BR112021012337A2

BR112021012337A2 - Proteínas de ligação multiespecíficas baseadas em pseudofab

Info

Publication number: BR112021012337A2
Application number: BR112021012337-7A
Authority: BR
Inventors: Christian Beil; Ercole Rao; Nadja Spindler; Sandra Weil; Karl-Christian ENGEL; Gerhard Hessler; Soraya Hoelper; Christian Lange; Thomas Langer; Cendrine Lemoine; Wulf-Dirk Leuschner; Sevim Oezguer Bruederle
Original assignee: Sanofi
Priority date: 2018-12-24
Filing date: 2019-12-23
Publication date: 2021-09-14
Also published as: CN114885609A; JP2024504880A; US20230391888A1; MX2021007677A; AU2019416895A1; TW202041534A; SG11202106393SA; EP3902825A1; WO2020136564A1; AU2019416895A2; IL284317A; CA3124770A1; US20200255540A1; MA54601A; KR20220015369A; US11739160B2; CO2021009025A2

Abstract

proteínas de ligação multiespecíficas baseadas em pseudofab. a presente invenção refere-se a proteínas de ligação que compreendem um domínio pseudofab incluindo um domínio nocaute estabilizado e um segundo vh/vl que forma um primeiro domínio de ligação a antígeno funcional. a presente invenção também se refere a proteínas de ligação multiespecíficas compreendendo pelo menos um pseudofab. a invenção ainda se refere a proteínas de ligação multiespecíficas, ácidos nucleicos que codificam proteínas de ligação e proteínas de ligação multiespecíficas, vetores de expressão, células hospedeiras, composição farmacêutica e métodos de tratamento de administração das proteínas de ligação ou proteínas de ligação multiespecíficas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO MULTIESPECÍFICAS BASEADAS EM PSEUDOFAB".

PEDIDOS RELACIONADOS

[001] O presente pedido reivindica prioridade ao pedido EP Nº.

18306840.2 depositado em 24 de dezembro de 2018 e pedido EP Nº.

19305813.8 depositado em 21 de junho de 2019, cujos conteúdos são aqui incorporados por referência para todos os efeitos.

ANTECEDENTES

[002] A criação de assimetria em uma estrutura de anticorpo nativa é um pré-requisito para a geração de proteínas de ligação multiespecíficas com duas (por exemplo, anticorpos biespecíficos) ou mais especificidades de ligação. Por exemplo, separando um ou mais Fvs em diferentes braços de ligação assimétricos ou Fabs, um anticorpo biespecífico pode ser feito com a flexibilidade de ligar dois antígenos ou epítopos diferentes simultaneamente. Apesar dessas vantagens, no entanto, uma grande variedade de tecnologias de anticorpos multiespecíficos sofre problemas de processo e fabricação devido ao emparelhamento incorreto de várias cadeias pesadas e leves assimétricas. Por exemplo, muitas dessas tecnologias sofrem do chamado "problema da cadeia leve", em que o emparelhamento aleatório das duas cadeias leves diferentes com as cadeias pesadas gera várias combinações de pares de cadeias diferentes da combinação desejada. Em alguns casos, o problema da cadeia leve pode ser contornado pelo uso de uma cadeia leve comum, que permite a ligação a ambos os antígenos ou epítopos. No entanto, isso pode não ser possível para muitos anticorpos, uma vez que este formato requer a geração de anticorpos de novo em camundongos transgênicos. Além disso, anticorpos raros, como anticorpos anti-HIV amplamente neutralizantes derivados de pacientes humanos, não podem ser adaptados a tal formato. Consequentemente, continua a haver necessidade de soluções alternativas e criativas para o problema do emparelhamento incorreto.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[003] A presente divulgação é baseada na descoberta de um novo domínio de heterodimerização denominado "domínio nocaute estabilizado" que pode ser usado para formar um "pseudoFab". Conforme divulgado neste documento, um pseudoFab pode ser incorporado em uma ampla variedade de proteínas de ligação e formatos de ligação para conferir propriedades de ligação multiespecíficas. Em certos aspectos, a porção pseudoFab pode facilitar a produção, síntese ou purificação preferencial de uma proteína de ligação multiespecífica desejada, enquanto minimiza ou elimina os emparelhamentos incorretos de cadeia indesejados que são comumente gerados com formatos convencionais de proteínas de ligação multiespecíficas. Em um aspecto, a presente divulgação fornece uma proteína de ligação que compreende: uma primeira porção pseudoFab compreendendo (1) um primeiro domínio VL (VLa) emparelhado com um primeiro domínio VH (VHa) para formar um primeiro sítio de ligação de antígeno funcional que liga o antígeno alvo A; (2) um primeiro domínio VH nocaute estabilizado (VHX) emparelhado com um primeiro domínio VL nocaute estabilizado (VLX) para formar um primeiro domínio nocaute estabilizado; em que o domínio nocaute estabilizado compreende (3) uma ou mais mutações de inativação que abolem a ligação a um antígeno alvo; e (4) uma ou mais ligações dissulfeto intercadeia construídas geneticamente.

[004] Em um aspecto, a presente divulgação fornece uma proteína de ligação que compreende: uma primeira porção pseudoFab compreendendo (1) um primeiro domínio VL (VLa) emparelhado com um primeiro domínio VH (VHa) para formar um primeiro sítio de ligação de antígeno funcional que liga o antígeno alvo A; (2) um primeiro domínio VH nocaute estabilizado (VHX) emparelhado com um primeiro domínio VL nocaute estabilizado (VLX) para formar um primeiro domínio nocaute estabilizado; em que o domínio nocaute estabilizado compreende (3) uma ou mais mutações de inativação que abolem sua ligação a um antígeno alvo em relação aos domínios de tipo selvagem e (4) uma ou mais ligações dissulfeto intercadeia construídas geneticamente que conferem estabilidade térmica aprimorada (Tm) do pseudoFab relativo a uma molécula Fab de referência, em que a molécula Fab de referência é idêntica à molécula pseudoFab, exceto que, em uma molécula pseudoFab, os domínios CH1 e CL da molécula Fab de referência são substituídos por domínios VHX e VLX.

[005] Em algumas modalidades, a proteína de ligação é uma proteína de ligação multiespecífica que adicionalmente compreende: pelo menos um segundo domínio VL (VLb) emparelhado com um segundo domínio VH (VHb) para formar um segundo sítio de ligação de antígeno funcional que liga o antígeno alvo B.

[006] Em um aspecto, a presente divulgação fornece uma proteína de ligação multiespecífica que compreende a) uma primeira porção pseudoFab compreendendo (1) um primeiro domínio VL (VLa) emparelhado com um primeiro domínio VH (VHa) para formar um primeiro sítio de ligação de antígeno funcional que liga o antígeno alvo A;

(2) um primeiro domínio VH nocaute estabilizado (VHX) emparelhado com um primeiro domínio VL nocaute estabilizado (VLX) para formar um primeiro domínio nocaute estabilizado; b) uma primeira porção Fab compreendendo (3) um segundo domínio VL (VLb) emparelhado com o segundo domínio VH (VHb) para formar um segundo sítio de ligação do antígeno funcional que liga o antígeno alvo B; (4) um primeiro domínio CH1 emparelhado com um primeiro domínio CL; e em que o domínio nocaute estabilizado compreende (5) uma ou mais mutações de inativação que abolem sua ligação a um antígeno alvo; e (6) uma ou mais ligações dissulfeto intercadeia construídas geneticamente; ou alternativamente em que o domínio nocaute estabilizado compreende (5) uma ou mais mutações de inativação que abolem sua ligação a um antígeno alvo em relação aos domínios de tipo selvagem e (6) uma ou mais ligações dissulfeto intercadeia construídas geneticamente que conferem estabilidade térmica aumentada (Tm) do pseudoFab relativo a uma molécula Fab de referência, em que a molécula Fab de referência é idêntica à molécula pseudoFab, exceto que, em uma molécula pseudoFab, os domínios CH1 e CL da molécula Fab de referência são substituídos por domínios VHX e VLX.

[007] Em outro aspecto, a presente divulgação fornece uma proteína de ligação multiespecífica que compreende a) uma primeira porção pseudoFab compreendendo (1) um primeiro domínio VL (VLa) emparelhado com um primeiro domínio VH (VHa) para formar um primeiro sítio de ligação de antígeno funcional que liga o antígeno alvo A; (2) um primeiro domínio VH nocaute estabilizado (VHX) emparelhado com um primeiro domínio VL nocaute estabilizado

(VLX) para formar um domínio nocaute estabilizado, com a condição de que a primeira porção pseudoFab não compreende um domínio CH1 emparelhado com um domínio CL; em que o domínio nocaute estabilizado compreende (3) uma ou mais mutações de inativação que abolem sua ligação a um antígeno alvo; e (4) uma ou mais ligações dissulfeto intercadeia construídas geneticamente; ou, alternativamente, em que o domínio nocaute estabilizado compreende (3) uma ou mais mutações de inativação que abolem sua ligação a um antígeno alvo em relação aos domínios de tipo selvagem e (4) uma ou mais ligações dissulfeto intercadeia construídas geneticamente que conferem estabilidade térmica aprimorada (Tm) do pseudoFab relativo a uma molécula Fab de referência, em que a molécula Fab de referência é idêntica à molécula pseudoFab, exceto que, em uma molécula pseudoFab, os domínios CH1 e CL da molécula Fab de referência são substituídos por domínios VHX e VLX; b) uma primeira porção Fab compreendendo (5) um segundo domínio VL (VLb) emparelhado com o segundo domínio VH (VHb) para formar um segundo sítio de ligação de antígeno funcional que liga o antígeno alvo B; (6) um primeiro domínio CH1 emparelhado com um primeiro domínio CL; e c) uma porção ligante que liga operativamente a primeira porção Fab e a primeira porção pseudoFab.

[008] Em outro aspecto, a presente divulgação fornece uma proteína de ligação multiespecífica que compreende a) uma primeira porção pseudoFab compreendendo (1) um primeiro domínio VL (VLa) emparelhado com um primeiro domínio VH (VHa) para formar um primeiro sítio de ligação de antígeno funcional que liga o antígeno alvo A;

(2) um primeiro domínio VH nocaute estabilizado (VHX) emparelhado com um primeiro domínio VL nocaute estabilizado (VLX) para formar um primeiro domínio nocaute estabilizado; b) uma primeira porção Fab compreendendo (3) um segundo domínio VL (VLb) emparelhado com o segundo domínio VH (VHb) para formar um segundo sítio de ligação do antígeno funcional que liga o antígeno alvo B; (4) um primeiro domínio CH1 emparelhado com um primeiro domínio CL; e em que o domínio nocaute estabilizado compreende (5) uma ou mais mutações de inativação que abolem sua ligação a um antígeno alvo; e (6) uma ou mais ligações dissulfeto intercadeia construídas geneticamente; ou alternativamente, em que o domínio nocaute estabilizado compreende (5) uma ou mais mutações de inativação que abolem sua ligação a um antígeno alvo em relação aos domínios de tipo selvagem e (6) uma ou mais ligações dissulfeto intercadeia construídas geneticamente que conferem estabilidade térmica aprimorada (Tm) do pseudoFab relativo a uma molécula Fab de referência, em que a molécula Fab de referência é idêntica à molécula pseudoFab, exceto que, em uma molécula pseudoFab, os domínios CH1 e CL da molécula Fab de referência são substituídos por domínios VHX e VLX. c) uma porção ligante que liga operativamente a primeira porção Fab e a primeira porção pseudoFab.

[009] Em algumas modalidades, a porção ligante está em uma ou mais cadeias pesadas.

[010] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica adicionalmente compreende um terceiro domínio VL (VLc) emparelhado com um terceiro domínio VH (VHc), para formar um terceiro sítio de ligação a antígeno funcional que liga o antígeno alvo C.

[011] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica compreende, independentemente, uma ou duas porções de pseudoFab e uma ou duas porções de Fab.

[012] Em algumas modalidades, a porção ligante é um ligante peptídico. Em algumas modalidades, o ligante peptídico é um ligante Gly-Ser da formulação (Gly4Ser) n, em que n é 1-10.

[013] Em algumas modalidades, o domínio de heterodimerização compreende um anticorpo IgG de comprimento total. Em algumas modalidades, o domínio de heterodimerização compreende o domínio Fc de um anticorpo IgG de comprimento total ou um fragmento funcional do mesmo.

[014] Em algumas modalidades, a proteína de ligação compreende cadeias de proteínas separadas e selecionadas a partir de um do seguinte grupo: (a) VHa-CH1-L1-VHb-L2-VHX e VLa-CL e VLb-L3-VLX; (b) VHa-L2-VHX-L1-VHb-CH1 e VLa-L3-VLX e VLb-CL; (c) VHa-CH1-L1-VHa-CH1 e VHb-L2-VHX-L3-VHb-L4-VHX e duas cadeias VLb-L5-VLX e duas cadeias VLa-CL; em que as cadeias de (a) e (b) podem estar presentes uma ou duas vezes, e em que L1, L2, L3, L4 e L5 são ligantes, que podem ser independentemente iguais ou diferentes.

[015] A presente divulgação fornece um anticorpo multiespecífico que compreende a) uma primeira porção pseudoFab que compreende: (1) um primeiro domínio VL (VLa) emparelhado com um primeiro domínio VH (VHa) para formar um primeiro sítio de ligação a antígeno que se liga ao antígeno alvo A; (2) um primeiro domínio VL nocaute estabilizado (VLX) emparelhado com um primeiro domínio VH nocaute estabilizado (VHX) para formar um primeiro domínio nocaute estabilizado por dissulfeto (dsKO);

(3) um primeiro domínio de heterodimerização (HD1); em que o primeiro domínio dsKO compreende (i) uma ou mais mutações de inativação que abolem sua ligação a um antígeno alvo e (ii) uma ou mais ligações dissulfeto intercadeia construídas geneticamente; ou, alternativamente, compreende (i) uma ou mais mutações de inativação que abolem sua ligação a um antígeno alvo em relação aos domínios de tipo selvagem e (ii) uma ou mais ligações dissulfeto intercadeia construídas geneticamente que conferem estabilidade térmica aprimorada (Tm) do pseudoFab relativo a uma molécula Fab de referência, em que a molécula Fab de referência é idêntica à molécula pseudoFab, exceto que, em uma molécula pseudoFab, os domínios CH1 e CL da molécula Fab de referência são substituídos por domínios VHX e VLX. b) uma primeira porção Fab compreendendo (1) um segundo domínio VL (VLb) emparelhado com o segundo domínio VH (VHb) para formar um segundo sítio de ligação de antígeno funcional que liga o antígeno alvo B; (2) um primeiro domínio CH1 emparelhado com um primeiro domínio CL; e (3) um segundo domínio de heterodimerização (HD2).

[016] Em algumas modalidades, o primeiro domínio de heterodimerização (HD1) está operativamente ligado ao C-terminal do domínio VHX da porção pseudoFab.

[017] Em algumas modalidades, o segundo domínio de heterodimerização (HD2) está operativamente ligado ao C-terminal do primeiro domínio CH1 da primeira porção Fab.

[018] Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo domínios de heterodimerização compreendem o primeiro e o segundo domínios Fc.

[019] Em algumas modalidades, os domínios Fc compreendem a estrutura geral dobradiça - domínio CH2 - domínio CH3.

[020] Em algumas modalidades, os domínios Fc compreendem uma ou mais mutações knob-in-hole (KIH).

[021] Em algumas modalidades, um dos domínios Fc compreende um primeiro domínio CH3 compreendendo uma ou ambas as mutações S354C e T366W, e o outro domínio Fc compreende um segundo domínio CH3 compreendendo uma ou ambas mutações Y349C, T366S, L368A e Y407V.

[022] Em algumas modalidades, os domínios Fc compreendem mutações H435R e/ou Y436F.

[023] Em algumas modalidades, a primeira porção do pseudoFab compreende uma primeira cadeia polipeptídica tendo uma estrutura representada pela fórmula: (Ia) N-VHa-L1-VHX-C e uma segunda cadeia polipeptídica tendo uma estrutura representada pela fórmula: (IIa) N-VLa-L2-VLX-C em que L1 e L2 são ligantes, que podem estar independentemente presentes ou ausentes, e em que N e C representam as extremidades N- e C-terminais, respectivamente.

[024] Em algumas modalidades, a primeira porção do pseudoFab compreende uma primeira cadeia polipeptídica tendo uma estrutura representada pela fórmula: (Ib) N-VHX-L1-VHa-C e uma segunda cadeia polipeptídica tendo uma estrutura representada pela fórmula: (IIb) N-VLX-L2-VLa-C em que L1 e L2 são ligantes, que podem estar independentemente presentes ou ausentes, e em que N e C representam as extremidades N- e C-terminais, respectivamente.

[025] Em algumas modalidades, a primeira porção do pseudoFab compreende uma primeira cadeia polipeptídica tendo uma estrutura representada pela fórmula: (Ic) N-VLa-L1-VHX-C e uma segunda cadeia polipeptídica tendo uma estrutura representada pela fórmula: (IIc) N-VHa-L2-VLX-C em que L1 e L2 são ligantes, que podem estar independentemente presentes ou ausentes, e em que N e C representam as extremidades N- e C-terminais, respectivamente.

[026] Em algumas modalidades, a primeira porção do pseudoFab compreende uma primeira cadeia polipeptídica tendo uma estrutura representada pela fórmula: (Id) N-VHX-L1-VLa-C e uma segunda cadeia polipeptídica tendo uma estrutura representada pela fórmula: (IId) N-VLX-L2-VHa-C em que L1 e L2 são ligantes, que podem estar independentemente presentes ou ausentes, e em que N e C representam as extremidades N- e C-terminais, respectivamente.

[027] Em algumas modalidades, pelo menos dois de Antígeno Alvo A, Antígeno Alvo B e Antígeno Alvo C são antígenos alvo diferentes.

[028] Em algumas modalidades, pelo menos um dos antígenos alvo é um ligando de um receptor de superfície celular e pelo menos um dos antígenos alvo é um receptor de superfície celular.

[029] Em algumas modalidades, os sítios de ligação a antígeno são derivados de diferentes anticorpos.

[030] Em algumas modalidades, Antígeno Alvo A, Antígeno Alvo B e Antígeno Alvo C são o mesmo antígeno alvo.

[031] Em algumas modalidades, os sítios de ligação a antígeno ligam diferentes epítopos no mesmo antígeno alvo.

[032] Em algumas modalidades, os sítios de ligação a antígeno ligam o mesmo epítopo no mesmo antígeno alvo.

[033] Em algumas modalidades, os sítios de ligação a antígeno são derivados do mesmo anticorpo.

[034] Em algumas modalidades, a temperatura de fusão (Tm) da porção pseudoFab é pelo menos 4 graus Celsius mais alta do que a molécula Fab de referência.

[035] Em algumas modalidades, a ligação dissulfeto intercadeia construída geneticamente é VH44C-VL100C.

[036] Em algumas modalidades, a ligação dissulfeto intercadeia construída geneticamente é VH105C-VL43C.

[037] Em algumas modalidades, pelo menos uma das uma ou mais mutações de inativação que abolem a ligação a antígeno alvo estão presentes no domínio VHX da porção pseudoFab.

[038] Em algumas modalidades, pelo menos uma das uma ou mais mutações de inativação que abolem a ligação a antígeno alvo estão presentes na CDRH3 do domínio VHX.

[039] Em algumas modalidades, pelo menos uma das uma ou mais mutações de inativação que abolem a ligação a antígeno alvo estão presentes na CDRH2 do domínio VHX.

[040] Em algumas modalidades, pelo menos uma das uma ou mais mutações de inativação que abolem a ligação a antígeno alvo estão presentes na CDRH1 do domínio VHX.

[041] Em algumas modalidades, pelo menos uma das uma ou mais mutações de inativação que abolem a ligação a antígeno alvo estão presentes no domínio VLX da porção PseudoFab.

[042] Em algumas modalidades, pelo menos uma das uma ou mais mutações de inativação que abolem a ligação a antígeno alvo estão presentes na CDRL3 do domínio VLX.

[043] Em algumas modalidades, pelo menos uma das uma ou mais mutações de inativação que abolem a ligação a antígeno alvo estão presentes na CDRL2 do domínio VLX.

[044] Em algumas modalidades, pelo menos uma das uma ou mais mutações de inativação que abolem a ligação a antígeno alvo estão presentes na CDRL1 do domínio VLX.

[045] Em algumas modalidades, o domínio VHX da porção pseudoFab compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Nº: 77, SEQ ID Nº: 78 e SEQ ID Nº: 79.

[046] Em algumas modalidades, o par VLX/VHX é selecionado a partir do grupo que consiste em: (i) VLX compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 76 e VHX compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 77; ii) VLX compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 76 e VHX compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 78; e iii) VLX compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 76 e VHX compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 79.

[047] Em algumas modalidades, a proteína de ligação adicionalmente compreende um ou mais domínios de ligação adicionais operativamente ligados a um N- ou C-terminal da proteína de ligação.

[048] Em algumas modalidades, um ou mais domínios de ligação adicionais estão operativamente ligados ao N-terminal da primeira ou segunda porção do pseudoFab.

[049] Em algumas modalidades, um ou mais domínios de ligação adicionais estão operativamente ligados ao N-terminal da primeira ou segunda porção Fab.

[050] Em outro aspecto, a presente divulgação fornece uma proteína de ligação multiespecífica compreendendo quatro cadeias polipeptídicas que formam pelo menos dois sítios de ligação a antígeno, em que a) um primeiro polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VLa-L1-VLX [I] (b) um segundo polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VHa-L2-VHX-FC1 [II] (c) um terceiro polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VLb-CL [III] (d) um quarto polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VHb-CH1-FC2 [IV] em que: VLa é um primeiro domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VLb é um segundo domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VHa é um primeiro domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; VHb é um segundo domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; VLX é um domínio variável de cadeia leve nocaute estabilizado;

VHX é um domínio variável de cadeia pesada nocaute estabilizado; CL é um domínio constante de cadeia leve de imunoglobulina; CH1 é um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina CH1; FC1 e FC2 são domínios Fc compreendendo uma região de dobradiça de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2 e CH3; e L1 e L2 são ligantes de aminoácidos, que podem ser independentemente iguais ou diferentes; em que (1) o primeiro domínio VL (VLa) é emparelhado com um primeiro domínio VH (VHa) para formar um primeiro sítio de ligação de antígeno funcional que liga o antígeno alvo A; (2) o segundo domínio VL (VLb) é emparelhado com um segundo domínio VH (VHb) para formar um segundo sítio de ligação de antígeno funcional que liga o antígeno alvo B; (3) o domínio VL nocaute estabilizado (VLX) é emparelhado com o domínio VH nocaute estabilizado (VHX) para formar um domínio nocaute estabilizado por dissulfeto (dsKO); em que o domínio dsKO compreende (i) uma ou mais mutações de inativação que abolem sua ligação a um antígeno alvo; e (ii) uma ou mais ligações dissulfeto intercadeia construídas geneticamente.

[051] Em outro aspecto, a presente divulgação fornece uma proteína de ligação a antígeno compreendendo seis cadeias polipeptídicas que formam quatro sítios de ligação a antígeno, em que (a) o primeiro e o segundo polipeptídeos compreendem uma estrutura representada pela fórmula:

VLa-L1-VLX [I] e [II] (b) o terceiro e o quarto polipeptídeos compreendem uma estrutura representada pela fórmula: VLb-CL [III] e [IV] (c) o quinto polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VHa-L2-VHX-L3-VHb-CH1-FC1 [V] (d) o sexto polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VHa-L2-VHX-L3-VHb-CH1-FC2 [VI] em que: VLa é um primeiro domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VLb é um segundo domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VHa é um primeiro domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; VHb é um segundo domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; VLX é um domínio variável de cadeia leve nocaute estabilizado; VHX é um domínio variável de cadeia pesada nocaute estabilizado; CL é um domínio constante de cadeia leve de imunoglobulina; CH1 é um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina CH1; FC1 e FC2 são domínios Fc compreendendo uma região de dobradiça de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2 e CH3; e

L1 e L2 são ligantes de aminoácidos, que podem ser independentemente iguais ou diferentes; em que (1) o primeiro domínio VL (VLa) é emparelhado com um primeiro domínio VH (VHa) para formar um primeiro sítio de ligação de antígeno funcional que liga o antígeno alvo A; (2) o segundo domínio VL (VLb) é emparelhado com um segundo domínio VH (VHb) para formar um segundo sítio de ligação de antígeno funcional que liga o antígeno alvo B; (3) o domínio VL nocaute estabilizado (VLX) é emparelhado com o domínio VH nocaute estabilizado (VHX) para formar um domínio nocaute estabilizado por dissulfeto (dsKO); em que o domínio dsKO compreende (i) uma ou mais mutações de inativação que abolem sua ligação a um antígeno alvo; e (ii) uma ou mais ligações dissulfeto intercadeia construídas geneticamente.

[052] Em outro aspecto, a presente divulgação fornece uma proteína de ligação a antígeno compreendendo seis cadeias polipeptídicas que formam quatro sítios de ligação a antígeno, em que (a) o primeiro e o segundo polipeptídeos compreendem uma estrutura representada pela fórmula: VLa-L1-VLX [I] e [II] (b) o terceiro e o quarto polipeptídeos compreendem uma estrutura representada pela fórmula: VLb-CL [III] e [IV] (c) o quinto polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VHb-CH1-L3-VHa-L2-VHX-FC1 [V] (d) o sexto polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula:

VHb-CH1-L3-VHa-L2-VHX-FC2 [VI] em que: VLa é um primeiro domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VLb é um segundo domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VHa é um primeiro domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; VHb é um segundo domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; VLX é um domínio variável de cadeia leve nocaute estabilizado; VHX é um domínio variável de cadeia pesada nocaute estabilizado; CL é um domínio constante de cadeia leve de imunoglobulina; CH1 é um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina; FC1 e FC2 são domínios Fc compreendendo uma região de dobradiça de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2 e CH3; e L1, L2 e L3 são ligantes de aminoácidos, em que (1) o primeiro domínio VL (VLa) é emparelhado com o primeiro domínio VH (VHa) para formar um primeiro sítio de ligação a antígeno funcional que liga o antígeno alvo A; (2) o segundo domínio VL (VLb) é emparelhado com o segundo domínio VH (VHb) para formar um segundo sítio de ligação a antígeno funcional que liga o antígeno alvo B; (3) o domínio VL nocaute estabilizado (VLX) é emparelhado com o domínio VH nocaute estabilizado (VHX) para formar um domínio nocaute estabilizado por dissulfeto (dsKO); em que os domínios dsKO compreendem (i) uma ou mais mutações de inativação que abolem sua ligação a um antígeno alvo; (ii) uma ou mais ligações dissulfeto intercadeia construídas geneticamente.

[053] Em outro aspecto, a presente divulgação fornece uma proteína de ligação a antígeno compreendendo seis cadeias polipeptídicas que formam quatro sítios de ligação a antígeno, em que (a) o primeiro e o segundo polipeptídeos compreendem uma estrutura representada pela fórmula: VLa-L1-VLX [I] e [II] (b) o terceiro e o quarto polipeptídeos compreendem uma estrutura representada pela fórmula: VLb-CL [III] e [IV] (c) o quinto polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VHa-L2-VHX-L3-VHa-L4-VHX-FC1 [V] (d) o sexto polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VHb-CH1-L5-VHb-CH1-FC2 [VI] em que: VLa é um primeiro domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VLb é um segundo domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VHa é um primeiro domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina;

VHb é um segundo domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; VLX é um domínio variável de cadeia leve nocaute estabilizado; VHX é um domínio variável de cadeia pesada nocaute estabilizado; CL é um domínio constante de cadeia leve de imunoglobulina; CH1 é um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina; FC1 e FC2 são domínios Fc compreendendo uma região de dobradiça de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2 e CH3; e L1, L2, L3, L4 e L5 são ligantes de aminoácidos, em que (1) o primeiro domínio VL (VLa) é emparelhado com o primeiro domínio VH (VHa) para formar um primeiro sítio de ligação a antígeno funcional que liga o antígeno alvo A; (2) o segundo domínio VL (VLb) é emparelhado com o segundo domínio VH (VHb) para formar um segundo sítio de ligação a antígeno funcional que liga o antígeno alvo B; (3) o domínio VL nocaute estabilizado (VLX) é emparelhado com o domínio VH nocaute estabilizado (VHX) para formar um domínio nocaute estabilizado por dissulfeto (dsKO); em que os domínios dsKO compreendem (i) uma ou mais mutações de inativação que abolem sua ligação a um antígeno alvo; e (ii) uma ou mais ligações dissulfeto intercadeia projetadas.

[054] Em outro aspecto, a presente divulgação fornece uma proteína de ligação a antígeno compreendendo quatro cadeias polipeptídicas que formam três sítios de ligação a antígeno, em que: (a) o polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VLa-L1-VLX [I] (b) o segundo polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VHa-L2-VHX-FC1 [II] (c) o terceiro polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VLb-L3-VLc-L4-CL [III] (d) o quarto polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula:

VHc-L5-VHb-L6-CH1-FC2 [IV]

em que: VLa é um primeiro domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VLb é um segundo domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VLc é um terceiro domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VHa é um primeiro domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; VHb é um segundo domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; VHc é um terceiro domínio variável da cadeia pesada de imunoglobulina; CL é um domínio constante de cadeia leve de imunoglobulina;

CH1 é um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina CH1; VLX é um primeiro domínio variável de cadeia leve nocaute estabilizado; VHX é um primeiro domínio variável de cadeia pesada nocaute estabilizado; FC1 e FC2 são domínios Fc compreendendo uma região de dobradiça de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2 e CH3; e L1, L2, L3, L4, L5 e L6 são ligantes de aminoácidos, em que (1) o primeiro domínio VL (VLa) é emparelhado com o primeiro domínio VH (VHa) para formar um primeiro sítio de ligação a antígeno funcional que liga o antígeno alvo A; (2) o segundo domínio VL (VLb) é emparelhado com o segundo domínio VH (VHb) para formar um segundo sítio de ligação a antígeno funcional que liga o antígeno alvo B; (3) o terceiro domínio VL (VLc) é emparelhado com o terceiro domínio VH (VHc) para formar um primeiro sítio de ligação a antígeno funcional que se liga ao antígeno C alvo; (4) o polipeptídeo de fórmula III e o polipeptídeo de fórmula IV formam um par cruzado de cadeia leve-cadeia pesada (CODV); (5) o domínio VL nocaute estabilizado (VLX) é emparelhado com o domínio VH nocaute estabilizado (VHX) para formar um domínio nocaute estabilizado por dissulfeto (dsKO); em que o domínio dsKO compreende (i) uma ou mais mutações de inativação que abolem sua ligação a um antígeno alvo; e (ii) uma ou mais ligações dissulfeto intercadeia construídas geneticamente.

[055] Em outro aspecto, a presente divulgação fornece uma proteína de ligação a antígeno compreendendo quatro cadeias polipeptídicas que formam três sítios de ligação a antígeno, em que: (a) o polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VLa-L1-VLX [I] (b) o segundo polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VHa-L2-VHX-FC1 [II] (c) o terceiro polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VLb-L3-VLc-L4-CL [III] (d) o quarto polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula:

VHc-L5-VHb-L6-CH1-FC2 [IV]

em que: VLa é um primeiro domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VLb é um segundo domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VLc é um terceiro domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VHa é um primeiro domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; VHb é um segundo domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; VHc é um terceiro domínio variável da cadeia pesada de imunoglobulina;

CL é um domínio constante de cadeia leve de imunoglobulina; CH1 é um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina CH1; VLX é um primeiro domínio variável de cadeia leve nocaute estabilizado; VHX é um primeiro domínio variável de cadeia pesada nocaute estabilizado; FC1 e FC2 são domínios Fc compreendendo uma região de dobradiça de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2 e CH3; e L1, L2, L3, L4, L5 e L6 são ligantes de aminoácidos, em que (1) o primeiro domínio VL (VLa) é emparelhado com o primeiro domínio VH (VHa) para formar um primeiro sítio de ligação a antígeno funcional que liga o antígeno alvo A; (2) o segundo domínio VL (VLb) é emparelhado com o segundo domínio VH (VHb) para formar um segundo sítio de ligação a antígeno funcional que liga o antígeno alvo B; (3) o terceiro domínio VL (VLc) é emparelhado com o terceiro domínio VH (VHc) para formar um primeiro sítio de ligação a antígeno funcional que se liga ao antígeno C alvo; (4) o polipeptídeo de fórmula III e o polipeptídeo de fórmula IV formam um par cruzado de cadeia leve-cadeia pesada (CODV); (5) o domínio VL nocaute estabilizado (VLX) é emparelhado com o domínio VH nocaute estabilizado (VHX) para formar um domínio nocaute estabilizado por dissulfeto (dsKO); em que o domínio dsKO compreende (i) uma ou mais mutações de inativação que abolem sua ligação a um antígeno alvo de uma molécula Fab de referência; e

(ii) uma ou mais ligações dissulfeto intercadeia construídas geneticamente.

[056] Em outros aspectos, algumas modalidades estão relacionadas a todas as proteínas de ligação aqui descritas, em que o domínio dsKO compreende (i) um ou mais mutações de inativação que abolem sua ligação a um antígeno alvo em relação aos domínios de tipo selvagem e (ii) uma ou mais ligações dissulfeto intercadeia construídas geneticamente que conferem estabilidade térmica aprimorada (Tm) do pseudoFab relativo a uma molécula Fab de referência, em que o Fab de referência A molécula é idêntica à molécula pseudoFab, exceto que, em uma molécula pseudoFab, os domínios CH1 e CL da molécula Fab de referência são substituídos por domínios VHX e VLX. Nessas modalidades, a ligação a um antígeno alvo é medida por métodos conhecidos na técnica, tais como, mas não se limitando a, ressonância plasmônica de superfície e a estabilidade térmica é medida por métodos conhecidos na técnica, tais como, mas não limitados a, Calorimetria de Varredura Diferencial.

[057] Em algumas modalidades, os domínios FC1 e FC2 compreendem uma ou mais mutações knob-in-hole (KIH), em que as mutações facilitam a heterodimerização do domínio Fc dos polipeptídeos.

[058] Em algumas modalidades, um de FC1 ou FC2 compreende um primeiro domínio CH3 compreendendo uma ou ambas as mutações S354C e T366W, e o outro de FC1 ou FC2 compreende um segundo domínio CH3 compreendendo uma ou ambas de mutações Y349C, T366S, L368A, e Y407V, em que as mutações facilitam a heterodimerização do domínio Fc.

[059] Em algumas modalidades, os domínios FC1 ou FC2 compreendem mutações H435R e/ou Y436F.

[060] Em algumas modalidades, pelo menos dois de Antígeno Alvo A, Antígeno Alvo B e Antígeno Alvo C são antígenos alvo diferentes.

[061] Em algumas modalidades, pelo menos um dos antígenos alvo é um ligando de um receptor de superfície celular e pelo menos um dos antígenos alvo é um receptor de superfície celular.

[062] Em algumas modalidades, os sítios de ligação a antígeno são derivados de diferentes anticorpos.

[063] Em algumas modalidades, Antígeno Alvo A, Antígeno Alvo B e Antígeno Alvo C são o mesmo antígeno alvo.

[064] Em algumas modalidades, os sítios de ligação a antígeno ligam diferentes epítopos no mesmo antígeno alvo.

[065] Em algumas modalidades, os sítios de ligação a antígeno ligam o mesmo epítopo no mesmo antígeno alvo.

[066] Em algumas modalidades, os sítios de ligação a antígeno são derivados do mesmo anticorpo.

[067] Em algumas modalidades, a temperatura de fusão (Tm) da porção pseudoFab é pelo menos 4 graus Celsius mais alta do que a molécula Fab de referência.

[068] Em algumas modalidades, a ligação dissulfeto intercadeia construída geneticamente é VH44C-VL100C.

[069] Em algumas modalidades, a ligação dissulfeto intercadeia construída geneticamente é VH105C-VL43C.

[070] Em algumas modalidades, pelo menos uma das uma ou mais mutações de inativação que abolem a ligação a antígeno alvo estão presentes no domínio VHX da porção pseudoFab.

[071] Em algumas modalidades, pelo menos uma das uma ou mais mutações de inativação que abolem a ligação a antígeno alvo estão presentes na CDRH3 do domínio VHX.

[072] Em algumas modalidades, pelo menos uma das uma ou mais mutações de inativação que abolem a ligação a antígeno alvo estão presentes na CDRH2 do domínio VHX.

[073] Em algumas modalidades, pelo menos uma das uma ou mais mutações de inativação que abolem a ligação a antígeno alvo estão presentes na CDRH1 do domínio VHX.

[074] Em algumas modalidades, pelo menos uma das uma ou mais mutações de inativação que abolem a ligação a antígeno alvo estão presentes no domínio VLX da porção pseudoFab.

[075] Em algumas modalidades, pelo menos uma de uma ou mais mutações de inativação que abolem a ligação a antígeno alvo estão presentes na CDRL3 do domínio VLX.

[076] Em algumas modalidades, pelo menos uma de uma ou mais mutações de inativação que abolem a ligação a antígeno alvo estão presentes na CDRL2 do domínio VLX.

[077] Em algumas modalidades, pelo menos uma das uma ou mais mutações de inativação que abolem a ligação a antígeno alvo estão presentes na CDRL1 do domínio VLX.

[078] Em algumas modalidades, o domínio VHX da porção pseudoFab compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Nº: 77, SEQ ID Nº: 78 e SEQ ID Nº: 79.

[079] Em algumas modalidades, o par VLX/VHX é selecionado a partir do grupo que consiste em: (i) VLX compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 76 e VHX compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 77; ii) VLX compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 76 e VHX compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 78; e iii) VLX compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 76 e VHX compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 79.

[080] Em outro aspecto, a presente divulgação fornece o uso de um domínio nocaute estabilizado para reduzir o emparelhamento incorreto de cadeia pesada - cadeia leve em uma proteína de ligação multiespecífica, em que o domínio nocaute estabilizado compreende domínios VHX e VLX compreendendo (3) uma ou mais mutações de inativação que abolem sua ligação a antígeno alvo; e (4) uma ou mais ligações dissulfeto intercadeia construídas geneticamente que conferem estabilidade térmica aprimorada (Tm) do pseudoFab relativo a uma molécula Fab de referência, em que a molécula Fab de referência é idêntica à molécula pseudoFab, exceto que, em uma molécula pseudoFab, os domínios CH1 e CL da molécula Fab de referência são substituídos por domínios VHX e VLX.

[081] Em algumas modalidades, a ligação dissulfeto intercadeia construída geneticamente é VH44C-VL100C.

[082] Em algumas modalidades, a ligação dissulfeto intercadeia construída geneticamente é VH105C-VL43C.

[083] Em algumas modalidades, o domínio VHX da porção pseudoFab compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Nº: 77, SEQ ID Nº: 78 e SEQ ID Nº: 79.

[084] Em algumas modalidades, o par VLX/VHX é selecionado a partir do grupo que consiste em: i) VLX compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 76 e VHX compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 77; ii) VLX compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 76 e VHX compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 78; e iii) VLX compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 76 e VHX compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 79.

[085] Em algumas modalidades, o pseudoFab não possui os domínios CH1 e CL.

[086] Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico isolada que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma ou mais das proteínas de ligação é fornecida. Em algumas modalidades, um kit de moléculas de ácido nucleico isoladas compreendendo uma ou mais sequências de nucleotídeos que codificam uma ou mais das proteínas de ligação é fornecido.

[087] Em algumas modalidades, um vetor de expressão que compreende a molécula de ácido nucleico é fornecido. Em algumas modalidades, um kit de vetores de expressão compreendendo o kit de moléculas de ácido nucleico é fornecido.

[088] Em algumas modalidades, uma célula hospedeira isolada compreendendo a molécula de ácido nucleico ou o vetor de expressão é fornecida. Em algumas modalidades, uma célula hospedeira isolada compreendendo o kit de moléculas de ácido nucleico ou o kit de vetores de expressão é fornecida.

[089] Em algumas modalidades, um método de produção da proteína de ligação compreendendo a cultura da célula hospedeira sob condições tais que a proteína de ligação seja expressa; e purificação da proteína de ligação da célula hospedeira.

[090] Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica que compreende um veículo farmaceuticamente aceitável e uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína de ligação multiespecífica é fornecida. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação multiespecífica para uso como um medicamento é fornecida.

[091] Em algumas modalidades, um método de tratamento de um distúrbio no qual a atividade do antígeno é prejudicial é fornecido, o método compreendendo administrar a um indivíduo em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de uma proteína de ligação multiespecífica.

[092] O resumo da invenção descrito acima não é limitante e outras características e vantagens da composição e métodos divulgados serão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada da invenção e das reivindicações.

BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS

[093] SEQ ID Nº: 1: sequência de cadeia leve variável de trastuzumab.

[094] SEQ ID Nº: 2: sequência de cadeia pesada variável de trastuzumab.

[095] SEQ ID Nº: 3: sequência de cadeia pesada variável de trastuzumab ko variante 1.

[096] SEQ ID Nº: 4: sequência de cadeia pesada variável de trastuzumab ko variante 2.

[097] SEQ ID Nº: 5: sequência de cadeia pesada variável de trastuzumab ko variante 3.

[098] SEQ ID Nº: 6: anti-IL13-VL-G4S-anti-Her2-(Trastuzumab- Q100C)-VL.

[099] SEQ ID Nº: 7: anti-IL13-VH-G4S-anti-Her2-(Trastuzumab- G44C)-VH-Fc-huIgG1.

[100] SEQ ID Nº: 8: anti-IL13-VL-(G4S)2-anti-Her2-(Trastuzumab- Q100C)-VL.

[101] SEQ ID Nº: 9: anti-IL13-VH-(G4S)2-anti-Her2-(Trastuzumab- G44C)-VH-Fc-huIgG1.

[102] SEQ ID Nº: 10: anti-IL13-VL3-IGK.

[103] SEQ ID Nº: 11: anti-IL13-VH2-IGHG1.

[104] SEQ ID Nº: 12: anti-TNFalpha-VL-G4S-anti-Her2- (Trastuzumab-Q100C)-VL.

[105] SEQ ID Nº: 13: anti-TNFalpha-VH-G4S-anti-Her2- (Trastuzumab-G44C)-VH-Fc-huIgG1.

[106] SEQ ID Nº: 14: anti-TNFalfa-VL-(G4S)2-anti-Her2- (Trastuzumab-Q100C)-VL.

[107] SEQ ID Nº: 15: anti-TNFalpha-VH-(G4S)2-anti-Her2- (Trastuzumab-G44C)-VH-Fc-huIgG1.

[108] SEQ ID Nº: 16: anti-TNFa-VL-huIGKC.

[109] SEQ ID Nº: 17: anti-TNFa-VH-huIgG1.

[110] SEQ ID Nº: 18: anti-IL6R-VL-G4S-anti-Her2-(Trastuzumab- Q100C)-VL.

[111] SEQ ID Nº: 19: anti-IL6R-VH-G4S-anti-Her2-(Trastuzumab- G44C)-VH-Fc-huIgG1.

[112] SEQ ID Nº: 20: anti-IL6R-VL-(G4S)2-anti-Her2- (Trastuzumab-Q100C)-VL

[113] SEQ ID Nº: 21: anti-IL6R-VH-(G4S)2-anti-Her2- (Trastuzumab-G44C)-VH-Fc-huIgG1.

[114] SEQ ID Nº: 22: anti-IL6R-VL-huIGKC.

[115] SEQ ID Nº: 23: anti-IL6R-VH-huIgG1.

[116] SEQ ID Nº: 24: anti-CTLA4-VL-G4S-anti-Her2- (Trastuzumab-Q100C)-VL.

[117] SEQ ID Nº: 25: anti-CTLA4-VH-G4S-anti-Her2- (Trastuzumab-G44C)-VH-Fc-huIgG1.

[118] SEQ ID Nº: 26: anti-CTLA4-VL-(G4S)2-anti-Her2- (Trastuzumab-Q100C)-VL.

[119] SEQ ID Nº: 27: anti-CTLA4-VH-(G4S)2-anti-Her2- (Trastuzumab-G44C)-VH-Fc-huIgG1.

[120] SEQ ID Nº: 28: anti-CTLA4-VL-huIGKC.

[121] SEQ ID Nº: 29: anti-CTLA4-VH –huIgG1.

[122] SEQ ID Nº: 30: anti-PD1-VL-G4S-anti-Her2-(Trastuzumab- Q100C)-VL.

[123] SEQ ID Nº: 31: anti-PD1-VH-G4S-anti-Her2-(Trastuzumab- G44C)-VH-Fc-huIgG1.

[124] SEQ ID Nº: 32: anti-PD1-VL-(G4S)2-anti-Her2- (Trastuzumab-Q100C)-VL.

[125] SEQ ID Nº: 33: anti-PD1-VH-(G4S)2-anti-Her2- (Trastuzumab-G44C)-VH-Fc-huIgG1.

[126] SEQ ID Nº: 34: anti-huPD-1-VL-huIGKC.

[127] SEQ ID Nº: 35: anti-huPD-1-VH-huIgG1.

[128] SEQ ID Nº: 36: anti-IL4-VL-G4S-anti-Her2-(Trastuzumab- Q100C)-VL.

[129] SEQ ID Nº: 37: anti-IL4-VH-G4S-anti-Her2-(Trastuzumab- G44C)-VH-Fc-huIgG1.

[130] SEQ ID Nº: 38: anti-IL4-VL-(G4S)2-anti-Her2-(Trastuzumab- Q100C)-VL.

[131] SEQ ID Nº: 39: anti-IL4-VH-(G4S)2-anti-Her2-(Trastuzumab- G44C)-VH-Fc-huIgG1.

[132] SEQ ID Nº: 40: anti-IL4-VL1-IGKC.

[133] SEQ ID Nº: 41: anti-IL4-VH1-IgG1.

[134] SEQ ID Nº: 42: anti-PD1-VL-(G4S)2-anti-Her2- (Trastuzumab-Q100C)-VL.

[135] SEQ ID Nº: 43: anti-PD1-VH-(G4S)2-anti-Her2- (Trastuzumab-G44C-Var2)-VH-Fc-huIgG1.

[136] SEQ ID Nº: 44: anti-CTLA4-VL-(G4S)2-anti-Her2- (Trastuzumab-Q100C)-VL.

[137] SEQ ID Nº: 45: anti-CTLA4-VH-(G4S)2-anti-Her2- (Trastuzumab-G44C-Var2)-VH-Fc-huIgG1.

[138] SEQ ID Nº: 46: anti-IL4-VL-(G4S)2-anti-Her2-(Trastuzumab- Q100C)-VL.

[139] SEQ ID Nº: 47: anti-IL4-VH-(G4S)2-anti-Her2-(Trastuzumab- G44C-Var2)-VH-Fc-huIgG1.

[140] SEQ ID Nº: 48: anti-IL13-VL-(G4S)2-anti-Her2- (Trastuzumab-Q100C)-VL.

[141] SEQ ID Nº: 49: anti-IL13-VH-(G4S)2-anti-Her2- (Trastuzumab-G44C-Var2)-VH-DKTHT-His6.

[142] SEQ ID Nº: 50: anti-IL13-VL-(G4S)2-anti-Her2- (Trastuzumab-Q100C)-VL.

[143] SEQ ID Nº: 51: anti-IL13-VH-(G4S)2-anti-Her2- (Trastuzumab-VH_Var1-G44C)-VH-Fc-huIgG1.

[144] SEQ ID Nº: 52: anti-IL4-VL-(G4S)2-anti-Her2-(Trastuzumab- Q100C)-VL.

[145] SEQ ID Nº: 53: anti-IL4-VH-(G4S)2-anti-Her2-(Trastuzumab- G44C-Var2)-VH-Fc-huIgG1 (knob).

[146] SEQ ID Nº: 54: anti-PD1-huIGKC.

[147] SEQ ID Nº: 55: anti-PD1-VH-huIgG1 (hole-RF).

[148] SEQ ID Nº: 56: anti-IL13-VL-(G4S)2-anti-Her2- (Trastuzumab-Q100C)-VL.

[149] SEQ ID Nº: 57: anti-IL13-VH-(G4S)2-anti-Her2- (Trastuzumab-G44C-Var2)-VH-Fc-huIgG1 (knob).

[150] SEQ ID Nº: 58: anti-PD1-VL-huIGKC.

[151] SEQ ID Nº: 59: anti-PD1-VH-huIgG1 (hole-RF).

[152] SEQ ID Nº: 60: anti-PD1-VL-(G4S)2-anti-Her2- (Trastuzumab-Q100C)-VL.

[153] SEQ ID Nº: 61: anti-PD1-VH-(G4S)2-anti-Her2- (Trastuzumab-G44C-Var2)-VH-Fc-huIgG1 (knob).

[154] SEQ ID Nº: 62: anti-IL13-VL huIGKC.

[155] SEQ ID Nº: 63: anti-IL13-VH-huIgG1 (hole-RF).

[156] SEQ ID Nº: 64: anti-CTLA4-VL-(G4S)2-anti-Her2- (Trastuzumab-Q100C)-VL.

[157] SEQ ID Nº: 65: anti-CTLA4-VH-(G4S)2-anti-Her2- (Trastuzumab-G44C-Var2)-VH-Fc-huIgG1 (knob).

[158] SEQ ID Nº: 66: anti-PD1-VL-huIGKC.

[159] SEQ ID Nº: 67: anti-PD1-VH-huIgG1 (hole-RF).

[160] SEQ ID Nº: 68: anti-IL4-VL-(G4S)2-anti-Her2-(Trastuzumab- Q100C)-VL.

[161] SEQ ID Nº: 69: anti-IL4-VH-(G4S)2-anti-Her2-(Trastuzumab- G44C-Var2)-VH-Fc-huIgG1 (knob).

[162] SEQ ID Nº: 70: anti-IL13-VL huIGKC.

[163] SEQ ID Nº: 71: anti-IL13-VH-huIgG1 (hole-RF).

[164] SEQ ID Nº: 72: anti-PD1-VL-(G4S)2-anti-Her2-(Trastuzumab- Q100C)-VL.

[165] SEQ ID Nº: 73: anti-PD1-VH-(G4S)2-anti-Her2- (Trastuzumab-G44C-Var2)-VH-Fc-huIgG1 (knob).

[166] SEQ ID Nº: 74: anti-PD1-VL-huIGKC.

[167] SEQ ID Nº: 75: anti-PD1-VH-huIgG1 (hole-RF).

[168] SEQ ID Nº: 76: sequência de cadeia leve variável de ds ko trastuzumab.

[169] SEQ ID Nº: 77: sequência de cadeia pesada variável de ds ko trastuzumab variante 1.

[170] SEQ ID Nº: 78: sequência de cadeia pesada variável de ds ko trastuzumab variante 2.

[171] SEQ ID Nº: 79: sequência de cadeia pesada variável de ds ko trastuzumab variante 3.

[172] SEQ ID Nº: 80: tipo selvagem anti-TCR α/β x anti-CD123

[173] SEQ ID Nº: 81: anti-TCR α/β x anti-CD123 - dsTrasKO2

[174] SEQ ID Nº: 82: anti-TCR α/β - dsTrasKO2 x anti-CD123

[175] SEQ ID Nº: 83: tipo selvagem anti-CD3ε x anti-CD123

[176] SEQ ID Nº: 84: anti-CD3ε x anti-CD123-dsTrasKO2

[177] SEQ ID Nº: 85: anti-CD3ε-dsTrasKO2 x anti-CD123

[178] SEQ ID Nº: 86: tipo selvagem anti-CD3ε x anti-CD123

[179] SEQ ID Nº: 87: anti-CD3ε x anti-CD123-dsTrasKO2

[180] SEQ ID Nº: 88: anti-CD3ε-dsTrasKO2 x anti-CD123

[181] SEQ ID Nº: 89: controle negativo anti-TCR α/β x anti-TNP - Tipo Selvagem

[182] SEQ ID Nº: 90: controle negativo anti-TCR α/β x anti-TNP- dsTrasKO2

[183] SEQ ID Nº: 91: controle negativo anti-TCR α/β-dsTrasKO2 x anti-TNP

[184] SEQ ID Nº: 92: controle negativo anti-TNP x anti-CD123 - Tipo Selvagem

[185] SEQ ID Nº: 93: controle negativo anti-TNP x anti-CD123- dsTrasKO2

[186] SEQ ID Nº: 94: controle negativo anti-TNP-dsTrasKO2 x anti- CD123

[187] SEQ ID Nº: 95: controle negativo anti-CD3ε x anti-TNP - Tipo Selvagem

[188] SEQ ID Nº: 96: controle negativo anti-CD3ε x anti-TNP- dsTrasKO2

[189] SEQ ID Nº: 97: controle negativo anti-CD3ε-dsTrasKO2 x anti-TNP

[190] SEQ ID Nº: 98: controle negativo anti-CD3ε x anti-TNP - Tipo Selvagem

[191] SEQ ID Nº: 99: controle negativo anti-CD3ε x anti-TNP- dsTrasKO2

[192] SEQ ID Nº: 100: controle negativo anti-CD3ε-dsTrasKO2 x anti-TNP

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[193] O acima e outras características e vantagens da presente invenção serão mais completamente compreendidas a partir da seguinte descrição detalhada de modalidades ilustrativas tomadas em conjunto com os desenhos anexos. O arquivo de patente ou pedido contém pelo menos um desenho executado em cores. Cópias desta publicação de patente ou pedido de patente com desenho(s) colorido(s)

serão fornecidas pelo Instituto mediante solicitação e pagamento da taxa necessária.

[194] Figura 1A - Figura 1B representa esquematicamente moléculas em tandem biespecíficas diméricas compreendendo fragmentos pseudoFab com substituição de um par CH1/CL por um domínio Nocaute estabilizado por dissulfeto (dsKO). Uma molécula Tandem-(Fv-Fab x Fv-pseudoFab) está representada na Figura 1A, e uma molécula Tandem-(Fv-pseudoFab x Fv-Fab) é representada na Figura 1B.

[195] Figura 2 representa esquematicamente uma molécula de IgG biespecífica dimérica exemplar ((Fv-pseudoFab) x (Fv-Fab)-Fc)). Um domínio nocaute estabilizado por dissulfeto (dsKO) substitui os domínios CH/CL de um braço Fab da molécula de IgG. Ligantes peptídicos (por exemplo, G4S ou (G4S)2) ligam um primeiro sítio de ligação a antígeno (Fv) ao domínio dsKO para formar uma porção pseudoFab que liga o antígeno Alvo A. Um domínio de heterodimerização Fc com knob-into-hole (KIH) ou mutações de RF ligam a porção pseudoFab com um segundo braço de ligação de Fab que se liga ao antígeno alvo B.

[196] Figura 3A - Figura 3C representam esquematicamente a fração monomérica de um construto de anticorpo compreendendo substituição de Trastuzumab WT VH/VL de CH1/CL (Figura 3A) em comparação com um construto de anticorpo compreendendo substituição de VH/VL de Trastuzumab knouck estabilizado por dissulfeto ("dsTrastKO") de CH1/CL (Figura 3B), bem como a termoestabilidade de ambos os construtos (FIGURA 3C).

[197] Figura 4 representa esquematicamente a estrutura PDB 1N8Z de trastuzumab que se liga a HER2. A localização das quatro mutações de inativação que abolem a ligação a HER2 (R50, R59, Y33 e Y103) são anotadas.

[198] Figura 5A - Figura 5B representam graficamente os resultados de experimentos de ligação demonstrando que as variantes 1-3 de dsTrastuKO não se ligam mais a HER2.

[199] Figura 6A - Figura 6B representam os construtos pseudoIgG e pseudoFab usados como certos controles em experimentos.

[200] Figura 7A - Figura 7D representam um formato biespecífico representativo e resultados de purificação de acordo com certas modalidades exemplares. Figura 7A mostra o arranjo dos domínios individuais dentro da estrutura de IgG. Fv1 (anti-IL4) é fundido a VL/VH de dsTrasKO2 via ligante (G4S)2. Fv2 (anti-IL13) retém a configuração do tipo selvagem. Figura 7B mostra a forma reduzida (uma cadeia leve e uma pesada) e oxidada do anticorpo usando 4-12% Bis/Tris MOPS em eletroforese em gel de dodecilsulfato de sódio poliacrilamida (SDS- PAGE). A pureza do produto é mostrada na Figura 7C usando cromatografia de exclusão de tamanho analítica. A integridade da molécula foi verificada por análise de massa intacta usando Q-TOF de definição ultra-alta (UHD) da Agilent 6540 equipado com uma interface Jet Stream ESI dupla e um Sistema LC Infinity Agilent 1290/1260 (Figura 7D).

[201] Figura 8 mostra resultados de cromatografia de interação hidrofóbica analítica (HIC) indicando que os construtos biespecíficos dsTrasKO2 foram emparelhados corretamente e não continham espécies inesperadas.

[202] Figura 9 representa esquematicamente a estrutura cristalina de um construto Pseudo-Fab IL13-dsTrasKO2 tendo a ultraestrutura da Figura 6A. A estrutura foi resolvida em 3,75Å. A estrutura mostra a sobreposição dos domínios IL13-VH/VL de TrasKO2-IL13 pseudo-Fab (cinza claro) e Fab anti-IL13 (cinza escuro).

[203] Figura 10A - 10B representam esquematicamente moléculas em tandem biespecíficas diméricas compreendendo fragmentos pseudoFab com substituição de um par CH1/CL com um domínio nocaute estabilizado por dissulfeto (dsKO). A molécula em tandem-(Fv- Fab x Fv-pseudoFab)-IgG está representada na Figura 10A, e uma molécula em Tandem-(Fv-pseudoFab x Fv-Fab)-IgG está representada na Figura 10B.

[204] Figura 11A - 11B representam esquematicamente moléculas em tandem biespecíficas diméricas compreendendo fragmentos pseudoFab com substituição de um par CH1/CL com um domínio nocaute estabilizado por dissulfeto (dsKO). A molécula (((Fv- pseudoFab) [HC] -(Fv-pseudoFab)) x ((Fv-Fab)[HC]-(Fv-Fab)))-Fc está representada na Figura 11A com um domínio de heterodimerização Fc com knob-into-hole (KIH) e mutações de RF, e na Figura 11B com mutações de RF apenas.

[205] Figura 12A - Figura 12D representa um projeto de IgG biespecífico representativo em que um primeiro pseudoFab compreendendo um domínio Fv1 (tendo especificidade de ligação para um primeiro Antígeno Alvo A, isto é, GITR) e um domínio dsTrasKO é anexado a cada domínio Fv2 (tendo especificidade de ligação a um segundo antígeno Alvo B, isto é, Ox40) de um anticorpo IgG convencional (Pogalizumab). Figura 12A mostra o arranjo dos domínios individuais dentro do arcabouço de IgG. Fv1 (anti-GITR) é fundido a VL/VH de dsTrasKO2 via ligante (G4S)2. Fv2 (anti-Ox40) retém a configuração do tipo selvagem. Fv1-dsTrasKO2 é fundido a Fv2- Ck/CH1 via ligante (G4S)2. Figura 12B mostra a forma reduzida (duas cadeias leves e uma pesada) e oxidada do anticorpo usando eletroforese em gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sódio a 4- 12% Bis/Tris MOPS (SDS-PAGE). A pureza do produto é mostrada na Figura 12C usando cromatografia analítica por exclusão de tamanho. A integridade da molécula foi verificada por análise de massa intacta usando Q-TOF de definiçãoultra-alta (UHD) da Agilent equipado com uma interface Jet Stream ESI dupla e um Sistema LC Infinity Agilent 1290/1260 (FIGURA 12D).

[206] Figura 13A - Figura 13D representam um projeto de CODV IgG trispecífico representativo em que um primeiro pseudoFab compreendendo um domínio Fv3 (tendo especificidade de ligação para um primeiro Antígeno Alvo A, isto é, CD137) e um domínio dsTrasKO é emparelhado com um braço CODV (tendo uma especificidade de ligação (Fv1) para um segundo antígeno alvo B, isto é, Ox40 e uma especificidade de ligação (Fv2) para um terceiro Antígeno alvo C, isto é, PD1). Figura 13A mostra o arranjo dos domínios individuais dentro do arcabouço CODV IgG. Fv1 (anti-Ox40) e Fv2 (anti-PD1) no braço CODV são fundidos com domínios lambda e CH1 de tipo selvagem. Fv3 (anti- CD137) no braço Fab é fundido a VL/VH de dsTrasKO2 via ligante (G4S)2. Figura 13B mostra a forma reduzida (duas cadeias leves e duas pesadas) e oxidada do anticorpo CODV usando eletroforese em gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sódio a 4-12% Bis/Tris MOPS (SDS- PAGE). A pureza do produto é mostrada na Figura 13C usando cromatografia analítica por exclusão de tamanho. A integridade da molécula foi verificada por análise de massa intacta usando Q-TOF de definição ultra-alta (UHD) da Agilent 6540 equipado com uma interface Jet Stream ESI dupla e um Sistema LC Infinity da Agilent 1290/1260 (Figura 13D).

[207] Figura 14 representa um esquema de um processo de purificação de duas etapas usado para garantir o emparelhamento correto da cadeia leve com moléculas biespecíficas nocaute dsTrasKO2.

[208] Figura 15A - Figura 15B representam ensaios de citotoxicidade de células panT humanas contra células alvo THP-1 coincubadas com anticorpos biespecíficos anti-CD3ε x anti-CD123. Figura 15A corresponde a anticorpos biespecíficos com os números de

ID 33, 34 e 35 com controles negativos 45 e 46. Figura 15B corresponde a anticorpos biespecíficos com os números de ID 36, 37 e 38 com controles negativos 47 e 48. Células T efetoras e células alvo THP-1 marcadas com CFSE foram semeadas em uma proporção de efetor para alvo de 10:1 e coincubadas com diluições em série das respectivas moléculas biespecíficas (10 nM - 0 nM) durante 20 horas a 37°C. As células mortas foram coradas com 7-AAD e medidas por citometria de fluxo. A atividade citotóxica foi calculada com base na porcentagem de células alvo THP-1 mortas (7-AAD/CFSE duplo positivo). Os dados mostram células alvo mortas [%] contra a concentração de moléculas biespecíficas [pM] como média de dois doadores saudáveis representativos.

DESCRIÇÃO DETALHADA I. DEFINIÇÕES

[209] Para que a divulgação possa ser mais facilmente compreendida, os termos selecionados são definidos abaixo.

[210] Conforme usado neste documento, os vinte aminoácidos convencionais e suas abreviaturas seguem o uso convencional. Estereoisômeros (por exemplo, D-aminoácidos) dos vinte aminoácidos convencionais; aminoácidos não naturais, tais como aminoácidos a- dissubstituídos, aminoácidos de N-alquil, ácido láctico e outros aminoácidos não convencionais, também podem ser componentes adequados para as cadeias polipeptídicas das proteínas de ligação da invenção. Exemplos de aminoácidos não convencionais incluem: 4- hidroxiprolina, y-carboxiglutamato, c-N,N,N-trimetilisina, c-N-acetilisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5- hidroxilisina, u-N-metilarginina e outros aminoácidos e iminoácidos semelhantes (por exemplo, 4-hidroxiprolina). Na notação polipeptídica aqui utilizada, a direção da mão esquerda é a direção do terminal amino e a direção da mão direita é a direção do terminal carboxila, de acordo com o uso e convenção padrão. Os resíduos de ocorrência natural podem ser divididos em classes com base nas propriedades comuns da cadeia lateral (vide Tabela 1). Propriedades de Grupo lateral Aminoácido Carga/Hidrofobicidade hidrofóbico não polar alifático Ala, Ile, Leu, Val alifático, contendo S- Met aromático Phe, Trp imino Pro polar não carregado alifático Gly amida Asn, Gln aromático Tyr hidroxila Ser, Thr sulfidrila Cys positivamente carregado básico Arg, His, Lys negativamente carregado ácido Asp, Glu

[211] As substituições conservadoras de aminoácidos podem envolver a troca de um membro de uma dessas classes por outro membro da mesma classe. As substituições conservadoras de aminoácidos podem abranger resíduos de aminoácidos de ocorrência não natural, que são tipicamente incorporados por síntese química de peptídeos em vez de por síntese em sistemas biológicos. Estes incluem peptidomiméticos e outras formas reversas ou invertidas de resíduos de aminoácidos. As substituições não conservadoras podem envolver a troca de um membro de uma dessas classes por um membro de outra classe.

[212] Conforme usado neste documento, o termo "mutação" ou "mutado" refere-se a uma alteração da sequência de aminoácidos por deleção, inserção e/ou substituição de um ou mais aminoácidos. Uma mutação é introduzida em relação a uma determinada sequência, por exemplo, a sequência de aminoácidos de um par VL1 e/ou VH1 que especificamente reconhece o epítopo 1. O termo "não mutado" refere- se a qualquer sequência de aminoácidos exibindo propriedades funcionais, por exemplo, qualquer sequência que ainda exiba propriedades de ligação. Isto é ilustrado como segue: Um VH1/VL1 é mutado de tal forma que não se liga especificamente a um epítopo. A forma não mutada deste VH1/VL1 ainda se liga especificamente ao epítopo 1. Cada domínio VH/VL de um anticorpo que se liga a qualquer epítopo é, portanto, adequado para ser mutado para servir como uma proteína arcabouço da invenção.

[213] Tal como aqui utilizado, o termo "variante" refere-se a uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ao aminoácido a partir do qual é derivada, por exemplo, SEQ ID Nº: 1 ou SEQ ID Nº: 2. A determinação da percentagem de identidade entre duas sequências é realizada usando o algoritmo matemático de Karlin e Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5873-5877, 1993. Esse algoritmo é incorporado nos programas BLASTN e BLASTP de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215, 403-410. Para obter alinhamentos com lacunas para fins comparativos, Gapped BLAST é utilizado conforme descrito em Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402. Ao utilizar os programas BLAST e Gapped BLAST, os parâmetros padrão dos respectivos programas são usados. Alternativamente, uma variante também pode ser definida como tendo até 20, 15, 10, 5, 4, 3, duas ou uma substituições de aminoácidos, em particular substituições de aminoácidos conservadoras. As substituições conservadoras são bem conhecidas na técnica (vide, por exemplo, Creighton (1984) Proteins. W.H. Freeman e Companhia). Uma visão geral das propriedades físicas e químicas dos aminoácidos é fornecida na Tabela 1 acima. Em uma modalidade particular, as substituições conservadoras são substituições feitas com aminoácidos tendo pelo menos uma propriedade de acordo com a

Tabela 1 em comum (isto é, da coluna 1 e/ou 2). O termo "variante" também inclui fragmentos. Um fragmento possui uma deleção N- terminal e/ou C-terminal de até 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 ou 1 aminoácido(s) no total. Além ou alternativamente, a variante pode ser modificada, por exemplo, por adições de aminoácidos N-terminal e/ou C-terminal de até 50, 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2 ou 1 amino ácido (s) no total.

[214] Tal como aqui utilizado, o termo "proteína de ligação" ou "polipeptídeo de ligação" refere-se a um polipeptídeo (por exemplo, um anticorpo ou fragmento do mesmo) que contém pelo menos um sítio de ligação que é responsável pela ligação seletiva a um antígeno alvo de interesse (por exemplo, um antígeno humano). Os sítios de ligação exemplares incluem, mas não estão limitados a, um domínio variável de anticorpo, um sítio de ligação ao ligando de um receptor ou um sítio de ligação ao receptor de um ligando. Em certos aspectos, os polipeptídeos de ligação compreendem múltiplos (por exemplo, dois, três, quatro ou mais) sítios de ligação. Em certos aspectos, a proteína de ligação não é uma enzima terapêutica.

[215] Conforme usado neste documento, o termo "Her2" ou "HER2" refere-se ao receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano, que é um membro da família do receptor do fator de crescimento epidérmico.

[216] Tal como aqui utilizado, o termo "proteína de ligação" refere- se a uma molécula de ocorrência não natural ou recombinante ou modificada capaz de se ligar especificamente a pelo menos um antígeno. Em uma modalidade particular, uma proteína de ligação compreende pelo menos um par VH/VL que se liga especificamente a um antígeno.

[217] A produção de uma proteína de ligação biespecífica por coexpressão das duas cadeias leves e duas pesadas em uma única célula hospedeira pode ser altamente desafiadora devido ao baixo rendimento da proteína de ligação biespecífica desejada e à dificuldade em remover proteínas de ligação mal pareadas intimamente relacionadas contaminantes (Suresh et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA83, 7989-7993, 1986). Isso ocorre porque as cadeias pesadas formam homodímeros, bem como os heterodímeros desejados, aqui referidos como o "problema de pareamento de cadeia pesada". Além disso, as cadeias leves podem parear incorretamente com cadeias pesadas não cognatas, aqui referidas como o "problema de pareamento de cadeia leve". Consequentemente, a coexpressão de dois anticorpos pode dar origem a até nove espécies indesejadas além das proteínas de ligação biespecíficas desejadas.

[218] Tal como aqui utilizado, um "domínio de heterodimerização" refere-se a uma subunidade de uma proteína de ligação bi ou multiespecífica que facilita, direciona ou força a montagem correta de cadeias leves e suas cadeias pesadas cognatas para resultar na proteína desejada enquanto prevenir o emparelhamento incorreto das respectivas cadeias leves ou pesadas.

[219] Conforme usado neste documento, o termo "Fc de heterodimerização" ou "fragmento funcional de um Fc de heterodimerização refere-se a uma forma mutante do domínio constante, por exemplo, o CH2-CH3 ou CH2-CH3-CH4, que é mutado em relação a uma parte Fc de ocorrência natural em que não forma mais homodímeros, mas forma um heterodímero com uma parte Fc mutada correspondentemente. Assim, o termo se refere a uma parte das duas cadeias que formam um heterodímero. Vários desses pares são conhecidos na técnica e compreendem, por exemplo, uma variante de knob-into-hole (KIH) ou uma variante EV-RWT.

[220] Ridgeway e cooperadores geraram uma interface CH3 favorecendo a montagem heterodimérica, substituindo pequenas cadeias laterais em uma interface CH3 por outras maiores para criar um knob e substituindo grandes cadeias laterais no outro domínio CH3 por menores para gerar um hole. O teste de tais variantes demonstrou uma heterodimerização preferencial. Estas mutações knobs-into-holes originais foram ainda estendidas para identificar outras combinações adequadas por exibição de fago que foram usadas para gerar anticorpos IgG biespecíficos testando substituições adicionais permitindo a formação de ligações dissulfeto. As variantes knobs-in- hole são descritas adicionalmente na Patente U.S. Nº. 5.732.168 e Patente U.S. Nº. 8.216.805, que são aqui incorporadas por referência. Por conseguinte, em uma modalidade, o domínio CH3 de um domínio FC ou domínio de heterodimerização contém as mutações Y349C, T366S, L368A e Y407V, e o domínio CH3 de outro domínio FC ou domínio de heterodimerização contém as mutações S354C e T366W (sendo a posição do aminoácido indicado por referência a uma sequência IgG1).

[221] Conforme usado neste documento, o termo "domínio de homodimerização" refere-se a um domínio que medeia a homodimerização de dois domínios semelhantes, por exemplo, duas cadeias pesadas. O emparelhamento da cadeia pesada é mediado pelo último domínio da região constante, isto é, CH3 em moléculas de IgG, que forma complexos de homodímero de alta afinidade (KD ~ 10 pM). Outras interações residem na região de dobradiça responsável pela ligação covalente de duas cadeias pesadas, que se formam após a montagem da cadeia pesada. A interação em um homodímero CH3 envolve aproximadamente 16 resíduos na interface CH3-CH3 como mostrado para CH3 γ1 humano com adesivo formado por 6 resíduos (T366, L368, F405, Y407 e K409) no centro da interface contribuindo fortemente para a estabilidade. Os domínios de homodimerização incluem, mas não estão limitados a, regiões Fc e variantes modificadas efetoras das mesmas e fragmentos de qualquer um, domínios CH2 ou fragmentos dos mesmos, domínios CH3 ou fragmentos dos mesmos, domínios ou fragmentos CH4 ou semelhantes.

[222] Anticorpos de ocorrência natural tipicamente compreendem um tetrâmero. Cada um desses tetrâmeros é tipicamente composto por dois pares idênticos de cadeias polipeptídicas, cada par tendo uma cadeia "leve" de comprimento total (tipicamente tendo um peso molecular de cerca de 25 KDa) e uma cadeia "pesada" de comprimento total (tipicamente tendo uma cadeia molecular peso de cerca de 50-70 KDa). Os termos "cadeia pesada" e "cadeia leve", tal como aqui utilizados, referem-se a qualquer polipeptídeo de imunoglobulina com sequência de domínio variável suficiente para conferir especificidade para um antígeno alvo. A porção amino terminal de cada cadeia leve e pesada inclui tipicamente um domínio variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos que normalmente é responsável pelo reconhecimento do antígeno. A porção terminal carbóxi de cada cadeia normalmente define um domínio constante responsável pela função efetora. Assim, em um anticorpo de ocorrência natural, um polipeptídeo de imunoglobulina IgG de cadeia pesada de comprimento completo inclui um domínio variável (VH) e três domínios constantes (CH1, CH2 e CH3), em que o domínio VH está no terminal amino do polipeptídeo e o domínio CH3 está no terminal carboxila, e um polipeptídeo de imunoglobulina de cadeia leve de comprimento completo inclui um domínio variável (VL) e um domínio constante (CL), em que o domínio VL está no terminal amino do polipeptídeo e o domínio CL está no terminal carboxila.

[223] As cadeias leves humanas são normalmente classificadas como cadeias leves kappa e lambda, e as cadeias pesadas humanas são normalmente classificadas como mu, delta, gama, alfa ou épsilon e definem o isótipo do anticorpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. IgG tem várias subclasses, incluindo, mas não se limitando a, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. IgM tem subclasses incluindo, mas não se limitando a, IgM1 e IgM2. IgA é subdividido de forma semelhante em subclasses, incluindo, mas não se limitando a, IgA1 e IgA2. Dentro das cadeias leves e pesadas de comprimento total, os domínios variável e constante normalmente são unidos por uma região "J" de cerca de 12 ou mais aminoácidos, com a cadeia pesada também incluindo uma região "D" de cerca de 10 mais aminoácidos. Vide, por exemplo, Fundamental Immunology (Paul, W., ed., Raven Press, 2ª ed., 1989), que é incorporado por referência em sua totalidade para todos os fins. As regiões variáveis de cada par de cadeia leve/pesada normalmente formam um sítio de ligação a antígeno. Os domínios variáveis de anticorpos de ocorrência natural exibem tipicamente a mesma estrutura geral de regiões estruturais relativamente conservadas (FR) unidas por três regiões hipervariáveis, também chamadas de regiões determinantes de complementaridade ou CDRs. As CDRs das duas cadeias de cada par são tipicamente alinhadas pelas regiões estruturais, o que pode permitir a ligação a um epítopo específico. Do terminal amino ao terminal carboxil, os domínios variáveis de cadeia leve e pesada compreendem tipicamente os domínios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4.

[224] Conforme usado neste documento, o termo "conjuntos de CDRs" refere-se a um grupo de três CDRs que ocorrem em uma única região variável capaz de se ligar o antígeno. Os limites exatos dessas CDRs foram definidos de forma diferente de acordo com os diferentes sistemas. O sistema descrito por Kabat (Kabat et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST (National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987) e (1991)) não apenas fornece um sistema de numeração de resíduo inequívoco aplicável a qualquer região variável de um anticorpo, mas também fornece limites de resíduos precisos que definem os três CDRs. Essas CDRs podem ser referidas como CDRs de Kabat.

Chothia e cooperadores (Chothia e Lesk, 1987, J.

Affol.

Biol. 196: 901-17; Chothia et al., 1989, Nature 342: 877-83) descobriram que certas subporções dentro de CDRs de Kabat adotam conformações de esqueleto peptídico quase idênticas, apesar de terem grande diversidade no nível da sequência de aminoácidos.

Essas subporções foram designadas como L1, L2 e L3 ou H1, H2 e H3, onde o "L" e o "H" designam as regiões da cadeia leve e da cadeia pesada, respectivamente.

Essas regiões podem ser referidas como CDRs de Chothia, que têm limites que se sobrepõem às CDRs de Kabat.

Outros limites definem CDRs sobrepostos à CDR de Kabat foram descritos por Padlan, 1995, FASEB J. 9: 13339; MacCallum, 1996, J.

Mol.

Biol. 262 (5): 732-45; e Lefranc, 2003, Dev.

Comp.

Immunol. 27: 55-77. Ainda outras definições de limite de CDR podem não seguir estritamente um dos sistemas aqui, mas, no entanto, se sobreporão às CDRs de Kabat, embora possam ser encurtadas ou alongadas à luz da previsão ou descobertas experimentais que resíduos particulares ou grupos de resíduos ou mesmo CDRs inteiras não impactam significativamente na ligação a antígeno.

Os métodos usados neste documento podem utilizar CDRs definidas de acordo com qualquer um desses sistemas, embora certas modalidades usem CDRs definidas por Kabat ou Chothia.

A identificação de CDRs previstas usando a sequência de aminoácidos é bem conhecida no campo, como em Martin, A.C. "Protein sequence and structure analysis of anticorpo variable domains", em Antibody Engineering, Vol. 2. Kontermann R., Dikel S., eds.

Springer-Verlag, Berlin, p. 33-51 (2010). A sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia pesada e/ou leve também pode ser inspecionada para identificar as sequências das CDRs por outros métodos convencionais, por exemplo, por comparação com sequências de aminoácidos conhecidas de outras regiões variáveis de cadeia pesada e leve para determinar as regiões de hipervariabilidade de sequência. As sequências numeradas podem ser alinhadas a olho nu ou usando um programa de alinhamento, tal como um do conjunto de programas CLUSTAL, conforme descrito em Thompson, 1994, Nucleic Acids Res. 22: 4673-80. Modelos moleculares são convencionalmente usados para delinear corretamente as regiões de estrutura e CDR e, assim, corrigir as atribuições baseadas em sequência.

[225] Em algumas modalidades, a definição de CDR/FR em uma cadeia leve ou pesada de imunoglobulina deve ser determinada com base na definição de IMGT (Lefranc et al. Dev. Comp. Immunol., 2003, 27 (1): 55-77; www.imgt.org).

[226] O termo "Fc", tal como aqui utilizado, refere-se a uma molécula que compreende a sequência de um não fragmento de ligação a antígeno resultante da digestão de um anticorpo ou produzido por outros meios, seja na forma monomérica ou multimérica, e pode conter a região da dobradiça. A fonte de imunoglobulina original do Fc nativo é tipicamente de origem humana e pode ser qualquer uma das imunoglobulinas, embora IgG1 e IgG2 sejam usados em modalidades exemplares. As moléculas Fc são constituídas por polipeptídeos monoméricos que podem ser ligados em formas diméricas ou multiméricas por associação covalente (isto é, ligações dissulfeto) e não covalente. O número de ligações dissulfeto intermoleculares entre subunidades monoméricas de moléculas Fc nativas varia de 1 a 4, dependendo da classe (por exemplo, IgG, IgA e IgE) ou subclasse (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgA1 e IgGA2). Um exemplo de um Fc é um dímero com ligação dissulfeto resultante da digestão com papaína de um IgG. O termo "Fc nativo", tal como aqui utilizado, é genérico para as formas monomérica, dimérica e multimérica.

[227] Um fragmento F(ab) inclui tipicamente uma cadeia leve e os domínios VH e CH1 de uma cadeia pesada, em que a porção da cadeia pesada VH-CH1 do fragmento F(ab) não pode formar uma ligação dissulfeto com outro polipeptídeo de cadeia pesada. Tal como aqui utilizado, um fragmento F(ab) também pode incluir uma cadeia leve contendo dois domínios variáveis separados por um ligante de aminoácido e uma cadeia pesada contendo dois domínios variáveis separados por um ligante de aminoácido e um domínio CH1.

[228] O fragmento AF(ab') inclui tipicamente uma cadeia leve e uma porção de uma cadeia pesada que contém mais da região constante (entre os domínios CH1 e CH2), de modo que uma ligação dissulfeto intercadeia pode ser formada entre duas cadeias pesadas para formar uma molécula F(ab')2.

[229] Conforme usado neste documento, o termo "Tm" se refere à temperatura de fusão de uma proteína de ligação, uma proteína de ligação a antígeno, um anticorpo e é um parâmetro crítico para a estabilidade térmica das proteínas de ligação a antígeno. A Tm comumente se refere à estabilidade térmica do fragmento Fv, isto é, uma cadeia leve e pesada de região variável (VH/VL). A Tm pode ser medida por calorimetria de varredura diferencial (DSC).

[230] Uma modalidade da divulgação fornece proteínas de ligação com especificidade biológica e imunológica para entre um e três antígenos alvo. Outra modalidade da divulgação fornece moléculas de ácido nucleico compreendendo sequências de nucleotídeos que codifi- cam cadeias polipeptídicas que formam tais proteínas de ligação. Outra modalidade da divulgação fornece vetores de expressão compreen- dendo moléculas de ácido nucleico compreendendo sequências de nucleotídeos que codificam cadeias polipeptídicas que formam tais proteínas de ligação. Ainda outra modalidade da divulgação fornece células hospedeiras que expressam tais proteínas de ligação (isto é, compreendendo moléculas de ácido nucleico ou vetores que codificam cadeias polipeptídicas que formam tais proteínas de ligação).

