID NO：63的氨基酸序列或与SEQ IDNO：63的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：63的多肽链的CDR 100％相同的CDR；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：62的氨基酸序列或与SEQ ID NO：62的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：62的多肽链的CDR 100％相同的CDR；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：60的氨基酸序列或与SEQ ID NO：60的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：60的多肽链的CDR100％相同的CDR；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：61的氨基酸序列或与SEQ ID NO：61的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：61的多肽链的CDR100％相同的CDR。
在一些实施方案中，所述第一多肽链包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列或与SEQ IDNO：69的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：69的多肽链的CDR 100％相同的CDR；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列或与SEQ ID NO：68的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：68的多肽链的CDR 100％相同的CDR；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：60的氨基酸序列或与SEQ ID NO：60的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：60的多肽链的CDR100％相同的CDR；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：61的氨基酸序列或与SEQ ID NO：61的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：61的多肽链的CDR100％相同的CDR。
在一些实施方案中，所述第一多肽链包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列或与SEQ IDNO：69的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：69的多肽链的CDR 100％相同的CDR；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列或与SEQ ID NO：68的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：68的多肽链的CDR 100％相同的CDR；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：60的氨基酸序列或与SEQ ID NO：60的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：60的多肽链的CDR100％相同的CDR；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：71的氨基酸序列或与SEQ ID NO：71的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：71的多肽链的CDR100％相同的CDR。
在一些实施方案中，所述第一多肽链包含SEQ ID NO：76的氨基酸序列或与SEQ IDNO：76的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：76的多肽链的CDR 100％相同的CDR；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：75的氨基酸序列或与SEQ ID NO：75的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：75的多肽链的CDR 100％相同的CDR；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列或与SEQ ID NO：73的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：73的多肽链的CDR100％相同的CDR；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：74的氨基酸序列或与SEQ ID NO：74的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：74的多肽链的CDR100％相同的CDR。
在一些实施方案中，所述第一多肽链包含SEQ ID NO：82的氨基酸序列或与SEQ IDNO：82的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：82的多肽链的CDR 100％相同的CDR；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：81的氨基酸序列或与SEQ ID NO：81的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：81的多肽链的CDR 100％相同的CDR；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列或与SEQ ID NO：73的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：73的多肽链的CDR100％相同的CDR；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：74的氨基酸序列或与SEQ ID NO：74的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：74的多肽链的CDR100％相同的CDR。
在一些实施方案中，所述第一多肽链包含SEQ ID NO：88的氨基酸序列或与SEQ IDNO：88的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：88的多肽链的CDR 100％相同的CDR；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：87的氨基酸序列或与SEQ ID NO：87的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：87的多肽链的CDR 100％相同的CDR；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：85的氨基酸序列或与SEQ ID NO：85的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：85的多肽链的CDR100％相同的CDR；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：86的氨基酸序列或与SEQ ID NO：86的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：86的多肽链的CDR100％相同的CDR。
在一些实施方案中，所述第一多肽链包含SEQ ID NO：94的氨基酸序列或与SEQ IDNO：94的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：94的多肽链的CDR 100％相同的CDR；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：93的氨基酸序列或与SEQ ID NO：93的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：93的多肽链的CDR 100％相同的CDR；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：85的氨基酸序列或与SEQ ID NO：85的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：85的多肽链的CDR100％相同的CDR；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：86的氨基酸序列或与SEQ ID NO：86的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：86的多肽链的CDR100％相同的CDR。
在一些实施方案中，所述第一多肽链包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列或与SEQ IDNO：69的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：69的多肽链的CDR 100％相同的CDR；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列或与SEQ ID NO：68的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：68的多肽链的CDR 100％相同的CDR；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列或与SEQ ID NO：73的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：73的多肽链的CDR100％相同的CDR；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：74的氨基酸序列或与SEQ ID NO：74的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：74的多肽链的CDR100％相同的CDR。
在一些实施方案中，所述第一多肽链包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列或与SEQ IDNO：69的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：69的多肽链的CDR 100％相同的CDR；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列或与SEQ ID NO：68的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：68的多肽链的CDR 100％相同的CDR；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：85的氨基酸序列或与SEQ ID NO：85的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：85的多肽链的CDR100％相同的CDR；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：86的氨基酸序列或与SEQ ID NO：86的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：86的多肽链的CDR100％相同的CDR。
在一些实施方案中，所述第一多肽链包含SEQ ID NO：63的氨基酸序列或与SEQ IDNO：63的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：63的多肽链的CDR 100％相同的CDR；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：62的氨基酸序列或与SEQ ID NO：62的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：62的多肽链的CDR 100％相同的CDR；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列或与SEQ ID NO：73的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：73的多肽链的CDR100％相同的CDR；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：74的氨基酸序列或与SEQ ID NO：74的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：74的多肽链的CDR100％相同的CDR。
在一些实施方案中，所述第一多肽链包含SEQ ID NO：63的氨基酸序列或与SEQ IDNO：63的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：63的多肽链的CDR 100％相同的CDR；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：62的氨基酸序列或与SEQ ID NO：62的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：62的多肽链的CDR 100％相同的CDR；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：85的氨基酸序列或与SEQ ID NO：85的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：85的多肽链的CDR100％相同的CDR；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：86的氨基酸序列或与SEQ ID NO：86的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：86的多肽链的CDR100％相同的CDR。
在一些实施方案中，所述第一多肽链包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列或与SEQ IDNO：4的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：4的多肽链的CDR 100％相同的CDR；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列或与SEQ ID NO：3的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：3的多肽链的CDR100％相同的CDR；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：114的氨基酸序列或与SEQ ID NO：114的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：114的多肽链的CDR100％相同的CDR；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：115的氨基酸序列或与SEQ ID NO：115的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：115的多肽链的CDR100％相同的CDR。
在一些实施方案中，所述第一多肽链包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列或与SEQ IDNO：10的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：10的多肽链的CDR 100％相同的CDR；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列或与SEQ ID NO：9的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：9的多肽链的CDR100％相同的CDR；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：114的氨基酸序列或与SEQ ID NO：114的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：114的多肽链的CDR100％相同的CDR；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：115的氨基酸序列或与SEQ ID NO：115的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：115的多肽链的CDR100％相同的CDR。
在其他实施方案中，本发明的结合蛋白是三特异性和/或三价结合蛋白，其包含形成3个抗原结合位点的4条多肽链，所述3个抗原结合位点特异性结合一个或多个(例如3个)不同的靶蛋白，其中第一多肽链具有如下式表示的结构：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽链具有如下式表示的结构：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-铰链-CH2-CH3 (臼) [II]
且第三多肽链具有如下式表示的结构：
VH3-CH1-铰链-CH2-CH3 (杵) [III]
且第四多肽链具有如下式表示的结构：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变域；
VL3是第三免疫球蛋白轻链可变域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变域；
VH3是第三免疫球蛋白重链可变域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定域；且
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
且其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对。
在其他实施方案中，本发明的结合蛋白是三特异性和/或三价结合蛋白，其包含形成3个抗原结合位点的4条多肽链，所述3个抗原结合位点特异性结合一个或多个(例如3个)靶蛋白，其中第一多肽链具有如下式表示的结构：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽链具有如下式表示的结构：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-铰链-CH2-CH3 (臼) [II]
且第三多肽链具有如下式表示的结构：
VH3-CH1-铰链-CH2-CH3(杵) [III]
且第四多肽链具有如下式表示的结构：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变域；
VL3是第三免疫球蛋白轻链可变域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变域；
VH3是第三免疫球蛋白重链可变域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定域；且
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
且其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对。
在一些实施方案中，所述第一多肽链和第二多肽链具有交叉取向，其形成两个不同的抗原结合位点。在一些实施方案中，VH1和VL1形成结合对并形成第一抗原结合位点。在一些实施方案中，VH2和VL2形成结合对并形成第二抗原结合位点。在一些实施方案中，所述第三和第四多肽形成第三抗原结合位点。在一些实施方案中，VH3和VL3形成结合对并形成第三抗原结合位点。在一些实施方案中，所述第二多肽链和第三多肽链包含一个或多个修饰。在一些实施方案中，所述结合蛋白的第二多肽链和第三多肽链是不同的，例如具有不同的CH1、CH2和/或CH3域(如包括本文所述的修饰的那些)。在一些实施方案中，所述第一多肽链和第四多肽链包含一个或多个修饰。在一些实施方案中，所述结合蛋白的第一多肽链和第四多肽链是不同的，例如具有不同的CL域(如包括本文所述的修饰的那些，和/或λ对比κ CL域)。
在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含抗原结合位点，所述抗原结合位点包含重链可变域和/或轻链可变域，所述重链可变域包含与SEQ ID NO：150至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ IDNO：150的多肽链的CDR 100％相同的CDR，所述轻链可变域包含与SEQ ID NO：151至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQID NO：151的多肽链的CDR 100％相同的CDR。在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含抗原结合位点，所述抗原结合位点包含重链可变域和/或轻链可变域，所述重链可变域包含与SEQ ID NO：152至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：152的多肽链的CDR 100％相同的CDR，所述轻链可变域包含与SEQ ID NO：153至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：153的多肽链的CDR 100％相同的CDR。在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含抗原结合位点，所述抗原结合位点包含重链可变域和/或轻链可变域，所述重链可变域包含与SEQ ID NO：154至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：154的多肽链的CDR100％相同的CDR，所述轻链可变域包含与SEQ ID NO：155至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：155的多肽链的CDR 100％相同的CDR。在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含抗原结合位点，所述抗原结合位点包含重链可变域和/或轻链可变域，所述重链可变域包含与SEQ ID NO：156至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：156的多肽链的CDR 100％相同的CDR，所述轻链可变域包含与SEQ ID NO：157至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：157的多肽链的CDR 100％相同的CDR。在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含抗原结合位点，所述抗原结合位点包含重链可变域和/或轻链可变域，所述重链可变域包含与SEQ ID NO：158至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：158的多肽链的CDR 100％相同的CDR，所述轻链可变域包含与SEQ ID NO：159至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：159的多肽链的CDR100％相同的CDR。在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含抗原结合位点，所述抗原结合位点包含重链可变域和/或轻链可变域，所述重链可变域包含与SEQ ID NO：160至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：160的多肽链的CDR 100％相同的CDR，所述轻链可变域包含与SEQ ID NO：161至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ IDNO：161的多肽链的CDR 100％相同的CDR。在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含抗原结合位点，所述抗原结合位点包含重链可变域和/或轻链可变域，所述重链可变域包含与SEQ ID NO：162至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：162的多肽链的CDR 100％相同的CDR，所述轻链可变域包含与SEQ ID NO：163至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：163的多肽链的CDR 100％相同的CDR。在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含抗原结合位点，所述抗原结合位点包含重链可变域和/或轻链可变域，所述重链可变域包含与SEQ ID NO：164至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：164的多肽链的CDR100％相同的CDR，所述轻链可变域包含与SEQ ID NO：165至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：165的多肽链的CDR 100％相同的CDR。在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含抗原结合位点，所述抗原结合位点包含重链可变域和/或轻链可变域，所述重链可变域包含与SEQ ID NO：166至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：166的多肽链的CDR 100％相同的CDR，所述轻链可变域包含与SEQ ID NO：167至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：167的多肽链的CDR 100％相同的CDR。在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含抗原结合位点，所述抗原结合位点包含重链可变域和/或轻链可变域，所述重链可变域包含与SEQ ID NO：168至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：168的多肽链的CDR 100％相同的CDR，所述轻链可变域包含与SEQ ID NO：169至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：169的多肽链的CDR 100％相同的CDR。在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含抗原结合位点，所述抗原结合位点包含重链可变域和/或轻链可变域，所述重链可变域包含与SEQ ID NO：170至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：170的多肽链的CDR 100％相同的CDR，所述轻链可变域包含与SEQ ID NO：171至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ IDNO：171的多肽链的CDR 100％相同的CDR。在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含抗原结合位点，所述抗原结合位点包含重链可变域和/或轻链可变域，所述重链可变域包含与SEQ ID NO：172至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：172的多肽链的CDR 100％相同的CDR，所述轻链可变域包含与SEQ ID NO：173至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％相同的氨基酸序列，其任选地包含与SEQ ID NO：173的多肽链的CDR 100％相同的CDR。
在一些实施方案中，本发明的结合蛋白以小于或等于1μM、500nM、100nM、50nM、10nM、5nM、或1nM的平衡解离常数(KD)结合至一个、两个或三个抗原靶标。用于确定KD的示例性测定是本领域已知的。例如，在一些实施方案中，通过用实施例1中所述的技术(例如SPR或ELISA)在0℃至37℃(例如0℃、4℃、25℃或37℃)处测量结合动力学来确定KD。
在一些实施方案中，本发明的结合蛋白体外活化CD4和/或CD8T细胞和/或诱导细胞(其表达所述结合蛋白的一个或多个结合域的一个或多个抗原靶标)的抗体介导的体外细胞杀伤。示例性的体外细胞杀伤和T细胞激活测定是本领域已知的。例如，在一些实施方案中，用实施例1中所述的技术来测定体外细胞杀伤和/或T细胞活化。
在一些实施方案中，本发明的结合蛋白特异性结合至和/或阻断由一个或多个细胞因子介导的信号传导。示例性的细胞因子释放测定是本领域已知的。例如，在一些实施方案中，通过使用实施例1中所述的技术来测定细胞因子释放。
在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含特异性结合T细胞上的靶蛋白的第一抗原结合位点、特异性结合T细胞上的靶蛋白的第二抗原结合位点和特异性结合抗原靶标或靶蛋白的第三抗原结合位点。在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含特异性结合T细胞上的靶蛋白的第一抗原结合位点、特异性结合T细胞上的靶蛋白的第二抗原结合位点和特异性结合肿瘤靶蛋白的第三抗原结合位点。在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含特异性结合T细胞上的靶蛋白的第一抗原结合位点、特异性结合T细胞上的靶蛋白的第二抗原结合位点和特异性结合人肿瘤靶蛋白的第三抗原结合位点。在一些实施方案中，第一和第二抗原结合位点特异性结合肿瘤靶蛋白，例如分别选自CD3和CD28。在一些实施方案中，第一和第二抗原结合位点特异性结合肿瘤靶蛋白，例如分别选自CD28和CD3。在一些实施方案中，第三抗原结合位点特异性结合CD19、CD20、CD38、Her2或LAMP1。此类靶标和靶蛋白的其他实例在下文提供。
在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含特异性结合CD3的第一抗原结合位点、特异性结合CD28的第二抗原结合位点和特异性结合抗原靶标或靶蛋白的第三抗原结合位点。在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含特异性结合CD28的第一抗原结合位点、特异性结合CD3的第二抗原结合位点和特异性结合抗原靶标或靶蛋白的第三抗原结合位点。此类抗原靶标或靶蛋白的其他实例在下文提供。在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含特异性结合CD3的第一抗原结合位点、特异性结合CD28的第二抗原结合位点和特异性结合肿瘤靶蛋白的第三抗原结合位点。在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含特异性结合CD3的第一抗原结合位点、特异性结合CD28的第二抗原结合位点和特异性结合人肿瘤靶蛋白的第三抗原结合位点。在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含特异性结合CD28的第一抗原结合位点、特异性结合CD3的第二抗原结合位点和特异性结合肿瘤靶蛋白的第三抗原结合位点。在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含特异性结合CD28的第一抗原结合位点、特异性结合CD3的第二抗原结合位点和特异性结合人肿瘤靶蛋白的第三抗原结合位点。在一些实施方案中，第三抗原结合位点特异性结合CD19、CD20、CD38、Her2或LAMP1。此类肿瘤抗原靶标或肿瘤靶蛋白的其他实例在下文提供。
在一些实施方案中，所述特异性结合CD3的抗原结合位点包含：包含SEQ ID NO：152的氨基酸序列的重链可变域和包含SEQ ID NO：153的氨基酸序列的轻链可变域；或包含SEQ ID NO：154的氨基酸序列的重链可变域和包含SEQ ID NO：155的氨基酸序列的轻链可变域。抗体的其他特异性结合CD3施用于本文所述任何结合蛋白的VH、VL和/或CDR序列可见于国际公开No.WO2016/116626中，其再次通过提述以其整体并入本文。在一些实施方案中，所述特异性结合CD3的抗原结合位点包含6个CDR，或重链和轻链可变域，如表2-5所示。在一些实施方案中，所述特异性结合CD3的抗原结合位点包含：(i)分别为SEQ ID No.34、35和36的3个重链CDR，和分别为SEQ ID No.52、53和54的3个轻链CDR；或(ii)分别为SEQ IDNo.34、35和36的3个重链CDR，和分别为SEQ ID No.149、53和54的3个轻链CDR。在一些实施方案中，特异性结合CD3的抗原结合位点是如下多肽链的一部分，所述多肽链包含SEQ IDNO：3的氨基酸序列或与SEQ ID NO：3的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，任选地包含与SEQ ID NO：3的多肽链的CDRs 100％相同的CDRs。在一些实施方案中，特异性结合CD3的抗原结合位点是如下多肽链的一部分，所述多肽链包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列或与SEQ ID NO：4的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，任选地包含与SEQ ID NO：4的多肽链的CDRs 100％相同的CDRs。
在一些实施方案中，所述特异性结合CD28的抗原结合位点包含：包含SEQ ID NO：160的氨基酸序列的重链可变域和包含SEQ ID NO：161的氨基酸序列的轻链可变域；或包含SEQ ID NO：162的氨基酸序列的重链可变域和包含SEQ ID NO：163的氨基酸序列的轻链可变域。在一些实施方案中，所述特异性结合CD28的抗原结合位点包含6个CDR，或重链和轻链可变域，如表2-5所示。在一些实施方案中，所述特异性结合CD28的抗原结合位点包含：(i)分别为SEQ ID No.28、29和30的3个重链CDR，和分别为SEQ ID No.46、47和48的3个轻链CDR；或(ii)分别为SEQ ID No.31、32和33的3个重链CDR，和分别为SEQ ID No.49、50和51的3个轻链CDR。在一些实施方案中，特异性结合CD28的抗原结合位点是如下多肽链的一部分，所述多肽链包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列或与SEQ ID NO：3的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，任选地包含与SEQ ID NO：3的多肽链的CDRs 100％相同的CDRs。在一些实施方案中，特异性结合CD28的抗原结合位点是如下多肽链的一部分，所述多肽链包含SEQ IDNO：4的氨基酸序列或与SEQ ID NO：4的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，任选地包含与SEQ ID NO：4的多肽链的CDRs 100％相同的CDRs。
在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含特异性结合CD3的第一抗原结合位点、特异性结合CD28的第二抗原结合位点和特异性结合CD38的第三抗原结合位点，或特异性结合CD28的第一抗原结合位点、特异性结合CD3的第二抗原结合位点和特异性结合CD38的第三抗原结合位点其中：
·特异性结合CD3的抗原结合位点包含：(i)分别为SEQ ID No.34、35和36的3个重链CDR，和分别为SEQ ID No.52、53和54的3个轻链CDR；或(ii)分别为SEQ ID No.34、35和36的3个重链CDR，和分别为SEQ ID No.149、53和54的3个轻链CDR；且
·特异性结合CD28的抗原结合位点包含：(i)分别为SEQ ID No.28、29和30的3个重链CDR，和分别为SEQ ID No.46、47和48的3个轻链CDR；或(ii)分别为SEQ ID No.31、32和33的3个重链CDR，和分别为SEQ ID No.49、50和51的3个轻链CDR；且
·特异性结合CD38的抗原结合位点包含：(i)分别为SEQ ID No.40、41和42的3个重链CDR，和分别为SEQ ID No.58、44和59的3个轻链CDR。
在一些实施方案中，特异性结合肿瘤靶蛋白的抗原结合位点包含：包含SEQ IDNO：156的氨基酸序列的重链可变域和包含SEQ ID NO：157的氨基酸序列的轻链可变域；包含SEQ ID NO：158的氨基酸序列的重链可变域和包含SEQ ID NO：159的氨基酸序列的轻链可变域；包含SEQ ID NO：164的氨基酸序列的重链可变域和包含SEQ ID NO：165的氨基酸序列的轻链可变域；包含SEQ ID NO：150的氨基酸序列的重链可变域和包含SEQ ID NO：151的氨基酸序列的轻链可变域；或包含SEQ ID NO：166的氨基酸序列的重链可变域和包含SEQID NO：167的氨基酸序列的轻链可变域。在一些实施方案中，特异性结合肿瘤靶蛋白的抗原结合位点包含6个CDR，或重链及轻链可变域，其示于表2-5中。在一些实施方案中，特异性结合肿瘤靶蛋白的抗原结合位点包含示于表2-5中的抗-Her2、抗-CD19、抗-CD20、抗-CD38或抗-LAMP1结合域的6个CDR。
在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含包含形成3个抗原结合位点的4条多肽链，其中第一多肽链包含如下式表示的结构：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽链包含如下式表示的结构：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-铰链-CH2-CH3 [II]
且第三多肽链包含如下式表示的结构：
VH3-CH1-铰链-CH2-CH3 [III]
且第四多肽链包含如下式表示的结构：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变域；
VL3是第三免疫球蛋白轻链可变域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变域；
VH3是第三免疫球蛋白重链可变域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定域；
CH2是免疫球蛋白CH2重链恒定域；
CH3是免疫球蛋白CH3重链恒定域；
铰链是连接CH1和CH2域的免疫球蛋白铰链区；且
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
且其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对；
其中：
VL1、VL2和VL3各自独立地包含如SEQ ID NO：169、171和173中任一项所示的可变域序列；且
其中：
VH1、VH2和VH3各自独立地包含如SEQ ID NO：168、170和172中任一项所示的可变域序列。
在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含形成3个抗原结合位点的4条多肽链，其中第一多肽链包含如下式表示的结构：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽链包含如下式表示的结构：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-铰链-CH2-CH3 [II]
且第三多肽链包含如下式表示的结构：
VH3-CH1-铰链-CH2-CH3 [III]
且第四多肽链包含如下式表示的结构：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变域；
VL3是第三免疫球蛋白轻链可变域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变域；
VH3是第三免疫球蛋白重链可变域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定域；
CH2是免疫球蛋白CH2重链恒定域；
CH3是免疫球蛋白CH3重链恒定域；
铰链是连接CH1和CH2域的免疫球蛋白铰链区；且
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
且其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对；
其中：
VL1、VL2和VL3各自独立地包含轻链互补决定区，所述轻链互补决定区包含选自下组的氨基酸序列：如SEQ ID NO：141-147、178和179；且
其中：
VH1、VH2和VH3各自独立地包含重链互补决定区，所述重链互补决定区包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：129-137。
在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含形成3个抗原结合位点的4条多肽链，其中第一多肽链包含如下式表示的结构：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽链包含如下式表示的结构：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-铰链-CH2-CH3 [II]
且第三多肽链包含如下式表示的结构：
VH3-CH1-铰链-CH2-CH3 [III]
且第四多肽链包含如下式表示的结构：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变域；
VL3是第三免疫球蛋白轻链可变域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变域；
VH3是第三免疫球蛋白重链可变域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定域；
CH2是免疫球蛋白CH2重链恒定域；
CH3是免疫球蛋白CH3重链恒定域；
铰链是连接CH1和CH2域的免疫球蛋白铰链区；且
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
且其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对；
其中：
VL1、VL2和VL3各自独立地包含如SEQ ID NO：151、153、155、157、159、161、163、165和167的任一项所示的可变域序列；且
其中：
VH1、VH2和VH3各自独立地包含如SEQ ID NO：150、152、154、156、158、160、162、164和166的任一项所示的可变域序列。
在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含形成3个抗原结合位点的4条多肽链，其中第一多肽链包含如下式表示的结构：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽链包含如下式表示的结构：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-铰链-CH2-CH3 [II]
且第三多肽链包含如下式表示的结构：
VH3-CH1-铰链-CH2-CH3 [III]
且第四多肽链包含如下式表示的结构：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变域；
VL3是第三免疫球蛋白轻链可变域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变域；
VH3是第三免疫球蛋白重链可变域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定域；
CH2是免疫球蛋白CH2重链恒定域；
CH3是免疫球蛋白CH3重链恒定域；
铰链是连接CH1和CH2域的免疫球蛋白铰链区；且
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
且其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对；
其中：
VL1、VL2和VL3各自独立地包含轻链互补决定区，所述轻链互补决定区包含如SEQ IDNO：43-59、123-125、138-140和149的任一项所示的氨基酸序列；且
其中：
VH1、VH2和VH3各自独立地包含重链互补决定区，所述重链互补决定区包含如SEQ IDNO：25-42、120-122和126-128的任一项所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含特异性结合CD3的抗原结合位点、特异性结合CD28的抗原结合位点和特异性结合除CD3或CD28以外的其他抗原靶标的抗原结合位点。在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含特异性结合人CD3的抗原结合位点、特异性结合人CD28的抗原结合位点和特异性结合除CD3或CD28以外的其他人抗原靶标的抗原结合位点。在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含(a)特异性结合CD3的抗原结合位点，其中所述特异性结合CD3的抗原结合位点包含：(i)包含SEQ ID NO：152的氨基酸序列的重链可变域和包含SEQ ID NO：153的氨基酸序列的轻链可变域，(ii)包含SEQ ID NO：154的氨基酸序列的重链可变域和包含SEQ ID NO：155的氨基酸序列的轻链可变域，(iii)重链可变域和轻链可变域，所述重链可变域包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ IDNO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3，所述轻链可变域包含：包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的CDR-L3，或(iv)重链可变域和轻链可变域，所述重链可变域包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3，所述轻链可变域包含：包含SEQ ID NO：149的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的CDR-L3；(b)特异性结合CD28的抗原结合位点，其中所述特异性结合CD28的抗原结合位点包含：(i)包含SEQ ID NO：160的氨基酸序列的重链可变域和包含SEQ ID NO：161的氨基酸序列的轻链可变域，(ii)包含SEQ ID NO：162的氨基酸序列的重链可变域和包含SEQ ID NO：163的氨基酸序列的轻链可变域，(iii)重链可变域和轻链可变域，所述重链可变域包含：包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的CDR-H3，所述轻链可变域包含：包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：47的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：48的氨基酸序列的CDR-L3，或(iv)重链可变域和轻链可变域，所述重链可变域包含：包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的CDR-H3，所述轻链可变域包含：包含SEQ IDNO：49的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ IDNO：51的氨基酸序列的CDR-L3；和(c)特异性结合除CD3或CD28以外的其他抗原靶标的抗原结合位点。在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含：包含SEQ ID NO：4或10的氨基酸序列的第一多肽链、包含SEQ ID NO：3或9的氨基酸序列的第二多肽链、及第三和第四多肽链，其中所述第三和第四多肽链形成抗原结合域，其特异性结合除CD3或CD28以外的其他抗原靶标。在一些实施方案中，所述特异性结合除CD3或CD28以外的其他抗原靶标的抗原结合位点结合选自下组的抗原：A2AR、APRIL、ATPD酶、BAFF、BAFFR、BCMA、BlyS、BTK、BTLA、B7DC、B7H1、B7H4(也称为VTCN1)、B7H5、B7H6、B7H7、B7RP1、B7-4、C3、C5、CCL2(也称为MCP-1)、CCL3(也称为MIP-1a)、CCL4(也称为MIP-1b)、CCL5(也称为RANTES)、CCL7(也称为MCP-3)、CCL8(也称为mcp-2)、CCL11(也称为嗜酸性粒细胞趋化因子)、CCL15(也称为MIP-1d)、CCL17(也称为TARC)、CCL19(也称为MIP-3b)、CCL20(也称为MIP-3a)、CCL21(也称为MIP-2)、CCL24(也称为MPIF-2/嗜酸性粒细胞趋化因子-2)、CCL25(也称为TECK)、CCL26(也称为嗜酸性粒细胞趋化因子-3)、CCR3、CCR4、CD19、CD20、CD23(也称为FCER2，IgE的受体)、CD24、CD27、CD38、CD39、CD40、CD70、CD80(也称为B7-1)、CD86(也称为B7-2)、CD122、CD137(也称为41BB)、CD137L、CD152(也称为CTLA4)、CD154(也称为CD40L)、CD160、CD272、CD273(也称为PDL2)、CD274(也称为PDL1)、CD275(也称为B7H2)、CD276(也称为B7H3)、CD278(也称为ICOS)、CD279(也称为PD-1)、CDH1(也称为E-钙粘素)、壳多糖酶、CLEC9、CLEC91、CRTH2、CSF-1(也称为M-CSF)、CSF-2(也称为GM-CSF)、CSF-3(也称为GCSF)、CX3CL1(也称为SCYD1)、CXCL12(也称为SDF1)、CXCL13、CXCR3、DNGR-1、外核苷三磷酸盐二磷酸水解酶1、EGFR、ENTPD1、FCER1A、FCER1、FLAP、FOLH1、Gi24、GITR、GITRL、GM-CSF、Her2、HHLA2、HMGB1、HVEM、ICOSLG、IDO、IFNα、IgE、IGF1R、IL2Rβ、IL1、IL1A、IL1B、IL1F10、IL2、IL4、IL4Ra、IL5、IL5R、IL6、IL7、IL7Ra、IL8、IL9、IL9R、IL10、rhIL10、IL12、IL13、IL13Ra1、IL13Ra2、IL15、IL17、IL17Rb(也已知作为IL25的受体)、IL18、IL22、IL23、IL25、IL27、IL33、IL35、ITGB4(也称为b4整合素)、ITK、KIR、LAG3、LAMP1、瘦素、LPFS2、II类MHC、NCR3LG1、NKG2D、NTPD酶-1、OX40、OX40L、PD-1H、血小板受体、PROM1、S152、SISP1、SLC、SPG64、ST2(也已知作为IL33的受体)、STEAP2、Syk激酶、TACI、TDO、T14、TIGIT、TIM3、TLR、TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、TMEF1、TNFa、TNFRSF7、Tp55、TREM1、TSLP(也已知作为IL7Ra的辅助受体)、TSLPR、TWEAK、VEGF、VISTA、Vstm3、WUCAM和XCR1(也称为GPR5/CCXCR1)。
在一些实施方案中，VH1包含：包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQID NO：29的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：47的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：48的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些实施方案中，VH1包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些实施方案中，VH1包含：包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQID NO：32的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些实施方案中，VH1包含：包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQID NO：29的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：47的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：48的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：55的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：56的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：57的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些实施方案中，VH1包含：包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQID NO：32的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：55的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：56的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：57的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些实施方案中，VH1包含：包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQID NO：29的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：47的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：48的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：58的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：59的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些实施方案中，VH1包含：包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQID NO：32的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：58的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：59的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些实施方案中，VH1包含：包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQID NO：29的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：47的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：48的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：126的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：127的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：128的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：138的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：139的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：140的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些实施方案中，VH1包含：包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQID NO：32的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：126的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：127的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：128的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：138的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：139的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：140的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些实施方案中，VH1包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：129的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：130的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：131的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：141的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQID NO：178的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：142的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些实施方案中，VH1包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：129的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：130的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：131的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：141的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQID NO：178的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：142的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些实施方案中，VH1包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：129的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：130的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：131的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：141的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQID NO：178的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：142的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些实施方案中，VH1包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：129的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：130的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：131的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：141的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：178的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：142的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些实施方案中，VH1包含：包含SEQ ID NO：129的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQID NO：130的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：131的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：141的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：178的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：142的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些实施方案中，VH1包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：129的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：130的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：131的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：141的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：178的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：142的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些实施方案中，VH1包含：包含SEQ ID NO：129的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQID NO：130的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：131的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：141的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：178的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：142的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些实施方案中，VH1包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些实施方案中，VH1包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些实施方案中，VH1包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些实施方案中，VH1包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些实施方案中，VH1包含：包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQID NO：29的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：47的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：48的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：120的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：121的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：122的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：123的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：124的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：125的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些实施方案中，VH1包含：包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQID NO：32的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：120的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：121的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：122的氨基酸序列的CDR-H3；且且VL3包含：包含SEQ ID NO：123的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：124的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：125的氨基酸序列的CDR-L3。
抗原靶标
