TW202417480A - 純化多特異性抗體之方法 - Google Patents
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Abstract
提供了包含四條多肽鏈的多價結合蛋白，其中第一重鏈多肽與第一輕鏈多肽締合以形成一個或多個抗原結合結構域，並且第二重鏈多肽與第二輕鏈多肽締合以結合一個或多個抗原結合結構域。還提供了純化此類多價結合蛋白的方法。
Description
相關申請的交叉引用
[0001]本申請要求2022年6月8日提交的美國臨時申請號63/350,255和2022年9月8日提交的歐洲專利申請號22315206.7的優先權權益，將其各自的內容通過引用以其整體併入本文。
對電子序列表的引用
[0002]將電子序列表的內容（183952034141SEQLIST.xml；大小：21,251位元組；並且創建日期：2023年5月30日）通過引用以其整體併入本文。
[0003]本公開文本涉及具有減少的與蛋白L和/或KappaSelect層析材料結合的多價結合蛋白、產生此類多價結合蛋白的方法、和從包含多價結合蛋白和雜質（例如，錯配多肽）的組成物中純化此類多價結合蛋白的方法。
[0004]作為用於人類疾病的治療劑的多價結合蛋白（例如，多價和/或多特異性抗體和抗體構築體）的開發具有巨大的臨床潛力。然而，呈IgG形式的多價結合蛋白的產生一直具有挑戰性，因為抗體重鏈已經進化為以相對混雜的方式結合抗體輕鏈。作為這種混雜配對的結果，包含例如兩種或更多種抗體重鏈（或重鏈構築體）和/或兩種或更多種抗體輕鏈（或輕鏈構築體）的多價結合蛋白的產生可以導致形成包含重鏈同二聚體和/或雜亂的重鏈/輕鏈對的不期望的種類。從此類不期望的錯配種類中層析分離出正確組裝的多價結合蛋白可能很困難，這是由於它們的結構和分子質量的相似性。此外，複雜的體外組裝反應和/或純化方法限制了許多多價結合蛋白平臺的適用性，特別是它們在許多治療性藥物管道所需的高通量篩選中的用途。
[0005]本領域中需要改進的去除錯配的重鏈/輕鏈副產物並且增加多價結合蛋白產率的蛋白純化方法。
[0006]在一些實施例中，提供了一種多價結合蛋白，所述多價結合蛋白包含形成兩個抗原結合結構域的四條多肽鏈；其中所述四條多肽鏈包括：
第一重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VH
1-CH1 [I]，
第一輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構：
VL
1-CL
1[II]，
第二重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VH
2-CH1 [III]，
和第二輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構：
VL
2-CL
2[IV]；
其中：VL
1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；VL
2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域，其中VL
2是κ1、κ3或κ4亞型輕鏈可變結構域，CL
1是第一免疫球蛋白輕鏈恆定結構域，其中CL
1是Cκ亞型輕鏈恆定結構域；CL
2是第二免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；VH
1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；VH
2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；CH1是免疫球蛋白重鏈恆定結構域；其中CL
1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，其中VL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且其中VH
1與VL
1締合以形成第一抗原結合結構域，並且VH
2與VL
2締合以形成第二抗原結合結構域。
[0007]在一些實施例中，提供了一種多價結合蛋白，所述多價結合蛋白包含形成兩個抗原結合結構域的四條多肽鏈；其中所述四條多肽鏈包括：
第一重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VH
1-CH1-CH2-CH3 [I]，
第一輕鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VL
1-CL
1[II]，
第二重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VH
2-CH1-CH2-CH3 [III]，
和第二輕鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VL
2-CL
2[IV]；
其中：VL
1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；VL
2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域；CL
1是第一免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；CL
2是第二免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；VH
1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；VH
2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；CH1、CH2和CH3是免疫球蛋白重鏈恆定結構域；其中CL
1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，其中VL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且其中VH
1與VL
1締合以形成第一抗原結合結構域，並且VH
2與VL
2締合以形成第二抗原結合結構域。
[0008]在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
1相比，包含所述一個或多個取代的CL
1與KappaSelect的結合減少了約90%。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
2相比，包含所述一個或多個取代的所述VL
2與所述蛋白L層析材料的結合減少了約90%。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，包含所述一個或多個取代的所述CL
1中的所述一個或多個胺基酸取代在對應於109、110或199的位置處，其中編號是根據EU索引。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，包含所述一個或多個取代的所述CL
1中的所述一個或多個胺基酸取代是T109A取代、V110D取代、Q199K取代、T109A-V110D取代或T109A-V110D-Q199K取代，其中胺基酸編號是根據EU索引。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，包含所述一個或多個取代的所述CL
1中的所述一個或多個胺基酸取代在對應於109、198、199或202的位置處，其中編號是根據EU索引。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，包含所述一個或多個取代的所述CL
1中的所述一個或多個胺基酸取代是H198R取代、Q199W取代或T109A-S202R取代，其中胺基酸編號是根據EU索引。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，包含所述一個或多個取代的所述VL
2中的所述一個或多個胺基酸取代是架構胺基酸的取代。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，包含所述一個或多個取代的所述VL
2中的所述一個或多個胺基酸取代在對應於12或18的位置處，其中編號是根據Kabat。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，包含所述一個或多個取代的所述VL
2中的所述一個或多個胺基酸取代是S12P取代、R18P取代、R18Q取代、S12P-R18P取代或S12P-R18Q取代，其中編號是根據Kabat。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，所述第一重鏈多肽的CH3結構域和/或所述第二重鏈多肽的CH3結構域是人類IgG1或IgG4 CH3結構域。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，所述第一重鏈多肽的CH3結構域包含對應於人類IgG1的位置354和366的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引，其中所述胺基酸取代是S354C和T366W；其中所述第二重鏈多肽的CH3結構域包含對應於人類IgG1的位置349、366、368、407、435和436的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引，其中所述胺基酸取代是Y349C、T366S、L368A和Y407V。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，所述第一重鏈多肽的CH3結構域包含對應於人類IgG1的位置349、366、368、407、435和436的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引，其中所述胺基酸取代是Y349C、T366S、L368A和Y407V；其中所述第二重鏈多肽的CH3結構域包含對應於人類IgG1的位置354和366的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引，其中所述胺基酸取代是S354C和T366W。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，所述第二重鏈多肽的CH3包含減少與蛋白A的結合的一個或多個胺基酸取代。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，所述第一重鏈多肽的CH3包含減少與蛋白A的結合的一個或多個胺基酸取代。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，減少與蛋白A的結合的一個或多個胺基酸取代是對應於人類IgG1的位置435和436的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，所述胺基酸取代是H435R和Y436F，其中胺基酸編號是根據EU索引。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，所述第一重鏈多肽的CH1、CH2和CH3結構域不同於所述第二重鏈多肽的CH1、CH2和CH3結構域。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，所述第一重鏈多肽源自與所述第二重鏈多肽不同的物種。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，所述第一重鏈多肽和所述第一輕鏈多肽源自小鼠重鏈免疫球蛋白和小鼠輕鏈免疫球蛋白，並且所述第二重鏈多肽和所述第二輕鏈多肽源自大鼠重鏈免疫球蛋白和大鼠輕鏈免疫球蛋白。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，所述第一重鏈多肽和所述第二重鏈多肽各自包含IgG4 CH3結構域。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，所述第一重鏈多肽包含K409R胺基酸取代，並且所述第二重鏈多肽包含F405L胺基酸取代，其中編號是根據EU索引。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，所述多價結合蛋白是雙特異性抗原結合蛋白。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，所述第一抗原結合結構域和所述第二抗原結合結構域結合不同抗原。
[0009]在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，所述多價結合蛋白的第一重鏈多肽鏈包含由下式表示的結構：
VH
1-CH1-CH2-CH3-VH
3-L-VL
3[Ia]，並且
所述多價結合蛋白的第二重鏈多肽包含由下式表示的結構：
VH
2-CH1-CH2-CH3 [IIIa]，
其中：VL
3是第三免疫球蛋白輕鏈可變結構域；VH
3是第三免疫球蛋白重鏈可變結構域；L是胺基酸連接子；其中VH
3與VL
3締合以形成第三抗原結合結構域。
[0010]在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，所述多價結合蛋白的第一重鏈多肽包含由下式表示的結構：
VH
1-CH1-CH2-CH3-VH
3[Ib]，並且
所述多價結合蛋白的第二重鏈多肽包含由下式表示的結構：
VH
2-CH1-CH2-CH3 [IIIb]，
其中：VH
3是第三免疫球蛋白重鏈可變結構域。
[0011]在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，所述VL
3包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
3相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與所述蛋白L層析材料的結合。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，VL
3是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2免疫球蛋白輕鏈可變結構域。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，所述多價結合蛋白是雙特異性或三特異性的。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，所述第一抗原結合結構域、所述第二抗原結合結構域結合和所述第三抗原結合結構域結合兩種或三種不同的抗原。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，所述第一抗原結合結構域結合第一抗原，所述第二抗原結合結構域結合第二抗原，並且所述第三抗原結合結構域結合第三抗原。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，所述第一抗原結合結構域和所述第二抗原結合結構域結合第一抗原，並且所述第三抗原結合結構域結合第二抗原。
[0012]在一些實施例中，提供了一種多價結合蛋白，所述多價結合蛋白包含形成三個抗原結合結構域的四條多肽鏈；其中所述四條多肽鏈包括：
第一重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VH
1-L
3-VH
2-L
4-CH1 [I]，
第一輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構：
VL
2-L
1-VL
1-L
2-CL
1[II]，
第二重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VH
3-CH1 [III]，
和第二輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構：
VL
3-CL
2[IV]
其中：VL
1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；VL
2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域；VL
3是第三免疫球蛋白輕鏈可變結構域；VH
1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；VH
2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；VH
3是第三免疫球蛋白重鏈可變結構域；CL
1是第一免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；CL
2是第二免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恆定結構域；並且L
1、L
2、L
3和L
4是胺基酸連接子；其中所述式I的多肽和所述式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對；其中VH
1與VL
1締合以形成第一抗原結合結構域，VH
2與VL
2締合以形成第二抗原結合結構域，並且VH
3與VL
3締合以形成第三抗原結合結構域；並且其中：
a) CL
1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL
3包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
3相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合；
b) CL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL
1和VL
2各自包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
1和VL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合；
c) CL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL
1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且其中VL
2是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域；或
d) CL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且其中VL
1是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域。
[0013]在一些實施例中，提供了一種多價結合蛋白，所述多價結合蛋白包含形成三個抗原結合結構域的四條多肽鏈；其中所述四條多肽鏈包括：
第一重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VH
1-L
3-VH
2-L
4-CH1-CH2-CH3 [Ia]，
第一輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構：
VL
2-L
1-VL
1-L
2-CL
1[II]，
第二重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VH
3-CH1-CH2-CH3 [IIIa]，
和第二輕鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VL
3-CL
2[IV]
其中：VL
1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；VL
2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域；VL
3是第三免疫球蛋白輕鏈可變結構域；VH
1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；VH
2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；VH
3是第三免疫球蛋白重鏈可變結構域；CL
1是第一免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；CL
2是第二免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恆定結構域；CH2是免疫球蛋白CH2重鏈恆定結構域；CH3是免疫球蛋白CH3重鏈恆定結構域；並且L
1、L
2、L
3和L
4是胺基酸連接子；其中所述式I的多肽和所述式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對；其中VH
1與VL
1締合以形成第一抗原結合結構域，VH
2與VL
2締合以形成第二抗原結合結構域，並且VH
3與VL
3締合以形成第三抗原結合結構域；並且其中：
a) CL
1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL
3包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
3相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合；
b) CL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL
1和VL
2各自包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
1和VL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合；
c) CL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL
1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且其中VL
2是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型輕鏈可變免疫球蛋白結構域；或
d) CL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且其中VL
1是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型輕鏈可變免疫球蛋白結構域。
[0014]在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，結合蛋白是三特異性的並且能夠特異性結合三種不同抗原標靶。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，L
1、L
2、L
3或L
4中的至少一個的長度各自獨立地是0個胺基酸。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，L
1、L
2、L
3或L
4的長度各自獨立地是至少一個胺基酸。
[0015]在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，所述多價結合蛋白的第二重鏈多肽包含由下式表示的結構：
VH
3-L
5-VH
4-L
6-CH1 [IIIb]，
並且所述多價結合蛋白的第二輕鏈多肽包含由下式表示的結構：
VL
4-L
7-VL
3-L
8-CL
2[IVa]
其中：VL
4是第四免疫球蛋白輕鏈可變結構域；VH
4是第四免疫球蛋白重鏈可變結構域；L
5、L
6、L
7和L
8是胺基酸連接子；其中所述式IIIa的多肽和所述式IVa的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對；其中VH
4與VL
4締合以形成第四抗原結合結構域；並且其中：
a) CL
1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL
3和VL
4各自包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
3和VL
4相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合；
b) CL
1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL
3包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
3相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且其中VL
4是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
c) CL
1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL
4包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
4相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且其中VL
3是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
d) CL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL
1和VL
2各自包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
1和VL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合；
e) CL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL
1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且其中VL
2是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域；或
f) CL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且其中VL
1是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域。
[0016]在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，所述多價結合蛋白的第二重鏈多肽包含由下式表示的結構：
VH
3-L
5-VH
4-L
6-CH1-CH2-CH3 [IIIc]，
其中：CH2是免疫球蛋白CH2重鏈恆定結構域，並且CH3是免疫球蛋白CH3重鏈恆定結構域。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，所述多價結合蛋白是四特異性的並且能夠特異性結合四種抗原標靶（例如，四種不同靶抗原）。
[0017]在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，L
1、L
2、L
3、L
4、L
5、L
6、L
7或L
8中的至少一個的長度各自獨立地是0個胺基酸。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，L
1、L
2、L
3、L
4、L
5、L
6、L
7或L
8的長度各自獨立地是至少一個胺基酸。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
1或CL
2相比，包含所述一個或多個胺基酸取代的CL
1或CL
2與所述KappaSelect層析材料的結合減少了約90%。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
1、VL
2、VL
3和/或VL
4相比，包含所述一個或多個取代的VL
1、VL
2、VL
3和/或VL
4與所述蛋白L層析材料的結合減少了約90%。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，所述CL
1或所述CL
2中的所述一個或多個胺基酸取代在對應於109、110或199的位置處，其中編號是根據EU索引。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，包含所述一個或多個胺基酸取代的CL
1或CL
2中的所述一個或多個胺基酸取代是T109A取代、V110D取代、Q199K取代、T109A-V110D取代或T109A-V110D-Q199K取代，其中胺基酸編號是根據EU索引。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，包含所述一個或多個取代的CL
1或CL
2中的所述一個或多個胺基酸取代在對應於109、198、199或202的位置處，其中編號是根據EU索引。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，包含所述一個或多個取代的CL
1或CL
2中的所述一個或多個胺基酸取代是H198R取代、Q199W取代或T109A-S202R取代，其中胺基酸編號是根據EU索引。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，包含所述一個或多個取代的VL
1、VL
2、VL
3和/或VL
4中的所述一個或多個胺基酸取代是架構胺基酸的取代。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，包含所述一個或多個取代的VL
1、VL
2、VL
3和/或VL
4中的所述一個或多個胺基酸取代是在對應於12或18的位置處，其中編號是根據Kabat。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，包含所述一個或多個取代的VL
1、VL
2、VL
3和/或VL
4中的所述一個或多個胺基酸取代是S12P取代、R18P取代、R18Q取代、S12P-R18P取代或S12P-R18Q取代，其中編號是根據Kabat。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，所述第一重鏈多肽的CH3結構域和/或所述第二重鏈多肽的CH3結構域是人類IgG1或IgG4 CH3結構域。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，所述第一重鏈多肽的CH3結構域包含對應於人類IgG1的位置354和366的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引，其中所述胺基酸取代是S354C和T366W；其中所述第二重鏈多肽的CH3結構域包含對應於人類IgG1的位置349、366、368、407、435和436的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引，其中所述胺基酸取代是Y349C、T366S、L368A和Y407V。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，所述第一重鏈多肽的CH3結構域包含對應於人類IgG1的位置349、366、368、407、435和436的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引，其中所述胺基酸取代是Y349C、T366S、L368A和Y407V；其中所述第二重鏈多肽的CH3結構域包含對應於人類IgG1的位置354和366的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引，其中所述胺基酸取代是S354C和T366W。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，所述第二重鏈多肽包含減少與蛋白A的結合的一個或多個胺基酸取代。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，所述第一重鏈多肽的CH3包含減少與蛋白A的結合的一個或多個胺基酸取代。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，減少與蛋白A的結合的一個或多個胺基酸取代是對應於人類IgG1的位置435和436的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，所述胺基酸取代是H435R和Y436F，其中胺基酸編號是根據EU索引。
[0018]在一些實施例中，提供了一種多價結合蛋白，所述多價結合蛋白包含形成兩個抗原結合結構域的四條多肽鏈；其中所述四條多肽鏈包括：
第一重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VH
1-CH1 [I]，
第一輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構：
VL
1-CL
1[II]，
第二重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VH
2-CL
2[III]，
和第二輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構：
VL
2-CH1 [IV]；
其中：VL
1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；VL
2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域；CL
1是第一免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；CL
2是第二免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；VH
1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；VH
2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；CH1是免疫球蛋白重鏈恆定結構域，其中
a) CL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL
1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，或
b) CL
1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合；
並且其中VH
1與VL
1締合以形成第一抗原結合結構域，並且VH
2與VL
2締合以形成第二抗原結合結構域。
[0019]在一些實施例中，提供了一種多價結合蛋白，所述多價結合蛋白包含形成兩個抗原結合結構域的四條多肽鏈；其中所述四條多肽鏈包括：
第一重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VH
1-CH1-CH2-CH3 [I]，
第一輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構：
VL
1-CL
1[II]，
第二重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VH
2-CL
2-CH2-CH3 [III]，
和第二輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構：
VL
2-CH1 [IV]；
其中：VL
1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；VL
2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域；CL
1是第一免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；CL
2是第二免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；VH
1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；VH
2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；CH1是免疫球蛋白重鏈恆定結構域，其中
a) CL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL
1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，或
b) CL
1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合；
並且其中VH
1與VL
1締合以形成第一抗原結合結構域，並且VH
2與VL
2締合以形成第二抗原結合結構域。
[0020]在一些實施例中，提供了一種多價結合蛋白，所述多價結合蛋白包含形成兩個抗原結合結構域的四條多肽鏈；其中所述四條多肽鏈包括：
第一重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VH
1-CH1 [I]，
第一輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構：
VL
1-CL
1[II]，
第二重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VL
2-CH1 [III]，
和第二輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構：
VH
2-CL
2[IV]；
其中：VL
1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；VL
2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域；CL
1是第一免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；CL
2是第二免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；VH
1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；VH
2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；CH1、CH2和CH3是免疫球蛋白重鏈恆定結構域；
其中
a) CL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL
1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，或
b) CL
1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合；
並且其中VH
1與VL
1締合以形成第一抗原結合結構域，並且VH
2與VL
2締合以形成第二抗原結合結構域。
[0021]在一些實施例中，提供了一種多價結合蛋白，所述多價結合蛋白包含形成兩個抗原結合結構域的四條多肽鏈；其中所述四條多肽鏈包括：
第一重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VH
1-CH1-CH2-CH3 [I]，
第一輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構：
VL
1-CL
1[II]，
第二重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VH
2-CH1-CH2-CH3 [III]，
和第二輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構：
VL
2-CL
2[IV]；
其中：VL
1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；VL
2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域；CL
1是第一免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；CL
2是第二免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；VH
1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；VH
2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；CH1、CH2和CH3是免疫球蛋白重鏈恆定結構域；
其中
a) CL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL
1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，或
b) CL
1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合；
並且其中VH
1與VL
1締合以形成第一抗原結合結構域，並且VH
2與VL
2締合以形成第二抗原結合結構域。
[0022]在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
1或CL
2相比，包含所述一個或多個胺基酸取代的CL
1或CL
2與所述KappaSelect層析材料的結合減少了約90%。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
1或VL
2相比，包含所述一個或多個胺基酸取代的VL
1或VL
2與所述蛋白L層析材料的結合減少了約90%。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，包含所述一個或多個胺基酸取代的CL
1或CL
2中的所述一個或多個胺基酸取代在對應於109、110或199的位置處，其中編號是根據EU索引。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，包含所述一個或多個胺基酸取代的CL
1或CL
2中的所述一個或多個胺基酸取代是T109A取代、V110D取代、Q199K取代、T109A-V110D取代或T109A-V110D-Q199K取代。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，包含所述一個或多個取代的CL