[231] O termo "antígeno" ou "antígeno alvo" ou "alvo de antígeno", tal como aqui utilizado, refere-se a uma molécula ou porção de uma molécula (por exemplo, um epítopo) que é capaz de ser ligada por uma proteína de ligação, e adicionalmente é capaz de ser usada em um animal para produzir anticorpos capazes de se ligarem a um epítopo desse antígeno. Um antígeno alvo pode ter um ou mais epítopos. No que diz respeito a cada antígeno alvo reconhecido por uma proteína de ligação, a proteína de ligação é capaz de competir com um anticorpo intacto que reconhece o antígeno alvo.

[232] Tal como aqui utilizado, o termo "epítopo" ou "epítopo alvo" ou "epítopo alvo" refere-se a qualquer determinante, por exemplo, um determinante polipeptídico, capaz de se ligar especificamente a uma imunoglobulina ou receptor de células T. Por exemplo, mas de forma alguma limitante, um epítopo alvo A pode ser um primeiro epítopo de um antígeno e um epítopo alvo B pode ser um segundo epítopo do antígeno. Alternativamente, o epítopo alvo B pode ser um segundo epítopo em um segundo antígeno. Em certas modalidades, os determinantes de epítopo incluem agrupamentos de superfície quimicamente ativos de moléculas, como aminoácidos, cadeias laterais de açúcar, grupos fosforil ou grupos sulfonil e, em certas modalidades, podem ter características estruturais tridimensionais específicas e/ou características de carga específicas. Um epítopo é uma região de um antígeno que é ligada por um anticorpo ou por um fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo ou por uma proteína de ligação. Em certas modalidades, diz-se que uma proteína de ligação se liga especificamente a um antígeno quando reconhece preferencialmente seu antígeno alvo em uma mistura complexa de proteínas e/ou macromoléculas. Em algumas modalidades, diz-se que uma proteína de ligação se liga especificamente a um antígeno quando a constante de dissociação de equilíbrio é < 10-8 M, quando a constante de dissociação de equilíbrio é < 1-9 M ou quando a constante de dissociação é < 10-10 M.

[233] Conforme usado neste documento, o termo "ligante" refere- se a 0-100 resíduos de aminoácidos contíguos. Os ligantes estão presentes ou ausentes e são iguais ou diferentes. Os ligantes podem ter todos a mesma sequência de aminoácidos ou podem ter diferentes sequências de aminoácidos.

[234] Em algumas modalidades, o termo "ligante" refere-se a 1-15 resíduos de aminoácidos contíguos. Normalmente, um ligante fornece flexibilidade e separação espacial entre dois aminoácidos ou entre dois domínios polipeptídicos. Um ligante pode ser inserido entre os domínios VH, VL, CH e/ou CL para fornecer flexibilidade e mobilidade suficientes para os domínios das cadeias leve e pesada, dependendo do formato da molécula, por exemplo, para dobrar em imunoglobulinas de região variável dupla cruzada. Um ligante é tipicamente inserido na transição entre os domínios variáveis entre o domínio variável e o domínio nocaute, ou entre os domínios variável e constante, respectivamente, no nível da sequência de aminoácidos. A transição entre os domínios pode ser identificada porque o tamanho aproximado dos domínios da imunoglobulina é bem compreendido. A localização precisa de uma transição de domínio pode ser determinada localizando trechos de peptídeo que não formam elementos estruturais secundários, como beta-folhas ou alfa-hélices, conforme demonstrado por dados experimentais ou como pode ser determinado por técnicas de modelagem ou predição de estrutura secundária. Em certas modalidades exemplares, o ligante pode ser inserido entre os domínios Fab para criar um anticorpo Fab em tandem. Em modalidades particulares, o ligante pode ser inserido entre o N-terminal de um domínio VH de um primeiro Fab e o C-terminal de um domínio CH1 de um segundo Fab.

[235] A identidade e a sequência de resíduos de aminoácidos no ligante podem variar dependendo do tipo de elemento (s) estrutural secundário necessário para alcançar o ligante. Por exemplo, glicina, serina e alanina são adequados para ligantes com flexibilidade máxima. Certas combinações de glicina, prolina, treonina e serina são úteis se um ligante mais rígido e estendido for desejado. Qualquer resíduo de aminoácido pode ser considerado como um ligante em combinação com outros resíduos de aminoácido para construir ligantes peptídicos maiores conforme necessário, dependendo das propriedades desejadas.

[236] Em algumas modalidades, um ligante compreende: um único resíduo de glicina (Gly); um peptídeo diglicina (Gly- Gly); um tripeptídeo (Gly-Gly-Gly); um peptídeo com quatro resíduos de glicina (Gly-Gly-Gly- Gly; SEQ ID Nº: x); um peptídeo com cinco resíduos de glicina (Gly-Gly-Gly-Gly- Gly; SEQ ID Nº: x); um peptídeo com seis resíduos de glicina (Gly-Gly-Gly-Gly- Gly-Gly; SEQ ID Nº: x); um peptídeo com sete resíduos de glicina (Gly-Gly-Gly-Gly- Gly-Gly-Gly; SEQ ID Nº: x); e um peptídeo com oito resíduos de glicina (Gly-Gly-Gly-Gly- Gly-Gly-Gly-Gly; SEQ ID Nº: x).

[237] Em algumas modalidades, um ligante compreende pequenos aminoácidos, como Gly, Ala ou Ser.

[238] Em algumas modalidades, um ligante compreende Gly e Ser, ou GS, GGS, GGGS ou GGGGS. Em algumas modalidades, um ligante compreende (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2 (isto é, (GGGGS)2). Em algumas modalidades, um ligante compreende (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3 (isto é, (GGGGS)3).

[239] Em algumas modalidades, um ligante compreende Gly-Gly- Gly-Gly-Ser (SEQ ID Nº: x), o peptídeo Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly- Gly-Gly-Ser (SEQ ID Nº: x), o peptídeo Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly- Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID Nº: x), e o peptídeo Gly- Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly (SEQ ID Nº: x).

[240] Em algumas modalidades, um ligante compreende um único resíduo Ser; um único resíduo Val; um dipeptídeo selecionado de Arg- Thr, Gln-Pro, Ser-Ser, Thr-Lys e Ser-Leu; Thr-Lys-Gly-Pro-Ser (SEQ ID Nº: x), Thr-Val-Ala-Ala-Pro (SEQ ID Nº: x), Gln-Pro-Lys-Ala-Ala (SEQ ID Nº: x), Gln-Arg-Ile-Glu-Gly (SEQ ID Nº: x); Ala-Ser-Thr-Lys-Gly-Pro-Ser (SEQ ID Nº: x), Arg-Thr- Val-Ala-Ala-Pro-Ser (SEQ ID Nº: x), Gly-Gln- Pro-Lys- Ala-Ala-Pro (SEQ ID Nº: x), His-Ile-Asp-Ser-Pro-Asn-Lys (SEQ ID Nº: x) e Asp-Lys-Thr-His-Thr (SEQ ID Nº: x)

[241] Em algumas modalidades, dois Fabs em tandem são ligados por meio de um ligante (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2. Em algumas modalidades, o ligante entre um domínio nocaute estabilizado e um par VH/VL é o ligante (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2.

[242] Em algumas modalidades com a porção CODV-Fab em que L1 e L2 estão na cadeia leve e L3 e L4 estão nas cadeias pesadas, L1 tem 3 a 12 resíduos de aminoácidos de comprimento, L2 tem 3 a 14 resíduos de aminoácidos em comprimento, L3 tem 1 a 8 resíduos de aminoácidos de comprimento e L4 tem 1 a 3 resíduos de aminoácidos de comprimento. Em algumas modalidades, L1 tem 5 a 10 resíduos de aminoácidos de comprimento, L2 tem 5 a 8 resíduos de aminoácidos de comprimento, L3 tem 1 a 5 resíduos de aminoácidos de comprimento e L4 tem 1 a 2 resíduos de aminoácidos de comprimento. Em algumas modalidades, L1 tem 7 resíduos de aminoácidos de comprimento, L2 tem 5 resíduos de aminoácidos de comprimento, L3 tem 1 resíduo de aminoácido de comprimento e L4 tem 2 resíduos de aminoácidos de comprimento. Em algumas modalidades, L1 tem 10 resíduos de aminoácidos de comprimento, L2 tem 10 resíduos de aminoácidos de comprimento, L3 tem 0 resíduos de aminoácidos de comprimento e L4 tem 0 resíduos de aminoácidos de comprimento. Em algumas modalidades, L1, L2, L3 e L4 têm, cada um, um comprimento selecionado independentemente de 0 a 15 aminoácidos (por exemplo, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 aminoácidos), em que pelo menos dois dos ligantes têm um comprimento de 1 a 15 aminoácidos (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 aminoácidos). Em algumas modalidades, L1, L2, L3 e L4 são Asp- Lys-Thr-His-Thr (SEQ ID Nº: x). Em algumas modalidades, os ligantes compreendem a sequência Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro (SEQ ID Nº: x). Em algumas modalidades, L1 compreende a sequência Gly-Gln-Pro- Lys-Ala-Ala-Pro (SEQ ID Nº: x). Em algumas modalidades, L1 compreende a sequência Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro (SEQ ID Nº: x), L2 compreende a sequência Thr-Lys-Gly-Pro-Ser-Arg (SEQ ID Nº: x), L3 compreende a sequência Ser e L4 compreende a sequência Arg-Thr. Em algumas modalidades, L3 compreende a sequência Gly-Gln-Pro- Lys-Ala-Ala-Pro (SEQ ID Nº: x). Em algumas modalidades, L1 compreende a sequência Ser, L2 compreende a sequência Arg-Thr, L3 compreende a sequência Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro (SEQ ID Nº: x) e L4 compreende a sequência Thr-Lys -Gly-Pro-Ser-Arg (SEQ ID Nº: x).

[243] Em algumas modalidades, L1, L2, L3 e L4, cada um independentemente, compreende uma sequência selecionada a partir de (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n (em que n é um número inteiro entre 0 e 5; SEQ ID Nº: x), Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID Nº: x), Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly- Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID Nº: x), Ser, Arg-Thr, Thr-Lys-Gly-Pro-Ser (SEQ ID Nº: x), Gly-Gln-Pro- Lys-Ala-Ala- Pro (SEQ ID Nº: x) e Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly- Gly (SEQ ID Nº: x). Em algumas modalidades, L1 compreende a sequência Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro (SEQ ID Nº: x), L2 compreende a sequência Thr-Lys-Gly-Pro-Ser (SEQ ID Nº: x), L3 compreende a sequência Ser e L4 compreende a sequência Arg-Thr.

Em algumas modalidades, L1 compreende a sequência Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly- Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID Nº: x), L2 compreende a sequência Gly-Gly- Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID Nº: x), L3 tem 0 aminoácidos de comprimento e L4 tem 0 aminoácidos de comprimento.

Em algumas modalidades, L1 compreende a sequência Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser- Gly-Ser-Gly-Gly (SEQ ID Nº: x), L2 compreende a sequência Gly-Gly- Ser-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly (SEQ ID N O: x), L3 tem 0 aminoácidos de comprimento e L4 tem 0 aminoácidos de comprimento.

Em algumas modalidades, L1 compreende a sequência Gly-Gly-Gly- Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID Nº: x), L2 é 0 aminoácidos em comprimento, L3 compreende a sequência Gly-Gly- Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID Nº: x), e L4 é 0 aminoácidos em comprimento.

Em algumas modalidades, L1 e L2 têm zero aminoácidos de comprimento, e L3 e L4 cada um compreende uma sequência independentemente selecionada a partir de (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n (SEQ ID Nº: x) (em que n é um número inteiro entre 0 e 5; SEQ ID Nº: x), Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID Nº: x), Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly -Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly- Gly-Ser (SEQ ID Nº: x), Ser, Arg-Thr, Thr-Lys-Gly-Pro-Ser (SEQ ID Nº: x), Gly -Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro (SEQ ID Nº: x), e Gly-Gly-Ser-Gly-Ser- Ser-Gly-Ser-Gly-Gly (SEQ ID Nº: x). Em algumas modalidades, L3 e L4 têm zero aminoácidos de comprimento, e L1 e L2 compreendem cada, uma sequência independentemente selecionada a partir de (Gly-Gly- Gly-Gly-Ser)n (em que n é um número inteiro entre 0 e 5; SEQ ID Nº: x), Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID Nº: x), Gly-Gly-Gly-Gly- Ser-Gly-Gly-Gly-Gly- Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID Nº: x), Ser, Arg-Thr, Thr-Lys-Gly-Pro-Ser (SEQ ID Nº: x), Gly-Gln-Pro-Lys- Ala-Ala-Pro (SEQ ID Nº: x) e Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly (SEQ ID Nº: x).

[244] Em algumas modalidades, os ligantes compreendem uma sequência derivada de uma sequência de ocorrência natural na junção entre um domínio variável de anticorpo e um domínio constante de anticorpo (por exemplo, conforme descrito em WO2012/135345). Por exemplo, em algumas modalidades, o ligante compreende uma sequência encontrada na transição entre um domínio VH e CH1 endógeno, ou entre um domínio VL e CL endógeno (por exemplo, kappa ou lambda). Em algumas modalidades, o ligante compreende uma sequência encontrada na transição entre um domínio VH e CH1 humano endógeno ou entre um domínio VL e CL humano endógeno (por exemplo, kappa ou lambda humano).

[245] Os exemplos listados acima não se destinam a limitar o escopo da divulgação de qualquer forma, e ligantes compreendendo aminoácidos selecionados aleatoriamente a partir do grupo que consiste em valina, leucina, isoleucina, serina, treonina, lisina, arginina, histidina, aspartato, glutamato, asparagina, glutamina, glicina e prolina são adequados para uso nas proteínas de ligação aqui descritas. Para descrições adicionais de sequências de ligação, vide, por exemplo, WO2012135345, WO2017/180913 incorporado por referência.

[246] Conforme usado neste documento, o termo "valência" se refere ao número de sítios de ligação de uma proteína de ligação, um epítopo, uma proteína de ligação a antígeno ou um anticorpo. Por exemplo, o termo "proteína de ligação monovalente" refere-se a uma proteína de ligação que tem um sítio de ligação a antígeno. O termo "proteína de ligação bivalente" refere-se a uma proteína de ligação que tem dois sítios de ligação. O termo "proteína de ligação trivalente" refere-se a uma proteína de ligação que tem três sítios de ligação. O termo "proteína de ligação tetravalente" refere-se a uma proteína de ligação que tem quatro sítios de ligação. Em modalidades particulares, a proteína de ligação divalente pode se ligar a um antígeno alvo. Em outras modalidades, a proteína de ligação divalente pode se ligar a dois alvos de antígeno diferentes. Em modalidades particulares, a proteína de ligação trivalente pode se ligar a um antígeno alvo, isto é, é monoespecífica. Em outras modalidades, a proteína de ligação trivalente pode se ligar a dois alvos de antígeno diferentes, isto é, é biespecífica. Em outras modalidades, a proteína de ligação trivalente pode se ligar a três alvos de antígeno diferentes, isto é, é triespecífica. Em modalidades particulares, a proteína de ligação tetravalente pode se ligar a um antígeno alvo, isto é, é monoespecífica. Em outras modalidades, a proteína de ligação tetravalente pode se ligar a dois alvos de antígeno diferentes, isto é, é biespecífica. Em outras modalidades, a proteína de ligação tetravalente pode se ligar a três alvos de antígeno diferentes, isto é, é triespecífica. Em outras modalidades, a proteína de ligação tetravalente pode se ligar a quatro alvos de antígeno diferentes, isto é, é tetraespecífica.

[247] Conforme usado neste documento, o termo "especificidade" refere-se ao número de especificidades de ligação de uma proteína de ligação, um epítopo, uma proteína de ligação a antígeno ou um anticorpo. Por exemplo, o termo "proteína de ligação monoespecífica" se refere a uma proteína de ligação que se liga especificamente a um alvo de antígeno. O termo "proteína de ligação biespecífica" refere-se a uma proteína de ligação que se liga especificamente a dois alvos de antígeno diferentes. O termo "proteína de ligação triespecífica" refere- se a uma proteína de ligação que se liga especificamente a três alvos de antígeno diferentes. O termo "proteína de ligação tetraespecífica" se refere a uma proteína de ligação que se liga especificamente a quatro alvos de antígeno diferentes e assim por diante.

[248] Conforme usado neste documento, o termo "sítio de reconhecimento seletivo" refere-se a uma modificação na proteína de ligação que permite ser reconhecida seletivamente por uma ligação de reagente de afinidade ao sítio de reconhecimento seletivo. Exemplos de um sítio de reconhecimento seletivo compreende o sítio de ligação para a proteína A na parte Fc de uma imunoglobulina.

[249] Conforme usado neste documento, o termo "reagente de afinidade" se refere a um reagente que contém um ligando que é imobilizado em uma matriz e se liga especificamente a agrupamentos de superfície de moléculas, tais como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar e geralmente têm características estruturais tridimensionais específicas, bem como características de carga específicas. Reagentes de afinidade são ferramentas em cromatografia de afinidade, onde a purificação é possibilitada pela interação específica entre o ligando e o produto. "Proteína L", que é um exemplo de um reagente de afinidade, refere-se à proteína L recombinante que é imobilizada em uma matriz para formar um ligando que tem afinidade para um subconjunto do domínio variável de cadeias leves kappa de imunoglobulina. Essas matrizes podem ser de resina. Outro exemplo de reagente de afinidade é "KappaSelect", que se refere a um anticorpo de cadeia única derivado de camelídeo de 13 KDa recombinante que é imobilizado em uma matriz para formar um ligando que tem afinidade para o domínio constante das cadeias leves kappa de imunoglobulina humana. Outro exemplo de um reagente de afinidade é a proteína A. A proteína A é uma proteína de superfície de 42 KDa originalmente encontrada na parede celular da bactéria Staphylococcus aureus. Foi demonstrado por meio de refinamento cristalográfico que o sítio de ligação primário para a proteína A está na região Fc, entre os domínios CH2 e CH3. Além disso, a proteína A mostrou ligar moléculas de IgG humana contendo fragmentos F(ab’)2 de IgG da família de genes VH3 humanos. A proteína A pode se ligar com forte afinidade à porção Fc da imunoglobulina de certas espécies.

[250] A constante de dissociação (KD) de uma proteína de ligação pode ser determinada, por exemplo, por ressonância plasmônica de superfície. Geralmente, a análise de ressonância plasmônica de superfície mede as interações de ligação em tempo real entre o ligando (um antígeno alvo em uma matriz de biossensor) e o analito (uma proteína de ligação em solução) por ressonância plasmônica de superfície (SPR) usando o sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor; Piscataway, NJ) A análise plasmônica de superfície também pode ser realizada imobilizando o analito (proteína de ligação em uma matriz de biossensor) e apresentando o ligando (antígeno alvo). O termo "KD", tal como aqui utilizado, refere-se à constante de dissociação da interação entre uma proteína de ligação particular e um antígeno alvo.

[251] Conforme usado neste documento, o termo "liga-se especificamente" refere-se à capacidade de uma proteína de ligação ou um fragmento de ligação a antígeno da mesma para se ligar a um antígeno contendo um epítopo com uma KD de pelo menos cerca de 1 x 10-6 M, 1 x 10-7 M, 1 x 10-8 M, 1 x 10-9 M, 1 x 10-10 M, 1 x 10-11 M, 1 x 10-12 M ou mais e/ou para se ligar a um epítopo com uma afinidade que é pelo menos duas vezes maior do que sua afinidade por um antígeno não específico. A afinidade de ligação de um antígeno a uma proteína de ligação ou um anticorpo pode ser conduzida por ressonância plasmônica de superfície (SPR) usando um instrumento BIAcore.

[252] Conforme usado neste documento, o termo "molécula Fab de referência" se refere a uma molécula que é idêntica à molécula pseudoFab, exceto que, em uma molécula pseudoFab, os domínios CH1 e CL da molécula Fab de referência são substituídos por domínios VHX e VLX. A "molécula Fab de referência" refere-se a uma molécula em que os domínios variáveis são idênticos aos domínios variáveis do pseudoFab e têm domínios CH1 e CL. Na molécula pseudoFab, os domínios CH1 e CL da molécula Fab de referência são substituídos por domínios VHX e VLX.

[253] Tal como aqui utilizado, o termo "ácido nucleico" refere-se a macromoléculas poliméricas ou oligoméricas, ou grandes moléculas biológicas, essenciais para todas as formas de vida conhecidas. Os ácidos nucleicos, que incluem DNA (ácido desoxirribonucleico) e RNA (ácido ribonucleico), são feitos de monômeros conhecidos como nucleotídeos. A maioria das moléculas de DNA de ocorrência natural consiste em dois filamentos de biopolímero complementares enrolados um em torno do outro para formar uma hélice dupla. O filamento de DNA também é conhecido como polinucleotídeos que consistem em nucleotídeos. Cada nucleotídeo é composto de uma nucleobase contendo nitrogênio, bem como um açúcar monossacarídeo chamado desoxirribose ou ribose e um grupo fosfato. Nucleobases de ocorrência natural compreendem guanina (G), adenina (A), timina (T), uracila (U) ou citosina (C). Os nucleotídeos são unidos uns aos outros em uma cadeia por ligações covalentes entre o açúcar de um nucleotídeo e o fosfato do próximo, resultando em uma estrutura alternada de açúcar- fosfato. Se o açúcar for desoxirribose, o polímero é DNA. Se o açúcar for ribose, o polímero é RNA. Normalmente, um polinucleotídeo é formado através de ligações fosfodiéster entre os monômeros de nucleotídeos individuais.

[254] Conforme usado neste documento, o termo "polinucleotídeo" refere-se a polímeros de ácido nucleico de filamento simples ou duplo de pelo menos 10 nucleotídeos de comprimento. Entende-se que os nucleotídeos que compreendem o polinucleotídeo podem ser ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleotídeo. Essas modificações incluem modificações de base tais como bromuridina, modificações de ribose, tais como arabinosídeo e 2',3'-didesoxirribose, e modificações de ligação internucleotídeo, tais como fosforotioato, fosforoditioato, fosforosselenoato, fosforodisselenoato, fosforoanilotioato,

fosforaniladato e fosforoamidato. O termo "polinucleotídeo" inclui especificamente formas de DNA de filamento simples e de filamento duplo.

[255] Um "polinucleotídeo isolado" é um polinucleotídeo de origem genômica, cDNA ou sintética ou alguma combinação dos mesmos, que: (1) não está associado com a totalidade ou uma porção de um polinucleotídeo em que o polinucleotídeo isolado é encontrado na natureza, (2) está ligado a um polinucleotídeo ao qual não está ligado na natureza, ou (3) não ocorre na natureza como parte de uma sequência maior.

[256] Um "polipeptídeo isolado" é aquele que: (1) está livre de pelo menos alguns outros polipeptídeos com os quais normalmente seria encontrado, (2) é essencialmente livre de outros polipeptídeos da mesma fonte, por exemplo, da mesma espécie, (3) é expresso por uma célula de uma espécie diferente, (4) foi separado de pelo menos cerca de 50 por cento dos polinucleotídeos, lipídeos, carboidratos ou outros materiais com os quais está associado na natureza, (5) não é associado (por interação covalente ou não covalente) com porções de um polipeptídeo com o qual o "polipeptídeo isolado" está associado na natureza, (6) está operativamente associado (por interação covalente ou não covalente) com um polipeptídeo com o qual não está associado na natureza, ou (7) não ocorre na natureza. Esse polipeptídeo isolado pode ser codificado por DNA genômico, cDNA, mRNA ou outro RNA, de origem sintética, ou qualquer combinação dos mesmos. Em modalidades exemplares, o polipeptídeo isolado é substancialmente livre de polipeptídeos ou outros contaminantes que são encontrados em seu ambiente natural que interfeririam com seu uso (terapêutico, diagnóstico, profilático, pesquisa ou outro).

[257] Conforme usado neste documento, o termo "vetor de expressão" também referido como um construto de expressão, geralmente se refere a um plasmídeo ou vírus projetado para a expressão de proteínas em células. O termo "vetor" refere-se a uma proteína ou um polinucleotídeo ou uma mistura dos mesmos que é capaz de ser introduzido ou de introduzir proteínas e/ou ácidos nucleicos compreendidos nele em uma célula. Exemplos de vetores incluem, mas não estão limitados a plasmídeos, cosmídeos, fagos, vírus ou cromossomos artificiais. Em particular, um vetor é usado para transportar um produto de gene de interesse, tal como, por exemplo, DNA estranho ou heterólogo em uma célula hospedeira adequada. Os vetores podem conter sequências polinucleotídicas de "replicon" que facilitam a replicação autônoma do vetor em uma célula hospedeira. DNA estranho é definido como DNA heterólogo, que é DNA não encontrado naturalmente na célula hospedeira, que, por exemplo, replica a molécula do vetor, codifica um marcador selecionável ou rastreável ou codifica um transgene. Uma vez na célula hospedeira, o vetor pode se replicar independente ou coincidentemente com o DNA cromossômico do hospedeiro, e várias cópias do vetor e seu DNA inserido podem ser geradas. Além disso, o vetor também pode conter os elementos necessários que permitem a transcrição do DNA inserido em uma molécula de mRNA ou de outra forma causar a replicação do DNA inserido em múltiplas cópias de RNA. Os vetores podem abranger ainda "sequências de controle de expressão" que regulam a expressão do gene de interesse. Normalmente, as sequências de controle de expressão são polipeptídeos ou polinucleotídeos, tais como, mas não se limitando a, promotores, intensificadores, silenciadores, isoladores ou repressores. Em um vetor que compreende mais de um polinucleotídeo que codifica um ou mais produtos gênicos de interesse, a expressão pode ser controlada em conjunto ou separadamente por uma ou mais sequências de controle de expressão. Mais especificamente, cada polinucleotídeo compreendido no vetor pode ser controlado por uma sequência de controle de expressão separada ou todos os polinucleotídeos compreendidos no vetor podem ser controlados por uma única sequência de controle de expressão. Os polinucleotídeos compreendidos em um único vetor controlado por uma única sequência de controle de expressão podem formar uma estrutura de leitura aberta. Alguns vetores de expressão contêm adicionalmente elementos de sequência adjacentes ao DNA inserido que aumentam a meia-vida do mRNA expresso e/ou permitem a tradução do mRNA em uma molécula de proteína. Muitas moléculas de mRNA e polipeptídeo codificadas pelo DNA inserido podem, assim, ser sintetizadas rapidamente.

[258] Conforme usado neste documento, o termo "célula hospedeira" refere-se a uma célula na qual um vetor de expressão recombinante foi introduzido. Uma célula hospedeira ou célula hospedeira recombinante destina-se a referir-se não apenas à célula em questão em particular, mas também à progênie de tal célula. Como certas modificações podem ocorrer nas gerações seguintes devido a mutações ou influências ambientais, tal progênie pode não ser, de fato, idêntica à célula progenitora, mas tais células ainda estão incluídas no escopo do termo "célula hospedeira", conforme usado neste documento. Uma ampla variedade de sistemas de expressão de células hospedeiras pode ser usada para expressar as proteínas de ligação, incluindo sistemas de expressão bacteriana, de levedura, baculoviral e de mamífero (bem como sistemas de expressão de exibição de fago). Um exemplo de um vetor de expressão bacteriano adequado é pUC19. Para expressar uma proteína de ligação de forma recombinante, uma célula hospedeira é transformada ou transfectada com um ou mais vetores de expressão recombinantes carregando fragmentos de DNA que codificam as cadeias polipeptídicas da proteína de ligação de modo que as cadeias polipeptídicas são expressas na célula hospedeira e, em modalidades exemplares, secretadas para o meio no qual as células hospedeiras são cultivadas, a partir do qual a proteína de ligação pode ser recuperada.

[259] Conforme usado neste documento, o termo "composição farmacêutica" refere-se a um composto ou composição capaz de induzir um efeito terapêutico desejado quando administrado adequadamente a um paciente.

[260] O termo "veículo farmaceuticamente aceitável" ou "transportador fisiologicamente aceitável", tal como aqui utilizado, refere-se a um ou mais materiais de formulação adequados para realizar ou aumentar a entrega de uma proteína de ligação.

[261] Os termos "quantidade eficaz" e "quantidade terapeuticamente eficaz", quando usados em referência a uma composição farmacêutica que compreende uma ou mais proteínas de ligação (por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos), referem-se a uma quantidade ou dosagem suficiente para produzir um resultado terapêutico desejado. Mais especificamente, uma quantidade terapeuticamente eficaz é uma quantidade de uma proteína de ligação (por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo) suficiente para inibir, por algum período de tempo, um ou mais dos processos patológicos clinicamente definidos associados à condição sendo tratada. A quantidade eficaz pode variar dependendo da proteína de ligação do tipo anticorpo específico que está sendo usada e também depende de uma variedade de fatores e condições relacionadas ao paciente a ser tratado e à gravidade do distúrbio. Por exemplo, se a proteína de ligação ou proteína de ligação multiespecífica for administrada in vivo, fatores como idade, peso e saúde do paciente, bem como curvas de resposta à dose e dados de toxicidade obtidos em trabalho pré-clínico com animais estariam entre esses fatores considerados. A determinação de uma quantidade eficaz ou quantidade terapeuticamente eficaz de uma dada composição farmacêutica está bem dentro da capacidade dos versados na técnica.

[262] Conforme usado neste documento, o termo "método de produção de uma proteína de ligação" refere-se a métodos recombinantes de expressão de proteínas usando técnicas bem conhecidas na área. II. PORÇÕES PSEUDOFAB

[263] Em certas modalidades, uma molécula de ligação aqui descrita compreende pelo menos uma porção pseudoFab. Tal como aqui utilizado, uma porção "pseudoFab" é análoga a uma porção Fab de um anticorpo convencional em que compreende uma porção de ligação a antígeno funcional formada pelo emparelhamento de um domínio de cadeia leve variável (VL) com uma cadeia pesada variável (VH). No entanto, enquanto os domínios VL e VH de um Fab convencional são diretamente fundidos ou ligados a um domínio de cadeia leve constante (CL) e um domínio de cadeia pesada constante 1 (CH1), respectivamente, uma porção pseudoFab não possui domínios CH1 e CL. Em vez disso, os domínios VL e VH do pseudoFab são operativamente ligados a um segundo par de domínios VL e VH nocaute estabilizados (denotados aqui como VLX e VHX) que formam uma porção de ligação inativa ou não funcional (aqui, uma porção ou domínio "nocaute estabilizado") que é incapaz de se ligar especificamente a um antígeno alvo (por exemplo, qualquer antígeno alvo). Em certas modalidades, a porção pseudoFab é incapaz de se ligar ao antígeno alvo da porção Fab correspondente da qual é derivada. A porção pseudoFab não possui domínios CH e CL.

[264] Embora incapaz de ligar seletivamente um antígeno alvo, os domínios VLX e VHX de um pseudoFab, no entanto, se associam preferencialmente entre si para formar um emparelhamento de cadeia estável. Portanto, ao anexar um pseudoFab a um ou mais domínios de ligação adicionais de especificidades diferentes, a estabilidade inerente do emparelhamento de cadeia VLX/VHX de um pseudoFab pode conduzir a heterodimerização das cadeias de uma molécula de ligação multiespecífica desejada.

[265] Por conseguinte, um pseudoFab da presente divulgação compreende ou consiste em uma primeira cadeia polipeptídica tendo uma estrutura representada pela fórmula: VHa-L1-VHX; ou VHb-L1-VHX e a segunda cadeia polipeptídica tendo uma estrutura representada pela fórmula: (III) VLa-L2-VLX; ou (IV) VLb-L2-VLX em que VHX se associa a VLX para formar um domínio nocaute, VH se associa a VL para formar um primeiro domínio de ligação de antígeno funcional, e L1 e L2 são ligantes, que podem estar presentes ou ausentes.

[266] Em certas modalidades, a primeira cadeia polipeptídica do pseudoFab tem a estrutura VH-L1-VHX e a segunda cadeia polipeptídica do pseudoFab tem a estrutura VL-L2-VLX.

[267] Em outras modalidades, o primeiro polipeptídeo do pseudoFab tem a estrutura VHX-L1-VH e a segunda cadeia polipeptídica tem a estrutura VLX-L2-VL.

[268] Em algumas modalidades, a proteína de ligação compreende cadeias de proteínas separadas selecionadas a partir de um do seguinte grupo: (a) VHa-CH1-L1-VHb-L2-VHX e VLa-CL e VLb-L3-VLX; (b) VHa-L2-VHX-L1-VHb-CH1 e VLa-L3-VLX e VLb-CL; (c) VHa-CH1-L1-VHa-CH1 e VHb-L2-VHX-L3-VHb-L4- VHX e duas cadeias VLb-L5-VLX e duas cadeias VLa-CL; em que as cadeias de (a) e (b) podem estar presentes uma ou duas vezes, e em que L1, L2, L3, L4 e L5 são ligantes, que podem ser independentemente iguais ou diferentes. (a) Domínios Nocaute

[269] O domínio "nocaute" de um pseudoFab pode ser gerado por qualquer meio que resulte na anulação ou diminuição da afinidade de ligação ou especificidade de um sítio de ligação a antígeno normalmente funcional. Em certas modalidades, o domínio nocaute do pseudoFab foi tornado inativo ou não funcional por um ou mutações em um ou ambos os domínios VLX e VHX do domínio nocaute. Em uma modalidade, uma modificação de nocaute é uma substituição de aminoácido. Em outras modalidades, uma modificação de nocaute é uma inserção ou exclusão de aminoácidos. Em outra modalidade, uma modificação de nocaute é uma combinação de uma ou mais substituições de aminoácidos, inserções de aminoácidos e deleções de aminoácidos. Em ainda outras modalidades, o domínio nocaute é tornado não funcional por modificação covalente com, por exemplo, uma porção que interfere com a capacidade de um domínio variável de se ligar a um antígeno alvo.

[270] Em certas modalidades, a modificação de nocaute abole a ligação criando repulsão ou interrupção de complexos estabilizados de proteína de ligação a antígeno. Em certas modalidades, a modificação de nocaute pode compreender a substituição de um resíduo que normalmente forma um contato com o antígeno alvo por um aminoácido que cria repulsão carga-carga com o antígeno alvo. Em adição ou alternativamente, mutações que desestabilizam complexos de interações pi-pi podem ser introduzidas.

[271] Em certas modalidades, a modificação de nocaute é a substituição de um aminoácido carregado por um aminoácido não carregado. Em outras modalidades, a modificação de nocaute é a substituição de um aminoácido não carregado por um aminoácido carregado. Em outras modalidades, a modificação de nocaute é a substituição de um aminoácido polar por um aminoácido não polar. Em outras modalidades, a modificação nocaute é a substituição de aminoácidos carregados por aminoácidos polares e não carregados e aminoácidos polares não carregados por aminoácidos hidrofóbicos não polares.

[272] Em certas modalidades, a modificação de nocaute é introduzida em uma posição de aminoácido que forma uma interação de ligação com um antígeno. Por exemplo, a modificação de nocaute pode estar localizada na superfície da proteína, onde normalmente ocorre uma interação antígeno-anticorpo. Em certas modalidades exemplares, as modificações podem ser introduzidas nas regiões determinantes de complementaridade (CDR) de um ou ambos os domínios VLX ou VHX.

[273] Em certas modalidades, a modificação de nocaute é uma substituição de um resíduo em CDRH1 do domínio VHX. Em outra modalidade, a modificação de nocaute é uma substituição de um resíduo em CDRH2 do domínio VHX. Em outra modalidade, a modificação de nocaute é uma substituição de um resíduo em CDRH3 do domínio VHX.

[274] Em certas modalidades, a modificação de nocaute é uma substituição de um resíduo em CDRL1 do domínio VLX. Em outra modalidade, a modificação de nocaute é uma substituição de um resíduo em CDRL2 do domínio VLX. Em outra modalidade, a modificação de nocaute é uma substituição de um resíduo em CDRL3 do domínio VLX.

[275] Em certas modalidades exemplares, uma arginina na CDR dos domínios VHX ou VLX é mutada para glutamato. Em outras modalidades, uma ou mais tirosinas na CDR do domínio VHX ou VLX são mutadas para alanina.

[276] Em certas modalidades, a modificação resulta em um domínio nocaute que é completamente desprovido da atividade de ligação a antígeno alvo da contraparte funcional não nocaute (isto é, de tipo selvagem) da qual é derivado. Alternativamente, a funcionalidade de ligação do domínio nocaute pode ser substancialmente reduzida em comparação com sua contraparte funcional não nocaute, embora retenha algum nível de ligação detectável.

[277] Os arcabouços para a geração de domínios nocaute podem ser obtidos, por exemplo, no Protein Data Bank (PDB). O PDB é um banco de dados cristalográfico para os dados estruturais tridimensionais de grandes moléculas biológicas, como proteínas e ácidos nucleicos. Domínios nocaute podem ser gerados pela mutação específica de aminoácidos que se prevê estarem envolvidos na ligação a antígeno por modelagem baseada em computador do domínio de ligação a antígeno e seu antígeno alvo cognato. Estudos de ligação subsequentes podem ser conduzidos usando métodos conhecidos na técnica, por exemplo, ressonância plasmônica de superfície, e revelam com alta precisão se a função de ligação é abolida e a interação entre o domínio de ligação e seu alvo é interrompida. (b) Domínios Nocaute Estabilizados

[278] Em certas modalidades, o domínio nocaute é um domínio nocaute estabilizado com estabilidade térmica aumentada em comparação com sua contraparte de tipo selvagem. Por exemplo, em certas modalidades exemplares, a temperatura de fusão (Tm) do domínio nocaute está dentro de pelo menos 0,25ºC, pelo menos 0,5ºC, pelo menos 0,75ºC, pelo menos 1ºC, pelo menos 2ºC, pelo menos 3ºC, pelo menos 4ºC, pelo menos 5ºC, ou pelo menos 10°Cem comparação com a contraparte de tipo selvagem da qual é derivado. Em outras modalidades exemplares, a Tm do domínio nocaute é aumentada em relação à sua contraparte de tipo selvagem. Por exemplo, a Tm pode ser aumentada em pelo menos 0,25°C, pelo menos 0,5°C, pelo menos 0,75°C, pelo menos 1°C, pelo menos 2°C, pelo menos 3°C, pelo menos 4°C, pelo menos 5°C, ou pelo menos 10°Cem comparação com a contraparte de tipo selvagem da qual é derivado. A estabilidade térmica pode ser medida por fluorimetria de varredura diferencial (DSF) ou outros métodos bioanalíticos rotineiramente usados por aqueles versados na técnica.

[279] Em certas modalidades, o pseudoFab compreende uma ligação dissulfeto intracadeia construída geneticamente entre os domínios VHX ou VLX do domínio nocaute do pseudoFab que confere estabilidade aprimorada. Normalmente, esta modificação é a substituição de pelo menos um aminoácido do domínio VHX por um resíduo de cisteína (Cys) e pelo menos um aminoácido no domínio VLX por um resíduo Cys. Os resíduos Cys podem ser introduzidos nas posições dos domínios VHX e VLX que permitem a formação de uma ligação dissulfeto após a formação do dímero. Em certas modalidades, as mutações podem ser feitas na interface VH e VL para melhorar a estabilidade entre a interface VH/VL. Conjuntos específicos de mutações de aminoácidos no domínio VH e nos domínios VL podem melhorar a estabilidade através da introdução de resíduos de cisteína não nativos que formam pontes dissulfeto.

[280] Um primeiro conjunto de mutações de estabilização de dissulfeto pode ser feito para resíduos de aminoácidos nos domínios VH e VL. Em uma modalidade exemplar, uma ligação dissulfeto é formada por um Cys na posição 44 do domínio VHX e um Cys na posição 100 do domínio VLX. Este conjunto de mutações de estabilização de dissulfeto pode ser alternativamente referido como o conjunto de mutações "VH44C/VL100C". O primeiro conjunto de mutações de estabilização de dissulfeto é descrito em mais detalhes em Reiter et al. Nature Biotechnology. Vol. 14. Pág. 1239-1245. 1996, aqui incorporado por referência para todos os efeitos.

[281] Um segundo conjunto de mutações de estabilização de dissulfeto pode ser feito para resíduos de aminoácidos no domínio VH e VL. Em uma modalidade exemplar, uma ligação dissulfeto é formada por um Cys na posição 105 do domínio VHX e um Cys na posição 43 do domínio VLX. O segundo conjunto de mutações de estabilização de dissulfeto pode ser alternativamente referido como o conjunto de mutações "VH105C/VL43C". Outras mutações de estabilização de dissulfeto são descritas em mais detalhes na Patente U.S. Nº.

9.527.927, que é aqui incorporada por referência para todos os fins.

[282] Em certas modalidades, o domínio VLX do pseudoFab compreende uma variante da SEQ ID Nº: 1 com pelo menos uma modificação de nocaute. Por exemplo, o domínio VLX pode compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, em pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1, mas para a modificação de nocaute.