在一些实施方案中，本发明的结合蛋白结合如下抗原靶标或靶蛋白的一个或多个(例如一个、两个或三个)：A2AR、APRIL、ATPD酶、BAFF、BAFFR、BCMA、BlyS、BTK、BTLA、B7DC、B7H1、B7H4(也称为VTCN1)、B7H5、B7H6、B7H7、B7RP1、B7-4、C3、C5、CCL2(也称为MCP-1)、CCL3(也称为MIP-1a)、CCL4(也称为MIP-1b)、CCL5(也称为RANTES)、CCL7(也称为MCP-3)、CCL8(也称为mcp-2)、CCL11(也称为嗜酸性粒细胞趋化因子)、CCL15(也称为MIP-1d)、CCL17(也称为TARC)、CCL19(也称为MIP-3b)、CCL20(也称为MIP-3a)、CCL21(也称为MIP-2)、CCL24(也称为MPIF-2/嗜酸性粒细胞趋化因子-2)、CCL25(也称为TECK)、CCL26(也称为嗜酸性粒细胞趋化因子-3)、CCR3、CCR4、CD3、CD19、CD20、CD23(也称为FCER2，IgE的受体)、CD24、CD27、CD28、CD38、CD39、CD40、CD70、CD80(也称为B7-1)、CD86(也称为B7-2)、CD122、CD137(也称为41BB)、CD137L、CD152(也称为CTLA4)、CD154(也称为CD40L)、CD160、CD272、CD273(也称为PDL2)、CD274(也称为PDL1)、CD275(也称为B7H2)、CD276(也称为B7H3)、CD278(也称为ICOS)、CD279(也称为PD-1)、CDH1(也称为E-钙粘素)、壳多糖酶、CLEC9、CLEC91、CRTH2、CSF-1(也称为M-CSF)、CSF-2(也称为GM-CSF)、CSF-3(也称为GCSF)、CX3CL1(也称为SCYD1)、CXCL12(也称为SDF1)、CXCL13、CXCR3、DNGR-1、外核苷三磷酸盐二磷酸水解酶1、EGFR、ENTPD1、FCER1A、FCER1、FLAP、FOLH1、Gi24、GITR、GITRL、GM-CSF、Her2、HHLA2、HMGB1、HVEM、ICOSLG、IDO、IFNα、IgE、IGF1R、IL2Rβ、IL1、IL1A、IL1B、IL1F10、IL2、IL4、IL4Ra、IL5、IL5R、IL6、IL7、IL7Ra、IL8、IL9、IL9R、IL10、rhIL10、IL12、IL13、IL13Ra1、IL13Ra2、IL15、IL17、IL17Rb(也已知作为IL25的受体)、IL18、IL22、IL23、IL25、IL27、IL33、IL35、ITGB4(也称为b4整合素)、ITK、KIR、LAG3、LAMP1、瘦素、LPFS2、II类MHC、NCR3LG1、NKG2D、NTPD酶-1、OX40、OX40L、PD-1H、血小板受体、PROM1、S152、SISP1、SLC、SPG64、ST2(也已知作为IL33的受体)、STEAP2、Syk激酶、TACI、TDO、T14、TIGIT、TIM3、TLR、TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、TMEF1、TNFa、TNFRSF7、Tp55、TREM1、TSLP(也已知作为IL7Ra的辅助受体)、TSLPR、TWEAK、VEGF、VISTA、Vstm3、WUCAM和XCR1(也称为GPR5/CCXCR1)。在一些实施方案中，上述抗原靶标的一个或多个是人抗原靶标。
在一个实施方案中，结合蛋白特异性结合至一个或多个肿瘤抗原靶标(例如靶蛋白)。在其他实施方案中，结合蛋白特异性结合至一个或多个肿瘤靶蛋白和一个或多个T细胞上的靶蛋白，包括T细胞受体复合体。这些T细胞衔接体结合蛋白能够瞬时招募T细胞至靶细胞，并同时激活T细胞的细胞裂解活性。T细胞上的靶蛋白的实例包括但不限于CD3和CD28，及其他。此类抗原靶标或靶蛋白的其他实例在上文提供。在一些实施方案中，可通过将两种或更多种单特异性抗体(亲本抗体)的抗原结合域组合于一个抗体内而产生三特异性结合蛋白。在一些实施方案中，本发明的结合蛋白结合如下抗原靶标的一个或多个(例如一个、两个或三个)：CD3、CD19、CD20、CD28、CD38、Her2、LAMP1、IL-4、IL-13和TNFa。
在本发明的一些实施方案中，三价结合蛋白能够结合3个抗原靶标。在本发明的一些实施方案中，三价结合蛋白能够结合3个不同的抗原靶标。在一个实施方案中，结合蛋白是三特异性的且一个轻链-重链对能够结合两个不同的抗原靶标或表位而一个轻链-重链对能够结合一个抗原靶标或表位。在另一个实施方案中，结合蛋白能够结合3个肿瘤抗原靶标。在另一个实施方案中，结合蛋白能够结合3个不同的肿瘤抗原靶标。在其他实施方案中，结合蛋白能够抑制一个或多个抗原靶标的功能。
在一些实施方案中，本发明的结合蛋白结合一个或多个肿瘤靶蛋白。在一些实施方案中，结合蛋白能够特异性结合单个肿瘤靶蛋白上的3个表位。在一些实施方案中，结合蛋白能够特异性结合单个肿瘤靶蛋白上的3个不同表位。在一些实施方案中，结合蛋白能够结合第一肿瘤靶蛋白上的2个不同表位，和第二肿瘤靶蛋白上的1个表位。在一些实施方案中，所述第一和第二肿瘤靶蛋白是不同的。在一些实施方案中，结合蛋白能够特异性结合3个不同的肿瘤靶蛋白。
在一些实施方案中，本发明的结合蛋白结合一个或多个细胞因子靶蛋白。在一些实施方案中，结合蛋白能够特异性结合单个细胞因子靶蛋白上的3个表位。在一些实施方案中，结合蛋白能够特异性结合单个细胞因子靶蛋白上的3个不同表位。在一些实施方案中，结合蛋白能够结合第一细胞因子靶蛋白上的2个不同表位，和第二细胞因子靶蛋白上的1个表位。在一些实施方案中，所述第一和第二细胞因子靶蛋白是不同的。在一些实施方案中，结合蛋白能够特异性结合3个不同的细胞因子靶蛋白。在一些实施方案中，所述一个或多个细胞因子靶蛋白是IL-4、IL-13和/或TNFa的一个或多个。细胞因子靶蛋白的其他实例提供于下文中。
在一些实施方案中，本发明的结合蛋白结合一个或多个肿瘤靶蛋白和一个或多个T细胞靶蛋白。在一些实施方案中，结合蛋白能够特异性结合1个肿瘤靶蛋白和单个T细胞靶蛋白上的2个不同表位。在一些实施方案中，结合蛋白能够特异性结合1个肿瘤靶蛋白和2个不同的T细胞靶蛋白(例如CD28和CD3)。在一些实施方案中，结合蛋白能够特异性结合1个T细胞靶蛋白和单个肿瘤靶蛋白上的2个不同表位。在一些实施方案中，结合蛋白能够特异性结合1个T细胞靶蛋白和2个不同的肿瘤靶蛋白。在一些实施方案中，结合蛋白的第一和第二多肽链形成2个抗原结合位点，其特异性靶向2个T细胞靶蛋白，且结合蛋白的第三和第四多肽链形成特异性结合肿瘤靶蛋白的抗原结合位点。在一些实施方案中，结合蛋白的第一和第二多肽链形成2个抗原结合位点，其特异性靶向2个肿瘤靶蛋白，且结合蛋白的第三和第四多肽链形成特异性结合T细胞靶蛋白的抗原结合位点。在一些实施方案中，所述一个或多个肿瘤靶蛋白是CD3、CD19、CD20、CD28、CD38、Her2、LAMP1、IL-4、IL-13和/或TNFa的一个或多个。在一些实施方案中，所述一个或多个T细胞靶蛋白是CD3和CD28的一个或多个。肿瘤靶蛋白和T细胞靶蛋白的其他实例提供于上文中。
在一些实施方案中，本发明的结合蛋白彼此独立地结合相同的或不同的1、2或3个抗原靶标或靶蛋白，其选自细胞因子靶蛋白、肿瘤靶抗原或肿瘤靶蛋白、T细胞靶蛋白、免疫检验点抑制因子、免疫检验点调节因子、免疫检验点共刺激分子和/或免疫细胞表面上的靶标分子。在一些实施方案中，本发明的结合蛋白是三价但双特异性的，并且能够特异性结合两个相同的抗原靶标或靶蛋白。在一些实施方案中，本发明的结合蛋白能够特异性结合单个细胞因子靶蛋白、肿瘤靶抗原或肿瘤靶蛋白、T细胞靶蛋白、免疫检验点抑制因子、免疫检验点调节因子、免疫检验点共刺激分子和/或免疫细胞表面上的靶标分子上的两个不同表位。此类抗原靶标或靶蛋白的其他实例提供于上文。
本发明的结合蛋白可以用获取自或源自人或非人抗体(包括例如人、鼠、或或人源化抗体)的域或序列来制备。
接头
在一些实施方案中，接头L1、L2、L3和L4长度范围为无氨基酸(长度＝0)至约100个氨基酸，或少于100、50、40、30、20、或15个氨基酸或更少。接头长度还可为10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1个氨基酸。一个结合蛋白中的L1、L2、L3和L4可全都具有相同的氨基酸序列或可具有不同的氨基酸序列。
合适的接头的实例包括单甘氨酸(Gly)残基；二甘氨酸肽(Gly-Gly)：三肽(Gly-Gly-Gly)；具有4个甘氨酸残基的肽(Gly-Gly-Gly-Gly；SEQ ID NO：98)；具有5个甘氨酸残基的肽(Gly-Gly-Gly-Gly-Gly；SEQ ID NO：99)；具有6个甘氨酸残基的肽(Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly；SEQ ID NO：100)；具有7个甘氨酸残基的肽(Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly；SEQ ID NO：101)；具有8个甘氨酸残基的肽(Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly；SEQ IDNO：102)。可使用其他氨基酸残基组合，如肽Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：103)，肽Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：104)，肽Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：105)，和肽Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly(SEQ ID NO：148)。其他合适的肽接头包括单个Ser，和Val残基；二肽Arg-Thr，Gln-Pro，Ser-Ser，Thr-Lys，和Ser-Leu；Thr-Lys-Gly-Pro-Ser(SEQ ID NO：106)，Thr-Val-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO：107)，Gln-Pro-Lys-Ala-Ala(SEQ ID NO：108)，Gln-Arg-Ile-Glu-Gly(SEQ ID NO：109)；Ala-Ser-Thr-Lys-Gly-Pro-Ser(SEQ ID NO：110)，Arg-Thr-Val-Ala-Ala-Pro-Ser(SEQ ID NO：111)，Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO：112)，和His-Ile-Asp-Ser-Pro-Asn-Lys(SEQ ID NO：113)。上文列出的实例不意在以任何方式限制本发明的范围，且已显示了包含选自下组的任选氨基酸的接头适于用于所述结合蛋白：缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，丝氨酸，苏氨酸，赖氨酸，精氨酸，组氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，甘氨酸和脯氨酸。关于接头序列的其他描述，参见例如WO2012135345。
接头中氨基酸残基的身份和序列可以根据在接头中实现所必需的二级结构元件的类型而变化。例如，甘氨酸，丝氨酸和丙氨酸对于具有最大柔性的接头而言是最佳的。如果需要更刚性和延伸的接头，甘氨酸、脯氨酸、苏氨酸和丝氨酸的一些组合是有用的。任何氨基酸残基可考虑作为与其它氨基酸残基组合的接头，以取决于所需的性质根据需要构建较大的肽接头。
在一些实施方案中，L1的长度是L3的长度的至少2倍。在一些实施方案中，L2的长度是L4的长度的至少2倍。在一些实施方案中，L1的长度是L3的长度的至少2倍且L2的长度是L4的长度的至少2倍。在一些实施方案中，L1的长度是3至12个氨基酸残基，L2的长度是3至14个氨基酸残基，L3的长度是1至8个氨基酸残基，且L4的长度是1至3个氨基酸残基。在一些实施方案中，L1的长度是5至10个氨基酸残基，L2的长度是5至8个氨基酸残基，L3的长度是1至5个氨基酸残基，且L4的长度是1至2个氨基酸残基。在一些实施方案中，L1的长度是7个氨基酸残基，L2的长度是5个氨基酸残基，L3的长度是1个氨基酸残基，且L4的长度是2个氨基酸残基。在一些实施方案中，L1的长度是10个氨基酸残基，L2的长度是10个氨基酸残基，L3的长度是0个氨基酸残基，且L4的长度是0个氨基酸残基。在一些实施方案中，L1、L2、L3和L4各自的长度独立选自0至15个氨基酸(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15个氨基酸)，其中所述接头的至少两个的长度为0至15个氨基酸(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15个氨基酸)。在一些实施方案中，L1、L2、L3和L4各自长度为0个氨基酸。
在一些实施方案中，L1、L2、L3和/或L4包含序列Asp-Lys-Thr-His-Thr(SEQ ID NO：525)。在一些实施方案中，L1包含序列Asp-Lys-Thr-His-Thr(SEQ ID NO：525)。在一些实施方案中，L3包含序列Asp-Lys-Thr-His-Thr(SEQ ID NO：525)。
在一些实施方案中，L1、L2、L3和/或L4包含源自抗体可变域和抗体恒定域之间的接点处天然存在的序列(例如WO2012/135345中所述的)。例如，在一些实施方案中，接头包含见于内源性VH和CH1域之间，或内源性VL和CL域(例如人κ或λ)之间的转接处。在一些实施方案中，接头包含见于内源性人VH和CH1域之间，或内源性人VL和CL域(例如人κ或λ)之间的转接处。
在一些实施方案中，L1、L2、L3和/或L4包含序列Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO：175)。在一些实施方案中，L1包含序列Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ IDNO：175)。在一些实施方案中，L1包含序列Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO：175)，L2包含序列Thr-Lys-Gly-Pro-Ser-Arg(SEQ ID NO：176)，L3包含序列Ser，且L4包含序列Arg-Thr。在一些实施方案中，L3包含序列Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO：175)。在一些实施方案中，L1包含序列Ser，L2包含序列Arg-Thr，L3包含序列Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO：175)和L4包含序列Thr-Lys-Gly-Pro-Ser-Arg(SEQ ID NO：176)。
在一些实施方案中，L1、L2、L3和L4各自独立地包含选自(GGGGS)n(其中n是0至5的整数；SEQ ID NO：174)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：104)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：105)、S、RT、TKGPS(SEQ ID NO：106)、GQPKAAP(SEQ ID NO：175)和GGSGSSGSGG(SEQ ID NO：148)的序列。在一些实施方案中，L1包含序列GQPKAAP(SEQ ID NO：175)，L2包含序列TKGPS(SEQ IDNO：106)，L3包含序列S，且L4包含序列RT。在一些实施方案中，L1包含序列GGGGSGGGGS(SEQID NO：104)，L2包含序列GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：104)，L3长度为0个氨基酸，且L4长度为0个氨基酸。在一些实施方案中，L1包含序列GGSGSSGSGG(SEQ ID NO：148)，L2包含序列GGSGSSGSGG(SEQ ID NO：148)，L3长度为0个氨基酸，且L4长度为0个氨基酸。在一些实施方案中，L1包含序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：105)，L2长度为0个氨基酸，L3包含序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：105)，且L4长度为0个氨基酸。在一些实施方案中，L1和L2长度为0个氨基酸，且L3和L4各自包含选自下列的独立选择的序列：(GGGGS)n(其中n是0至5的整数；SEQ ID NO：174)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：104)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：105)、S、RT、TKGPS(SEQ ID NO：106)、GQPKAAP(SEQ ID NO：175)和GGSGSSGSGG(SEQ ID NO：148)。在一些实施方案中，L3和L4长度为0个氨基酸，且L1和L2各自包含选自下列的独立选择的序列：(GGGGS)n(其中n是0至5的整数；SEQ ID NO：174)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：104)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：105)、S、RT、TKGPS(SEQ ID NO：106)、GQPKAAP(SEQ ID NO：175)和GGSGSSGSGG(SEQ ID NO：148)。
Fc区和恒定域
在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含第二多肽链，所述第二多肽链进一步包含连接至CH1的Fc区，所述Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域。在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含第三多肽链，所述第三多肽链进一步包含连接至CH1的Fc区，所述Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域。在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含第二多肽链和第三多肽链，所述第二多肽链进一步包含连接至CH1的Fc区，所述Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域，所述第三多肽链进一步包含连接至CH1的Fc区，所述Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域。
在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包括一个或两个Fc变体。本文所用的术语“Fc变体”是指自天然Fc修饰但还包含针对挽救(salvage)受体，FcRn(新生Fc受体)的结合位点的分子或序列。示例性Fc变体，以及它们与挽救受体的相互作用，是本领域已知的。因此，术语“Fc变体”可以包括自非人天然Fc人源化的分子或序列。此外，天然Fc包含可去除的区域，因为它们提供本发明的抗体样结合蛋白不需要的结构特征或生物活性。因此，术语“Fc变体”包括这样的分子或序列，其中缺少一个或多个天然Fc位点或残基或其中一个或多个Fc位点或残基是修饰的，其影响或涉及：(1)二硫键形成，(2)与选择的宿主细胞不相容，(3)在选择的宿主细胞中表达时的N-末端异质性，(4)糖基化，(5)与补体的相互作用，(6)结合至除挽救受体之外的Fc受体，或(7)抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
为了改进结合蛋白的产量，在一些实施方案中，可通过“杵臼”技术来改造CH3域，所述技术详细描述于一些实例中，例如国际公开No.WO 96/027011，Ridgway等，1996，ProteinEng.9：617-21；和Merchant等，1998，Nat.Biotechnol.16：677-81中。具体地，对两个CH3域的相互作用表面进行改造以增加含有这两个CH3域的两条重链的异二聚体化。(两条重链的)两个CH3域各自可为“杵”，而另一个则为“臼”。导入二硫桥进一步将异二聚体稳定化并增加产量(Merchant等，1998；Atwell等，1997，J.Mol.Biol.270：26-35)。在具体的实施方案中，所述杵在具有单一可变域的第二对多肽上。在其他实施方案中，所述杵在具有交叉取向的第一对多肽上。在另一些实施方案中，CH3域不包含杵臼。
在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含第二多肽链上的“杵”突变和第三多肽链上的“臼”突变。在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含第三多肽链上的“杵”突变和第二多肽链上的“臼”突变。在一些实施方案中，所述“杵”突变在对应于人IgG1或IgG4的位置354和/或366的位置处包含取代，所述位置根据EU索引。在一些实施方案中，所述氨基酸取代为S354C、T366W、T366Y、S354C和T366W或S354C和T366Y。在一些实施方案中，所述“杵”突变在对应于人IgG1或IgG4的位置354和366的位置处包含取代，所述位置根据EU索引。在一些实施方案中，所述氨基酸取代为S354C和T366W。在一些实施方案中，所述“臼”突变在对应于人IgG1或IgG4的位置407和任选地349、366和/或368的位置处包含取代，所述位置根据EU索引。在一些实施方案中，所述氨基酸取代为Y407V或Y407T，和任选地Y349C、T366S和/或L368A。在一些实施方案中，所述“臼”突变在对应于人IgG1或IgG4的位置349、366、368和407的位置处包含取代，其根据EU索引。在一些实施方案中，所述氨基酸取代是Y349C、T366S、L368A和Y407V。
在一些实施方案中，所述第二多肽链还包含连接至CH1的第一Fc区，所述第一Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域，其中第一Fc区在对应于人IgG1或IgG4的位置366和任选地354的位置处包含氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为T366W或T366Y和任选地S354C；且其中所述第三多肽链还包含连接至CH1的第二Fc区，所述第二Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域，其中所述第二Fc区在对应于人IgG1或IgG4的位置407和任选地349、366和/或368的位置处包含氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为Y407V或Y407T及任选地Y349C、T366S和/或L368A。
在一些实施方案中，所述第二多肽链还包含连接至CH1的第一Fc区，所述第一Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域，其中第一Fc区在对应于人IgG1或IgG4的位置407和任选地349、366和/或368的位置处包含氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为Y407V或Y407T及任选地Y349C、T366S和/或L368A；且其中所述第三多肽链还包含连接至CH1的第二Fc区，所述第二Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域，其中所述第二Fc区在对应于人IgG1或IgG4的位置366和任选地354的位置处包含氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为T366W或T366Y及任选地S354C。
在一些实施方案中，所述第二多肽链还包含连接至CH1的第一Fc区，所述第一Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域，其中第一Fc区在对应于人IgG1或IgG4的位置366的位置处包含氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为T366W；且其中所述第三多肽链还包含连接至CH1的第二Fc区，所述第二Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域，其中所述第二Fc区在对应于人IgG1或IgG4的位置366、368和/或407的位置处包含氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为T366S、L368A和/或Y407V。
在一些实施方案中，所述第二多肽链还包含连接至CH1的第一Fc区，所述第一Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域，其中第一Fc区在对应于人IgG1或IgG4的位置366、368和/或407的位置处包含氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为T366S、L368A和/或Y407V；且其中所述第三多肽链还包含连接至CH1的第二Fc区，所述第二Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域，其中所述第二Fc区在对应于人IgG1或IgG4的位置366的位置处包含氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为T366W。
在一些实施方案中，所述第二多肽链还包含连接至CH1的第一Fc区，所述第一Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域，其中所述第一Fc区包含与人IgG1或IgG4的位置354和366对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为S354C和T366W；且其中所述第三多肽链还包含连接至CH1的第二Fc区，所述第二Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域，其中所述第二Fc区在对应于人IgG1或IgG4的位置349、366、368和407的位置处包含氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为Y349C、T366S、L368A和Y407V。在一些实施方案中，所述第二多肽链还包含连接至CH1的第一Fc区，所述第一Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫蛋白重链恒定域，其中所述第一Fc区包含与人IgG1或IgG4的位置349、366、368和407对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为Y349C、T366S、L368A和Y407V；且其中所述第三多肽链还包含连接至CH1的第二Fc区，所述第二Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域，其中所述第二Fc区在对应于人IgG1或IgG4的位置354和366的位置处包含氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为S354C和T366W。在一些实施方案中，所述第一和/或第二Fc区为人IgG1 Fc区。在一些实施方案中，所述第一和/或第二Fc区为人IgG4Fc区。
在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含一个或多个改进血清半衰期的突变(参见例如Hinton，P.R等(2006)J.Immunol.176(1)：346-56)。在一些实施方案中，所述突变包括对应于人IgG1或IgG4的位置428和434的位置处的取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为M428L和N434S。在一些实施方案中，结合蛋白包含第二多肽链和第三多肽链，所述第二多肽链进一步包含连接至CH1的第一Fc区，所述第一Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域，所述第三多肽链进一步包含连接至CH1的第二Fc区，所述第二Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域，其中所述第一和/或第二Fc区包含与人IgG1或IgG4的位置428和434对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为M428L和N434S。在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含杵和臼突变及一个或多个改进血清半衰期的突变。在一些实施方案中，所述第一和/或第二Fc区是人IgG1 Fc区。在一些实施方案中，所述第一和/或第二Fc区是人IgG4Fc区。
在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含一个或多个改进稳定性的突变，例如IgG4的铰链区和/或二聚体接合点的突变(参见例如Spiess，C等(2013)J.Biol.Chem.288：26583-26593)。在一些实施方案中，所述突变包含对应于人IgG4的位置228和409的位置处的取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为S228P和R409K。在一些实施方案中，所述结合蛋白包含第二多肽链和第三多肽链，所述第二多肽链进一步包含连接至CH1的第一Fc区，所述第一Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域，所述第三多肽链进一步包含连接至CH1的第二Fc区，所述第二Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域；其中所述第一和第二Fc区是人IgG4Fc区；且其中所述第一和第二Fc区各自包含与人IgG4的位置228和409对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为S228P和R409K。在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含杵和臼突变及一个或多个改进稳定性的突变。在一些实施方案中，所述第一和/或第二Fc区是人IgG4 Fc区。
在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含一个或多个改进纯化的突变，例如通过调节针对纯化试剂的亲和力。例如，已知异二聚化结合蛋白可以从其同二聚化形式选择性地纯化出来，如果该异二聚化形式的两个Fc区含有降低或消除对蛋白A的结合的突变的话，这是由于与任一同二聚化形式相比，异二聚化形式会针对基于蛋白A的纯化具有中等的亲和力，并能从蛋白A选择性洗脱，例如通过使用不同的pH(参见例如Smith，E.J.等(2015)Sci.Rep.5：17943)。在一些实施方案中，所述突变包含与人IgG1或IgG4的位置435和436对于的位置处的取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为H435R和Y436F。在一些实施方案中，结合蛋白包含第二多肽链和第三多肽链，所述第二多肽链进一步包含连接至CH1的第一Fc区，所述第一Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域，所述第三多肽链进一步包含连接至CH1的第二Fc区，所述第二Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域；且其中第一和第二Fc区仅有一个在对应于人IgG1或IgG4的位置435和436的位置处包含氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为H435R和Y436F。在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含杵和臼突变及一个或多个改进纯化的突变。在一些实施方案中，所述第一和/或第二Fc区是人IgG1 Fc区。在一些实施方案中，所述第一和/或第二Fc区是人IgG4 Fc区。
在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含一个或多个降低效应功能的突变，例如Fc受体介导的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、补体依赖性细胞毒性作用(CDC)和/或抗体依赖性细胞毒性作用(ADCC)。在一些实施方案中，所述第二多肽链还包含连接至CH1的第一Fc区，所述第一Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域；其中所述第三多肽链还包含连接至CH1的第二Fc区，所述第二Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域；其中所述第一和第二Fc区是人IgG1 Fc区；且其中所述第一和第二Fc区各自包含对应于人IgG1的位置234和235的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为L234A和L235A。在一些实施方案中，所述第二和第三多肽链的Fc区是人IgG1 Fc区，且其中所述Fc区各自包含对应于人IgG1的位置234和235的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为L234A和L235A。在一些实施方案中，所述第二多肽链还包含连接至CH1的第一Fc区，所述第一Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域；其中所述第三多肽链还包含连接至CH1的第二Fc区，所述第二Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域；其中所述第一和第二Fc区是人IgG1 Fc区；且其中所述第一和第二Fc区各自包含对应于人IgG1的位置234、235、329的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为L234A、L235A和P329A。在一些实施方案中，所述第二和第三多肽链的Fc区是人IgG1 Fc区，且其中所述Fc各自包含对应于人IgG1的位置234、235和329的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为L234A、L235A和P329A。在一些实施方案中，所述突变包含对应于人IgG4的位置234和235的位置处的取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为F234A和L235A。在一些实施方案中，所述结合蛋白包含第二多肽链和第三多肽链，所述第二多肽链进一步包含连接至CH1的第一Fc区，所述第一Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域，所述第三多肽链进一步包含连接至CH1的第二Fc区，所述第二Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域；且其中所述第一和第二Fc区各自包含与人IgG4的位置234和235对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为F234A和L235A。在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含杵和臼突变及一个或多个降低效应功能的突变。在一些实施方案中，所述第一和/或第二Fc区是人IgG1 Fc区。在一些实施方案中，所述第一和/或第二Fc区是人IgG4 Fc区。关于位置329处的Fc突变的进一步描述，参见例如Shields，R.L等(2001)J.Biol.Chem.276：6591-6604和WO1999051642。
在一些实施方案中，前文所述的突变类型可以任何顺序或组合进行组合。例如，本发明的结合蛋白可包含两个或更多个“杵”和“臼”突变，一个或多个改进血清半衰期的突变，一个或多个改进IgG4稳定性的突变，一个或多个改进纯化的突变，和/或一个或多个降低效应功能的突变，如上文所述。
在一些实施方案中，本发明的结合蛋白包含：包含λCL域的第一多肽链；包含对应于人IgG1的位置354和366的位置处的氨基酸取代的第二多肽链的CH3域，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为S354C和T366W；包含对应于人IgG1的位置349、366、368、407、435和436的位置处的氨基酸取代的第三多肽链的CH3域，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为Y349C、T366S、L368A、Y407V、H435R和Y436F；和包含κCL域的第四多肽链。在一些实施方案中，所述第一多肽链包含λCL域；其中所述第三多肽链的CH3域在对应于人IgG1的位置354和366的位置处包含氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为S354C和T366W；其中所述第二多肽链的CH3域在对应于人IgG1的位置349、366、368、407、435和436的位置处包含氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为Y349C、T366S、L368A、Y407V、H435R和Y436F；且其中所述第四多肽链包含κCL域。在一些实施方案中，所述第一多肽链包含λCL域；其中所述第二多肽链的CH3域在对应于人IgG1的位置354、366、435和436的位置处包含氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为S354C、T366W、H435R和Y436F；其中所述第三多肽链的CH3域在对应于人IgG1的位置349、366、368和407的位置处包含氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为Y349C、T366S、L368A和Y407V；且其中第四多肽链包含κCL域。在一些实施方案中，所述第一多肽链包含κCL域；其中所述第二多肽链的CH3域在对应于人IgG1的位置354和366的位置处包含氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为S354C和T366W；其中所述第三多肽链的CH3域在对应于人的位置349、366、368、407、435和436的位置处包含氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为Y349C、T366S、L368A、Y407V、H435R和Y436F；且其中第四多肽链包含λCL域。
在一些实施方案中，本发明的结合蛋白通过蛋白A亲和色谱、κ轻链亲和色谱(例如使用KappaSelect树脂根据制造商的说明进行；GE Healthcare)和任选地λ轻链亲和色谱(例如使用LambdaFabSelect树脂根据制造商的说明进行；GE Healthcare)加以纯化。在一些实施方案中，本发明的结合蛋白通过蛋白A亲和色谱、λ轻链亲和色谱(例如使用LambdaFabSelect树脂根据制造商的说明进行；GE Healthcare)和任选地κ轻链亲和色谱(例如使用KappaSelect树脂根据制造商的说明进行；GE Healthcare)加以纯化。在一些实施方案中，结合蛋白包含两个Fc区，其各自包含CH3域，且所述CH3域仅有一个在对应于人IgG1或IgG4的位置435和436的位置处包含氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为H435R和Y436F。在一些实施方案中，本发明的结合蛋白通过按顺序为蛋白A亲和色谱，然后是κ轻链亲和色谱(例如使用KappaSelect树脂根据制造商的说明进行；GEHealthcare)，然后是任选的λ轻链亲和色谱(例如使用LambdaFabSelect树脂根据制造商的说明进行；GE Healthcare)加以纯化。在一些实施方案中，本发明的结合蛋白通过按顺序为蛋白A亲和色谱，然后是λ轻链亲和色谱(例如使用LambdaFabSelect树脂根据制造商的说明进行；GE Healthcare)，然后是任选的κ轻链亲和色谱(例如使用KappaSelect树脂根据制造商的说明进行；GE Healthcare)加以纯化。例如在一些实施方案中，将结合蛋白与蛋白A接触，并在适于从包含0或2个含H435R和Y436F氨基酸取代的CH3域的结合蛋白分离出该结合蛋白的条件下从蛋白A洗脱，将结合蛋白与κ轻链亲和介质(例如KappaSelect树脂中所用的；GE Healthcare)接触，并在适于从仅包含λCL域的结合蛋白分离出该结合蛋白的条件下从κ轻链亲和介质洗脱(例如根据制造商的说明书)。适于蛋白A洗脱的条件是本领域已知的，包括但不限于从pH4.5-2.8逐步洗脱梯度。在一些实施方案中，采用可用于蛋白质纯化的蛋白A或蛋白A变体。在一些实施方案中，将所述蛋白A附接于基质或树脂，例如作为层析介质的一部分。在一些实施方案中，在从κ轻链亲和介质洗脱后，将所述结合蛋白与λ轻链亲和介质(例如LambdaFabSelect树脂中所用的；GE Healthcare)接触，并在适于从仅包含κCL域的结合蛋白分离出该结合蛋白的条件下从λ轻链亲和介质洗脱(例如根据制造商的说明书)。在一些实施方案中，用HIC色谱来检测本发明的结合蛋白。在一些实施方案中，所述结合蛋白包含：包含λCL域的第一多肽链；在对应于人IgG1或IgG4的位置354和366的位置处包含氨基酸取代的第二多肽链的CH3域，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为S354C和T366W；在对应于人IgG1或IgG4的位置349、366、368、407、435和436的位置处包含氨基酸取代的第三多肽链的CH3域，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为Y349C、T366S、L368A、Y407V、H435R和Y436F；和包含κCL域的第四多肽链。在一些实施方案中，结合蛋白通过宿主细胞产生。在一些实施方案中，结合蛋白纯化自细胞培养介质或宿主细胞提取物。在一些实施方案中，结合蛋白通过宿主细胞分泌或产生和提取自宿主细胞(例如在与蛋白A接触之前)。在一些实施方案中，当与蛋白A接触时，结合蛋白处于细胞培养介质或宿主细胞提取物中。在一些实施方案中，将结合蛋白从其他结合蛋白、多肽和/或其他细胞组分中纯化。
在一些实施方案中，本文所述三特异性结合蛋白的CH1、CH2、CH3和CL可为结合蛋白1-53的任何CH1、CH2、CH3和CL序列。
核酸
采用标准重组DNA方法来构建编码形成所述结合蛋白的多肽的多核苷酸，将这些多核苷酸掺入重组表达载体中，并将这类载体导入宿主细胞中。参见例如Sambrook等，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第三版)。酶促反应和纯化技术可按照生产商的说明书、按本领域通常实现的或按本文描述的进行。除提供特定的定义外，与本文所述分析化学、合成有机化学及医学和制药化学的实验室程序和技术联用的术语是本领域熟知和常用的术语。类似地，常规技术可用于化学合成、化学分析、药物制备、制剂化、递送和患者治疗。
本发明的其他态样涉及分离的核酸分子，其包含编码本文所述任何结合多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述分离核酸可操作地连接至异源性启动子以指导编码结合蛋白的核酸序列的转录。启动子可指指导核酸转录的核酸控制序列。当第一核酸序列置于与第二核酸序列的功能性联系中时，则第一核酸序列可操作地连接至第二核酸序列。例如，如果启动子影响该编码序列的转录或表达，则所述启动子可操作地连接至结合蛋白的编码序列。启动子的实例包括但不限于获取自病毒基因组的启动子(如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒、猿猴病毒40(SV40)等等)，来自异源真核启动子(如肌动蛋白启动子、免疫球蛋白启动子、来自热休克启动子，等等)，CAG-启动子(Niwa等，Gene 108(2)：193-9，1991)，磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子，四环素诱导型启动子(Masui等，Nucleic Acids Res.33：e43，2005)，lac系统，trp系统，tac系统，trc系统，噬菌体λ的主要操纵子和启动子区，3-磷酸甘油酸激酶的启动子，酵母酸性磷酸酶的启动子，和酵母α-交配因子的启动子。编码本发明结合蛋白的多核苷酸可以受到如下启动子的控制：组成型启动子、诱导型启动子、或本文描述的任何其他合适的启动子或本领域技术人员容易公认的其他合适的启动子。
在一些实施方案中，分离核酸被掺入至载体中。在一些实施方案中，所述载体是表达载体。表达载体可包括一个或多个可操作地连接至待表达多核苷酸的调控序列。术语“调控序列”包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如多腺苷酸化信号)。合适的增强子的实例包括但不限于来自哺乳动物基因(例如球蛋白，弹性蛋白酶，白蛋白，甲胎蛋白(α-fetoprotein)，胰岛素等)的增强子序列，以及来自真核细胞病毒的增强子序列(如位于复制起点的晚期侧(1ate side)的SV40增强子(bp 100-270)，巨细胞病毒早期启动子增强子，如位于复制起点的晚期侧的多瘤病毒增强子，腺病毒增强子等)。合适的载体的实例可包括例如质粒、粘粒、附加体、转座子和病毒载体(例如腺病毒，牛痘病毒，辛德毕斯病毒(Sindbis-viral)，麻疹病毒，疱疹病毒，慢病毒，逆转录病毒，腺相关病毒载体等)。表达载体可用于转染宿主细胞，如例如细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。能在宿主中表达和复制的生物功能性病毒和质粒DNA载体是本领域已知的，并能用于转染任何目的细胞。
本发明的其他态样涉及包含一个或多个载体的载体系统，其编码本文所述的任意结合蛋白的第一、第二、第三和第四多肽链。在一些实施方案中，所述载体系统包含编码结合蛋白的第一多肽链的第一载体，编码结合蛋白的第二多肽链的第二载体，编码结合蛋白的第三多肽链的第三载体，和编码结合蛋白的第四多肽链的第四载体。在一些实施方案中，载体系统包含编码结合蛋白的第一和第二多肽链的第一载体，以及编码结合蛋白的第三和第四多肽链的第二载体。在一些实施方案中，载体系统包含编码结合蛋白的第一和第三多肽链的第一载体，以及编码结合蛋白的第二和第四多肽链的第二载体。在一些实施方案中，载体系统包含编码结合蛋白的第一和第四多肽链的第一载体，以及编码结合蛋白的第二和第三多肽链的第二载体。在一些实施方案中，载体系统包含编码结合蛋白的第一、第二、第三和第四多肽链的第一载体。载体系统的一个或多个载体可为本文所述的任何载体。在一些实施方案中，所述一个或多个载体是表达载体。
分离的宿主细胞
本发明的其他态样涉及包含一个或多个本文所述分离的多核苷酸、载体和/或载体系统的分离的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是细菌细胞(例如大肠杆菌(E.coli)细胞)。在一些实施方案中，宿主细胞是酵母细胞(例如酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞)。在一些实施方案中，宿主细胞是昆虫细胞。昆虫细胞的实例可以包括例如果蝇(Drosophila)细胞(例如S2细胞)，粉纹夜蛾(Trichoplusiani)细胞(例如High FiveTM细胞)，和草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞(例如Sf21或Sf9细胞)。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。哺乳动物宿主细胞的实例可包括例如人胚肾细胞(例如293或用于悬浮培养生长的293细胞亚纯系)，Expi293TM细胞，CHO细胞，幼仓鼠肾细胞(例如BHK，ATCC CCL 10)，小鼠sertoli细胞(例如TM4细胞)，猴肾细胞(例如CV1 ATCC CCL 70)，非洲绿猴肾细胞(例如VERO-76，ATCC CRL-1587)，人宫颈癌细胞(例如HELA，ATCC CCL 2)，犬肾细胞(例如MDCK，ATCC CCL 34)，布法罗大鼠肝细胞(例如BRL 3A，ATCC CRL 1442)，人肺细胞(例如W138，ATCC CCL 75)，人肝细胞(例如Hep G2，HB 8065)，小鼠乳腺肿瘤细胞(例如MMT 060562，ATCC CCL51)，TRI细胞，MRC 5细胞，FS4细胞，人肝细胞瘤细胞系(例如HepG2)，及骨髓瘤细胞(例如NS0和Sp2/0细胞)。
本发明的其他态样涉及生产本文所述的任何结合蛋白的方法。在一些实施方案中，所述方法包括a)在适合宿主细胞表达所述结合蛋白的条件下培养包含分离核酸、载体和/或载体系统(例如本文所述的任何分离核酸、载体和/或载体系统)的宿主细胞(例如本文所述的任何宿主细胞)；和b)从宿主细胞分离所述结合蛋白。在表达蛋白的条件下培养宿主细胞的方法是本领域普通技术人员已知的。从培养的宿主细胞分离蛋白的方法是本领域普通技术人员已知的，其包括例如通过亲和色谱(例如两步亲和色谱法，其包括蛋白A亲和色谱，然后是大小排阻色谱)进行。
结合蛋白的用途
所述结合蛋白可应用于任何已知的测定方法，如竞争性结合测定法、直接和间接夹心测定法和用于一种或多种靶抗原的检测和定量的免疫沉淀测定法。所述结合蛋白以适于所应用的测定方法的亲和力结合一个或多个靶抗原。
对于诊断应用，在一些实施方案中，可用可检测模块来标记结合蛋白。可检测模块可为能够直接或间接产生可检测信号的任一种。例如，可检测模块可为放射性同位素，如3H、14C、32p、35S、125I、99Tc、111In、或67Ga；荧光或化学发光化合物，如异硫氰酸荧光素、罗丹明、或荧光素；或酶，如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、或辣根过氧化物酶。
所述结合蛋白还可用于体内成像。可将用可检测模块标记的结合蛋白施用于动物，优选为施用至血液中，并测定宿主中带标记的抗体的存在和定位。可用动物中(无论是通过核磁共振、放射学、或本领域所知的其他方法)可检测的任何模块来标记结合蛋白。
结合蛋白还能用于细胞活化，肿瘤靶向，细胞因子活性的中和，病毒感染的中和，多重信号传导事件的组合，以治疗癌症，关节炎和/或炎症性疾病。例如在一些实施方案中，结合蛋白特异性结合一个、两个或三个选自下组的抗原靶标：A2AR、APRIL、ATPD酶、BAFF、BAFFR、BCMA、BlyS、BTK、BTLA、B7DC、B7H1、B7H4(也称为VTCN1)、B7H5、B7H6、B7H7、B7RP1、B7-4、C3、C5、CCL2(也称为MCP-1)、CCL3(也称为MIP-1a)、CCL4(也称为MIP-1b)、CCL5(也称为RANTES)、CCL7(也称为MCP-3)、CCL8(也称为mcp-2)、CCL11(也称为嗜酸性粒细胞趋化因子)、CCL15(也称为MIP-1d)、CCL17(也称为TARC)、CCL19(也称为MIP-3b)、CCL20(也称为MIP-3a)、CCL21(也称为MIP-2)、CCL24(也称为MPIF-2/嗜酸性粒细胞趋化因子-2)、CCL25(也称为TECK)、CCL26(也称为嗜酸性粒细胞趋化因子-3)、CCR3、CCR4、CD3、CD19、CD20、CD23(也称为FCER2，IgE的受体)、CD24、CD27、CD28、CD38、CD39、CD40、CD70、CD80(也称为B7-1)、CD86(也称为B7-2)、CD122、CD137(也称为41BB)、CD137L、CD152(也称为CTLA4)、CD154(也称为CD40L)、CD160、CD272、CD273(也称为PDL2)、CD274(也称为PDL1)、CD275(也称为B7H2)、CD276(也称为B7H3)、CD278(也称为ICOS)、CD279(也称为PD-1)、CDH1(也称为E-钙粘素)、壳多糖酶、CLEC9、CLEC91、CRTH2、CSF-1(也称为M-CSF)、CSF-2(也称为GM-CSF)、CSF-3(也称为GCSF)、CX3CL1(也称为SCYD1)、CXCL12(也称为SDF1)、CXCL13、CXCR3、DNGR-1、外核苷三磷酸盐二磷酸水解酶1、EGFR、ENTPD1、FCER1A、FCER1、FLAP、FOLH1、Gi24、GITR、GITRL、GM-CSF、Her2、HHLA2、HMGB1、HVEM、ICOSLG、IDO、IFNα、IgE、IGF1R、IL2Rβ、IL1、IL1A、IL1B、IL1F10、IL2、IL4、IL4Ra、IL5、IL5R、IL6、IL7、IL7Ra、IL8、IL9、IL9R、IL10、rhIL10、IL12、IL13、IL13Ra1、IL13Ra2、IL15、IL17、IL17Rb(也已知作为IL25的受体)、IL18、IL22、IL23、IL25、IL27、IL33、IL35、ITGB4(也称为b4整合素)、ITK、KIR、LAG3、LAMP1、瘦素、LPFS2、II类MHC、NCR3LG1、NKG2D、NTPD酶-1、OX40、OX40L、PD-1H、血小板受体、PROM1、S152、SISP1、SLC、SPG64、ST2(也已知作为IL33的受体)、STEAP2、Syk激酶、TACI、TDO、T14、TIGIT、TIM3、TLR、TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、TMEF1、TNFa、TNFRSF7、Tp55、TREM1、TSLP(也已知作为IL7Ra的辅助受体)、TSLPR、TWEAK、VEGF、VISTA、Vstm3、WUCAM和XCR1(也称为GPR5/CCXCR1)。在一些实施方案中，上述抗原靶标的一个或多个是人抗原靶标。
在一些实施方案中，将本发明的结合蛋白施用于对其有需要的患者，用于治疗或预防癌症。例如，在一些实施方案中，结合蛋白包含一个特异性结合T细胞表面蛋白的抗原结合位点和另一个特异性结合肿瘤靶蛋白的抗原结合位点(例如特异性结合T细胞表明蛋白的2个抗原结合位点和1个特异性结合肿瘤靶蛋白的抗原结合位点，或2个特异性结合肿瘤靶蛋白的抗原结合位点和1个特异性结合T细胞表面蛋白的抗原结合位点)。在一些实施方案中，结合蛋白包含特异性结合CD3的抗原结合位点、特异性结合CD28的抗原结合位点和特异性结选自下组的肿瘤靶蛋白的抗原结合位点：CD19、CD20、CD38、Her2和LAMP1。在一些实施方案中，所述结合蛋白与化疗剂共同施用。在一些实施方案中，所述患者是人。
在一些实施方案中，将本发明的结合蛋白施用于对其有需要的患者，用于治疗或预防炎性疾病或病症。在一些实施方案中，所述结合蛋白包含3个抗原结合位点，其各自特异性结合选自IL-4、IL-13和TNFa的细胞因子靶蛋白。在一些实施方案中，所述结合蛋白与抗炎剂共同施用。在一些实施方案中，所述患者是人。
本发明还涉及包含结合蛋白和其他试剂的套组，其可用于检测生物样品中的靶抗原水平。此类试剂包括可检测标记、封闭血清、阳性和阴性对照样品、以及检测试剂。在一些实施方案中，套组包含组合物，所述组合物包含本文所述的任何结合蛋白、多核苷酸、载体、载体系统和/或宿主细胞。在一些实施方案中，套组包含容器及标签或包装插页，其位于所述容器上或与容器相连。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、IV溶液袋等。所述容器可由多种材料形成，如玻璃或塑料。所述容器盛有组合物，所述组合物是单独的或与另一组合物组合，其对于治疗、预防和/或诊断病况是有效的，并且所述容器可以具有无菌入口(例如所述容器可以是静脉内溶液袋或小瓶，其具有可由皮下注射针刺穿的塞子)。在一些实施方案中，所述标签或包装插页指示了该组合物用于预防、诊断和/或治疗优选的病况。或者或此外，制品或套组还可包含第二(或第三)容器，其包含药学上可接受的缓冲剂，如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、Ringer′s溶液和右旋糖溶液。其还可包括从商业和用户角度所需的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、滤器、针和注射器。
结合蛋白治疗组合物及其施用
包含结合蛋白的治疗性组合物或药物组合物在本发明的范围内。此类治疗性组合物或药物组合物可包含治疗有效量的结合蛋白、或结合蛋白-药物缀合物，与药学上或生理学上可接受的制剂(其根据与施用模式的适应性而选出)混合。
可接受的配制材料优选为在所采用的剂量和浓度处对受试者是非毒性的。
所述药物组合物可含有用于改变、维持、或保留组合物的例如pH、渗透压(osmolarity)、粘度、澄清度、颜色、等张性、气味、无菌度、稳定度、溶解或释放速率、吸收、或渗透的制剂材料。合适的制剂材料包括但不限于氨基酸(例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)、抗微生物剂、抗氧化剂(例如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)、缓冲剂(例如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其它有机酸)、填充剂(例如甘露糖醇或甘氨酸)、螯合剂(例如乙二胺四乙酸(EDTA))、络合剂(例如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)、填料、单糖、二糖和其它碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖或糊精)、蛋白质(例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)、着色剂、矫味剂和稀释剂、乳化剂、亲水聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮)、低分子量多肽、成盐平衡离子(例如钠)、防腐剂(例如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)、溶剂(例如甘油、丙二醇或聚乙二醇)、糖醇(例如甘露醇或山梨醇)、悬浮剂、表面活性剂或润湿剂(例如普朗尼克类(pluronics)、PEG、山梨聚糖酯类(sorbitan esters)、聚山梨醇酯类如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80、Triton(曲拉通)、氨丁三醇、卵磷脂、胆固醇或Tyloxapal(四丁酚醛))、稳定增强剂(如蔗糖或山梨醇)、张度增强剂(例如碱金属卤化物(优选为氯化钠或氯化钾)或甘露醇山梨醇)、递送介质、稀释剂、赋形剂和/或药学佐剂(参见例如REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES (第18版，A.R.Gennaro编，Mack Publishing Company 1990)和其后续版本，通过提述并入本文用于任何目的)。
根据例如意欲的施用途径、递送形式和所需剂量，技术人员可确定最适药物组合物。所述组合物可影响结合蛋白的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。
药物组合物中主要的介质或载剂在性质上可为水性的或非水的。例如，合适的注射用介质或载剂可为水、生理盐水溶液或人工脑脊液，可能补充有用于胃肠外施用的组合物中常见的其它物质。中性缓冲的盐水或与血清白蛋白混合的盐水是其它的示例性介质。其它示例性的药物组合物包含约pH7.0-8.5的Tris缓冲液，或约pH 4.0-5.5的乙酸盐缓冲液，其还可包括山梨醇或合适的代替物。在本发明的一个实施方案中，可通过将所选的具有所需纯度的组合物与任选的配制剂混合，来制备呈冻干饼或水溶液形式的结合蛋白组合物用于储存。另外，可使用合适的赋形剂(例如蔗糖)，将结合蛋白配置为冻干物。
可选择本发明的药物组合物用于胃肠外递送或皮下使用。或者，组合物可选择用于吸入或用于通过消化道递送，例如口服。这类药学上可接受的组合物的制备属本领域的技术范围内。
制剂组分以施用部位可接受的浓度存在。例如，使用缓冲剂使组合物保持在生理pH或在略微较低的pH，通常在约5至约8的pH范围。
当考虑胃肠外施用时，用于本发明的治疗组合物可呈无热原、胃肠外可接受的水溶液形式，其包含药学上可接受的介质中的所需结合蛋白。用于胃肠外注射的特别合适的介质是无菌蒸馏水，其中结合蛋白被配制为适当防腐的无菌等渗溶液。另一种制备物可涉及所需分子与制剂的配制物，所述制剂例如可注射微球、生物可侵蚀粒子、聚合化合物(例如聚乳酸或聚乙醇酸)、小珠或脂质体，其提供产品的控释或缓释，然后产品通过积存注射(depot injection)递送。还可使用透明质酸，其可具有促进维持循环中的持续时间的作用。用于引入所需分子的其它合适方法包括可植入药物递送装置。
在一个实施方案中，药物组合物可配制来用于吸入。例如，结合蛋白可配制成干粉剂用于吸入。结合蛋白吸入溶液还可与推进剂(propellant)配制在一起用于气雾剂递送。在又一个实施方案中，可使溶液雾化。
还考虑某些配制物可口服施用。在本发明的一个实施方案中，以这种方式施用的结合蛋白可与或不与常用于固体剂型(例如片剂和胶囊剂)混配的那些载剂配制在一起。例如，胶囊剂可设计成在胃肠道某点上释放制剂的活性部分，此时生物利用度被最大化且内吸收前降解被最小化。可包括其它作用剂以促进结合蛋白的吸收。还可使用稀释剂、矫味剂、低熔点蜡、植物油、润滑剂、悬浮剂、片剂崩解剂和粘合剂。
另一种药物组合物可涉及与适于制造片剂的无毒赋形剂混合的有效量的结合蛋白。可通过将片剂溶于无菌水或另一种合适的介质来制备呈单位剂型的溶液剂。合适的赋形剂包括但不限于惰性稀释剂，例如碳酸钙、碳酸钠或碳酸氢钠、乳糖或磷酸钙；或粘合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯胶；或润滑剂例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。
本发明的其它药物组合物对本领域技术人员而言会是显然的，包括这样的配制物，所述配制物涉及呈缓释或控释配制物的结合蛋白。用于配制各种其它缓释或控释方法的技术，例如脂质体载体、生物可蚀解微粒或多孔珠粒和积存注射，也是本领域技术人员已知的。缓释配制物的其它实例包括呈成型制品形式的半渗透聚合物基质，例如膜或微囊。缓释基质可包括聚酯、水凝胶、聚乳酸、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸的共聚物、聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)、乙烯乙酸乙烯酯或聚-D(-)-3-羟基丁酸。缓释组合物还可包括脂质体，其可通过本领域已知的几种方法中的任一种制备。
用于体内施用的本发明的药物组合物通常必须是无菌的。这可通过经无菌滤膜过滤实现。当组合物是冻干的时，采用该方法的灭菌可在冻干和复溶之前或之后进行。用于胃肠外施用的组合物可以冻干形式保存或在溶液中保存。另外，通常将胃肠外组合物装入具有无菌入口的容器中，例如静脉内溶液袋或小瓶，其具有可通过皮下注射针刺穿的塞子。
一旦药物组合物制成，便可将其作为溶液、悬液、凝胶、乳液、固体或作为脱水或冻干粉剂储存在无菌小瓶中。这类制剂可以即用形式或以需要在施用前复溶的形式(例如冻干)储存。
本发明还包括用于产生单剂施用单位的套组。套组可各含有具有干燥蛋白质的第一容器和具有含水制剂的第二容器。含有单室和多室预填药注射器(例如液体注射器和Lyosyringes)的套组也包括在本发明的范围内。
待治疗性应用的结合蛋白药物组合物的有效量取决于例如治疗背景和目的。本领域的技术人员会了解，用于治疗的合适剂量水平会因此部分地根据所递送的分子、使用结合蛋白所针对的适应症、施用途径和患者尺寸(体重、体表面或器官大小)和状况(年龄和一般健康状况)而变化。因此，临床医师可滴定剂量和修改施用途径以获得最佳治疗效果。
施用频率会取决于待使用制剂中的结合蛋白的药代动力学参数。通常，临床医师会施用组合物直至达到获得所需效果的剂量。组合物因此可如下施用：作为单剂、随时间推移作为两剂或更多剂(其可含或不含相同量的所需分子)或作为经植入装置或导管的连续输注。适当剂量的进一步改进按常规由本领域普通技术人员进行，这属□他们常规进行的任务的范围内。合适的剂量可通过利用合适的剂量-响应数据来确定。
药物组合物的施用途径遵循已知方法，例如口服；通过经由静脉内、腹膜内、大脑内(实质内)、脑室内、肌内、眼内、动脉内、门静脉内(intraportal)或病灶内途径的注射；通过缓释系统；或通过植入装置。需要时，通过推注或通过连续输注或通过植入装置施用组合物。
还可通过植入其中已吸附或包封所需分子的膜、海绵或其它合适的材料，来局部施用组合物。在使用植入装置时，可将装置植入任何合适的组织或器官中，并且所需分子的递送可以是通过扩散、定时释放推注或连续施用。
在一些实施方案中，本发明涉及预防和/或治疗患者中的增生性疾病或病症(例如癌症)的方法。在一些实施方案中，所述方法包括对该患者施用治疗有效量的本文所述结合蛋白的至少一种。在一些实施方案中，所述患者是人。在一些实施方案中，所述至少一种结合蛋白与抗癌治疗(例如本领域已知的任何抗癌治疗)组合施用。在一些实施方案中，所述至少一种结合蛋白在一种或多种抗癌治疗之前施用。在一些实施方案中，所述至少一种结合蛋白与一种或多种抗癌治疗同时施用。在一些实施方案中，所述至少一种结合蛋白在一种或多种抗癌治疗之后施用。
在一些实施方案中，本发明涉及预防和/或治疗炎性疾病或病症(例如癌症)的方法。在一些实施方案中，所述方法包括对患者施用治疗有效量的本文所述结合蛋白的至少一种。在一些实施方案中，所述患者是人。在一些实施方案中，所述至少一种结合蛋白与抗炎治疗(例如本领域已知的任何抗炎治疗)组合施用。在一些实施方案中，所述至少一种结合蛋白在一种或多种抗炎治疗之前施用。在一些实施方案中，所述至少一种结合蛋白与一种或多种抗炎治疗同时施用。在一些实施方案中，所述至少一种结合蛋白在一种或多种抗炎治疗之后施用。
在不限制本发明的前提下，下文描述了一些本发明的实施方案用于说明目的。
项1：一种结合蛋白，其包含形成3个抗原结合位点的4条多肽链，所述3个抗原结合位点特异性结合一个或多个靶蛋白，其中第一多肽链包含如下式表示的结构：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽链包含如下式表示的结构：
VH1-L3-VH2-L4-CH1 [II]
且第三多肽链包含如下式表示的结构：
VH3-CH1 [III]
且第四多肽链包含如下式表示的结构：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变域；
VL3是第三免疫球蛋白轻链可变域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变域；
VH3是第三免疫球蛋白重链可变域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定域；且
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
且其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对。
项2：一种结合蛋白，其包含形成3个抗原结合位点的4条多肽链，所述3个抗原结合位点特异性结合一个或多个靶蛋白，其中第一多肽链包含如下式表示的结构：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽链包含如下式表示的结构：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-铰链-CH2-CH3 [II]
且第三多肽链包含如下式表示的结构：
VH3-CH1-铰链-CH2-CH3 [III]
且第四多肽链包含如下式表示的结构：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变域；
VL3是第三免疫球蛋白轻链可变域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变域；
VH3是第三免疫球蛋白重链可变域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定域；
CH2是免疫球蛋白CH2重链恒定域；
CH3是免疫球蛋白CH3重链恒定域；
铰链是连接CH1和CH2域的免疫球蛋白铰链区；且
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
且其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对。
项3：项1的结合蛋白，其中所述第二和/或第三多肽链还包含连接至CH1的Fc区，所述Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域。
项4：项1-3任一项的结合蛋白，其中L1、L2、L3、或L4的至少一个独立地长度为0个氨基酸。
项5：项1-3任一项的结合蛋白，其中L1、L2、L3、或L4各自独立地长度为至少1个氨基酸。
项6：项1-3任一项的结合蛋白，其中(a)L1、L2、L3和L4各自独立地长度为0个氨基酸或包含选自由下列组成的组的序列：GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：104)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQID NO：105)、S、RT、TKGPS(SEQ ID NO：106)、GQPKAAP(SEQ ID NO：175)和GGSGSSGSGG(SEQID NO：148)：或(b)L1、L2、L3、或L4各自独立地包含选自由下列组成的组的序列：GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：104)，GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：105)，S，RT，TKGPS(SEQ ID NO：106)，GQPKAAP(SEQ ID NO：175)，和GGSGSSGSGG(SEQ ID NO：148)。
项7：项1-5任一项的结合蛋白，其中
