TWI788286B - 三特異性和/或三價結合蛋白 - Google Patents

三特異性和/或三價結合蛋白 Download PDF

Info

Publication number
TWI788286B
TWI788286B TW106112360A TW106112360A TWI788286B TW I788286 B TWI788286 B TW I788286B TW 106112360 A TW106112360 A TW 106112360A TW 106112360 A TW106112360 A TW 106112360A TW I788286 B TWI788286 B TW I788286B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
amino acid
seq
acid sequence
cdr
polypeptide chain
Prior art date
Application number
TW106112360A
Other languages
English (en)
Other versions
TW201803899A (zh
Inventor
克里斯頓 貝爾
喬西恩 貝寧格
卡斯頓 科魏
克里斯頓 藍格
沃夫 德克 路西納
蓋瑞Ｊ 納貝爾
厄爾寇 拉歐
艾德華 宋
羅尼 魏
嵐 吳
之庸 楊
Original Assignee
法商賽諾菲公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=58464471&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=TWI788286(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 法商賽諾菲公司 filed Critical 法商賽諾菲公司
Publication of TW201803899A publication Critical patent/TW201803899A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI788286B publication Critical patent/TWI788286B/zh

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C07K16/247—IL-4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pyrrole Compounds (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)

Abstract

本發明提供包含4條多肽鏈的三特異性和/或三價結合蛋白，所述4條多肽鏈形成特異性結合一個或多個靶蛋白的3個抗原結合位點，其中形成該結合蛋白的第一對多肽具有雙重可變域，其具有交叉(cross-over)取向，且其中形成該結合蛋白的第二對多肽具有單一可變域。本文還提供用於製備三特異性和/或三價結合蛋白的方法和此類結合蛋白的用途。

