JP2023519699A - スプリットｃｈ２ドメイン - Google Patents

Abstract

本発明は、少なくとも２つのポリペプチド鎖Ａ（ＰＣＡ）およびＢ（ＰＣＢ）を含むタンパク質複合体であって、ＰＣＡはヘテロ二量体化ドメインＡ（ＨＤＡ）を含み、ＰＣＢはヘテロ二量体化ドメインＢ（ＨＤＢ）を含み、ＨＤＡとＨＤＢとは互いに結合し、一方のヘテロ二量体化ドメインは免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインの２つのＮ末端βストランド（Ｎ－β）を含むかまたはそれらからなり、もう一方のヘテロ二量体化ドメインはＩｇドメインの２つのＣ末端βストランド（Ｃ－β）を含むかまたはそれらからなる、前記タンパク質複合体に関する。本発明は、該タンパク質複合体の１つまたはそれ以上のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および該ポリヌクレオチドまたは該発現ベクターを含む細胞にさらに関する。

Description

本発明は、特殊化したヘテロ二量体化ドメインによって媒介されたタンパク質ヘテロ二量体化の分野に関する。詳細には、本発明は、互いに結合するヘテロ二量体化ドメインを有する少なくとも２つのポリペプチド鎖を含むタンパク質複合体に関する。一方のヘテロ二量体化ドメインは、免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインのＮ末端βストランドを含み、もう一方のヘテロ二量体化ドメインは、ＩｇドメインのＣ末端βストランドを含む。

タンパク質相補性の現象は、５０年以上前に、Ｕｌｌｍａｎらが、ペプチドがβ－ガラクトシダーゼの活性を回復させることができることを発見し、初めて記述された（非特許文献１）。この先駆的研究以降、タンパク質相補性の数多くの例が記述されている。基本原理は、タンパク質を特異な部位で二分割（スプリット）し、この２つの部分は、結合させると、機能性タンパク質へとリフォールディングすることができるというものである。この手法において使用されるタンパク質は、通常、酵素（例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素、グリシンアミドリボヌクレオチドトランスホルミラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、β－ラクタマーゼ、またはルシフェラーゼ）であるが、ユビキチンおよび蛍光タンパク質のような非酵素的タンパク質であることもある。タンパク質相補性技術は、多くの場合、タンパク質－タンパク質相互作用を調べるために使用される。しかしながら、タンパク質相補性の現象は、その他の用途にも使用可能である。

モノクローナル抗体は、特にがんの治療のための、新しい治療選択肢として極めて有望な候補である。二価であるが単一特異性である（すなわち、１つの標的だけを認識する）天然抗体とは対照的に、二重特異性抗体は、同時に２種の異なる標的またはエピトープに結合することができる。多重特異性抗体は、幾つかの種類に分類することができる。一例では、二重特異性抗体は、Ｆｃドメインを欠く抗原結合ドメインだけからなる。これらの二重特異性抗体は低分子であり、微生物系において産生させることができるが、Ｆｃドメインが存在しないため抗体依存性細胞媒介細胞障害（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘起しない。Ｆｃドメインは、これらの作用を、それぞれＦｃ受容体および補体Ｃ１ｑタンパク質に結合することによって媒介している。Ｆｃドメインは、さらに、抗体の長い血漿内半減期に寄与している。これは、Ｆｃドメインが受容体ＦｃＲｎに結合することによって、血液循環での抗体の再生利用を可能とすることによってもたらされる。Ｆｃドメインが存在しなければ、血漿内半減期ははるかに短いものとなる。別の例では、ヘテロ二量体二重特異性抗体は、２つの異なる重鎖および対応する２つの軽鎖を有しうる。これらは、それぞれが重鎖と軽鎖とを含む、２つの発現カセットの共発現によって生成させることができる。しかしながら、この手法は、多数の望まない誤対合副産物を形成する。重鎖は、所望のヘテロ二量体だけでなくホモ二量体も形成する（「重鎖の対合問題」）。いわゆるｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ変異の導入または静電気的ステアリング（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｓｔｅｅｒｉｎｇ）変異の導入など、重鎖のヘテロ二量体化を達成する幾つかの方法が開発されている。しかし、重鎖がヘテロ二量体化されていても、依然としてある問題、すなわち「軽鎖の対合問題」が残っており、これは、２つの異なる軽鎖がそれらの対応する重鎖に正確に対合することに関係している。１つの可能性としては、共通の軽鎖を使用することである。しかしながら、この手法は、すべての場合に実行可能なものではない。

Ｕｌｌｍａｎｎら；Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． １９６５年；１２：９１８～９２３頁

本発明は、誤対合問題に対処するものであり、多重特異性抗体の異なる鎖の所望の対合を、同じ細胞において望ましくない副産物、すなわち所望の鎖以外の鎖の対合が最少限または皆無で得るものである。これは、スプリット免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインに由来する新規ヘテロ二量体化ドメインを使用することによって得られる。

第１の態様では、本発明は、少なくとも２つのポリペプチド鎖Ａ（ＰＣＡ）およびＢ（ＰＣＢ）を含むタンパク質複合体であって、ＰＣＡはヘテロ二量体化ドメインＡ（ＨＤＡ）を含み、ＰＣＢはヘテロ二量体化ドメインＢ（ＨＤＢ）を含み、ＨＡＤとＨＤＢとは互いに結合し、一方のヘテロ二量体化ドメインは、免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインの２つのＮ末端βストランド（Ｎ－β）を含むかまたはそれらからなり、もう一方のヘテロ二量体化ドメインは、Ｉｇドメインの２つのＣ末端βストランド（Ｃ－β）を含むかまたはそれらからなる、前記タンパク質複合体に関する。

第２の態様では、本発明は、本発明の第１の態様によるタンパク質複合体の１つまたはそれ以上のポリペプチドをコードする、１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドに関する。

第３の態様では、本発明は、本発明の第２の態様による１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドを含む、１つまたはそれ以上の発現ベクターに関する。

第４の態様では、本発明は、本発明の第２の態様による１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドまたは本発明の第３の態様による１つまたはそれ以上の発現ベクターを含む、細胞に関する。

第５の態様では、本発明は、薬学的に許容される担体と、本発明の第１の態様によるタンパク質複合体、本発明の第２の態様による１つまたはそれ以上のポリヌクレオチド、または本発明の第３の態様による１つまたはそれ以上の発現ベクターとを含む、薬学的組成物に関する。

本発明を以下に詳述する前に、方法論、プロトコール、および試薬は様々でありうるため、本発明が、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコール、および試薬に限定されるものではないことを理解されたい。また、本明細書で使用した専門用語は、実施形態の説明だけを目的としており、本発明の範囲を限定することを意図しておらず、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるものであることも理解されたい。別段の定義がないかぎり、本明細書で使用される技術および科学用語はすべて、当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。好ましくは、本明細書において使用される用語は、「Ａ ｍｕｌｔｉｌｉｎｇｕａｌ ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｅｒｍｓ：（ＩＵＰＡＣ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ）」（Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｈ．Ｇ．Ｗ、Ｎａｇｅｌ，Ｂ．、およびＫｏｌｂｌ，Ｈ．編 （１９９５）、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ、ＣＨ－４０１０ Ｂａｓｅｌ、スイス）に記載の通り定義されるものとする。

幾つかの文書は、本明細書の本文を通して引用される。本明細書で引用された各文書（すべての特許、特許出願、科学論文、製造業者の仕様書、使用説明書などを含む）は、上記、下記のいずれにせよ、全体として参照によって本明細書に組み入れる。いずれも、本明細書では、先行発明であるという理由によって、本発明がそのような開示に先んじる権利を与えられない承認として解釈されるものではない。

本発明を実施するためには、特段の指示がないかぎり、当技術分野の文献で説明されている、化学、生化学、および組換えＤＮＡ技術の従来方法を用いる（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ １９８９年を参照されたい）。

以下の本明細書および特許請求の範囲を通して、特に必要がないかぎり、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、ならびに「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、明記された整数もしくは工程または整数もしくは工程の群の包含を意味するが、その他の整数もしくは工程または整数もしくは工程の群の排除ではないことは理解されよう。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という単数形は、内容に特段の明示がないかぎり、複数の指示対象を含む。

以下の説明では、アミノ酸番号は、抗体に関して使用しており、配列番号を指すものではない。これらの番号は、２０１６年８月２６日に開示されたバージョンのＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベース（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ）に準じた、抗体中のアミノ酸位置を指す。別段の指定がないかぎり、該番号は、ヒトＩｇＧでの、特にヒトＩｇＧ１での位置に一致するものである。ヒトＩｇＧ１の抗体ドメインなど、本明細書で言及した抗体ドメインのＵｎｉＰｒｏｔＫＢ配列（２０１６年８月２６日に開示されたバージョン）は、本明細書に記載のドメインの実施形態ならびに下記にて定義したようなそれらの変形形態として参照によって組み入れる。

以下に、本発明の要素を説明する。これらの要素は、特定の実施形態と併せて列記されているが、さらなる実施形態を創出するために、これらをいかなる方法およびいかなる数でも組み合わせることができることを理解されたい。様々に説明された実施例および実施形態は、本発明を明記された実施形態だけに限定するものと解釈されるべきものではない。この説明は、実施形態を支持し包含し、明記された実施形態と、任意の数の開示のかつ／または特定の要素とを組み合わせるものと理解されるべきである。さらに、特段の指示がないかぎり、本出願の中で説明された要素すべてのあらゆる順列および組合せが、本出願の説明によって開示されているものとみなされるべきである。

第１の態様では、本発明は、少なくとも２つのポリペプチド鎖Ａ（ＰＣＡ）およびＢ（ＰＣＢ）を含むタンパク質複合体であって、ＰＣＡはヘテロ二量体化ドメインＡ（ＨＤＡ）を含み、ＰＣＢはヘテロ二量体化ドメインＢ（ＨＤＢ）を含み、ＨＤＡとＨＤＢとは互いに結合し、一方のヘテロ二量体化ドメインは免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインの２つのＮ末端βストランド（Ｎ－β）を含むかまたはそれらからなり、もう一方のヘテロ二量体化ドメインはＩｇドメインの２つのＣ末端βストランド（Ｃ－β）を含むかまたはそれらからなる、前記タンパク質複合体に関する。

本発明の実施形態では、ＨＤＡまたはＨＤＢのうちの一方は、２つのＮ末端βストランドを含んでおり、１つまたはそれ以上のＣ末端βストランド（Ｃ－β）は含んでおらず、もう一方は、２つのＣ末端のβストランドを含んでおり、１つまたはそれ以上のＮ末端βストランド（Ｎ－β）は含んでいない。言い換えると、ＨＤＡおよび／またはＨＤＢは、Ｃ末端βストランド（Ｃ－β）およびＮ末端βストランド（Ｎ－β）からなる完全なＩｇＧドメインであってはいけない。

本発明の一実施形態では、ＨＤＡおよびＨＤＢはそれぞれ、２０～８０アミノ酸の長さを有し、一実施形態では、ＨＤＡおよびＨＤＢはそれぞれ、３０～７０アミノ酸の長さを有し、ある実施形態では、ＨＤＡおよびＨＤＢはそれぞれ、３５～６５アミノ酸の長さを有する。

本明細書の関連において、「免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン」または「免疫グロブリンフォールド」という用語は、グリークキートポロジーを有する２つのβシート内に配列した７～９本の逆平行βストランドの２層サンドイッチからなるタンパク質ドメインを指すのに互換的に使用される。Ｉｇドメインは、おそらく、天然に存在するタンパク質において最も頻繁に使用される「基本構成要素」である。Ｉｇドメインを含むタンパク質は、免疫グロブリンスーパーファミリーに含まれる。抗体だけでなく、細胞接着分子、Ｔ細胞受容体、Ｆｃγ受容体など多数のタンパク質も、このタンパク質ファミリーに属する。免疫グロブリンフォールディングは、Ｂｏｒｋらによる総説論文の中で余すところなく説明されている（「Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｆｏｌｄ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｐａｔｔｅｒｎｓ ａｎｄ ｃｏｍｍｏｎ ｃｏｒｅ．」１９９４年９月；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２４２（４）：３０９～２０頁）。本明細書では、Ｉｇドメインの各βストランドの呼称（すなわち、βストランドａ、ｂ、ｃ、ｃ’、ｃ’’、ｄ、ｅ、ｆ、およびｇ）は、Ｂｏｒｋらが使用した呼称に一致している。Ｉｇドメインのアミノ酸配列を特徴とする主鎖は、２つのβシートの間で繰り返し交替している。このように、βストランドａは第１または第２のシートに属し得、βストランドｂは第１のシートに属し、βストランドｃは第２のシートに属し、βストランドｃ’およびｃ’’（存在する場合）もまた第２のシートに属し、βストランドｄ（存在する場合）は再び第１のシートに属し、βストランドｅは第１のシートに属し、βストランドｆおよびｇは第２のシートに属す。

７～９本のβストランドのうち、ストランドａ、ｂ、ｃ、ｃ’およびｃ’’はＮ末端とみなし、ストランドｄ、ｅ、ｆ、およびｇはＣ末端とみなす。

本明細書の関連において、「Ｎ－β」は、ＨＤＡまたはＨＤＢ内に存在する、ＩｇドメインのＮ末端βストランドを含むかまたはそれらからなるアミノ酸配列を指すのに使用される。ＨＤＡ（またはＨＤＢ）がＩｇドメインの２つのＮ末端βストランドだけを含む場合は、Ｎ－βはこれらの２つのβストランドを含むアミノ酸配列を指す。ＨＤＡ（またはＨＤＢ）がＩｇドメインの３つのＮ末端βストランドを含む場合は、Ｎ－βはこれらの３つのβストランドを含むアミノ酸配列を指す。ＨＤＡ（またはＨＤＢ）は、Ｎ－βのアミノ酸の他に別のアミノ酸を含んでいてもよい。

本明細書の関連において、「Ｃ－β」は、ＨＤＡまたはＨＤＢ内に存在する、ＩｇドメインのＣ末端βストランドを含むかまたはそれらからなるアミノ酸配列を指すのに使用される。ＨＤＢ（またはＨＤＡ）がＩｇドメインの２つのＣ末端βストランドだけを含む場合は、Ｃ－βはこれらの２つのβストランドを含むアミノ酸配列を指す。ＨＤＢ（またはＨＤＡ）がＩｇドメインの３～５個のＣ末端βストランドを含む場合は、Ｃ－βはこれらの３～５個のβストランドを含むアミノ酸配列を指す。ＨＤＢ（またはＨＤＡ）は、Ｃ－βのアミノ酸の他に別のアミノ酸を含んでいてもよい。

ヒトＩｇＧ１のＣＨ２ドメインなどのＩｇドメインは、原核生物の系、例えば大腸菌において、高い量で発現させることができる。

驚くべきことに、発明者らは、ＩｇドメインのＮ末端部およびＣ末端部を２つの別々のポリペプチドとして発現させた場合、この２つの部分は完全なＩｇドメインに再会合することができることを見出した。この特性によって、スプリットＩｇドメインのＮ末端部およびＣ末端部は、このＮ末端部およびＣ末端部にそれぞれ融合させた２つのポリペプチドの特異的二量体化を可能にするヘテロ二量体化ドメインとして使用することができる。そのようなヘテロ二量体化ドメインの重要な応用として、タンパク質複合体の、特に多重特異性抗体、抗体誘導体、または抗体様分子の、会合の制御がある。

本明細書で使用される「抗体」という用語は、抗体の全構造を有する分子、例えばＩｇＧ抗体を指す。一般的に、ＩｇＧに関する場合、別段の定義がないかぎり、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４が含まれる。ＩｇＧ抗体分子は、４つのポリペプチド鎖、すなわち２つの重鎖および２つの軽鎖を含む、Ｙ字形の分子である。各軽鎖は、可変またはＶＬドメイン（または領域）として知られているＮ末端ドメイン、および定常（またはＣＬ）ドメイン（定常カッパ（Ｃκ）または定常ラムダ（Ｃλ）ドメイン）として知られているＣ末端ドメインの、２つのドメインからなる。各重鎖は、４つのドメインからなる。重鎖のＮ末端ドメインは、可変（またはＶＨ）ドメイン（または領域）として知られており、これに第１の定常ドメイン（ＣＨ１）、ヒンジ領域、次いで第２のおよび第３の定常ドメイン（ＣＨ２およびＣＨ３）が続く。会合した抗体では、ＶＬドメインおよびＶＨドメインは、連携して抗原結合部位を形成している。また、ＣＬドメインおよびＣＨ１ドメインは、連携して１つの重鎖と１つの軽鎖との結合を保っている。２つの重鎖－軽鎖ヘテロ二量体は、２つの重鎖のＣＨ２・ＣＨ３ドメインの相互作用およびヒンジ領域間の相互作用によって結び付いている。本明細書で使用される「抗体」という用語は、キメラ型のドメイン置換（すなわち、異なる抗体由来のドメインで置換された少なくとも１つのドメイン）を有しうる分子、例えば、ＩｇＧ３ドメイン（例えば、ＩｇＧ３のＣＨ３ドメイン）を含むＩｇＧ１抗体なども含む。さらに、この用語は、一般的に、多重特異性、例えば、二重特異性または三重特異性抗体を指す。