(a)L1包含序列GQPKAAP(SEQ ID NO：175)，L2包含序列TKGPS(SEQ ID NO：106)，L3包含序列S，且L4包含序列RT；
(b)L1包含序列GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：104)，L2包含序列GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：104)，L3长度为0个氨基酸，且L4长度为0个氨基酸；
(c)L1包含序列GGSGSSGSGG(SEQ ID NO：148)，L2包含序列GGSGSSGSGG(SEQ ID NO：148)，L3长度为0个氨基酸，且L4长度为0个氨基酸；或
(d)L1包含序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：105)，L2长度为0个氨基酸，L3包含序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：105)，且L4长度为0个氨基酸。
项8：项1-7任一项的结合蛋白，其中所述结合蛋白是三特异性的且能够特异性结合3个不同的抗原靶标。
项9：权利要求1-8任一项的结合蛋白，其中所述结合蛋白特异性结合3个靶蛋白，所述靶蛋白对应于T细胞上的2个靶蛋白以及1个肿瘤靶蛋白。
项10：项9的结合蛋白，其中T细胞上的所述靶蛋白之一是CD3。
项11：项9或项10的结合蛋白，其中T细胞上的所述靶蛋白之一是CD28。
项12：项9-11任一项的结合蛋白，其中所述肿瘤靶蛋白是CD38。
项13：项1-8任一项的结合蛋白，其中所述结合蛋白特异性结合3个靶蛋白，所述靶蛋白对应于T细胞上的2个靶蛋白以及1个选自下组的靶蛋白：A2AR、APRIL、ATPD酶、BAFF、BAFFR、BCMA、BlyS、BTK、BTLA、B7DC、B7H1、B7H4、B7H5、B7H6、B7H7、B7RP1、B7-4、C3、C5、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL15、CCL17、CCL19、CCL20、CCL21、CCL24、CCL25、CCL26、CCR3、CCR4、CD3、CD19、CD20、CD23、CD24、CD27、CD28、CD38、CD39、CD40、CD70、CD80、CD86、CD122、CD137、CD137L、CD152、CD154、CD160、CD272、CD273、CD274、CD275、CD276、CD278、CD279、CDH1、壳多糖酶、CLEC9、CLEC91、CRTH2、CSF-1、CSF-2、CSF-3、CX3CL1、CXCL12、CXCL13、CXCR3、DNGR-1、外核苷三磷酸盐二磷酸水解酶1、EGFR、ENTPD1、FCER1A、FCER1、FLAP、FOLH1、Gi24、GITR、GITRL、GM-CSF、Her2、HHLA2、HMGB1、HVEM、ICOSLG、IDO、IFNα、IgE、IGF1R、IL2Rβ、IL1、IL1A、IL1B、IL1F10、IL2、IL4、IL4Ra、IL5、IL5R、IL6、IL7、IL7Ra、IL8、IL9、IL9R、IL10、rhIL10、IL12、IL13、IL13Ra1、IL13Ra2、IL15、IL17、IL17Rb、IL18、IL22、IL23、IL25、IL27、IL33、IL35、ITGB4、ITK、KIR、LAG3、LAMP1、瘦素、LPFS2、II类MHC、NCR3LG1、NKG2D、NTPD酶-1、OX40、OX40L、PD-1H、血小板受体、PROM1、S152、SISP1、SLC、SPG64、ST2、STEAP2、Syk激酶、TACI、TDO、T14、TIGIT、TIM3、TLR、TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、TMEF1、TNFa、TNFRSF7、Tp55、TREM1、TSLP、TSLPR、TWEAK、VEGF、VISTA、Vstm3、WUCAM和XCR1。
项14：项1-13任一项的结合蛋白，其中所述结合蛋白能够抑制一个或多个靶蛋白的功能。
项15：项14的结合蛋白，其中所述一个或多个靶蛋白选自由下列组成的组：A2AR、APRIL、ATPD酶、BAFF、BAFFR、BCMA、BlyS、BTK、BTLA、B7DC、B7H1、B7H4、B7H5、B7H6、B7H7、B7RP1、B7-4、C3、C5、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL15、CCL17、CCL19、CCL20、CCL21、CCL24、CCL25、CCL26、CCR3、CCR4、CD3、CD19、CD20、CD23、CD24、CD27、CD28、CD38、CD39、CD40、CD70、CD80、CD86、CD122、CD137、CD137L、CD152、CD154、CD160、CD272、CD273、CD274、CD275、CD276、CD278、CD279、CDH1、壳多糖酶、CLEC9、CLEC91、CRTH2、CSF-1、CSF-2、CSF-3、CX3CL1、CXCL12、CXCL13、CXCR3、DNGR-1、外核苷三磷酸盐二磷酸水解酶1、EGFR、ENTPD1、FCER1A、FCER1、FLAP、FOLH1、Gi24、GITR、GITRL、GM-CSF、Her2、HHLA2、HMGB1、HVEM、ICOSLG、IDO、IFNα、IgE、IGF1R、IL2Rβ、IL1、IL1A、IL1B、IL1F10、IL2、IL4、IL4Ra、IL5、IL5R、IL6、IL7、IL7Ra、IL8、IL9、IL9R、IL10、rhIL10、IL12、IL13、IL13Ra1、IL13Ra2、IL15、IL17、IL17Rb、IL18、IL22、IL23、IL25、IL27、IL33、IL35、ITGB4、ITK、KIR、LAG3、LAMP1、瘦素、LPFS2、II类MHC、NCR3LG1、NKG2D、NTPD酶-1、OX40、OX40L、PD-1H、血小板受体、PROM1、S152、SISP1、SLC、SPG64、ST2、STEAP2、Syk激酶、TACI、TDO、T14、TIGIT、TIM3、TLR、TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、TMEF1、TNFa、TNFRSF7、Tp55、TREM1、TSLP、TSLPR、TWEAK、VEGF、VISTA、Vstm3、WUCAM和XCR1。
项16：一种结合蛋白，其包含形成3个抗原结合位点的4条多肽链，其中第一多肽链包含如下式表示的结构：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽链包含如下式表示的结构：
VH1-L3-VH2-L4-CH1 [II]
且第三多肽链包含如下式表示的结构：
VH3-CH1 [III]
且第四多肽链包含如下式表示的结构：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变域；
VL3是第三免疫球蛋白轻链可变域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变域；
VH3是第三免疫球蛋白重链可变域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定域；且
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对；
其中：
(a)VL1、VL2和VL3各自独立地包含如SEQ ID NO：151、153、155、157、159、161、163、165和167任一项所示的可变域序列；或
(b)VL1、VL2和VL3各自独立地包含轻链互补决定区，其包含如SEQ ID NO：43-59、123-125、138-140和149任一项所示的氨基酸序列；且
其中：
(a)VH1、VH2和VH3各自独立地包含如SEQ ID NO：150、152、154、156、158、160、162、164和166的任一项所示的可变域序列；或
(b)VH1、VH2和VH3各自独立地包含重链互补决定区，其包含如SEQ ID NO：25-42、120-122和126-128任一项所示的氨基酸序列。
项17：一种结合蛋白，其包含形成3个抗原结合位点的4条多肽链，其中第一多肽链包含如下式表示的结构：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽链包含如下式表示的结构：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-铰链-CH2-CH3 [II]
且第三多肽链包含如下式表示的结构：
VH3-CH1-铰链-CH2-CH3 [III]
且第四多肽链包含如下式表示的结构：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变域；
VL3是第三免疫球蛋白轻链可变域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变域；
VH3是第三免疫球蛋白重链可变域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定域；
CH2是免疫球蛋白CH2重链恒定域；
CH3是免疫球蛋白CH3重链恒定域；
铰链是连接CH1和CH2域的免疫球蛋白铰链区；且
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
且其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对；
其中：
(a)VL1、VL2和VL3各自独立地包含如SEQ ID NO：151、153、155、157、159、161、163、165和167任一项所示的可变域序列；或
(b)VL1、VL2和VL3各自独立地包含轻链互补决定区，其包含如SEQ ID NO：43-59、123-125、138-140和149任一项所示的氨基酸序列；且
其中：
(a)VH1、VH2和VH3各自独立地包含如SEQ ID NO：150、152、154、156、158、160、162、164和166的任一项所示的可变域序列；或
(b)VH1、VH2和VH3各自独立地包含重链互补决定区，其包含如SEQ ID NO：25-42、120-122和126-128任一项所示的氨基酸序列。
项18：项16的结合蛋白，其中所述第二和/或第三多肽链还包含连接至Cm的Fc区，所述Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域。
项19：项16-18任一项的结合蛋白，其中L1、L2、L3、或L4的至少一个独立地长度为0个氨基酸。
项20：项16-18任一项的结合蛋白，其中L1、L2、L3、或L4各自独立地长度为至少1个氨基酸。
项21：项16-18和20任一项的结合蛋白，其中L1、L2、L3、或L4各自独立地包含选自由下列组成的组的序列：(a)L1、L2、L3和L4各自独立地长度为0个氨基酸或包含选自由下列组成的组的序列：GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：104)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：105)、S、RT、TKGPS(SEQ ID NO：106)、GQPKAAP(SEQ ID NO：175)和GGSGSSGSGG(SEQ ID NO：148)；或(b)GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：104)，GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：105)，S，RT，TKGPS(SEQ IDNO：106)，GQPKAAP(SEQ ID NO：175)，和GGSGSSGSGG(SEQ ID NO：148)。
项22：项16-20任一项结合蛋白，其中
(a)L1包含序列GQPKAAP(SEQ ID NO：175)，L2包含序列TKGPS(SEQ ID NO：106)，L3包含序列S，且L4包含序列RT；
(b)L1包含序列GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：104)，L2包含序列GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：104)，L3长度为0个氨基酸，且L4长度为0个氨基酸；
(c)L1包含序列GGSGSSGSGG(SEQ ID NO：148)，L2包含序列GGSGSSGSGG(SEQ ID NO：148)，L3长度为0个氨基酸，且L4长度为0个氨基酸；或
(d)L1包含序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：105)，L2长度为0个氨基酸，L3包含序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：105)，且L4长度为0个氨基酸。
项23：项16-22任一项的结合蛋白，其中：
(a)VH1包含：包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：47的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：48的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQID NO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ IDNO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQID NO：26的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列的CDR-L3；
(b)VH1包含：包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQID NO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ IDNO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQID NO：26的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列的CDR-L3；
(c)VH1包含：包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：47的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：48的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQID NO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ IDNO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQID NO：38的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：55的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：56的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：57的氨基酸序列的CDR-L3；
(d)VH1包含：含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ IDNO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ IDNO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQID NO：38的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：55的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：56的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：57的氨基酸序列的CDR-L3；
(e)VH1包含：包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：48的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ IDNO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：58的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：59的氨基酸序列的CDR-L3；
(f)VH1包含：含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ IDNO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ IDNO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQID NO：41的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：58的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：59的氨基酸序列的CDR-L3；
(g)VH1包含；包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：47的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：48的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQID NO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ IDNO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：126的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：127的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：128的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：138的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：139的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：140的氨基酸序列的CDR-L3；
(h)VH1包含：含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ IDNO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ IDNO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：126的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：127的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：128的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：138的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：139的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：140的氨基酸序列的CDR-L3；
(i)VH1包含：包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：47的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：48的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQID NO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ IDNO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：120的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：121的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：122的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：123的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：124的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：125的氨基酸序列的CDR-L3；或
(j)VH1包含：含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ IDNO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ IDNO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：120的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：121的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：122的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：123的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：124的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：125的氨基酸序列的CDR-L3。
项24：一种结合蛋白，其包含形成3个抗原结合位点的4条多肽链，其中第一多肽链包含如下式表示的结构：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽链包含如下式表示的结构：
VH1-L3-VH2-L4-CH1 [II]
且第三多肽链包含如下式表示的结构：
VH3-CH1 [III]
且第四多肽链包含如下式表示的结构：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变域；
VL3是第三免疫球蛋白轻链可变域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变域；
VH3是第三免疫球蛋白重链可变域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定域；且
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对；
其中：
(a)VL1、VL2和VL3各自独立地包含如SEQ ID NO：169、171和173任一项所示的可变域序列；或
(b)VL1、VL2和VL3各自独立地包含轻链互补决定区，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：141-147、178和179；
其中：
(a)VH1、VH2和VH3各自独立地包含如SEQ ID NO：168、170和172的任一项所示的可变域序列；或
(b)VH1、VH2和VH3各自独立地包含重链互补决定区，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：129-137。
项25：一种结合蛋白，其包含形成3个抗原结合位点的4条多肽链，其中第一多肽链包含如下式表示的结构：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽链包含如下式表示的结构：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-铰链-CH2-CH3 [II]
且第三多肽链包含如下式表示的结构：
VH3-CH1-铰链-CH2-CH3 [III]
且第四多肽链包含如下式表示的结构：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变域；
VL3是第三免疫球蛋白轻链可变域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变域；
VH3是第三免疫球蛋白重链可变域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定域；
CH2是免疫球蛋白CH2重链恒定域；
CH3是免疫球蛋白CH3重链恒定域；
铰链是连接CH1和CH2域的免疫球蛋白铰链区；且
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
且其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对；
其中：
(a)VL1、VL2和VL3各自独立地包含如SEQ ID NO：169、171和173任一项所示的可变域序列；或
(b)VL1、VL2和VL3各自独立地包含轻链互补决定区，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：141-147、178和179；
其中：
(a)VH1、VH2和VH3各自独立地包含如SEQ ID NO：168、170和172的任一项所示的可变域序列；或
(b)VH1、VH2和VH3各自独立地包含重链互补决定区，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：129-137。
项26：项24的结合蛋白，其中第二和/或第三多肽链还包含连接至CH1的Fc区，所述Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域。
项27：项24-26任一项的结合蛋白，其中L1、L2、L3和L4的至少一个独立地长度为0个氨基酸。
项28.项24-26任一项的结合蛋白，其中L1、L2、L3和L4各自独立地长度为至少1个氨基酸。
项29.项24-26和28任一项的结合蛋白，其中(a)L1、L2、L3和L4各自独立地长度为0个氨基酸或包含选自由下列组成的组的序列：GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：104)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：105)、S、RT、TKGPS(SEQ ID NO：106)、GQPKAAP(SEQ ID NO：175)和GGSGSSGSGG(SEQ ID NO：148)；或(b)L1、L2、L3和L4各自独立地包含选自由下列组成的组的序列：GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：104)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：105)、S、RT、TKGPS(SEQ ID NO：106)、GQPKAAP(SEQ ID NO：175)和GGSGSSGSGG(SEQ ID NO：148)。
项30.项24-28任一项的结合蛋白，其中：
(a)L1包含序列GQPKAAP(SEQ ID NO：175)，L2包含序列TKGPS(SEQ ID NO：106)，L3包含序列S，且L4包含序列RT；
(b)L1包含序列GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：104)，L2包含序列GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：104)，L3长度为0个氨基酸，且L4长度为0个氨基酸；
(c)L1包含序列GGSGSSGSGG(SEQ ID NO：148)，L2包含序列GGSGSSGSGG(SEQ ID NO：148)，L3长度为0个氨基酸，且L4长度为0个氨基酸；或
(d)L1包含序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：105)，L2长度为0个氨基酸，L3包含序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：105)，且L4长度为0个氨基酸。
项31.项24-30任一项的结合蛋白，其中：
(a)VH1包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：129的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：130的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：131的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：141的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：178的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：142的氨基酸序列的CDR-L3；
(b)VH1包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：47的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：129的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：130的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：131的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：141的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：178的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：142的氨基酸序列的CDR-L3：
(c)VH1包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：129的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQID NO：130的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：131的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：141的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：178的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：142的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3：
(d)VH1包含：包含SEQ ID NO：129的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：130的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：131的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：141的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：178的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：142的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；
(e)VH1包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：129的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQID NO：130的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：131的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：141的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：178的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：142的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3：
(f)VH1包含：包含SEQ ID NO：129的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：130的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：131的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：141的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：178的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：142的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDRR-L3；
(g)VH1包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；
(h)VH1包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDRR-L3：
(i)VH1包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；或
(j)VH1包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3。
项32：项1、3-16、18-24和26-31任一项的结合蛋白，其中所述第二多肽链还包含连接至CH1的第一Fc区，所述第一Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域，其中所述第一Fc区包含与人IgG1或IgG4的位置354和366对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为S354C和T366W；且其中所述第三多肽链还包含连接至CH1的第二Fc区，所述第二Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域，其中所述第二Fc区包含与人IgG1或IgG4的位置349、366、368和407对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为Y349C、T366S、L368A和Y407V。
项33：项1、3-16、18-24和26-31任一项的结合蛋白，其中所述第二多肽链还包含连接至CH1的第一Fc区，所述第一Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域，其中所述第一Fc区包含与人IgG1或IgG4的位置349、366、368和407对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为Y349C、T366S、L368A和Y407V；且其中所述第三多肽链还包含连接至CH1的第二Fc区，所述第二Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域，其中所述第二Fc区包含与人IgG1或IgG4的位置354和366对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为S354C和T366W。
项34：项1、3-16、18-24和26-33任一项的结合蛋白，其中所述第二多肽链还包含连接至CH1的第一Fc区，所述第一Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域，且其中所述第三多肽链还包含连接至CH1的第二Fc区，所述第二Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域；其中所述第一和第二Fc区包含与人IgG1或IgG4的位置428和434对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为M428L和N434S。
项35：项2、4-15、17、19-23、25和27-31任一项的结合蛋白，其中所述第二多肽链的CH3域包含与人IgG1或IgG4的位置354和366对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为S354C和T366W；且其中所述第三多肽链的CH3域包含与人IgG1或IgG4的位置349、366、368和407对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为Y349C、T366S、L368A和Y407V。
项36：项2、4-15、17、19-23、25和27-31任一项的结合蛋白，其中所述第二多肽链的CH3域包含与人IgG1或IgG4的位置349、366、368和407对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为Y349C、T366S、L368A和Y407V；且其中所述第三多肽链的CH3域包含与人IgG1或IgG4的位置354和366对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为S354C和T366W。
项37：项2、4-15、17、19-23、25、27-31、35和36任一项的结合蛋白，其中所述第二和第三多肽链二者的CH3域均包含与人IgG1或IgG4的位置428和434对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为M428L和N434S。
项38：项1、3-16、18-24和26-34任一项的结合蛋白，其中所述第二多肽链还包含连接至CH1的第一Fc区，所述第一Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域；其中所述第三多肽链还包含连接至CH1的第二Fc区，所述第二Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域；其中所述第一和第二Fc区为人IgG1或IgG4Fc区；且其中所述第一和第二Fc区中仅有一个包含与人IgG1或IgG4的位置435和436对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为H435R和Y436F。
项39：项2、4-15、17、19-23、25、27-31和35-37任一项的结合蛋白，其中所述第二和第三多肽链的CH3域是人IgG1或IgG4 CH3域，且其中所述CH3域中仅一项包含与人IgG1或IgG4的位置435和436对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为H435R和Y436F。
项40：项1、3-16、18-24、26-34和38任一项的结合蛋白，其中所述第二多肽链还包含连接至CH1的第一Fc区，所述第一Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域；其中所述第三多肽链还包含连接至CH1的第二Fc区，所述第二Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域；其中所述第一和第二Fc区是人IgG4 Fc区；且其中第一和第二Fc区各自包含与人IgG4的位置228和409对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为S228P和R409K。
项41：项2、4-15、17、19-23、25、27-31、35-37和39任一项的结合蛋白，其中所述第二和第三多肽链的CH3域是人IgG4 CH3域，且其中所述CH3域各自包含与人IgG4的位置228和409对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为S228P和R409K。
项42：项1、3-16、18-24、26-34、38和40任一项的结合蛋白，其中所述第二多肽链还包含连接至CH1的第一Fc区，所述第一Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域；其中所述第三多肽链还包含连接至CH1的第二Fc区，所述第二Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域；其中所述第一和第二Fc区是人IgG4 Fc区；且其中所述第一和第二Fc区各自包含与人IgG4的位置234和235对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为F234A和L235A。
项43：项2、4-15、17、19-23、25、27-31、35-37、39和41任一项的结合蛋白，其中所述第二和第三多肽链的CH3域是人IgG4 CH3域，且其中所述CH3域各自包含与人IgG4的位置234和235对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为F234A和L235A。
项44：项1、3-16、18-24、26-34、38和40任一项的结合蛋白，其中所述第二多肽链还包含连接至CH1的第一Fc区，所述第一Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域；其中所述第三多肽链还包含连接至CH1的第二Fc区，所述第二Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域；其中所述第一和第二Fc区是人IgG1 Fc区；且其中所述第一和第二Fc区各自包含与人IgG4的位置234和235对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为L234A和L235A。
项45：项2、4-15、17、19-23、25、27-31、35-37、39和41任一项的结合蛋白，其中所述第二和第三多肽链的CH3域是人IgG1CH3域，且其中所述CH3域各自包含与人IgG4的位置234和235对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为L234A和L235A。
项46：项2、4-15、17、19-23、25、27-31、35-37、39、41、43和45任一项的结合蛋白，其中VH1和VL1形成特异性结合的人CD3的第一抗原结合位点，其中VH2和VL2形成特异性结合人CD28的第二抗原结合位点，且其中VH3和VL3形成特异性结合人肿瘤靶蛋白的第三抗原结合位点。
项47：项2、4-15、17、19-23、25、27-31、35-37、39、41、43和45任一项的结合蛋白，其中VH1和VL1形成特异性结合人CD28的第一抗原结合位点，其中VH2和VL2形成特异性结合人CD3的第二抗原结合位点，且其中VH3和VL3形成特异性结合人肿瘤靶蛋白的第三抗原结合位点。
项48：项46或项47的结合蛋白，其中所述第三抗原结合位点特异性结合选自下组的人肿瘤靶蛋白：CD19、CD20、CD38、Her2和LAMP1。
项49：项46-48任一项的结合蛋白，其中所述特异性结合CD3的抗原结合位点包含：
(a)包含SEQ ID NO：152的氨基酸序列的重链可变域和包含SEQ ID NO：153的氨基酸序列的轻链可变域；或
(b)包含SEQ ID NO：154的氨基酸序列的重链可变域和包含SEQ ID NO：155的氨基酸序列的轻链可变域。
项50：项46-49任一项的结合蛋白，其中所述特异性结合CD28的抗原结合位点包含：
(a)包含SEQ ID NO：160的氨基酸序列的重链可变域和包含SEQ ID NO：161的氨基酸序列的轻链可变域；或
(b)包含SEQ ID NO：162的氨基酸序列的重链可变域和包含SEQ ID NO：163的氨基酸序列的轻链可变域。
项51：项46-50任一项的结合蛋白，其中所述特异性结合肿瘤靶蛋白的抗原结合位点包含：
(a)包含SEQ ID NO：156的氨基酸序列的重链可变域和包含SEQ ID NO：157的氨基酸序列的轻链可变域；
(b)包含SEQ ID NO：158的氨基酸序列的重链可变域和包含SEQ ID NO：159的氨基酸序列的轻链可变域；
(c)包含SEQ ID NO：164的氨基酸序列的重链可变域和包含SEQ ID NO：165的氨基酸序列的轻链可变域；
(d)包含SEQ ID NO：150的氨基酸序列的重链可变域和包含SEQ ID NO：151的氨基酸序列的轻链可变域；或
(e)包含SEQ ID NO：166的氨基酸序列的重链可变域和包含SEQ ID NO：167的氨基酸序列的轻链可变域。
项52：项2、17、35-37、39、41、43和45任一项的结合蛋白，其中：
(a)VH1和VL1形成特异性结合人TNFa的第一抗原结合位点，VH2和VL2形成特异性结合人IL13的第二抗原结合位点，且VH3和VL3形成特异性结合人IL4的第三抗原结合位点；
(b)VH1和VL1形成特异性结合人TNFa的第一抗原结合位点，VH2和VL2形成特异性结合人IL4的第二抗原结合位点，且VH3和VL3形成特异性结合人IL13的第三抗原结合位点；
(c)VH1和VL1形成特异性结合人IL4的第一抗原结合位点，VH2和VL2形成特异性结合人TNFa的第二抗原结合位点，且VH3和VL3形成特异性结合人IL13的第三抗原结合位点；
(d)VH1和VL1形成特异性结合人IL4的第一抗原结合位点，VH2和VL2形成特异性结合人IL13的第二抗原结合位点，且VH3和VL3形成特异性结合人TNFa的第三抗原结合位点；
(e)VH1和VL1形成特异性结合人IL13的第一抗原结合位点，VH2和VL2形成特异性结合人IL4的第二抗原结合位点，且VH3和VL3形成特异性结合人TNFa的第三抗原结合位点；或
(f)VH1和VL1形成特异性结合人IL13的第一抗原结合位点，VH2和VL2形成特异性结合人TNFa的第二抗原结合位点，且VH3和VL3形成特异性结合人IL4的第三抗原结合位点。
项53：项52的结合蛋白，其中所述特异性结合人TNFa的抗原结合位点包含重链可变域和轻链可变域，所述重链可变域包含SEQ ID NO：168的氨基酸序列，所述轻链可变域包含SEQ ID NO：169的氨基酸序列。
项54：项52或项53的结合蛋白，其中所述特异性结合人IL4的抗原结合位点包含重链可变域和轻链可变域，所述重链可变域包含SEQ ID NO：170的氨基酸序列，所述轻链可变域包含SEQ ID NO：171的氨基酸序列。
项55：项52-54任一项的结合蛋白，其中所述特异性结合人IL13的抗原结合位点包含重链可变域和轻链可变域，所述重链可变域包含SEQ ID NO：172的氨基酸序列，所述轻链可变域包含SEQ ID NO：173的氨基酸序列。
项56：项1-55任一项的结合蛋白，其中：
(a)所述第一多肽链的CL域是人κCL域，且所述第四多肽链的CL域是人λCL域；或
(b)所述第一多肽链的CL域是人λCL域，且所述第四多肽链的CL域是人κCL域。
项57：项2、17、25、35-37、39、41和43-55任一项的结合蛋白，其中所述第一多肽链包含λCL域；其中所述第二多肽链的CH3域包含与人IgG1的位置354和366对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为S354C和T366W；其中所述第三多肽链的CH3域包含与人IgG1的位置349、366、368、407、435和436对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为Y349C、T366S、L368A、Y407V、H435R和Y436F；且其中第四多肽链包含κCL域。
项58：一种结合蛋白，其包含第一多肽链、第二多肽链、第三多肽链和第四多肽链，其中：
(a)所述第一多肽链包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列或与SEQ ID NO：4的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列或与SEQID NO：3的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列或与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或与SEQ ID NO：2的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；
(b)所述第一多肽链包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列或与SEQ ID NO：10的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列或与SEQID NO：9的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列或与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或与SEQ ID NO：2的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；
(c)所述第一多肽链包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列或与SEQ ID NO：4的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列或与SEQID NO：3的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列或与SEQ ID NO：13的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列或与SEQ ID NO：14的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；
(d)所述第一多肽链包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列或与SEQ ID NO：10的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列或与SEQID NO：9的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列或与SEQ ID NO：13的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列或与SEQ ID NO：14的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；
(e)所述第一多肽链包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列或与SEQ ID NO：4的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列或与SEQID NO：3的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列或与SEQ ID NO：17的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列或与SEQ ID NO：18的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；
(f)所述第一多肽链包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列或与SEQ ID NO：10的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列或与SEQID NO：9的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列或与SEQ ID NO：17的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列或与SEQ ID NO：18的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；
(g)所述第一多肽链包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列或与SEQ ID NO：4的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列或与SEQID NO：3的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列或与SEQ ID NO：21的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列或与SEQ ID NO：22的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；
(h)所述第一多肽链包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列或与SEQ ID NO：10的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列或与SEQID NO：9的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列或与SEQ ID NO：21的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列或与SEQ ID NO：22的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；
(i)所述第一多肽链包含SEQ ID NO：63的氨基酸序列或与SEQ ID NO：63的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：62的氨基酸序列或与SEQ ID NO：62的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：60的氨基酸序列或与SEQ ID NO：60的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：61的氨基酸序列或与SEQ ID NO：61的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；
(j)所述第一多肽链包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列或与SEQ ID NO：69的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列或与SEQ ID NO：68的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：60的氨基酸序列或与SEQ ID NO：60的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：61的氨基酸序列或与SEQ ID NO：61的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；
(k)所述第一多肽链包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列或与SEQ ID NO：69的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列或与SEQ ID NO：68的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：60的氨基酸序列或与SEQ ID NO：60的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：71的氨基酸序列或与SEQ ID NO：71的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；
(1)所述第一多肽链包含SEQ ID NO：76的氨基酸序列或与SEQ ID NO：76的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：75的氨基酸序列或与SEQ ID NO：75的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列或与SEQ ID NO：73的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：74的氨基酸序列或与SEQ ID NO：74的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；
(m)所述第一多肽链包含SEQ ID NO：82的氨基酸序列或与SEQ ID NO：82的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：81的氨基酸序列或与SEQ ID NO：81的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列或与SEQ ID NO：73的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：74的氨基酸序列或与SEQ ID NO：74的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；
(n)所述第一多肽链包含SEQ ID NO：88的氨基酸序列或与SEQ ID NO：88的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：87的氨基酸序列或与SEQ ID NO：87的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：85的氨基酸序列或与SEQ ID NO：85的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：86的氨基酸序列或与SEQ ID NO：86的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；
(o)所述第一多肽链包含SEQ ID NO：94的氨基酸序列或与SEQ ID NO：94的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：93的氨基酸序列或与SEQ ID NO：93的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：85的氨基酸序列或与SEQ ID NO：85的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：86的氨基酸序列或与SEQ ID NO：86的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；
(p)所述第一多肽链包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列或与SEQ ID NO：69的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列或与SEQ ID NO：68的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列或与SEQ ID NO：73的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：74的氨基酸序列或与SEQ ID NO：74的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；
(q)所述第一多肽链包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列或与SEQ ID NO：69的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列或与SEQ ID NO：68的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：85的氨基酸序列或与SEQ ID NO：85的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：86的氨基酸序列或与SEQ ID NO：86的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；
(r)所述第一多肽链包含SEQ ID NO：63的氨基酸序列或与SEQ ID NO：63的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：62的氨基酸序列或与SEQ ID NO：62的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列或与SEQ ID NO：73的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：74的氨基酸序列或与SEQ ID NO：74的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；
(s)所述第一多肽链包含SEQ ID NO：63的氨基酸序列或与SEQ ID NO：63的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：62的氨基酸序列或与SEQ ID NO：62的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：85的氨基酸序列或与SEQ ID NO：85的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：86的氨基酸序列或与SEQ ID NO：86的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；
(t)所述第一多肽链包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列或与SEQ ID NO：4的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列或与SEQID NO：3的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：114的氨基酸序列或与SEQ ID NO：114的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：115的氨基酸序列或与SEQ ID NO：115的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；或
(u)所述第一多肽链包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列或与SEQ ID NO：10的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列或与SEQID NO：9的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO：114的氨基酸序列或与SEQ ID NO：114的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO：115的氨基酸序列或与SEQ ID NO：115的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列。
项59：一种分离的核酸分子，其包含编码项1-58任一项的结合蛋白的核苷酸序列。
项60：一种表达载体，其包含项59的核酸分子。
项61：一种分离的宿主细胞，其包含项59的核酸分子。
项62：一种分离的宿主细胞，其包含项60的表达载体。
项63：项61或项62的分离的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞或昆虫细胞。
项64：一种药物组合物，其包含项1-58任一项的结合蛋白及药学上可接受的载剂。
项65：一种在患者中预防和/或治疗癌症的方法，包括对所述患者施用治疗有效量的项1-23和32-58任一项的至少一个结合蛋白或项64的药物组合物。
项66：项65的方法，其中所述结合蛋白包含一个特异性结合T细胞表面蛋白的抗原结合位点和另一个特异性结合肿瘤靶蛋白的抗原结合位点。
项67：项66的方法，其中所述结合蛋白包含特异性结合CD3的第一抗原结合位点，特异性结合CD28的第二抗原结合位点，和特异性结合选自下组的肿瘤靶蛋白第三抗原结合位点：CD19、CD20、CD38、Her2和LAMP1。
项68：项65-67任一项的方法，其中所述至少一个结合蛋白与化疗剂共同施用。
项69：一种在患者中预防和/或治疗炎性疾病或病症的方法，包括对所述患者施用治疗有效量的项1-15、24-45和52-58任一项的至少一个结合蛋白或项64的药物组合物。
项70：项69的方法，其中所述结合蛋白包含3个抗原结合位点，其各自特异性结合选自下组的细胞因子靶蛋白：IL-4、IL-13和TNFa。
项71：项69或项70的方法，其中所述至少一个结合蛋白与抗炎剂共同施用。
项72：项65-71任一项的方法，其中所述患者是人。
项73：项65或项69的方法，其中所述结合蛋白能够抑制一个或多个选自下组的靶蛋白的功能：A2AR、APRIL、ATPD酶、BAFF、BAFFR、BCMA、BlyS、BTK、BTLA、B7DC、B7H1、B7H4、B7H5、B7H6、B7H7、B7RP1、B7-4、C3、C5、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL15、CCL17、CCL19、CCL20、CCL21、CCL24、CCL25、CCL26、CCR3、CCR4、CD3、CD19、CD20、CD23、CD24、CD27、CD28、CD38、CD39、CD40、CD70、CD80、CD86、CD122、CD137、CD137L、CD152、CD154、CD160、CD272、CD273、CD274、CD275、CD276、CD278、CD279、CDH1、壳多糖酶、CLEC9、CLEC91、CRTH2、CSF-1、CSF-2、CSF-3、CX3CL1、CXCL12、CXCL1 3、CXCR3、DNGR-1、外核苷三磷酸盐二磷酸水解酶1、EGFR、ENTPD1、FCER1A、FCER1、FLAP、Gi24、GITR、GITRL、GM-CSF、Her2、HHLA2、HMGB1、HVEM、ICOSLG、IDO、IFNα、IgE、IGF1R、IL2Rβ、IL1、IL1A、IL1B、IL1F10、IL2、IL4、IL4Ra、IL5、IL5R、IL6、IL7、IL7Ra、IL8、IL9、IL9R、IL10、rhIL10、IL12、IL13、IL13Ra1、IL13Ra2、IL15、IL17、IL17Rb、IL18、IL22、IL23、IL25、IL27、IL33、IL35、ITGB4、ITK、KIR、LAG3、LAMP1、瘦素、LPFS2、II类MHC、NCR3LG1、NKG2D、NTPD酶-1、OX40、OX40L、PD-1H、血小板受体、S152、SISP1、SLC、SPG64、ST2、Syk激酶、TACI、TDO、T14、TIGIT、TIM3、TLR、TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、TNFa、TNFRSF7、Tp55、TREM1、TSLP、TSLPR、TWEAK、VEGF、VISTA、Vstm3、WUCAM和XCR1。
项74：项1-23和32-58任一项的结合蛋白或项64的组合物，其用于在患者中预防和/或治疗癌症的用途。
项75：用于项74的用途的结合蛋白或组合物，其中所述结合蛋白包含一个特异性结合T细胞表面蛋白的抗原结合位点和另一个特异性结合肿瘤靶蛋白的抗原结合位点。