Description

三特異性和/或三價結合蛋白 【相關申請的交叉引用】
本申請要求2016年4月13日提交的美國臨時申請序列號62/322,036；2016年5月3日提交的美國臨時申請序列號62/331,191；2016年10月24日提交的美國臨時申請序列號62/412,187；及2017年3月17日提交的歐洲申請EP17305298.6號的優先權權益，所述申請通過提述以其整體幷入本文。
【以ASCII文本文件提交的序列表】
以ASCII文本文件的如下提交內容在此通過提述以其整體幷入本文：計算機可讀形式(CRF)的序列表(文件名183952027140SEQLISTING.txt，記錄日期：2017年4月11日，大小：200KB)。
本發明涉及包含4條多肽鏈的三特異性和/或三價結合蛋白，所述4條多肽鏈形成特異性結合一個或多個靶蛋白的3個抗原結合位點，其中形成該結合蛋白的第一對多肽具有雙重可變域，其具有交叉(cross-over)取向，且其中形成該結合蛋白的第二對多肽具有單一可變域。本發明還涉及用於製備三特異性和/或三價結合蛋白的方法及此類結合蛋白的用途。
基于生物治療劑的單克隆抗體已成為新藥開發的重要途徑。單克隆抗體技術通過其Fc功能提供特異性靶向、精確信號傳送和/或對特定細胞群體的有效負載，幷提供長效生物效應。抗體工程中的努力允許開發組合兩種單克隆抗體的特異性的雙特異性抗體用於多種生物學應用，這拓寬了抗體藥物開發的範圍。新發現的具有改進的廣度和效力的中和抗體可以提供更多選擇用於開發生物治療劑以治療複雜疾病(如癌症、關節炎和/或炎性病症)。
本發明提供形成3個抗原結合位點的多特異性結合蛋白(例如抗體)。這些結合蛋白能特異性結合一個、兩個或三個抗原靶標或靶蛋白。
在一個實施方案中，本發明提供一種結合蛋白，其包含形成3個抗原結合位點的4條多肽鏈，所述3個抗原結合位點特異性結合一個或多個抗原靶標或靶蛋白，其中第一多肽鏈具有如下式表示的結構：VL2-L1-VL1-L2-CL [I]；第二多肽鏈具有如下式表示的結構：VH1-L3-VH2-L4-CH1 [II]；第三多肽鏈具有如下式表示的結構：VH3-CH1 [III]；第四多肽鏈具有如下式表示的結構：VL3-CL [IV]；其中：VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變域；VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變域；VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變域；VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變域；VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變域； VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變域；CL是免疫球蛋白輕鏈恆定域；CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恆定域；且L1、L2、L3和L4是氨基酸連接子；且其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對。
在一些實施方案中，所述第二和/或第三多肽鏈還包含連接至CH1的Fc區，所述Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋白重鏈恆定域。
在另一個實施方案中，本發明提供一種結合蛋白，其包含形成3個抗原結合位點的4條多肽鏈，所述3個抗原結合位點特異性結合一個或多個靶蛋白，其中第一多肽鏈包含如下式表示的結構：VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽鏈包含如下式表示的結構：VH1-L3-VH2-L4-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [II]
且第三多肽鏈包含如下式表示的結構：VH3-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [III]
且第四多肽鏈包含如下式表示的結構：VL3-CL [IV]
其中：VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變域；VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變域；VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變域；VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變域；VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變域；VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變域；CL是免疫球蛋白輕鏈恆定域；CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恆定域； CH2是免疫球蛋白CH2重鏈恆定域；CH3是免疫球蛋白CH3重鏈恆定域；鉸鏈是連接CH1和CH2域的免疫球蛋白鉸鏈區；且L1、L2、L3和L4是氨基酸連接子；且其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對。
在一些實施方案中，結合蛋白是三特異性的且能够特異性結合3個不同的抗原靶標。在一些實施方案中，結合蛋白是三價但雙特異性的，幷且能够特異性結合3個抗原靶標，其中兩個是相同的。在一些實施方案中，本發明的結合蛋白是三價但單特異性的，幷且能够特異性結合3個抗原靶標，其全都是相同的。在一些實施方案中，結合蛋白能够抑制一個或多個靶蛋白的功能。在一些實施方案中，結合蛋白是三特異性的且能够特異性結合3個不同的抗原靶標。
在一些實施方案中，本發明的結合蛋白包含一個、兩個或三個抗原結合位點，其特異性結合選自下組的靶蛋白：A2AR、APRIL、ATPD酶(ATPDase)、BAFF、BAFFR、BCMA、BlyS、BTK、BTLA、B7DC、B7H1、B7H4(也稱為VTCN1)、B7H5、B7H6、B7H7、B7RP1、B7-4、C3、C5、CCL2(也稱為MCP-1)、CCL3(也稱為MIP-1a)、CCL4(也稱為MIP-1b)、CCL5(也稱為RANTES)、CCL7(也稱為MCP-3)、CCL8(也稱為mcp-2)、CCL11(也稱為嗜酸性粒細胞趨化因子(eotaxin))、CCL15(也稱為MIP-1d)、CCL17(也稱為TARC)、CCL19(也稱為MIP-3b)、CCL20(也稱為MIP-3a)、CCL21(也稱為MIP-2)、CCL24(也稱為MPIF-2/嗜酸性粒細胞趨化因子-2)、CCL25(也稱為TECK)、CCL26(也稱為嗜酸性粒細胞趨化因子-3)、CCR3、CCR4、CD3、CD19、CD20、CD23(也稱為FCER2)、CD24、CD27、CD28、CD38、CD39、CD40、CD70、CD80(也稱為B7-1)、CD86(也稱為B7-2)、CD122、CD137(也稱為41BB)、CD137L、CD152(也稱為CTLA4)、CD154(也稱為CD40L)、CD160、CD272、CD273(也稱為PDL2)、CD274(也稱為PDL1)、CD275(也稱為B7H2)、CD276(也稱為B7H3)、CD278(也稱為ICOS)、CD279(也稱為PD- 1)、CDH1(也稱為E-鈣粘素)、殼多糖酶、CLEC9、CLEC91、CRTH2、CSF-1(也稱為M-CSF)、CSF-2(也稱為GM-CSF)、CSF-3(也稱為GCSF)、CX3CL1(也稱為SCYD1)、CXCL12(也稱為SDF1)、CXCL13、CXCR3、DNGR-1、外核苷三磷酸鹽二磷酸水解酶1(ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1)、EGFR、ENTPD1、FCER1A、FCER1、FLAP、Gi24、GITR、GITRL、GM-CSF、Her2、HHLA2、HMGB1、HVEM、ICOSLG、IDO、IFNα、IgE、IGF1R、IL2Rβ、IL1、IL1A、IL1B、IL1F10、IL2、IL4、IL4Ra、IL5、IL5R、IL6、IL7、IL7Ra、IL8、IL9、IL9R、IL10、rhIL10、IL12、IL13、IL13Ra1、IL13Ra2、IL15、IL17、IL17Rb、IL18、IL22、IL23、IL25、IL27、IL33、IL35、ITGB4(也稱為b4整合素)、ITK、KIR、LAG3、LAMP1、瘦素、LPFS2、II類MHC、NCR3LG1、NKG2D、NTPD酶-1、OX40、OX40L、PD-1H、血小板受體、S152、SISP1、SLC、SPG64、ST2、Syk激酶、TACI、TDO、T14、TIGIT、TIM3、TLR、TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、TNFa、TNFRSF7、Tp55、TREM1、TSLP、TSLPR、TWEAK、VEGF、VISTA、Vstm3、WUCAM和XCR1(也稱為GPR5/CCXCR1)。在一些實施方案中，一個或多個上述抗原靶標為人抗原靶標。在一些實施方案中，本發明的結合蛋白是三特異性的且能够特異性結合選自上文列表的3個不同的抗原靶標。在一些實施方案中，本發明的結合蛋白是三價但雙特異性的，且能够特異性結合選自上文列表的3個抗原靶標，其中兩個是相同的。在一些實施方案中，本發明的結合蛋白是三價但單特異性的，且能够特異性結合選自上文列表的3個抗原靶標，其全部是相同的。在一些實施方案中，結合蛋白特異性結合3個靶蛋白，所述靶蛋白對應于T細胞上的2個靶蛋白以及1個腫瘤靶蛋白。在一些實施方案中，T細胞上的所述靶蛋白之一是CD3。在一些實施方案中，T細胞上的所述靶蛋白之一是CD28。在一些實施方案中，所述腫瘤靶蛋白是CD38。在一些實施方案中，結合蛋白特異性結合3個靶蛋白，所述靶蛋白對應于T細胞上的2個靶蛋白以及1個選自下組的靶蛋白：A2AR、APRIL、ATPD酶、BAFF、 BAFFR、BCMA、BlyS、BTK、BTLA、B7DC、B7H1、B7H4、B7H5、B7H6、B7H7、B7RP1、B7-4、C3、C5、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL15、CCL17、CCL19、CCL20、CCL21、CCL24、CCL25、CCL26、CCR3、CCR4、CD3、CD19、CD20、CD23、CD24、CD27、CD28、CD38、CD39、CD40、CD70、CD80、CD86、CD122、CD137、CD137L、CD152、CD154、CD160、CD272、CD273、CD274、CD275、CD276、CD278、CD279、CDH1、殼多糖酶、CLEC9、CLEC91、CRTH2、CSF-1、CSF-2、CSF-3、CX3CL1、CXCL12、CXCL13、CXCR3、DNGR-1、外核苷三磷酸鹽二磷酸水解酶1、EGFR、ENTPD1、FCER1A、FCER1、FLAP、Gi24、GITR、GITRL、GM-CSF、Her2、HHLA2、HMGB1、HVEM、ICOSLG、IDO、IFNα、IgE、IGF1R、IL2Rβ、IL1、IL1A、IL1B、IL1F10、IL2、IL4、IL4Ra、IL5、IL5R、IL6、IL7、IL7Ra、IL8、IL9、IL9R、IL10、rhIL10、IL12、IL13、IL13Ra1、IL13Ra2、IL15、IL17、IL17Rb、IL18、IL22、IL23、IL25、IL27、IL33、IL35、ITGB4、ITK、KIR、LAG3、LAMP1、瘦素、LPFS2、II類MHC、NCR3LG1、NKG2D、NTPD酶-1、OX40、OX40L、PD-1H、血小板受體、S152、SISP1、SLC、SPG64、ST2、Syk激酶、TACI、TDO、T14、TIGIT、TIM3、TLR、TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、TNFa、TNFRSF7、Tp55、TREM1、TSLP、TSLPR、TWEAK、VEGF、VISTA、Vstm3、WUCAM和XCR1。
在另一個實施方案中，本發明提供一種結合蛋白，其包含形成3個抗原結合位點的4條多肽鏈，其中第一多肽鏈具有如下式表示的結構：VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽鏈具有如下式表示的結構：VH1-L3-VH2-L4-CH1 [II]
且第三多肽鏈具有如下式表示的結構：VH3-CH1 [III]
且第四多肽鏈具有如下式表示的結構：VL3-CL [IV]
其中：VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變域；VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變域；VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變域；VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變域；VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變域；VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變域；CL是免疫球蛋白輕鏈恆定域；CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恆定域；且L1、L2、L3和L4是氨基酸連接子；其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對；其中：(a)VL1、VL2和VL3各自獨立地是源自如SEQ ID NO：2、4、10、14、18、22、115任一項所示氨基酸序列的可變域；(b)VL1、VL2和VL3各自獨立地包含可變域的輕鏈互補决定區，所述可變域包含如SEQ ID NO：43-59、123-125的任一項所示的氨基酸序列；(c)VL1、VL2和VL3各自獨立地包含如SEQ ID NO：151、153、155、157、159、161、163、165和167的任一項所示的可變域序列；(d)VL1、VL2和VL3各自獨立地包含輕鏈互補决定區，其包含如SEQ ID NO：43-59、123-125、138-140和149的任一項所示的氨基酸序列；或(e)VL1、VL2和VL3各自獨立地包含如表2-5所示的輕鏈互補决定區和/或可變域序列；且其中：(a)VH1、VH2和VH3各自獨立地是源自如SEQ ID NO：1、3、9、13、17、 21、114任一項所示氨基酸序列的可變域；(b)VH1、VH2和VH3各自獨立地包含可變域的重鏈互補决定區，所述可變域包含如SEQ ID NO：25-42、120-122的任一項所示的氨基酸序列；(c)VH1、VH2和VH3各自獨立地包含如SEQ ID NO：150、152、154、156、158、160、162、164和166的任一項所示的可變域序列；(d)VH1、VH2和VH3各自獨立地包含可變域的重鏈互補决定區，其包含如SEQ ID NO：25-42、120-122和126-128任一項所示的氨基酸序列；或(e)VH1、VH2和VH3各自獨立地包含如表2-5所示的重鏈互補决定區和/或可變域序列。
在一些實施方案中，第二和/或第三多肽鏈還包含連接至CH1的Fc區，所述Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋白重鏈恆定域。
在另一個實施方案中，本發明提供一種結合蛋白，其包含形成3個抗原結合位點的4條多肽鏈，其中第一多肽鏈包含如下式表示的結構：VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽鏈包含如下式表示的結構：VH1-L3-VH2-L4-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [II]
且第三多肽鏈包含如下式表示的結構：VH3-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [III]
且第四多肽鏈包含如下式表示的結構：VL3-CL [IV]
其中：VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變域；VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變域；VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變域；VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變域；VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變域； VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變域；CL是免疫球蛋白輕鏈恆定域；CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恆定域；CH2是免疫球蛋白CH2重鏈恆定域；CH3是免疫球蛋白CH3重鏈恆定域；鉸鏈是連接CH1和CH2域的免疫球蛋白鉸鏈區；且L1、L2、L3和L4是氨基酸連接子；其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對；其中：(a)VL1、VL2和VL3各自獨立地是源自如SEQ ID NO：2、4、10、14、18、22、115的任一項所示氨基酸序列的可變域；(b)VL1、VL2和VL3各自獨立地包含可變域的輕鏈互補决定區，所述可變域包含如SEQ ID NO：43-59、123-125的任一項所示的氨基酸序列；(c)VL1、VL2和VL3各自獨立地包含如SEQ ID NO：151、153、155、157、159、161、163、165和167的任一項所示的可變域序列；(d)VL1、VL2和VL3各自獨立地包含輕鏈互補决定區，其包含如SEQ ID NO：43-59、123-125、138-140和149的任一項所示的氨基酸序列；或(e)VL1、VL2和VL3各自獨立地包含如表2-5所示的輕鏈互補决定區和/或可變域序列；且其中：(a)VH1、VH2和VH3各自獨立地是源自如SEQ ID NO：1、3、9、13、17、21、114的任一項所示氨基酸序列的可變域；(b)VH1、VH2和VH3各自獨立地包含可變域的重鏈互補决定區，所述可變域包含如SEQ ID NO：25-42、120-122的任一項所示的氨基酸序列；(c)VH1、VH2和VH3各自獨立地包含如SEQ ID NO：150、152、154、156、158、160、162、164和166的任一項所示的可變域序列； (d)VH1、VH2和VH3各自獨立地包含可變域的重鏈互補决定區，其包含如SEQ ID NO：25-42、120-122和126-128任一項所示的氨基酸序列；或(e)VH1、VH2和VH3各自獨立地包含如表2-5所示的重鏈互補决定區和/或可變域序列。
在本文所述的任一結合蛋白的一些實施方案中，(a)VH1包含：包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：48的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列的CDR-L3；(b)VH1包含含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列的CDR-L3；(c)VH1包含：包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：48的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：55的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：56的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：57的氨基酸序列的CDR-L3；(d)VH1包含：包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：55的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：56的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：57的氨基酸序列的CDR-L3；(e)VH1包含：包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的CDR-H2和包含 SEQ ID NO：30的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：48的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：58的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：59的氨基酸序列的CDR-L3；(f)VH1包含：包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：58的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：59的氨基酸序列的CDR-L3；(g)VH1包含：包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：48的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的 CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：126的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：127的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：128的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：138的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：139的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：140的氨基酸序列的CDR-L3；(h)VH1包含：包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：126的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：127的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：128的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：138的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：139的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：140的氨基酸序列的CDR-L3；(i)VH1包含：包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：48的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：120的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：121的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：122的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：123的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：124的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：125的氨基酸序列的CDR-L3；或(j)VH1包含：包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：120的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：121的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：122的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：123的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：124的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：125的氨基酸序列的CDR-L3。在一些實施方案中，(a)VH1包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包 含：包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些實施方案中，結合蛋白包含一個特異性結合T細胞表面蛋白的抗原結合位點和另一個特異性結合抗原靶標(例如腫瘤靶蛋白)的抗原結合位點。在一些實施方案中，結合蛋白包含特異性結合CD3的抗原結合位點，特異性結合CD28的抗原結合位點，和特異性結合選自下組的腫瘤靶蛋白的抗原結合位點：CD19、CD20、CD38、Her2和LAMP1。在一些實施方案中，VH1和VL1形成特異性結合人CD3的第一抗原結合位點，VH2和VL2形成特異性結合人CD28的第二抗原結合位點，且VH3和VL3形成特異性結合人腫瘤靶蛋白的第三抗原結合位點。在一些實施方案中，VH1和VL1形成特異性結合人CD28的第一抗原結合位點，VH2和VL2形成特異性結合人CD3的第二抗原結合位點，且VH3和VL3形成特異性結合人腫瘤靶蛋白的第三結合位點。在一些實施方案中，所述抗原結合位點特異性結合選自下組的人腫瘤靶蛋白：CD19、CD20、CD38、Her2和LAMP1。在一些實施方案中，特異性結合CD3的抗原結合位點包含：(a)包含SEQ ID NO：152的氨基酸序列的重鏈可變域和包含SEQ ID NO：153的氨基酸序列的輕鏈可變域；或(b)包含SEQ ID NO：154的氨基酸序列的重鏈可變域和包含SEQ ID NO：155的氨基酸序列的輕鏈可變域。在一些實施方案中，特異性結合CD3的抗原結合位點包含6個CDR，或重鏈和輕鏈可變域，其示于表2-5。在一些實施方案中，特異性結合CD28的抗原結合位點包含：(a)包含SEQ ID NO：160的氨基酸序列的重鏈可變域和包含SEQ ID NO：161的氨基酸序列的輕鏈可變域；或(b)包含SEQ ID NO：162的氨基酸序列的重鏈可變域和包含SEQ ID NO：163的氨基酸序列的輕鏈可變域。在一些實施方案中，特異性結合CD28的抗原結合位點包含6個CDR，或重鏈和輕鏈可變域，其示于表2-5。在一些實施方案中，特異性結合腫瘤靶蛋白的抗原結合位點包含：(a)包含SEQ ID NO：156的氨基酸序列的重鏈可變域和包含SEQ ID NO：157的氨基酸序列的輕鏈可變域；(b)包含SEQ ID NO：158的氨基酸序列的重鏈可變域和包含SEQ ID NO：159的氨基酸序列的輕鏈可變 域；(c)包含SEQ ID NO：164的氨基酸序列的重鏈可變域和包含SEQ ID NO：165的氨基酸序列的輕鏈可變域；(d)包含SEQ ID NO：150的氨基酸序列的重鏈可變域和包含SEQ ID NO：151的氨基酸序列的輕鏈可變域；或(e)包含SEQ ID NO：166的氨基酸序列的重鏈可變域和包含SEQ ID NO：167的氨基酸序列的輕鏈可變域。在一些實施方案中，特異性結合腫瘤靶蛋白的抗原結合位點包含6個CDR，或重鏈和輕鏈可變域，其示于表2-5。
在另一個實施方案中，本發明提供一種結合蛋白，其包含形成3個抗原結合位點的4條多肽鏈，其中第一多肽鏈具有如下式表示的結構：VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽鏈具有如下式表示的結構：VH1-L3-VH2-L4-CH1 [II]
且第三多肽鏈具有如下式表示的結構：VH3-CH1 [III]
且第四多肽鏈具有如下式表示的結構：VL3-CL [IV]
其中：VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變域；VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變域；VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變域；VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變域；VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變域；VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變域；CL是免疫球蛋白輕鏈恆定域；CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恆定域；且L1、L2、L3和L4是氨基酸連接子；其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對； 其中：(a)VL1、VL2和VL3各自獨立地是源自如SEQ ID NO：61、63、69、71、74、76、82、86、88、94任一項所示氨基酸序列的可變域；或(b)VL1、VL2和VL3各自獨立地包含可變域的輕鏈互補决定區，所述可變域是如SEQ ID NO：61、63、69、71、74、76、82、86、88、94的任一項所示的至少一個氨基酸序列；(c)VL1、VL2和VL3各自獨立地包含如SEQ ID NO：169、171和173的任一項所示的可變域序列；(d)VL1、VL2和VL3各自獨立地包含輕鏈互補决定區，其包含選自下組的氨基酸序列：SEQ ID NO：50、141-147、178和179；或(e)VL1、VL2和VL3各自獨立地包含如表2-5所示的輕鏈互補决定區和/或可變域序列；且其中：(a)VH1、VH2和VH3各自獨立地是源自如SEQ ID NO：60、62、68、73、75、81、85、87、93的任一項所示氨基酸序列的可變域；或(b)VH1、VH2和VH3各自獨立地包含可變域的重鏈互補决定區，所述可變域是SEQ ID NO：60、62、68、73、75、81、85、87、93的任一項所示的至少一個氨基酸序列；(c)VH1、VH2和VH3各自獨立地包含如SEQ ID NO：168、170和172的任一項所示的可變域序列；(d)VH1、VH2和VH3各自獨立地包含重鏈互補决定區，其包含選自下組的氨基酸序列：SEQ ID NO：129-137；或(e)VH1、VH2和VH3各自獨立地包含如表2-5所示的重鏈互補决定區和/或可變域序列。
在一些實施方案中，第二和/或第三多肽鏈還包含連接至CH1的Fc區，所述Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋白重鏈恆定域。
在另一個實施方案中，本發明提供一種結合蛋白，其包含形成3個抗原結合位點的4條多肽鏈，其中第一多肽鏈包含如下式表示的結構：VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽鏈包含如下式表示的結構：VH1-L3-VH2-L4-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [II]
且第三多肽鏈包含如下式表示的結構：VH3-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [III]
且第四多肽鏈包含如下式表示的結構：VL3-CL [IV]
其中：VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變域；VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變域；VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變域；VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變域；VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變域；VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變域；CL是免疫球蛋白輕鏈恆定域；CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恆定域；CH2是免疫球蛋白CH2重鏈恆定域；CH3是免疫球蛋白CH3重鏈恆定域；鉸鏈是連接CH1和CH2域的免疫球蛋白鉸鏈區；且L1、L2、L3和L4是氨基酸連接子；其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對；其中：(a)VL1、VL2和VL3各自獨立地是源自如SEQ ID NO：61、63、69、71、74、76、82、86、88、94的任一項所示氨基酸序列的可變域； (b)VL1、VL2和VL3各自獨立地包含可變域的輕鏈互補决定區，所述可變域是如SEQ ID NO：61、63、69、71、74、76、82、86、88、94的任一項所示的至少一個氨基酸序列；(c)VL1、VL2和VL3各自獨立地包含如SEQ ID NO：169、171和173的任一項所示的可變域序列；(d)VL1、VL2和VL3各自獨立地包含輕鏈互補决定區，其包含選自下組的氨基酸序列：SEQ ID NO：50、141-147、178和179；或(e)VL1、VL2和VL3各自獨立地包含如表2-5所示的輕鏈互補决定區和/或可變域序列；且其中：(a)VH1、VH2和VH3各自獨立地是源自如SEQ ID NO：60、62、68、73、75、81、85、87、93的任一項所示氨基酸序列的可變域；(b)VH1、VH2和VH3各自獨立地包含可變域的重鏈互補决定區，所述可變域是SEQ ID NO：60、62、68、73、75、81、85、87、93的任一項所示的至少一個氨基酸序列；(c)VH1、VH2和VH3各自獨立地包含如SEQ ID NO：168、170和172的任一項所示的可變域序列；(d)VH1、VH2和VH3各自獨立地包含重鏈互補决定區，其包含選自下組的氨基酸序列：SEQ ID NO：129-137；(e)VH1、VH2和VH3各自獨立地包含如表2-5所示的重鏈互補决定區和/或可變域序列。
在本文所述的任一結合蛋白的一些實施方案中，(a)VH1包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：135的 氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：129的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：130的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：131的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：141的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：178的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：142的氨基酸序列的CDR-L3；(b)VH1包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：129的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：130的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：131的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：141的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：178的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：142的氨基酸序列的CDR-L3；(c)VH1包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：129的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：130的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：131的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：141的氨基酸序列的CDR- L1、包含SEQ ID NO：178的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：142的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；(d)VH1包含：包含SEQ ID NO：129的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：130的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：131的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：141的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：178的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：142的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；(e)VH1包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：129的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：130的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：131的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：141的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：178的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：142的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR- H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3；(f)VH1包含：包含SEQ ID NO：129的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：130的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：131的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：141的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：178的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：142的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3；(g)VH1包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR- L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；(h)VH1包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3；(i)VH1包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；或(j)VH1包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的 CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3。在一些實施方案中，VH1、VL1、VH2、VL2、VH3和VL3的一項或多項包含表2-5所示抗體的一個、兩個或三個CDR序列。
在一些實施方案中，結合蛋白包含3個抗原結合位點，其中所述抗原結合位點的一個、兩個或三個特異性結合選自下組的細胞因子靶蛋白：IL-4、IL-13和TNFa。在一些實施方案中，(a)VH1和VL1形成特異性結合人TNFa的第一抗原結合位點VH2和VL2形成特異性結合人IL13的抗原結合位點，且VH3和VL3形成特異性結合人IL4的抗原結合位點；(b)VH1和VL1形成特異性結合人TNFa的第一抗原結合位點，VH2和VL2形成特異性結合人IL4的第二抗原結合位點，且VH3和VL3形成特異性結合人IL13的第三抗原結合位點；(c)VH1和VL1形成特異性結合人IL4的第一抗原結合位點，VH2和VL2形成特異性結合人TNFa的第二抗原結合位點，且VH3和VL3形成特異性結合人IL13的第三抗原結合位點；(d)VH1和VL1形成特異性結合人IL4的第一抗原結合位點，VH2和VL2形成特異性結合人IL13的抗原結合位點，且VH3和VL3形成特異性結合人TNFa的第三抗原結合位點；(e)VH1和VL1形成特異性結合人IL13的第一抗原結合位點，VH2和VL2形成特異性結合人IL4的第二抗原結合位點，且VH3和VL3形成特異性結合人TNFa的第三抗原結合 位點；或(f)VH1和VL1形成特異性結合人IL13的第一抗原結合位點，VH2和VL2形成特異性結合人TNFa的第二抗原結合位點，且VH3和VL3形成特異性結合人IL4的第三抗原結合位點。在一些實施方案中，特異性結合人TNFa的抗原結合位點包含重鏈可變域和輕鏈可變域，所述重鏈可變域包含SEQ ID NO：168的氨基酸序列，所述輕鏈可變域包含SEQ ID NO：169的氨基酸序列。在一些實施方案中，特異性結合人IL4的抗原結合位點包含重鏈可變域和輕鏈可變域，所述重鏈可變域包含SEQ ID NO：170的氨基酸序列，所述輕鏈可變域包含SEQ ID NO：171的氨基酸序列。在一些實施方案中，特異性結合人IL13的抗原結合位點包含重鏈可變域和輕鏈可變域，所述重鏈可變域包含SEQ ID NO：172的氨基酸序列，所述輕鏈可變域包含SEQ ID NO：173的氨基酸序列。
在本文所述的任一結合蛋白的一些實施方案中，所述第二和/或第三多肽鏈還包含連接至CH1的Fc區，所述Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋白重鏈恆定域。在一些實施方案中，L1、L2、L3、或L4的至少一個獨立地長度為0個氨基酸。在一些實施方案中，L1、L2、L3、或L4各自獨立地長度為至少1個氨基酸。在一些實施方案中，所述結合蛋白是三特異性的且能够特異性結合3個不同的抗原靶標。在一些實施方案中，所述結合蛋白是三特異性的且能够特異性結合3個不同的抗原靶標。在一些實施方案中，所述結合蛋白能够抑制一個或多個靶蛋白的功能。
在本文所述的任一結合蛋白的一些實施方案中，L1、L2、L3、或L4的至少一個獨立地長度為0個氨基酸。在一些實施方案中，L1、L2、L3、或L4各自獨立地長度為至少1個氨基酸。在一些實施方案中，L1、L2、L3和L4的一項、兩項、三項或全部四項的長度為0至15個氨基酸。在一些實施方案中，L1、L2、L3和L4的至少兩項的長度為1至15個氨基酸。在一些實施方案中，L1、L2、L3和L4各自獨立地包含選自由下列組成之群組的序列：GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：104)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：105)、S、RT、TKGPS(SEQ ID NO：106)、GQPKAAP(SEQ ID NO：175)和GGSGSSGSGG(SEQ ID NO：148)。在一 些實施方案中，L1包含序列GQPKAAP(SEQ ID NO：175)，L2包含序列TKGPS(SEQ ID NO：106)，L3包含序列S，且L4包含序列RT；L1包含序列GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：104)，L2包含序列GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：104)，L3長度為0個氨基酸，且L4長度為0個氨基酸；L1包含序列GGSGSSGSGG(SEQ ID NO：148)，L2包含序列GGSGSSGSGG(SEQ ID NO：148)，L3長度為0個氨基酸，且L4長度為0個氨基酸；或L1包含序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：105)，L2長度為0個氨基酸，L3包含序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：105)，且L4長度為0個氨基酸。
在本文所述的任一結合蛋白的一些實施方案中，所述第二多肽鏈還包含連接至CH1的第一Fc區，所述第一Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋白重鏈恆定域，其中所述第一Fc區包含與人IgG1或IgG4的位置354和366對應的位置處的氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為S354C和T366W；且其中所述第三多肽鏈還包含連接至CH1的第二Fc區，所述第二Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋白重鏈恆定域，其中所述第二Fc區包含與人IgG1或IgG4的位置349、366、368和407對應的位置處的氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為Y349C、T366S、L368A和Y407V。在一些實施方案中，所述第二多肽鏈還包含連接至CH1的第一Fc區，所述第一Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋白重鏈恆定域，其中所述第一Fc區包含與人IgG1或IgG4的位置349、366、368和407對應的位置處的氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為Y349C、T366S、L368A和Y407V；且其中所述第三多肽鏈還包含連接至CH1的第二Fc區，所述第二Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋白重鏈恆定域，其中所述第二Fc區包含與人IgG1或IgG4的位置354和366對應的位置處的氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為S354C和T366W。在一些實施方案中，所述第二多肽鏈還包含連接至CH1的第一Fc區，所述第一Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋白重鏈恆定域，且其中所述第三多肽鏈還包含連接至CH1的第二 Fc區，所述第二Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋白重鏈恆定域；其中所述第一和/或第二Fc區包含與人IgG1或IgG4的位置428和434對應的位置處的氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為M428L和N434S。在一些實施方案中，所述第二多肽鏈的CH3域包含與人IgG1或IgG4的位置354和366對應的位置處的氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為S354C和T366W；且其中所述第三多肽鏈的CH3域包含與人IgG1或IgG4的位置349、366、368和407對應的位置處的氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為Y349C、T366S、L368A和Y407V。在一些實施方案中，所述第二多肽鏈的CH3域包含與人IgG1或IgG4的位置349、366、368和407對應的位置處的氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為Y349C、T366S、L368A和Y407V且其中所述第三多肽鏈的CH3域包含與人IgG1或IgG4的位置354和366對應的位置處的氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為S354C和T366W。在一些實施方案中，所述第二和第三多肽鏈二者的CH3域包含與人IgG1或IgG4的位置428和434對應的位置處的氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為M428L和N434S。在一些實施方案中，所述第二多肽鏈還包含連接至CH1的第一Fc區，所述第一Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋白重鏈恆定域；其中所述第三多肽鏈還包含連接至CH1的第二Fc區，所述第二Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋白重鏈恆定域；且其中所述第一和第二Fc區僅有一個包含與人IgG1或IgG4的位置435和436對應的位置處的氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為H435R和Y436F。在一些實施方案中，所述第二和第三多肽鏈的CH3域是人IgG1 CH3域，且其中所述CH3域僅有一個包含與人IgG1或IgG4的位置435和436對應的位置處的氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為H435R和Y436F。在一些實施方案中，所述第二多肽鏈還包含連接至CH1的第一Fc區，所述第一Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋白重鏈恆定域；其中所述第三多肽鏈還包含連接至CH1的第二Fc區，所述第二Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋 白重鏈恆定域；其中所述第一和/或第二Fc區是人IgG4 Fc區；且其中所述第一和第二Fc區各自包含與人IgG4的位置228和409對應的位置處的氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為S228P和R409K。在一些實施方案中，所述第二和第三多肽鏈的CH3域是人IgG4 CH3域，且其中所述CH3域各自包含與人IgG4的位置228和409對應的位置處的氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為S228P和R409K。在一些實施方案中，所述第二多肽鏈還包含連接至CH1的第一Fc區，所述第一Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋白重鏈恆定域；其中所述第三多肽鏈還包含連接至CH1的第二Fc區，所述第二Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋白重鏈恆定域；其中所述第一和/或第二Fc區是人IgG4 Fc區；且其中所述第一和第二Fc區各自包含與人IgG4的位置234和235對應的位置處的氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為F234A和L235A。在一些實施方案中，所述第二和第三多肽鏈的CH3域是人IgG4 CH3域，且其中所述CH3域各自包含與人IgG4的位置234和235對應的位置處的氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為F234A和L235A。在一些實施方案中，所述第二多肽鏈還包含連接至CH1的第一Fc區，所述第一Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋白重鏈恆定域；其中所述第三多肽鏈還包含連接至CH1的第二Fc區，所述第二Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋白重鏈恆定域；其中所述第一和/或第二Fc區是人IgG1 Fc區；且其中所述第一和第二Fc區各自包含與人IgG1的位置234和235對應的位置處的氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為L234A和L235A。在一些實施方案中，所述第二和第三多肽鏈的CH3域是人IgG1 CH3域，且其中所述CH3域各自包含與人IgG1的位置234和235對應的位置處的氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為L234A和L235A。在一些實施方案中，所述第一和/或第二Fc區是人IgG1 Fc區。在一些實施方案中，所述第一和/或第二Fc區是人IgG4 Fc區。
在本文所述的任一結合蛋白的一些實施方案中，所述第一多肽鏈的CL域 是人κCL域，且第四多肽鏈的CL域是人λCL域；或所述第一多肽鏈的CL域是人λCL域，且第四多肽鏈的CL域是人κCL域。在一些實施方案中，第一多肽鏈包含λCL域；其中第二多肽鏈的CH3域包含與人IgG1或IgG4的位置354和366對應的位置處的氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為S354C和T366W；其中所述第三多肽鏈的CH3域包含與人IgG1或IgG4的位置349、366、368、407、435和436對應的位置處的氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為Y349C、T366S、L368A、Y407V、H435R和Y436F；且其中第四多肽鏈包含κCL域。在一些實施方案中，第一多肽鏈包含λCL域；其中第三多肽鏈的CH3域包含與人IgG1或IgG4的位置354和366對應的位置處的氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為S354C和T366W；其中第二多肽鏈的CH3域包含與人IgG1或IgG4的位置349、366、368、407、435和436對應的位置處的氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為Y349C、T366S、L368A、Y407V、H435R和Y436F，且其中第四多肽鏈包含κCL域。在一些實施方案中，第一多肽鏈包含λCL域；其中第二多肽鏈的CH3域包含與人IgG1或IgG4的位置354、366、435和436對應的位置處的氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為S354C、T366W、H435R和Y436F；其中第三多肽鏈的CH3域包含與人IgG1或IgG4的位置349、366、368和407對應的位置處的氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為Y349C、T366S、L368A和Y407V；且其中第四多肽鏈包含κCL域。在一些實施方案中，第一多肽鏈包含κCL域；其中第二多肽鏈的CH3域包含與人IgG1或IgG4的位置354和366對應的位置處的氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為S354C和T366W；其中第三多肽鏈的CH3域包含與人IgG1或IgG4的位置349、366、368、407、435和436對應的位置處的氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為Y349C、T366S、L368A、Y407V、H435R和Y436F；且其中第四多肽鏈包含λCL域。在一些實施方案中，第二和/或第三多肽鏈包含人IgG1或IgG4 Fc區。
在另一個實施方案中，本發明提供一種結合蛋白，其包含第一多肽鏈、第 二多肽鏈、第三多肽鏈和第四多肽鏈，其中：(a)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列或與SEQ ID NO：4的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列或與SEQ ID NO：3的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列或與SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或與SEQ ID NO：2的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；(b)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列或與SEQ ID NO：10的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列或與SEQ ID NO：9的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列或與SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或與SEQ ID NO：2的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；(c)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列或與SEQ ID NO：4的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列或與SEQ ID NO：3的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列或與SEQ ID NO：13的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列或與SEQ ID NO：14的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；(d)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列或與SEQ ID NO：10的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列或與SEQ ID NO：9的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列或與SEQ ID NO：13的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列或與SEQ ID NO：14的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；(e)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列或與SEQ ID NO：4的 氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列或與SEQ ID NO：3的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列或與SEQ ID NO：17的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列或與SEQ ID NO：18的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；(f)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列或與SEQ ID NO：10的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列或與SEQ ID NO：9的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列或與SEQ ID NO：17的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列或與SEQ ID NO：18的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；(g)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列或與SEQ ID NO：4的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列或與SEQ ID NO：3的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列或與SEQ ID NO：21的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列或與SEQ ID NO：22的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；(h)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列或與SEQ ID NO：10的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列或與SEQ ID NO：9的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列或與SEQ ID NO：21的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列或與SEQ ID NO：22的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；(i)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：63的氨基酸序列或與SEQ ID NO：63的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：62的氨基酸序列或與SEQ ID NO：62的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述 第三多肽鏈包含SEQ ID NO：60的氨基酸序列或與SEQ ID NO：60的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：61的氨基酸序列或與SEQ ID NO：61的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；(j)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列或與SEQ ID NO：69的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列或與SEQ ID NO：68的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：60的氨基酸序列或與SEQ ID NO：60的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：61的氨基酸序列或與SEQ ID NO：61的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；(k)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列或與SEQ ID NO：69的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列或與SEQ ID NO：68的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：60的氨基酸序列或與SEQ ID NO：60的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：71的氨基酸序列或與SEQ ID NO：71的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；(l)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：76的氨基酸序列或與SEQ ID NO：76的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：75的氨基酸序列或與SEQ ID NO：75的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列或與SEQ ID NO：73的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：74的氨基酸序列或與SEQ ID NO：74的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；(m)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：82的氨基酸序列或與SEQ ID NO：82的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：81的氨基酸序列或與SEQ ID NO：81的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列或與SEQ ID NO：73的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：74的氨基酸 序列或與SEQ ID NO：74的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；(n)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：88的氨基酸序列或與SEQ ID NO：88的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：87的氨基酸序列或與SEQ ID NO：87的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：85的氨基酸序列或與SEQ ID NO：85的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：86的氨基酸序列或與SEQ ID NO：86的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；(o)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：94的氨基酸序列或與SEQ ID NO：94的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：93的氨基酸序列或與SEQ ID NO：93的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：85的氨基酸序列或與SEQ ID NO：85的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：86的氨基酸序列或與SEQ ID NO：86的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；(p)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列或與SEQ ID NO：69的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列或與SEQ ID NO：68的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列或與SEQ ID NO：73的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：74的氨基酸序列或與SEQ ID NO：74的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；(q)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列或與SEQ ID NO：69的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列或與SEQ ID NO：68的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：85的氨基酸序列或與SEQ ID NO：85的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：86的氨基酸序列或與SEQ ID NO：86的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；(r)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：63的氨基酸序列或與SEQ ID NO：63的 氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：62的氨基酸序列或與SEQ ID NO：62的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列或與SEQ ID NO：73的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：74的氨基酸序列或與SEQ ID NO：74的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；(s)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：63的氨基酸序列或與SEQ ID NO：63的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：62的氨基酸序列或與SEQ ID NO：62的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：85的氨基酸序列或與SEQ ID NO：85的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：86的氨基酸序列或與SEQ ID NO：86的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；(t)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列或與SEQ ID NO：4的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列或與SEQ ID NO：3的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：114的氨基酸序列或與SEQ ID NO：114的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：115的氨基酸序列或與SEQ ID NO：115的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；或(u)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列或與SEQ ID NO：10的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列或與SEQ ID NO：9的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：114的氨基酸序列或與SEQ ID NO：114的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：115的氨基酸序列或與SEQ ID NO：115的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列。
在另一個實施方案中，本發明提供分離的核酸分子，其包含編碼根據任何上述實施方案的結合蛋白或其多肽的核苷酸序列。在另一個實施方案中，本發明提供包含根據上述實施方案之一的核酸分子的表達載體。在另一個實施方案 中，本發明提供分離的宿主細胞，其包含根據任何上述實施方案的核酸分子。在另一個實施方案中，本發明提供宿主細胞，其包含根據任何上述實施方案的表達載體。在一些實施方案中，所述分離的宿主細胞是哺乳動物細胞或昆蟲細胞。在另一個實施方案中，本發明提供一種載體系統，其包含編碼根據任何上述實施方案的結合蛋白的第一、第二、第三和第四多肽鏈的一個或多個載體。在一些實施方案中，載體系統包含編碼所述結合蛋白的第一多肽鏈的第一載體、編碼所述結合蛋白的第二多肽鏈的第二載體、編碼所述結合蛋白的第三多肽鏈的第三載體和編碼所述結合蛋白的第四多肽鏈的第四載體。在一些實施方案中，載體系統包含編碼所述結合蛋白的第一和第二多肽鏈的第一載體，及編碼所述結合蛋白的第三和第四多肽鏈的第二載體。在一些實施方案中，所述一個或多個載體是表達載體。在一個實施方案中，本發明提供分離的宿主細胞，其包含根據任何上述實施方案的載體系統。在一個實施方案中，本發明提供生產結合蛋白的方法，該方法包括：a)在使得該宿主細胞表達所述結合蛋白的條件下培養根據上述任何實施方案的宿主細胞；和b)從該宿主細胞分離所述結合蛋白。在一個實施方案中，本發明提供包含根據任何上述實施方案的結合蛋白及藥學上可接受的載劑的醫藥組合物。
在另一個實施方案中，本發明提供在患者中預防和/或治療癌症的方法，包括對該患者投予治療有效量的根據任何上述實施方案的至少一種結合蛋白或醫藥組合物。在另一個實施方案中，本發明提供根據任何上述實施方案的結合蛋白或醫藥組合物，其用於在患者中預防和/或治療癌症的用途。在另一個實施方案中，本發明提供根據任何上述實施方案的結合蛋白，其用於製造用於在患者中預防和/或治療癌症的藥物。在一些實施方案中，所述結合蛋白包含一個特異性結合T細胞表面蛋白的抗原結合位點和另一個特異性結合腫瘤靶蛋白的抗原結合位點。在一些實施方案中，所述結合蛋白包含特異性結合CD3的抗原結合位點、特異性結合CD28的抗原結合位點和特異性結合選自下組的腫瘤靶蛋白的抗原結合位點：CD19、CD20、CD38、Her2和LAMP1。在一些實施方案中， 所述至少一個結合蛋白與化療劑共同投予。在一些實施方案中，所述患者是人。在一些實施方案中，所述結合蛋白能够抑制一個或多個選自下組的靶蛋白的功能：A2AR、APRIL、ATPD酶、BAFF、BAFFR、BCMA、BlyS、BTK、BTLA、B7DC、B7H1、B7H4、B7H5、B7H6、B7H7、B7RP1、B7-4、C3、C5、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL15、CCL17、CCL19、CCL20、CCL21、CCL24、CCL25、CCL26、CCR3、CCR4、CD3、CD19、CD20、CD23、CD24、CD27、CD28、CD38、CD39、CD40、CD70、CD80、CD86、CD122、CD137、CD137L、CD152、CD154、CD160、CD272、CD273、CD274、CD275、CD276、CD278、CD279、CDH1、殼多糖酶、CLEC9、CLEC91、CRTH2、CSF-1、CSF-2、CSF-3、CX3CL1、CXCL12、CXCL13、CXCR3、DNGR-1、外核苷三磷酸鹽二磷酸水解酶1、EGFR、ENTPD1、FCER1A、FCER1、FLAP、Gi24、GITR、GITRL、GM-CSF、Her2、HHLA2、HMGB1、HVEM、ICOSLG、IDO、IFNα、IgE、IGF1R、IL2Rβ、IL1、IL1A、IL1B、IL1F10、IL2、IL4、IL4Ra、IL5、IL5R、IL6、IL7、IL7Ra、IL8、IL9、IL9R、IL10、rhIL10、IL12、IL13、IL13Ra1、IL13Ra2、IL15、IL17、IL17Rb、IL18、IL22、IL23、IL25、IL27、IL33、IL35、ITGB4、ITK、KIR、LAG3、LAMP1、瘦素、LPFS2、II類MHC、NCR3LG1、NKG2D、NTPD酶-1、OX40、OX40L、PD-1H、血小板受體、S152、SISP1、SLC、SPG64、ST2、Syk激酶、TACI、TDO、T14、TIGIT、TIM3、TLR、TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、TNFa、TNFRSF7、Tp55、TREM1、TSLP、TSLPR、TWEAK、VEGF、VISTA、Vstm3、WUCAM和XCR1。
在另一個實施方案中，本發明提供在患者中預防和/或治療炎性疾病或病症的方法，包括對該患者投予治療有效量的根據任何上述實施方案的至少一種結合蛋白或醫藥組合物。在另一個實施方案中，本發明提供根據任何上述實施方案的結合蛋白或醫藥組合物，其用於在患者中預防和/或治療炎性疾病或病症的 方法的用途。在另一個實施方案中，本發明提供根據任何上述實施方案的結合蛋白，其用於製造在患者中預防和/或治療炎性疾病或病症的藥物。在一些實施方案中，所述結合蛋白包含3個抗原結合位點，其各自特異性結合選自下組的細胞因子靶蛋白：IL-4、IL-13和TNFa。在一些實施方案中，所述3個結合位點中的2個特異性結合細胞因子靶蛋白選自下組的細胞因子靶蛋白：IL-4、IL-13和TNFa。在一些實施方案中，所述至少一種結合蛋白與抗炎劑共同投予。在一些實施方案中，所述患者是人。在一些實施方案中，所述結合蛋白能够抑制一個或多個選自下組的靶蛋白的功能：A2AR、APRIL、ATPD酶、BAFF、BAFFR、BCMA、BlyS、BTK、BTLA、B7DC、B7H1、B7H4、B7H5、B7H6、B7H7、B7RP1、B7-4、C3、C5、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL15、CCL17、CCL19、CCL20、CCL21、CCL24、CCL25、CCL26、CCR3、CCR4、CD3、CD19、CD20、CD23、CD24、CD27、CD28、CD38、CD39、CD40、CD70、CD80、CD86、CD122、CD137、CD137L、CD152、CD154、CD160、CD272、CD273、CD274、CD275、CD276、CD278、CD279、CDH1、殼多糖酶、CLEC9、CLEC91、CRTH2、CSF-1、CSF-2、CSF-3、CX3CL1、CXCL12、CXCL13、CXCR3、DNGR-1、外核苷三磷酸鹽二磷酸水解酶1、EGFR、ENTPD1、FCER1A、FCER1、FLAP、Gi24、GITR、GITRL、GM-CSF、Her2、HHLA2、HMGB1、HVEM、ICOSLG、IDO、IFNα、IgE、IGF1R、IL2Rβ、IL1、IL1A、IL1B、IL1F10、IL2、IL4、IL4Ra、IL5、IL5R、IL6、IL7、IL7Ra、IL8、IL9、IL9R、IL10、rhIL10、IL12、IL13、IL13Ra1、IL13Ra2、IL15、IL17、IL17Rb、IL18、IL22、IL23、IL25、IL27、IL33、IL35、ITGB4、ITK、KIR、LAG3、LAMP1、瘦素、LPFS2、II類MHC、NCR3LG1、NKG2D、NTPD酶-1、OX40、OX40L、PD-1H、血小板受體、S152、SISP1、SLC、SPG64、ST2、Syk激酶、TACI、TDO、T14、TIGIT、TIM3、TLR、TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、TNFa、TNFRSF7、Tp55、TREM1、TSLP、TSLPR、 TWEAK、VEGF、VISTA、Vstm3、WUCAM和XCR1。
在另一個實施方案中，本發明提供純化結合蛋白的方法，包括：(a)提供包含4條多肽鏈的結合蛋白，所述4條多肽鏈形成特異性結合一個或多個靶蛋白的3個抗原結合位點，其中第一多肽鏈包含如下式表示的結構：VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽鏈包含如下式表示的結構：VH1-L3-VH2-L4-CH1 [II]
且第三多肽鏈包含如下式表示的結構：VH3-CH1 [III]
且第四多肽鏈包含如下式表示的結構：VL3-CL [IV]
其中：VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變域；VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變域；VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變域；VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變域；VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變域；VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變域；CL是免疫球蛋白輕鏈恆定域；CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恆定域；且L1、L2、L3和L4是氨基酸連接子；且其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對；其中所述第二多肽鏈的CH3域和第三多肽鏈的CH3域包含與人IgG1或IgG4的位置435和436對應的位置處的氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代是H435R和Y436F； (b)使(a)中提供的結合蛋白與蛋白A接觸；(c)在適于從包含0或2個CH3域的結合蛋白分離出結合蛋白的條件下從蛋白A洗脫所述結合蛋白，所述CH3域包含為H435R和Y436F的氨基酸取代；(d)使(c)中洗脫的結合蛋白與κ輕鏈親和介質接觸，及(e)在適于從僅包含λCL域的結合蛋白分離出結合蛋白的條件下從所述κ輕鏈親和介質洗脫結合蛋白，由此純化所述結合蛋白。
在一些實施方案中，該方法還包括：(d)使(c)中洗脫的結合蛋白與κ輕鏈親和介質接觸；和(e)在適于從僅包含λCL域的結合蛋白分離出結合蛋白的條件下從所述κ輕鏈親和介質洗脫結合蛋白，由此純化所述結合蛋白。
在一些實施方案中，所述方法在(e)之後還包括：(f)使(e)中洗脫的結合蛋白與λ輕鏈親和介質接觸；和(g)在適于從僅包含κCL域的結合蛋白分離出結合蛋白的條件下從所述λ輕鏈親和介質洗脫洗脫結合蛋白。在一些實施方案中，第一多肽鏈包含λCL域；其中第二多肽鏈的CH3域包含與人IgG1的位置354和366對應的位置處的氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為S354C和T366W；其中所述第三多肽鏈的CH3域包含與人IgG1的位置349、366、368、407、435和436對應的位置處的氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為Y349C、T366S、L368A、Y407V、H435R和Y436F；且其中第四多肽鏈包含κCL域。在一些實施方案中，在(c)和(e)的一項或多項中使用疏水作用色譜(HIC)來檢測所述結合蛋白。
應當理解的是，本文描述的各種實施方案的一個、一部分、或全部特徵可以進行組合以形成本發明的其他實施方案。本發明的這些及其他態樣對于本領域技術人員而言是明顯的。本發明的這些和其他實施方案在下文進一步詳述。
圖1A-C顯示了三特異性結合蛋白的示意圖，所述結合蛋白包含形成3個抗原結合位點的4條多肽鏈，所述3個抗原結合位點特異性結合3個靶蛋白，其中 第一對多肽具有雙重可變域(其具有交叉取向(VH1-VH2和VL2-VL1))，形成2個抗原結合位點，且其中第二對多肽具有形成單一抗原結合位點的單一可變域(VH3和VL3)。圖1A顯示了包含“節-入-穴(knobs-into-holes)”突變的三特異性結合蛋白，其中所述節在具有單一可變域的第二對多肽上。圖1B顯示了包含“節-入-穴”突變的三特異性結合蛋白，其中所述節在具有交叉取向的第一對多肽上。圖1C顯示了表1-3中所示結合蛋白的多肽鏈上可變域的取向，以及節/穴取向。“重鏈A”(例如本發明的第三多肽鏈)指重鏈A的可變域。“輕鏈A”(例如本發明的第四多肽鏈)指輕鏈A的可變域。“重鏈B”(例如本發明的第二多肽鏈)指重鏈B的可變域1和可變域2。“輕鏈B”(例如本發明的第一多肽鏈)指輕鏈B的可變域1和可變域2。
圖2顯示了用於確定抗Her2 x CD28 x CD3 IgG4三特異性抗體(結合蛋白1)或同種型對照抗體與人CD3、CD28和Her2的結合的ELISA測定的結果。使用綴合有辣根過氧化物酶(HRP)的抗Fab二抗來檢測結合的抗體。
圖3A-3C顯示了Her2+乳腺癌細胞的抗體介導的特異性殺傷的結果，其使用抗Her2 x CD28 x CD3 IgG4三特異性抗體(本文稱為“結合蛋白1”)、抗CD28 x CD3 IgG4雙特異性抗體(huCD28 x CD3)、抗Her2 IgG1抗體、或對照抗體(人-IgG1)來進行，其使用E：T=10處的人PBMC。圖3A顯示了ZR-75-1細胞的三特異性抗體介導的特異性殺傷的結果。圖3B顯示了AU565細胞的三特異性抗體介導的特異性殺傷的結果。圖3C顯示了用於確定ZR-75-1和AU565細胞上的指定標志物的細胞表面表達的FACS分析的結果。
圖4和5顯示了Her2+乳腺癌細胞的抗體介導的特異性殺傷的結果，其使用抗Her2 x CD28 x CD3 IgG4三特異性抗體(結合蛋白1)、抗CD28 x CD3 IgG4雙特異性抗體(huCD28 x CD3)、抗Her2 IgG1抗體、或對照抗體(人-IgG1)來進行。圖4顯示了ZR-75-1細胞的抗體介導的特異性殺傷的結果，其使用來自供體KP45926的人外周血單核細胞(PBMC)以E：T=10進行。圖5顯示了AU565細胞的抗體介導的特異性殺傷的結果，其使用來自供體KP45944的人PBMC以E：T=10進行。圖4 和圖5證實了與圖3A-3C(其使用來自不同供體的PBMC)相似的細胞殺傷結果。
圖6A和6B顯示了用抗Her2 x CD28 x CD3 IgG4三特異性結合蛋白(HER2/CD28supxCD3mid；本文稱為“結合蛋白1”)、缺乏抗CD28結合域的抗Her2 x CD28 x CD3 IgG4三特異性結合蛋白(HER2/△CD28supxCD3mid)、缺乏抗CD3結合域的抗Her2 x CD28 x CD3 IgG4三特異性結合蛋白(HER2/CD28supx△CD3mid)、缺乏抗CD28結合域和抗CD3結合域二者的抗Her2 x CD28 x CD3 IgG4三特異性結合蛋白(HER2/△(CD28supx△CD3mid)、對照抗CD3單克隆抗體、或對照IgG4抗體處理的人T細胞的活化(CD69+)和增殖。圖6A顯示了來自三種供體的人CD4+ T細胞的活化(CD69+)。圖6B顯示了來自三種供體的人CD8+ T細胞的活化(CD69+)。CD28sup：抗CD28超激動劑抗體。CD3mid：抗CD3抗體。
圖7A-C顯示了經由抗CD3和抗CD28信號傳輸的IL-2、NFκB和活化T細胞的核因子(NFAT)通路激活，如通過螢光素酶測定法使用帶有IL-2啟動子-螢光素酶構建體(圖7A)，NFκB啟動子-螢光素酶構建體(圖7B)、或NFAT啟動子-螢光素酶構建體(圖7C)的人Jurkat T細胞所測量的。測試的抗體是上文關于圖6A-6D所述的那些。
圖8顯示了ELISA測定的結果，所述測定用於確定抗CD19 x CD28 x CD3 IgG4三特異性抗體(本文稱為“結合蛋白3”)，或同種型對照抗體，與CD3、CD28和CD19的結合。用綴合有辣根過氧化物酶(HRP)的抗Fab二抗來檢測結合的抗體。