1或CL
2中的所述一個或多個胺基酸取代在對應於109、198、199或202的位置處，其中編號是根據EU索引。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，包含所述一個或多個取代的CL
1或CL
2中的所述一個或多個胺基酸取代是H198R取代、Q199W取代或T109A-S202R取代，其中胺基酸編號是根據EU索引。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，包含所述一個或多個胺基酸取代的VL
1或VL
2中的所述一個或多個胺基酸取代是架構胺基酸的取代。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，包含所述一個或多個胺基酸取代的VL
1或VL
2中的所述一個或多個胺基酸取代是在對應於12或18的位置處，其中編號是根據Kabat。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，包含所述一個或多個胺基酸取代的VL
1或VL
2中的所述一個或多個胺基酸取代是S12P取代、R18P取代、R18Q取代、S12P-R18P取代或S12P-R18Q取代，其中編號是根據Kabat。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，所述第一重鏈多肽的CH3結構域和/或所述第二重鏈多肽的CH3結構域是人類IgG1或IgG4 CH3結構域。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，所述第一重鏈多肽的CH3結構域包含對應於人類IgG1的位置354和366的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引，其中所述胺基酸取代是S354C和T366W；其中所述第二重鏈多肽的CH3結構域包含對應於人類IgG1的位置349、366、368、407、435和436的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引，其中所述胺基酸取代是Y349C、T366S、L368A和Y407V。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，所述第一重鏈多肽的CH3結構域包含對應於人類IgG1的位置349、366、368、407、435和436的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引，其中所述胺基酸取代是Y349C、T366S、L368A和Y407V；其中所述第二重鏈多肽的CH3結構域包含對應於人類IgG1的位置354和366的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引，其中所述胺基酸取代是S354C和T366W。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，所述第二重鏈多肽的CH3包含減少與蛋白A層析材料的結合的一個或多個胺基酸取代。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，所述第一重鏈多肽的CH3包含減少與蛋白A層析材料的結合的一個或多個胺基酸取代。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，減少與所述蛋白A層析材料的結合的所述一個或多個胺基酸取代是在對應於人類IgG1的位置435和436的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，所述胺基酸取代是H435R和Y436F，其中胺基酸編號是根據EU索引。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，所述多價結合蛋白是雙特異性抗原結合蛋白。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，所述第一抗原結合結構域和所述第二抗原結合結構域結合不同抗原。
[0023]在一些實施例中，提供了一種多價結合蛋白，所述多價結合蛋白包含形成四個抗原結合結構域的四條多肽鏈；其中所述四條多肽鏈包括：
第一重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VH
1-CH1
1-L
1-VH
2-CH1
2[I]，
第一輕鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VL
1-CL
1-L
2-VL
2-CL
2[II]，
第二重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VH
3-CH1
3-L
3-VH
4-CH1
4[III]，
第二輕鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VL
3-CL
3-L
4-VL
4-CL
4[IV]
其中：VL
1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；VL
2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域；VL
3是第三免疫球蛋白輕鏈可變結構域；VL
4是第四免疫球蛋白輕鏈可變結構域；CL
1是第一免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；CL
2是第二免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；CL
3是第三免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；CL
4是第四免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；VH
1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；VH
2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；VH
3是第三免疫球蛋白重鏈可變結構域；VH
4是第四免疫球蛋白重鏈可變結構域；CH1
1是第一免疫球蛋白重鏈恆定結構域；CH1
2是第二免疫球蛋白重鏈恆定結構域；CH1
3是第三免疫球蛋白重鏈恆定結構域；CH1
4是第四免疫球蛋白重鏈恆定結構域；並且L
1、L
2、L
3和L
4是胺基酸連接子；其中：
a) CL
1和CL
2各自包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
1和CL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL
3和VL
4各自包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
3和VL
4相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合；
b) CL
1和CL
2各自包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
1和CL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL
3包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
3相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且VL
4是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
c) CL
1和CL
2各自包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
1和CL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL
4包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
4相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且其中VL
3是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
d) CL
1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，CL
2是λ亞型免疫球蛋白輕鏈恆定結構域，並且VL
3和VL
4各自包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
1和VL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合；
e) CL
1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，CL
2是λ亞型免疫球蛋白輕鏈恆定結構域，VL
3包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
3相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且VL
4是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
f) CL
1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，CL
2是λ亞型免疫球蛋白輕鏈恆定結構域，VL
4包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
4相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且其中VL
3是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
g) CL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，CL
1是λ亞型免疫球蛋白輕鏈恆定結構域，並且VL
3和VL
4各自包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
3和VL
4相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合；
h) CL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，CL
1是λ亞型免疫球蛋白輕鏈恆定結構域，VL
3包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
3相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且VL
4是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
i) CL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，CL
1是λ亞型免疫球蛋白輕鏈恆定結構域，VL
4包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
4相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且其中VL
3是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
並且其中VL
1和VH
1形成第一抗原結合結構域，VL
2和VH
2形成第二抗原結合結構域，VL
3和VH
3形成第三抗原結合結構域，並且VL
4和VH
4形成第四抗原結合結構域。
[0024]在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，L
1、L
2、L
3或L
4中的至少一個的長度各自獨立地是0個胺基酸。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，L
1、L
2、L
3或L
4中的至少一個的長度各自獨立地是至少一個胺基酸。
[0025]在一些實施例中，提供了一種多價結合蛋白，所述多價結合蛋白包含形成四個抗原結合結構域的四條多肽鏈；其中所述四條多肽鏈包括：
第一重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VH
1-L
1-VH
2-L
2-CH1
1[I]，
第一輕鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VL
1-L
3-VL
2-L
4-CL
1[II]，
第二重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VH
3-L
5-VH
4-L
6-CH1
2[III]，
第二輕鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VL
3-L
7-VL
4-L
8-CL
2[IV]
其中：VL
1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；VL
2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域；VL
3是第三免疫球蛋白輕鏈可變結構域；VL
4是第四免疫球蛋白輕鏈可變結構域；CL
1是第一免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；CL
2是第二免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；VH
1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；VH
2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；VH
3是第三免疫球蛋白重鏈可變結構域；VH
4是第四免疫球蛋白重鏈可變結構域；CH1
1是第一免疫球蛋白重鏈恆定結構域；CH1
2是第二免疫球蛋白重鏈恆定結構域；並且L
1、L
2、L
3、L
4、L
5、L
6、L
7和L
8是胺基酸連接子；其中：
a) CL
1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL
3和VL
4各自包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
3和VL
4相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合；
b) CL
1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL
3包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
3相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且VL
4是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
c) CL
1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL
4包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
4相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且其中VL
3是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
並且其中VL
1和VH
1形成第一抗原結合結構域，VL
2和VH
2形成第二抗原結合結構域，VL
3和VH
3形成第三抗原結合結構域，並且VL
4和VH
4形成第四抗原結合結構域。
[0026]在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，L
1、L
2、L
3、L
4、L
5、L
6、L
7或L
8中的至少一個的長度各自獨立地是0個胺基酸。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，L
1、L
2、L
3、L
4、L
5、L
6、L
7或L
8中的至少一個的長度各自獨立地是至少一個胺基酸。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
1和/或CL
2相比，包含所述一個或多個胺基酸取代的CL
1和/或CL
2與所述KappaSelect層析材料的結合減少了約90%。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
3和/或VL
4相比，包含所述一個或多個胺基酸取代的VL
3和/或VL
4與所述蛋白L層析材料的結合減少了約90%。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，包含所述一個或多個胺基酸取代的CL
1和/或CL
2中的所述一個或多個胺基酸取代在對應於109、110或199的位置處，其中編號是根據EU索引。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，包含所述一個或多個胺基酸取代的CL
1和/或CL
2中的所述一個或多個胺基酸取代是T109A取代、V110D取代、Q199K取代、T109A-V110D取代或T109A-V110D-Q199K取代，其中胺基酸編號是根據EU索引。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，包含所述一個或多個取代的CL
1和/或CL
2中的所述一個或多個胺基酸取代在對應於109、198、199或202的位置處，其中編號是根據EU索引。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，包含所述一個或多個取代的CL
1和/或CL
2中的所述一個或多個胺基酸取代是H198R取代、Q199W取代或T109A-S202R取代，其中胺基酸編號是根據EU索引。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，包含所述一個或多個胺基酸取代的VL
3和/或VL
4中的所述一個或多個胺基酸取代是架構胺基酸的取代。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，包含所述一個或多個胺基酸取代的VL
3和/或VL
4中的所述一個或多個胺基酸取代是在對應於12或18的位置處，其中編號是根據Kabat。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，包含所述一個或多個胺基酸取代的VL
3和/或VL
4中的所述一個或多個胺基酸取代是S12P取代、R18P取代、R18Q取代、S12P-R18P取代或S12P-R18Q取代，其中編號是根據Kabat。
[0027]在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，所述多價結合蛋白的第一重鏈多肽包含由下式表示的結構：
VH
1-CH1
1-L
1-VH
2-CH1
2-CH2-CH3 [Ia]，
所述多價結合蛋白的第二重鏈多肽包含由下式表示的結構：
VH
3-CH1
3-L
3-VH
4-CH1
4-CH2-CH3 [IIIa]。
[0028]在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，所述多價結合蛋白的第一重鏈多肽包含由下式表示的結構：
VH
1-L
1-VH
2-L
2-CH1
1-CH2-CH3 [Ia]，
所述多價結合蛋白的第二重鏈多肽包含由下式表示的結構：
VH
3-L
5-VH
4-L6-CH1
2-CH2-CH3 [IIIa]。
[0029]在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，所述第一重鏈多肽的CH3結構域和/或所述第二重鏈多肽的CH3結構域是人類IgG1或IgG4 CH3結構域。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，所述第一重鏈多肽的CH3結構域包含對應於人類IgG1的位置354和366的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引，其中所述胺基酸取代是S354C和T366W；其中所述第二重鏈多肽的CH3結構域包含對應於人類IgG1的位置349、366、368、407、435和436的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引，其中所述胺基酸取代是Y349C、T366S、L368A和Y407V。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，所述第一重鏈多肽的CH3結構域包含對應於人類IgG1的位置349、366、368、407、435和436的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引，其中所述胺基酸取代是Y349C、T366S、L368A和Y407V；其中所述第二重鏈多肽的CH3結構域包含對應於人類IgG1的位置354和366的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引，其中所述胺基酸取代是S354C和T366W。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，所述第二重鏈多肽的CH3包含減少與蛋白A層析材料的結合的一個或多個胺基酸取代。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，所述第一重鏈多肽的CH3包含減少與蛋白A層析材料的結合的一個或多個胺基酸取代。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，減少與所述蛋白A層析材料的結合的所述一個或多個胺基酸取代是在對應於人類IgG1的位置435和436的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，所述胺基酸取代是H435R和Y436F，其中胺基酸編號是根據EU索引。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，所述結合蛋白是四特異性的並且能夠特異性結合四種不同抗原標靶。
[0030]在一些實施例中，提供了一種多價結合蛋白，所述多價結合蛋白包含形成抗原結合結構域的四條多肽鏈；其中所述四條多肽鏈包括：
第一重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VH
1-CH1
1[I]，
第一輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構：
VL
1-CL
1[II]，
第二重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
融合多肽-L
1-CH1
2[III]，
和第二輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構：
融合多肽-L
2- CL
2[IV]
其中：VL
1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；CL
1是第一免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；CL
2是第二免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；VH
1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；CH1
1是第一免疫球蛋白重鏈恆定結構域；CH1
2是第二免疫球蛋白重鏈恆定結構域；並且L
1和L
2是胺基酸連接子；其中CL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL
1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合；並且其中VL
1和VH
1形成抗原結合結構域。
[0031]在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，L
1或L
2的長度獨立地是0個胺基酸。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，L
1或L
2的長度獨立地是至少一個胺基酸。
[0032]在一些實施例中，提供了一種多價結合蛋白，所述多價結合蛋白包含形成兩個抗原結合結構域的四條多肽鏈；其中所述四條多肽鏈包括：
第一重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VH
1-CH1
1-L
1-VH
2-CH1
2[I]，
第一輕鏈多肽，其鏈包含由下式表示的結構：
VL
1-CL
1-L
2-VL
2-CL
2[II]，
第二重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
融合多肽-L
3-CH1
3[III]，
和第二輕鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
融合多肽-L
4-CL
3[IV]
其中：VL
1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；VL
2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域；CL
1是第一免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；CL
2是第二免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；CL
3是第三免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；VH
1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；VH
2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；CH1
1是第一免疫球蛋白重鏈恆定結構域；CH1
2是第二免疫球蛋白重鏈恆定結構域；CH1
3是第三免疫球蛋白重鏈恆定結構域，並且L
1、L
2、L
3和L
4是胺基酸連接子；其中：
a) CL
3包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
3相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL
1和VL
2各自包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
1和VL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，
b) CL
3包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
3相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL
1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且VL
2是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白結構域；或
c) CL
3包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
3相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且VL
1是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白結構域；並且
其中VL
1和VH
1形成第一抗原結合結構域並且VL
2和VH
2形成第二抗原結合結構域。
[0033]在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，L
1、L
2、L
3或L
4中的至少一個的長度各自獨立地是0個胺基酸。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，L
1、L
2、L
3或L
4的長度各自獨立地是至少一個胺基酸。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
2或CL
3相比，包含所述一個或多個胺基酸取代的CL
2或CL
3與所述KappaSelect層析材料的結合減少了約90%。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
1和/或VL
2相比，包含所述一個或多個胺基酸取代的VL
1和/或VL
2與所述蛋白L層析材料的結合減少了約90%。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，包含所述一個或多個胺基酸取代的CL
2或CL
3中的所述一個或多個胺基酸取代在對應於109、110或199的位置處，其中編號是根據EU索引。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，包含所述一個或多個胺基酸取代的CL
2或CL
3中的所述一個或多個胺基酸取代是T109A取代、V110D取代、Q199K取代、T109A-V110D取代或T109A-V110D-Q199K取代。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，包含所述一個或多個取代的CL
2或CL
3中的所述一個或多個胺基酸取代在對應於109、198、199或202的位置處，其中編號是根據EU索引。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，包含所述一個或多個取代的CL
2或CL
3中的所述一個或多個胺基酸取代是H198R取代、Q199W取代或T109A-S202R取代，其中胺基酸編號是根據EU索引。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，包含所述一個或多個胺基酸取代的VL
1和/或VL
2中的所述一個或多個胺基酸取代是架構胺基酸的取代。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，包含所述一個或多個胺基酸取代的VL
1和/或VL
2中的所述一個或多個胺基酸取代是在對應於12或18的位置處，其中編號是根據Kabat。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，所述VL
1和/或VL
2中的所述一個或多個胺基酸取代是S12P取代、R18P取代、R18Q取代、S12P-R18P取代或S12P-R18Q取代，其中編號是根據Kabat。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，所述第一重鏈多肽包含第一CH2免疫球蛋白重鏈恆定結構域和第一CH3免疫球蛋白重鏈恆定結構域，並且所述第二重鏈多肽包含第二CH2免疫球蛋白重鏈恆定結構域和第二CH3免疫球蛋白重鏈恆定結構域。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，所述第一CH3結構域和/或所述CH3結構域是人類IgG1或IgG4 CH3結構域。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，所述第一CH3結構域包含對應於人類IgG1的位置354和366的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引，其中所述胺基酸取代是S354C和T366W；其中第二CH3結構域包含在對應於人類IgG1的位置349、366、368、407、435和436的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引，其中所述胺基酸取代是Y349C、T366S、L368A和Y407V。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，所述第二重鏈多肽的CH3包含減少與蛋白A的結合的一個或多個胺基酸取代。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，所述第一重鏈多肽的CH3包含減少與蛋白A的結合的一個或多個胺基酸取代。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，減少與蛋白A的結合的一個或多個胺基酸取代是對應於人類IgG1的位置435和436的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，所述胺基酸取代是H435R和Y436F，其中胺基酸編號是根據EU索引。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，所述多價結合蛋白是多特異性抗體或其抗原結合片段。
[0034]在一些實施例中，提供了一種或多種多核苷酸，所述一種或多種多核苷酸編碼本文所述的多價結合蛋白。在一些實施例中，提供了一種或多種載體，所述一種或多種載體包含本文所述的一種或多種多核苷酸。在一些實施例中，提供了一種宿主細胞，所述宿主細胞包含本文所述的一種或多種多核苷酸或載體。在一些實施例中，提供了一種產生多價結合蛋白的方法，所述方法包括培養本文所述的宿主細胞，使得產生所述結合蛋白（例如，在其中所述多價結合蛋白由所述宿主細胞表現的條件下）。在一些實施例中，所述方法進一步包括從所述宿主細胞種回收所述結合蛋白。
[0035]在一些實施例中，提供了一種醫藥組成物，所述醫藥組成物包含本文所述的多價結合蛋白和醫藥上可接受的載劑。
[0036]在一些實施例中，提供了一種純化本文提供的多價結合蛋白的方法（例如，從一種或多種雜質中分離本文提供的多價結合蛋白），所述方法包括：a) 使包含所述多價結合蛋白（例如，所述多價結合蛋白和雜質，諸如錯配的或錯誤組裝的多肽）的組成物以結合和洗脫模式經受蛋白L層析，以產生蛋白L洗出液，以及b) 使所述蛋白L洗出液以結合和洗脫模式經受KappaSelect層析，以產生KappaSelect洗出液，其中所述KappaSelect洗出液包含所述多價結合蛋白並且基本上不含錯配的（或錯誤組裝的）多肽。在一些實施例中，所述KappaSelect洗出液中的多價結合蛋白的純度至少85%、至少90%或至少95%（例如，不含錯配的或錯誤組裝的多肽）。在一些實施例中，所述KappaSelect洗出液中小於15%、小於10%或小於5%的所述多肽是錯配的（或錯誤組裝的）多肽。
[0037]在一些實施例中，提供了一種純化本文所述的多價結合蛋白的方法（例如，從一種或多種雜質（諸如錯配的或錯誤組裝的多肽）中分離本文提供的多價結合蛋白），所述方法包括a) 使包含所述多價結合蛋白和錯配的（或錯誤組裝的）多肽的組成物以結合和洗脫層析經受KappaSelect層析，以產生如KappaSelect洗出液，以及b) 使所述KappaSelect洗出液以結合和洗脫模式經受蛋白L層析，以產生蛋白L洗出液，其中所述蛋白L洗出液包含所述多價結合蛋白並且基本上不含所述錯配的（或錯誤組裝的）多肽。在一些實施例中，所述蛋白L洗出液中的多價結合蛋白的純度至少85%、至少90%或至少95%（例如，不含錯配的或錯誤組裝的多肽）。在一些實施例中，所述蛋白L洗出液中小於15%、小於10%或小於5%的所述多肽是錯配的或錯誤組裝的多肽。
[0038]在一些實施例中，提供了一種純化本文所述的多價結合蛋白的方法（例如，從一種或多種雜質中分離本文提供的多價結合蛋白），所述方法包括：a) 使包含所述多價結合蛋白（例如，所述多價抗原結合蛋白和雜質，諸如錯配的或錯誤組裝的多肽）的組成物以結合和洗脫模式經受蛋白A層析，以產生蛋白A洗出液，b) 使所述蛋白A洗出液以結合和洗脫模式經受蛋白L層析，以產生蛋白L洗出液，以及c) 使所述蛋白L洗出液以結合和洗脫模式經受KappaSelect層析，以產生KappaSelect洗出液，其中所述KappaSelect洗出液包含所述多價結合蛋白並且基本上不含錯配的（或錯誤組裝的）多肽。在一些實施例中，所述KappaSelect洗出液中的多價結合蛋白的純度至少85%、至少90%或至少95%（例如，不含錯配的或錯誤組裝的多肽）。在一些實施例中，所述KappaSelect洗出液中小於15%、小於10%或小於5%的所述多肽是錯配的（或錯誤組裝的）多肽。
[0039]在一些實施例中，提供了一種純化本文所述的多價結合蛋白的方法（例如，從一種或多種雜質中分離多價結合蛋白），所述方法包括：a) 使包含所述多價結合蛋白的組成物（例如，包含所述多價結合蛋白和錯配的或錯誤組裝的多肽的組成物）以結合和洗脫模式經受蛋白A層析，以產生蛋白A洗出液，b) 使所述蛋白A洗出液以結合和洗脫模式經受KappaSelect層析，以產生KappaSelect洗出液，以及c) 使所述蛋白KappaSelect洗出液以結合和洗脫模式經受蛋白L層析，以產生蛋白L洗出液，其中所述L洗出液包含所述多價結合蛋白並且基本上不含錯配的（或錯誤組裝的）多肽。在一些實施例中，所述蛋白L洗出液中的多價結合蛋白的純度至少85%、至少90%或至少95%（例如，不含錯配的或錯誤組裝的多肽）。在一些實施例中，所述蛋白L洗出液中小於15%、小於10%或小於5%的所述多肽是錯配的（或錯誤組裝的）多肽。
[0040]在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，包含所述多價結合蛋白的所述組成物源自工程化為表現所述多特異性結合蛋白的宿主細胞。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，包含所述多價結合蛋白的所述組成物是宿主細胞培養物上清液。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，包含所述多價結合蛋白的所述組成物包含錯配多肽。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，將包含所述多價結合蛋白的所述組成物在層析之前過濾。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，所述方法進一步包括在所述KappaSelect或蛋白L層析後的精製步驟。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，所述精製步驟是尺寸排阻層析。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，所述蛋白A層析是MabSelect™、MabSelect SuRe™、MabSelect SuRe™ LX、MabSelect PrismA、ProSep®-vA、ProSep® Ultra Plus、蛋白A Sepharose® Fast Flow或Toyopearl® AF-rProtein A層析。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，所述蛋白L層析是Pierce™蛋白L層析管柱、Capto™ L層析、HiTrap
®蛋白L層析、TOYOPEARL® AF-rProtein L-650F層析或KanCap™ L層析。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，所述KappaSelect層析是HiTrap™ KappaSelect或CaptureSelect™ Kappa XL層析。在根據（或如適用於）本文任何實施例的一些實施例中，包含所述多價結合蛋白的所述組成物與醫藥上可接受的載劑組合。
[0041]應當理解，本文中所描述的多種實施例的一種、一些或全部特性都可以組合以形成本發明的其他實施例。本發明的這些和其他方面對於本領域具有通常知識者將變得清楚。本發明的這些和其他實施例通過隨後的詳細說明進行進一步描述。
概述 [0080]本發明提供了包含四條多肽鏈的多價結合蛋白，其中第一重鏈多肽與第一輕鏈多肽締合以形成一個或多個抗原結合結構域，並且第二重鏈多肽與第二輕鏈多肽締合以結合一個或多個抗原結合結構域。在一些實施例中，所述多價結合蛋白與多於一種抗原結合。為了減少在產生多價結合蛋白期間形成的具有錯配多肽鏈的蛋白質的存在，將胺基酸取代引入一條輕鏈中以在根本上防止它與Kappa Select層析材料的結合並且將胺基酸取代引入其他輕鏈多肽中以在根本上防止它與蛋白L層析材料的結合。多價結合蛋白的Fc部分中還可以包含杵臼結構和RF突變（例如，H435R和436F突變，其中胺基酸編號是根據EU索引），以在多價結合蛋白製備中進一步減少錯配多肽。
[0081]本發明還提供了利用Kappa Select和蛋白L層析用或不用蛋白A層析純化本發明多價結合蛋白的兩步和三步層析方法。基於包含錯配多肽的蛋白質缺乏Kappa Select結合和/或蛋白L結合，將它們從多價結合蛋白的製備物中去除。
通用定義 [0082]除非另有說明，否則根據如本公開文本所用，以下術語應理解為具有以下含義。除非上下文另外要求，否則單數術語應包括複數，並且複數術語應包括單數。
[0083]如本文所用的術語「多核苷酸」是指長度為至少10個核苷酸的單鏈或雙鏈核酸聚合物。在某些實施例中，構成多核苷酸的核苷酸可以是核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸或者任一類型的核苷酸的修飾形式。此類修飾包括鹼基修飾（諸如溴尿苷）、核糖修飾（諸如阿糖胞苷和2',3'-二去氧核糖）以及核苷酸間連接修飾（諸如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯（phosphoroselenoate）、二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯（phosphoroanilothioate）、苯胺磷酸酯（phoshoraniladate）和胺基磷酸酯（phosphoroamidate））。術語「多核苷酸」具體地包括單鏈和雙鏈形式的DNA。
[0084]「分離的多核苷酸」是基因體、cDNA或合成來源的多核苷酸或其某種組合的多核苷酸，所述分離的多核苷酸：(1) 不與在自然界中發現其所在的多核苷酸的全部或一部分締合，(2) 與在自然界中其並不連接的多核苷酸連接，或 (3) 在自然界中不作為更大序列的一部分存在。