项76：用于项75的用途的结合蛋白或组合物，其中所述结合蛋白包含特异性结合CD3的第一抗原结合位点，特异性结合CD28的第二抗原结合位点，和特异性结合选自下组的肿瘤靶蛋白的第三抗原结合位点：CD19、CD20、CD38、Her2和LAMP1。
项77：用于项74-76的任一项的用途的结合蛋白或组合物，其中所述结合蛋白与化疗剂共同施用。
项78：项1-15、24-45和52-58任一项的结合蛋白或项64的药物组合物，其用于在患者中预防和/或治疗炎性疾病或病症的用途。
项79：用于项78的用途的结合蛋白或组合物，其中所述结合蛋白包含3个抗原结合位点，其各自特异性结合选自下组的细胞因子靶蛋白：IL-4、IL-13和TNFa。
项80：用于项78或项79的用途的结合蛋白或组合物，其中所述结合蛋白与抗炎剂共同施用。
项81：用于项74-80任一项的用途的结合蛋白或组合物，其中所述患者是人。
项82：用于项74或项78的用途的结合蛋白或组合物，其中所述结合蛋白能够抑制一个或多个选自下组的靶蛋白的功能：A2AR、APRIL、ATPD酶、BAFF、BAFFR、BCMA、BlyS、BTK、BTLA、B7DC、B7H1、B7H4、B7H5、B7H6、B7H7、B7RP1、B7-4、C3、C5、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL1 5、CCL17、CCL19、CCL20、CCL21、CCL24、CCL25、CCL26、CCR3、CCR4、CD3、CD19、CD20、CD23、CD24、CD27、CD28、CD38、CD39、CD40、CD70、CD80、CD86、CD122、CD137、CD137L、CD152、CD154、CD160、CD272、CD273、CD274、CD275、CD276、CD278、CD279、CDH1、壳多糖酶、CLEC9、CLEC91、CRTH2、CSF-1、CSF-2、CSF-3、CX3CL1、CXCL12、CXCL13、CXCR3、DNGR-1、外核苷三磷酸盐二磷酸水解酶1、EGFR、ENTPD1、FCER1A、FCER1、FLAP、FOLH1、Gi24、GITR、GITRL、GM-CSF、Her2、HHLA2、HMGB1、HVEM、ICOSLG、IDO、IFNα、IgE、IGF1R、IL2Rβ、IL1、IL1A、IL1B、IL1F10、IL2、IL4、IL4Ra、IL5、IL5R、IL6、IL7、IL7Ra、IL8、IL9、IL9R、IL10、rhIL10、IL12、IL13、IL13Ra1、IL13Ra2、IL15、IL17、IL17Rb、IL18、IL22、IL23、IL25、IL27、IL33、IL35、ITGB4、ITK、KIR、LAG3、LAMP1、瘦素、LPFS2、II类MHC、NCR3LG1、NKG2D、NTPD酶-1、OX40、OX40L、PD-1H、血小板受体、PROM1、S152、SISP1、SLC、SPG64、ST2、STEAP2、Syk激酶、TACI、TDO、T14、TIGIT、TIM3、TLR、TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、TMEF1、TNFa、TNFRSF7、Tp55、TREM1、TSLP、TSLPR、TWEAK、VEGF、VISTA、Vstm3、WUCAM和XCR1。
项83：一种纯化通过宿主细胞产生的结合蛋白的方法，包括：
(a)在宿主细胞中产生项2、17、25、35-37、41、43、45和46-55任一项的结合蛋白，其中第二多肽链的CH3域和所述第三多肽链的CH3域中仅有一个包含与人IgG1或IgG4的位置435和436对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代是H435R和Y436F；
(b)使(a)中产生的结合蛋白与蛋白A接触；和
(c)在适于从包含0或2个CH3域的结合蛋白分离出结合蛋白的条件下从蛋白A洗脱所述结合蛋白，所述CH3域包含为H435R和Y436F的氨基酸取代，由此纯化所述结合蛋白。
项84：项83的方法，其中所述第一多肽链的CL域是人κCL域，且所述第四多肽链的CL域是人λCL域；或所述第一多肽链的CL域是人λCL域，且所述第四多肽链的CL域是人κCL域，且所述方法进一步包括：
(d)使(c)中洗脱的结合蛋白与κ轻链亲和介质接触；和
(e)在适于从仅包含λCL域的结合蛋白分离出结合蛋白的条件下从所述κ轻链亲和介质洗脱结合蛋白。
项85：项84的方法，其在(e)之后还包括：
(f)使(e)中洗脱的结合蛋白与λ轻链亲和介质接触；和
(g)在适于从仅包含κCL域的结合蛋白分离出结合蛋白的条件下从所述λ轻链亲和介质洗脱所述结合蛋白。
项86.项83的方法，其中所述第一多肽链的CL域是人κCL域，且所述第四多肽链的CL域是人λCL域；或所述第一多肽链的CL域是人λCL域，且所述第四多肽链的CL域是人κCL域，且所述方法进一步包括：
(d)使(c)中洗脱的结合蛋白与λ轻链亲和介质接触；和
(e)在适于从仅包含κCL域的结合蛋白分离出所述结合蛋白的条件下从所述λ轻链亲和介质洗脱结合蛋白。
项87.项86的方法，在(e)之后进一步包括：
(f)使(e)中洗脱的结合蛋白与κ轻链亲和介质接触；和
(g)在适于从仅包含λCL域的结合蛋白分离出所述结合蛋白的条件下从所述κ轻链亲和介质洗脱结合蛋白。
项88：项83-87任一项的方法，其中所述第一多肽链包含λCL域；其中所述第二多肽链的CH3域包含与人IgG1的位置354和366对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为S354C和T366W；其中所述第三多肽链的CH3域包含与人IgG1的位置349、366、368、407、435和436对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为Y349C、T366S、L368A、Y407V、H435R和Y436F；且其中第四多肽链包含κCL域。
项89：项83-88任一项的方法，其中在(c)和(e)的一项或多项中使用疏水相互作用色谱(HIC)来检测所述结合蛋白。
项90.权利要求83-89任一项的方法，其中所述第二和第三多肽链的CH3域是人IgG1或IgG4 CH3域。
实施例
下文实施例用于描述本发明的具体实施方案，及其多种用途。所述实施例仅出于例示目的而示出，并且不应理解为以任何方式限制本发明的范围。
实施例1：材料与方法
如下材料与方法用于实施例2-5所述的实验。
三特异性抗体设计
图1A-1C中示出了通用三特异性抗体设计的示意图。基于5个参数设计单个三特异性抗体：1)选择抗体结合位点；2)考虑每个结合位点的位置；3)双特异性结合臂(即图1C中的重链/轻链B)的接头选择；4)“杵”和“臼”突变整合至抗体的各自的那一半中；5)选择Fc同种型(IgG1或IgG4)。在每个三特异性分子的氨基酸序列的装配之后，使用人优选密码子(CambrY Applied Biosciences，Cambridge，MA，USA)对各个三特异性抗体合成四个基因，并克隆至真核表达载体中。
三特异性抗体的生产和纯化
根据制造商的方案，通过使用ExpiFectamineTM 293转染套组(Thermo FisherScientific)将4种表达质粒瞬时转染至Expi293细胞中来产生三特异性抗体。简言之，将每个质粒的25％(w/w)稀释于Opti-MEM中，在室温(RT)与预稀释的ExpiFectamine试剂混合20-30分钟，并加入至Expi293细胞中(2.5x106细胞/ml)。通常使用转染优化以确定质粒的最佳比例，从而产生具有良好产率和纯度的三特异性抗体。
转染后4-5天，从转染细胞收集上清液，并通过0.45μm过滤单元(Nalgene)过滤。使用3步法纯化上清液中的三特异性抗体。首先，使用蛋白A亲和纯化，并使用“IgG ElutionBuffer”(Thermo Fisher Scientific)洗脱结合的抗体。第二，将产物针对PBS(pH7.4)透析过夜，其中2次更换PBS缓冲液。在下一步之前通过0.45μm过滤器单元(Nalgene)过滤清除任何沉淀物。第三，使用大小排阻层析(SEC)纯化(Hiload 16/600Superdex 200pg或Hiload26/600Superdex 200pg，GE Healthcare)去除制备中的聚集体和不同种类。在还原和非还原的SDS-PAGE上分析级分以鉴定含有单体三特异性抗体的级分，然后将其组合。纯化的抗体可被等分并长期储存在-80℃。
ELISA测定
使用ELISA或SPR方法分析纯化的抗体的结合特性。对于ELISA，使用三特异性抗体中每个结合位点的对应抗原在4℃以4PBS(pH7.4)中的2μg/ml每种抗原涂覆96孔免疫平板(Nunc 439454，Thermo Fisher Scientific)过夜。使用PBS中的5％脱脂乳+2％BSA在室温将涂覆的平板封闭1小时，然后用PBS+0.25％Tween 20洗涤三次(Aqua Max 400，MolecularDevices)。制备抗体(三特异性和对照抗体)的连续稀释液，并添加到ELISA板(100μl/孔，一式两份)上，在室温温育1小时，然后用PBS+0.25％Tween 20洗涤5次。
洗涤后，将缀合有HRP的二抗人Fab(1：5000，目录号109-035-097，JacksonImmunoResearch Inc)添加至每个孔并在室温温育30分钟。用PBS+0.25％Tween 20洗涤5次后，向每个孔加入100μl的TMB微孔过氧化物酶底物(KPL，Gaithersburg，MD，USA)。通过加入50μl 1M H2SO4终止反应，并使用SpectraMax M5(Molecular Devices)测量OD450，并使用SoftMax Pro6.3软件(Molecular Devices)进行分析。将最终数据转移至GraphPad Prism软件(GraphPad Software，CA，USA)，并如所示绘图。使用相同的软件计算EC50。
SPR测定
选择两对重链和轻链进行全动力学分析。使用BIACORE 3000(GE Healthcare)上的表面等离振子共振(SPR)技术进行纯化抗体的动力学表征。使用研究的抗体的捕获测定(其使用标签特异性抗体捕获)和取向。对于捕获含有蛋白构建体的Fc，使用人抗体捕获套组(GE Healthcare)，对于捕获含有蛋白构建体的His标签，使用His捕获套组(GEHealthcare)。使用标准程序将捕获抗体经伯胺基团(11000RU)固定在研究级CM5芯片(GELife Sciences)上。以10μL/分钟的流速用调节的RU值捕获分析的抗体，所述调节的RU值导致通常为30RU的最大分析物结合信号。
对于示例性测定，重组人IL13(目录号IL012)和人IL4(目录号IL004)购自Millipore，重组人TNFα(目录号H8916)购自Sigma Aldrich。在0.1至3nM的浓度范围的IL4和0.8至25nM的IL13，针对重组人IL4和IL13测量结合动力学。对于人TNFα，使用3至100nM的浓度范围。作为测定缓冲液，以30μl/分钟的流速使用HBS EP(10mM HEPES，pH 7.4，150mMNaCl，3mM EDTA和0.005％表面活性剂P20)。用各自的捕获套组的再生溶液(regenerationsolution)再生芯片表面。在BIAevaluation程序包v4.1中使用没有捕获抗体的流动细胞(f1ow cell)作为参考和具有质量转移(mass transfer)的1∶1Langmuir结合模型来分析和计算动力学参数。为了研究抗原的同时结合，通过抗人抗体捕获表面来捕获三特异性抗体。抗原以单一浓度使用，IL4为3nM，IL13为25nM，TNFα为100nM。为了显示所有三种抗原的同时结合，注射IL4，IL13和TNFα的混合物。在分开的分析周期中，单独注射IL1 3，然后注射IL4或TNFα，然后共注射IL4/TNFα或共注射TNFα/IL4。比较了每个循环中测量的最终响应，以显示两种或三种抗原的连续结合与所有三种抗原的混合物的同时结合的相似性。
体外T细胞活化和增殖测定
使用Ficoll-Paque Plus方法从购自Blood Research Component(Brookline，MA，USA)的血沉棕黄层纯化人PBMC。简言之，首先在PBS(pH7.4)中以1：3的比例稀释新鲜的血沉棕黄层，并在使用前与Ficoll-Paque Plus溶液(Ficoll)通过颠倒瓶数次而充分混合。将15mL密度梯度培养基添加至每个管，以1000xg、室温旋转30秒。培养基现在位于多孔屏障下方，然后将30-40mL稀释的血沉棕黄层小心地倒入每个Leucosep管中，并在室温以800×g离心15分钟，松开制动(brake off)和最大加速度为5。除去血浆层，将含有富集的PBMC的上清液其余部分转移到新管中(Leucosep管未保持在倒置位置超过2秒)。富集的PBMC用45ml PBS洗涤，并在室温以250×g离心10分钟。重复洗涤，并将多个管组合为一个管。将细胞重悬于20mL PBS中并用Bio-Rad TC20计数。
为了建立体外T细胞活化测定，将纯化的人PBMC重悬于培养基(具有10％FBS且补充谷氨酰胺/链霉素的RPMI1640)(Thermo Fisher Scientmc)(106细胞/m1))中。将指定浓度的不同的三特异性和对照抗体加入至每个孔中，或用于在使用前涂覆平板，如Stebbings，R等(2007)J.Immunol.179：3325-3331，并在组织培养箱中温育16-24小时。将细胞旋转减慢，收集上清液以测量细胞因子释放，或弃去。用针对T细胞标志物(CD3，CD4，CD8等)和活化标志物(CD69，CD62L等)的荧光标记抗体染色细胞，并通过在Fortessa流式细胞仪(Beckton Dickinson，San Jose，CA)上运行样品，然后使用Flowjo软件(FlowJo v10)分析来进行分析，并如所示绘图。
为了建立体外T细胞增殖测定，将纯化的人PBMC重悬于培养基(具有10％FBS且补充谷氨酰胺/链霉素的RPMI1640)(Thermo Fisher Scientific)(106细胞/ml)。将指定浓度的不同的三特异性和对照抗体加入每个孔，并在组织培养箱中温育1-7天。将细胞旋转减慢，收集上清液以测量细胞因子释放，或弃去。用针对T细胞标志物(CD3，CD4，CD8等)和活化标志物(CD69，CD62L等)的荧光标记抗体染色细胞，并通过在Fortessa流式细胞仪(BecktonDickinson，San Jose，CA)上运行样品，然后使用Flowjo软件(FlowJo v10)分析来进行分析，并如所示绘图。
体外细胞杀伤测定
使用纯化的人PBMC用于使用不同的三特异性抗体针对各种癌细胞的体外杀伤测定。简言之，在96孔V底平板中建立杀伤测定。对于各个平板，将来自各个供体的40ml PBMC以2x10∧6个细胞/ml铺板，并制备2.5x10∧5个细胞/ml(4μL的染料染色至高达1x10∧7个细胞)的30ml PKH26(Sigma＃MINI26)标记的靶细胞。将各种浓度的第一20μL/孔测试蛋白或PMA添加至各个孔，然后向各个孔添加80μL/孔标记的靶细胞(2X10∧4个细胞/孔)。然后向每个孔添加100μL PBMC，达到E∶T＝10∶1孔(2x10∧5个细胞/孔)，并在37℃ 5％CO2培养箱中温育24小时。将细胞旋转减慢，收集上清液以测量细胞因子释放，或弃去。用VividLIVE/DEADTM可固定紫罗兰死细胞染色缓冲液(LifeTechnology＃L34955)染色细胞(通过将60μL Vivid试剂加入60ml PBS中来制备染色缓冲液)。通过在黑暗中室温温育15分钟将细胞重悬于100μL染色缓冲液中。用1xPBS洗涤细胞后，将细胞重悬于具有0.5％多聚甲醛的200μL PBS中，并通过Fortessa流式细胞仪(Beckton Dickinson，San Jose，CA)收集PKH26+Vivid+癌细胞，然后使用Flowjo软件分析。杀伤百分比计算为“特异性杀伤-自发杀伤/总细胞”，如所示绘图。
细胞因子释放测定
为了测量体外活化测定、体外杀伤测定、CD34+脐带细胞人源化NSG小鼠中的体内活化测定和毒性研究中的炎性细胞因子浓度，收集细胞培养物上清液，并用MilliplexHuman High Sensitivity T细胞13-plex套组(EMD Millipore)根据制造商的方案稀释血清样品。这些随后通过EMD Millipore系统和Analyst 5.1软件进行分析。
体内小、鼠模型和功效研究
使用人CD34+造血干细胞移植的NSG小鼠(hu-CD34)作为体内小鼠模型。这些小鼠建立了多谱系人免疫细胞，并且是免疫肿瘤学功效研究的有效平台(参见例如Shultz，L.D等(2014)Cold Spring Harb.Protoc.2014：694-708)。通过注射CD34+造血干细胞产生Hu-CD34+NSG小鼠，显示有效的多谱系移植人免疫细胞群体，包括T细胞，B细胞和一些其他群体(McDermott，S.P等(2010)Blood 116：193-200)。多谱系造血作用发生在12周内。移植稳定超过一年没有移植物抗宿主病。
对于使用hu-CD34NSG小鼠的功效研究，小鼠购自The Jackson Laboratory(Maine，USA)，并在使用前验证人细胞群体。一般而言，将在Matrigel(BD Biosciences)(50％v/v)中混合的5x106肿瘤细胞用于在每只小鼠中接种肿瘤。一旦肿瘤大小达到100-150mm3的范围，选择小鼠并随机分配至各组用于研究。抗体以给定剂量每周3次静脉内给予。每周监测体重1-3次。肿瘤大小通过卡尺测量1-3次/周。当肿瘤大小达到1,500mm3时或最后一次施用后24小时，终止/杀死(terminated)所有小鼠。将终末血液样品(0.3mL)收集到血清分离管中，通过轻轻颠倒5次予以混合，并置于管架中。还收集终末肿瘤并称重，然后置于固定剂中用于免疫组织化学分析。
使用人PBMC人源化(hu-PBMC)NSG小鼠作为另一体内小鼠模型。这些小鼠通过注射来自健康供体的纯化的人PBMC而产生，其使用成年外周血单核细胞而具有最快的移植速率，并且能够进行需要强效应和记忆T细胞和NK细胞功能的短期研究，并且适于短期功效研究(3-4周)，这是由于移植物抗宿主病。
对于使用hu-PBMC NSG小鼠的功效研究，从The Jackson Jackson(Maine，USA)购买了8-10周龄的NSG小鼠(货号：005557，NOD.Cg-Prkdcscid I12rgtm1Wjl/SzJ)。每只小鼠接种了Matrigel(BD Biosciences)(50％v/v)中混合的5x106个肿瘤细胞。一旦肿瘤大小达到50-100mm3的范围，将来自健康供体的10x106人PBMC重建至每只小鼠。第二天验证人细胞重建。一旦肿瘤大小达到100-150mm3的范围，选择小鼠并随机分入各组用于研究。抗体以施用剂量每周3次静脉内施用。每周监测体重1-3次。肿瘤大小通过卡尺测量1-3次/周。当肿瘤大小达到1,500mm3时或最后一次施用后24小时，终止/杀死所有小鼠。将终末血液样品(0.3mL)收集到血清分离管中，通过轻轻颠倒5次予以混合，并置于管架中。还收集终末肿瘤并称重，然后置于固定剂中用于免疫组织化学分析。
NHP耐受性和药代动力学研究
所有NHP研究均由Covance(Princeton，New Jersey，USA)根据Covance ICUCA方案进行。在所有研究中都使用药物和蛋白未施用(Drug-and protein-)或蛋白未施用的雄性食蟹猴。基于研究设计，为每个三特异性抗体选择并分组猴子。通过经隐静脉静脉内输注1小时给予抗体。对于低剂量(＜10μg/kg)连续给予增加的剂量，而对于较高剂量(＞10μg/kg)则具有1-2天的间隔，出于观察目的。按照规定，在每个剂量施用后对所有动物自输注开始的0小时(仅第1天)，0.5小时(中间输注)，1小时和6小时收集血液样品。根据研究主管，病理学家和/或临床兽医的判断收集额外的非计划血液样品。所有动物在第60天返回群落。使用标准方法制备来自血液样品的PBMC和血清，并保存以供将来分析。
荧光素酶报告测定
GloResponseTM IL2-luc2P Jurkat细胞，复苏及使用(Promega部件＃CS187002)和GloResponseTM NFAT-Luc2Jurkat细胞(Promega目录＃CS176401)购自Promega(WI，USA)，并制备用于根据制造商的方案使用。
简言之，将细胞在37℃水浴中复苏2分钟，并轻轻转移至含有10mL预热的R10培养基的15mL锥形离心管中。将管在室温以300g离心5分钟。去除上清液，将细胞重悬于20mL预热的R10培养基中并转移至75cm2培养瓶中，然后在37℃的组织培养箱中温育，直到细胞生长且稳定(～3-4天)。细胞每周两次分装为0.1e6个细胞/mL。将细胞保持在R10+潮霉素B培养基中用于选择。复苏后～7天使用细胞用于测定。
对于抗体刺激，以各种浓度制备三特异性或对照抗体，并在PBS中连续稀释。每孔分配25μL抗体。对于平板结合的抗体，使用Maxisorp平板，并在40℃温育过夜。对于可溶性抗体，使用U底平板。将报告细胞重悬至0.3-0.5e6/mL，并将175μL细胞添加至各个孔，并在37℃CO2培养箱中温育6小时。然后将板从培养箱中取出并使其平衡至环境温度(10-15分钟)。然后将50μl的Bio-GloTM试剂(Promega目录号G7941)(环境温度)加入测定平板的各个孔。温育5分钟后，使用MicroB2 LumiJET微孔板计数器(Perkin Elmer；1s读取时间)测量发光活性。使用GraphPad Prism软件绘制数据。
构象稳定性
使用差示扫描荧光测定法(DSF)确定热稳定性测量(例如熔点，Tm)。将样品在D-PBS缓冲液(Invitrogen)中稀释至终浓度为0.2μg/μl，包括白色半裙边96孔板(BIORAD)中的D-PBS中的SYPRO-Orange染料的4x浓缩溶液(Invitrogen，DMSO中的5000x储液)。所有测量均使用MyiQ2实时PCR仪(BIORAD)一式两份进行。在iQ5软件v2.1(BIORAD)中生成熔解曲线的负一阶导数曲线(-d(RFU)/dT)。然后将数据导出到Microsoft Excel中，以确定Tm和数据的图形显示。
IC50测量
用报告细胞系检测针对II-4和II-13的抗体活性
在可商购的HEK-Blue IL-4/IL-13报告细胞(InvivoGen)中确定双特异性抗体或针对细胞因子IL4和IL13的衍生物的活性。设计HEK-Blue IL-4/IL-13细胞以监测IL-4或IL13对STAT6途径的活化。用细胞因子刺激细胞导致报告基因分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)的产生，其可以用QUANTI-Blue测定法在培养上清液中测量。为了测试针对IL4或IL13的抗体活性，将细胞因子与不同浓度的抗体预温育1小时，并添加至50,000个HEK-BlueIL-4/IL-13细胞。在细胞培养上清液中温育24小时后用QUANTI-Blue测定法(InvivoGen)测量SEAP的细胞因子介导的诱导。对每个抗体浓度用n＝3个数据点来进行每个实验。通过内部应用Biostat-Speed V2.0(Sanofi)计算每种抗体的半最大抑制浓度(IC50)。
用报告细胞系检测针对TNFα的抗体活性
通过使用市售的HEK-Blue TNF-a报告细胞(InvivoGen)测定双特异性抗体或衍生物针对TNFa的活性。设计HEK-Blue TNF-a细胞以通过监测NFkB途径的激活来检测生物活性TNFa，其通过报告基因分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)的表达来进行，所述表达可用QUANTIBlue Assay(InvivoGen)在上清液中测量。为了确定针对TNFa的抗体活性，将细胞因子与不同浓度的抗体预温育1小时，并添加至50,000个HEK Blue TNF-a细胞。在培养上清液中24小时后用QUANTI-Blue测定法(InvivoGen)测量SEAP的细胞因子介导的诱导。对于每个抗体浓度用n＝3个数据点来进行每个实验。计算每种抗体的半最大抑制浓度。
实施例2：三特异性结合蛋白概览
开发了一种用于生成三特异性结合蛋白的新策略。三特异性蛋白质包含形成三个靶结合位点的四个多肽(图1A-C)。每个靶结合位点包含来自靶向不同的人抗原靶的抗体的VH和VL域(参见例如表1)。三特异性结合蛋白含有第一对多肽，其具有双重可变域，该可变域具有形成两个不同的抗原结点位点的交叉取向(称为CODV Ig形式)，以及第二对多肽，其各自具有形成第三抗原结点位点的单一可变域(图1A和1B)。
表1：结合蛋白1-21的重链和轻链SEQ ID NO，和结合蛋白所针对的靶抗原
第一对多肽(具有双重可变域)包含具有结构VL2-接头-VL1-接头-免疫球蛋白轻链恒定域的第一多肽和具有结构VH1-接头-VH2-接头-免疫球蛋白CH1重链恒定结构域，得到一对具有交叉取向的多肽，其形成两个不同的抗原结合位点：VH1-VL1和VH2-VL2(图1C，参见轻链和重链B)。表A概述了代表性的三特异性结合蛋白的IgG1和IgG4变体的双特异性臂(即包含重链和轻链B的臂)的设计，包括指示三特异性结合蛋白的双特异性臂中使用的接头的各种组合。第二对多肽(其各自具有单一可变域)包含具有结构VH3-免疫球蛋白CH1重链恒定域的第一多肽和具有结构VL3-免疫球蛋白轻链恒定域的第二多肽，得到一对多肽，其形成第三抗原结合位点：VH3-VL3(图1C，参见轻链和重链A)。此外，构建三特异性结合蛋白，使得CH3域中的任一个可包含杵或臼修饰以促进抗体异源二聚化(图1)。
表A：作为IgG1(臼)或IgG4(臼)的三特异性结合蛋白的三特异性臂的设计概述
接头：[L3，L4]/[L1，L2]-[S，RT]/[GQPKAAP(SEQ ID NO：175)，TKGPS(SEQ ID NO：106)]；[，]/[GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：104)，GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：104)]；或[GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：105)，]/[GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：105)，]
实施例3：T细胞衔接体的体外结合活性和抗体介导的特异性杀伤
本实施例描述了表征T细胞衔接体的活性的体外测定。
使用上述实施例2中关于三特异性结合蛋白设计描述的方法，生成了四种三特异性结合蛋白(结合蛋白1、3、5和6)。这些三特异性结合蛋白是通过将分离自靶向不同的人蛋白的抗体的VH和VL域移接到三特异性结合蛋白框架上产生的，所述不同的人蛋白：CD3，CD19，CD28，CD38或Her2。构建结构蛋白1使得第一对多肽(其形成两个抗原结合位点)靶向CD28和CD3且第二对多肽(其形成单个抗原结点位点)靶向Her2(结合蛋白1＝Her2x(CD28×CD3))。构建结合蛋白3使得第一对多肽(其形成两个抗原结合位点)靶向CD28和CD3且第二对多肽(其形成单个抗原结合位点)靶向CD19(结合蛋白3＝CD19×(CD28×CD3))。构建结构蛋白5使得第一对多肽(其形成两个抗原结合位点)靶向CD28和CD3且第二对多肽(其形成单个抗原结合位点)靶向CD38(结合蛋白5＝CD38×(CD28×CD3))。构建结合蛋白6使得第一对多肽(其形成两个抗原结合位点)靶向CD28和CD3且第二对多肽(其形成单个抗原结点位)靶向CD38(结合蛋白6＝CD38×(CD28×CD3))。
用包含抗Her2的三特异性结合蛋白的体外测定
为了测试三特异性结合蛋白靶向和结合三种不同的人抗原的能力，首先通过ELISA测定测验结合蛋白1对其靶标的特异性。结合蛋白1能够结合其所有三种靶蛋白CD3，CD28和Her2(图2)，指示三特异性形式的每个结合域保留其功能。
用膜染料PKH-26(Sigma)标记ZR-75-1，AU565(Her2+)，ARH-77(CD19+)，MOLP-8，RPMI-8226，KMS-12_BM，NCI-H929，MM.1.S，MM.1.，R OPM-2，KMS-26和U266细胞(CD38+)并用作细胞毒性测定中的靶细胞。在增加浓度的三特异性抗体，双特异性抗体或对照蛋白的存在下，将这些标记的细胞系以10∶1的E∶T比率与富集的人Pan T细胞共培养24小时。通过如下步骤来确定靶细胞中细胞裂解的程度：用活/死细胞标记物(Life Technologies)染色，并通过在Fortessa流式细胞仪(Beckton Dickinson，San Jose，CA)上运行样品来测量标记的靶细胞群体中的死细胞数目，然后使用Flowjo软件(FlowJo v10)进行分析。
用荧光缀合的针对人CD3、CD28、CD19、CD38、LAMP1和/或Her2的抗体(Biolegend)来染色Her2+、CD19+、CD38+肿瘤细胞系。还包括用各自同种型匹配的对照抗体进行染色。然后在Fortessa仪器(Beckton Dickinson，San Jose，CA)上获得细胞。流式分析在FlowJov10上进行。各种结合蛋白的介导的杀伤结果示于图3A-5，9A，9B和11A-16中。
测试了结合蛋白1在表达HER2蛋白的肿瘤细胞的表面上诱导其抗体介导的细胞杀伤的能力。不仅结合蛋白1能够结合其所有三种靶蛋白，而且还能够诱导Her2+细胞系的抗体介导的细胞杀伤(图3A-4)。结合蛋白1表现出强的抗体介导的细胞杀伤活性，而抗CD3/CD28双特异性抗体和抗Her2抗体显示出最小的杀伤活性(图3A，3B，4和5)，证明使用三特异性抗体使得肿瘤细胞与T细胞通过肿瘤抗原(HER2)和T细胞标志物(CD3和CD28)接合的有效性。抗CD3/CD28不仅对T细胞募集很重要，而且还提供了更有效的T细胞激活和生存信号传导，潜在地改进了疗效。
另外，使用抗Her2 x CD28 x CD3三特异性抗体(结合蛋白1)对体外T细胞活化和增殖以及细胞因子产生进行了研究。结合蛋白1和具有一个或两个通过定点诱变失活的结合域的对照变体(ΔCD28：抗CD28失活；ΔCD3：抗CD3失活；Δ(CD3xCD28)：抗CD3和抗CD28均失活)用于人PBMC体外活化测定，如实施例1所述。结果显示，结合蛋白1在体外有效活化人原代CD4T细胞和CD8T细胞二者。抗CD28的失活降低了活化效力，指示抗CD28共信号传导通路的重要性。抗CD3结合位点的失活使结合蛋白1达到最小的活性，表明抗CD3提供了主要的T细胞激活信号传导(图6A和6B)。使用IL2和NFAT报告基因人T细胞系(Jurkat-IL2和Jurkat-NFAT)获得了相似的结果(图7A-7C)。
使用包含抗CD19的三特异性结合蛋白的体外测定
抗CD19×CD28×CD3三特异性结合蛋白能够结合其靶抗原(图8)，表明三特异性形式的每个结合域保持其功能。
抗CD19×CD28×CD3三特异性结合蛋白还能诱导CD19+细胞的抗体介导的细胞杀伤(图9A-9N)。类似地，抗CD19×CD28×CD3三特异性结合蛋白对人淋巴瘤细胞表现出强的杀伤活性，而抗CD3/CD28，抗CD19和同种型对照抗体显示出最小的杀伤活性，证明使用三特异性抗体通过肿瘤抗原(CD19)和T细胞标志物(CD3和CD28)使得T细胞与肿瘤细胞接合的有效性。
使用包含抗CD38的三特异性结合蛋白的体外测定
如对结合蛋白1和3所观察到的，结合蛋白5能够结合其所有三种靶蛋白(CD3，CD28和CD38)，如通过ELISA测定(图10)所评估的，表明三特异性形式的各结合域保留其功能。
还发现结合蛋白5针对具有各种水平的CD38和CD28表达的9种人多发性骨髓瘤细胞(参见图11D，12D和13D)诱导细胞的抗体介导的细胞杀伤(图11A-15D)。类似地，三特异性结合蛋白5对人多发性骨髓瘤细胞表现出强的杀伤活性，而抗CD38和同种型对照抗体显示出最小的杀伤活性，证明使用三特异性抗体通过肿瘤抗原(CD38和CD28)和T细胞标志物(CD3和CD28)将肿瘤细胞与T细胞接合的有效性。双特异性抗CD3/CD28对照抗体还显示出对CD28+MM细胞的边际杀伤活性(marginal killing activity)，参见图11B，12A-C和13A-C)。
这些结果证明，本文所述的三特异性抗体平台提供了整合两个肿瘤标志物的结合位点或T细胞标记的两个结合位点的可能性，允许科学设计和各种应用的灵活性。结合蛋白5对于5种CD38+人淋巴瘤细胞系(图14C和15D)也是有效的，显示出强的杀伤活性(图14A-B和15A-C)。
测试了使用结合蛋白5和6的针对多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226的抗体介导的细胞杀伤，并计算它们的EC50并与靶向CD28和CD3的CODV形式双特异性抗体(图16和表B)进行比较。结合蛋白5和6的不同仅在于抗CD28结合域；结合蛋白5含有抗CD28超激动剂，而结合蛋白6含有常规的抗CD28。结合蛋白5显示出更强的杀伤活性。
表B：针对双特异性和三特异性结合蛋白计算的EC50值
EC<sub>50</sub>(pM)
huCD28 x CD3 IgG4 56.16
结合蛋白5 IgG4 0.3787
结合蛋白6 IgG4 5.709
抗CD38×CD28×CD3三特异性结合蛋白5和具有一个或两个通过定点诱变失活的结合域的对照变体(ΔCD28：抗CD28失活；ΔCD3：抗CD3失活；Δ(CD3xCD28)：抗CD3和抗CD28二者均失活)在体外活化测定中使用IL2和NFAT报告人T细胞系(Jurkat-IL2和Jurkat-NFAT)测试，如实施例1所述。结果显示，结合蛋白5在体外有效激活人IL2和NFAT启动子二者(图17A和17B)。抗CD28的失活降低了活化效力，其对于IL2报告基因更为突出，这表明抗CD28共信号传导通路的重要性。抗CD3结合位点的失活使结合蛋白5达到最小的活性，表明抗CD3提供了主要的T细胞激活信号传导。
实施例4：T细胞衔接体的体内活性
本实施例描述的实验表征了含有T细胞衔接体的抗Her2或抗CD38的体内特性和活性。
使用包含抗Her2的三特异性结合蛋白的体内测定
如实施例1所述，使用Her2×CD28×CD3三特异性抗体的剂量递增研究在非人灵长类动物(图18A-18E)中进行。结合蛋白1中的所有三个结合域均与猴CD3/CD28/HER2具有交叉反应性。设计了剂量递增毒性研究来评估分子的潜在毒性概貌。收集血样用于血清和PBMC分离。在每次施用后研究循环T细胞群体(图18A和18B)，以及T细胞亚群活化(CD69+)(图18C和18D)。循环中CD4和CD8T细胞的百分比在低剂量升高时增加，但在高剂量升高时最终降低。显著的CD4和CD8T细胞活化仅在100μg/kg剂量处突出，表明相对高的可耐受剂量。还测量了几种细胞因子的血清水平。仅在最高剂量处观察到显著的细胞因子释放(100μg/kg；图18E)。
接下来，如实施例1(图19A-20H)所述检查三特异性抗Her2×CD28×CD3结合蛋白1抗体对人源化小鼠模型中肿瘤生长的影响。图19A和19B总结了使用接种有人HER2+乳腺癌细胞系BT474的人CD34+造血干细胞移植的NSG小鼠(hu-CD34)模型得到的结果。所有剂量组中显著的抗肿瘤活性均是明显的。抗肿瘤活性是剂量依赖性的，与25μg/kg的对照组相比有统计学差异。任何治疗组中均未观察到明显体重减轻。
还进行了使用人HER2+乳腺癌细胞系BT474接种的人PBMC重建NSG小鼠模型的第二次体内研究(图20A-20H)。在高剂量组(100和500μg/kg)内观察到了显著的抗肿瘤活性。在500μg/kg组的40％的小鼠中观察到肿瘤缩减。抗肿瘤活性是剂量依赖性的。用100和500μg/kg剂量治疗的组中的抗肿瘤活性显著优于抗HER2治疗组(0.1至10mg/kg)，指示来自结合蛋白1的优异的抗肿瘤活性。任何观察组中均未观察到明显体重减轻。
使用包含抗CD38的三特异性结合蛋白的体内测定
使用如实施例1中所述的三特异性抗CD38×CD28×CD3抗体(结合蛋白5)在非人灵长类中进行剂量递增研究(图21A-21F)。结合蛋白5中的三个结合域中的两个与猴CD3和CD28具有交叉反应性。设计了剂量递增毒性研究来评估该分子的潜在毒性概貌。收集血样用于血清和PBMC分离。每次施用后研究循环T细胞群体(图21A和21B，柱状图)以及T细胞亚群活化(CD69+)(图21A和21B，线图)。循环中的CD4和CD8T细胞的百分比在低剂量升高时增加，但在高剂量升高时最终降低。显著的CD4和CD8T细胞活化仅在100μg/kg剂量处突出，表明相对高的可耐受剂量。还测量了几种细胞因子的血清水平。仅在最高剂量(100μg/kg；图21C-21F)处观察到显著的细胞因子释放。
如实施例1所述，随后在人源化小鼠(图22A-23D)中测试了抗CD38×CD28×CD3三特异性抗体的体内活性。图22A-22C总结了来自使用人CD34+造血干细胞移接的NSG小鼠(hu-CD34)模型(其移植有用CD38和PD-L1转导的人MM细胞系RPMI-8226，以5、50和100μg/kg的剂量用结合蛋白5处理)的剂量确定先导研究的结果。显著的抗肿瘤活性仅在5μg/kg处理的组中明显(图22A)。在结合蛋白5处理的小鼠(5μg/kg)(图22B和22C)中观察到CD8T细胞浸润。
使用结合蛋白5，以0.04-5μg/kg施用，在相同模型中进行随访研究(图23A-23D)。在结合蛋白5处理的所有组中均显示出显著的抗肿瘤活性(图23B)，其在研究结束时与对照有统计学差异(图23C)。在任何处理组中均未观察到显著的体重减轻(图23A)。在用指定浓度的结合蛋白5或PBS对照(图23D)处理的小鼠中，在第一次施用后4小时观察到血清炎症细胞因子IFN-γ，TNF-α和IL-2的剂量依赖性诱导，指示三特异性结合蛋白5的体内有效T细胞活化。
对人源化CD34+NSG小鼠(n＝3)静脉注射100mcg/kg的三特异性抗体(三角形)，双特异性抗体(正方形)或单特异性抗体(圆形)。在抗体注射后0(注射前)、1、24和72小时，通过在各个时间点由Luminex’s xMAP多重复合技术确定CD69的平均百分比增加，血浆中CD62L和/或炎性细胞因子的浓度的百分比降低来测量CD4+或CD8+T细胞的活化。各种三特异性抗体的T细胞活化结果如图24-26C所示。
在施用结合蛋白5、抗CD3/CD28_IgG4双特异性抗体和抗CD28IgG4抗体对照后，在人CD34+造血干细胞移植的NSG小鼠(hu-CD34)模型中研究全身性体内T细胞活化(图24)。将100μg/kg的结合蛋白5和对照抗体以3只小鼠/组施用。在施用后1小时，24小时和72小时收集血样。从血液分离小鼠血清和人T细胞，将其保存用于T细胞活化分析和用于血清细胞因子水平的测量。图24和图25显示，在抗体输注后1小时人CD4和CD8T细胞被活化，其在72小时处恢复到基线。图26A-26C显示在输注后1小时观察到的相同小鼠中血清IFN-γ，TNF-α和IL-2释放的升高，并在24小时后恢复至基线。这些结果证明结合蛋白5和抗CD3/CD28IgG4双特异性抗体在给定动物模型中有效激活T细胞，使其适合于体内功效研究。
实施例5：针对细胞因子的三特异性和双特异性三价结合蛋白的表征
如下实施例描述了表征靶向人细胞因子的新型三特异性和双特异性三价结合蛋白的稳定性，结合特性和活性的实验。
设计了三特异性结合蛋白(例如其结合三种不同的靶蛋白；结合蛋白9-15)，以及双特异性三价结合蛋白(例如在单价结合一个抗原上二价结合一个抗原；结合蛋白16-19)(表C)。除了结构蛋白11，其中在CODV-LC和Fab-臂-LC两者上都使用κ恒定域，所有其他结合蛋白(9-10和12-19)都以CODV-LC上的κ恒定域和Fab-臂-LC上的λ恒定域来产生。使用IgG1序列作为Fc骨架。当CODV-HC携带杵-RF突变(S354C，T366W；H435R和Y436F)，Fab-臂-HC含有臼突变(Y349C，T366S，L368A，Y407V)。
表C：针对抗IL-4/IL-13/TNFα的三特异性/三价结合蛋白的总结
三特异性和双特异性三价结合蛋白如上文所述生产并纯化(图27)。
表D：结合蛋白16-19的SEC纯化
为了评估三特异性结合蛋白的稳定性，通过DSF评价其熔点并与亲本抗体的热稳定性进行比较(表E)。
表E：通过DSF和来自各种三特异性结合蛋白的制备型大小排阻色谱的百分比单体的热稳定性总结
nd＝未确定
为了评估三特异性形式中每个单一抗体结合域的结合亲和力，如前所述进行每个单一抗原的SPR分析。结果是针对亲本抗体的亲和力的基准(表F，G和H)。
表F：各种三特异性结合蛋白的IL-4的表面等离子体共振结果总结
表G：各种三特异性结合蛋白的IL-13的表面等离子体共振结果总结
表H：各种三特异性结合蛋白的TNFα的表面等离子体共振结果总结
为了评估三特异性结合蛋白的中和活性，使用不同的HEK Blue套组(Invivogen)进行细胞测定。细胞因子在96孔板中在室温用不同浓度的抗细胞因子抗体预温育30分钟。对照包括仅细胞因子或仅抗体的使用。将50，000个HEK Blue细胞(HEK Blue TNFa/IL1β细胞(InvivoGen，目录＃hkb-tnfil1；HEK Blue STAT-6细胞(InvivoGen，目录＃Hkb.stat6)添加至细胞因子/抗体混合物，并在5％CO2的培养箱中于37℃温育23小时。将QuantiBlue试剂添加至各个培养孔，并在37℃处温育2小时。在620nm处测量OD，并使用BioStat Speed2.0计算IC50。各种三特异性抗体的HEK Blue报告细胞测定结果示于表I和表M。
然后，针对单一亲本抗体计算结合蛋白9-15和基准的IC50值(表I)。
表I：各种三特异性结合蛋白的HEK Blue报告测定总结(IC50数据)
通过差示扫描荧光测定法测量双特异性三价结合蛋白的热稳定性(DSF；表J)。
表J：各种三价结合蛋白的通过DSF的热稳定性的总结
测量了针对人IL-4(表K)和IL-13(表K和L)的各个双特异性三价结合蛋白所结合的靶蛋白的结合亲和力和数目。
表K：各种三价结合蛋白的IL-4的表面等离子体共振结果总结
表L：各种三价结合蛋白的IL-13的表面等离子体共振结果总结
最终，计算了结合蛋白16-19的IC50值(表M)。
表M：各种三价结合蛋白的HEK Blue报告测定(IC50数据)总结
实施例6：三特异性结合蛋白形式优化
许多现有的异二聚体结合蛋白形式(例如双特异性抗体及其各种变体)的问题在于，仅纯化所需的异二聚体物质而不包括任一同二聚体物质是困难的。因此，有效纯化所需的异二聚体结合蛋白的方法是非常有意义的，例如用于工业规模生产。
如本文所述，本发明的结合蛋白可包括几个可选特征，包括但不限于杵和臼突变(例如促进适当的异二聚体形成)和突变以改进纯化。此外，这些结合蛋白包括两条轻链，导致四种潜在的构型：两条κ轻链，两条λ轻链，具有双重可变域的臂(“CODV臂”)上的κ轻链和传统抗体臂(“Fab臂”)上的λ轻链，以及CODV臂上的λ轻链和Fab臂上的κ轻链。
因此，进行实验以鉴定允许有效纯化所需结合蛋白的方法。还测试了结合蛋白变体的纯化效率。
图28A示出了本发明的示例性结合蛋白的图，其表明了导致独特构型的变体。这些实验测试了布置(placement)的效果：κ和λ轻链(例如两个κ，两个λ，CODV臂上的κ和Fab臂上的λ，以及CODV臂上的λ和Fab臂上的κ)，杵和臼突变(例如CODV臂上的杵突变和Fab臂上的臼突变，CODV臂上的臼突变和Fab臂上的杵突变)和H435R/Y436F突变(“RF突变”，例如CODV或Fab臂上的RF突变，或没有RF突变)。共测试了18种不同的变体，如图28B所示。对于这些实验，CODV臂具有特异性针对TNFa(即分别为SEQ ID NO：168和169的VH和VL序列)和IL4(即分别为SEQ ID NO：170和171的VH和VL序列)的抗原结合位点，而Fab臂具有特异性针对IL1 3的抗原结点位点(即分别为SEQ ID NO：172和173的VH和VL序列)。S354C和T366W用于杵突变，而Y349C，T366S，L368A和Y407V用于臼突变。
测试了各种处理步骤监测CODV和Fab臂的正确配对(例如与CODV或Fab同二聚体相反)的能力，以及正确的重链-轻链配对(例如与Fab臂轻链和CODV臂重链之间的配对相反，或与Fab臂重链和CODV臂轻链之间的配对相反)。发现分析型大小排阻色谱(SEC)在区分正确的重链和轻链配对方面无效；发现具有与CODV重链错配的Fab臂轻链的结合蛋白和具有两个Fab臂的同二聚体结合蛋白与所需的三特异性结合蛋白共同洗脱。然而，发现分析疏水相互作用色谱(HIC)从具有与CODV重链错配的Fab臂轻链的结合蛋白和具有两个Fab臂的同二聚体结合蛋白中解析出(resolve)所需的三特异性结合蛋白(图29)。
图28B所示的18个结合蛋白构型通过蛋白A亲和色谱纯化，然后是KappaSelect(GEHealthcare)纯化。通过HIC色谱法监测物质种类。一个结合蛋白构型得以高效纯化，而不包括错配种类：CODV臂的λ轻链，Fab臂的κ轻链，CODV臂上的杵突变，Fab臂上的臼突变和Fab臂上的RF突变。HIC色谱(图30A)，SDS-PAGE(图30B)和完整质量分析证明，纯化出了对应于所需三特异性结合蛋白的单一种类。
这些结果鉴定了一个结合蛋白构型，其允许更有效地从错配的种类纯化所需的结合蛋白种类。此外，蛋白A的纯化过程之后是KappaSelect纯化步骤，显示其提供有效地从错配的种类分离所需结合蛋白。
虽然本发明包括各种实施方案，但是应当理解，本领域技术人员会想到变化和修改。因此，所附权利要求书旨在覆盖落入本发明范围内的所有等同变化。此外，本文使用的部章节分标题仅出于组织目的，而不应被理解为限制所描述的主题。
除非明确指出相反，否则本文所述的每个实施方案可以与任何其它实施方案或多个实施方案组合。具体地，表明为优选的或有利的任何特征或实施方案可以与表明为优选或有利的任何其它特征或多个特征或实施方案或多个实施方案组合，除非清楚的相反指示。
本申请中引用的所有参考文献通过提述明确并入本文。
序列
表1：结合蛋白1-21的重链和轻链序列SEQ ID NO及所述结合蛋白所针对的靶抗原
表2：特异性针对Her2、CD3、CD28、CD19和/或CD20的结合蛋白的重链和轻链序列。CDR序列以粗体和斜体显示。
表3：特异性针对IL-4、IL-13和/或TNFa的结合蛋白的重链和轻链序列
序列表
<110> YANG, Zhi-yong
NABEL, Gary J.
WU, Lan
SEUNG, Edward
WEI, Ronnie
BENINGA, Jochen
RAO, Ercole
LEUSCHNER, Wulf Dirk
BEIL, Christian
LANGE, Christian
CORVEY, Carsten
<120>三特异性和/或三价结合蛋白
<130> 183952027140
<140> 尚未指定
<141> 与此同时
<150> US 62/322,036
<151> 2016-04-13
<150> US 62/331,191
<151> 2016-05-03
<150> US 62/412,187
<151> 2016-10-24
<150> EP 17305298.6
<151> 2017-03-17
<160> 179
<170> 用于Windows的FastSEQ 4.0版
<210> 1
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
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Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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<223> 合成构建体
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 4
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Ser Gln Asn Ile Tyr Val Trp Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
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Glu Cys
<210> 5
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成构建体
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tacacctgta acgtggacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagcg ggtggaatct 660
aagtacggcc ctccctgccc tccttgccca gcccctgaat ttctgggcgg accctccgtg 720
ttcctgttcc ccccaaagcc caaggacacc ctgatgatca gccggacccc cgaagtgacc 780
tgcgtggtgg tggatgtgtc ccaggaagat cccgaggtgc agttcaattg gtacgtggac 840
ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag cccagagagg aacagttcaa cagcacctac 900
cgggtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa agagtacaag 960
tgcaaggtgt ccaacaaggg cctgcccagc tccatcgaga aaaccatcag caaggccaag 1020
ggccagcccc gcgagcctca agtgtatacc ctgccccctt gccaggaaga gatgaccaag 1080
aaccaggtgt ccctgtggtg tctcgtgaaa ggcttctacc ccagcgacat tgccgtggaa 1140
tgggagagca acggccagcc cgagaacaac tacaagacca ccccccctgt gctggacagc 1200
gacggctcat tcttcctgta ctccaagctg accgtggaca agagccggtg gcaggaaggc 1260
aacgtgttca gctgctccgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagtcc 1320
ctgtctctgt ccctgggcaa g 1341
<210> 6
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 6
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgtctgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacctgta gagccagcca ggacgtgaac accgccgtgg cctggtatca gcagaagcct 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctacagc gccagcttcc tgtacagcgg cgtgcccagc 180
agattcagcg gaagcagaag cggcaccgac ttcaccctga ccatcagctc cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag cactacacca ccccccccac atttggccag 300
ggcaccaagg tggaaatcaa gcgtacggtg gccgctccca gcgtgttcat cttcccacct 360
agcgacgagc agctgaagtc cggcacagcc tctgtcgtgt gcctgctgaa caacttctac 420
ccccgcgagg ccaaagtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagagcgg caacagccag 480
gaaagcgtga ccgagcagga cagcaaggac tccacctaca gcctgagcag caccctgaca 540
ctgagcaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaagtgac ccaccagggc 600
ctgtctagcc ccgtgaccaa gagcttcaac cggggcgagt gt 642
<210> 7
<211> 1713
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 7
caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgag gtcgtgaaac ctggcgcctc tgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta cacctttacc agctactaca tccactgggt gcgccaggcc 120
cctggacagg gactggaatg gatcggcagc atctaccccg gcaacgtgaa caccaactac 180
gcccagaagt tccagggcag agccaccctg accgtggaca ccagcatcag caccgcctac 240
atggaactga gccggctgag aagcgacgac accgccgtgt actactgcac ccggtcccac 300
tacggcctgg attggaactt cgacgtgtgg ggcaagggca ccaccgtgac agtgtctagc 360
agccaggtgc agctggtgga atctggcggc ggagtggtgc agcctggcag aagcctgaga 420
ctgagctgtg ccgccagcgg cttcaccttc accaaggcct ggatgcactg ggtgcgccag 480
gcccctggaa agcagctgga atgggtggcc cagatcaagg acaagagcaa cagctacgcc 540
acctactacg ccgacagcgt gaagggccgg ttcaccatca gccgggacga cagcaagaac 600
accctgtacc tgcagatgaa cagcctgcgg gccgaggaca ccgccgtgta ctactgtcgg 660
ggcgtgtact atgccctgag ccccttcgat tactggggcc agggaaccct cgtgaccgtg 720
tctagtcgga ccgccagcac aaagggccca tcggtgttcc ctctggcccc ttgcagcaga 780
agcaccagcg aatctacagc cgccctgggc tgcctcgtga aggactactt tcccgagccc 840
gtgaccgtgt cctggaactc tggcgctctg acaagcggcg tgcacacctt tccagccgtg 900
ctccagagca gcggcctgta ctctctgagc agcgtcgtga cagtgcccag cagcagcctg 960
ggcaccaaga cctacacctg taacgtggac cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 1020
cgggtggaat ctaagtacgg ccctccctgc cctccttgcc cagcccctga atttctgggc 1080
ggaccctccg tgttcctgtt ccccccaaag cccaaggaca ccctgatgat cagccggacc 1140
cccgaagtga cctgcgtggt ggtggatgtg tcccaggaag atcccgaggt gcagttcaat 1200
tggtacgtgg acggcgtgga agtgcacaac gccaagacca agcccagaga ggaacagttc 1260
aacagcacct accgggtggt gtccgtgctg accgtgctgc accaggactg gctgaacggc 1320
aaagagtaca agtgcaaggt gtccaacaag ggcctgccca gctccatcga gaaaaccatc 1380
agcaaggcca agggccagcc ccgcgagcct caagtgtgta ccctgccccc tagccaggaa 1440
gagatgacca agaaccaggt gtccctgagc tgtgccgtga aaggcttcta ccccagcgac 1500
attgccgtgg aatgggagag caacggccag cccgagaaca actacaagac caccccccct 1560
gtgctggaca gcgacggctc attcttcctg gtgtccaagc tgaccgtgga caagagccgg 1620
tggcaggaag gcaacgtgtt cagctgctcc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1680
acccagaagt ccctgtctct gtccctgggc aag 1713
<210> 8
<211> 1014
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 8
gacatcgtga tgacccagac ccccctgagc ctgagcgtga cacctggaca gcctgccagc 60
atcagctgca agagcagcca gagcctggtg cacaacaacg ccaacaccta cctgagctgg 120
tatctgcaga agcccggcca gagcccccag tccctgatct acaaggtgtc caacagattc 180
agcggcgtgc ccgacagatt ctccggcagc ggctctggca ccgacttcac cctgaagatc 240
agccgggtgg aagccgagga cgtgggcgtg tactattgtg gccagggcac ccagtacccc 300
ttcacctttg gcagcggcac caaggtggaa atcaagggcc agcccaaggc cgcccccgac 360
atccagatga cccagagccc cagcagcctg tctgccagcg tgggcgacag agtgaccatc 420
acctgtcagg ccagccagaa catctacgtg tggctgaact ggtatcagca gaagcccggc 480
aaggccccca agctgctgat ctacaaggcc agcaacctgc acaccggcgt gcccagcaga 540
ttttctggca gcggctccgg caccgacttc accctgacaa tcagctccct gcagcccgag 600
gacattgcca cctactactg ccagcagggc cagacctacc cctacacctt tggccagggc 660
accaagctgg aaatcaagac caagggcccc agccgtacgg tggccgctcc cagcgtgttc 720
atcttcccac ctagcgacga gcagctgaag tccggcacag cctctgtcgt gtgcctgctg 780
aacaacttct acccccgcga ggccaaagtg cagtggaagg tggacaacgc cctgcagagc 840
ggcaacagcc aggaaagcgt gaccgagcag gacagcaagg actccaccta cagcctgagc 900
agcaccctga cactgagcaa ggccgactac gagaagcaca aggtgtacgc ctgcgaagtg 960
acccaccagg gcctgtctag ccccgtgacc aagagcttca accggggcga gtgt 1014
<210> 9
<211> 571
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 9
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Lys Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Lys Gly Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
130 135 140
Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Lys Ala Trp Met His Trp Val Arg Gln
145 150 155 160
Ala Pro Gly Lys Gln Leu Glu Trp Val Ala Gln Ile Lys Asp Lys Ser
165 170 175
Asn Ser Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
180 185 190
Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser
195 200 205
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Arg Gly Val Tyr Tyr
210 215 220
Ala Leu Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser Arg Thr Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
245 250 255
Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
260 265 270
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
275 280 285
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
290 295 300
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
305 310 315 320
Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr
325 330 335
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro
340 345 350
Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
355 360 365
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
370 375 380
Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
385 390 395 400
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
405 410 415
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
420 425 430
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
435 440 445
Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
450 455 460
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu
465 470 475 480
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe
485 490 495
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
500 505 510
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
515 520 525
Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly
530 535 540
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
545 550 555 560
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
565 570
<210> 10
<211> 342
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 10
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val His Asn
20 25 30
Asn Ala Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Ser Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Gly
85 90 95
Thr Gln Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala
115 120 125
Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala
130 135 140
Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr Val Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln
145 150 155 160
Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Phe Ala Ala Ser Asn
165 170 175
Val Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
180 185 190
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Pro Val Glu Ala Asn Asp Val Ala Asn
195 200 205
Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg Lys Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly
210 215 220
Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Lys Gly Pro Ser Arg Thr Val Ala Ala
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
245 250 255
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
260 265 270
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
275 280 285
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
290 295 300
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
305 310 315 320
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
325 330 335
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
340
<210> 11
<211> 1713
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 11
caggtgcagc tgcaggaatc tggccctggc ctcgtgaagc ctagccagac cctgagcctg 60
acctgtaccg tgtccggctt cagcctgagc gactacggcg tgcactgggt gcgccagcca 120
cctggaaaag gcctggaatg gctgggcgtg atctgggctg gcggaggcac caactacaac 180
cccagcctga agtccagaaa gaccatcagc aaggacacca gcaagaacca ggtgtccctg 240
aagctgagca gcgtgacagc cgccgatacc gccgtgtact actgcgccag agacaagggc 300
tacagctact actacagcat ggactactgg ggccagggca ccaccgtgac cgtgtcatcc 360
tctcaggtgc agctggtgga atctggcggc ggagtggtgc agcctggcag aagcctgaga 420
ctgagctgtg ccgccagcgg cttcaccttc accaaggcct ggatgcactg ggtgcgccag 480
gcccctggaa agcagctgga atgggtggcc cagatcaagg acaagagcaa cagctacgcc 540