[283] Em certas modalidades, o domínio VHX do pseudoFab compreende uma variante da SEQ ID Nº: 2 com pelo menos uma modificação de nocaute. Por exemplo, o domínio VHX pode compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%,

pelo menos 94%, pelo menos 95%, em pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 2, mas para a modificação de nocaute.

[284] Em uma modalidade, o domínio VLX do pseudoFab compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Nº: 76 e o domínio VHX do pseudoFab compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo de SEQ ID Nº: 77, SEQ ID Nº: 78 e SEQ ID Nº: 79. II. POLIPEPTÍDEOS DE LIGAÇÃO CONTENDO PSEUDOFAB

MULTIESPECÍFICO

[285] Em outros aspectos, proteínas de ligação multiespecíficas compreendendo uma porção pseudoFab aqui descrita são fornecidas. A natureza altamente modular da porção pseudoFab permite que uma grande variedade de estruturas multiespecíficas seja formada.

[286] Em certas modalidades, as proteínas de ligação multiespecíficas da divulgação compreendem especificidades de ligação adicionais anexadas ao N-terminal e/ou C-terminal de uma ou ambas as cadeias de uma porção pseudoFab para formar uma proteína de ligação contendo pseudoFab multivalente.

[287] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação multiespecífica compreende: a) uma primeira porção pseudoFab que compreende: (1) um primeiro domínio VL (VLa) emparelhado com um primeiro domínio VH (VHa) para formar um primeiro sítio de ligação a antígeno que se liga ao antígeno alvo A; (2) um primeiro domínio VL nocaute estabilizado (VLX) emparelhado com um primeiro domínio VH nocaute estabilizado (VHX) para formar um primeiro domínio nocaute estabilizado por dissulfeto (dsKO);

(3) um primeiro domínio de heterodimerização (HD1); em que o primeiro domínio dsKO compreende (i) uma ou mais mutações de inativação que abolem sua ligação a um antígeno alvo; e (ii) uma ou mais ligações dissulfeto intercadeia construídas geneticamente; b) uma primeira porção Fab compreendendo (1) um segundo domínio VL (VLb) emparelhado com o segundo domínio VH (VHb) para formar um segundo sítio de ligação de antígeno funcional que liga o antígeno alvo B; (2) um primeiro domínio CH1 emparelhado com um primeiro domínio CL; e (3) um segundo domínio de heterodimerização (HD2).

[288] Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo domínios de heterodimerização da proteína de ligação compreendem o primeiro e o segundo domínios Fc. Em algumas modalidades, os domínios Fc compreendem a estrutura geral dobradiça - domínio CH2 - domínio CH3. (a) Domínios de Heterodimerização Fc

[289] Em certas modalidades, as proteínas de ligação multiespecíficas da divulgação podem compreender ainda um domínio Fc-heterodimerização C1 ou C2. Em algumas modalidades, o domínio Fc-heterodimerização é selecionado a partir do grupo que consiste em um Fc heterodimerizador ou fragmentos do mesmo, em particular uma variante knob-in-hole (KIH) de uma parte Fc e variantes modificadas pelo efetor ou um Fc heterodimerizador ou fragmentos do mesmo, em particular uma variante EV-RWT de um Fc e suas variantes modificadas pelo efetor. Em algumas modalidades, o Fc compreende uma ou mais mutações de aminoácidos. Uma possibilidade é remover um sítio de reconhecimento seletivo para um primeiro reagente de afinidade, por exemplo, por mutações selecionadas a partir do grupo que consiste em H435R, Y436F e introduzir um sítio de reconhecimento seletivo para um segundo reagente de afinidade. Alternativamente, apenas um sítio de reconhecimento seletivo para um segundo reagente de afinidade pode ser introduzido. (b) Domínios de homodimerização

[290] Em certas modalidades, as proteínas de ligação multiespecíficas da divulgação podem compreender ainda um domínio de homodimerização. Em algumas modalidades, o domínio de homodimerização é selecionado a partir do grupo que consiste em uma região Fc e suas variantes modificadas pelo efetor; um ou mais domínios CH2, por exemplo, de IgG, IgE ou IgM; um ou mais domínios CH3, por exemplo, de IgG, IgA ou IgD; e um ou mais domínios CH4, por exemplo, de IgE ou IgM. III. PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO CONTENDO PSEUDOFAB

MULTIMÉRICO (a) Construtos Tetravalentes Simétricos

[291] Em outra modalidade, o polipeptídeo de ligação compreende um pseudo Fab contendo proteína de ligação compreendendo cadeias polipeptídicas adicionais que se associam com as cadeias polipeptídicas de um pseudoFab para formar domínios de ligação adicionais. Estes polipeptídeos de ligação contendo pseudo Fab são adicionalmente fundidos a um domínio de heterodimerização Fc para formar uma metade do anticorpo em forma de Y convencional.

[292] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação a antígeno compreende seis cadeias polipeptídicas que formam quatro sítios de ligação a antígeno, em que (a) o primeiro e o segundo polipeptídeos compreendem uma estrutura representada pela fórmula: VLa-L1-VLX [I] e [II]

b) o terceiro e o quarto polipeptídeos compreendem uma estrutura representada pela fórmula: VLb-CL [III] e [IV] (c) o quinto polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VHa-L2-VHX-L3-VHb-CH1-FC1 [V] (d) o sexto polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VHa-L2-VHX-L3-VHb-CH1-FC2 [VI] em que: VLa é um primeiro domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VLb é um segundo domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VHa é um primeiro domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; VHb é um segundo domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; VLX é um domínio variável de cadeia leve nocaute estabilizado; VHX é um domínio variável de cadeia pesada nocaute estabilizado; CL é um domínio constante de cadeia leve de imunoglobulina; CH1 é um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina; FC1 e FC2 são domínios Fc compreendendo uma região de dobradiça de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2 e CH3; e L1, L2 e L3 são ligantes de aminoácidos,

em que (1) o primeiro domínio VL (VLa) é emparelhado com o primeiro domínio VH (VHa) para formar um primeiro sítio de ligação a antígeno funcional que liga o antígeno alvo A; (2) o segundo domínio VL (VLb) é emparelhado com o segundo domínio VH (VHb) para formar um segundo sítio de ligação a antígeno funcional que liga o antígeno alvo B; (3) o domínio VL nocaute estabilizado (VLX) é emparelhado com o domínio VH nocaute estabilizado (VHX) para formar um domínio nocaute estabilizado por dissulfeto (dsKO); em que os domínios dsKO compreendem (i) uma ou mais mutações de inativação que abolem sua ligação a um antígeno alvo; e (ii) uma ou mais ligações dissulfeto intercadeia construídas geneticamente.

[293] Estas moléculas também podem ser referidas como um "Tandem-(Fv-pseudo Fab x Fv-Fab)" (vide Figura 10B).

[294] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação a antígeno compreende seis cadeias polipeptídicas que formam quatro sítios de ligação a antígeno, em que (a) o primeiro e o segundo polipeptídeos compreendem uma estrutura representada pela fórmula: V La-L1-VLX [I] e [II] (b) o terceiro e o quarto polipeptídeos compreendem uma estrutura representada pela fórmula: VLb-CL [III] e [IV] (c) o quinto polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VHb-CH1-L3-VHa-L2-VHX-FC1 [V]

(d) o sexto polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula:

VHb-CH1-L3-VHa-L2-VHX-FC2 [VI]

em que: VLa é um primeiro domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VLb é um segundo domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VHa é um primeiro domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; VHb é um segundo domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; VLX é um domínio variável de cadeia leve nocaute estabilizado; VHX é um domínio variável de cadeia pesada nocaute estabilizado; CL é um domínio constante de cadeia leve de imunoglobulina; CH1 é um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina; FC1 e FC2 são domínios Fc compreendendo uma região de dobradiça de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2 e CH3; e L1, L2 e L3 são ligantes de aminoácidos, em que (1) o primeiro domínio VL (VLa) é emparelhado com o primeiro domínio VH (VHa) para formar um primeiro sítio de ligação a antígeno funcional que liga o antígeno alvo A; (2) o segundo domínio VL (VLb) é emparelhado com o segundo domínio VH (VHb) para formar um segundo sítio de ligação a antígeno funcional que liga o antígeno alvo B; (3) o domínio VL nocaute estabilizado (VLX) é emparelhado com o domínio VH nocaute estabilizado (VHX) para formar um domínio nocaute estabilizado por dissulfeto (dsKO); em que os domínios dsKO compreendem (i) uma ou mais mutações de inativação que abolem sua ligação a um antígeno alvo; e (ii) uma ou mais ligações dissulfeto intercadeia construídas geneticamente.

[295] Estas moléculas também podem ser referidas como um "Tandem-(Fv-Fab x Fv-pseudoFab-IgG) (vide Figura 10A). (b) Moléculas tetraespecíficas assimétricas

[296] A dimerização de polipeptídeos de ligação em que apenas um contém pseudoFab leva a construtos assimétricos com especificidades adicionais. Estes polipeptídeos de ligação contendo pseudoFab são ainda fundidos a um domínio de heterodimerização Fc para formar uma metade do anticorpo IgG em forma de Y de comprimento total convencional.

[297] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação multiespecífica compreende quatro cadeias polipeptídicas que formam pelo menos dois sítios de ligação a antígeno, em que (a) um primeiro polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VLa-L1-VLX [I] (b) um segundo polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VHa-L2-VHX-FC1 [II] (c) um terceiro polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula:

VLb-CL [III] (d) um quarto polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VHb-CH1-FC2 [IV] em que: VLa é um primeiro domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VLb é um segundo domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VHa é um primeiro domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; VHb é um segundo domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; VLX é um domínio variável de cadeia leve nocaute estabilizado; VHX é um domínio variável de cadeia pesada nocaute estabilizado; CL é um domínio constante de cadeia leve de imunoglobulina; CH1 é um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina CH1; FC1 e FC2 são domínios Fc compreendendo uma região de dobradiça de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2 e CH3; e L1 e L2 são ligantes de aminoácidos, que podem ser independentemente iguais ou diferentes, em que o primeiro domínio VL (VLa) é emparelhado com um primeiro domínio VH (VHa) para formar um primeiro sítio de ligação a antígeno funcional que liga o antígeno alvo A;

o segundo domínio VL (VLb) é emparelhado com um segundo domínio VH (VHb) para formar um segundo sítio de ligação de antígeno funcional que liga o antígeno alvo B; o domínio VL nocaute estabilizado (VLX) é emparelhado com o domínio VH nocaute estabilizado (VHX) para formar um domínio nocaute estabilizado por dissulfeto (dsKO); em que o domínio dsKO compreende (i) uma ou mais mutações de inativação que abolem sua ligação a um antígeno alvo; e (ii) uma ou mais ligações dissulfeto intercadeia construídas geneticamente.

[298] Estas moléculas também podem ser referidas como moléculas IgG biespecíficas diméricas (Fv-pseudoFab) x (Fv-Fab)-Fc (vide Figura 2 e 7).

[299] Em outra modalidade, o polipeptídeo de ligação compreende uma proteína de ligação contendo pseudo Fab compreendendo cadeias polipeptídicas adicionais que se associam com as cadeias polipeptídicas de um pseudoFab para formar domínios de ligação adicionais. Estes polipeptídeos de ligação contendo pseudoFab são ainda fundidos a um domínio de heterodimerização Fc para formar uma metade de um anticorpo em forma de Y convencional. A dimerização de tais moléculas leva a construções com especificidades adicionais.

[300] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação a antígeno compreende seis cadeias polipeptídicas que formam quatro sítios de ligação a antígeno, em que (a) o primeiro e o segundo polipeptídeos compreendem uma estrutura representada pela fórmula: VLa-L1-VLX [I] e [II] (b) o terceiro e o quarto polipeptídeos compreendem uma estrutura representada pela fórmula: VLb-CL [III] e [IV]

(c) o quinto polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula:

VHa-L2-VHX-L3-VHa-L4-VHX-FC1 [V]

(d) o sexto polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula:

VHb-CH1-L5-VHb-CH1-FC2 [VI]

em que: VLa é um primeiro domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VLb é um segundo domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VHa é um primeiro domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; VHb é um segundo domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; VLX é um domínio variável de cadeia leve nocaute estabilizado; VHX é um domínio variável de cadeia pesada nocaute estabilizado; CL é um domínio constante de cadeia leve de imunoglobulina; CH1 é um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina; FC1 e FC2 são domínios Fc compreendendo uma região de dobradiça de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2 e CH3; e L1, L2, L3, L4 e L5 são ligantes de aminoácidos, em que

(1) o primeiro domínio VL (VLa) é emparelhado com o primeiro domínio VH (VHa) para formar um primeiro sítio de ligação a antígeno funcional que liga o antígeno alvo A; (2) o segundo domínio VL (VLb) é emparelhado com o segundo domínio VH (VHb) para formar um segundo sítio de ligação a antígeno funcional que liga o antígeno alvo B; (3) o domínio VL nocaute estabilizado (VLX) é emparelhado com o domínio VH nocaute estabilizado (VHX) para formar um domínio nocaute estabilizado por dissulfeto (dsKO); em que os domínios dsKO compreendem (i) uma ou mais mutações de inativação que abolem sua ligação a um antígeno alvo; (ii) uma ou mais ligações dissulfeto intercadeia construídas geneticamente.

[301] O domínio de heterodimerização C-terminal pode ser um domínio de heterodimerização Fc-Knob-into-hole convencional, um domínio de heterodimerização Fc-RF convencional ou combinações dos mesmos. Essas moléculas também podem ser referidas como "Fv- pseudoFab ([HC] -(Fv-pseudoFab)) x ((Fv-Fab) [HC] -(Fv-Fab)))- Fc" (vide Figura 11).

[302] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação a antígeno compreende quatro cadeias polipeptídicas que formam três sítios de ligação a antígeno, em que: (a) o primeiro polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VLa-L1-VLX [I] (b) o segundo polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VHa-L2-VHX- FC1 [II]

(c) o terceiro polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VLb-L3-VLc-L4-CL [III] (d) o quarto polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VHc-L5-VHb-L6-CH1-FC2 [IV] em que: VLa é um primeiro domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VLb é um segundo domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VLc é um terceiro domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VHa é um primeiro domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; VHb é um segundo domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; VHc é um terceiro domínio variável da cadeia pesada de imunoglobulina; CL é um domínio constante de cadeia leve de imunoglobulina; CH1 é um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina CH1; VLX é um domínio variável de cadeia leve nocaute estabilizado; VHX é um domínio variável de cadeia pesada nocaute estabilizado; FC1 e FC2 são domínios Fc compreendendo uma região de dobradiça de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2 e CH3; e

L1, L2, L3, L4, L5 e L6 são ligantes de aminoácidos, em que (1) o primeiro domínio VL (VLa) é emparelhado com o primeiro domínio VH (VHa) para formar um primeiro sítio de ligação a antígeno funcional que liga o antígeno alvo A; (2) o segundo domínio VL (VLb) é emparelhado com o segundo domínio VH (VHb) para formar um segundo sítio de ligação a antígeno funcional que liga o antígeno alvo B; (3) o terceiro domínio VL (VLc) é emparelhado com o terceiro domínio VH (VHc) para formar um terceiro sítio de ligação de antígeno funcional que liga o antígeno alvo C; (4) o polipeptídeo de fórmula III e o polipeptídeo de fórmula IV formam um par cruzado de cadeia leve-cadeia pesada (CODV); (5) o domínio VL nocaute estabilizado (VLX) é emparelhado com o domínio VH nocaute estabilizado (VHX) para formar um domínio nocaute estabilizado por dissulfeto (dsKO2); em que o domínio dsKO compreende (i) uma ou mais mutações de inativação que abolem sua ligação a um antígeno alvo; e (ii) uma ou mais ligações dissulfeto intercadeia construídas geneticamente.

[303] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação a antígeno compreende quatro cadeias polipeptídicas que formam três sítios de ligação a antígeno, em que: (a) o primeiro polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VLa-L1-VLX [I] (b) o segundo polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula:

VHa-L2-VHX- FC1 [II] (c) o terceiro polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula:

VLb-L3-VLc-L4-CL [III]

(d) o quarto polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula:

VHc-L5-VHb-L6-CH1-FC2 [IV]

em que: VLa é um primeiro domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VLb é um segundo domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VLc é um terceiro domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VHa é um primeiro domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; VHb é um segundo domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; VHc é um terceiro domínio variável da cadeia pesada de imunoglobulina; CL é um domínio constante de cadeia leve de imunoglobulina; CH1 é um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina CH1; VLX é um domínio variável de cadeia leve nocaute estabilizado; VHX é um domínio variável de cadeia pesada nocaute estabilizado;

FC1 e FC2 são domínios Fc compreendendo uma região de dobradiça de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2 e CH3; e L1, L2, L3, L4, L5 e L6 são ligantes de aminoácidos, em que (a) o primeiro domínio VL (VLa) é emparelhado com o primeiro domínio VH (VHa) para formar um primeiro sítio de ligação a antígeno funcional que liga o antígeno alvo A; (2) o segundo domínio VL (VLb) é emparelhado com o segundo domínio VH (VHb) para formar um segundo sítio de ligação a antígeno funcional que liga o antígeno alvo B; (3) o terceiro domínio VL (VLc) é emparelhado com o terceiro domínio VH (VHc) para formar um terceiro sítio de ligação de antígeno funcional que liga o antígeno alvo C; (4) o polipeptídeo de fórmula III e o polipeptídeo de fórmula IV formam um par cruzado de cadeia leve-cadeia pesada (CODV); (5) o domínio VL nocaute estabilizado (VLX) é emparelhado com o domínio VH nocaute estabilizado (VHX) para formar um domínio nocaute estabilizado por dissulfeto (dsKO2); em que o domínio dsKO compreende (i) uma ou mais mutações de inativação que abolem sua ligação a um antígeno alvo de uma molécula Fab de referência; e (ii) uma ou mais ligações dissulfeto intercadeia construídas geneticamente.

[304] Essas moléculas também podem ser referidas como "(CODV-Fab) x (pseudoFab)-Fc" (vide Figura 13).

[305] Em modalidades particulares do primeiro e segundo aspectos da presente invenção, a proteína de ligação compreende um par de cadeia leve e cadeia pesada selecionados do grupo que consiste em SEQ ID Nº: 6 e 7; SEQ ID Nº: 8 e 9; SEQ ID Nº: 10 e 11; SEQ ID Nº: 12 e 13; SEQ ID Nº: 14 e 15; SEQ ID Nº: 16 e 17; SEQ ID Nº: 18 e 19; SEQ ID Nº: 20 e 21; SEQ ID Nº: 22 e 23; SEQ ID Nº: 24 e 25; SEQ ID Nº: 26 e 27; SEQ ID Nº: 28 e 29; SEQ ID Nº: 30 e 31; SEQ ID Nº: 32 e 33; SEQ ID Nº: 34 e 35; SEQ ID Nº: 36 e 37; SEQ ID Nº: 38 e 39; SEQ ID Nº: 40 e 41; SEQ ID Nº: 42 e 43; SEQ ID Nº: 44 e 45; SEQ ID Nº: 46 e 47 e SEQ ID Nº: 48 e 49; SEQ ID Nº: 50 e 51; SEQ ID Nº: 52 e 53 e SEQ ID Nº: 54 e 55; SEQ ID Nº: 56 e 57 e SEQ ID Nº: 58 e 59; SEQ ID Nº: 60 e 61 e SEQ ID Nº: 62 e 63; SEQ ID Nº: 64 e 65 e SEQ ID Nº: 66 e 67; SEQ ID Nº: 68 e 69 e SEQ ID Nº: 70 e 71; SEQ ID Nº: 72 e 73; e SEQ ID Nº: 74 e 75.

[306] Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo CL são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em kappa de cadeia leve de região constante (CLк) e lambda de cadeia leve de região constante (CLλ).

[307] Em algumas modalidades, o HD1 e HD2 compreendem, cada um, uma região Fc e suas variantes modificadas pelo efetor; uma parte Fc de heterodimerização, em particular uma variante de knob-into- hole (KIH) de uma parte Fc e suas variantes modificadas pelo efetor; um ou mais domínios CH2, por exemplo, de IgG, IgE ou IgM, um ou mais domínios CH3, por exemplo, de IgG, IgA ou IgD, ou um ou mais domínios CH4, por exemplo, de IgE ou IgM.

[308] Em algumas modalidades, um dos domínios Fc compreende um primeiro domínio CH3 compreendendo uma ou ambas as mutações S354C e T366W, e o outro domínio Fc compreende um segundo domínio CH3 compreendendo um ou ambos de Mutações Y349C, T366S, L368A e Y407V.

[309] Em uma modalidade, a região Fc de HD1 ou HD2 compreende uma ou mais mutações de aminoácidos que levam à remoção de um sítio de reconhecimento seletivo para um segundo reagente de afinidade, por exemplo, selecionado a partir do grupo que consiste em H435R ou Y436F, ou levam à introdução um sítio de reconhecimento seletivo para um terceiro reagente de afinidade. Tabela 2: Sequências de proteínas de ligação selecionadas ID Sequência Comentário: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSA Sequência de cadeia leve SFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGT variável de Trastuzumab

KVEIK SEQ ID Nº:1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVA Sequência de cadeia RIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRW pesada variável GGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS deTrastuzumab SEQ ID Nº:2 Var. 1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTAIHWVRQAPGKGLEWVA Sequência de cadeia EIYPTNGYTEYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWG pesada variável GDGFAAMDYWGQGTLVTVSS detrastuzumab variant 1. SEQ ID Nº: 3 Var. 2 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVAE Sequência de cadeia IYPTNGYTEYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWG pesada variável GDGFYAMDYWGQGTLVTVSS detrastuzumab variant 2. SEQ ID Nº: 4 Var. 3 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTAIHWVRQAPGKGLEWVA Sequência de cadeia RIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRW pesada variável GGDGFAAMDYWGQGTLVTVSS detrastuzumab variant 3. SEQ ID Nº: 5 1 DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYGQSYMHWYQQKAGQPPK anti-IL13-VL-G4S-anti- LLIYLASNLESGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVQAEDAATYYCQQNAEDS Her2-(Trastuzumab- RTFGGGTKLEIKGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAV Q100C)-VL

AWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFA TYYCQQHYTTPPTFGCGTKVEIK (SEQ ID Nº: 6) EVQLKESGPGLVAPGGSLSITCTVSGFSLTDSSINWVRQPPGKGLEWLG anti-IL13-VH-G4S-anti- MIWGDGRIDYADALKSRLSISKDSSKSQVFLEMTSLRTDDTATYYCARDG Her2-(Trastuzumab- YFPYAMDFWGQGTSVTVSSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA G44C)-VH-Fc-huIgG1

SGFNIKDTYIHWVRQAPGKCLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTS KNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSDKT (SEQ ID Nº: 7)

HTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS

CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 2 DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYGQSYMHWYQQKAGQPPK anti-IL13-VL-(G4S)2-anti- LLIYLASNLESGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVQAEDAATYYCQQNAEDS Her2-(Trastuzumab- RTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQD Q100C)-VL

VNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQ PEDFATYYCQQHYTTPPTFGCGTKVEIK (SEQ ID Nº: 8)

EVQLKESGPGLVAPGGSLSITCTVSGFSLTDSSINWVRQPPGKGLEWLG anti-IL13-VH-(G4S)2-anti- MIWGDGRIDYADALKSRLSISKDSSKSQVFLEMTSLRTDDTATYYCARDG Her2-(Trastuzumab- YFPYAMDFWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSL G44C)-VH-Fc-huIgG1

RLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKCLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFT ISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTV (SEQ ID Nº: 9)

SSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKE YKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ

GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 3 DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYGQSYMHWYQQKAGQPPK anti-IL13-VL3-IGKC

LLIYLASNLESGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVQAEDAATYYCQQNAEDS RTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV (SEQ ID Nº: 10)

QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEV

THQGLSSPVTKSFNRGEC EVQLKESGPGLVAPGGSLSITCTVSGFSLTDSSINWVRQPPGKGLEWLG anti-IL13-VH2-IGHG1

MIWGDGRIDYADALKSRLSISKDSSKSQVFLEMTSLRTDDTATYYCARDG YFPYAMDFWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD (SEQ ID Nº: 11)

YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYT LPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS

DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 4 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYA anti-TNFalpha-VL-G4S- ASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQ anti-Her2-(Trastuzumab- GTKVEIKGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQ Q100C)-VL

KPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ HYTTPPTFGCGTKVEIK (SEQ ID Nº: 12) EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWV anti-TNFalpha-VH-G4S- SAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK anti-Her2-(Trastuzumab- VSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLS G44C)-VH-Fc-huIgG1

CAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKCLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISA DTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID Nº: 13)

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN

VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 5 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYA anti-TNFalpha-VL- ASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQ (G4S)2-anti-Her2- GTKVEIKGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAV (Trastuzumab-Q100C)-VL

AWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFA TYYCQQHYTTPPTFGCGTKVEIK (SEQ ID Nº: 14) EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWV anti-TNFalpha-VH- SAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK (G4S)2-anti-Her2- VSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPG (Trastuzumab-G44C)-VH- GSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKCLEWVARIYPTNGYTRYADSVK Fc-huIgG1

GRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGT LVTVSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD (SEQ ID Nº: 15)

VSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSL TCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR

WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 6 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYA anti-TNFa-VL-huIGKC

ASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQ GTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD (SEQ ID Nº: 16)

NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGL SSPVTKSFNRGEC

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWV anti-TNFa-VH-huIgG1

SAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK VSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC (SEQ ID Nº: 17)

LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGT QTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQ VYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL

DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 7 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYYT anti-IL6R-VL-G4S-anti- SRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPYTFGQG Her2-(Trastuzumab- TKVEIKGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQK Q100C)-VL

PGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQH YTTPPTFGCGTKVEIK (SEQ ID Nº: 18) QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGYSITSDHAWSWVRQPPGRGLEWI anti-IL6R-VH-G4S-anti- GYISYSGITTYNPSLKSRVTMLRDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARSL Her2-(Trastuzumab- ARTTAMDYWGQGSLVTVSSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA G44C)-VH-Fc-huIgG1

SGFNIKDTYIHWVRQAPGKCLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTS KNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSDKT (SEQ ID Nº: 19)

CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 8 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYYT anti-IL6R-VL-(G4S)2-anti- SRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPYTFGQG Her2-(Trastuzumab- TKVEIKGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVA Q100C)-VL

WYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFAT YYCQQHYTTPPTFGCGTKVEIK (SEQ ID Nº: 20) QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGYSITSDHAWSWVRQPPGRGLEWI anti-IL6R-VH-(G4S)2-anti- GYISYSGITTYNPSLKSRVTMLRDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARSL Her2-(Trastuzumab- ARTTAMDYWGQGSLVTVSSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSL G44C)-VH-Fc-huIgG1

RLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKCLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFT ISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTV (SEQ ID Nº: 21)

GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 9 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYYT anti-IL6R-VL-huIGKC

SRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPYTFGQG TKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDN (SEQ ID Nº: 22)

ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLS

SPVTKSFNRGEC QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGYSITSDHAWSWVRQPPGRGLEWI anti-IL6R-VH-huIgG1

GYISYSGITTYNPSLKSRVTMLRDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARSL ARTTAMDYWGQGSLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK (SEQ ID Nº: 23)

DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQT YICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS

DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 10 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIY anti-CTLA4-VL-G4S-anti- GAFSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFG Her2-(Trastuzumab- QGTKVEIKGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQ Q100C)-VL

QKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQ QHYTTPPTFGCGTKVEIK (SEQ ID Nº: 24)

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWV anti-CTLA4-VH-G4S-anti- TFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCART Her2-(Trastuzumab- GWLGPFDYWGQGTLVTVSSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA G44C)-VH-Fc-huIgG1

SGFNIKDTYIHWVRQAPGKCLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTS KNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSDKT (SEQ ID Nº: 25)

CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 11 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIY anti-CTLA4-VL-(G4S)2- GAFSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFG anti-Her2-(Trastuzumab- QGTKVEIKGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTA Q100C)-VL

VAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDF ATYYCQQHYTTPPTFGCGTKVEIK (SEQ ID Nº: 26) QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWV anti-CTLA4-VH-(G4S)2- TFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCART anti-Her2-(Trastuzumab- GWLGPFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSL G44C)-VH-Fc-huIgG1

RLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKCLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFT ISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTV (SEQ ID Nº: 27)

GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 12 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIY anti-CTLA4-VL-huIGKC

GAFSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFG QGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKV (SEQ ID Nº: 28)

DNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQG

LSSPVTKSFNRGEC QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWV anti-CTLA4-VH –huIgG1

TFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCART GWLGPFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK (SEQ ID Nº: 29

DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 13 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYD anti-PD1-VL-G4S-anti- ASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQ Her2-(Trastuzumab- GTKVEIKGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQ Q100C)-VL

KPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ HYTTPPTFGCGTKVEIK (SEQ ID Nº: 30) QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWV anti-PD1-VH-G4S-anti- AVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCAT Her2-(Trastuzumab- NDDYWGQGTLVTVSSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNI G44C)-VH-Fc-huIgG1

KDTYIHWVRQAPGKCLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAY LQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSDKTHTCPP (SEQ ID Nº: 31)

CPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH

EALHNHYTQKSLSLSPG 14 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYD anti-PD1-VL-(G4S)2-anti- ASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQ Her2-(Trastuzumab- GTKVEIKGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAV Q100C)-VL

AWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFA TYYCQQHYTTPPTFGCGTKVEIK (SEQ ID Nº: 32)

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWV anti-PD1-VH-(G4S)2-anti- AVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCAT Her2-(Trastuzumab- NDDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCA G44C)-VH-Fc-huIgG1

ASGFNIKDTYIHWVRQAPGKCLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADT SKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSDK (SEQ ID Nº: 33)

THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS

CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 15 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYD anti-huPD-1-VL-huIGKC

ASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQ GTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD (SEQ ID Nº: 34)

NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGL

SSPVTKSFNRGEC QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWV anti-huPD-1-VH-huIgG1

AVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCAT NDDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE (SEQ ID Nº: 35)

PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVN HKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF

FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 16 DIQMTQSPASLSVSVGDTITLTCHASQNIDVWLSWFQQKPGNIPKLLIYKA anti-IL4-VL-G4S-anti- SNLHTGVPSRFSGSGSGTGFTLTISSLQPEDIATYYCQQAHSYPFTFGGG Her2-(Trastuzumab- TKLEIKGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQK Q100C)-VL

PGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQH YTTPPTFGCGTKVEIK (SEQ ID Nº: 36) QVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTSYWIHWIKQRPGQGLEWIG anti-IL4-VH-G4S-anti- MIDPSDGETRLNQRFQGRATLTVDESTSTAYMQLRSPTSEDSAVYYCTRL Her2-(Trastuzumab- KEYGNYDSFYFDVWGAGTLVTVSSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLR G44C)-VH-Fc-huIgG1

LSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKCLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTI SADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTV (SEQ ID Nº: 37)

GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 17 DIQMTQSPASLSVSVGDTITLTCHASQNIDVWLSWFQQKPGNIPKLLIYKA anti-IL4-VL-(G4S)2-anti- SNLHTGVPSRFSGSGSGTGFTLTISSLQPEDIATYYCQQAHSYPFTFGGG Her2-(Trastuzumab- TKLEIKGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVA Q100C)-VL

WYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFAT YYCQQHYTTPPTFGCGTKVEIK (SEQ ID Nº: 38) QVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTSYWIHWIKQRPGQGLEWIG anti-IL4-VH-(G4S)2-anti- MIDPSDGETRLNQRFQGRATLTVDESTSTAYMQLRSPTSEDSAVYYCTRL Her2-(Trastuzumab- KEYGNYDSFYFDVWGAGTLVTVSSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQP G44C)-VH-Fc-huIgG1

GGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKCLEWVARIYPTNGYTRYADSV KGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQG (SEQ ID Nº: 39)

TLVTVSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS

RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 18 DIQMTQSPASLSVSVGDTITLTCHASQNIDVWLSWFQQKPGNIPKLLIYKA anti-IL4-VL1-IGKC

SNLHTGVPSRFSGSGSGTGFTLTISSLQPEDIATYYCQQAHSYPFTFGGG TKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDN (SEQ ID Nº: 40)

ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC

QVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTSYWIHWIKQRPGQGLEWIG anti-IL4-VH1-IgG1

MIDPSDGETRLNQRFQGRATLTVDESTSTAYMQLRSPTSEDSAVYYCTRL KEYGNYDSFYFDVWGAGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALG (SEQ ID Nº: 41)

CLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSL GTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE PQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP

G 19 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYD anti-PD1-VL-(G4S)2-anti- ASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQ Her2-(Trastuzumab- GTKVEIKGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAV Q100C)-VL

AWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFA TYYCQQHYTTPPTFGCGTKVEIK (SEQ ID Nº: 42) QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWV anti-PD1-VH-(G4S)2-anti- AVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCAT Her2-(Trastuzumab- NDDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCA G44C-Var2)-VH-Fc- ASGFNIKDTYIHWVRQAPGKCLEWVAEIYPTNGYTEYADSVKGRFTISADT huIgG1

SKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSDK THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV (SEQ ID Nº: 43)

KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS

CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 20 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIY anti-CTLA4-VL-(G4S)2- GAFSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFG anti-Her2-(Trastuzumab- QGTKVEIKGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTA Q100C)-VL

VAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDF ATYYCQQHYTTPPTFGCGTKVEIK (SEQ ID Nº: 44) QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWV anti-CTLA4-VH-(G4S)2- TFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCART anti-Her2-(Trastuzumab- GWLGPFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSL G44C-Var2)-VH-Fc- RLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKCLEWVAEIYPTNGYTEYADSVKGRFT huIgG1

ISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTV SSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE (SEQ ID Nº: 45)

DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKE YKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ

GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 21 DIQMTQSPASLSVSVGDTITLTCHASQNIDVWLSWFQQKPGNIPKLLIYKA anti-IL4-VL-(G4S)2-anti- SNLHTGVPSRFSGSGSGTGFTLTISSLQPEDIATYYCQQAHSYPFTFGGG Her2-(Trastuzumab- TKLEIKGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVA Q100C)-VL

WYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFAT YYCQQHYTTPPTFGCGTKVEIK (SEQ ID Nº: 46) QVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTSYWIHWIKQRPGQGLEWIG anti-IL4-VH-(G4S)2-anti- MIDPSDGETRLNQRFQGRATLTVDESTSTAYMQLRSPTSEDSAVYYCTRL Her2-(Trastuzumab- KEYGNYDSFYFDVWGAGTLVTVSSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQP G44C-Var2)-VH-Fc- GGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKCLEWVAEIYPTNGYTEYADSVK huIgG1

GRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGT LVTVSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD (SEQ ID Nº: 47)

WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYGQSYMHWYQQKAGQPPK anti-IL13-VL-(G4S)2-anti- LLIYLASNLESGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVQAEDAATYYCQQNAEDS Her2-(Trastuzumab- 22 RTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQD Q100C)-VL

VNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQ PEDFATYYCQQHYTTPPTFGCGTKVEIK (SEQ ID Nº: 48)

EVQLKESGPGLVAPGGSLSITCTVSGFSLTDSSINWVRQPPGKGLEWLG anti-IL13-VH-(G4S)2-anti- MIWGDGRIDYADALKSRLSISKDSSKSQVFLEMTSLRTDDTATYYCARDG Her2-(Trastuzumab- YFPYAMDFWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSL G44C-Var2)-VH-DKTHT- RLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKCLEWVAEIYPTNGYTEYADSVKGRFT His6

ISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTV SSDKTHTHHHHHH (SEQ ID Nº: 49) 23 DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYGQSYMHWYQQKAGQPPK anti-IL13-VL-(G4S)2-anti- LLIYLASNLESGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVQAEDAATYYCQQNAEDS Her2-(Trastuzumab- RTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQD Q100C)-VL

VNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQ PEDFATYYCQQHYTTPPTFGCGTKVEIK (SEQ ID Nº: 50) EVQLKESGPGLVAPGGSLSITCTVSGFSLTDSSINWVRQPPGKGLEWLG anti-IL13-VH-(G4S)2-anti- MIWGDGRIDYADALKSRLSISKDSSKSQVFLEMTSLRTDDTATYYCARDG Her2-(Trastuzumab- YFPYAMDFWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSL VH_Var1-G44C)-VH-Fc- RLSCAASGFNIKDTAIHWVRQAPGKCLEWVAEIYPTNGYTEYADSVKGRFT huIgG1

ISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFAAMDYWGQGTLVTV SSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE (SEQ ID Nº: 51)

GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 24 DIQMTQSPASLSVSVGDTITLTCHASQNIDVWLSWFQQKPGNIPKLLIYKA anti-IL4-VL-(G4S)2-anti- SNLHTGVPSRFSGSGSGTGFTLTISSLQPEDIATYYCQQAHSYPFTFGGG Her2-(Trastuzumab- TKLEIKGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVA Q100C)-VL

WYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFAT YYCQQHYTTPPTFGCGTKVEIK (SEQ ID Nº: 52) QVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTSYWIHWIKQRPGQGLEWIG anti-IL4-VH-(G4S)2-anti- MIDPSDGETRLNQRFQGRATLTVDESTSTAYMQLRSPTSEDSAVYYCTRL Her2-(Trastuzumab- KEYGNYDSFYFDVWGAGTLVTVSSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQP G44C-Var2)-VH-Fc- GGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKCLEWVAEIYPTNGYTEYADSVK huIgG1(knob)

GRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGT LVTVSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD (SEQ ID Nº: 53)

VSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSL WCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS

RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYD anti-PD1-huIGKC

ASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQ GTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD (SEQ ID Nº: 54)

NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGL

SSPVTKSFNRGEC QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWV anti-PD1-VH- AVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCAT huIgG1(hole-RF)

NDDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVN (SEQ ID Nº: 55)

HKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPS RDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF

FLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPG 25 DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYGQSYMHWYQQKAGQPPK anti-IL13-VL -(G4S)2-anti- LLIYLASNLESGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVQAEDAATYYCQQNAEDS Her2-(Trastuzumab- RTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQD Q100C)-VL

VNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQ PEDFATYYCQQHYTTPPTFGCGTKVEIK (SEQ ID Nº: 56)

EVQLKESGPGLVAPGGSLSITCTVSGFSLTDSSINWVRQPPGKGLEWLG anti-IL13-VH -(G4S)2- MIWGDGRIDYADALKSRLSISKDSSKSQVFLEMTSLRTDDTATYYCARDG anti-Her2-(Trastuzumab- YFPYAMDFWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSL G44C-Var2)-VH-Fc- RLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKCLEWVAEIYPTNGYTEYADSVKGRFT huIgG1(knob)

ISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTV SSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE (SEQ ID Nº: 57)

DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKE YKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ

GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYD anti-PD1-VL-huIGKC

ASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQ GTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD (SEQ ID Nº: 58)

NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGL

NDDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVN (SEQ ID Nº: 59)

FLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPG 26 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYD anti-PD1-VL-(G4S)2-anti- ASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQ Her2-(Trastuzumab- GTKVEIKGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAV Q100C)-VL

AWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFA TYYCQQHYTTPPTFGCGTKVEIK (SEQ ID Nº: 60) QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWV anti-PD1-VH- (G4S)2-anti- AVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCAT Her2-(Trastuzumab- NDDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCA G44C-Var2)-VH-Fc- ASGFNIKDTYIHWVRQAPGKCLEWVAEIYPTNGYTEYADSVKGRFTISADT huIgG1(knob)

SKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSDK THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV (SEQ ID Nº: 61)

KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVF

SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYGQSYMHWYQQKAGQPPK anti-IL13-VL - huIGKC

LLIYLASNLESGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVQAEDAATYYCQQNAEDS RTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV (SEQ ID Nº: 62)

QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEV

THQGLSSPVTKSFNRGEC EVQLKESGPGLVAPGGSLSITCTVSGFSLTDSSINWVRQPPGKGLEWLG anti-IL13)-VH - MIWGDGRIDYADALKSRLSISKDSSKSQVFLEMTSLRTDDTATYYCARDG huIgG1(hole-RF)

YFPYAMDFWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI (SEQ ID Nº: 63)

CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCT LPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS

DGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPG 27 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIY anti-CTLA4-VL -(G4S)2- GAFSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFG anti-Her2-(Trastuzumab- QGTKVEIKGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTA Q100C)-VL

VAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDF ATYYCQQHYTTPPTFGCGTKVEIK (SEQ ID Nº: 64)

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWV anti-CTLA4-VH-(G4S)2- TFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCART anti-Her2-(Trastuzumab- GWLGPFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSL G44C-Var2)-VH-Fc- RLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKCLEWVAEIYPTNGYTEYADSVKGRFT huIgG1(knob)

ISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTV SSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE (SEQ ID Nº: 65)

ASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQ GTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD (SEQ ID Nº: 66)

NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGL

NDDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVN (SEQ ID Nº: 67)

FLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPG 28 DIQMTQSPASLSVSVGDTITLTCHASQNIDVWLSWFQQKPGNIPKLLIYKA anti-IL4-VL-(G4S)2-anti- SNLHTGVPSRFSGSGSGTGFTLTISSLQPEDIATYYCQQAHSYPFTFGGG Her2-(Trastuzumab- TKLEIKGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVA Q100C)-VL

WYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFAT YYCQQHYTTPPTFGCGTKVEIK (SEQ ID Nº: 68) QVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTSYWIHWIKQRPGQGLEWIG anti-IL4)-VH-(G4S)2-anti- MIDPSDGETRLNQRFQGRATLTVDESTSTAYMQLRSPTSEDSAVYYCTRL Her2-(Trastuzumab- KEYGNYDSFYFDVWGAGTLVTVSSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQP G44C-Var2)-VH-Fc- GGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKCLEWVAEIYPTNGYTEYADSVK huIgG1(knob)

GRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGT LVTVSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD (SEQ ID Nº: 69)

RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYGQSYMHWYQQKAGQPPK anti-IL13-VL - huIGKC

LLIYLASNLESGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVQAEDAATYYCQQNAEDS RTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV (SEQ ID Nº: 70)

QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEV

THQGLSSPVTKSFNRGEC EVQLKESGPGLVAPGGSLSITCTVSGFSLTDSSINWVRQPPGKGLEWLG anti-IL13-VH - MIWGDGRIDYADALKSRLSISKDSSKSQVFLEMTSLRTDDTATYYCARDG huIgG1(hole-RF)

YFPYAMDFWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI (SEQ ID Nº: 71)

DGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPG 29 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYD anti-PD1-VL-(G4S)2-anti- ASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQ Her2-(Trastuzumab- GTKVEIKGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAV Q100C)-VL

AWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFA TYYCQQHYTTPPTFGCGTKVEIK (SEQ ID Nº: 72)

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWV anti-PD1-VH- (G4S)2-anti- AVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCAT Her2-(Trastuzumab- NDDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCA G44C-Var2)-VH-Fc- ASGFNIKDTYIHWVRQAPGKCLEWVAEIYPTNGYTEYADSVKGRFTISADT huIgG1(knob)

SKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSDK THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV (SEQ ID Nº: 73)

SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYD anti-PD1-VL-huIGKC

ASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQ GTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD (SEQ ID Nº: 74)

NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGL

NDDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVN (SEQ ID Nº: 75)

FLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPG DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSA VLX ds Sequência de SFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGCGT cadeia leve variável de KVEIK Trastuzumab SEQ ID NO:76 dsTrasKO1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTAIHWVRQAPGKCLEWVAE VHX Sequência de cadeia IYPTNGYTEYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWG pesada variável GDGFAAMDYWGQGTLVTVSS detrastuzumab variant 1. SEQ ID Nº: 77 dsTrasKO2 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKCLEWVAE VHX Sequência de cadeia IYPTNGYTEYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWG pesada variável GDGFYAMDYWGQGTLVTVSS detrastuzumab variant 2. SEQ ID Nº: 78 dsTrasKO3 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTAIHWVRQAPGKCLEWVA VHX Sequência de cadeia RIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRW pesada variável GGDGFAAMDYWGQGTLVTVSS detrastuzumab variant 3. SEQ ID Nº: 79

Tabela 3: Sequência de anticorpos de engajamento de células T biespecíficos ID Sequência LC1 Sequência HC1 Sequência HC2 Sequência LC2 30 QIVLTQSPAIMS EVQLQQSGPELVKPGASVKMSC EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCK DFVMTQSPSSL

ASPGEKVTMTC KASGYKFTSYVMHWVKQKPGQG ASGYTFTDYYMKWVKQSHGKSLE TVTAGEKVTMS anti-TCR

SATSSVSYMH LEWIGYINPYNDVTKYNEKFKGKA WIGDIIPSNGATFYNQKFKGKATLT CKSSQSLLNSG α/β x anti-

WYQQKSGTSP TLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSA VDRSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYY NQKNYLTWYLQ CD123

KRWIYDTSKLA VHYCARGSYYDYDGFVYWGQGT CTRSHLLRASWFAYWGQGTLVTV KPGQPPKLLIY

SGVPARFSGS LVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKST SAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT WASTRESGVPD Tipo GSGTSYSLTIS SGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL RFTGSGSGTDF Selvagem SMEAEDAATYY NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT TLTISSVQAEDL

CQQWSSNPLT LSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHK VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKV AVYYCQNDYSY FGAGTKLELKR PSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPP DKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA PYTFGGGTKLEI

SEQ ID TVAAPSVFIFPP CPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT KRTVAAPSVFIF Nº: 80 SDEQLKSGTAS MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE PPSDEQLKSGT

VVCLLNNFYPR FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLT ASVVCLLNNFYP EAKVQWKVDN NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA REAKVQWKVD ALQSGNSQES KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP PIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSR NALQSGNSQES VTEQDSKDSTY REPQVYTLPPCRDELTKNQVSLW DELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVE VTEQDSKDSTY SLSSTLTLSKA CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS SLSSTLTLSKAD DYEKHKVYACE NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD FFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV YEKHKVYACEV VTHQGLSSPVT KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH MHEALHNRFTQKSLSLSPG THQGLSSPVTK

KSFNRGEC YTQKSLSLSPG SFNRGEC 31 QIVLTQSPAIMS EVQLQQSGPELVKPGASVKMSC EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCK DFVMTQSPSSL

ASPGEKVTMTC KASGYKFTSYVMHWVKQKPGQG ASGYTFTDYYMKWVKQSHGKSLE TVTAGEKVTMS

SATSSVSYMH LEWIGYINPYNDVTKYNEKFKGKA WIGDIIPSNGATFYNQKFKGKATLT CKSSQSLLNSG anti-TCR WYQQKSGTSP TLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSA VDRSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYY NQKNYLTWYLQ α/β x anti- KRWIYDTSKLA VHYCARGSYYDYDGFVYWGQGT CTRSHLLRASWFAYWGQGTLVTV KPGQPPKLLIY CD123 – SGVPARFSGS LVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKST SAGGGGSGGGGSEVQLVESGGG WASTRESGVPD dsTrasKO GSGTSYSLTIS SGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW LVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIH RFTGSGSGTDF 2 SMEAEDAATYY NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS WVRQAPGKCLEWVAEIYPTNGYT TLTISSVQAEDL

CQQWSSNPLT LSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHK EYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQ AVYYCQNDYSY FGAGTKLELKR PSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPP MNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFY PYTFGGGTKLEI SEQ ID

TVAAPSVFIFPP CPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTL AMDYWGQGTLVTVSSDKTHTCPP KGGGGSGGGG Nº: 81

SDEQLKSGTAS MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK CPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMI SDIQMTQSPSS VVCLLNNFYPR FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN LSASVGDRVTIT EAKVQWKVDN NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST CRASQDVNTAV ALQSGNSQES KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV AWYQQKPGKA VTEQDSKDSTY REPQVYTLPPCRDELTKNQVSLW SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV PKLLIYSASFLYS SLSSTLTLSKA CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN CTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGF GVPSRFSGSRS DYEKHKVYACE NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP GTDFTLTISSLQ VTHQGLSSPVT KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH VLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQ PEDFATYYCQQ KSFNRGEC YTQKSLSLSPG GNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSL HYTTPPTFGCG SPG TKVEIK

32 QIVLTQSPAIM EVQLQQSGPELVKPGASVKMS EVQLQQSGPELVKPGASVKMS DFVMTQSPSS

SASPGEKVTM CKASGYKFTSYVMHWVKQKPG CKASGYTFTDYYMKWVKQSHG LTVTAGEKVT

TCSATSSVSY QGLEWIGYINPYNDVTKYNEKF KSLEWIGDIIPSNGATFYNQKFK MSCKSSQSLL anti-TCR

MHWYQQKSG KGKATLTSDKSSSTAYMELSSL GKATLTVDRSSSTAYMHLNSLT NSGNQKNYLT α/β –

TSPKRWIYDT TSEDSAVHYCARGSYYDYDGF SEDSAVYYCTRSHLLRASWFA WYLQKPGQP dsTrasKO

SKLASGVPAR VYWGQGTLVTVSAGGGGSGG YWGQGTLVTVSAASTKGPSVF PKLLIYWASTR 2

FSGSGSGTSY GGSEVQLVESGGGLVQPGGSL PLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD ESGVPDRFTG x anti- SLTISSMEAED RLSCAASGFNIKDTYIHWVRQA YFPEPVTVSWNSGALTSGVHT SGSGTDFTLTI CD123 AATYYCQQWS PGKCLEWVAEIYPTNGYTEYAD FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSS SSVQAEDLAV

SNPLTFGAGT SVKGRFTISADTSKNTAYLQMN SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK YYCQNDYSYP KLELKGGGGS SLRAEDTAVYYCSRWGGDGFY KVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA YTFGGGTKLEI SEQ ID

GGGGSDIQMT AMDYWGQGTLVTVSSDKTHTC GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTP KRTVAAPSVFI Nº: 82

QSPSSLSASV PPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPK EVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY FPPSDEQLKS GDRVTITCRAS DTLMISRTPEVTCVVVDVSHED VDGVEVHNAKTKPREEQYNST GTASVVCLLN QDVNTAVAWY PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK NFYPREAKVQ QQKPGKAPKL REEQYNSTYRVVSVLTVLHQD CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP WKVDNALQS LIYSASFLYSG WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK REPQVCTLPPSRDELTKNQVSL GNSQESVTEQ VPSRFSGSRS TISKAKGQPREPQVYTLPPCRD SCAVKGFYPSDIAVEWESNGQ DSKDSTYSLS GTDFTLTISSL ELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIA PENNYKTTPPVLDSDGSFFLVS STLTLSKADYE QPEDFATYYC VEWESNGQPENNYKTTPPVLD KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH KHKVYACEVT QQHYTTPPTF SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG EALHNRFTQKSLSLSPG HQGLSSPVTK GCGTKVEIK NVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SFNRGEC

SLSPG 33 DIQLTQSPAIMS DIKLQQSGAELARPGASVKMSCK EVQLQQSGPELVKPGASVKMSC DFVMTQSPSSL

ASPGEKVTMTC TSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGL KASGYTFTDYYMKWVKQSHGKS TVTAGEKVTMS

RASSSVSYMN EWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKA LEWIGDIIPSNGATFYNQKFKGKA CKSSQSLLNSG anti-CD3ε WYQQKSGTSP TLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDS TLTVDRSSSTAYMHLNSLTSEDS NQKNYLTWYL x anti- KRWIYDTSKVA AVYYCARYYDDHYCLDYWGQGT AVYYCTRSHLLRASWFAYWGQG QKPGQPPKLLI CD123 SGVPYRFSGS TLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKST TLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKS YWASTRESGV

GSGTSYSLTIS SGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW TSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS PDRFTGSGSG

SMEAEDAATYY NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY TDFTLTISSVQA Tipo

CQQWSSNPLT LSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHK SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNH EDLAVYYCQN Selvagem

FGAGTKLELKR PSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPP KPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCP DYSYPYTFGG TVAAPSVFIFPP CPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTL PCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDT GTKLEIKRTVA SDEQLKSGTAS MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV APSVFIFPPSD SEQ ID

VVCLLNNFYPR FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ EQLKSGTASVV Nº: 83

EAKVQWKVDN NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKE CLLNNFYPREA ALQSGNSQES KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP YKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ KVQWKVDNAL VTEQDSKDSTY REPQVYTLPPCRDELTKNQVSLW PREPQVCTLPPSRDELTKNQVSL QSGNSQESVT SLSSTLTLSKA CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN SCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPE EQDSKDSTYSL DYEKHKVYACE NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD NNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV SSTLTLSKADY VTHQGLSSPVT KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN EKHKVYACEVT KSFNRGEC YTQKSLSLSPG RFTQKSLSLSPG HQGLSSPVTKS FNRGEC

34 DIQLTQSPAIMS DIKLQQSGAELARPGASVKMSCK EVQLQQSGPELVKPGASVKMSC DFVMTQSPSSL

ASPGEKVTMTC TSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGL KASGYTFTDYYMKWVKQSHGKS TVTAGEKVTMS

RASSSVSYMN EWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKA LEWIGDIIPSNGATFYNQKFKGKA CKSSQSLLNSG anti-CD3ε WYQQKSGTSP TLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDS TLTVDRSSSTAYMHLNSLTSEDS NQKNYLTWYL x anti- KRWIYDTSKVA AVYYCARYYDDHYCLDYWGQGT AVYYCTRSHLLRASWFAYWGQG QKPGQPPKLLI CD123- SGVPYRFSGS TLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKST TLVTVSAGGGGSGGGGSEVQLV YWASTRESGV dsTrasKO GSGTSYSLTIS SGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW ESGGGLVQPGGSLRLSCAASGF PDRFTGSGSG 2 SMEAEDAATYY NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS NIKDTYIHWVRQAPGKCLEWVAEI TDFTLTISSVQA

CQQWSSNPLT LSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHK YPTNGYTEYADSVKGRFTISADT EDLAVYYCQN FGAGTKLELKR PSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPP SKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCS DYSYPYTFGG SEQ ID

TVAAPSVFIFPP CPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTL RWGGDGFYAMDYWGQGTLVTV GTKLEIKGGGG Nº: 84

SDEQLKSGTAS MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK SSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVF SGGGGSDIQM VVCLLNNFYPR FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD TQSPSSLSASV EAKVQWKVDN NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY VSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA GDRVTITCRAS ALQSGNSQES KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDVNTAVAWY VTEQDSKDSTY REPQVYTLPPCRDELTKNQVSLW QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE QQKPGKAPKLL SLSSTLTLSKA CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN KTISKAKGQPREPQVCTLPPSRD IYSASFLYSGV DYEKHKVYACE NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD ELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVE PSRFSGSRSG VTHQGLSSPVT KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH WESNGQPENNYKTTPPVLDSDG TDFTLTISSLQP KSFNRGEC YTQKSLSLSPG SFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSC EDFATYYCQQ SVMHEALHNRFTQKSLSLSPG HYTTPPTFGCG

TKVEIK 35 DIQLTQSPAIM DIKLQQSGAELARPGASVKMSC EVQLQQSGPELVKPGASVKMS DFVMTQSPSS

SASPGEKVTM KTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQ CKASGYTFTDYYMKWVKQSHG LTVTAGEKVT

TCRASSSVSY GLEWIGYINPSRGYTNYNQKFK KSLEWIGDIIPSNGATFYNQKFK MSCKSSQSLL anti-

MNWYQQKSG DKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTS GKATLTVDRSSSTAYMHLNSLT NSGNQKNYLT CD3ε-

TSPKRWIYDT EDSAVYYCARYYDDHYCLDYWG SEDSAVYYCTRSHLLRASWFA WYLQKPGQP dsTrasKO

SKVASGVPYR QGTTLTVSSGGGGSGGGGSEV YWGQGTLVTVSAASTKGPSVF PKLLIYWASTR 2 x anti-

FSGSGSGTSY QLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA PLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD ESGVPDRFTG CD123

SLTISSMEAED SGFNIKDTYIHWVRQAPGKCLE YFPEPVTVSWNSGALTSGVHT SGSGTDFTLTI AATYYCQQWS WVAEIYPTNGYTEYADSVKGRFT FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSS SSVQAEDLAV

SEQ ID SNPLTFGAGT ISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTA SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK YYCQNDYSYP Nº: 85 KLELKGGGGS VYYCSRWGGDGFYAMDYWGQ KVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA YTFGGGTKLEI

GGGGSDIQMT GTLVTVSSDKTHTCPPCPAPEA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTP KRTVAAPSVFI QSPSSLSASV AGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT EVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY FPPSDEQLKS GDRVTITCRAS PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW VDGVEVHNAKTKPREEQYNST GTASVVCLLN QDVNTAVAWY YVDGVEVHNAKTKPREEQYNS YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK NFYPREAKVQ QQKPGKAPKL TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP WKVDNALQS LIYSASFLYSG KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ REPQVCTLPPSRDELTKNQVSL GNSQESVTEQ VPSRFSGSRS PREPQVYTLPPCRDELTKNQVS SCAVKGFYPSDIAVEWESNGQ DSKDSTYSLS GTDFTLTISSL LWCLVKGFYPSDIAVEWESNG PENNYKTTPPVLDSDGSFFLVS STLTLSKADYE QPEDFATYYC QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH KHKVYACEVT QQHYTTPPTF SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM EALHNRFTQKSLSLSPG HQGLSSPVTK GCGTKVEIK HEALHNHYTQKSLSLSPG SFNRGEC

36 DIVMTQTPLSL QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSC EVQLQQSGPELVKPGASVKMSC DFVMTQSPSSL

SVTPGQPASIS AASGFTFTKAWMHWVRQAPGKQ KASGYTFTDYYMKWVKQSHGKS TVTAGEKVTMS

CKSSQSLVHEN LEWVAQIKDKSNSYATYYADSVK LEWIGDIIPSNGATFYNQKFKGKA CKSSQSLLNSG anti-CD3ε LQTYLSWYLQK GRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRA TLTVDRSSSTAYMHLNSLTSEDS NQKNYLTWYL x anti- PGQSPQSLIYK EDTAVYYCRGVYYALSPFDYWG AVYYCTRSHLLRASWFAYWGQG QKPGQPPKLLI CD123 VSNRFSGVPD QGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPS TLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKS YWASTRESGV

RFSGSGSGTD SKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPV TSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS PDRFTGSGSG

FTLKISRVEAED TVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY TDFTLTISSVQA Tipo

VGVYYCGQGT GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICN SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNH EDLAVYYCQN Selvagem

QYPFTFGSGTK VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTH KPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCP DYSYPYTFGG VEIKRTVAAPS TCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKP PCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDT GTKLEIKRTVA VFIFPPSDEQLK KDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV APSVFIFPPSD SEQ ID

SGTASVVCLLN PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ EQLKSGTASVV Nº: 86

NFYPREAKVQ EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKE CLLNNFYPREA WKVDNALQSG GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA YKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ KVQWKVDNAL NSQESVTEQD KGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQ PREPQVCTLPPSRDELTKNQVSL QSGNSQESVT SKDSTYSLSST VSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNG SCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPE EQDSKDSTYSL LTLSKADYEKH QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS NNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV SSTLTLSKADY KVYACEVTHQ KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN EKHKVYACEVT GLSSPVTKSFN ALHNHYTQKSLSLSPG RFTQKSLSLSPG HQGLSSPVTKS

RGEC FNRGEC 37 DIVMTQTPLSL QVQLVESGGGVVQPGRSLRLS EVQLQQSGPELVKPGASVKMS DFVMTQSPSS

SVTPGQPASIS CAASGFTFTKAWMHWVRQAP CKASGYTFTDYYMKWVKQSHG LTVTAGEKVT

CKSSQSLVHE GKQLEWVAQIKDKSNSYATYYA KSLEWIGDIIPSNGATFYNQKFK MSCKSSQSLL anti-CD3ε

NLQTYLSWYL DSVKGRFTISRDDSKNTLYLQM GKATLTVDRSSSTAYMHLNSLT NSGNQKNYLT x anti-

QKPGQSPQSL NSLRAEDTAVYYCRGVYYALSP SEDSAVYYCTRSHLLRASWFA WYLQKPGQP CD123-

IYKVSNRFSGV FDYWGQGTLVTVSSASTKGPS YWGQGTLVTVSAGGGGSGGG PKLLIYWASTR dsTrasKO

PDRFSGSGSG VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV GSEVQLVESGGGLVQPGGSLR ESGVPDRFTG 2

TDFTLKISRVE KDYFPEPVTVSWNSGALTSGV LSCAASGFNIKDTYIHWVRQAP SGSGTDFTLTI AEDVGVYYCG HTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP GKCLEWVAEIYPTNGYTEYADS SSVQAEDLAV

SEQ ID QGTQYPFTFG SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKV VKGRFTISADTSKNTAYLQMNS YYCQNDYSYP Nº: 87 SGTKVEIKRTV DKKVEPKSCDKTHTCPPCPAP LRAEDTAVYYCSRWGGDGFYA YTFGGGTKLEI

AAPSVFIFPPS EAAGGPSVFLFPPKPKDTLMIS MDYWGQGTLVTVSSDKTHTCP KGGGGSGGG DEQLKSGTAS RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN PCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKD GSDIQMTQSP VVCLLNNFYP WYVDGVEVHNAKTKPREEQYN TLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP SSLSASVGDR REAKVQWKVD STYRVVSVLTVLHQDWLNGKE EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR VTITCRASQDV NALQSGNSQE YKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDW NTAVAWYQQ SVTEQDSKDS QPREPQVYTLPPCRDELTKNQ LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI KPGKAPKLLIY TYSLSSTLTLS VSLWCLVKGFYPSDIAVEWESN SKAKGQPREPQVCTLPPSRDE SASFLYSGVP KADYEKHKVY GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL LTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAV SRFSGSRSGT ACEVTHQGLS YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV EWESNGQPENNYKTTPPVLDS DFTLTISSLQP SPVTKSFNRG MHEALHNHYTQKSLSLSPG DGSFFLVSKLTVDKSRWQQGN EDFATYYCQQ EC VFSCSVMHEALHNRFTQKSLSL HYTTPPTFGC SPG GTKVEIK

38 DIVMTQTPLSL QVQLVESGGGVVQPGRSLRLS EVQLQQSGPELVKPGASVKMS DFVMTQSPSS

SVTPGQPASIS CAASGFTFTKAWMHWVRQAP CKASGYTFTDYYMKWVKQSHG LTVTAGEKVT

CKSSQSLVHE GKQLEWVAQIKDKSNSYATYYA KSLEWIGDIIPSNGATFYNQKFK MSCKSSQSLL anti-

NLQTYLSWYL DSVKGRFTISRDDSKNTLYLQM GKATLTVDRSSSTAYMHLNSLT NSGNQKNYLT CD3ε-

QKPGQSPQSL NSLRAEDTAVYYCRGVYYALSP SEDSAVYYCTRSHLLRASWFA WYLQKPGQP dsTrasKO

IYKVSNRFSGV FDYWGQGTLVTVSSGGGGSG YWGQGTLVTVSAASTKGPSVF PKLLIYWASTR 2 x anti-

PDRFSGSGSG GGGSEVQLVESGGGLVQPGG PLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD ESGVPDRFTG CD123

TDFTLKISRVE SLRLSCAASGFNIKDTYIHWVR YFPEPVTVSWNSGALTSGVHT SGSGTDFTLTI AEDVGVYYCG QAPGKCLEWVAEIYPTNGYTEY FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSS SSVQAEDLAV

SEQ ID QGTQYPFTFG ADSVKGRFTISADTSKNTAYLQ SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK YYCQNDYSYP Nº: 88 SGTKVEIKGG MNSLRAEDTAVYYCSRWGGD KVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA YTFGGGTKLEI

GGSGGGGSDI GFYAMDYWGQGTLVTVSSDKT GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTP KRTVAAPSVFI QMTQSPSSLS HTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPP EVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY FPPSDEQLKS ASVGDRVTITC KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS VDGVEVHNAKTKPREEQYNST GTASVVCLLN RASQDVNTAV HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK NFYPREAKVQ AWYQQKPGK TKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP WKVDNALQS APKLLIYSASF QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI REPQVCTLPPSRDELTKNQVSL GNSQESVTEQ LYSGVPSRFS EKTISKAKGQPREPQVYTLPPC SCAVKGFYPSDIAVEWESNGQ DSKDSTYSLS GSRSGTDFTL RDELTKNQVSLWCLVKGFYPS PENNYKTTPPVLDSDGSFFLVS STLTLSKADYE TISSLQPEDFA DIAVEWESNGQPENNYKTTPP KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH KHKVYACEVT TYYCQQHYTT VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW EALHNRFTQKSLSLSPG HQGLSSPVTK PPTFGCGTKV QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ SFNRGEC

EIK KSLSLSPG 39 QIVLTQSPAIMS EVQLQQSGPELVKPGASVKMSC QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCK DVVMTQSPLSL

ASPGEKVTMTC KASGYKFTSYVMHWVKQKPGQG ASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGL PVTLGQPASIS

SATSSVSYMH LEWIGYINPYNDVTKYNEKFKGKA EWVGWINTYTGGPKYAQGFTGR CRSSQSLVHSI anti-TCR WYQQKSGTSP TLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSA FVFSVDTSVSTAYLQISSLKAEDT GNTYLHWYQQ α/β x anti- KRWIYDTSKLA VHYCARGSYYDYDGFVYWGQGT AVYYCARGIYDGYHWYFDVWGR RPGQSPRLLIY

TNP SGVPARFSGS LVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKST GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSS KVSNRFSGVP GSGTSYSLTIS SGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW KSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT DRFSGSGSGT

SMEAEDAATYY NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS DFTLKISRVEAE Controle

CQQWSSNPLT LSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHK GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICN DVGVYYCSQS negativo

FGAGTKLELKR PSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPP VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTH THVPFTFGQGT TVAAPSVFIFPP CPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTL TCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKP KLEIKRTVAAPS

SDEQLKSGTAS MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK KDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED VFIFPPSDEQL Tipo

VVCLLNNFYPR FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR KSGTASVVCLL Selvagem

EAKVQWKVDN NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN NNFYPREAKV ALQSGNSQES KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA QWKVDNALQS

SEQ ID VTEQDSKDSTY REPQVYTLPPCRDELTKNQVSLW KGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQ GNSQESVTEQ Nº: 89 SLSSTLTLSKA CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN VSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNG DSKDSTYSLSS

DYEKHKVYACE NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVS TLTLSKADYEK VTHQGLSSPVT KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE HKVYACEVTH KSFNRGEC YTQKSLSLSPG ALHNRFTQKSLSLSPG QGLSSPVTKSF NRGEC

40 QIVLTQSPAIM EVQLQQSGPELVKPGASVKMS QIQLVQSGSELKKPGASVKVSC DVVMTQSPLS

SASPGEKVTM CKASGYKFTSYVMHWVKQKPG KASGYTFTNYGMNWVRQAPG LPVTLGQPASI

TCSATSSVSY QGLEWIGYINPYNDVTKYNEKF QGLEWVGWINTYTGGPKYAQG SCRSSQSLVH anti-TCR

MHWYQQKSG KGKATLTSDKSSSTAYMELSSL FTGRFVFSVDTSVSTAYLQISSL SIGNTYLHWY α/β x anti-

TSPKRWIYDT TSEDSAVHYCARGSYYDYDGF KAEDTAVYYCARGIYDGYHWY QQRPGQSPRL TNP-

SKLASGVPAR VYWGQGTLVTVSAASTKGPSV FDVWGRGTLVTVSSGGGGSG LIYKVSNRFSG dsTrasKO

FSGSGSGTSY FPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK GGGSEVQLVESGGGLVQPGG VPDRFSGSGS 2

SLTISSMEAED DYFPEPVTVSWNSGALTSGVH SLRLSCAASGFNIKDTYIHWVR GTDFTLKISRV

AATYYCQQWS TFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS QAPGKCLEWVAEIYPTNGYTEY EAEDVGVYYC Controle SNPLTFGAGT SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVD ADSVKGRFTISADTSKNTAYLQ SQSTHVPFTF negativo KLELKRTVAAP KKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEA MNSLRAEDTAVYYCSRWGGD GQGTKLEIKG

SVFIFPPSDEQ AGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT GFYAMDYWGQGTLVTVSSDKT GGGSGGGGS LKSGTASVVC PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW HTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPP DIQMTQSPSS SEQ ID

LLNNFYPREA YVDGVEVHNAKTKPREEQYNS KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS LSASVGDRVTI Nº: 90

KVQWKVDNAL TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK TCRASQDVNT QSGNSQESVT KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ TKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH AVAWYQQKP EQDSKDSTYS PREPQVYTLPPCRDELTKNQVS QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI GKAPKLLIYSA LSSTLTLSKAD LWCLVKGFYPSDIAVEWESNG EKTISKAKGQPREPQVCTLPPS SFLYSGVPSR YEKHKVYACE QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY RDELTKNQVSLSCAVKGFYPSD FSGSRSGTDF VTHQGLSSPV SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM IAVEWESNGQPENNYKTTPPVL TLTISSLQPED TKSFNRGEC HEALHNHYTQKSLSLSPG DSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQ FATYYCQQHY GNVFSCSVMHEALHNRFTQKS TTPPTFGCGT

LSLSPG KVEIK 41 QIVLTQSPAIMS EVQLQQSGPELVKPGASVKMSC QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCK DVVMTQSPLSL

ASPGEKVTMTC KASGYKFTSYVMHWVKQKPGQG ASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGL PVTLGQPASIS

SATSSVSYMH LEWIGYINPYNDVTKYNEKFKGKA EWVGWINTYTGGPKYAQGFTGR CRSSQSLVHSI anti-TCR WYQQKSGTSP TLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSA FVFSVDTSVSTAYLQISSLKAEDT GNTYLHWYQQ α/β- KRWIYDTSKLA VHYCARGSYYDYDGFVYWGQGT AVYYCARGIYDGYHWYFDVWGR RPGQSPRLLIY dsTrasKO SGVPARFSGS LVTVSAGGGGSGGGGSEVQLVE GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSS KVSNRFSGVP 2 x anti- GSGTSYSLTIS SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNI KSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT DRFSGSGSGT

TNP SMEAEDAATYY KDTYIHWVRQAPGKCLEWVAEIY VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS DFTLKISRVEAE CQQWSSNPLT PTNGYTEYADSVKGRFTISADTS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICN DVGVYYCSQS

FGAGTKLELKG KNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSR VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTH THVPFTFGQGT Controle

GGGSGGGGSD WGGDGFYAMDYWGQGTLVTVS TCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKP KLEIKRTVAAPS negativo

IQMTQSPSSLS SDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFL KDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED VFIFPPSDEQL ASVGDRVTITC FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR KSGTASVVCLL RASQDVNTAVA SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN NNFYPREAKV SEQ ID

WYQQKPGKAP TKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA QWKVDNALQS Nº: 91

KLLIYSASFLYS DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK KGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQ GNSQESVTEQ GVPSRFSGSR TISKAKGQPREPQVYTLPPCRDE VSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNG DSKDSTYSLSS SGTDFTLTISSL LTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVE QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVS TLTLSKADYEK QPEDFATYYCQ WESNGQPENNYKTTPPVLDSDG KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE HKVYACEVTH QHYTTPPTFGC SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC ALHNRFTQKSLSLSPG QGLSSPVTKSF GTKVEIK SVMHEALHNHYTQKSLSLSPG NRGEC

42 DVVMTQSPLS QIQLVQSGSELKKPGASVKVSC EVQLQQSGPELVKPGASVKMS DFVMTQSPSS

LPVTLGQPASI KASGYTFTNYGMNWVRQAPG CKASGYTFTDYYMKWVKQSHG LTVTAGEKVT

SCRSSQSLVH QGLEWVGWINTYTGGPKYAQG KSLEWIGDIIPSNGATFYNQKFK MSCKSSQSLL anti-TNP

SIGNTYLHWY FTGRFVFSVDTSVSTAYLQISSL GKATLTVDRSSSTAYMHLNSLT NSGNQKNYLT x anti-

QQRPGQSPRL KAEDTAVYYCARGIYDGYHWY SEDSAVYYCTRSHLLRASWFA WYLQKPGQP CD123

LIYKVSNRFSG FDVWGRGTLVTVSSASTKGPS YWGQGTLVTVSAASTKGPSVF PKLLIYWASTR

VPDRFSGSGS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV PLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD ESGVPDRFTG Controle GTDFTLKISRV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGV YFPEPVTVSWNSGALTSGVHT SGSGTDFTLTI negativo EAEDVGVYYC HTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSS SSVQAEDLAV

SQSTHVPFTF SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKV SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK YYCQNDYSYP

GQGTKLEIKRT DKKVEPKSCDKTHTCPPCPAP KVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA YTFGGGTKLEI Tipo VAAPSVFIFPP EAAGGPSVFLFPPKPKDTLMIS GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTP KRTVAAPSVFI Selvagem SDEQLKSGTA RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN EVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY FPPSDEQLKS

SVVCLLNNFY WYVDGVEVHNAKTKPREEQYN VDGVEVHNAKTKPREEQYNST GTASVVCLLN PREAKVQWKV STYRVVSVLTVLHQDWLNGKE YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK NFYPREAKVQ SEQ ID

DNALQSGNSQ YKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP WKVDNALQS Nº: 92

ESVTEQDSKD QPREPQVYTLPPCRDELTKNQ REPQVCTLPPSRDELTKNQVSL GNSQESVTEQ STYSLSSTLTL VSLWCLVKGFYPSDIAVEWESN SCAVKGFYPSDIAVEWESNGQ DSKDSTYSLS SKADYEKHKV GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL PENNYKTTPPVLDSDGSFFLVS STLTLSKADYE YACEVTHQGL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH KHKVYACEVT SSPVTKSFNR MHEALHNHYTQKSLSLSPG EALHNRFTQKSLSLSPG HQGLSSPVTK

GEC SFNRGEC 43 DVVMTQSPLSL QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCK EVQLQQSGPELVKPGASVKMSC DFVMTQSPSSL

PVTLGQPASIS ASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGL KASGYTFTDYYMKWVKQSHGKS TVTAGEKVTMS

CRSSQSLVHSI EWVGWINTYTGGPKYAQGFTGR LEWIGDIIPSNGATFYNQKFKGKA CKSSQSLLNSG anti-TNP GNTYLHWYQQ FVFSVDTSVSTAYLQISSLKAEDT TLTVDRSSSTAYMHLNSLTSEDS NQKNYLTWYL x anti- RPGQSPRLLIY AVYYCARGIYDGYHWYFDVWGR AVYYCTRSHLLRASWFAYWGQG QKPGQPPKLLI CD123- KVSNRFSGVPD GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSS TLVTVSAGGGGSGGGGSEVQLV YWASTRESGV dsTrasKO RFSGSGSGTD KSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT ESGGGLVQPGGSLRLSCAASGF PDRFTGSGSG 2 FTLKISRVEAED VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS NIKDTYIHWVRQAPGKCLEWVAEI TDFTLTISSVQA

VGVYYCSQST GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICN YPTNGYTEYADSVKGRFTISADT EDLAVYYCQN

HVPFTFGQGTK VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTH SKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCS DYSYPYTFGG Controle

LEIKRTVAAPSV TCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKP RWGGDGFYAMDYWGQGTLVTV GTKLEIKGGGG negativo

FIFPPSDEQLKS KDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED SSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVF SGGGGSDIQM GTASVVCLLNN PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD TQSPSSLSASV FYPREAKVQW EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN VSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA GDRVTITCRAS SEQ ID

KVDNALQSGN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDVNTAVAWY Nº: 93

SQESVTEQDSK KGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQ QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE QQKPGKAPKLL DSTYSLSSTLTL VSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNG KTISKAKGQPREPQVCTLPPSRD IYSASFLYSGV SKADYEKHKVY QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS ELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVE PSRFSGSRSG ACEVTHQGLSS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDG TDFTLTISSLQP PVTKSFNRGEC ALHNHYTQKSLSLSPG SFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSC EDFATYYCQQ SVMHEALHNRFTQKSLSLSPG HYTTPPTFGCG TKVEIK

44 DVVMTQSPLS QIQLVQSGSELKKPGASVKVSC EVQLQQSGPELVKPGASVKMS DFVMTQSPSS

LPVTLGQPASI KASGYTFTNYGMNWVRQAPG CKASGYTFTDYYMKWVKQSHG LTVTAGEKVT

SCRSSQSLVH QGLEWVGWINTYTGGPKYAQG KSLEWIGDIIPSNGATFYNQKFK MSCKSSQSLL anti-TNP-

SIGNTYLHWY FTGRFVFSVDTSVSTAYLQISSL GKATLTVDRSSSTAYMHLNSLT NSGNQKNYLT dsTrasKO

QQRPGQSPRL KAEDTAVYYCARGIYDGYHWY SEDSAVYYCTRSHLLRASWFA WYLQKPGQP 2 x anti-

LIYKVSNRFSG FDVWGRGTLVTVSSGGGGSG YWGQGTLVTVSAASTKGPSVF PKLLIYWASTR CD123

VPDRFSGSGS GGGSEVQLVESGGGLVQPGG PLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD ESGVPDRFTG

GTDFTLKISRV SLRLSCAASGFNIKDTYIHWVR YFPEPVTVSWNSGALTSGVHT SGSGTDFTLTI Controle EAEDVGVYYC QAPGKCLEWVAEIYPTNGYTEY FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSS SSVQAEDLAV negativo SQSTHVPFTF ADSVKGRFTISADTSKNTAYLQ SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK YYCQNDYSYP

GQGTKLEIKG MNSLRAEDTAVYYCSRWGGD KVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA YTFGGGTKLEI GGGSGGGGS GFYAMDYWGQGTLVTVSSDKT GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTP KRTVAAPSVFI

SEQ ID DIQMTQSPSS HTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPP EVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY FPPSDEQLKS Nº: 94

LSASVGDRVTI KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS VDGVEVHNAKTKPREEQYNST GTASVVCLLN TCRASQDVNT HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK NFYPREAKVQ AVAWYQQKP TKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP WKVDNALQS GKAPKLLIYSA QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI REPQVCTLPPSRDELTKNQVSL GNSQESVTEQ SFLYSGVPSR EKTISKAKGQPREPQVYTLPPC SCAVKGFYPSDIAVEWESNGQ DSKDSTYSLS FSGSRSGTDF RDELTKNQVSLWCLVKGFYPS PENNYKTTPPVLDSDGSFFLVS STLTLSKADYE TLTISSLQPED DIAVEWESNGQPENNYKTTPP KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH KHKVYACEVT FATYYCQQHY VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW EALHNRFTQKSLSLSPG HQGLSSPVTK TTPPTFGCGT QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ SFNRGEC

KVEIK KSLSLSPG 45 DIQLTQSPAIMS DIKLQQSGAELARPGASVKMSCK QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCK DVVMTQSPLSL

ASPGEKVTMTC TSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGL ASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGL PVTLGQPASIS

RASSSVSYMN EWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKA EWVGWINTYTGGPKYAQGFTGR CRSSQSLVHSI anti-CD3ε WYQQKSGTSP TLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDS FVFSVDTSVSTAYLQISSLKAEDT GNTYLHWYQQ x anti- KRWIYDTSKVA AVYYCARYYDDHYCLDYWGQGT AVYYCARGIYDGYHWYFDVWGR RPGQSPRLLIY

TNP SGVPYRFSGS TLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKST GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSS KVSNRFSGVP GSGTSYSLTIS SGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW KSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT DRFSGSGSGT

SDEQLKSGTAS MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK KDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED VFIFPPSDEQL Tipo

VVCLLNNFYPR FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR KSGTASVVCLL Selvagem

SEQ ID VTEQDSKDSTY REPQVYTLPPCRDELTKNQVSLW KGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQ GNSQESVTEQ Nº: 95 SLSSTLTLSKA CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN VSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNG DSKDSTYSLSS

46 DIQLTQSPAIM DIKLQQSGAELARPGASVKMSC QIQLVQSGSELKKPGASVKVSC DVVMTQSPLS

SASPGEKVTM KTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQ KASGYTFTNYGMNWVRQAPG LPVTLGQPASI

TCRASSSVSY GLEWIGYINPSRGYTNYNQKFK QGLEWVGWINTYTGGPKYAQG SCRSSQSLVH anti-CD3ε

MNWYQQKSG DKATLTTDKSSSTAYMQLSSLT FTGRFVFSVDTSVSTAYLQISSL SIGNTYLHWY x anti-

TSPKRWIYDT SEDSAVYYCARYYDDHYCLDY KAEDTAVYYCARGIYDGYHWY QQRPGQSPRL TNP-

SKVASGVPYR WGQGTTLTVSSASTKGPSVFP FDVWGRGTLVTVSSGGGGSG LIYKVSNRFSG dsTrasKO

FSGSGSGTSY LAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY GGGSEVQLVESGGGLVQPGG VPDRFSGSGS 2

SLTISSMEAED FPEPVTVSWNSGALTSGVHTF SLRLSCAASGFNIKDTYIHWVR GTDFTLKISRV

AATYYCQQWS PAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS QAPGKCLEWVAEIYPTNGYTEY EAEDVGVYYC Controle SNPLTFGAGT LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK ADSVKGRFTISADTSKNTAYLQ SQSTHVPFTF negativo KLELKRTVAAP VEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA MNSLRAEDTAVYYCSRWGGD GQGTKLEIKG

SVFIFPPSDEQ GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTP GFYAMDYWGQGTLVTVSSDKT GGGSGGGGS LKSGTASVVC EVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY HTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPP DIQMTQSPSS SEQ ID