圖9A-9N顯示了CD19+人GCB淋巴瘤細胞的抗體介導的特異性殺傷的結果，其使用抗CD19 x CD28 x CD3 IgG4三特異性抗體(本文稱為“結合蛋白3”)，或指定的對照，用人PBMC作為效應細胞以E：T=10來進行。圖9A顯示了OCI-LY19細胞的抗體介導的特異性殺傷的結果。圖9B顯示了FACS分析的結果，所述FACS分析用於確定指定標志物在OCI-LY1細胞上的細胞表面表達。圖9C顯示了OCI-LY19細胞的抗體介導的特異性殺傷的結果，其使用來自供體KP48572的PBMC以E：T=10來進行。圖9D顯示了OCI-LY19細胞的抗體介導的特異性殺傷 的結果，其使用來自供體KP48573的PBMC以E：T=10來進行。圖9E顯示了人淋巴瘤KARPASS-42細胞的抗體介導的特異性殺傷的結果，其使用來自供體KP48572的PBMC以E：T=10來進行。圖9F顯示了KARPASS-422細胞的抗體介導的特異性殺傷的結果，其使用來自供體KP48573的PBMC以E：T=10來進行。圖9G顯示了人慢性B細胞白血病MeC1細胞的抗體介導的特異性殺傷的結果，其使用來自供體KP48572的PBMC以E：T=10來進行。圖9H顯示了人多發性骨髓瘤RPMI8226細胞的抗體介導的特異性殺傷的結果，其使用來自供體KP48775的PBMC以E：T=10來進行。圖9I顯示了人伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)Raji細胞的抗體介導的特異性殺傷的結果，其使用來自供體KP48572的PBMC以E：T=10來進行。圖9J顯示了彌散性大B細胞淋巴瘤HBL1細胞的抗體介導的特異性殺傷的結果，其使用來自供體KP48775的PBMC以E：T=10來進行。圖9K顯示了大細胞淋巴瘤SUDHL8細胞的抗體介導的特異性殺傷的結果，其使用來自供體KP48572的PBMC以E：T=10來進行。圖9L顯示了SUDHL8細胞的抗體介導的特異性殺傷的結果，其使用來自供體KP48573的PBMC以E：T=10來進行。圖9M顯示了人B細胞淋巴瘤ARH77細胞的抗體介導的特異性殺傷的結果，其使用來自供體KP48775的PBMC以E：T=10來進行。圖9N顯示了OCI-Ly3細胞的抗體介導的特異性殺傷的結果，其使用來自供體KP48775的PBMC以E：T=10來進行。
圖10顯示了ELISA測定的結果，所述ELISA測定用於確定抗CD38 x CD28 x CD3 IgG4三特異性抗體(結合蛋白5)，或同種型對照抗體，對CD3、CD28和CD38的結合。用綴合有辣根過氧化物酶(HRP)的抗Fab二抗來檢測結合的抗體。
圖11A-11D顯示了CD38+人多發性骨髓瘤癌細胞的抗體介導的特異性殺傷的結果，其使用抗CD38 x CD28 x CD3 IgG4三特異性抗體(結合蛋白5)、抗CD28 x CD3 IgG4雙特異性抗體(huCD28 x CD3)、抗CD38 IgG1抗體、或對照抗體(人IgG1)來進行。圖11A顯示了MOLP-8細胞的抗體介導的特異性殺傷的結果，其使用人PBMC作為效應細胞以E：T=10進行。圖11B顯示了RPMI-8226細胞 的抗體介導的特異性殺傷的結果，其使用人PBMC作為效應細胞以E：T=10進行。圖11C顯示了KMS-12-BM細胞的抗體介導的特異性殺傷的結果，其使用人PBMC作為效應細胞以E：T=10進行。圖11D顯示了FACS分析的結果，所述FACS分析用於確定指定標志物在MOLP-8、RPMI-8226和KMS-12-BM細胞上的細胞表面表達。
圖12A-12D顯示了CD38+人多發性骨髓瘤癌細胞的抗體介導的特異性殺傷的結果，其使用抗CD38 x CD28 x CD3 IgG4三特異性抗體(結合蛋白5)、抗CD28 x CD3 IgG4雙特異性抗體(huCD28 x CD3)、抗CD38 IgG1抗體、或對照抗體(人IgG1)，用PBMC作為效應細胞以E：T=10來進行。圖12A顯示了NCI-H929細胞的抗體介導的特異性殺傷的結果。圖12B顯示了MM.1S細胞的抗體介導的特異性殺傷的結果。圖12C顯示了MM.1R細胞的抗體介導的特異性殺傷的結果。圖12D顯示了FACS分析的結果，所述FACS分析用於確定指定標志物在NCI-H929、MM.1S和MM.1R細胞上的細胞表面表達。
圖13A-13D顯示了CD38+人多發性骨髓瘤癌細胞的抗體介導的特異性殺傷的結果，其使用抗CD38 x CD28 x CD3 IgG4三特異性抗體(結合蛋白5)、抗CD28 x CD3 IgG4雙特異性抗體(huCD28 x CD3)、抗CD38 IgG1抗體、或對照抗體(人IgG1)，用PBMC作為效應細胞以E：T=10來進行。圖13A顯示了OPM-2細胞的抗體介導的特異性殺傷的結果。圖13B顯示了KMS-26細胞的抗體介導的特異性殺傷的結果。圖13C顯示了U266細胞的抗體介導的特異性殺傷的結果。圖13D顯示了FACS分析的結果，所述FACS分析用於確定指定標志物在OPM-2、KMS-26和U226細胞上的細胞表面表達。
圖14A-14C顯示了CD38+人多發性骨髓瘤癌細胞的抗體介導的特異性殺傷的結果，其使用抗CD38 x CD28 x CD3 IgG4三特異性抗體(結合蛋白5)、抗CD28 x CD3 IgG4雙特異性抗體(huCD28 x CD3)、抗CD38 IgG1抗體、或對照抗體(人IgG1)，用PBMC作為效應細胞以E：T=10來進行。圖14A顯示了SUDHL-8細胞的抗體介導的特異性殺傷的結果。圖14B顯示了OCI-LY19細胞的抗體介導 的特異性殺傷的結果。圖14C顯示了FACS分析的結果，所述FACS分析用於確定指定標志物在SUDHL-8和OCI-LY19細胞上的細胞表面表達。
圖15A-15D顯示了CD38+ ALL癌細胞的抗體介導的特異性殺傷的結果，其使用抗CD38 x CD28 x CD3 IgG4三特異性抗體(結合蛋白5)、抗CD28 x CD3 IgG4雙特異性抗體(huCD28 x CD3)、抗CD38 IgG1抗體、或對照抗體(人IgG1)，用PBMC作為效應細胞以E：T=10來進行。圖15A顯示了KOPN-8細胞的特異性殺傷的結果。圖15B顯示了HAL-1細胞的特異性殺傷的結果。圖15C顯示了CCRF-SB細胞的特異性殺傷的結果。圖15D顯示了FACS分析的結果，所述FACS分析用於確定指定標志物在KOPN-8、HAL-1和CCRF-SB細胞上的細胞表面表達。
圖16顯示了CD38+骨髓瘤癌細胞的抗體介導的特異性殺傷的結果，其使用抗CD38 x CD28 x CD3 IgG4三特異性抗體(稱為“結合蛋白5”和“結合蛋白6”，取决于所用的具體抗CD28結合域)、抗CD28 x CD3 IgG4雙特異性抗體(huCD28 x CD3)、抗CD38 IgG1抗體、對照抗CD38 IgG1抗體、或對照抗體(人IgG1)，用來自供體PK45926的PBMC以E：T=10來進行。
圖17A和17B顯示了經由抗CD3和抗CD28信號傳輸的IL-2、NFκB和活化T細胞的核因子(NFAT)通路激活，如通過螢光素酶測定法使用帶有IL-2啟動子-螢光素酶構建體(圖17A)或NFAT啟動子-螢光素酶構建體(圖17B)的人Jurkat T細胞所測量的。測試的抗體是抗CD38 x CD28 x CD3 IgG4三特異性IgG4抗體(結合蛋白5，標記為“Tri-Ab”)、缺乏CD28結合域的抗CD38 x CD28 x CD3 IgG4三特異性IgG4抗體(標記為“Tri-Ab(△CD28)”)、缺乏CD3結合域的抗CD38 x CD28 x CD3 IgG4三特異性IgG4抗體(標記為“Tri-Ab(△CD3)”)和缺乏CD3和CD28結合域的抗CD38 x CD28 x CD3 IgG4三特異性IgG4抗體(標記為“Tri-Ab(△CD28x△CD3)”)。對每個指定的Tri-Ab一式兩份進行螢光素酶測定。
圖18A-18E顯示了在非人靈長類中使用抗Her2 x CD28 x CD3 IgG4三特異性抗體(本文稱為“結合蛋白1”)的劑量遞增毒性研究(劑量從0.1、0.5、2.5、5、10、遞增至100μg/kg；動物標記為“409”和“410”)。圖18A顯示了投予抗Her2 x CD28 x CD3三特異性抗體之後6小時，各動物中的循環CD4+ T細胞百分比的結果。圖18B顯示了投予抗Her2 x CD28 x CD3三特異性抗體之後6小時，各動物中的循環CD8+ T細胞百分比的結果。圖18C顯示了投予後6小時循環CD4+ T細胞的(CD69+)的結果。圖18D顯示了投予後6小時循環CD8+ T細胞的(CD69+)的結果。圖18E顯示了以各個劑量投予抗Her2 x CD28 x CD3三特異性抗體之後6小時觀察到的炎性細胞因子釋放。
圖19A-B顯示了移植了BT474細胞的CD34+臍帶血細胞人源化NSG小鼠模型中，抗Her2 x CD28 x CD3 IgG4三特異性抗體(本文稱為“結合蛋白1”)的體內抗腫瘤活性。圖19A顯示了用指定濃度的抗Her2 x CD28 x CD3三特異性結合蛋白或PBS對照處理的小鼠的體重的變化。圖19B顯示了用指定濃度的抗Her2 x CD28 x CD3三特異性結合蛋白或PBS對照處理的小鼠中腫瘤體積變化。
圖20A-20H顯示了移植了BT474細胞的人PMBC人源化的NSG小鼠模型中抗Her2 x CD28 x CD3 IgG4三特異性抗體(本文稱為“結合蛋白1”)的體內抗腫瘤活性。圖20A顯示了投予指定濃度的抗Her2 x CD28 x CD3三特異性結合蛋白、指定濃度的赫賽汀(Herceptin)、或介質對照對小鼠體重的效果。圖20B顯示了抗Her2 x CD28 x CD3三特異性結合蛋白、赫賽汀或指定對照的劑量依賴性抗腫瘤活性，如個體小鼠中的。圖20C顯示了投予指定濃度的抗Her2 x CD28 x CD3三特異性結合蛋白或PBS之後小鼠中的平均腫瘤體積。圖20D顯示了投予指定濃度的赫賽汀或PBS對照後小鼠中的平均腫瘤體積。圖20E顯示了投予指定濃度的抗Her2 x CD28 x CD3三特異性結合蛋白、指定濃度的赫賽汀或PBS對照後第34天小鼠中的平均腫瘤體積。圖20F顯示了投予指定濃度的抗Her2 x CD28 x CD3三特異性結合蛋白、指定濃度的赫賽汀或PBS對照後第34天小鼠中的平均腫瘤重量。圖20G顯示了研究結束時小鼠血液中的人CD45+、CD3+、CD4+、CD8+細胞。圖20H顯示了研究結束時小鼠脾臟中的人CD45+、CD3+、CD4+、CD8+細胞。
圖21A-F顯示了非人靈長類中使用抗CD38 x CD28 x CD3 IgG4三特異性抗 體(結合蛋白5)的劑量遞增毒性研究的結果(劑量從0.1、0.5、2.5、5、10、遞增至100μg/kg)。圖21A顯示了投予抗CD38 x CD28 x CD3三特異性抗體後的T細胞活化(CD69+)(綫狀圖)和循環CD4+ T細胞的增殖(柱狀圖)。圖21B顯示了投予抗CD38 x CD28 x CD3三特異性抗體後的T細胞活化(CD69+)(綫狀圖)和循環CD8+ T細胞的增殖(柱狀圖)。圖21C顯示了接受抗CD38 x CD28 x CD3三特異性抗體的動物在通過個體動物每次投予後6小時的IL6釋放。圖21D顯示了接受抗CD38 x CD28 x CD3三特異性抗體的動物在通過個體動物每次投予後6小時的IL10釋放。圖21D顯示了接受抗CD38 x CD28 x CD3三特異性抗體的動物中的TNFα釋放。圖21F顯示了接受抗CD38 x CD28 x CD3三特異性抗體的動物在通過個體動物每次投予後6小時的IFNγ釋放。
圖22A-22C顯示了CD34+臍帶血細胞人源化的NSG小鼠模型中抗CD38 x CD28 x CD3 IgG4三特異性抗體(結合蛋白5)的體內抗腫瘤活性，所述模型移植了用CD38和PD-L1轉導的RPMI-8226多發性骨髓瘤細胞。作為先導性研究，該實驗確定了結合蛋白5的工作劑量範圍。圖22A顯示了指定濃度的抗CD38 x CD28 x CD3三特異性結合蛋白或對照的組中的體內腫瘤生長曲綫。圖22B顯示投予了抗CD38 x CD28 x CD3三特異性結合蛋白或指定對照的小鼠中的腫瘤浸潤性人CD8+ T細胞。圖22C顯示投予了抗CD38 x CD28 x CD3三特異性結合蛋白或指定對照的小鼠中的腫瘤浸潤性人CD4+ T細胞。
圖23A-23D顯示了CD34+臍帶血細胞人源化NSG小鼠模型中的抗CD38 x CD28 x CD3 IgG4三特異性抗體(結合蛋白5)的體內活性，所述模型移植了用CD38和PD-L1轉導的RPMI-8226細胞。圖23A顯示了用指定濃度的抗CD38 x CD28 x CD3三特異性結合蛋白或PBS對照處理的小鼠的體重變化。圖23B顯示了用指定濃度的抗CD38 x CD28 x CD3三特異性結合蛋白或PBS對照處理的小鼠中的腫瘤體積變化。圖23C顯示了在第19天各組中的腫瘤體積。所有處理組中的腫瘤體積都顯示出顯著降低，這與PBS對照組在統計學上是不同的。圖23D顯示了在第一次投予指定濃度的抗CD38 x CD28 x CD3三特異性結合蛋白或 PBS對照後4小時小鼠中炎性細胞因子IFN-g、TNF和IL-2的濃度。
圖24和25顯示了CD34+臍帶血細胞人源化的NSG小鼠模型中的T細胞體內活化，其通過確定CD69+ T細胞的百分比增加來進行，所述活化是通過投予抗CD38 x CD28 x CD3 IgG4三特異性抗體(結合蛋白5；三角形)、抗CD28 x CD3 IgG4雙特異性抗體(正方形)、或抗CD28 IgG4抗體(圓形)來進行的。圖24顯示了CD4+ T細胞的體內活化。圖25顯示了CD8+ T細胞的體內活化。
圖26A-26C顯示了CD34+臍帶血細胞人源化的NSG小鼠模型中的T細胞體內活化，其通過確定炎性細胞因子的血清水平來進行，所述活化是通過投予抗CD38 x CD28 x CD3 IgG4三特異性抗體(結合蛋白5；三角形)、抗CD28 x CD3 IgG4雙特異性抗體(正方形)、或抗CD28 IgG4抗體(圓形)來進行的。圖26A顯示了IL-2的血清水平。圖26B顯示了TNF的血清水平。圖26C顯示了IFN-γ的血清水平。
圖27A和27B顯示了通過大小排阻色譜對指定蛋白的純化。圖27A顯示了通過大小排阻色譜對結合蛋白9-15的純化。圖27B顯示了通過大小排阻色譜對結合蛋白16-19的純化。
圖28A描繪了用於優化純化策略的實驗中使用的三特異性結合蛋白和可選的結合蛋白特徵的構型(例如κ/λ輕鏈、節/穴突變和H435R/Y436F突變)。圖28B顯示了測試的構型。
圖29顯示了來自分析型疏水相互作用色譜(HIC)的代表性的色譜圖，證明瞭三特異性結合蛋白與錯配的種類是可區分的。
圖30A和30B顯示了結合蛋白的成功純化，其針對CODV組采用λ輕鏈、針對Fab組采用κ輕鏈、在CODV組有節突變，在Fab組有穴突變、及在Fab組有RF突變，其通過蛋白A純化，然後是KappaSelect(GE Healthcare)純化步驟。通過疏水作用色譜(HIC；圖30A)和SDS-PAGE(圖30B)，證明瞭從錯配的種類成功純化結合蛋白。
本發明提供三特異性和/或三價結合蛋白，其包含形成3個抗原結合位點的4條多肽鏈，所述3個抗原結合位點特異性結合至一個或多個靶蛋白，其中形成所述結合蛋白的第一對多肽具有雙重可變域，其具有交叉取向，且其中形成所述結合蛋白的第二對多肽具有單一可變域。
一般定義
如本發明所使用的，下列術語除非另有說明，否則應理解為具有下列含義。除非文中另有要求，否則單數術語應包括複數，複數術語應包括單數。
本文所用術語“多核苷酸”是指長度為至少10個核苷酸的單鏈或雙鏈核酸聚合物。在一些實施方案中，包含多核苷酸的核苷酸可以是核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或任一核苷酸類型的修飾形式。所述修飾包括碱基修飾例如溴尿苷、核糖修飾例如阿拉伯糖苷和2',3'-雙脫氧核糖及核苷酸間鍵修飾例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯、苯胺基硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯胺基磷酸酯(phoshoraniladate)和氨基磷酸酯(phosphoroamidate)。術語“多核苷酸”明確包括DNA的單鏈和雙鏈形式。
“分離的多核苷酸”是基因組、cDNA或合成來源的或其一些組合的多核苷酸，其：(1)不與分離的多核苷酸天然存在于其中的多核苷酸的全部或部分締合，(2)與其天然不與其連接的多核苷酸連接，或(3)不作為較大序列的部分天然存在。
“分離的多肽”是這樣的多肽：(1)不含正常與其一起存在的至少一些其它多肽，(2)基本不含來自相同來源(例如來自相同物種)的其它多肽，(3)由來自不同物種的細胞表達，(4)已從其與之天然締合的多核苷酸、脂質、碳水化合物或其它物質的至少約50%分離，(5)不與“分離的多肽”天然與之締合的多肽的部分締合(通過共價或非共價相互作用)，(6)與其與之天然不締合的多肽可操作地締合(通過共價或非共價相互作用)，或(7)天然不存在。所述分離的多肽可由合成來源的基因組DNA、cDNA、mRNA或其它RNA或其任何組合編碼。優選地， 分離的多肽基本不含在其自然環境中存在的可能幹擾其用途(治療、診斷、預防、研究或其它)的多肽或其它污染物。
天然存在的抗體通常包含四聚體。每個此種四聚體通常由兩個相同的多肽鏈對組成，每對具有一條全長“輕”鏈(通常分子量為約25kDa)和一條全長“重”鏈(通常分子量為約50-70kDa)。本文所用術語“重鏈”和“輕鏈”是指任何具有足以賦予針對靶抗原的特異性的可變域序列的免疫球蛋白多肽。各輕鏈和重鏈的氨基端部分通常包括約100-110個或更多個氨基酸的可變結構域，其通常負責抗原識別。各鏈的羧基端部分通常限定負責效應子功能的恆定域。因此，在天然存在的抗體中，全長重鏈免疫球蛋白多肽包含可變域(VH)和3個恆定域(CH1、CH2和CH3)，其中VH域位于多肽的氨基端，CH3域位于羧基端，而全長輕鏈免疫球蛋白多肽包含可變域(VL)和恆定域(CL)，其中VL域位于多肽的氨基端，CL域位于羧基端。
人輕鏈通常分類為κ和λ輕鏈，人重鏈通常分類為μ、δ、γ、α或ε，分別限定抗體的同種型為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有若干亞類，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM具有亞類，包括但不限于IgM1和IgM2。IgA同樣被細分為亞類，包括但不限于IgA1和IgA2。在全長輕鏈和重鏈內，可變域和恆定域通常通過約12個或更多個氨基酸的“J”區連接，其中重鏈還包含多出約10個氨基酸的“D”區。參見例如FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY(Paul,W編，Raven Press，第二版，1989)，其通過提述以其整體幷入用於所有目的。各輕鏈/重鏈對的可變區通常形成抗原結合位點。天然存在的抗體的可變域通常顯示出由3個高變區(亦稱互補决定區或CDR)連接的相對保守的框架區(FR)的同樣的通用結構。來自每對的兩條鏈的CDR通常通過框架區對齊，這可以使得能够結合特定的表位。從氨基端到羧基端，輕鏈和重鏈可變域二者通常包含域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。
術語“CDR組”意指在能够結合抗原的單個可變區中存在的一組3個CDR。這些CDR的確切邊界已根據不同系統進行了不同定義。由Kabat描述 的系統(Kabat等，SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST(National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1987)和(1991))不僅提供了可應用於抗體的任何可變區的明確殘基編號系統，而且還提供了限定3個CDR的精確殘基邊界。這些CDR可以被稱為Kabat CDR。Chothia和同事(Chothia和Lesk,1987,J.Mol.Biol.196：901-17；Chothia等，1989,Nature 342：877-83)發現在Kabat CDR內的某些亞部分采用幾乎相同的肽主鏈構象，儘管在氨基酸序列水平上具有很大的多樣性。這些亞部分指定為L1、L2和L3或H1、H2和H3，其中“L”和“H”分別指定輕鏈和重鏈區。這些區域可以稱為Chothia CDR，其具有與Kabat CDR重叠的邊界。限定與Kabat CDR重叠的CDR的其他邊界已由Padlan,1995,FASEBJ.9：133-39；MacCallum,1996,J.Mol.Biol.262(5)：732-45；和Lefranc,2003,Dev.Comp.Immunol.27：55-77描述。另外其他的CDR邊界定義可能不嚴格遵循上述系統之一，但仍會與Kabat CDR重叠，儘管它們可以按照下述預測或實驗發現來加以縮短或延長：特定殘基或殘基組或甚至整個CDR不顯著影響抗原結合。本文使用的方法可以利用根據這些系統中任一種定義的CDRs，儘管具體實施方案使用Kabat或Chothia定義的CDR。使用所述氨基酸序列鑒定預測的CDR是本領域所熟知的，如Martin,A.C."Protein sequence and structure analysis of antibody variable domains,"In Antibody Engineering,Vol.2.Kontermann R.,Dübel S編.Springer-Verlag,Berlin,p.33-51(2010)中所述。還可以通過其他常規方法來檢查重鏈和/或輕鏈可變域的氨基酸序列以鑒定CDR的序列，所述其他常規方法例如通過與已知的其他重鏈和輕鏈可變區的氨基酸序列進行比較以確定序列高變性的區域。編號的序列可以通過肉眼進行比對，或者通過采用比對程序如CLUSTAL程序套件中之一來比對，如Thompson,1994,Nucleic Acids Res.22：4673-80中所述。慣常使用分子模型來正確地描繪框架區和CDR區，幷因而對基于序列的指定加以校正。
本文所用術語“Fc”是指這樣的分子，其包含因抗體消化得到的或通過其它方法產生的非抗原結合片段的序列，不論呈單體還是多聚體形式，幷可含有鉸 鏈區。天然Fc的原始免疫球蛋白來源優選為人源的，幷可以是任何的免疫球蛋白，儘管優選的是IgG1和IgG2。Fc分子由單體多肽組成，所述單體多肽可通過共價(即二硫鍵)和非共價締合連接成為二聚或多聚體形式。天然Fc分子單體亞單元之間的分子間二硫鍵的數量範圍為1-4，這取决于類別(例如IgG、IgA和IgE)或亞類(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgA1和IgGA2)。Fc的一個實例是自木瓜蛋白酶消化IgG所得的二硫鍵鍵合的二聚體。本文所用術語“天然Fc”是單體、二聚和多聚體形式的通稱。
F(ab)片段通常包含一條輕鏈及一條重鏈的VH和CH1域，其中F(ab)片段的VH-CH1重鏈部分無法與另一重鏈多肽形成二硫鍵。本文所用的F(ab)片段還可包含一條輕鏈(其含有被氨基酸連接子分隔開的2個可變域)和一條重鏈(其含有被氨基酸連接子分隔開的2個可變域和CH1域)。
F(ab')片段通常包含一條輕鏈和含有多個恒定區(在CH1與CH2域之間)的一條重鏈的一部分，從而可在兩條重鏈間形成鏈間二硫鍵以形成F(ab')2分子。
本文使用的術語“結合蛋白”意指這樣的非天然存在的(或是重組的或工程化的)分子，其特異性結合至少一個靶抗原，幷且其包含形成3個抗原結合位點的4條多肽鏈，其中第一多肽鏈具有下式表示的結構：VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽鏈具有下式表示的結構：VH1-L3-VH2-L4-CH1 [II]
且第三多肽鏈具有下式表示的結構：VH3-CH1 [III]
且第四多肽鏈具有下式表示的結構：VL3-CL [IV]
其中：VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變域；VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變域； VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變域；VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變域；VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變域；VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變域；CL是免疫球蛋白輕鏈恆定域；CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恆定域；且L1、L2、L3和L4是氨基酸連接子；且其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對。
“重組的”分子是通過重組方法製備、表達、產生或分離的分子。
本發明的一個實施方案提供了具有生物學和免疫學特異性的結合蛋白，所述特異性是針對1至3個靶抗原。本發明的另一個實施方案提供了包含核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列編碼形成此類結合蛋白的多肽鏈。本發明的另一個實施方案提供了包含核酸分子的表達載體，所述核酸分子包含編碼形成此類結合蛋白的多肽鏈的核苷酸序列。本發明的又一個實施方案提供了表達此類結合蛋白(即包含編碼形成此類結合蛋白的多肽鏈的核酸分子或載體)的宿主細胞。
本文所用術語“可交換性”是指結合蛋白形式內的且保持折叠和最終結合親和力的可變域的可互換性。“完全可交換性”是指在式I的多肽鏈或式II的多肽鏈中交換VH1和VH2域兩者的順序幷因此交換VL1和VL2域的順序(即將順序顛倒)，同時保持所述結合蛋白的完整功能性的能力，這通過結合親和力的保留來證實。而且，應注意的是，標識VH和VL僅是指最終形式中特定蛋白質鏈上的域位置。例如，VH1和VH2可來源于親本抗體中的VL1和VL2域，幷被置于結合蛋白中的VH1和VH2位置中。同樣地，VL1和VL2可來源于親本抗體中的VH1和VH2域，幷被置于結合蛋白中的VH1和VH2位置中。因此，VH和VL標識是指現在的位置，而非親本抗體中的原始位置。VH和VL域因而是“可交換的”。
本文所用的術語“抗原”或“靶抗原”或“抗原靶標”是指這樣的分子或分子的 部分，其能够被結合蛋白結合，且額外能够用於動物以產生能與該抗原的表位結合的抗體。靶抗原可具有一個或多個表位。關于被結合蛋白識別的各個靶抗原，結合蛋白能够與識別靶抗原的完整抗體競爭。
術語“Her2”意指人表皮生長因子受體2，其是表皮生長因子受體家族的成員。
“CD3”是分化因子簇3多肽且是T細胞表面蛋白，其通常是T細胞受體(TCR)複合體的一部分。
“CD28”是分化簇28多肽幷且是T細胞表面蛋白，其提供協同刺激信號用於T細胞激活和存活。
“CD19”是分化簇19多肽幷且定位在B細胞上。
“CD20”是分化簇20多肽幷且是活化的糖基化磷蛋白，其在B細胞表面表達。
“CD38”是分化簇38多肽幷且是見于許多免疫細胞表面的糖蛋白。
“LAMP1”是溶酶體相關膜蛋白1。
“IL-4”是白介素4幷且是誘導天然輔助T細胞分化的細胞因子。
“IL-13”是白介素13幷且是一種由許多細胞類型(如T細胞)分泌的細胞因子。
“TNFa”是腫瘤壞死因子α幷且是涉及全身性炎症的細胞因子。
術語“T細胞銜接體”是指針對宿主免疫系統(更具體而言是T細胞的胞毒活性)以及針對腫瘤靶蛋白的結合蛋白。
術語“單特異性結合蛋白”是指特異性結合至一個抗原靶標的結合蛋白。
術語“單價結合蛋白”是指具有一個抗原結合位點的結合蛋白。
術語“雙特異性結合蛋白”是指特異性結合至兩個不同抗原靶標的結合蛋白。
術語“二價結合蛋白”是指具有兩個結合位點的結合蛋白。
術語“三特異性結合蛋白”是指特異性結合至三個不同抗原靶標的結合蛋 白。
術語“三價結合蛋白”是指具有三個結合位點的結合蛋白。在特定的實施方案中，三價結合蛋白能結合至1個抗原靶標。在其他實施方案中，三價結合蛋白能結合至2個抗原靶標。在其他實施方案中，三價結合蛋白能結合至3個抗原靶標。
“分離的”結合蛋白指已從其天然環境的污染組分中鑒定和分離和/或回收的多肽。其天然環境的污染組分是幹擾多肽的診斷或治療用途的材料，其可包括酶、激素和其他蛋白質性質或非蛋白質性質的溶質。在一些實施方案中，將所述多肽純化達到：(1)通過Lowry法測得的以抗體重量計大于95%，最優選的是以重量計大于99%，(2)通過使用轉杯式(spinning cup)測序儀測得的足以獲得至少15個N-末端或內部氨基酸序列殘基的程度，或者(3)通過使用考馬斯藍或優選的銀染色法在還原或非還原條件下的SDS-PAGE測得的同質性。分離的結合蛋白包括在重組細胞內原位的結合蛋白，因為結合蛋白天然環境中的至少一種污染組分是不存在的。
本文所用術語“基本純的”或“基本純化的”是指是存在的主要種類的任何化合物或種類(即以摩爾濃度基礎計，比組合物中的任何其它各個種類豐富)。在一些實施方案中，基本純化的部分是其中所述種類包含存在的所有大分子種類的至少約50%(以摩爾濃度基礎計)的組合物。在其它實施方案中，基本純的組合物包含存在于組合物中的所有大分子種類的大于約80%、85%、90%、95%或99%。在另外其它的實施方案中，該種類被純化至基本同質性(通過常規檢測方法無法在組合物中檢出污染種類)，其中組合物基本由單一大分子種類組成。
本文所用的“中和”結合蛋白意指能阻遏或顯著降低其結合的靶抗原的效應子功能的分子。本文所用的“顯著降低”意指靶抗原的效應子功能至少約60%、優選為至少約70%、更優選為至少約75%、更優選為至少約80%、更優選為至少約85%、最優選為至少約90%的降低。
術語“表位”包括任何决定簇，優選為能够與免疫球蛋白或T細胞受體特異 性結合的多肽决定簇。在一些實施方案中，表位决定簇包括例如氨基酸、糖側鏈、磷醯基或磺醯基等分子的化學活性表面群聚，幷且在一些實施方案中，可具有特定的三維結構特徵和/或特定的電荷特徵。表位是被抗體或結合蛋白結合的抗原的區域。在一些實施方案中，當結合蛋白優先識別其在蛋白質和/或大分子的複雜混合物中的靶抗原時，稱為與抗原特異性結合。在一些的實施方案中，當平衡解離常數
Figure 106112360-A0305-02-0058-26
10-8M、更優選當平衡解離常數
Figure 106112360-A0305-02-0058-27
10-9M、最優選當解離常數
Figure 106112360-A0305-02-0058-28
10-10M時，結合蛋白被稱為與抗原特異性結合。
可通過例如表面等離振子共振來測定結合蛋白的解離常數(KD)。一般而言，通過采用BIAcore系統(Pharmacia Biosensor；Piscataway，NJ)的表面等離振子共振(SPR)，表面等離振子共振分析測量配體(生物傳感器基質上的靶抗原)和分析物(溶液中的結合蛋白)之間的實時結合相互作用。表面等離振子分析也可通過固定分析物(將結合蛋白固定在生物傳感器基質上)和呈現配體(靶抗原)來進行。本文所用術語“KD”是指具體結合蛋白和靶抗原間的相互作用的解離常數。
本文所用術語“特異性結合”是指結合蛋白或其抗原結合片段以至少約1 x 10-6M、1 x 10-7M、1 x 10-8M、1 x 10-9M、1 x 10-10M、1 x 10-11M、1 x 10-12M或更大的Kd與含有表位的抗原結合和/或以其對非特異性抗原的親和力至少2倍大的親和力與表位結合的能力。
本文所用術語“連接子”是指插入免疫球蛋白域中為輕鏈和重鏈的域提供足够的可動性以折叠成交叉雙重可變區免疫球蛋白的一個或多個氨基酸殘基。在序列水平上，連接子分別在可變域之間或可變和恆定域之間的轉換處插入。可鑒定域之間的轉換，因為已完全瞭解免疫球蛋白域的近似大小。域轉換的確切位置可通過定位不形成二級結構元件如β-片層或α-螺旋的肽段來確定，其通過實驗數據證實或可通過建模技術或二級結構預測來假設。本文所述連接子稱為L1，其位于VL2的C端和VL1域的N端之間的輕鏈上；以及L2，其位于VL1的C端和CL域的N端之間的輕鏈上。重鏈連接子稱為L3，其位于VH1的C和 VH2域的N端之間；和L4，其位于VH2的C端和CH1域的N端之間。
本文所用術語“載體”是指用於將編碼信息轉移至宿主細胞中的任何分子(例如核酸、質粒或病毒)。術語“載體”包括能够將其已連接的另一個核酸轉運的核酸分子。載體的一個類型是“質粒”，其是指可向其中插入另外的DNA區段的環狀雙鏈DNA分子。載體的另一個類型是病毒載體，其中另外的DNA區段可插入病毒基因組中。某些載體能够在其所導入的宿主細胞中自主複製(例如具有細菌複製起點的細菌載體和附加型(episomal)哺乳動物載體)。其它載體(例如非附加型哺乳動物載體)可在導入宿主細胞中時整合到宿主細胞的基因組中，由此與宿主基因組一起複製。此外，一些載體能够指導其與之有效連接的基因的表達。此類載體在本文稱為“重組表達載體”(或簡稱“表達載體”)。一般而言，在重組DNA技術中實用的表達載體常常為質粒的形式。術語“質粒”和“載體”在本文可互換使用，因為質粒是最常使用的載體形式。然而，本發明意欲包括表達載體的其它形式，例如病毒載體(例如複製缺陷型逆轉錄病毒、腺病毒和腺相關病毒)，其起等同功能的作用。
本文所用短語“重組宿主細胞”(或“宿主細胞”)是指其中已導入重組表達載體的細胞。重組宿主細胞或宿主細胞不僅意指特定的受試細胞，而且還指這類細胞的子代。由于因其突變或環境影響所致某些修飾可發生在後代中，因此儘管這樣的後代實際上可不與親本細胞相同，但這樣的細胞仍包括在本文所用術語“宿主細胞”的範圍內。可使用各種宿主細胞表達系統來表達結合蛋白，包括細菌、酵母、杆狀病毒和哺乳動物表達系統(以及噬菌體展示表達系統)。合適細菌表達載體的一個實例為pUC19。為了重組表達結合蛋白，用一個或多個携帶編碼結合蛋白的多肽鏈的DNA片段的重組表達載體轉化或轉染宿主細胞，使得多肽鏈在宿主細胞中表達，幷優選分泌到其中培養宿主細胞的培養基中，可從所述培養基中回收結合蛋白。
本文所用術語“轉化”是指細胞遺傳特性的改變，當細胞被修飾以含有新的DNA時，細胞被轉化。例如，當細胞自其天然狀態被遺傳修飾時，細胞被轉 化。在轉化後，轉化的DNA可通過物理上(physically)整合至細胞染色體中而與細胞的重組，或可瞬時保持為附加型元件而不被複製，或可作為質粒獨立複製。當DNA隨細胞分裂而複製時，細胞被視為已穩定轉化。本文所用術語“轉染”是指外來或外源DNA被細胞攝取，當外源DNA被導入細胞膜內時，細胞被“轉染”。多種轉染技術是本領域所熟知的。可采用這類技術將一個或多個外源DNA分子導入合適的宿主細胞中。
本文所用和應用於客體的術語“天然存在的”是指該客體可存在于大自然中幷且未經人為操作的事實。例如，存在于可從天然來源分離的生物(包括病毒)中且未被人為有意修飾的多核苷酸或多肽是天然存在的。類似地，本文所用的“非天然存在的”是指自然中不存在或已人為進行結構修飾或合成的客體。
如本文所用，20個常規氨基酸及其縮寫按照常規用法。20個常用氨基酸的立體异構體(例如D-氨基酸)；非天然氨基酸例如α-、α-二取代的氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其它非常規氨基酸也可以是結合蛋白的多肽鏈的合適組分。非常規氨基酸的實例包括：4-羥脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N,N,N-三甲基賴氨酸、ε-N-乙醯基賴氨酸、O-磷酸絲氨酸、N-乙醯絲氨酸、N-甲醯甲硫氨酸、3-甲基組氨酸、5-羥賴氨酸、σ-N-甲基精氨酸和其它類似氨基酸和亞氨基酸(例如4-羥脯氨酸)。在本文所用多肽表示法中，按照標準用法和慣例，左側方向為氨基端方向，右側方向為羧基端方向。
可基于共同的側鏈性質，將天然存在的殘基分類：(1)疏水：Met、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Tyr、Pro；(2)極性親水：Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、His、Lys、Ser、Thr；(3)脂肪族：Ala、Gly、Ile、Leu、Val、Pro；(4)脂肪族疏水：Ala、Ile、Leu、Val、Pro；(5)中性親水：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(6)酸性：Asp、Glu；(7)鹼性：His、Lys、Arg； (8)影響鏈取向的殘基：Gly、Pro；(9)芳香族：His、Trp、Tyr、Phe；和(10)芳香族疏水：Phe、Trp、Tyr。
保守氨基酸取代可涉及這些類別之一的成員與同一類別的另一成員的交換。非保守取代可涉及這些類別之一的成員與另一類別的成員的交換。
采用衆所周知的技術，技術人員會能够確定結合蛋白的多肽鏈的合適變體。例如，通過靶向被視為對活性不重要的區域，本領域的技術人員可鑒定可被改變而不破壞活性的多肽鏈的合適區域。或者，本領域的技術人員可鑒定在類似多肽中保守的殘基和分子部分。此外，甚至可將對生物活性或對結構可能是重要的區域進行保守氨基酸取代而不破壞生物活性或對多肽結構沒有不利影響。
本文所用術語“患者”包括人和動物受試者。
本文所用術語“治療(treatment)”或“治療(treat)”是指任何治療性治療和預防或預防性措施二者。需要治療的受試者包括患有病症的受試者以及易患病症的受試者或要對其病症進行預防的受試者。在具體的實施方案中，結合蛋白可用於治療患有癌症的人，或對癌症易感的人，或在人受試者中减輕癌症。結合蛋白還可用於在人患者中預防癌症。在具體的實施方案中，所述癌症為多發性骨髓瘤、急性成淋巴細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、急性骨髓性白血病、淋巴瘤、乳腺癌(如Her2+乳腺癌)、生髮中心B細胞淋巴瘤或B細胞急性成淋巴細胞性白血病，在其他實施方案中，結合蛋白可用於治療患有炎性病症的人，或對炎性病症易感的人，或在人受試者中减輕炎性病症。
本文所用術語“醫藥組合物”或“治療組合物”是指當適當地投予于患者時能够引起所需治療效果的任何化合物或組合物。
本文所用術語“藥學上可接受的載劑”或“生理學上可接受的載劑”是指適于實現或增强結合蛋白的遞送的一種或多種製劑材料。
術語“有效量”和“治療有效量”在用於修飾包含一種或多種結合蛋白的醫藥 組合物時，是指足以產生所需治療結果的量或劑量。更具體地說，治療有效量是足以抑制與待治療病况相關的一個或多個臨床上確定的病理過程達一定時間的結合蛋白的量。有效量可隨所使用的具體結合蛋白而變化，也可取决于與受治療患者相關的各種因素和狀况和病症的嚴重程度。例如，如果結合蛋白是進行體內投予，則因素如患者的年齡、體重和健康狀况以及在臨床前動物研究中獲得的劑量反應曲綫和毒性數據會是需要考慮的因素。對給定醫藥組合物的有效量或治療有效量的確定完全在本領域技術人員的能力範圍內。
本發明的一個實施方案提供包含藥學上可接受的載劑和治療有效量的結合蛋白的醫藥組合物。
三特異性和/或三價結合蛋白
在一些實施方案中，本發明的結合蛋白是三特異性和/或三價結合蛋白，其包含形成3個抗原結合位點的4條多肽鏈，所述3個抗原結合位點特異性結合一個或多個(例如3個)不同的抗原靶標或靶蛋白，其中第一多肽鏈包含如下式表示的結構：VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽鏈包含如下式表示的結構：VH1-L3-VH2-L4-CH1 [II]
且第三多肽鏈包含如下式表示的結構：VH3-CH1 [III]
且第四多肽鏈包含如下式表示的結構：VL3-CL [IV]
其中：VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變域；VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變域；VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變域；VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變域； VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變域；VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變域；CL是免疫球蛋白輕鏈恆定域；CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恆定域；且L1、L2、L3和L4是氨基酸連接子；且其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對。
在一些實施方案中，本發明的結合蛋白是三特異性和/或三價結合蛋白，其包含形成3個抗原結合位點的4條多肽鏈，所述3個抗原結合位點特異性結合一個或多個(例如3個)抗原靶標或靶蛋白，其中第一多肽鏈包含如下式表示的結構：VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽鏈包含如下式表示的結構：VH1-L3-VH2-L4-CH1 [II]
且第三多肽鏈包含如下式表示的結構：VH3-CH1 [III]
且第四多肽鏈包含如下式表示的結構：VL3-CL [IV]
其中：VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變域；VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變域；VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變域；VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變域；VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變域；VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變域；CL是免疫球蛋白輕鏈恆定域；CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恆定域；且 L1、L2、L3和L4是氨基酸連接子；且其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對。
在一些實施方案中，本發明的結合蛋白是三特異性和/或三價結合蛋白，其包含形成3個抗原結合位點的4條多肽鏈，所述3個抗原結合位點特異性結合一個或多個(例如3個)不同的抗原靶標或靶蛋白，其中第一多肽鏈包含如下式表示的結構：VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽鏈包含如下式表示的結構：VH1-L3-VH2-L4-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [II]
且第三多肽鏈包含如下式表示的結構：VH3-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [III]
且第四多肽鏈包含如下式表示的結構：VL3-CL [IV]
其中：VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變域；VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變域；VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變域；VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變域；VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變域；VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變域；CL是免疫球蛋白輕鏈恆定域；CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恆定域；CH2是免疫球蛋白CH2重鏈恆定域；CH3是免疫球蛋白CH3重鏈恆定域；鉸鏈是連接CH1和CH2域的免疫球蛋白鉸鏈區；且L1、L2、L3和L4是氨基酸連接子； 且其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對。
在一些實施方案中，本發明的結合蛋白是三特異性和/或三價結合蛋白，其包含形成3個抗原結合位點的4條多肽鏈，所述3個抗原結合位點特異性結合一個或多個(例如3個)抗原靶標或靶蛋白，其中第一多肽鏈包含如下式表示的結構：VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽鏈包含如下式表示的結構：VH1-L3-VH2-L4-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [II]
且第三多肽鏈包含如下式表示的結構：VH3-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [III]
且第四多肽鏈包含如下式表示的結構：VL3-CL [IV]
其中：VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變域；VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變域；VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變域；VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變域；VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變域；VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變域；CL是免疫球蛋白輕鏈恆定域；CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恆定域；CH2是免疫球蛋白CH2重鏈恆定域；CH3是免疫球蛋白CH3重鏈恆定域；鉸鏈是連接CH1和CH2域的免疫球蛋白鉸鏈區；且L1、L2、L3和L4是氨基酸連接子；且其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對。
在一些實施方案中，所述第一多肽鏈和第二多肽鏈具有交叉取向，其形成兩個不同的抗原結合位點。在一些實施方案中，VH1和VL1形成結合對幷形成第一抗原結合位點。在一些實施方案中，VH2和VL2形成結合對幷形成第二抗原結合位點。在一些實施方案中，所述第三和第四多肽形成第三抗原結合位點。在一些實施方案中，VH3和VL3形成結合對幷形成第三抗原結合位點。
在一些實施方案中，本發明的結合蛋白是三特異性和/或三價結合蛋白，其包含形成3個抗原結合位點的4條多肽鏈，所述3個抗原結合位點特異性結合一個或多個(例如3個)抗原靶標或靶蛋白，其中第一多肽鏈包含如下式表示的結構：VD1-L1-VD2-L2-CL [I]
且第二多肽鏈包含如下式表示的結構：VD3-L3-VD4-L4-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [II]
且第三多肽鏈包含如下式表示的結構：VH3-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [III]
且第四多肽鏈包含如下式表示的結構：VL3-CL [IV]
其中：VD1是第一免疫球蛋白的重鏈或輕鏈的可變域；VD2是第二免疫球蛋白的重鏈或輕鏈的可變域；VD3是第三免疫球蛋白的重鏈或輕鏈的可變域；VD4是第四免疫球蛋白的重鏈或輕鏈的可變域；VH3是免疫球蛋白重鏈可變域；VL3是免疫球蛋白輕鏈可變域；CL是免疫球蛋白輕鏈恆定域；CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恆定域；CH2是免疫球蛋白CH2重鏈恆定域； CH3是免疫球蛋白CH3重鏈恆定域；鉸鏈是連接CH1和CH2域的免疫球蛋白鉸鏈區；且L1、L2、L3和L4是氨基酸連接子；且其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對。
在一些實施方案中，本發明的結合蛋白包含特異性結合一個、兩個或三個抗原靶標或靶蛋白的3個抗原結合位點。在一些實施方案中，結合蛋白結合3個抗原靶標。在一些實施方案中，結合蛋白結合3個不同的抗原靶標。在一些實施方案中，所述抗原結合位點的2個結合相同的抗原靶標。在那些實施方案中，結合蛋白包含兩個相同的結合域，或不同的結合域，和/或特異性結合相同抗原靶標上不同的抗原或表位。在一些實施方案中，所述抗原結合位點的3個結合相同的抗原靶標。在那些實施方案中，結合蛋白包含3個相同的結合域，或不同的結合域，和/或特異性結合相同抗原靶標上不同的抗原或表位。
在一些實施方案中，VL1、VL2和VL3各自獨立地是源自如SEQ ID NO：2、4、10、14、18、22或115任一項所示氨基酸序列的可變域；且VH1、VH2和VH3各自獨立地是源自如SEQ ID NO：1、3、9、13、17、21或114任一項所示氨基酸序列的可變域。在其他實施方案中，VL1、VL2和VL3各自獨立地是源自如SEQ ID NO：61、63、69、71、74、76、82、86、88或94任一項所示氨基酸序列的可變域；且VH1、VH2和VH3各自獨立地是源自如SEQ ID NO：60、62、68、73、75、81、85、87或93任一項所示氨基酸序列的可變域。在其他實施方案中，VL1、VL2和VL3各自獨立地包含可變域的輕鏈互補决定區，所述可變域包含如SEQ ID NO：43-59、123-125任一項所示的氨基酸序列；且VH1、VH2和VH3各自獨立地包含可變域的重鏈互補决定區，所述可變域包含如SEQ ID NO：25-42、120-122任一項所示的氨基酸序列。在其他實施方案中，VL1、VL2和VL3各自獨立地包含可變域的輕鏈互補决定區，所述可變域包含如SEQ ID NO：61、63、69、71、74、76、82、86、88或94任一項所示的氨基酸序列；且VH1、VH2和VH3各自獨立地包含可變域的重鏈互補决定區，所述可變域包含如SEQ ID NO： 60、62、68、73、75、81、85、87或93任一項所示的氨基酸序列。在一些實施方案中，VH1、VH2和VH3各自獨立地包含如表2-5中所示的重鏈互補决定區和/或可變域序列。
在一些實施方案中，VL1、VL2和VL3各自獨立地包含如SEQ ID NO：169、171和173任一項所示的可變域序列；和/或VH1、VH2和VH3各自獨立地包含如SEQ ID NO：168、170和172任一項所示的可變域序列。在一些實施方案中，VL1、VL2和VL3各自獨立地包含輕鏈互補决定區，其包含選自下組的氨基酸序列：SEQ ID NO：50、141-147、178和179；和/或VH1、VH2和VH3各自獨立地包含重鏈互補决定區，其包含選自下組的氨基酸序列：SEQ ID NO：129-137。在一些實施方案中，VL1、VL2和VL3各自獨立地包含如SEQ ID NO：151、153、155、157、159、161、163、165和167任一項所示的可變域序列；和/或VH1、VH2和VH3各自獨立地包含如SEQ ID NO：150、152、154、156、158、160、162、164和166的任一項所示的可變域序列。在一些實施方案中，VL1、VL2和VL3各自獨立地包含輕鏈互補决定區，其包含如SEQ ID NO：43-59、123-125、138-140和149任一項所示的氨基酸序列；和/或VH1、VH2和VH3各自獨立地包含可變域的重鏈互補决定區，其包含如SEQ ID NO：25-42、120-122和126-128任一項所示的氨基酸序列。在一些實施方案中，VL1、VL2和VL3各自獨立地包含如表2-5中所示的輕鏈互補决定區和/或可變域序列。
在具體的實施方案中，式I的多肽鏈或式II的多肽鏈中VH1和VH2域的順序是互相調換的(即順序顛倒)，幷且因此VL1和VL2的順序也是互相調換的。
在一些實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列或與SEQ ID NO：4的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：4的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列或與SEQ ID NO：3的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：3的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列或與SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少 95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：1的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或與SEQ ID NO：2的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：2的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR。
在一些實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列或與SEQ ID NO：10的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：10的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列或與SEQ ID NO：9的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：9的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列或與SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：1的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或與SEQ ID NO：2的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：2的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR。
在一些實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列或與SEQ ID NO：4的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：4的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列或與SEQ ID NO：3的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：3的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列或與SEQ ID NO：13的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：13的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列或與SEQ ID NO：14的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：14的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR。
在一些實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列或與SEQ ID NO：10的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與 SEQ ID NO：10的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列或與SEQ ID NO：9的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：9的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列或與SEQ ID NO：13的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：13的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列或與SEQ ID NO：14的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：14的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR。
在一些實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列或與SEQ ID NO：4的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：4的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列或與SEQ ID NO：3的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：3的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列或與SEQ ID NO：17的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：17的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列或與SEQ ID NO：18的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：18的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR。
在一些實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列或與SEQ ID NO：10的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：10的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列或與SEQ ID NO：9的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：9的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列或與SEQ ID NO：17的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：17的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：18的氨基酸序 列或與SEQ ID NO：18的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：18的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR。
在一些實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列或與SEQ ID NO：4的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：4的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列或與SEQ ID NO：3的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：3的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列或與SEQ ID NO：21的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：21的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列或與SEQ ID NO：22的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：22的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR。
在一些實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列或與SEQ ID NO：10的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：10的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列或與SEQ ID NO：9的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：9的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列或與SEQ ID NO：21的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：21的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列或與SEQ ID NO：22的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：22的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR。
在一些實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：63的氨基酸序列或與SEQ ID NO：63的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：63的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：62的氨基酸序列或與SEQ ID NO：62的氨基酸序列至少95%相同的氨 基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：62的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：60的氨基酸序列或與SEQ ID NO：60的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：60的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：61的氨基酸序列或與SEQ ID NO：61的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：61的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR。
在一些實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列或與SEQ ID NO：69的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：69的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列或與SEQ ID NO：68的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：68的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：60的氨基酸序列或與SEQ ID NO：60的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：60的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：61的氨基酸序列或與SEQ ID NO：61的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：61的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR。
在一些實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列或與SEQ ID NO：69的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：69的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列或與SEQ ID NO：68的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：68的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：60的氨基酸序列或與SEQ ID NO：60的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：60的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：71的氨基酸序列或與SEQ ID NO：71的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：71的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR。
在一些實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：76的氨基酸序列或與SEQ ID NO：76的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：76的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：75的氨基酸序列或與SEQ ID NO：75的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：75的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列或與SEQ ID NO：73的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：73的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：74的氨基酸序列或與SEQ ID NO：74的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：74的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR。
在一些實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：82的氨基酸序列或與SEQ ID NO：82的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：82的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：81的氨基酸序列或與SEQ ID NO：81的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：81的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列或與SEQ ID NO：73的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：73的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：74的氨基酸序列或與SEQ ID NO：74的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：74的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR。
在一些實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：88的氨基酸序列或與SEQ ID NO：88的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：88的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：87的氨基酸序列或與SEQ ID NO：87的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：87的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：85的氨基酸序列或與SEQ ID NO：85 的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：85的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：86的氨基酸序列或與SEQ ID NO：86的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：86的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR。
在一些實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：94的氨基酸序列或與SEQ ID NO：94的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：94的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：93的氨基酸序列或與SEQ ID NO：93的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：93的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：85的氨基酸序列或與SEQ ID NO：85的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：85的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：86的氨基酸序列或與SEQ ID NO：86的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：86的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR。
在一些實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列或與SEQ ID NO：69的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：69的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列或與SEQ ID NO：68的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：68的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列或與SEQ ID NO：73的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：73的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：74的氨基酸序列或與SEQ ID NO：74的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：74的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR。
在一些實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列或與SEQ ID NO：69的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與 SEQ ID NO：69的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列或與SEQ ID NO：68的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：68的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：85的氨基酸序列或與SEQ ID NO：85的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：85的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：86的氨基酸序列或與SEQ ID NO：86的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：86的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR。
在一些實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：63的氨基酸序列或與SEQ ID NO：63的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：63的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：62的氨基酸序列或與SEQ ID NO：62的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：62的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列或與SEQ ID NO：73的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：73的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：74的氨基酸序列或與SEQ ID NO：74的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：74的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR。
在一些實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：63的氨基酸序列或與SEQ ID NO：63的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：63的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：62的氨基酸序列或與SEQ ID NO：62的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：62的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：85的氨基酸序列或與SEQ ID NO：85的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：85的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：86的氨 基酸序列或與SEQ ID NO：86的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：86的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR。
在一些實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列或與SEQ ID NO：4的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：4的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列或與SEQ ID NO：3的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：3的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：114的氨基酸序列或與SEQ ID NO：114的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：114的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：115的氨基酸序列或與SEQ ID NO：115的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：115的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR。
在一些實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列或與SEQ ID NO：10的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：10的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列或與SEQ ID NO：9的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：9的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：114的氨基酸序列或與SEQ ID NO：114的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：114的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：115的氨基酸序列或與SEQ ID NO：115的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：115的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR。
在其他實施方案中，本發明的結合蛋白是三特異性和/或三價結合蛋白，其包含形成3個抗原結合位點的4條多肽鏈，所述3個抗原結合位點特異性結合一個或多個(例如3個)不同的靶蛋白，其中第一多肽鏈具有如下式表示的結構： VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽鏈具有如下式表示的結構：VH1-L3-VH2-L4-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 (穴) [II]
且第三多肽鏈具有如下式表示的結構：VH3-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 (節) [III]
且第四多肽鏈具有如下式表示的結構：VL3-CL [IV]
其中：VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變域；VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變域；VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變域；VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變域；VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變域；VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變域；CL是免疫球蛋白輕鏈恆定域；CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恆定域；且L1、L2、L3和L4是氨基酸連接子；且其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對。
在其他實施方案中，本發明的結合蛋白是三特異性和/或三價結合蛋白，其包含形成3個抗原結合位點的4條多肽鏈，所述3個抗原結合位點特異性結合一個或多個(例如3個)靶蛋白，其中第一多肽鏈具有如下式表示的結構：VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽鏈具有如下式表示的結構：VH1-L3-VH2-L4-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 (穴) [II]
且第三多肽鏈具有如下式表示的結構：VH3-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 (節) [III]
且第四多肽鏈具有如下式表示的結構：VL3-CL [IV]
其中：VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變域；VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變域；VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變域；VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變域；VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變域；VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變域；CL是免疫球蛋白輕鏈恆定域；CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恆定域；且L1、L2、L3和L4是氨基酸連接子；且其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對。
在一些實施方案中，所述第一多肽鏈和第二多肽鏈具有交叉取向，其形成兩個不同的抗原結合位點。在一些實施方案中，VH1和VL1形成結合對幷形成第一抗原結合位點。在一些實施方案中，VH2和VL2形成結合對幷形成第二抗原結合位點。在一些實施方案中，所述第三和第四多肽形成第三抗原結合位點。在一些實施方案中，VH3和VL3形成結合對幷形成第三抗原結合位點。在一些實施方案中，所述第二多肽鏈和第三多肽鏈包含一個或多個修飾。在一些實施方案中，所述結合蛋白的第二多肽鏈和第三多肽鏈是不同的，例如具有不同的CH1、CH2和/或CH3域(如包括本文所述的修飾的那些)。在一些實施方案中，所述第一多肽鏈和第四多肽鏈包含一個或多個修飾。在一些實施方案中，所述結合蛋白的第一多肽鏈和第四多肽鏈是不同的，例如具有不同的CL域(如包括本文所述的修飾的那些，和/或λ對比κ CL域)。
在一些實施方案中，本發明的結合蛋白包含抗原結合位點，所述抗原結合位點包含重鏈可變域和/或輕鏈可變域，所述重鏈可變域包含與SEQ ID NO：150 至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：150的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR，所述輕鏈可變域包含與SEQ ID NO：151至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：151的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR。在一些實施方案中，本發明的結合蛋白包含抗原結合位點，所述抗原結合位點包含重鏈可變域和/或輕鏈可變域，所述重鏈可變域包含與SEQ ID NO：152至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：152的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR，所述輕鏈可變域包含與SEQ ID NO：153至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：153的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR。在一些實施方案中，本發明的結合蛋白包含抗原結合位點，所述抗原結合位點包含重鏈可變域和/或輕鏈可變域，所述重鏈可變域包含與SEQ ID NO：154至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：154的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR，所述輕鏈可變域包含與SEQ ID NO：155至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：155的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR。在一些實施方案中，本發明的結合蛋白包含抗原結合位點，所述抗原結合位點包含重鏈可變域和/或輕鏈可變域，所述重鏈可變域包含與SEQ ID NO：156至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：156的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR，所述輕鏈可變域包含與SEQ ID NO：157至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：157的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR。在一些實施方案中，本發明的結合蛋白包含抗原結合位點，所述抗原結合位點包含重鏈可變域和/或輕鏈可變域，所述重鏈可變域包含與SEQ ID NO：158至少95%、至少96%、至少97%、至 少98%、至少99%、或100%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：158的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR，所述輕鏈可變域包含與SEQ ID NO：159至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：159的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR。在一些實施方案中，本發明的結合蛋白包含抗原結合位點，所述抗原結合位點包含重鏈可變域和/或輕鏈可變域，所述重鏈可變域包含與SEQ ID NO：160至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：160的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR，所述輕鏈可變域包含與SEQ ID NO：161至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：161的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR。在一些實施方案中，本發明的結合蛋白包含抗原結合位點，所述抗原結合位點包含重鏈可變域和/或輕鏈可變域，所述重鏈可變域包含與SEQ ID NO：162至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：162的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR，所述輕鏈可變域包含與SEQ ID NO：163至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：163的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR。在一些實施方案中，本發明的結合蛋白包含抗原結合位點，所述抗原結合位點包含重鏈可變域和/或輕鏈可變域，所述重鏈可變域包含與SEQ ID NO：164至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：164的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR，所述輕鏈可變域包含與SEQ ID NO：165至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：165的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR。在一些實施方案中，本發明的結合蛋白包含抗原結合位點，所述抗原結合位點包含重鏈可變域和/或輕鏈可變域，所述重鏈可變域包含與SEQ ID NO：166至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100% 相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：166的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR，所述輕鏈可變域包含與SEQ ID NO：167至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：167的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR。在一些實施方案中，本發明的結合蛋白包含抗原結合位點，所述抗原結合位點包含重鏈可變域和/或輕鏈可變域，所述重鏈可變域包含與SEQ ID NO：168至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：168的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR，所述輕鏈可變域包含與SEQ ID NO：169至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：169的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR。在一些實施方案中，本發明的結合蛋白包含抗原結合位點，所述抗原結合位點包含重鏈可變域和/或輕鏈可變域，所述重鏈可變域包含與SEQ ID NO：170至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：170的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR，所述輕鏈可變域包含與SEQ ID NO：171至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：171的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR。在一些實施方案中，本發明的結合蛋白包含抗原結合位點，所述抗原結合位點包含重鏈可變域和/或輕鏈可變域，所述重鏈可變域包含與SEQ ID NO：172至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：172的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR，所述輕鏈可變域包含與SEQ ID NO：173至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同的氨基酸序列，其任選地包含與SEQ ID NO：173的多肽鏈的CDR 100%相同的CDR。