本明細書で使用される「抗体誘導体」という用語は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＹ、またはＩｇＷなどの抗体の、含むように指定されたドメインは少なくとも含むが、それらの抗体の全構造は有しておらず、しかしながらなお標的分子に結合することができる分子を指す。前記誘導体は、機能的な（すなわち、標的に結合する、特に特異的に標的に結合する）抗体フラグメントまたはそれらの組合せであってもよいが、これらに限定されない。前記誘導体はまた、さらなる可変領域などのさらなる抗体ドメインが付加された抗体にも関する。したがって、抗体誘導体という用語には、多重特異性（二重特異性、三重特異性、四重特異性、五重特異性、六重特異性など）かつ多価（二価、三価、四価など）の抗体も含まれる。

二重特異性抗体は、複数のフォーマットで創製されている（ＢｒｉｎｋｍａｎｎおよびＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ、Ｍａｂｓ ２０１７年、９巻、２号、１８２～２１２頁）。抗原結合ドメインだけからなる二重特異性抗体の例は、二価Ｆａｂ（ｂｉ－Ｆａｂ）であり、例えば、本明細書に記載のＤＶＤ－ＦａｂまたはＣＯＤＶ－Ｆａｂである。別の例としては、可変領域（Ｆｖ）だけを含み、定常ドメインは含まないフォーマットがあり、例えば「ダイアボディ」または本明細書に記載の「ｓｐｌｉｔｅダイアボディ」などである。可変領域だけを含むフォーマットは、極めて低い分子量によって優れた腫瘍浸透性がもたらされるという利点を有しており、これは、腫瘍学的適用のためには重要なことである。しかしながら、ＦｃＲｎへの結合を媒介する定常ドメインを欠くことから、血漿内半減期が短いことが不利な点である。

ホモ二量体二重特異性抗体は、ｓｃＦｖを重鎖または軽鎖に融合させることによって、または追加のＦｖドメインを重鎖および軽鎖にそれぞれ付加することによって得ることができる。これらの種類のフォーマットの例としては、本明細書に記載したような、「二重可変領域」（ＤＶＤ）構成（「四価二重特異性タンデム免疫グロブリン（ｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔａｎｄｅｍ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）」（ＴＢＴＩ）構成とも呼ばれる）および「クロスオーバー二重可変（ｃｒｏｓｓ－ｏｖｅｒ ｄｕａｌ ｖａｒｉａｂｌｅ）」（ＣＯＤＶ）構成がある（Ｗｕら；Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００７年；２５：１２９０～１２９７頁、およびＳｔｅｉｎｍｅｔｚら；Ｍａｂｓ ２０１６年；８：８６７～８７頁）。

本明細書の関連において使用される「抗体様分子」という用語は、抗体誘導体および抗体ミメティックを含む。「抗体ミメティック」という用語は、抗体と同様に抗原と特異的に結合することができるが、構造的に抗体に関連していない化合物を指す。通常、抗体ミメティックは、抗原に特異的に結合する１つ、２つ、またはそれ以上の露出したドメインを含む、約３～２０ｋＤａのモル質量の人工ペプチドまたはタンパク質である。典型的には、そのような抗体ミメティックは、両端をタンパク質足場に結合させた少なくとも１つの可変ペプチドループを含む。この二重の構造的束縛によって、抗体様タンパク質の結合親和性は、抗体の結合親和性に匹敵するレベルにまで大きく高められる。可変ペプチドループの長さは、典型的には１０～２０個のアミノ酸からなる。足場タンパク質は、優れた溶解特性を有する任意のタンパク質でありうる。好ましくは、足場タンパク質は、低分子の球状タンパク質である。例としては、中でも、ＬＡＣＩ－Ｄ１（リポタンパク質関連凝固インヒビター）；アフィリン、例えばヒトγＢクリスタリンまたはヒトユビキチン；シスタチン；スルホロブス・アシドカルダリウス由来Ｓａｃ７Ｄ；リポカインおよびリポカインに基づくアンチカリン；ＤＡＲＰｉｎｓ（設計されたアンキリンリピート領域（ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ ｄｏｍａｉｎｓ））；ＦｙｎのＳＨ３ドメイン；プロテアーゼ阻害薬のＫｕｎｉｔｚドメイン；モノボディ、例えばフィブロネクチンの１０番目のＩＩＩ型ドメイン；アドネクチン：ノッチン（シスチンノットタンパク質）；アトリマー；エビボディ、例えばＣＴＬＡ４ベース結合剤；アフィボディ、例えばスタフィロコッカス・アウレウス由来プロテインＡのＺ－ドメイン由来の３ヘリックスバンドル；トランスボディ（Ｔｒａｎｓ－ｂｏｄｙ）、例えばヒトトランスフェリン；テトラネクチン、例えば単量体または三量体ヒトＣ型レクチンドメイン；ミクロボディー、例えばトリプシンインヒビター－ＩＩ；アフィリン；アルマジロリピートタンパク質が挙げられる。同様に、核酸および低分子も抗体ミメティックとみなさすこともあるが（アプタマー）、人工抗体、抗体フラグメント、およびこれらから構成された融合タンパク質は抗体ミメティックとはみなさない。抗体にまさっている共通の利点は、より良好な溶解性、組織浸透性、熱および酵素に対する安定性、ならびに比較的生産費用が低いことである。

「抗原」という用語は、好ましくは、少なくとも１つのエピトープ、好ましくは、ＢもしくはＴ細胞反応またはＢ細胞およびＴ細胞反応を誘発するエピトープを含む免疫原性ペプチドである物質を指すのに使用される。

「エピトープ」は、抗原決定基とも呼ばれ、物質の、免疫系によって認識される部分であり、例えば、免疫原性ポリペプチドである。好ましくは、この認識は、抗体、Ｂ細胞、またはＴ細胞が当該エピトープに結合することによって媒介される。本文脈では、「結合」という用語は、好ましくは特異的結合に関する。エピトープは、通常、化学的に活性な、アミノ酸または糖側鎖などの分子の表面群からなり、通常、特異的な三次元構造の特徴、および特異的な電荷の特徴を有する。「エピトープ」という用語には、構造依存性および非構造依存性エピトープの両方が含まれる。構造依存性エピトープと非構造依存性エピトープは、変性溶媒の存在下で、前者への結合は失われるが、後者への結合は失われないという点で区別される。

本発明による免疫原性ポリペプチドは、病原体から得られる。一部の実施形態では、病原体は、ウイルス、細菌、および原生動物からなる群から選択される。しかしながら、本発明の別の実施形態では、免疫原性ポリペプチドは、腫瘍抗原、すなわち、がんによって特異的に発現されるポリペプチドまたはポリペプチドの断片である。

一実施形態では、Ｎ－βは、βストランドｂおよびｃを含むかまたはそれらからなるＩｇドメインの連続したアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。

一実施形態では、Ｎ－βは、βストランドａ、ｂ、およびｃを含むかまたはそれらからなるＩｇドメインの連続したアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。

一実施形態では、Ｃ－βは、βストランドｅおよびｆを含むかまたはそれらからなるＩｇドメインの連続したアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。

一実施形態では、Ｃ－βは、βストランドｅ、ｆ、およびｇを含むかまたはそれらからなるＩｇドメインの連続したアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。

一実施形態では、Ｎ－βは、βストランドｂおよびｃを含むかまたはそれらからなるＩｇドメインの連続したアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、Ｃ－βは、βストランドｅおよびｆを含むかまたはそれらからなるＩｇドメインの連続したアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。

一実施形態では、Ｎ－βは、βストランドａ～ｃを含むかまたはそれらからなるＩｇドメインの連続したアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、Ｃ－βは、βストランドｅ～ｇを含むかまたはそれらからなるＩｇドメインの連続したアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。

一実施形態では、Ｎ－βおよびＣ－βのＩｇドメインは、重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）または重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）から独立して選択される。言い換えると、Ｎ－βは、ＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインのＮ末端アミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、Ｃ－βは、ＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインのＣ末端アミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。

一実施形態では、Ｎ－βおよびＣ－βのＩｇドメインは、同じＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインから選択される。言い換えると、Ｎ－βは、ＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインのＮ末端アミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、Ｃ－βは、同じＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインのＣ末端アミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。

一実施形態では、Ｎ－βは、βストランドｂおよびｃを含むかまたはそれらからなるＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインの連続したアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。

一実施形態では、Ｎ－βは、βストランドａ～ｃを含むかまたはそれらからなるＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインの連続したアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。

一実施形態では、Ｃ－βは、βストランドｅおよびｆを含むかまたはそれらからなるＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインの連続したアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。

一実施形態では、Ｃ－βは、βストランドｅ～ｇを含むかまたはそれらからなるＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインの連続したアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。

一実施形態では、Ｎ－βは、βストランドｂおよびｃを含むかまたはそれらからなるＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインの連続したアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、Ｃ－βは、βストランドｅおよびｆを含むかまたはそれらからなるＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインの連続したアミノ酸配列からなる。

一実施形態では、Ｎ－βは、βストランドａ～ｃを含むかまたはそれらからなるＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインの連続したアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、Ｃ－βは、βストランドｅ～ｇを含むかまたはそれらからなるＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインの連続したアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。

本明細書の関連では、一般的にＣＨ２ドメインに言及する場合、ＣＨ２ドメインには、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＧ抗体の重鎖に存在する２番目の定常ドメインが含まれる。特に、ＣＨ２は、ＩｇＧ、詳細にはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のＣＨ２ドメインを指す。ＣＨ２ドメインは、抗体内でその他のドメインとのタンパク質－タンパク質接触がない。ＣＨ２ドメインは、ドメインの三次構造を安定化する分子内ジスルフィド結合を含む。ＣＨ２ドメインは、細菌発現系で発現させても、安定な単量体のままであるというさらなる利点を有する。ＩｇＭまたはＩｇＥ分子では、ＣＨ３ドメインがＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＤのＣＨ２ドメインに相当する。

一実施形態では、Ｎ－βおよびＣ－βのＩｇドメインは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、もしくはＩｇＧ重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）、またはＩｇＭもしくはＩｇＥ重鎖定常ドメイン３（ＩｇＭ ＣＨ３、ＩｇＥ ＣＨ３）から独立して選択される。言い換えると、Ｎ－βは、ＣＨ２ドメインまたはＩｇＭもしくはＩｇＥ ＣＨ３ドメインのＮ末端アミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、Ｃ－βは、ＣＨ２ドメインまたはＩｇＭもしくはＩｇＥ ＣＨ３ドメインのＣ末端アミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。

一実施形態では、Ｎ－βおよびＣ－βのＩｇドメインは、同じＣＨ２ドメインまたはＩｇＭもしくはＩｇＥ ＣＨ３ドメインから選択される。言い換えると、Ｎ－βは、ＣＨ２ドメインまたはＩｇＭもしくはＩｇＥ ＣＨ３ドメインのＮ末端アミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、Ｃ－βは、同じＣＨ２ドメインまたはＩｇＭもしくはＩｇＥ ＣＨ３ドメインのＣ末端アミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。

一実施形態では、Ｎ－βは、βストランドｂおよびｃを含むかまたはそれらからなるＣＨ２ドメインまたはＩｇＭもしくはＩｇＥ ＣＨ３ドメインの連続したアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。

一実施形態では、Ｎ－βは、βストランドａ～ｃを含むかまたはそれらからなるＣＨ２ドメインまたはＩｇＭもしくはＩｇＥ ＣＨ３ドメインの連続したアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。

一実施形態では、Ｃ－βは、βストランドｅおよびｆを含むかまたはそれらからなるＣＨ２ドメインまたはＩｇＭもしくはＩｇＥ ＣＨ３ドメインの、連続したアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。

一実施形態では、Ｃ－βは、βストランドｅ～ｇを含むかまたはそれらからなるＣＨ２ドメインまたはＩｇＭもしくはＩｇＥ ＣＨ３ドメインの連続したアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。

一実施形態では、Ｎ－βは、βストランドｂおよびｃを含むかまたはそれらからなるＣＨ２ドメインまたはＩｇＭもしくはＩｇＥ ＣＨ３ドメインの連続したアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、Ｃ－βは、βストランドｅおよびｆを含むかまたはそれらからなるＣＨ２ドメインまたはＩｇＭもしくはＩｇＥ ＣＨ３ドメインの連続したアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。

一実施形態では、Ｎ－βは、βストランドａ～ｃを含むかまたはそれらからなるＣＨ２ドメインまたはＩｇＭもしくはＩｇＥ ＣＨ３ドメインの連続したアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、Ｃ－βは、βストランドｅ～ｇを含むかまたはそれらからなるＣＨ２ドメインまたはＩｇＭもしくはＩｇＥ ＣＨ３ドメインの連続したアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。

一実施形態では、Ｎ－βおよびＣ－βのＩｇドメインは、ＩｇＧ ＣＨ２ドメインである。一実施形態では、Ｎ－βおよびＣ－βのＩｇドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ ＣＨ２ドメインから独立して選択される。一実施形態では、Ｎ－βおよびＣ－βのＩｇドメインは、同じＩｇＧ ＣＨ２ドメインから選択される。

一実施形態では、Ｎ－βは、βストランドｂおよびｃを含むかまたはそれらからなるＩｇＧ ＣＨ２ドメインの連続したアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。

一実施形態では、Ｎ－βは、βストランドａ～ｃを含むかまたはそれらからなるＩｇＧ ＣＨ２ドメインの連続したアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。

一実施形態では、Ｃ－βは、βストランドｅおよびｆを含むかまたはそれらからなるＩｇＧ ＣＨ２ドメインの連続したアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。

一実施形態では、Ｃ－βは、βストランドｅ～ｇを含むかまたはそれらからなるＩｇＧ ＣＨ２ドメインの連続したアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。

一実施形態では、Ｎ－βは、βストランドｂおよびｃを含むかまたはそれらからなるＩｇＧ ＣＨ２ドメインの連続したアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、Ｃ－βは、βストランドｅおよびｆを含むかまたはそれらからなるＩｇＧ ＣＨ２ドメインの連続したアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。

一実施形態では、Ｎ－βは、βストランドａ～ｃを含むかまたはそれらからなるＩｇＧ ＣＨ２ドメインの連続したアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、Ｃ－βは、βストランドｅ～ｇを含むかまたはそれらからなるＩｇＧ ＣＨ２ドメインの連続したアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。

一実施形態では、ＨＤＡおよびＨＤＢは、互いに（ｉ）非共有結合するか、または（ｉｉ）非共有結合かつ共有結合する。一実施形態では、ＨＤＡおよびＨＤＢは、互いに非共有結合かつ共有結合する。

一実施形態では、共有結合は、分子間ジスルフィド結合である。天然型ＣＨ２ドメインは、分子内ジスルフィド結合を含む。ＨＤＡおよびＨＤＢがＣＨ２ドメイン由来である場合（すなわち、Ｎ－βはＣＨ２ドメインのＮ末端アミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、Ｃ－βはＣＨ２ドメインのＣ末端アミノ酸配列を含むかまたはそれからなる場合）、同じＣＨ２ドメインに基づく一部の実施形態では、ＨＤＡおよびＨＤＢを連結する分子間ジスルフィド結合は、「親」ＣＨ２ドメインの分子内ジスルフィド結合に一致しうる。該ジスルフィド結合は、共有結合である。このように、ジスルフィド結合は、再会合したＩｇドメインのＮ末端部およびＣ末端部が１つの分子に合体することを確実にするものである。これは、既知のスプリットタンパク質手法（タンパク質相補性手法）と比較した利点である。ＨＤＡおよびＨＤＢは、親のかつ／または親のものではない、１つまたはそれ以上の共有結合を介して結合していてもよい。

一実施形態では、Ｃ－βは、そのＣ末端に１つまたはそれ以上のＬｙｓ残基を含む。一実施形態では、Ｃ－βは、Ｃ末端から１０アミノ酸以内に、１、２、または３個のＬｙｓ残基を含む。Ｌｙｓ残基は、天然型Ｉｇドメインに存在する天然に存在するＬｙｓ残基であってもよく、または天然型Ｉｇドメインに導入された天然には存在しないＬｙｓ残基であってもよい。Ｃ末端のＬｙｓ残基は、再会合したＩｇドメインの三次構造を安定化させるという理由で、有利である。