[0085]「分離的多肽」是如下多肽，其：(1) 不含通常與其一起被發現的至少一些其他多肽，(2) 基本上不含來自相同來源（例如，來自相同物種）的其他多肽，(3) 由來自不同物種的細胞表現，(4) 已經從至少約50%的在自然界中與所述分離的多肽結合的多核苷酸、脂質、碳水化合物或其他物質分離，(5) 不與在自然界中與所述「分離的多肽」結合的多肽的部分（透過共價或非共價相互作用）結合，(6) 與在自然界中不與所述分離的多肽結合的多肽可操作地（透過共價或非共價相互作用）結合，或 (7) 在自然界中不存在。這種分離的多肽可以由基因體DNA、cDNA、mRNA或具有合成來源的其他RNA或其任何組合來編碼。優選地，分離的多肽基本上不含在其自然環境中發現的會干擾其應用（治療、診斷、預防、研究或其他應用）的多肽或其他污染物。
[0086]天然存在的抗體典型地包含四聚體。每個這種四聚體典型地由兩個相同的多肽鏈對構成，每一對具有一條全長「輕」鏈（典型地具有約25 kDa的分子量）和一條全長「重」鏈（典型地具有約50至70 kDa的分子量）。如本文所用，術語「重鏈」和「輕鏈」是指具有足以賦予對靶抗原的特異性的可變結構域序列的任何免疫球蛋白多肽。每條輕鏈和重鏈的胺基末端部分典型地包含約100至110個或更多個胺基酸的可變結構域，所述可變結構域典型地負責抗原識別。每條鏈的羧基末端部分典型地定義負責效應子功能的恆定結構域。因此，在天然存在的抗體中，全長重鏈免疫球蛋白多肽包含一個可變結構域（V
H）和三個恆定結構域（C
H1、C
H2和C
H3），其中V
H結構域位於多肽的胺基末端並且C
H3結構域位於羧基末端，並且全長輕鏈免疫球蛋白多肽包含一個可變結構域（V
L）和一個恆定結構域（C
L），其中V
L結構域位於多肽的胺基末端並且C
L結構域位於羧基末端。
[0087]典型地將人類輕鏈分類為κ和λ輕鏈，並且典型地將人類重鏈分類為μ、δ、γ、α或ε，並且將抗體的同種型分別定義為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有幾個子類，包括但不限於IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM具有多個子類，包括但不限於IgM1和IgM2。將IgA類似地細分為多個子類，包括但不限於IgA1和IgA2。在全長輕鏈和重鏈內，可變結構域和恆定結構域典型地透過約12個或更多個胺基酸的「J」區接合，並且重鏈還包括約10個或更多個胺基酸的「D」區。參見例如，Fundamental Immunology（Paul, W.編輯, Raven Press, 第2版, 1989），出於所有目的將其通過引用以其整體併入。每個輕鏈/重鏈對的可變區典型地形成抗原結合位點。天然存在的抗體的可變結構域典型地展現出透過三個高變區（也稱為互補決定區或CDR）接合的相對保守的架構區（FR）的相同總體結構。來自每一對的兩條鏈的CDR典型地通過架構區對齊，這可以使得能夠與特異性表位結合。從胺基末端到羧基末端，輕鏈和重鏈可變結構域二者典型地均包含結構域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。
[0088]術語「CDR組」是指存在於能夠結合抗原的單一可變區中的一組三個CDR。這些CDR的確切邊界已根據不同系統以不同方式加以定義。由Kabat所述的系統（Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest（National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) 和 (1991)）不僅提供適用於抗體的任何可變區的明確殘基編號系統，還提供定義三個CDR的準確殘基邊界。這些CDR可以被稱為Kabat CDR。Chothia和同事（Chothia和Lesk, 1987,
J. Mol. Biol. 196: 901-17；Chothia等人, 1989,
Nature342: 877-83）發現，雖然在胺基酸序列水準上具有顯著多樣性，但是Kabat CDR內的某些子部分採用幾乎相同的肽骨架構象。這些子部分被命名為L1、L2和L3或者H1、H2和H3，其中「L」和「H」分別指定輕鏈區和重鏈區。這些區域可以被稱為Chothia CDR，它們具有與Kabat CDR重疊的邊界。定義與Kabat CDR重疊的CDR的其他邊界已由Padlan, 1995,
FASEB J. 9: 133-39；MacCallum, 1996,
J. Mol. Biol. 262(5): 732-45；和Lefranc, 2003,
Dev. Comp. Immunol. 27: 55-77進行描述。仍有其他CDR邊界定義可能不嚴格遵循本文系統之一，但仍然會與Kabat CDR重疊，不過鑒於特定殘基或殘基組或甚至整個CDR不顯著影響抗原結合的預測或實驗發現，所述其他CDR邊界可能會被縮短或延長。本文所用的方法可以利用根據這些系統中的任一個系統定義的CDR，但是某些實施例使用Kabat或Chothia定義的CDR。使用胺基酸序列鑒定預測的CDR是本領域中熟知的，諸如在以下文獻中：Martin, A.C. 「Protein sequence and structure analysis of antibody variable domains,」
In Antibody Engineering, 第2卷. Kontermann R., Dübel S.編輯 Springer-Verlag, Berlin, 第33-51頁 (2010)。還可以透過其他常規方法（例如，透過與其他重鏈和輕鏈可變區的已知胺基酸序列進行比較以確定具有序列高變性的區域）來檢查重鏈和/或輕鏈可變結構域的胺基酸序列以鑒定CDR的序列。可以透過目測，或透過採用比對程式（諸如CLUSTAL程式套件中的一種）來比對已編號的序列，如以下文獻中所述：Thompson, 1994,
Nucleic Acids Res. 22: 4673-80。常規地使用分子模型來正確描繪架構區和CDR區，並且由此校正基於序列的比對。
[0089]如本文所用，術語「Fc」是指包含由抗體消化產生或透過其他手段產生的非抗原結合片段的序列的分子（所述分子呈單體或多聚體形式），並且可以含有鉸鏈區。雖然優選IgG1和IgG2，但是天然Fc的原始免疫球蛋白來源優選地是人類起源的，並且可以是任何免疫球蛋白。Fc分子由可透過共價（即，雙硫鍵）和非共價締合連接成二聚體或多聚體形式的單體多肽構成。天然Fc分子的單體亞基之間的分子間雙硫鍵的數目範圍從1至4，這取決於類別（例如，IgG、IgA和IgE）或子類（例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgA1和IgGA2）。Fc的一個例子是由IgG的木瓜蛋白酶消化產生的雙硫鍵鍵合的二聚體。如本文所用的術語「天然Fc」是單體、二聚體和多聚體形式通用的。
[0090]F(ab)片段典型地包括一條輕鏈以及一條重鏈的V
H和C
H1結構域，其中F(ab)片段的V
H-C
H1重鏈部分無法與另一個重鏈多肽形成雙硫鍵。如本文所用，F(ab)片段也可以包含含有被胺基酸連接子隔開的兩個可變結構域的一條輕鏈，以及含有被胺基酸連接子隔開的兩個可變結構域和C
H1結構域的一條重鏈。
[0091]F(ab')片段典型地包含一條輕鏈和含有更多恆定區的一條重鏈的一部分（在C
H1與C
H2結構域之間），使得可以在兩條重鏈之間形成鏈間雙硫鍵以形成F(ab')
2分子。
[0092]如本文所用的術語「多價結合蛋白」是指包含多於一個結合結構域的非天然存在的（或重組的或工程化的）分子，其中所述多於一個結合結構域與多於一個靶抗原結合。在一些例子中，所述結合蛋白包含四條多肽鏈，典型地是締合以形成至少一個抗原結合結構域的第一重鏈多肽與第一輕鏈多肽，以及締合以形成至少一個抗原結合結構域的第二重鏈多肽與第二輕鏈多肽。
[0093]「重組」分子是已經通過重組手段製備、表現、產生或分離的分子。
[0094]本公開文本的一個實施例提供了對多於一種抗原具有生物學和免疫學特異性的多價結合蛋白。本公開文本的另一個實施例提供了核酸分子，其包含編碼形成此類多價結合蛋白的多肽鏈的核苷酸序列。本公開文本的另一個實施例提供了包含核酸分子的表現載體，所述核酸分子包含編碼形成此類多價結合蛋白的多肽鏈的核苷酸序列。本公開文本的又另一個實施例提供了宿主細胞，其表現此類多價結合蛋白（即，包含編碼形成此類結合蛋白的多肽鏈的核酸分子或載體）。
[0095]如本文所用術語「可交換性」是指在結合蛋白形式內並且在保持折疊和最終結合親和力的情況下可變結構域的互換性。「完全可交換性」是指在維持結合蛋白的完全功能性（諸如通過結合親和力的保持所證實）的同時，交換式I的多肽鏈或式II的多肽鏈中的V
H1和V
H2結構域二者的順序，並且由此交換V
L1和V
L2結構域的順序（即，顛倒所述順序）的能力。另外，應注意，名稱V
H和V
L僅是指結構域在呈最終形式的特定蛋白質鏈上的位置。例如，V
H1和V
H2可以衍生自親代抗體中的V
L1和V
L2結構域並且被置入結合蛋白中的V
H1和V
H2位置中。同樣，V
L1和V
L2可以衍生自親代抗體中的V
H1和V
H2結構域並且被置於結合蛋白中的V
H1和V
H2位置中。因此，V
H和V
L名稱是指目前的位置而不是在親代抗體中的原始位置。V
H和V
L結構域因此是「可交換的」。
[0096]如本文所用術語「抗原」或「靶抗原」或「抗原標靶」是指分子或分子的一部分，所述分子或分子的一部分能夠被結合蛋白結合，並且另外能夠被用於動物中以產生能夠與該抗原的表位結合的抗體。靶抗原可以具有一個或多個表位。關於由結合蛋白識別的每種靶抗原，結合蛋白能夠與識別所述靶抗原的完整抗體競爭。
[0097]術語「單特異性結合蛋白」是指與一種抗原標靶特異性地結合的結合蛋白。
[0098]術語「單價結合蛋白」是指具有一個抗原結合位點的結合蛋白。
[0099]術語「雙特異性結合蛋白」是指與兩種不同抗原標靶特異性地結合的結合蛋白。
[0100]術語「二價結合蛋白」是指具有兩個結合位點的結合蛋白。
[0101]術語「三特異性結合蛋白」是指與三種不同抗原標靶特異性地結合的結合蛋白。
[0102]術語「三價結合蛋白」是指具有三個結合位點的結合蛋白。在特定實施例中，三價結合蛋白可以與一種抗原標靶結合。在其他實施例中，三價結合蛋白可以與兩種抗原標靶結合。在其他實施例中，三價結合蛋白可以與三種抗原標靶結合。
[0103]術語「四特異性結合蛋白」是指與四種不同抗原標靶特異性地結合的結合蛋白。
[0104]術語「四價結合蛋白」是指具有四個結合位點的結合蛋白。在特定實施例中，四價結合蛋白可以與一種抗原標靶結合。在其他實施例中，四價結合蛋白可以與兩種抗原標靶結合。在其他實施例中，四價結合蛋白可以與三種抗原標靶結合。在其他實施例中，四價結合蛋白可以與四種抗原標靶結合。
[0105]「分離的」結合蛋白是已鑒定出並且與其天然環境的組分分離和/或從其天然環境的組分回收的抗體。其天然環境的污染物組分是會干擾結合蛋白的診斷或治療用途的材料，並且可以包括酶、激素和其他蛋白質或非蛋白質溶質。在一些實施例中，將結合蛋白純化至：(1) 如透過勞裡法（Lowry method）所確定按重量計大於95%的抗體，並且最優選按重量計大於99%，(2) 足以獲得通過使用旋杯式序列分析儀所測的至少15個殘基的N末端或內部胺基酸序列的程度，或 (3) 在還原或非還原條件下使用考馬斯藍或優選銀染色透過SDS-PAGE測得的同質性。分離的結合蛋白包括重組細胞內的原位結合蛋白，因為結合蛋白的天然環境中的至少一種組分將不存在。
[0106]如本文所用術語「基本上純的」或「基本上純化的」是指作為存在的主要種類（即，以莫耳計，其比組成物中的任何其他單獨種類更豐富）的化合物或種類。在一些實施例中，此類術語是相對的並且不一定意味著絕對純度。在一些實施例中，基本上純化的級分是如下組成物，在所述組成物中所述種類占存在的所有大分子種類的至少約50%（以莫耳計）。在其他實施例中，基本上純的組成物將包含組成物中存在的大於約80%、85%、90%、95%或99%的所有大分子種類。在仍其他實施例中，將所述種類純化至基本同質（通過常規檢測方法不能檢測到組成物中的污染物種類），其中所述組成物基本上由單一大分子種類組成。在仍進一步的實施例中，所述種類的純度增加，使得它以比其在天然環境中和/或在初始合成和/或在實驗室條件下擴大時存在的形式更純的形式存在。
[0107]如本文所用，「中和」結合蛋白是指能夠阻斷或基本上降低其結合的靶抗原的效應子功能的分子。如本文所用，「基本上降低」意指靶抗原的效應子功能降低至少約60%，優選至少約70%、更優選至少約75%、甚至更優選至少約80%、仍更優選至少約85%、最優選至少約90%。
[0108]術語「表位」包括能夠與免疫球蛋白或T細胞受體特異性地結合的任何決定簇，優選多肽決定簇。在某些實施例中，表位決定簇包括分子的化學活性表面基團（grouping），諸如胺基酸、糖側鏈、磷醯基或磺醯基，並且在某些實施例中，可以具有特定的三維結構特徵和/或特定的電荷特徵。表位是抗原中被抗體或結合蛋白結合的區域。在某些實施例中，當結合蛋白在蛋白質和/或大分子的複雜混合物中優先識別其靶抗原時，稱為結合蛋白特異性地結合抗原。在一些實施例中，當平衡解離常數 ≤ 10
-8M時、更優選地在平衡解離常數 ≤ 10
-9M時並且最優選地在解離常數 ≤ 10
-10M時，稱為結合蛋白特異性地結合抗原。
[0109]結合蛋白的解離常數（K
D）可以例如透過表面等離子體共振來確定。通常，表面等離子體共振分析透過表面等離子體共振（SPR）使用BIAcore系統（Pharmacia Biosensor；新澤西州皮斯卡塔韋）測量配體（生物感測器基質上的靶抗原）與分析物（溶液中的結合蛋白）之間的即時結合相互作用。表面等離子體分析還可以透過固定分析物（生物感測器基質上的結合蛋白）並且呈遞配體（靶抗原）來進行。如本文所用術語「K
D」是指特定結合蛋白與靶抗原之間的相互作用的解離常數。
[0110]如本文所用，術語「特異性結合」是指結合蛋白或其抗原結合片段以至少約1 x 10
-6M、1 x 10
-7M、1 x 10
-8M、1 x 10
-9M、1 x 10
-10M、1 x 10
-11M、1 x 10
-12M或更大的Kd與含有表位的抗原結合的能力，和/或以比所述結合蛋白或其抗原結合片段對非特異性抗原的親和力大至少兩倍的親和力與表位結合的能力。
[0111]如本文所用術語「連接子」是指在免疫球蛋白結構域之間插入的一個或多個胺基酸殘基，它們為輕鏈和重鏈的結構域提供足夠的移動性，以折疊成在雙重可變區免疫球蛋白上的交叉。在序列水平上，連接子分別是在可變結構域之間或可變結構域與恆定結構域之間的過渡處插入。由於免疫球蛋白結構域的大致尺寸已被充分理解，因此可以鑒定結構域之間的過渡。結構域過渡的準確位置可以透過定位不形成二級結構元件（諸如β折疊或α螺旋）的肽延伸段來確定，如透過實驗資料所證實或者如通過建模或二級結構預測的技術可以假定。例如，關於
圖 1F中示出的示例性多價結合蛋白，連接子被稱為L
1，其位於V
L2結構域的C末端與V
L1結構域的N末端之間的輕鏈上；以及L
2，其位於V
L1結構域的C末端與C
L結構域的N末端之間的輕鏈上。重鏈連接子被稱為L
3，其位於V
H1結構域的C末端與V
H2結構域的N末端之間；以及L
4，其位於V
H2結構域的C末端與C
H1結構域的N末端之間。
[0112]如本文所用術語「載體」是指用於將編碼資訊轉移至宿主細胞的任何分子（例如，核酸、質體或病毒）。術語「載體」包括能夠運輸已經與其連接的另一個核酸的核酸分子。一種類型的載體是「質體」，它是指可以將另外的DNA區段插入其中的環狀雙股DNA分子。另一種類型的載體是病毒載體，其中可以將另外的DNA區段插入病毒基因體中。某些載體能夠在引入它們的宿主細胞中自主複製（例如，具有細菌複製起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體）。其他載體（例如，非附加型哺乳動物載體）可以在引入宿主細胞中之後整合至宿主細胞的基因體中，從而與宿主基因體一起複製。另外，某些載體能夠引導與其可操作連接的基因的表現。此類載體在本文中稱為「重組表現載體」（或簡單地「表現載體」）。一般來說，用於重組DNA技術中的表現載體通常呈質體形式。術語「質體」和「載體」在本文中可以互換使用，因為質體是最常用的載體形式。然而，本公開文本意圖包括發揮同等功能的其他形式的表現載體，諸如病毒載體（例如，複製缺陷性反轉錄病毒、腺病毒和腺相關病毒）。
[0113]如本文所用片語「重組宿主細胞」（或「宿主細胞」）是指已經將重組表現載體引入其中的細胞。重組宿主細胞或宿主細胞旨在不僅是指特定的受試細胞，而且還指這種細胞的子代。因為後代中可能由於突變或環境影響而發生某些修飾，所以這種子代可能實際上與親代細胞不同，但是此類細胞仍包括在如本文所用的術語「宿主細胞」的範圍內。眾多種宿主細胞表現系統可以用於表現結合蛋白，所述表現系統包括細菌、酵母、桿狀病毒和哺乳動物表現系統（以及噬菌體展示表現系統）。合適的細菌表現載體的例子是pUC19。為了重組表現結合蛋白，用攜帶編碼結合蛋白多肽鏈的DNA片段的一種或多種重組表現載體轉化或轉染宿主細胞，使得在所述宿主細胞中表現所述多肽鏈並且優選地將所述多肽鏈分泌到培養所述宿主細胞的培養基中，可以從所述培養基回收所述結合蛋白。
[0114]如本文所用術語「轉化」是指細胞的遺傳特徵的變化，並且當細胞被修飾而含有新DNA時，所述細胞已經被轉化。例如，如果細胞從其天然狀態進行遺傳修飾，則所述細胞被轉化。在轉化後，轉化DNA可以透過物理整合至細胞的染色體中與細胞的DNA重組，或者可以在不被複製的情況下短暫維持為附加型元件，或者可以作為質體獨立複製。當DNA隨著細胞分裂進行複製時，認為細胞已經被穩定轉化。如本文所用術語「轉染」是指細胞攝取外來或外源DNA，並且當已經將外源DNA引入細胞膜內時，細胞已經被「轉染」。多種轉染技術是本領域熟知的。此類技術可以用於將一種或多種外源DNA分子引入合適的宿主細胞中。
[0115]如本文所用並應用於物件的術語「天然存在的」是指以下事實：所述物件可以在自然界中發現並且尚未被人類操縱。例如，可以從自然界中的來源分離並且尚未被人類有意修飾的存在於生物體（包括病毒）中的多核苷酸或多肽是天然存在的。類似地，如本文所用的「非天然存在的」是指在自然界中沒有發現或者已經被人類進行結構修飾或合成的物件。
[0116]如本文所用，二十種常規胺基酸及其縮寫遵循常規用法。二十種常規胺基酸的立體異構體（例如，d-胺基酸）；非天然胺基酸和類似物（諸如α-, α-二取代胺基酸、N-烷基胺基酸、乳酸和其他非常規胺基酸）也可以是結合蛋白多肽鏈的合適組分。非常規胺基酸的例子包括：4-羥脯胺酸、γ-羧基麩胺酸、ε-N,N,N-三甲基離胺酸、ε-N-乙醯基離胺酸、O-磷酸絲胺酸、N-乙醯基絲胺酸、N-甲醯基甲硫胺酸、3-甲基組胺酸、5-羥離胺酸、σ-N-甲基精胺酸以及其他類似胺基酸和亞胺基酸（例如，4-羥脯胺酸）。在本文所用的多肽標記法中，根據標準用法和慣例，左手方向是胺基末端方向並且右手方向是羧基末端方向。
[0117]可以基於常見側鏈特性將天然存在的殘基分為多個類別：
(1) 疏水性的：Met、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Tyr、Pro；
(2) 極性親水性的：Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、His、Lys、Ser、Thr；
(3) 脂肪族的：Ala、Gly、Ile、Leu、Val、Pro；
(4) 脂肪族疏水性的：Ala、Ile、Leu、Val、Pro；
(5) 中性親水性的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(6) 酸性的：Asp、Glu；
(7) 鹼性的：His、Lys、Arg；
(8) 影響鏈取向的殘基：Gly、Pro；
(9) 芳香族的：His、Trp、Tyr、Phe；以及
(10) 芳香族疏水性的：Phe、Trp、Tyr。
[0118]保守胺基酸取代可以涉及這些類別中一個類別的成員與同一類別中另一個成員的交換。非保守取代可以涉及這些類別中一個類別的成員與來自另一個類別的成員的交換。
[0119]具有通常知識者將能夠使用熟知的技術確定多價結合蛋白多肽鏈的合適變體。例如，本領域具有通常知識者可以透過靶向被認為對活性不重要的區域來鑒定多肽鏈中可以在不破壞活性的情況下改變的合適區域。可替代地，本領域具有通常知識者可以鑒定分子中在相似多肽之間保守的殘基和部分。另外，即使可能對生物活性或對結構重要的區域也可以在不破壞生物活性的情況下或在不對多肽結構造成不良影響的情況下經受保守胺基酸取代。
[0120]如本文所用術語「醫藥組成物」或「治療性組成物」是指在適當給予至患者時能夠誘導所需治療效果的化合物或組成物。
[0121]如本文所用，術語「醫藥上可接受的載劑」或「生理學上可接受的載劑」是指適合於實現或增強結合蛋白的遞送的一種或多種調配材料。
[0122]術語「有效量」和「治療有效量」在關於包含一種或多種結合蛋白的醫藥組成物使用時是指足以產生所需治療結果的量或劑量。更具體地，治療有效量是結合蛋白足以將與所治療病症相關的一種或多種臨床上定義的病理方法抑制一定時間段的量。有效量可以根據所用的特定結合蛋白而變化，並且還取決於與所治療患者和障礙的嚴重程度相關的多種因素和狀況。例如，如果要在體內給予結合蛋白，則諸如患者的年齡、體重和健康狀況以及在臨床前動物工作中獲得的劑量反應曲線和毒性資料等因素將屬於所考慮的那些因素。給定的醫藥組成物的有效量或治療有效量的確定完全在本領域具有通常知識者的能力範圍內。
[0123]本公開文本的一個實施例提供包含醫藥上可接受的載劑和治療有效量的結合蛋白的醫藥組成物。
[0124]本文中引用的所有參考文獻（包括專利申請、專利公開案和UniProtKB/Swiss-Prot登錄號）都通過引用以其整體併入本文，如同每個單獨的參考文獻被明確地且單獨地指示通過引用併入。
具有減少的與 KappaSelect 和 / 或蛋白 L 層析材料的結合的多價結合蛋白 示例性二價結合蛋白 [0125]在一些實施例中，提供了一種多價結合蛋白（例如，雙特異性抗體），所述多價結合蛋白包含形成兩個抗原結合結構域的四條多肽鏈；其中所述四條多肽鏈包括：第一重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VH
1-CH1 [I]，
第一輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構：
VL
1-CL
1[II]，
第二重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VH
2-CH1 [III]，
和第二輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構：
VL
2-CL
2[IV]；
其中：VL
1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；VL
2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域，其中VL
2是κ1、κ3或κ4亞型輕鏈可變結構域，CL
1是第一免疫球蛋白輕鏈恆定結構域，其中CL
1是Cκ亞型輕鏈恆定結構域；CL
2是第二免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；VH
1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；VH
2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；CH1是免疫球蛋白重鏈恆定結構域；其中CL
1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，其中VL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且其中VH
1與VL
1締合以形成第一抗原結合結構域，並且VH
2與VL
2締合以形成第二抗原結合結構域。
[0126]在一些實施例中，提供了結合蛋白（例如，多價結合蛋白），所述結合蛋白包含形成兩個抗原結合結構域的四條多肽鏈；其中所述四條多肽鏈包括：第一重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VH
1-CH1-CH2-CH3 [I]，
第一輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構：
VL
1-CL
1[II]，
第二重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VH
2-CH1-CH2-CH3 [III]，
和第二輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構：
VL
2-CL
2[IV]；
其中：VL
1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；VL
2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域；CL
1是第一免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；CL
2是第二免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；VH
1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；VH
2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；CH1、CH2和CH3是免疫球蛋白重鏈恆定結構域；其中CL
1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，其中VL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且其中VH
1與VL
1締合以形成第一抗原結合結構域，並且VH
2與VL
2締合以形成第二抗原結合結構域。該實施例的例子示出於
圖 1A中。
[0127]在一些實施例中，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的多價結合蛋白（例如，雙特異性抗體）的CL
1的結合相比，所述多價結合蛋白（例如，雙特異性抗體）的CL
1與KappaSelect層析材料的結合減少了約90%。在一些實施例中，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的多價結合蛋白的VL
2結合相比，所述多價結合蛋白的VL
2與蛋白L層析材料的結合減少了約90%。在一些實施例中，所述多價結合蛋白的CL
1中的所述一個或多個胺基酸取代是在對應於109、110或199的位置處，其中胺基酸編號是根據EU索引（參見例如，Edelman等人, 1969,
Proc Natl Acad Sci USA63: 78-85）。在一些實施例中，所述CL
1中的所述一個或多個胺基酸取代是T109A取代、V110D取代、Q199K取代、T109A-V110D取代或T109A-V110D-Q199K取代，其中胺基酸編號是根據EU索引。在一些實施例中，所述多價結合蛋白的VL
2中的所述一個或多個胺基酸取代是架構胺基酸的取代。在一些實施例中，所述多價結合蛋白的VL
2中的所述一個或多個胺基酸取代是在對應於12或18的位置處，其中胺基酸編號是根據Kabat（參見例如，Kabat等人,
Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第15版, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)）。在一些實施例中，所述多價結合蛋白的VL
2中的所述一個或多個胺基酸取代是S12P取代、R18P取代、R18Q取代、S12P-R18P取代或S12P-R18Q取代，其中胺基酸編號是根據Kabat。
[0128]在一些實施例中，所述多價結合蛋白的第一重鏈多肽的CH3結構域和/或第二重鏈多肽的CH3結構域是人類IgG1或IgG4 CH3結構域。在一些實施例中，所述第一重鏈多肽的CH3結構域包含對應於（例如，諸如相對於）人類IgG1的位置354和366的位置處的胺基酸取代，其中胺基酸編號是根據EU索引。參見例如，Spiess等人 (2013)
JBC, 288(37): P26583-26593。在一些實施例中，所述胺基酸取代是（或對應於）人類IgG1的S354C和T366W，其中胺基酸編號是根據EU索引。另外地或可替代地，在一些實施例中，所述第二重鏈多肽的CH3結構域包含對應於（例如，諸如相對於）人類IgG1的位置349、366、368、407、435和436的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引。在一些實施例中，所述胺基酸取代是（或對應於）Y349C、T366S、L368A和Y407V，其中胺基酸編號是根據EU索引。在一些實施例中，所述第一重鏈多肽的CH3結構域包含對應於（例如，諸如相對於）人類IgG1的位置349、366、368、407、435和436的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引。在一些實施例中，所述胺基酸取代是（或對應於）Y349C、T366S、L368A和Y407V，其中胺基酸編號是根據EU索引。另外地或可替代地，在一些實施例中，所述第二重鏈多肽的CH3結構域包含對應於（例如，諸如相對於）人類IgG1的位置354和366的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引。在一些實施例中，所述胺基酸取代是（或對應於）S354C和T366W，其中胺基酸編號是根據EU索引。
[0129]在一些實施例中，所述多價結合蛋白的第二重鏈多肽的CH3結構域包含（諸如進一步包含）減少與蛋白A的結合的一個或多個胺基酸取代。在一些實施例中，所述多價結合蛋白的第一重鏈多肽的CH3結構域包含（諸如進一步包含）減少與蛋白A的結合的一個或多個胺基酸取代。在一些實施例中，第一或第二重鏈多肽的CH3結構域中的減少與蛋白A層析材料的結合的所述一個或多個胺基酸取代對應於（例如，諸如相對於）人類IgG1的位置435和436的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引。在一些實施例中，所述胺基酸取代是（或對應於）H435R和Y436F，其中胺基酸編號是根據EU索引。
[0130]在一些實施例中，所述多價結合蛋白的第一重鏈多肽的CH1、CH2和CH3結構域不同於第二重鏈多肽的CH1、CH2和CH3結構域。在一些實施例中，第一重鏈多肽源自不同於第二重鏈多肽的物種。另外地或可替代地，在一些實施例中，第一輕鏈多肽源自不同於第二輕鏈多肽的物種。該實施例的例子示出於
圖 1B中。在一些實施例中，第一重鏈多肽和第一輕鏈多肽分別源自小鼠重鏈免疫球蛋白和小鼠輕鏈免疫球蛋白，並且第二重鏈多肽和第二輕鏈多肽分別源自大鼠重鏈免疫球蛋白和大鼠輕鏈免疫球蛋白。在一些實施例中，第一重鏈多肽和第一輕鏈多肽分別源自大鼠重鏈免疫球蛋白和大鼠輕鏈免疫球蛋白，並且第二重鏈多肽和第二輕鏈多肽分別源自小鼠重鏈免疫球蛋白和小鼠輕鏈免疫球蛋白。
[0131]在一些實施例中，所述多價結合蛋白的第一重鏈多肽和第二重鏈多肽各自包含IgG4 CH3結構域。該實施例的例子示出於
圖 1C中。在一些實施例中，第一重鏈多肽包含K409R胺基酸取代，並且第二重鏈多肽包含F405L胺基酸取代，其中編號是根據EU索引。（參見
圖 1C。）在一些實施例中，第一重鏈多肽包含F405L胺基酸取代，並且第二重鏈多肽包含K409R胺基酸取代，其中編號是根據EU索引。在一些實施例中，所述多價結合蛋白是雙特異性抗原結合蛋白。在一些實施例中，第一抗原結合結構域和第二抗原結合結構域結合不同的抗原。在一些實施例中，第一抗原結合結構域和第二抗原結合結構域與相同抗原上的不同表位結合。在一些實施例中，多價結合蛋白是多特異性抗體或其抗原結合片段。
示例性三價結合蛋白 [0132]在一些實施例中，所述多價結合蛋白的第一重鏈多肽鏈包含由下式表示的結構：
VH
1-CH1-CH2-CH3-VH
3-L-VL
3[Ia]，
第一輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構：
VL
1-CL
1[II]，
所述第二重鏈多肽包含由下式表示的結構：
VH
2-CH1-CH2-CH3 [IIIa]，
和第二輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構：
VL
2-CL
2[IV]；
其中：VL
1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；VL
2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域；VL
3是第三免疫球蛋白輕鏈可變結構域；CL
1是第一免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；CL
2是第二免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；VH
1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；VH
2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；VH
3是第三免疫球蛋白重鏈可變結構域；CH1、CH2和CH3是免疫球蛋白重鏈恆定結構域；其中CL
1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，其中VL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且其中VH
1與VL
1締合以形成第一抗原結合結構域，並且VH
2與VL
2締合以形成第二抗原結合結構域，並且VH
3與VL
3締合以形成第三抗原結合結構域，並且其中VH
3和VL
3經由胺基酸連接子L連接。在一些實施例中，VL
3不結合蛋白L層析材料。在一些實施例中，VL
3是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2免疫球蛋白輕鏈可變結構域。在一些實施例中，L的長度是0個胺基酸。在一些實施例中，長度為0個胺基酸的連接子表明結合蛋白上不存在連接子。在一些實施例中，L的長度是至少一個胺基酸。該實施例的例子示出於
圖 1D中。在一些實施例中，所述多價結合蛋白的第一重鏈多肽鏈包含由下式表示的結構：
VH
1-CH1-CH2-CH3-VH
3[Ib]，
所述第二重鏈多肽包含由下式表示的結構：
VH
2-CH1-CH2-CH3 [IIIb]。
[0133]該實施例的例子示出於圖1E中。在一些實施例中，所述多價結合蛋白是雙特異性的。在一些實施例中，所述多價結合蛋白是三特異性的。在一些實施例中，第一抗原結合結構域、第二抗原結合結構域和第三抗原結合結構域結合兩種或三種不同抗原。在一些實施例中，第一抗原結合結構域結合第一抗原，第二抗原結合結構域結合第二抗原，並且第三抗原結合結構域結合第三抗原。在一些實施例中，第一抗原結合結構域和第二抗原結合結構域結合第一抗原，並且第三抗原結合結構域結合第二抗原。在一些實施例中，多價結合蛋白是多特異性抗體或其抗原結合片段。
[0134]在一些實施例中，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的多價結合蛋白（例如，三特異性抗體）的CL
1的結合相比，所述多價結合蛋白（例如，雙特異性抗體）的CL
1與KappaSelect層析材料的結合減少了約90%。在一些實施例中，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的多價結合蛋白的VL
2結合相比，所述多價結合蛋白的VL
2與蛋白L層析材料的結合減少了約90%。在一些實施例中，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的多價結合蛋白的VL
3結合相比，所述多價結合蛋白的VL
3與蛋白L層析材料的結合減少了約90%。在一些實施例中，所述多價結合蛋白的CL
1中的所述一個或多個胺基酸取代是在對應於109、110或199的位置處，其中編號是根據EU索引（參見例如，Edelman等人, 1969,
Proc Natl Acad Sci USA63: 78-85）。在一些實施例中，所述CL
1中的所述一個或多個胺基酸取代是T109A取代、V110D取代、Q199K取代、T109A-V110D取代或T109A-V110D-Q199K取代，其中胺基酸編號是根據EU索引。在一些實施例中，所述多價結合蛋白的CL
1中的所述一個或多個胺基酸取代在對應於109、198、199或202的位置處，其中編號是根據EU索引（參見例如，Edelman等人, 1969,
Proc Natl Acad Sci USA63: 78-85）。在一些實施例中，CL
1中的所述一個或多個胺基酸取代是H198R取代、Q199W取代或T109A-S202R取代，其中胺基酸編號是根據EU索引。在一些實施例中，所述多價結合蛋白的VL
2中的所述一個或多個胺基酸取代是架構胺基酸的取代。在一些實施例中，所述多價結合蛋白的VL
2中的所述一個或多個胺基酸取代在對應於12或18的位置處，其中編號是根據Kabat（參見例如，Kabat等人,
Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第15版, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)）。在一些實施例中，所述多價結合蛋白的VL
2中的所述一個或多個胺基酸取代是S12P取代、R18P取代、R18Q取代、S12P-R18P取代或S12P-R18Q取代，其中編號是根據Kabat。在一些實施例中，所述多價結合蛋白的VL
3中的所述一個或多個胺基酸取代是架構胺基酸的取代。在一些實施例中，所述多價結合蛋白的VL
3中的所述一個或多個胺基酸取代在對應於12或18的位置處，其中編號是根據Kabat（參見例如，Kabat等人,
Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第15版, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)）。在一些實施例中，所述多價結合蛋白的VL
3中的所述一個或多個胺基酸取代是S12P取代、R18P取代、R18Q取代、S12P-R18P取代或S12P-R18Q取代，其中編號是根據Kabat。
[0135]在一些實施例中，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的多價結合蛋白（例如，三特異性抗體）的CL
2的結合相比，所述多價結合蛋白（例如，雙特異性抗體）的CL
2與KappaSelect層析材料的結合減少了約90%。在一些實施例中，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的多價結合蛋白的VL
1結合相比，所述多價結合蛋白的VL
1與蛋白L層析材料的結合減少了約90%。在一些實施例中，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的多價結合蛋白的VL
3結合相比，所述多價結合蛋白的VL
3與蛋白L層析材料的結合減少了約90%。在一些實施例中，所述多價結合蛋白的CL
2中的所述一個或多個胺基酸取代是在對應於109、110或199的位置處，其中編號是根據EU索引（參見例如，Edelman等人, 1969,
Proc Natl Acad Sci USA63: 78-85）。在一些實施例中，所述CL
2中的所述一個或多個胺基酸取代是T109A取代、V110D取代、Q199K取代、T109A-V110D取代或T109A-V110D-Q199K取代，其中胺基酸編號是根據EU索引。在一些實施例中，所述多價結合蛋白的CL
2中的所述一個或多個胺基酸取代在對應於109、198、199或202的位置處，其中編號是根據EU索引（參見例如，Edelman等人, 1969,
Proc Natl Acad Sci USA63: 78-85）。在一些實施例中，CL
2中的所述一個或多個胺基酸取代是H198R取代、Q199W取代或T109A-S202R取代，其中胺基酸編號是根據EU索引。在一些實施例中，所述多價結合蛋白的VL
1中的所述一個或多個胺基酸取代是架構胺基酸的取代。在一些實施例中，所述多價結合蛋白的VL
1中的所述一個或多個胺基酸取代在對應於12或18的位置處，其中編號是根據Kabat（參見例如，Kabat等人,
Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第15版, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)）。在一些實施例中，所述多價結合蛋白的VL
1中的所述一個或多個胺基酸取代是S12P取代、R18P取代、R18Q取代、S12P-R18P取代或S12P-R18Q取代，其中編號是根據Kabat。在一些實施例中，所述多價結合蛋白的VL
3中的所述一個或多個胺基酸取代是架構胺基酸的取代。在一些實施例中，所述多價結合蛋白的VL
3中的所述一個或多個胺基酸取代在對應於12或18的位置處，其中編號是根據Kabat（參見例如，Kabat等人,
Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第15版, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)）。在一些實施例中，所述多價結合蛋白的VL
3中的所述一個或多個胺基酸取代是S12P取代、R18P取代、R18Q取代、S12P-R18P取代或S12P-R18Q取代，其中編號是根據Kabat。
[0136]在一些實施例中，所述多價結合蛋白的第一重鏈多肽的CH3結構域和/或第二重鏈多肽的CH3結構域是人類IgG1或IgG4 CH3結構域。在一些實施例中，所述第一重鏈多肽的CH3結構域包含對應於（例如，諸如相對於）人類IgG1的位置354和366的位置處的胺基酸取代，其中胺基酸編號是根據EU索引。參見例如，Spiess等人 (2013)
JBC, 288(37): P26583-26593。在一些實施例中，所述胺基酸取代是（或對應於）人類IgG1的S354C和T366W，其中胺基酸編號是根據EU索引。另外地或可替代地，在一些實施例中，所述第二重鏈多肽的CH3結構域包含對應於（例如，諸如相對於）人類IgG1的位置349、366、368、407、435和436的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引。在一些實施例中，所述胺基酸取代是（或對應於）Y349C、T366S、L368A和Y407V，其中胺基酸編號是根據EU索引。在一些實施例中，所述第一重鏈多肽的CH3結構域包含對應於（例如，諸如相對於）人類IgG1的位置349、366、368、407、435和436的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引。在一些實施例中，所述胺基酸取代是（或對應於）Y349C、T366S、L368A和Y407V，其中胺基酸編號是根據EU索引。另外地或可替代地，在一些實施例中，所述第二重鏈多肽的CH3結構域包含對應於（例如，諸如相對於）人類IgG1的位置354和366的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引。在一些實施例中，所述胺基酸取代是（或對應於）S354C和T366W，其中胺基酸編號是根據EU索引。