LLNNFYPREA VDGVEVHNAKTKPREEQYNST KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS LSASVGDRVTI Nº: 96

KVQWKVDNAL YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK TCRASQDVNT QSGNSQESVT CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP TKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH AVAWYQQKP EQDSKDSTYS REPQVYTLPPCRDELTKNQVSL QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI GKAPKLLIYSA LSSTLTLSKAD WCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ EKTISKAKGQPREPQVCTLPPS SFLYSGVPSR YEKHKVYACE PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS RDELTKNQVSLSCAVKGFYPSD FSGSRSGTDF VTHQGLSSPV KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH IAVEWESNGQPENNYKTTPPVL TLTISSLQPED TKSFNRGEC EALHNHYTQKSLSLSPG DSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQ FATYYCQQHY GNVFSCSVMHEALHNRFTQKS TTPPTFGCGT

LSLSPG KVEIK 47 DIQLTQSPAIMS DIKLQQSGAELARPGASVKMSCK QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCK DVVMTQSPLSL

ASPGEKVTMTC TSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGL ASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGL PVTLGQPASIS

RASSSVSYMN EWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKA EWVGWINTYTGGPKYAQGFTGR CRSSQSLVHSI anti- WYQQKSGTSP TLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDS FVFSVDTSVSTAYLQISSLKAEDT GNTYLHWYQQ CD3ε- KRWIYDTSKVA AVYYCARYYDDHYCLDYWGQGT AVYYCARGIYDGYHWYFDVWGR RPGQSPRLLIY dsTrasKO SGVPYRFSGS TLTVSSGGGGSGGGGSEVQLVE GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSS KVSNRFSGVP 2 x anti- GSGTSYSLTIS SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNI KSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT DRFSGSGSGT

GGGSGGGGSD WGGDGFYAMDYWGQGTLVTVS TCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKP KLEIKRTVAAPS negativo

WYQQKPGKAP TKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA QWKVDNALQS Nº: 97

48 DIVMTQTPLSL QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSC QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCK DVVMTQSPLSL

SVTPGQPASIS AASGFTFTKAWMHWVRQAPGKQ ASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGL PVTLGQPASIS

CKSSQSLVHEN LEWVAQIKDKSNSYATYYADSVK EWVGWINTYTGGPKYAQGFTGR CRSSQSLVHSI anti-CD3ε LQTYLSWYLQK GRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRA FVFSVDTSVSTAYLQISSLKAEDT GNTYLHWYQQ x anti- PGQSPQSLIYK EDTAVYYCRGVYYALSPFDYWG AVYYCARGIYDGYHWYFDVWGR RPGQSPRLLIY

TNP VSNRFSGVPD QGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPS GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSS KVSNRFSGVP RFSGSGSGTD SKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPV KSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT DRFSGSGSGT

FTLKISRVEAED TVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS DFTLKISRVEAE Controle

VGVYYCGQGT GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICN GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICN DVGVYYCSQS negativo

QYPFTFGSGTK VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTH VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTH THVPFTFGQGT VEIKRTVAAPS TCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKP TCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKP KLEIKRTVAAPS

VFIFPPSDEQLK KDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED KDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED VFIFPPSDEQL Tipo

SGTASVVCLLN PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR KSGTASVVCLL Selvagem

NFYPREAKVQ EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN NNFYPREAKV WKVDNALQSG GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA QWKVDNALQS

SEQ ID NSQESVTEQD KGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQ KGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQ GNSQESVTEQ Nº: 98 SKDSTYSLSST VSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNG VSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNG DSKDSTYSLSS

LTLSKADYEKH QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVS TLTLSKADYEK KVYACEVTHQ KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE HKVYACEVTH GLSSPVTKSFN ALHNHYTQKSLSLSPG ALHNRFTQKSLSLSPG QGLSSPVTKSF

RGEC NRGEC 49 DIVMTQTPLSL QVQLVESGGGVVQPGRSLRLS QIQLVQSGSELKKPGASVKVSC DVVMTQSPLS

SVTPGQPASIS CAASGFTFTKAWMHWVRQAP KASGYTFTNYGMNWVRQAPG LPVTLGQPASI

CKSSQSLVHE GKQLEWVAQIKDKSNSYATYYA QGLEWVGWINTYTGGPKYAQG SCRSSQSLVH anti-CD3ε

NLQTYLSWYL DSVKGRFTISRDDSKNTLYLQM FTGRFVFSVDTSVSTAYLQISSL SIGNTYLHWY x anti-

QKPGQSPQSL NSLRAEDTAVYYCRGVYYALSP KAEDTAVYYCARGIYDGYHWY QQRPGQSPRL TNP-

IYKVSNRFSGV FDYWGQGTLVTVSSASTKGPS FDVWGRGTLVTVSSGGGGSG LIYKVSNRFSG dsTrasKO

PDRFSGSGSG VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV GGGSEVQLVESGGGLVQPGG VPDRFSGSGS 2

TDFTLKISRVE KDYFPEPVTVSWNSGALTSGV SLRLSCAASGFNIKDTYIHWVR GTDFTLKISRV

AEDVGVYYCG HTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP QAPGKCLEWVAEIYPTNGYTEY EAEDVGVYYC Controle QGTQYPFTFG SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKV ADSVKGRFTISADTSKNTAYLQ SQSTHVPFTF negativo SGTKVEIKRTV DKKVEPKSCDKTHTCPPCPAP MNSLRAEDTAVYYCSRWGGD GQGTKLEIKG

AAPSVFIFPPS EAAGGPSVFLFPPKPKDTLMIS GFYAMDYWGQGTLVTVSSDKT GGGSGGGGS DEQLKSGTAS RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN HTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPP DIQMTQSPSS SEQ ID

VVCLLNNFYP WYVDGVEVHNAKTKPREEQYN KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS LSASVGDRVTI Nº: 99

REAKVQWKVD STYRVVSVLTVLHQDWLNGKE HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK TCRASQDVNT NALQSGNSQE YKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG TKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH AVAWYQQKP SVTEQDSKDS QPREPQVYTLPPCRDELTKNQ QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI GKAPKLLIYSA TYSLSSTLTLS VSLWCLVKGFYPSDIAVEWESN EKTISKAKGQPREPQVCTLPPS SFLYSGVPSR KADYEKHKVY GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL RDELTKNQVSLSCAVKGFYPSD FSGSRSGTDF ACEVTHQGLS YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV IAVEWESNGQPENNYKTTPPVL TLTISSLQPED SPVTKSFNRG MHEALHNHYTQKSLSLSPG DSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQ FATYYCQQHY EC GNVFSCSVMHEALHNRFTQKS TTPPTFGCGT LSLSPG KVEIK

50 DIVMTQTPLSL QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSC QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCK DVVMTQSPLSL

SVTPGQPASIS AASGFTFTKAWMHWVRQAPGKQ ASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGL PVTLGQPASIS

CKSSQSLVHEN LEWVAQIKDKSNSYATYYADSVK EWVGWINTYTGGPKYAQGFTGR CRSSQSLVHSI anti- LQTYLSWYLQK GRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRA FVFSVDTSVSTAYLQISSLKAEDT GNTYLHWYQQ CD3ε- PGQSPQSLIYK EDTAVYYCRGVYYALSPFDYWG AVYYCARGIYDGYHWYFDVWGR RPGQSPRLLIY dsTrasKO VSNRFSGVPD QGTLVTVSSGGGGSGGGGSEVQ GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSS KVSNRFSGVP 2 RFSGSGSGTD LVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS KSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT DRFSGSGSGT x anti- FTLKISRVEAED GFNIKDTYIHWVRQAPGKCLEWV VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS DFTLKISRVEAE

TNP VGVYYCGQGT AEIYPTNGYTEYADSVKGRFTISA GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICN DVGVYYCSQS QYPFTFGSGTK DTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYY VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTH THVPFTFGQGT

VEIKGGGGSG CSRWGGDGFYAMDYWGQGTLV TCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKP KLEIKRTVAAPS Controle GGGSDIQMTQ TVSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPS KDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED VFIFPPSDEQL negativo SPSSLSASVGD VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR KSGTASVVCLL

RVTITCRASQD VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN NNFYPREAKV VNTAVAWYQQ NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTV GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA QWKVDNALQS

SEQ ID KPGKAPKLLIYS LHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA KGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQ GNSQESVTEQ Nº: 100 ASFLYSGVPSR PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPC VSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNG DSKDSTYSLSS

FSGSRSGTDFT RDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDI QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVS TLTLSKADYEK LTISSLQPEDFA AVEWESNGQPENNYKTTPPVLD KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE HKVYACEVTH TYYCQQHYTTP SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN ALHNRFTQKSLSLSPG QGLSSPVTKSF PTFGCGTKVEI VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS NRGEC

K PG (e) Ácidos Nucleicos

[310] Em um quinto aspecto, a presente invenção se refere a uma molécula de ácido nucleico isolada que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica o pseudoFab contendo um ou ambos de uma proteína de ligação e uma proteína de ligação multiespecífica do primeiro, segundo ou terceiro aspecto da presente invenção.

[311] Um aspecto da presente invenção se refere a um polinucleotídeo que codifica uma proteína de ligação de qualquer um do primeiro ao terceiro aspectos da presente invenção.

[312] Metodologias de DNA recombinante padrão são usadas para construir os polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos que formam as proteínas de ligação, incorporar esses polinucleotídeos em vetores de expressão recombinantes e introduzir tais vetores nas células hospedeiras. Vide, por exemplo, Sambrook et al., 2001, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3ª ed.). As reações enzimáticas e técnicas de purificação podem ser realizadas de acordo com as especificações do fabricante, como comumente realizadas na técnica, ou conforme descritas neste documento. A menos que sejam fornecidas definições específicas, a nomenclatura utilizada em conexão com os procedimentos e técnicas laboratoriais de química analítica, química orgânica sintética, e química medicinal e farmacêutica aqui descritos é aquela bem conhecida e comumente usada na técnica. Da mesma forma, as técnicas convencionais podem ser usadas para sínteses químicas, análises químicas, preparação farmacêutica, formulação, entrega e tratamento de pacientes.

[313] Outros aspectos da presente divulgação se referem a moléculas de ácido nucleico isoladas que compreendem uma sequência de nucleotídeos que codifica qualquer uma das proteínas de ligação aqui descritas. Em algumas modalidades do quinto aspecto da presente invenção, as moléculas de ácido nucleico isoladas compreendem uma sequência que é pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90 %, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica a um ácido nucleico que codifica qualquer uma das proteínas de ligação aqui descritas.

[314] Certos aspectos da presente divulgação se referem a kits de polinucleotídeos. Em algumas modalidades, um ou mais dos polinucleotídeos é um vetor (por exemplo, um vetor de expressão). Os kits podem encontrar uso, inter alia, na produção de uma ou mais das proteínas de ligação aqui descritas, por exemplo, um domínio de heterodimerização, uma proteína de ligação bivalente, trivalente, tetravalente ou multivalente da presente divulgação.

[315] Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado está operativamente ligado a um promotor heterólogo para dirigir a transcrição da sequência de ácido nucleico que codifica a proteína de ligação. Um promotor pode referir-se a sequências de controle de ácido nucleico que dirigem a transcrição de um ácido nucleico. Uma primeira sequência de ácido nucleico está operativamente ligada a uma segunda sequência de ácido nucleico quando a primeira sequência de ácido nucleico é colocada em uma relação funcional com a segunda sequência de ácido nucleico. Por exemplo, um promotor está operativamente ligado a uma sequência de codificação de uma proteína de ligação se o promotor afetar a transcrição ou expressão da sequência de codificação. Exemplos de promotores podem incluir, mas não estão limitados a, promotores obtidos a partir de genomas de vírus (tais como vírus polioma, vírus da varíola aviária, adenovírus (tal como Adenovírus 2), vírus do papiloma bovino, vírus do sarcoma aviário, citomegalovírus, um retrovírus, vírus da hepatite-B, Vírus Símio 40 (SV40) e semelhantes), a partir de promotores eucarióticos heterólogos (como o promotor de actina, um promotor de imunoglobulina, de promotores de choque térmico e semelhantes), o promotor CAG (Niwa et al., Gene 108 (2): 193-9, 1991), o promotor de fosfoglicerato quinase (PGK), um promotor indutível por tetraciclina (Masui et al., Nucleic Acids Res. 33: e43, 2005), o sistema lac, o sistema trp, o sistema tac, o sistema trc, o operador principal e as regiões promotoras do fago lambda, o promotor da 3-fosfoglicerato quinase, os promotores da fosfatase ácida de levedura, e o promotor dos fatores de correspondência alfa de levedura. Os polinucleotídeos que codificam as proteínas de ligação da presente divulgação podem estar sob o controle de um promotor constitutivo, um promotor induzível ou qualquer outro promotor adequado aqui descrito ou outro promotor adequado que será prontamente reconhecido por um versado na técnica.

[316] Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado é incorporado em um vetor. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor de expressão. Os vetores de expressão podem incluir uma ou mais sequências regulatórias operativamente ligadas ao polinucleotídeo a ser expresso. O termo "sequência reguladora", tal como aqui utilizado, inclui promotores, potencializadores e outros elementos de controle de expressão (por exemplo, sinais de poliadenilação). Exemplos de potenciadores adequados podem incluir, mas não estão limitados a, sequências potenciadoras de genes de mamíferos (tais como globina, elastase, albumina, α-fetoproteína, insulina e semelhantes) e sequências potenciadoras de um vírus de células eucarióticas (como potenciador SV40 no lado posterior da origem de replicação (pb 100- 270), o intensificador do promotor inicial de citomegalovírus, o intensificador de polioma no lado posterior da origem de replicação, intensificadores de adenovírus e semelhantes). Exemplos de vetores adequados podem incluir, por exemplo, plasmídeos, cosmídeos, epissomas, transposons e vetores virais (por exemplo, adenoviral, vaccinia viral, Sindbis-viral, sarampo, herpes viral, lentiviral, retroviral, vetores virais adeno-associados, etc.). Os vetores de expressão podem ser usados para transfectar células hospedeiras, tais como, por exemplo, células bacterianas, células de levedura, células de inseto e células de mamífero. Os vetores de DNA viral e plasmídeo biologicamente funcionais, capazes de expressão e replicação em um hospedeiro, são conhecidos na técnica e podem ser usados para transfectar qualquer célula de interesse.

[317] Em um sexto aspecto, a presente invenção se refere a um vetor de expressão que compreende a molécula de ácido nucleico do quinto aspecto da presente invenção.

[318] Outros aspectos da presente divulgação se referem a um sistema de vetor que compreende um ou mais vetores que codificam uma primeira, segunda, terceira e quarta cadeia polipeptídica de qualquer uma das proteínas de ligação aqui descritas. Em algumas modalidades do sexto aspecto da presente invenção, o sistema de vetor compreende um primeiro vetor que codifica a primeira cadeia polipeptídica da proteína de ligação, um segundo vetor que codifica a segunda cadeia polipeptídica da proteína de ligação, um terceiro vetor que codifica a terceira cadeia polipeptídica da proteína de ligação e um quarto vetor que codifica a quarta cadeia polipeptídica da ligação proteína. Em algumas modalidades, o sistema de vetor compreende um primeiro vetor que codifica a primeira e a segunda cadeias polipeptídicas da proteína de ligação e um segundo vetor que codifica a terceira e a quarta cadeias polipeptídicas da proteína de ligação. Em algumas modalidades, o sistema de vetor compreende um primeiro vetor que codifica a primeira e a terceira cadeias polipeptídicas da proteína de ligação e um segundo vetor que codifica a segunda e a quarta cadeias polipeptídicas da proteína de ligação. Em algumas modalidades, o sistema de vetor compreende um primeiro vetor que codifica a primeira e a quarta cadeias polipeptídicas da proteína de ligação e um segundo vetor que codifica a segunda e terceira cadeias polipeptídicas da proteína de ligação. Em algumas modalidades, o sistema de vetor compreende um primeiro vetor que codifica a primeira, segunda, terceira e quarta cadeias polipeptídicas da proteína de ligação. Os um ou mais vetores do sistema de vetor podem ser qualquer um dos vetores aqui descritos. Em algumas modalidades, um ou mais vetores são vetores de expressão. (f) Células Hospedeiras Isoladas

[319] Em um sétimo aspecto, a presente invenção se refere a uma célula hospedeira isolada compreendendo a molécula de ácido nucleico do quinto aspecto da presente invenção ou o vetor de expressão do sexto aspecto da presente invenção.

[320] Outros aspectos da presente divulgação se referem a uma célula hospedeira isolada compreendendo um ou mais polinucleotídeos,

kits de polinucleotídeos, vetores e/ou sistemas de vetores aqui descritos.

Em algumas modalidades do sétimo aspecto da presente invenção, a célula hospedeira é uma célula bacteriana (por exemplo, uma célula de E. coli). Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula E.coli DH5α.

Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula de levedura (por exemplo, uma célula de S. cerevisiae). Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula de inseto.

Exemplos de células hospedeiras de inseto podem incluir, por exemplo, células de Drosophila (por exemplo, células S2), células de Trichoplusia ni (por exemplo, células High Five™) e células de Spodoptera frugiperda (por exemplo, células Sf21 ou Sf9). Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula de mamífero.

Exemplos de células hospedeiras de mamíferos podem incluir, por exemplo, células renais embrionárias humanas (por exemplo, células 293 ou 293 subclonadas para crescimento em cultura em suspensão), células Expi293TM, células CHO, células de rim de filhote de hamster (por exemplo, BHK, ATCC CCL 10), células de Sertoli de camundongo (por exemplo, células TM4), células de rim de macaco (por exemplo, CV1 ATCC CCL 70), células de rim de macaco verde africano (por exemplo, VERO-76, ATCC CRL- 1587), células de carcinoma cervical humano (por exemplo, HELA, ATCC CCL 2), células renais caninas (por exemplo, MDCK, ATCC CCL 34), células de fígado de rato búfalo (por exemplo, BRL 3A, ATCC CRL 1442), células de pulmão humano (por exemplo, W138, ATCC CCL 75), células de fígado humano (por exemplo, Hep G2, HB 8065), células de tumor mamário de camundongo (por exemplo, MMT 060562, ATCC CCL51), células TRI, células MRC 5, células FS4, uma linha de hepatoma humano (por exemplo, Hep G2), células de mieloma (por exemplo, células NS0 e Sp2/0) e semelhantes.

IV. MÉTODOS DE PREPARAÇÃO

1. Métodos de expressão

[321] Outros aspectos da presente divulgação se referem a um método de produção de qualquer uma das proteínas de ligação aqui descritas. Em algumas modalidades, o método inclui: a) cultivar uma célula hospedeira (por exemplo, qualquer uma das células hospedeiras aqui descritas) compreendendo um ácido nucleico isolado, vetor e/ou sistema de vetor (por exemplo, qualquer um dos ácidos nucleicos isolados, vetores e/ou sistemas de vetor aqui descritos) sob condições tais que a célula hospedeira expressa a proteína de ligação; e b) isolar a proteína de ligação da célula hospedeira. Os métodos de cultura de células hospedeiras em condições para expressar uma proteína são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Os métodos de isolamento de proteínas de células hospedeiras cultivadas são bem-conhecidos por aqueles versados na técnica, incluindo, por exemplo, por cromatografia de afinidade (por exemplo, cromatografia de afinidade em duas etapas compreendendo cromatografia de afinidade de proteína A seguida por cromatografia de exclusão de tamanho).

2. Métodos de Purificação

[322] Em um quarto aspecto, a presente invenção se refere a um método para purificar uma proteína de ligação multiespecífica do terceiro aspecto da invenção, compreendendo as etapas de: (i) aplicar uma solução compreendendo a proteína de ligação multiespecífica a um primeiro, segundo ou terceiro reagente de afinidade, que se liga especificamente a um sítio de reconhecimento da proteína de ligação multiespecífica para o primeiro, segundo ou terceiro reagente de afinidade; e (ii) recuperar a proteína de ligação multiespecífica que não se liga ao primeiro, segundo ou terceiro reagente de afinidade ou a proteína de ligação multiespecífica que se liga ao primeiro ou terceiro reagente de afinidade, em que cada um do primeiro, segundo e terceiro reagente de afinidade se liga a um sítio de reconhecimento diferente da proteína de ligação multiespecífica.

[323] Em algumas modalidades, o método compreendendo as etapas adicionais de aplicação de uma solução compreendendo a proteína de ligação multiespecífica recuperada na etapa (ii) ao primeiro, segundo ou terceiro reagente de afinidade, em que o reagente de afinidade é diferente do reagente de afinidade usado na etapa (i), recuperar a proteína de ligação multiespecífico que não se liga ao primeiro, segundo ou terceiro reagente de afinidade ou à proteína de ligação multiespecífica que se liga ao primeiro ou terceiro reagente de afinidade.

[324] Em algumas modalidades, o primeiro reagente de afinidade se liga a Cк; o segundo reagente de afinidade é a proteína A; e/ou o terceiro reagente de afinidade é a Proteína G.

[325] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente divulgação é purificada por cromatografia de afinidade de proteína A, cromatografia de afinidade de cadeia leve kappa (por exemplo, usando uma resina KappaSelect de acordo com as instruções do fabricante; GE Healthcare) e, opcionalmente, cromatografia de afinidade de cadeia leve lambda (por exemplo, usando uma resina LambdaFabSelect de acordo com as instruções do fabricante; GE Healthcare). Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente divulgação é purificada por cromatografia de afinidade de Proteína A, cromatografia de afinidade de cadeia leve lambda (por exemplo, usando uma resina LambdaFabSelect de acordo com as instruções do fabricante; GE Healthcare) e, opcionalmente,

cromatografia de afinidade de cadeia leve kappa (por exemplo, usando uma resina KappaSelect de acordo com as instruções do fabricante; GE Healthcare). Em algumas modalidades, a proteína de ligação compreende duas regiões Fc, cada uma compreendendo um domínio CH3, e apenas um dos domínios CH3 compreende substituições de aminoácidos nas posições correspondentes às posições 435 e 436 de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o Índice EU, em que as substituições de aminoácido são H435R e Y436F.

Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente divulgação é purificada por cromatografia de afinidade de proteína A, em seguida, cromatografia de afinidade de cadeia leve kappa (por exemplo, usando uma resina KappaSelect de acordo com as instruções do fabricante; GE Healthcare), então opcionalmente cromatografia de afinidade de cadeia leve lambda (por exemplo, usando uma resina LambdaFabSelect de acordo com as instruções do fabricante; GE Healthcare) na sequência.

Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente divulgação é purificada por cromatografia de afinidade de proteína A, então cromatografia de afinidade de cadeia leve lambda (por exemplo, usando uma resina LambdaFabSelect de acordo com as instruções do fabricante; GE Healthcare), então opcionalmente cromatografia de afinidade de cadeia leve kappa (por exemplo, usando uma resina KappaSelect de acordo com as instruções do fabricante; GE Healthcare) na sequência.

Por exemplo, em algumas modalidades, a proteína de ligação é contatada com a Proteína A, eluída da Proteína A sob condições adequadas para isolar a proteína de ligação das proteínas de ligação compreendendo 0 ou 2 domínios CH3 compreendendo as substituições de aminoácidos são H435R e Y436F, contatadas com um meio de afinidade de cadeia leve kappa (por exemplo, como usado na resina KappaSelect; GE Healthcare), e eluída do meio de afinidade de cadeia leve kappa sob condições adequadas para isolar a proteína de ligação longe de proteínas de ligação compreendendo apenas domínios CL lambda (por exemplo, de acordo com as instruções do fabricante).

[326] As condições adequadas para a eluição da Proteína A são conhecidas na técnica, incluindo, sem limitação, um gradiente de eluição em etapas de pH 4,5-2,8. Em algumas modalidades, é utilizada a proteína A ou uma variante da proteína A útil para a purificação da proteína. Em algumas modalidades, a Proteína A é fixada a um substrato ou resina, por exemplo, como parte de um meio de cromatografia. Em algumas modalidades, após a eluição do meio de afinidade de cadeia leve kappa, a proteína de ligação é contatada com um meio de afinidade de cadeia leve lambda (por exemplo, como usado na resina LambdaFabSelect; GE Healthcare) e eluída do meio de afinidade de cadeia leve lambda sob condições adequadas para isolar a proteína de ligação longe de proteínas de ligação compreendendo apenas domínios CL kappa (por exemplo, de acordo com as instruções do fabricante). Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente divulgação é detectada usando cromatografia HIC. Em algumas modalidades, a proteína de ligação compreende: uma primeira cadeia polipeptídica que compreende um domínio CL lambda; um domínio CH3 de uma segunda cadeia polipeptídica que compreende substituições de aminoácidos nas posições correspondentes às posições 354 e 366 de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o índice EU, em que as substituições de aminoácidos são S354C e T366W; um domínio CH3 de uma terceira cadeia polipeptídica que compreende substituições de aminoácidos nas posições correspondentes às posições 349, 366, 368, 407, 435 e 436 de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o índice EU, em que as substituições de aminoácidos são Y349C, T366S, L368A, Y407V, H435R e Y436F; e uma quarta cadeia polipeptídica que compreende um domínio CL kappa. Em algumas modalidades, a proteína de ligação é produzida por uma célula hospedeira. Em algumas modalidades, a proteína de ligação é purificada a partir de um meio de cultura celular ou extrato de célula hospedeira. Em algumas modalidades, as proteínas de ligação são secretadas por uma célula hospedeira ou produzidas e extraídas a partir de uma célula hospedeira (por exemplo, antes de serem contatadas com a proteína A). Em algumas modalidades, a proteína de ligação está em um meio de cultura de células ou extrato de célula hospedeira quando em contato com a Proteína A. Em algumas modalidades, a proteína de ligação é purificada de outras proteínas de ligação, polipeptídeos e/ou outros componentes celulares.

[327] Em algumas modalidades, um domínio nocaute estabilizado é usado para facilitar a síntese preferencial ou purificação de uma proteína de ligação multiespecífica desejada, em que o domínio nocaute estabilizado compreende (1) uma ou mais mutações de inativação que abolem a ligação a antígeno alvo; e (2) uma ou mais ligações dissulfeto intercadeia construídas geneticamente que conferem estabilidade térmica aumentada (Tm) em relação à molécula Fab de referência, em que a molécula Fab de referência é idêntica à molécula pseudoFab exceto que, em uma molécula pseudoFab, domínios CH1 e CL a molécula Fab de referência são substituídas por domínios VHX e VLX. V. FORMULAÇÃO/COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA

[328] Em um oitavo aspecto, a presente invenção se refere a uma composição farmacêutica que compreende um veículo farmaceuticamente aceitável e uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína de qualquer um do primeiro a terceiro aspectos da presente invenção.

[329] As composições terapêuticas ou farmacêuticas que compreendem proteínas de ligação estão dentro do escopo da divulgação. Algumas modalidades do oitavo aspecto da presente invenção compreendem composições farmacêuticas que compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer uma das proteínas de ligação como aqui descritas, ou um conjugado de proteína de ligação-droga, em mistura com um agente de formulação farmaceuticamente ou fisiologicamente aceitável selecionado para adequação com o modo de administração.

[330] Os materiais de formulação aceitáveis são tipicamente não tóxicos para os destinatários nas dosagens e concentrações usadas.

[331] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica pode conter materiais de formulação para modificar, manter ou preservar, por exemplo, o pH, osmolaridade, viscosidade, clareza, cor, isotonicidade, odor, esterilidade, estabilidade, taxa de dissolução ou liberação, adsorção, ou penetração da composição. Os materiais de formulação adequados incluem, mas não estão limitados a, aminoácidos (como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina), antimicrobianos, antioxidantes (como ácido ascórbico, sulfito de sódio ou hidrogenossulfito de sódio), tampões (como como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos ou outros ácidos orgânicos), agentes de volume (como manitol ou glicina), agentes quelantes (como ácido etilenodiamina tetra-acético (EDTA)), agentes complexantes (como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina ou hidroxipropil-beta- ciclodextrina), preenchedores, monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos (como glicose, manose ou dextrinas), proteínas (como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas), corantes, aromatizantes e agentes diluentes, agentes emulsionantes, polímeros hidrofílicos (como polivinilpirrolidona), polipeptídeos de baixo peso molecular, contraíons formadores de sal (como sódio), conservantes (como cloreto de benzalcônio, ácido benzóico, ácido salicílico, timerosal, álcool fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorexidina, ácido sórbico ou peróxido de hidrogênio), solventes (como glicerina, propilenoglicol ou polietilenoglicol), álcoois de açúcar (como manitol ou sorbitol), agentes de suspensão, surfactantes ou agentes umectantes (como plurônicos; PEG; ésteres de sorbitano; polissorbatos, tais como polissorbato 20 ou polissorbato 80; triton; trometamina; lecitina; colesterol ou tiloxapal), agentes de aumento de estabilidade (como sacarose ou sorbitol), agentes de aumento de tonicidade (como haletos de metal alcalino, por exemplo, cloreto de sódio ou potássio ou manitol sorbitol), veículos de entrega, diluentes, excipientes e/ou adjuvantes farmacêuticos (vide, por exemplo, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (18ª Ed., AR Gennaro, ed., Mack Publishing Company 1990), e edições subsequentes das mesmas, aqui incorporadas por referência para qualquer finalidade).

[332] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica ideal será determinada por um versado na técnica, dependendo, por exemplo, da via de administração pretendida, formato de entrega e dosagem desejada. Essas composições podem influenciar o estado físico, estabilidade, taxa de liberação in vivo e taxa de depuração in vivo da proteína de ligação.

[333] Em algumas modalidades, o veículo ou transportador primário em uma composição farmacêutica pode ser de natureza aquosa ou não aquosa. Por exemplo, um veículo ou transportador adequado para injeção pode ser água, solução salina fisiológica ou fluido cerebrospinal artificial, possivelmente suplementado com outros materiais comuns em composições para administração parenteral. Solução salina tamponada neutra ou solução salina misturada com albumina sérica são outros veículos exemplares. Outro exemplar composições farmacêuticas compreendem tampão Tris de cerca de pH 7,0-8,5, ou tampão acetato de cerca de pH 4,0-5,5, que pode ainda incluir sorbitol ou um substituto adequado. Em uma modalidade da divulgação, as composições de proteínas de ligação podem ser preparadas para armazenamento misturando a composição selecionada com o grau de pureza desejado com agentes de formulação opcionais na forma de um bolo liofilizado ou uma solução aquosa. Além disso, a proteína de ligação pode ser formulada como um liofilizado usando excipientes apropriados, como sacarose.

[334] Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas da divulgação podem ser selecionadas para entrega parenteral ou subcutânea. Alternativamente, as composições podem ser selecionadas para inalação ou para distribuição através do trato digestivo, tal como por via oral. A preparação de tais composições farmaceuticamente aceitáveis está dentro da especialidade na técnica.

[335] Em algumas modalidades, os componentes da formulação estão presentes em concentrações que são aceitáveis para o sítio de administração. Por exemplo, os tampões são usados para manter a composição em pH fisiológico ou em um pH ligeiramente mais baixo, tipicamente dentro de uma faixa de pH de cerca de 5 a cerca de 8.

[336] Quando a administração parenteral é contemplada, as composições terapêuticas para uso podem estar na forma de uma solução aquosa apirogênica, parenteralmente aceitável, compreendendo a proteína de ligação desejada em um veículo farmaceuticamente aceitável. Um veículo particularmente adequado para injeção parenteral é água destilada estéril na qual uma proteína de ligação é formulada como uma solução isotônica estéril, devidamente preservada. Ainda outra preparação pode envolver a formulação da molécula desejada com um agente, como microesferas injetáveis, partículas bioerodíveis, compostos poliméricos (como ácido polilático ou ácido poliglicólico), grânulos ou lipossomas, que proporcionam a liberação controlada ou sustentada do produto, que pode então ser entregue por meio de uma injeção de depósito. O ácido hialurônico também pode ser usado, e isso pode ter o efeito de promover uma duração sustentada na circulação. Outros meios adequados para a introdução da molécula desejada incluem dispositivos implantáveis de distribuição de drogas.

[337] Em uma modalidade, uma composição farmacêutica pode ser formulada para inalação. Por exemplo, uma proteína de ligação pode ser formulada como um pó seco para inalação. As soluções de inalação de proteínas de ligação também podem ser formuladas com um propulsor para entrega em aerossol. Em ainda outra modalidade, as soluções podem ser nebulizadas.

[338] Também está contemplado que certas formulações podem ser administradas por via oral. Em uma modalidade da divulgação, as proteínas de ligação multiespecíficas que são administradas desta forma podem ser formuladas com ou sem aqueles transportadores habitualmente usados na composição de formas de dosagem sólidas, como comprimidos e cápsulas. Por exemplo, uma cápsula pode ser projetada para liberar a porção ativa da formulação no ponto no trato gastrointestinal quando a biodisponibilidade é maximizada e a degradação pré-sistêmica é minimizada. Agentes adicionais podem ser incluídos para facilitar a absorção da proteína de ligação. Diluentes, aromatizantes, ceras de baixo ponto de fusão, óleos vegetais, lubrificantes, agentes de suspensão, agentes de desintegração de comprimidos e aglutinantes também podem ser usados.

[339] Outra composição farmacêutica pode envolver uma quantidade eficaz de proteínas de ligação multiespecíficas em uma mistura com excipientes não tóxicos que são adequados para a fabricação de comprimidos. Ao dissolver os comprimidos em água estéril, ou outro veículo apropriado, as soluções podem ser preparadas na forma de dose unitária. Os excipientes adequados incluem, mas não estão limitados a, diluentes inertes, tais como carbonato de cálcio, carbonato ou bicarbonato de sódio, lactose ou fosfato de cálcio; ou agentes de ligação, tais como amido, gelatina ou acácia; ou agentes lubrificantes, tais como estearato de magnésio, ácido esteárico ou talco.

[340] Composições farmacêuticas adicionais da divulgação serão evidentes para aqueles versados na técnica, incluindo formulações envolvendo proteínas de ligação em formulações de entrega sustentada ou controlada. As técnicas para formular uma variedade de outros meios de entrega sustentada ou controlada, tais como transportadores de lipossomas, micropartículas bioerodíveis ou grânulos porosos e injeções de depósito, também são conhecidas pelos versados na técnica. Exemplos adicionais de preparações de liberação sustentada incluem matrizes poliméricas semipermeáveis na forma de artigos moldados, por exemplo, filmes ou microcápsulas. Matrizes de liberação sustentada podem incluir poliésteres, hidrogéis, polilactídeos, copolímeros de ácido L-glutâmico e gama etil-L-glutamato, poli (2- hidroxietil-metacrilato), etileno vinil acetato ou ácido poli-D(-)-3- hidroxibutírico. As composições de liberação sustentada também podem incluir lipossomas, que podem ser preparados por qualquer um dos vários métodos conhecidos na técnica.

[341] Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas devem ser usadas para administração in vivo, normalmente devem ser estéreis. Isso pode ser e realizado por filtração através de membranas de filtração estéreis. Quando a composição é liofilizada, a esterilização usando este método pode ser conduzida antes ou após a liofilização e reconstituição. A composição para administração parentérica pode ser armazenada na forma liofilizada ou em solução. Além disso, as composições parenterais geralmente são colocadas em um recipiente com uma porta de acesso estéril, por exemplo, um saco ou frasco de solução intravenosa com uma rolha que pode ser perfurada por uma agulha de injeção hipodérmica.

[342] Uma vez que a composição farmacêutica foi formulada, ela pode ser armazenada em frascos estéreis como uma solução,

suspensão, gel, emulsão, sólido ou como um pó desidratado ou liofilizado. Tais formulações podem ser armazenadas em uma forma pronta para uso ou em uma forma (por exemplo, liofilizada) requerendo reconstituição antes da administração.

[343] A divulgação também abrange kits para a produção de uma unidade de administração de dose única. Cada um dos kits pode conter um primeiro recipiente com uma proteína de ligação multiespecífica seca e um segundo recipiente com uma formulação aquosa. Também estão incluídos no escopo desta divulgação kits contendo seringas pré- prenchidas de uma ou várias câmaras (por exemplo, seringas líquidas e liosseringas).

[344] A quantidade eficaz de uma composição farmacêutica de proteína de ligação a ser usada terapeuticamente dependerá, por exemplo, do contexto e objetivos terapêuticos. Um versado na técnica apreciará que os níveis de dosagem apropriados para o tratamento irão, portanto, variar dependendo, em parte, da molécula entregue, a indicação para a qual a proteína de ligação está sendo usada, a via de administração e o tamanho (peso corporal, superfície corporal ou tamanho do órgão) e condição (idade e estado geral de saúde) do paciente. Consequentemente, o clínico pode titular a dosagem e modificar a via de administração para obter o efeito terapêutico ideal.

[345] A frequência de dosagem dependerá dos parâmetros farmacocinéticos da proteína de ligação na formulação a ser usada. Normalmente, um clínico administrará a composição até que uma dosagem que alcance o efeito desejado seja alcançada. A composição pode, portanto, ser administrada como uma dose única, como duas ou mais doses (que podem ou não conter a mesma quantidade da molécula desejada) ao longo do tempo, ou como uma infusão contínua por meio de um dispositivo de implantação ou cateter. O refinamento adicional da dosagem apropriada é rotineiramente feito por aqueles versados na técnica e está dentro do âmbito das tarefas rotineiramente realizadas por eles. As dosagens apropriadas podem ser verificadas através do uso de dados de resposta à dose apropriados.

[346] A via de administração da composição farmacêutica está de acordo com métodos conhecidos, por exemplo, oralmente; através da injeção por via intravenosa, intraperitoneal, intracerebral (intraparenquimatosa), intracerebroventricular, intramuscular, intraocular, intraarterial, intraportal ou intralesional; por sistemas de liberação sustentada; ou por dispositivos de implantação. Quando desejado, as composições podem ser administradas por injeção em bolus ou continuamente por infusão ou por dispositivo de implantação.

[347] Em algumas modalidades, a composição também pode ser administrada localmente por meio da implantação de uma membrana, esponja ou outro material apropriado no qual a molécula desejada foi absorvida ou encapsulada. Quando um dispositivo de implantação é usado, o dispositivo pode ser implantado em qualquer tecido ou órgão adequado e a distribuição da molécula desejada pode ser por difusão, bolus de liberação programada ou administração contínua. VI. MÉTODOS DE TRATAMENTO/USO

[348] Em um nono aspecto, a presente invenção se refere a um método de tratamento de um distúrbio no qual a atividade do antígeno é prejudicial, o método compreendendo administrar a um indivíduoindivíduo em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de uma proteína de ligação de qualquer um dos primeiros a terceiros aspectos da presente invenção. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação multiespecífica para uso como um medicamento é fornecida.

[349] As proteínas de ligação podem ser usadas em qualquer método de ensaio conhecido, tal como ensaios de ligação competitiva, ensaios de sanduíche diretos e indiretos e ensaios de imunoprecipitação para a detecção e quantificação de um ou mais antígenos alvo. As proteínas de ligação se ligarão a um ou mais antígenos alvo com uma afinidade que é apropriada para o método de ensaio a ser usado.

[350] Para aplicações de diagnóstico, em algumas modalidades, as proteínas de ligação podem ser marcadas com uma porção detectável. A porção detectável pode ser qualquer uma que seja capaz de produzir, direta ou indiretamente, um sinal detectável. Por exemplo, a porção detectável pode ser um radioisótopo, como 3H, 14 C, 32 P, 35 S, 125 99 111 67 I, Tc, In ou Ga; um composto fluorescente ou quimioluminescente, tal como isotiocianato de fluoresceína, rodamina ou luciferina; ou uma enzima, tal como fosfatase alcalina, β- galactosidase ou peroxidase de rábano silvestre.

[351] As proteínas de ligação também são úteis para imagiologia in vivo. Uma proteína de ligação marcada com uma porção detectável pode ser administrada a um animal, por exemplo, na corrente sanguínea e a presença e localização do anticorpo marcado no hospedeiro testado. A proteína de ligação pode ser marcada com qualquer porção que seja detectável em um animal, seja por ressonância magnética nuclear, radiologia ou outros meios de detecção conhecidos na técnica.

[352] Para aplicações clínicas ou de pesquisa, em algumas modalidades, as proteínas de ligação podem ser conjugadas a um agente citotóxico. Uma variedade de anticorpos acoplados a agentes citotóxicos (isto é, conjugados anticorpo-droga) têm sido usados para direcionar cargas citotóxicas para células tumorais específicas. Agentes citotóxicos e ligantes que conjugam os agentes a um anticorpo são conhecidos na técnica; vide, por exemplo, Parslow, A.C. et al. (2016) Biomedicines 4:14 e Kalim, M. et al. (2017) Drug Des. Develop. Ther. 11: 2265-2276.