一実施形態では、Ｃ－βは、少なくともβストランドｅおよびｆを含むかまたはそれらからなるＣＨ２ドメインの連続したアミノ酸配列、ならびにＣ末端の１つまたはそれ以上のＬｙｓ残基を含むかまたはそれらからなる。一実施形態では、Ｃ－βは、少なくともβストランドｅおよびｆを含むかまたはそれらからなるＩｇＧ ＣＨ２ドメインの連続したアミノ酸配列、ならびにＣ末端の１つまたはそれ以上のＬｙｓ残基を含むかまたはそれらからなる。一実施形態では、Ｃ－βは、少なくともβストランドｄ～ｇを含むかまたはそれらからなるＣＨ２ドメインの連続したアミノ酸配列、ならびに場合によりＣ末端の１つまたはそれ以上のＬｙｓ残基を含むかまたはそれらからなる。一実施形態では、Ｃ－βは、少なくともβストランドｄ～ｇを含むかまたはそれらからなるＩｇＧ ＣＨ２ドメインの連続したアミノ酸配列、ならびに場合によりＣ末端の１つまたはそれ以上のＬｙｓ残基を含むかまたはそれらからなる。一実施形態では、Ｃ－βは、βストランドｃ’、ｄ、ｅ、ｆ、およびｇを含むかまたはそれらからなるＣＨ２ドメインの連続したアミノ酸配列、ならびに場合によりＣ末端の１つまたはそれ以上のＬｙｓ残基を含むかまたはそれらからなる。一実施形態では、Ｃ－βは、βストランドｃ’、ｄ、ｅ、ｆ、およびｇを含むかまたはそれらからなるＩｇＧ ＣＨ２ドメインの連続したアミノ酸配列、ならびに場合によりＣ末端の１つまたはそれ以上のＬｙｓ残基を含むかまたはそれらからなる。

一実施形態では、Ｎ－βおよびＣ－βはそれぞれ、天然には存在しないＣｙｓ残基を含み、天然には存在しないＣｙｓ残基は、フォールディングしたＮ－βおよびＣ－βそれぞれにおいて、天然では３～７．５ÅのＣα原子間距離を有するアミノ酸に取って代わっている。再会合したＩｇドメインでは、Ｎ－βの天然には存在しないＣｙｓ残基とＣ－βの天然には存在しないＣｙｓ残基とは、ジスルフィド結合の形成を可能にする距離を有することとなる。このように導入されたジスルフィド結合は、再会合したＩｇドメイン三次構造を安定化させることとなるという理由で、有利である。

本発明の関連において、配列番号１は、アミノ酸配列
ＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＸ_１ＥＤＰＥＶＸ_２ＦＸ_３ＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮ
に関する。

本発明の関連において、配列番号２は、アミノ酸配列
ＮＳＴＸ_４ＲＶＶＳＶＬＴＶＸ_５ＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＸ_６ＬＰＸ_７Ｘ_８ＩＥＫＴＩ
に関する。

一実施形態では、ＨＤＡは、配列番号１（配列中、Ｘ_１はＨまたはＱであり、Ｘ_２はＫまたはＱであり、Ｘ_３はＮまたはＫである）；または配列番号１に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む配列番号１の変異体を含むかまたはそれからなり；かつ／またはＨＤＢは、配列番号２（配列中、Ｘ_４はＹまたはＦであり；Ｘ_５はＬまたはＶであり；Ｘ_６はＡまたはＧであり；Ｘ_７はＫまたはＱであり；Ｘ_８はＮまたはＫである）；または配列番号２に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む配列番号２の変異体を含むかまたはそれからなり、配列番号１またはその変異体は、配列番号２またはその変異体とヘテロ二量体化することができる。ＨＤＡが配列番号１の変異体を含むかまたはそれからなる場合、配列番号１の前記変異体は２４位に変異を含まず、一部の実施形態では、前記変異体は、２４位での変異を含まず、３、５、２２、２３、２５、２６、３６、３８、および４０位に１つまたは２つ以下の変異しか含まず、一部の実施形態では、前記変異体は、３、５、２２～２６、３６、３８、および４０位に変異を含まない。ＨＤＢが配列番号２の変異体を含むかまたはそれからなる場合、配列番号２の前記変異体は、２５位に変異を含まず、一部の実施形態では前記変異体は、２５位に変異を含まず、４、６～１０、１７、２３、２４、２６、および２７位に１つまたは２つ以下の変異しか含まず、一部の実施形態では、前記変異体は、４、６～１０、１７、および２３～２７位に変異を含まない。

一実施形態では、ＨＤＡは、配列番号３、または配列番号３に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む配列番号３の変異体を含むかまたはそれからなり；ＨＤＢは、配列番号４、または配列番号４に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む配列番号４の変異体を含むかまたはそれからなり、配列番号３またはその変異体は、配列番号４またはその変異体とヘテロ二量体化することができる。

一実施形態では、ＨＤＡは、配列番号５、または配列番号５に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む配列番号５の変異体を含むかまたはそれからななり；ＨＤＢは、配列番号６、または配列番号６に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む配列番号６の変異体を含むかまたはそれからなり、配列番号５またはその変異体は、配列番号６またはその変異体とヘテロ二量体化することができる。

一実施形態では、ＨＤＡは、配列番号７、または配列番号７に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む配列番号７の変異体を含むかまたはそれからなり；ＨＤＢは、配列番号８、または配列番号８に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む配列番号８の変異体を含むかまたはそれからなり、配列番号７またはその変異体は、配列番号８またはその変異体とヘテロ二量体化することができる。

一実施形態では、ＨＤＡは、配列番号９、または配列番号９に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む配列番号９の変異体を含むかまたはそれからなり；ＨＤＢは、配列番号１０、または配列番号１０に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む配列番号１０の変異体を含むかまたはそれからなり、配列番号９またはその変異体は、配列番号１０またはその変異体とヘテロ二量体化することができる。

ＨＤＡが配列番号３、５、７、または９の変異体を含むかまたはそれからなる場合、配列番号３、５、７、または９の前記変異体は、２４位に変異を含まず、一部の実施形態では、前記変異体は、２４位に変異を含まず、３、５、２２、２３、２５、２６、３６、３８、および４０位に１つまたは２つ以下の変異しか含まず、一部の実施形態では、前記変異体は、３、５、２２～２６、３６、３８、および４０位に変異を含まない。ＨＤＢが配列番号４、６、８、または１０の変異体を含むかまたはそれからなる場合、配列番号４、６、８、または１０の前記変異体は、２５位に変異を含まず、一部の実施形態では、前記変異体は、２５位に変異を含まず、４、６～１０、１７、２３、２４、２６、および２７位に１つまたは２つ以下の変異しか含まず、一部の実施形態では、前記変異体は、４、６～１０、１７、および２３～２７位に変異を含まない。

２つの配列間のパーセント同一性の決定は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０、５８７３～５８７７頁、１９９３の数学的アルゴリズムを使用して行った。そのようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２１５、４０３～４１０頁のＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰプログラムに組み込まれている。比較のためのギャップ挿入アラインメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５、３３８９～３４０２頁に記載されているように、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用した。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメーターを使用する。別法として、変異体はまた、アミノ酸置換を２０、１５、１０、５、４、３、２、または１個まで有すると定義され、一部の実施形態では、前記アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。保存的置換は、当技術分野において公知である（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ （１９８４） Ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙを参照されたい）。アミノ酸の物理的および化学的特性の概要を、下記の表１に示す。一実施形態では、保存的置換は、表１に記載の共通の（すなわち、縦列１および／または２の）特性を少なくとも１つ有するアミノ酸により行われた置換である。

一実施形態では、配列番号２は、ａａ付加として、そのＣ末端に１つまたはそれ以上のＬｙｓ残基をさらに含む。一実施形態では、配列番号２は、ａａ付加として、そのＣ末端にＳｅｒ残基およびＬｙｓ残基（すなわち、ＳＫ）をさらに含む。一実施形態では、配列番号２は、そのＣ末端に残基ＳＫＴＫまたはＳＫＡＫをさらに含む。

一実施形態では、配列番号４、６、８、または１０は、ａａ付加として、それらの各Ｃ末端に１つまたはそれ以上のＬｙｓ残基をさらに含む。一実施形態では、配列番号４、６、８、または１０は、ａａ付加として、それらの各Ｃ末端にＳｅｒ残基およびＬｙｓ残基（すなわち、ＳＫ）をさらに含む。一実施形態では、配列番号４、６、８、または１０は、それらの各Ｃ末端に、残基ＳＫＴＫまたはＳＫＡＫをさらに含む。

一実施形態では、本複合体は、ＰＣＡおよび／またはＰＣＢ内に１つまたはそれ以上の抗原結合部位を含む。一実施形態では、１つまたはそれ以上の抗原結合部位は各々、一方がＰＣＡに含まれ、もう一方がＰＣＢに含まれる２つの可変領域の対によって形成されている。本明細書の関連では、抗原結合部位は、パラトープと呼ばれることもある。本発明の第１の態様のある特定の実施形態では、タンパク質複合体は、抗体または抗体様分子である。

一実施形態では、抗原結合部位は、１つまたは２つの可変領域を含むかまたはそれらからなる。一実施形態では、抗原結合部位は、２つの可変領域を含むかまたはそれらからなる。

抗原結合部位は、ラクダ科の免疫グロブリンの重鎖の可変領域を含むかまたはそれからなっていてもよい。一実施形態では、抗原結合部位は、軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含むかまたはそれらからなる。一実施形態では、抗原結合部位は、アルファ鎖の可変領域およびベータ鎖の可変領域を含むかまたはそれらからなる。抗原結合部位はまた、タンパク質足場、例えば、アドネクチン、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アンチカリン、アルマジロリピートタンパク質ベースの足場、アトリマー、アビマー、フィノマー、Ｋｕｎｉｔｚドメイン、ノッチン、アフィボディ、βヘアピンミメティック、モノボディ、ナノフィチン、またはアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ）によって各々形成された、１つまたは２つの可変領域を含むかまたはそれらからなっていてもよい。

一実施形態では、ＰＣＡおよび／またはＰＣＢは、１つまたはそれ以上のさらなるホモおよび／またはヘテロ二量体化ドメインＣ（ＨＤＣ）を含む。ＨＤＣは、別のポリペプチド鎖に含まれる第２のＨＤＣとのホモまたはヘテロ二量体化を媒介しており、すなわち、２つのＨＤＣは、互いに結合することとなる。

一実施形態では、ＰＣＡおよびＰＣＢは各々、さらなるヘテロ二量体化ドメインを含む。ＰＣＡおよびＰＣＢの各々が、１つのさらなるヘテロ二量体化ドメインＨＤＣを含む構成の例は、本明細書に記載のＤＶＤ－ＦａｂスプリットＣＨ２フォーマット（変異体２、図２Ｂ）または本明細書に記載のＣＯＤＶ－ＦａｂスプリットＣＨ２フォーマット（変異体３、図２Ｃ）である。これらのフォーマットの例では、一方のＨＤＣはＣＨ１ドメインであり、もう一方のＨＤＣはＣＬドメインである。

一実施形態では、ＰＣＡかＰＣＢかの一方だけが、さらなるホモ二量体化ドメインを含む。ＰＣＡかＰＣＢかの一方だけがホモ二量体化ドメインＨＤＣを含み、もう一方はホモ二量体化ドメインＨＤＣを含まない構成の一例としては、本明細書に記載の対称性の四価二重特異性抗体フォーマットがある（ｐ．２２第２段落）。これらの構成では、ホモ二量体化ドメインＨＤＣを含むポリペプチド鎖、例えばＰＣＡは、第１のＰＣＡと同一である第２のＰＣＡに結合する。第２および第１のＰＣＡは各々、ヘテロ二量体化ドメインＨＤＡおよびＨＤＢの相互作用を介してＰＣＢに結合する。このように、四量体が形成される。これらのフォーマットの例では、ＨＤＣは、ＣＨ２－ＣＨ３ドメインである。

ＰＣＡかＰＣＢかの一方だけがホモ二量体化ドメインを含み、もう一方はホモ二量体化ドメインを含まず、加えて、ＰＣＡおよびＰＣＢの両方が（それぞれ、ＨＤＡまたはＨＤＢに加えて）さらなるヘテロ二量体化ドメインを含む構成の一例は、本明細書に記載のＤＶＤおよびＣＯＤＶ構成四価二重特異性抗体である（変異体９および１０、図５Ｂ、Ｃ）。

一実施形態では、ＰＣＡかＰＣＢかの一方が、さらなるヘテロ二量体化ドメインを含む。ＰＣＡかＰＣＢかの一方だけがさらなるヘテロ二量体化ドメインＨＤＣを含むが、もう一方はさらなるヘテロ二量体化ドメインＨＤＣを含まない構成の一例は、本明細書に記載の非対称性二価二重特異性抗体フォーマットである（変異体４、図２Ｄ）。これらのフォーマットの例では、ＨＤＣは、ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ ＣＨ２－ＣＨ３ドメインである。

一実施形態では、ホモ二量体化ドメインは、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２－ＣＨ３ドメイン、またはホモ二量体化がＩｇ様フォールド、ロスマンまたはロスマン様アルファ－ベータ－アルファサンドイッチフォールド、アルファサンドイッチフォールド、連続ベータシートフォールド、ベータサンドイッチフォールド、混合ベータシートフォールド、２－ヘリックス配向、逆平行アルファヘリックス配向、平行アルファヘリックス配向、４－ヘリックスバンドルモチーフ、ロイシンジッパー、およびコイルドコイルドメインによって媒介されているドメインからなる群から選択される。

一実施形態では、ヘテロ二量体化ドメインは、ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ ＣＨ３ドメイン、ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ ＣＨ２－ＣＨ３ドメイン、ヘテロ二量体化を起こすように導入された変異（例えば、荷電変異）を有するＦｃ－ドメイン、相互交換された一対のドメイン（例えば、Ｆｃ－ドメイン／カッパヘテロ二量体化ドメイン、ＣＬおよびＣＨドメインなど）のうちの一方のドメイン、ヘテロ二量体化を起こすように導入された変異を有するＩｇ様フォールド、またはロスマンもしくはロスマン様アルファ－ベータ－アルファサンドイッチフォールド、アルファサンドイッチフォールド、連続ベータシートフォールド、ベータサンドイッチフォールド、混合ベータシートフォールド、２－ヘリックス配向、逆平行アルファヘリックス配向、平行アルファヘリックス配向、４－ヘリックスバンドルモチーフ、ロイシンジッパー、およびコイルドコイルドメインを含むヘテロ二量体化を媒介するドメインからなる群から選択される。

本明細書の関連において、「ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ ＣＨ３ドメイン」とは、「ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ」変異を含む一対のＣＨ３ドメインのうちの１つを指す。そのようなｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ変異は、一方のＣＨ３ドメイン上に「ノブ（ｋｎｏｂ）」を、もう一方のＣＨ３ドメイン上に「穴（ｈｏｌｅ）」を作出させるためのアミノ酸置換である。ノブはチロシン（Ｙ）によって表され、一方、穴はスレオニン（Ｔ）によって表される。特に、ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ変異は、一方のＣＨ３ドメインではＴ３６６Ｙで、もう一方のＣＨ３ドメインではＹ４０７Ｔであり、この２つのＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ１定常ドメインであり、また、場合により、Ｔ３６６Ｙ変異を含むＦｃ領域（「ノブ」鎖）は変異Ｓ３５４ＣおよびＴ１６６Ｗをさらに含み、Ｙ４０７Ｔ変異を含むＦｃ領域（「穴」鎖）は、変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖをさらに含む。

本明細書の関連において、「ＲＦ変異」という用語は、一対のＣＨ３ドメインのうちの一方での変異Ｈ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆ（ＲＦ変異）を指す。ＲＦ変異は、Ｔ３６６Ｙ変異を含むＣＨ３ドメイン（「ノブ」鎖）内、またはＹ４０７Ｔ変異を含むＣＨ３ドメイン（「穴」鎖）内であってもよい。

本明細書の関連では、「ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ ＣＨ２－ＣＨ３ドメイン」とは、ＣＨ３ドメインが「ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ」変異を含むＣＨ２－ＣＨ３ドメインである。