acctactacg ccgacagcgt gaagggccgg ttcaccatca gccgggacga cagcaagaac 600
accctgtacc tgcagatgaa cagcctgcgg gccgaggaca ccgccgtgta ctactgtcgg 660
ggcgtgtact atgccctgag ccccttcgat tactggggcc agggaaccct cgtgaccgtg 720
tctagtcgga ccgcttcgac caagggccca tcggtgttcc ctctggcccc ttgcagcaga 780
agcaccagcg aatctacagc cgccctgggc tgcctcgtga aggactactt tcccgagccc 840
gtgaccgtgt cctggaactc tggcgctctg acaagcggcg tgcacacctt tccagccgtg 900
ctccagagca gcggcctgta ctctctgagc agcgtcgtga cagtgcccag cagcagcctg 960
ggcaccaaga cctacacctg taacgtggac cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 1020
cgggtggaat ctaagtacgg ccctccctgc cctccttgcc cagcccctga atttctgggc 1080
ggaccctccg tgttcctgtt ccccccaaag cccaaggaca ccctgatgat cagccggacc 1140
cccgaagtga cctgcgtggt ggtggatgtg tcccaggaag atcccgaggt gcagttcaat 1200
tggtacgtgg acggcgtgga agtgcacaac gccaagacca agcccagaga ggaacagttc 1260
aacagcacct accgggtggt gtccgtgctg accgtgctgc accaggactg gctgaacggc 1320
aaagagtaca agtgcaaggt gtccaacaag ggcctgccca gctccatcga gaaaaccatc 1380
agcaaggcca agggccagcc ccgcgagcct caagtgtgta ccctgccccc tagccaggaa 1440
gagatgacca agaaccaggt gtccctgagc tgtgccgtga aaggcttcta ccccagcgac 1500
attgccgtgg aatgggagag caacggccag cccgagaaca actacaagac caccccccct 1560
gtgctggaca gcgacggctc attcttcctg gtgtccaagc tgaccgtgga caagagccgg 1620
tggcaggaag gcaacgtgtt cagctgctcc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1680
acccagaagt ccctgtctct gtccctgggc aag 1713
<210> 12
<211> 1026
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 12
gacatcgtga tgacccagac ccccctgagc ctgagcgtga cacctggaca gcctgccagc 60
atcagctgca agagcagcca gagcctggtg cacaacaacg ccaacaccta cctgagctgg 120
tatctgcaga agcccggcca gagcccccag tccctgatct acaaggtgtc caacagattc 180
agcggcgtgc ccgacagatt ctccggcagc ggctctggca ccgacttcac cctgaagatc 240
agccgggtgg aagccgagga cgtgggcgtg tactattgtg gccagggcac ccagtacccc 300
ttcacctttg gcagcggcac caaggtggaa atcaagggcc agcccaaggc cgcccccgac 360
atcgtgctga cacagagccc tgctagcctg gccgtgtctc ctggacagag ggccaccatc 420
acctgtagag ccagcgagag cgtggaatat tacgtgacca gcctgatgca gtggtatcag 480
cagaagcccg gccagccccc caagctgctg attttcgccg ccagcaacgt ggaaagcggc 540
gtgccagcca gattttccgg cagcggctct ggcaccgact tcaccctgac catcaacccc 600
gtggaagcca acgacgtggc caactactac tgccagcaga gccggaaggt gccctacacc 660
tttggccagg gcaccaagct ggaaatcaag accaagggcc ccagccgtac ggtggccgct 720
cccagcgtgt tcatcttccc acctagcgac gagcagctga agtccggcac agcctctgtc 780
gtgtgcctgc tgaacaactt ctacccccgc gaggccaaag tgcagtggaa ggtggacaac 840
gccctgcaga gcggcaacag ccaggaaagc gtgaccgagc aggacagcaa ggactccacc 900
tacagcctga gcagcaccct gacactgagc aaggccgact acgagaagca caaggtgtac 960
gcctgcgaag tgacccacca gggcctgtct agccccgtga ccaagagctt caaccggggc 1020
gagtgt 1026
<210> 13
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 13
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu
130 135 140
Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn
195 200 205
Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser
210 215 220
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Gly Lys
450
<210> 14
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 14
Asp Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asn Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Thr
85 90 95
Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 15
<211> 1353
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 15
caggtgcagc tggtgcagag cggcgccgaa gtgaagaagc ctggcagcag cgtgaaggtg 60
agctgcaagg ccagcggcta tgccttcagc agctactgga tgaactgggt gaggcaggca 120
cctggccagg gcctggagtg gataggccaa atatggcctg gcgatggcga caccaactac 180
aaccagaagt tcaagggcag agcgaccttg accgccgacg agagcaccag caccgcgtac 240
atggagctga gcagcctgag gagcgaggac accgccgtgt actattgcgc cagaagggag 300
accaccaccg tgggcaggta ctactacgcc atggactact ggggccaggg aaccaccgtg 360
accgtgagca gcgcctcgac caagggccca tcggtgttcc ctctggcccc ttgcagcaga 420
agcaccagcg aatctacagc cgccctgggc tgcctcgtga aggactactt tcccgagccc 480
gtgaccgtgt cctggaactc tggcgctctg acaagcggcg tgcacacctt tccagccgtg 540
ctccagagca gcggcctgta ctctctgagc agcgtcgtga cagtgcccag cagcagcctg 600
ggcaccaaga cctacacctg taacgtggac cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 660
cgggtggaat ctaagtacgg ccctccctgc cctccttgcc cagcccctga atttctgggc 720
ggaccctccg tgttcctgtt ccccccaaag cccaaggaca ccctgatgat cagccggacc 780
cccgaagtga cctgcgtggt ggtggatgtg tcccaggaag atcccgaggt gcagttcaat 840
tggtacgtgg acggcgtgga agtgcacaac gccaagacca agcccagaga ggaacagttc 900
aacagcacct accgggtggt gtccgtgctg accgtgctgc accaggactg gctgaacggc 960
aaagagtaca agtgcaaggt gtccaacaag ggcctgccca gctccatcga gaaaaccatc 1020
agcaaggcca agggccagcc ccgcgagcct caagtgtata ccctgccccc ttgccaggaa 1080
gagatgacca agaaccaggt gtccctgtgg tgtctcgtga aaggcttcta ccccagcgac 1140
attgccgtgg aatgggagag caacggccag cccgagaaca actacaagac caccccccct 1200
gtgctggaca gcgacggctc attcttcctg tactccaagc tgaccgtgga caagagccgg 1260
tggcaggaag gcaacgtgtt cagctgctcc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1320
acccagaagt ccctgtctct gtccctgggc aag 1353
<210> 16
<211> 654
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 16
gacctcgtgc tgacccagag ccctgcgagc ctggctgtga gccctggcca gagagccacc 60
atcacctgca aagccagcca gagcgtggac tacgacggcg acagctacct caactggtac 120
cagcagaagc ctggccagcc ccccaagctg ctgatttacg atgccagcaa cctggtgagc 180
ggcgtgcctg ctagattcag cggctccggc agcggcaccg acttcaccct gaccatcaac 240
cccgtggagg ccaacgacac cgccaactac tactgccagc agagcacgga ggacccctgg 300
accttcggcc agggcacaaa gctggagatc aagcgtacgg tggccgctcc cagcgtgttc 360
atcttcccac ctagcgacga gcagctgaag tccggcacag cctctgtcgt gtgcctgctg 420
aacaacttct acccccgcga ggccaaagtg cagtggaagg tggacaacgc cctgcagagc 480
ggcaacagcc aggaaagcgt gaccgagcag gacagcaagg actccaccta cagcctgagc 540
agcaccctga cactgagcaa ggccgactac gagaagcaca aggtgtacgc ctgcgaagtg 600
acccaccagg gcctgtctag ccccgtgacc aagagcttca accggggcga gtgt 654
<210> 17
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 17
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Lys Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Lys Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met His Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Tyr Tyr Gly Ser Asn Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Cys Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 18
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 18
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Leu Ser Met Ser Thr Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Pro Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Val
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ile Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Pro Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 19
<211> 1341
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 19
caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtggccaagc ctggcacaag cgtgaagctg 60
agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc gactactgga tgcagtgggt caagcagagg 120
ccaggccagg gcctggaatg gatcggcaca atctatcccg gcgacggcga taccggctac 180
gcccagaagt ttcagggcaa ggccaccctg accgccgaca agagcagcaa gaccgtgtac 240
atgcacctga gcagcctggc cagcgaggac agcgccgtgt actattgcgc cagaggcgac 300
tactacggca gcaacagcct ggactattgg ggccagggca ccagcgtgac agtgtctagt 360
gcgtcgacca agggcccatc ggtgttccct ctggcccctt gcagcagaag caccagcgaa 420
tctacagccg ccctgggctg cctcgtgaag gactactttc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480
tggaactctg gcgctctgac aagcggcgtg cacacctttc cagccgtgct ccagagcagc 540
ggcctgtact ctctgagcag cgtcgtgaca gtgcccagca gcagcctggg caccaagacc 600
tacacctgta acgtggacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagcg ggtggaatct 660
aagtacggcc ctccctgccc tccttgccca gcccctgaat ttctgggcgg accctccgtg 720
ttcctgttcc ccccaaagcc caaggacacc ctgatgatca gccggacccc cgaagtgacc 780
tgcgtggtgg tggatgtgtc ccaggaagat cccgaggtgc agttcaattg gtacgtggac 840
ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag cccagagagg aacagttcaa cagcacctac 900
cgggtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa agagtacaag 960
tgcaaggtgt ccaacaaggg cctgcccagc tccatcgaga aaaccatcag caaggccaag 1020
ggccagcccc gcgagcctca agtgtatacc ctgccccctt gccaggaaga gatgaccaag 1080
aaccaggtgt ccctgtggtg tctcgtgaaa ggcttctacc ccagcgacat tgccgtggaa 1140
tgggagagca acggccagcc cgagaacaac tacaagacca ccccccctgt gctggacagc 1200
gacggctcat tcttcctgta ctccaagctg accgtggaca agagccggtg gcaggaaggc 1260
aacgtgttca gctgctccgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagtcc 1320
ctgtctctgt ccctgggcaa g 1341
<210> 20
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 20
gacatcgtga tgacccagag ccacctgagc atgagcacca gcctgggcga ccccgtgtcc 60
atcacctgta aagccagcca ggacgtgtcc accgtggtgg cctggtatca gcagaagcct 120
ggccagagcc ccagacggct gatctacagc gccagctatc ggtacatcgg cgtgcccgac 180
agattcaccg gaagcggagc cggcaccgac ttcaccttca ccatcagctc tgtgcaggcc 240
gaggacctgg ccgtgtacta ctgccagcag cactacagcc ccccctacac ctttggcgga 300
ggcaccaagc tggaaatcaa gcgtacggtg gccgctccca gcgtgttcat cttcccacct 360
agcgacgagc agctgaagtc cggcacagcc tctgtcgtgt gcctgctgaa caacttctac 420
ccccgcgagg ccaaagtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagagcgg caacagccag 480
gaaagcgtga ccgagcagga cagcaaggac tccacctaca gcctgagcag caccctgaca 540
ctgagcaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaagtgac ccaccagggc 600
ctgtctagcc ccgtgaccaa gagcttcaac cggggcgagt gt 642
<210> 21
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 21
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Asn Ile His Trp Val Lys Lys Ser Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Ala Pro Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Thr Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Ala Asn Trp Asp Val Ala Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys
340 345 350
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 22
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 22
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asp Arg Tyr
20 25 30
Met Ala Trp Tyr Gln Asp Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
His Asp Thr Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 23
<211> 1335
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 23
caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ccggcagcag cgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta catcttcacc aactacaaca tccactgggt caagaagtcc 120
ccaggccagg gcctggaatg gatcggcgcc atctatcccg gaaacggcga cgccccttac 180
agccagaagt tccagggcaa ggccaccctg accgccgata ccagcacctc caccacctac 240
atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actattgcgt gcgggccaac 300
tgggatgtgg ccttcgccta ttggggccag ggcacactcg tgaccgtgtc ctctgcgtcg 360
accaagggcc catcggtgtt ccctctggcc ccttgcagca gaagcaccag cgaatctaca 420
gccgccctgg gctgcctcgt gaaggactac tttcccgagc ccgtgaccgt gtcctggaac 480
tctggcgctc tgacaagcgg cgtgcacacc tttccagccg tgctccagag cagcggcctg 540
tactctctga gcagcgtcgt gacagtgccc agcagcagcc tgggcaccaa gacctacacc 600
tgtaacgtgg accacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agcgggtgga atctaagtac 660
ggccctccct gccctccttg cccagcccct gaatttctgg gcggaccctc cgtgttcctg 720
ttccccccaa agcccaagga caccctgatg atcagccgga cccccgaagt gacctgcgtg 780
gtggtggatg tgtcccagga agatcccgag gtgcagttca attggtacgt ggacggcgtg 840
gaagtgcaca acgccaagac caagcccaga gaggaacagt tcaacagcac ctaccgggtg 900
gtgtccgtgc tgaccgtgct gcaccaggac tggctgaacg gcaaagagta caagtgcaag 960
gtgtccaaca agggcctgcc cagctccatc gagaaaacca tcagcaaggc caagggccag 1020
ccccgcgagc ctcaagtgta taccctgccc ccttgccagg aagagatgac caagaaccag 1080
gtgtccctgt ggtgtctcgt gaaaggcttc taccccagcg acattgccgt ggaatgggag 1140
agcaacggcc agcccgagaa caactacaag accacccccc ctgtgctgga cagcgacggc 1200
tcattcttcc tgtactccaa gctgaccgtg gacaagagcc ggtggcagga aggcaacgtg 1260
ttcagctgct ccgtgatgca cgaggccctg cacaaccact acacccagaa gtccctgtct 1320
ctgtccctgg gcaag 1335
<210> 24
<211> 639
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 24
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgtctgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacatgca aggccagcca ggacatcgat cggtacatgg cctggtatca ggacaagccc 120
ggcaaggccc ccagactgct gatccacgat accagcacac tgcagagcgg cgtgcccagc 180
agattttccg gctctggcag cggcagagac tacaccctga ccatcagcaa cctggaaccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgcctgcag tacgacaacc tgtggacctt cggcggaggc 300
accaaggtgg aaatcaagcg tacggtggcc gctcccagcg tgttcatctt cccacctagc 360
gacgagcagc tgaagtccgg cacagcctct gtcgtgtgcc tgctgaacaa cttctacccc 420
cgcgaggcca aagtgcagtg gaaggtggac aacgccctgc agagcggcaa cagccaggaa 480
agcgtgaccg agcaggacag caaggactcc acctacagcc tgagcagcac cctgacactg 540
agcaaggccg actacgagaa gcacaaggtg tacgcctgcg aagtgaccca ccagggcctg 600
tctagccccg tgaccaagag cttcaaccgg ggcgagtgt 639
<210> 25
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 25
Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr
1 5
<210> 26
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 26
Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr
1 5
<210> 27
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 27
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 28
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 28
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr
1 5
<210> 29
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 29
Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr
1 5
<210> 30
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 30
Thr Arg Ser His Tyr Gly Leu Asp Trp Asn Phe Asp Val
1 5 10
<210> 31
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 31
Gly Phe Ser Leu Ser Asp Tyr Gly
1 5
<210> 32
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 32
Ile Trp Ala Gly Gly Gly Thr
1 5
<210> 33
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 33
Ala Arg Asp Lys Gly Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp
1 5 10
<210> 34
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 34
Gly Phe Thr Phe Thr Lys Ala Trp
1 5
<210> 35
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 35
Ile Lys Asp Lys Ser Asn Ser
1 5
<210> 36
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 36
Arg Gly Val Tyr Tyr Ala Leu Ser Pro Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 37
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 37
Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr Trp
1 5
<210> 38
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 38
Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr
1 5
<210> 39
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 39
Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp
1 5 10 15
<210> 40
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 40
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Trp
1 5
<210> 41
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 41
Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr
1 5
<210> 42
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 42
Ala Arg Gly Asp Tyr Tyr Gly Ser Asn Ser Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 43
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 43
Gln Asp Val Asn Thr Ala
1 5
<210> 44
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 44
Ser Ala Ser
1
<210> 45
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 45
Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr
1 5
<210> 46
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 46
Gln Asn Ile Tyr Val Trp
1 5
<210> 47
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 47
Lys Ala Ser
1
<210> 48
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 48
Gln Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 49
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 49
Glu Ser Val Glu Tyr Tyr Val Thr Ser Leu
1 5 10
<210> 50
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 50
Ala Ala Ser
1
<210> 51
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 51
Gln Gln Ser Arg Lys Val Pro Tyr Thr
1 5
<210> 52
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 52
Gln Ser Leu Val His Asn Asn Ala Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 53
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 53
Lys Val Ser
1
<210> 54
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 54
Gly Gln Gly Thr Gln Tyr Pro
1 5
<210> 55
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 55
Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr
1 5 10
<210> 56
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 56
Asp Ala Ser
1
<210> 57
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 57
Gln Gln Ser Thr Glu Asp Pro Trp Thr
1 5
<210> 58
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 58
Gln Asp Val Ser Thr Val
1 5
<210> 59
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 59
Gln Gln His Tyr Ser Pro Pro Tyr Thr
1 5
<210> 60
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 60
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly
450
<210> 61
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 61
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gln Pro Lys Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala
115 120 125
Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala
130 135 140
Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val
145 150 155 160
Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser
165 170 175
Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr
180 185 190
Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala
195 200 205
Pro Thr Glu Cys Ser
210
<210> 62
<211> 570
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 62
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile His Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Ile Asp Pro Ser Asp Gly Glu Thr Arg Leu Asn Gln Arg Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Arg Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Leu Lys Glu Tyr Gly Asn Tyr Asp Ser Phe Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Ala Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Val Gln Leu Lys
115 120 125
Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Gly Gly Ser Leu Ser Ile Thr
130 135 140
Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asp Ser Ser Ile Asn Trp Val
145 150 155 160
Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Met Ile Trp Gly
165 170 175
Asp Gly Arg Ile Asp Tyr Ala Asp Ala Leu Lys Ser Arg Leu Ser Ile
180 185 190
Ser Lys Asp Ser Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Glu Met Thr Ser Leu
195 200 205
Arg Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Tyr Phe
210 215 220
Pro Tyr Ala Met Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser
225 230 235 240
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
245 250 255
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
260 265 270
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
275 280 285
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
290 295 300
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
305 310 315 320
Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
325 330 335
Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
340 345 350
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
355 360 365
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
370 375 380
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
385 390 395 400
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
405 410 415
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
420 425 430
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
435 440 445
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
450 455 460
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp
465 470 475 480
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe
485 490 495
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
500 505 510
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
515 520 525
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
530 535 540
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe
545 550 555 560
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
565 570
<210> 63
<211> 345
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 63
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr
20 25 30
Gly Gln Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp
65 70 75 80
Pro Val Gln Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Ala
85 90 95
Glu Asp Ser Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Ser Ser Gly Ser Gly Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser
115 120 125
Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly Asp Thr Ile Thr Leu Thr Cys
130 135 140
His Ala Ser Gln Asn Ile Asp Val Trp Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys
145 150 155 160
Pro Gly Asn Ile Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His
165 170 175
Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe
180 185 190
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr
195 200 205
Cys Gln Gln Ala His Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
210 215 220
Leu Glu Ile Lys Gly Gly Ser Gly Ser Ser Gly Ser Gly Gly Arg Thr
225 230 235 240
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
245 250 255
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
260 265 270
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
275 280 285
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
290 295 300
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
305 310 315 320
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
325 330 335
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
340 345
<210> 64
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 64
gaggtgcagc tggtggaaag cggcggagga ctggtgcagc ccggcagaag cctgagactg 60
agctgcgccg ccagcggctt caccttcgac gactacgcca tgcactgggt ccgccaggcc 120
cctggcaagg gcctggaatg ggtgtccgcc atcacctgga acagcggcca catcgactac 180
gccgacagcg tggaaggccg gttcaccatc agccgggaca acgccaagaa cagcctgtac 240
ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caaggtgtcc 300
tacctgagca ccgccagcag cctggactac tggggccagg gcaccctggt gacagtgtcc 360
agcgcttcca ccaagggccc cagcgtgttc cccctggccc ctagcagcaa gagcacatct 420
ggcggcacag ccgccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgagcc cgtgacagtg 480
tcctggaact ctggcgccct gaccagcgga gtgcatacct tccctgccgt gctgcagtcc 540
agcggcctgt acagcctgag cagcgtggtc acagtgccca gcagcagcct gggcacccag 600
acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaggtggaa 660
cccaagagct gcgacaagac ccacacctgt cccccctgcc ctgcccctga actgctgggc 720
ggaccctccg tgttcctgtt ccccccaaag cccaaggaca ccctgatgat cagccggacc 780
cccgaagtga cctgcgtggt ggtggacgtg tcccacgagg accctgaagt gaagttcaat 840
tggtacgtgg acggcgtgga agtgcataac gccaagacca agcccagaga ggaacagtac 900
aacagcacct accgggtggt gtccgtgctg accgtgctgc accaggactg gctgaacggc 960
aaagagtaca agtgcaaggt gtccaacaag gccctgcctg cccccatcga gaaaaccatc 1020
agcaaggcca agggccagcc tagagagccc caagtctgca ccctgccccc cagcagagat 1080
gagctgacca agaaccaggt gtccctgagc tgcgccgtga agggcttcta ccccagcgat 1140
atcgccgtgg aatgggagag caacggccag cccgagaaca actacaagac caccccccct 1200
gtgctggaca gcgacggctc attcttcctg gtgtccaagc tgacagtgga caagagccgg 1260
tggcagcagg gcaacgtgtt cagctgcagc gtgatgcacg aggccctgca caaccattac 1320
acccagaagt ccctgagcct gagccccggc 1350
<210> 65
<211> 639
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 65
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacctgtc gggccagcca gggcatccgg aactacctgg cctggtatca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctacgcc gccagcacac tgcagagcgg cgtgcccagc 180
agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240
gaggacgtgg ccacctacta ctgccagcgg tacaacagag ccccctacac cttcggccag 300
ggcaccaagg tggaaatcaa gggacagccc aaggctgccc cctcggtcac cctgttcccc 360
ccaagcagcg aggaactgca ggccaacaag gccaccctcg tgtgcctgat cagcgacttc 420
taccctggcg ccgtgaccgt ggcctggaag gccgatagct ctcccgtgaa ggccggcgtg 480
gaaaccacca cccccagcaa gcagagcaac aacaaatacg ccgcctccag ctacctgagc 540
ctgacccccg agcagtggaa gtcccaccgg tcctacagct gccaggtcac acacgagggc 600
agcaccgtgg aaaagaccgt ggcccccacc gagtgcagc 639
<210> 66
<211> 1710
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 66
caggtgcagc tgcagcagag cggccctgag ctggtcaagc ctggcgccag cgtgaagatc 60
agctgcaagg ccagcggcta cagcttcacc agctactgga tccactggat caagcagcgg 120
cctggccagg gcctggaatg gatcggcatg atcgacccca gcgacggcga gacacggctg 180
aaccagagat tccagggcag agccaccctg accgtggacg agagcaccag caccgcctac 240
atgcagctgc ggagccccac cagcgaggac agcgccgtgt actactgcac ccggctgaaa 300
gagtacggca actacgacag cttctacttc gacgtgtggg gagccggcac cctggtcacc 360
gtgtccagcg aagtgcagct gaaagaaagc ggccctggcc tggtggcccc tggcggcagc 420
ctgagcatca cctgtaccgt gtccggcttc agcctgaccg acagcagcat caactgggtc 480
cgacagcccc ctggcaaggg cctcgagtgg ctgggaatga tctggggcga cggccggatc 540
gactacgccg acgccctgaa gtcccggctg agcatcagca aggacagcag caagagccag 600
gtgttcctgg aaatgaccag cctgcggacc gacgacaccg ccacctacta ctgcgccagg 660
gacggctact tcccctacgc catggatttc tggggccagg gcaccagcgt gaccgtgtcc 720
tctgcttcca ccaagggccc cagcgtgttc cctctggccc ctagcagcaa gagcacatct 780
ggcggaacag ccgccctggg ctgcctggtc aaggactact ttcccgagcc cgtgaccgtg 840
tcctggaact ctggtgccct gacaagcgga gtgcatacct tccctgccgt gctgcagagc 900
agcggcctgt actctctgag cagcgtggtc accgtgccaa gcagcagcct gggcacccag 960
acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc tccaacacca aggtggacaa gaaggtggaa 1020
cccaagagct gcgacaagac ccacacctgt cctccctgtc ctgcccctga actgctgggc 1080
ggaccctccg tgttcctgtt ccctccaaag cccaaggata ccctgatgat cagccggacc 1140
cctgaagtga cctgcgtggt ggtggacgtg tcccacgagg atcccgaagt gaagttcaat 1200
tggtacgtgg acggcgtgga agtgcataac gccaagacca agcccagaga ggaacagtac 1260
aacagcacct accgggtggt gtccgtgctg acagtgctgc accaggactg gctgaacggc 1320
aaagagtaca agtgcaaggt gtccaacaag gccctgccag cccctatcga gaaaaccatc 1380
agcaaggcca agggccagcc ccgcgagcct caggtgtaca cactgcctcc atgccgggac 1440
gagctgacca agaaccaggt gtccctgtgg tgcctcgtga agggcttcta cccctccgat 1500
atcgccgtgg aatgggagag caacggccag cccgagaaca actacaagac cacccctccc 1560
gtgctggaca gcgacggctc attcttcctg tacagcaagc tgaccgtgga caagtcccgg 1620
tggcagcagg gcaacgtgtt cagctgctct gtgatgcacg aggccctgca caaccggttc 1680
acccagaagt ccctgagcct gagccctggc 1710
<210> 67
<211> 1035
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 67
gacatcgtgc tgacccagag ccctgccagc ctggccgtgt ctctgggcca gagagccacc 60
atcagctgcc gggccagcga gagcgtggac agctacggcc agagctacat gcactggtat 120
cagcagaagg ccggccagcc ccccaagctg ctgatctacc tggccagcaa cctggaaagc 180
ggcgtgcccg ccagattcag cggcagcggc agcagaaccg acttcaccct gaccatcgac 240
cccgtgcagg ccgaggacgc cgccacctac tactgccagc agaacgccga ggacagccgg 300
accttcggcg gaggcaccaa gctggaaatc aagggcggct ccggcagcag cggctctggc 360
ggcgatatcc agatgaccca gtcccccgcc tccctgagcg tgtccgtggg cgacaccatc 420
accctgacat gccacgccag ccagaacatc gacgtgtggc tgagctggtt ccagcagaag 480
cctggcaaca tccctaagct gctcatctat aaggcctcca acctgcacac cggcgtgccc 540
agcaggtttt ccggctctgg cagcggcacc ggctttaccc tgacaatcag cagcctgcag 600
cccgaggata tcgccacata ttactgtcag caggcccaca gctacccctt cacctttggc 660
ggcggaacaa agctcgagat taagggcggc agcggaagct ccggctccgg cggacgtacg 720
gtggccgctc cttccgtgtt catcttccct ccctccgacg agcagctgaa gtccggcacc 780
gcctccgtgg tgtgtctgct gaacaacttc taccctcggg aggccaaggt gcagtggaag 840
gtggacaacg ccctgcagtc cggcaactcc caggagtccg tcaccgagca ggactccaag 900
gacagcacct actccctgtc ctccaccctg accctgtcca aggccgacta cgagaagcac 960
aaggtgtacg cctgtgaggt gacccaccag ggcctgtcca gccctgtgac caagtccttc 1020
aaccggggcg agtgc 1035
<210> 68
<211> 570
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 68
Glu Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asp Ser
20 25 30
Ser Ile Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Arg Ile Asp Tyr Ala Asp Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Glu Met Thr Ser Leu Arg Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Gly Tyr Phe Pro Tyr Ala Met Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu
115 120 125
Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly
130 135 140
Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile His Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly
145 150 155 160
Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Met Ile Asp Pro Ser Asp Gly Glu Thr
165 170 175
Arg Leu Asn Gln Arg Phe Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Glu
180 185 190
Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Arg Ser Pro Thr Ser Glu Asp
195 200 205
Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Leu Lys Glu Tyr Gly Asn Tyr Asp
210 215 220
Ser Phe Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
225 230 235 240
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
245 250 255
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
260 265 270
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
275 280 285
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
290 295 300
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
305 310 315 320
Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
325 330 335
Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
340 345 350
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
355 360 365
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
370 375 380
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
385 390 395 400
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
405 410 415
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
420 425 430
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
435 440 445
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
450 455 460
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp
465 470 475 480
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe
485 490 495
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
500 505 510
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
515 520 525
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
530 535 540
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe
545 550 555 560
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
565 570
<210> 69
<211> 345
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 69
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Thr Ile Thr Leu Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Asp Val Trp
20 25 30
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ile Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala His Ser Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Ser Gly Ser
100 105 110
Ser Gly Ser Gly Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu
115 120 125
Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu
130 135 140
Ser Val Asp Ser Tyr Gly Gln Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys
145 150 155 160
Ala Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu
165 170 175
Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe
180 185 190
Thr Leu Thr Ile Asp Pro Val Gln Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr
195 200 205
Cys Gln Gln Asn Ala Glu Asp Ser Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
210 215 220
Leu Glu Ile Lys Gly Gly Ser Gly Ser Ser Gly Ser Gly Gly Arg Thr
225 230 235 240
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
245 250 255
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
260 265 270