在一些實施方案中，本發明的結合蛋白以小于或等于1μM、500nM、100nM、50nM、10nM、5nM、或1nM的平衡解離常數(KD)結合至一個、兩個或三個抗原靶標。用於確定KD的示例性測定是本領域已知的。例如，在一些實施 方案中，通過用實施例1中所述的技術(例如SPR或ELISA)在0℃至37℃(例如0℃、4℃、25℃或37℃)處測量結合動力學來確定KD。
在一些實施方案中，本發明的結合蛋白體外活化CD4和/或CD8 T細胞和/或誘導細胞(其表達所述結合蛋白的一個或多個結合域的一個或多個抗原靶標)的抗體介導的體外細胞殺傷。示例性的體外細胞殺傷和T細胞激活測定是本領域已知的。例如，在一些實施方案中，用實施例1中所述的技術來測定體外細胞殺傷和/或T細胞活化。
在一些實施方案中，本發明的結合蛋白特異性結合至和/或阻斷由一個或多個細胞因子介導的信號傳輸。示例性的細胞因子釋放測定是本領域已知的。例如，在一些實施方案中，通過使用實施例1中所述的技術來測定細胞因子釋放。
在一些實施方案中，本發明的結合蛋白包含特異性結合T細胞上的靶蛋白的第一抗原結合位點、特異性結合T細胞上的靶蛋白的第二抗原結合位點和特異性結合抗原靶標或靶蛋白的第三抗原結合位點。在一些實施方案中，本發明的結合蛋白包含特異性結合T細胞上的靶蛋白的第一抗原結合位點、特異性結合T細胞上的靶蛋白的第二抗原結合位點和特異性結合腫瘤靶蛋白的第三抗原結合位點。在一些實施方案中，本發明的結合蛋白包含特異性結合T細胞上的靶蛋白的第一抗原結合位點、特異性結合T細胞上的靶蛋白的第二抗原結合位點和特異性結合人腫瘤靶蛋白的第三抗原結合位點。在一些實施方案中，第一和第二抗原結合位點特異性結合腫瘤靶蛋白，例如分別選自CD3和CD28。在一些實施方案中，第三抗原結合位點特異性結合腫瘤靶蛋白，例如選自CD19、CD20、CD38、Her2和LAMP1。此類靶標和靶蛋白的其他實例在下文提供。
在一些實施方案中，本發明的結合蛋白包含特異性結合CD3的第一抗原結合位點、特異性結合CD28的第二抗原結合位點和特異性結合抗原靶標或靶蛋白的第三抗原結合位點。此類抗原靶標或靶蛋白的其他實例在下文提供。在一些實施方案中，本發明的結合蛋白包含特異性結合CD3的第一抗原結合位點、特 異性結合CD28的第二抗原結合位點和特異性結合腫瘤靶蛋白的第三抗原結合位點。在一些實施方案中，本發明的結合蛋白包含特異性結合CD3的第一抗原結合位點、特異性結合CD28的第二抗原結合位點和特異性結合人腫瘤靶蛋白的第三抗原結合位點。在一些實施方案中，第三抗原結合位點特異性結合腫瘤靶蛋白，例如選自CD19、CD20、CD38、Her2和LAMP1。此類腫瘤抗原靶標或腫瘤靶蛋白的其他實例在下文提供。
在一些實施方案中，所述特異性結合CD3的抗原結合位點包含：包含SEQ ID NO：152的氨基酸序列的重鏈可變域和包含SEQ ID NO：153的氨基酸序列的輕鏈可變域；或包含SEQ ID NO：154的氨基酸序列的重鏈可變域和包含SEQ ID NO：155的氨基酸序列的輕鏈可變域。抗體的其他特異性結合CD3投予于本文所述任何結合蛋白的VH、VL和/或CDR序列可見于國際公開No.WO2016/116626中，其再次通過提述以其整體幷入本文。在一些實施方案中，所述特異性結合CD3的抗原結合位點包含6個CDR，或重鏈和輕鏈可變域，如表2-5所示。在一些實施方案中，所述特異性結合CD3的抗原結合位點包含：(i)分別為SEQ ID No.34、35和36的3個重鏈CDR，和分別為SEQ ID No.52、53和54的3個輕鏈CDR；或(ii)分別為SEQ ID No.34、35和36的3個重鏈CDR，和分別為SEQ ID No.149、53和54的3個輕鏈CDR。
在一些實施方案中，所述特異性結合CD28的抗原結合位點包含：包含SEQ ID NO：160的氨基酸序列的重鏈可變域和包含SEQ ID NO：161的氨基酸序列的輕鏈可變域；或包含SEQ ID NO：162的氨基酸序列的重鏈可變域和包含SEQ ID NO：163的氨基酸序列的輕鏈可變域。在一些實施方案中，所述特異性結合CD28的抗原結合位點包含6個CDR，或重鏈和輕鏈可變域，如表2-5所示。在一些實施方案中，所述特異性結合CD28的抗原結合位點包含：(i)分別為SEQ ID No.28、29和30的3個重鏈CDR，和分別為SEQ ID No.46、47和48的3個輕鏈CDR；或(ii)分別為SEQ ID No.31、32和33的3個重鏈CDR，和分別為SEQ ID No.49、50和51的3個輕鏈CDR。
在一些實施方案中，本發明的結合蛋白包含特異性結合CD3的第一抗原結合位點、特異性結合CD28的第二抗原結合位點和特異性結合CD38的第三抗原結合位點，其中：˙特異性結合CD3的抗原結合位點包含：(i)分別為SEQ ID No.34、35和36的3個重鏈CDR，和分別為SEQ ID No.52、53和54的3個輕鏈CDR；或(ii)分別為SEQ ID No.34、35和36的3個重鏈CDR，和分別為SEQ ID No.149、53和54的3個輕鏈CDR；且˙特異性結合CD28的抗原結合位點包含：(i)分別為SEQ ID No.28、29和30的3個重鏈CDR，和分別為SEQ ID No.46、47和48的3個輕鏈CDR；或(ii)分別為SEQ ID No.31、32和33的3個重鏈CDR，和分別為SEQ ID No.49、50和51的3個輕鏈CDR；且˙特異性結合CD28的抗原結合位點包含：(i)分別為SEQ ID No.40、41和42的3個重鏈CDR，和分別為SEQ ID No.58、44和59的3個輕鏈CDR。
在一些實施方案中，特異性結合腫瘤靶蛋白的抗原結合位點包含：包含SEQ ID NO：156的氨基酸序列的重鏈可變域和包含SEQ ID NO：157的氨基酸序列的輕鏈可變域；包含SEQ ID NO：158的氨基酸序列的重鏈可變域和包含SEQ ID NO：159的氨基酸序列的輕鏈可變域；包含SEQ ID NO：164的氨基酸序列的重鏈可變域和包含SEQ ID NO：165的氨基酸序列的輕鏈可變域；包含SEQ ID NO：150的氨基酸序列的重鏈可變域和包含SEQ ID NO：151的氨基酸序列的輕鏈可變域；或包含SEQ ID NO：166的氨基酸序列的重鏈可變域和包含SEQ ID NO：167的氨基酸序列的輕鏈可變域。在一些實施方案中，特異性結合腫瘤靶蛋白的抗原結合位點包含6個CDR，或重鏈及輕鏈可變域，其示于表2-5中。
在一些實施方案中，本發明的結合蛋白包含包含形成3個抗原結合位點的4條多肽鏈，其中第一多肽鏈包含如下式表示的結構：VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽鏈包含如下式表示的結構： VH1-L3-VH2-L4-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [II]
且第三多肽鏈包含如下式表示的結構：VH3-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [III]
且第四多肽鏈包含如下式表示的結構：VL3-CL [IV]
其中：VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變域；VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變域；VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變域；VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變域；VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變域；VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變域；CL是免疫球蛋白輕鏈恆定域；CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恆定域；CH2是免疫球蛋白CH2重鏈恆定域；CH3是免疫球蛋白CH3重鏈恆定域；鉸鏈是連接CH1和CH2域的免疫球蛋白鉸鏈區；且L1、L2、L3和L4是氨基酸連接子；且其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對；其中：VL1、VL2和VL3各自獨立地包含如SEQ ID NO：169、171和173中任一項所示的可變域序列；且其中：VH1、VH2和VH3各自獨立地包含如SEQ ID NO：168、170和172中任一項所示的可變域序列。
在一些實施方案中，本發明的結合蛋白包含形成3個抗原結合位點的4條 多肽鏈，其中第一多肽鏈包含如下式表示的結構：VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽鏈包含如下式表示的結構：VH1-L3-VH2-L4-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [II]
且第三多肽鏈包含如下式表示的結構：VH3-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [III]
且第四多肽鏈包含如下式表示的結構：VL3-CL [IV]
其中：VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變域；VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變域；VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變域；VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變域；VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變域；VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變域；CL是免疫球蛋白輕鏈恆定域；CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恆定域；CH2是免疫球蛋白CH2重鏈恆定域；CH3是免疫球蛋白CH3重鏈恆定域；鉸鏈是連接CH1和CH2域的免疫球蛋白鉸鏈區；且L1、L2、L3和L4是氨基酸連接子；且其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對；其中：VL1、VL2和VL3各自獨立地包含輕鏈互補决定區，所述輕鏈互補决定區包含選自下組的氨基酸序列：如SEQ ID NO：50、141-147、178和179；且其中： VH1、VH2和VH3各自獨立地包含重鏈互補决定區，所述重鏈互補决定區包含選自下組的氨基酸序列：SEQ ID NO：129-137。
在一些實施方案中，本發明的結合蛋白包含形成3個抗原結合位點的4條多肽鏈，其中第一多肽鏈包含如下式表示的結構：VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽鏈包含如下式表示的結構：VH1-L3-VH2-L4-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [II]
且第三多肽鏈包含如下式表示的結構：VH3-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [III]
且第四多肽鏈包含如下式表示的結構：VL3-CL [IV]
其中：VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變域；VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變域；VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變域；VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變域；VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變域；VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變域；CL是免疫球蛋白輕鏈恆定域；CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恆定域；CH2是免疫球蛋白CH2重鏈恆定域；CH3是免疫球蛋白CH3重鏈恆定域；鉸鏈是連接CH1和CH2域的免疫球蛋白鉸鏈區；且L1、L2、L3和L4是氨基酸連接子；且其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對；其中： VL1、VL2和VL3各自獨立地包含如SEQ ID NO：151、153、155、157、159、161、163、165和167的任一項所示的可變域序列；且其中：VH1、VH2和VH3各自獨立地包含如SEQ ID NO：150、152、154、156、158、160、162、164和166的任一項所示的可變域序列。
在一些實施方案中，本發明的結合蛋白包含形成3個抗原結合位點的4條多肽鏈，其中第一多肽鏈包含如下式表示的結構：VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽鏈包含如下式表示的結構：VH1-L3-VH2-L4-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [II]
且第三多肽鏈包含如下式表示的結構：VH3-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [III]
且第四多肽鏈包含如下式表示的結構：VL3-CL [IV]
其中：VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變域；VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變域；VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變域；VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變域；VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變域；VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變域；CL是免疫球蛋白輕鏈恆定域；CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恆定域；CH2是免疫球蛋白CH2重鏈恆定域；CH3是免疫球蛋白CH3重鏈恆定域；鉸鏈是連接CH1和CH2域的免疫球蛋白鉸鏈區；且 L1、L2、L3和L4是氨基酸連接子；且其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對；其中：VL1、VL2和VL3各自獨立地包含輕鏈互補决定區，所述輕鏈互補决定區包含如SEQ ID NO：43-59、123-125、138-140和149的任一項所示的氨基酸序列；且其中：VH1、VH2和VH3各自獨立地包含重鏈互補决定區，所述重鏈互補决定區包含如SEQ ID NO：25-42、120-122和126-128的任一項所示的氨基酸序列。
在一些實施方案中，本發明的結合蛋白包含特異性結合CD3的抗原結合位點、特異性結合CD28的抗原結合位點和特異性結合除CD3或CD28以外的其他抗原靶標的抗原結合位點。在一些實施方案中，本發明的結合蛋白包含特異性結合人CD3的抗原結合位點、特異性結合人CD28的抗原結合位點和特異性結合除CD3或CD28以外的其他人抗原靶標的抗原結合位點。在一些實施方案中，本發明的結合蛋白包含(a)特異性結合CD3的抗原結合位點，其中所述特異性結合CD3的抗原結合位點包含：(i)包含SEQ ID NO：152的氨基酸序列的重鏈可變域和包含SEQ ID NO：153的氨基酸序列的輕鏈可變域，(ii)包含SEQ ID NO：154的氨基酸序列的重鏈可變域和包含SEQ ID NO：155的氨基酸序列的輕鏈可變域，(iii)重鏈可變域和輕鏈可變域，所述重鏈可變域包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3，所述輕鏈可變域包含：包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的CDR-L3，或(iv)重鏈可變域和輕鏈可變域，所述重鏈可變域包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3，所述輕鏈可變域包含：包含SEQ ID NO：149的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的 CDR-L3；(b)特異性結合CD28的抗原結合位點，其中所述特異性結合CD28的抗原結合位點包含：(i)包含SEQ ID NO：160的氨基酸序列的重鏈可變域和包含SEQ ID NO：161的氨基酸序列的輕鏈可變域，(ii)包含SEQ ID NO：162的氨基酸序列的重鏈可變域和包含SEQ ID NO：163的氨基酸序列的輕鏈可變域，(iii)重鏈可變域和輕鏈可變域，所述重鏈可變域包含：包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的CDR-H3，所述輕鏈可變域包含：包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：48的氨基酸序列的CDR-L3，或重鏈可變域和輕鏈可變域，所述重鏈可變域包含：包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的CDR-H3，所述輕鏈可變域包含：包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的CDR-L3；和(c)特異性結合除CD3或CD28以外的其他抗原靶標的抗原結合位點。在一些實施方案中，本發明的結合蛋白包含：包含SEQ ID NO：4或10的氨基酸序列的第一多肽鏈、包含SEQ ID NO：3或9的氨基酸序列的第二多肽鏈、及第三和第四多肽鏈，其中所述第三和第四多肽鏈形成抗原結合域，其特異性結合除CD3或CD28以外的其他抗原靶標。在一些實施方案中，所述特異性結合除CD3或CD28以外的其他抗原靶標的抗原結合位點結合選自下組的抗原：A2AR、APRIL、ATPD酶、BAFF、BAFFR、BCMA、BlyS、BTK、BTLA、B7DC、B7H1、B7H4(也稱為VTCN1)、B7H5、B7H6、B7H7、B7RP1、B7-4、C3、C5、CCL2(也稱為MCP-1)、CCL3(也稱為MIP-1a)、CCL4(也稱為MIP-1b)、CCL5(也稱為RANTES)、CCL7(也稱為MCP-3)、CCL8(也稱為mcp-2)、CCL11(也稱為嗜酸性粒細胞趨化因子)、CCL15(也稱為MIP-1d)、CCL17(也稱為TARC)、CCL19(也稱為MIP-3b)、CCL20(也稱為MIP-3a)、CCL21(也稱為MIP-2)、CCL24(也稱為MPIF-2/嗜酸性粒細胞趨化因子-2)、CCL25(也稱為TECK)、CCL26(也稱 為嗜酸性粒細胞趨化因子-3)、CCR3、CCR4、CD19、CD20、CD23(也稱為FCER2)、CD24、CD27、CD38、CD39、CD40、CD70、CD80(也稱為B7-1)、CD86(也稱為B7-2)、CD122、CD137(也稱為41BB)、CD137L、CD152(也稱為CTLA4)、CD154(也稱為CD40L)、CD160、CD272、CD273(也稱為PDL2)、CD274(也稱為PDL1)、CD275(也稱為B7H2)、CD276(也稱為B7H3)、CD278(也稱為ICOS)、CD279(也稱為PD-1)、CDH1(也稱為E-鈣粘素)、殼多糖酶、CLEC9、CLEC91、CRTH2、CSF-1(也稱為M-CSF)、CSF-2(也稱為GM-CSF)、CSF-3(也稱為GCSF)、CX3CL1(也稱為SCYD1)、CXCL12(也稱為SDF1)、CXCL13、CXCR3、DNGR-1、外核苷三磷酸鹽二磷酸水解酶1、EGFR、ENTPD1、FCER1A、FCER1、FLAP、Gi24、GITR、GITRL、GM-CSF、Her2、HHLA2、HMGB1、HVEM、ICOSLG、IDO、IFNα、IgE、IGF1R、IL2Rβ、IL1、IL1A、IL1B、IL1F10、IL2、IL4、IL4Ra、IL5、IL5R、IL6、IL7、IL7Ra、IL8、IL9、IL9R、IL10、rhIL10、IL12、IL13、IL13Ra1、IL13Ra2、IL15、IL17、IL17Rb、IL18、IL22、IL23、IL25、IL27、IL33、IL35、ITGB4(也稱為b4整合素)、ITK、KIR、LAG3、LAMP1、瘦素、LPFS2、II類MHC、NCR3LG1、NKG2D、NTPD酶-1、OX40、OX40L、PD-1H、血小板受體、S152、SISP1、SLC、SPG64、ST2、Syk激酶、TACI、TDO、T14、TIGIT、TIM3、TLR、TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、TNFa、TNFRSF7、Tp55、TREM1、TSLP、TSLPR、TWEAK、VEGF、VISTA、Vstm3、WUCAM和XCR1(也稱為GPR5/CCXCR1)。
在一些實施方案中，VH1包含：包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：48的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR- H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些實施方案中，VH1包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些實施方案中，VH1包含：包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3 包含：包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些實施方案中，VH1包含：包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：48的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：55的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：56的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：57的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些實施方案中，VH1包含：包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包 含：包含SEQ ID NO：55的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：56的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：57的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些實施方案中，VH1包含：包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：48的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：58的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：59的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些實施方案中，VH1包含：包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：58的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：59的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些實施方案中，VH1包含：包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：48的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：126的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：127的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：128的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：138的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：139的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：140的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些實施方案中，VH1包含：包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：126的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：127的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：128的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：138的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：139的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：140的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些實施方案中，VH1包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨 基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：129的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：130的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：131的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：141的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：178的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：142的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些實施方案中，VH1包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：129的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：130的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：131的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：141的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：178的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：142的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些實施方案中，VH1包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨 基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：129的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：130的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：131的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：141的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：178的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：142的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些實施方案中，VH1包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：129的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：130的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：131的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：141的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：178的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：142的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些實施方案中，VH1包含：包含SEQ ID NO：129的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：130的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：131的氨 基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：141的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：178的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：142的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些實施方案中，VH1包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：129的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：130的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：131的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：141的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：178的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：142的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些實施方案中，VH1包含：包含SEQ ID NO：129的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：130的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：131的氨 基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：141的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：178的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：142的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些實施方案中，VH1包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些實施方案中，VH1包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨 基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些實施方案中，VH1包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些實施方案中，VH1包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨 基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些實施方案中，VH1包含：包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：48的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：120的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：121的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：122的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：123的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：124的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：125的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些實施方案中，VH1包含：包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列的CDR-L1、包 含SEQ ID NO：50的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：120的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：121的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：122的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：123的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：124的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：125的氨基酸序列的CDR-L3。
抗原靶標
在一些實施方案中，本發明的結合蛋白結合如下抗原靶標或靶蛋白的一個或多個(例如一個、兩個或三個)：A2AR、APRIL、ATPD酶、BAFF、BAFFR、BCMA、BlyS、BTK、BTLA、B7DC、B7H1、B7H4(也稱為VTCN1)、B7H5、B7H6、B7H7、B7RP1、B7-4、C3、C5、CCL2(也稱為MCP-1)、CCL3(也稱為MIP-1a)、CCL4(也稱為MIP-1b)、CCL5(也稱為RANTES)、CCL7(也稱為MCP-3)、CCL8(也稱為mcp-2)、CCL11(也稱為嗜酸性粒細胞趨化因子)、CCL15(也稱為MIP-1d)、CCL17(也稱為TARC)、CCL19(也稱為MIP-3b)、CCL20(也稱為MIP-3a)、CCL21(也稱為MIP-2)、CCL24(也稱為MPIF-2/嗜酸性粒細胞趨化因子-2)、CCL25(也稱為TECK)、CCL26(也稱為嗜酸性粒細胞趨化因子-3)、CCR3、CCR4、CD3、CD19、CD20、CD23(也稱為FCER2)、CD24、CD27、CD28、CD38、CD39、CD40、CD70、CD80(也稱為B7-1)、CD86(也稱為B7-2)、CD122、CD137(也稱為41BB)、CD137L、CD152(也稱為CTLA4)、CD154(也稱為CD40L)、CD160、CD272、CD273(也稱為PDL2)、CD274(也稱為PDL1)、CD275(也稱為B7H2)、CD276(也稱為B7H3)、CD278(也稱為ICOS)、CD279(也稱為PD-1)、CDH1(也稱為E-鈣粘素)、殼多糖酶、CLEC9、CLEC91、CRTH2、CSF-1(也稱為M-CSF)、CSF-2(也稱為GM- CSF)、CSF-3(也稱為GCSF)、CX3CL1(也稱為SCYD1)、CXCL12(也稱為SDF1)、CXCL13、CXCR3、DNGR-1、外核苷三磷酸鹽二磷酸水解酶1、EGFR、ENTPD1、FCER1A、FCER1、FLAP、Gi24、GITR、GITRL、GM-CSF、Her2、HHLA2、HMGB1、HVEM、ICOSLG、IDO、IFNα、IgE、IGF1R、IL2Rβ、IL1、IL1A、IL1B、IL1F10、IL2、IL4、IL4Ra、IL5、IL5R、IL6、IL7、IL7Ra、IL8、IL9、IL9R、IL10、rhIL10、IL12、IL13、IL13Ra1、IL13Ra2、IL15、IL17、IL17Rb、IL18、IL22、IL23、IL25、IL27、IL33、IL35、ITGB4(也稱為b4整合素)、ITK、KIR、LAG3、LAMP1、瘦素、LPFS2、II類MHC、NCR3LG1、NKG2D、NTPD酶-1、OX40、OX40L、PD-1H、血小板受體、S152、SISP1、SLC、SPG64、ST2、Syk激酶、TACI、TDO、T14、TIGIT、TIM3、TLR、TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、TNFa、TNFRSF7、Tp55、TREM1、TSLP、TSLPR、TWEAK、VEGF、VISTA、Vstm3、WUCAM和XCR1(也稱為GPR5/CCXCR1)。在一些實施方案中，上述抗原靶標的一個或多個是人抗原靶標。
在一個實施方案中，結合蛋白特異性結合至一個或多個腫瘤抗原靶標(例如靶蛋白)。在其他實施方案中，結合蛋白特異性結合至一個或多個腫瘤靶蛋白和一個或多個T細胞上的靶蛋白，包括T細胞受體複合體。這些T細胞銜接體結合蛋白能够瞬時招募T細胞至靶細胞，幷同時激活T細胞的細胞裂解活性。T細胞上的靶蛋白的實例包括但不限于CD3和CD28，及其他。此類抗原靶標或靶蛋白的其他實例在上文提供。在一些實施方案中，可通過將兩種或更多種單特異性抗體(親本抗體)的抗原結合域組合于一個抗體內而產生三特異性結合蛋白。在一些實施方案中，本發明的結合蛋白結合如下抗原靶標的一個或多個(例如一個、兩個或三個)：CD3、CD19、CD20、CD28、CD38、Her2、LAMP1、IL-4、IL-13和TNFa。
在本發明的一些實施方案中，三價結合蛋白能够結合3個抗原靶標。在本發明的一些實施方案中，三價結合蛋白能够結合3個不同的抗原靶標。在一個 實施方案中，結合蛋白是三特異性的且一個輕鏈-重鏈對能够結合兩個不同的抗原靶標或表位而一個輕鏈-重鏈對能够結合一個抗原靶標或表位。在另一個實施方案中，結合蛋白能够結合3個腫瘤抗原靶標。在另一個實施方案中，結合蛋白能够結合3個不同的腫瘤抗原靶標。在其他實施方案中，結合蛋白能够抑制一個或多個抗原靶標的功能。
在一些實施方案中，本發明的結合蛋白結合一個或多個腫瘤靶蛋白。在一些實施方案中，結合蛋白能够特異性結合單個腫瘤靶蛋白上的3個表位。在一些實施方案中，結合蛋白能够特異性結合單個腫瘤靶蛋白上的3個不同表位。在一些實施方案中，結合蛋白能够結合第一腫瘤靶蛋白上的2個不同表位，和第二腫瘤靶蛋白上的1個表位。在一些實施方案中，所述第一和第二腫瘤靶蛋白是不同的。在一些實施方案中，結合蛋白能够特異性結合3個不同的腫瘤靶蛋白。
在一些實施方案中，本發明的結合蛋白結合一個或多個細胞因子靶蛋白。在一些實施方案中，結合蛋白能够特異性結合單個細胞因子靶蛋白上的3個表位。在一些實施方案中，結合蛋白能够特異性結合單個細胞因子靶蛋白上的3個不同表位。在一些實施方案中，結合蛋白能够結合第一細胞因子靶蛋白上的2個不同表位，和第二細胞因子靶蛋白上的1個表位。在一些實施方案中，所述第一和第二細胞因子靶蛋白是不同的。在一些實施方案中，結合蛋白能够特異性結合3個不同的細胞因子靶蛋白。在一些實施方案中，所述一個或多個細胞因子靶蛋白是IL-4、IL-13和/或TNFa的一個或多個。細胞因子靶蛋白的其他實例提供于下文中。
在一些實施方案中，本發明的結合蛋白結合一個或多個腫瘤靶蛋白和一個或多個T細胞靶蛋白。在一些實施方案中，結合蛋白能够特異性結合1個腫瘤靶蛋白和單個T細胞靶蛋白上的2個不同表位。在一些實施方案中，結合蛋白能够特異性結合1個腫瘤靶蛋白和2個不同的T細胞靶蛋白(例如CD28和CD3)。在一些實施方案中，結合蛋白能够特異性結合1個T細胞靶蛋白和單個腫瘤靶蛋白上 的2個不同表位。在一些實施方案中，結合蛋白能够特異性結合1個T細胞靶蛋白和2個不同的腫瘤靶蛋白。在一些實施方案中，結合蛋白的第一和第二多肽鏈形成2個抗原結合位點，其特異性靶向2個T細胞靶蛋白，且結合蛋白的第三和第四多肽鏈形成特異性結合腫瘤靶蛋白的抗原結合位點。在一些實施方案中，結合蛋白的第一和第二多肽鏈形成2個抗原結合位點，其特異性靶向2個腫瘤靶蛋白，且結合蛋白的第三和第四多肽鏈形成特異性結合T細胞靶蛋白的抗原結合位點。在一些實施方案中，所述一個或多個腫瘤靶蛋白是CD3、CD19、CD20、CD28、CD38、Her2、LAMP1、IL-4、IL-13和/或TNFa的一個或多個。在一些實施方案中，所述一個或多個T細胞靶蛋白是CD3和CD28的一個或多個。腫瘤靶蛋白和T細胞靶蛋白的其他實例提供于上文中。
在一些實施方案中，本發明的結合蛋白彼此獨立地結合相同的或不同的1、2或3個抗原靶標或靶蛋白，其選自細胞因子靶蛋白、腫瘤靶抗原或腫瘤靶蛋白、T細胞靶蛋白、免疫檢驗點抑制因子、免疫檢驗點調節因子、免疫檢驗點共刺激分子和/或免疫細胞表面上的靶標分子。在一些實施方案中，本發明的結合蛋白是三價但雙特異性的，幷且能够特異性結合兩個相同的抗原靶標或靶蛋白。在一些實施方案中，本發明的結合蛋白能够特異性結合單個細胞因子靶蛋白、腫瘤靶抗原或腫瘤靶蛋白、T細胞靶蛋白、免疫檢驗點抑制因子、免疫檢驗點調節因子、免疫檢驗點共刺激分子和/或免疫細胞表面上的靶標分子上的兩個不同表位。此類抗原靶標或靶蛋白的其他實例提供于上文。
本發明的結合蛋白可以用獲取自或源自人或非人抗體(包括例如人、鼠、或或人源化抗體)的域或序列來製備。
連接子
在一些實施方案中，連接子L1、L2、L3和L4長度範圍為無氨基酸(長度=0)至約100個氨基酸，或少于100、50、40、30、20、或15個氨基酸或更少。連接子長度還可為10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1個氨基酸。一個結合蛋白中的L1、L2、L3和L4可全都具有相同的氨基酸序列或可具有不同的氨基酸序列。
合適的連接子的實例包括單甘氨酸(Gly)殘基；二甘氨酸肽(Gly-Gly)；三肽(Gly-Gly-Gly)；具有4個甘氨酸殘基的肽(Gly-Gly-Gly-Gly；SEQ ID NO：98)；具有5個甘氨酸殘基的肽(Gly-Gly-Gly-Gly-Gly；SEQ ID NO：99)；具有6個甘氨酸殘基的肽(Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly；SEQ ID NO：100)；具有7個甘氨酸殘基的肽(Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly；SEQ ID NO：101)；具有8個甘氨酸殘基的肽(Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly；SEQ ID NO：102)。可使用其他氨基酸殘基組合，如肽Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：103)，肽Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：104)，肽Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：105)，和肽Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly(SEQ ID NO：148)。其他合適的肽連接子包括單個Ser，和Val殘基；二肽Arg-Thr，Gln-Pro，Ser-Ser，Thr-Lys，和Ser-Leu；Thr-Lys-Gly-Pro-Ser(SEQ ID NO：106)，Thr-Val-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO：107)，Gln-Pro-Lys-Ala-Ala(SEQ ID NO：108)，Gln-Arg-Ile-Glu-Gly(SEQ ID NO：109)；Ala-Ser-Thr-Lys-Gly-Pro-Ser(SEQ ID NO：110)，Arg-Thr-Val-Ala-Ala-Pro-Ser(SEQ ID NO：111)，Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO：112)，和His-Ile-Asp-Ser-Pro-Asn-Lys(SEQ ID NO：113)。上文列出的實例不意在以任何方式限制本發明的範圍，且已顯示了包含選自下組的任選氨基酸的連接子適于用於所述結合蛋白：纈氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，賴氨酸，精氨酸，組氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，天冬醯胺，穀氨醯胺，甘氨酸和脯氨酸。關于連接子序列的其他描述，參見例如WO2012135345。
連接子中氨基酸殘基的身份和序列可以根據在連接子中實現所必需的二級結構元件的類型而變化。例如，甘氨酸，絲氨酸和丙氨酸對于具有最大柔性的連接子而言是最佳的。如果需要更剛性和延伸的連接子，甘氨酸、脯氨酸、蘇氨酸和絲氨酸的一些組合是有用的。任何氨基酸殘基可考慮作為與其它氨基酸殘基組合的連接子，以取决于所需的性質根據需要構建較大的肽連接子。
在一些實施方案中，L1的長度是L3的長度的至少2倍。在一些實施方案中， L2的長度是L4的長度的至少2倍。在一些實施方案中，L1的長度是L3的長度的至少2倍且L2的長度是L4的長度的至少2倍。在一些實施方案中，L1的長度是3至12個氨基酸殘基，L2的長度是3至14個氨基酸殘基，L3的長度是1至8個氨基酸殘基，且L4的長度是1至3個氨基酸殘基。在一些實施方案中，L1的長度是5至10個氨基酸殘基，L2的長度是5至8個氨基酸殘基，L3的長度是1至5個氨基酸殘基，且L4的長度是1至2個氨基酸殘基。在一些實施方案中，L1的長度是7個氨基酸殘基，L2的長度是5個氨基酸殘基，L3的長度是1個氨基酸殘基，且L4的長度是2個氨基酸殘基。在一些實施方案中，L1的長度是10個氨基酸殘基，L2的長度是10個氨基酸殘基，L3的長度是0個氨基酸殘基，且L4的長度是0個氨基酸殘基。在一些實施方案中，L1、L2、L3和L4各自的長度獨立選自0至15個氨基酸(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15個氨基酸)，其中所述連接子的至少兩個的長度為0至15個氨基酸(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15個氨基酸)。在一些實施方案中，L1、L2、L3和L4各自長度為0個氨基酸。
在一些實施方案中，L1、L2、L3和/或L4包含序列Asp-Lys-Thr-His-Thr(SEQ ID NO：525)。在一些實施方案中，L1包含序列Asp-Lys-Thr-His-Thr(SEQ ID NO：525)。在一些實施方案中，L3包含序列Asp-Lys-Thr-His-Thr(SEQ ID NO：525)。
在一些實施方案中，L1、L2、L3和/或L4包含源自抗體可變域和抗體恆定域之間的接點處天然存在的序列(例如WO2012/135345中所述的)。例如，在一些實施方案中，連接子包含見于內源性VH和CH1域之間，或內源性VL和CL域(例如人κ或λ)之間的轉接處。在一些實施方案中，連接子包含見于內源性人VH和CH1域之間，或內源性人VL和CL域(例如人κ或λ)之間的轉接處。
在一些實施方案中，L1、L2、L3和/或L4包含序列Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO：175)。在一些實施方案中，L1包含序列Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO：175)。在一些實施方案中，L1包含序列Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO：175)，L2包含序列Thr-Lys-Gly-Pro-Ser-Arg(SEQ ID NO：176)，L3包含序列Ser，且L4包含序列Arg-Thr。在一些實施方案中，L3包含序列Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO：175)。在一些實施方案中，L1包含序列Ser，L2包含序列Arg-Thr，L3包含序列Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO：175)和L4包含序列Thr-Lys-Gly-Pro-Ser-Arg(SEQ ID NO：176)。
在一些實施方案中，L1、L2、L3和L4各自獨立地包含選自(GGGGS)n(其中n是0至5的整數；SEQ ID NO：174)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：104)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：105)、S、RT、TKGPS(SEQ ID NO：106)、GQPKAAP(SEQ ID NO：175)和GGSGSSGSGG(SEQ ID NO：148)的序列。在一些實施方案中，L1包含序列GQPKAAP(SEQ ID NO：175)，L2包含序列TKGPS(SEQ ID NO：106)，L3包含序列S，且L4包含序列RT。在一些實施方案中，L1包含序列GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：104)，L2包含序列GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：104)，L3長度為0個氨基酸，且L4長度為0個氨基酸。在一些實施方案中，L1包含序列GGSGSSGSGG(SEQ ID NO：148)，L2包含序列GGSGSSGSGG(SEQ ID NO：148)，L3長度為0個氨基酸，且L4長度為0個氨基酸。在一些實施方案中，L1包含序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：105)，L2長度為0個氨基酸，L3包含序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：105)，且L4長度為0個氨基酸。
Fc區和恆定域
在一些實施方案中，本發明的結合蛋白包含第二多肽鏈，所述第二多肽鏈進一步包含連接至CH1的Fc區，所述Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋白重鏈恆定域。在一些實施方案中，本發明的結合蛋白包含第三多肽鏈，所述第三多肽鏈進一步包含連接至CH1的Fc區，所述Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋白重鏈恆定域。在一些實施方案中，本發明的結合蛋白包含第二多肽鏈和第三多肽鏈，所述第二多肽鏈進一步包含連接至CH1的Fc區，所述Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋白重鏈恆定域，所述第三多肽鏈進一步包含連接至CH1的Fc區，所述Fc區包含免疫球蛋白 鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋白重鏈恆定域。
在一些實施方案中，本發明的結合蛋白包括一個或兩個Fc變體。本文所用的術語“Fc變體”是指自天然Fc修飾但還包含針對挽救(salvage)受體，FcRn(新生Fc受體)的結合位點的分子或序列。示例性Fc變體，以及它們與挽救受體的相互作用，是本領域已知的。因此，術語“Fc變體”可以包括自非人天然Fc人源化的分子或序列。此外，天然Fc包含可去除的區域，因為它們提供本發明的抗體樣結合蛋白不需要的結構特徵或生物活性。因此，術語“Fc變體”包括這樣的分子或序列，其中缺少一個或多個天然Fc位點或殘基或其中一個或多個Fc位點或殘基是修飾的，其影響或涉及：(1)二硫鍵形成，(2)與選擇的宿主細胞不相容，(3)在選擇的宿主細胞中表達時的N-末端异質性，(4)糖基化，(5)與補體的相互作用，(6)結合至除挽救受體之外的Fc受體，或(7)抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。
為了改進結合蛋白的產量，在一些實施方案中，可通過“節-入-穴”技術來改造CH3域，所述技術詳細描述于一些實例中，例如國際公開No.WO 96/027011，Ridgway等，1996,Protein Eng.9：617-21；和Merchant等，1998,Nat.Biotechnol.16：677-81中。具體地，對兩個CH3域的相互作用表面進行改造以增加含有這兩個CH3域的兩條重鏈的异二聚體化。(兩條重鏈的)兩個CH3域各自可為“節”，而另一個則為“穴”。導入二硫橋進一步將异二聚體穩定化幷增加產量(Merchant等，1998；Atwell等，1997,J.Mol.Biol.270：26-35)。在具體的實施方案中，所述節在具有單一可變域的第二對多肽上。在其他實施方案中，所述節在具有交叉取向的第一對多肽上。在另一些實施方案中，CH3域不包含節入穴。
在一些實施方案中，本發明的結合蛋白包含第二多肽鏈上的“節”突變和第三多肽鏈上的“穴”突變。在一些實施方案中，本發明的結合蛋白包含第三多肽鏈上的“節”突變和第二多肽鏈上的“穴”突變。在一些實施方案中，所述“節”突變在對應于人IgG1的位置354和任選地366的位置處包含取代，所述位置根據EU索引。在一些實施方案中，所述氨基酸取代為S354C和任選地T366W或 T366Y。在一些實施方案中，所述“節”突變在對應于人IgG1的位置354和366的位置處包含取代，所述位置根據EU索引。在一些實施方案中，所述氨基酸取代為S354C和T366W。在一些實施方案中，所述“穴”突變在對應于人IgG1或IgG4的位置407和任選地349、366和/或368的位置處包含取代，所述位置根據EU索引。在一些實施方案中，所述氨基酸取代為Y407V或Y407T，和任選地Y349C、T366S和/或L368A。在一些實施方案中，所述“穴”突變在對應于人IgG1或IgG4的位置349、366、368和407的位置處包含取代，其根據EU索引。在一些實施方案中，所述氨基酸取代是Y349C、T366S、L368A和Y407V。
在一些實施方案中，所述第二多肽鏈還包含連接至CH1的第一Fc區，所述第一Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋白重鏈恆定域，其中第一Fc區在對應于人IgG1或IgG4的位置366和任選地354的位置處包含氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為T366W或T366Y和任選地S354C；且其中所述第三多肽鏈還包含連接至CH1的第二Fc區，所述第二Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋白重鏈恆定域，其中所述第二Fc區在對應于人IgG1或IgG4的位置407和任選地349、366和/或368的位置處包含氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為Y407V或Y407T及任選地Y349C、T366S和/或L368A。
在一些實施方案中，所述第二多肽鏈還包含連接至CH1的第一Fc區，所述第一Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋白重鏈恆定域，其中第一Fc區在對應于人IgG1或IgG4的位置407和任選地349、366和/或368的位置處包含氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為Y407V或Y407T及任選地Y349C、T366S和/或L368A；且其中所述第三多肽鏈還包含連接至CH1的第二Fc區，所述第二Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋白重鏈恆定域，其中所述第二Fc區在對應于人IgG1或IgG4的位置366和任選地354的位置處包含氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為T366W或T366Y及任選地S354C。
在一些實施方案中，所述第二多肽鏈還包含連接至CH1的第一Fc區，所述第一Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋白重鏈恆定域，其中第一Fc區在對應于人IgG1或IgG4的位置366的位置處包含氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為T366W；且其中所述第三多肽鏈還包含連接至CH1的第二Fc區，所述第二Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋白重鏈恆定域，其中所述第二Fc區在對應于人IgG1或IgG4的位置366、368和/或407的位置處包含氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為T366S、L368A和/或Y407V。
在一些實施方案中，所述第二多肽鏈還包含連接至CH1的第一Fc區，所述第一Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋白重鏈恆定域，其中第一Fc區在對應于人IgG1或IgG4的位置366、368和/或407的位置處包含氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為T366S、L368A和/或Y407V；且其中所述第三多肽鏈還包含連接至CH1的第二Fc區，所述第二Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋白重鏈恆定域，其中所述第二Fc區在對應于人IgG1或IgG4的位置366的位置處包含氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為T366W。
在一些實施方案中，所述第二多肽鏈還包含連接至CH1的第一Fc區，所述第一Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋白重鏈恆定域，其中所述第一Fc區包含與人IgG1或IgG4的位置354和366對應的位置處的氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為S354C和T366W；且其中所述第三多肽鏈還包含連接至CH1的第二Fc區，所述第二Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋白重鏈恆定域，其中所述第二Fc區在對應于人IgG1或IgG4的位置349、366、368和407的位置處包含氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為Y349C、T366S、L368A和Y407V。在一些實施方案中，所述第二多肽鏈還包含連接至CH1的第一Fc區，所述第一Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫蛋白重鏈恆定域，其中所述第一Fc區包含與人IgG1或IgG4的位置349、 366、368和407對應的位置處的氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為Y349C、T366S、L368A和Y407V；且其中所述第三多肽鏈還包含連接至CH1的第二Fc區，所述第二Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋白重鏈恆定域，其中所述第二Fc區在對應于人IgG1或IgG4的位置354和366的位置處包含氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為S354C和T366W。在一些實施方案中，所述第一和/或第二Fc區為人IgG1 Fc區。在一些實施方案中，所述第一和/或第二Fc區為人IgG4 Fc區。
在一些實施方案中，本發明的結合蛋白包含一個或多個改進血清半衰期的突變(參見例如Hinton,P.R等(2006)J.Immunol.176(1)：346-56)。在一些實施方案中，所述突變包括對應于人IgG1或IgG4的位置428和434的位置處的取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為M428L和N434S。在一些實施方案中，結合蛋白包含第二多肽鏈和第三多肽鏈，所述第二多肽鏈進一步包含連接至CH1的第一Fc區，所述第一Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋白重鏈恆定域，所述第三多肽鏈進一步包含連接至CH1的第二Fc區，所述第二Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋白重鏈恆定域，其中所述第一和/或第二Fc區包含與人IgG1或IgG4的位置428和434對應的位置處的氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為M428L和N434S。在一些實施方案中，本發明的結合蛋白包含節和穴突變及一個或多個改進血清半衰期的突變。在一些實施方案中，所述第一和/或第二Fc區是人IgG1 Fc區。在一些實施方案中，所述第一和/或第二Fc區是人IgG4 Fc區。
在一些實施方案中，本發明的結合蛋白包含一個或多個改進穩定性的突變，例如IgG4的鉸鏈區和/或二聚體接合點的突變(參見例如Spiess,C等(2013)J.Biol.Chem.288：26583-26593)。在一些實施方案中，所述突變包含對應于人IgG4的位置228和409的位置處的取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為S228P和R409K。在一些實施方案中，所述結合蛋白包含第二多肽鏈和第三多肽鏈，所述第二多肽鏈進一步包含連接至CH1的第一Fc區，所述第一Fc區包含 免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋白重鏈恆定域，所述第三多肽鏈進一步包含連接至CH1的第二Fc區，所述第二Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋白重鏈恆定域；其中所述第一和第二Fc區是人IgG4 Fc區；且其中所述第一和第二Fc區各自包含與人IgG4的位置228和409對應的位置處的氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為S228P和R409K。在一些實施方案中，本發明的結合蛋白包含節和穴突變及一個或多個改進穩定性的突變。在一些實施方案中，所述第一和/或第二Fc區是人IgG4 Fc區。
在一些實施方案中，本發明的結合蛋白包含一個或多個改進純化的突變，例如通過調節針對純化試劑的親和力。例如，已知异二聚化結合蛋白可以從其同二聚化形式選擇性地純化出來，如果該异二聚化形式的兩個Fc區含有降低或消除對蛋白A的結合的突變的話，這是由于與任一同二聚化形式相比，异二聚化形式會針對基于蛋白A的純化具有中等的親和力，幷能從蛋白A選擇性洗脫，例如通過使用不同的pH(參見例如Smith,E.J.等(2015)Sci.Rep.5：17943)。在一些實施方案中，所述突變包含與人IgG1或IgG4的位置435和436對于的位置處的取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為H435R和Y436F。在一些實施方案中，結合蛋白包含第二多肽鏈和第三多肽鏈，所述第二多肽鏈進一步包含連接至CH1的第一Fc區，所述第一Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋白重鏈恆定域，所述第三多肽鏈進一步包含連接至CH1的第二Fc區，所述第二Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋白重鏈恆定域；且其中第一和第二Fc區僅有一個在對應于人IgG1或IgG4的位置435和436的位置處包含氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為H435R和Y436F。在一些實施方案中，本發明的結合蛋白包含節和穴突變及一個或多個改進純化的突變。在一些實施方案中，所述第一和/或第二Fc區是人IgG1 Fc區。在一些實施方案中，所述第一和/或第二Fc區是人IgG4 Fc區。
在一些實施方案中，本發明的結合蛋白包含一個或多個降低效應功能的突變，例如Fc受體介導的抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)、補體依賴性細胞毒性 作用(CDC)和/或抗體依賴性細胞毒性作用(ADCC)。在一些實施方案中，所述第二多肽鏈還包含連接至CH1的第一Fc區，所述第一Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋白重鏈恆定域；其中所述第三多肽鏈還包含連接至CH1的第二Fc區，所述第二Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋白重鏈恆定域；其中所述第一和第二Fc區是人IgG1 Fc區；且其中所述第一和第二Fc區各自包含對應于人IgG1的位置234和235的位置處的氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為L234A和L235A。在一些實施方案中，所述第二和第三多肽鏈的Fc區是人IgG1 Fc區，且其中所述Fc區各自包含對應于人IgG1的位置234和235的位置處的氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為L234A和L235A。在一些實施方案中，所述第二多肽鏈還包含連接至CH1的第一Fc區，所述第一Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋白重鏈恆定域；其中所述第三多肽鏈還包含連接至CH1的第二Fc區，所述第二Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋白重鏈恆定域；其中所述第一和第二Fc區是人IgG1 Fc區；且其中所述第一和第二Fc區各自包含對應于人IgG1的位置234、235、329的位置處的氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為L234A、L235A和P329A。在一些實施方案中，所述第二和第三多肽鏈的Fc區是人IgG1 Fc區，且其中所述Fc各自包含對應于人IgG1的位置234、235和329的位置處的氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為L234A、L235A和P329A。在一些實施方案中，所述突變包含對應于人IgG4的位置234和235的位置處的取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為F234A和L235A。在一些實施方案中，所述結合蛋白包含第二多肽鏈和第三多肽鏈，所述第二多肽鏈進一步包含連接至CH1的第一Fc區，所述第一Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋白重鏈恆定域，所述第三多肽鏈進一步包含連接至CH1的第二Fc區，所述第二Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋白重鏈恆定域；且其中所述第一和第二Fc區各自包含與人IgG4的位置234和235對應的位置處的氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為F234A和 L235A。在一些實施方案中，本發明的結合蛋白包含節和穴突變及一個或多個降低效應功能的突變。在一些實施方案中，所述第一和/或第二Fc區是人IgG1 Fc區。在一些實施方案中，所述第一和/或第二Fc區是人IgG4 Fc區。關于位置329處的Fc突變的進一步描述，參見例如Shields,R.L等(2001)J.Biol.Chem.276：6591-6604和WO1999051642。
在一些實施方案中，前文所述的突變類型可以任何順序或組合進行組合。例如，本發明的結合蛋白可包含兩個或更多個“節”和“穴”突變，一個或多個改進血清半衰期的突變，一個或多個改進IgG4穩定性的突變，一個或多個改進純化的突變，和/或一個或多個降低效應功能的突變，如上文所述。
在一些實施方案中，本發明的結合蛋白包含：包含λCL域的第一多肽鏈；包含對應于人IgG1的位置354和366的位置處的氨基酸取代的第二多肽鏈的CH3域，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為S354C和T366W；包含對應于人IgG1的位置349、366、368、407、435和436的位置處的氨基酸取代的第三多肽鏈的CH3域，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為Y349C、T366S、L368A、Y407V、H435R和Y436F；和包含κCL域的第四多肽鏈。在一些實施方案中，所述第一多肽鏈包含λCL域；其中所述第三多肽鏈的CH3域在對應于人IgG1的位置354和366的位置處包含氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為S354C和T366W；其中所述第二多肽鏈的CH3域在對應于人IgG1的位置349、366、368、407、435和436的位置處包含氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為Y349C、T366S、L368A、Y407V、H435R和Y436F；且其中所述第四多肽鏈包含κCL域。在一些實施方案中，所述第一多肽鏈包含λCL域；其中所述第二多肽鏈的CH3域在對應于人IgG1的位置354、366、435和436的位置處包含氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為S354C、T366W、H435R和Y436F；其中所述第三多肽鏈的CH3域在對應于人IgG1的位置349、366、368和407的位置處包含氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為Y349C、T366S、L368A和Y407V；且其中第四多肽鏈包含κCL域。在一些 實施方案中，所述第一多肽鏈包含κCL域；其中所述第二多肽鏈的CH3域在對應于人IgG1的位置354和366的位置處包含氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為S354C和T366W；其中所述第三多肽鏈的CH3域在對應于人的位置349、366、368、407、435和436的位置處包含氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為Y349C、T366S、L368A、Y407V、H435R和Y436F；且其中第四多肽鏈包含λCL域。
在一些實施方案中，本發明的結合蛋白通過蛋白A親和色譜、κ輕鏈親和色譜(例如使用KappaSelect樹脂根據製造商的說明進行；GE Healthcare)和任選地λ輕鏈親和色譜(例如使用LambdaFabSelect樹脂根據製造商的說明進行；GE Healthcare)加以純化。在一些實施方案中，本發明的結合蛋白通過蛋白A親和色譜、λ輕鏈親和色譜(例如使用LambdaFabSelect樹脂根據製造商的說明進行；GE Healthcare)和任選地κ輕鏈親和色譜(例如使用KappaSelect樹脂根據製造商的說明進行；GE Healthcare)加以純化。在一些實施方案中，結合蛋白包含兩個Fc區，其各自包含CH3域，且所述CH3域僅有一個在對應于人IgG1或IgG4的位置435和436的位置處包含氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為H435R和Y436F。在一些實施方案中，本發明的結合蛋白通過按順序為蛋白A親和色譜，然後是κ輕鏈親和色譜(例如使用KappaSelect樹脂根據製造商的說明進行；GE Healthcare)，然後是任選的λ輕鏈親和色譜(例如使用LambdaFabSelect樹脂根據製造商的說明進行；GE Healthcare)加以純化。在一些實施方案中，本發明的結合蛋白通過按順序為蛋白A親和色譜，然後是λ輕鏈親和色譜(例如使用LambdaFabSelect樹脂根據製造商的說明進行；GE Healthcare)，然後是任選的κ輕鏈親和色譜(例如使用KappaSelect樹脂根據製造商的說明進行；GE Healthcare)加以純化。例如在一些實施方案中，將結合蛋白與蛋白A(或其衍生物)接觸，幷在適于從包含0或2個含H435R和Y436F氨基酸取代的CH3域的結合蛋白分離出該結合蛋白的條件下從蛋白A洗脫，將結合蛋白與κ輕鏈親和介質(例如KappaSelect樹脂中所用的；GE Healthcare)接觸，幷在適于從僅包含λCL域的結 合蛋白分離出該結合蛋白的條件下從κ輕鏈親和介質洗脫(例如根據製造商的說明書)。適于蛋白A洗脫的條件是本領域已知的，包括但不限于從pH4.5-2.8逐步洗脫梯度。在一些實施方案中，在從κ輕鏈親和介質洗脫後，將所述結合蛋白與λ輕鏈親和介質(例如LambdaFabSelect樹脂中所用的；GE Healthcare)接觸，幷在適于從僅包含κCL域的結合蛋白分離出該結合蛋白的條件下從λ輕鏈親和介質洗脫(例如根據製造商的說明書)。在一些實施方案中，用HIC色譜來檢測本發明的結合蛋白。在一些實施方案中，所述結合蛋白包含：包含λCL域的第一多肽鏈；在對應于人IgG1或IgG4的位置354和366的位置處包含氨基酸取代的第二多肽鏈的CH3域，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為S354C和T366W；在對應于人IgG1或IgG4的位置349、366、368、407、435和436的位置處包含氨基酸取代的第三多肽鏈的CH3域，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為Y349C、T366S、L368A、Y407V、H435R和Y436F；和包含κCL域的第四多肽鏈。
在一些實施方案中，本文所述三特異性結合蛋白的CH1、CH2、CH3和CL可為結合蛋白1-53的任何CH1、CH2、CH3和CL序列。
核酸
采用標準重組DNA方法來構建編碼形成所述結合蛋白的多肽的多核苷酸，將這些多核苷酸摻入重組表達載體中，幷將這類載體導入宿主細胞中。參見例如Sambrook等，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第三版)。酶促反應和純化技術可按照生產商的說明書、按本領域通常實現的或按本文描述的進行。除提供特定的定義外，與本文所述分析化學、合成有機化學及醫學和製藥化學的實驗室程序和技術聯用的術語是本領域熟知和常用的術語。類似地，常規技術可用於化學合成、化學分析、藥物製備、製劑化、遞送和患者治療。
本發明的其他態樣涉及分離的核酸分子，其包含編碼本文所述任何結合多肽的核苷酸序列。在一些實施方案中，所述分離核酸可操作地連接至异源性啟動子以指導編碼結合蛋白的核酸序列的轉錄。啟動子可指指導核酸轉錄的核酸 控制序列。當第一核酸序列置于與第二核酸序列的功能性聯繫中時，則第一核酸序列可操作地連接至第二核酸序列。例如，如果啟動子影響該編碼序列的轉錄或表達，則所述啟動子可操作地連接至結合蛋白的編碼序列。啟動子的實例包括但不限于獲取自病毒基因組的啟動子(如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細胞病毒、逆轉錄病毒、乙型肝炎病毒、猿猴病毒40(SV40)等等)，來自异源真核啟動子(如肌動蛋白啟動子、免疫球蛋白啟動子、來自熱休克啟動子，等等)，CAG-啟動子(Niwa等，Gene 108(2)：193-9,1991)，磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動子，四環素誘導型啟動子(Masui等，Nucleic Acids Res.33：e43,2005)，lac系統，trp系統，tac系統，trc系統，噬菌體λ的主要操縱子和啟動子區，3-磷酸甘油酸激酶的啟動子，酵母酸性磷酸酶的啟動子，和酵母α-交配因子的啟動子。編碼本發明結合蛋白的多核苷酸可以受到如下啟動子的控制：組成型啟動子、誘導型啟動子、或本文描述的任何其他合適的啟動子或本領域技術人員容易公認的其他合適的啟動子。
在一些實施方案中，分離核酸被摻入至載體中。在一些實施方案中，所述載體是表達載體。表達載體可包括一個或多個可操作地連接至待表達多核苷酸的調控序列。術語“調控序列”包括啟動子、增强子和其他表達控制元件(例如多腺苷酸化信號)。合適的增强子的實例包括但不限于來自哺乳動物基因(例如球蛋白，彈性蛋白酶，白蛋白，甲胎蛋白(α-fetoprotein)，胰島素等)的增强子序列，以及來自真核細胞病毒的增强子序列(如位于複製起點的晚期側(late side)的SV40增强子(bp 100-270)，巨細胞病毒早期啟動子增强子，如位于複製起點的晚期側的多瘤病毒增强子，腺病毒增强子等)。合適的載體的實例可包括例如質粒、粘粒、附加體、轉座子和病毒載體(例如腺病毒，牛痘病毒，辛德畢斯病毒(Sindbis-viral)，麻疹病毒，疱疹病毒，慢病毒，逆轉錄病毒，腺相關病毒載體等)。表達載體可用於轉染宿主細胞，如例如細菌細胞、酵母細胞、昆蟲細胞和哺乳動物細胞。能在宿主中表達和複製的生物功能性病毒和質粒DNA載體是本領域已知的，幷能用於轉染任何目的細胞。
本發明的其他態樣涉及包含一個或多個載體的載體系統，其編碼本文所述的任意結合蛋白的第一、第二、第三和第四多肽鏈。在一些實施方案中，所述載體系統包含編碼結合蛋白的第一多肽鏈的第一載體，編碼結合蛋白的第二多肽鏈的第二載體，編碼結合蛋白的第三多肽鏈的第三載體，和編碼結合蛋白的第四多肽鏈的第四載體。在一些實施方案中，載體系統包含編碼結合蛋白的第一和第二多肽鏈的第一載體，以及編碼結合蛋白的第三和第四多肽鏈的第二載體。在一些實施方案中，載體系統包含編碼結合蛋白的第一和第三多肽鏈的第一載體，以及編碼結合蛋白的第二和第四多肽鏈的第二載體。在一些實施方案中，載體系統包含編碼結合蛋白的第一和第四多肽鏈的第一載體，以及編碼結合蛋白的第二和第三多肽鏈的第二載體。在一些實施方案中，載體系統包含編碼結合蛋白的第一、第二、第三和第四多肽鏈的第一載體。載體系統的一個或多個載體可為本文所述的任何載體。在一些實施方案中，所述一個或多個載體是表達載體。
分離的宿主細胞
本發明的其他態樣涉及包含一個或多個本文所述分離的多核苷酸、載體和/或載體系統的分離的宿主細胞。在一些實施方案中，宿主細胞是細菌細胞(例如大腸杆菌(E.coli)細胞)。在一些實施方案中，宿主細胞是酵母細胞(例如釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞)。在一些實施方案中，宿主細胞是昆蟲細胞。昆蟲細胞的實例可以包括例如果蠅(Drosophila)細胞(例如S2細胞)，粉紋夜蛾(Trichoplusiani)細胞(例如High FiveTM細胞)，和草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞(例如Sf21或Sf9細胞)。在一些實施方案中，宿主細胞是哺乳動物細胞。哺乳動物宿主細胞的實例可包括例如人胚腎細胞(例如293或用於懸浮培養生長的293細胞亞純系)，Expi293TM細胞，CHO細胞，幼倉鼠腎細胞(例如BHK，ATCC CCL 10)，小鼠sertoli細胞(例如TM4細胞)，猴腎細胞(例如CV1 ATCC CCL 70)，非洲綠猴腎細胞(例如VERO-76，ATCC CRL-1587)，人宮頸癌細胞(例如HELA，ATCC CCL 2)，犬腎細胞(例如MDCK，ATCC CCL 34)，布法羅大鼠肝細胞(例如BRL 3A，ATCC CRL 1442)，人肺細胞(例如W138，ATCC CCL 75)，人肝細胞(例如Hep G2，HB 8065)，小鼠乳腺腫瘤細胞(例如MMT 060562，ATCC CCL51)，TRI細胞，MRC 5細胞，FS4細胞，人肝細胞瘤細胞系(例如Hep G2)，及骨髓瘤細胞(例如NS0和Sp2/0細胞)。
本發明的其他態樣涉及生產本文所述的任何結合蛋白的方法。在一些實施方案中，所述方法包括a)在適合宿主細胞表達所述結合蛋白的條件下培養包含分離核酸、載體和/或載體系統(例如本文所述的任何分離核酸、載體和/或載體系統)的宿主細胞(例如本文所述的任何宿主細胞)；和b)從宿主細胞分離所述結合蛋白。在表達蛋白的條件下培養宿主細胞的方法是本領域普通技術人員已知的。從培養的宿主細胞分離蛋白的方法是本領域普通技術人員已知的，其包括例如通過親和色譜(例如兩步親和色譜法，其包括蛋白A親和色譜，然後是大小排阻色譜)進行。
結合蛋白的用途
所述結合蛋白可應用於任何已知的測定方法，如競爭性結合測定法、直接和間接夾心測定法和用於一種或多種靶抗原的檢測和定量的免疫沉澱測定法。所述結合蛋白以適于所應用的測定方法的親和力結合一個或多個靶抗原。
對于診斷應用，在一些實施方案中，可用可檢測模塊來標記結合蛋白。可檢測模塊可為能够直接或間接產生可檢測信號的任一種。例如，可檢測模塊可為放射性同位素，如3H、14C、32P、35S、125I、99Tc、111In、或67Ga；螢光或化學發光化合物，如异硫氰酸螢光素、羅丹明、或螢光素；或酶，如鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、或辣根過氧化物酶。
所述結合蛋白還可用於體內成像。可將用可檢測模塊標記的結合蛋白投予于動物，優選為投予至血液中，幷測定宿主中帶標記的抗體的存在和定位。可用動物中(無論是通過核磁共振、放射學、或本領域所知的其他方法)可檢測的任何模塊來標記結合蛋白。
結合蛋白還能用於細胞活化，腫瘤靶向，細胞因子活性的中和，病毒感染 的中和，多重信號傳導事件的組合，以治療癌症，關節炎和/或炎症性疾病。例如在一些實施方案中，結合蛋白特異性結合一個、兩個或三個選自下組的抗原靶標：A2AR、APRIL、ATPD酶、BAFF、BAFFR、BCMA、BlyS、BTK、BTLA、B7DC、B7H1、B7H4(也稱為VTCN1)、B7H5、B7H6、B7H7、B7RP1、B7-4、C3、C5、CCL2(也稱為MCP-1)、CCL3(也稱為MIP-1a)、CCL4(也稱為MIP-1b)、CCL5(也稱為RANTES)、CCL7(也稱為MCP-3)、CCL8(也稱為mcp-2)、CCL11(也稱為嗜酸性粒細胞趨化因子)、CCL15(也稱為MIP-1d)、CCL17(也稱為TARC)、CCL19(也稱為MIP-3b)、CCL20(也稱為MIP-3a)、CCL21(也稱為MIP-2)、CCL24(也稱為MPIF-2/嗜酸性粒細胞趨化因子-2)、CCL25(也稱為TECK)、CCL26(也稱為嗜酸性粒細胞趨化因子-3)、CCR3、CCR4、CD3、CD19、CD20、CD23(也稱為FCER2)、CD24、CD27、CD28、CD38、CD39、CD40、CD70、CD80(也稱為B7-1)、CD86(也稱為B7-2)、CD122、CD137(也稱為41BB)、CD137L、CD152(也稱為CTLA4)、CD154(也稱為CD40L)、CD160、CD272、CD273(也稱為PDL2)、CD274(也稱為PDL1)、CD275(也稱為B7H2)、CD276(也稱為B7H3)、CD278(也稱為ICOS)、CD279(也稱為PD-1)、CDH1(也稱為E-鈣粘素)、殼多糖酶、CLEC9、CLEC91、CRTH2、CSF-1(也稱為M-CSF)、CSF-2(也稱為GM-CSF)、CSF-3(也稱為GCSF)、CX3CL1(也稱為SCYD1)、CXCL12(也稱為SDF1)、CXCL13、CXCR3、DNGR-1、外核苷三磷酸鹽二磷酸水解酶1、EGFR、ENTPD1、FCER1A、FCER1、FLAP、Gi24、GITR、GITRL、GM-CSF、Her2、HHLA2、HMGB1、HVEM、ICOSLG、IDO、IFNα、IgE、IGF1R、IL2Rβ、IL1、IL1A、IL1B、IL1F10、IL2、IL4、IL4Ra、IL5、IL5R、IL6、IL7、IL7Ra、IL8、IL9、IL9R、IL10、rhIL10、IL12、IL13、IL13Ra1、IL13Ra2、IL15、IL17、IL17Rb、IL18、IL22、IL23、IL25、IL27、IL33、IL35、ITGB4(也稱為b4整合素)、ITK、KIR、LAG3、LAMP1、瘦素、LPFS2、II類MHC、NCR3LG1、NKG2D、NTPD酶-1、OX40、OX40L、PD- 1H、血小板受體、S152、SISP1、SLC、SPG64、ST2、Syk激酶、TACI、TDO、T14、TIGIT、TIM3、TLR、TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、TNFa、TNFRSF7、Tp55、TREM1、TSLP、TSLPR、TWEAK、VEGF、VISTA、Vstm3、WUCAM和XCR1(也稱為GPR5/CCXCR1)。在一些實施方案中，上述抗原靶標的一個或多個是人抗原靶標。
在一些實施方案中，將本發明的結合蛋白投予于對其有需要的患者，用於治療或預防癌症。例如，在一些實施方案中，結合蛋白包含一個特異性結合T細胞表面蛋白的抗原結合位點和另一個特異性結合腫瘤靶蛋白的抗原結合位點(例如特異性結合T細胞表明蛋白的2個抗原結合位點和1個特異性結合腫瘤靶蛋白的抗原結合位點，或2個特異性結合腫瘤靶蛋白的抗原結合位點和1個特異性結合T細胞表面蛋白的抗原結合位點)。在一些實施方案中，結合蛋白包含特異性結合CD3的抗原結合位點、特異性結合CD28的抗原結合位點和特異性結選自下組的腫瘤靶蛋白的抗原結合位點：CD19、CD20、CD38、Her2和LAMP1。在一些實施方案中，所述結合蛋白與化療劑共同投予。在一些實施方案中，所述患者是人。
在一些實施方案中，將本發明的結合蛋白投予于對其有需要的患者，用於治療或預防炎性疾病或病症。在一些實施方案中，所述結合蛋白包含3個抗原結合位點，其各自特異性結合選自IL-4、IL-13和TNFa的細胞因子靶蛋白。在一些實施方案中，所述結合蛋白與抗炎劑共同投予。在一些實施方案中，所述患者是人。
本發明還涉及包含結合蛋白和其他試劑的套組，其可用於檢測生物樣品中的靶抗原水平。此類試劑包括可檢測標記、封閉血清、陽性和陰性對照樣品、以及檢測試劑。在一些實施方案中，套組包含組合物，所述組合物包含本文所述的任何結合蛋白、多核苷酸、載體、載體系統和/或宿主細胞。在一些實施方案中，套組包含容器及標簽或包裝插頁，其位于所述容器上或與容器相連。合適的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、IV溶液袋等。所述容器可由多種材料形 成，如玻璃或塑料。所述容器盛有組合物，所述組合物是單獨的或與另一組合物組合，其對于治療、預防和/或診斷病况是有效的，幷且所述容器可以具有無菌入口(例如所述容器可以是靜脉內溶液袋或小瓶，其具有可由皮下注射針刺穿的塞子)。在一些實施方案中，所述標簽或包裝插頁指示了該組合物用於預防、診斷和/或治療優選的病况。或者或此外，製品或套組還可包含第二(或第三)容器，其包含藥學上可接受的緩衝劑，如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、Ringer's溶液和右旋糖溶液。其還可包括從商業和用戶角度所需的其他材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑、濾器、針和注射器。