一実施形態では、抗原結合部位は、ＨＤＡまたはＨＤＢのＮ末端および／もしくはＣ末端に位置する。

一実施形態では、抗原結合部位は、ＨＤＣのＮ末端および／またはＣ末端に位置する。

一実施形態では、ＰＣＡおよびＰＣＢは、Ｎ末端からＣ末端に、以下の要素：
（ｉ）ＰＣＡ：Ｖ２－Ｌ１－ＨＤＡ、およびＰＣＢ：Ｖ２－Ｌ２－ＨＤＢ；
（ｉｉ）ＰＣＡ：Ｖ１－Ｌ３－ＨＤＡ－Ｌ４－Ｖ２、およびＰＣＢ：Ｖ１－Ｌ１－ＨＤＢ－Ｌ２－Ｖ２；
（ｉｉｉ）ＰＣＡ：Ｖ１－Ｌ１－Ｖ２－Ｌ２－ＨＤＡ、およびＰＣＢ：Ｖ２－Ｌ３－Ｖ１－Ｌ４－ＨＤＢ；
（ｉｖ）ＰＣＡ：Ｖ１－Ｌ３－Ｖ２－Ｌ５－ＣＬ－Ｌ４－ＨＤＡ、およびＰＣＢ：Ｖ１－Ｌ１－Ｖ２－Ｌ６－ＣＨ１－Ｌ２－ＨＤＢ
（ここでは、Ｌ５、ＣＬ、Ｌ６、およびＣＨ１は、存在していても存在していなくてもよい）；または
（ｖ）ＰＣＡ：Ｖ１－Ｌ４－Ｖ２－Ｌ５－ＣＬ－Ｌ６－ＨＤＡ、およびＰＣＢ：Ｖ２－Ｌ１－Ｖ１－Ｌ２－ＣＨ１－Ｌ３－ＨＤＢ
（ここでは、Ｌ５、ＣＬ、Ｌ２、およびＣＨ１は、存在していても存在していなくてもよい）
を含む。

上記段落で言及したＰＣＡおよびＰＣＢの実施形態（ｉ）～（ｖ）すべてにおいて、Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３、およびＶ４の各ペア（すなわち、Ｖ１／Ｖ１、Ｖ２／Ｖ２、Ｖ３／Ｖ３、およびＶ４／Ｖ４）は、重鎖の可変領域および軽鎖の可変領域またはアルファ鎖の可変領域およびベータ鎖の可変領域を含むかまたはそれらからなり、抗原結合部位を形成している。Ｌ１～Ｌ６は、ペプチドリンカーである。ＣＨ１は、重鎖定常ドメイン１である。ＣＬは、軽鎖定常ドメインである。ＰＣＡおよび／またはＰＣＢは、ＨＤＣをさらに含んでいてもよい。

「ペプチドリンカー」という用語は、一般的に、また別段の指定がないかぎり、２つのドメインの各々とペプチド結合を形成することによって２つのドメインを連結させる部分を指す。本明細書では、ペプチドリンカーは、０～Ｘアミノ酸（「ａａ」）の長さを有するリンカーを指す。２つのドメインが０ａａの長さを有するリンカーによって連結されるという場合、これは、２つのドメインはその２つのドメインの間のペプチド結合によって直接連結されていることを意味する。これについては、「連結された」の代わりに「融合された」という用語を使用してもよい。ペプチドリンカーは、特に可動性ペプチドリンカーであり、すなわち、ペプチドリンカーは、一体に連結されたドメインの間に可動性を与えるものである。そのような可動性は、アミノ酸が、低分子であり、かつアミノ酸鎖の回転または屈曲を妨害する嵩高い側鎖を有さなければ、一般的には高められる。よって、一部の実施形態では、本発明のペプチドリンカーは、低分子のアミノ酸、例えば、グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、ロイシン、およびイソロイシンの含量が高い。一部の実施形態では、ペプチドリンカーのアミノ酸の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上が、そのような低分子のアミノ酸である。一実施形態では、該リンカーのアミノ酸は、グリシンおよびセリンから選択され、すなわち、前記リンカーは、ポリグリシンまたはポリグリシン／セリンリンカーであり、ここで「ポリ」とは、該リンカーにおける少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくはさらに１００％のグリシンおよび／またはセリン残基の割合を意味している。本明細書の関連では、ポリ－グリシン／セリンリンカーという用語はまた、ＧまたはＳから選択された１種類のアミノ酸のみからなるリンカーを指すこともある。

一部の実施形態では、ペプチドリンカーＬ１～Ｌ６は、一般式（Ｉ）：［Ｇ_ｗＳ_ｘＧ_ｙ］_ｚ（配列番号３４）（式中、ｗは、０から２０の間の整数、一部の実施形態では２から５の間の整数であり、ｘは、０から１０の間の整数、一部の実施形態では０から３の間の整数であり、ｙは、０から２０の間の整数、一部の実施形態では０から５の間の整数であり、ｚは、０から１０の間の整数、一部の実施形態では０から４の間の整数である）のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。２０アミノ酸（ａａ）以下のペプチドリンカー長は、特に有用である。

実施形態（ｉ）では、ＰＣＡおよびＰＣＢは、Ｎ末端からＣ末端に、以下の要素：ＰＣＡ：Ｖ２－Ｌ１－ＨＤＡおよびＰＣＢ：Ｖ２－Ｌ２－ＨＤＢを含む。一部の実施形態では、ＰＣＡかＰＣＢかの一方は、ヘテロ二量体化ドメインＨＤＣをさらに含む。この構成の例は、本明細書に記載の非対称性二価二重特異性抗体フォーマットに含まれるＰＣＡおよびＰＣＢである（変異体１１および１２、図５Ｄ、Ｅ）。一部の実施形態では、Ｌ１およびＬ２は、２０ａａ以下の長さを有し、一部の実施形態では１５ａａ以下、一部の実施形態では１０ａａ以下、一部の実施形態では５ａａ以下の長さを有する。一部の実施形態では、Ｌ１およびＬ２は、ポリグリシンまたはポリグリシン／セリンリンカーである。非限定的な例では、ＰＣＢは、ヘテロ二量体化ドメインＨＤＣをさらに含み、Ｌ１はＧ_２であり、Ｌ２は（Ｇ_５Ｓ）_２（配列番号３５）である。

実施形態（ｉｉ）では、ＰＣＡおよびＰＣＢは、Ｎ末端からＣ末端に、以下の要素：ＰＣＡ：Ｖ１－Ｌ３－ＨＤＡ－Ｌ４－Ｖ２およびＰＣＢ：Ｖ１－Ｌ１－ＨＤＢ－Ｌ２－Ｖ２を含む。この構成の一例は、本明細書に記載の「ｓｐｌｉｔｅ」（「スプリットｂｉｔｅ様（ｓｐｌｉｔ ｂｉｔｅ－ｌｉｋｅ）」）ダイアボディフォーマットである（変異体４～７、図２Ｄ）。「ｓｐｌｉｔｅ」ダイアボディフォーマットでは、ＨＤＡおよびＨＤＢは、それぞれＰＣＡおよびＰＣＢの、可変領域Ｖ１およびＶ２の間に挿入されている（図２Ｄ）。一部の実施形態では、ＰＣＡおよびＰＣＢは、Ｎ末端からＣ末端に、以下の要素：ＰＣＡ：ＶＬ１－Ｌ３－ＨＤＡ－Ｌ４－ＶＬ２およびＰＣＢ：ＶＨ１－Ｌ１－ＨＤＢ－Ｌ２－ＶＨ２を含む。「ｓｐｌｉｔｅ」ダイアボディフォーマットの一部の実施形態では、Ｌ１～Ｌ４は、２０ａａ以下の長さを有し、一部の実施形態では、１５ａａ以下の長さを有する。一部の実施形態では、Ｌ１～Ｌ４は、ポリグリシンまたはポリグリシン／セリンリンカーである。一部の実施形態では、Ｌ１～Ｌ４のうちの２つまたは３つは、０ａａである。

「ｓｐｌｉｔｅ」ダイアボディフォーマットの一部の実施形態では、
－ Ｌ３は、１０～２０ａａの長さを有し、一部の実施形態では１３～１７ａａの長さを、一部の実施形態では約１５ａａの長さを有し、Ｌ４は、０～１０ａａの長さを有し、一部の実施形態では０～５ａａの長さを、一部の実施形態では０ａａの長さを有し、Ｌ１は、１０～２０ａａの長さを有し、一部の実施形態では１３～１７ａａの長さを、一部の実施形態では約１５ａａの長さを有し、Ｌ２は、０～１０ａａの長さを有し、一部の実施形態では０～５ａａの長さを、一部の実施形態では０ａａの長さを有し；
－ Ｌ３は、０～１０ａａの長さを有し、一部の実施形態では０～５ａａの長さを、一部の実施形態では約３ａａの長さを有し、Ｌ４、Ｌ１、およびＬ２は、０～１０ａａの長さを有し、一部の実施形態では０～５ａａ、一部の実施形態では０ａａの長さを有し、；
－ Ｌ３は、０～１０ａａの長さを有し、一部の実施形態では０～５ａａの長さを、一部の実施形態では約３ａａの長さを有し、Ｌ１は、１０～２０ａａの長さを有し、一部の実施形態では１３～１７ａａの長さを、一部の実施形態では約１５ａａの長さを有し、Ｌ４およびＬ２は、０～１０ａａの長さを有し、一部の実施形態では０～５ａａの長さを、一部の実施形態では０ａａの長さを有し；または
－ Ｌ３は、１０～２０ａａの長さを有し、一部の実施形態では１３～１７ａａの長さを、一部の実施形態では約１５ａａの長さを有し、Ｌ４、Ｌ１、およびＬ２は、０～１０ａａの長さを有し、一部の実施形態では０～５ａａの長さを、一部の実施形態では０ａａの長さを有する。

非限定的な例として、Ｌ１～Ｌ４の可能な組合せは：Ｌ３が（Ｇ_４Ｓ）_３（配列番号３６）であり、Ｌ４が０ａａであり、Ｌ１が（Ｇ_４Ｓ）_３（配列番号３６）であり、Ｌ２が０ａａであり；Ｌ３がＧ_３であり、Ｌ４が０ａａであり、Ｌ１が０ａａであり、Ｌ２がａａであり；Ｌ３がＧ_３であり、Ｌ４が０ａａであり、Ｌ１が（Ｇ_４Ｓ）_３（配列番号３６）であり、Ｌ２が０ａａであり、またはＬ３が（Ｇ_４Ｓ）_３（配列番号３６）であり、Ｌ４が０ａａであり、Ｌ１が０ａａであり、Ｌ２が０ａａである。

実施形態（ｉｉ）によるフォーマットもまた、可変領域の追加の対を、例えば、再構成されたスプリットＩｇドメインの各末端（すなわち、Ｎ末端とＣ末端と）に二対の可変領域を含んでいてもよく、これによって、四価構築物が得られる。

実施形態（ｉｉｉ）では、ＰＣＡおよびＰＣＢは、Ｎ末端からＣ末端に、以下の要素：ＰＣＡ：Ｖ１－Ｌ１－Ｖ２－Ｌ２－ＨＤＡおよびＰＣＢ：Ｖ２－Ｌ３－Ｖ１－Ｌ４－ＨＤＢを含む。この構成の一例は、本明細書に記載したようなダイアボディスプリットＣＨ２フォーマット（変異体１、図２Ａ）である。ダイアボディスプリットＣＨ２フォーマットでは、ＰＣＡおよびＰＣＢの可変領域は交差した向きにあり、すなわち、Ｖ１は、ＰＣＡではＶ２に対してＮ末端側に位置し、ＰＣＢではＶ２に対してＣ末端側に位置する。よって、ダイアボディスプリットＣＨ２フォーマットでは、リンカーＬ１～Ｌ４は、可変領域を交差構成にフォールディングさせるのに十分な可動性を提供しなければならない。ＨＤＡおよびＨＤＢは、それぞれ、ＰＣＡおよびＰＣＢの可変領域に対してＣ末端側に付加されている（図２Ａ）。一部の実施形態では、ＰＣＡおよびＰＣＢは、Ｎ末端からＣ末端に、以下の要素：ＰＣＡ：ＶＬ１－Ｌ１－ＶＨ２－Ｌ２－ＨＤＡおよびＰＣＢ：ＶＬ２－Ｌ３－ＶＨ１－Ｌ４－ＨＤＢを含む。ダイアボディスプリットＣＨ２フォーマット一部の実施形態では、Ｌ１～Ｌ４は、２０ａａ以下の長さを有する。一部の実施形態では、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は５～２０ａａの長さを有し、Ｌ２は、０～５ａａの長さを有する。一部の実施形態では、Ｌ１～Ｌ４は、ポリグリシンもしくはポリグリシン／セリンリンカーであるか、または０ａａである。一部の実施形態では、Ｌ１およびＬ３は、５～１５ａａの長さを有し、一部の実施形態では５～１０ａａの長さを、一部の実施形態では約８ａａの長さを有し、Ｌ２は、０～１０ａａの長さを有し、一部の実施形態では０～５ａａ、一部の実施形態では０ａａの長さを有し、Ｌ４は、５～２０ａａの長さを有し、一部の実施形態では８～１５ａａの長さを、一部の実施形態では約１０ａａの長さを有する。

ダイアボディスプリットＣＨ２フォーマットの非限定的な例では、Ｌ１およびＬ３は、Ｇ_３ＳＧ_４（配列番号３７）であり、Ｌ２は、０ａａであり、Ｌ４は、（Ｇ_４Ｓ）_２（配列番号３８）である。

実施形態（ｉｖ）では、ＰＣＡおよびＰＣＢは、Ｎ末端からＣ末端に、以下の要素：ＰＣＡ：Ｖ１－Ｌ３－Ｖ２－Ｌ５－ＣＬ－Ｌ４－ＨＤＡ、およびＰＣＢ：Ｖ１－Ｌ１－Ｖ２－Ｌ６－ＣＨ１－Ｌ２－ＨＤＢを含み；ここで、Ｌ５、ＣＬ、Ｌ６、およびＣＨ１は、存在していても存在していなくてもよい。この構成の一例は、本明細書に記載のＤＶＤ－ＦａｂスプリットＣＨ２フォーマットである（変異体２、図２Ｂ）。ＤＶＤ－ＦａｂスプリットＣＨ２フォーマットでは、ＰＣＡおよびＰＣＢは各々、定常ヘテロ二量体化ドメイン（それぞれ、ＣＨ１またはＣＬ）を、それぞれ、可変領域のＣ末端側、およびＨＤＡまたはＨＤＢのＮ末端側に含む（図２Ｂ）。一部の実施形態では、ＰＣＡおよびＰＣＢは、Ｎ末端からＣ末端に、以下の要素：ＰＣＡ：ＶＬ１－Ｌ３－ＶＬ２－Ｌ５－ＣＬ－Ｌ４－ＨＤＡおよびＰＣＢ：ＶＨ１－Ｌ１－ＶＨ２－Ｌ６－ＣＨ１－Ｌ２－ＨＤＢを含む。ＤＶＤ－ＦａｂスプリットＣＨ２フォーマットの一部の実施形態では、Ｌ１～Ｌ６は、２０ａａ以下の長さを有する。一部の実施形態では、Ｌ１～Ｌ６は、一部の実施形態では、Ｌ１～Ｌ３は、ポリグリシンもしくはポリグリシン／セリンリンカーであるか、または０ａａである。一部の実施形態では、Ｌ５およびＬ６は、０ａａである。一部の実施形態では、Ｌ１は、５～１５ａａの長さを、一部の実施形態では約１０ａａの長さを有し、Ｌ２は、０～１０ａａの長さを有し、一部の実施形態では０～５ａａの長さを、一部の実施形態では約３ａａの長さを有し、Ｌ３は、５～１５ａａの長さを、一部の実施形態では約１０ａａの長さを有し、Ｌ４は、０～１０ａａの長さを有し、一部の実施形態では０～５ａａの長さを、一部の実施形態では０ａａの長さを有し、Ｌ５およびＬ６は、０～１０ａａの長さを有し、一部の実施形態では０～５ａａの長さを、一部の実施形態では０ａａの長さを有する。

ＤＶＤ－ＦａｂスプリットＣＨ２フォーマットの非限定的な例では、Ｌ１は（Ｇ_４Ｓ）_２（配列番号３８）であり、Ｌ２はＧ_３であり、Ｌ３は（Ｇ_４Ｓ）_２（配列番号３８）であり、Ｌ４～Ｌ６は０ａａである。