[0137]在一些實施例中，所述多價結合蛋白的第二重鏈多肽的CH3結構域包含（諸如進一步包含）減少與蛋白A的結合的一個或多個胺基酸取代。在一些實施例中，所述多價結合蛋白的第一重鏈多肽的CH3結構域包含（諸如進一步包含）減少與蛋白A的結合的一個或多個胺基酸取代。在一些實施例中，第一或第二重鏈多肽的CH3結構域中的減少與蛋白A層析材料的結合的所述一個或多個胺基酸取代對應於（例如，諸如相對於）人類IgG1的位置435和436的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引。在一些實施例中，所述胺基酸取代是（或對應於）H435R和Y436F，其中胺基酸編號是根據EU索引。
示例性 CODV 多價結合蛋白 [0138]在一些實施例中，提供了結合蛋白（例如，多價結合蛋白），所述結合蛋白包含形成三個抗原結合結構域的四條多肽鏈；其中所述四條多肽鏈包括：第一重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VH
1-L
3-VH
2-L
4-CH1 [I]，
第一輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構：
VL
2-L
1-VL
1-L
2-CL
1[II]，
第二重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VH
3-CH1 [III]，
和第二輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構：
VL
3-CL
2[IV]
其中VL
1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；VL
2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域；VL
3是第三免疫球蛋白輕鏈可變結構域；VH
1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；VH
2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；VH
3是第三免疫球蛋白重鏈可變結構域；CL
1是第一免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；CL
2是第二免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恆定結構域；並且L
1、L
2、L
3和L
4是胺基酸連接子；其中所述式I的多肽和所述式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對；其中VH
1與VL
1締合以形成第一抗原結合結構域，VH
2與VL
2締合以形成第二抗原結合結構域，並且VH
3與VL
3締合以形成第三抗原結合結構域；並且其中：
a) CL
1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL
3包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
3相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合；
b) CL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL
1和VL
2各自包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
1和VL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合；
c) CL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL
1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且其中VL
2是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域；或
d) CL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且其中VL
1是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域。在一些實施例中，提供了結合蛋白（例如，多價結合蛋白），所述結合蛋白包含形成三個抗原結合結構域的四條多肽鏈；其中所述四條多肽鏈包括：第一重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VH
1-L
3-VH
2-L
4-CH1-CH2-CH3 [Ia]，
第一輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構：
VL
2-L
1-VL
1-L
2-CL
1[II]，
第二重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VH
3-CH1-CH2-CH3 [IIIa]，
和第二輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構：
VL
3-CL
2[IV]
其中VL
1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；VL
2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域；VL
3是第三免疫球蛋白輕鏈可變結構域；VH
1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；VH
2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；VH
3是第三免疫球蛋白重鏈可變結構域；CL
1是第一免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；CL
2是第二免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恆定結構域；CH2是免疫球蛋白CH2重鏈恆定結構域；CH3是免疫球蛋白CH3重鏈恆定結構域；並且L
1、L
2、L
3和L
4是胺基酸連接子；其中所述式I的多肽和所述式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對；其中VH
1與VL
1締合以形成第一抗原結合結構域，VH
2與VL
2締合以形成第二抗原結合結構域，並且VH
3與VL
3締合以形成第三抗原結合結構域；並且其中：
a) CL
1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL
3包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合；
b) CL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL
1和VL
2各自包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
1和VL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合；
c) CL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL
1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且其中VL
2是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域；或
d) CL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且其中VL
1是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域。該實施例的例子示出於
圖 1F中。在一些實施例中，所述結合蛋白是三特異性的並且能夠特異性地結合三種不同抗原標靶。在一些實施例中，L
1、L
2、L
3或L
4中的至少一個的長度獨立地是0個胺基酸。在一些實施例中，長度為0個胺基酸的連接子表明結合蛋白上不存在連接子。在一些實施例中，L
1、L
2、L
3或L
4的長度各自獨立地是至少一個胺基酸。
[0139]在一些實施例中，所述結合蛋白（例如，多價結合蛋白）的第二重鏈多肽包含由下式表示的結構：
VH
3-L
5-VH
4-L
6-CH1 [IIIb]，
並且所述結合蛋白（例如，多價結合蛋白）的第二輕鏈多肽鏈包含由下式表示的結構：
VL
4-L
7-VL
3-L
8-CL
2[IVa]
其中VL
4是第四免疫球蛋白輕鏈可變結構域；VH
4是第四免疫球蛋白重鏈可變結構域；L
5、L
6、L
7和L
8是胺基酸連接子；其中所述式IIIa的多肽和所述式IVa的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對；其中VH
4與VL
4締合以形成第四抗原結合結構域；並且其中：
a) CL
1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL
3和VL
4各自包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
3和VL
4相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合；
b) CL
1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL
3包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
3相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且其中VL
4是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型輕鏈可變免疫球蛋白結構域；
c) CL
1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL
4包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
4相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且其中VL
3是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
d) CL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL
1和VL
2各自包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
1和VL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合；
e) CL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL
1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且其中VL
2是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域；或
f) CL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且其中VL
1是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域。在一些實施例中，所述結合蛋白（例如，多價結合蛋白）的第二重鏈多肽鏈包含由下式表示的結構：
VH
3-L
5-VH
4-L
6-CH1-CH2-CH3 [IIIc]，
其中CH2是免疫球蛋白CH2重鏈恆定結構域，並且CH3是免疫球蛋白CH3重鏈恆定結構域。該實施例的例子示出於
圖 1G中。在一些實施例中，所述結合蛋白是四特異性的並且能夠特異性地結合四種不同抗原標靶。在一些實施例中，L
1、L
2、L
3、L
4、L
5、L
6、L
7或L
8中的至少一個的長度獨立地是0個胺基酸。在一些實施例中，長度為0個胺基酸的連接子表明結合蛋白上不存在連接子。在一些實施例中，L
1、L
2、L
3、L
4、L
5、L
6、L
7或L
8的長度各自獨立地是至少一個胺基酸。
[0140]在一個實施例中，本公開文本的結合蛋白是包含形成三個抗原結合位點的四條多肽鏈的三特異性和/或三價結合蛋白，所述三個抗原結合位點特異性結合一種或多種（例如，三種）不同抗原標靶或靶蛋白，其中第一多肽鏈包含由下式表示的結構：
VL
2-L
1-VL
1-L
2-CL
1[I]
並且第二多肽鏈包含由下式表示的結構：
VH
1-L
3-VH
2-L
4-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [II]
並且第三多肽鏈包含由下式表示的結構：
VH
3- CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [III]
並且第四多肽鏈包含由下式表示的結構：
VL
3- CL
2[IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；
VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；
VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變結構域；
CL1是第一免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；
CL2是第二免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；
CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恆定結構域；
CH2是免疫球蛋白CH2重鏈恆定結構域；
CH3是免疫球蛋白CH3重鏈恆定結構域；
鉸鏈是連接CH1結構域和CH2結構域的免疫球蛋白鉸鏈區；並且
L1、L2、L3和L4是胺基酸連接子；
並且其中式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對，其中VH
1與VL
1締合以形成第一抗原結合結構域，VH
2與VL
2締合以形成第二抗原結合結構域，並且VH
3與VL
3締合以形成第三抗原結合結構域；並且其中：
a) CL
1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL
3包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
3相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合；
b) CL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL
1和VL
2各自包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
1和VL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合；
c) CL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL
1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且其中VL
2是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域；或
d) CL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且其中VL
1是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域。
[0141]在一些實施例中，第一多肽鏈和第二多肽鏈具有形成兩種不同抗原結合位點的交叉取向。在一些實施例中，VH
1和VL
1形成結合對並且形成第一抗原結合位點。在一些實施例中，VH
2和VL
2形成結合對並且形成第二抗原結合位點。在一些實施例中，第三多肽和第四多肽形成第三抗原結合位點。在一些實施例中，VH
3（例如，第三多肽的VH
3）和VL
3（例如，第四多肽的VL
3）形成結合對並且形成第三抗原結合位點。
[0142]在一些實施例中，本公開文本的結合蛋白包含三種抗原結合位點，其特異性結合一種、兩種或三種抗原標靶或靶蛋白（例如，一種抗原標靶、兩種不同抗原標靶或三種不同抗原標靶）。在一些實施例中，所述結合蛋白結合三種抗原標靶。在一些實施例中，所述結合蛋白結合三種不同抗原標靶。在一些實施例中，所述抗原結合位點中的兩個結合相同的抗原標靶。在那些實施例中，所述結合蛋白包含兩次相同的結合結構域或不同的結合結構域，和/或特異性結合不同的抗原或相同抗原標靶上的表位。在一些實施例中，所述抗原結合位點中的三個結合相同的抗原標靶。在那些實施例中，所述結合蛋白包含三次相同的結合結構域或不同的結合結構域，和/或特異性結合不同的抗原或相同抗原標靶上的表位。
[0143]在一些實施例中，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的多價結合蛋白的CL
1結合相比，所述多價結合蛋白的CL
1與KappaSelect層析材料的結合減少了約90%。在一些實施例中，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的多價結合蛋白的VL
4（如果存在）和/或VL
3的結合相比，所述VL
4（如果存在）和/或所述VL
3與蛋白L層析材料的結合減少了約90%。在一些實施例中，所述多價結合蛋白的CL
1中的所述一個或多個胺基酸取代在對應於109、110或199的位置處，其中編號是根據EU索引。在一些實施例中，所述CL
1中的所述一個或多個胺基酸取代是T109A取代、V110D取代、Q199K取代、T109A-V110D取代或T109A-V110D-Q199K取代，其中胺基酸編號是根據EU索引。在一些實施例中，所述多價結合蛋白的CL
1中的所述一個或多個胺基酸取代在對應於109、198、199或202的位置處，其中編號是根據EU索引（參見例如，Edelman等人, 1969,
Proc Natl Acad Sci USA63: 78-85）。在一些實施例中，CL
1中的所述一個或多個胺基酸取代是H198R取代、Q199W取代或T109A-S202R取代，其中胺基酸編號是根據EU索引。在一些實施例中，VL
4（如果存在）和/或VL
3中的所述一個或多個胺基酸取代是架構胺基酸的取代。在一些實施例中，所述多價結合蛋白的VL
4（如果存在）和/或VL
3中的所述一個或多個胺基酸取代在對應於12或18的位置處，其中編號是根據Kabat。在一些實施例中，VL
4（如果存在）和/或VL
3中的所述一個或多個胺基酸取代是S12P取代、R18P取代、R18Q取代、S12P-R18P取代或S12P-R18Q取代，其中胺基酸編號是根據Kabat。
[0144]在一些實施例中，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的多價結合蛋白的CL
2結合相比，所述多價結合蛋白的CL
2與KappaSelect層析材料的結合減少了約90%。在一些實施例中，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的多價結合蛋白的VL
1和/或VL
2的結合相比，所述VL
1和/或所述VL
2與蛋白L層析材料的結合減少了約90%。在一些實施例中，所述多價結合蛋白的CL
2中的所述一個或多個胺基酸取代在對應於109、110或199的位置處，其中編號是根據EU索引。在一些實施例中，所述CL
2中的所述一個或多個胺基酸取代是T109A取代、V110D取代、Q199K取代、T109A-V110D取代或T109A-V110D-Q199K取代，其中胺基酸編號是根據EU索引。在一些實施例中，所述多價結合蛋白的CL
1中的所述一個或多個胺基酸取代在對應於109、198、199或202的位置處，其中編號是根據EU索引（參見例如，Edelman等人, 1969,
Proc Natl Acad Sci USA63: 78-85）。在一些實施例中，CL
1中的所述一個或多個胺基酸取代是H198R取代、Q199W取代或T109A-S202R取代，其中胺基酸編號是根據EU索引。在一些實施例中，VL
1和/或VL
2中的所述一個或多個胺基酸取代是架構胺基酸的取代。在一些實施例中，所述多價結合蛋白的VL
1和/或VL
2中的所述一個或多個胺基酸取代是在對應於12或18的位置處，其中編號是根據Kabat。在一些實施例中，VL
1和/或VL
2中的所述一個或多個胺基酸取代是S12P取代、R18P取代、R18Q取代、S12P-R18P取代或S12P-R18Q取代，其中胺基酸編號是根據Kabat。
[0145]在一些實施例中，所述多價結合蛋白的第一重鏈多肽的CH3結構域和/或第二重鏈多肽的CH3結構域是人類IgG1或IgG4 CH3結構域。在一些實施例中，所述第一重鏈多肽的CH3結構域包含對應於（例如，諸如相對於）人類IgG1的位置354和366的位置處的胺基酸取代，其中胺基酸編號是根據EU索引。參見例如，Spiess等人 (2013)
JBC, 288(37): P26583-26593。在一些實施例中，所述胺基酸取代是（或對應於）人類IgG1的S354C和T366W，其中胺基酸編號是根據EU索引。另外地或可替代地，在一些實施例中，所述第二重鏈多肽的CH3結構域包含對應於（例如，諸如相對於）人類IgG1的位置349、366、368、407、435和436的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引。在一些實施例中，所述胺基酸取代是（或對應於）Y349C、T366S、L368A和Y407V，其中胺基酸編號是根據EU索引。在一些實施例中，所述第一重鏈多肽的CH3結構域包含對應於（例如，諸如相對於）人類IgG1的位置349、366、368、407、435和436的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引。在一些實施例中，所述胺基酸取代是（或對應於）Y349C、T366S、L368A和Y407V，其中胺基酸編號是根據EU索引。另外地或可替代地，在一些實施例中，所述第二重鏈多肽的CH3結構域包含對應於（例如，諸如相對於）人類IgG1的位置354和366的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引。在一些實施例中，所述胺基酸取代是（或對應於）S354C和T366W，其中胺基酸編號是根據EU索引。
[0146]在一些實施例中，所述多價結合蛋白的第二重鏈多肽的CH3結構域包含（諸如進一步包含）減少與蛋白A的結合的一個或多個胺基酸取代。在一些實施例中，所述多價結合蛋白的第一重鏈多肽的CH3結構域包含（諸如進一步包含）減少與蛋白A的結合的一個或多個胺基酸取代。在一些實施例中，第一或第二重鏈多肽的CH3結構域中的減少與蛋白A層析材料的結合的所述一個或多個胺基酸取代對應於（例如，諸如相對於）人類IgG1的位置435和436的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引。在一些實施例中，所述胺基酸取代是（或對應於）H435R和Y436F，其中胺基酸編號是根據EU索引。
[0147]在一些實施例中，多價結合蛋白是多特異性抗體或其抗原結合片段。
示例性交叉 mab 二價結合蛋白 [0148]在一些實施例中，所述結合蛋白是多價結合蛋白，所述多價結合蛋白包含形成兩個抗原結合結構域的四條多肽鏈；其中所述四條多肽鏈包括：第一重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VH
1-CH1 [I]，
第一輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構：
VL
1-CL
1[II]，
第二重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VH
2-CL
2[III]，
和第二輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構：
VL
2-CH1 [IV]；
其中VL
1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；VL
2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域；CL
1是第一免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；CL
2是第二免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；VH
1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；VH
2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；CH1是免疫球蛋白重鏈恆定結構域，並且其中
a) CL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL
1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，或
b) CL
1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合；
並且其中VH
1與VL
1締合以形成第一抗原結合結構域，並且VH
2與VL
2締合以形成第二抗原結合結構域。
[0149]在一些實施例中，提供了結合蛋白（例如，多價結合蛋白），所述結合蛋白包含形成兩個抗原結合結構域的四條多肽鏈；其中所述四條多肽鏈包括：
第一重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VH
1-CH1-CH2-CH3 [I]，
第一輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構：
VL
1-CL
1[II]，
第二重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VH
2-CL
2-CH2-CH3 [III]，
和第二輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構：
VL
2-CH1 [IV]；
其中VL
1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域，VL
2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域，CL
1是第一免疫球蛋白輕鏈恆定結構域，CL
2是第二免疫球蛋白輕鏈恆定結構域，VH
1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域，VH
2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域。CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恆定結構域；CH2是免疫球蛋白CH2重鏈恆定結構域；並且CH3是免疫球蛋白CH3重鏈恆定結構域；其中
a) CL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL
1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，或
b) CL
1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合；
並且其中VH
1與VL
1締合以形成第一抗原結合結構域，並且VH
2與VL
2締合以形成第二抗原結合結構域。該實施例的例子示出於
圖 1H中。
[0150]在一些實施例中，所述結合蛋白是多價結合蛋白，所述多價結合蛋白包含形成兩個抗原結合結構域的四條多肽鏈；其中所述四條多肽鏈包括：
第一重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VH
1-CH1 [I]，
第一輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構：
VL
1-CL
1[II]，
第二重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VL
2-CH1 [III]，
和第二輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構：
VH
2-CL
2[IV]；
其中VL
1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域，VL
2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域，CL
1是第一免疫球蛋白輕鏈恆定結構域，CL
2是第二免疫球蛋白輕鏈恆定結構域，VH
1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域，VH
2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域，並且CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恆定結構域；其中
a) CL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL
1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，或
b) CL
1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合；
並且其中VH
1與VL
1締合以形成第一抗原結合結構域，並且VH
2與VL
2締合以形成第二抗原結合結構域。
[0151]在一些實施例中，提供了結合蛋白（例如，多價結合蛋白），所述結合蛋白包含形成兩個抗原結合結構域的四條多肽鏈；其中所述四條多肽鏈包括：
第一重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VH
1-CH1-CH2-CH3 [I]，
第一輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構：
VL
1-CL
1[II]，
第二重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VL
2-CH1-CH2-CH3 [III]，
和第二輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構：
VH
2-CL
2[IV]；
其中VL
1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；VL
2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域；CL
1是第一免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；CL
2是第二免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；VH
1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；VH
2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；CH1、CH2和CH3是免疫球蛋白重鏈恆定結構域；其中
a) CL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL
1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，或
b) CL
1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合；
並且其中VH
1與VL
1締合以形成第一抗原結合結構域，並且VH
2與VL
2締合以形成第二抗原結合結構域。該實施例的例子示出於
圖 1I中。
[0152]在一些實施例中，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的多價結合蛋白的CL
1或CL
2相比，所述多價結合蛋白的CL
1或CL
2與KappaSelect層析材料的結合減少了約90%。在一些實施例中，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的多價結合蛋白的VL
1或VL
2相比，所述多價結合蛋白的VL
1或VL
2與蛋白L層析材料的結合減少了約90%。在一些實施例中，所述多價結合蛋白的CL
1或CL
2中的所述一個或多個胺基酸取代在對應於109、110或199的位置處，其中編號是根據EU索引。在一些實施例中，CL
1或CL
2中的所述一個或多個胺基酸取代是T109A取代、V110D取代、Q199K取代、T109A-V110D取代或T109A-V110D-Q199K取代，其中胺基酸編號是根據EU索引。在一些實施例中，所述多價結合蛋白的CL
1或CL
2中的所述一個或多個胺基酸取代在對應於109、198、199或202的位置處，其中編號是根據EU索引。在一些實施例中，CL
1或CL
2中的所述一個或多個胺基酸取代是H198R取代、Q199W取代或T109A-S202R取代，其中胺基酸編號是根據EU索引。在一些實施例中，所述多價結合蛋白的VL
3或VL
4中的所述一個或多個胺基酸取代是架構胺基酸的取代。在一些實施例中，VL
3或VL
4中的所述一個或多個胺基酸取代在對應於12或18的位置處，其中編號是根據Kabat。在一些實施例中，所述多價結合蛋白的VL
3或VL
4中的所述一個或多個胺基酸取代是S12P取代、R18P取代、R18Q取代、S12P-R18P取代或S12P-R18Q取代，其中編號是根據Kabat。
[0153]在一些實施例中，所述多價結合蛋白的第一重鏈多肽的CH3結構域和/或第二重鏈多肽的CH3結構域是人類IgG1或IgG4 CH3結構域。在一些實施例中，所述第一重鏈多肽的CH3結構域包含對應於（例如，諸如相對於）人類IgG1的位置354和366的位置處的胺基酸取代，其中胺基酸編號是根據EU索引。參見例如，Spiess等人 (2013)
JBC, 288(37): P26583-26593。在一些實施例中，所述胺基酸取代是（或對應於）人類IgG1的S354C和T366W，其中胺基酸編號是根據EU索引。另外地或可替代地，在一些實施例中，所述第二重鏈多肽的CH3結構域包含對應於（例如，諸如相對於）人類IgG1的位置349、366、368、407、435和436的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引。在一些實施例中，所述胺基酸取代是（或對應於）Y349C、T366S、L368A和Y407V，其中胺基酸編號是根據EU索引。在一些實施例中，所述第一重鏈多肽的CH3結構域包含對應於（例如，諸如相對於）人類IgG1的位置349、366、368、407、435和436的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引。在一些實施例中，所述胺基酸取代是（或對應於）Y349C、T366S、L368A和Y407V，其中胺基酸編號是根據EU索引。另外地或可替代地，在一些實施例中，所述第二重鏈多肽的CH3結構域包含對應於（例如，諸如相對於）人類IgG1的位置354和366的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引。在一些實施例中，所述胺基酸取代是（或對應於）S354C和T366W，其中胺基酸編號是根據EU索引。
[0154]在一些實施例中，所述多價結合蛋白的第二重鏈多肽的CH3結構域包含（諸如進一步包含）減少與蛋白A的結合的一個或多個胺基酸取代。在一些實施例中，所述多價結合蛋白的第一重鏈多肽的CH3結構域包含（諸如進一步包含）減少與蛋白A的結合的一個或多個胺基酸取代。在一些實施例中，第一或第二重鏈多肽的CH3結構域中的減少與蛋白A層析材料的結合的所述一個或多個胺基酸取代對應於（例如，諸如相對於）人類IgG1的位置435和436的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引。在一些實施例中，所述胺基酸取代是（或對應於）H435R和Y436F，其中胺基酸編號是根據EU索引。
[0155]在一些實施例中，所述多價結合蛋白是雙特異性抗原結合蛋白。在一些實施例中，所述多價結合蛋白的第一抗原結合結構域和第二抗原結合結構域結合不同抗原。在一些實施例中，多價結合蛋白是多特異性抗體或其抗原結合片段。
示例性串聯 Fab 結合蛋白 [0156]在一些實施例中，提供了結合蛋白（例如，多價結合蛋白），所述結合蛋白包含形成四個抗原結合結構域的四條多肽鏈，其中所述四條多肽鏈包括：
第一重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VH
1-CH1
1-L
1-VH
2-CH1
2[I]，
第一輕鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VL
1-CL
1-L
2-VL
2-CL
2[II]，
第二重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VH
3-CH1
3-L
3-VH
4-CH1
4[III]，
第二輕鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VL
3-CL
3-L
4-VL
4-CL
4[IV]
其中VL
1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；VL
2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域；VL
3是第三免疫球蛋白輕鏈可變結構域；VL
4是第四免疫球蛋白輕鏈可變結構域；CL
1是第一免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；CL
2是第二免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；CL
3是第三免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；CL
4是第四免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；VH
1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；VH
2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；VH
3是第三免疫球蛋白重鏈可變結構域；VH
4是第四免疫球蛋白重鏈可變結構域；CH1
1是第一免疫球蛋白重鏈恆定結構域；CH1
2是第二免疫球蛋白重鏈恆定結構域；CH1
3是第三免疫球蛋白重鏈恆定結構域；CH1
4是第四免疫球蛋白重鏈恆定結構域；並且L
1、L
2、L
3和L
4是胺基酸連接子；其中：
a) CL
1和CL
2各自包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
1和CL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL
3和VL
4各自包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
3和VL
4相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合；
b) CL
1和CL
2各自包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
1和CL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL
3包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
3相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且VL
4是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型輕鏈可變免疫球蛋白結構域；
c) CL
1和CL
2各自包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
1和CL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL
4包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
4相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且其中VL
3是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
d) CL
1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，CL
2是λ亞型免疫球蛋白輕鏈恆定結構域，並且VL
3和VL
4各自包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
3和VL
4相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合；
e) CL
1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，CL
2是λ亞型免疫球蛋白輕鏈恆定結構域，VL
3包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
3相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且VL