結合蛋白治療組合物及其投予
包含結合蛋白的治療性組合物或醫藥組合物在本發明的範圍內。此類治療性組合物或醫藥組合物可包含治療有效量的結合蛋白、或結合蛋白-藥物綴合物，與藥學上或生理學上可接受的製劑(其根據與投予模式的適應性而選出)混合。
可接受的配製材料優選為在所采用的劑量和濃度處對受試者是非毒性的。
所述醫藥組合物可含有用於改變、維持、或保留組合物的例如pH、滲透壓(osmolarity)、粘度、澄清度、顏色、等張性、氣味、無菌度、穩定度、溶解或釋放速率、吸收、或滲透的製劑材料。合適的製劑材料包括但不限于氨基酸(例如甘氨酸、穀氨醯胺、天冬醯胺、精氨酸或賴氨酸)、抗微生物劑、抗氧化劑(例如抗壞血酸、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉)、緩衝劑(例如硼酸鹽、碳酸氫鹽、Tris-HCl、檸檬酸鹽、磷酸鹽或其它有機酸)、填充劑(例如甘露糖醇或甘氨酸)、螯合劑(例如乙二胺四乙酸(EDTA))、絡合劑(例如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-環糊精或羥丙基-β-環糊精)、填料、單糖、二糖和其它碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖或糊精)、蛋白質(例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白)、著色劑、矯味劑和稀釋劑、乳化劑、親水聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮)、低分子量多肽、成鹽平衡離子(例如鈉)、防腐劑(例如苯扎氯銨、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞、苯乙醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或過氧 化氫)、溶劑(例如甘油、丙二醇或聚乙二醇)、糖醇(例如甘露醇或山梨醇)、懸浮劑、表面活性劑或潤濕劑(例如普朗尼克類(pluronics)、PEG、山梨聚糖酯類(sorbitan esters)、聚山梨醇酯類如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80、Triton(曲拉通)、氨丁三醇、卵磷脂、膽固醇或Tyloxapal(四丁酚醛))、穩定增强劑(如蔗糖或山梨醇)、張度增强劑(例如鹼金屬鹵化物(優選為氯化鈉或氯化鉀)或甘露醇山梨醇)、遞送介質、稀釋劑、賦形劑和/或藥學佐劑(參見例如REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES(第18版，A.R.Gennaro編，Mack Publishing Company 1990)和其後續版本，通過提述幷入本文用於任何目的)。
根據例如意欲的投予途徑、遞送形式和所需劑量，技術人員可確定最適醫藥組合物。所述組合物可影響結合蛋白的物理狀態、穩定性、體內釋放速率和體內清除速率。
醫藥組合物中主要的介質或載劑在性質上可為水性的或非水的。例如，合適的注射用介質或載劑可為水、生理鹽水溶液或人工腦脊液，可能補充有用於胃腸外投予的組合物中常見的其它物質。中性緩衝的鹽水或與血清白蛋白混合的鹽水是其它的示例性介質。其它示例性的醫藥組合物包含約pH 7.0-8.5的Tris緩衝液，或約pH 4.0-5.5的乙酸鹽緩衝液，其還可包括山梨醇或合適的代替物。在本發明的一個實施方案中，可通過將所選的具有所需純度的組合物與任選的配製劑混合，來製備呈凍幹餅或水溶液形式的結合蛋白組合物用於儲存。另外，可使用合適的賦形劑(例如蔗糖)，將結合蛋白配置為凍幹物。
可選擇本發明的醫藥組合物用於胃腸外遞送或皮下使用。或者，組合物可選擇用於吸入或用於通過消化道遞送，例如口服。這類藥學上可接受的組合物的製備屬 本領域的技術範圍內。
製劑組分以投予部位可接受的濃度存在。例如，使用緩衝劑使組合物保持在生理pH或在略微較低的pH，通常在約5至約8的pH範圍。
當考慮胃腸外投予時，用於本發明的治療組合物可呈無熱原、胃腸外可接受的水溶液形式，其包含藥學上可接受的介質中的所需結合蛋白。用於胃腸外 注射的特別合適的介質是無菌蒸餾水，其中結合蛋白被配製為適當防腐的無菌等滲溶液。另一種製備物可涉及所需分子與製劑的配製物，所述製劑例如可注射微球、生物可侵蝕粒子、聚合化合物(例如聚乳酸或聚乙醇酸)、小珠或脂質體，其提供產品的控釋或緩釋，然後產品通過積存注射(depot injection)遞送。還可使用透明質酸，其可具有促進維持循環中的持續時間的作用。用於引入所需分子的其它合適方法包括可植入藥物遞送裝置。
在一個實施方案中，醫藥組合物可配製來用於吸入。例如，結合蛋白可配製成幹粉劑用於吸入。結合蛋白吸入溶液還可與推進劑(propellant)配製在一起用於氣霧劑遞送。在又一個實施方案中，可使溶液霧化。
還考慮某些配製物可口服投予。在本發明的一個實施方案中，以這種方式投予的結合蛋白可與或不與常用於固體劑型(例如片劑和膠囊劑)混配的那些載劑配製在一起。例如，膠囊劑可設計成在胃腸道某點上釋放製劑的活性部分，此時生物利用度被最大化且內吸收前降解被最小化。可包括其它作用劑以促進結合蛋白的吸收。還可使用稀釋劑、矯味劑、低熔點蠟、植物油、潤滑劑、懸浮劑、片劑崩解劑和粘合劑。
另一種醫藥組合物可涉及與適于製造片劑的無毒賦形劑混合的有效量的結合蛋白。可通過將片劑溶于無菌水或另一種合適的介質來製備呈單位劑型的溶液劑。合適的賦形劑包括但不限于惰性稀釋劑，例如碳酸鈣、碳酸鈉或碳酸氫鈉、乳糖或磷酸鈣；或粘合劑，例如澱粉、明膠或阿拉伯膠；或潤滑劑例如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。
本發明的其它醫藥組合物對本領域技術人員而言會是顯然的，包括這樣的配製物，所述配製物涉及呈緩釋或控釋配製物的結合蛋白。用於配製各種其它緩釋或控釋方法的技術，例如脂質體載體、生物可蝕解微粒或多孔珠粒和積存注射，也是本領域技術人員已知的。緩釋配製物的其它實例包括呈成型製品形式的半滲透聚合物基質，例如膜或微囊。緩釋基質可包括聚酯、水凝膠、聚乳酸、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸的共聚物、聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)、乙烯 乙酸乙烯酯或聚-D(-)-3-羥基丁酸。緩釋組合物還可包括脂質體，其可通過本領域已知的幾種方法中的任一種製備。
用於體內投予的本發明的醫藥組合物通常必須是無菌的。這可通過經無菌濾膜過濾實現。當組合物是凍幹的時，采用該方法的滅菌可在凍幹和複溶之前或之後進行。用於胃腸外投予的組合物可以凍幹形式保存或在溶液中保存。另外，通常將胃腸外組合物裝入具有無菌入口的容器中，例如靜脉內溶液袋或小瓶，其具有可通過皮下注射針刺穿的塞子。
一旦醫藥組合物製成，便可將其作為溶液、懸液、凝膠、乳液、固體或作為脫水或凍幹粉劑儲存在無菌小瓶中。這類製劑可以即用形式或以需要在投予前複溶的形式(例如凍幹)儲存。
本發明還包括用於產生單劑投予單位的套組。套組可各含有具有乾燥蛋白質的第一容器和具有含水製劑的第二容器。含有單室和多室預填藥注射器(例如液體注射器和Lyosyringes)的套組也包括在本發明的範圍內。
待治療性應用的結合蛋白醫藥組合物的有效量取决于例如治療背景和目的。本領域的技術人員會瞭解，用於治療的合適劑量水平會因此部分地根據所遞送的分子、使用結合蛋白所針對的適應症、投予途徑和患者尺寸(體重、體表面或器官大小)和狀况(年齡和一般健康狀况)而變化。因此，臨床醫師可滴定劑量和修改投予途徑以獲得最佳治療效果。
投予頻率會取决于待使用製劑中的結合蛋白的藥代動力學參數。通常，臨床醫師會投予組合物直至達到獲得所需效果的劑量。組合物因此可如下投予：作為單劑、隨時間推移作為兩劑或更多劑(其可含或不含相同量的所需分子)或作為經植入裝置或導管的連續輸注。適當劑量的進一步改進按常規由本領域普通技術人員進行，這屬他們常規進行的任務的範圍內。合適的劑量可通過利用合適的劑量-響應數據來確定。
醫藥組合物的投予途徑遵循已知方法，例如口服；通過經由靜脉內、腹膜內、大腦內(實質內)、腦室內、肌內、眼內、動脉內、門靜脉內(intraportal)或 病灶內途徑的注射；通過緩釋系統；或通過植入裝置。需要時，通過推注或通過連續輸注或通過植入裝置投予組合物。
還可通過植入其中已吸附或包封所需分子的膜、海綿或其它合適的材料，來局部投予組合物。在使用植入裝置時，可將裝置植入任何合適的組織或器官中，幷且所需分子的遞送可以是通過擴散、定時釋放推注或連續投予。
在一些實施方案中，本發明涉及預防和/或治療患者中的增生性疾病或病症(例如癌症)的方法。在一些實施方案中，所述方法包括對該患者投予治療有效量的本文所述結合蛋白的至少一種。在一些實施方案中，所述患者是人。在一些實施方案中，所述至少一種結合蛋白與抗癌治療(例如本領域已知的任何抗癌治療)組合投予。在一些實施方案中，所述至少一種結合蛋白在一種或多種抗癌治療之前投予。在一些實施方案中，所述至少一種結合蛋白與一種或多種抗癌治療同時投予。在一些實施方案中，所述至少一種結合蛋白在一種或多種抗癌治療之後投予。
在一些實施方案中，本發明涉及預防和/或治療炎性疾病或病症(例如癌症)的方法。在一些實施方案中，所述方法包括對患者投予治療有效量的本文所述結合蛋白的至少一種。在一些實施方案中，所述患者是人。在一些實施方案中，所述至少一種結合蛋白與抗炎治療(例如本領域已知的任何抗炎治療)組合投予。在一些實施方案中，所述至少一種結合蛋白在一種或多種抗炎治療之前投予。在一些實施方案中，所述至少一種結合蛋白與一種或多種抗炎治療同時投予。在一些實施方案中，所述至少一種結合蛋白在一種或多種抗炎治療之後投予。
在不限制本發明的前提下，下文描述了一些本發明的實施方案用於說明目的。
項1：一種結合蛋白，其包含形成3個抗原結合位點的4條多肽鏈，所述3個抗原結合位點特異性結合一個或多個靶蛋白，其中第一多肽鏈包含如下式表示的結構： VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽鏈包含如下式表示的結構：VH1-L3-VH2-L4-CH1 [II]
且第三多肽鏈包含如下式表示的結構：VH3-CH1 [III]
且第四多肽鏈包含如下式表示的結構：VL3-CL [IV]
其中：VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變域；VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變域；VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變域；VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變域；VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變域；VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變域；CL是免疫球蛋白輕鏈恆定域；CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恆定域；且L1、L2、L3和L4是氨基酸連接子；且其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對。
項2：一種結合蛋白，其包含形成3個抗原結合位點的4條多肽鏈，所述3個抗原結合位點特異性結合一個或多個靶蛋白，其中第一多肽鏈包含如下式表示的結構：VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽鏈包含如下式表示的結構：VH1-L3-VH2-L4-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [II]
且第三多肽鏈包含如下式表示的結構：VH3-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [III]
且第四多肽鏈包含如下式表示的結構：VL3-CL [IV]
其中：VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變域；VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變域；VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變域；VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變域；VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變域；VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變域；CL是免疫球蛋白輕鏈恆定域；CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恆定域；CH2是免疫球蛋白CH2重鏈恆定域；CH3是免疫球蛋白CH3重鏈恆定域；鉸鏈是連接CH1和CH2域的免疫球蛋白鉸鏈區；且L1、L2、L3和L4是氨基酸連接子；且其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對。
項3：項1的結合蛋白，其中所述第二多肽鏈還包含連接至CH1的Fc區，所述Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋白重鏈恆定域。
項4：項1-3任一項的結合蛋白，其中L1、L2、L3、或L4的至少一個獨立地長度為0個氨基酸。
項5：項1-3任一項的結合蛋白，其中L1、L2、L3、或L4各自獨立地長度為至少1個氨基酸。
項6：項1-3任一項的結合蛋白，其中L1、L2、L3、或L4各自獨立地包含選自由下列組成之群組的序列：GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：104)，GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：105)，S，RT，TKGPS(SEQ ID NO：106)，GQPKAAP(SEQ ID NO：175)，和GGSGSSGSGG(SEQ ID NO：148)。
項7：項1-5任一項的結合蛋白，其中(a)L1包含序列GQPKAAP(SEQ ID NO：175)，L2包含序列TKGPS(SEQ ID NO：106)，L3包含序列S，且L4包含序列RT；(b)L1包含序列GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：104)，L2包含序列GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：104)，L3長度為0個氨基酸，且L4長度為0個氨基酸；(c)L1包含序列GGSGSSGSGG(SEQ ID NO：148)，L2包含序列GGSGSSGSGG(SEQ ID NO：148)，L3長度為0個氨基酸，且L4長度為0個氨基酸；或(d)L1包含序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：105)，L2長度為0個氨基酸，L3包含序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：105)，且L4長度為0個氨基酸。
項8：項1-7任一項的結合蛋白，其中所述結合蛋白是三特異性的且能够特異性結合3個不同的抗原靶標。
項9：權利要求1-8任一項的結合蛋白，其中所述結合蛋白特異性結合3個靶蛋白，所述靶蛋白對應于T細胞上的2個靶蛋白以及1個腫瘤靶蛋白。
項10：項9的結合蛋白，其中T細胞上的所述靶蛋白之一是CD3。
項11：項9或項10的結合蛋白，其中T細胞上的所述靶蛋白之一是CD28。
項12：項9-11任一項的結合蛋白，其中所述腫瘤靶蛋白是CD38。
項1：項1-8任一項的結合蛋白，其中所述結合蛋白特異性結合3個靶蛋白，所述靶蛋白對應于T細胞上的2個靶蛋白以及1個選自下組的靶蛋白：A2AR、APRIL、ATPD酶、BAFF、BAFFR、BCMA、BlyS、BTK、BTLA、B7DC、B7H1、B7H4、B7H5、B7H6、B7H7、B7RP1、B7-4、C3、C5、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL15、CCL17、CCL19、CCL20、CCL21、CCL24、CCL25、CCL26、CCR3、CCR4、CD3、CD19、CD20、CD23、CD24、CD27、CD28、CD38、CD39、CD40、CD70、 CD80、CD86、CD122、CD137、CD137L、CD152、CD154、CD160、CD272、CD273、CD274、CD275、CD276、CD278、CD279、CDH1、殼多糖酶、CLEC9、CLEC91、CRTH2、CSF-1、CSF-2、CSF-3、CX3CL1、CXCL12、CXCL13、CXCR3、DNGR-1、外核苷三磷酸鹽二磷酸水解酶1、EGFR、ENTPD1、FCER1A、FCER1、FLAP、Gi24、GITR、GITRL、GM-CSF、Her2、HHLA2、HMGB1、HVEM、ICOSLG、IDO、IFNα、IgE、IGF1R、IL2Rβ、IL1、IL1A、IL1B、IL1F10、IL2、IL4、IL4Ra、IL5、IL5R、IL6、IL7、IL7Ra、IL8、IL9、IL9R、IL10、rhIL10、IL12、IL13、IL13Ra1、IL13Ra2、IL15、IL17、IL17Rb、IL18、IL22、IL23、IL25、IL27、IL33、IL35、ITGB4、ITK、KIR、LAG3、LAMP1、瘦素、LPFS2、II類MHC、NCR3LG1、NKG2D、NTPD酶-1、OX40、OX40L、PD-1H、血小板受體、S152、SISP1、SLC、SPG64、ST2、Syk激酶、TACI、TDO、T14、TIGIT、TIM3、TLR、TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、TNFa、TNFRSF7、Tp55、TREM1、TSLP、TSLPR、TWEAK、VEGF、VISTA、Vstm3、WUCAM和XCR1。
項14：項1-13任一項的結合蛋白，其中所述結合蛋白能够抑制一個或多個靶蛋白的功能。
項15：項14的結合蛋白，其中所述一個或多個靶蛋白選自由下列組成之群組：A2AR、APRIL、ATPD酶、BAFF、BAFFR、BCMA、BlyS、BTK、BTLA、B7DC、B7H1、B7H4、B7H5、B7H6、B7H7、B7RP1、B7-4、C3、C5、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL15、CCL17、CCL19、CCL20、CCL21、CCL24、CCL25、CCL26、CCR3、CCR4、CD3、CD19、CD20、CD23、CD24、CD27、CD28、CD38、CD39、CD40、CD70、CD80、CD86、CD122、CD137、CD137L、CD152、CD154、CD160、CD272、CD273、CD274、CD275、CD276、CD278、CD279、CDH1、殼多糖酶、CLEC9、CLEC91、CRTH2、CSF-1、CSF-2、CSF-3、 CX3CL1、CXCL12、CXCL13、CXCR3、DNGR-1、外核苷三磷酸鹽二磷酸水解酶1、EGFR、ENTPD1、FCER1A、FCER1、FLAP、Gi24、GITR、GITRL、GM-CSF、Her2、HHLA2、HMGB1、HVEM、ICOSLG、IDO、IFNα、IgE、IGF1R、IL2Rβ、IL1、IL1A、IL1B、IL1F10、IL2、IL4、IL4Ra、IL5、IL5R、IL6、IL7、IL7Ra、IL8、IL9、IL9R、IL10、rhIL10、IL12、IL13、IL13Ra1、IL13Ra2、IL15、IL17、IL17Rb、IL18、IL22、IL23、IL25、IL27、IL33、IL35、ITGB4、ITK、KIR、LAG3、LAMP1、瘦素、LPFS2、II類MHC、NCR3LG1、NKG2D、NTPD酶-1、OX40、OX40L、PD-1H、血小板受體、S152、SISP1、SLC、SPG64、ST2、Syk激酶、TACI、TDO、T14、TIGIT、TIM3、TLR、TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、TNFa、TNFRSF7、Tp55、TREM1、TSLP、TSLPR、TWEAK、VEGF、VISTA、Vstm3、WUCAM和XCR1。
項16：一種結合蛋白，其包含形成3個抗原結合位點的4條多肽鏈，其中第一多肽鏈包含如下式表示的結構：VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽鏈包含如下式表示的結構：VH1-L3-VH2-L4-CH1 [II]
且第三多肽鏈包含如下式表示的結構：VH3-CH1 [III]
且第四多肽鏈包含如下式表示的結構：VL3-CL [IV]
其中：VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變域；VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變域；VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變域；VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變域； VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變域；VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變域；CL是免疫球蛋白輕鏈恆定域；CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恆定域；且L1、L2、L3和L4是氨基酸連接子；其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對；其中：(a)VL1、VL2和VL3各自獨立地包含如SEQ ID NO：151、153、155、157、159、161、163、165和167任一項所示的可變域序列；或(b)VL1、VL2和VL3各自獨立地包含輕鏈互補决定區，其包含如SEQ ID NO：43-59、123-125、138-140和149任一項所示的氨基酸序列；且其中：(a)VH1、VH2和VH3各自獨立地包含如SEQ ID NO：150、152、154、156、158、160、162、164和166的任一項所示的可變域序列；或(b)VH1、VH2和VH3各自獨立地包含可變域的重鏈互補决定區，其包含如SEQ ID NO：25-42、120-122和126-128任一項所示的氨基酸序列。
項17：一種結合蛋白，其包含形成3個抗原結合位點的4條多肽鏈，其中第一多肽鏈包含如下式表示的結構：VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽鏈包含如下式表示的結構：VH1-L3-VH2-L4-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [II]
且第三多肽鏈包含如下式表示的結構：VH3-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [III]
且第四多肽鏈包含如下式表示的結構：VL3-CL [IV]
其中： VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變域；VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變域；VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變域；VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變域；VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變域；VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變域；CL是免疫球蛋白輕鏈恆定域；CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恆定域；CH2是免疫球蛋白CH2重鏈恆定域；CH3是免疫球蛋白CH3重鏈恆定域；鉸鏈是連接CH1和CH2域的免疫球蛋白鉸鏈區；且L1、L2、L3和L4是氨基酸連接子；且其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對；其中：(a)VL1、VL2和VL3各自獨立地包含如SEQ ID NO：151、153、155、157、159、161、163、165和167任一項所示的可變域序列；或(b)VL1、VL2和VL3各自獨立地包含輕鏈互補决定區，其包含如SEQ ID NO：43-59、123-125、138-140和149任一項所示的氨基酸序列；且其中：(a)VH1、VH2和VH3各自獨立地包含如SEQ ID NO：150、152、154、156、158、160、162、164和166的任一項所示的可變域序列；或(b)VH1、VH2和VH3各自獨立地包含可變域的重鏈互補决定區，其包含如SEQ ID NO：25-42、120-122和126-128任一項所示的氨基酸序列。
項18：項16的結合蛋白，其中所述第二多肽鏈還包含連接至CH1的Fc區，所述Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋白重鏈恆定域。
項19：項16-18任一項的結合蛋白，其中L1、L2、L3、或L4的至少一個獨立 地長度為0個氨基酸。
項20：項16-18任一項的結合蛋白，其中L1、L2、L3、或L4各自獨立地長度為至少1個氨基酸。
項21：項16-18和20任一項的結合蛋白，其中L1、L2、L3、或L4各自獨立地包含選自由下列組成之群組的序列：GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：104)，GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：105)，S，RT，TKGPS(SEQ ID NO：106)，GQPKAAP(SEQ ID NO：175)，和GGSGSSGSGG(SEQ ID NO：148)。
項22：項16-20任一項結合蛋白，其中(a)L1包含序列GQPKAAP(SEQ ID NO：175)，L2包含序列TKGPS(SEQ ID NO：106)，L3包含序列S，且L4包含序列RT；(b)L1包含序列GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：104)，L2包含序列GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：104)，L3長度為0個氨基酸，且L4長度為0個氨基酸；(c)L1包含序列GGSGSSGSGG(SEQ ID NO：148)，L2包含序列GGSGSSGSGG(SEQ ID NO：148)，L3長度為0個氨基酸，且L4長度為0個氨基酸；或(d)L1包含序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：105)，L2長度為0個氨基酸，L3包含序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：105)，且L4長度為0個氨基酸。
項23：項16-22任一項的結合蛋白，其中：(a)VH1包含：包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：48的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包 含：包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列的CDR-L3；(b)VH1包含：包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列的CDR-L3；(c)VH1包含：包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：48的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含 SEQ ID NO：37的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：55的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：56的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：57的氨基酸序列的CDR-L3；(d)VH1包含：含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：55的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：56的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：57的氨基酸序列的CDR-L3；(e)VH1包含：包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：48的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：58的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：59的氨基酸序列的CDR-L3；(f)VH1包含：含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：58的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：59的氨基酸序列的CDR-L3；(g)VH1包含：包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：48的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：126的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：127的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：128的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：138的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：139的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：140的氨基酸序列的CDR-L3； (h)VH1包含：含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：126的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：127的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：128的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：138的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：139的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：140的氨基酸序列的CDR-L3；(i)VH1包含：包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：48的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：120的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：121的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：122的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：123的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：124的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：125的氨基酸序列的CDR-L3；或(j)VH1包含：含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的CDR-H3；VL1 包含：包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：120的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：121的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：122的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：123的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：124的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：125的氨基酸序列的CDR-L3。
項24：一種結合蛋白，其包含形成3個抗原結合位點的4條多肽鏈，其中第一多肽鏈包含如下式表示的結構：VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽鏈包含如下式表示的結構：VH1-L3-VH2-L4-CH1 [II]
且第三多肽鏈包含如下式表示的結構：VH3-CH1 [III]
且第四多肽鏈包含如下式表示的結構：VL3-CL [IV]
其中：VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變域；VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變域；VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變域；VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變域；VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變域；VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變域； CL是免疫球蛋白輕鏈恆定域；CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恆定域；且L1、L2、L3和L4是氨基酸連接子；其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對；其中：(a)VL1、VL2和VL3各自獨立地包含如SEQ ID NO：169、171和173任一項所示的可變域序列；或(b)VL1、VL2和VL3各自獨立地包含輕鏈互補决定區，其包含選自下組的氨基酸序列：SEQ ID NO：50、141-147、178和179；其中：(a)VH1、VH2和VH3各自獨立地包含如SEQ ID NO：168、170和172的任一項所示的可變域序列；或(b)VH1、VH2和VH3各自獨立地包含重鏈互補决定區，其包含選自下組的氨基酸序列：SEQ ID NO：129-137。
項25：一種結合蛋白，其包含形成3個抗原結合位點的4條多肽鏈，其中第一多肽鏈包含如下式表示的結構：VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽鏈包含如下式表示的結構：VH1-L3-VH2-L4-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [II]
且第三多肽鏈包含如下式表示的結構：VH3-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [III]
且第四多肽鏈包含如下式表示的結構：VL3-CL [IV]
其中：VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變域；VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變域； VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變域；VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變域；VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變域；VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變域；CL是免疫球蛋白輕鏈恆定域；CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恆定域；CH2是免疫球蛋白CH2重鏈恆定域；CH3是免疫球蛋白CH3重鏈恆定域；鉸鏈是連接CH1和CH2域的免疫球蛋白鉸鏈區；且L1、L2、L3和L4是氨基酸連接子；且其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對；其中：(a)VL1、VL2和VL3各自獨立地包含如SEQ ID NO：169、171和173任一項所示的可變域序列；或(b)VL1、VL2和VL3各自獨立地包含輕鏈互補决定區，其包含選自下組的氨基酸序列：SEQ ID NO：50、141-147、178和179；其中：(a)VH1、VH2和VH3各自獨立地包含如SEQ ID NO：168、170和172的任一項所示的可變域序列；或(b)VH1、VH2和VH3各自獨立地包含重鏈互補决定區，其包含選自下組的氨基酸序列：SEQ ID NO：129-137。
項26：項24的結合蛋白，其中第二多肽鏈還包含連接至CH1的Fc區，所述Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋白重鏈恆定域。
項27：項24-26任一項的結合蛋白，其中L1、L2、L3和L4的至少一個獨立地長度為0個氨基酸。
項28.項24-26任一項的結合蛋白，其中L1、L2、L3和L4各自獨立地長度 為至少1個氨基酸。
項29.項24-26和28任一項的結合蛋白，其中L1、L2、L3和L4各自獨立地包含選自由下列組成之群組的序列：GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：104)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：105)、S、RT、TKGPS(SEQ ID NO：106)、GQPKAAP(SEQ ID NO：175)和GGSGSSGSGG(SEQ ID NO：148)。
項30.項24-28任一項的結合蛋白，其中：(a)L1包含序列GQPKAAP(SEQ ID NO：175)，L2包含序列TKGPS(SEQ ID NO：106)，L3包含序列S，且L4包含序列RT；(b)L1包含序列GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：104)，L2包含序列GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：104)，L3長度為0個氨基酸，且L4長度為0個氨基酸；(c)L1包含序列GGSGSSGSGG(SEQ ID NO：148)，L2包含序列GGSGSSGSGG(SEQ ID NO：148)，L3長度為0個氨基酸，且L4長度為0個氨基酸；或(d)L1包含序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：105)，L2長度為0個氨基酸，L3包含序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：105)，且L4長度為0個氨基酸。
項31.項24-30任一項的結合蛋白，其中：(a)VH1包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包 含：包含SEQ ID NO：129的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：130的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：131的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：141的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：178的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：142的氨基酸序列的CDR-L3；(b)VH1包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：47的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：129的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：130的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：131的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：141的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：178的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：142的氨基酸序列的CDR-L3；(c)VH1包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：129的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：130的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：131的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：141的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：178的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：142的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包 含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；(d)VH1包含：包含SEQ ID NO：129的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：130的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：131的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：141的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：178的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：142的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；(e)VH1包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：129的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：130的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：131的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：141的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：178的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：142的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3； (f)VH1包含：包含SEQ ID NO：129的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：130的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：131的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：141的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：178的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：142的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3；(g)VH1包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；(h)VH1包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR- H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3；(i)VH1包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；或(j)VH1包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3； VH2包含：包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：145的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：143的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的氨基酸序列的CDR-L3。
項32：項1、3-16、18-24和26-31任一項的結合蛋白，其中所述第二多肽鏈還包含連接至CH1的第一Fc區，所述第一Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋白重鏈恆定域，其中所述第一Fc區包含與人IgG1或IgG4的位置354和366對應的位置處的氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為S354C和T366W；且其中所述第三多肽鏈還包含連接至CH1的第二Fc區，所述第二Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋白重鏈恆定域，其中所述第二Fc區包含與人IgG1或IgG4的位置349、366、368和407對應的位置處的氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為Y349C、T366S、L368A和Y407V。
項33：項1、3-16、18-24和26-31任一項的結合蛋白，其中所述第二多肽鏈還包含連接至CH1的第一Fc區，所述第一Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋白重鏈恆定域，其中所述第一Fc區包含與人IgG1或IgG4的位置349、366、368和407對應的位置處的氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為Y349C、T366S、L368A和Y407V；且其中所述第三多肽鏈還包含連接至CH1的第二Fc區，所述第二Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋白重鏈恆定域，其中所述第二Fc區包含與人IgG1或IgG4的位置354和366對應的位置處的氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為S354C和T366W。
項34：項1、3-16、18-24和26-33任一項的結合蛋白，其中所述第二多肽鏈 還包含連接至CH1的第一Fc區，所述第一Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋白重鏈恆定域，且其中所述第三多肽鏈還包含連接至CH1的第二Fc區，所述第二Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋白重鏈恆定域；其中所述第一和第二Fc區包含與人IgG1或IgG4的位置428和434對應的位置處的氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為M428L和N434S。
項35：項2、4-15、17、19-23、25和27-31任一項的結合蛋白，其中所述第二多肽鏈的CH3域包含與人IgG1或IgG4的位置354和366對應的位置處的氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為S354C和T366W；且其中所述第三多肽鏈的CH3域包含與人IgG1或IgG4的位置349、366、368和407對應的位置處的氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為Y349C、T366S、L368A和Y407V。
項36：項2、4-15、17、19-23、25和27-31任一項的結合蛋白，其中所述第二多肽鏈的CH3域包含與人IgG1或IgG4的位置349、366、368和407對應的位置處的氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為Y349C、T366S、L368A和Y407V；且其中所述第三多肽鏈的CH3域包含與人IgG1或IgG4的位置354和366對應的位置處的氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為S354C和T366W。
項37：項2、4-15、17、19-23、25、27-31、35和36任一項的結合蛋白，其中所述第二和第三多肽鏈二者的CH3域均包含與人IgG1或IgG4的位置428和434對應的位置處的氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為M428L和N434S。
項38：項1、3-16、18-24和26-34任一項的結合蛋白，其中所述第二多肽鏈還包含連接至CH1的第一Fc區，所述第一Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋白重鏈恆定域；其中所述第三多肽鏈還包含連接至CH1的第二Fc區，所述第二Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋白重鏈恆定域；其中所述第一和第二Fc區為人IgG1或IgG4 Fc區；且其中所述第一和第二Fc區中僅有 一個包含與人IgG1或IgG4的位置435和436對應的位置處的氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為H435R和Y436F。
項39：項2、4-15、17、19-23、25、27-31和35-37任一項的結合蛋白，其中所述第二和第三多肽鏈的CH3域是人IgG1或IgG4 CH3域，且其中所述CH3域中僅一項包含與人IgG1或IgG4的位置435和436對應的位置處的氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為H435R和Y436F。
項40：項1、3-16、18-24、26-34和38任一項的結合蛋白，其中所述第二多肽鏈還包含連接至CH1的第一Fc區，所述第一Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋白重鏈恆定域；其中所述第三多肽鏈還包含連接至CH1的第二Fc區，所述第二Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋白重鏈恆定域；其中所述第一和第二Fc區是人IgG4 Fc區；且其中第一和第二Fc區各自包含與人IgG4的位置228和409對應的位置處的氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為S228P和R409K。
項41：項2、4-15、17、19-23、25、27-31、35-37和39任一項的結合蛋白，其中所述第二和第三多肽鏈的CH3域是人IgG4 CH3域，且其中所述CH3域各自包含與人IgG4的位置228和409對應的位置處的氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為S228P和R409K。
項42：項1、3-16、18-24、26-34、38和40任一項的結合蛋白，其中所述第二多肽鏈還包含連接至CH1的第一Fc區，所述第一Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋白重鏈恆定域；其中所述第三多肽鏈還包含連接至CH1的第二Fc區，所述第二Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋白重鏈恆定域；其中所述第一和第二Fc區是人IgG4 Fc區；且其中所述第一和第二Fc區各自包含與人IgG4的位置234和235對應的位置處的氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為F234A和L235A。
項43：項2、4-15、17、19-23、25、27-31、35-37、39和41任一項的結合蛋白，其中所述第二和第三多肽鏈的CH3域是人IgG4 CH3域，且其中所述CH3域各 自包含與人IgG4的位置234和235對應的位置處的氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為F234A和L235A。
項44：項1、3-16、18-24、26-34、38和40任一項的結合蛋白，其中所述第二多肽鏈還包含連接至CH1的第一Fc區，所述第一Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋白重鏈恆定域；其中所述第三多肽鏈還包含連接至CH1的第二Fc區，所述第二Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和CH2及CH3免疫球蛋白重鏈恆定域；其中所述第一和第二Fc區是人IgG1 Fc區；且其中所述第一和第二Fc區各自包含與人IgG4的位置234和235對應的位置處的氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為L234A和L235A。
項45：項2、4-15、17、19-23、25、27-31、35-37、39和41任一項的結合蛋白，其中所述第二和第三多肽鏈的CH3域是人IgG1CH3域，且其中所述CH3域各自包含與人IgG4的位置234和235對應的位置處的氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為L234A和L235A。
項46：項2、4-15、17、19-23、25、27-31、35-37、39、41、43和45任一項的結合蛋白，其中VH1和VL1形成特異性結合的人CD3的第一抗原結合位點，其中VH2和VL2形成特異性結合人CD28的第二抗原結合位點，且其中VH3和VL3形成特異性結合人腫瘤靶蛋白的第三抗原結合位點。
項47：項2、4-15、17、19-23、25、27-31、35-37、39、41、43和45任一項的結合蛋白，其中VH1和VL1形成特異性結合人CD28的第一抗原結合位點，其中VH2和VL2形成特異性結合人CD3的第二抗原結合位點，且其中VH3和VL3形成特異性結合人腫瘤靶蛋白的第三抗原結合位點。
項48：項46或項47的結合蛋白，其中所述第三抗原結合位點特異性結合選自下組的人腫瘤靶蛋白：CD19、CD20、CD38、Her2和LAMP1。
項49：項46-48任一項的結合蛋白，其中所述特異性結合CD3的抗原結合位點包含：(a)包含SEQ ID NO：152的氨基酸序列的重鏈可變域和包含SEQ ID NO： 153的氨基酸序列的輕鏈可變域；或(b)包含SEQ ID NO：154的氨基酸序列的重鏈可變域和包含SEQ ID NO：155的氨基酸序列的輕鏈可變域。
項50：項46-49任一項的結合蛋白，其中所述特異性結合CD28的抗原結合位點包含：(a)包含SEQ ID NO：160的氨基酸序列的重鏈可變域和包含SEQ ID NO：161的氨基酸序列的輕鏈可變域；或(b)包含SEQ ID NO：162的氨基酸序列的重鏈可變域和包含SEQ ID NO：163的氨基酸序列的輕鏈可變域。
項51：項46-50任一項的結合蛋白，其中所述特異性結合腫瘤靶蛋白的抗原結合位點包含：(a)包含SEQ ID NO：156的氨基酸序列的重鏈可變域和包含SEQ ID NO：157的氨基酸序列的輕鏈可變域；(b)包含SEQ ID NO：158的氨基酸序列的重鏈可變域和包含SEQ ID NO：159的氨基酸序列的輕鏈可變域；(c)包含SEQ ID NO：164的氨基酸序列的重鏈可變域和包含SEQ ID NO：165的氨基酸序列的輕鏈可變域；(d)包含SEQ ID NO：150的氨基酸序列的重鏈可變域和包含SEQ ID NO：151的氨基酸序列的輕鏈可變域；或(e)包含SEQ ID NO：166的氨基酸序列的重鏈可變域和包含SEQ ID NO：167的氨基酸序列的輕鏈可變域。
項52：項2、17、35-37、39、41、43和45任一項的結合蛋白，其中：(a)VH1和VL1形成特異性結合人TNFa的第一抗原結合位點，VH2和VL2形成特異性結合人IL13的第二抗原結合位點，且VH3和VL3形成特異性結合人IL4的第三抗原結合位點；(b)VH1和VL1形成特異性結合人TNFa的第一抗原結合位點，VH2和VL2形 成特異性結合人IL4的第二抗原結合位點，且VH3和VL3形成特異性結合人IL13的第三抗原結合位點；(c)VH1和VL1形成特異性結合人IL4的第一抗原結合位點，VH2和VL2形成特異性結合人TNFa的第二抗原結合位點，且VH3和VL3形成特異性結合人IL13的第三抗原結合位點；(d)VH1和VL1形成特異性結合人IL4的第一抗原結合位點，VH2和VL2形成特異性結合人IL13的第二抗原結合位點，且VH3和VL3形成特異性結合人TNFa的第三抗原結合位點；(e)VH1和VL1形成特異性結合人IL13的第一抗原結合位點，VH2和VL2形成特異性結合人IL4的第二抗原結合位點，且VH3和VL3形成特異性結合人TNFa的第三抗原結合位點；或(f)VH1和VL1形成特異性結合人IL13的第一抗原結合位點，VH2和VL2形成特異性結合人TNFa的第二抗原結合位點，且VH3和VL3形成特異性結合人IL4的第三抗原結合位點。
項53：項52的結合蛋白，其中所述特異性結合人TNFa的抗原結合位點包含重鏈可變域和輕鏈可變域，所述重鏈可變域包含SEQ ID NO：168的氨基酸序列，所述輕鏈可變域包含SEQ ID NO：169的氨基酸序列。
項54：項52或項53的結合蛋白，其中所述特異性結合人IL4的抗原結合位點包含重鏈可變域和輕鏈可變域，所述重鏈可變域包含SEQ ID NO：170的氨基酸序列，所述輕鏈可變域包含SEQ ID NO：171的氨基酸序列。
項55：項52-54任一項的結合蛋白，其中所述特異性結合人IL13的抗原結合位點包含重鏈可變域和輕鏈可變域，所述重鏈可變域包含SEQ ID NO：172的氨基酸序列，所述輕鏈可變域包含SEQ ID NO：173的氨基酸序列。
項56：項1-55任一項的結合蛋白，其中：(a)所述第一多肽鏈的CL域是人κCL域，且所述第四多肽鏈的CL域是人λCL域；或 (b)所述第一多肽鏈的CL域是人λCL域，且所述第四多肽鏈的CL域是人κCL域。
項57：項2、17、25、35-37、39、41和43-55任一項的結合蛋白，其中所述第一多肽鏈包含λCL域；其中所述第二多肽鏈的CH3域包含與人IgG1的位置354和366對應的位置處的氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為S354C和T366W；其中所述第三多肽鏈的CH3域包含與人IgG1的位置349、366、368、407、435和436對應的位置處的氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為Y349C、T366S、L368A、Y407V、H435R和Y436F；且其中第四多肽鏈包含κCL域。
項58：一種結合蛋白，其包含第一多肽鏈、第二多肽鏈、第三多肽鏈和第四多肽鏈，其中：(a)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列或與SEQ ID NO：4的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列或與SEQ ID NO：3的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列或與SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或與SEQ ID NO：2的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；(b)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列或與SEQ ID NO：10的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列或與SEQ ID NO：9的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列或與SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或與SEQ ID NO：2的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；(c)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列或與SEQ ID NO：4的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列或與SEQ ID NO：3的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述 第三多肽鏈包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列或與SEQ ID NO：13的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列或與SEQ ID NO：14的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；(d)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列或與SEQ ID NO：10的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列或與SEQ ID NO：9的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列或與SEQ ID NO：13的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列或與SEQ ID NO：14的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；(e)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列或與SEQ ID NO：4的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列或與SEQ ID NO：3的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列或與SEQ ID NO：17的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列或與SEQ ID NO：18的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；(f)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列或與SEQ ID NO：10的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列或與SEQ ID NO：9的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列或與SEQ ID NO：17的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列或與SEQ ID NO：18的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；(g)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列或與SEQ ID NO：4的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列或與SEQ ID NO：3的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列或與SEQ ID NO：21的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：22的氨基酸序 列或與SEQ ID NO：22的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；(h)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列或與SEQ ID NO：10的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列或與SEQ ID NO：9的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列或與SEQ ID NO：21的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列或與SEQ ID NO：22的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；(i)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：63的氨基酸序列或與SEQ ID NO：63的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：62的氨基酸序列或與SEQ ID NO：62的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：60的氨基酸序列或與SEQ ID NO：60的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：61的氨基酸序列或與SEQ ID NO：61的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；(j)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列或與SEQ ID NO：69的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列或與SEQ ID NO：68的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：60的氨基酸序列或與SEQ ID NO：60的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：61的氨基酸序列或與SEQ ID NO：61的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；(k)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列或與SEQ ID NO：69的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列或與SEQ ID NO：68的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：60的氨基酸序列或與SEQ ID NO：60的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：71的氨基酸序列或與SEQ ID NO：71的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；(l)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：76的氨基酸序列或與SEQ ID NO：76的 氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：75的氨基酸序列或與SEQ ID NO：75的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列或與SEQ ID NO：73的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：74的氨基酸序列或與SEQ ID NO：74的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；(m)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：82的氨基酸序列或與SEQ ID NO：82的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：81的氨基酸序列或與SEQ ID NO：81的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列或與SEQ ID NO：73的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：74的氨基酸序列或與SEQ ID NO：74的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；(n)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：88的氨基酸序列或與SEQ ID NO：88的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：87的氨基酸序列或與SEQ ID NO：87的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：85的氨基酸序列或與SEQ ID NO：85的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：86的氨基酸序列或與SEQ ID NO：86的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；(o)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：94的氨基酸序列或與SEQ ID NO：94的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：93的氨基酸序列或與SEQ ID NO：93的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：85的氨基酸序列或與SEQ ID NO：85的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：86的氨基酸序列或與SEQ ID NO：86的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；(p)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列或與SEQ ID NO：69的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列或與SEQ ID NO：68的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所 述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列或與SEQ ID NO：73的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：74的氨基酸序列或與SEQ ID NO：74的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；(q)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列或與SEQ ID NO：69的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列或與SEQ ID NO：68的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：85的氨基酸序列或與SEQ ID NO：85的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：86的氨基酸序列或與SEQ ID NO：86的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；(r)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：63的氨基酸序列或與SEQ ID NO：63的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：62的氨基酸序列或與SEQ ID NO：62的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列或與SEQ ID NO：73的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：74的氨基酸序列或與SEQ ID NO：74的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；(s)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：63的氨基酸序列或與SEQ ID NO：63的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：62的氨基酸序列或與SEQ ID NO：62的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：85的氨基酸序列或與SEQ ID NO：85的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：86的氨基酸序列或與SEQ ID NO：86的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；(t)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列或與SEQ ID NO：4的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列或與SEQ ID NO：3的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：114的氨基酸序列或與SEQ ID NO：114的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：115的氨基酸 序列或與SEQ ID NO：115的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；或(u)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列或與SEQ ID NO：10的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列或與SEQ ID NO：9的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：114的氨基酸序列或與SEQ ID NO：114的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：115的氨基酸序列或與SEQ ID NO：115的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列。
項59：一種分離的核酸分子，其包含編碼項1-58任一項的結合蛋白的核苷酸序列。
項60：一種表達載體，其包含項59的核酸分子。
項61：一種分離的宿主細胞，其包含項59的核酸分子。
項62：一種分離的宿主細胞，其包含項60的表達載體。
項63：項61或項62的分離的宿主細胞，其中所述宿主細胞是哺乳動物細胞或昆蟲細胞。
項64：一種醫藥組合物，其包含項1-58任一項的結合蛋白及藥學上可接受的載劑。
項65：一種在患者中預防和/或治療癌症的方法，包括對所述患者投予治療有效量的項1-23和32-58任一項的至少一個結合蛋白或項64的醫藥組合物。
項66：項65的方法，其中所述結合蛋白包含一個特異性結合T細胞表面蛋白的抗原結合位點和另一個特異性結合腫瘤靶蛋白的抗原結合位點。
項67：項66的方法，其中所述結合蛋白包含特異性結合CD3的第一抗原結合位點，特異性結合CD28的第二抗原結合位點，和特異性結合選自下組的腫瘤靶蛋白第三抗原結合位點：CD19、CD20、CD38、Her2和LAMP1。
項68：項65-67任一項的方法，其中所述至少一個結合蛋白與化療劑共同投予。
項69：一種在患者中預防和/或治療炎性疾病或病症的方法，包括對所述患 者投予治療有效量的項1-15、24-45和52-58任一項的至少一個結合蛋白或項64的醫藥組合物。
項70：項69的方法，其中所述結合蛋白包含3個抗原結合位點，其各自特異性結合選自下組的細胞因子靶蛋白：IL-4、IL-13和TNFa。
項71：項69或項70的方法，其中所述至少一個結合蛋白與抗炎劑共同投予。
項72：項65-71任一項的方法，其中所述患者是人。
項73：項65或項69的方法，其中所述結合蛋白能够抑制一個或多個選自下組的靶蛋白的功能：A2AR、APRIL、ATPD酶、BAFF、BAFFR、BCMA、BlyS、BTK、BTLA、B7DC、B7H1、B7H4、B7H5、B7H6、B7H7、B7RP1、B7-4、C3、C5、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL15、CCL17、CCL19、CCL20、CCL21、CCL24、CCL25、CCL26、CCR3、CCR4、CD3、CD19、CD20、CD23、CD24、CD27、CD28、CD38、CD39、CD40、CD70、CD80、CD86、CD122、CD137、CD137L、CD152、CD154、CD160、CD272、CD273、CD274、CD275、CD276、CD278、CD279、CDH1、殼多糖酶、CLEC9、CLEC91、CRTH2、CSF-1、CSF-2、CSF-3、CX3CL1、CXCL12、CXCL13、CXCR3、DNGR-1、外核苷三磷酸鹽二磷酸水解酶1、EGFR、ENTPD1、FCER1A、FCER1、FLAP、Gi24、GITR、GITRL、GM-CSF、Her2、HHLA2、HMGB1、HVEM、ICOSLG、IDO、IFNα、IgE、IGF1R、IL2Rβ、IL1、IL1A、IL1B、IL1F10、IL2、IL4、IL4Ra、IL5、IL5R、IL6、IL7、IL7Ra、IL8、IL9、IL9R、IL10、rhIL10、IL12、IL13、IL13Ra1、IL13Ra2、IL15、IL17、IL17Rb、IL18、IL22、IL23、IL25、IL27、IL33、IL35、ITGB4、ITK、KIR、LAG3、LAMP1、瘦素、LPFS2、II類MHC、NCR3LG1、NKG2D、NTPD酶-1、OX40、OX40L、PD-1H、血小板受體、S152、SISP1、SLC、SPG64、ST2、Syk激酶、TACI、TDO、T14、TIGIT、TIM3、TLR、TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、TNFa、TNFRSF7、 Tp55、TREM1、TSLP、TSLPR、TWEAK、VEGF、VISTA、Vstm3、WUCAM和XCR1。
項74：項1-23和32-58任一項的結合蛋白或項64的組合物，其用於在患者中預防和/或治療癌症的用途。
項75：用於項74的用途的結合蛋白或組合物，其中所述結合蛋白包含一個特異性結合T細胞表面蛋白的抗原結合位點和另一個特異性結合腫瘤靶蛋白的抗原結合位點。
項76：用於項75的用途的結合蛋白或組合物，其中所述結合蛋白包含特異性結合CD3的第一抗原結合位點，特異性結合CD28的第二抗原結合位點，和特異性結合選自下組的腫瘤靶蛋白的第三抗原結合位點：CD19、CD20、CD38、Her2和LAMP1。
項77：用於項74-76的任一項的用途的結合蛋白或組合物，其中所述結合蛋白與化療劑共同投予。
項78：項1-15、24-45和52-58任一項的結合蛋白或項64的醫藥組合物，其用於在患者中預防和/或治療炎性疾病或病症的用途。
項79：用於項78的用途的結合蛋白或組合物，其中所述結合蛋白包含3個抗原結合位點，其各自特異性結合選自下組的細胞因子靶蛋白：IL-4、IL-13和TNFa。
項80：用於項78或項79的用途的結合蛋白或組合物，其中所述結合蛋白與抗炎劑共同投予。
項81：用於項74-80任一項的用途的結合蛋白或組合物，其中所述患者是人。
項82：用於項74或項78的用途的結合蛋白或組合物，其中所述結合蛋白能够抑制一個或多個選自下組的靶蛋白的功能：A2AR、APRIL、ATPD酶、BAFF、BAFFR、BCMA、BlyS、BTK、BTLA、B7DC、B7H1、B7H4、B7H5、B7H6、B7H7、B7RP1、B7-4、C3、C5、CCL2、CCL3、CCL4、 CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL15、CCL17、CCL19、CCL20、CCL21、CCL24、CCL25、CCL26、CCR3、CCR4、CD3、CD19、CD20、CD23、CD24、CD27、CD28、CD38、CD39、CD40、CD70、CD80、CD86、CD122、CD137、CD137L、CD152、CD154、CD160、CD272、CD273、CD274、CD275、CD276、CD278、CD279、CDH1、殼多糖酶、CLEC9、CLEC91、CRTH2、CSF-1、CSF-2、CSF-3、CX3CL1、CXCL12、CXCL13、CXCR3、DNGR-1、外核苷三磷酸鹽二磷酸水解酶1、EGFR、ENTPD1、FCER1A、FCER1、FLAP、Gi24、GITR、GITRL、GM-CSF、Her2、HHLA2、HMGB1、HVEM、ICOSLG、IDO、IFNα、IgE、IGF1R、IL2Rβ、IL1、IL1A、IL1B、IL1F10、IL2、IL4、IL4Ra、IL5、IL5R、IL6、IL7、IL7Ra、IL8、IL9、IL9R、IL10、rhIL10、IL12、IL13、IL13Ra1、IL13Ra2、IL15、IL17、IL17Rb、IL18、IL22、IL23、IL25、IL27、IL33、IL35、ITGB4、ITK、KIR、LAG3、LAMP1、瘦素、LPFS2、II類MHC、NCR3LG1、NKG2D、NTPD酶-1、OX40、OX40L、PD-1H、血小板受體、S152、SISP1、SLC、SPG64、ST2、Syk激酶、TACI、TDO、T14、TIGIT、TIM3、TLR、TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、TNFa、TNFRSF7、Tp55、TREM1、TSLP、TSLPR、TWEAK、VEGF、VISTA、Vstm3、WUCAM和XCR1。
項83：一種純化結合蛋白的方法，包括：(a)提供權利要求57的結合蛋白，其中第二多肽鏈的CH3域和所述第三多肽鏈的CH3域中僅有一個包含與人IgG1或IgG4的位置435和436對應的位置處的氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代是H435R和Y436F；(b)使(a)中提供的結合蛋白與蛋白A接觸；(c)在適于從包含0或2個CH3域的結合蛋白分離出結合蛋白的條件下從蛋白A洗脫所述結合蛋白，所述CH3域包含為H435R和Y436F的氨基酸取代；(d)使(c)中洗脫的結合蛋白與κ輕鏈親和介質接觸；和(e)在適于從僅包含λCL域的結合蛋白分離出結合蛋白的條件下從所述κ輕 鏈親和介質洗脫結合蛋白，由此純化所述結合蛋白。
項84：項83的方法，其在(e)之後還包括：(f)使(e)中洗脫的結合蛋白與λ輕鏈親和介質接觸；和(g)在適于從僅包含κCL域的結合蛋白分離出結合蛋白的條件下從所述λ輕鏈親和介質洗脫所述結合蛋白。
項85：項83或項84的方法，其中所述第一多肽鏈包含λCL域；其中所述第二多肽鏈的CH3域包含與人IgG1的位置354和366對應的位置處的氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為S354C和T366W；其中所述第三多肽鏈的CH3域包含與人IgG1的位置349、366、368、407、435和436對應的位置處的氨基酸取代，其根據EU索引，其中所述氨基酸取代為Y349C、T366S、L368A、Y407V、H435R和Y436F；且其中第四多肽鏈包含κCL域。
項86：項83-85任一項的方法，其中在(c)和(e)的一項或多項中使用疏水相互作用色譜(HIC)來檢測所述結合蛋白。
【實施例】
下文實施例用於描述本發明的具體實施方案，及其多種用途。所述實施例僅出于例示目的而示出，幷且不應理解為以任何方式限制本發明的範圍。
實施例1：材料與方法
如下材料與方法用於實施例2-5所述的實驗。
三特異性抗體設計
圖1A-1C中示出了通用三特異性抗體設計的示意圖。基于5個參數設計單個三特異性抗體：1)選擇抗體結合位點；2)考慮每個結合位點的位置；3)雙特異性結合臂(即圖1C中的重鏈/輕鏈B)的連接子選擇；4)“節”和“穴”突變整合至抗體的各自的那一半中；5)選擇Fc同種型(IgG1或IgG4)。在每個三特異性分子的氨基酸序列的裝配之後，使用人優選密碼子(CambrY Applied Biosciences,Cambridge,MA,USA)對各個三特異性抗體合成四個基因，幷克隆至真核表達載 體中。
三特異性抗體的生產和純化
根據製造商的方案，通過使用ExpiFectamineTM 293轉染套組(Thermo Fisher Scientific)將4種表達質粒瞬時轉染至Expi293細胞中來產生三特異性抗體。簡言之，將每個質粒的25%(w/w)稀釋于Opti-MEM中，在室溫(RT)與預稀釋的ExpiFectamine試劑混合20-30分鐘，幷加入至Expi293細胞中(2.5x106細胞/ml)。通常使用轉染優化以確定質粒的最佳比例，從而產生具有良好產率和純度的三特異性抗體。
轉染後4-5天，從轉染細胞收集上清液，幷通過0.45μm過濾單元(Nalgene)過濾。使用3步法純化上清液中的三特異性抗體。首先，使用蛋白A親和純化，幷使用“IgG Elution Buffer”(Thermo Fisher Scientific)洗脫結合的抗體。第二，將產物針對PBS(pH7.4)透析過夜，其中2次更換PBS緩衝液。在下一步之前通過0.45μm過濾器單元(Nalgene)過濾清除任何沉澱物。第三，使用大小排阻層析(SEC)純化(Hiload 16/600 Superdex 200pg或Hiload 26/600 Superdex 200pg,GE Healthcare)去除製備中的聚集體和不同種類。在還原和非還原的SDS-PAGE上分析級分以鑒定含有單體三特異性抗體的級分，然後將其組合。純化的抗體可被等分幷長期儲存在-80℃。