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
275 280 285
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
290 295 300
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
305 310 315 320
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
325 330 335
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
340 345
<210> 70
<211> 1035
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 70
gacatccaga tgacccagag ccccgccagc ctgagcgtgt ccgtgggcga taccatcacc 60
ctgacctgcc acgccagcca gaacatcgac gtgtggctga gctggttcca gcagaagccc 120
ggcaacatcc ccaagctgct gatctacaag gccagcaacc tgcacaccgg cgtgcccagc 180
agattcagcg gctctggcag cggcaccggc tttaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240
gaggatatcg ccacctacta ctgccagcag gcccacagct accccttcac cttcggcgga 300
ggcaccaagc tggaaatcaa gggcggcagc ggcagctccg gctctggcgg cgatatcgtg 360
ctgacccagt ctcccgcctc cctggccgtg tctctgggcc agagagccac catcagctgc 420
cgggccagcg agagcgtgga cagctacggc cagagctaca tgcactggta tcagcagaag 480
gccggacagc cccctaaact gctcatctac ctggcctcca acctggaaag cggcgtgccc 540
gccaggtttt ccggcagcgg ctccagaacc gacttcaccc tgacaatcga ccccgtgcag 600
gccgaggacg ccgccacata ttactgtcag cagaacgccg aggacagcag aacctttggc 660
ggcggaacaa agctcgagat taagggcggc tccggctcca gcggatctgg cggacgtacg 720
gtggccgctc cttccgtgtt catcttccct ccctccgacg agcagctgaa gtccggcacc 780
gcctccgtgg tgtgtctgct gaacaacttc taccctcggg aggccaaggt gcagtggaag 840
gtggacaacg ccctgcagtc cggcaactcc caggagtccg tcaccgagca ggactccaag 900
gacagcacct actccctgtc ctccaccctg accctgtcca aggccgacta cgagaagcac 960
aaggtgtacg cctgtgaggt gacccaccag ggcctgtcca gccctgtgac caagtccttc 1020
aaccggggcg agtgc 1035
<210> 71
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 71
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 72
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 72
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacctgtc gggccagcca gggcatccgg aactacctgg cctggtatca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctacgcc gccagcacac tgcagagcgg cgtgcccagc 180
agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240
gaggacgtgg ccacctacta ctgccagcgg tacaacagag ccccctacac cttcggccag 300
ggcaccaagg tggaaatcaa gcgtacggtg gccgctcctt ccgtgttcat cttccctccc 360
tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc tccgtggtgt gtctgctgaa caacttctac 420
cctcgggagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg caactcccag 480
gagtccgtca ccgagcagga ctccaaggac agcacctact ccctgtcctc caccctgacc 540
ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gtgaggtgac ccaccagggc 600
ctgtccagcc ctgtgaccaa gtccttcaac cggggcgagt gc 642
<210> 73
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 73
Glu Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asp Ser
20 25 30
Ser Ile Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Arg Ile Asp Tyr Ala Asp Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Glu Met Thr Ser Leu Arg Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Gly Tyr Phe Pro Tyr Ala Met Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys
355 360 365
Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 74
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 74
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr
20 25 30
Gly Gln Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp
65 70 75 80
Pro Val Gln Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Ala
85 90 95
Glu Asp Ser Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
115 120 125
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
130 135 140
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val
145 150 155 160
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
165 170 175
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
180 185 190
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
195 200 205
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 75
<211> 573
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 75
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile His Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Ile Asp Pro Ser Asp Gly Glu Thr Arg Leu Asn Gln Arg Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Arg Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Leu Lys Glu Tyr Gly Asn Tyr Asp Ser Phe Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Ala Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Val Gln Leu Val
115 120 125
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser
130 135 140
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala Met His Trp Val
145 150 155 160
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Thr Trp
165 170 175
Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr
180 185 190
Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser
195 200 205
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Val Ser Tyr
210 215 220
Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
225 230 235 240
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
245 250 255
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
260 265 270
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
275 280 285
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
290 295 300
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
305 310 315 320
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
325 330 335
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
340 345 350
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
355 360 365
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
370 375 380
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
385 390 395 400
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
405 410 415
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
420 425 430
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
435 440 445
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
450 455 460
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
465 470 475 480
Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val
485 490 495
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
500 505 510
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
515 520 525
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
530 535 540
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
545 550 555 560
Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
565 570
<210> 76
<211> 341
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 76
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Ser Gly Ser
100 105 110
Ser Gly Ser Gly Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu
115 120 125
Ser Val Ser Val Gly Asp Thr Ile Thr Leu Thr Cys His Ala Ser Gln
130 135 140
Asn Ile Asp Val Trp Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ile
145 150 155 160
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro
165 170 175
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile
180 185 190
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala
195 200 205
His Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
210 215 220
Gly Gly Ser Gly Ser Ser Gly Ser Gly Gly Arg Thr Val Ala Ala Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
245 250 255
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
260 265 270
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
275 280 285
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
290 295 300
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
305 310 315 320
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
325 330 335
Asn Arg Gly Glu Cys
340
<210> 77
<211> 1341
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 77
gaggtgcagc tgaaggagag cggccccggc ctggtggccc ccggcggcag cctgagcatc 60
acctgcaccg tgagcggctt cagcctgacc gacagcagca tcaactgggt gcgccagccc 120
cccggcaagg gcctggagtg gctgggcatg atctggggcg acggccgcat cgactacgcc 180
gacgccctga agagccgcct gagcatcagc aaggacagca gcaagagcca ggtgttcctg 240
gagatgacca gcctgcgcac cgacgacacc gccacctact actgcgcccg cgacggctac 300
ttcccctacg ccatggactt ctggggccag ggcaccagcg tgaccgtgag cagcgccagc 360
accaagggcc ccagcgtgtt ccccctggcc cctagcagca agagcacatc tggcggcaca 420
gccgccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgagc ccgtgacagt gtcctggaac 480
tctggcgccc tgaccagcgg agtgcatacc ttccctgccg tgctgcagtc cagcggcctg 540
tacagcctga gcagcgtggt cacagtgccc agcagcagcc tgggcaccca gacctacatc 600
tgcaacgtga accacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaggtgga acccaagagc 660
tgcgacaaga cccacacctg tcccccctgc cctgcccctg aactgctggg cggaccctcc 720
gtgttcctgt tccccccaaa gcccaaggac accctgatga tcagccggac ccccgaagtg 780
acctgcgtgg tggtggacgt gtcccacgag gaccctgaag tgaagttcaa ttggtacgtg 840
gacggcgtgg aagtgcataa cgccaagacc aagcccagag aggaacagta caacagcacc 900
taccgggtgg tgtccgtgct gaccgtgctg caccaggact ggctgaacgg caaagagtac 960
aagtgcaagg tgtccaacaa ggccctgcct gcccccatcg agaaaaccat cagcaaggcc 1020
aagggccagc ctagagagcc ccaagtctgc accctgcccc ccagcagaga tgagctgacc 1080
aagaaccagg tgtccctgag ctgcgccgtg aagggcttct accccagcga tatcgccgtg 1140
gaatgggaga gcaacggcca gcccgagaac aactacaaga ccaccccccc tgtgctggac 1200
agcgacggct cattcttcct ggtgtccaag ctgacagtgg acaagagccg gtggcagcag 1260
ggcaacgtgt tcagctgcag cgtgatgcac gaggccctgc acaaccatta cacccagaag 1320
tccctgagcc tgagccccgg c 1341
<210> 78
<211> 651
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 78
gacatcgtgc tgacccagag ccctgccagc ctggccgtgt ctctgggcca gagagccacc 60
atcagctgcc gggccagcga gagcgtggac agctacggcc agagctacat gcactggtat 120
cagcagaagg ccggccagcc ccccaagctg ctgatctacc tggccagcaa cctggaaagc 180
ggcgtgcccg ccagattcag cggcagcggc agcagaaccg acttcaccct gaccatcgac 240
cccgtgcagg ccgaggacgc cgccacctac tactgccagc agaacgccga ggacagccgg 300
accttcggcg gaggcaccaa gctggaaatc aagggacagc ccaaggctgc cccctcggtc 360
accctgttcc ccccaagcag cgaggaactg caggccaaca aggccaccct cgtgtgcctg 420
atcagcgact tctaccctgg cgccgtgacc gtggcctgga aggccgatag ctctcccgtg 480
aaggccggcg tggaaaccac cacccccagc aagcagagca acaacaaata cgccgccagc 540
agctacctga gcctgacccc cgagcagtgg aagtcccacc ggtcctacag ctgccaggtc 600
acacacgagg gcagcaccgt ggaaaagacc gtggccccca ccgagtgcag c 651
<210> 79
<211> 1719
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 79
caggtgcagc tgcagcagag cggccctgag ctggtcaagc ctggcgccag cgtgaagatc 60
agctgcaagg ccagcggcta cagcttcacc agctactgga tccactggat caagcagcgg 120
cctggccagg gcctggaatg gatcggcatg atcgacccca gcgacggcga gacacggctg 180
aaccagagat tccagggcag agccaccctg accgtggacg agagcaccag caccgcctac 240
atgcagctgc ggagccccac cagcgaggac agcgccgtgt actactgcac ccggctgaaa 300
gagtacggca actacgacag cttctacttc gacgtgtggg gagccggcac cctggtcacc 360
gtgtccagcg aagtgcagct ggtggaaagc ggcggaggcc tggtgcagcc cggcagaagc 420
ctgagactga gctgcgccgc cagcggcttc accttcgacg actacgccat gcactgggtc 480
cgacaggccc ctggcaaagg actggaatgg gtgtccgcca tcacctggaa cagcggccac 540
atcgactacg ccgacagcgt ggaaggccgg ttcaccatca gccgggacaa cgccaagaac 600
agcctgtacc tgcagatgaa cagcctgcgg gccgaggata ccgccgtgta ttattgcgcc 660
aaggtgtcct acctgagcac cgccagcagc ctggactact ggggccaggg caccctcgtg 720
acagtgtcct ccgcttccac caagggcccc agcgtgttcc ctctggcccc tagcagcaag 780
agcacatctg gcggaacagc cgccctgggc tgcctggtca aggactactt tcccgagccc 840
gtgaccgtgt cctggaactc tggtgccctg acaagcggag tgcatacctt ccctgccgtg 900
ctgcagagca gcggcctgta ctctctgagc agcgtggtca ccgtgccaag cagcagcctg 960
ggcacccaga cctacatctg caacgtgaac cacaagccct ccaacaccaa ggtggacaag 1020
aaggtggaac ccaagagctg cgacaagacc cacacctgtc ctccctgtcc tgcccctgaa 1080
ctgctgggcg gaccctccgt gttcctgttc cctccaaagc ccaaggatac cctgatgatc 1140
agccggaccc ctgaagtgac ctgcgtggtg gtggacgtgt cccacgagga tcccgaagtg 1200
aagttcaatt ggtacgtgga cggcgtggaa gtgcataacg ccaagaccaa gcccagagag 1260
gaacagtaca acagcaccta ccgggtggtg tccgtgctga cagtgctgca ccaggactgg 1320
ctgaacggca aagagtacaa gtgcaaggtg tccaacaagg ccctgccagc ccctatcgag 1380
aaaaccatca gcaaggccaa gggccagccc cgcgagcctc aggtgtacac actgcctcca 1440
tgccgggacg agctgaccaa gaaccaggtg tccctgtggt gcctcgtgaa gggcttctac 1500
ccctccgata tcgccgtgga atgggagagc aacggccagc ccgagaacaa ctacaagacc 1560
acccctcccg tgctggacag cgacggctca ttcttcctgt acagcaagct gaccgtggac 1620
aagtcccggt ggcagcaggg caacgtgttc agctgctctg tgatgcacga ggccctgcac 1680
aaccggttca cccagaagtc cctgagcctg agccctggc 1719
<210> 80
<211> 1023
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 80
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacctgtc gggccagcca gggcatccgg aactacctgg cctggtatca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctacgcc gccagcacac tgcagagcgg cgtgcccagc 180
agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240
gaggacgtgg ccacctacta ctgccagcgg tacaacagag ccccctacac cttcggccag 300
ggcaccaagg tggaaatcaa gggcggctct ggcagctccg gcagcggcgg agacattcag 360
atgacacagt cccccgccag cctgtccgtg tccgtgggcg ataccatcac cctgacatgc 420
cacgccagcc agaacatcga cgtgtggctg agctggttcc agcagaaacc tggcaacatc 480
cctaagctgc tcatctataa ggccagcaac ctgcacacag gcgtgccctc cagattctcc 540
ggctctggct ctggcaccgg ctttacactg acaatcagtt ctctgcagcc tgaggatatc 600
gccacatatt actgtcagca ggcccacagc taccctttca ccttcggagg cggcaccaag 660
ctcgagatta agggcggaag cggctcctcc ggctccggcg gacgtacggt ggccgctcct 720
tccgtgttca tcttccctcc ctccgacgag cagctgaagt ccggcaccgc ctccgtggtg 780
tgtctgctga acaacttcta ccctcgggag gccaaggtgc agtggaaggt ggacaacgcc 840
ctgcagtccg gcaactccca ggagtccgtc accgagcagg actccaagga cagcacctac 900
tccctgtcct ccaccctgac cctgtccaag gccgactacg agaagcacaa ggtgtacgcc 960
tgtgaggtga cccaccaggg cctgtccagc cctgtgacca agtccttcaa ccggggcgag 1020
tgc 1023
<210> 81
<211> 573
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 81
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser
115 120 125
Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys
130 135 140
Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile His Trp Ile Lys Gln
145 150 155 160
Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Met Ile Asp Pro Ser Asp
165 170 175
Gly Glu Thr Arg Leu Asn Gln Arg Phe Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr
180 185 190
Val Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Arg Ser Pro Thr
195 200 205
Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Leu Lys Glu Tyr Gly
210 215 220
Asn Tyr Asp Ser Phe Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Leu Val
225 230 235 240
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
245 250 255
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
260 265 270
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
275 280 285
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
290 295 300
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
305 310 315 320
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
325 330 335
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
340 345 350
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
355 360 365
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
370 375 380
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
385 390 395 400
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
405 410 415
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
420 425 430
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
435 440 445
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
450 455 460
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
465 470 475 480
Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val
485 490 495
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
500 505 510
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
515 520 525
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
530 535 540
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
545 550 555 560
Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
565 570
<210> 82
<211> 341
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 82
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Thr Ile Thr Leu Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Asp Val Trp
20 25 30
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ile Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala His Ser Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Ser Gly Ser
100 105 110
Ser Gly Ser Gly Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
115 120 125
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln
130 135 140
Gly Ile Arg Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
145 150 155 160
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro
165 170 175
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
180 185 190
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr
195 200 205
Asn Arg Ala Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
210 215 220
Gly Gly Ser Gly Ser Ser Gly Ser Gly Gly Arg Thr Val Ala Ala Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
245 250 255
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
260 265 270
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
275 280 285
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
290 295 300
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
305 310 315 320
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
325 330 335
Asn Arg Gly Glu Cys
340
<210> 83
<211> 1719
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 83
gaggtgcagc tggtggaaag cggcggagga ctggtgcagc ccggcagaag cctgagactg 60
agctgcgccg ccagcggctt caccttcgac gactacgcca tgcactgggt ccgacaggcc 120
cctggcaagg gcctggaatg ggtgtccgcc atcacctgga acagcggcca catcgactac 180
gccgacagcg tggaaggccg gttcaccatc agccgggaca acgccaagaa cagcctgtac 240
ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caaggtgtcc 300
tacctgagca ccgccagcag cctggactac tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc 360
agtcaggtcc agctgcagca gagcggccct gagctggtca agcctggcgc cagcgtgaag 420
atcagctgca aggccagcgg ctacagcttc accagctact ggatccactg gatcaagcag 480
cggcctggcc agggcctcga gtggatcggc atgatcgacc ccagcgacgg cgagacacgg 540
ctgaaccaga gattccaggg cagagccacc ctgaccgtgg acgagagcac cagcaccgcc 600
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aaagagtacg gcaactacga cagcttctac ttcgacgtgt ggggagccgg caccctcgtg 720
acagtgtcct ccgcttccac caagggcccc agcgtgttcc ctctggcccc tagcagcaag 780
agcacatctg gcggaacagc cgccctgggc tgcctggtca aggactactt tcccgagccc 840
gtgaccgtgt cctggaactc tggtgccctg acaagcggag tgcatacctt ccctgccgtg 900
ctgcagagca gcggcctgta ctctctgagc agcgtggtca ccgtgccaag cagcagcctg 960
ggcacccaga cctacatctg caacgtgaac cacaagccct ccaacaccaa ggtggacaag 1020
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agccggaccc ctgaagtgac ctgcgtggtg gtggacgtgt cccacgagga tcccgaagtg 1200
aagttcaatt ggtacgtgga cggcgtggaa gtgcataacg ccaagaccaa gcccagagag 1260
gaacagtaca acagcaccta ccgggtggtg tccgtgctga cagtgctgca ccaggactgg 1320
ctgaacggca aagagtacaa gtgcaaggtg tccaacaagg ccctgccagc ccctatcgag 1380
aaaaccatca gcaaggccaa gggccagccc cgcgagcctc aggtgtacac actgcctcca 1440
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acccctcccg tgctggacag cgacggctca ttcttcctgt acagcaagct gaccgtggac 1620
aagtcccggt ggcagcaggg caacgtgttc agctgctctg tgatgcacga ggccctgcac 1680
aaccggttca cccagaagtc cctgagcctg agccctggc 1719
<210> 84
<211> 1023
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 84
gacatccaga tgacccagag ccccgccagc ctgagcgtgt ccgtgggcga taccatcacc 60
ctgacctgcc acgccagcca gaacatcgac gtgtggctga gctggttcca gcagaagccc 120
ggcaacatcc ccaagctgct gatctacaag gccagcaacc tgcacaccgg cgtgcccagc 180
agattcagcg gctctggcag cggcaccggc tttaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240
gaggatatcg ccacctacta ctgccagcag gcccacagct accccttcac cttcggcgga 300
ggcaccaagc tggaaatcaa gggcggcagc ggcagctccg gcagcggcgg agacattcag 360
atgacacagt cccccagcag cctgtccgcc agcgtgggcg acagagtgac catcacctgt 420
cgggccagcc agggcatccg gaactacctg gcctggtatc agcagaaacc tggcaaggcc 480
cctaaactgc tcatctacgc cgccagcaca ctgcagtctg gcgtgccctc cagattctcc 540
ggaagcggct ccggcaccga tttcaccctg acaatctcat ctctgcagcc tgaggacgtg 600
gccacatatt actgccagag atacaacaga gccccctaca cctttggcca gggcaccaag 660
gtcgagatta agggcggatc cggctccagc ggcagcggag gacgtacggt ggccgctcct 720
tccgtgttca tcttccctcc ctccgacgag cagctgaagt ccggcaccgc ctccgtggtg 780
tgtctgctga acaacttcta ccctcgggag gccaaggtgc agtggaaggt ggacaacgcc 840
ctgcagtccg gcaactccca ggagtccgtc accgagcagg actccaagga cagcacctac 900
tccctgtcct ccaccctgac cctgtccaag gccgactacg agaagcacaa ggtgtacgcc 960
tgtgaggtga cccaccaggg cctgtccagc cctgtgacca agtccttcaa ccggggcgag 1020
tgc 1023
<210> 85
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 85
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile His Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Ile Asp Pro Ser Asp Gly Glu Thr Arg Leu Asn Gln Arg Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Arg Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Leu Lys Glu Tyr Gly Asn Tyr Asp Ser Phe Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Ala Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly
450
<210> 86
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 86
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Thr Ile Thr Leu Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Asp Val Trp
20 25 30
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ile Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala His Ser Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gln Pro Lys Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala
115 120 125
Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala
130 135 140
Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val
145 150 155 160
Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser
165 170 175
Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr
180 185 190
Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala
195 200 205
Pro Thr Glu Cys Ser
210
<210> 87
<211> 568
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 87
Glu Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asp Ser
20 25 30
Ser Ile Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Arg Ile Asp Tyr Ala Asp Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Glu Met Thr Ser Leu Arg Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Gly Tyr Phe Pro Tyr Ala Met Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
130 135 140
Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
145 150 155 160
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile
165 170 175
Asp Tyr Ala Asp Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
180 185 190
Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
195 200 205
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser
210 215 220
Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
225 230 235 240
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
245 250 255
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
260 265 270
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
275 280 285
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
290 295 300
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
305 310 315 320
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
325 330 335
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
340 345 350
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
355 360 365
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
370 375 380
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
385 390 395 400
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
405 410 415
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
420 425 430
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
435 440 445
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
450 455 460
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu
465 470 475 480
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
485 490 495
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
500 505 510
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
515 520 525
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
530 535 540
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln
545 550 555 560
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
565
<210> 88
<211> 344
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 88
Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr Leu
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Ser Gly Ser Ser
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala
115 120 125
Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser
130 135 140
Val Asp Ser Tyr Gly Gln Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ala
145 150 155 160
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser
165 170 175
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr
180 185 190
Leu Thr Ile Asp Pro Val Gln Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
195 200 205
Gln Gln Asn Ala Glu Asp Ser Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
210 215 220
Glu Ile Lys Gly Gly Ser Gly Ser Ser Gly Ser Gly Gly Arg Thr Val
225 230 235 240
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
245 250 255
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
260 265 270
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
275 280 285
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
290 295 300
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
305 310 315 320
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
325 330 335
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
340
<210> 89
<211> 1356
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 89
caggtgcagc tgcagcagag cggccccgag ctggtgaagc ccggcgccag cgtgaagatc 60
agctgcaagg ccagcggcta cagcttcacc agctactgga ttcactggat caagcagcgc 120
cccggccagg gcctggagtg gatcggcatg atcgacccca gcgacggcga gacccgcctg 180
aaccagcgct tccagggccg cgccaccctg accgtggacg agagcaccag caccgcctac 240
atgcagctgc gcagccccac cagcgaggac agcgccgtgt actactgcac ccgcctgaag 300
gagtacggca actacgacag cttctacttc gacgtgtggg gcgccggcac cctggtgacc 360
gtgagcagcg ccagcaccaa gggccccagc gtgttccccc tggcccctag cagcaagagc 420
acatctggcg gcacagccgc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgagcccgtg 480
acagtgtcct ggaactctgg cgccctgacc agcggagtgc ataccttccc tgccgtgctg 540
cagtccagcg gcctgtacag cctgagcagc gtggtcacag tgcccagcag cagcctgggc 600
acccagacct acatctgcaa cgtgaaccac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaag 660
gtggaaccca agagctgcga caagacccac acctgtcccc cctgccctgc ccctgaactg 720
ctgggcggac cctccgtgtt cctgttcccc ccaaagccca aggacaccct gatgatcagc 780
cggacccccg aagtgacctg cgtggtggtg gacgtgtccc acgaggaccc tgaagtgaag 840
ttcaattggt acgtggacgg cgtggaagtg cataacgcca agaccaagcc cagagaggaa 900
cagtacaaca gcacctaccg ggtggtgtcc gtgctgaccg tgctgcacca ggactggctg 960
aacggcaaag agtacaagtg caaggtgtcc aacaaggccc tgcctgcccc catcgagaaa 1020
accatcagca aggccaaggg ccagcctaga gagccccaag tctgcaccct gccccccagc 1080
agagatgagc tgaccaagaa ccaggtgtcc ctgagctgcg ccgtgaaggg cttctacccc 1140
agcgatatcg ccgtggaatg ggagagcaac ggccagcccg agaacaacta caagaccacc 1200
ccccctgtgc tggacagcga cggctcattc ttcctggtgt ccaagctgac agtggacaag 1260
agccggtggc agcagggcaa cgtgttcagc tgcagcgtga tgcacgaggc cctgcacaac 1320
cattacaccc agaagtccct gagcctgagc cccggc 1356
<210> 90
<211> 639
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 90
gacatccaga tgacccagag ccccgccagc ctgagcgtgt ccgtgggcga taccatcacc 60
ctgacctgcc acgccagcca gaacatcgac gtgtggctga gctggttcca gcagaagccc 120
ggcaacatcc ccaagctgct gatctacaag gccagcaacc tgcacaccgg cgtgcccagc 180
agattcagcg gctctggcag cggcaccggc tttaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240
gaggatatcg ccacctacta ctgccagcag gcccacagct accccttcac cttcggcgga 300
ggcaccaagc tggaaatcaa gggacagccc aaggctgccc cctcggtcac cctgttcccc 360
ccaagctctg aggaactgca ggccaacaag gccaccctcg tgtgcctgat cagcgacttc 420
taccctggcg ccgtgaccgt ggcctggaag gccgatagct ctcccgtgaa ggccggcgtg 480
gaaaccacca cccccagcaa gcagagcaac aacaaatacg ccgccagcag ctacctgagc 540
ctgacccccg agcagtggaa gtcccaccgg tcctacagct gccaggtcac acacgagggc 600
agcaccgtgg aaaagaccgt ggcccccacc gagtgcagc 639
<210> 91
<211> 1704
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 91
gaggtgcagc tgaaagagtc cggccctgga ctggtggccc ctggcggcag cctgagcatc 60
acctgtaccg tgtccggctt cagcctgacc gacagcagca tcaactgggt ccgacagccc 120
cctggcaagg gcctggaatg gctgggcatg atctggggcg acggccggat cgactacgcc 180
gacgccctga agtcccggct gagcatcagc aaggacagca gcaagagcca ggtgttcctg 240
gaaatgacca gcctgcggac cgacgacacc gccacctact actgcgccag ggacggctac 300
ttcccctacg ccatggattt ctggggccag ggcaccagcg tgaccgtgtc ctccgaagtg 360
cagctggtgg aaagcggcgg aggcctggtg cagcccggca gaagcctgag actgagctgc 420
gccgccagcg gcttcacctt cgacgactac gccatgcact gggtccgcca ggctcccgga 480
aagggactcg agtgggtgtc cgccatcacc tggaacagcg gccacatcga ttacgccgat 540
agcgtggaag gccggttcac catcagccgg gacaacgcca agaacagcct gtacctgcag 600
atgaacagcc tgagagccga ggataccgcc gtgtactact gtgccaaggt gtcctacctg 660
agcaccgcca gcagcctgga ctactgggga cagggaaccc tggtcaccgt gtccagcgct 720
tccaccaagg gccccagcgt gttccctctg gcccctagca gcaagagcac atctggcgga 780
acagccgccc tgggctgcct ggtcaaggac tactttcccg agcccgtgac cgtgtcctgg 840
aactctggtg ccctgacaag cggagtgcat accttccctg ccgtgctgca gagcagcggc 900
ctgtactctc tgagcagcgt ggtcaccgtg ccaagcagca gcctgggcac ccagacctac 960
atctgcaacg tgaaccacaa gccctccaac accaaggtgg acaagaaggt ggaacccaag 1020
agctgcgaca agacccacac ctgtcctccc tgtcctgccc ctgaactgct gggcggaccc 1080
tccgtgttcc tgttccctcc aaagcccaag gataccctga tgatcagccg gacccctgaa 1140
gtgacctgcg tggtggtgga cgtgtcccac gaggatcccg aagtgaagtt caattggtac 1200
gtggacggcg tggaagtgca taacgccaag accaagccca gagaggaaca gtacaacagc 1260
acctaccggg tggtgtccgt gctgacagtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaagag 1320
tacaagtgca aggtgtccaa caaggccctg ccagccccta tcgagaaaac catcagcaag 1380
gccaagggcc agccccgcga gcctcaggtg tacacactgc ctccatgccg ggacgagctg 1440
accaagaacc aggtgtccct gtggtgcctc gtgaagggct tctacccctc cgatatcgcc 1500
gtggaatggg agagcaacgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc tcccgtgctg 1560
gacagcgacg gctcattctt cctgtacagc aagctgaccg tggacaagtc ccggtggcag 1620
cagggcaacg tgttcagctg ctctgtgatg cacgaggccc tgcacaaccg gttcacccag 1680
aagtccctga gcctgagccc tggc 1704
<210> 92
<211> 1035
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 92
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacctgtc gggccagcca gggcatccgg aactacctgg cctggtatca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctacgcc gccagcacac tgcagagcgg cgtgcccagc 180
agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240
gaggacgtgg ccacctacta ctgccagcgg tacaacagag ccccctacac cttcggccag 300
ggcaccaagg tggaaatcaa gggcggctct ggcagctccg gctctggcgg cgatatcgtg 360
ctgacccagt ctcccgccag cctggccgtg tctctgggcc agagagccac catcagctgc 420
agagccagcg agagcgtgga cagctacggc cagagctaca tgcattggta tcagcagaaa 480
gccggccagc ctcctaaact gctcatctac ctggccagca acctggaatc cggcgtgccc 540
gccaggtttt ccggcagcgg cagcagaacc gatttcacac tgacaatcga ccccgtgcag 600
gccgaggatg ccgccacata ttactgtcag cagaacgccg aggacagccg gaccttcggc 660
ggaggcacca agctcgagat taagggcgga agcggctcca gcggcagtgg cggacgtacg 720
gtggccgctc cttccgtgtt catcttccct ccctccgacg agcagctgaa gtccggcacc 780
gcctccgtgg tgtgtctgct gaacaacttc taccctcggg aggccaaggt gcagtggaag 840
gtggacaacg ccctgcagtc cggcaactcc caggagtccg tcaccgagca ggactccaag 900
gacagcacct actccctgtc ctccaccctg accctgtcca aggccgacta cgagaagcac 960
aaggtgtacg cctgtgaggt gacccaccag ggcctgtcca gccctgtgac caagtccttc 1020