4是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
f) CL
1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，CL
2是λ亞型免疫球蛋白輕鏈恆定結構域，VL
4包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
4相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且其中VL
3是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
g) CL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，CL
1是λ亞型免疫球蛋白輕鏈恆定結構域，並且VL
3和VL
4各自包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
3和VL
4相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合；
h) CL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，CL
1是λ亞型免疫球蛋白輕鏈恆定結構域，VL
3包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
3相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且VL
4是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
i) CL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，CL
1是λ亞型免疫球蛋白輕鏈恆定結構域，VL
4包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
4相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且其中VL
3是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
並且其中VL
1和VH
1形成第一抗原結合結構域，VL
2和VH
2形成第二抗原結合結構域，VL
3和VH
3形成第三抗原結合結構域，並且VL
4和VH
4形成第四抗原結合結構域。在一些實施例中，L
1、L
2、L
3或L
4中的至少一個的長度獨立地是0個胺基酸。在一些實施例中，長度為0個胺基酸的連接子表明結合蛋白上不存在連接子。在一些實施例中，L
2和/或L
4不存在。在一些實施例中，L
1、L
2、L
3或L
4的長度各自獨立地是至少一個胺基酸。
[0157]在一些實施例中，提供了結合蛋白（例如，多價結合蛋白），所述結合蛋白包含形成四個抗原結合結構域的四條多肽鏈，其中所述四條多肽鏈包括：
第一重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VH
1-L
1-VH
2-L
2-CH1
1[I]，
第一輕鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VL
1-L
3-VL
2-L
4-CL
1[II]，
第二重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VH
3-L
5-VH
4-L
6-CH1
2[III]，
第二輕鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VL
3-L
7-VL
4-L
8-CL
2[IV]
其中VL
1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域，VL
2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域，VL
3是第三免疫球蛋白輕鏈可變結構域，VL
4是第四免疫球蛋白輕鏈可變結構域，CL
1是第一免疫球蛋白輕鏈恆定結構域，CL
2是第二免疫球蛋白輕鏈恆定結構域，VH
1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域，VH
2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域，VH
3是第三免疫球蛋白重鏈可變結構域，VH
4是第四免疫球蛋白重鏈可變結構域，CH1
1是第一免疫球蛋白CH1重鏈恆定結構域，CH1
2是第二免疫球蛋白CH1重鏈恆定結構域，並且L
1、L
2、L
3、L
4、L
5、L
6、L
7和L
8是胺基酸連接子；其中：
a) CL
1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL
3和VL
4各自包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
3和VL
4相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合；
b) CL
1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL
3包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
3相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且VL
4是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
c) CL
1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL
4包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
4相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且其中VL
3是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
d) CL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL
1和VL
2各自包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
1和VL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合；
e) CL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL
1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且VL
2是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
f) CL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且其中VL
1是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
並且其中VL
1和VH
1形成第一抗原結合結構域，VL
2和VH
2形成第二抗原結合結構域，VL
3和VH
3形成第三抗原結合結構域，並且VL
4和VH
4形成第四抗原結合結構域。在一些實施例中，L
1、L
2、L
3、L
4、L
5、L
6、L
7或L
8中的至少一個的長度獨立地是0個胺基酸。在一些實施例中，長度為0個胺基酸的連接子表明結合蛋白上不存在連接子。在一些實施例中，其中L
3、L
4、L
7或L
8中的至少一個是不存在的。在一些實施例中，L
1、L
2、L
3、L
4、L
5、L
6、L
7或L
8的長度各自獨立地是至少一個胺基酸。在一些實施例中，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的多特異性結合蛋白的CL
1或CL
2相比，所述多價結合蛋白的CL
1或CL
2與KappaSelect層析材料的結合減少了約90%。在一些實施例中，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的多價結合蛋白的VL
3和/或VL
4相比，所述多價結合蛋白的VL
3和/或VL
4與蛋白L層析材料的結合減少了約90%。在一些實施例中，所述多價結合蛋白的CL
1或CL
2中的所述一個或多個胺基酸取代在對應於109、110或199的位置處，其中編號是根據EU索引。在一些實施例中，CL
1或CL
2中的所述一個或多個胺基酸取代是T109A取代、V110D取代、Q199K取代、T109A-V110D取代或T109A-V110D-Q199K取代，其中胺基酸編號是根據EU索引。在一些實施例中，所述多價結合蛋白的CL
1中的所述一個或多個胺基酸取代在對應於109、198、199或202的位置處，其中編號是根據EU索引。在一些實施例中，CL
1中的所述一個或多個胺基酸取代是H198R取代、Q199W取代或T109A-S202R取代，其中胺基酸編號是根據EU索引。在一些實施例中，所述多價結合蛋白的VL
3和/或VL
4中的所述一個或多個胺基酸取代是架構胺基酸的取代。在一些實施例中，所述多價結合蛋白的VL
3和/或VL
4中的所述一個或多個胺基酸取代是在對應於12或18的位置處，其中編號是根據Kabat。在一些實施例中，VL
3或VL
4中的所述一個或多個胺基酸取代是S12P取代、R18P取代、R18Q取代、S12P-R18P取代或S12P-R18Q取代，其中編號是根據Kabat。
[0158]在一些實施例中，所述多價結合蛋白的第一重鏈多肽包含由下式表示的結構：
VH
1-CH1
1-L
1-VH
2-CH1
2-CH2-CH3 [Ia]，
並且所述第二重鏈多肽包含由下式表示的結構：
VH
3-CH1
3-L
3-VH
4-CH1
4-CH2-CH3 [IIIa]。
該實施例的例子示出於
圖 1J中。
[0159]在一些實施例中，所述多價結合肽的第一重鏈多肽包含由下式表示的結構：
VH
1-L
1-VH
2-L
2-CH1
1-CH2-CH3 [Ia]，
並且所述第二重鏈多肽包含由下式表示的結構：
VH
3-L
5-VH
4-L
6-CH1
2-CH2-CH3 [IIIa]。
該實施例的例子示出於
圖 1K。
[0160]在一些實施例中，所述多價結合蛋白的第一重鏈多肽的CH3結構域和/或第二重鏈多肽的CH3結構域是人類IgG1或IgG4 CH3結構域。在一些實施例中，所述第一重鏈多肽的CH3結構域包含對應於（例如，諸如相對於）人類IgG1的位置354和366的位置處的胺基酸取代，其中胺基酸編號是根據EU索引。參見例如，Spiess等人 (2013)
JBC, 288(37): P26583-26593。在一些實施例中，所述胺基酸取代是（或對應於）人類IgG1的S354C和T366W，其中胺基酸編號是根據EU索引。另外地或可替代地，在一些實施例中，所述第二重鏈多肽的CH3結構域包含對應於（例如，諸如相對於）人類IgG1的位置349、366、368、407、435和436的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引。在一些實施例中，所述胺基酸取代是（或對應於）Y349C、T366S、L368A和Y407V，其中胺基酸編號是根據EU索引。在一些實施例中，所述第一重鏈多肽的CH3結構域包含對應於（例如，諸如相對於）人類IgG1的位置349、366、368、407、435和436的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引。在一些實施例中，所述胺基酸取代是（或對應於）Y349C、T366S、L368A和Y407V，其中胺基酸編號是根據EU索引。另外地或可替代地，在一些實施例中，所述第二重鏈多肽的CH3結構域包含對應於（例如，諸如相對於）人類IgG1的位置354和366的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引。在一些實施例中，所述胺基酸取代是（或對應於）S354C和T366W，其中胺基酸編號是根據EU索引。
[0161]在一些實施例中，所述多價結合蛋白的第二重鏈多肽的CH3結構域包含（諸如進一步包含）減少與蛋白A的結合的一個或多個胺基酸取代。在一些實施例中，所述多價結合蛋白的第一重鏈多肽的CH3結構域包含（諸如進一步包含）減少與蛋白A的結合的一個或多個胺基酸取代。在一些實施例中，第一或第二重鏈多肽的CH3結構域中的減少與蛋白A層析材料的結合的所述一個或多個胺基酸取代對應於（例如，諸如相對於）人類IgG1的位置435和436的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引。在一些實施例中，所述胺基酸取代是（或對應於）H435R和Y436F，其中胺基酸編號是根據EU索引。
[0162]在一些實施例中，所述結合蛋白是四特異性的並且能夠特異性地結合四種不同的抗原標靶。
[0163]在一些實施例中，多價結合蛋白是多特異性抗體或其抗原結合片段。
包含融合蛋白的示例性多價結合蛋白 [0164]在一些實施例中，提供了結合蛋白（例如，多價結合蛋白），所述結合蛋白包含形成抗原結合結構域和標靶結合結構域的四條多肽鏈；其中所述四條多肽鏈包括：
第一多肽鏈（例如，第一重鏈多肽），其包含由下式表示的結構：
VH
1-CH1
1[I]，
第二多肽鏈（例如，第一輕鏈多肽），其包含由下式表示的結構：
VL
1-CL
1[II]，
第三多肽（例如，第二重鏈多肽），其包含由下式表示的結構：
融合多肽-L
1-CH1
2[III]，或
L
1-CH1
2[IIIa]
和第四多肽（例如，第二輕鏈多肽），其包含由下式表示的結構：
融合多肽-L
2- CL
2[IV]，或
L
2- CL
2[IVa]
其中VL
1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域，CL
1是第一免疫球蛋白輕鏈恆定結構域，CL
2是第二免疫球蛋白輕鏈恆定結構域，VH
1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域，CH1
1是第一CH1免疫球蛋白重鏈恆定結構域，CH1
2是第二CH1免疫球蛋白重鏈恆定結構域；並且L
1和L
2是胺基酸連接子；其中CL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL
1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合；並且其中VL
1和VH
1形成抗原結合結構域。在一些實施例中，所述結合蛋白（例如，多價結合蛋白）包含含有 [III] 的第三多肽和含有式 [IV] 的第四多肽。在一些實施例中，所述結合蛋白（例如，多價結合蛋白）包含含有 [IIIa] 的第三多肽和含有式 [IV] 的第四多肽。在一些實施例中，所述結合蛋白（例如，多價結合蛋白）包含含有 [III] 的第三多肽和含有式 [IVa] 的第四多肽。在一些實施例中，其中所述結合蛋白（例如，多價結合蛋白）包含含有 [III] 的第三多肽和含有式 [IV] 的第四多肽，每個融合多肽結合靶抗原。在一些實施例中，所述靶抗原是相同的。在一些實施例中，所述靶抗原是不同的。在一些實施例中，其中所述結合蛋白（例如，多價結合蛋白）包含含有 [III] 的第三多肽和含有式 [IV] 的第四多肽，所述融合多肽二聚化並且結合單一標靶。上述實施例的例子示出於
圖 1L中。在一些實施例中，L
1和/或L
2的長度獨立地是0個胺基酸。在一些實施例中，長度為0個胺基酸的連接子表明結合蛋白上不存在連接子。在一些實施例中，L
1和/或L
2的長度獨立地是至少一個胺基酸。
[0165]在一些實施例中，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的多價結合蛋白的CL
2的結合相比，所述多價結合蛋白的CL
2與KappaSelect層析材料的結合減少了約90%。在一些實施例中，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
1的結合相比，所述VL
1與蛋白L層析材料的結合減少了約90%。在一些實施例中，所述多價結合蛋白的CL
2中的所述一個或多個胺基酸取代在對應於109、110或199的位置處，其中編號是根據EU索引。在一些實施例中，CL
2中的所述一個或多個胺基酸取代是T109A取代、V110D取代、Q199K取代、T109A-V110D取代或T109A-V110D-Q199K取代，其中胺基酸編號是根據EU索引。在一些實施例中，所述多價結合蛋白的CL
2中的所述一個或多個胺基酸取代在對應於109、198、199或202的位置處，其中編號是根據EU索引。在一些實施例中，CL
2中的所述一個或多個胺基酸取代是H198R取代、Q199W取代或T109A-S202R取代，其中胺基酸編號是根據EU索引。在一些實施例中，所述多價結合蛋白的VL
1中的所述一個或多個胺基酸取代是架構胺基酸的取代。在一些實施例中，VL
1中的所述一個或多個胺基酸取代在對應於12或18的位置處，其中編號是根據Kabat。在一些實施例中，VL
1中的所述一個或多個胺基酸取代是S12P取代、R18P取代、R18Q取代、S12P-R18P取代或S12P-R18Q取代，其中編號是根據Kabat。
[0166]在一些實施例中，提供了結合蛋白（例如，多價結合蛋白），所述結合蛋白包含形成兩個抗原結合結構域和標靶結合結構域的四條多肽鏈；其中所述四條多肽鏈包括：
第一多肽鏈（例如，第一重鏈多肽），其包含由下式表示的結構：
VH
1-CH1
1-L
1-VH
2-CH1
2[I]，
第二多肽鏈（例如，第一輕鏈多肽），其包含由下式表示的結構：
VL
1-CL
1-L
2-VL
2-CL
2[II]，
第三多肽鏈（例如，第二重鏈多肽），其包含由下式表示的結構：
融合多肽-L
3-CH1
3[III]，
和第四多肽鏈（例如，第二輕鏈多肽），其包含由下式表示的結構：
CL
3[IVa]
其中：VL
1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域，VL
2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域，CL
1是第一免疫球蛋白輕鏈恆定結構域，CL
2是第二免疫球蛋白輕鏈恆定結構域，CL
3是第三免疫球蛋白輕鏈恆定結構域，VH
1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域，VH
2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域，CH1
1是第一免疫球蛋白重鏈恆定結構域，CH1
2是第二免疫球蛋白重鏈恆定結構域，CH1
3是第三免疫球蛋白重鏈恆定結構域，並且L
1、L
2和L
3是胺基酸連接子；其中：
a) CL
3包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
3相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL
1和VL
2各自包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
1和VL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，
b) CL
3包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
3相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL
1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且VL
2是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域；或
c) CL
3包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
3相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且VL
1是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域；並且
其中VL
1和VH
1形成第一抗原結合結構域並且VL
2和VH
2形成第二抗原結合結構域。
[0167]在一些實施例中，提供了結合蛋白（例如，多價結合蛋白），所述結合蛋白包含形成兩個抗原結合結構域和標靶結合結構域的四條多肽鏈；其中所述四條多肽鏈包括：
第一多肽鏈（例如，第一重鏈多肽），其包含由下式表示的結構：
VH
1-CH1
1-L
1-VH
2-CH1
2[I]，
第二多肽鏈（例如，第一輕鏈多肽），其包含由下式表示的結構：
VL
1-CL
1-L
2-VL
2-CL
2[II]，
第三多肽鏈（例如，第二重鏈多肽），其包含由下式表示的結構：
CH1
3[IIIa]，
和第四多肽鏈（例如，第二輕鏈多肽），其包含由下式表示的結構：
融合多肽-L
3-CL
3[IVb]
其中：VL
1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域，VL
2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域，CL
1是第一免疫球蛋白輕鏈恆定結構域，CL
2是第二免疫球蛋白輕鏈恆定結構域，CL
3是第三免疫球蛋白輕鏈恆定結構域，VH
1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域，VH
2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域，CH1
1是第一免疫球蛋白重鏈恆定結構域，CH1
2是第二免疫球蛋白重鏈恆定結構域，CH1
3是第三免疫球蛋白重鏈恆定結構域，並且L
1、L
2和L
3是胺基酸連接子；其中：
a) CL
3包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
3相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL
1和VL
2各自包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
1和VL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，
b) CL
3包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
3相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL
1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且VL
2是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域；或
c) CL
3包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
3相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且VL
1是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域；並且
其中VL
1和VH
1形成第一抗原結合結構域並且VL
2和VH
2形成第二抗原結合結構域。
[0168]在一些實施例中，L
1、L
2或L
3中的至少一個的長度各自獨立地是0個胺基酸。在一些實施例中，長度為0個胺基酸的連接子表明結合蛋白上不存在連接子。在一些實施例中，L
1、L
2或L
3的長度各自獨立地是至少一個胺基酸。在一些實施例中，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的多價結合蛋白的CL
3的結合相比，所述多價結合蛋白的CL
3與KappaSelect層析材料的結合減少了約90%。在一些實施例中，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
1或VL
2的結合相比，所述VL
1和/或所述VL
2與蛋白L層析材料的結合減少了約90%。在一些實施例中，所述多價結合蛋白的CL
3中的所述一個或多個胺基酸取代在對應於109、110或199的位置處，其中編號是根據EU索引。在一些實施例中，CL
3中的所述一個或多個胺基酸取代是T109A取代、V110D取代、Q199K取代、T109A-V110D取代或T109A-V110D-Q199K取代，其中編號是根據EU索引。在一些實施例中，所述多價結合蛋白的CL
3中的所述一個或多個胺基酸取代在對應於109、198、199或202的位置處，其中編號是根據EU索引。在一些實施例中，CL
3中的所述一個或多個胺基酸取代是H198R取代、Q199W取代或T109A-S202R取代，其中胺基酸編號是根據EU索引。在一些實施例中，所述多價結合蛋白的VL
1和/或VL
2中的所述一個或多個胺基酸取代是架構胺基酸的取代。在一些實施例中，VL
1和/或VL
2中的所述一個或多個胺基酸取代在對應於12或18的位置處，其中編號是根據Kabat。在一些實施例中，VL
1和/或VL
2中的所述一個或多個胺基酸取代是S12P取代、R18P取代、R18Q取代、S12P-R18P取代或S12P-R18Q取代，其中編號是根據Kabat。
[0169]在一些實施例中，提供了結合蛋白（例如，多價結合蛋白），所述結合蛋白包含形成兩個抗原結合結構域和標靶結合結構域的四條多肽鏈；其中所述四條多肽鏈包括：
第一多肽鏈（例如，第一重鏈多肽），其包含由下式表示的結構：
VH
1-CH1
1-L
1-VH
2-CH1
2[I]，
第二多肽鏈（例如，第一輕鏈多肽），其包含由下式表示的結構：
VL
1-CL
1-L
2-VL
2-CL
2[II]，
第三多肽鏈（例如，第二重鏈多肽），其包含由下式表示的結構：
融合多肽-L
3-CH1
3[III]，
和第四多肽鏈（例如，第二輕鏈多肽），其包含由下式表示的結構：
融合多肽-L
4-CL
3[IV]
其中：VL
1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；VL
2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域；CL
1是第一免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；CL
2是第二免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；CL
3是第三免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；VH
1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；VH
2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；CH1
1是第一免疫球蛋白重鏈恆定結構域；CH1
2是第二免疫球蛋白重鏈恆定結構域；CH1
3是第三免疫球蛋白重鏈恆定結構域，並且L
1、L
2、L
3和L
4是胺基酸連接子；其中：
a) CL
3包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
3相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL
1和VL
2各自包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
1和VL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，
b) CL
3包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
3相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL
1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且VL
2是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域；或
c) CL
3包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL
3相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL
2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL
2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且VL
1是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域；並且
其中VL
1和VH
1形成第一抗原結合結構域並且VL
2和VH
2形成第二抗原結合結構域。在一些實施例中，每個融合多肽結合靶抗原。在一些實施例中，所述靶抗原是相同的。在一些實施例中，所述靶抗原是不同的。在一些實施例中，所述融合多肽二聚化並且結合單一標靶。上述實施例的例子示出於
圖 1M中。
[0170]在一些實施例中，所述多價結合蛋白的第一重鏈多肽包含第一CH2免疫球蛋白重鏈恆定結構域和第一CH3免疫球蛋白重鏈恆定結構域，並且所述多價結合蛋白的第二重鏈多肽包含第二CH2免疫球蛋白重鏈恆定結構域和第二CH3免疫球蛋白重鏈恆定結構域。在一些實施例中，第一CH3結構域和/或CH3結構域是人類IgG1或IgG4 CH3結構域。在一些實施例中，第一CH3結構域包含對應於（例如，相對於）人類IgG1的位置354和366的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引。在一些實施例中，所述胺基酸取代是（或對應於）S354C和T366W，其中胺基酸編號是根據EU索引。另外地或可替代地，在一些實施例中，第二CH3結構域包含對應於（例如，相對於）人類IgG1的位置349、366、368、407、435和436的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引，其中所述胺基酸取代是（或對應於）Y349C、T366S、L368A和Y407V，其中胺基酸編號是根據EU索引。
[0171]在一些實施例中，所述多價結合蛋白的第二CH3結構域包含（諸如進一步包含）減少與蛋白A的結合的一個或多個胺基酸取代。在一些實施例中，所述多價結合蛋白的第一重鏈多肽的CH3包含（諸如進一步包含）減少與蛋白A的結合的一個或多個胺基酸取代。在一些實施例中，減少與蛋白A層析材料的結合的所述一個或多個胺基酸取代是對應於（例如，諸如相對於）人類IgG1的位置435和436的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引。在一些實施例中，所述胺基酸取代是（或對應於）H435R和Y436F，其中胺基酸編號是根據EU索引。在一些實施例中，多價結合蛋白是多特異性抗體或其抗原結合片段。
連接子 [0172]合適的連接子的例子包括單甘胺酸（Gly）殘基；雙甘胺肽（Gly-Gly）；三肽（Gly-Gly-Gly）；具有四個甘胺酸殘基的肽（Gly-Gly-Gly-Gly（SEQ ID NO: 1））；具有五個甘胺酸殘基的肽（Gly-Gly-Gly-Gly-Gly（SEQ ID NO: 2））；具有六個甘胺酸殘基的肽（Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly（SEQ ID NO: 3））；具有七個甘胺酸殘基的肽（Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly（SEQ ID NO: 4））；具有八個甘胺酸殘基的肽（Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly（SEQ ID NO: 5））。可以使用其他胺基酸殘基組合，諸如肽Gly-Gly-Gly-Gly-Ser（SEQ ID NO: 6）、肽Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser（SEQ ID NO: 7）、肽Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser（SEQ ID NO: 8）和肽Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly（SEQ ID NO: 6）。在一些實施例中，所述連接子是或包含(GGGGS)
n，例如，(SEQ ID NO:6)
n（其中n是介於0與5之間的整數），例如，GGGGSGGGGS（SEQ ID NO: 9）、GGGGSGGGGSGGGGS（SEQ IS NO: 10）等。在一些實施例中，所述連接子是或包含S、RT、TKGPS（SEQ ID NO: 11）、GQPKAAP（SEQ ID NO: 12）或GGSGSSGSGG（SEQ ID NO: 13）。其他合適的連接子包括單一Ser殘基或單一Val殘基；二肽Arg-Thr、Gln-Pro、Ser-Ser、Thr-Lys和Ser-Leu；Thr-Lys-Gly-Pro-Ser（SEQ ID NO: 13）；Thr-Val-Ala-Ala-Pro（SEQ ID NO: 14）；Gln-Pro-Lys-Ala-Ala（SEQ ID NO: 15）；Gln-Arg-Ile-Glu-Gly（SEQ ID NO: 16）；Ala-Ser-Thr-Lys-Gly-Pro-Ser（SEQ ID NO: 17）；Arg-Thr-Val-Ala-Ala-Pro-Ser（SEQ ID NO: 18）；Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro（SEQ ID NO: 19）；Asp-Lys-Thr-His-Thr（SEQ ID NO: 20）；Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro（SEQ ID NO: 21）；Thr-Lys-Gly-Pro-Ser-Arg（SEQ ID NO: 22）；和His-Ile-Asp-Ser-Pro-Asn-Lys（SEQ ID NO: 23）。上文列出的例子不旨在以任何方式限制本公開文本的範圍，並且已經顯示包含選自以下的隨機選擇的胺基酸的連接子在結合蛋白中是合適的：纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、離胺酸、精胺酸、組胺酸、天門冬胺酸、麩胺酸、天門冬醯胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸和脯胺酸。對於連接子序列的另外描述，參見例如，WO 2012135345。
[0173]連接子中胺基酸殘基的身份和序列可以根據連接子中需要實現的一種或多種二級結構元件的類型而變化。例如，甘胺酸、絲胺酸和丙胺酸對於具有最大柔性的連接子是最佳的。如果需要剛性更強且延長的連接子，則可使用甘胺酸、脯胺酸、蘇胺酸和絲胺酸的一些組合。根據所希望的特性，必要時可以將任何胺基酸殘基與其他胺基酸殘基的組合視為連接子，以構築較大肽連接子。
[0174]在一些實施例中，本文公開的多價結合蛋白的連接子包含衍生自天然存在的序列的序列，所述天然存在的序列位於抗體可變結構域與抗體恆定結構域之間的接合處（例如，如WO2012/135345中所述）。例如，在一些實施例中，連接子包含在內源V
H與C
H1結構域之間或在內源V
L與C
L結構域（例如，κ或λ）之間的過渡處發現的序列。在一些實施例中，連接子包含在內源人類V
H與C
H1結構域之間或在內源人類V
L與C
L結構域（例如，人類κ或λ）之間的過渡處發現的序列。
Fc 區和恆定結構域 [0175]在一些實施例中，本公開文本的多價結合蛋白包含一個或多個Fc變體。在一些例子中，如本文所用的術語「Fc變體」是指從天然Fc修飾但仍包含補救受體FcRn（新生Fc受體）的結合位點的分子或序列。示例性Fc變體及其與補救受體的相互作用是本領域中已知的。因此，術語「Fc變體」可以包括從非人類天然Fc人類源化的分子或序列。在一些例子中，天然Fc包含可以去除的區域，因為它們提供的結構特徵或生物活性是本發明的抗體樣結合蛋白不需要的。因此，術語「Fc變體」包含缺乏一個或多個天然Fc位點或殘基或者其中一個或多個Fc位點或殘基已被修飾的分子或序列，所述分子或序列影響或參與：(1) 雙硫鍵的形成，(2) 與選定的宿主細胞不相容，(3) 在選定的宿主細胞中表現後的N末端異質性，(4) 糖基化，(5) 與補體的相互作用，(6) 與除補救受體外的Fc受體結合，或 (7) 抗體依賴性細胞毒性（ADCC）。
[0176]為了提高結合蛋白的產量，可以透過「杵臼結構」技術改變C
H3結構域，所述「杵臼結構」技術詳細描述於例如以下幾個例子中：國際公開號WO 96/027011，Ridgway等人, 1996,
Protein Eng. 9: 617-21；和Merchant等人, 1998,
Nat. Biotechnol. 16: 677-81。具體地，改變兩個C
H3結構域的相互作用表面以增加含有這兩個C
H3結構域的兩條重鏈的異二聚化。（兩條重鏈的）兩個C
H3結構域中的每一個可以是「杵」，而另一個是「臼」。二硫橋的引入進一步穩定異二聚體（Merchant等人, 1998；Atwell等人, 1997,
J. Mol. Biol. 270: 26-35）並且增加產率。在特定實施例中，杵位於具有單一可變結構域的第二對多肽上。在其他實施例中，杵位於具有交叉取向的第一對多肽上。在又其他實施例中，C
H3結構域不包括臼中的杵。在一些實施例中，第一重鏈多肽的CH3結構域包含對應於（例如，相對於）人類IgG1的位置354和366的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引。參見例如，Spiess等人 (2013)
JBC, 288(37): P26583-26593。在一些實施例中，所述胺基酸取代是（或對應於）S354C和T366W（即，杵取代），其中胺基酸編號是根據EU索引。另外地或可替代地，在一些實施例中，所述第二重鏈多肽的CH3結構域包含對應於（例如，相對於）人類IgG1的位置349、366、368、407、435和436的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引。在一些實施例中，所述胺基酸取代是（或對應於）Y349C、T366S、L368A和Y407V（即，臼取代），其中胺基酸編號是根據EU索引。
[0177]在一些實施例中，本公開文本的結合蛋白包含一個或多個突變以提高血清半衰期（參見例如，Hinton, P.R.等人 (2006) J. Immunol. 176(1):346-56）。在一些實施例中，突變包含對應於（例如，諸如相對於）人類IgG1的位置428和434的位置處的取代，其中編號是根據EU索引，其中所述胺基酸取代是（或對應於）M428L和N434S，其中胺基酸編號是根據EU索引。
[0178]在一些實施例中，本公開文本的結合蛋白包含一個或多個突變以例如透過調節對層析材料的親和力來改善純化。例如，已知如果異二聚體形式的兩個Fc區域中的一個含有降低或消除與蛋白A的結合的一個或多個突變，則可以將異二聚體結合蛋白從其同二聚體形式選擇性地純化出來，因為與任一同二聚體形式相比，異二聚體形式將具有對基於蛋白A的純化的中間親和力並且可以例如透過使用不同pH從蛋白A選擇性地洗脫（參見例如，Smith, E.J.等人 (2015)
Sci. Rep.5:17943）。在一些實施例中，突變包含對應於（例如，諸如相對於）人類IgG1的位置435和436的位置處的取代，其中編號是根據EU索引，其中所述胺基酸取代是（或對應於）H435R和Y436F，其中胺基酸編號是根據EU索引。
[0179]在一些實施例中，本公開文本的多價結合蛋白包含一個或多個突變以降低效應子功能，例如，Fc受體介導的抗體依賴性細胞吞噬作用（ADCP）、補體依賴性細胞毒性（CDC）和/或抗體依賴性細胞毒性（ADCC）。在一些實施例中，所述突變包含對應於（例如，相對於）人類IgG1的位置234、235和/或239的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引。在一些實施例中，所述胺基酸取代是（或對應於）L234A、L235A和/或P329A，其中胺基酸編號是根據EU索引。
[0180]在一些實施例中，上述突變的類型可以以任何順序或組合來組合。例如，本公開文本的結合蛋白可以包含上述的兩個或更多個「杵」和「臼」突變、用於提高血清半衰期的一個或多個突變、用於改善IgG4穩定性的一個或多個突變、用於改善純化的一個或多個突變和/或用於降低效應子功能的一個或多個突變。
純化多價結合蛋白的方法 示例性層析材料 蛋白 A [0181]葡萄球菌蛋白A（SPA或「蛋白A」）是首次發現的免疫球蛋白結合分子之一並且在過去幾十年裡被廣泛研究。由於其對免疫球蛋白的親和力，已發現蛋白A被廣泛用作檢測和純化抗體、抗體構築體和含Fc的融合蛋白的工具。由五個免疫球蛋白結合結構域構成，其中每個都能夠結合來自許多哺乳動物物種的蛋白質，最值得注意的是通過Fc區內的重鏈結合免疫球蛋白G（IgG）。儘管天然形式的蛋白A被用作第一代蛋白A樹脂的配體，但在大腸桿菌（E. coli）中產生的重組形式（rProtein A）是現今最盛行的。可商購的蛋白A層析材料包括但不限於下文詳述的那些。
KappaSelect [0182]KappaSelect是與κ輕鏈的恆定區（LC）特異性結合的親和層析材料。KappaSelect配體包含不依賴VL序列的與所有人類Cκ-LC以高親和力結合的駱駝單可變重鏈（HC）Ig（VHH）結構域。KappaSelect配體主要與Cκ中的殘基相互作用並且在一定程度上與Vκ-Cκ鉸鏈區中的殘基相互作用。可商購的KappaSelect層析材料包括但不限於下文詳述的那些。
蛋白 L [0183]蛋白L是細菌大消化鏈球菌（
Peptostreptococcus magnus）的細胞壁蛋白（Björck 等人 (1988) 「Novel Bacterial-Cell Wall Protein with Affinity for Ig L-Chains.」
J. Immunol.140: 1194-1197），所述細胞壁蛋白與κ輕鏈的可變區結合，而不干擾抗體或抗體構築體（例如，本文所述的多價結合蛋白）的抗原結合位點（Nilson等人 (1992) 「Protein L from Peptostreptococcus magnus binds to the kappa light chain variable domain.」
J Biol Chem.267: 2234-2239）。蛋白L與κ輕鏈的V區中的FW1相互作用，並且其結合局限於κ1、κ3和κ4亞型的VL。可商購的蛋白L層析材料包括但不限於下文詳述的那些。