実施形態（ｖ）では、ＰＣＡおよびＰＣＢは、Ｎ末端からＣ末端に、以下の要素：ＰＣＡ：Ｖ１－Ｌ４－Ｖ２－Ｌ５－ＣＬ－Ｌ６－ＨＤＡおよびＰＣＢ：Ｖ２－Ｌ１－Ｖ１－Ｌ２－ＣＨ１－Ｌ３－ＨＤＢを含み；ここで、Ｌ５、ＣＬ、Ｌ２、およびＣＨ１は、存在していても存在していなくてもよい。この構成の一例は、本明細書に記載したようなＣＯＤＶ－ＦａｂスプリットＣＨ２フォーマットである（変異体３、図２Ｃ）。ＣＯＤＶ－ＦａｂスプリットＣＨ２フォーマットでは、ＰＣＡおよびＰＣＢの可変領域は交差した向きにあり、すなわち、Ｖ１は、ＰＣＡではＶ２に対してＮ末端側に位置し、ＰＣＢではＶ２に対してＣ末端側に位置する。よって、ＣＯＤＶ－ＦａｂスプリットＣＨ２フォーマットでは、リンカーＬ１～Ｌ６は、可変領域を交差構成にフォールディングさせるのに十分な可動性を提供しなければならない。加えて、ＰＣＡおよびＰＣＢは各々、定常ヘテロ二量体化ドメイン（それぞれＣＨ１またはＣＬ）を、それぞれ、可変領域のＣ末端側、およびＨＤＡまたはＨＤＢのＮ末端側に含む（図２Ｃ）。一部の実施形態では、ＰＣＡおよびＰＣＢは、Ｎ末端からＣ末端に、以下の要素：ＰＣＡ：ＶＬ１－Ｌ４－ＶＬ２－Ｌ５－ＣＬ－Ｌ６－ＨＤＡおよびＰＣＢ：ＶＨ２－Ｌ１－ＶＨ１－Ｌ２－ＣＨ１－Ｌ３－ＨＤＢを含む。ＣＯＤＶ－ＦａｂスプリットＣＨ２フォーマット一部の実施形態では、Ｌ１～Ｌ６は、２０ａａ以下の長さを有する。一部の実施形態では、Ｌ４およびＬ５は、５～１５ａａの長さを有し、Ｌ１およびＬ２は、１０ａａ以下の長さを有する。一部の実施形態では、Ｌ１～Ｌ６は、ポリグリシン、ポリセリン、ポリグリシン／セリンリンカーである。一部の実施形態では、Ｌ３は、ポリグリシン、ポリセリン、ポリグリシン／セリンリンカーである。一部の実施形態では、Ｌ４は、５～１５ａａの長さを有し、一部の実施形態では５～１０ａａの長さを、一部の実施形態では約８ａａの長さを有し、Ｌ５は、５～１５ａａの長さを有し、一部の実施形態では５～１０ａａの長さを、一部の実施形態では約６ａａの長さを有し、Ｌ１は、０～１０ａａの長さを有し、一部の実施形態では０～５ａａの長さを、一部の実施形態では約１ａａの長さを有し、Ｌ２は、０～１０ａａの長さを有し、一部の実施形態では０～５ａａの長さを、一部の実施形態では０ａａの長さを有し、Ｌ６は、０～１０ａａの長さを有し、一部の実施形態では０～５ａａの長さを、一部の実施形態では０ａａの長さを有し、Ｌ３は、０～１０ａａの長さを有し、一部の実施形態では０～５ａａの長さを、一部の実施形態では約３ａａの長さを有する。

ＣＯＤＶ－ＦａｂスプリットＣＨ２フォーマットの非限定的な例では、Ｌ４は、ＧＱＰＫＡＡＰＳ（配列番号３９）であり、Ｌ５は、ＴＫＧＰＳＶ（配列番号４０）であり、Ｌ１はＳであり、Ｌ２は０ａａであり、Ｌ６は０ａａであり、Ｌ３はＧ_３である。

実施形態（ｉｉｉ）～（ｖ）によるフォーマットはまた、可変領域の追加の対、例えば合計三対の可変領域を含んでいてもよく、これによって三価構築物が得られる。

一実施形態では、ＰＣＡおよび／またはＰＣＢは、第１のＨＤＣを含み、本複合体は、１つまたはそれ以上の抗原結合部位を含む１つまたはそれ以上の追加のポリペプチド、および第１のＨＤＣに共有結合または非共有結合している第２のＨＤＣを含む。一部の実施形態では、追加のポリペプチドは、ＰＣＡおよび／もしくはＰＣＢに従った構造または抗体様構造を有する。

追加のポリペプチドがＰＣＡおよびＰＣＢに従った構造を有する構成の例は、本明細書に記載の対称性四価二重特異性抗体フォーマットである（変異体８～１０、図５Ａ～Ｃ）。これらの対称性フォーマットは、上記の実施形態によるＰＣＡおよびＰＣＢ（第１のＰＣＡおよび第１のＰＣＢ）を含み、実施形態（ｉｉｉ）～（ｖ）では、第１のＰＣＡと同一である第２のＰＣＡおよび第１のＰＣＢと同一である第２のＰＣＢを含む。第１のＰＣＡ－ＰＣＢ対と第２のＰＣＡ－ＰＣＢ対とのホモ二量体化は、共有結合でまたは非共有結合で、例えば、ＰＣＡおよびＰＣＢの第１の対に含まれるホモ二量体化ドメインＨＤＣの、ＰＣＡおよびＰＣＢの第２の対に含まれるホモ二量体化ドメインＨＤＣへの非共有結合によって、媒介されている。

ダイアボディスプリットＣＨ２四価二重特異性抗体フォーマット（変異体８）は、ダイアボディフォーマット（変異体１）のための上記のような２つの同一のＰＣＡおよび２つの同一のＰＣＢを含み、該２つのＰＣＡまたは該２つのＰＣＢ、一部の実施形態では該２つのＰＣＢは、該２つのＰＣＡまたはＰＣＢの、一部の実施形態では該２つのＰＣＢのホモ二量体化を媒介しているホモ二量体化ドメインＨＤＣを、さらに含む。

ＤＶＤスプリットＣＨ２四価二重特異性抗体フォーマット（変異体９）は、ＤＶＤ－ＦａｂスプリットＣＨ２フォーマット（変異体２）のための上記のような２つの同一のＰＣＡおよび２つの同一のＰＣＢを含み、該２つのＰＣＡまたは該２つのＰＣＢ、一部の実施形態では該２つのＰＣＢは、該２つのＰＣＡまたはＰＣＢの、一部の実施形態では該２つのＰＣＢのホモ二量体化を媒介しているホモ二量体化ドメインＨＤＣを、さらに含む。

ＣＯＤＶスプリットＣＨ２四価二重特異性抗体フォーマット（変異体１０）は、ＣＯＤＶ－ＦａｂスプリットＣＨ２フォーマット（変異体３）のための上記のような２つの同一のＰＣＡおよび２つの同一のＰＣＢを含み、該２つのＰＣＡまたは該２つのＰＣＢ、一部の実施形態では該２つのＰＣＢは、該２つのＰＣＡまたはＰＣＢの、一部の実施形態では該２つのＰＣＢのホモ二量体化を媒介しているホモ二量体化ドメインＨＤＣを、さらに含む。

追加のポリペプチドがＰＣＡおよびＰＣＢに従った構造を有する構成の別の例は、非対称性抗体フォーマットであり、第２のＰＣＡおよび第２のＰＣＢは、第１のＰＣＡおよび第１のＰＣＢと異なっている。

本明細書の関連では、抗体様構造は、抗体誘導体または抗体ミメティックであってもよい。追加のポリペプチドが抗体様構造を有する構成の例は、本明細書に記載の非対称性スプリットＣＨ２二価二重特異性抗体フォーマットである（変異体１１～１２、図５Ｄ～Ｅ）。これらのフォーマットは、上記のような実施形態（ｉ）によるＰＣＡおよびＰＣＢならびに互いに共有結合または非共有結合した抗体重鎖および抗体軽鎖を含む。ＰＣＡ／ＰＣＢと抗体重鎖との間の結合は、共有結合または非共有結合によって媒介されており、一実施形態では、ＰＣＡまたはＰＣＢに含まれる第１のＨＤＣが抗体重鎖に含まれる第２のＨＤＣに非共有結合することによって媒介されている。この構成では、第１および第２のＨＤＣは、一部の実施形態では重鎖の対形成問題を克服するヘテロ二量体化ドメインである。一実施形態では、第１のＨＤＣおよび第２のＨＤＣは、ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ ＣＨ３ドメインを含む。このフォーマットの一実施形態もまた、Ｆａｂ／ＦｖスプリットＣＨ２ ＩｇＧとして説明され、該ＩｇＧの一方のアームは、一価のＦａｂであり、もう一方のアームは、Ｖ２－Ｌ１－ＨＤＡからなるＰＣＡおよびＶ２－Ｌ２－ＨＤＢからなるＰＣＢを含む一価のＦｖスプリットＣＨ２である。

一実施形態では、タンパク質複合体は、一価かつ単一特異性、二価かつ単一もしくは二重特異性、三価かつ単一、二重、もしくは三重特異性、四価かつ単一、二重、三重、もしくは四重特異性、五価かつ単一、二重、三重、四重、もしくは五重特異性、または六価かつ単一、二重、三重、四重、五重、もしくは六重特異性である。

一実施形態では、タンパク質複合体は、四価かつ二重特異性である。

一実施形態では、タンパク質複合体は、二価かつ二重特異性である。

発明者らは、Ｉｇドメインの再会合を、二価二重特異性抗体の作製中に生じる軽鎖の対合問題に対処するために用いた。発明者らは、二価二重特異性抗体の一方のアームにおいて、上記のようなＨＤＡおよびＨＤＢが、それぞれ重鎖のＣＨ１ドメインおよび軽鎖のＣＬドメインの置き換えに使用できることを見出した。その結果、ＨＤＡおよびＨＤＢを含む軽鎖および重鎖は、ヘテロ二量体化して第１の抗体アームを形成することとなる。前記二価二重特異性抗体の第２のアームでは、非改変の軽鎖が、ＣＨ１ドメインとＣＬドメインの相互作用を介して非改変の重鎖とヘテロ二量体化することとなる。ＣＨ、ＣＬはいずれも、ＨＤＡまたはＨＤＢと二量体化することはない。したがって、両アームは、望ましくない軽鎖の対合なく会合する。最終的に、第１のアームと第２のアームのヘテロ二量体化は、重鎖の対形成問題を克服する当技術分野で既知の技術の１つによって、制御することができる。

多重特異性抗体または誘導体は、複数の異なる抗原と結合することができ、二重特異性抗体または誘導体は、２つの異なる抗原と結合することができる。

本明細書に記載のすべての抗体または誘導体の一部の実施形態では、抗体または誘導体は、ＩＬ－４および／またはＩＬ－１３に結合することができる。一部の実施形態では、抗体または誘導体は、二重特異性であり、ＩＬ－４およびＩＬ－１３に結合することができる。

本発明の対称性多重特異性抗体の例は、ダイアボディタイプの四価二重特異性抗体（図５Ａ）、ＤＶＤ構成四価二重特異性抗体（図５Ｂ）、またはＣＯＤＶ構成四価二重特異性抗体（図５Ｃ）である。

本発明の非対称性多重特異性抗体の一例は、二価二重特異性抗体（図５ＤおよびＥ）、またはダイアボディ、ＤＶＤ－ＦａｂスプリットＣＨ２、ＣＯＤＶ－ＦａｂスプリットＣＨ２、もしくは「ｓｐｌｉｔｅ」ダイアボディ（図２Ａ～Ｄ）である。

ある特定の実施形態では、抗体またはそれらの誘導体は、Ｆｃエフェクター機能が低減しているかまたはＦｃエフェクター機能を有していなくてもよい。Ｆｃエフェクター機能とは、補体タンパク質Ｃ１ｑとの相互作用および／またはＦｃ受容体への結合である。エフェクター機能の低減または欠失は、例えばＣＨ２Ａおよび／またはＣＨ２Ｂドメインにおける二重変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ（いわゆる「ＬＡＬＡ変異」）によって得られる。それぞれのＮ－βおよびＣ－βがＣＨ２ドメインのアミノ酸配列を含んでいれば、対応する変異をＨＤＡおよびＨＤＢに導入することもできる。

以下の本発明の第２、第３、第４、および第５の態様に関して使用したすべての用語は、特段の定義がないかぎり、本発明の第１の態様に関して定義された通りの意味を有する。さらに、第２、第３、第４、および第５の態様に適用可能である、第１の態様のために明記された実施形態もすべて、これらの態様のために想定されるものである。

第２の態様では、本発明は、本発明の第１の態様によるタンパク質複合体の少なくとも２つのポリペプチドをコードする、１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドに関する。第２の態様による１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドはまた、第１の態様によるタンパク質複合体に含まれている１つまたはそれ以上の追加のポリペプチドをコードしていてもよい。一実施形態では、１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドは、抗体または抗体様構造をコードする。このことは、上記のすべての実施形態に、例えば、本明細書に記載の抗体または抗体誘導体構成のいずれにも関することである。一実施形態では、１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドが単離される。

第３の態様では、本発明は、本発明の第２の態様による１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドを含む、１つまたはそれ以上の発現ベクターに関する。本明細書で使用される「ベクター」という用語は、コード化情報を宿主細胞に移入するために使用されるあらゆる分子（例えば、核酸、プラスミド、またはウイルス）を指す。「ベクター」という用語は、自身に融合された別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を含んでいる。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、これは、付加するＤＮＡセグメントを挿入することができる環状二本鎖ＤＮＡ分子を指す。別のタイプのベクターは、付加するＤＮＡセグメントをウイルスゲノムに挿入することができる、ウイルスベクターである。ある特定のベクターは、導入された宿主細胞において自律複製することができる（例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。その他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入させると宿主細胞のゲノムに組み込まれ、これにより、宿主ゲノムと同調して複製する。また、ある特定のベクターは、ベクターが含む遺伝子の発現を指示することができる。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ぶ。

第４の態様では、本発明は、本発明の第２の態様による１つまたはそれ以上のポリヌクレオチド、または本発明の第３の態様による１つまたはそれ以上の発現ベクターを含む、細胞に関する。細菌細胞（例えば、大腸菌）、酵母細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞（例えば、マウス細胞、ラット細胞、ヒト細胞など）などの、原核および真核細胞の使用を含む幅広い種類の細胞発現系が、前記ポリヌクレオチドを発現させるために使用することができる。この目的のために、本発明のポリヌクレオチドを、細胞中で発現させ、一実施形態では、細胞が培養されている培地中に分泌させ、該培地から発現産物を回収することができるように、細胞は、前記ポリヌクレオチドまたは発現ベクターで形質転換またはトランスフェストされる。

第５の態様では、本発明は、薬学的に許容される担体と、本発明の第１の態様によるタンパク質複合体、本発明の第２の態様による１つまたはそれ以上のポリヌクレオチド、または本発明の第３の態様による１つまたはそれ以上の発現ベクターとを含む薬学的組成物に関する。一実施形態では、タンパク質複合体は、病原体、罹患細胞、細胞受容体、または細胞シグナル伝達分子に特異的に結合する抗体または抗体様分子である。本発明の医薬組成物は、非経口送達のために選択される。別法として、該組成物は、吸入のためにまたは経口などの消化管を通す送達のために選択される。そのような薬学的に許容される組成物の調製は、当技術分野の技術の範囲に含まれる。

本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」または「生理学的に許容される担体」という用語は、抗体または抗体様分子の送達を成し遂げるかまたは増強するために好適である１つまたはそれ以上の配合物を指す。医薬組成物中の主要な担体は、本質的に水性、非水性のどちらであってもよい。例えば、注射に好適な溶媒または担体は、水、生理的食塩水、または人工脳脊髄液であってもよく、非経口投与には、組成物に一般的なその他の物質がおそらく補足されている。中性緩衝生理食塩水または血清アルブミンを混合した生理食塩水は、さらなる例示的溶媒である。その他の例示的医薬組成物は、約ｐＨ７．０～８．５のＴｒｉｓ緩衝液または約ｐＨ４．０～５．５の酢酸緩衝液を含み、ソルビトールまたは好適な代替物をさらに含んでいてもよい。本発明の一実施形態では、抗体または抗体様分子組成物は、凍結乾燥したケークまたは水溶液の形態で、所望の純度を有する選択された組成物を任意選択の配合剤と混合することによって保存用に調製することができる。さらに、抗体または抗体様分子は、ショ糖などの適切な賦形剤を使用して、凍結乾燥物として製剤化することができる。