aaccggggcg agtgc 1035
<210> 93
<211> 568
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 93
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Val Gln Leu Lys Glu Ser
115 120 125
Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Gly Gly Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr
130 135 140
Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asp Ser Ser Ile Asn Trp Val Arg Gln
145 150 155 160
Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly
165 170 175
Arg Ile Asp Tyr Ala Asp Ala Leu Lys Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys
180 185 190
Asp Ser Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Glu Met Thr Ser Leu Arg Thr
195 200 205
Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Tyr Phe Pro Tyr
210 215 220
Ala Met Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala
225 230 235 240
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
245 250 255
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
260 265 270
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
275 280 285
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
290 295 300
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
305 310 315 320
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
325 330 335
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
340 345 350
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
355 360 365
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
370 375 380
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
385 390 395 400
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
405 410 415
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
420 425 430
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
435 440 445
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
450 455 460
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu
465 470 475 480
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
485 490 495
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
500 505 510
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
515 520 525
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
530 535 540
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln
545 550 555 560
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
565
<210> 94
<211> 345
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 94
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr
20 25 30
Gly Gln Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp
65 70 75 80
Pro Val Gln Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Ala
85 90 95
Glu Asp Ser Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Ser Ser Gly Ser Gly Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser
115 120 125
Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
130 135 140
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
145 150 155 160
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln
165 170 175
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
180 185 190
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr
195 200 205
Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
210 215 220
Val Glu Ile Lys Gly Gly Ser Gly Ser Ser Gly Ser Gly Gly Arg Thr
225 230 235 240
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
245 250 255
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
260 265 270
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
275 280 285
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
290 295 300
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
305 310 315 320
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
325 330 335
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
340 345
<210> 95
<211> 1704
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 95
gaggtgcagc tggtggaaag cggcggagga ctggtgcagc ccggcagaag cctgagactg 60
agctgcgccg ccagcggctt caccttcgac gactacgcca tgcactgggt ccgacaggcc 120
cctggcaagg gcctggaatg ggtgtccgcc atcacctgga acagcggcca catcgactac 180
gccgacagcg tggaaggccg gttcaccatc agccgggaca acgccaagaa cagcctgtac 240
ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caaggtgtcc 300
tacctgagca ccgccagcag cctggactac tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc 360
tccgaagtgc agctgaaaga gtccggccct ggcctggtgg cccctggcgg cagcctgagc 420
atcacctgta ccgtgtccgg cttcagcctg accgacagca gcatcaactg ggtccgccag 480
cctcccggaa agggactcga gtggctgggc atgatctggg gcgacggccg gatcgattac 540
gccgatgccc tgaagtcccg gctgagcatc agcaaggaca gcagcaagag ccaggtgttc 600
ctggaaatga ccagcctgag aaccgacgac accgccacct actactgtgc ccgggacggc 660
tacttcccct acgccatgga tttctgggga cagggaacca gcgtgaccgt gtccagcgct 720
tccaccaagg gccccagcgt gttccctctg gcccctagca gcaagagcac atctggcgga 780
acagccgccc tgggctgcct ggtcaaggac tactttcccg agcccgtgac cgtgtcctgg 840
aactctggtg ccctgacaag cggagtgcat accttccctg ccgtgctgca gagcagcggc 900
ctgtactctc tgagcagcgt ggtcaccgtg ccaagcagca gcctgggcac ccagacctac 960
atctgcaacg tgaaccacaa gccctccaac accaaggtgg acaagaaggt ggaacccaag 1020
agctgcgaca agacccacac ctgtcctccc tgtcctgccc ctgaactgct gggcggaccc 1080
tccgtgttcc tgttccctcc aaagcccaag gataccctga tgatcagccg gacccctgaa 1140
gtgacctgcg tggtggtgga cgtgtcccac gaggatcccg aagtgaagtt caattggtac 1200
gtggacggcg tggaagtgca taacgccaag accaagccca gagaggaaca gtacaacagc 1260
acctaccggg tggtgtccgt gctgacagtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaagag 1320
tacaagtgca aggtgtccaa caaggccctg ccagccccta tcgagaaaac catcagcaag 1380
gccaagggcc agccccgcga gcctcaggtg tacacactgc ctccatgccg ggacgagctg 1440
accaagaacc aggtgtccct gtggtgcctc gtgaagggct tctacccctc cgatatcgcc 1500
gtggaatggg agagcaacgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc tcccgtgctg 1560
gacagcgacg gctcattctt cctgtacagc aagctgaccg tggacaagtc ccggtggcag 1620
cagggcaacg tgttcagctg ctctgtgatg cacgaggccc tgcacaaccg gttcacccag 1680
aagtccctga gcctgagccc tggc 1704
<210> 96
<211> 1035
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 96
gacatcgtgc tgacccagag ccctgccagc ctggccgtgt ctctgggcca gagagccacc 60
atcagctgcc gggccagcga gagcgtggac agctacggcc agagctacat gcactggtat 120
cagcagaagg ccggccagcc ccccaagctg ctgatctacc tggccagcaa cctggaaagc 180
ggcgtgcccg ccagattcag cggcagcggc agcagaaccg acttcaccct gaccatcgac 240
cccgtgcagg ccgaggacgc cgccacctac tactgccagc agaacgccga ggacagccgg 300
accttcggcg gaggcaccaa gctggaaatc aagggcggct ccggcagcag cggctctggc 360
ggcgatatcc agatgaccca gtcccccagc agcctgagcg ccagcgtggg cgacagagtg 420
accatcacct gtagagccag ccagggcatc cggaactacc tggcttggta tcagcagaaa 480
cccggaaagg cccctaaact gctcatctac gccgccagca ccctgcagtc cggcgtgcca 540
agcagattct ccggctctgg cagcggcacc gatttcacac tgacaatcag cagcctgcag 600
cccgaggatg tggccaccta ttattgccag agatacaaca gagcccccta caccttcggc 660
cagggcacca aggtcgagat taagggcgga agcggcagct ccggctccgg cggacgtacg 720
gtggccgctc cttccgtgtt catcttccct ccctccgacg agcagctgaa gtccggcacc 780
gcctccgtgg tgtgtctgct gaacaacttc taccctcggg aggccaaggt gcagtggaag 840
gtggacaacg ccctgcagtc cggcaactcc caggagtccg tcaccgagca ggactccaag 900
gacagcacct actccctgtc ctccaccctg accctgtcca aggccgacta cgagaagcac 960
aaggtgtacg cctgtgaggt gacccaccag ggcctgtcca gccctgtgac caagtccttc 1020
aaccggggcg agtgc 1035
<210> 97
<211> 1710
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 97
gaggtgcagc tgaaagagtc cggccctgga ctggtggccc ctggcggcag cctgagcatc 60
acctgtaccg tgtccggctt cagcctgacc gacagcagca tcaactgggt ccgacagccc 120
cctggcaagg gcctggaatg gctgggcatg atctggggcg acggccggat cgactacgcc 180
gacgccctga agtcccggct gagcatcagc aaggacagca gcaagagcca ggtgttcctg 240
gaaatgacca gcctgcggac cgacgacacc gccacctact actgcgccag ggacggctac 300
ttcccctacg ccatggattt ctggggccag ggcaccagcg tgaccgtgtc cagtcaggtc 360
cagctgcagc agagcggccc tgagctggtc aagcctggcg ccagcgtgaa gatcagctgc 420
aaggccagcg gctacagctt caccagctac tggatccact ggatcaagca gcggcctggc 480
cagggcctcg agtggatcgg aatgatcgac cccagcgacg gcgagacacg gctgaaccag 540
agattccagg gcagagccac cctgaccgtg gacgagagca ccagcaccgc ctacatgcag 600
ctgcggagcc ccaccagcga ggacagcgcc gtgtactact gcacccggct gaaagaatac 660
ggcaactacg acagcttcta cttcgacgtg tggggagccg gcaccctggt caccgtgtct 720
agcgcttcca ccaagggccc cagcgtgttc cctctggccc ctagcagcaa gagcacatct 780
ggcggaacag ccgccctggg ctgcctggtc aaggactact ttcccgagcc cgtgaccgtg 840
tcctggaact ctggtgccct gacaagcgga gtgcatacct tccctgccgt gctgcagagc 900
agcggcctgt actctctgag cagcgtggtc accgtgccaa gcagcagcct gggcacccag 960
acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc tccaacacca aggtggacaa gaaggtggaa 1020
cccaagagct gcgacaagac ccacacctgt cctccctgtc ctgcccctga actgctgggc 1080
ggaccctccg tgttcctgtt ccctccaaag cccaaggata ccctgatgat cagccggacc 1140
cctgaagtga cctgcgtggt ggtggacgtg tcccacgagg atcccgaagt gaagttcaat 1200
tggtacgtgg acggcgtgga agtgcataac gccaagacca agcccagaga ggaacagtac 1260
aacagcacct accgggtggt gtccgtgctg acagtgctgc accaggactg gctgaacggc 1320
aaagagtaca agtgcaaggt gtccaacaag gccctgccag cccctatcga gaaaaccatc 1380
agcaaggcca agggccagcc ccgcgagcct caggtgtaca cactgcctcc atgccgggac 1440
gagctgacca agaaccaggt gtccctgtgg tgcctcgtga agggcttcta cccctccgat 1500
atcgccgtgg aatgggagag caacggccag cccgagaaca actacaagac cacccctccc 1560
gtgctggaca gcgacggctc attcttcctg tacagcaagc tgaccgtgga caagtcccgg 1620
tggcagcagg gcaacgtgtt cagctgctct gtgatgcacg aggccctgca caaccggttc 1680
acccagaagt ccctgagcct gagccctggc 1710
<210> 98
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 98
Gly Gly Gly Gly
1
<210> 99
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 99
Gly Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 100
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 100
Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 101
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 101
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 102
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 102
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 103
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 103
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 104
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 104
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 105
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 105
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 106
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 106
Thr Lys Gly Pro Ser
1 5
<210> 107
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 107
Thr Val Ala Ala Pro
1 5
<210> 108
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 108
Gln Pro Lys Ala Ala
1 5
<210> 109
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 109
Gln Arg Ile Glu Gly
1 5
<210> 110
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 110
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
1 5
<210> 111
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 111
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser
1 5
<210> 112
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 112
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro
1 5
<210> 113
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 113
His Ile Asp Ser Pro Asn Lys
1 5
<210> 114
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 114
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly
100 105 110
Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Cys Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 115
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 115
Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 116
<211> 1344
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 116
caggtgcagc tgcagcagcc tggcgccgaa ctcgtgaaac ctggcgcctc cgtgaagatg 60
agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc agctacaaca tgcactgggt caagcagacc 120
cccggcagag gcctggaatg gatcggcgcc atctaccccg gcaacggcga cacctcctac 180
aaccagaagt tcaagggcaa ggccaccctg accgccgaca agagcagcag cacagcctac 240
atgcagctgt ccagcctgac cagcgaggac agcgccgtgt actactgcgc cagaagcacc 300
tactacggcg gcgactggta cttcaacgtg tggggagccg gcaccaccgt gacagtgtct 360
gctgcttcga ccaagggccc atcggtgttc cctctggccc cttgcagcag aagcaccagc 420
gaatctacag ccgccctggg ctgcctcgtg aaggactact ttcccgagcc cgtgaccgtg 480
tcctggaact ctggcgctct gacaagcggc gtgcacacct ttccagccgt gctccagagc 540
agcggcctgt actctctgag cagcgtcgtg acagtgccca gcagcagcct gggcaccaag 600
acctacacct gtaacgtgga ccacaagccc agcaacacca aggtggacaa gcgggtggaa 660
tctaagtacg gccctccctg ccctccttgc ccagcccctg aatttctggg cggaccctcc 720
gtgttcctgt tccccccaaa gcccaaggac accctgatga tcagccggac ccccgaagtg 780
acctgcgtgg tggtggatgt gtcccaggaa gatcccgagg tgcagttcaa ttggtacgtg 840
gacggcgtgg aagtgcacaa cgccaagacc aagcccagag aggaacagtt caacagcacc 900
taccgggtgg tgtccgtgct gaccgtgctg caccaggact ggctgaacgg caaagagtac 960
aagtgcaagg tgtccaacaa gggcctgccc agctccatcg agaaaaccat cagcaaggcc 1020
aagggccagc cccgcgagcc tcaagtgtat accctgcccc cttgccagga agagatgacc 1080
aagaaccagg tgtccctgtg gtgtctcgtg aaaggcttct accccagcga cattgccgtg 1140
gaatgggaga gcaacggcca gcccgagaac aactacaaga ccaccccccc tgtgctggac 1200
agcgacggct cattcttcct gtactccaag ctgaccgtgg acaagagccg gtggcaggaa 1260
ggcaacgtgt tcagctgctc cgtgatgcac gaggccctgc acaaccacta cacccagaag 1320
tccctgtctc tgtccctggg caag 1344
<210> 117
<211> 639
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 117
cagatcgtgc tgagccagag ccctgccatc ctgagcgctt ccccaggcga gaaagtgacc 60
atgacctgca gagccagcag cagcgtgtcc tacatccact ggttccagca gaagcccggc 120
agcagcccca agccttggat ctacgccacc agcaatctgg ccagcggagt gcctgtgcgg 180
tttagcggct ctggcagcgg cacaagctac agcctgacca tcagccgggt ggaagccgaa 240
gatgccgcca cctactactg ccagcagtgg accagcaacc cccccacatt tggcggaggc 300
accaagctgg aaatcaagcg tacggtggcc gctcccagcg tgttcatctt cccacctagc 360
gacgagcagc tgaagtccgg cacagcctct gtcgtgtgcc tgctgaacaa cttctacccc 420
cgcgaggcca aagtgcagtg gaaggtggac aacgccctgc agagcggcaa cagccaggaa 480
agcgtgaccg agcaggacag caaggactcc acctacagcc tgagcagcac cctgacactg 540
agcaaggccg actacgagaa gcacaaggtg tacgcctgcg aagtgaccca ccagggcctg 600
tctagccccg tgaccaagag cttcaaccgg ggcgagtgt 639
<210> 118
<211> 1713
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 118
caggtgcagc tgcaggaatc tggccctggc ctcgtgaagc ctagccagac cctgagcctg 60
acctgtaccg tgtccggctt cagcctgagc gactacggcg tgcactgggt gcgccagcca 120
cctggaaaag gcctggaatg gctgggcgtg atctgggctg gcggaggcac caactacaac 180
cccagcctga agtccagaaa gaccatcagc aaggacacca gcaagaacca ggtgtccctg 240
aagctgagca gcgtgacagc cgccgatacc gccgtgtact actgcgccag agacaagggc 300
tacagctact actacagcat ggactactgg ggccagggca ccaccgtgac cgtgtcatcc 360
tctcaggtgc agctggtgga atctggcggc ggagtggtgc agcctggcag aagcctgaga 420
ctgagctgtg ccgccagcgg cttcaccttc accaaggcct ggatgcactg ggtgcgccag 480
gcccctggaa agcagctgga atgggtggcc cagatcaagg acaagagcaa cagctacgcc 540
acctactacg ccgacagcgt gaagggccgg ttcaccatca gccgggacga cagcaagaac 600
accctgtacc tgcagatgaa cagcctgcgg gccgaggaca ccgccgtgta ctactgtcgg 660
ggcgtgtact atgccctgag ccccttcgat tactggggcc agggaaccct cgtgaccgtg 720
tctagtcgga ccgcttcgac caagggccca tcggtgttcc ctctggcccc ttgcagcaga 780
agcaccagcg aatctacagc cgccctgggc tgcctcgtga aggactactt tcccgagccc 840
gtgaccgtgt cctggaactc tggcgctctg acaagcggcg tgcacacctt tccagccgtg 900
ctccagagca gcggcctgta ctctctgagc agcgtcgtga cagtgcccag cagcagcctg 960
ggcaccaaga cctacacctg taacgtggac cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 1020
cgggtggaat ctaagtacgg ccctccctgc cctccttgcc cagcccctga atttctgggc 1080
ggaccctccg tgttcctgtt ccccccaaag cccaaggaca ccctgatgat cagccggacc 1140
cccgaagtga cctgcgtggt ggtggatgtg tcccaggaag atcccgaggt gcagttcaat 1200
tggtacgtgg acggcgtgga agtgcacaac gccaagacca agcccagaga ggaacagttc 1260
aacagcacct accgggtggt gtccgtgctg accgtgctgc accaggactg gctgaacggc 1320
aaagagtaca agtgcaaggt gtccaacaag ggcctgccca gctccatcga gaaaaccatc 1380
agcaaggcca agggccagcc ccgcgagcct caagtgtgta ccctgccccc tagccaggaa 1440
gagatgacca agaaccaggt gtccctgagc tgtgccgtga aaggcttcta ccccagcgac 1500
attgccgtgg aatgggagag caacggccag cccgagaaca actacaagac caccccccct 1560
gtgctggaca gcgacggctc attcttcctg gtgtccaagc tgaccgtgga caagagccgg 1620
tggcaggaag gcaacgtgtt cagctgctcc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1680
acccagaagt ccctgtctct gtccctgggc aag 1713
<210> 119
<211> 1026
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 119
gacatcgtga tgacccagac ccccctgagc ctgagcgtga cacctggaca gcctgccagc 60
atcagctgca agagcagcca gagcctggtg cacaacaacg ccaacaccta cctgagctgg 120
tatctgcaga agcccggcca gagcccccag tccctgatct acaaggtgtc caacagattc 180
agcggcgtgc ccgacagatt ctccggcagc ggctctggca ccgacttcac cctgaagatc 240
agccgggtgg aagccgagga cgtgggcgtg tactattgtg gccagggcac ccagtacccc 300
ttcacctttg gcagcggcac caaggtggaa atcaagggcc agcccaaggc cgcccccgac 360
atcgtgctga cacagagccc tgctagcctg gccgtgtctc ctggacagag ggccaccatc 420
acctgtagag ccagcgagag cgtggaatat tacgtgacca gcctgatgca gtggtatcag 480
cagaagcccg gccagccccc caagctgctg attttcgccg ccagcaacgt ggaaagcggc 540
gtgccagcca gattttccgg cagcggctct ggcaccgact tcaccctgac catcaacccc 600
gtggaagcca acgacgtggc caactactac tgccagcaga gccggaaggt gccctacacc 660
tttggccagg gcaccaagct ggaaatcaag accaagggcc ccagccgtac ggtggccgct 720
cccagcgtgt tcatcttccc acctagcgac gagcagctga agtccggcac agcctctgtc 780
gtgtgcctgc tgaacaactt ctacccccgc gaggccaaag tgcagtggaa ggtggacaac 840
gccctgcaga gcggcaacag ccaggaaagc gtgaccgagc aggacagcaa ggactccacc 900
tacagcctga gcagcaccct gacactgagc aaggccgact acgagaagca caaggtgtac 960
gcctgcgaag tgacccacca gggcctgtct agccccgtga ccaagagctt caaccggggc 1020
gagtgt 1026
<210> 120
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 120
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn
1 5
<210> 121
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 121
Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr
1 5
<210> 122
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 122
Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val
1 5 10
<210> 123
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 123
Ser Ser Val Ser Tyr
1 5
<210> 124
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 124
Ala Thr Ser
1
<210> 125
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 125
Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro
1 5
<210> 126
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 126
Gly Tyr Ile Phe Thr Asn Tyr Asn Ile His
1 5 10
<210> 127
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 127
Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Ala Pro
1 5 10
<210> 128
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 128
Ala Asn Trp Asp Val Ala Phe Ala Tyr
1 5
<210> 129
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 129
Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala Met His
1 5 10
<210> 130
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 130
Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp
1 5 10
<210> 131
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 131
Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 132
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 132
Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile His
1 5 10
<210> 133
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 133
Met Ile Asp Pro Ser Asp Gly Glu Thr
1 5
<210> 134
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 134
Leu Lys Glu Tyr Gly Asn Tyr Asp Ser Phe Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 135
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 135
Gly Phe Ser Leu Thr Asp Ser Ser Ile Asn
1 5 10
<210> 136
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 136
Met Ile Trp Gly Asp Gly Arg Ile Asp
1 5
<210> 137
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 137
Asp Gly Tyr Phe Pro Tyr Ala Met Asp Phe
1 5 10
<210> 138
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 138
Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asp Arg Tyr Met Ala
1 5 10
<210> 139
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 139
Asp Thr Ser Thr Leu Gln Ser
1 5
<210> 140
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 140
Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Trp Thr
1 5
<210> 141
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 141
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 142
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 142
Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Thr
1 5
<210> 143
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 143
His Ala Ser Gln Asn Ile Asp Val Trp Leu Ser
1 5 10
<210> 144
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 144
Gln Gln Ala His Ser Tyr Pro Phe Thr
1 5
<210> 145
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 145
Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly Gln Ser Tyr Met His
1 5 10 15
<210> 146
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 146
Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 147
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 147
Gln Gln Asn Ala Glu Asp Ser Arg Thr
1 5
<210> 148
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 148
Gly Gly Ser Gly Ser Ser Gly Ser Gly Gly
1 5 10
<210> 149
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 149
Gln Ser Leu Val His Asn Asn Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 150
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 150
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 151
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 151
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 152
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 152
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Lys Ala
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gln Ile Lys Asp Lys Ser Asn Ser Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Arg Gly Val Tyr Tyr Ala Leu Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 153
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 153
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val His Asn
20 25 30
Asn Ala Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Ser Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Gly
85 90 95
Thr Gln Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 154
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 154
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Lys Ala
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gln Ile Lys Asp Lys Ser Asn Ser Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Arg Gly Val Tyr Tyr Ala Leu Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 155
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 155
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val His Asn
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Gly
85 90 95
Thr Gln Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 156
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 156
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 157
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 157
Asp Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asn Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Thr
85 90 95
Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 158
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 158
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly
100 105 110
Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 159
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 159
Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 160
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 160
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ser Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Ser His Tyr Gly Leu Asp Trp Asn Phe Asp Val Trp Gly Lys
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 161
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 161
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Val Trp
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 162
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 162
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Lys Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Lys Gly Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 163
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 163
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr
20 25 30
Val Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Phe Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asn Asp Val Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg
85 90 95
Lys Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 164
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 164
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Lys Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Lys Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met His Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Tyr Tyr Gly Ser Asn Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 165
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 165
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Leu Ser Met Ser Thr Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Pro Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Val
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ile Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Pro Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 166
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 166
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Asn Ile His Trp Val Lys Lys Ser Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Ala Pro Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Thr Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Ala Asn Trp Asp Val Ala Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 167
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 167
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asp Arg Tyr
20 25 30
Met Ala Trp Tyr Gln Asp Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
His Asp Thr Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 168
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 168
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 169
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 169
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 170
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 170
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile His Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Ile Asp Pro Ser Asp Gly Glu Thr Arg Leu Asn Gln Arg Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Arg Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Leu Lys Glu Tyr Gly Asn Tyr Asp Ser Phe Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Ala Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 171
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 171
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Thr Ile Thr Leu Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Asp Val Trp
20 25 30
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ile Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala His Ser Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 172
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 172
Glu Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asp Ser
20 25 30
Ser Ile Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Arg Ile Asp Tyr Ala Asp Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Glu Met Thr Ser Leu Arg Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Gly Tyr Phe Pro Tyr Ala Met Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 173
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 173
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr
20 25 30
Gly Gln Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp
65 70 75 80
Pro Val Gln Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Ala
85 90 95
Glu Asp Ser Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 174
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)...(5)
<223> Can be absent or present, or present in repeats
of up to 5 times
<400> 174
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 175
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 175
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro
1 5
<210> 176
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 176
Asp Lys Thr His Thr
1 5
<210> 177
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 177
Thr Lys Gly Pro Ser Arg
1 5
<210> 178
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 178
Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser
1 5
<210> 179
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 179
Lys Ala Ser Asn Leu His Thr
1 5

Claims (90)

1.一种结合蛋白，其包含形成3个抗原结合位点的4条多肽链，所述3个抗原结合位点特异性结合一个或多个靶蛋白，其中第一多肽链包含如下式表示的结构：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽链包含如下式表示的结构：
VH1-L3-VH2-L4-CH1 [II]
且第三多肽链包含如下式表示的结构：
VH3-CH1 [III]
且第四多肽链包含如下式表示的结构：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变域；
VL3是第三免疫球蛋白轻链可变域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变域；
VH3是第三免疫球蛋白重链可变域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定域；且
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
且其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对。
2.一种结合蛋白，其包含形成3个抗原结合位点的4条多肽链，所述3个抗原结合位点特异性结合一个或多个靶蛋白，其中第一多肽链包含如下式表示的结构：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽链包含如下式表示的结构：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-铰链-CH2-CH3 [II]
且第三多肽链包含如下式表示的结构：
VH3-CH1-铰链-CH2-CH3 [III]
且第四多肽链包含如下式表示的结构：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变域；
VL3是第三免疫球蛋白轻链可变域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变域；
VH3是第三免疫球蛋白重链可变域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定域；
CH2是免疫球蛋白CH2重链恒定域；
CH3是免疫球蛋白CH3重链恒定域；
铰链是连接CH1和CH2域的免疫球蛋白铰链区；且
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
且其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对。
3.权利要求1的结合蛋白，其中所述第二多肽链还包含连接至CH1的Fc区，所述Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域。
4.权利要求1或权利要求2的结合蛋白，其中L1、L2、L3、或L4的至少一个独立地长度为0个氨基酸。
5.权利要求1或权利要求2的结合蛋白，其中L1、L2、L3、或L4各自独立地长度为至少1个氨基酸。
6.权利要求1或权利要求2的结合蛋白，其中L1、L2、L3、或L4各自独立地包含选自由下列组成的组的序列：GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:104)，GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:105)，S，RT，TKGPS(SEQ ID NO:106)，GQPKAAP(SEQ ID NO:175)，和GGSGSSGSGG(SEQ ID NO:148)。
7.权利要求1或权利要求2的结合蛋白，其中
(a)L1包含序列GQPKAAP(SEQ ID NO:175)，L2包含序列TKGPS(SEQ ID NO:106)，L3包含序列S，且L4包含序列RT；
(b)L1包含序列GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:104)，L2包含序列GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:104)，L3长度为0个氨基酸，且L4长度为0个氨基酸；
(c)L1包含序列GGSGSSGSGG(SEQ ID NO:148)，L2包含序列GGSGSSGSGG(SEQ ID NO:148)，L3长度为0个氨基酸，且L4长度为0个氨基酸；或
(d)L1包含序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:105)，L2长度为0个氨基酸，L3包含序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:105)，且L4长度为0个氨基酸。
8.权利要求1或权利要求2的结合蛋白，其中所述结合蛋白是三特异性的且能够特异性结合3个不同的抗原靶标。
9.权利要求1-8任一项的结合蛋白，其中所述结合蛋白特异性结合3个靶蛋白，所述靶蛋白对应于T细胞上的2个靶蛋白以及1个肿瘤靶蛋白。
10.权利要求9的结合蛋白，其中T细胞上的所述靶蛋白之一是CD3。
11.权利要求9或权利要求10的结合蛋白，其中T细胞上的所述靶蛋白之一是CD28。
12.权利要求9-11的任一项的结合蛋白，其中所述肿瘤靶蛋白是CD38。