示例性兩步純化方法 [0184]本文提供了一種純化本文所述的多價結合蛋白的方法，所述方法包括 (a) 使包含所述多價結合蛋白的組成物以結合和洗脫模式經受蛋白L層析，以產生蛋白L洗出液，以及 (b) 使所述蛋白L洗出液以結合和洗脫層析經受KappaSelect層析，以產生KappaSelect洗出液，其中所述KappaSelect洗出液包含所述多價結合蛋白並且基本上不含錯配多肽。例如，在一些實施例中，使所述多價結合蛋白在適合於從不期望的蛋白質種類中分離出所述結合蛋白的條件下與蛋白L接觸，所述多價結合蛋白包含含有一個或多個胺基酸取代的0或2個VL結構域，所述一個或多個胺基酸取代減少所述VL與蛋白L層析材料的結合（例如，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL結構域相比）。然後使由此產生的蛋白L洗出液在適合於從不期望的蛋白質種類中分離出所述結合蛋白的條件下與KappaSelect層析材料接觸，所述結合蛋白包含含有一個或多個胺基酸取代的0或2個CL結構域，所述一個或多個胺基酸取代減少所述CL與KappaSelect層析材料的結合（例如，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL結構域相比）。還提供了一種純化本文公開的多價結合蛋白的方法，所述方法包括 (a) 使包含所述多價結合蛋白和錯配抗體的組成物以結合和洗脫模式經受KappaSelect層析，以產生KappaSelect洗出液，以及 (b) 使所述KappaSelect洗出液以結合和洗脫模式經受蛋白L層析，以產生蛋白L洗出液，其中所述蛋白L洗出液包含所述多價結合蛋白並且基本上不含錯配多肽。
[0185]適合於以結合和洗脫模式使用蛋白L和KappaSelect層析材料的條件在本領域中是已知的。在一些實施例中，將蛋白L和/或KappaSelect例如作為層析材料的一部分附接到基質或樹脂。在一些實施例中，蛋白L層析是Pierce™蛋白L層析管柱、Capto™ L層析、HiTrap
®蛋白L層析、TOYOPEARL® AF-rProtein L-650F層析或KanCap™ L層析。另外地或可替代地，在任何本文公開的純化方法的一些實施例中，KappaSelect層析是HiTrap™ KappaSelect或CaptureSelect™ Kappa XL層析。
[0186]KappaSelect洗出液包含所述多價結合蛋白並且基本上不含錯配多肽。在一些實施例中，KappaSelect洗出液中的多價結合蛋白的純度是至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中的任一個，包括在這些值之間的任何範圍。在一些實施例中，KappaSelect洗出液中的多價結合蛋白的純度大於約99%。在一些實施例中，KappaSelect洗出液中少於約15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%中的任一個的多價結合多肽是錯配多肽。在一些實施例中，KappaSelect洗出液中少於約1%的多價結合蛋白是錯配多肽。
示例性三步純化方法 [0187]本文提供了一種純化本文所述的多價結合蛋白的方法，所述方法包括 (a) 使包含所述多價結合蛋白的組成物以結合和洗脫模式經受蛋白A層析，以產生蛋白A洗出液，(b) 使所述蛋白A洗出液以結合和洗脫模式經受蛋白L層析，以產生蛋白L洗出液，以及 (c) 使所述蛋白L洗出液以結合和洗脫模式經受KappaSelect層析，以產生KappaSelect洗出液，其中所述KappaSelect洗出液包含所述多價結合蛋白並且基本上不含錯配多肽。例如，在一些實施例中，使所述多價結合蛋白與蛋白A在用於從不期望的蛋白質種類中分離出所述結合蛋白的條件下與蛋白A接觸，所述多價結合蛋白包含2個CH3結構域，所述2個CH3結構域各自包含Y349C、T366S、L368A和Y407V取代（相對於人類IgG1），其中胺基酸編號是根據EU索引，並且其中。在一些實施例中，使所述多價結合蛋白在用於從不期望的蛋白質種類中分離出所述結合蛋白的條件下與蛋白A接觸，所述多價結合蛋白包含2個CH3結構域，所述2個CH3結構域各自包含H435R和Y436F取代（相對於人類IgG1），其中胺基酸編號是根據EU索引。在一些實施例中，使所述多價結合蛋白在用於從不期望的蛋白質種類中分離出所述結合蛋白的條件下與蛋白A接觸，所述多價結合蛋白包含2個CH3結構域，所述2個CH3結構域各自包含Y349C、T366S、L368A和Y407V取代以及H435R和Y436F取代（相對於人類IgG1），其中胺基酸編號是根據EU索引。在一些實施例中，所述多價結合蛋白的第二CH3結構域包含（諸如進一步包含）減少與蛋白A的結合的一個或多個胺基酸取代。在一些實施例中，所述多價結合蛋白的第一重鏈多肽的CH3包含（諸如進一步包含）減少與蛋白A的結合的一個或多個胺基酸取代。在一些實施例中，減少與蛋白A層析材料的結合的所述一個或多個胺基酸取代是（或對應於）對應於人類IgG1的位置435和436的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引。在一些實施例中，所述胺基酸取代是（或對應於）H435R和Y436F，其中胺基酸編號是根據EU索引。在一些實施例中，多價結合蛋白是多特異性抗體或其抗原結合片段。
[0188]然後使所述蛋白A洗出液在適合於從不期望的蛋白質種類中分離出所述結合蛋白的條件下與蛋白L接觸，所述多價結合蛋白包含含有一個或多個胺基酸取代的0或2個VL結構域，所述一個或多個胺基酸取代減少所述VL與蛋白L層析材料的結合（例如，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL結構域相比）。然後使蛋白L洗出液在適合於從不期望的蛋白質種類中分離出所述結合蛋白的條件下與KappaSelect層析材料接觸，所述結合蛋白包含含有一個或多個胺基酸取代的0或2個CL結構域，所述一個或多個胺基酸取代減少所述CL與KappaSelect層析材料的結合（例如，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL結構域相比）。還提供了一種純化本文所述的多價結合蛋白的方法，所述方法包括 (a) 使包含所述多價結合蛋白的組成物以結合和洗脫模式經受蛋白A層析，以產生蛋白A洗出液，(b) 使所述蛋白A洗出液以結合和洗脫模式經受KappaSelect層析，以產生KappaSelect洗出液，以及 (c) 使所述蛋白KappaSelect洗出液以結合和洗脫模式經受蛋白L層析，以產生蛋白L洗出液，其中所述L洗出液包含所述多價結合蛋白並且基本上不含錯配多肽。
[0189]適合於以結合和洗脫模式使用蛋白A、蛋白L和KappaSelect層析材料的條件是本領域中已知的。在一些實施例中，將蛋白A、蛋白L和／或KappaSelect配體例如作為層析材料的一部分附接到基質或樹脂。在任何本文公開的純化方法的一些實施例中，蛋白A層析是MabSelect™、MabSelect SuRe™、MabSelect SuRe™ LX、MabSelect PrismA、ProSep®-vA、ProSep® Ultra Plus、蛋白A Sepharose® Fast Flow或Toyopearl® AF-rProtein A層析。在一些實施例中，蛋白L層析是Pierce™蛋白L層析管柱、Capto™ L層析、HiTrap
®蛋白L層析、TOYOPEARL® AF-rProtein L-650F層析或KanCap™ L層析。另外地或可替代地，在任何本文公開的純化方法的一些實施例中，KappaSelect層析是HiTrap™ KappaSelect或CaptureSelect™ Kappa XL層析。
[0190]KappaSelect洗出液包含所述多價結合蛋白並且基本上不含錯配多肽。在一些實施例中，KappaSelect洗出液中的多價結合蛋白的純度是至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中的任一個，包括在這些值之間的任何範圍。在一些實施例中，KappaSelect洗出液中的多價結合蛋白的純度大於約99%。在一些實施例中，KappaSelect洗出液中少於約15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%中的任一個的多價結合多肽是錯配多肽。在一些實施例中，KappaSelect洗出液中少於約1%的多價結合蛋白是錯配多肽。
[0191]在任何本文公開的純化方法的一些實施例中，包含所述多價結合蛋白的組成物源自工程化以產生多特異性結合蛋白的宿主細胞。在一些實施例中，包含所述多價結合蛋白的組成物是宿主細胞培養物上清液。在一些實施例中，包含所述多價結合蛋白的組成物包含錯配多肽。在一些實施例中，將包含所述多價結合蛋白的組成物在層析（例如，第一個層析步驟）之前過濾。在一些實施例中，本文公開的純化方法進一步包括在KappaSelect層析或蛋白L層析後的精製步驟。在一些實施例中，所述精製步驟是尺寸排阻層析。
[0192]在任何本文公開的純化方法的一些實施例中，將包含所述多價結合蛋白的組成物與醫藥上可接受的載劑組合。在本文中其他地方進一步詳細描述示例性醫藥上可接受的載劑和賦形劑。
產生具有與 KappaSelect 和 / 或蛋白 L 層析材料的減少的結合的多價結合蛋白的方法 核酸和載體 [0193]還考慮了編碼本文所述的多價結合蛋白的核酸分子。在一些實施例中，提供了一種編碼本文所述的多價結合蛋白的核酸（或一組核酸）。使用標準重組DNA方法構築編碼形成結合蛋白的多肽的多核苷酸，將這些多核苷酸摻入重組表現載體中，並且將此類載體引入宿主細胞中。參見例如，Sambrook等人, 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第3版)。可以根據製造商的說明書來進行酶反應和純化技術，如本領域通常所實現的或如本文所述。除非提供具體定義，否則關於本文所述的分析化學、合成有機化學以及醫學和藥物化學使用的術語以及本文所述的分析化學、合成有機化學以及醫學和藥物化學的實驗室程序和技術是本領域中熟知且常用的那些。類似地，常規技術可以用於化學合成、化學分析、藥物製備、調配、遞送和患者的治療。
[0194]本公開文本的其他方面涉及分離的核酸分子，其包含編碼本文所述的任何結合蛋白（例如，多價結合蛋白）的核苷酸序列。在一些實施例中，分離的核酸可操作地連接至異源啟動子，以指導編碼結合蛋白的核酸序列的轉錄。啟動子可以是指引導核酸的轉錄的核酸控制序列。在第一核酸序列被放置成與第二核酸序列具有功能關係時，第一核酸序列可操作地連接至第二核酸序列。例如，如果啟動子影響編碼序列的轉錄或表現，則所述啟動子可操作地連接至結合蛋白的編碼序列。啟動子的例子可以包括但不限於從病毒（諸如多瘤病毒、雞痘病毒、腺病毒（諸如腺病毒2）、牛乳頭狀瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細胞病毒、反轉錄病毒、B型肝炎病毒、猿猴病毒40（SV40）等）的基因體獲得的啟動子、異源真核啟動子（諸如肌動蛋白啟動子、免疫球蛋白啟動子、熱休克啟動子等）、CAG啟動子（Niwa等人, Gene 108(2):193-9, 1991）、磷酸甘油酸激酶（PGK）啟動子、四環素誘導型啟動子（Masui等人, Nucleic Acids Res. 33:e43, 2005）、lac系統、trp系統、tac系統、trc系統、噬菌體λ的主要操縱子和啟動子區域、3-磷酸甘油酸激酶的啟動子、酵母酸性磷酸酶的啟動子和酵母α交配因子的啟動子。編碼本公開文本的結合蛋白的多核苷酸可以處於以下啟動子的控制下：組成型啟動子、誘導型啟動子、或本文所述的任何其他合適的啟動子、或本領域具有通常知識者將易於識別的其他合適的啟動子。
[0195]在一些實施例中，將所述分離的核酸摻入載體中。在一些實施例中，所述載體是表現載體。表現載體可以包括與要表現的多核苷酸可操作地連接的一個或多個調節序列。術語「調節序列」包括啟動子、增強子和其他表現控制元件（例如，多腺苷酸化信號）。合適的增強子的例子可以包括但不限於來自哺乳動物基因的增強子序列（諸如球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白、胰島素等）、和來自真核細胞病毒的增強子序列（諸如複製起點的後側上的SV40增強子（bp 100-270）、巨細胞病毒早期啟動子增強子、複製起點的後側上的多瘤病毒增強子、腺病毒增強子等）。合適的載體的例子可以包括例如質體、黏質體、附加體（episome）、轉位子和病毒載體（例如，腺病毒、牛痘病毒、辛德畢斯病毒（Sindbis-viral）、麻疹、皰疹病毒、慢病毒、反轉錄病毒、腺相關病毒載體等）。表現載體可以用於轉染宿主細胞，例如像細菌細胞、酵母細胞、昆蟲細胞和哺乳動物細胞。能夠在宿主體內表現並複製的生物功能病毒和質體DNA載體是本領域中已知的，並且可以用於轉染任何目的細胞。
[0196]本公開文本的其他方面涉及載體系統，所述載體系統包含編碼本文所述的任何結合蛋白的第一多肽鏈、第二多肽鏈、第三多肽鏈和第四多肽鏈的一種或多種載體。在一些實施例中，載體系統包括編碼結合蛋白的第一多肽鏈的第一載體、編碼結合蛋白的第二多肽鏈的第二載體、編碼結合蛋白的第三多肽鏈的第三載體和編碼結合蛋白的第四多肽鏈的第四載體。在一些實施例中，載體系統包括編碼結合蛋白的第一和第二多肽鏈的第一載體和編碼結合蛋白的第三和第四多肽鏈的第二載體。在一些實施例中，載體系統包括編碼結合蛋白的第一和第三多肽鏈的第一載體和編碼結合蛋白的第二和第四多肽鏈的第二載體。在一些實施例中，載體系統包括編碼結合蛋白的第一和第四多肽鏈的第一載體和編碼結合蛋白的第二和第三多肽鏈的第二載體。在一些實施例中，載體系統包含編碼結合蛋白的第一、第二、第三和第四多肽鏈的第一載體。載體系統的所述一種或多種載體可以是本文所述的任何載體。在一些實施例中，所述一種或多種載體是表現載體。
分離的宿主細胞 [0197]本公開文本的其他方面涉及一種包含一種或多種本文所述的分離的多核苷酸、載體和/或載體系統的分離的宿主細胞。在一些實施例中，宿主細胞是細菌細胞（例如，大腸桿菌細胞）。在一些實施例中，宿主細胞是酵母細胞（例如，釀酒酵母（
S. cerevisiae）細胞）。在一些實施例中，宿主細胞是昆蟲細胞。昆蟲宿主細胞的例子可以包括例如果蠅屬（Drosophila）細胞（例如，S2細胞）、粉紋夜蛾（Trichoplusia ni）細胞（例如，High Five™細胞）和草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）細胞（例如，Sf21或Sf9細胞）。在一些實施例中，宿主細胞是哺乳動物細胞。哺乳動物宿主細胞的例子可以包括例如人類胚腎細胞（例如，293細胞或亞選殖用於在懸浮培養物中生長的293細胞）、Expi293TM細胞、CHO細胞、幼倉鼠腎細胞（例如，BHK，ATCC CCL 10）、小鼠賽托立細胞（sertoli cell，例如，TM4細胞）、猴腎細胞（例如，CV1 ATCC CCL 70）、非洲綠猴腎細胞（例如，VERO-76，ATCC CRL-1587）、人類子宮頸癌細胞（例如，HELA，ATCC CCL 2）、犬腎細胞（例如，MDCK，ATCC CCL 34）、布法羅（buffalo）大鼠肝細胞（例如，BRL 3A，ATCC CRL 1442）、人類肺細胞（例如，W138，ATCC CCL 75）、人類肝細胞（例如，Hep G2，HB 8065）、小鼠乳房腫瘤細胞（例如，MMT 060562，ATCC CCL51）、TRI細胞、MRC 5細胞、FS4細胞、人類肝細胞瘤株（例如，Hep G2）和骨髓瘤細胞（例如，NS0和Sp2/0細胞）。
[0198]本公開文本的其他方面涉及產生本文所述的任何結合蛋白的方法。在一些實施例中，所述方法包括：a) 在使得宿主細胞表現結合蛋白的條件下培養包含分離的核酸、載體和/或載體系統（例如，本文所述的任何分離的核酸、載體和/或載體系統）的宿主細胞（例如，本文所述的任何宿主細胞）；以及b) 從所述宿主細胞分離結合蛋白。在表現蛋白質的條件下培養宿主細胞的方法是本領域具有通常知識者所熟知的。從培養的宿主細胞中分離本文所述的多價結合蛋白的方法對於本領域具有通常知識者是熟知的。在本文中的其他地方詳述了純化本文所述的多價結合蛋白的方法。
多價結合蛋白的示例性用途 [0199]多價結合蛋白可以用於任何已知的測定方法，諸如競爭性結合測定、直接和間接夾心式測定以及免疫沈澱測定，所述測定方法用於一種或多種靶抗原的檢測和定量。結合蛋白將以適合於所用測定方法的親和力結合所述一種或多種靶抗原。
[0200]對於診斷應用，在某些實施例中，可以用可檢測部分標記結合蛋白。可檢測部分可以是能夠直接或間接產生可檢測信號的任何部分。例如，可檢測部分可以是放射性同位素，諸如
3H、
14C、
32P、
35S、
125I、
99Tc、
111In或
67Ga；螢光或化學發光化合物，諸如異硫氰酸螢光素、羅丹明或螢光素；或者酶，諸如鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根過氧化物酶。
[0201]結合蛋白還可用於體內成像。可以將用可檢測部分標記的結合蛋白投予至動物，優選投予至血流中，並且測定宿主中經標記的抗體的存在和位置。可以用在動物中透過核磁共振、放射學或本領域已知的其他檢測手段可檢測的任何部分標記結合蛋白。
[0202]結合蛋白還可以用於細胞啟動、靶向腫瘤、細胞介素活性的中和、病毒感染的中和、多發性信號傳導事件的組合，以治療癌症、關節炎和/或炎性障礙。例如，在一些實施例中，結合蛋白與選自以下的一種、兩種或三種抗原標靶特異性結合：A2AR、APRIL、ATPDase、BAFF、BAFFR、BCMA、BlyS、BTK、BTLA、B7DC、B7H1、B7H4（也稱為VTCN1）、B7H5、B7H6、B7H7、B7RP1、B7-4、C3、C5、CCL2（也稱為MCP-1）、CCL3（也稱為MIP-1a）、CCL4（也稱為MIP-1b）、CCL5（也稱為RANTES）、CCL7（也稱為MCP-3）、CCL8（也稱為mcp-2）、CCL11（也稱為嗜酸性顆粒球趨化介素）、CCL15（也稱為MIP-1d）、CCL17（也稱為TARC）、CCL19（也稱為MIP-3b）、CCL20（也稱為MIP-3a）、CCL21（也稱為MIP-2）、CCL24（也稱為MPIF-2/嗜酸性顆粒球趨化介素-2）、CCL25（也稱為TECK）、CCL26（也稱為嗜酸性顆粒球趨化介素-3）、CCR3、CCR4、CD3、CD19、CD20、CD23（也稱為FCER2，IgE的受體）、CD24、CD27、CD28、CD38、CD39、CD40、CD70、CD80（也稱為B7-1）、CD86（也稱為B7-2）、CD122、CD137（也稱為41BB）、CD137L、CD152（也稱為CTLA4）、CD154（也稱為CD40L）、CD160、CD272、CD273（也稱為PDL2）、CD274（也稱為PDL1）、CD275（也稱為B7H2）、CD276（也稱為B7H3）、CD278（也稱為ICOS）、CD279（也稱為PD-1）、CDH1（也稱為E-鈣黏蛋白）、幾丁質酶、CLEC9、CLEC91、CRTH2、CSF-1（也稱為M-CSF）、CSF-2（也稱為GM-CSF）、CSF-3（也稱為GCSF）、CX3CL1（也稱為SCYD1）、CXCL12（也稱為SDF1）、CXCL13、CXCR3、DNGR-1、外核苷三磷酸二磷酸水解酶1、EGFR、ENTPD1、FCER1A、FCER1、FLAP、FOLH1、Gi24、GITR、GITRL、GM-CSF、Her2、HHLA2、HMGB1、HVEM、ICOSLG、IDO、IFNα、IgE、IGF1R、IL2Rβ、IL1、IL1A、IL1B、IL1F10、IL2、IL4、IL4Ra、IL5、IL5R、IL6、IL7、IL7Ra、IL8、IL9、IL9R、IL10、rhIL10、IL12、IL13、IL13Ra1、IL13Ra2、IL15、IL17、IL17Rb（也稱為IL25的受體）、IL18、IL22、IL23、IL25、IL27、IL33、IL35、ITGB4（也稱為b4整合素）、ITK、KIR、LAG3、LAMP1、瘦素、LPFS2、II類MHC、NCR3LG1、NKG2D、NTPD酶-1、OX40、OX40L、PD-1H、血小板受體、PROM1、S152、SISP1、SLC、SPG64、ST2（也稱為IL33的受體）、STEAP2、Syk激酶、TACI、TDO、T14、TIGIT、TIM3、TLR、TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、TMEF1、TNFa、TNFRSF7、Tp55、TREM1、TSLP（也稱為IL7Ra的共受體）、TSLPR、TWEAK、VEGF、VISTA、Vstm3、WUCAM和XCR1（也稱為GPR5/CCXCR1）。在一些實施例中，以上抗原標靶中的一種或多種是人類抗原標靶。
[0203]在一些實施例中，將本公開文本的結合蛋白投予於有需要的患者用於治療或預防癌症。例如，在一些實施例中，所述結合蛋白包含一種特異性結合T細胞表面蛋白的抗原結合位點，和另一種特異性結合腫瘤靶蛋白的抗原結合位點（例如，兩種特異性結合T細胞表面蛋白的抗原結合位點和一種特異性結合腫瘤靶蛋白的抗原結合位點，或者兩種特異性結合腫瘤靶蛋白的抗原結合位點和一種特異性結合T細胞表面蛋白的抗原結合位點）。在某些實施例中，所述結合蛋白包含特異性結合CD3的抗原結合位點、特異性結合CD28的抗原結合位點和特異性結合選自CD19、CD20、CD38、Her2和LAMP1的腫瘤靶蛋白的抗原結合位點。在一些實施例中，將所述結合蛋白與化療劑共投予。在一些實施例中，所述患者是人類。
[0204]在一些實施例中，將本公開文本的結合蛋白投予於有需要的患者用於治療或預防炎性疾病或障礙。在一些實施例中，所述結合蛋白包含三種抗原結合位點，其各自特異性結合選自IL-4、IL-13和TNFa的細胞介素靶蛋白。在一些實施例中，所述結合蛋白與抗炎劑共投予。在一些實施例中，所述患者是人類。
[0205]本公開文本還涉及套組，所述套組包含結合蛋白和可用於檢測生物樣品中的靶抗原水平的其他試劑。此類試劑可以包括可檢測標記、封閉血清、陽性和陰性對照樣品以及檢測試劑。在一些實施例中，所述套組包含組成物，所述組成物包含本文所述的任何結合蛋白、多核苷酸、載體、載體系統和/或宿主細胞。在一些實施例中，所述套組包含容器以及在所述容器上或與所述容器相連的標籤或藥品說明書。合適的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV輸液袋等。容器可以由諸如玻璃或塑膠等多種材料製成。容器容納本身或與另一種組成物組合地有效治療、預防和/或診斷病症的組成物，並且可以具有無菌進入口（例如，容器可以是靜脈輸液袋或具有可由皮下注射針刺穿的塞子的小瓶）。在一些實施例中，標籤或藥品說明書指示，所述組成物用於預防、診斷和/或治療所選病症。可替代地或另外地，所述製品或套組可以還包括第二（或第三）容器，所述第二（或第三）容器容納醫藥上可接受的緩衝液，諸如注射用抑菌水（BWFI）、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液（Ringer's solution）和右旋糖溶液。所述製品或套組可以進一步包括從商業和用戶角度所需的其他材料，包括其他緩衝液、稀釋劑、過濾器、針和注射器。
包含多價結合蛋白的治療性組成物及其投予 [0206]包含結合蛋白的治療或醫藥組成物在本公開文本的範圍內。此類治療或醫藥組成物可以包含與選擇的適合於投予方式的醫藥上或生理上可接受的調配劑混合的治療有效量的結合蛋白或結合蛋白-藥物偶聯物。
[0207]可接受的調配材料優選地在所用劑量和濃度下對接受者無毒。
[0208]醫藥組成物可以含有用於修改、維持或保持例如組成物的pH、容量滲透壓莫耳濃度、黏度、澄清度、顏色、等滲性、氣味、無菌度、穩定性、溶解或釋放速率、吸附或滲透的調配材料。合適的調配材料包括但不限於胺基酸（諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天門冬醯胺酸、精胺酸或離胺酸）、抗微生物劑、抗氧化劑（諸如抗壞血酸、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉）、緩衝液（諸如硼酸鹽、碳酸氫鹽、Tris-HCl、檸檬酸鹽、磷酸鹽或其他有機酸）、膨脹劑（諸如甘露糖醇或甘胺酸）、螯合劑（諸如乙二胺四乙酸（EDTA））、錯合劑（諸如咖啡因、聚乙烯吡咯啶酮、β-環糊精或羥丙基-β-環糊精）、填充劑、單糖、二糖和其他碳水化合物（諸如葡萄糖、甘露糖或糊精）、蛋白質（諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白）、著色劑、調味劑和稀釋劑、乳化劑、親水聚合物（諸如聚乙烯吡咯啶酮）、低分子量多肽、成鹽抗衡離子（諸如鈉）、防腐劑（諸如苯紮氯銨、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞、苯乙醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或過氧化氫）、溶劑（諸如丙三醇、丙二醇或聚乙二醇）、糖醇（諸如甘露醇或山梨糖醇）、懸浮劑、表面活性劑或潤濕劑（諸如泊洛沙姆（pluronics）；PEG；脫水山梨醇酯；聚山梨醇酯（諸如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80）；曲拉通（triton）；胺丁三醇；卵磷脂；膽固醇或泰洛沙泊（tyloxapal））、穩定性增強劑（諸如蔗糖或山梨醇）、張力調節劑（諸如鹼金屬鹵化物（優選氯化鈉或氯化鉀）或甘露醇山梨醇）、遞送媒劑、稀釋劑、賦形劑和/或藥物佐劑（參見例如，Remington's Pharmaceutical Sciences（第18版, A.R. Gennaro編輯, Mack Publishing Company 1990）和其後續形式，所述文獻出於任何目的通過引用併入本文）。
[0209]最佳醫藥組成物將由熟練具有通常知識者根據例如預期投予途徑、遞送形式和所需劑量來決定。此類組成物可能影響結合蛋白的物理狀態、穩定性、體內釋放速率和體內清除速率。
[0210]醫藥組成物中的主要媒劑或載劑的性質可以是水性或非水性的。例如，適合於注射的媒劑或載劑可以是水、生理鹽水溶液或人工腦脊液，可能補充有用於腸胃外投予的組成物中常用的其他材料。中性緩衝鹽水或與血清白蛋白混合的鹽水是其他示例性媒劑。其他示例性醫藥組成物包含約pH 7.0-8.5的Tris緩衝液或約pH 4.0-5.5的乙酸鹽緩衝液，它們還可以包括山梨醇或合適的替代物。在本公開文本的一個實施例中，結合蛋白組成物可以透過將具有所選純度的組成物與呈凍乾餅或水溶液形式的任選調配劑混合來製備用於儲存。此外，可以使用適當賦形劑諸如蔗糖將結合蛋白調配為凍乾物。
[0211]可以選擇本公開文本的醫藥組成物用於腸胃外遞送或皮下遞送。可替代地，可以選擇組成物用於吸入或用於通過消化道遞送，諸如口服。此類醫藥上可接受的組成物的製備在本領域的技術範圍內。
[0212]所述調配組分以投予位點可接受的濃度存在。例如，使用緩衝液將組成物維持在生理pH或略低的pH，典型地在約5至約8的pH範圍內。
[0213]在考慮腸胃外投予時，所用治療組成物可以呈無熱原的腸胃外可接受的水溶液形式，其包含在醫藥上可接受的媒劑中的所需結合蛋白。用於腸胃外注射的特別合適的媒劑是無菌蒸餾水，在其中將結合蛋白調配為適當保存的無菌等滲溶液。又另一種製備可以涉及用提供產物的受控或持續釋放的試劑（諸如可注射微球、生物蝕解性顆粒、聚合物化合物（諸如聚乳酸或聚乙醇酸）、珠或脂質體）調配所需分子，然後可以將所述分子經由積存注射來遞送。還可以使用透明質酸，並且這可以具有促進在循環中的持久持續時間的作用。用於引入所需分子的其他合適的手段包括可植入的藥物遞送裝置。
[0214]在一個實施例中，可以將醫藥組成物調配用於吸入。例如，可以將結合蛋白調配為吸入用乾粉。結合蛋白吸入溶液也可以用用於氣溶膠遞送的推進劑來調配。在又另一個實施例中，可以將溶液霧化。
[0215]還考慮到可以將某些調配物口服投予。在本公開文本的一個實施例中，可以將以這種方式投予的結合蛋白用或不用在固體劑型（諸如片劑和膠囊）的混配中通常使用的那些載劑來調配。例如，膠囊可以設計為在胃腸道中在生物利用度最大化且前系統性降解最小化時釋放調配物的活性部分。可以包括其他試劑以有利於結合蛋白的吸收。還可以採用稀釋劑、調味劑、低熔點蠟、植物油、潤滑劑、助懸劑、片劑崩解劑和黏合劑。
[0216]另一種醫藥組成物可以涉及在具有適合於製造片劑的無毒賦形劑的混合物中的有效量的結合蛋白。通過將片劑溶解於無菌水或另一種適當媒劑中，可以按單位劑量形式製備溶液。合適的賦形劑包括但不限於惰性稀釋劑，諸如碳酸鈣、碳酸鈉或碳酸氫鈉、乳糖或磷酸鈣；或者結合劑，諸如澱粉、明膠或阿拉伯膠；或者潤滑劑，諸如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。
[0217]本公開文本的另外的醫藥組成物對於本領域具有通常知識者將是明顯的，所述醫藥組成物包括在持續或受控遞送調配物中包含結合蛋白的調配物。用於調配多種其他持續或受控遞送手段（諸如脂質體載劑、生物蝕解性微粒或多孔珠和積存注射）的技術也是本領域具有通常知識者已知的。緩釋製劑的另外的例子包括呈成型物品（例如，薄膜）或微膠囊形式的半滲透性聚合物基質。持續釋放基質可以包括聚酯、水凝膠、聚丙交酯、L-麩胺酸與γ乙基-L-麩胺酸酯的共聚物、聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)、乙烯乙酸乙烯酯或聚D(-)-3-羥丁酸。緩釋組成物還可以包含脂質體，所述脂質體可以通過本領域已知的幾種方法中的任何方法來製備。
[0218]待用於體內投予的醫藥組成物典型地必須是無菌的。這可以通過經無菌濾膜過濾來實現。在將組成物凍乾的情況下，可以在凍乾和回溶之前或之後使用這種方法進行滅菌。用於腸胃外投予的組成物可以以凍乾形式或溶液形式儲存。此外，通常將腸胃外組成物置於具有無菌進入口的容器中，所述容器例如具有可由皮下注射針刺穿的塞子的靜脈內輸液袋或小瓶。
[0219]一旦已經調配醫藥組成物，可以將其作為溶液、懸浮劑、凝膠、乳劑、固體或作為脫水或凍乾粉末儲存在無菌小瓶中。可以將此類調配物以即用形式或以需要在投予前回溶的形式（例如，凍乾）儲存。
[0220]本公開文本還涵蓋用於產生單一劑量投予單元的套組。所述套組可以各自含有具有乾燥蛋白質的第一容器和具有水性調配物的第二容器二者。本公開文本的範圍內還包括含有單室和多室預填充注射器（例如，液體注射器和凍乾劑注射器（lyosyringe））的套組。
[0221]將治療性地採用的結合蛋白醫藥組成物的有效量將取決於例如治療背景和目標。本領域具有通常知識者將認識到，治療的適當劑量水準將因此部分根據以下而變：所遞送的分子、結合蛋白所用於的適應症、投予途徑以及患者的大小（體重、體表或器官大小）和狀況（年齡和一般健康狀況）。因此，臨床醫師可以逐步調整劑量並且修改投予途徑以獲得最佳治療效果。
[0222]給藥頻率將取決於所用調配物中結合蛋白的藥代動力學參數。典型地，臨床醫師將投予組成物直至達到實現所需效果的劑量為止。因此，可以將組成物作為單一劑量、作為隨時間的兩個或更多個劑量（它們可以含有或不含等量的所需分子）或作為連續輸注經由植入裝置或導管來投予。適當劑量的進一步改進是由本領域普通具有通常知識者以常規方式進行，並且在本領域普通具有通常知識者常規進行的任務範圍內。適當劑量可以透過使用適當的劑量-反應資料來確定。
[0223]醫藥組成物的投予途徑與已知方法一致，例如，口服；透過經靜脈內、腹膜內、大腦內（腦實質內）、腦室內、肌內、眼內、動脈內、門靜脈內或病灶內途徑注射；透過持續釋放系統；或者透過植入裝置。在需要的情況下，組成物可以透過單次快速注射來投予，或者透過輸注連續投予，或者透過植入裝置來投予。
[0224]還可以將組成物經由已經使所需分子吸附或包封於其上的膜、海綿狀物或其他適當材料的植入局部投予。在使用植入裝置的情況下，可以將所述裝置植入任何合適的組織或器官中，並且所需分子的遞送可以經由擴散、定時釋放推注或連續投予來進行。
[0225]在一些實施例中，本公開文本涉及預防和/或治療增殖性疾病或障礙（例如，癌症）的方法。在一些實施例中，所述方法包括向患者投予治療有效量的至少一種本文所述的結合蛋白。在一些實施例中，所述患者是人類。在一些實施例中，將所述至少一種結合蛋白與一種或多種抗癌療法（例如，本領域已知的任何抗癌療法）組合投予。在一些實施例中，將所述至少一種結合蛋白在所述一種或多種抗癌療法之前投予。在一些實施例中，將所述至少一種結合蛋白與所述一種或多種抗癌療法同時投予。在一些實施例中，將所述至少一種結合蛋白在所述一種或多種抗反轉錄病毒療法之後投予。
[0226]在一些實施例中，本公開文本涉及預防和/或治療炎性疾病或障礙（例如，癌症）的方法。在一些實施例中，所述方法包括向患者投予治療有效量的至少一種本文所述的結合蛋白。在一些實施例中，所述患者是人類。在一些實施例中，將所述至少一種結合蛋白與一種或多種抗炎療法（例如，本領域已知的任何抗炎療法）組合投予。在一些實施例中，將所述至少一種結合蛋白在所述一種或多種抗炎療法前投予。在一些實施例中，將所述至少一種結合蛋白與所述一種或多種抗炎療法同時投予。在一些實施例中，將所述至少一種結合蛋白在所述一種或多種抗炎療法後投予。
[0227]在不限制本公開文本的情況下，下文出於說明的目的描述本公開文本的多個實施例。
示例性實施例 [0228]本發明提供了以下枚舉的示例性實施例。
1. 一種多價結合蛋白，所述多價結合蛋白包含形成兩個抗原結合結構域的四條多肽鏈；其中所述四條多肽鏈包括：
第一重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VH1-CH1 [I]，
第一輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構：
VL1-CL1 [II]，
第二重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VH2-CH1 [III]，
和第二輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構：
VL2-CL2 [IV]；
其中：
VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域，其中VL2是κ1、κ3或κ4亞型輕鏈可變結構域，
CL1是第一免疫球蛋白輕鏈恆定結構域，其中CL1是Cκ亞型輕鏈恆定結構域；
CL2是第二免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；
VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；
VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；
CH1是免疫球蛋白重鏈恆定結構域；
其中CL1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，
其中VL2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且
其中VH1與VL1締合以形成第一抗原結合結構域，並且VH2與VL2締合以形成第二抗原結合結構域。
2. 一種多價結合蛋白，所述多價結合蛋白包含形成兩個抗原結合結構域的四條多肽鏈；其中所述四條多肽鏈包括：
第一重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VH1-CH1-CH2-CH3 [I]，
第一輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構：
VL1-CL1 [II]，
第二重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VH2-CH1-CH2-CH3 [III]，
和第二輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構：
VL2-CL2 [IV]；
其中：
VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
CL1是第一免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；
CL2是第二免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；
VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；
VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；
CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恆定結構域，
CH2是免疫球蛋白CH2重鏈恆定結構域，並且
CH3是免疫球蛋白CH3重鏈恆定結構域；
其中CL1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，
其中VL2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且
其中VH1與VL1締合以形成第一抗原結合結構域，並且VH2與VL2締合以形成第二抗原結合結構域。
3. 根據實施例1或實施例2所述的多價結合蛋白，其中與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL1相比，包含所述一個或多個取代的所述CL1與KappaSelect的結合減少了約90%。
4. 根據實施例1至3中任一項所述的多價結合蛋白，其中與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL2相比，包含所述一個或多個取代的所述VL2與所述蛋白L層析材料的結合減少了約90%。
5. 根據實施例1至4中任一項所述的多價結合蛋白，其中包含所述一個或多個取代的所述CL1中的所述一個或多個胺基酸取代在對應於109、110或199的位置處，其中編號是根據EU索引。
6. 根據實施例5所述的多價結合蛋白，其中包含所述一個或多個取代的所述CL1中的所述一個或多個胺基酸取代是T109A取代、V110D取代、Q199K取代、T109A-V110D取代或T109A-V110D-Q199K取代，其中胺基酸編號是根據EU索引。
7. 根據實施例1至4中任一項所述的多價結合蛋白，其中包含所述一個或多個取代的所述CL1中的所述一個或多個胺基酸取代在對應於109、198、199或202的位置處，其中編號是根據EU索引。
8. 根據實施例7所述的多價結合蛋白，其中包含所述一個或多個取代的所述CL1中的所述一個或多個胺基酸取代是H198R取代、Q199W取代或T109A-S202R取代，其中胺基酸編號是根據EU索引。
9. 根據實施例1至8中任一項所述的多價結合蛋白，其中包含所述一個或多個取代的所述VL2中的所述一個或多個胺基酸取代是架構胺基酸的取代。
10. 根據實施例1至9中任一項所述的多價結合蛋白，其中包含所述一個或多個取代的所述VL2中的所述一個或多個胺基酸取代在對應於12或18的位置處，其中編號是根據Kabat。
11. 根據實施例10所述的多價結合蛋白，其中包含所述一個或多個取代的所述VL2中的所述一個或多個胺基酸取代是S12P取代、R18P取代、R18Q取代、S12P-R18P取代或S12P-R18Q取代，其中編號是根據Kabat。
12. 根據實施例2至11中任一項所述的多價結合蛋白，其中所述第一重鏈多肽的CH3結構域和/或所述第二重鏈多肽的CH3結構域是人類IgG1或IgG4 CH3結構域。
13. 根據實施例2至12中任一項所述的多價結合蛋白，其中所述第一重鏈多肽的CH3結構域包含對應於人類IgG1的位置354和366的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引，其中所述胺基酸取代是S354C和T366W；其中所述第二重鏈多肽的CH3結構域包含對應於人類IgG1的位置349、366、368、407、435和436的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引，其中所述胺基酸取代是Y349C、T366S、L368A和Y407V。
14. 根據實施例2至13中任一項所述的多價結合蛋白，其中所述第一重鏈多肽的CH3結構域包含對應於人類IgG1的位置349、366、368、407、435和436的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引，其中所述胺基酸取代是Y349C、T366S、L368A和Y407V；其中所述第二重鏈多肽的CH3結構域包含對應於人類IgG1的位置354和366的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引，其中所述胺基酸取代是S354C和T366W。
15. 根據實施例13所述的多價結合蛋白，其中所述第二重鏈多肽的CH3包含減少與蛋白A的結合的一個或多個胺基酸取代。
16. 根據實施例14所述的多價結合蛋白，其中所述第一重鏈多肽的CH3包含減少與蛋白A的結合的一個或多個胺基酸取代。
17. 根據請求項15或16所述的多價結合蛋白，其中減少與蛋白A的結合的一個或多個胺基酸取代是對應於人類IgG1的位置435和436的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引。
18. 根據請求項17所述的多價結合蛋白，其中所述胺基酸取代是H435R和Y436F，其中胺基酸編號是根據EU索引。
19. 根據請求項2至18中任一項所述的多價結合蛋白，其中所述第一重鏈多肽的CH1、CH2和CH3結構域不同於所述第二重鏈多肽的CH1、CH2和CH3結構域。
20. 根據請求項2至19中任一項所述的多價結合蛋白，其中所述第一重鏈多肽源自與所述第二重鏈多肽不同的物種。
21. 根據請求項2至11、19或20中任一項所述的多價結合蛋白，其中所述第一重鏈多肽和所述第一輕鏈多肽源自小鼠重鏈免疫球蛋白和小鼠輕鏈免疫球蛋白，並且所述第二重鏈多肽和所述第二輕鏈多肽源自大鼠重鏈免疫球蛋白和大鼠輕鏈免疫球蛋白。
22. 根據請求項2至11中任一項所述的多價結合蛋白，其中所述第一重鏈多肽和所述第二重鏈多肽各自包含IgG4 CH3結構域。
23. 根據請求項22所述的多價結合蛋白，其中所述第一重鏈多肽包含K409R胺基酸取代，並且所述第二重鏈多肽包含F405L胺基酸取代，其中編號是根據EU索引。
24. 根據請求項1至23中任一項所述的多價結合蛋白，其中所述多價結合蛋白是雙特異性抗原結合蛋白。
25. 根據請求項1至24中任一項所述的多價結合蛋白，其中所述第一抗原結合結構域和所述第二抗原結合結構域結合不同的抗原。
26. 根據請求項2至18中任一項所述的多價結合蛋白，
其中所述第一重鏈多肽鏈包含由下式表示的結構：
VH1-CH1-CH2-CH3-VH3-L-VL3 [Ia]，
其中所述第二重鏈多肽包含由下式表示的結構：
VH2-CH1-CH2-CH3 [IIIa]，
其中：
VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變結構域；
L是胺基酸連接子；
其中VH3與VL3締合以形成第三抗原結合結構域。
27. 根據請求項2至18中任一項所述的多價結合蛋白，
其中所述第一重鏈多肽鏈包含由下式表示的結構：
VH1-CH1-CH2-CH3-VH3 [Ib]，
其中所述第二重鏈多肽包含由下式表示的結構：