ELISA測定
使用ELISA或SPR方法分析純化的抗體的結合特性。對于ELISA，使用三特異性抗體中每個結合位點的對應抗原在4℃以PBS(pH7.4)中的2μg/ml每種抗原塗覆96孔免疫平板(Nunc 439454，Thermo Fisher Scientific)過夜。使用PBS中的5%脫脂乳+2%BSA在室溫將塗覆的平板封閉1小時，然後用PBS+0.25% Tween 20洗滌三次(Aqua Max 400，Molecular Devices)。製備抗體(三特異性和對照抗體)的連續稀釋液，幷添加到ELISA板(100μl/孔，一式兩份)上，在室溫溫育l小時，然後用PBS+0.25% Tween 20洗滌5次。
洗滌後，將綴合有HRP的二抗人Fab(1：5000，目錄號109-035-097，Jackson ImmunoResearch Inc)添加至每個孔幷在室溫溫育30分鐘。用PBS+0.25% Tween 20洗滌5次後，向每個孔加入100μl的TMB微孔過氧化物酶底物(KPL,Gaithersburg,MD,USA)。通過加入50μl 1M H2SO4終止反應，幷使用SpectraMax M5(Molecular Devices)測量OD450，幷使用SoftMax Pro6.3軟件(Molecular Devices)進行分析。將最終數據轉移至GraphPad Prism軟件(GraphPad Software,CA,USA)，幷如所示繪圖。使用相同的軟件計算EC50。
SPR測定
選擇兩對重鏈和輕鏈進行全動力學分析。使用BIACORE 3000(GE Healthcare)上的表面等離振子共振(SPR)技術進行純化抗體的動力學表徵。使用研究的抗體的捕獲測定(其使用標簽特異性抗體捕獲)和取向。對于捕獲含有蛋白構建體的Fc，使用人抗體捕獲套組(GE Healthcare)，對于捕獲含有蛋白構建體的His標簽，使用His捕獲套組(GE Healthcare)。使用標準程序將捕獲抗體經伯胺基團(11000RU)固定在研究級CM5芯片(GE Life Sciences)上。以10μL/分鐘的流速用調節的RU值捕獲分析的抗體，所述調節的RU值導致通常為30RU的最大分析物結合信號。
對于示例性測定，重組人IL13(目錄號IL012)和人IL4(目錄號IL004)購自Millipore，重組人TNFα(目錄號H8916)購自Sigma Aldrich。在0.1至3nM的濃度範圍的IL4和0.8至25nM的IL13，針對重組人IL4和IL13測量結合動力學。對于人TNFα，使用3至100nM的濃度範圍。作為測定緩衝液，以30μl/分鐘的流速使用HBS EP(10mM HEPES，pH 7.4，150mM NaCl，3mM EDTA和0.005%表面活性劑P20)。用各自的捕獲套組的再生溶液(regeneration solution)再生芯片表面。在BIAevaluation程序包v4.1中使用沒有捕獲抗體的流動細胞(flow cell)作為參考和具有質量轉移(mass transfer)的1：1 Langmuir結合模型來分析和計算動力學參數。為了研究抗原的同時結合，通過抗人抗體捕獲表面來捕獲三特異性抗體。抗原以單一濃度使用，IL4為3nM，IL13為25nM，TNFα為100nM。為了顯示所有三種抗原的同時結合，注射IL4，IL13和TNFα的混合物。在分開的分析周 期中，單獨注射IL13，然後注射IL4或TNFα，然後共注射IL4/TNFα或共注射TNFα/IL4。比較了每個循環中測量的最終響應，以顯示兩種或三種抗原的連續結合與所有三種抗原的混合物的同時結合的相似性。
體外T細胞活化和增殖測定
使用Ficoll-Paque Plus方法從購自Blood Research Component(Brookline,MA,USA)的血沉棕黃層純化人PBMC。簡言之，首先在PBS(pH7.4)中以1：3的比例稀釋新鮮的血沉棕黃層，幷在使用前與Ficoll-Paque Plus溶液(Ficoll)通過顛倒瓶數次而充分混合。將15mL密度梯度培養基添加至每個Leucosep®管，以1000xg、室溫旋轉30秒。培養基現在位于多孔屏障下方，然後將30-40mL稀釋的血沉棕黃層小心地倒入每個Leucosep管中，幷在室溫以800×g離心15分鐘，鬆開制動(brake off)和最大加速度為5。除去血漿層，將含有富集的PBMC的上清液其餘部分轉移到新管中(Leucosep管未保持在倒置位置超過2秒)。富集的PBMC用45ml PBS洗滌，幷在室溫以250×g離心10分鐘。重複洗滌，幷將多個管組合為一個管。將細胞重懸于20mL PBS中幷用Bio-Rad TC20計數。
為了建立體外T細胞活化測定，將純化的人PBMC重懸于培養基(具有10% FBS且補充穀氨醯胺/鏈黴素的RPMI1640)(Thermo Fisher Scientific)(106細胞/ml))中。將指定濃度的不同的三特異性和對照抗體加入至每個孔中，或用於在使用前塗覆平板，如Stebbings,R等(2007)J.Immunol.179：3325-3331，幷在組織培養箱中溫育16-24小時。將細胞旋轉减慢，收集上清液以測量細胞因子釋放，或弃去。用針對T細胞標志物(CD3，CD4，CD8等)和活化標志物(CD69，CD62L等)的螢光標記抗體染色細胞，幷通過在Fortessa流式細胞儀(Beckton Dickinson,San Jose,CA)上運行樣品，然後使用Flowjo軟件(FlowJo v10)分析來進行分析，幷如所示繪圖。
為了建立體外T細胞增殖測定，將純化的人PBMC重懸于培養基(具有10% FBS且補充穀氨醯胺/鏈黴素的RPMI1640)(Thermo Fisher Scientific)(106細胞/ml)。將指定濃度的不同的三特異性和對照抗體加入每個孔，幷在組織培養箱 中溫育1-7天。將細胞旋轉减慢，收集上清液以測量細胞因子釋放，或弃去。用針對T細胞標志物(CD3，CD4，CD8等)和活化標志物(CD69，CD62L等)的螢光標記抗體染色細胞，幷通過在Fortessa流式細胞儀(Beckton Dickinson,San Jose,CA)上運行樣品，然後使用Flowjo軟件(FlowJo v10)分析來進行分析，幷如所示繪圖。
體外細胞殺傷測定
使用純化的人PBMC用於使用不同的三特異性抗體針對各種癌細胞的體外殺傷測定。簡言之，在96孔V底平板中建立殺傷測定。對于各個平板，將來自各個供體的40ml PBMC以2x10^6個細胞/ml鋪板，幷製備2.5x10^5個細胞/ml(4μL的染料染色至高達1x10^7個細胞)的30ml PKH26(Sigma #MINI26)標記的靶細胞。將各種濃度的第一20μL/孔測試蛋白或PMA添加至各個孔，然後向各個孔添加80μL/孔標記的靶細胞(2X10^4個細胞/孔)。然後向每個孔添加100μL PBMC，達到E：T=10：1孔(2x10^5個細胞/孔)，幷在37℃ 5% CO2培養箱中溫育24小時。將細胞旋轉减慢，收集上清液以測量細胞因子釋放，或弃去。用Vivid LIVE/DEADTM可固定紫羅蘭死細胞染色緩衝液(LifeTechnology #L34955)染色細胞(通過將60μL Vivid試劑加入60ml PBS中來製備染色緩衝液)。通過在黑暗中室溫溫育15分鐘將細胞重懸于100μL染色緩衝液中。用1xPBS洗滌細胞後，將細胞重懸于具有0.5%多聚甲醛的200μL PBS中，幷通過Fortessa流式細胞儀(Beckton Dickinson,San Jose,CA)收集PKH26+Vivid+癌細胞，然後使用Flowjo軟件分析。殺傷百分比計算為“特異性殺傷-自發殺傷/總細胞”，如所示繪圖。
細胞因子釋放測定
為了測量體外活化測定、體外殺傷測定、CD34+臍帶細胞人源化NSG小鼠中的體內活化測定和毒性研究中的炎性細胞因子濃度，收集細胞培養物上清液，幷用Milliplex Human High Sensitivity T細胞13-plex套組(EMD Millipore)根據製造商的方案稀釋血清樣品。這些隨後通過EMD Millipore MAGPIX®系統和MILLIPLEX® Analyst 5.1軟件進行分析。
體內小鼠模型和功效研究
使用人CD34+造血幹細胞移植的NSG小鼠(hu-CD34)作為體內小鼠模型。這些小鼠建立了多譜系人免疫細胞，幷且是免疫腫瘤學功效研究的有效平臺(參見例如Shultz,L.D等(2014)Cold Spring Harb.Protoc.2014：694-708)。通過注射CD34+造血幹細胞產生Hu-CD34+ NSG小鼠，顯示有效的多譜系移植人免疫細胞群體，包括T細胞，B細胞和一些其他群體(McDermott,S.P等(2010)Blood 116：193-200)。多譜系造血作用發生在12周內。移植穩定超過一年沒有移植物抗宿主病。
對于使用hu-CD34 NSG小鼠的功效研究，小鼠購自The Jackson Laboratory(Maine,USA)，幷在使用前驗證人細胞群體。一般而言，將在Matrigel(BD Biosciences)(50% v/v)中混合的5x106腫瘤細胞用於在每只小鼠中接種腫瘤。一旦腫瘤大小達到100-150mm3的範圍，選擇小鼠幷隨機分配至各組用於研究。抗體以給定劑量每周3次靜脉內給予。每周監測體重1-3次。腫瘤大小通過卡尺測量1-3次/周。當腫瘤大小達到1,500mm3時或最後一次投予後24小時，終止/殺死(terminated)所有小鼠。將終末血液樣品(0.3mL)收集到血清分離管中，通過輕輕顛倒5次予以混合，幷置于管架中。還收集終末腫瘤幷稱重，然後置于固定劑中用於免疫組織化學分析。
使用人PBMC人源化(hu-PBMC)NSG小鼠作為另一體內小鼠模型。這些小鼠通過注射來自健康供體的純化的人PBMC而產生，其使用成年外周血單核細胞而具有最快的移植速率，幷且能够進行需要强效應和記憶T細胞和NK細胞功能的短期研究，幷且適于短期功效研究(3-4周)，這是由于移植物抗宿主病。
對于使用hu-PBMC NSG小鼠的功效研究，從The Jackson Jackson(Maine,USA)購買了8-10周齡的NSG小鼠(貨號：005557,NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1 Wjl/SzJ)。每只小鼠接種了Matrigel(BD Biosciences)(50% v/v)中混合的5x106個腫瘤細胞。一旦腫瘤大小達到50-100mm3的範圍，將來自健康供體的10x106人PBMC重建至每只小鼠。第二天驗證人細胞重建。一旦腫瘤大小達到 100-150mm3的範圍，選擇小鼠幷隨機分入各組用於研究。抗體以投予劑量每周3次靜脉內投予。每周監測體重1-3次。腫瘤大小通過卡尺測量1-3次/周。當腫瘤大小達到1,500mm3時或最後一次投予後24小時，終止/殺死所有小鼠。將終末血液樣品(0.3mL)收集到血清分離管中，通過輕輕顛倒5次予以混合，幷置于管架中。還收集終末腫瘤幷稱重，然後置于固定劑中用於免疫組織化學分析。
NHP耐受性和藥代動力學研究
所有NHP研究均由Covance(Princeton,New Jersey,USA)根據Covance ICUCA方案進行。在所有研究中都使用藥物和蛋白未投予(Drug- and protein- naïve)或蛋白未投予的雄性食蟹猴。基于研究設計，為每個三特異性抗體選擇幷分組猴子。通過經隱靜脉靜脉內輸注1小時給予抗體。對于低劑量(<10μg/kg)連續給予增加的劑量，而對于較高劑量(>10μg/kg)則具有1-2天的間隔，出于觀察目的。按照規定，在每個劑量投予後對所有動物自輸注開始的0小時(僅第1天)，0.5小時(中間輸注)，1小時和6小時收集血液樣品。根據研究主管，病理學家和/或臨床獸醫的判斷收集額外的非計劃血液樣品。所有動物在第60天返回群落。使用標準方法製備來自血液樣品的PBMC和血清，幷保存以供將來分析。
螢光素酶報告測定
GloResponseTM IL2-luc2P Jurkat細胞，復蘇及使用(Promega部件# CS187002)和GloResponseTM NFAT-Luc2 Jurkat細胞(Promega目錄# CS176401)購自Promega(WI,USA)，幷製備用於根據製造商的方案使用。
簡言之，將細胞在37℃水浴中復蘇2分鐘，幷輕輕轉移至含有10mL預熱的R10培養基的15mL錐形離心管中。將管在室溫以300g離心5分鐘。去除上清液，將細胞重懸于20mL預熱的R10培養基中幷轉移至75cm2培養瓶中，然後在37℃的組織培養箱中溫育，直到細胞生長且穩定(~3-4天)。細胞每周兩次分裝為0.1e6個細胞/mL。將細胞保持在R10+潮黴素B培養基中用於選擇。復蘇後~7天使用細胞用於測定。
對于抗體刺激，以各種濃度製備三特異性或對照抗體，幷在PBS中連續稀釋。每孔分配25μL抗體。對于平板結合的抗體，使用Maxisorp平板，幷在40℃溫育過夜。對于可溶性抗體，使用U底平板。將報告細胞重懸至0.3-0.5e6/mL，幷將175μL細胞添加至各個孔，幷在37℃ CO2培養箱中溫育6小時。然後將板從培養箱中取出幷使其平衡至環境溫度(10-15分鐘)。然後將50μl的Bio-GloTM試劑(Promega目錄號G7941)(環境溫度)加入測定平板的各個孔。溫育5分鐘後，使用MicroB2 LumiJET微孔板計數器(Perkin Elmer；1s讀取時間)測量發光活性。使用GraphPad Prism軟件繪製數據。
構象穩定性
使用差示掃描螢光測定法(DSF)確定熱穩定性測量(例如熔點，Tm)。將樣品在D-PBS緩衝液(Invitrogen)中稀釋至終濃度為0.2μg/μl，包括白色半裙邊96孔板(BIORAD)中的D-PBS中的SYPRO-Orange染料的4x濃縮溶液(Invitrogen，DMSO中的5000x儲液)。所有測量均使用MyiQ2實時PCR儀(BIORAD)一式兩份進行。在iQ5軟件v2.1(BIORAD)中生成熔解曲綫的負一階導數曲綫(-d(RFU)/dT)。然後將數據導出到Microsoft Excel中，以確定Tm和數據的圖形顯示。
IC50測量
用報告細胞系檢測針對IL-4和IL-13的抗體活性
在可商購的HEK-Blue IL-4/IL-13報告細胞(InvivoGen)中確定雙特異性抗體或針對細胞因子IL4和IL13的衍生物的活性。設計HEK-Blue IL-4/IL-13細胞以監測IL-4或IL13對STAT6途徑的活化。用細胞因子刺激細胞導致報告基因分泌的胚胎鹼性磷酸酶(SEAP)的產生，其可以用QUANTI-Blue測定法在培養上清液中測量。為了測試針對IL4或IL13的抗體活性，將細胞因子與不同濃度的抗體預溫育1小時，幷添加至50,000個HEK-Blue IL-4/IL-13細胞。在細胞培養上清液中溫育24小時後用QUANTI-Blue測定法(InvivoGen)測量SEAP的細胞因子介導的誘導。對每個抗體濃度用n=3個數據點來進行每個實驗。通過內部應用Biostat-Speed V2.0(Sanofi)計算每種抗體的半最大抑制濃度(IC50)。
用報告細胞系檢測針對TNFα的抗體活性
通過使用市售的HEK-Blue TNF-a報告細胞(InvivoGen)測定雙特異性抗體或衍生物針對TNFa的活性。設計HEK-Blue TNF-a細胞以通過監測NFkB途徑的激活來檢測生物活性TNFa，其通過報告基因分泌的胚胎鹼性磷酸酶(SEAP)的表達來進行，所述表達可用QUANTI Blue Assay(InvivoGen)在上清液中測量。為了確定針對TNFa的抗體活性，將細胞因子與不同濃度的抗體預溫育1小時，幷添加至50,000個HEK Blue TNF-a細胞。在培養上清液中24小時後用QUANTI-Blue測定法(InvivoGen)測量SEAP的細胞因子介導的誘導。對于每個抗體濃度用n=3個數據點來進行每個實驗。計算每種抗體的半最大抑制濃度。
實施例2：三特異性結合蛋白概覽
開發了一種用於生成三特異性結合蛋白的新策略。三特異性蛋白質包含形成三個靶結合位點的四個多肽(圖1A-C)。每個靶結合位點包含來自靶向不同的人抗原靶的抗體的VH和VL域(參見例如表1)。三特異性結合蛋白含有第一對多肽，其具有雙重可變域，該可變域具有形成兩個不同的抗原結點位點的交叉取向(稱為CODV Ig形式)，以及第二對多肽，其各自具有形成第三抗原結點位點的單一可變域(圖1A和1B)。
Figure 106112360-A0305-02-0171-1
Figure 106112360-A0305-02-0172-2
第一對多肽(具有雙重可變域)包含具有結構VL2-連接子-VL1-連接子-免疫球蛋白輕鏈恆定域的第一多肽和具有結構VH1-連接子-VH2-連接子-免疫球蛋白CH1重鏈恒定結構域，得到一對具有交叉取向的多肽，其形成兩個不同的抗原結合位點：VH1-VL1和VH2-VL2(圖1C，參見輕鏈和重鏈B)。表A概述了代表性的三特異性結合蛋白的IgG1和IgG4變體的雙特異性臂(即包含重鏈和輕鏈B的臂)的設計，包括指示三特異性結合蛋白的雙特異性臂中使用的連接子的各種組合。第二對多肽(其各自具有單一可變域)包含具有結構VH3-免疫球蛋白CH1重鏈恆定域的第一多肽和具有結構VL3-免疫球蛋白輕鏈恆定域的第二多肽，得到一對多肽，其形成第三抗原結合位點：VH3-VL3(圖1C，參見輕鏈和重鏈A)。此外，構建三特異性結合蛋白，使得CH3域中的任一個可包含節或穴修飾以促進抗體异源二聚化(圖1)。
表A：作為IgG1(穴)或IgG4(穴)的三特異性結合蛋白的三特異性臂的設計概述
Figure 106112360-A0305-02-0173-3
 連接子：[L3,L4]/[L1,L2]-[S,RT]/[GQPKAAP(SEQ ID NO：175),TKGPS(SEQ ID NO：106)]；[,]/[GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：104),GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：104)]；或[GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：105),]/[GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：105),]
實施例3：T細胞銜接體的體外結合活性和抗體介導的特異性殺傷
本實施例描述了表徵T細胞銜接體的活性的體外測定。
使用上述實施例2中關于三特異性結合蛋白設計描述的方法，生成了四種三特異性結合蛋白(結合蛋白1、3、5和6)。這些三特異性結合蛋白是通過將分離自靶向不同的人蛋白的抗體的VH和VL域移接到三特異性結合蛋白框架上產生的，所述不同的人蛋白：CD3，CD19，CD28，CD38或Her2。構建結構蛋白1使得第一對多肽(其形成兩個抗原結合位點)靶向CD28和CD3且第二對多肽(其形 成單個抗原結點位點)靶向Her2(結合蛋白1=Her2 x(CD28×CD3))。構建結合蛋白3使得第一對多肽(其形成兩個抗原結合位點)靶向CD28和CD3且第二對多肽(其形成單個抗原結合位點)靶向CD19(結合蛋白3=CD19×(CD28×CD3))。構建結構蛋白5使得第一對多肽(其形成兩個抗原結合位點)靶向CD28和CD3且第二對多肽(其形成單個抗原結合位點)靶向CD38(結合蛋白5=CD38×(CD28×CD3))。構建結合蛋白6使得第一對多肽(其形成兩個抗原結合位點)靶向CD28和CD3且第二對多肽(其形成單個抗原結點位)靶向CD38(結合蛋白6=CD38×(CD28×CD3))。
用包含抗Her2的三特異性結合蛋白的體外測定
為了測試三特異性結合蛋白靶向和結合三種不同的人抗原的能力，首先通過ELISA測定測驗結合蛋白1對其靶標的特異性。結合蛋白1能够結合其所有三種靶蛋白CD3，CD28和Her2(圖2)，指示三特異性形式的每個結合域保留其功能。
用膜染料PKH-26(Sigma)標記ZR-75-1，AU565(Her2+)，ARH-77(CD19+)，MOLP-8，RPMI-8226，KMS-12_BM，NCI-H929，MM.1.S，MM.1.，R OPM-2，KMS-26和U266細胞(CD38+)幷用作細胞毒性測定中的靶細胞。在增加濃度的三特異性抗體，雙特異性抗體或對照蛋白的存在下，將這些標記的細胞系以10：1的E：T比率與富集的人Pan T細胞共培養24小時。通過如下步驟來確定靶細胞中細胞裂解的程度：用活/死細胞標記物(Life Technologies)染色，幷通過在Fortessa流式細胞儀(Beckton Dickinson,San Jose,CA)上運行樣品來測量標記的靶細胞群體中的死細胞數目，然後使用Flowjo軟件(FlowJo v10)進行分析。
用螢光綴合的針對人CD3、CD28、CD19、CD38、LAMP1和/或Her2的抗體(Biolegend)來染色Her2+、CD19+、CD38+腫瘤細胞系。還包括用各自同種型匹配的對照抗體進行染色。然後在Fortessa儀器(Beckton Dickinson,San Jose,CA)上獲得細胞。流式分析在FlowJo v10上進行。各種結合蛋白的介導的殺傷結果 示于圖3A-5，9A，9B和11A-16中。
測試了結合蛋白1在表達HER2蛋白的腫瘤細胞的表面上誘導其抗體介導的細胞殺傷的能力。不僅結合蛋白1能够結合其所有三種靶蛋白，而且還能够誘導Her2+細胞系的抗體介導的細胞殺傷(圖3A-4)。結合蛋白1表現出强的抗體介導的細胞殺傷活性，而抗CD3/CD28雙特異性抗體和抗Her2抗體顯示出最小的殺傷活性(圖3A，3B，4和5)，證明使用三特異性抗體使得腫瘤細胞與T細胞通過腫瘤抗原(HER2)和T細胞標志物(CD3和CD28)接合的有效性。抗CD3/CD28不僅對T細胞募集很重要，而且還提供了更有效的T細胞激活和生存信號傳輸，潜在地改進了療效。
另外，使用抗Her2 x CD28 x CD3三特異性抗體(結合蛋白1)對體外T細胞活化和增殖以及細胞因子產生進行了研究。結合蛋白1和具有一個或兩個通過定點誘變失活的結合域的對照變體(△CD28：抗CD28失活；△CD3：抗CD3失活；△(CD3xCD28)：抗CD3和抗CD28均失活)用於人PBMC體外活化測定，如實施例1所述。結果顯示，結合蛋白1在體外有效活化人原代CD4 T細胞和CD8 T細胞二者。抗CD28的失活降低了活化效力，指示抗CD28共信號傳輸通路的重要性。抗CD3結合位點的失活使結合蛋白1達到最小的活性，表明抗CD3提供了主要的T細胞激活信號傳輸(圖6A和6B)。使用IL2和NFAT報告基因人T細胞系(Jurkat-IL2和Jurkat-NFAT)獲得了相似的結果(圖7A-7C)。
使用包含抗CD19的三特異性結合蛋白的體外測定
抗CD19×CD28×CD3三特異性結合蛋白能够結合其靶抗原(圖8)，表明三特異性形式的每個結合域保持其功能。
抗CD19×CD28×CD3三特異性結合蛋白還能誘導CD19+細胞的抗體介導的細胞殺傷(圖9A-9N)。類似地，抗CD19×CD28×CD3三特異性結合蛋白對人淋巴瘤細胞表現出强的殺傷活性，而抗CD3/CD28，抗CD19和同種型對照抗體顯示出最小的殺傷活性，證明使用三特異性抗體通過腫瘤抗原(CD19)和T細胞標志物(CD3和CD28)使得T細胞與腫瘤細胞接合的有效性。
使用包含抗CD38的三特異性結合蛋白的體外測定
如對結合蛋白1和3所觀察到的，結合蛋白5能够結合其所有三種靶蛋白(CD3，CD28和CD38)，如通過ELISA測定(圖10)所評估的，表明三特異性形式的各結合域保留其功能。
還發現結合蛋白5針對具有各種水平的CD38和CD28表達的9種人多發性骨髓瘤細胞(參見圖11D，12D和13D)誘導細胞的抗體介導的細胞殺傷(圖11A-15D)。類似地，三特異性結合蛋白5對人多發性骨髓瘤細胞表現出强的殺傷活性，而抗CD38和同種型對照抗體顯示出最小的殺傷活性，證明使用三特異性抗體通過腫瘤抗原(CD38和CD28)和T細胞標志物(CD3和CD28)將腫瘤細胞與T細胞接合的有效性。雙特異性抗CD3/CD28對照抗體還顯示出對CD28+ MM細胞的邊際殺傷活性(marginal killing activity)，參見圖11B，12A-C和13A-C)。
這些結果證明，本文所述的三特異性抗體平臺提供了整合兩個腫瘤標志物的結合位點或T細胞標記的兩個結合位點的可能性，允許科學設計和各種應用的靈活性。結合蛋白5對于5種CD38+人淋巴瘤細胞系(圖14C和15D)也是有效的，顯示出强的殺傷活性(圖14A-B和15A-C)。
測試了使用結合蛋白5和6的針對多發性骨髓瘤細胞系RPMI8226的抗體介導的細胞殺傷，幷計算它們的EC50幷與靶向CD28和CD3的CODV形式雙特異性抗體(圖16和表B)進行比較。結合蛋白5和6的不同僅在于抗CD28結合域；結合蛋白5含有抗CD28超激動劑，而結合蛋白6含有常規的抗CD28。結合蛋白5顯示出更强的殺傷活性。
Figure 106112360-A0305-02-0176-5
抗CD38×CD28×CD3三特異性結合蛋白5和具有一個或兩個通過定點誘變失 活的結合域的對照變體(△CD28：抗CD28失活；△CD3：抗CD3失活；△(CD3xCD28)：抗CD3和抗CD28二者均失活)在體外活化測定中使用IL2和NFAT報告人T細胞系(Jurkat-IL2和Jurkat-NFAT)測試，如實施例1所述。結果顯示，結合蛋白5在體外有效激活人IL2和NFAT啟動子二者(圖17A和17B)。抗CD28的失活降低了活化效力，其對于IL2報告基因更為突出，這表明抗CD28共信號傳輸通路的重要性。抗CD3結合位點的失活使結合蛋白5達到最小的活性，表明抗CD3提供了主要的T細胞激活信號傳輸。
實施例4：T細胞銜接體的體內活性
本實施例描述的實驗表徵了含有T細胞銜接體的抗Her2或抗CD38的體內特性和活性。
使用包含抗Her2的三特異性結合蛋白的體內測定
如實施例1所述，使用Her2×CD28×CD3三特異性抗體的劑量遞增研究在非人靈長類動物(圖18A-18E)中進行。結合蛋白1中的所有三個結合域均與猴CD3/CD28/HER2具有交叉反應性。設計了劑量遞增毒性研究來評估分子的潜在毒性概貌。收集血樣用於血清和PBMC分離。在每次投予後研究循環T細胞群體(圖18A和18B)，以及T細胞亞群活化(CD69+)(圖18C和18D)。循環中CD4和CD8 T細胞的百分比在低劑量升高時增加，但在高劑量升高時最終降低。顯著的CD4和CD8 T細胞活化僅在100μg/kg劑量處突出，表明相對高的可耐受劑量。還測量了幾種細胞因子的血清水平。僅在最高劑量處觀察到顯著的細胞因子釋放(100μg/kg；圖18E)。
接下來，如實施例1(圖19A-20H)所述檢查三特異性抗Her2×CD28×CD3結合蛋白1抗體對人源化小鼠模型中腫瘤生長的影響。圖19A和19B總結了使用接種有人HER2+乳腺癌細胞系BT474的人CD34+造血幹細胞移植的NSG小鼠(hu-CD34)模型得到的結果。所有劑量組中顯著的抗腫瘤活性均是明顯的。抗腫瘤活性是劑量依賴性的，與25μg/kg的對照組相比有統計學差异。任何治療組中 均未觀察到明顯體重减輕。
還進行了使用人HER2+乳腺癌細胞系BT474接種的人PBMC重建NSG小鼠模型的第二次體內研究(圖20A-20H)。在高劑量組(100和500μg/kg)內觀察到了顯著的抗腫瘤活性。在500μg/kg組的40%的小鼠中觀察到腫瘤縮减。抗腫瘤活性是劑量依賴性的。用100和500μg/kg劑量治療的組中的抗腫瘤活性顯著優于抗HER2治療組(0.1至10mg/kg)，指示來自結合蛋白1的優异的抗腫瘤活性。任何觀察組中均未觀察到明顯體重减輕。
使用包含抗CD38的三特異性結合蛋白的體內測定
使用如實施例1中所述的三特異性抗CD38×CD28×CD3抗體(結合蛋白5)在非人靈長類中進行劑量遞增研究(圖21A-21F)。結合蛋白5中的三個結合域中的兩個與猴CD3和CD28具有交叉反應性。設計了劑量遞增毒性研究來評估該分子的潜在毒性概貌。收集血樣用於血清和PBMC分離。每次投予後研究循環T細胞群體(圖21A和21B，柱狀圖)以及T細胞亞群活化(CD69+)(圖21A和21B，綫圖)。循環中的CD4和CD8 T細胞的百分比在低劑量升高時增加，但在高劑量升高時最終降低。顯著的CD4和CD8 T細胞活化僅在100μg/kg劑量處突出，表明相對高的可耐受劑量。還測量了幾種細胞因子的血清水平。僅在最高劑量(100μg/kg；圖21C-21F)處觀察到顯著的細胞因子釋放。
如實施例1所述，隨後在人源化小鼠(圖22A-23D)中測試了抗CD38×CD28×CD3三特異性抗體的體內活性。圖22A-22C總結了來自使用人CD34+造血幹細胞移接的NSG小鼠(hu-CD34)模型(其移植有用CD38和PD-L1轉導的人MM細胞系RPMI-8226，以5、50和100μg/kg的劑量用結合蛋白5處理)的劑量確定先導研究的結果。顯著的抗腫瘤活性僅在5μg/kg處理的組中明顯(圖22A)。在結合蛋白5處理的小鼠(5μg/kg)(圖22B和22C)中觀察到CD8 T細胞浸潤。
使用結合蛋白5，以0.04-5μg/kg投予，在相同模型中進行隨訪研究(圖23A-23D)。在結合蛋白5處理的所有組中均顯示出顯著的抗腫瘤活性(圖23B)，其在 研究結束時與對照有統計學差异(圖23C)。在任何處理組中均未觀察到顯著的體重减輕(圖23A)。在用指定濃度的結合蛋白5或PBS對照(圖23D)處理的小鼠中，在第一次投予後4小時觀察到血清炎症細胞因子IFN-γ，TNF-α和IL-2的劑量依賴性誘導，指示三特異性結合蛋白5的體內有效T細胞活化。
對人源化CD34+ NSG小鼠(n=3)靜脉注射100mcg/kg的三特異性抗體(三角形)，雙特異性抗體(正方形)或單特異性抗體(圓形)。在抗體注射後0(注射前)、1、24和72小時，通過在各個時間點由Luminex’s xMAP多重複合技術確定CD69的平均百分比增加，血漿中CD62L和/或炎性細胞因子的濃度的百分比降低來測量CD4+或CD8+ T細胞的活化。各種三特異性抗體的T細胞活化結果如圖24-26C所示。
在投予結合蛋白5、抗CD3/CD28_IgG4雙特異性抗體和抗CD28 IgG4抗體對照後，在人CD34+造血幹細胞移植的NSG小鼠(hu-CD34)模型中研究全身性體內T細胞活化(圖24)。將100μg/kg的結合蛋白5和對照抗體以3只小鼠/組投予。在投予後1小時，24小時和72小時收集血樣。從血液分離小鼠血清和人T細胞，將其保存用於T細胞活化分析和用於血清細胞因子水平的測量。圖24和圖25顯示，在抗體輸注後1小時人CD4和CD8 T細胞被活化，其在72小時處恢復到基綫。圖26A-26C顯示在輸注後1小時觀察到的相同小鼠中血清IFN-γ，TNF-α和IL-2釋放的升高，幷在24小時後恢復至基綫。這些結果證明結合蛋白5和抗CD3/CD28 IgG4雙特異性抗體在給定動物模型中有效激活T細胞，使其適合于體內功效研究。
實施例5：針對細胞因子的三特異性和雙特異性三價結合蛋白的表徵
如下實施例描述了表徵靶向人細胞因子的新型三特異性和雙特異性三價結合蛋白的穩定性，結合特性和活性的實驗。
設計了三特異性結合蛋白(例如其結合三種不同的靶蛋白；結合蛋白9-15)，以及雙特異性三價結合蛋白(例如在單價結合一個抗原上二價結合一個抗 原；結合蛋白16-19)(表C)。除了結構蛋白11，其中在CODV-LC和Fab-臂-LC兩者上都使用κ恆定域，所有其他結合蛋白(9-10和12-19)都以CODV-LC上的κ恆定域和Fab-臂-LC上的λ恆定域來產生。使用IgG1序列作為Fc骨架。當CODV-HC携帶節-RF突變(S354C，T366W；H435R和Y436F)，Fab-臂-HC含有穴突變(Y349C，T366S，L368A，Y407V)。
Figure 106112360-A0305-02-0180-6
三特異性和雙特異性三價結合蛋白如上文所述生產幷純化(圖27)。
Figure 106112360-A0305-02-0181-7
為了評估三特異性結合蛋白的穩定性，通過DSF評價其熔點幷與親本抗體的熱穩定性進行比較(表E)。
Figure 106112360-A0305-02-0181-8
nd=未確定
為了評估三特異性形式中每個單一抗體結合域的結合親和力，如前所述進行每個單一抗原的SPR分析。結果是針對親本抗體的親和力的基準(表F，G和H)。
Figure 106112360-A0305-02-0182-9
Figure 106112360-A0305-02-0182-10
Figure 106112360-A0305-02-0183-11
為了評估三特異性結合蛋白的中和活性，使用不同的HEK Blue套組(Invivogen)進行細胞測定。細胞因子在96孔板中在室溫用不同濃度的抗細胞因子抗體預溫育30分鐘。對照包括僅細胞因子或僅抗體的使用。將50,000個HEK Blue細胞(HEK Blue TNFa/IL1ß細胞(InvivoGen，目錄# hkb-tnfil1；HEK Blue STAT-6細胞(InvivoGen，目錄# Hkb.stat6)添加至細胞因子/抗體混合物，幷在5% CO2的培養箱中于37℃溫育23小時。將QuantiBlue試劑添加至各個培養孔，幷在37℃處溫育2小時。在620nm處測量OD，幷使用BioStat Speed 2.0計算IC50。各種三特異性抗體的HEK Blue報告細胞測定結果示于表I和表M。
然後，針對單一親本抗體計算結合蛋白9-15和基準的IC50值(表I)。
Figure 106112360-A0305-02-0183-12
Figure 106112360-A0305-02-0184-13
通過差示掃描螢光測定法測量雙特異性三價結合蛋白的熱穩定性(DSF；表J)。
Figure 106112360-A0305-02-0184-14
測量了針對人IL-4(表K)和IL-13(表K和L)的各個雙特異性三價結合蛋白所結合的靶蛋白的結合親和力和數目。
Figure 106112360-A0305-02-0184-16
Figure 106112360-A0305-02-0185-17
Figure 106112360-A0305-02-0185-18
最終，計算了結合蛋白16-19的IC50值(表M)。
Figure 106112360-A0305-02-0185-20
實施例6：三特異性結合蛋白形式優化
許多現有的异二聚體結合蛋白形式(例如雙特異性抗體及其各種變體)的問題在于，僅純化所需的异二聚體物質而不包括任一同二聚體物質是困難的。因此，有效純化所需的异二聚體結合蛋白的方法是非常有意義的，例如用於工業規模生產。
如本文所述，本發明的結合蛋白可包括幾個可選特徵，包括但不限于節和穴突變(例如促進適當的异二聚體形成)和突變以改進純化。此外，這些結合蛋白包括兩條輕鏈，導致四種潜在的構型：兩條κ輕鏈，兩條λ輕鏈，具有雙重可變域的臂(“CODV臂”)上的κ輕鏈和傳統抗體臂(“Fab臂”)上的λ輕鏈，以及CODV臂上的λ輕鏈和Fab臂上的κ輕鏈。
因此，進行實驗以鑒定允許有效純化所需結合蛋白的方法。還測試了結合蛋白變體的純化效率。
圖28A示出了本發明的示例性結合蛋白的圖，其表明了導致獨特構型的變體。這些實驗測試了布置(placement)的效果：κ和λ輕鏈(例如兩個κ，兩個λ，CODV臂上的κ和Fab臂上的λ，以及CODV臂上的λ和Fab臂上的κ)，節和穴突變(例如CODV臂上的節突變和Fab臂上的穴突變，CODV臂上的穴突變和Fab臂上的節突變)和H435R/Y436F突變(“RF突變”，例如CODV或Fab臂上的RF突變，或沒有RF突變)。共測試了18種不同的變體，如圖28B所示。對于這些實驗，CODV臂具有特異性針對TNFa(即分別為SEQ ID NO：168和169的VH和VL序列)和IL4(即分別為SEQ ID NO：170和171的VH和VL序列)的抗原結合位點，而Fab臂具有特異性針對IL13的抗原結點位點(即分別為SEQ ID NO：172和173的VH和VL序列)。S354C和T366W用於節突變，而Y349C，T366S，L368A和Y407V用於穴突變。
測試了各種處理步驟監測CODV和Fab臂的正確配對(例如與CODV或Fab同二聚體相反)的能力，以及正確的重鏈-輕鏈配對(例如與Fab臂輕鏈和CODV臂重 鏈之間的配對相反，或與Fab臂重鏈和CODV臂輕鏈之間的配對相反)。發現分析型大小排阻色譜(SEC)在區分正確的重鏈和輕鏈配對方面無效；發現具有與CODV重鏈錯配的Fab臂輕鏈的結合蛋白和具有兩個Fab臂的同二聚體結合蛋白與所需的三特異性結合蛋白共同洗脫。然而，發現分析疏水相互作用色譜(HIC)從具有與CODV重鏈錯配的Fab臂輕鏈的結合蛋白和具有兩個Fab臂的同二聚體結合蛋白中解析出(resolve)所需的三特異性結合蛋白(圖29)。
圖28B所示的18個結合蛋白構型通過蛋白A親和色譜純化，然後是KappaSelect(GE Healthcare)純化。通過HIC色譜法監測物質種類。一個結合蛋白構型得以高效純化，而不包括錯配種類：CODV臂的λ輕鏈，Fab臂的κ輕鏈，CODV臂上的節突變，Fab臂上的穴突變和Fab臂上的RF突變。HIC色譜(圖30A)，SDS-PAGE(圖30B)和完整質量分析證明，純化出了對應于所需三特異性結合蛋白的單一種類。
這些結果鑒定了一個結合蛋白構型，其允許更有效地從錯配的種類純化所需的結合蛋白種類。此外，蛋白A的純化過程之後是KappaSelect純化步驟，顯示其提供有效地從錯配的種類分離所需結合蛋白。
雖然本發明包括各種實施方案，但是應當理解，本領域技術人員會想到變化和修改。因此，所附權利要求書旨在覆蓋落入本發明範圍內的所有等同變化。此外，本文使用的部章節分標題僅出于組織目的，而不應被理解為限制所描述的主題。
除非明確指出相反，否則本文所述的每個實施方案可以與任何其它實施方案或多個實施方案組合。具體地，表明為優選的或有利的任何特徵或實施方案可以與表明為優選或有利的任何其它特徵或多個特徵或實施方案或多個實施方案組合，除非清楚的相反指示。
本申請中引用的所有參考文獻通過提述明確幷入本文。
序列
Figure 106112360-A0305-02-0188-21
Figure 106112360-A0305-02-0188-22
Figure 106112360-A0305-02-0189-23
Figure 106112360-A0305-02-0190-24
Figure 106112360-A0305-02-0191-25
Figure 106112360-A0305-02-0192-26
Figure 106112360-A0305-02-0193-27
Figure 106112360-A0305-02-0194-28
Figure 106112360-A0305-02-0195-29
Figure 106112360-A0305-02-0196-30
Figure 106112360-A0305-02-0197-31
Figure 106112360-A0305-02-0198-32
Figure 106112360-A0305-02-0199-33
Figure 106112360-A0305-02-0200-34
Figure 106112360-A0305-02-0201-35
Figure 106112360-A0305-02-0202-36
Figure 106112360-A0305-02-0203-37
Figure 106112360-A0305-02-0204-38
Figure 106112360-A0305-02-0205-39
Figure 106112360-A0305-02-0206-40
Figure 106112360-A0305-02-0207-41
Figure 106112360-A0305-02-0208-42
Figure 106112360-A0305-02-0209-43
Figure 106112360-A0305-02-0210-44
Figure 106112360-A0305-02-0211-45
Figure 106112360-A0305-02-0212-46
Figure 106112360-A0305-02-0213-47
Figure 106112360-A0305-02-0214-48
Figure 106112360-A0305-02-0215-49
Figure 106112360-A0305-02-0216-50
Figure 106112360-A0305-02-0217-51
Figure 106112360-A0305-02-0218-52
Figure 106112360-A0305-02-0219-53
Figure 106112360-A0305-02-0220-54
Figure 106112360-A0305-02-0221-55
Figure 106112360-A0305-02-0222-56
Figure 106112360-A0305-02-0223-57
Figure 106112360-A0305-02-0224-58
Figure 106112360-A0305-02-0225-59
Figure 106112360-A0305-02-0226-93
Figure 106112360-A0305-02-0226-94
Figure 106112360-A0305-02-0227-61
Figure 106112360-A0305-02-0228-62
Figure 106112360-A0305-02-0229-63
Figure 106112360-A0305-02-0230-64
Figure 106112360-A0305-02-0231-65
Figure 106112360-A0305-02-0232-66
Figure 106112360-A0305-02-0233-67
Figure 106112360-A0305-02-0234-68
Figure 106112360-A0305-02-0235-69
Figure 106112360-A0305-02-0236-70
Figure 106112360-A0305-02-0237-71
Figure 106112360-A0305-02-0238-72
Figure 106112360-A0305-02-0239-73
Figure 106112360-A0305-02-0240-74
Figure 106112360-A0305-02-0241-75
Figure 106112360-A0305-02-0242-76
Figure 106112360-A0305-02-0243-77
Figure 106112360-A0305-02-0244-78
Figure 106112360-A0305-02-0245-79
Figure 106112360-A0305-02-0246-80
Figure 106112360-A0305-02-0247-81
Figure 106112360-A0305-02-0248-82
Figure 106112360-A0305-02-0249-83
Figure 106112360-A0305-02-0250-84
Figure 106112360-A0305-02-0251-85
Figure 106112360-A0305-02-0252-86
Figure 106112360-A0305-02-0253-87
Figure 106112360-A0305-02-0254-88
Figure 106112360-A0305-02-0255-89
Figure 106112360-A0305-02-0256-90
Figure 106112360-A0305-02-0257-92
Figure 106112360-A0305-02-0258-95
Figure 106112360-A0305-02-0258-96
Figure 106112360-A0305-02-0259-97
Figure 106112360-A0305-02-0260-98
Figure 106112360-A0305-02-0261-99
<110> 法商賽諾菲公司(SANOFI)
<120> 三特異性和/或三價結合蛋白
<130> 183952027140
<140> 106112360
<141> 2017-04-13
<150> US 62/322,036
<151> 2016-04-13
<150> US 62/331,191
<151> 2016-05-03
<150> US 62/412,187
<151> 2016-10-24
<150> EP 17305298.6
<151> 2017-03-17
<160> 179
<170> 用於Windows的FastSEQ版本4.0
<210> 1
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 1
Figure 106112360-A0305-02-0262-101
Figure 106112360-A0305-02-0263-100
<210> 2
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 2
Figure 106112360-A0305-02-0264-102
<210> 3
<211> 571
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 3
Figure 106112360-A0305-02-0264-103
Figure 106112360-A0305-02-0265-104
Figure 106112360-A0305-02-0266-105
<210> 4
<211> 338
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 4
Figure 106112360-A0305-02-0266-106
Figure 106112360-A0305-02-0267-107
<210> 5
<211> 1341
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 5
Figure 106112360-A0305-02-0267-108
Figure 106112360-A0305-02-0268-109
<210> 6
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 6
Figure 106112360-A0305-02-0268-110
<210> 7
<211> 1713
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 7
Figure 106112360-A0305-02-0268-111
Figure 106112360-A0305-02-0269-112
<210> 8
<211> 1014
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 8
Figure 106112360-A0305-02-0269-113
<210> 9
<211> 571
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 9
Figure 106112360-A0305-02-0270-114
Figure 106112360-A0305-02-0271-115
<210> 10
<211> 342
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 10
Figure 106112360-A0305-02-0271-116
Figure 106112360-A0305-02-0272-117
<210> 11
<211> 1713
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 11
Figure 106112360-A0305-02-0272-118
Figure 106112360-A0305-02-0273-119
<210> 12
<211> 1026
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 12
Figure 106112360-A0305-02-0273-120
<210> 13
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 13
Figure 106112360-A0305-02-0274-121
Figure 106112360-A0305-02-0275-122
<210> 14
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 14
Figure 106112360-A0305-02-0275-123
Figure 106112360-A0305-02-0276-124
<210> 15
<211> 1353
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 15
Figure 106112360-A0305-02-0276-125
<210> 16
<211> 654
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 16
Figure 106112360-A0305-02-0276-126
Figure 106112360-A0305-02-0277-127
<210> 17
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 17
Figure 106112360-A0305-02-0277-131
Figure 106112360-A0305-02-0278-129
<210> 18
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 18
Figure 106112360-A0305-02-0278-130
Figure 106112360-A0305-02-0279-132
<210> 19
<211> 1341
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 19
Figure 106112360-A0305-02-0279-133
<210> 20
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 20
Figure 106112360-A0305-02-0280-134
<210> 21
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 21
Figure 106112360-A0305-02-0280-135
Figure 106112360-A0305-02-0281-136
<210> 22
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 22
Figure 106112360-A0305-02-0281-137
Figure 106112360-A0305-02-0282-138
<210> 23
<211> 1335
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 23
Figure 106112360-A0305-02-0282-139
Figure 106112360-A0305-02-0283-140
<210> 24
<211> 639
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 24
Figure 106112360-A0305-02-0283-141
<210> 25
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 25
Figure 106112360-A0305-02-0283-142
<210> 26
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 26
Figure 106112360-A0305-02-0284-143
<210> 27
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 27
Figure 106112360-A0305-02-0284-144
<210> 28
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 28
Figure 106112360-A0305-02-0284-145
<210> 29
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 29
Figure 106112360-A0305-02-0284-146
<210> 30
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 30
Figure 106112360-A0305-02-0285-147
<210> 31
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 31
Figure 106112360-A0305-02-0285-148
<210> 32
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 32
Figure 106112360-A0305-02-0285-149
<210> 33
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 33
Figure 106112360-A0305-02-0285-150
<210> 34
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 34
Figure 106112360-A0305-02-0286-151
<210> 35
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 35
Figure 106112360-A0305-02-0286-152
<210> 36
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 36
Figure 106112360-A0305-02-0286-153
<210> 37
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 37
Figure 106112360-A0305-02-0286-154
<210> 38
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 38
Figure 106112360-A0305-02-0287-155
<210> 39
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 39
Figure 106112360-A0305-02-0287-156
<210> 40
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 40
Figure 106112360-A0305-02-0287-157
<210> 41
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 41
Figure 106112360-A0305-02-0287-159
<210> 42
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 42
Figure 106112360-A0305-02-0288-160
<210> 43
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 43
Figure 106112360-A0305-02-0288-161
<210> 44
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 44
Figure 106112360-A0305-02-0288-162
<210> 45
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 45
Figure 106112360-A0305-02-0288-163
<210> 46
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 46
Figure 106112360-A0305-02-0289-164
<210> 47
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 47
Figure 106112360-A0305-02-0289-166
<210> 48
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 48
Figure 106112360-A0305-02-0289-167
<210> 49
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 49
Figure 106112360-A0305-02-0290-168
<210> 50
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 50
Figure 106112360-A0305-02-0290-170
<210> 51
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 51
Figure 106112360-A0305-02-0290-169
<210> 52
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 52
Figure 106112360-A0305-02-0290-172
<210> 53
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 53
Figure 106112360-A0305-02-0291-173
<210> 54
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 54
Figure 106112360-A0305-02-0291-174
<210> 55
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 55
Figure 106112360-A0305-02-0291-175
<210> 56
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 56
Figure 106112360-A0305-02-0291-176
<210> 57
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 57
Figure 106112360-A0305-02-0292-177
<210> 58
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 58
Figure 106112360-A0305-02-0292-179
<210> 59
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 59
Figure 106112360-A0305-02-0292-180
<210> 60
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 60
Figure 106112360-A0305-02-0292-181
Figure 106112360-A0305-02-0293-182
Figure 106112360-A0305-02-0294-183
<210> 61
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 61
Figure 106112360-A0305-02-0294-184
<210> 62
<211> 570
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 62
Figure 106112360-A0305-02-0295-185
Figure 106112360-A0305-02-0296-186
<210> 63
<211> 345
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 63
Figure 106112360-A0305-02-0296-187
Figure 106112360-A0305-02-0297-188
<210> 64
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 64
Figure 106112360-A0305-02-0297-189
Figure 106112360-A0305-02-0298-190
<210> 65
<211> 639
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 65
Figure 106112360-A0305-02-0298-191
<210> 66
<211> 1710
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 66
Figure 106112360-A0305-02-0298-192
Figure 106112360-A0305-02-0299-193
<210> 67
<211> 1035
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 67
Figure 106112360-A0305-02-0299-194
<210> 68
<211> 570
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 68
Figure 106112360-A0305-02-0300-195
Figure 106112360-A0305-02-0301-196
<210> 69
<211> 345
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 69
Figure 106112360-A0305-02-0301-197
Figure 106112360-A0305-02-0302-198
<210> 70
<211> 1035
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 70
Figure 106112360-A0305-02-0302-199
Figure 106112360-A0305-02-0303-200
<210> 71
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 71
Figure 106112360-A0305-02-0303-201
Figure 106112360-A0305-02-0304-202
<210> 72
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 72
Figure 106112360-A0305-02-0304-204
<210> 73
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 73
Figure 106112360-A0305-02-0304-205
Figure 106112360-A0305-02-0305-206
<210> 74
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 74
Figure 106112360-A0305-02-0306-207
<210> 75
<211> 573
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 75
Figure 106112360-A0305-02-0306-208
Figure 106112360-A0305-02-0307-209
Figure 106112360-A0305-02-0308-210
<210> 76
<211> 341
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 76
Figure 106112360-A0305-02-0308-211
Figure 106112360-A0305-02-0309-212
<210> 77
<211> 1341
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 77
Figure 106112360-A0305-02-0309-213
Figure 106112360-A0305-02-0310-214
<210> 78
<211> 651
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 78
Figure 106112360-A0305-02-0310-215
<210> 79
<211> 1719
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 79
Figure 106112360-A0305-02-0310-216
Figure 106112360-A0305-02-0311-217
<210> 80
<211> 1023
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 80
Figure 106112360-A0305-02-0311-218
<210> 81
<211> 573
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 81
Figure 106112360-A0305-02-0312-219
Figure 106112360-A0305-02-0313-220
<210> 82
<211> 341
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 82
Figure 106112360-A0305-02-0313-222
Figure 106112360-A0305-02-0314-223
<210> 83
<211> 1719
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 83
Figure 106112360-A0305-02-0314-224
Figure 106112360-A0305-02-0315-225
<210> 84
<211> 1023
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 84
Figure 106112360-A0305-02-0315-226
<210> 85
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 85
Figure 106112360-A0305-02-0316-227
Figure 106112360-A0305-02-0317-228
<210> 86
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 86
Figure 106112360-A0305-02-0317-229
Figure 106112360-A0305-02-0318-230
<210> 87
<211> 568
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 87
Figure 106112360-A0305-02-0318-231
Figure 106112360-A0305-02-0319-232
<210> 88
<211> 344
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 88
Figure 106112360-A0305-02-0319-233
Figure 106112360-A0305-02-0320-234
<210> 89
<211> 1356
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 89
Figure 106112360-A0305-02-0321-235
<210> 90
<211> 639
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 90
Figure 106112360-A0305-02-0321-237
<210> 91
<211> 1704
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 91
Figure 106112360-A0305-02-0322-238
<210> 92
<211> 1035
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 92
Figure 106112360-A0305-02-0322-239
Figure 106112360-A0305-02-0323-240
<210> 93
<211> 568
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 93
Figure 106112360-A0305-02-0323-241
Figure 106112360-A0305-02-0324-242
<210> 94
<211> 345
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 94
Figure 106112360-A0305-02-0325-244
<210> 95
<211> 1704
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 95
Figure 106112360-A0305-02-0326-245
<210> 96
<211> 1035
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 96
Figure 106112360-A0305-02-0327-246
<210> 97
<211> 1710
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 97
Figure 106112360-A0305-02-0327-248
Figure 106112360-A0305-02-0328-249
<210> 98
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 98
Figure 106112360-A0305-02-0328-250
<210> 99
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 99
Figure 106112360-A0305-02-0328-251
<210> 100
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 100
Figure 106112360-A0305-02-0328-252
<210> 101
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 101
Figure 106112360-A0305-02-0329-256
<210> 102
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 102
Figure 106112360-A0305-02-0329-255
<210> 103
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 103
Figure 106112360-A0305-02-0329-254
<210> 104
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 104
Figure 106112360-A0305-02-0329-253
<210> 105
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 105
Figure 106112360-A0305-02-0330-257
<210> 106
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 106
Figure 106112360-A0305-02-0330-258
<210> 107
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 107
Figure 106112360-A0305-02-0330-259
<210> 108
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 108
Figure 106112360-A0305-02-0330-261
<210> 109
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 109
Figure 106112360-A0305-02-0331-262
<210> 110
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 110
Figure 106112360-A0305-02-0331-263
<210> 111
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 111
Figure 106112360-A0305-02-0331-264
<210> 112
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 112
Figure 106112360-A0305-02-0331-265
Figure 106112360-A0305-02-0332-266
<210> 113
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 113
Figure 106112360-A0305-02-0332-267
<210> 114
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 114
Figure 106112360-A0305-02-0332-268
Figure 106112360-A0305-02-0333-269
<210> 115
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 115
Figure 106112360-A0305-02-0333-270
Figure 106112360-A0305-02-0334-271
<210> 116
<211> 1344
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 116
Figure 106112360-A0305-02-0334-272
Figure 106112360-A0305-02-0335-273
<210> 117
<211> 639
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 117
Figure 106112360-A0305-02-0335-274
<210> 118
<211> 1713
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 118
Figure 106112360-A0305-02-0335-276
Figure 106112360-A0305-02-0336-277
<210> 119
<211> 1026
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 119
Figure 106112360-A0305-02-0336-279
<210> 120
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 120
Figure 106112360-A0305-02-0337-281
<210> 121
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 121
Figure 106112360-A0305-02-0337-282
<210> 122
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 122
Figure 106112360-A0305-02-0337-283
<210> 123
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 123
Figure 106112360-A0305-02-0337-284
<210> 124
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 124
Figure 106112360-A0305-02-0338-285
<210> 125
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 125
Figure 106112360-A0305-02-0338-286
<210> 126
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 126
Figure 106112360-A0305-02-0338-287
<210> 127
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 127
Figure 106112360-A0305-02-0338-288
<210> 128
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 128
Figure 106112360-A0305-02-0339-289
<210> 129
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 129
Figure 106112360-A0305-02-0339-291
<210> 130
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 130
Figure 106112360-A0305-02-0339-292
<210> 131
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 131
Figure 106112360-A0305-02-0339-293
<210> 132
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 132
Figure 106112360-A0305-02-0340-294
<210> 133
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 133
Figure 106112360-A0305-02-0340-296
<210> 134
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 134
Figure 106112360-A0305-02-0340-297
<210> 135
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 135
Figure 106112360-A0305-02-0340-298
<210> 136
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 136
Figure 106112360-A0305-02-0341-299
<210> 137
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 137
Figure 106112360-A0305-02-0341-300
<210> 138
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 138
Figure 106112360-A0305-02-0341-301
<210> 139
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 139
Figure 106112360-A0305-02-0341-302
Figure 106112360-A0305-02-0342-303
<210> 140
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 140
Figure 106112360-A0305-02-0342-304
<210> 141
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 141
Figure 106112360-A0305-02-0342-305
<210> 142
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 142
Figure 106112360-A0305-02-0342-306
<210> 143
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 143
Figure 106112360-A0305-02-0343-307
<210> 144
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 144
Figure 106112360-A0305-02-0343-308
<210> 145
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 145
Figure 106112360-A0305-02-0343-309
<210> 146
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 146
Figure 106112360-A0305-02-0343-310
<210> 147
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 147
Figure 106112360-A0305-02-0344-311
<210> 148
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 148
Figure 106112360-A0305-02-0344-312
<210> 149
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 149
Figure 106112360-A0305-02-0344-313
<210> 150
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 150
Figure 106112360-A0305-02-0344-314
Figure 106112360-A0305-02-0345-315
<210> 151
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 151
Figure 106112360-A0305-02-0345-316
<210> 152
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 152
Figure 106112360-A0305-02-0345-317
Figure 106112360-A0305-02-0346-318
<210> 153
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 153
Figure 106112360-A0305-02-0346-319
<210> 154
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 154
Figure 106112360-A0305-02-0346-320
Figure 106112360-A0305-02-0347-321
<210> 155
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 155
Figure 106112360-A0305-02-0347-322
<210> 156
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 156
Figure 106112360-A0305-02-0347-324
Figure 106112360-A0305-02-0348-325
<210> 157
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 157
Figure 106112360-A0305-02-0348-326
<210> 158
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 158
Figure 106112360-A0305-02-0349-327
<210> 159
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 159
Figure 106112360-A0305-02-0349-328
<210> 160
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 160
Figure 106112360-A0305-02-0350-329
<210> 161
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 161
Figure 106112360-A0305-02-0350-330
<210> 162
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 162
Figure 106112360-A0305-02-0351-331
<210> 163
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 163
Figure 106112360-A0305-02-0351-332
<210> 164
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 164
Figure 106112360-A0305-02-0352-333
<210> 165
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 165
Figure 106112360-A0305-02-0352-334
<210> 166
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 166
Figure 106112360-A0305-02-0353-335
<210> 167
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 167
Figure 106112360-A0305-02-0353-336
<210> 168
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 168
Figure 106112360-A0305-02-0354-337
<210> 169
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 169
Figure 106112360-A0305-02-0354-339
Figure 106112360-A0305-02-0355-340
<210> 170
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 170
Figure 106112360-A0305-02-0355-341
<210> 171
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 171
Figure 106112360-A0305-02-0355-342
Figure 106112360-A0305-02-0356-343
<210> 172
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 172
Figure 106112360-A0305-02-0356-344
<210> 173
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 173
Figure 106112360-A0305-02-0356-346
Figure 106112360-A0305-02-0357-347
<210> 174
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)...(5)
<223> Can be absent or present,or present in repeats of up to 5 times
<400> 174
Figure 106112360-A0305-02-0357-348
<210> 175
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 175
Figure 106112360-A0305-02-0357-349
<210> 176
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 176
Figure 106112360-A0305-02-0357-351
<210> 177
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 177
Figure 106112360-A0305-02-0358-352
<210> 178
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 178
Figure 106112360-A0305-02-0358-353
<210> 179
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 179
Figure 106112360-A0305-02-0358-354