医薬組成物は、例えば、該組成物のｐＨ、モル浸透圧濃度、粘度、透明度、着色、等張性、臭い、無菌性、安定性、溶解もしくは放出速度、吸着性、または浸透度を、改変、維持、または保存するための配合材料を含むことができる。好適な配合材料としては、アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジンなど）、抗生物質、抗酸化物質（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、または亜硫酸水素ナトリウムなど）、緩衝液（例えば、ホウ酸、炭酸水素、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、クエン酸、リン酸、またはその他の有機酸など）、充填剤（例えば、マンニトールまたはグリシンなど）、キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）、錯化剤（例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ－シクロデキストリン、またはヒドロキシプロピルベータ－シクロデキストリンなど）、増量剤、単糖、二糖、およびその他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、またはデキストリンなど）、タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどの）、着色料、香味料、および希釈剤、乳化剤、親水性高分子（例えば、ポリビニルピロリドンなど）、低分子量ポリペプチド、造塩対イオン（例えばナトリウムなど）、防腐剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、または過酸化水素など）、溶媒（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコールなど）、糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトールなど）、懸濁化剤、界面活性剤、もしくは湿潤剤（例えば、プルロニック；ＰＥＧ；ソルビタンエステル；ポリソルベート２０もしくはポリソルベート８０などのポリソルベート；トリトン；トロメタミン；レシチン；コレステロール、またはチロキサポールなど）、安定性増強剤（例えば、ショ糖またはソルビトールなど）、張性増強剤（ハロゲン化アルカリ金属など、例えば塩化ナトリウムまたは塩化カリウム－マンニトールもしくはソルビトール）、送達担体、希釈剤、賦形剤、および／または医薬補助剤が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（第１８版、Ａ．Ｒ． Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ １９９０年）およびその続版を参照されたい）。

本明細書で使用される「特異的に結合する」という用語は、インビトロでの、または例えばヒトの体など生物におけるインビボでの、標的分子の存在に限定的な結合反応を指す。そのように、特異化されたリガンドは、その特定の標的分子に結合し、存在するその他の分子には大部分は結合しない。一般的に、標的分子に「特異的に結合する」抗体またはそれらの誘導体は、該標的分子に対して約１０５モル／リットルを超える平衡親和性定数（例えば、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、および１０１２以上）を有する。

「病原体」という用語は、対象において疾患をもたらしうるあらゆる生物を指す。病原体には、これらだけに限定されないが、細菌、原生動物、真菌、線虫、ウイロイド、およびウイルス、またはそれらの任意の組合せが含まれ、各病原体は、単独で、または別の病原体と共同で、これだけに限定されないがヒトを含む、これだけに限定されないが哺乳動物を含む、脊椎動物において疾患を誘発することができる。本明細書で使用される場合、「病原体」という用語はまた、非免疫低下宿主では通常は病原性ではないが免疫低下宿主では病原性でありうる微生物も包含する。

罹患細胞は、腫瘍細胞、慢性的な感染細胞、老化細胞、炎症性表現型を示している細胞、アミロイドタンパク質蓄積細胞、またはミスフォールドタンパク質蓄積細胞であってもよい。

腫瘍細胞の場合、基礎疾患は、腫瘍であり、例えば、ホジキンリンパ腫などのＩＬ４／ＩＬ１３シグナル伝達と関連した腫瘍である。

老化細胞の場合、基礎疾患は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）および慢性閉塞性肺疾患などの、老化関連疾患である。

炎症性表現型を示している細胞の場合、基礎疾患は、アレルギー、アレルギー性鼻炎、喘息、アトピー性皮膚炎、クローン病（ＣＤ）、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）などの（自己）炎症性疾患である。

「細胞受容体」という用語は、何らかの特定の受容体に限定されない。例えば、細胞受容体とは、Ｇタンパク質共役型受容体、イオンチャネル、または膜通過トランスポーターであってもよい。具体的な例としては、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ１６、およびＮＫｐ４６である。

細胞シグナル伝達分子は、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、もしくは腫瘍壊死因子などのサイトカイン、またはホルモンもしくは増殖因子、または細胞内シグナル伝達カスケードの分子であってもよい。

第５の態様の一実施形態では、抗体または抗体様分子は多重特異性であり、一実施形態では二重特異性であり、エフェクター分子に、例えば、細胞傷害性物質または受容体リガンドに、さらに結合する。

例示的フォーマット
一部の例示的な本発明による抗体またはそれらの誘導体は、以下のようなアミノ酸配列によって表される：
変異体１の例：
－ 残基１～１１１が軽鎖可変ドメインＶ１（ＶＬ１）であり、残基１２０～２４２が重鎖可変ドメインＶ２（ＶＨ２）である、配列番号１１によるＰＣＡ、
－ 残基１～１０７が軽鎖可変ドメインＶ２（ＶＬ２）であり、残基１１６～２３３が重鎖可変ドメインＶ１（ＶＨ１）である、配列番号１２によるＰＣＢ
を有するダイアボディスプリットＣＨ２（図２Ａ、図７、表７）。
変異体２の例：
－ 残基１～１１１が軽鎖可変ドメインＶ１（ＶＬ１）であり、残基１２２～２２８が軽鎖可変ドメインＶ２（ＶＬ２）である、配列番号１３によるＰＣＡ、
－ 残基１～１１８が重鎖可変ドメインＶ１（ＶＨ１）であり、残基１２０－２５１が重鎖可変ドメインＶ２（ＶＨ２）である、配列番号１４によるＰＣＢ
を有するＤＶＤ－ＦａｂスプリットＣＨ２（図２Ｂ、図８、表８、９）。
変異体３の例：
－ 残基１～１１１が軽鎖可変ドメインＶ１（ＶＬ１）であり、残基１２０～２２６が軽鎖可変ドメインＶ２（ＶＬ２）である、配列番号１５によるＰＣＡ、
－ 残基１～１３３が重鎖可変ドメインＶ２（ＶＨ２）であり、残基１３５～２４２が重鎖可変ドメインＶ１（ＶＨ１）である、配列番号１６によるＰＣＢ
を有するＣＯＤＶ－ＦａｂスプリットＣＨ２（図２Ｃ、図９、表１０）。
ＣＯＤＶフォーマットでは、ＰＣＡおよびＰＣＢの各々は、２つの可変ドメインＶ１およびＶ２、定常ドメイン（ＣＬまたはＣＨ１）、ならびにヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤＡまたはＨＤＢ）を含む。Ｎ末端からＣ末端への可変ドメインの順序は、一方のポリペプチド鎖ではＶ１からＶ２であり、もう一方のポリペプチド鎖ではＶ２からＶ１である。
変異体４の例：
－ 残基１～１１１が軽鎖可変ドメインＶ１（ＶＬ１）であり、残基１７８～２８４が軽鎖可変ドメインＶ２（ＶＬ２）である、配列番号１７によるＰＣＡ、
－ 残基１～１３３が重鎖可変ドメインＶ１（ＶＨ１）であり、残基１９３～３１５が重鎖可変ドメインＶ２（ＶＨ２）である、配列番号１８によるＰＣＢ
を有するｓｐｌｉｔｅダイアボディ（図２Ｄ、図１０、図１９、表１１）。
変異体５の例：
－ 残基１～１１１が軽鎖可変ドメインＶ１（ＶＬ１）であり、残基１７３～２８９が軽鎖可変ドメインＶ２（ＶＬ２）である、配列番号１９によるＰＣＡ、
－ 残基１～１３３が重鎖可変ドメインＶ１（ＶＨ１）であり、残基１８１～３０３が重鎖可変ドメインＶ１（ＶＨ１）である、配列番号２０によるＰＣＢ
を有するｓｐｌｉｔｅダイアボディ（図２Ｄ、図１１、表１２）。
変異体６の例：
－ 残基１～１１１が軽鎖可変ドメインＶ１（ＶＨ１）であり、残基１７８～２８４が軽鎖可変ドメインＶ２（ＶＬ２）である、配列番号１７によるＰＣＡ、
－ 残基１～１３３が重鎖可変ドメインＶ１（ＶＨ１）であり、残基１８１～３０３が重鎖可変ドメインＶ１（ＶＨ１）である、配列番号２０によるＰＣＢ
を有するｓｐｌｉｔｅダイアボディ（図２Ｄ、図１２、表１３）。
変異体７の例：
－ 残基１～１１１が軽鎖可変ドメインＶ１（ＶＬ１）であり、残基１７３～２８９が軽鎖可変ドメインＶ２（ＶＬ２）である、配列番号１９によるＰＣＡ、
－ 残基１～１３３が重鎖可変ドメインＶ１（ＶＨ１）であり、残基１９３～３１５が重鎖可変ドメインＶ１（ＶＨ１）である、配列番号１８によるＰＣＢ
を有するｓｐｌｉｔｅダイアボディ（図２Ｄ、図１３、表１４）。
変異体８の例：
－ 残基１～１１１が軽鎖可変ドメインＶ１（ＶＬ１）であり、残基１２０～２４２が重鎖可変ドメインＶ１（ＶＨ１）である、配列番号１１による２つのＰＣＡ、
－ 残基１～１０７が軽鎖可変ドメインＶ２（ＶＬ２）であり、残基１１６～２３３が重鎖可変ドメインＶ１（ＶＨ１）である、配列番号２１による２つのＰＣＢ
を有するダイアボディスプリットＣＨ２四価二重特異性抗体（図５Ａ、図１４、表１５）。
変異体９の例：
－ 残基１～１１１が軽鎖可変ドメインＶ１（ＶＬ１）であり、残基１２２～２２８が軽鎖可変ドメインＶ２（ＶＬ２）である、配列番号１３による２つのＰＣＡ、
－ 残基１～１１８が重鎖可変ドメインＶ１（ＶＨ１）であり、残基１２０～２５１が重鎖可変ドメインＶ１（ＶＨ１）である、配列番号２２による２つのＰＣＢ
を有するＤＶＤスプリットＣＨ２四価二重特異性抗体（図５Ｂ、図１５、表１６）。
変異体１０の例：
－ 残基１～１１１が軽鎖可変ドメインＶ１（ＶＬ１）であり、残基１２０～２２６が軽鎖可変ドメインＶ２（ＶＬ２）である、配列番号１５による２つのＰＣＡ、
－ 残基１～１３３が重鎖可変ドメインＶ１（ＶＨ１）であり、残基１３５～２４２が重鎖可変ドメインＶ１（ＶＨ１）である、配列番号２３による２つのＰＣＢ
を有するＣＯＤＶスプリットＣＨ２四価二重特異性抗体（図５Ｃ、図１６、表１７）。
変異体１１の例：
－ 残基１～１０７が軽鎖可変ドメインＶ２（ＶＬ２）である、配列番号２５によるＰＣＡ、
－ 残基１～１３３が重鎖可変ドメインＶ１（ＶＨ１）である、配列番号２６によるＰＣＢ、
－ 残基１～１１１が軽鎖可変ドメインＶ１（ＶＬ１）である、配列番号２７による軽鎖、
－ 残基１～１１８が重鎖可変ドメインＶ１（ＶＨ１）である、配列番号２４による重鎖
を有するスプリットＣＨ２二価二重特異性抗体（図５Ｄ、図１７、表１８）。
変異体１２の例：
－ 残基１～１３３が重鎖可変ドメインＶ１（ＶＨ１）である、配列番号２９によるＰＣＡ、
－ 残基１～１０７が軽鎖可変ドメインＶ２（ＶＬ２）である、配列番号２８によるＰＣＢ、
－ 残基１～１１１が軽鎖可変ドメインＶ１（ＶＬ１）である、配列番号２７による軽鎖、
－ 残基１～１１８が重鎖可変ドメインＶ１（ＶＨ１）である、配列番号２４による重鎖
を有するスプリットＣＨ２二価二重特異性抗体（図５Ｅ、図１８、表１９＋２０）。
変異体１３の例：
－ 残基１～１１１が軽鎖可変ドメインＶ１（ＶＬ１）であり、残基１２０～２４２が重鎖可変ドメインＶ１（ＶＨ１）である、配列番号４１によるＰＣＡ、
－ 残基１～１０７が軽鎖可変ドメインＶ２（ＶＬ２）であり、残基１１６～２３３が重鎖可変ドメインＶ１（ＶＨ１）である、配列番号４２によるＰＣＢ
を有するダイアボディスプリットＩｇＡ ＣＨ２（図２１）。
変異体１４の例：
－ 残基１～１１１が軽鎖可変ドメインＶ１（ＶＬ１）であり、残基１２０～２４２が重鎖可変ドメインＶ１（ＶＨ１）である、配列番号４３によるＰＣＡ、
－ 残基１～１０７が軽鎖可変ドメインＶ２（ＶＬ２）であり、残基１１６～２３３が重鎖可変ドメインＶ１（ＶＨ１）である、配列番号４４によるＰＣＢ
を有するダイアボディスプリットＩｇＤ ＣＨ２（図２２）。
変異体１５の例：
－ 残基１～１１１が軽鎖可変ドメインＶ１（ＶＬ１）であり、残基１２０～２４２が重鎖可変ドメインＶ１（ＶＨ１）である、配列番号４５によるＰＣＡ、
－ 残基１～１０７が軽鎖可変ドメインＶ２（ＶＬ２）であり、残基１１６～２３３が重鎖可変ドメインＶ１（ＶＨ１）である、配列番号４６によるＰＣＢ
を有するダイアボディスプリットＩｇＥ ＣＨ３。
変異体１６の例：
－ 残基１～１１１が軽鎖可変ドメインＶ１（ＶＬ１）であり、残基１２０～２４２が重鎖可変ドメインＶ１（ＶＨ１）である、配列番号４７によるＰＣＡ、
－ 残基１～１０７が軽鎖可変ドメインＶ２（ＶＬ２）であり、残基１１６～２３３が重鎖可変ドメインＶ１（ＶＨ１）である、配列番号４８によるＰＣＢ
を有するダイアボディスプリットＩｇＥ ＣＨ２。

上記で明記した例示的フォーマット１～１６では、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの各対（ＶＬ１／ＶＨ１、ＶＬ２／ＶＨ２）を、例示の対とは異なる特異性を有する可変ドメインの対によって置き換えてもよい。

上記で明記した例示的フォーマット１～１６では、６個のＣ末端ヒスチジン残基（Ｈｉｓ－タグ）は、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、および配列番号４８に存在していなくてもよい。

Ｉｇドメインが２つの部分に分割することによって、新たなＣ末端がＮ末端部分に生成され、新たなＮ末端がＣ末端部分に生成される。元々のＮ末端およびＣ末端ならびに新たに生成されたＮ末端およびＣ末端は、いずれも、異なるタンパク質ドメインをＦａｂ、Ｆｖ、またはＦｃなどのＩｇドメインのＮ末端およびＣ末端部に連結するために使用することができる。これによって、多重特異性抗体またはそれらの誘導体の生成が可能となる。例えば、四価抗体は、４つの末端すべてに、各々異なる特異性を有する４種の単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を融合することによって生成することができる。

利用可能な構造的データに基づくと、基本構成要素としてスプリットＩｇドメイン、特にＣＨ２ドメインの使用によって、異なる融合パートナーの新規の空間配置が可能になると論じることは理にかなっている。例えば多価ナノボディで使用されているような異なるドメインまたは基本構成要素の連続的な連結とは対照的に、異なるドメインまたは基本構成要素は、スプリットＣＨ２ドメインに連結させる場合、交差した向きにある。これは、例えば、１つの標的上の様々なエピトープを同時にブロックキングするという新たな状況を提供する可能性がある。

一部の実施形態では、ヘテロ二量体化ドメインＨＤＡおよびＨＤＢは、全くアミノ酸改変をしていないＩｇドメインのＮ末端部およびＣ末端部からなる。これらの場合、新たなアミノ酸配列は導入されておらず、したがって、例えばＨＤＡおよびＨＤＢを含む抗体誘導体に対する免疫応答のリスクを最小化する。

Ｎ－βおよびＣ－βが、ＣＨ２ドメイン、例えば同じＣＨ２ドメインから選択される場合、ＨＤＡおよびＨＤＢのヘテロ二量体化によって完全なＣＨ２ドメインの形成がもたらされ、これは、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）、新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）、および補体成分１ｑ（Ｃ１ｑ）への結合を媒介することができる。このことは、タンパク質複合体が、本明細書に記載したようなｓｐｌｉｔｅダイアボディ（変異体４～７）またはダイアボディスプリットＣＨ２（変異体１）などの、それ以外に定常ドメインをいっさい含まない多重特異性抗体、特に二重特異性抗体である場合、特に有利である。ＣＨ２ドメインのＦｃＲｎへの結合は、血漿内半減期の延長につながるため、医学的適用に重要である。ＣＨ２ドメインの、ＦｃγＲおよびＣ１ｑへの結合は、それぞれ、抗体依存性細胞媒介細胞障害（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の誘起に重要である。

例えば（一方のＦａｂアームについて、重鎖由来のＣ１ドメインを軽鎖由来のＣＬドメインと入れ替えている）ＣｒｏｓｓＭａｂフォーマットのような、２つの完全なＩｇドメインを使用する場合と比較して、ヘテロ二量体化ドメインＨＤＡおよびＨＤＢのさらなる利点は、小さなサイズ／低分子量であることである。腫瘍学的適用では、このことは、腫瘍浸透度を高めるという重要な利点を有する。