VH2-CH1-CH2-CH3 [IIIb]，
其中：
VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變結構域。
28. 根據請求項26所述的多價結合蛋白，其中VL3包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL3相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與所述蛋白L層析材料的結合。
29. 根據請求項26所述的多價結合蛋白，其中VL3是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2免疫球蛋白輕鏈可變結構域。
30. 根據請求項26-至29中任一項所述的多價結合蛋白，其中所述多價結合蛋白是雙特異性的或三特異性的。
31. 根據請求項26至30中任一項所述的多價結合蛋白，其中所述第一抗原結合結構域、所述第二抗原結合結構域結合和所述第三抗原結合結構域結合兩種或三種不同的抗原。
32. 根據請求項26至30中任一項所述的多價結合蛋白，其中所述第一抗原結合結構域結合第一抗原，所述第二抗原結合結構域結合第二抗原，並且所述第三抗原結合結構域結合第三抗原。
33. 根據請求項26至30中任一項所述的多價結合蛋白，其中所述第一抗原結合結構域和所述第二抗原結合結構域結合第一抗原，並且所述第三抗原結合結構域結合第二抗原。
34. 一種多價結合蛋白，所述多價結合蛋白包含形成三個抗原結合結構域的四條多肽鏈；其中所述四條多肽鏈包括：
第一重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VH1-L3-VH2-L4-CH1 [I]，
第一輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構：
VL2-L1-VL1-L2-CL1 [II]，
第二重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VH3-CH1 [III]，
和第二輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構：
VL3-CL2 [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；
VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；
VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變結構域；
CL1是第一免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；
CL2是第二免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；
CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恆定結構域；並且
L1、L2、L3和L4是胺基酸連接子；
其中所述式I的多肽和所述式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對；
其中VH1與VL1締合以形成第一抗原結合結構域，VH2與VL2締合以形成第二抗原結合結構域，並且VH3與VL3締合以形成第三抗原結合結構域；並且
其中：
a) CL1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL3包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL3相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合；
b) CL2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL1和VL2各自包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL1和VL2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合；
c) CL2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且其中VL2是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域；或
d) CL2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且其中VL1是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域。
35. 一種多價結合蛋白，所述多價結合蛋白包含形成三個抗原結合結構域的四條多肽鏈；其中所述四條多肽鏈包括：
第一重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-CH2-CH3 [Ia]，
第一輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構：
VL2-L1-VL1-L2-CL1 [II]，
第二重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VH3-CH1-CH2-CH3 [IIIa]，
和第二輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構：
VL3-CL2 [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；
VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；
VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變結構域；
CL1是第一免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；
CL2是第二免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；
CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恆定結構域；
CH2是免疫球蛋白CH2重鏈恆定結構域；
CH3是免疫球蛋白CH3重鏈恆定結構域；並且
L1、L2、L3和L4是胺基酸連接子；
其中所述式I的多肽和所述式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對；
其中VH1與VL1締合以形成第一抗原結合結構域，VH2與VL2締合以形成第二抗原結合結構域，並且VH3與VL3締合以形成第三抗原結合結構域；並且
其中：
a) CL1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL3包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL3相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合；
b) CL2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL1和VL2各自包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL1和VL2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合；
c) CL2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且其中VL2是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型輕鏈可變免疫球蛋白結構域；或
d) CL2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且其中VL1是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型輕鏈可變免疫球蛋白結構域。
36. 根據實施例34或35所述的多價結合蛋白，其中所述結合蛋白是三特異性的並且能夠特異性結合三種不同抗原標靶。
37. 根據實施例34至36中任一項所述的多價結合蛋白，其中L1、L2、L3和/或L4中的至少一個的長度各自獨立地是0個胺基酸。
38. 根據實施例34至36中任一項所述的多價結合蛋白，其中L1、L2、L3和/或L4的長度各自獨立地是至少一個胺基酸。
39. 根據實施例34或35所述的多價結合蛋白，其中：
所述第二重鏈多肽包含由下式表示的結構：
VH3-L5-VH4-L6-CH1 [IIIb]，
和第二輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構：
VL4-L7-VL3-L8-CL2 [IVa]
其中：
VL4是第四免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VH4是第四免疫球蛋白重鏈可變結構域；
L5、L6、L7和L8是胺基酸連接子；
其中所述式IIIa的多肽和所述式IVa的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對；
其中VH4與VL4締合以形成第四抗原結合結構域；並且
其中：
a) CL1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL3和VL4各自包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL3和VL4相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合；
b) CL1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL3包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL3相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且其中VL4是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
c) CL1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL4包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL4相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且其中VL3是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
d) CL2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL1和VL2各自包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL1和VL2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合；
e) CL2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且其中VL2是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域；或
f) CL2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且其中VL1是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域。
40. 根據實施例39所述的多價結合蛋白，其中
所述第二重鏈多肽包含由下式表示的結構：
VH3-L5-VH4-L6-CH1-CH2-CH3 [IIIc]，
其中：
CH2是免疫球蛋白CH2重鏈恆定結構域，並且
CH3是免疫球蛋白CH3重鏈恆定結構域。
41. 根據實施例39或40所述的多價結合蛋白，其中所述結合蛋白是四特異性的並且能夠特異性結合四種不同抗原標靶。
42. 根據實施例39至41中任一項所述的多價結合蛋白，其中L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7和/或L8中的至少一個的長度各自獨立地是0個胺基酸。
43. 根據實施例39至41中任一項所述的多價結合蛋白，其中L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7和/或L8的長度各自獨立地是至少一個胺基酸。
44. 根據實施例34至43中任一項所述的多價結合蛋白，其中與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL1或CL2相比，包含所述一個或多個胺基酸取代的CL1或CL2與所述KappaSelect層析材料的結合減少了約90%。
45. 根據實施例34至44中任一項所述的多價結合蛋白，其中與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL1、VL2、VL3和/或VL4相比，包含所述一個或多個取代的VL1、VL2、VL3和/或VL4與所述蛋白L層析材料的結合減少了約90%。
46. 根據實施例34至45中任一項所述的多價結合蛋白，其中所述CL1或所述CL2中的所述一個或多個胺基酸取代在對應於109、110或199的位置處，其中編號是根據EU索引。
47. 根據實施例46所述的多價結合蛋白，其中包含所述一個或多個胺基酸取代的CL1或CL2中的所述一個或多個胺基酸取代是T109A取代、V110D取代、Q199K取代、T109A-V110D取代或T109A-V110D-Q199K取代，其中胺基酸編號是根據EU索引。
48. 根據實施例34至45中任一項所述的多價結合蛋白，其中包含所述一個或多個取代的CL1或CL2中的所述一個或多個胺基酸取代在對應於109、198、199或202的位置處，其中編號是根據EU索引。
49. 根據實施例48所述的多價結合蛋白，其中包含所述一個或多個取代的CL1或CL2中的所述一個或多個胺基酸取代是H198R取代、Q199W取代或T109A-S202R取代，其中胺基酸編號是根據EU索引。
50. 根據實施例34至49中任一項所述的多價結合蛋白，其中包含所述一個或多個取代的VL1、VL2、VL3和/或VL4中的所述一個或多個胺基酸取代是架構胺基酸的取代。
51. 根據實施例34至50中任一項所述的多價結合蛋白，其中包含所述一個或多個取代的VL1、VL2、VL3和/或VL4中的所述一個或多個胺基酸取代在對應於12或18的位置處，其中編號是根據Kabat。
52. 根據實施例51所述的多價結合蛋白，其中包含所述一個或多個取代的VL1、VL2、VL3和/或VL4中的所述一個或多個胺基酸取代是S12P取代、R18P取代、R18Q取代、S12P-R18P取代或S12P-R18Q取代，其中編號是根據Kabat。
53. 根據實施例35至38和40至52中任一項所述的多價結合蛋白，其中所述第一重鏈多肽的CH3結構域和/或所述第二重鏈多肽的CH3結構域是人類IgG1或IgG4 CH3結構域。
54. 根據實施例35至38和40至53中任一項所述的多價結合蛋白，其中所述第一重鏈多肽的CH3結構域包含對應於人類IgG1的位置354和366的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引，其中所述胺基酸取代是S354C和T366W；其中所述第二重鏈多肽的CH3結構域包含對應於人類IgG1的位置349、366、368、407、435和436的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引，其中所述胺基酸取代是Y349C、T366S、L368A和Y407V。
55. 根據實施例35至38和40至53中任一項所述的多價結合蛋白，其中所述第一重鏈多肽的CH3結構域包含對應於人類IgG1的位置349、366、368、407、435和436的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引，其中所述胺基酸取代是Y349C、T366S、L368A和Y407V；其中所述第二重鏈多肽的CH3結構域包含對應於人類IgG1的位置354和366的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引，其中所述胺基酸取代是S354C和T366W。
56. 根據實施例54所述的多價結合蛋白，其中所述第二重鏈多肽的CH3包含減少與蛋白A的結合的一個或多個胺基酸取代。
57. 根據實施例55所述的多價結合蛋白，其中所述第一重鏈多肽的CH3包含減少與蛋白A的結合的一個或多個胺基酸取代。
58. 根據實施例56或57所述的多價結合蛋白，其中減少與蛋白A的結合的一個或多個胺基酸取代是對應於人類IgG1的位置435和436的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引。
59. 根據實施例58所述的多價結合蛋白，其中所述胺基酸取代是H435R和Y436F，其中胺基酸編號是根據EU索引。
60. 一種多價結合蛋白，所述多價結合蛋白包含形成兩個抗原結合結構域的四條多肽鏈；其中所述四條多肽鏈包括：
第一重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VH1-CH1 [I]，
第一輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構：
VL1-CL1 [II]，
第二重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VH2-CL2 [III]，
和第二輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構：
VL2-CH1 [IV]；
其中：
VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
CL1是第一免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；
CL2是第二免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；
VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；
VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；
CH1是免疫球蛋白重鏈恆定結構域
其中
a) CL2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，或
b) CL1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合；
並且其中VH1與VL1締合以形成第一抗原結合結構域，並且VH2與VL2締合以形成第二抗原結合結構域。
61. 一種多價結合蛋白，所述多價結合蛋白包含形成兩個抗原結合結構域的四條多肽鏈；其中所述四條多肽鏈包括：
第一重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VH1-CH1-CH2-CH3 [I]，
第一輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構：
VL1-CL1 [II]，
第二重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VH2-CL2-CH2-CH3 [III]，
和第二輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構：
VL2-CH1 [IV]；
其中：
VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
CL1是第一免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；
CL2是第二免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；
VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；
VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；
CH1是免疫球蛋白重鏈恆定結構域；
CH2是免疫球蛋白CH2重鏈恆定結構域；並且
CH3是免疫球蛋白CH3重鏈恆定結構域
其中
a) CL2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，或
b) CL1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合；
並且其中VH1與VL1締合以形成第一抗原結合結構域，並且VH2與VL2締合以形成第二抗原結合結構域。
62. 一種多價結合蛋白，所述多價結合蛋白包含形成兩個抗原結合結構域的四條多肽鏈；其中所述四條多肽鏈包括：
第一重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VH1-CH1 [I]，
第一輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構：
VL1-CL1 [II]，
第二重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VL2-CH1 [III]，
和第二輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構：
VH2-CL2 [IV]；
其中：
VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
CL1是第一免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；
CL2是第二免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；
VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；
VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；
CH1是免疫球蛋白重鏈恆定結構域；
CH2是免疫球蛋白CH2重鏈恆定結構域；並且
CH3是免疫球蛋白CH3重鏈恆定結構域；
其中
a) CL2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，或
b) CL1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合；
並且其中VH1與VL1締合以形成第一抗原結合結構域，並且VH2與VL2締合以形成第二抗原結合結構域。
63. 一種多價結合蛋白，所述多價結合蛋白包含形成兩個抗原結合結構域的四條多肽鏈；其中所述四條多肽鏈包括：
第一重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VH1-CH1-CH2-CH3 [I]，
第一輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構：
VL1-CL1 [II]，
第二重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VH2-CH1-CH2-CH3 [III]，
和第二輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構：
VL2-CL2 [IV]；
其中：
VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
CL1是第一免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；
CL2是第二免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；
VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；
VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；
CH1是免疫球蛋白重鏈恆定結構域；
CH2是免疫球蛋白CH2重鏈恆定結構域；並且
CH3是免疫球蛋白CH3重鏈恆定結構域；
其中
a) CL2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，或
b) CL1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合；
並且其中VH1與VL1締合以形成第一抗原結合結構域，並且VH2與VL2締合以形成第二抗原結合結構域。
64. 根據實施例60至63中任一項所述的多價結合蛋白，其中與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL1或CL2相比，包含所述一個或多個胺基酸取代的CL1或CL2與所述KappaSelect層析材料的結合減少了約90%。
65. 根據實施例60至64中任一項所述的多價結合蛋白，其中與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL1或VL2相比，包含所述一個或多個胺基酸取代的VL1或VL2與所述蛋白L層析材料的結合減少了約90%。
66. 根據實施例60至65中任一項所述的多價結合蛋白，其中包含所述一個或多個胺基酸取代的CL1或CL2中的所述一個或多個胺基酸取代在對應於109、110或199的位置處，其中編號是根據EU索引。
67. 根據實施例66所述的多價結合蛋白，其中包含所述一個或多個胺基酸取代的CL1或CL2中的所述一個或多個胺基酸取代是T109A取代、V110D取代、Q199K取代、T109A-V110D取代或T109A-V110D-Q199K取代。
68. 根據實施例60至65中任一項所述的多價結合蛋白，其中包含所述一個或多個取代的CL1或CL2中的所述一個或多個胺基酸取代在對應於109、198、199或202的位置處，其中編號是根據EU索引。
69. 根據實施例68所述的多價結合蛋白，其中包含所述一個或多個取代的CL1或CL2中的所述一個或多個胺基酸取代是H198R取代、Q199W取代或T109A-S202R取代，其中胺基酸編號是根據EU索引。
70. 根據實施例60至69中任一項所述的多價結合蛋白，其中包含所述一個或多個胺基酸取代的VL1或VL2中的所述一個或多個胺基酸取代是架構胺基酸的取代。
71. 根據實施例60至70中任一項所述的多價結合蛋白，其中包含所述一個或多個胺基酸取代的VL1或VL2中的所述一個或多個胺基酸取代是在對應於12或18的位置處，其中編號是根據Kabat。
72. 根據實施例71所述的多價結合蛋白，其中包含所述一個或多個胺基酸取代的VL1或VL2中的所述一個或多個胺基酸取代是S12P取代、R18P取代、R18Q取代、S12P-R18P取代或S12P-R18Q取代，其中編號是根據Kabat。
73. 根據實施例57至66中任一項所述的多價結合蛋白，其中所述第一重鏈多肽的CH3結構域和/或所述第二重鏈多肽的CH3結構域是人類IgG1或IgG4 CH3結構域。
74. 根據實施例61至73中任一項所述的多價結合蛋白，其中所述第一重鏈多肽的CH3結構域包含對應於人類IgG1的位置354和366的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引，其中所述胺基酸取代是S354C和T366W；其中所述第二重鏈多肽的CH3結構域包含對應於人類IgG1的位置349、366、368、407、435和436的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引，其中所述胺基酸取代是Y349C、T366S、L368A和Y407V。
75. 根據實施例61至74中任一項所述的多價結合蛋白，其中所述第一重鏈多肽的CH3結構域包含對應於人類IgG1的位置349、366、368、407、435和436的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引，其中所述胺基酸取代是Y349C、T366S、L368A和Y407V；其中所述第二重鏈多肽的CH3結構域包含對應於人類IgG1的位置354和366的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引，其中所述胺基酸取代是S354C和T366W。
76. 根據實施例74所述的多價結合蛋白，其中所述第二重鏈多肽的所述CH3包含減少與蛋白A層析材料的結合的一個或多個胺基酸取代。
77. 根據實施例75所述的多價結合蛋白，其中所述第一重鏈多肽的CH3包含減少與蛋白A層析材料的結合的一個或多個胺基酸取代。
78. 根據實施例76或77所述的多價結合蛋白，其中減少與所述蛋白A層析材料的結合的一個或多個胺基酸取代對應於人類IgG1的位置435和436的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引。
79. 根據實施例78所述的多價結合蛋白，其中所述胺基酸取代是H435R和Y436F，其中胺基酸編號是根據EU索引。
80. 根據實施例56至73中任一項所述的多價結合蛋白，其中所述多價結合蛋白是雙特異性抗原結合蛋白。
81. 根據實施例60至80中任一項所述的多價結合蛋白，其中所述第一抗原結合結構域和所述第二抗原結合結構域結合不同的抗原。
82. 一種多價結合蛋白，所述多價結合蛋白包含形成四個抗原結合結構域的四條多肽鏈；其中所述四條多肽鏈包括：
第一重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VH1-CH11-L1-VH2-CH12 [I]，
第一輕鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VL1-CL1-L2-VL2-CL2 [II]，
第二重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VH3-CH13-L3-VH4-CH14 [III]，
第二輕鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VL3-CL3-L4-VL4- CL4 [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VL4是第四免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
CL1是第一免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；
CL2是第二免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；
CL3是第三免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；
CL4是第四免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；
VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；
VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；
VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變結構域；
VH4是第四免疫球蛋白重鏈可變結構域；
CH11是第一免疫球蛋白重鏈恆定結構域；
CH12是第二免疫球蛋白重鏈恆定結構域；
CH13是第三免疫球蛋白重鏈恆定結構域；
CH14是第四免疫球蛋白重鏈恆定結構域；
並且
L1、L2、L3和L4是胺基酸連接子；
其中：
a) CL1和CL2各自包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL1和CL2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL3和VL4各自包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL3和VL4相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合；
b) CL1和CL2各自包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL1和CL2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL3包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL3相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且VL4是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
c) CL1和CL2各自包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL1和CL2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL4包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL4相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且其中VL3是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
d) CL1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，CL2是λ亞型免疫球蛋白輕鏈恆定結構域，並且VL3和VL4各自包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL1和VL2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合；
e) CL1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，CL2是λ亞型免疫球蛋白輕鏈恆定結構域，VL3包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL3相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且VL4是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
f) CL1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，CL2是λ亞型免疫球蛋白輕鏈恆定結構域，VL4包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL4相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且其中VL3是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
g) CL2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，CL1是λ亞型免疫球蛋白輕鏈恆定結構域，並且VL3和VL4各自包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL3和VL4相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合；
h) CL2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，CL1是λ亞型免疫球蛋白輕鏈恆定結構域，VL3包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL3相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且VL4是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
i) CL2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，CL1是λ亞型免疫球蛋白輕鏈恆定結構域，VL4包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL4相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且其中VL3是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
並且其中VL1和VH1形成第一抗原結合結構域，VL2和VH2形成第二抗原結合結構域，VL3和VH3形成第三抗原結合結構域，並且VL4和VH4形成第四抗原結合結構域。
83. 根據實施例82所述的多價結合蛋白，其中L1、L2、L3或L4中的至少一個的長度各自獨立地是0個胺基酸。
84. 根據實施例82或83所述的結合蛋白，其中L1、L2、L3或L4中的至少一個的長度各自獨立地是至少一個胺基酸。
85. 一種多價結合蛋白，所述多價結合蛋白包含形成四個抗原結合結構域的四條多肽鏈；其中所述四條多肽鏈包括：
第一重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VH1-L1-VH2- L2-CH11 [I]，
第一輕鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VL1-L3-VL2- L4-CL1 [II]，
第二重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VH3-L5-VH4- L6-CH12 [III]，
第二輕鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VL3-L7-VL4- L8-CL2 [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VL4是第四免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
CL1是第一免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；
CL2是第二免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；
VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；
VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；
VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變結構域；
VH4是第四免疫球蛋白重鏈可變結構域；
CH11是第一免疫球蛋白重鏈恆定結構域；
CH12是第二免疫球蛋白重鏈恆定結構域；
並且
L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7和L8是胺基酸連接子；
其中：
a) CL1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL3和VL4各自包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL3和VL4相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合；
b) CL1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL3包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL3相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且VL4是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
c) CL1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL4包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL4相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且其中VL3是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
並且其中VL1和VH1形成第一抗原結合結構域，VL2和VH2形成第二抗原結合結構域，VL3和VH3形成第三抗原結合結構域，並且VL4和VH4形成第四抗原結合結構域。
86. 根據實施例85所述的多價結合蛋白，其中L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7或L8中的至少一個的長度各自獨立地是0個胺基酸。
87. 根據實施例85或86所述的結合蛋白，其中L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7或L8中的至少一個的長度各自獨立地是至少一個胺基酸。
88. 根據實施例82至87中任一項所述的多價結合蛋白，其中與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL1和/或CL2相比，包含所述一個或多個胺基酸取代的CL1和/或CL2與所述KappaSelect層析材料的結合減少了約90%。
89. 根據實施例82至88中任一項所述的多價結合蛋白，其中與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL3和/或VL4相比，包含所述一個或多個胺基酸取代的VL3和/或VL4與所述蛋白L層析材料的結合減少了約90%。
90. 根據實施例82至89中任一項所述的多價結合蛋白，其中包含所述一個或多個胺基酸取代的CL1和/或CL2中的所述一個或多個胺基酸取代在對應於109、110或199的位置處，其中編號是根據EU索引。