Claims (50)

  1. 一種結合蛋白，其包含形成3個抗原結合位點的4條多肽鏈，該3個抗原結合位點特異性結合一個或多個靶蛋白，其中第一多肽鏈包含如下式表示的結構：VL2-L1-VL1-L2-CL [I]且第二多肽鏈包含如下式表示的結構：VH1-L3-VH2-L4-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [II]且第三多肽鏈包含如下式表示的結構：VH3-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [III]且第四多肽鏈包含如下式表示的結構：VL3-CL [IV]其中：VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變域；VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變域；VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變域；VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變域；VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變域；VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變域；CL是免疫球蛋白輕鏈恆定域；CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恆定域；CH2是免疫球蛋白CH2重鏈恆定域；CH3是免疫球蛋白CH3重鏈恆定域；鉸鏈是連接CH1和CH2域的免疫球蛋白鉸鏈區；且L1、L2、L3和L4是胺基酸連接子；其中該式I的多肽和該式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對；且 其中VH1和VL1形成結合對及第一抗原結合位點，其中VH2和VL2形成結合對及第二抗原結合位點，其中VH3和VL3形成結合對及第三抗原結合位點。
  2. 如請求項1之結合蛋白，其中：(a)L1、L2、L3、或L4的至少一者獨立地長度為0個胺基酸；或(b)L1、L2、L3、或L4各自獨立地長度為1至15個胺基酸。
  3. 如請求項1之結合蛋白，其中(a)L1、L2、L3及L4各自獨立地長度為0個胺基酸或包含選自由下列組成之群組的序列：SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：105、S、RT、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：175、SEQ ID NO：525和SEQ ID NO：148；或(b)L1、L2、L3及L4各自獨立地包含選自由下列組成之群組的序列：SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：175、SEQ ID NO：525和SEQ ID NO：148。
  4. 如請求項1之結合蛋白，其中(a)L1包含SEQ ID NO：175之序列，L2包含SEQ ID NO：106之序列，L3包含序列S，且L4包含序列RT；(b)L1包含SEQ ID NO：104之序列，L2包含SEQ ID NO：104之序列，L3長度為0個胺基酸，且L4長度為0個胺基酸；(c)L1包含SEQ ID NO：148之序列，L2包含SEQ ID NO：148之序列，L3長度為0個胺基酸，且L4長度為0個胺基酸；或(d)L1包含SEQ ID NO：105之序列，L2長度為0個胺基酸，L3包含SEQ ID NO：105之序列，且L4長度為0個胺基酸。
  5. 如請求項1之結合蛋白，其中該結合蛋白為三特異性且可特異性結合3個不同的抗原標靶。
  6. 如請求項1-5中任一項之結合蛋白，其中該結合蛋白特異性結合3個靶蛋白，該靶蛋白對應於T細胞上的2個靶蛋白及1個腫瘤靶蛋白。
  7. 如請求項6之結合蛋白，其中T細胞上的該靶蛋白之一是CD3，T細胞上的該靶蛋白之一是CD28，且該腫瘤靶蛋白是CD38。
  8. 如請求項1-5中任一項之結合蛋白，其中該結合蛋白特異性結合3個靶蛋白，該靶蛋白對應於T細胞上的2個靶蛋白及1個選自由以下組成之群之靶蛋白：A2AR、APRIL、ATPD酶(ATPDase)、BAFF、BAFFR、BCMA、BlyS、BTK、BTLA、B7DC、B7H1、B7H4、B7H5、B7H6、B7H7、B7RP1、B7-4、C3、C5、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL15、CCL17、CCL19、CCL20、CCL21、CCL24、CCL25、CCL26、CCR3、CCR4、CD3、CD19、CD20、CD23、CD24、CD27、CD28、CD38、CD39、CD40、CD70、CD80、CD86、CD122、CD137、CD137L、CD152、CD154、CD160、CD272、CD273、CD274、CD275、CD276、CD278、CD279、CDH1、殼多糖酶、CLEC9、CLEC91、CRTH2、CSF-1、CSF-2、CSF-3、CX3CL1、CXCL12、CXCL13、CXCR3、DNGR-1、外核苷三磷酸鹽二磷酸水解酶1(ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1)、EGFR、ENTPD1、FCER1A、FCER1、FLAP、FOLH1、Gi24、GITR、GITRL、GM-CSF、Her2、HHLA2、HMGB1、HVEM、ICOSLG、IDO、IFNα、IgE、IGF1R、IL2Rβ、IL1、IL1A、IL1B、IL1F10、IL2、IL4、IL4Ra、IL5、IL5R、IL6、IL7、IL7Ra、IL8、IL9、IL9R、IL10、rhIL10、IL12、IL13、IL13Ra1、IL13Ra2、IL15、IL17、IL17Rb、IL18、IL22、IL23、IL25、IL27、IL33、IL35、ITGB4、ITK、KIR、LAG3、LAMP1、瘦素、LPFS2、II類MHC、NCR3LG1、NKG2D、NTPD酶-1(NTPDase-1)、OX40、OX40L、PD-1H、血小板受體、PROM1、S152、SISP1、SLC、SPG64、ST2、STEAP2、Syk激酶、TACI、TDO、T14、TIGIT、TIM3、TLR、TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、TMEF1、TNFa、TNFRSF7、Tp55、TREM1、TSLP、TSLPR、TWEAK、VEGF、VISTA、Vstm3、WUCAM和XCR1。
  9. 如請求項1之結合蛋白，其中該結合蛋白可抑制一個或多個靶蛋白的功能。
  10. 如請求項1之結合蛋白，其中： (a)VL1、VL2和VL3各自獨立地包含如SEQ ID NO：151、153、155、157、159、161、163、165和167中任一者所示的可變域序列；或(b)VL1、VL2和VL3各自獨立地包含輕鏈互補決定區，其包含如SEQ ID NO：43-59、123-125、138-140和149中任一者所示的胺基酸序列；且其中：(a)VH1、VH2和VH3各自獨立地包含如SEQ ID NO：150、152、154、156、158、160、162、164和166中任一者所示的可變域序列；或(b)VH1、VH2和VH3各自獨立地包含重鏈互補決定區，其包含如SEQ ID NO：25-42、120-122和126-128中任一者所示的胺基酸序列。
  11. 如請求項10之結合蛋白，其中：(a)VH1包含：包含SEQ ID NO：28的胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：29的胺基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：30的胺基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：46的胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：47的胺基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：48的胺基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的胺基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的胺基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：52的胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的胺基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的胺基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：25的胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：26的胺基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：43的胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：44的胺基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：45的胺基酸序列的CDR-L3；(b)VH1包含：包含SEQ ID NO：31的胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：32的胺基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：33的胺基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：49的胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：50的胺基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：51的胺基酸序列的CDR-L3；VH2 包含：包含SEQ ID NO：34的胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的胺基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的胺基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：52的胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的胺基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的胺基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：25的胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：26的胺基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：43的胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：44的胺基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：45的胺基酸序列的CDR-L3；(c)VH1包含：包含SEQ ID NO：28的胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：29的胺基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：30的胺基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：46的胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：47的胺基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：48的胺基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的胺基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的胺基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：52的胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的胺基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的胺基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：37的胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：38的胺基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：39的胺基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：55的胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：56的胺基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：57的胺基酸序列的CDR-L3；(d)VH1包含：含SEQ ID NO：31的胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：32的胺基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：33的胺基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：49的胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：50的胺基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：51的胺基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的胺基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的胺基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：52的胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的胺基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的胺基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：37的胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：38的胺基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：39的胺基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：55的胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：56的胺基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：57的胺基酸序列的CDR-L3；(e)VH1包含：包含SEQ ID NO：28的胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：29的胺基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：30的胺基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：46的胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：47的胺基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：48的胺基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的胺基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的胺基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：52的胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的胺基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的胺基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：40的胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：41的胺基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：42的胺基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：58的胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：44的胺基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：59的胺基酸序列的CDR-L3；(f)VH1包含：含SEQ ID NO：31的胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：32的胺基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：33的胺基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：49的胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：50的胺基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：51的胺基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的胺基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的胺基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：52的胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的胺基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的胺基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO： 40的胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：41的胺基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：42的胺基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：58的胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：44的胺基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：59的胺基酸序列的CDR-L3；(g)VH1包含：包含SEQ ID NO：28的胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：29的胺基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：30的胺基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：46的胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：47的胺基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：48的胺基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的胺基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的胺基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：52的胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的胺基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的胺基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：126的胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：127的胺基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：128的胺基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：138的胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：139的胺基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：140的胺基酸序列的CDR-L3；(h)VH1包含：含SEQ ID NO：31的胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：32的胺基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：33的胺基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：49的胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：50的胺基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：51的胺基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的胺基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的胺基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：52的胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的胺基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的胺基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：126的胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：127的胺基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：128的胺基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO： 138的胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：139的胺基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：140的胺基酸序列的CDR-L3；(i)VH1包含：包含SEQ ID NO：28的胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：29的胺基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：30的胺基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：46的胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：47的胺基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：48的胺基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的胺基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的胺基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：52的胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的胺基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的胺基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：120的胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：121的胺基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：122的胺基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：123的胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：124的胺基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：125的胺基酸序列的CDR-L3；或(j)VH1包含：含SEQ ID NO：31的胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：32的胺基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：33的胺基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：49的胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：50的胺基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：51的胺基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：34的胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：35的胺基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：36的胺基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：52的胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：53的胺基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：54的胺基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：120的胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：121的胺基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：122的胺基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：123的胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：124的胺基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：125的胺基酸序列的CDR-L3。
  12. 如請求項1之結合蛋白，其中：(a)VL1、VL2和VL3各自獨立地包含如SEQ ID NO：169、171和173中任一者所示的可變域序列；或(b)VL1、VL2和VL3各自獨立地包含輕鏈互補決定區，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：141-147、178和179；且其中：(a)VH1、VH2和VH3各自獨立地包含如SEQ ID NO：168、170和172中任一者所示的可變域序列；或(b)VH1、VH2和VH3各自獨立地包含重鏈互補決定區，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：129-137。
  13. 如請求項12之結合蛋白，其中：(a)VH1包含：包含SEQ ID NO：132的胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的胺基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的胺基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：143的胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的胺基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的胺基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：135的胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的胺基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的胺基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：145的胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的胺基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的胺基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：129的胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：130的胺基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：131的胺基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：141的胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：178的胺基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：142的胺基酸序列的CDR-L3；(b)VH1包含：包含SEQ ID NO：135的胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的胺基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的胺基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：145的胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO： 146的胺基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的胺基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：132的胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的胺基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的胺基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：143的胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：47的胺基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的胺基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：129的胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：130的胺基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：131的胺基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：141的胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：178的胺基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：142的胺基酸序列的CDR-L3；(c)VH1包含：包含SEQ ID NO：132的胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的胺基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的胺基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：143的胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的胺基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的胺基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：129的胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：130的胺基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：131的胺基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：141的胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：178的胺基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：142的胺基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：135的胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的胺基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的胺基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：145的胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的胺基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的胺基酸序列的CDR-L3；(d)VH1包含：包含SEQ ID NO：129的胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：130的胺基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：131的胺基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：141的胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：178的胺基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：142的胺基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：132的胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133 的胺基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的胺基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：143的胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的胺基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的胺基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：135的胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的胺基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的胺基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：145的胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的胺基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的胺基酸序列的CDR-L3；(e)VH1包含：包含SEQ ID NO：135的胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的胺基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的胺基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：145的胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的胺基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的胺基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：129的胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：130的胺基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：131的胺基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：141的胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：178的胺基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：142的胺基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：132的胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的胺基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的胺基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：143的胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的胺基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的胺基酸序列的CDR-L3；(f)VH1包含：包含SEQ ID NO：129的胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：130的胺基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：131的胺基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：141的胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：178的胺基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：142的胺基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：135的胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的胺基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的胺基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：145的胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的胺 基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的胺基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：132的胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的胺基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的胺基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：143的胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的胺基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的胺基酸序列的CDR-L3；(g)VH1包含：包含SEQ ID NO：135的胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的胺基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的胺基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：145的胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的胺基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的胺基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：132的胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的胺基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的胺基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：143的胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的胺基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的胺基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：135的胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的胺基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的胺基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：145的胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的胺基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的胺基酸序列的CDR-L3；(h)VH1包含：包含SEQ ID NO：135的胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的胺基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的胺基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：145的胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的胺基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的胺基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：132的胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的胺基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的胺基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：143的胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的胺基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的胺基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：132的胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的胺 基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的胺基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：143的胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的胺基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的胺基酸序列的CDR-L3；(i)VH1包含：包含SEQ ID NO：132的胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的胺基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的胺基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：143的胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的胺基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的胺基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：135的胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的胺基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的胺基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：145的胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的胺基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的胺基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：135的胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的胺基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的胺基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：145的胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的胺基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的胺基酸序列的CDR-L3；或(j)VH1包含：包含SEQ ID NO：132的胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的胺基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的胺基酸序列的CDR-H3；VL1包含：包含SEQ ID NO：143的胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的胺基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的胺基酸序列的CDR-L3；VH2包含：包含SEQ ID NO：135的胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：136的胺基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：137的胺基酸序列的CDR-H3；VL2包含：包含SEQ ID NO：145的胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：146的胺基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：147的胺基酸序列的CDR-L3；VH3包含：包含SEQ ID NO：132的胺基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：133的胺基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：134的胺基酸序列的CDR-H3；且VL3包含：包含SEQ ID NO：143的胺基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：179的胺基 酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：144的胺基酸序列的CDR-L3。
  14. 如請求項1、10及12中任一項之結合蛋白，其中該第二多肽鏈的CH3域包含與人類IgG1或IgG4的位置354和366對應的位置處的胺基酸取代，其根據EU索引，其中該胺基酸取代為S354C和T366W；且其中該第三多肽鏈的CH3域包含與人類IgG1或IgG4的位置349、366、368和407對應的位置處的胺基酸取代，其根據EU索引，其中該胺基酸取代為Y349C、T366S、L368A和Y407V。
  15. 如請求項1、10及12中任一項之結合蛋白，其中該第二多肽鏈的CH3域包含與人類IgG1或IgG4的位置349、366、368和407對應的位置處的胺基酸取代，其根據EU索引，其中該胺基酸取代為Y349C、T366S、L368A和Y407V；且其中該第三多肽鏈的CH3域包含與人類IgG1或IgG4的位置354和366對應的位置處的胺基酸取代，其根據EU索引，其中該胺基酸取代為S354C和T366W。
  16. 如請求項1之結合蛋白，其中該第二和第三多肽鏈二者的CH3域均包含與人類IgG1或IgG4的位置428和434對應的位置處的胺基酸取代，其根據EU索引，其中該胺基酸取代為M428L和N434S。
  17. 如請求項1之結合蛋白，其中該第二和第三多肽鏈的CH3域係人類IgG1或IgG4 CH3域，且其中該CH3域中僅一者包含與人類IgG1或IgG4的位置435和436對應的位置處的胺基酸取代，其根據EU索引，其中該胺基酸取代為H435R和Y436F。
  18. 如請求項1之結合蛋白，其中該第二和第三多肽鏈的CH3域係人類IgG4 CH3域，且其中該CH3域各自包含與人類IgG4的位置228和409對應的位置處的胺基酸取代，其根據EU索引，其中該胺基酸取代為S228P和R409K。
  19. 如請求項1之結合蛋白，其中該第二和第三多肽鏈的CH3域係人類IgG4 CH3域，且其中該CH3域各自包含與人類IgG4的位置234和235對應的位置處的胺基酸取代，其根據EU索引，其中該胺基酸取代為F234A和L235A。
  20. 如請求項1之結合蛋白，其中該第二和第三多肽鏈的CH3域係人類IgG1 CH3域，且其中該CH3域各自包含與人類IgG4的位置234和235對應的位置處的胺 基酸取代，其根據EU索引，其中該胺基酸取代為L234A和L235A。
  21. 如請求項1之結合蛋白，其中VH1和VL1形成特異性結合人類CD3的第一抗原結合位點，其中VH2和VL2形成特異性結合人類CD28的第二抗原結合位點，且其中VH3和VL3形成特異性結合人類腫瘤靶蛋白的第三抗原結合位點。
  22. 如請求項1之結合蛋白，其中VH1和VL1形成特異性結合人類CD28的第一抗原結合位點，其中VH2和VL2形成特異性結合人類CD3的第二抗原結合位點，且其中VH3和VL3形成特異性結合人類腫瘤靶蛋白的第三抗原結合位點。
  23. 如請求項21或22之結合蛋白，其中該第三抗原結合位點特異性結合選自由以下組成之群之人類腫瘤靶蛋白：CD19、CD20、CD38、Her2和LAMP1。
  24. 如請求項21或22之結合蛋白，其中該特異性結合CD3的抗原結合位點包含：(a)包含SEQ ID NO：152的胺基酸序列的重鏈可變域和包含SEQ ID NO：153的胺基酸序列的輕鏈可變域；或(b)包含SEQ ID NO：154的胺基酸序列的重鏈可變域和包含SEQ ID NO：155的胺基酸序列的輕鏈可變域。
  25. 如請求項21或22之結合蛋白，其中該特異性結合CD28的抗原結合位點包含：(a)包含SEQ ID NO：160的胺基酸序列的重鏈可變域和包含SEQ ID NO：161的胺基酸序列的輕鏈可變域；或(b)包含SEQ ID NO：162的胺基酸序列的重鏈可變域和包含SEQ ID NO：163的胺基酸序列的輕鏈可變域。
  26. 如請求項21或22之結合蛋白，其中該特異性結合腫瘤靶蛋白的抗原結合位點包含：(a)包含SEQ ID NO：156的胺基酸序列的重鏈可變域和包含SEQ ID NO：157的胺基酸序列的輕鏈可變域； (b)包含SEQ ID NO：158的胺基酸序列的重鏈可變域和包含SEQ ID NO：159的胺基酸序列的輕鏈可變域；(c)包含SEQ ID NO：164的胺基酸序列的重鏈可變域和包含SEQ ID NO：165的胺基酸序列的輕鏈可變域；(d)包含SEQ ID NO：150的胺基酸序列的重鏈可變域和包含SEQ ID NO：151的胺基酸序列的輕鏈可變域；或(e)包含SEQ ID NO：166的胺基酸序列的重鏈可變域和包含SEQ ID NO：167的胺基酸序列的輕鏈可變域。
  27. 如請求項1之結合蛋白，其中：(a)VH1和VL1形成特異性結合人類TNFa的第一抗原結合位點，VH2和VL2形成特異性結合人類IL13的第二抗原結合位點，且VH3和VL3形成特異性結合人類IL4的第三抗原結合位點；(b)VH1和VL1形成特異性結合人類TNFa的第一抗原結合位點，VH2和VL2形成特異性結合人類IL4的第二抗原結合位點，且VH3和VL3形成特異性結合人類IL13的第三抗原結合位點；(c)VH1和VL1形成特異性結合人類IL4的第一抗原結合位點，VH2和VL2形成特異性結合人類TNFa的第二抗原結合位點，且VH3和VL3形成特異性結合人類IL13的第三抗原結合位點；(d)VH1和VL1形成特異性結合人類IL4的第一抗原結合位點，VH2和VL2形成特異性結合人類IL13的第二抗原結合位點，且VH3和VL3形成特異性結合人類TNFa的第三抗原結合位點；(e)VH1和VL1形成特異性結合人類IL13的第一抗原結合位點，VH2和VL2形成特異性結合人類IL4的第二抗原結合位點，且VH3和VL3形成特異性結合人類TNFa的第三抗原結合位點；或(f)VH1和VL1形成特異性結合人類IL13的第一抗原結合位點，VH2和VL2形成特異性結合人類TNFa的第二抗原結合位點，且VH3和VL3形成特異性結合人類 IL4的第三抗原結合位點。
  28. 如請求項27的結合蛋白，其中該特異性結合人類TNFa的抗原結合位點包含重鏈可變域和輕鏈可變域，該重鏈可變域包含SEQ ID NO：168的胺基酸序列，該輕鏈可變域包含SEQ ID NO：169的胺基酸序列。
  29. 如請求項27之結合蛋白，其中該特異性結合人類IL4的抗原結合位點包含重鏈可變域和輕鏈可變域，該重鏈可變域包含SEQ ID NO：170的胺基酸序列，該輕鏈可變域包含SEQ ID NO：171的胺基酸序列。
  30. 如請求項27之結合蛋白，其中該特異性結合人類IL13的抗原結合位點包含重鏈可變域和輕鏈可變域，該重鏈可變域包含SEQ ID NO：172的胺基酸序列，該輕鏈可變域包含SEQ ID NO：173的胺基酸序列。
  31. 如請求項1之結合蛋白，其中：(a)該第一多肽鏈的CL域係人類κCL域，且該第四多肽鏈的CL域係人類λCL域；或(b)該第一多肽鏈的CL域係人類λCL域，且該第四多肽鏈的CL域係人類κCL域。
  32. 如請求項1之結合蛋白，其中該第一多肽鏈包含λCL域；其中該第二多肽鏈的CH3域包含與人類IgG1的位置354和366對應的位置處的胺基酸取代，其根據EU索引，其中該胺基酸取代為S354C和T366W；其中該第三多肽鏈的CH3域包含與人類IgG1的位置349、366、368、407、435和436對應的位置處的胺基酸取代，其根據EU索引，其中該胺基酸取代為Y349C、T366S、L368A、Y407V、H435R和Y436F；且其中該第四多肽鏈包含κCL域。
  33. 一種結合蛋白，其包含第一多肽鏈、第二多肽鏈、第三多肽鏈和第四多肽鏈，其中：(a)該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：4的胺基酸序列；該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：3的胺基酸序列；該第三多肽鏈包含SEQ ID NO：1的胺基酸序列；且該第四多肽鏈包含SEQ ID NO：2的胺基酸序列； (b)該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：10的胺基酸序列；該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：9的胺基酸序列；該第三多肽鏈包含SEQ ID NO：1的胺基酸序列；且該第四多肽鏈包含SEQ ID NO：2的胺基酸序列；(c)該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：4的胺基酸序列；該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：3的胺基酸序列；該第三多肽鏈包含SEQ ID NO：13的胺基酸序列；且該第四多肽鏈包含SEQ ID NO：14的胺基酸序列；(d)該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：10的胺基酸序列；該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：9的胺基酸序列；該第三多肽鏈包含SEQ ID NO：13的胺基酸序列；且該第四多肽鏈包含SEQ ID NO：14的胺基酸序列；(e)該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：4的胺基酸序列；該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：3的胺基酸序列；該第三多肽鏈包含SEQ ID NO：17的胺基酸序列；且該第四多肽鏈包含SEQ ID NO：18的胺基酸序列；(f)該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：10的胺基酸序列；該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：9的胺基酸序列；該第三多肽鏈包含SEQ ID NO：17的胺基酸序列；且該第四多肽鏈包含SEQ ID NO：18的胺基酸序列；(g)該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：4的胺基酸序列；該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：3的胺基酸序列；該第三多肽鏈包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列；且該第四多肽鏈包含SEQ ID NO：22的胺基酸序列；(h)該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：10的胺基酸序列；該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：9的胺基酸序列；該第三多肽鏈包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列；且該第四多肽鏈包含SEQ ID NO：22的胺基酸序列；(i)該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：63的胺基酸序列；該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：62的胺基酸序列；該第三多肽鏈包含SEQ ID NO：60的胺基酸序列；且該第四多肽鏈包含SEQ ID NO：61的胺基酸序列；(j)該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：69的胺基酸序列；該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：68的胺基酸序列；該第三多肽鏈包含SEQ ID NO：60的胺基酸序 列；且該第四多肽鏈包含SEQ ID NO：61的胺基酸序列列；(k)該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：69的胺基酸序列；該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：68的胺基酸序列；該第三多肽鏈包含SEQ ID NO：60的胺基酸序列；且該第四多肽鏈包含SEQ ID NO：71的胺基酸序列；(l)該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：76的胺基酸序列；該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：75的胺基酸序列；該第三多肽鏈包含SEQ ID NO：73的胺基酸序列；且該第四多肽鏈包含SEQ ID NO：74的胺基酸序列；(m)該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：82的胺基酸序列；該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：81的胺基酸序列；該第三多肽鏈包含SEQ ID NO：73的胺基酸序列；且該第四多肽鏈包含SEQ ID NO：74的胺基酸序列；(n)該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：88的胺基酸序列；該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：87的胺基酸序列；該第三多肽鏈包含SEQ ID NO：85的胺基酸序列；且該第四多肽鏈包含SEQ ID NO：86的胺基酸序列；(o)該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：94的胺基酸序列；該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：93的胺基酸序列；該第三多肽鏈包含SEQ ID NO：85的胺基酸序列；且該第四多肽鏈包含SEQ ID NO：86的胺基酸序列；(p)該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：69的胺基酸序列；該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：68的胺基酸序列；該第三多肽鏈包含SEQ ID NO：73的胺基酸序列；且該第四多肽鏈包含SEQ ID NO：74的胺基酸序列；(q)該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：69的胺基酸序列；該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：68的胺基酸序列；該第三多肽鏈包含SEQ ID NO：85的胺基酸序列；且該第四多肽鏈包含SEQ ID NO：86的胺基酸序列；(r)該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：63的胺基酸序列；該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：62的胺基酸序列；該第三多肽鏈包含SEQ ID NO：73的胺基酸序列；且該第四多肽鏈包含SEQ ID NO：74的胺基酸序列；(s)該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：63的胺基酸序列；該第二多肽鏈包含 SEQ ID NO：62的胺基酸序列；該第三多肽鏈包含SEQ ID NO：85的胺基酸序列；且該第四多肽鏈包含SEQ ID NO：86的胺基酸序列；(t)該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：4的胺基酸序列；該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：3的胺基酸序列；該第三多肽鏈包含SEQ ID NO：114的胺基酸序列；且該第四多肽鏈包含SEQ ID NO：115的胺基酸序列；或(u)該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：10的胺基酸序列；該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：9的胺基酸序列；該第三多肽鏈包含SEQ ID NO：114的胺基酸序列；且該第四多肽鏈包含SEQ ID NO：115的胺基酸序列。
  34. 一種分離的核酸分子，其包含編碼如請求項1-33中任一項之結合蛋白的核苷酸序列。
  35. 一種表現載體，其包含如請求項34之核酸分子。
  36. 一種分離之宿主細胞，其包含如請求項34之核酸分子或如請求項35之表現載體。
  37. 如請求項36之分離的宿主細胞，其中該宿主細胞係哺乳動物細胞或昆蟲細胞。
  38. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1-33中任一項之結合蛋白及藥學上可接受的載劑。
  39. 一種如請求項1-11及14-33中任一項之至少一個結合蛋白或如請求項38之醫藥組合物之用途，其係用以製備在患者中治療癌症的藥物。
  40. 如請求項39之用途，其中該結合蛋白包含一個特異性結合T細胞表面蛋白的抗原結合位點和另一個特異性結合腫瘤靶蛋白的抗原結合位點。
  41. 如請求項40之用途，其中該結合蛋白包含特異性結合CD3的第一抗原結合位點，特異性結合CD28的第二抗原結合位點，和特異性結合選自由以下組成之群的腫瘤靶蛋白的第三抗原結合位點：CD19、CD20、CD38、Her2和LAMP1。
  42. 如請求項39-41中任一項之用途，其中該至少一個結合蛋白係與化療劑 共同投予。
  43. 一種如請求項1-9、12-20及27-33中任一項之至少一個結合蛋白或如請求項38之醫藥組合物之用途，其係用以製備在患者中治療炎性疾病或病症的藥物。
  44. 如請求項43之用途，其中該結合蛋白包含3個抗原結合位點，其各自特異性結合選自由以下組成之群的細胞因子靶蛋白：IL-4、IL-13和TNFa。
  45. 如請求項43或44之用途，其中該至少一個結合蛋白係與抗炎劑共同投予。
  46. 如請求項39之用途，其中該患者是人類。
  47. 如請求項39或43之用途，其中該結合蛋白可抑制一個或多個選自由以下組成之群的靶蛋白的功能：A2AR、APRIL、ATPD酶、BAFF、BAFFR、BCMA、BlyS、BTK、BTLA、B7DC、B7H1、B7H4、B7H5、B7H6、B7H7、B7RP1、B7-4、C3、C5、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL15、CCL17、CCL19、CCL20、CCL21、CCL24、CCL25、CCL26、CCR3、CCR4、CD3、CD19、CD20、CD23、CD24、CD27、CD28、CD38、CD39、CD40、CD70、CD80、CD86、CD122、CD137、CD137L、CD152、CD154、CD160、CD272、CD273、CD274、CD275、CD276、CD278、CD279、CDH1、殼多糖酶、CLEC9、CLEC91、CRTH2、CSF-1、CSF-2、CSF-3、CX3CL1、CXCL12、CXCL13、CXCR3、DNGR-1、外核苷三磷酸鹽二磷酸水解酶1、EGFR、ENTPD1、FCER1A、FCER1、FLAP、FOLH1、Gi24、GITR、GITRL、GM-CSF、Her2、HHLA2、HMGB1、HVEM、ICOSLG、IDO、IFNα、IgE、IGF1R、IL2Rβ、IL1、IL1A、IL1B、IL1F10、IL2、IL4、IL4Ra、IL5、IL5R、IL6、IL7、IL7Ra、IL8、IL9、IL9R、IL10、rhIL10、IL12、IL13、IL13Ra1、IL13Ra2、IL15、IL17、IL17Rb、IL18、IL22、IL23、IL25、IL27、IL33、IL35、ITGB4、ITK、KIR、LAG3、LAMP1、瘦素、LPFS2、II類MHC、NCR3LG1、NKG2D、NTPD酶- 1、OX40、OX40L、PD-1H、血小板受體、PROM1、S152、SISP1、SLC、SPG64、ST2、STEAP2、Syk激酶、TACI、TDO、T14、TIGIT、TIM3、TLR、TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、TMEF1、TNFa、TNFRSF7、Tp55、TREM1、TSLP、TSLPR、TWEAK、VEGF、VISTA、Vstm3、WUCAM和XCR1。
  48. 一種純化由宿主細胞製造之結合蛋白的方法，其包括：(a)於宿主細胞製造如請求項1、10、12、14-16及18-30中任一項之結合蛋白，其中第二多肽鏈的CH3域和第三多肽鏈的CH3域中僅有一個包含與人類IgG1或IgG4的位置435和436對應的位置處的胺基酸取代，其根據EU索引，其中該胺基酸取代是H435R和Y436F；(b)使(a)中製造的結合蛋白與蛋白A接觸；及(c)在適於從包含0或2個CH3域的結合蛋白分離出該僅含有包含胺基酸取代H435R及Y436F之1個CH3域的結合蛋白的條件下從蛋白A洗脫該結合蛋白，該0或2個CH3域包含胺基酸取代H435R和Y436F。
  49. 如請求項48之方法，其中該第一多肽鏈的CL域係人類κCL域，且該第四多肽鏈的CL域係人類λCL域；或該第一多肽鏈的CL域係人類λCL域，且該第四多肽鏈的CL域係人類κCL域，且該方法另外包含：(d)使(c)中洗脫的結合蛋白與κ輕鏈親和介質接觸；(e)在適於從僅包含λCL域的結合蛋白分離出該結合蛋白的條件下從該κ輕鏈親和介質洗脫該結合蛋白；(f)使(e)中洗脫的結合蛋白與λ輕鏈親和介質接觸；和(g)在適於從僅包含κCL域的結合蛋白分離出該結合蛋白的條件下從該λ輕鏈親和介質洗脫該結合蛋白；或(d)使(c)中洗脫的結合蛋白與λ輕鏈親和介質接觸；(e)在適於從僅包含κCL域的結合蛋白分離出該結合蛋白的條件下從該λ輕鏈親和介質洗脫該結合蛋白； (f)使(e)中洗脫的結合蛋白與κ輕鏈親和介質接觸；和(g)在適於從僅包含λCL域的結合蛋白分離出該結合蛋白的條件下從該κ輕鏈親和介質洗脫該結合蛋白。
  50. 如請求項48-49中任一項之方法，其中該第一多肽鏈包含λCL域；其中該第二多肽鏈的CH3域包含與人類IgG1的位置354和366對應的位置處的胺基酸取代，其根據EU索引，其中該胺基酸取代為S354C和T366W；其中該第三多肽鏈的CH3域包含與人類IgG1的位置349、366、368、407、435和436對應的位置處的胺基酸取代，其根據EU索引，其中該胺基酸取代為Y349C、T366S、L368A、Y407V、H435R和Y436F；且其中第四多肽鏈包含κCL域。
TW106112360A 2016-04-13 2017-04-13 三特異性和/或三價結合蛋白 TWI788286B (zh)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662322036P 2016-04-13 2016-04-13
US62/322,036 2016-04-13
US201662331191P 2016-05-03 2016-05-03
US62/331,191 2016-05-03
US201662412187P 2016-10-24 2016-10-24
US62/412,187 2016-10-24
EP17305298 2017-03-17
EP17305298.6 2017-03-17
??17305298.6 2017-03-17