[353] A divulgação também se refere a um kit que compreende uma proteína de ligação e outros reagentes úteis para detectar os níveis de antígeno alvo em amostras biológicas. Esses reagentes podem incluir um rótulo detectável, soro de bloqueio, amostras de controle positivo e negativo e reagentes de detecção. Em algumas modalidades, o kit compreende uma composição compreendendo qualquer proteína de ligação, polinucleotídeo, vetor, sistema de vetor e/ou célula hospedeira aqui descritos. Em algumas modalidades, o kit compreende um recipiente e um rótulo ou bula no ou associado ao recipiente. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, sacos de solução IV, etc. Os recipientes podem ser formados de uma variedade de materiais, como vidro ou plástico. O recipiente contém uma composição que é por si só ou combinada com outra composição eficaz para tratar, prevenir e/ou diagnosticar uma condição e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser um saco de solução intravenosa ou um frasco com uma rolha que pode ser perfurado por uma agulha de injeção hipodérmica). Em algumas modalidades, o rótulo ou bula indica que a composição é usada para prevenir, diagnosticar e/ou tratar a condição de escolha. Alternativamente, ou adicionalmente, o artigo de fabricação ou kit pode compreender ainda um segundo (ou terceiro) recipiente compreendendo um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática para injeção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Pode ainda incluir outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.

[354] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente divulgação é administrada a um paciente em necessidade da mesma para o tratamento ou prevenção do câncer. Em algumas modalidades, a presente divulgação se refere a um método de prevenção e/ou tratamento de uma doença ou distúrbio proliferativo (por exemplo, câncer). Em algumas modalidades, o método compreende a administração a um paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos uma das proteínas de ligação, ou composições farmacêuticas relacionadas às mesmas, aqui descritas. Em algumas modalidades, o paciente é um ser humano.

[355] Em algumas modalidades, a pelo menos uma proteína de ligação é administrada em combinação com uma ou mais terapias anticâncer (por exemplo, qualquer terapia anticâncer conhecida na técnica, tal como um agente quimioterápico ou terapia). Em algumas modalidades, a pelo menos uma proteína de ligação é administrada antes de uma ou mais terapias anticâncer. Em algumas modalidades, a pelo menos uma proteína de ligação é administrada simultaneamente com uma ou mais terapias anticâncer. Em algumas modalidades, a pelo menos uma proteína de ligação é administrada após uma ou mais terapias antirretrovirais.

EXEMPLOS

[356] Antes da presente invenção ser descrita em detalhes abaixo, deve ser entendido que esta invenção não está limitada à metodologia, protocolos e reagentes específicos descritos neste documento, pois estes podem variar. Também deve ser entendido que a terminologia usada neste documento tem o propósito de descrever modalidades particulares apenas, e não se destina a limitar o escopo da presente invenção, que será limitado apenas pelas reivindicações anexas. A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm os mesmos significados como comumente entendidos por alguém versado na técnica. Em modalidades particulares, os termos usados neste documento são definidos conforme descrito em "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)," Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. e Kolb, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-

4010 Basel, Suíça). A menos que definido de outra forma neste documento, os termos científicos e técnicos usados neste documento têm os significados que são comumente compreendidos por aqueles versados na técnica. No caso de qualquer ambiguidade latente, as definições fornecidas neste documento prevalecem sobre qualquer dicionário ou definição extrínseca. A menos que exigido de outra forma pelo contexto, os termos singulares devem incluir pluralidades e os termos plurais devem incluir o singular. O uso de "ou" significa "um e/ou" a menos que indicado de outra forma. O uso do termo "incluindo", bem como outras formas, como "inclui" e "incluído", não é limitativo. Conforme usado neste documento, a menos que indicado de outra forma, as formas singulares "um", "uma", "o" e "a" incluem referência no plural. Assim, por exemplo, uma referência a "uma proteína" inclui uma pluralidade de moléculas de proteína.

[357] Além disso, os experimentos aqui descritos, a menos que indicado de outra forma, usam técnicas convencionais de biologia molecular e celular e técnicas imunológicas dentro da habilidade na técnica. Essas técnicas são bem conhecidas do especialista e são totalmente explicadas na literatura. Vide, por exemplo, Ausubel, et al., Ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2008), incluindo todos os suplementos, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Quarta Edição) por MR Green e J. Sambrook e Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Capítulo 14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (2013, 2ª edição).

[358] Vários documentos são citados ao longo do texto desta especificação. Cada um dos documentos citados neste documento (incluindo todas as patentes, pedidos de patentes, publicações científicas, especificações do fabricante, instruções etc.), supra ou infra, é incorporado por meio deste por referência em sua totalidade. Nada aqui deve ser interpretado como uma admissão de que a invenção não tem o direito de anteceder tal divulgação em virtude da invenção anterior.

[359] A seguir, os elementos da presente invenção serão descritos. Esses elementos são listados com modalidades específicas, no entanto, deve ser entendido que eles podem ser combinados de qualquer maneira e em qualquer número para criar modalidades adicionais. Os exemplos descritos de várias maneiras e modalidades preferidas/particulares não devem ser interpretados como limitando a presente invenção apenas às modalidades explicitamente descritas. Esta descrição deve ser entendida para suportar e abranger modalidades que combinam as modalidades explicitamente descritas com qualquer número dos elementos divulgados e/ou preferidos. Além disso, quaisquer permutações e combinações de todos os elementos descritos neste pedido devem ser consideradas divulgadas pela descrição do presente pedido, a menos que o contexto indique o contrário.

[360] Geralmente, as nomenclaturas usadas em conexão com cultura de células e tecidos, biologia molecular, imunologia, microbiologia, genética e proteína e química de ácido nucleico e hibridização aqui descritas são aquelas bem conhecidas e comumente usadas na técnica. Os métodos e técnicas fornecidos neste documento são geralmente realizados de acordo com métodos convencionais bem conhecidos na técnica e conforme descrito em várias referências gerais e mais específicas que são citadas e discutidas ao longo da presente especificação, a menos que indicado de outra forma. As reações enzimáticas e as técnicas de purificação são realizadas de acordo com as especificações do fabricante, como comumente realizado na técnica ou conforme descrito neste documento. As nomenclaturas usadas em conexão com, e os procedimentos de laboratório e técnicas de, química analítica, química orgânica sintética e química medicinal e farmacêutica aqui descritos são aqueles bem conhecidos e comumente usados na técnica. As técnicas padrão são usadas para sínteses químicas, análises químicas, preparação farmacêutica, formulação e distribuição e tratamento de pacientes. Exemplo 1: Identificação de um arcabouço de substituição adequado

[361] As proteínas de ligação aqui divulgadas compreendem uma substituição de um par CH1/CL por um domínio VH/VL nocaute em vários formatos de anticorpo (vide Figuras 1, 2, 7, 10-13). A fim de identificar um arcabouço de substituição adequado para substituir um dímero CH1/CL, a introdução de pontes dissulfeto em certos pares VH/VL foi investigada. Além disso, a expressibilidade e a fusão com outro par VH/VL foram investigadas.

[362] Trastuzumab foi determinado como um arcabouço de substituição adequado para substituir um dímero CH1/CL a fim de resolver o problema de emparelhamento de cadeia leve correto. Exemplo 2: Uso de domínios variáveis de trastuzumab para substituir CH1/CL

[363] Foi determinado que os resíduos de cisteína nas posições VH44 e VL100 eram compatíveis para gerar uma ligação dissulfeto entre VH/VL de trastuzumab (referido aqui como ds-trastuzumab), estabilizando assim o heterodímero. Para determinação de sua estabilidade térmica, os domínios ds-trastuzumab foram incubados a uma concentração de 1 mg/mL em tampão D-PBS (GIBCO) por 14 dias a 40°C. As amostras de controle na mesma concentração foram mantidas a -80°Ce 4°C. Após a conclusão do teste de estresse, as amostras foram analisadas quanto ao seu conteúdo agregado por cromatografia analítica de exclusão de tamanho (SEC). SEC analítica foi realizada usando um instrumento BioSECcurity (PSS Polymer)

com uma coluna TSKgel SuperSW3000 (4,6 mm x 300 mm) e coluna de guarda TSKgel SuperSW HPLC (Tosoh Bioscience) a 25°C. A análise foi executada a uma taxa de fluxo de 0,25 ml/min usando 250 mM de NaCl, 100 mM de fosfato de Na pH 6,7 com detecção em 280 nm e 260 nm. A dispersão de luz estática foi detectada a 436 nm. 5 µl de amostra de proteína (a 1 mg/ml) foram aplicados na coluna. A avaliação dos dados foi realizada usando o software WinGPC v8.1 (PSS Polymer). Para estimativa do peso molecular, a coluna SEC foi calibrada com padrões de proteína em uma faixa de peso molecular de 6,5 a 670 KDa.

[364] Verificou-se que o arcabouço ds-trastuzumab (com as modificações de cisteína VH44/VL100) aumenta a termoestabilidade em 4°C(vide Figura 3A-C). Exemplo 3: Investigando a conexão com VH/VL em um projeto pseudo-IgG

[365] Construtos de Pseudo-IgG1 contendo a estrutura de Trastuzumab estabilizada por ligação dissulfeto como um arcabouço de substituição para CH1/CL foram gerados. O arcabouço ds-trastuzumab foi fundido a um par VH/VL de interesse com o ligante G4S ou (G4S)2 (vide Figura 6). Determinação dos Pontos de Fusão (Tm)

[366] Os pontos de fusão (Tm) foram determinados usando fluorimetria de varredura diferencial (DSF). As amostras foram diluídas em tampão D-PBS (Invitrogen) para uma concentração final de 0,2 µg/µl incluindo uma solução concentrada 4x de corante SYPRO-Orange (Invitrogen, estoque 5000x em DMSO) em D-PBS em placas de 96 poços semissaia brancas (BIORAD). Todas as medições foram feitas em duplicata usando um instrumento de PCR em tempo real MyiQ2 (BIORAD). As primeiras curvas derivadas negativas (-d(RFU)/dT) das curvas de fusão foram geradas no software iQ5 v2.1 (BIORAD). Os dados foram então exportados para o Excel para determinação de Tm e exibição gráfica dos dados.

[367] Seis sequências de anticorpos foram expressas na fusão com ds-trastuzumab e a % de monômero após a purificação da proteína A e a temperatura de fusão de cada proteína de fusão, bem como o anticorpo pseudo-IgG sem o domínio ds-trastuzumab são descritos na Tabela 4 abaixo. O nível de expressão foi ligeiramente inferior em comparação com aquele de WT-IgG e a quantidade de teor de monômero foi ligeiramente inferior em comparação com aquele de WT- IgG. Tabela 4: % de Monômeros e Temperatura de Fusão de Proteínas de Fusão Pseudo-IgG1 Anticorpo-ds-Trastuzumab Monômero [%] Temp. de ID Construto após Proteína A Fusão (°C) 1 IL13mAb-G4S-dsTras 90 68 - (SEQ ID Nº: 6 e 7) 2 IL13mAb-(G4S)2-dsTras 90 67 - (SEQ ID Nº: 8 e 9) 3 IL13mAb-huIgG1 100 70 80 (SEQ ID Nº: 10 e 11) 4 TNFa mAb-G4S-dsTras 94 61 66 (SEQ ID Nº: 12 e 13) 5 TNFa mAb-(G4S)2- 93 59 65 (SEQ ID Nº: 14 e 15) dsTras 6 TNFa mAb-huIgG1 99 71 - (SEQ ID Nº: 16 e 17) 7 IL6R mAb -G4S-dsTras 72 66 - (SEQ ID Nº: 18 e 19) 8 IL6R mAb -(G4S)2-dsTras 96 69 - (SEQ ID Nº: 20 e 21) 9 IL6R mAb -huIgG1 98 69 81 (SEQ ID Nº: 22 e 23) 10 CTLA4mAb-G4S-dsTras 72 67 - (SEQ ID Nº: 24 e 25)

Monômero [%] Temp. de ID Construto após Proteína A Fusão (°C) 11 CTLA4mAb-(G4S)2- 90 67 - (SEQ ID Nº: 26 e 27 dsTras 12 CTLA4mAb-huIgG1 99 69 75 (SEQ ID Nº: 28 e 29 13 PD1mAb-G4S-dsTras 80 57 65 (SEQ ID Nº: 30 e 31) 14 PD1mAb-(G4S)2-dsTras 76 54 65 (SEQ ID Nº: 32 e 33) 15 PD1mAb-huIgG1 99 68 - (SEQ ID Nº: 34 e 35) 16 IL4mAb-G4S-dsTras 97 70 - (SEQ ID Nº: 36 e 37) 17 IL4mAb -(G4S)2-dsTras 96 68 - (SEQ ID Nº: 38 e 39) 18 IL4mAb -huIgG1 99 70 81 (SEQ ID Nº: 40 e 41) Exemplo 4: Geração de variantes ds-Tras-knock-out (dsTrasKO)

[368] A atividade de ligação de trastuzumab foi eliminada pela introdução de quatro mutações de resíduos de aminoácidos chaves na região paratópica do anticorpo Trastuzumab para impactar a capacidade de ligação do anticorpo ao receptor tirosina-proteína quinase erbB-2 (HER2). Trastuzumab foi modelado com base na estrutura 1N8Z de PDB, disponível no banco de dados público de PDB. Quatro posições na cadeia pesada foram identificadas para potencialmente destruir a interação de ds-trastuzumab com seu antígeno. As posições incluem arginina R59 e R50, que se ligam a um glutamato e um aspartato em HER2. Reverter as cargas pela mutação da arginina em resíduos de glutamato deve resultar em uma repulsão de HER2. Sem a intenção de se limitar à teoria científica, as outras duas posições, tirosina Y33 e Y105, pareciam estabilizar o complexo pela interação Pi-Pi com uma fenilalanina. Sem a intenção de se limitar à teoria científica, as mutações na alanina deveriam interromper essa interação. Os dados cristalográficos do arquivo 1N8Z foram analisados com o pacote BIOVIA Discovery Studio. Uma atenção particular foi dada à região de interface existente entre o anticorpo (fab de Trastuzumab) e seu alvo (domínio da proteína HER2) (vide Figura 4). Análise de região de interface de cocristal 1N8Z

[369] Durante as análises de anticorpo e região de interface alvo, todas as interações não covalentes foram qualificadas usando Monitor de Ligação sem Interação da BIOVIA Discovery Studio. Um extrato da tabela resultante é apresentado na Tabela 5. A Tabela 5 apresenta, para cada interação, a distância entre os átomos interagindo, a natureza do tipo de interação e as características dos átomos interagindo. Tabela 5. Extrato do monitor de interação sem ligação para o arquivo 1N8Z PDB. Cadeias A, B e C correspondem respectivamente à cadeia leve Fab de Trastuzumab, cadeia pesada Fab de Trastuzumab e HER2. Para Nome Distância Categoria Tipos De Da Química Para Química B:ARG50:NH1 - Ligação de Hidrogênio; Aceitador de

3.13344 Ponte de Sal B:ARG50:NH1 Doador de H C:GLU558:OE1 C:GLU558:OE1 Eletrostática H B:ARG50:NH2 - Ligação de Hidrogênio; Aceitador de

2.60091 Ponte de Sal B:ARG50:NH2 Doador de H C:ASP560:OD2 C:ASP560:OD2 Eletrostática H B:ARG59:NH1 - Ligação de Hidrogênio; Aceitador de

3.60836 Ponte de Sal B:ARG59:NH1 Doador de H C:ASP560:OD2 C:ASP560:OD2 Eletrostática H B:ARG50:NH1 -

5.51884 Eletrostática Carga Atrativa B:ARG50:NH1 Positivo C:ASP560:OD1 Negativo C:ASP560:OD1 B:ARG50:NH2 -

4.67324 Eletrostática Carga Atrativa B:ARG50:NH2 Positivo C:GLU558:OE2 Negativo C:GLU558:OE2 B:ARG59:NH1 -

4.85457 Eletrostática Carga Atrativa B:ARG59:NH1 Positivo C:GLU558:OE2 Negativo C:GLU558:OE2 A:ARG66:NH2 -

5.45049 Eletrostática Carga Atrativa A:ARG66:NH2 Positivo C:GLU598:OE1 Negativo C:GLU598:OE1 Ligação de A:ASN30:ND2 - Aceitador de

3.2212 Ligação de Hidrogênio Hidrogênio A:ASN30:ND2 Doador de H C:GLN602:OE1 C:GLN602:OE1 H Convencional

Para Nome Distância Categoria Tipos De Da Química Para Química Ligação de A:THR94:OG1 - Aceitador de

2.82322 Ligação de Hidrogênio Hidrogênio A:THR94:OG1 Doador de H C:ASP560:OD2 C:ASP560:OD2 H Convencional Ligação de C:LYS569:NZ - Aceitador de

2.95716 Ligação de Hidrogênio Hidrogênio C:LYS569:NZ Doador de H A:TYR92:OH A:TYR92:OH H Convencional Ligação de C:LYS593:NZ - Aceitador de

2.41699 Ligação de Hidrogênio Hidrogênio C:LYS593:NZ Doador de H B:GLY103:O B:GLY103:O H Convencional B:GLY103:CA - Carbono Ligação Aceitador de

3.66277 Ligação de Hidrogênio B:GLY103:CA Doador de H C:ASP570:OD2 C:ASP570:OD2 de Hidrogênio H A:HIS91:CD2 - Carbono Ligação Aceitador de

2.88782 Ligação de Hidrogênio A:HIS91:CD2 Doador de H C:PRO571:O C:PRO571:O de Hidrogênio H C:PRO572:CA - Carbono Ligação Aceitador de

3.24352 Ligação de Hidrogênio C:PRO572:CA Doador de H A:TYR92:O A:TYR92:O de Hidrogênio H B:TYR33:OH - Pi-Doador Ligação

4.09465 Ligação de Hidrogênio B:TYR33:OH Doador de H C:PHE573 Pi-Orbitais C:PHE573 de Hidrogênio B:TYR33 -

5.30661 Hidrofóbica Pi-Pi Empilhado B:TYR33 Pi-Orbitais C:PHE573 Pi-Orbitais C:PHE573 B:TYR105 - Pi-Pi Em formato

4.81559 Hidrofóbica B:TYR105 Pi-Orbitais C:PHE573 Pi-Orbitais C:PHE573 de T A:ALA32 -

4.20712 Hidrofóbica Alquila A:ALA32 Alquila C:PRO571 Alquila C:PRO571 B:TYR57 -

4.20034 Hidrofóbica Pi-Alquila B:TYR57 Pi-Orbitais C:PRO557 Alquila C:PRO557 B:TRP99 -

5.45598 Hidrofóbica Pi-Alquila B:TRP99 Pi-Orbitais C:PRO572 Alquila C:PRO572 A:PHE53 -

4.09395 Hidrofóbica Pi-Alquila A:PHE53 Pi-Orbitais C:PRO603 Alquila C:PRO603 A:TYR92 -

5.22151 Hidrofóbica Pi-Alquila A:TYR92 Pi-Orbitais C:PRO571 Alquila C:PRO571

[370] Com base na tabela de interações não covalentes que ocorrem entre fab de Trastuzumab e proteína HER2, certas interações foram escolhidas para abolir a fim de interromper as interações de ligação.

Combinações de mutação propostas para interromper interações de ligação:

[371] As seguintes quatro mutações de resíduos de aminoácidos foram selecionadas com base nos dados de interação sem ligação, a fim de manter as sequências originais de Trastuzumab. Caso de resíduo de arginina 50 de cadeia pesada de trastuzumab:

[372] Este resíduo de arginina do anticorpo faz interações de ponte de sal com resíduos HER2 glutamato 558 e aspartato 560. A arginina 50 foi mutada em um resíduo de glutamato a fim de criar uma repulsão de resíduos HER2 glutamato 558 e aspartato 560. Caso de resíduo de arginina 59 de cadeia pesada de trastuzumab:

[373] Este resíduo de arginina do anticorpo faz interações de ponte de sal com resíduos HER2 glutamato 558 e aspartato 560. A arginina 59 foi mutada em um resíduo de glutamato a fim de criar uma repulsão de resíduos HER2 glutamato 558 e aspartato 560. Caso de resíduo de arginina 33 de cadeia pesada de tirosina:

[374] Este resíduo de tirosina 33 do anticorpo faz interações Pi com o resíduo HER2 fenilalanina 573. A tirosina 33 foi mutada em um resíduo de alanina a fim de interromper essas interações Pi que ocorrem entre o anticorpo e seu alvo. Caso de resíduo de arginina 105 de cadeia pesada de tirosina:

[375] Este resíduo de tirosina 105 do anticorpo faz interações Pi com o resíduo HER2 fenilalanina 573. A tirosina 105 foi mutada em um resíduo de alanina a fim de interromper essas interações Pi que ocorrem entre o anticorpo e seu alvo.

[376] As combinações particulares de resíduos de aminoácidos propostas para serem mutadas são apresentadas na Tabela 6.

Essas combinações levam a duas variantes do anticorpo de Trastuzumab. Tabela 6. Variantes Nocaute de Trastuzumab (TrasKO) Cadeia Pesada de Cadeia Pesada de Cadeia Pesada de Cadeia Pesada de Fab de Fab Variante1 Fab de Variante2 Fab de Variante3 Trastuzumab (TrasKO1) (TrasKO2) (TrasKO3) (SEQ ID Nº: 2) (SEQ ID Nº: 3) (SEQ ID Nº: 4) (SEQ ID Nº: 5) Arginina 50 Glutamato 50 Glutamato 50 Arginina 59 Glutamato 59 Glutamato 59 Tirosina 33 Alanina 33 Alanina 33 Tirosina 105 Alanina 105 Alanina 105

[377] Fab de Variante1 compreende todas as quatro mutações pontuais. Fab de Variante2 com a reversão de dois resíduos carregados positivamente em resíduos carregados negativamente possui uma área repulsiva para a proteína HER2 na região de ligação de Trastuzumab HER2 original. Fab de Variante3 com a interrupção das interações de Pi com HER2 Fenilalanina 573 induz a desestabilização do complexo TrastuzumAb-HER2. Todas as três variantes de dsTrasKO foram encontradas para abolir a ligação a HER2 (vide Figura 5A - Figura 5B). Variante 2 (dsTrasKO2) foi identificada como a melhor produtora. Exemplo 5: Avaliação de dstrasko2 como arcabouço de substituição para CH1/CL

[378] As variantes dsTrasKO foram avaliadas no formato Pseudo- IgG (monoespecífico) (vide Figura 6A) e pseudo-Fab (vide Figura 6B). Os formatos Pseudo IgG e pseudo-Fab testados tinham características de expressão e purificação semelhantes àquelas do anticorpo original (vide Tabela 7).

Tabela 7: Resultados de Expressão e Purificação de Anticorpos Pseudo-IgG com a Substituição do Domínio dsTrasKO2 de CH1/CL Rendimento Fração da Monomérica ID Sequência Formato expressão após [mg/L] Proteína A 19 PD1 mAb Pseudo-IgG 243 67% (SEQ ID Nº: 42 e 43) 20 CTLA4 mAb Pseudo-IgG 153 84% (SEQ ID Nº: 44 e 45) 21 IL4 mAb Pseudo-IgG 45 100% (SEQ ID Nº: 46 e 47) 22 IL13 mAb Pseudo-IgG 114 94% (SEQ ID Nº: 48 e 49) 23 IL13 mAb Pseudo-Fab 243 94% (SEQ ID Nº: 50 e 51) Exemplo 6: Avaliação de anticorpos biespecíficos com estrutura nativa usando dstrasko2 como arcabouço de substituição para CH1/CL

[379] O domínio dsTrasKO2 foi avaliado como um arcabouço de substituição em um anticorpo biespecífico tendo uma estrutura de IgG nativa. Em particular, um projeto biespecífico anti-IL4-dsTrasKO (Var2) x anti-IL13-huIgG1 com mutações de RF no Fc foi sintetizado (vide Figura 7). i. Expressão de Moléculas Biespecíficas de dsTrasKO2

[380] Os plasmídeos de expressão que codificam ambas as cadeias pesadas (dsTrasKO2-knob e WT-hole) e ambas as cadeias leves (dsTrasKO e WT-Kappa/lambda) dos construtos correspondentes foram propagados em DH5α de E. coli. Os plasmídeos usados para transfecção foram preparados a partir de E. coli usando o kit Qiagen EndoFree Plasmid Mega.

[381] Células HEK 293-FS crescendo em cultura de suspensão livre de soro F17 (Invitrogen) foram transfectadas com plasmídeos de cadeia leve (LC) e cadeia pesada (HC) indicados usando reagente de transfecção de polietilenimina. Após 7 dias de cultivo a 37°C, as células foram removidas por centrifugação e o sobrenadante foi passado por um filtro de 0,22 µm para remover as partículas.

[382] Para purificação, o anticorpo foi capturado na coluna MabSelect SuRe (Cat. Nº: 11-0034-93, GE Healthcare) e eluído com tampão citrato a 0,1 M pH 3,0 e diretamente dessalinizado usando uma coluna de dessalinização HiPrep 26/10 (Cat.Nº.: 17-05087-02, GE Healthcare). As moléculas monoespecíficas de dsTrasKO2 homodimérico possíveis serão classificadas usando uma etapa de captura KappaSelect adicional (tampão de eluição de Glicina a 0,1 M pH 2,7) (vide Figura 14). Depois de polir a proteína por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC, realizada como descrito no Exemplo 2 acima) usando um Superdex200 26/60 (GE) e uma etapa final de concentração de ultrafiltração, a proteína foi usada para caracterização adicional. Vide a Tabela 8 para resultados de purificação de construtos biespecíficos dsTrasKO2. Veja a Figura 7A - Figura 7D para design biespecífico representativo e resultados de purificação. Tabela 8. Rendimentos de purificação de construtos biespecíficos dsTrasKO2 dsTrasKO-huFc1 CTLA4 IL4 mAb PD1 mAb IL13 mAb IL4 mAb CTLA4 mAb (Knob) mAb huIgG1 (hole-RF) IL13 mAb IL13 mAb IL13 mAb PD1 mAb PD1 mAb PD1 mAb 28 26 25 24 27 (SEQ ID Nº: 68 e (SEQ ID Nº: 60 e (SEQ ID Nº: 56 (SEQ ID Nº: 52 (SEQ ID Nº: 64 ID 30 69 e SEQ ID Nº: 61 e SEQ ID Nº: e 57 e SEQ ID e 53 e SEQ ID e 65 e SEQ ID 70 e 71) 62 e 63) Nº: 58 e 59) Nº: 54 e 55) Nº: 66 e 67) Rendimento [mg] 51,6 64 42,4 70 45,4 62,7 % de Monômero 93,60% 91,30% 61,30% 95,40% 95,60% 84,10% (SEC)

Avaliação da ligação a antígeno de anticorpos biespecíficos compreendendo a substituição de dsTrasKO2 de um par CH1/CL.

[383] Ressonância plasmônica de superfície (SPR) foi usada para avaliar a ligação de antígenos ao anticorpo. A ligação de antígenos aos construtos de anticorpo foi medida usando ressonância plasmônica de superfície (SPR) com um instrumento BIAcore 3000 (GE Healthcare) com tampão HBS-EP (GE Healthcare). IL4 humana (IL004, Millipore) e IL13 humana (IL012, Millipore), HER2 humano (1129-ER, R&D Systems), TNFa humano (H8916, SIGMA Aldrich), CTLA4 humano (CT4-H5229, ACRO Biosystems), PD-1 humano (8986-PD, R&D Systems) e IL6Ra humano (227-SR/CF, R&D Systems) foram usados como antígenos. O anticorpo de captura Fc anti-humano (kit de captura de anticorpo humano, GE Life Sciences) foi imobilizado por meio de grupos de amina primária (11000 RU) em um chip CM5 de grau de busca (GE Life Sciences) usando procedimentos padrão. Os ligandos foram capturados a uma taxa de fluxo de 10 µl/min com um valor RU ajustado que resultou na ligação máxima do analito de 30 RU. Os testes de ligação com HER2 foram realizados por captura do antígeno com o anticorpo Fc anti-humano. Os construtos de anticorpos testados foram usados como analitos e injetados a uma concentração de 100 nM por 240 s com um tempo de dissociação de 300 s a uma taxa de fluxo de 30 µL/min. As medições da cinética de ligação foram feitas usando os anticorpos capturados com injeções de diluições em série de duas vezes dos analitos de 3 nM a 100 nM. Para IL4 e IL13 humanas, uma série de diluições de 0,1 nM a 3 nM e 0,8 nM a 25 nM, respectivamente foi usada. As superfícies dos chips foram regeneradas com injeções de 2 minutos do tampão de regeneração fornecido com o kit de captura. Os sensogramas foram duplamente referenciados com uma superfície de chip em branco e tampões HBS-EP em branco. Dados a análise foi realizada usando o software BIAevaluation v4.1. As características de ligação de mAbs, pseudo-IgGs e biespecíficos são mostradas na Tabela 9 abaixo.

Tabela 9. Cinética de ligação por SPR: Comparação de mAbs, pseudo- IgGs e biespecíficos Cinética de ligação por SPR ID Construto Antígeno ka [1/MXs] kd [1/s] KD [nM] 18 IL4 mAb IL4 1,04E+08 1,61E-04 1,55E-12 (SEQ ID Nº: 40 e 41) 21 IL4 pseudo-IgG IL4 7,43E+07 1,44E-04 1,94E-12 (SEQ ID Nº: 46 e 47) 24 IL4 x PD1 IL4 9,35E+07 1,27E-04 1,36E-12 (SEQ ID Nº: 52 e 53 e SEQ ID Nº: 54 e 55) 3 IL13 mAb IL13 1,28E+06 3,46E-05 2,69E-11 (SEQ ID Nº: 10 e 11) 22 IL13 pseudo- IL13 1,54E+06 6,56E-07X 4,25E-13 (SEQ ID Nº: 48 e 49) IgG

25 IL13 x PD1 IL13 1,28E+06 1,84E-07X 1,44E-13 (SEQ ID Nº: 56 e 57 e SEQ ID Nº: 58 e 59) 26 PD1 x IL13 IL13 2,92E+06 1,66E-05 5,68E-12 (SEQ ID Nº: 60 e 61 e SEQ ID Nº: 62 e 63) 12 CTLA4 mAb CTLA-4 1,62E+05 1,11E-03 6,83E-09 (SEQ ID Nº: 28 e 29) 20 CTLA4 pseudo- CTLA-4 2,52E+05 9,64E-04 3,82E-09 (SEQ ID Nº: 44 e 45) IgG

27 CTLA4 x PD1 CTLA-4 2,52E+05 1,28E-03 5,08E-09 (SEQ ID Nº: 64 e 65 e SEQ ID Nº: 66 e 67) 15 PD1 mAb PD-1 2,14E+05 2,05E-03 9,56E-09 (SEQ ID Nº: 34 e 35) 19 PD1 pseudo- PD-1 2,66E+05 2,86E-03 1,08E-08 (SEQ ID Nº: 42 e 43) IgG

26 PD1 x IL13 PD-1 1,31E+05 2,90E-03 2,21E-08 (SEQ ID Nº: 60 e 61 e SEQ ID Nº: 62 e 63) 24 PD1 x IL4 PD-1 2,19E+05 2,10E-03 9,60E-09 (SEQ ID Nº: 52 e 53 e SEQ ID Nº: 54 e 55) 27 CTLA4 x PD1 PD-1 1,63E+05 1,10E-03 6,78E-09 (SEQ ID Nº: 64 e 65 e SEQ ID Nº: 66 e 67)

[384] Os resultados de SPR mostraram que vários VH/VLs fundidos a dsTrasKO2 retêm as afinidades de ligação a antígeno parental, incluindo anticorpos biespecíficos. Análise da Integridade da Proteína

[385] A integridade da proteína e o emparelhamento incorreto potencial de construtos heterodiméricos foram analisados por espectrometria de massa LC (LC-MS). As amostras de proteínas foram desglicosiladas com 12,5 µg de proteína diluída a 0,5 mg/ml em tampão D-PBS tratado com 0,5 µl de PNGaseF (sem glicerol, New England Biolabs) a 37°C durante 15 horas. A análise de LC-MS foi realizada usando um instrumento de LC/MS Q-TOF de Massa Preciso 6540 UHD (Agilent). A cromatografia de fase reversa (RP) foi feita usando uma Poroshell 300SB-C8 5 µm, 75 x 0,5 mm (Agilent) com coluna de guarda Poroshell 300SB-C8, 5 µm, 2,1 x 12,5 mm (Agilent) a 180 µL/min. Os eluentes foram água LC, ácido fórmico 0,1% (A) e acetonitrila 90%, água LC 10%, ácido fórmico 0,1% (B). 2 µg de proteína foram injetados na coluna e eluídos usando um gradiente linear de 0% a 100% B em 13 minutos. A análise de dados foi feita usando o software MassHunter B.06 (Agilent). As massas moleculares foram calculadas com base nas sequências de aminoácidos das proteínas usando o software GPMAW versão 9.13a2 (dados Lighthouse). As proteínas de fusão dsTrasKO2- anticorpo mostraram estar principalmente intactas e exibirem o emparelhamento correto de heterodímero (vide Tabela 10 abaixo).

Tabela 10. Resultados de LC-MS de proteínas de fusão dsTrasKO2- anticorpo Esperado Diferença Picos de Empare- ID de lote Amostra Medido (Da) Coment. Dímero (Da) X (Da) espectro lhamento 21 LC1+HC1 1 153599,86 153613,37 13,51 intacto 1 Heterodimérico (SEQ ID Nº: 46 e 47) LC2+HC2 20 LC1+HC1 1 152538,62 152550,41 11,79 intacto 1 Heterodimérico (SEQ ID Nº: 44 e 45) LC2+HC2 19 LC1+HC1 1 151135,00 151141,57 6,57 intacto 2 Heterodimérico (SEQ ID Nº: 42 e 43) LC2+HC2 28 Corte de Lys LC1+HC1 (SEQ ID Nº: 68 e 69 e 1 149342,54 149222,42 -120,12 1 Heterodimérico Cter LC2+HC2 SEQ ID Nº: 70 e 71) 26 Corte de Lys LC1+HC1 (SEQ ID Nº: 60 e 61 e 1 148110,11 147988,32 -121,79 1 Heterodimérico Cter LC2+HC2 SEQ ID Nº: 62 e 63) 25 LC1+HC1 (SEQ ID Nº: 56 e 57 e P1 147981,92 147988,31 6,39 intacto 1 Heterodimérico LC2+HC2 SEQ ID Nº: 58 e 59) 24 LC1+HC1 (SEQ ID Nº: 52 e 53 e P1 148541,65 148548,27 6,62 intacto 1 Heterodimérico LC2+HC2 SEQ ID Nº: 54 e 55) 27 LC1+HC1 (SEQ ID Nº: 64 e 65 e P1 148011,02 148017,36 6,34 intacto 1 Heterodimérico LC2+HC2 SEQ ID Nº: 66 e 67) 29 LC1+HC1 (SEQ ID Nº: 72 e 73 e P1 147309,22 147315,24 6,02 intacto 1 Heterodimérico LC2+HC2 SEQ ID Nº: 74 e 75)

[386] Além da análise de LC-MS, as amostras biespecíficas também foram analisadas por cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) para detectar espécies emparelhadas incorretas ou inesperadas potenciais. HIC analítico foi realizado usando um instrumento LC10 HPLC (Shimadzu) com um TSKgel Ether-5PW 10 µm, 2 x 75 mm (Tosoh Bioscience) a 25°C. A análise foi executada a uma taxa de fluxo de 0,1 ml/min com detecção a 280 nm. 5 µg de amostra de proteína não diluída foram aplicados na coluna. A eluição do gradiente foi de 0 a 30 min (0% a 100% B) seguido por 10 min 100% B e 15 minutos de reequilíbrio. O tampão A era composto por sulfato de amônio a 1,5 M, 25 mM de fosfato de sódio, pH 7,0. O tampão B era composto por 25 mM de fosfato de sódio, pH 7,0. A avaliação dos dados foi realizada usando o software LabSolutions v5.85 (Shimadzu). Os dados mostraram que as amostras biespecíficas dsTrasKO2 tinham um perfil HIC homogêneo, indicando que não havia espécies inesperadas e que as amostras biespecíficas tinham emparelhamentos corretos (vide Figura 8). Estabilidade Térmica: Comparação de Pseudo-IgGs e Biespecíficos

[387] A estabilidade térmica do dsTrasKO2 pseudo-IgG e amostras biespecíficas foi avaliada como descrito no Exemplo 2 acima. Os pontos de fusão (Tm) foram determinados usando fluorimetria de varredura diferencial (DSF), conforme descrito no Exemplo 3. Os construtos baseados em dsTrasKO2 mostraram uma temperatura de fusão reduzida em comparação com o IgG monoclonal original e nenhum comprometimento da estabilidade foi detectado em uma estabilidade térmica de duas semanas ensaio (40°C, 4°Ce -80°C) (vide Tabela 11 abaixo). Tabela 11. Estabilidade térmica de Construtos dsTrasKO2- anticorpo. Estabilidade (2 sem @40°C), Temperatura de ID Construto agregação [%] Fusão (°C) 2 sem 40°C 4°C -80°C 18 IL4 mAb 70 81 0 0 0 (SEQ ID Nº: 40 e 41) 21 IL4 pseudo- 68 - 1 1 1 (SEQ ID Nº: 46 e 47) IgG 24_P1 IL4 x PD1 68 - 2 2 2 (SEQ ID Nº: 52 e 53 e SEQ ID Nº: 54 e 55) 3 IL13 mAb 70 80 0 0 0 (SEQ ID Nº: 10 e 11) 22 IL13 pseudo- 68 - 1 0 0 (SEQ ID Nº: 48 e 49) IgG 25 IL13 x PD1 67 - 1 0 0 (SEQ ID Nº: 56 e 57 e SEQ ID Nº: 58 e 59) 12 CTLA4 mAb 69 75 1 1 1 (SEQ ID Nº: 28 e 29 20 CTLA4 67 - 0 0 0 (SEQ ID Nº: 44 e 45) pseudo-IgG 27 CTLA4 x 67 - 0 0 0 (SEQ ID Nº: 64 e 65 e SEQ ID Nº: 66 e 67) PD1 15 PD1 mAb 68 - 0 0 0 (SEQ ID Nº: 34 e 35) 19 PD1 pseudo- 54 68 3X 0 0 (SEQ ID Nº: 42 e 43) IgG 26 PD1 x IL13 3 0 0 (SEQ ID Nº: 60 e 61 e SEQ ID Nº: 62 e 63)

Exemplo 7: Estrutura cristalina da IL-13 do pseudo-fab

[388] Cristalização de dsTrasKO2-IL13-pseudoFab foi realizada para estudos estruturais. Os ensaios de cristalização foram estabelecidos como experimentos de gota depositada (sitting-drop) em placas MRC de 96 poços de duas gotas padrão usando uma razão proteína:reservatório de 1:1 e foram incubados a 20°C. Tanto TrasKO2- CH1/CL quanto anti-IL13-TrasKO2 foram triados para resultados de cristalização contra uma variedade de triagem de matriz esparsa disponível comercialmente. Gotas de triagem para TrasKO2-CH1/CL (estoque a 15 mg/ml) e anti-IL13-TrasKO2 (estoque a 15,6 mg ml) em 20 mM de HEPES pH 7,5, cloreto de sódio a 0,1 M foram preparadas misturando 100 nl de solução de proteína com 100 nl de solução de reservatório e equilibradas em experimentos de difusão de vapor de gota depositada contra 80 µl de reservatório. Cristais finais de TrasKO2- CH1/CL adequados para coleta de dados e solução de estrutura foram cultivados a 20°Ccom uma solução reservatório consistindo em citrato de fosfato de sódio a 0,1 M pH 4,2, 20% (p/v) polietilenoglicol 8000 e cloreto de sódio a 0,2 M. Cristais anti-IL13-TrasKO2 de qualidade de difração foram cultivados com uma solução reservatório consistindo em CHES a 0,1 M pH 9,5 e 20% (p/v) polietilenoglicol 8000. Todos os cristais foram crioprotegidos antes do resfriamento flash em nitrogênio líquido através adição de 25% (p/v) de etilenoglicol (concentração final). Coleta de Dados e Determinação de Estrutura

[389] Dados de difração foram coletados na linha de feixe PSII na Swiss Light Source (SLS), Villingen, Suíça. Os dados de difração foram processados usando uma combinação de XDS (Kabsch, 2010) e AIMLESS (Evans & Mushudov, 2013) do pacote de programas CCP4 (Winn et al., 2011). TrasKO2-CH1/CL cristalizou no grupo espacial I23 com parâmetro de célula 153,23 Å, 153,23 Å, 153,23 Å, 90,00°, 90,00°, 90,00°, os dados estendidos para uma resolução de 3,70 Å. Os cristais de anti-IL13-TrasKO2 pertenciam ao grupo espacial P3221 com parâmetro celular 145,37 145,37 52,06 90,00 90,00 120,00 e difratados a 1,85 Å.