ＣＨ２ドメインを二分割するための構造的基盤を示す図である。（Ａ）全長ヒト抗体（ｐｄｂエントリ３Ｓ７Ｇ）の構造模式図。１つのＣＨ２ドメインを、黒色で強調表示している。グリカンは、球として示す。このＣＨ２ドメインは直接的なタンパク質－タンパク質接触を有さないことに留意されたい。（Ｂ）ＣＨ２ドメインの構造。分割部位は、２つのβシートを連結しているループ内に位置する。Ｎ末端側半分は灰色で着色し、Ｃ末端部は黒色で着色している。ジスルフィド結合が、この２つのβシートの間で形成されており、スプリットＣＨ２ドメイン構造のＮ末端とＣ末端とを共有結合させている。模式図は、ｐｙｍｏｌ（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｐｙｍｏｌ／）で作成した。 スプリットＣＨ２ドメインを組み込んだＦｖのみのフォーマットおよびＦａｂ様フォーマットの構造を示す概略図である。ＣＨ２スプリットが分かれると、Ｃ末端に加えて、新たなＮ末端が生成される。様々なドメインのＮ末端を示す。精製目的で、Ｈｉｓ－タグをすべての構築物に付加している。（Ａ）ダイアボディフォーマットに付加されたスプリットＣＨ２ドメイン（ダイアボディスプリットＣＨ２）。（Ｂ）ＤＶＤ－ＦａｂスプリットＣＨ２。（Ｃ）ＣＯＤＶ－ＦａｂスプリットＣＨ２。（Ｄ）ダイアボディフォーマットに挿入されたスプリットＣＨ２ドメイン（「ｓｐｌｉｔｅ」ダイアボディ）。このフォーマットでは、新たに生成させたＮ末端とＣ末端とで異なるリンカー（それぞれＬ１およびＬ４）を使用した。本報告に記載している分子は、連続して番号付けしている。 非還元および還元条件下で分析した、タンパク質変異体（１）～（７）のＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す図である。すべてのタンパク質を、Ｈｉｓ－タグを介して精製した。還元条件下では、２つのタンパク質鎖が存在していることから、両方の鎖の連結がジスルフィド架橋を介して起こっていることは明らかである。正しく会合したタンパク質に相当するタンパク質バンドを、矢印で示している。 （１）～（７）およびＣＨ２－ドメイン（ｗｔ）の安定性測定を示す図である。すべてのタンパク質について、濃度は０．５ｍｇ／ｍＬに調整した。（Ａ）トリプトファン蛍光測定によって、タンパク質の融解をモニタリングすることが可能である。測定された蛍光比Ｆ３５０ｎｍ／Ｆ３３０ｎｍによって、タンパク質の融解曲線を表している。算出されたＴ_ｍ（表２）は、Ｆ３５０／Ｆ３３０曲線の一次導関数の最大値に一致している。（Ｂ）タンパク質の凝集挙動のモニタリングには、光散乱を使用した。算出されたＴ_ａｇｇ（表２）は、測定された散乱強度の一次導関数の最大値に一致している。ＣＨ２－ドメイン（ｗｔ）は、タンパク質がフォールディングしていないことにかかわらず、凝集を開始していないことに留意されたい。 スプリットＣＨ２ドメインを組み込んだ、様々な抗体様フォーマットの構造の概略図である。ＣＨ２スプリット上に、新たなＮ末端およびＣ末端を生成させている。変異体（７）～（９）は、四価二重特異性抗体変異体を生成しているＩｇＧ Ｆｃ－ドメインに融合されたＦｖのみのフォーマットおよびＦａｂ様フォーマット構築物（１）～（３）に基づいている。変異体（１１）および（１２）は、二価二重特異性抗体である。抗体の片側で、ＣＨ１およびＣＬドメインがスプリット－ＣＨ２ドメインによって置き換えられている。軽鎖を１つしか使用していないため、この構築物デザインによって、軽鎖の誤対合問題が回避される。重鎖のヘテロ二量体化は、ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ変異を適用することによって成されている。（Ａ）ダイアボディスプリットＣＨ２四価二重特異性抗体。（Ｂ）ＤＶＤスプリットＣＨ２四価二重特異性抗体。（Ｃ）ＣＯＤＶスプリットＣＨ２四価二重特異性抗体。（Ｄ、Ｅ）スプリットＣＨ２二価二重特異性抗体。 非還元および還元条件下で分析した、タンパク質変異体（８）～（１２）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ。タンパク質はすべて、プロテインＡマトリックス上のＦｃ－ドメインを介して精製した。変異体（８）～（１０）では２つのタンパク質鎖を必要とするのに対し、変異体（１１）および（１２）では４つのタンパク質鎖を必要とする。還元型のタンパク質バンドの染色強度から、タンパク質バンドが等モル量で存在することが概ね推定される。（１１）および（１２）では、２つの重鎖は概ね同じ分子量を有しており、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上では別々のバンドに分かれていないことに留意されたい。 タンパク質変異体（１）の質量分析を示す図である。（Ａ）脱グリコシル化、非還元条件。（Ｂ）脱グリコシル化、還元条件。 タンパク質変異体（２）の質量分析を示す図である。（Ａ）脱グリコシル化、非還元条件。（Ｂ）脱グリコシル化、還元条件。 タンパク質変異体（３）の質量分析を示す図である。（Ａ）脱グリコシル化、非還元条件。（Ｂ）脱グリコシル化、還元条件。 タンパク質変異体（４）の質量分析を示す図である。（Ａ）脱グリコシル化、非還元条件。（Ｂ）脱グリコシル化、還元条件。 タンパク質変異体（５）の質量分析を示す図である。（Ａ）脱グリコシル化、非還元条件。（Ｂ）脱グリコシル化、還元条件。 タンパク質変異体（６）の質量分析を示す図である。（Ａ）脱グリコシル化、非還元条件。（Ｂ）脱グリコシル化、還元条件。 タンパク質変異体（７）の質量分析を示す図である。（Ａ）脱グリコシル化、非還元条件。（Ｂ）脱グリコシル化、還元条件。 タンパク質変異体（８）の質量分析を示す図である。（Ａ）脱グリコシル化、非還元条件。（Ｂ）脱グリコシル化、還元条件。 タンパク質変異体（９）の質量分析を示す図である。（Ａ）脱グリコシル化、非還元条件。（Ｂ）脱グリコシル化、還元条件。 タンパク質変異体（１０）の質量分析を示す図である。（Ａ）脱グリコシル化、非還元条件。（Ｂ）脱グリコシル化、還元条件。 タンパク質変異体（１１）の質量分析を示す図である。（Ａ）脱グリコシル化、非還元条件。（Ｂ）脱グリコシル化、還元条件。 タンパク質変異体（１２）の質量分析を示す図である。（Ａ）脱グリコシル化、非還元条件。（Ｂ）脱グリコシル化、還元条件。 チップに固定化されたヒトＦｃＲｎに対する、タンパク質変異体（４）のＢｉａｃｏｒｅ測定を示す図である。 非還元および還元条件下で分析した、タンパク質変異体（１３）～（１６）のＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す図である。変異体（１３）～（１６）は各々、２つのタンパク質鎖を必要とする。４つの変異体すべてについて、Ｎ－グリコシル化が起こりうる部位を含むことに留意されたい（変異体（１３）：Ｎ末端スプリットＣＨ２ドメイン、１４４位；変異体（１４）：Ｃ末端スプリットＣＨ２ドメイン、２５５位；変異体（１５）：Ｎ末端およびＣ末端スプリットＣＨ３ドメイン、それぞれ２５２および２７５位；変異体（１６）：Ｎ末端スプリットＣＨ２ドメイン、１４６位）。これらの修飾が、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで、特にタンパク質変異体（１５）および（１６）について、一部のタンパク質バンドがぼやけて見えた原因となった可能性が考えられる。 タンパク質変異体（１３）の質量分析を示す図である。（Ａ）脱グリコシル化、非還元条件。（Ｂ）脱グリコシル化、還元条件。 タンパク質変異体（１４）の質量分析を示す図である。（Ａ）脱グリコシル化、非還元条件。（Ｂ）脱グリコシル化、還元条件。 タンパク質変異体（１３）～（１６）の安定性測定を示す図である。トリプトファン蛍光測定によって、タンパク質の融解をモニタリングすることが可能である。測定された蛍光比Ｆ３５０ｎｍ／Ｆ３３０ｎｍによって、タンパク質の融解曲線を表している。算出されたＴｍ（表２）は、Ｆ３５０／Ｆ３３０曲線の一次導関数の最大値に一致している。

材料および方法
タンパク質発現および精製
所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを合成し（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、Ｇｅｎｅａｒｔ）、ＣＭＶプロモーターおよび細胞培養培地へのタンパク質の分泌に必要なシグナル配列の下流で、発現ベクターにクローニングした。タンパク質の発現は、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の一過性トランスフェクションによって行った。細胞は、バッフルなし振盪フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で、１１０ｒｐｍ、３７℃、８％ＣＯ_２で培養した。トランスフェクションは、細胞密度が１．２×１０^６細胞／ｍＬに達した時点で行った。ＤＮＡは、オプチメンＩ－培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中でポリエチレンイミンと１：３の比で混合した。室温で２０分インキュベーションした後、このトランスフェクションミックスを、細胞培養物に加えた。細胞は、６ｍＭグルタミンを補足したＦｒｅｅＳｔｙｌｅ Ｆ１７培地中で、６日間さらに培養した。遠心分離（４℃、４．５００ｇで、３０分）によって、細胞を培養ブロスから取り除き、上清を０．２２μｍ滅菌ろ過によって清澄化した。タンパク質変異体（１）～（７）およびＣＨ２ドメインｗｔのみの構築物は、一連の６個のヒスチジン残基（Ｈｉｓ－タグ）を含む。タンパク質精製は、ＮＧＣ Ｄｉｓｃｏｖｅｒ １００ Ｐｒｏシステム（Ｂｉｏｒａｄ）上で、完全Ｈｉｓ－タグ精製カラム（Ｒｏｃｈｅ）を備えた固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によって行った。カラムは、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭヒスチジンで平衡化した。１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０溶液を、１Ｌ当たり５０ｍｌを加えることによって、ｐＨを８．０に調整した後、培養上清を投入した。さらに、１Ｌ当たり５ｍｌの２Ｍイミダゾール、ｐＨ７．５溶液を加えた。カラムを平衡化緩衝液で洗浄し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾールまでの勾配で、３５ＣＶでタンパク質を溶出した。画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析し、対応する画分をプールし、遠心分離（Ｖｉｖａｓｐｉｎ ２０）によって濃縮し、リン緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｐｇ １６／６０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ゲルろ過カラムに投入した。所望のタンパク質を含む画分をプールし、濃縮した（Ｖｉｖａｓｐｉｎ ２０）。タンパク質変異体（８）～（１２）は、Ｈｉｓ－タグは有さずＦｃ－ドメインを有する。これらの変異体の捕捉は、ＨｉＴｒａｐプロテインＡカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で行った。カラムはＰＢＳで平衡化した。清澄化した上清を投入した後、カラムをＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）および０．１Ｍクエン酸、ｐＨ６．０で洗浄した。タンパク質を、０．１Ｍクエン酸、ｐＨ３．０緩衝液で溶出した。溶出された画分を、１０％１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５を加えることによって中和した。ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｐｇ １６／６９（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ゲルろ過カラムを使用して、さらなる精製を行った。タンパク質濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＴ１０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、２８０ｎｍで吸収を測定することによって決定した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、ランニングバッファーとしてＭＥＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む４～１２％ ＢｉｓＴｒｉｓゲルを使用して行った。還元試料には、０．１Ｍ ＤＴＴをサンプルバッファー（ＬＤＳサンプルバッファー、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ）に加え、試料を９９℃で５分間インキュベートした。分離は、２００Ｖの定電圧で、４５分間行った。ＢｅｎｃｈＭａｒｋタンパク質ラダーをマーカーとして使用した（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。泳動後、ゲルをクマシーブルー（ＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅ、Ｅｘｐｅｄｅｏｎ）で染色した。

熱安定性分析
熱安定性分析は、ナノＤＳＦ技術を使用するＰｒｏｍｅｔｈｅｕｓ ＮＴ Ｆｌｅｘ装置（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて行った。この装置は、蛍光測定と同時に散乱情報を収集することを可能にするＡｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ Ｏｐｔｉｃｓを備えている。分析は、製造業者の使用説明書に従って、１℃／分の昇温率で２０℃から９５℃の範囲で行った。すべてのタンパク質試料はＰＢＳに溶解し、タンパク質濃度を０．５ｍｇ／ｍＬに調整した。測定は、二度繰り返して行った。データ分析は、ソフトウエアＰＲ ＴｈｅｒｍＣｏｎｔｒｏｌ Ｖ．２．１（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して行った。

ＭＳ分析
タンパク質整合性は、ＬＣ－ＭＳによって分析した。タンパク質試料は、ＰＮＧａｓｅＦ（グリセロールフリー、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を含むｄｄＨ２Ｏで０．５ｍｇ／ｍｌに希釈した１２．５μｇのタンパク質（１：５０ｖ／ｖ）を用いて、３７℃で１５時間、脱グリコシル化した。ＬＣ－ＭＳ分析は、デュアルＥＳＩインターフェースを備えたＡｇｉｌｅｎｔ ６５４０ Ｕｌｔｒａ Ｈｉｇｈ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ（ＵＨＤ） Ｑ－ＴＯＦおよびＡｇｉｌｅｎｔ １２９０／１２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＬＣ Ｓｙｓｔｅｍで行った。逆相（ＲＰ）クロマトグラフィーは、ガードカラムＰＬＲＰ－Ｓ ３００Ａ ５μｍ、３×５ｍＭ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を装着したＰＬＲＰ－Ｓ １０００Ａ ５μｍ、５０×２．１ｍｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を、２００μＬ／分および８０℃カラム温度で使用して行った。溶離液は、ＬＣ水および０．１％ギ酸を含むバッファーＡ、ならびに９０％アセトニトリル、１０％ＬＣ水、および０．１％ギ酸を含むバッファーＢとした。１μｇのタンパク質をカラムに注入し、０分から１７分までアセトニトリル濃度を上げていく直線勾配を使用して溶出した。データは、ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ Ｂｉｏｃｏｎｆｉｒｍ Ｂ．０６（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して分析した。分子質量は、ＧＰＭＡＷソフトウエア、バージョン１０．３２（Ｌｉｇｈｔｈｏｕｓｅ Ｄａｔａ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して、タンパク質のアミノ酸配列に基づいて算出した。

親和性決定
抗体構築物への抗原の結合を、ＨＢＳ－ＥＰバッファー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いるＢＩＡｃｏｒｅ ３０００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）での表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して測定した。抗原として、ヒトＩＬ４（ＩＬ００４、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）およびヒトＩＬ１３（ＩＬ０１２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用した。捕捉抗体（ヒト抗体捕捉キット、Ｈｉｓ捕捉キット、Ｆａｂ捕捉キット、ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）は、標準手順を使用して、第一級アミン基（１１０００ＲＵ）を介して、研究グレードのＣＭ５チップ（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上に固定した。リガンドは、１０μｌ／分の流速、および最大３０ＲＵのアナライト結合をもたらすよう調整したＲＵ値で捕捉した。抗原ヒトＩＬ４およびヒトＩＬ１３をアナライトとして使用し、３０μＬ／分の流速で、２４０秒間注入し、解離時間を３００秒とした。ＩＬ４およびＩＬ１３は、それぞれ、０．１ｎＭ～３ｎＭおよび０．８ｎＭ～２５ｎＭの希釈系列で使用した。捕捉キットを提供する再生バッファーを２分注入して、チップ表面を再生させた。センサーグラムは、ブランクのチップ表面およびＨＢＳ－ＥＰバッファーブランクをダブルレファレンスとした。組換えヒト新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）タンパク質を、標準手順を使用して、研究グレードのＣＭ５チップ（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）のサンプルフローセルコンパートメント内に、第一級アミン基（２００ＲＵ）を介して固定した。レファレンスフローセルコンパートメントは、ＦｃＲｎを固定せずに活性化および不活性化してブランクのチップ表面を生成した。分析には、ｐＨ６．０のアッセイバッファー（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．０５％界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ６．０）を使用した。抗体をアッセイバッファーで８００ｎＭに希釈して、アナライトとして使用し、レファレンスおよびサンプルフローセルに、３０μＬ／分の流速で、２４０秒間注入し、解離時間は３００秒とした。チップ表面を、ＨＢＳ－ＥＰバッファーを３０μｌ／分で２分注入して再生させた。センサーグラムは、ブランクのチップ表面およびＨＢＳ－ＥＰバッファーブランクをダブルレファレンスとした。すべてのデータ分析は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウエアｖ４．１を使用して行った。