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201803899A TW201803899A (zh) 2018-02-01
TWI788286B true TWI788286B (zh) 2023-01-01

Family

ID=58464471

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW106112360A TWI788286B (zh) 2016-04-13 2017-04-13 三特異性和/或三價結合蛋白

Country Status (23)

Country Link
US (2) US10882922B2 (zh)
EP (1) EP3443006B1 (zh)
JP (1) JP7195929B2 (zh)
KR (1) KR20180134378A (zh)
CN (1) CN109476732B (zh)
AU (1) AU2017248671A1 (zh)
BR (1) BR112018070998A2 (zh)
CA (1) CA3020633A1 (zh)
CL (1) CL2018002883A1 (zh)
CO (1) CO2018012107A2 (zh)
CR (1) CR20180539A (zh)
DO (1) DOP2018000225A (zh)
EA (1) EA201892312A1 (zh)
IL (1) IL262241B2 (zh)
MA (1) MA44670B1 (zh)
MX (1) MX2018012566A (zh)
PE (1) PE20190128A1 (zh)
PH (1) PH12018502182A1 (zh)
PT (1) PT3443006T (zh)
SG (1) SG11201808911SA (zh)
TW (1) TWI788286B (zh)
UY (1) UY37206A (zh)
WO (1) WO2017180913A2 (zh)

Families Citing this family (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI803876B (zh) * 2011-03-28 2023-06-01 法商賽諾菲公司 具有交叉結合區定向之雙重可變區類抗體結合蛋白
AR106188A1 (es) 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
AU2016347058B2 (en) 2015-10-25 2023-11-09 Sanofi Trispecific and/or trivalent binding proteins for prevention or treatment of HIV infection
DK3443006T5 (da) 2016-04-13 2023-11-06 Sanofi Sa Trispecifikke og/eller trivalente bindingsproteiner
SG11201808911SA (en) 2016-04-13 2018-11-29 Sanofi Sa Trispecific and/or trivalent binding proteins
WO2017189959A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
WO2018151841A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Sanofi Multispecific binding molecules having specificity to dystroglycan and laminin-2
KR102654105B1 (ko) 2017-02-17 2024-04-04 사노피 디스트로글리칸 및 라미닌-2에 대한 특이성을 갖는 다중특이적 결합 분자
KR102585848B1 (ko) 2017-02-24 2023-10-11 마크로제닉스, 인크. Cd137 및 종양 항원에 결합할 수 있는 이중특이적 결합 분자, 및 그것의 용도
UY37758A (es) * 2017-06-12 2019-01-31 Novartis Ag Método de fabricación de anticuerpos biespecíficos, anticuerpos biespecíficos y uso terapéutico de dichos anticuerpos
CN111788225A (zh) * 2017-10-10 2020-10-16 赛诺菲 抗cd38抗体及与抗cd3和抗cd28抗体的组合
AU2018357923A1 (en) * 2017-11-01 2020-03-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific 2+1 contorsbodies
US20200325232A1 (en) * 2017-11-21 2020-10-15 Innate Pharma Multispecific antigen binding proteins
CN109957026A (zh) * 2017-12-22 2019-07-02 成都恩沐生物科技有限公司 共价多特异性抗体
MX2020007444A (es) 2018-01-12 2020-09-14 Genzyme Corp Metodos para la cuantificacion de polipeptidos.
US11685781B2 (en) 2018-02-15 2023-06-27 Macrogenics, Inc. Variant CD3-binding domains and their use in combination therapies for the treatment of disease
WO2019166650A1 (en) * 2018-03-02 2019-09-06 Cdr-Life Ag Trispecific antigen binding proteins
CA3089653A1 (en) * 2018-03-08 2019-09-12 Phanes Therapeutics, Inc. Anti-claudin 18.2 antibodies and uses thereof
WO2019178364A2 (en) * 2018-03-14 2019-09-19 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules and uses thereof
CN111566127A (zh) * 2018-03-27 2020-08-21 西雅图免疫公司 制导和导航控制蛋白及其制备和使用方法
US10654944B2 (en) * 2018-04-10 2020-05-19 Y-Biologics Inc. Cell engaging binding molecules
AU2019255270A1 (en) * 2018-04-17 2020-11-19 Invenra Inc. Trivalent trispecific antibody constructs
KR20210049863A (ko) * 2018-08-23 2021-05-06 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 항-Fc 엡실론-R1 알파 (FCERIA) 항체, FCERIA 및 CD3에 결합하는 이중특이적 항원-결합 분자 및 이들의 용도
SG11202103478RA (en) * 2018-10-09 2021-05-28 Sanofi Sa Trispecific anti-cd38, anti-cd28, and anti-cd3 binding proteins and methods of use for treating viral infection
CN111153988B (zh) * 2018-11-08 2022-11-04 中国科学院上海巴斯德研究所 广谱抗肠道病毒d68型的中和性单克隆抗体
EP3674316A1 (en) 2018-12-24 2020-07-01 Sanofi Multispecific binding proteins with mutant fab domains
TW202041534A (zh) 2018-12-24 2020-11-16 法商賽諾菲公司 基於假Fab的多特異性結合蛋白
US11965030B2 (en) 2018-12-24 2024-04-23 Sanofi Multispecific binding proteins with mutant fab domains
KR20210128399A (ko) * 2019-02-20 2021-10-26 더 리서치 인스티튜트 앳 네이션와이드 칠드런스 하스피탈 암-표적화되고, 바이러스-암호화된, 조절 가능한 t 세포 (catvert) 또는 nk 세포 (catvern) 링커
EP3953388A1 (en) 2019-04-09 2022-02-16 Sanofi Trispecific binding proteins, methods, and uses thereof
TW202104274A (zh) 2019-04-09 2021-02-01 法商賽諾菲公司 用於治療ｈｉｖ感染之三特異性及／或三價結合蛋白
US11613576B2 (en) 2019-04-09 2023-03-28 Sanofi Trispecific binding proteins, methods, and uses thereof
CN112111012B (zh) * 2019-06-20 2023-07-04 成都恩沐生物科技有限公司 共价多特异性抗体
US20220251186A1 (en) * 2019-07-11 2022-08-11 Tavotek Biotherapeutics (Hong Kong) Limited Agents that interfere with thymic stromal lymphopoietin (tslp)-receptor signaling
CN113166273A (zh) * 2019-07-25 2021-07-23 天境生物科技(上海)有限公司 具有il-7活性的双功能分子
CA3155356A1 (en) 2019-10-25 2021-04-29 Fateme TOUSI Methods for analyzing chain mispairing in multispecific binding proteins
MX2022005330A (es) * 2019-11-05 2022-05-26 Regeneron Pharma Moleculas de union multiespecificas con scfv en el extremo nterminal.
CN115515980A (zh) 2020-02-26 2022-12-23 拜格拉夫55公司 C19 c38双特异性抗体
TW202146463A (zh) 2020-03-05 2021-12-16 法商賽諾菲公司 蛋白酶加工的分子
JP2023519699A (ja) * 2020-03-30 2023-05-12 サノフイ スプリットｃｈ２ドメイン
IL297880A (en) * 2020-06-23 2023-01-01 Hoffmann La Roche Agonistic cd28 antigen-binding molecules targeting her2
WO2022036495A1 (en) 2020-08-17 2022-02-24 Utc Therapeutics Inc. Lymphocytes-antigen presenting cells co-stimulators and uses thereof
MX2023003214A (es) * 2020-09-18 2023-05-24 Regeneron Pharma Moleculas de union al antigeno que se unen a cd38 y/o cd28 y usos de las mismas.
EP4347640A1 (en) 2021-05-27 2024-04-10 Sanofi Fc variant with enhanced affinity to fc receptors and improved thermal stability
IL311758A (en) * 2021-09-29 2024-05-01 Modex Therapeutics Inc Antigen-binding polypeptides, antigen-binding polypeptide complexes and methods of using them
WO2023060277A1 (en) * 2021-10-08 2023-04-13 Arbele Limited Composition of multispecific antibodies targeting cdh17-expressing tumors and method of making and using thereof
TW202334204A (zh) * 2021-12-21 2023-09-01 美商莫德斯醫療公司 條件性活化之抗原結合多肽複合物及其使用方法
WO2023155845A1 (zh) * 2022-02-16 2023-08-24 上海优替济生生物医药有限公司 人源化抗cd28抗体及其与抗cd40的双特异性抗体
WO2023166420A1 (en) * 2022-03-03 2023-09-07 Pfizer Inc. Multispecific antibodies and uses thereof
TW202400660A (zh) 2022-05-06 2024-01-01 瑞士商伊克諾斯科學公司 Cd3/bcma/cd38 三特異性抗體
WO2023227790A1 (en) 2022-05-27 2023-11-30 Sanofi Natural killer (nk) cell engagers binding to nkp46 and bcma variants with fc-engineering
WO2023246911A1 (zh) * 2022-06-24 2023-12-28 北京可瑞生物科技有限公司 基于t细胞受体的双特异性多肽分子及其用途
WO2024027828A1 (en) * 2022-08-05 2024-02-08 Chimagen Biosciences, Ltd Multi-specific antibodies targeting a dimerizable tumor antigen and an immunostimulatory antigen

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013163427A1 (en) * 2012-04-25 2013-10-31 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Antibodies to treat hiv-1 infection
WO2014116846A2 (en) * 2013-01-23 2014-07-31 Abbvie, Inc. Methods and compositions for modulating an immune response
TW201437227A (zh) * 2013-02-26 2014-10-01 Roche Glycart Ag 雙特異性ｔ細胞活化抗原結合分子
CN104968685A (zh) * 2012-09-25 2015-10-07 格兰马克药品股份有限公司 异源二聚免疫球蛋白的纯化

Family Cites Families (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0308936B1 (en) 1987-09-23 1994-07-06 Bristol-Myers Squibb Company Antibody heteroconjugates for the killing of HIV-infected cells
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
PT1068241E (pt) 1998-04-02 2007-11-19 Genentech Inc Variantes de anticorpos e respectivos fragmentos
EP2706116A1 (en) * 2001-01-17 2014-03-12 Emergent Product Development Seattle, LLC Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
CN1294148C (zh) * 2001-04-11 2007-01-10 中国科学院遗传与发育生物学研究所 环状单链三特异抗体
EP1641826A2 (en) 2003-06-27 2006-04-05 Biogen Idec MA Inc. Use of hydrophobic-interaction-chromatography or hinge-region modifications for the production of homogeneous antibody-solutions
US9200061B2 (en) 2004-02-06 2015-12-01 Morpho Sys AG Generation and profiling of fully human HuCAL gold®-derived therapeutic antibodies specific for human CD3i
CN100376599C (zh) 2004-04-01 2008-03-26 北京安波特基因工程技术有限公司 基因工程重组抗cea抗cd3抗cd28线性单链三特异抗体
EP2050764A1 (en) 2007-10-15 2009-04-22 sanofi-aventis Novel polyvalent bispecific antibody format and uses thereof
EP3002299A1 (en) 2008-06-03 2016-04-06 AbbVie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
CN103403026B (zh) 2009-09-25 2016-05-11 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) Hiv-1中和抗体及其用途
SI2580243T1 (sl) * 2010-06-09 2020-02-28 Genmab A/S Protitelesa proti humanemu CD38
JOP20210044A1 (ar) 2010-12-30 2017-06-16 Takeda Pharmaceuticals Co الأجسام المضادة لـ cd38
TWI803876B (zh) 2011-03-28 2023-06-01 法商賽諾菲公司 具有交叉結合區定向之雙重可變區類抗體結合蛋白
WO2012154312A1 (en) 2011-05-09 2012-11-15 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Neutralizing antibodies to hiv-1 and their use
CN107936121B (zh) 2011-05-16 2022-01-14 埃泰美德(香港)有限公司 多特异性fab融合蛋白及其使用方法
PT2710033T (pt) 2011-05-17 2021-03-11 Univ Rockefeller Anticorpos neutralizantes do vírus da imunodeficiência humana e métodos de utilização destes
RU2624046C2 (ru) 2011-11-07 2017-06-30 Дзе Юнайтед Стейтс Оф Америка, Эз Репрезентед Бай Дзе Секретэри, Департмент Оф Хелт Энд Хьюман Сервисиз Gp41-нейтрализующие антитела и их применение
WO2013086533A1 (en) 2011-12-08 2013-06-13 The United States Of America, As Represented By The Secretary Department Of Health & Human Services Neutralizing antibodies to hiv-1 and their use
JOP20200236A1 (ar) 2012-09-21 2017-06-16 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد cd3 وجزيئات ربط الأنتيجين ثنائية التحديد التي تربط cd3 وcd20 واستخداماتها
US20140213772A1 (en) 2012-12-28 2014-07-31 Abbvie, Inc. Cross-over dual variable domain immunoglobulin constructs
US10487155B2 (en) 2013-01-14 2019-11-26 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US20140302037A1 (en) 2013-03-15 2014-10-09 Amgen Inc. BISPECIFIC-Fc MOLECULES
TW201446800A (zh) 2013-03-15 2014-12-16 Abbvie Inc 針對ＴＮＦα之雙特異性結合蛋白
SG10201909806SA (en) 2013-11-04 2019-11-28 Glenmark Pharmaceuticals Sa Production of t cell retargeting hetero-dimeric immunoglobulins
ME03666B (me) * 2014-03-28 2020-10-20 Xencor Inc Bispecifična antitela koja se vezuju za cd38 i cd3
CA2996848C (en) 2014-09-04 2021-01-05 Stemcell Technologies Inc. Soluble antibody complexes for t cell or nk cell activation and expansion
MA40801A1 (fr) 2015-01-23 2018-07-31 Sanofi Sa Anticorps anti-cd3, anticorps anti-cd123 et anticorps bispécifiques se liant spécifiquement à cd3 et/ou cd123
US10654943B2 (en) 2015-06-02 2020-05-19 The Rockefeller University Tri-specific antibodies for HIV therapy
EA201890782A1 (ru) 2015-09-22 2018-09-28 Дзе Трастиз Оф Дзе Юниверсити Оф Пенсильвания Способ перенацеливания t-клеток для лечения инфекции hiv
AU2016347058B2 (en) 2015-10-25 2023-11-09 Sanofi Trispecific and/or trivalent binding proteins for prevention or treatment of HIV infection
CN105837688B (zh) 2015-11-20 2019-02-26 北京大学深圳研究生院 单域抗体及其编码基因，免疫毒素及其编码基因、制备方法、表达载体、应用，及宿主细胞
EA202091898A1 (ru) 2015-12-15 2021-06-22 Джилид Сайэнс, Инк. Антитела, нейтрализующие вирус иммунодефицита человека
SG11201808911SA (en) 2016-04-13 2018-11-29 Sanofi Sa Trispecific and/or trivalent binding proteins
US20230242876A1 (en) 2016-12-30 2023-08-03 Shanghai Sinobio Biotech Co., Ltd. Bifunctional molecule and use thereof
KR102654105B1 (ko) 2017-02-17 2024-04-04 사노피 디스트로글리칸 및 라미닌-2에 대한 특이성을 갖는 다중특이적 결합 분자
WO2018151841A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Sanofi Multispecific binding molecules having specificity to dystroglycan and laminin-2
CN111788225A (zh) 2017-10-10 2020-10-16 赛诺菲 抗cd38抗体及与抗cd3和抗cd28抗体的组合
SG11202103478RA (en) 2018-10-09 2021-05-28 Sanofi Sa Trispecific anti-cd38, anti-cd28, and anti-cd3 binding proteins and methods of use for treating viral infection
US11613576B2 (en) 2019-04-09 2023-03-28 Sanofi Trispecific binding proteins, methods, and uses thereof

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013163427A1 (en) * 2012-04-25 2013-10-31 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Antibodies to treat hiv-1 infection
CN104968685A (zh) * 2012-09-25 2015-10-07 格兰马克药品股份有限公司 异源二聚免疫球蛋白的纯化
WO2014116846A2 (en) * 2013-01-23 2014-07-31 Abbvie, Inc. Methods and compositions for modulating an immune response
TW201437227A (zh) * 2013-02-26 2014-10-01 Roche Glycart Ag 雙特異性ｔ細胞活化抗原結合分子

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
期刊 Anke Steinmetz et al., "CODV-ig, a universal bispecific tetravalent and multifunctional immunoglobulin format for medical applications" MAbs vol.8 no.5 2016/03/16 p.867-878 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2017180913A3 (en) 2018-02-08
WO2017180913A2 (en) 2017-10-19
SG11201808911SA (en) 2018-11-29
EP3443006B1 (en) 2023-08-02
WO2017180913A9 (en) 2017-11-23
MA44670A (fr) 2019-02-20
US20210061925A1 (en) 2021-03-04
TW201803899A (zh) 2018-02-01
CN109476732B (zh) 2024-03-22
UY37206A (es) 2017-11-30
PT3443006T (pt) 2023-10-26
PE20190128A1 (es) 2019-01-17
CR20180539A (es) 2019-02-15
US10882922B2 (en) 2021-01-05
IL262241B2 (en) 2024-05-01
EA201892312A1 (ru) 2019-04-30
CN109476732A (zh) 2019-03-15
JP7195929B2 (ja) 2022-12-26
MX2018012566A (es) 2019-08-05
US11192960B2 (en) 2021-12-07
EP3443006A2 (en) 2019-02-20
IL262241B1 (en) 2024-01-01
MA44670B1 (fr) 2023-11-30
JP2019522459A (ja) 2019-08-15
IL262241A (en) 2018-11-29
PH12018502182A1 (en) 2019-11-04
CL2018002883A1 (es) 2019-01-18
KR20180134378A (ko) 2018-12-18
CA3020633A1 (en) 2017-10-19
DOP2018000225A (es) 2019-01-31
US20170320967A1 (en) 2017-11-09
BR112018070998A2 (pt) 2019-02-26
AU2017248671A1 (en) 2018-11-29
CO2018012107A2 (es) 2018-11-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI788286B (zh) 三特異性和/或三價結合蛋白
JP7387780B2 (ja) 抗ｃｄ３８抗体および使用方法
JP7462621B2 (ja) 三重特異性抗ｃｄ３８、抗ｃｄ２８、および抗ｃｄ３結合タンパク質ならびにウイルス感染を処置するための使用方法
EP2691416B1 (en) Dual variable region antibody-like binding proteins having cross-over binding region orientation
US11932704B2 (en) Trispecific and/or trivalent binding proteins
TW202104261A (zh) 三特異性結合蛋白、方法及其用途