13.权利要求1-8任一项的结合蛋白，其中所述结合蛋白特异性结合3个靶蛋白，所述靶蛋白对应于T细胞上的2个靶蛋白以及1个选自下组的靶蛋白：A2AR、APRIL、ATPD酶(ATPDase)、BAFF、BAFFR、BCMA、BlyS、BTK、BTLA、B7DC、B7H1、B7H4、B7H5、B7H6、B7H7、B7RP1、B7-4、C3、C5、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL15、CCL17、CCL19、CCL20、CCL21、CCL24、CCL25、CCL26、CCR3、CCR4、CD3、CD19、CD20、CD23、CD24、CD27、CD28、CD38、CD39、CD40、CD70、CD80、CD86、CD122、CD137、CD137L、CD152、CD154、CD160、CD272、CD273、CD274、CD275、CD276、CD278、CD279、CDH1、壳多糖酶、CLEC9、CLEC91、CRTH2、CSF-1、CSF-2、CSF-3、CX3CL1、CXCL12、CXCL13、CXCR3、DNGR-1、外核苷三磷酸盐二磷酸水解酶1(ectonucleosidetriphosphate diphosphohydrolase 1)、EGFR、ENTPD1、FCER1A、FCER1、FLAP、FOLH1、Gi24、GITR、GITRL、GM-CSF、Her2、HHLA2、HMGB1、HVEM、ICOSLG、IDO、IFNα、IgE、IGF1R、IL2Rβ、IL1、IL1A、IL1B、IL1F10、IL2、IL4、IL4Ra、IL5、IL5R、IL6、IL7、IL7Ra、IL8、IL9、IL9R、IL10、rhIL10、IL12、IL13、IL13Ra1、IL13Ra2、IL15、IL17、IL17Rb、IL18、IL22、IL23、IL25、IL27、IL33、IL35、ITGB4、ITK、KIR、LAG3、LAMP1、瘦素、LPFS2、II类MHC、NCR3LG1、NKG2D、NTPD酶-1(NTPDase-1)、OX40、OX40L、PD-1H、血小板受体、PROM1、S152、SISP1、SLC、SPG64、ST2、STEAP2、Syk激酶、TACI、TDO、T14、TIGIT、TIM3、TLR、TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、TMEF1、TNFa、TNFRSF7、Tp55、TREM1、TSLP、TSLPR、TWEAK、VEGF、VISTA、Vstm3、WUCAM和XCR1。
14.权利要求1或权利要求2的结合蛋白，其中所述结合蛋白能够抑制一个或多个靶蛋白的功能。
15.权利要求14的结合蛋白，其中所述一个或多个靶蛋白选自由下列组成的组：A2AR、APRIL、ATPD酶、BAFF、BAFFR、BCMA、BlyS、BTK、BTLA、B7DC、B7H1、B7H4、B7H5、B7H6、B7H7、B7RP1、B7-4、C3、C5、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL15、CCL17、CCL19、CCL20、CCL21、CCL24、CCL25、CCL26、CCR3、CCR4、CD3、CD19、CD20、CD23、CD24、CD27、CD28、CD38、CD39、CD40、CD70、CD80、CD86、CD122、CD137、CD137L、CD152、CD154、CD160、CD272、CD273、CD274、CD275、CD276、CD278、CD279、CDH1、壳多糖酶、CLEC9、CLEC91、CRTH2、CSF-1、CSF-2、CSF-3、CX3CL1、CXCL12、CXCL13、CXCR3、DNGR-1、外核苷三磷酸盐二磷酸水解酶1、EGFR、ENTPD1、FCER1A、FCER1、FLAP、FOLH1、Gi24、GITR、GITRL、GM-CSF、Her2、HHLA2、HMGB1、HVEM、ICOSLG、IDO、IFNα、IgE、IGF1R、IL2Rβ、IL1、IL1A、IL1B、IL1F10、IL2、IL4、IL4Ra、IL5、IL5R、IL6、IL7、IL7Ra、IL8、IL9、IL9R、IL10、rhIL10、IL12、IL13、IL13Ra1、IL13Ra2、IL15、IL17、IL17Rb、IL18、IL22、IL23、IL25、IL27、IL33、IL35、ITGB4、ITK、KIR、LAG3、LAMP1、瘦素、LPFS2、II类MHC、NCR3LG1、NKG2D、NTPD酶-1、OX40、OX40L、PD-1H、血小板受体、PROM1、S152、SISP1、SLC、SPG64、ST2、STEAP2、Syk激酶、TACI、TDO、T14、TIGIT、TIM3、TLR、TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、TMEF1、TNFa、TNFRSF7、Tp55、TREM1、TSLP、TSLPR、TWEAK、VEGF、VISTA、Vstm3、WUCAM和XCR1。
16.一种结合蛋白，其包含形成3个抗原结合位点的4条多肽链，其中第一多肽链包含如下式表示的结构：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽链包含如下式表示的结构：
VH1-L3-VH2-L4-CH1 [II]
且第三多肽链包含如下式表示的结构：
VH3-CH1 [III]
且第四多肽链包含如下式表示的结构：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变域；
VL3是第三免疫球蛋白轻链可变域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变域；
VH3是第三免疫球蛋白重链可变域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定域；且
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对；
其中：
(a)VL1、VL2和VL3各自独立地包含如SEQ ID NO:151、153、155、157、159、161、163、165和167任一项所示的可变域序列；或
(b)VL1、VL2和VL3各自独立地包含轻链互补决定区，其包含如SEQ ID NO:43-59、123-125、138-140和149任一项所示的氨基酸序列；且
其中：
(a)VH1、VH2和VH3各自独立地包含如SEQ ID NO:150、152、154、156、158、160、162、164和166的任一项所示的可变域序列；或
(b)VH1、VH2和VH3各自独立地包含可变域的重链互补决定区，其包含如SEQ ID NO:25-42、120-122和126-128任一项所示的氨基酸序列。
17.一种结合蛋白，其包含形成3个抗原结合位点的4条多肽链，其中第一多肽链包含如下式表示的结构：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽链包含如下式表示的结构：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-铰链-CH2-CH3 [II]
且第三多肽链包含如下式表示的结构：
VH3-CH1-铰链-CH2-CH3 [III]
且第四多肽链包含如下式表示的结构：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变域；
VL3是第三免疫球蛋白轻链可变域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变域；
VH3是第三免疫球蛋白重链可变域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定域；
CH2是免疫球蛋白CH2重链恒定域；
CH3是免疫球蛋白CH3重链恒定域；
铰链是连接CH1和CH2域的免疫球蛋白铰链区；且
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
且其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对；
其中：
(a)VL1、VL2和VL3各自独立地包含如SEQ ID NO:151、153、155、157、159、161、163、165和167任一项所示的可变域序列；或
(b)VL1、VL2和VL3各自独立地包含轻链互补决定区，其包含如SEQ ID NO:43-59、123-125、138-140和149任一项所示的氨基酸序列；且
其中：
(a)VH1、VH2和VH3各自独立地包含如SEQ ID NO:150、152、154、156、158、160、162、164和166的任一项所示的可变域序列；或
(b)VH1、VH2和VH3各自独立地包含可变域的重链互补决定区，其包含如SEQ ID NO:25-42、120-122和126-128任一项所示的氨基酸序列。
18.权利要求16的结合蛋白，其中所述第二多肽链还包含连接至CH1的Fc区，所述Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域。
19.权利要求16或权利要求17的结合蛋白，其中L1、L2、L3、或L4的至少一个独立地长度为0个氨基酸。
20.权利要求16或权利要求17的结合蛋白，其中L1、L2、L3、或L4各自独立地长度为至少1个氨基酸。
21.权利要求16或权利要求17的结合蛋白，其中L1、L2、L3、或L4各自独立地包含选自由下列组成的组的序列：GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:104)，GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:105)，S，RT，TKGPS(SEQ ID NO:106)，GQPKAAP(SEQ ID NO:175)，和GGSGSSGSGG(SEQ ID NO:148)。
22.权利要求16或权利要求17的结合蛋白，其中
(a)L1包含序列GQPKAAP(SEQ ID NO:175)，L2包含序列TKGPS(SEQ ID NO:106)，L3包含序列S，且L4包含序列RT；
(b)L1包含序列GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:104)，L2包含序列GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:104)，L3长度为0个氨基酸，且L4长度为0个氨基酸；
(c)L1包含序列GGSGSSGSGG(SEQ ID NO:148)，L2包含序列GGSGSSGSGG(SEQ ID NO:148)，L3长度为0个氨基酸，且L4长度为0个氨基酸；或
(d)L1包含序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:105)，L2长度为0个氨基酸，L3包含序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:105)，且L4长度为0个氨基酸。
23.权利要求16或权利要求17的结合蛋白，其中：
(a)VH1包含：包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ IDNO:52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ IDNO:54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQID NO:26的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的CDR-L3；
(b)VH1包含：包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ IDNO:52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ IDNO:54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQID NO:26的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的CDR-L3；
(c)VH1包含：包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ IDNO:52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ IDNO:54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQID NO:38的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的CDR-L3；
(d)VH1包含：含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ IDNO:38的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的CDR-L3；
(e)VH1包含：包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ IDNO:52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ IDNO:54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQID NO:41的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的CDR-L3；
(f)VH1包含：含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ IDNO:41的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的CDR-L3；
(g)VH1包含：包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ IDNO:52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ IDNO:54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:128的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:139的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列的CDR-L3；
(h)VH1包含：含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ IDNO:127的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:128的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:139的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列的CDR-L3；
(i)VH1包含：包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ IDNO:52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ IDNO:54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO:123的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:124的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列的CDR-L3；或
(j)VH1包含：含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ IDNO:121的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO:123的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:124的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列的CDR-L3。
24.一种结合蛋白，其包含形成3个抗原结合位点的4条多肽链，其中第一多肽链包含如下式表示的结构：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽链包含如下式表示的结构：
VH1-L3-VH2-L4-CH1 [II]
且第三多肽链包含如下式表示的结构：
VH3-CH1 [III]
且第四多肽链包含如下式表示的结构：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变域；
VL3是第三免疫球蛋白轻链可变域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变域；
VH3是第三免疫球蛋白重链可变域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定域；且
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
且其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对；
其中：
(a)VL1、VL2和VL3各自独立地包含如SEQ ID NO:169、171和173任一项所示的可变域序列；或
(b)VL1、VL2和VL3各自独立地包含轻链互补决定区，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQID NO:141-147、178和179；
其中：
(a)VH1、VH2和VH3各自独立地包含如SEQ ID NO:168、170和172的任一项所示的可变域序列；或
(b)VH1、VH2和VH3各自独立地包含重链互补决定区，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQID NO:129-137。
25.一种结合蛋白，其包含形成3个抗原结合位点的4条多肽链，其中第一多肽链包含如下式表示的结构：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽链包含如下式表示的结构：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-铰链-CH2-CH3 [II]
且第三多肽链包含如下式表示的结构：
VH3-CH1-铰链-CH2-CH3 [III]
且第四多肽链包含如下式表示的结构：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变域；
VL3是第三免疫球蛋白轻链可变域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变域；
VH3是第三免疫球蛋白重链可变域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定域；
CH2是免疫球蛋白CH2重链恒定域；
CH3是免疫球蛋白CH3重链恒定域；
铰链是连接CH1和CH2域的免疫球蛋白铰链区；且
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
且其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对；
其中：
(a)VL1、VL2和VL3各自独立地包含如SEQ ID NO:169、171和173任一项所示的可变域序列；或
(b)VL1、VL2和VL3各自独立地包含轻链互补决定区，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQID NO:141-147、178和179；
其中：
(a)VH1、VH2和VH3各自独立地包含如SEQ ID NO:168、170和172的任一项所示的可变域序列；或
(b)VH1、VH2和VH3各自独立地包含重链互补决定区，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQID NO:129-137。
26.权利要求24的结合蛋白，其中第二多肽链还包含连接至CH1的Fc区，所述Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域。
27.权利要求24或权利要求25的结合蛋白，其中L1、L2、L3和L4的至少一个独立地长度为0个氨基酸。
28.权利要求24或权利要求25的结合蛋白，其中L1、L2、L3和L4各自独立地长度为至少1个氨基酸。
29.权利要求24或权利要求25的结合蛋白，其中L1、L2、L3和L4各自独立地包含选自由下列组成的组的序列：GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:104)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:105)、S、RT、TKGPS(SEQ ID NO:106)、GQPKAAP(SEQ ID NO:175)和GGSGSSGSGG(SEQ ID NO:148)。
30.权利要求24或权利要求25的结合蛋白，其中
(a)L1包含序列GQPKAAP(SEQ ID NO:175)，L2包含序列TKGPS(SEQ ID NO:106)，L3包含序列S，且L4包含序列RT；
(b)L1包含序列GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:104)，L2包含序列GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:104)，L3长度为0个氨基酸，且L4长度为0个氨基酸；
(c)L1包含序列GGSGSSGSGG(SEQ ID NO:148)，L2包含序列GGSGSSGSGG(SEQ ID NO:148)，L3长度为0个氨基酸，且L4长度为0个氨基酸；或
(d)L1包含序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:105)，L2长度为0个氨基酸，L3包含序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:105)，且L4长度为0个氨基酸。
31.权利要求24或权利要求25的结合蛋白，其中：
(a)VH1包含：包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO:143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:144的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ IDNO:136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:131的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO:141的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列的CDR-L3；
(b)VH1包含：包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ IDNO:133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO:143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:144的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:131的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO:141的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列的CDR-L3；
(c)VH1包含：包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO:143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:144的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ IDNO:130的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:131的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO:141的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列的CDR-L3；
(d)VH1包含：包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:131的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO:141的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ IDNO:133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO:143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:144的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列的CDR-L3；
(e)VH1包含：包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ IDNO:130的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:131的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO:141的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO:143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:144的氨基酸序列的CDR-L3；
(f)VH1包含：包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:131的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO:141的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ IDNO:136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO:143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:144的氨基酸序列的CDR-L3；
(g)VH1包含：包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ IDNO:133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO:143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:144的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列的CDR-L3；
(h)VH1包含：包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ IDNO:133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO:143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:144的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO:143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:144的氨基酸序列的CDR-L3；
(i)VH1包含：包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO:143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:144的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ IDNO:136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列的CDR-L3；或
(j)VH1包含：包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO:143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:144的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ IDNO:136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO:143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:144的氨基酸序列的CDR-L3。
32.权利要求1、16和24任一项的结合蛋白，其中所述第二多肽链还包含连接至CH1的第一Fc区，所述第一Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域，其中所述第一Fc区包含与人IgG1或IgG4的位置354和366对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为S354C和T366W；且其中所述第三多肽链还包含连接至CH1的第二Fc区，所述第二Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域，其中所述第二Fc区包含与人IgG1或IgG4的位置349、366、368和407对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为Y349C、T366S、L368A和Y407V。
33.权利要求1、16和24任一项的结合蛋白，其中所述第二多肽链还包含连接至CH1的第一Fc区，所述第一Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域，其中所述第一Fc区包含与人IgG1或IgG4的位置349、366、368和407对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为Y349C、T366S、L368A和Y407V；且其中所述第三多肽链还包含连接至CH1的第二Fc区，所述第二Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域，其中所述第二Fc区包含与人IgG1或IgG4的位置354和366对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为S354C和T366W。
34.权利要求1、16、24、32和33任一项的结合蛋白，其中所述第二多肽链还包含连接至CH1的第一Fc区，所述第一Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域，且其中所述第三多肽链还包含连接至CH1的第二Fc区，所述第二Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域；其中所述第一和第二Fc区包含与人IgG1或IgG4的位置428和434对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为M428L和N434S。
35.权利要求2、17和25任一项的结合蛋白，其中所述第二多肽链的CH3域包含与人IgG1或IgG4的位置354和366对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为S354C和T366W；且其中所述第三多肽链的CH3域包含与人IgG1或IgG4的位置349、366、368和407对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为Y349C、T366S、L368A和Y407V。
36.权利要求2、17和25任一项的结合蛋白，其中所述第二多肽链的CH3域包含与人IgG1或IgG4的位置349、366、368和407对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为Y349C、T366S、L368A和Y407V；且其中所述第三多肽链的CH3域包含与人IgG1或IgG4的位置354和366对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为S354C和T366W。
37.权利要求2、17、25、35和36任一项的结合蛋白，其中所述第二和第三多肽链二者的CH3域均包含与人IgG1或IgG4的位置428和434对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为M428L和N434S。
38.权利要求1、16、24和32-34任一项的结合蛋白，其中所述第二多肽链还包含连接至CH1的第一Fc区，所述第一Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域；其中所述第三多肽链还包含连接至CH1的第二Fc区，所述第二Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域；其中所述第一和第二Fc区为人IgG1或IgG4Fc区；且其中所述第一和第二Fc区中仅有一个包含与人IgG1或IgG4的位置435和436对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为H435R和Y436F。
39.权利要求2、17、25和35-37任一项的结合蛋白，其中所述第二和第三多肽链的CH3域是人IgG1或IgG4CH3域，且其中所述CH3域中仅一个包含与人IgG1或IgG4的位置435和436对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为H435R和Y436F。
40.权利要求1、16、24、32-34和38任一项的结合蛋白，其中所述第二多肽链还包含连接至CH1的第一Fc区，所述第一Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域；其中所述第三多肽链还包含连接至CH1的第二Fc区，所述第二Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域；其中所述第一和第二Fc区是人IgG4Fc区；且其中第一和第二Fc区各自包含与人IgG4的位置228和409对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为S228P和R409K。
41.权利要求2、17、25、35-37和39任一项的结合蛋白，其中所述第二和第三多肽链的CH3域是人IgG4CH3域，且其中所述CH3域各自包含与人IgG4的位置228和409对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为S228P和R409K。
42.权利要求1、16、24、32-34、38和40任一项的结合蛋白，其中所述第二多肽链还包含连接至CH1的第一Fc区，所述第一Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域；其中所述第三多肽链还包含连接至CH1的第二Fc区，所述第二Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域；其中所述第一和第二Fc区是人IgG4Fc区；且其中所述第一和第二Fc区各自包含与人IgG4的位置234和235对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为F234A和L235A。
43.权利要求2、17、25、35-37、39和41任一项的结合蛋白，其中所述第二和第三多肽链的CH3域是人IgG4CH3域，且其中所述CH3域各自包含与人IgG4的位置234和235对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为F234A和L235A。
44.权利要求1、16、24、32-34、38和40任一项的结合蛋白，其中所述第二多肽链还包含连接至CH1的第一Fc区，所述第一Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域；其中所述第三多肽链还包含连接至CH1的第二Fc区，所述第二Fc区包含免疫球蛋白铰链区和CH2及CH3免疫球蛋白重链恒定域；其中所述第一和第二Fc区是人IgG1Fc区；且其中所述第一和第二Fc区各自包含与人IgG4的位置234和235对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为L234A和L235A。
45.权利要求2、17、25、35-37、39和41任一项的结合蛋白，其中所述第二和第三多肽链的CH3域是人IgG1CH3域，且其中所述CH3域各自包含与人IgG4的位置234和235对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为L234A和L235A。
46.权利要求2、17、35-37、39、41、43和45任一项的结合蛋白，其中VH1和VL1形成特异性结合的人CD3的第一抗原结合位点，其中VH2和VL2形成特异性结合人CD28的第二抗原结合位点，且其中VH3和VL3形成特异性结合人肿瘤靶蛋白的第三抗原结合位点。
47.权利要求2、17、35-37、39、41、43和45任一项的结合蛋白，其中VH1和VL1形成特异性结合人CD28的第一抗原结合位点，其中VH2和VL2形成特异性结合人CD3的第二抗原结合位点，且其中VH3和VL3形成特异性结合人肿瘤靶蛋白的第三抗原结合位点。
48.权利要求46或权利要求47的结合蛋白，其中所述第三抗原结合位点特异性结合选自下组的人肿瘤靶蛋白：CD19、CD20、CD38、Her2和LAMP1。
49.权利要求46-48任一项的结合蛋白，其中所述特异性结合CD3的抗原结合位点包含：
(a)包含SEQ ID NO:152的氨基酸序列的重链可变域和包含SEQ ID NO:153的氨基酸序列的轻链可变域；或
(b)包含SEQ ID NO:154的氨基酸序列的重链可变域和包含SEQ ID NO:155的氨基酸序列的轻链可变域。
50.权利要求46-49任一项的结合蛋白，其中所述特异性结合CD28的抗原结合位点包含：
(a)包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列的重链可变域和包含SEQ ID NO:161的氨基酸序列的轻链可变域；或
(b)包含SEQ ID NO:162的氨基酸序列的重链可变域和包含SEQ ID NO:163的氨基酸序列的轻链可变域。
51.权利要求46-50任一项的结合蛋白，其中所述特异性结合肿瘤靶蛋白的抗原结合位点包含：
(a)包含SEQ ID NO:156的氨基酸序列的重链可变域和包含SEQ ID NO:157的氨基酸序列的轻链可变域；
(b)包含SEQ ID NO:158的氨基酸序列的重链可变域和包含SEQ ID NO:159的氨基酸序列的轻链可变域；
(c)包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列的重链可变域和包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列的轻链可变域；
(d)包含SEQ ID NO:150的氨基酸序列的重链可变域和包含SEQ ID NO:151的氨基酸序列的轻链可变域；或
(e)包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列的重链可变域和包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列的轻链可变域。
52.权利要求2、17、35-37、39、41、43和45任一项的结合蛋白，其中：
(a)VH1和VL1形成特异性结合人TNFa的第一抗原结合位点，VH2和VL2形成特异性结合人IL13的第二抗原结合位点，且VH3和VL3形成特异性结合人IL4的第三抗原结合位点；
(b)VH1和VL1形成特异性结合人TNFa的第一抗原结合位点，VH2和VL2形成特异性结合人IL4的第二抗原结合位点，且VH3和VL3形成特异性结合人IL13的第三抗原结合位点；
(c)VH1和VL1形成特异性结合人IL4的第一抗原结合位点，VH2和VL2形成特异性结合人TNFa的第二抗原结合位点，且VH3和VL3形成特异性结合人IL13的第三抗原结合位点；
(d)VH1和VL1形成特异性结合人IL4的第一抗原结合位点，VH2和VL2形成特异性结合人IL13的第二抗原结合位点，且VH3和VL3形成特异性结合人TNFa的第三抗原结合位点；
(e)VH1和VL1形成特异性结合人IL13的第一抗原结合位点，VH2和VL2形成特异性结合人IL4的第二抗原结合位点，且VH3和VL3形成特异性结合人TNFa的第三抗原结合位点；或
(f)VH1和VL1形成特异性结合人IL13的第一抗原结合位点，VH2和VL2形成特异性结合人TNFa的第二抗原结合位点，且VH3和VL3形成特异性结合人IL4的第三抗原结合位点。
53.权利要求52的结合蛋白，其中所述特异性结合人TNFa的抗原结合位点包含重链可变域和轻链可变域，所述重链可变域包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列，所述轻链可变域包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列。
54.权利要求52或权利要求53的结合蛋白，其中所述特异性结合人IL4的抗原结合位点包含重链可变域和轻链可变域，所述重链可变域包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列，所述轻链可变域包含SEQ ID NO:171的氨基酸序列。
55.权利要求52-54任一项的结合蛋白，其中所述特异性结合人IL13的抗原结合位点包含重链可变域和轻链可变域，所述重链可变域包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列，所述轻链可变域包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列。
56.权利要求1-55任一项的结合蛋白，其中：
(a)所述第一多肽链的CL域是人κCL域，且所述第四多肽链的CL域是人λCL域；或
(b)所述第一多肽链的CL域是人λCL域，且所述第四多肽链的CL域是人κCL域。
57.权利要求2、17、25、35-37、39、41和43-55任一项的结合蛋白，其中所述第一多肽链包含λCL域；其中所述第二多肽链的CH3域包含与人IgG1的位置354和366对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代为S354C和T366W；其中所述第三多肽链的CH3域包含与人IgG1的位置349、366、368、407、435和436对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引,其中所述氨基酸取代为Y349C、T366S、L368A、Y407V、H435R和Y436F；且其中第四多肽链包含κCL域。
58.一种结合蛋白，其包含第一多肽链、第二多肽链、第三多肽链和第四多肽链，其中：
(a)所述第一多肽链包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与SEQ IDNO:3的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；
(b)所述第一多肽链包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列或与SEQ ID NO:10的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或与SEQ IDNO:9的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；
(c)所述第一多肽链包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与SEQ IDNO:3的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列或与SEQ ID NO:13的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列或与SEQ ID NO:14的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；
(d)所述第一多肽链包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列或与SEQ ID NO:10的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或与SEQ IDNO:9的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列或与SEQ ID NO:13的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列或与SEQ ID NO:14的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；
(e)所述第一多肽链包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与SEQ IDNO:3的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列或与SEQ ID NO:17的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列或与SEQ ID NO:18的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；
(f)所述第一多肽链包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列或与SEQ ID NO:10的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或与SEQ IDNO:9的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列或与SEQ ID NO:17的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列或与SEQ ID NO:18的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；
(g)所述第一多肽链包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与SEQ IDNO:3的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列或与SEQ ID NO:21的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列或与SEQ ID NO:22的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；
(h)所述第一多肽链包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列或与SEQ ID NO:10的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或与SEQ IDNO:9的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列或与SEQ ID NO:21的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列或与SEQ ID NO:22的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；
(i)所述第一多肽链包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列或与SEQ ID NO:63的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列或与SEQ IDNO:62的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列或与SEQ ID NO:60的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列或与SEQ ID NO:61的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；
(j)所述第一多肽链包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列或与SEQ ID NO:69的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列或与SEQ IDNO:68的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列或与SEQ ID NO:60的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列或与SEQ ID NO:61的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；
(k)所述第一多肽链包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列或与SEQ ID NO:69的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列或与SEQ IDNO:68的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列或与SEQ ID NO:60的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列或与SEQ ID NO:71的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；
(l)所述第一多肽链包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列或与SEQ ID NO:76的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列或与SEQ IDNO:75的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列或与SEQ ID NO:73的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列或与SEQ ID NO:74的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；
(m)所述第一多肽链包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列或与SEQ ID NO:82的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列或与SEQ IDNO:81的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列或与SEQ ID NO:73的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列或与SEQ ID NO:74的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；
(n)所述第一多肽链包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列或与SEQ ID NO:88的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列或与SEQ IDNO:87的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列或与SEQ ID NO:85的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列或与SEQ ID NO:86的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；
(o)所述第一多肽链包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列或与SEQ ID NO:94的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列或与SEQ IDNO:93的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列或与SEQ ID NO:85的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列或与SEQ ID NO:86的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；
(p)所述第一多肽链包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列或与SEQ ID NO:69的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列或与SEQ IDNO:68的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列或与SEQ ID NO:73的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列或与SEQ ID NO:74的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；
(q)所述第一多肽链包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列或与SEQ ID NO:69的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列或与SEQ IDNO:68的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列或与SEQ ID NO:85的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列或与SEQ ID NO:86的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；
(r)所述第一多肽链包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列或与SEQ ID NO:63的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列或与SEQ IDNO:62的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列或与SEQ ID NO:73的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列或与SEQ ID NO:74的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；
(s)所述第一多肽链包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列或与SEQ ID NO:63的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列或与SEQ IDNO:62的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列或与SEQ ID NO:85的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列或与SEQ ID NO:86的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；
(t)所述第一多肽链包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与SEQ IDNO:3的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列或与SEQ ID NO:114的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列或与SEQ ID NO:115的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；或
(u)所述第一多肽链包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列或与SEQ ID NO:10的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或与SEQ IDNO:9的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；所述第三多肽链包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列或与SEQ ID NO:114的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；且所述第四多肽链包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列或与SEQ ID NO:115的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列。
59.一种分离的核酸分子，其包含编码权利要求1-58任一项的结合蛋白的核苷酸序列。
60.一种表达载体，其包含权利要求59的核酸分子。
61.一种分离的宿主细胞，其包含权利要求59的核酸分子。
62.一种分离的宿主细胞，其包含权利要求60的表达载体。
63.权利要求61或权利要求62的分离的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞或昆虫细胞。
64.一种药物组合物，其包含权利要求1-58任一项的结合蛋白及药学上可接受的载剂。
65.一种在患者中预防和/或治疗癌症的方法，包括对所述患者施用治疗有效量的权利要求1-23和32-58任一项的至少一个结合蛋白或权利要求64的药物组合物。
66.权利要求65的方法，其中所述结合蛋白包含一个特异性结合T细胞表面蛋白的抗原结合位点和另一个特异性结合肿瘤靶蛋白的抗原结合位点。
67.权利要求66的方法，其中所述结合蛋白包含特异性结合CD3的第一抗原结合位点，特异性结合CD28的第二抗原结合位点，和特异性结合选自下组的肿瘤靶蛋白第三抗原结合位点：CD19、CD20、CD38、Her2和LAMP1。
68.权利要求65-67任一项的方法，其中所述至少一个结合蛋白与化疗剂共同施用。
69.一种在患者中预防和/或治疗炎性疾病或病症的方法，包括对所述患者施用治疗有效量的权利要求1-15、24-45和52-58任一项的至少一个结合蛋白或权利要求64的药物组合物。
70.权利要求69的方法，其中所述结合蛋白包含3个抗原结合位点，其各自特异性结合选自下组的细胞因子靶蛋白：IL-4、IL-13和TNFa。
71.权利要求69或权利要求70的方法，其中所述至少一个结合蛋白与抗炎剂共同施用。
72.权利要求65-71任一项的方法，其中所述患者是人。
73.权利要求65或权利要求69的方法，其中所述结合蛋白能够抑制一个或多个选自下组的靶蛋白的功能：A2AR、APRIL、ATPD酶、BAFF、BAFFR、BCMA、BlyS、BTK、BTLA、B7DC、B7H1、B7H4、B7H5、B7H6、B7H7、B7RP1、B7-4、C3、C5、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL15、CCL17、CCL19、CCL20、CCL21、CCL24、CCL25、CCL26、CCR3、CCR4、CD3、CD19、CD20、CD23、CD24、CD27、CD28、CD38、CD39、CD40、CD70、CD80、CD86、CD122、CD137、CD137L、CD152、CD154、CD160、CD272、CD273、CD274、CD275、CD276、CD278、CD279、CDH1、壳多糖酶、CLEC9、CLEC91、CRTH2、CSF-1、CSF-2、CSF-3、CX3CL1、CXCL12、CXCL13、CXCR3、DNGR-1、外核苷三磷酸盐二磷酸水解酶1、EGFR、ENTPD1、FCER1A、FCER1、FLAP、FOLH1、Gi24、GITR、GITRL、GM-CSF、Her2、HHLA2、HMGB1、HVEM、ICOSLG、IDO、IFNα、IgE、IGF1R、IL2Rβ、IL1、IL1A、IL1B、IL1F10、IL2、IL4、IL4Ra、IL5、IL5R、IL6、IL7、IL7Ra、IL8、IL9、IL9R、IL10、rhIL10、IL12、IL13、IL13Ra1、IL13Ra2、IL15、IL17、IL17Rb、IL18、IL22、IL23、IL25、IL27、IL33、IL35、ITGB4、ITK、KIR、LAG3、LAMP1、瘦素、LPFS2、II类MHC、NCR3LG1、NKG2D、NTPD酶-1、OX40、OX40L、PD-1H、血小板受体、PROM1、S152、SISP1、SLC、SPG64、ST2、STEAP2、Syk激酶、TACI、TDO、T14、TIGIT、TIM3、TLR、TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、TMEF1、TNFa、TNFRSF7、Tp55、TREM1、TSLP、TSLPR、TWEAK、VEGF、VISTA、Vstm3、WUCAM和XCR1。
74.权利要求1-23和32-58任一项的结合蛋白或权利要求64的组合物，其用于在患者中预防和/或治疗癌症的用途。
75.用于权利要求74的用途的结合蛋白或组合物，其中所述结合蛋白包含一个特异性结合T细胞表面蛋白的抗原结合位点和另一个特异性结合肿瘤靶蛋白的抗原结合位点。
76.用于权利要求75的用途的结合蛋白或组合物，其中所述结合蛋白包含特异性结合CD3的第一抗原结合位点，特异性结合CD28的第二抗原结合位点，和特异性结合选自下组的肿瘤靶蛋白的第三抗原结合位点：CD19、CD20、CD38、Her2和LAMP1。
77.用于权利要求74-76的任一项的用途的结合蛋白或组合物，其中所述结合蛋白与化疗剂共同施用。
78.权利要求1-15、24-45和52-58任一项的结合蛋白或权利要求64的药物组合物，其用于在患者中预防和/或治疗炎性疾病或病症的用途。
79.用于权利要求78的用途的结合蛋白或组合物，其中所述结合蛋白包含3个抗原结合位点，其各自特异性结合选自下组的细胞因子靶蛋白：IL-4、IL-13和TNFa。
80.用于权利要求78或权利要求79的用途的结合蛋白或组合物，其中所述结合蛋白与抗炎剂共同施用。
81.用于权利要求74-80任一项的用途的结合蛋白或组合物，其中所述患者是人。
82.用于权利要求74或权利要求78的用途的结合蛋白或组合物，其中所述结合蛋白能够抑制一个或多个选自下组的靶蛋白的功能：A2AR、APRIL、ATPD酶、BAFF、BAFFR、BCMA、BlyS、BTK、BTLA、B7DC、B7H1、B7H4、B7H5、B7H6、B7H7、B7RP1、B7-4、C3、C5、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL15、CCL17、CCL19、CCL20、CCL21、CCL24、CCL25、CCL26、CCR3、CCR4、CD3、CD19、CD20、CD23、CD24、CD27、CD28、CD38、CD39、CD40、CD70、CD80、CD86、CD122、CD137、CD137L、CD152、CD154、CD160、CD272、CD273、CD274、CD275、CD276、CD278、CD279、CDH1、壳多糖酶、CLEC9、CLEC91、CRTH2、CSF-1、CSF-2、CSF-3、CX3CL1、CXCL12、CXCL13、CXCR3、DNGR-1、外核苷三磷酸盐二磷酸水解酶1、EGFR、ENTPD1、FCER1A、FCER1、FLAP、FOLH1、Gi24、GITR、GITRL、GM-CSF、Her2、HHLA2、HMGB1、HVEM、ICOSLG、IDO、IFNα、IgE、IGF1R、IL2Rβ、IL1、IL1A、IL1B、IL1F10、IL2、IL4、IL4Ra、IL5、IL5R、IL6、IL7、IL7Ra、IL8、IL9、IL9R、IL10、rhIL10、IL12、IL13、IL13Ra1、IL13Ra2、IL15、IL17、IL17Rb、IL18、IL22、IL23、IL25、IL27、IL33、IL35、ITGB4、ITK、KIR、LAG3、LAMP1、瘦素、LPFS2、II类MHC、NCR3LG1、NKG2D、NTPD酶-1、OX40、OX40L、PD-1H、血小板受体、PROM1、S152、SISP1、SLC、SPG64、ST2、STEAP2、Syk激酶、TACI、TDO、T14、TIGIT、TIM3、TLR、TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、TMEF1、TNFa、TNFRSF7、Tp55、TREM1、TSLP、TSLPR、TWEAK、VEGF、VISTA、Vstm3、WUCAM和XCR1。
83.一种纯化通过宿主细胞产生的结合蛋白的方法，包括：
(a)在宿主细胞中产生权利要求2、17、25、35-37、41、43、45和46-55任一项的结合蛋白，其中第二多肽链的CH3域和所述第三多肽链的CH3域中仅有一个包含与人IgG1或IgG4的位置435和436对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引，其中所述氨基酸取代是H435R和Y436F；
(b)使(a)中产生的结合蛋白与蛋白A接触；和
(c)在适于从包含0或2个CH3域的结合蛋白分离出所述结合蛋白的条件下从蛋白A洗脱所述结合蛋白，所述CH3域包含其为H435R和Y436F的氨基酸取代。
84.权利要求83的方法，其中所述第一多肽链的CL域是人κCL域，且所述第四多肽链的CL域是人λCL域；或所述第一多肽链的CL域是人λCL域，且所述第四多肽链的CL域是人κCL域，且所述方法进一步包括：
(d)使(c)中洗脱的结合蛋白与κ轻链亲和介质接触；和
(e)在适于从仅包含λCL域的结合蛋白分离出所述结合蛋白的条件下从所述κ轻链亲和介质洗脱结合蛋白。
85.权利要求84的方法，其在(e)之后还包括：
(f)使(e)中洗脱的结合蛋白与λ轻链亲和介质接触；和
(g)在适于从仅包含κCL域的结合蛋白分离出所述结合蛋白的条件下从所述λ轻链亲和介质洗脱结合蛋白。
86.权利要求83的方法，其中所述第一多肽链的CL域是人κCL域，且所述第四多肽链的CL域是人λCL域；或所述第一多肽链的CL域是人λCL域，且所述第四多肽链的CL域是人κCL域，且所述方法进一步包括：
(d)使(c)中洗脱的结合蛋白与λ轻链亲和介质接触；和
(e)在适于从仅包含κCL域的结合蛋白分离出所述结合蛋白的条件下从所述λ轻链亲和介质洗脱结合蛋白。
87.权利要求86的方法，在(e)之后进一步包括：
(f)使(e)中洗脱的结合蛋白与κ轻链亲和介质接触；和
(g)在适于从仅包含λCL域的结合蛋白分离出所述结合蛋白的条件下从所述κ轻链亲和介质洗脱结合蛋白。
88.权利要求83-87任一项的方法，其中所述第一多肽链包含λCL域；其中所述第二多肽链的CH3域包含与人IgG1的位置354和366对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引,其中所述氨基酸取代为S354C和T366W；其中所述第三多肽链的CH3域包含与人IgG1的位置349、366、368、407、435和436对应的位置处的氨基酸取代，其根据EU索引,其中所述氨基酸取代为Y349C、T366S、L368A、Y407V、H435R和Y436F；且其中第四多肽链包含κCL域。
89.权利要求83-88任一项的方法，其中在(c)和(e)的一项或多项中使用疏水作用色谱(HIC)来检测所述结合蛋白。
90.权利要求83-89任一项的方法，其中所述第二和第三多肽链的CH3域是人IgG1或IgG4CH3域。
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