結果
ＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインを、スプリットユビキチンシステムについて説明されている方法と同様の方法で概ね同じサイズの２つの部分に分割することを想定した。これは、完全なタンパク質の僅かな部分だけで十分に機能性を回復させるスプリットＧＦＰまたはβ－ガラクトシダーゼ手法とは対照的である。分割部位を推定するための構造的基盤を図１に示す。スプリットＣＨ２ドメインの再会合を評価するための最初の試みとして、発明者らは、ＣＨ１およびＣＬドメインを含むかまたは含まない２つの異なる可変ドメインを加えることで、様々なフォーマットを創出した（図２）。インターロイキンＩＬ４およびＩＬ１３に対するこの２つの異なる可変ドメインは、目下臨床開発中の二重特異性抗体のドメインであり、以前に詳述されている（Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚら；Ｍａｂｓ ２０１６年；８：８６７～８７８頁）。本報告で使用したようなスプリットＣＨ２ドメインのＮ末端部分の配列は、５２個のアミノ酸からなり（５．７ｋＤａ）、配列番号３０を特徴とする。本報告で使用したようなスプリットＣＨ２ドメインのＣ末端部分の配列は、５８個のアミノ酸からなり（６．７ｋＤａ）、配列番号３１を特徴とする。スプリットＣＨ２ドメインが再会合すると、２つの部分の間でジスルフィド結合が形成することが予想され、ゆえに、この２つのタンパク質鎖は共有結合で連結されるはずである。１つのタンパク質鎖だけが精製のためのタグに融合されているため、ヘテロ二量体分子だけが精製されるはずである。ジスルフィド結合によるこの２つの鎖の連結は、還元条件下で実行するＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して、非還元条件と比較して、容易にモニタリングすることができた（図３）。これらの結果から明らかなように、ＣＨ２ドメインは再構築され、２つの半分のスプリットＣＨ２を連結するジスルフィド結合が形成された。タンパク質試料が還元されると、２つのタンパク質鎖を連結しているジスルフィド結合だけが破壊される。このジスルフィド結合は、スプリットＣＨ２ドメイン部分の間で形成される。ＳＤＳ－ＰＡＧＥでは、観察された主なタンパク質バンドは、それらの予想されたサイズで移動していた。産生されたタンパク質が再会合したＣＨ２ドメインを含むかどうかをさらに評価するために、発明者らは、示差走査蛍光定量（ＤＳＦ）技術を使用して、タンパク質の安定性を分析した（図４、表２）。この技術は、タンパク質内のトリプトファン残基の固有の蛍光をモニタリングするものである。トリプトファン蛍光は、その近接の環境に対して高感度である。例えば変性中に、タンパク質のコンフォーメーションが変化すると、蛍光の発光極大は変わる。発明者らは、スプリットＣＨ２ドメインが再会合すれば、そのタンパク質の独特な融解温度（Ｔ_ｍ）が測定できると予想する。蛍光測定と並行して、タンパク質凝集（Ｔ_ａｇｇ）の開始の算出を可能にする光散乱データを記録した。得られたＴ_ｍおよびＴ_ａｇｇデータを、表２に示す。測定されたＴｍ値は、約６０℃または６０℃より若干高い範囲、および、ＣＨ２－ドメインｗｔ構築物のＴｍの範囲である。これらのデータは、スプリットＣＨ２ドメインが再会合していることを示唆している。タンパク質変異体（２）および（３）は、僅かに高いＴｍを有し、タンパク質変異体（２）は、約１２℃高いＴ_ａｇｇを有する。高いＴ_ｍおよびＴ_ａｇｇは、タンパク質をさらに安定化させるＣＬおよびＣＨ１ドメインの存在に起因すると考えられる。次に、発明者らは、スプリットＣＨ２ドメインだけを発現させ、再会合させたＣＨ２－ドメインを精製することが可能であるかどうかを評価した。しかしながら、スプリットＣＨ２ドメインの発現は全く検出できなかった。おそらく、スプリットＣＨ２ドメインの適切な発現および再構成には、フォールディングした融合パートナーが必要である。スプリットＣＨ２ドメインの発現は、ＦｖおよびＦａｂのみのフォーマットでは十分に作動していたため、発明者らは次に、これらの構築物をＩｇＧ様構造内に組み込んだ場合の発現を評価した（図５Ａ～Ｃ）。さらに、発明者らは、二重特異性ヘテロ二量体ＩｇＧ様フォーマットにおける軽鎖の対合問題に対処するために、スプリットＣＨ２－ドメインを使用した（図５Ｄ、Ｅ）。すべての変異体が発現でき、精製することができた（図６）。再会合したスプリットＣＨ２ドメインを含むすべてのタンパク質を、酸化条件および還元条件下で質量分析法によって分析した。予想された種および対応するタンパク質鎖の存在を実証することができた（図７～１８）。発明者らの焦点は、スプリットＣＨ２ドメインを、原則的にはより大きな分子に組み込み、そのような構造において再会合させることが可能であることを示すことであった。標的分子の正確な会合は、対応する抗原への結合特性を評価することによって実証した。これは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定値によって確認した（表３、表７～２０）。Ｆｖドメインより下の構造変化がＦｖドメイン内に微妙な変化をもたらし、その結果として、結合親和性の喪失が生じ得た可能性がある。しかしながら、レファレンス分子である二重特異性抗ＩＬ４－抗ＩＬ１３ ＣＯＤＶ－ＩｇＧ（変異体１３）と比較して、検出された種々の構築物間の結合親和性の差異は、極めて軽微なものに過ぎなかった（Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚら；Ｍａｂｓ ２０１６；８：８６７～８７頁）。さらに、再構成されたＣＨ２ドメインのヒトＦｃＲｎへの結合を、Ｂｉａｃｏｒｅ分析によって分析した。ＦｃＲｎをチップに固定し、変異体（４）をアナライトとして使用した。測定値は、変異体（４）のＦｃＲｎへの結合を示している（図１９）。

すべてのＩｇＧ１スプリットＣＨ２ドメインに基づく変異体（１）～（１２）とは対照的に、変異体（１３）～（１６）はその他の抗体クラスのＣＨドメインを含む。変異体（１３）～（１６）は、変異体（１）で使用したようなダイアボディスプリットＣＨ２フォーマットを有するが、ＩｇＧ１スプリットＣＨ２ドメインが、次のスプリットＣＨドメインに替わっている：変異体（１３）：スプリットＩｇＡ ＣＨ２；変異体（１４）：スプリットＩｇＤ ＣＨ２；変異体（１５）：スプリットＩｇＥ ＣＨ３；および変異体（１６）：スプリットＩｇＥ ＣＨ２。表４は、変異体の配列を示す。

実験手順は、上記で変異体（１）～（１２）について記載したように実施した。

変異体（１３）～（１６）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析（図２０）は、すべてのタンパク質が産生され、会合可能であることを実証している。熱安定性測定値は、すべての事例で独特な融点を示している（図２３、表２）。得られた融解温度は野生型ＣＨ２ドメインに匹敵しており、これは、タンパク質が正しくフォールディングしていることを意味している。変異体（１３）および（１４）もまた、質量分析法によって分析した（図２１および２２、表５および６）。まとめると、変異体（１３）～（１６）の結果は、二分割および再会合は、ＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインに限定されないことを実証している。

分子量は、ＧＰＭＡＷ（バージョン１０．３２；Ｌｉｇｈｔｈｏｕｓｅ Ｄａｔａ、Ｄｅｎｍａｒｋ）によって算出した（平均質量値、すべてのシステインがジスルフィド架橋を形成していると仮定する）。

分子量は、ＧＰＭＡＷ（バージョン１０．３２；Ｌｉｇｈｔｈｏｕｓｅ Ｄａｔａ、Ｄｅｎｍａｒｋ）によって算出した（平均質量値、すべてのシステインが還元されている（ＳＨ）と仮定する）

Ｂｉａｃｏｒｅ測定値

Claims (15)

1. 少なくとも２つのポリペプチド鎖Ａ（ＰＣＡ）およびＢ（ＰＣＢ）を含むタンパク質複合体であって、該ＰＣＡはヘテロ二量体化ドメインＡ（ＨＤＡ）を含み、該ＰＣＢはヘテロ二量体化ドメインＢ（ＨＤＢ）を含み、ＨＤＡとＨＤＢとは互いに結合し、該ヘテロ二量体化ドメインの一方は免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインの２つのＮ末端βストランド（Ｎ－β）を含むかまたはそれらからなり、該ヘテロ二量体化ドメインのもう一方はＩｇドメインの２つのＣ末端βストランド（Ｃ－β）を含むかまたはそれらからなる、前記タンパク質複合体。
2. ａ．Ｎ－βは、少なくともβストランドｂおよびｃを含むＩｇドメインの連続したアミノ酸配列を含み、
   ｂ．Ｃ－βは、少なくともβストランドｅおよびｆを含むＩｇドメインの連続したアミノ酸配列を含む、
   請求項１に記載のタンパク質複合体。
3. Ｎ－βおよびＣ－βのＩｇドメインは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）、およびＩｇＭまたはＩｇＥ重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）から独立して選択され、場合により、同じＣＨ２またはＣＨ３から選択される、請求項１または２に記載のタンパク質複合体。
4. ＨＤＡおよびＨＤＢは、互いに（ｉ）非共有結合するか、または（ｉｉ）非共有結合かつ共有結合する、請求項１～３のいずれか１項に記載のタンパク質複合体。
5. Ｎ－βは、βストランドａ～βストランドｃを含むかまたはそれらからなるＣＨ２またはＣＨ３ドメインの連続したアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなり、Ｃ－βは、βストランドｅ～βストランドｇを含むかまたはそれらからなるＣＨ２またはＣＨ３ドメインの連続したアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる、請求項３または４に記載のタンパク質複合体。
6. Ｎ－βおよびＣ－βは各々、天然には存在しないＣｙｓ残基を含み、該Ｃｙｓ残基は、フォールディングしたＮ－βおよびＣ－βそれぞれにおいて、天然では３から７．５Åの間Ｃα原子間距離を有するアミノ酸に取って代わっている、請求項１～５のいずれか１項に記載のタンパク質複合体。
7. ＨＡＤは、
   ＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＸ_１ＥＤＰＥＶＸ_２ＦＸ_３ＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮ
   （配列番号１）
   （配列中、Ｘ_１はＨまたはＱであり、Ｘ_２はＫまたはＱであり、Ｘ_３はＮまたはＫである）；または配列番号１に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む配列番号１の変異体を含むかまたはそれからなり；
   かつ／またはＨＤＢは、
   ＮＳＴＸ_４ＲＶＶＳＶＬＴＶＸ_５ＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＸ_６ＬＰＸ_７Ｘ_８ＩＥＫＴＩ
   （配列番号２）
   （配列中、Ｘ_４はＹまたはＦであり；Ｘ_５はＬまたはＶであり；Ｘ_６はＡまたはＧであり；Ｘ_７はＫまたはＱであり；Ｘ_８はＮまたはＫである）；または配列番号２に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む配列番号２の変異体を含むかまたはそれからなり：配列番号１またはその変異体は、配列番号２またはその変異体とヘテロ二量体化することができる、請求項１～６のいずれか１項に記載のタンパク質複合体。
8. ＰＣＡおよび／またはＰＣＢ内に１つまたはそれ以上の抗原結合部位を含む複合体であって、該１つまたはそれ以上の抗原結合部位はそれぞれ、２つのドメインの対によって形成されており、一方は該ＰＣＡ中に含まれ、もう一方は該ＰＣＢ中に含まれており、該抗原結合部位はＨＤＡまたはＨＤＢのＮ末端および／もしくはＣ末端に位置する、請求項１～７のいずれか１項に記載のタンパク質複合体。
9. ＰＣＡおよび／またはＰＣＢは、１つまたはそれ以上のさらなるホモおよび／またはヘテロ二量体化ドメインＣ（ＨＤＣ）を含み、該ホモ二量体化ドメインは、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２－ＣＨ３ドメイン、または、ホモ二量体化がＩｇ様フォールド、ロスマンもしくはロスマン様アルファ－ベータ－アルファサンドイッチフォールド、アルファサンドイッチフォールド、連続ベータシートフォールド、ベータサンドイッチフォールド、混合ベータシートフォールド、２－ヘリックス配向、逆平行アルファヘリックス配向、平行アルファヘリックス配向、４－ヘリックスバンドルモチーフ、ロイシンジッパー、およびコイルドコイルドメインによって媒介されるドメインからなる群から選択され、該ヘテロ二量体化ドメインは、ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ ＣＨ３ドメイン、ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ ＣＨ２－ＣＨ３ドメイン、ヘテロ二量体化を起こすように導入された変異（例えば、荷電変異）を有するＦｃ－ドメイン、相互交換されたドメイン（例えば、Ｆｃ－ドメイン／カッパヘテロ二量体化ドメイン、ＣＬおよびＣＨドメインなどの）の一対のうちのドメイン、ヘテロ二量体化を起こすように導入された変異を有するＩｇ様フォールド、または、ロスマンもしくはロスマン様アルファ－ベータ－アルファサンドイッチフォールド、アルファサンドイッチフォールド、連続ベータシートフォールド、ベータサンドイッチフォールド、混合ベータシートフォールド、２－ヘリックス配向、逆平行アルファヘリックス配向、平行アルファヘリックス配向、４－ヘリックスバンドルモチーフ、ロイシンジッパー、およびコイルドコイルドメインを含むヘテロ二量体化を媒介するドメインからなる群から選択され；該抗原結合部位は、ＨＤＣのＮ末端および／またはＣ末端に位置する、請求項１～８のいずれか１項に記載のタンパク質複合体。
10. ＰＣＡおよびＰＣＢは、Ｎ末端からＣ末端へ、以下の要素：
    （ｉ）ＰＣＡ：Ｖ２－Ｌ１－ＨＤＡ、およびＰＣＢ：Ｖ２－Ｌ２－ＨＤＢ；
    （ｉｉ）ＰＣＡ：Ｖ１－Ｌ３－ＨＤＡ－Ｌ４－Ｖ２、およびＰＣＢ：Ｖ１－Ｌ１－ＨＤＢ－Ｌ２－Ｖ２；
    （ｉｉｉ）ＰＣＡ：Ｖ１－Ｌ１－Ｖ２－Ｌ２－ＨＤＡ、およびＰＣＢ：Ｖ２－Ｌ３－Ｖ１－Ｌ４－ＨＤＢ；
    （ｉｖ）ＰＣＡ：Ｖ１－Ｌ３－Ｖ２－Ｌ５－ＣＬ－Ｌ４－ＨＤＡ、およびＰＣＢ：Ｖ１－Ｌ１－Ｖ２－Ｌ６－ＣＨ１－Ｌ２－ＨＤＢ、
    （ここでは、Ｌ５、ＣＬ、Ｌ６、およびＣＨ１は、存在していてもしていなくてもよい）；または
    （ｖ）ＰＣＡ：Ｖ１－Ｌ４－Ｖ２－Ｌ５－ＣＬ－Ｌ６－ＨＤＡ、およびＰＣＢ：Ｖ２－Ｌ１－Ｖ１－Ｌ２－ＣＨ１－Ｌ３－ＨＤＢ
    （ここでは、Ｌ５、ＣＬ、Ｌ２、およびＣＨ１は、存在していてもしていなくてもよい）；
    を含み、
    Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３、およびＶ４の各対は、重鎖の可変ドメインおよび軽鎖の可変ドメインまたはアルファ鎖の可変ドメインおよびベータ鎖の可変ドメインを含み、抗原結合部位を形成しており、Ｌ１～Ｌ６は、ペプチドリンカーであり、該ＰＣＡおよび／または該ＰＣＢは、場合によりＨＤＣをさらに含む、請求項８または９に記載のタンパク質複合体。
11. ＰＣＡおよび／またはＰＣＢは第１のＨＤＣを含み、複合体は、１つまたはそれ以上の抗原結合部位を含む１つまたはそれ以上の追加のポリペプチド、および該第１のＨＤＣに共有結合または非共有結合している第２のＨＤＣを含む、請求項１０に記載のタンパク質複合体。
12. 請求項１～１１のいずれか１項に記載のタンパク質複合体の１つまたはそれ以上のポリペプチドをコードする、１つまたはそれ以上のポリヌクレオチド。
13. 請求項１２に記載の１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドを含む、１つまたはそれ以上の発現ベクター。
14. 請求項１２に記載の１つまたはそれ以上のポリヌクレオチド、または請求項１３に記載の１つまたはそれ以上の発現ベクターを含む、細胞。
15. 薬学的に許容される担体と、請求項１～１１のいずれか１項に記載のタンパク質複合体、請求項１２に記載の１つまたはそれ以上のポリヌクレオチド、または請求項１３に記載の１つまたはそれ以上の発現ベクターとを含む、薬学的組成物。

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