[390] As estruturas foram resolvidas por substituição molecular usando a implementação CCP4 de Phaser (McCoy et al., 2007). Para TrasKO2-CH1/CL, uma versão modificada do domínio trastuzumab-VH- VL e o domínio CH1/CL da entrada pdb 1n8z foram usados como modelos de pesquisa. A substituição molecular no anti-IL13-TrasKO2 foi realizada com o domínio VH/VL anti-IL13 da estrutura interna Sanofi de Fab anti-IL13 e a versão modificada do domínio VH/VL 1n8z como modelos de fase. Os modelos atômicos foram construídos por rodadas iterativas de construção e refinamento manual de modelos usando Coot (Emsley et al., 2010) e Refine (Bricogne, 2017). Os fatores R e livres de R dos modelos finais são 19,2/23,2 para TrasKO2-CH1/CL e 21,0/31,2 para anti-IL13-TrasKO2 (vide Figura 9 para a estrutura de cristal). Exemplo 8: Avaliação de anticorpos biespecíficos tendo uma estrutura em tandem usando dstrasko2 como arcabouço de substituição CH1/CL

[391] O domínio dsTrasKO2 foi avaliado como um arcabouço de substituição em um projeto de IgG em tandem biespecífico. Em particular, um projeto de IgG em tandem anti-GITR-dsTrasKO2 x anti- OX40-kappa] -huIgG1 foi sintetizado e testado (vide Figura 10-12). Expressão de Moléculas em Tandem Biespecíficas dsTrasKO2

[392] Os plasmídeos de expressão que codificam as cadeias pesada e leve (dsTrasKO e WT-Kappa/lambda) dos construtos correspondentes foram propagados em DH5a de E. coli. Os plasmídeos usados para transfecção foram preparados a partir de E. coli usando o kit Qiagen EndoFree Plasmid Mega.

[393] Células HEK 293-FS que crescem em cultura em suspensão livre de soro F17 (Invitrogen) foram transfectadas com plasmídeos LC e

HC indicados usando reagente de transfecção de polietilenimina. Após 7 dias de cultivo a 37°Cas células foram removidas por centrifugação e o sobrenadante foi passado por um filtro de 0,22 µm para remover as partículas.

[394] Para purificação, o anticorpo foi capturado na coluna MabSelect SuRe (Cat.No.: 11-0034-93, GE Healthcare) e eluído com tampão Citrato a 0,1 M pH 3,0 e diretamente dessalinizado usando uma coluna de dessalinização HiPrep 26/10 (Cat.No.: 17-05087-02, GE Healthcare). As possíveis moléculas monoespecíficas de dsTrasKO2 homodimérico serão classificadas usando uma etapa de captura KappaSelect adicional (tampão de eluição de Glicina a 0,1 M pH 2,7) (vide Figura 14). Depois de polir a proteína por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) usando um Superdex200 26/60 (GE) e uma etapa de concentração de ultrafiltração final, a proteína foi usada para caracterização adicional. Vide Figura 12A - Figura 12D para projeto biespecífico representativo e resultados de purificação. Exemplo 9: Avaliação de anticorpos triespecíficos com uma estrutura CODV usando dstrasko2 como arcabouço de substituição para CH1/CL

[395] O domínio dsTrasKO2 foi avaliado como um arcabouço de substituição em um projeto de domínio variável de cruzamento triespecífico (CODV). Em particular, um construto CODV-anti-Ox40 x anti-PD1] x anti-CD137-dsTrasKO2-huIgG1-LALA-KIH-RF foi sintetizado e testado (vide Figura 13). Expressão de moléculas CODV triespecíficas dsTrasKO2

[396] Os plasmídeos de expressão que codificam as cadeias pesadas e leves (dsTrasKO e WT), e os plasmídeos de expressão que codificam as cadeias pesadas (CODV-knob e dsTrasKO2-hole) e leves (CODV e dsTrasKO) dos construtos correspondentes foram propagados em DH5a de E.coli. Os plasmídeos usados para transfecção foram preparados a partir de E. coli usando o kit Qiagen EndoFree Plasmid Mega.

[397] Células HEK 293-FS crescendo em cultura em suspensão livre de soro F17 (Invitrogen) foram transfectadas com plasmídeos LC e HC indicados usando reagente de transfecção de polietilenimina. Após 7 dias de cultivo a 37°C, as células foram removidas por centrifugação e o sobrenadante foi passado por um filtro de 0,22 µm para remover as partículas.

[398] Para purificação, o anticorpo foi capturado na coluna MabSelect SuRe (Cat.No.: 11-0034-93, GE Healthcare) e eluído com tampão Citrato a 0,1 M pH 3,0 e diretamente dessalinizado usando uma coluna de dessalinização HiPrep 26/10 (Cat.No.: 17-05087-02, GE Healthcare). A amostra foi ainda purificada em uma coluna de troca catiônica MonoS (Cat.No.: 17-5169-01, GE Healthcare, gradiente de sal NaCl a 0-1M em tampão de L-Histidina a 0,01M pH 6,0). Após a etapa de concentração de ultrafiltração, a proteína foi usada para posterior caracterização. Vide a Figura 13A - Figura 13D para projeto triespecífico representativo e resultados de purificação. Exemplo 10: Avaliação de anticorpos engajadores de células T biespecíficas usando dstrasko2 como arcabouço de substituição para CH1/CL Métodos Gerais Cromatografia por Exclusão de Tamanho (SEC) Analítica

[399] SEC analítica foi realizada usando um instrumento BioSECcurity (PSS Polymer) com uma coluna AdvanceBio 300 (4,6 mm x 300 mm) e coluna de guarda AdvanceBio 300 (Agilent Technologies) a 25ºC. A análise foi executada a uma taxa de fluxo de 0,5 ml/min usando tampão D-PBS concentrado 2x (Thermo Fisher Scientific) com detecção a 280 nm. 10 µl de amostra de proteína (a 1 mg/ml) foram aplicados na coluna. A avaliação dos dados foi realizada usando o software WinGPC v8.1 (PSS Polymer). Para estimativa do peso molecular, a coluna SEC foi calibrada com uma mistura padrão de calibração de proteínas (Agilent Technologies). Cromatografia de Interação Hidrofóbica (HIC) Analítica

[400] HIC analítica foi realizada usando um instrumento LC10 HPLC (Shimadzu) ou um instrumento Vanquish HPLC (Thermo Fisher Scientific) equipado com uma coluna TSKgel Butyl-NPR (2,5 µm, 4,6 x 35 mm) (Tosoh Bioscience) a 25°C. A análise foi executada a uma taxa de fluxo de 1 ml/min com detecção a 280 nm. 5 µg de amostra de proteína não diluída foram aplicados na coluna. A eluição do gradiente foi de 15% B a 85% B em 7 min, seguido por 1 min a 100% B, depois 1 min a 15% B e, em seguida, equilíbrio de 3 minutos a 15% B. O tampão A era composto por sulfato de amônio a 1,5 M, 25 mM de fosfato de sódio, pH 7,0. O tampão B era composto por 25 mM de fosfato de sódio, pH 7,0. A avaliação dos dados foi realizada usando o software LabSolutions v5.85 (Shimadzu) ou o software Chromeleon 7 (Thermo Fisher Scientific). nanoDSF

[401] As temperaturas de início (Tonset) e os pontos de fusão (Tm) de desnaturação da proteína foram determinados usando fluorimetria de varredura diferencial nano (nanoDSF). As amostras foram diluídas em tampão de formulação a uma concentração final de 0,5 µg/µl e carregadas em capilares nanoDSF (Nanotemper Technologies) em duplicatas. Todas as medições foram feitas usando um dispositivo nanoDSF Prometheus NT.plex (Nanotemper Technologies). A taxa de aquecimento foi de 1°Cpor minuto de 20°Ca 95°C. Os dados foram registrados usando PR.ThermControl Software v2.3.1 (Nanotemper Technologies) e analisados usando PR.Stability Analysis Software v1.0.3 (Nanotemper Technologies).

Ressonância Plasmônica de Superfície (SPR)

[402] Ligação de antígenos aos construtos de anticorpo foi medida usando ressonância plasmônica de superfície (SPR) com um instrumento BIAcore 8K (GE Healthcare) com Tampão HBS-EP+ (GE Healthcare). Para a cinética de ligação e determinação de afinidade, as proteínas de fusão CD3εδ-Fc-His humanas e CD123-Fc-His humanas (ambas de fonte interna) foram utilizadas como antígenos. O anticorpo de captura anti-His (kit de captura His, GE Life Sciences) foi imobilizado por meio de grupos de amina primária (11000 RU) em um chip CM5 de grau de pesquisa (GE Life Sciences) usando procedimentos padrão. Os antígenos foram capturados pela superfície do chip de captura anti-His a uma taxa de fluxo de 10 µL/min por 90 segundos para atingir níveis de ligação do anticorpo entre 10 e 30 RU. Os anticorpos foram injetados por 240 s a 30 µL/min em uma série de diluição dupla de 100 nM a 3,1 nM para determinação de afinidades de CD123 e de 400 nM a 3,1 nM ou 100nM a 3,1 nM para determinação de afinidades de ligação de CD3. Dissociação foi medida a 30 µL/min por injeção de tampão HBS-EP+ por 1200 s. A superfície do chip foi regenerada por injeção de tampão de regeneração (kit de captura His, GE Life Sciences). Sensorgramas foram duplamente referenciados com uma superfície de chip em branco e tampões HBS-EP+ em branco. Os dados foram ajustados com um modelo de ligação Langmuir 1:1 para determinação das constantes cinéticas e de afinidade ka, kd e KD usando o software de avaliação Biacore 8K v1.11.7442 (GE Healthcare).

[403] Para avaliação dos níveis de ligação relativa (% Rmax) dos anticorpos para CD3 e CD123, os anticorpos foram capturados por captura de afinidade anti-Fc para o chip sensor. Neste ensaio foram utilizadas proteínas humanas CD3εδ-FLAG-His (# CT038-H2508H, Sino Biological) e humanas CD123 (# 301-R3/CF, R&D Systems). O anticorpo de captura Fc anti-humano (kit de captura de anticorpo humano, GE Life Sciences) foi imobilizado por meio de grupos de amina primária (11000 RU) em um chip CM5 de grau de pesquisa (GE Life Sciences) usando procedimentos padrão. Os anticorpos foram capturados a uma taxa de fluxo de 10 µl/min com um valor RU ajustado que resultou na ligação máxima do analito de 10 a 30 RU. Os antígenos foram usados como analitos e injetados quer nas concentrações de 400 nM e 100 nM para CD3εδ-FLAG-His ou na concentração de 100 nM para CD123. Os antígenos foram injetados por 240 s com um tempo de dissociação de 300 s a uma taxa de fluxo de 30 µL/min. As superfícies dos chips foram regeneradas com injeções de 2 min do tampão de regeneração fornecido com o kit de captura. Os sensogramas foram duplamente referenciados com uma superfície de chip em branco e tampões HBS-EP em branco. A análise de dados e a determinação do nível de ligação foram realizadas usando o software de avaliação Biacore 8K v1.11.7442 (GE Healthcare). Os valores de % Rmax foram calculados usando o nível de ligação máximo dividido pelo valor Rmax teórico. Os valores de Rmax teóricos foram calculados a partir do nível de captura Rcapture, a estequiometria de ligação N e o peso molecular do anticorpo Mw (Ab) e antígeno Mw (Ag) com Rmax = Rcapture * N * (Mw (Ag)/Mw (Ab)). Espectrometria de Massa

[404] A integridade da proteína e o potencial de emparelhamento incorreto de construtos heterodiméricos foram analisados por espectrometria de massa LC (LC-MS). As amostras de proteínas foram desglicosiladas com 12,5 µg de proteína diluída para 0,17 mg/mL em água grau LC-MS (Thermo Scientific) tratadas com 0,5 µL de PNGaseF (sem glicerol, New England Biolabs) a 37°Cpor 16 horas. A análise LC- MS foi realizada usando um instrumento de Espectrometria de Massa Orbitrap Fusion Lumos Tribrid. A cromatografia de fase reversa (RP) foi feita usando uma coluna HPLC RP MabPac, tamanho de partícula analítica de 4 µm, 2,1 x 100 mm (Thermo Scientific) a 300 µL/min. Os eluentes foram água LC, ácido fórmico 0,1% (A) e acetonitrila 90%, água LC 10%, ácido fórmico 0,1% (B). 2 µg de solução de proteína foram injetados na coluna e eluídos usando um gradiente linear de 0% a 95% B em 12 minutos. A análise dos dados foi realizada por meio do software Expressionist 13.0.3 (Genedata). As massas moleculares foram calculadas com base nas sequências de aminoácidos das proteínas usando o software GPMAW versão 10.32b1 (dados Lighthouse). Ensaio de citotoxicidade com moléculas TrasKO2 biespecíficas

[405] Moléculas TrasKO2 biespecíficas foram analisadas em ensaios de citotoxicidade usando células T humanas primárias. Células mononucleares periféricas humanas de sangue de doadores saudáveis foram isoladas em Leucosep-Tubes (Greiner Bio-One, # 227290) usando 15 mL de Histopaque (Sigma-Aldrich, # 10771) e centrifugação por 10 minutos a 1000 x g. PBMCs isoladas foram lavadas duas vezes em tampão de enxágue autoMACS (Miltenyi Biotec, # 130-091-222) suplementado com solução estoque de MACS BSA a 5% (Miltenyi Biotec, # 130-091-370). Células T humanas primárias foram isoladas de PBMCs humanas com o Separador MACSpro (Miltenyi Biotec) e o Kit de Isolamento de Células T Pan (Miltenyi Biotec, # 130-096-535) usando os protocolos dos fabricantes. As células T humanas isoladas foram ressuspensas a 5 x 106 células/mL em meio RPMI GlutaMAX I (Gibco, # 72400) suplementado com FCS HI a 10% (Gibco, # 10082-147). Antes do ensaio de citotoxicidade, as células alvo THP-1 (ADCC TIB-202) foram coradas com 1 µM de CFSE (Invitrogen, # C1157) durante 15 minutos a 37°C. As células foram lavadas duas vezes em meio RPMI+ GlutaMAX I e centrifugadas a 400 x g durante 5 minutos. As células alvo THP-1 foram ressuspensas a 5 x 105 células/mL em meio RPMI suplementado com 10% FCS HI. Células THP-1 marcadas com CFSE e células T pan humanas foram misturadas em uma razão efetor para alvo de 10:1 e semeadas em um volume total de 100 µL/poço em uma placa de ensaio de 96 poços (Greiner BioOne, # 650185). Moléculas de TrasKO2 biespecíficas foram adicionadas em 11 séries de diluições começando de 10 nM - 0 nM (diluição 1:6) em um volume de 5 µL/poço às células e incubadas por 20 horas a 37°C e 5% de CO2. Após a incubação, as células foram coradas com 5 µg/mL de 7-AAD (Invitrogen, # A1310) durante 30 minutos a 4°C. Para determinar a citotoxicidade, células alvo mortas foram medidas por controle em células CFSE/7-AAD duplamente positivas THP-1 em um citômetro de fluxo LSRII (BD) e os valores de EC50 foram determinados com software Xlfit.

[406] O domínio dsTrasKO2 foi avaliado como um arcabouço de substituição em um projeto de anticorpo engajador de células T biespecíficas. Engajadores de células T biespecíficas foram gerados usando um anti-TCR α/β ou um de dois anti-CD3ε como braços efetores e um anti-CD123 como braço alvo diferentes. Os controles negativos para ambos os braços foram gerados usando sequências de anticorpos TNP (anticorpo tri-nitrofenol). Proteínas biespecíficas foram purificadas por MabSelect Sure, seguido por KappaSelect e SEC. Os anticorpos biespecíficos foram expressos como IgG biespecífico de tipo selvagem (detecção de emparelhamento incorreto de ocorrência natural) ou com substituição de TrasKO2 em um dos braços Fab (foram produzidos os dois braços Fab reprojetados possíveis). A caracterização biofísica dos anticorpos biespecíficos é descrita abaixo na Tabela 12.

Tabela 12. Caracterização biofísica de construtos de anticorpo engajador de células T dsTrasKO2.

MS Emparelhado Emparelhado Emparelhado Combinação Rend. SEC [%de HIC [%de correto LC1 + Incorreto LC1 + Incorreto LC2 +

ID biespecífica [mg/L] monômero] monômero] HC1 LC2 + HC1 LC1 + HC1 LC2 + HC2 [%] HC2 [%] HC2 [%] anti-TCR α/β x anti-CD123 30 10,3 95,5 87,7 63,1 5,0 31,9 anti-TCR α/β x anti-CD123 – 31 13,3 85,7 88,0 98,8 dsTrasKO2 anti-TCR α/β – dsTrasKO2 32 26,7 100,0 100,0 100,0 x anti-CD123 anti-CD3ε x anti-CD123 33 25,7 100,0 87,7 79,7 8,3 12,0 anti-CD3ε x anti-CD123- 34 19,0 93,1 89,1 100,0 dsTrasKO2 anti-CD3ε-dsTrasKO2 x anti- 35 39,0 100,0 100,0 100,0 CD123 anti-CD3ε x anti-CD123 36 40,7 100,0 100,0 77,4 14,7 7,9 anti-CD3ε x anti-CD123- 37 35,7 100,0 100,0 100,0 dsTrasKO2 anti-CD3ε-dsTrasKO2 x anti- 38 40,7 100,0 100,0 100,0 CD123 anti-TCR α/β x anti-TNP 39 34,0 92,3 94,9 45,0 55,0 anti-TCR α/β x anti-TNP- 40 58,3 95,8 65,5 100,0 dsTrasKO2 anti-TCR α/β-dsTrasKO2 x anti- 41 56,0 99,7 97,0 100,0

TNP anti-TNP x anti-CD123 42 39,0 99,6 55,3 49,6 50,4 anti-TNP x anti-CD123- 43 51,0 98,6 94,2 100,0 dsTrasKO2 anti-TNP-dsTrasKO2 x anti- 44 43,3 98,9 71,2 100,0 CD123 anti-CD3ε x anti-TNP 45 64,0 99,0 69,8 69,0 31,0 anti-CD3ε x anti-TNP-dsTrasKO2 46 19,7 98,2 63,5 100,0 anti-CD3ε-dsTrasKO2 x anti-TNP 47 44,7 100,0 90,4 98,7 anti-CD3ε x anti-TNP 48 95,0 100,0 100,0 88,2 1,6 10,2 anti-CD3ε x anti-TNP-dsTrasKO2 49 56,7 100,0 67,3 100,0 anti-CD3ε-dsTrasKO2 x anti-TNP 50 59,7 100,0 100,0 100,0

DSF SPR Citotox.

Tinício Tm1 KD(CD3) %Rmax KD(CD123) %Rmax EC50

ID [°C] [°C] [M] (CD3) [M] (CD123) [pM] 30 n.d. n.d. n.a. n.a. n.d. n.d. n.d.

31 n.d. n.d. n.a. n.a. n.d. n.d. n.d.

32 58,5 63,6 n.a. n.a. n.d. n.d. n.d.

33 58,2 64,1 2,28E-07 33 2,12E-10 80 0,2 34 n.d. n.d. 2,16E-07 33 2,39E-10 92 0,1 35 58,1 64,2 2,64E-07 35 2,57E-10 96 0,4 36 59,3 64,1 4,50E-08 19 3,52E-10 77 1,15 37 52,2 56,7 4,66E-08 21 3,86E-10 96 0,70 38 54,8 63,2 5,45E-08 25 3,32E-10 102 0,95 39 59,2 64,2 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.

40 n.d. 57,5 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.

41 58,4 62,8 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.

42 59,0 64,3 n.a. n.a. 2,31E-10 94 n.a.

43 52,2 56,7 n.a. n.a. 5,46E-10 87 n.a.

44 59,3 62,4 n.a. n.a. 2,87E-10 97 n.a.

45 58,6 64,3 3,90E-07 34 n.a. n.a. n.a.

46 55,7 61,6 2,34E-07 33 n.a. n.a. n.a.

47 57,6 63,7 3,27E-07 32 n.a. n.a. n.a.

48 59,6 64,1 4,24E-08 18 n.a. n.a. n.a.

49 n.d. 61,6 3,86E-08 19 n.a. n.a. n.a.

50 60,3 64,8 4,33E-08 24 n.a. n.a. n.a.

[407] Além da caracterização biofísica acima, as moléculas TrasKO2 biespecíficas foram analisadas em ensaios de citotoxicidade baseados em células. Como mostrado na Figura 15A, todos os três anticorpos biespecíficos anti-CD3ε x anti-CD123 demonstraram atividade comparável e robusta.

A presença do domínio dsTrasKO2 no ID de anticorpo número 34 e 35 não impactou negativamente a atividade, enquanto reduz o emparelhamento incorreto da cadeia.

Controles negativos de ID de anticorpos números 45 e 46, que contêm sequências de anticorpos TNP foram usados.

Como mostrado na Figura 15B, todos os três dos anticorpos biespecíficos anti-CD3ε x anti-CD123 com um domínio de ligação anti-CD3ε alternativo demonstraram atividade comparável e robusta também.

A presença do domínio dsTrasKO2 no ID de anticorpo número 37 e 38 não impactou negativamente a atividade, enquanto reduz o emparelhamento incorreto da cadeia.

Como controles negativos, ID de anticorpos números 47 e 48, que contêm sequências de anticorpos TNP, foi usado.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Proteína de ligação, caracterizada pelo fato de que compreende: pelo menos uma porção pseudoFab compreendendo (1) um primeiro domínio VL (VLa) emparelhado com um primeiro VH domínio (VHa) para formar um primeiro sítio de ligação do antígeno funcional que liga o antígeno alvo A; (2) um primeiro domínio VH nocaute estabilizado (VHX) emparelhado com um primeiro domínio VL nocaute estabilizado (VLX) para formar um primeiro domínio nocaute estabilizado; e em que o domínio nocaute estabilizado compreende (3) uma ou mais mutações de inativação que abolem sua ligação a um antígeno alvo; e (4) uma ou mais ligações dissulfeto intercadeia construídas geneticamente.

2. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação é uma proteína de ligação multiespecífica compreendendo ainda pelo menos um segundo domínio VL (VLb) emparelhado com um segundo domínio VH (VHb) para formar um segundo sítio de ligação de antígeno funcional que liga o antígeno alvo B.

3. Proteína de ligação multiespecífica, caracterizada pelo fato de que compreende: a) uma primeira porção pseudoFab compreendendo (1) um primeiro domínio VL (VLa) emparelhado com um primeiro domínio VH (VHa) para formar um primeiro sítio de ligação de antígeno funcional que liga o antígeno alvo A; (2) um primeiro domínio VH nocaute estabilizado (VHX) emparelhado com um primeiro domínio VL nocaute estabilizado (VLX) para formar um primeiro domínio nocaute estabilizado; e b) uma primeira porção Fab compreendendo (3) um segundo domínio VL (VLb) emparelhado com o segundo domínio VH (VHb) para formar um segundo sítio de ligação do antígeno funcional que liga o antígeno alvo B; (4) um primeiro domínio CH1 emparelhado com um primeiro domínio CL; e em que o domínio nocaute estabilizado compreende (5) uma ou mais mutações de inativação que abolem sua ligação a um antígeno alvo; e (6) uma ou mais ligações dissulfeto intercadeia construídas geneticamente.

4. Proteína de ligação multiespecífica, caracterizada pelo fato de que compreende: a) uma primeira porção pseudoFab compreendendo (1) um primeiro domínio VL (VLa) emparelhado com um primeiro domínio VH (VHa) para formar um primeiro sítio de ligação de antígeno funcional que liga o antígeno alvo A; (2) um primeiro domínio VH nocaute estabilizado (VHX) emparelhado com um primeiro domínio VL nocaute estabilizado (VLX) para formar um primeiro domínio nocaute estabilizado; e b) uma primeira porção Fab compreendendo (3) um segundo domínio VL (VLb) emparelhado com o segundo domínio VH (VHb) para formar um segundo sítio de ligação do antígeno funcional que liga o antígeno alvo B; (4) um primeiro domínio CH1 emparelhado com um primeiro domínio CL; e c) uma porção ligante que liga operativamente a primeira porção Fab e a primeira porção pseudoFab, em que o domínio nocaute estabilizado compreende

(5) uma ou mais mutações de inativação que abolem sua ligação a um antígeno alvo; e (6) uma ou mais ligações dissulfeto intercadeia construídas geneticamente.

5. Proteína de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a porção ligante é um ligante peptídico.

6. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o ligante peptídico é um ligante Gly-Ser da formulação (Gly4Ser)n, em que n é 1-10.

7. Proteína de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a porção ligante é um domínio de heterodimerização.

8. Domínio de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que compreende independentemente uma ou duas primeiras porções do pseudoFab e uma ou duas primeiras porções do Fab.

9. Proteína de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que compreende cadeias de proteínas separadas selecionadas a partir de um dos seguintes grupos: (a) VHa-CH1-L1-VHb-L2-VHX e VLa-CL e VLb-L3-VLX; (b) VHa-L2-VHX-L1-VHb-CH1 e VLa-L3-VLX e VLb-CL; (c) VHa-CH1-L1-VHa-CH1 e VHb-L2-VHX-L3-VHb-L4- VHX e duas cadeias VLb-L5-VLX e duas cadeias VLa-CL; em que as cadeias de (a) e (b) podem estar presentes uma ou duas vezes, e em que L1, L2, L3, L4 e L5 são ligantes, que podem ser independentemente iguais ou diferentes.

10. Proteína de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a primeira porção do pseudoFab compreende uma primeira cadeia polipeptídica tendo uma estrutura representada pela fórmula: (Ia) N-VHa-L1-VHX-C e uma segunda cadeia polipeptídica tendo uma estrutura representada pela fórmula: (IIa) N-VLa-L2-VLX-C em que L1 e L2 são ligantes, que podem estar independentemente presentes ou ausentes, e em que N e C representam as extremidades N- e C-terminais, respectivamente.

11. Proteína de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a primeira porção do pseudoFab compreende uma primeira cadeia polipeptídica tendo uma estrutura representada pela fórmula: (Ib) N-VHX-L1-VHa-C e uma segunda cadeia polipeptídica tendo uma estrutura representada pela fórmula: (IIb) N-VLX-L2-VLa-C em que L1 e L2 são ligantes, que podem estar independentemente presentes ou ausentes, e em que N e C representam as extremidades N- e C-terminais, respectivamente.

12. Proteína de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a primeira porção do pseudoFab compreende uma primeira cadeia polipeptídica tendo uma estrutura representada pela fórmula: (Ic) N-VLa-L1-VHX-C e uma segunda cadeia polipeptídica tendo uma estrutura representada pela fórmula: (IIc) N-VHa-L2-VLX-C em que L1 e L2 são ligantes, que podem estar independentemente presentes ou ausentes, e em que N e C representam as extremidades N- e C-terminais, respectivamente.

13. Proteína de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a primeira porção do pseudoFab compreende uma primeira cadeia polipeptídica tendo uma estrutura representada pela fórmula: (Id) N- VHX-L1-VLa-C e uma segunda cadeia polipeptídica tendo uma estrutura representada pela fórmula: (IId) N-VLX-L2-VHa-C em que L1 e L2 são ligantes, que podem estar independentemente presentes ou ausentes, e em que N e C representam as extremidades N- e C-terminais, respectivamente.

14. Proteína de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que adicionalmente compreende um ou mais domínios de ligação adicionais operativamente ligados a um N- ou C-terminal da proteína de ligação.

15. Proteína de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que um ou mais domínios de ligação adicionais estão operativamente ligados ao N- terminal da primeira ou segunda porção do pseudoFab.

16. Proteína de ligação multiespecífica, caracterizada pelo fato de que compreende: a) uma primeira porção pseudoFab que compreende: (1) um primeiro domínio VL (VLa) emparelhado com um primeiro domínio VH (VHa) para formar um primeiro sítio de ligação a antígeno que se liga ao antígeno alvo A; (2) um primeiro domínio VL nocaute estabilizado (VLX) emparelhado com um primeiro domínio VH nocaute estabilizado (VHX) para formar um primeiro domínio nocaute estabilizado por dissulfeto (dsKO); (3) um primeiro domínio de heterodimerização (HD1); em que o primeiro domínio dsKO compreende (i) uma ou mais mutações de inativação que abolem sua ligação a um antígeno alvo; e (ii) uma ou mais ligações dissulfeto intercadeia construídas geneticamente; b) uma primeira porção Fab compreendendo (1) um segundo domínio VL (VLb) emparelhado com o segundo domínio VH (VHb) para formar um segundo sítio de ligação de antígeno funcional que liga o antígeno alvo B; (2) um primeiro domínio CH1 emparelhado com um primeiro domínio CL; e (3) um segundo domínio de heterodimerização (HD2).

17. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que o primeiro e o segundo domínios de heterodimerização compreendem o primeiro e o segundo domínios Fc.

18. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizada pelo fato de que os domínios Fc compreendem a estrutura geral dobradiça-domínio CH2-domínio CH3.

19. Proteína de ligação multiespecífica, caracterizada pelo fato de que compreende quatro cadeias polipeptídicas que formam pelo menos dois sítios de ligação a antígeno, em que (a) um primeiro polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VLa-L1-VLX [I] (b) um segundo polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula:

VHa-L2-VHX-FC1 [II] (c) um terceiro polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VLb-CL [III] (d) um quarto polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VHb-CH1-FC2 [IV] em que: VLa é um primeiro domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VLb é um segundo domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VHa é um primeiro domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; VHb é um segundo domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; VLX é um domínio variável de cadeia leve nocaute estabilizado; VHX é um domínio variável de cadeia pesada nocaute estabilizado; CL é um domínio constante de cadeia leve de imunoglobulina; CH1 é um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina CH1; FC1 e FC2 são domínios Fc compreendendo uma região de dobradiça de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2 e CH3; e L1 e L2 são ligantes de aminoácidos, que podem ser independentemente iguais ou diferentes, em que o primeiro domínio VL (VLa) é emparelhado com um primeiro domínio VH (VHa) para formar um primeiro sítio de ligação a antígeno funcional que liga o antígeno alvo A; o segundo domínio VL (VLb) é emparelhado com um segundo domínio VH (VHb) para formar um segundo sítio de ligação de antígeno funcional que liga o antígeno alvo B; o domínio VL nocaute estabilizado (VLX) é emparelhado com o domínio VH nocaute estabilizado (VHX) para formar um domínio nocaute estabilizado por dissulfeto (dsKO); em que o domínio dsKO compreende (i) uma ou mais mutações de inativação que abolem sua ligação a um antígeno alvo; e (ii) uma ou mais ligações dissulfeto intercadeia construídas geneticamente.

20. Proteína de ligação a antígeno, caracterizada pelo fato de que compreende seis cadeias polipeptídicas que formam quatro sítios de ligação a antígeno, em que (a) o primeiro e o segundo polipeptídeos compreendem uma estrutura representada pela fórmula: VLa-L1-VLX [I] e [II] (b) o terceiro e o quarto polipeptídeos compreendem uma estrutura representada pela fórmula: VLb-CL [III] e [IV] (c) o quinto polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VHa-L2-VHX-L3-VHb-CH1-FC1 [V] (d) o sexto polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VHa-L2-VHX-L3-VHb-CH1-FC2 [VI]

em que: VLa é um primeiro domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VLb é um segundo domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VHa é um primeiro domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; VHb é um segundo domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; VLX é um domínio variável de cadeia leve nocaute estabilizado; VHX é um domínio variável de cadeia pesada nocaute estabilizado; CL é um domínio constante de cadeia leve de imunoglobulina; CH1 é um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina; FC1 e FC2 são domínios Fc compreendendo uma região de dobradiça de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2 e CH3; e L1, L2 e L3 são ligantes de aminoácidos, em que (1) o primeiro domínio VL (VLa) é emparelhado com o primeiro domínio VH (VHa) para formar um primeiro sítio de ligação a antígeno funcional que liga o antígeno alvo A; (2) o segundo domínio VL (VLb) é emparelhado com o segundo domínio VH (VHb) para formar um segundo sítio de ligação do antígeno funcional que liga o antígeno alvo B; (3) o domínio VL nocaute estabilizado (VLX) é emparelhado com o domínio VH nocaute estabilizado (VHX) para formar um domínio nocaute estabilizado por dissulfeto (dsKO); em que os domínios dsKO compreendem (i) uma ou mais mutações de inativação que abolem sua ligação a um antígeno alvo; e (ii) uma ou mais ligações dissulfeto intercadeia construídas geneticamente.

21. Proteína de ligação a antígeno, caracterizada pelo fato de que compreende seis cadeias polipeptídicas que formam quatro sítios de ligação a antígeno, em que (a) o primeiro e o segundo polipeptídeos compreendem uma estrutura representada pela fórmula: VLa-L1-VLX [I] e [II] (b) o terceiro e o quarto polipeptídeos compreendem uma estrutura representada pela fórmula: VLb-CL [III] e [IV] (c) o quinto polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VHb-CH1-L3-VHa-L2-VHX-FC1 [V] (d) o sexto polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VHb-CH1-L3-VHa-L2-VHX-FC2 [VI] em que: VLa é um primeiro domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VLb é um segundo domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VHa é um primeiro domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; VHb é um segundo domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina;

VLX é um domínio variável de cadeia leve nocaute estabilizado; VHX é um domínio variável de cadeia pesada nocaute estabilizado; CL é um domínio constante de cadeia leve de imunoglobulina; CH1 é um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina; FC1 e FC2 são domínios Fc compreendendo uma região de dobradiça de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2 e CH3; e L1, L2 e L3 são ligantes de aminoácidos, em que (1) o primeiro domínio VL (VLa) é emparelhado com o primeiro domínio VH (VHa) para formar um primeiro sítio de ligação a antígeno funcional que liga o antígeno alvo A; (2) o segundo domínio VL (VLb) é emparelhado com o segundo domínio VH (VHb) para formar um segundo sítio de ligação a antígeno funcional que liga o antígeno alvo B; (3) o domínio VL nocaute estabilizado (VLX) é emparelhado com o domínio VH nocaute estabilizado (VHX) para formar um domínio nocaute estabilizado por dissulfeto (dsKO); em que os domínios dsKO compreendem (i) uma ou mais mutações de inativação que abolem sua ligação a um antígeno alvo; e (ii) uma ou mais ligações dissulfeto intercadeia construídas geneticamente.

22. Proteína de ligação a antígeno, caracterizada pelo fato de que compreende seis cadeias polipeptídicas que formam quatro sítios de ligação a antígeno, em que

(a) o primeiro e o segundo polipeptídeos compreendem uma estrutura representada pela fórmula: VLa-L1-VLX [I] e [II] (b) o terceiro e o quarto polipeptídeos compreendem uma estrutura representada pela fórmula: VLb-CL [III] e [IV] (c) o quinto polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VHa-L2-VHX-L3-VHa-L4-VHX-FC1 [V] (d) o sexto polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VHb-CH1-L5-VHb-CH1-FC2 [VI] em que: VLa é um primeiro domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VLb é um segundo domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VHa é um primeiro domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; VHb é um segundo domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; VLX é um domínio variável de cadeia leve nocaute estabilizado; VHX é um domínio variável de cadeia pesada nocaute estabilizado; CL é um domínio constante de cadeia leve de imunoglobulina; CH1 é um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina; FC1 e FC2 são domínios Fc compreendendo uma região de dobradiça de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2 e CH3; e L1, L2, L3, L4 e L5 são ligantes de aminoácidos, em que (1) o primeiro domínio VL (VLa) é emparelhado com o primeiro domínio VH (VHa) para formar um primeiro sítio de ligação a antígeno funcional que liga o antígeno alvo A; (2) o segundo domínio VL (VLb) é emparelhado com o segundo domínio VH (VHb) para formar um segundo sítio de ligação a antígeno funcional que liga o antígeno alvo B; (3) o domínio VL nocaute estabilizado (VLX) é emparelhado com o domínio VH nocaute estabilizado (VHX) para formar um domínio nocaute estabilizado por dissulfeto (dsKO); em que os domínios dsKO compreendem (i) uma ou mais mutações de inativação que abolem sua ligação a um antígeno alvo; (ii) uma ou mais ligações dissulfeto intercadeia construídas geneticamente.

23. Proteína de ligação a antígeno, caracterizada pelo fato de que compreende quatro cadeias polipeptídicas que formam três sítios de ligação a antígeno, em que: (a) o primeiro polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VLa-L1-VLX [I] (b) o segundo polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VHa-L2-VHX- FC1 [II] (c) o terceiro polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VLb-L3-VLc-L4-CL [III]

(d) o quarto polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VHc-L5-VHb-L6-CH1-FC2 [IV] em que: VLa é um primeiro domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VLb é um segundo domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VLc é um terceiro domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VHa é um primeiro domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; VHb é uma segunda variável de cadeia pesada de imunoglobulina domínio; VHc é um terceiro domínio variável da cadeia pesada de imunoglobulina; CL é um domínio constante de cadeia leve de imunoglobulina; CH1 é um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina CH1; VLX é um domínio variável de cadeia leve nocaute estabilizado; VHX é um domínio variável de cadeia pesada nocaute estabilizado; FC1 e FC2 são domínios Fc compreendendo uma região de dobradiça de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2 e CH3; e L1, L2, L3, L4, L5 e L6 são ligantes de aminoácidos, em que (1) o primeiro domínio VL (VLa) é emparelhado com o primeiro domínio VH (VHa) para formar um primeiro sítio de ligação a antígeno funcional que liga o antígeno alvo A; (2) o segundo domínio VL (VLb) é emparelhado com o segundo domínio VH (VHb) para formar um segundo sítio de ligação a antígeno funcional que liga o antígeno alvo B; (3) o terceiro domínio VL (VLc) é emparelhado com o terceiro domínio VH (VHc) para formar um terceiro sítio de ligação de antígeno funcional que liga o antígeno alvo C; (4) o polipeptídeo de fórmula III e o polipeptídeo de fórmula IV formam um par cruzado de cadeia leve-cadeia pesada (CODV); (5) o domínio VL nocaute estabilizado (VLX) é emparelhado com o domínio VH nocaute estabilizado (VHX) para formar um domínio nocaute estabilizado por dissulfeto (dsKO2); em que o domínio dsKO compreende (i) uma ou mais mutações de inativação que abolem sua ligação a um antígeno alvo; e (ii) uma ou mais ligações dissulfeto intercadeia construídas geneticamente.

24. Proteína de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 23, caracterizada pelo fato de que os domínios Fc compreendem uma ou mais mutações knob-in-hole (KIH).

25. Proteína de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a temperatura de fusão (Tm) da porção pseudoFab é pelo menos 4 graus Celsius mais alta do que a molécula Fab de referência.

26. Molécula de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma das uma ou mais ligações dissulfeto intercadeia construídas geneticamente é VH44C-VL100C.

27. Proteína de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que o antígeno alvo A e o antígeno alvo B são epítopos diferentes do mesmo antígeno.

28. Proteína de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que o par VLX/VHX é selecionado a partir do grupo que consiste em: i) VLX compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 76 e VHX compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 77; ii) VLX compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 76 e VHX compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 78; e iii) VLX compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 76 e VHX compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 79.

29. Uso de um domínio nocaute estabilizado, caracterizado pelo fato de que é para reduzir o emparelhamento incorreto de cadeia pesada - cadeia leve em uma proteína de ligação multiespecífica, em que o domínio nocaute estabilizado compreende domínios VHK e VLX compreendendo (1) uma ou mais mutações de inativação que abolem sua ligação a um antígeno alvo em relação a domínios de tipo selvagem e (2) uma ou mais ligações dissulfeto intercadeia construídas geneticamente que conferem estabilidade térmica aprimorada (T m) do pseudoFab relativo a uma molécula Fab de referência, em que a molécula Fab de referência é idêntica à molécula pseudoFab, exceto que, em uma referência pseudoFab molécula, domínios CH1 e CL da molécula Fab de referência são substituídos por domínios VHX e VLX.

30. Uso, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o par VLX/VHX é selecionado a partir do grupo que consiste em:

i) VLX compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 76 e VHX compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 77; ii) VLX compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 76 e VHX compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 78; e iii) VLX compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 76 e VHX compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 79.

31. Molécula de ácido nucleico isolada, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica a proteína de ligação, como definida em qualquer uma das reivindicações precedentes.

32. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico, como definida na reivindicação 31.

33. Célula hospedeira isolada, caracterizada pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico, como definida na reivindicação 31, ou o vetor de expressão, como definido na reivindicação 32.

34. Método de produção da proteína de ligação, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 28, caracterizado pelo fato de que compreende a cultura da célula hospedeira, como definida na reivindicação 33, sob condições tais que a proteína de ligação seja expressa; e purificar a proteína de ligação da célula hospedeira.

35. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um veículo farmaceuticamente aceitável e uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína de ligação multiespecífica, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a

28.

36. Método de tratamento de um distúrbio no qual a atividade do antígeno é prejudicial, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a um indivíduo em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de uma proteína de ligação multiespecífica, como definida em qualquer uma das reivindicações precedentes.