91. 根據實施例90所述的多價結合蛋白，其中包含所述一個或多個胺基酸取代的CL1和/或CL2中的所述一個或多個胺基酸取代是T109A取代、V110D取代、Q199K取代、T109A-V110D取代或T109A-V110D-Q199K取代，其中胺基酸編號是根據EU索引。
92. 根據實施例82至89中任一項所述的多價結合蛋白，其中包含所述一個或多個取代的CL1和/或CL2中的所述一個或多個胺基酸取代在對應於109、198、199或202的位置處，其中編號是根據EU索引。
93. 根據實施例92所述的多價結合蛋白，其中包含所述一個或多個取代的CL1和/或CL2中的所述一個或多個胺基酸取代是H198R取代、Q199W取代或T109A-S202R取代，其中胺基酸編號是根據EU索引。
94. 根據實施例82至93中任一項所述的多價結合蛋白，其中包含所述一個或多個胺基酸取代的VL3和/或VL4中的所述一個或多個胺基酸取代是架構胺基酸的取代。
95. 根據實施例82至94中任一項所述的多價結合蛋白，其中包含所述一個或多個胺基酸取代的VL3和/或VL4中的所述一個或多個胺基酸取代是在對應於12或18的位置處，其中編號是根據Kabat。
96. 根據實施例95所述的多價結合蛋白，其中包含所述一個或多個胺基酸取代的VL3和/或VL4中的所述一個或多個胺基酸取代是S12P取代、R18P取代、R18Q取代、S12P-R18P取代或S12P-R18Q取代，其中編號是根據Kabat。
97. 根據實施例82或86至96中任一項所述的多價結合蛋白，其中
所述第一重鏈多肽包含由下式表示的結構：
VH1-CH11-L1-VH2-CH12-CH2-CH3 [Ia]，
所述第二重鏈多肽包含由下式表示的結構：
VH3-CH13-L3-VH4-CH14-CH2-CH3 [IIIa]。
98. 根據實施例83至96中任一項所述的多價結合蛋白，其中
所述第一重鏈多肽包含由下式表示的結構：
VH1-L1-VH2-L2-CH11-CH2-CH3 [Ia]，
所述第二重鏈多肽包含由下式表示的結構：
VH3-L5-VH4-L6-CH12-CH2-CH3 [IIIa]。
99. 根據實施例97所述的多價結合蛋白，其中所述第一重鏈多肽的CH3結構域和/或所述第二重鏈多肽的CH3結構域是人類IgG1或IgG4 CH3結構域。
100. 根據實施例97或99所述的多價結合蛋白，其中所述第一重鏈多肽的CH3結構域包含對應於人類IgG1的位置354和366的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引，其中所述胺基酸取代是S354C和T366W；其中所述第二重鏈多肽的CH3結構域包含對應於人類IgG1的位置349、366、368、407、435和436的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引，其中所述胺基酸取代是Y349C、T366S、L368A和Y407V。
101. 根據實施例96至100中任一項所述的多價結合蛋白，其中所述第一重鏈多肽的CH3結構域包含對應於人類IgG1的位置349、366、368、407、435和436的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引，其中所述胺基酸取代是Y349C、T366S、L368A和Y407V；其中所述第二重鏈多肽的CH3結構域包含對應於人類IgG1的位置354和366的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引，其中所述胺基酸取代是S354C和T366W。
102. 根據實施例101所述的多價結合蛋白，其中所述第二重鏈多肽的所述CH3包含減少與蛋白A層析材料的結合的一個或多個胺基酸取代。
103. 根據實施例101所述的多價結合蛋白，其中所述第一重鏈多肽的CH3包含減少與蛋白A層析材料的結合的一個或多個胺基酸取代。
104. 根據實施例102或103所述的多價結合蛋白，其中減少與所述蛋白A層析材料的結合的一個或多個胺基酸取代對應於人類IgG1的位置435和436的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引。
105. 根據實施例104所述的多價結合蛋白，其中所述胺基酸取代是H435R和Y436F，其中胺基酸編號是根據EU索引。
106. 根據實施例82至105中任一項所述的多價結合蛋白，其中所述結合蛋白是四特異性的並且能夠特異性結合四種不同抗原標靶。
107. 一種多價結合蛋白，所述多價結合蛋白包含形成抗原結合結構域的四條多肽鏈；其中所述四條多肽鏈包括：
第一重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VH1-CH11 [I]，
第一輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構：
VL1-CL1 [II]，
第二重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
融合多肽-L1-CH12 [III]，
和第二輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構：
融合多肽-L2-CL2 [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
CL1是第一免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；
CL2是第二免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；
VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；
CH11是第一免疫球蛋白重鏈恆定結構域；
CH12是第二免疫球蛋白重鏈恆定結構域；並且
L1和L2是胺基酸連接子；
其中CL2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合；並且
其中VL1和VH1形成抗原結合結構域。
108. 根據實施例107所述的多價結合蛋白，其中L1或L2的長度獨立地是0個胺基酸。
109. 根據實施例107或108所述的結合蛋白，其中L1或L2的長度獨立地是至少一個胺基酸。
110. 一種多價結合蛋白，所述多價結合蛋白包含形成兩個抗原結合結構域的四條多肽鏈；其中所述四條多肽鏈包括：
第一重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
VH1-CH11-L1-VH2-CH12 [I]，
第一輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構：
VL1-CL1-L2-VL2-CL2 [II]，
第二重鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
融合多肽-L3-CH13 [III]，
和第二輕鏈多肽，其包含由下式表示的結構：
融合多肽-L4-CL3 [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
CL1是第一免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；
CL2是第二免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；
CL3是第三免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；
VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；
VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；
CH11是第一免疫球蛋白重鏈恆定結構域；
CH12是第二免疫球蛋白重鏈恆定結構域；
CH13是第三免疫球蛋白重鏈恆定結構域；並且
L1、L2、L3和L4是胺基酸連接子；
其中：
a) CL3包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL3相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL1和VL2各自包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL1和VL2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，
b) CL3包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL3相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL1相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且VL2是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白結構域；或
c) CL3包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL3相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL2相比，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且VL1是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白結構域；並且
其中VL1和VH1形成第一抗原結合結構域並且VL2和VH2形成第二抗原結合結構域。
111. 根據實施例110所述的多價結合蛋白，其中L1、L2、L3或L4中的至少一個的長度各自獨立地是0個胺基酸。
112. 根據實施例110或111所述的結合蛋白，其中L1、L2、L3或L4的長度各自獨立地是至少一個胺基酸。
113. 根據實施例99至104中任一項所述的多價結合蛋白，其中與沒有所述一個或多個胺基酸取代的CL2或CL3相比，包含所述一個或多個胺基酸取代的CL2或CL3與所述KappaSelect層析材料的結合減少了約90%。
114. 根據實施例107至113中任一項所述的多價結合蛋白，其中與沒有所述一個或多個胺基酸取代的VL1和/或VL2相比，包含所述一個或多個胺基酸取代的VL1和/或VL2與所述蛋白L層析材料的結合減少了約90%。
115. 根據實施例107至114中任一項所述的多價結合蛋白，其中包含所述一個或多個胺基酸取代的CL2或CL3中的所述一個或多個胺基酸取代在對應於109、110或199的位置處，其中編號是根據EU索引。
116. 根據實施例115所述的多價結合蛋白，其中包含所述一個或多個胺基酸取代的CL2或CL3中的所述一個或多個胺基酸取代是T109A取代、V110D取代、Q199K取代、T109A-V110D取代或T109A-V110D-Q199K取代。
117. 根據實施例107至114中任一項所述的多價結合蛋白，其中包含所述一個或多個取代的CL2或CL3中的所述一個或多個胺基酸取代在對應於109、198、199或202的位置處，其中編號是根據EU索引。
118. 根據實施例117所述的多價結合蛋白，其中包含所述一個或多個取代的CL2或CL3中的所述一個或多個胺基酸取代是H198R取代、Q199W取代或T109A-S202R取代，其中胺基酸編號是根據EU索引。
119. 根據實施例107至118中任一項所述的多價結合蛋白，其中包含所述一個或多個胺基酸取代的VL1和/或VL2中的所述一個或多個胺基酸取代是架構胺基酸的取代。
120. 根據實施例107至119中任一項所述的多價結合蛋白，其中包含所述一個或多個胺基酸取代的VL1和/或VL2中的所述一個或多個胺基酸取代是在對應於12或18的位置處，其中編號是根據Kabat。
121. 根據實施例120所述的多價結合蛋白，其中所述VL1和/或VL2中的所述一個或多個胺基酸取代是S12P取代、R18P取代、R18Q取代、S12P-R18P取代或S12P-R18Q取代，其中編號是根據Kabat。
122. 根據實施例107至121中任一項所述的多價結合蛋白，其中所述第一重鏈多肽包含第一CH2免疫球蛋白重鏈恆定結構域和第一CH3免疫球蛋白重鏈恆定結構域，並且所述第二重鏈多肽包含第二CH2免疫球蛋白重鏈恆定結構域和第二CH3免疫球蛋白重鏈恆定結構域。
123. 根據實施例122所述的多價結合蛋白，其中所述第一CH3結構域和/或所述CH3結構域是人類IgG1或IgG4 CH3結構域。
124. 根據實施例122或123中任一項所述的多價結合蛋白，其中所述第一CH3結構域包含對應於人類IgG1的位置354和366的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引，其中所述胺基酸取代是S354C和T366W；其中第二CH3結構域包含在對應於人類IgG1的位置349、366、368、407、435和436的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引，其中所述胺基酸取代是Y349C、T366S、L368A和Y407V。
125. 根據實施例124所述的多價結合蛋白，其中所述第二重鏈多肽的CH3包含一個或多個胺基酸取代，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白A的結合。
126. 根據實施例125所述的多價結合蛋白，其中所述第一重鏈多肽的CH3包含一個或多個胺基酸取代，所述一個或多個胺基酸取代減少與蛋白A的結合。
127. 根據實施例126所述的多價結合蛋白，其中減少與蛋白A的結合的一個或多個胺基酸取代是對應於人類IgG1的位置435和436的處置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引。
128. 根據實施例127所述的多價結合蛋白，其中所述胺基酸取代是H435R和Y436F，其中胺基酸編號是根據EU索引。
129. 根據實施例1至128中任一項所述的多價結合蛋白，其中所述多價結合蛋白是多特異性抗體或其抗原結合片段。
130. 一種或多種多核苷酸，所述一種或多種多核苷酸編碼根據實施例1至129中任一項所述的多價結合蛋白。
131. 一種或多種載體，所述一種或多種載體包含根據實施例130所述的一種或多種多核苷酸。
132. 一種宿主細胞，所述宿主細胞包含根據實施例130所述的一種或多種多核苷酸，或根據實施例131所述的一種或多種表現載體。
133. 一種產生多價結合蛋白的方法，所述方法包括培養根據實施例122所述的宿主細胞，使得產生所述結合蛋白。
134. 根據實施例133所述的方法，所述方法進一步包括從所述宿主細胞中回收所述結合蛋白。
135. 一種醫藥組成物，所述醫藥組成物包含根據實施例1至129中任一項所述的多價結合蛋白和醫藥上可接受的載劑。
136. 一種純化根據實施例1至129中任一項所述的多價結合蛋白的方法，所述方法包括
a) 使包含所述多價結合蛋白的組成物以結合和洗脫模式經受蛋白L層析，以產生蛋白L洗出液，以及
b) 使所述蛋白L洗出液以結合和洗脫模式經受KappaSelect層析，以產生KappaSelect洗出液，
其中所述KappaSelect洗出液包含所述多價結合蛋白並且基本上不含錯配多肽。
137. 根據實施例136所述的方法，其中所述KappaSelect洗出液中的多價結合蛋白的純度至少85%、至少90%或至少95%。
138. 根據實施例136或137所述的方法，其中所述KappaSelect洗出液中小於15%、小於10%或小於5%的所述多肽是錯配多肽。
139. 一種純化根據實施例1至129中任一項所述的多價結合蛋白的方法，所述方法包括
a) 使包含所述多價結合蛋白和錯配抗體的組成物以結合和洗脫層析經受KappaSelect層析，以產生KappaSelect洗出液，以及
b) 使所述KappaSelect洗出液以結合和洗脫模式經受蛋白L層析，以產生蛋白L洗出液，
其中所述蛋白L洗出液包含所述多價結合蛋白並且基本上不含錯配多肽。
140. 根據實施例139所述的方法，其中所述蛋白L洗出液中的多價結合蛋白的純度至少85%、至少90%或至少95%。
141. 根據實施例139或140所述的方法，其中所述蛋白L洗出液中小於15%、小於10%或小於5%的所述多肽是錯配多肽。
142. 一種純化根據實施例1至129中任一項所述的多價結合蛋白的方法，所述方法包括
a) 使包含所述多價結合蛋白的組成物以結合和洗脫模式經受蛋白A層析，以產生蛋白A洗出液，
b) 使所述蛋白A洗出液以結合和洗脫模式經受蛋白L層析，以產生蛋白L洗出液，以及
c) 使所述蛋白L洗出液以結合和洗脫模式經受KappaSelect層析，以產生KappaSelect洗出液，
其中所述KappaSelect洗出液包含所述多價結合蛋白並且基本上不含錯配多肽。
143. 根據實施例142所述的方法，其中所述KappaSelect洗出液中的多價結合蛋白的純度至少85%、至少90%或至少95%。
144. 根據實施例142或143所述的方法，其中所述KappaSelect洗出液中小於15%、小於10%或小於5%的所述多肽是錯配多肽。
145. 一種純化根據實施例1至129中任一項所述的多價結合蛋白的方法，所述方法包括
a) 使包含所述多價結合蛋白的組成物以結合和洗脫模式經受蛋白A層析，以產生蛋白A洗出液，
b) 使所述蛋白A洗出液以結合和洗脫模式經受KappaSelect層析，以產生KappaSelect洗出液，以及
c) 使所述蛋白KappaSelect洗出液以結合和洗脫模式經受蛋白L層析，以產生蛋白L洗出液，
其中所述L洗出液包含所述多價結合蛋白並且基本上不含錯配多肽。
146. 根據實施例145所述的方法，其中所述蛋白L洗出液中的多價結合蛋白的純度至少85%、至少90%或至少95%。
147. 根據實施例145或146所述的方法，其中所述蛋白L洗出液中小於15%、小於10%或小於5%的所述多肽是錯配多肽。
148. 根據實施例136至147中任一項所述的方法，其中包含所述多價結合蛋白的所述組成物源自工程化為表現所述多特異性結合蛋白的宿主細胞。
149. 根據實施例136至148中任一項所述的方法，其中包含所述多價結合蛋白的所述組成物是宿主細胞培養物上清液。
150. 根據實施例136至149中任一項所述的方法，其中包含所述多價結合蛋白的所述組成物進一步包含錯配多肽。
151. 根據實施例136至150中任一項所述的方法，其中將包含所述多價結合蛋白的所述組成物在層析之前過濾。
152. 根據實施例136至151中任一項所述的方法，所述方法進一步包括在KappaSelect或蛋白L層析後的精製步驟。
153. 根據實施例152所述的方法，其中所述精製步驟是尺寸排阻層析。
154. 根據實施例146至153中任一項所述的方法，其中所述蛋白A層析是MabSelect™、MabSelect SuRe™、MabSelect SuRe™ LX、MabSelect PrismA、ProSep®-vA、ProSep® Ultra Plus、蛋白A Sepharose® Fast Flow或Toyopearl® AF-rProtein A層析。
155. 根據實施例136至154中任一項所述的方法，其中所述蛋白L層析是Pierce™蛋白L層析管柱、Capto™ L層析、HiTrap®蛋白L層析、TOYOPEARL® AF-rProtein L-650F層析或KanCap™ L層析。
156. 根據實施例136至155中任一項所述的方法，其中所述KappaSelect層析是HiTrap™ KappaSelect或CaptureSelect™ Kappa XL層析。
157. 根據實施例136至156中任一項所述的方法，其中包含所述多價結合蛋白的所述組成物與醫藥上可接受的載劑組合。
實例
[0229]下面的實例說明了本公開文本的具體實施例及其各種用途。它們僅出於解釋的目的而提出，並且不應當被解釋為以任何方式限制本發明的範圍。
實例 1. Pro-L KO 突變體的開發 [0230]大消化鏈球菌蛋白L（PpL）是與人類抗體κ輕鏈子類的可變輕鏈（VL）區相互作用的多結構域細菌表面蛋白。它不與人類抗體λ輕鏈相互作用。因此，當重組形式的蛋白-L固定於層析基質時，它們對純化不同抗體和抗體片段具有廣泛的應用。
[0231]為了能夠開發新型純化方法，鑒定了會減少或完全根除抗體輕鏈（LC）與蛋白-L的結合的突變體。在阿達木單抗（一種明確表徵的靶向TNFα的抗體）的可變輕鏈架構-1（FW1）結構域中引入了一系列單、雙或三胺基酸取代和/或缺失。產生含有這些不同突變LC的阿達木單抗變體，並且相對於野生型形式表徵這些阿達木單抗變體對在溶液中的或固定在樹脂上的蛋白-L配體的結合，以及其他幾種特性（包括表現力價、與靶蛋白TNFα的相互作用、加速穩定性和預測的免疫原性）。
[0232] 圖 3示出了人類VLκ和λ亞型中的殘基及其PpL結合特性的比對。對於每種亞型示出了在這些基因的種系中最多觀察到的殘基。將在蛋白-L與抗體的VL區相互作用的性質上報告的序列資訊以及結構資料用於設計我們的測試分子阿達木單抗的VL FW1中的一系列突變，以鑒定會減少或完全根除蛋白-L結合的變化。
[0233]阿達木單抗野生型和11種蛋白-L結合敲除突變體（即，R18T-T20R、delS7、S9R-R18T-T20R、S9R、S9P、R18T、del7-S9P、S12P、S12P-R18P、R18P和S7P（參見
圖 4，上部小圖））在Expi293F細胞中表現，並且透過mAbSelect SuRe柱純化以評價蛋白質力價。將野生型阿達木單抗用作參考。
[0234]當細胞密度達到2.8 × 10
6/mL時，遵循製造商方案使用ExpiFectamine™ 293轉染套組（Thermo fisher A14635）將編碼阿達木單抗重鏈和輕鏈的質體轉染到15至30 mL在搖瓶中的Expi293表現培養基中培養的Expi293F細胞中。在第二天將ExpiFectamine™ 293轉染增強子1和2添加到培養基中。將轉染的細胞在37ºC與8% CO
2下以125 rpm的搖動速度在懸浮液中繼續培養7天。
[0235]在第7天，將轉染的細胞透過以200g離心10 min從培養基中去除。然後將細胞培養上清液進一步以3500g離心15 min以清除細胞碎片。最後，將細胞培養上清液通過0.22 uM過濾器過濾。
[0236]將過濾的細胞培養基載入到5 mL mAbSelect SuRe柱（Cytiva #11-0034-95）。純化程序與
圖 2的步驟1中描述的程序相同。
[0237]使用Nanodrop通過A280 nm確定mAbSelect SuRe純化後的蛋白質濃度。使用蛋白質的量（蛋白質濃度 x 體積）除以細胞培養物體積來計算蛋白質產率。蛋白-L敲除突變體的產率略低於野生型阿達木單抗（
圖 4，下部小圖）。
[0238]使用生物膜干涉法（BLI）評估溶液中阿達木單抗VL FW1變體與100 nM pro-L配體（ThermoFisher Inc.）的結合。將阿達木單抗野生型、10種蛋白-L敲除突變體和λ輕鏈陰性對照抗體在結合緩衝液（磷酸鹽緩衝鹽水，pH 7.4，含1 mg/mL牛血清白蛋白）中稀釋至100 nM，然後使用生物膜干涉系統（Octet RED96e，ForteBio）載入到抗人類IgG Fc捕獲（AHC）生物感測器（Sartorius，18-5060）上至1.0 nm的密度。平衡後，在25ºC下使用180秒締合和180秒解離進行與100 nM重組蛋白L（Pierce™ 2118）的結合。捕獲結合反應，並且使用1：1結合模型擬合結合親和力。S12P突變極大減少與Pro-L的結合，而S12P_R18P雙重突變體完全廢除了Pro-L結合。
[0239] 圖 5中示出了第1波（頂部，其示出了變體R18T-T20R、delS7、S9R-R18T-T20R、S9R、S9P和R18T的結合）、第2波（底部，其示出了變體del7-S9P、S12P、S12P-R18P和R18P的結合）和第3波（底部，其示出了變體S7P的結合）中的每種阿達木單抗變體、野生型阿達木單抗以及具有λ輕鏈（非蛋白-L結合）的不相關的（非TNFα結合）陰性對照抗體的結合曲線。
[0240]評估溶液中阿達木單抗VL FW1變體與100 nM TNFα（來自供應商X）的BLI結合。將阿達木單抗野生型、10種蛋白-L敲除突變體和λ輕鏈陰性對照抗體在Octet結合緩衝液（磷酸鹽緩衝鹽水，pH 7.4，含1 mg/mL牛血清白蛋白）中稀釋至100 nM，然後使用生物膜干涉系統（Octet RED96e，ForteBio）載入到抗人類IgG Fc捕獲（AHC）生物感測器（Sartorius，18-5060）上至1.0 nm的密度。平衡後，在25ºC下使用180秒締合和180秒解離進行與100 nM重組TNFα抗原（R&D Systems，10291-TA-050）的結合。捕獲結合反應，並且使用1：1結合模型擬合結合親和力。這些蛋白-L敲除突變體保留與野生型阿達木單抗相同的抗原結合。
[0241] 圖 6中示出了第1波中的第1波變體（頂部，其示出了變體R18T-T20R、delS7、S9R-R18T-T20R、S9R、S9P和R18T的結合）、第2波（底部，其示出了變體del7-S9P、S12P、S12P-R18P和R18P的結合）和第3波（底部，其示出了變體S7P的結合）中的每種阿達木單抗變體、野生型阿達木單抗以及不相關的（非TNFα結合）陰性對照抗體的結合曲線。
[0242]評價阿達木單抗VL FW1變體相比於野生型與蛋白-L樹脂（ThermoFisher Inc.）的結合。將在中性pH緩衝液中的1 mg mAbSelect SuRe樹脂純化的阿達木單抗野生型和四種蛋白-L敲除突變體以1 mL/min流速載入到1 mL蛋白L柱（Pierce™，89928）。然後用10個柱體積（CV）的磷酸鹽緩衝鹽水洗滌。收集並且合併在流過物和洗滌緩衝液中的蛋白質。然後洗滌，將柱用5 CV的50 mM乙酸鈉（pH 3.5）洗脫。將洗脫的蛋白質使用1M，pH 9.0 Tris緩衝液中和。將柱用5 CV的50 mM甘胺酸-HCl（pH 2.5）進一步洗脫，並且用Tris緩衝液中和洗脫物。在Nanodrop上使用A280 nm測量流過物和兩份洗脫物中的蛋白質的量。delS7-S9P和S12P突變體部分地從Pro-L柱流過（未結合的），而S12P_R18P完全喪失與該柱的結合。
[0243]如
圖 7所示，將載入量設置為1.0並且示出了在其他樣品中收集的抗體的相對水平，反映為其分數量。
實例 2 ： KappaSelect （ KS ） KO 突變的開發 [0244]KappaSelect（KS）是一種透過將駱駝源性僅重鏈抗體（VHH）配體固定化而構築的親和層析材料。KS樹脂僅選擇性地與κ輕鏈的恆定區（CL）以高能力和親和力結合。
[0245]為了進一步擴展新型純化方法的開發，鑒定了會減少或完全根除抗體LC與KS配體以及與KS親和樹脂的結合的突變。設計並且測試阿達木單抗的CL結構域中的一系列單、雙或三重胺基酸取代（
圖 8，上部小圖）。產生含有這些不同突變LC的阿達木單抗變體，並且透過BLI或固定在樹脂上的KS相對於野生型形式表徵對KS配體的結合，以及其他幾種特性（包括表現力價、與靶蛋白TNFα的相互作用、加速穩定性和預測的免疫原性）。
[0246]使野生型和三種KappaSelect結合敲除突變體在Expi293F細胞中表現，並且使用如
圖 4中描述的方法通過mAbSelect SuRe親和樹脂純化。與野生型阿達木單抗的蛋白力價相比，三種KappaSelect結合敲除突變體具有相似的蛋白力價（
圖 8，下部小圖）。將野生型阿達木單抗用作參考。
[0247]評估阿達木單抗CL變體與KS配體（Cytiva）的BLI結合（
圖 9）。將CaptureSelect™生物素抗LC-κ（人類）偶聯物（Thermofisher Scientific，7103292100）稀釋在Octet結合緩衝液（磷酸鹽緩衝鹽水，pH 7.4，含1 mg/mL牛血清白蛋白）中，並且載入到鏈黴親和素（SA）生物感測器（Sartorius，18-5019）上，然後與100 nM野生型阿達木單抗和三種KappaSelect結合敲除突變體在關於生物膜層干涉法（Octet RED96e，ForteBio）的Octet結合緩衝液中結合。捕獲結合跡線和反應。
圖 9示出了每種阿達木單抗變體和野生型阿達木單抗的結合曲線。所有三種KappaSelect結合敲除突變體都喪失了與KappaSelect配體的結合。
[0248]阿達木單抗CL變體與溶液中的100 nM TNFα（R&D Systems，10291-TA-050）的BLI結合評估示出於
圖 10中。如上文對
圖 6所描述的，使用Forte Bio Octet生物感測器和抗人類IgG Fc捕獲（AHC）生物感測器尖端（Sartorius，18-5060）產生資料。示出了每種阿達木單抗CL變體、野生型阿達木單抗和不相關的（非TNFα結合）陰性對照抗體的結合曲線。
[0249]阿達木單抗CL變體相比於野生型與KS樹脂（Cytiva）的結合的評價示出於
圖 11中。將在中性pH緩衝液中的5 mg mAbSelect SuRe樹脂純化的阿達木單抗野生型和三種KappaSelect敲除突變體以1 mL/min的流速載入到1 mL的HiTrap KappaSelect柱（Cytiva 17545811）。然後將柱用10個柱體積（CV）的磷酸鹽緩衝鹽水洗滌。收集並且合併在流過物和洗滌緩衝液中的蛋白質。然後洗滌，將柱用5 CV 50 mM 甘胺酸-HCl，pH 2.5洗脫緩衝液洗脫，並且用1M，pH 9.0 Tris緩衝液中和洗脫物。在Nanodrop上使用A280 nm測量在流過物和洗脫物中的蛋白質的量。所有三種KappaSelect敲除突變體均處於流過狀態，沒有與KappaSelect柱結合。在
圖 11中示出的圖表中，示出了初始載入量（mg）用於與其他級分中收集的抗體量進行比較。
實例 3 ：使用非 pro-L 結合 LC 基於親和力去除錯配 LC 多特異性抗體種類的原理研究的證據 [0250]含有三特異性CODV的抗體含有不能結合pro-L的Vk2 Fab臂LC和能夠結合pro-L的非Vk2輕鏈。表現能夠結合pro-L的CODV臂LC，然後經MSS（Cytiva）處理（
圖 12）。然後在第二步中通過蛋白-L樹脂進一步純化含有目的triAb以及2xFabLC和2xCODV LC錯配種類的MSS洗脫材料。
[0251] 圖 13示出了來自三特異性CODV的2步純化的樣品的考馬斯染色SDS-PAGE凝膠。示出了在還原和非還原兩種條件下的MSS洗脫物/pro-L載入物、Pro-L FT/洗滌物和Pro-L洗脫物。如預期的那樣，在pro-L上的第二步純化導致選擇性去除2xFabLC錯配種類，這是由於存在不能與pro-L相互作用的Vk2 Fab臂LC。
實例 4 ：具有 Pro-L KO 突變的阿達木單抗變體的另外表徵 [0252]MSS純化後的阿達木單抗的野生型和VL FW1突變體形式的分析型尺寸排阻層析（aSEC）資料示出於
圖 14中。示出了預期主峰的百分比。
[0253] 圖 15示出了在穩定性加速測試（50 mM HEPES，pH 7.4，37ºC持續2週）結束時取得的野生型阿達木單抗和S12P-R18P突變體的樣品的分析。上部小圖顯示了非還原樣品和還原樣品的考馬斯染色SDS-PAGE凝膠（NuPAGE™ 4%至12%，Bis-Tris，Invitrogen，NP0321BOX）。下部小圖示出了每種相應樣品的aSEC資料。示出了預期主峰的百分比。
[0254]將阿達木單抗野生型和Pro-L KO S12P-R18P突變體緩衝在10 mM pH 6.0組胺酸緩衝液中，並且將蛋白質濃度相對於0.5 mg/mL歸一化。差示掃描螢光測定術（nano-DSF）資料和源自NanoTemper Prometheus的Tm示出於
圖 16中。將9 μl樣品載入到相應的毛細管（NanoTemper PR-C006）中，並且將溫度平衡在20ºC持續3 min，之後以1ºC/min逐步增加至95ºC。記錄螢光發射（330 nm和350 nm）隨溫度的變化。將隨溫度變化的在330 nm和350 nm處的螢光強度的比率的一階導數的最大值用於確定蛋白質的熔解溫度。
實例 5A. 具有 KS KO 突變的阿達木單抗變體的另外表特 [0255]MSS純化後的阿達木單抗的野生型和CL突變體形式的分析型尺寸排阻層析（aSEC）資料。結果示出於
圖 17中。示出了預期主峰的百分比。
[0256]在穩定性加速測試（40ºC持續2週）結束時取得的WT阿達木單抗和三種CL突變體的樣品的分析示出於
圖 18中。上部小圖示出了非還原樣品和還原樣品的考馬斯染色SDS-PAGE凝膠。下部小圖示出了每種相應樣品的aSEC資料。示出了預期主峰的百分比。
[0257]進行在F(ab)'2水準的阿達木單抗的WT和KappaSelect KO突變體的DSC分析。
[0258]將1 mg阿達木單抗的野生型和三種KappaSelect KO突變體用IdeZ蛋白酶（New England Biolabs，P0770S）在37ºC下過夜酶切。第二天，在SDS-PAGE上分析5 μg酶切的抗體，以確認F(ab)'2從Fc完全裂解。將其餘的蛋白酶酶切的抗體樣品載入在1 mL的CaptureSelect CH1-XL親和樹脂（Thermo Scientific 494346201）上。用PBS洗滌後，將樣品用5個柱體積的0.1 M甘胺酸緩衝液（pH 2.5）洗脫，並且用1 M Tris（pH 9.0）中和。
[0259]將樣品在10 mM組胺酸（pH 6.0）中進行緩衝液交換，並且在MicroCal PEAQ-DSC系統（Malvern Panalytical）上由15ºC至105ºC，在200ºC/h掃描速率下進行差示掃描量熱法（DSC）。結果示出於
圖 19中。用僅參考的緩衝液進行背景減法後，示出了蛋白質的熱容（Cp）隨溫度的變化。根據熔解曲線計算Tm（熔點）。
[0260] 圖 20中示出了野生型阿達木單抗和敲除KappaSelect樹脂結合的三種CL突變體的差示掃描螢光測定術（nano-DSF）資料和得出的Tm。所使用的DSF方法與
圖 16中描述的相同。
實例 5B. 使用非 KS 結合 LC 基於親和力去除錯配 LC 多特異性抗體種類的原理研究的證據 [0261]使用Expi293系統表現在其CODV輕鏈中具有單一Q199K突變的三特異性CODV，並且使用蛋白A純化，然後通過KappaSelect層析純化。SDS-PAGE證明了蛋白A洗出液中存在2x CODV LC三特異性Ab、2x Fab LC三特異性Ab和所需的完整三特異性Ab（
圖 24）。收集KappaSelect流過物和兩種低pH洗脫物級分（pH 1.7和2.5），並且透過SDS-PAGE分析。KappaSelect流過物主要含有如預期的2x CODV LC三特異性Ab，而洗出液不含有該錯配污染物（
圖 24），表明在CODV臂上的KappaSelect敲除突變能夠去除2x CODV LC tsAb種類。
實例 6 ：用於 CODV 抗體的三步親和純化程序 [0262]評價典型的用於多特異性抗體的三步親和純化程序，所述程序由mAbSelect SuRe、KappaSelect和蛋白-L組成。
[0263]在第一純化評價中，使用三步親和純化方法純化CODV三特異性抗體。將Q199K KS KO突變引入CODV臂的輕鏈中，並且將S12P-R18P ProL KO突變引入Fab臂的輕鏈中。該抗體還具有在CODV重鏈中的杵突變和在Fab臂的重鏈中的臼突變。
[0264]在第二純化評價中，使用三步親和純化方法純化CODV三特異性抗體。將Q199K KS KO突變引入Fab臂的輕鏈中，並且將S12P-R18P ProL KO突變引入CODV臂的輕鏈中。該抗體還具有在CODV重鏈中的杵突變和在Fab臂的重鏈中的臼突變。
[0265]4至14天後，在Expi293F細胞或ExpiCHO-S細胞中的蛋白質表現後收穫細胞培養上清液。然後在0.2 µm PES過濾器單元（或等效物）上過濾以去除任何微粒。
[0266] 步驟 1：使用以下條件進行mAbSelect SuRe親和純化。
[0267]柱：mAbSelect SuRe（Cytiva #11-0034-95）
[0268]尺寸：5 mL柱（16 mm x 25 mm）
[0269]默認流速：5 mL/min（最大約20 mL/min）
[0270]緩衝液：
A：0.2 M NaOH
B：20 mM磷酸鈉，150 mM NaCl，pH 7.2
C：50 mM乙酸鈉，pH 3.5
D：50 mM琥珀酸
E：20%乙醇
[0271]載入體積：使用30 mg IgG/mL樹脂計算所需的mAbSelect SuRe樹脂的量。5 mL柱將在培養的細胞上清液中捕獲＞ 150 mg IgG。
[0272]柱操作：
將4 CV緩衝液A消毒15分鐘接觸時間
用5 CV MilliQ水沖洗
用15 CV緩衝液B平衡
[0273]將含有抗體的細胞培養上清液載入
[0274]用10 CV緩衝液B洗滌
[0275]在含有1/10體積（2.5 mL）1M Tris pH 9的管中用5 CV緩衝液C洗脫以進行中和
[0276]用5 CV緩衝液D汽提柱，收集在具有600 mM磷酸氫二鈉的容器中以進行中和。這只是為了防止Ab如在IgG2的情況下有時看到的那樣洗脫得晚。
[0277]將柱用10 CV緩衝液A清洗
[0278]用5 CV MilliQ水沖洗
[0279]用10 CV緩衝液B重平衡
[0280]用10 CV緩衝液E洗滌並且儲存在4ºC。
[0281]將在中性pH緩衝液中含有抗體的mAbSelect SuRe洗脫物準備用於下一步的親和純化。使用A280 nm與Nanodrop測量蛋白質濃度。計算用於下一步KappaSelect親和純化的蛋白質量，使得其不超過結合能力。
[0282] 步驟 2：使用以下條件進行KappaSelect親和純化。
[0283]柱：HiTrap KappaSelect 5 × 1 mL（Cytiva 17545811）
[0284]尺寸：1 mL預填裝柱
[0285]默認流速：1 mL/min
[0286]緩衝液：
F：10 mM NaOH，pH 12
G：0.1 M甘胺酸緩衝液，pH 2.5
H：0.1 M檸檬酸，pH 2.1
[0287]樣品輸入：中和蛋白洗脫MSS。
[0288]載入體積：使用15 mg IgG/mL樹脂計算需要多少KappaSelect樹脂。
[0289]柱操作：
1) 就地清洗10 CV緩衝液F持續15分鐘接觸時間。將柱留在該高pH緩衝液中過長時間將使柱損壞。
2) 用5 CV MilliQ水沖洗
3) 用10 CV緩衝液B平衡
[0290]將來自mAbSelect SuRe步驟1.6的中和蛋白洗脫物載入到一個或多個KappaSelect柱
5) 用10 CV緩衝液B洗滌
6) 用5 CV緩衝液G在含有1/10體積1M Tris（pH 9）的管中洗脫以中和至pH 7-8
7) 將柱用5 CV緩衝液H汽提。將柱留在該低pH緩衝液中過長時間將使柱損壞。
8) 將柱用10 CV緩衝液F清潔。將柱留在該高pH緩衝液中過長時間將使柱損壞
9) 用5 CV MilliQ水沖洗
10) 用10 CV緩衝液B重平衡
11) 用10 CV緩衝液E洗滌並且儲存在4ºC
[0291]使在中性pH緩衝液中含有抗體的KappaSelect親和洗脫物準備用於下一步的蛋白-L親和純化。使用A280 nm與Nanodrop測量蛋白質濃度。計算用於下一步親和純化的蛋白質量，使得其不超過結合能力。
[0292] 步驟 3：使用以下條件進行蛋白-L親和純化。
[0293]柱：Thermo Scientific 89929 Pierce層析管柱蛋白L，1 × 5 mL
[0294]尺寸：1 mL預填裝柱
[0295]默認流速：1 mL/min
[0296]樣品輸入：來自KS樹脂的中和蛋白洗脫物
[0297]載入體積：使用4-5 mg人類IgG/mL樹脂床計算需要多少蛋白-L樹脂。
[0298]柱操作：
1) 就地清洗10 CV緩衝液F持續15分鐘接觸時間。將柱留在該高pH緩衝液中過長時間將使柱損壞。
2) 用5 CV MilliQ水沖洗
3) 用10 CV緩衝液B平衡
4) 將來自KappaSelect步驟的中和蛋白洗脫物載入到一個或多個蛋白-L柱
5) 用10 CV緩衝液B洗滌
6) 用5 CV緩衝液G在含有1/10體積1M Tris（pH 9）的管中洗脫以中和至pH 7-8
7) 將柱用10 CV緩衝液F清潔。將柱留在該高pH緩衝液中過長時間將使柱損壞
8) 用5 CV MilliQ水沖洗
9) 用10 CV緩衝液B重平衡
10) 用10 CV緩衝液E洗滌並且儲存在4ºC。
[0299]第一評價（CODV臂上的KS KO/Fab臂上的ProL KO）的結果示出於
圖 21中，並且第二評價（Fab臂上的KS KO/CODV臂上的ProL KO）的結果示出於
圖 22中。
實例 7. 雙特異性抗體的三步親和純化程序 [0300]評價如實例6中所述的典型三步親和純化程序。雙特異性抗體含有曲妥珠單抗臂和帕妥珠單抗臂。曲妥珠單抗臂含有S12P-R18P ProL KO突變和杵突變，並且帕妥珠單抗臂含有Q199K KS KO突變和臼突變。帕妥珠單抗臂還含有在CH3結構域中的RF突變。
[0301]MabSelect Sure洗脫的結果示出於
圖 23A。MabSelect Sure洗脫、KS洗脫和Pro-L洗脫的結果示出於
圖 23B中。
實例 8 ：用於多價抗體的兩步親和純化程序 [0302]評價典型的用於多價抗體的兩步親和純化程序，所述程序由用於多特異性抗體的KappaSelect和蛋白-L組成。所述多價抗體包含兩條輕鏈和兩條重鏈。
[0303]將Q199K KS KO突變引入多價抗體的一條輕鏈中，並且將S12P-R18P ProL KO突變引入多價抗體的另一條輕鏈中。
[0304]在宿主細胞中產生多價抗體。在4至14天後在蛋白質表現後，收穫細胞培養上清液。然後將細胞培養上清液在0.2 um PES過濾器單元（或等效物）上過濾以去除任何微粒。
[0305] 步驟 1：使用以下條件進行KappaSelect親和純化。
[0306]柱：HiTrap KappaSelect 5 × 1 mL（Cytiva 17545811）
[0307]尺寸：1 mL預填裝柱
[0308]默認流速：1 mL/min
[0309]緩衝液：
F：10 mM NaOH，pH 12
G：0.1 M甘胺酸緩衝液，pH 2.5
H：0.1 M檸檬酸，pH 2.1
[0310]樣品輸入：中和蛋白洗脫MSS。
[0311]載入體積：使用15 mg IgG/mL樹脂計算需要多少KappaSelect樹脂。
[0312]柱操作：
1) 就地清洗10 CV緩衝液F持續15分鐘接觸時間。將柱留在該高pH緩衝液中過長時間將使柱損壞。
2) 用5 CV MilliQ水沖洗
3) 用10 CV緩衝液B平衡
[0313]將過濾的細胞培養上清液載入到KappaSelect柱
5) 用10 CV緩衝液B洗滌
6) 用5 CV緩衝液G在含有1/10體積1M Tris（pH 9）的管中洗脫以中和至pH 7-8。收集包含多價抗體的級分。
7) 將柱用5 CV緩衝液H汽提。
8) 將柱用10 CV緩衝液F清洗。
9) 用5 CV MilliQ水沖洗
10) 用10 CV緩衝液B重平衡
11) 用10 CV緩衝液E洗滌並且儲存在4ºC
[0314]使在中性pH緩衝液中含有抗體的KappaSelect親和洗脫物準備用於下一步的蛋白-L親和純化。使用A280 nm與Nanodrop測量蛋白質濃度。計算用於下一步親和純化的蛋白質量，使得其不超過結合能力。
[0315] 步驟 2：使用以下條件進行蛋白-L親和純化。
[0316]柱：Thermo Scientific 89929 Pierce層析管柱蛋白L，1 × 5 mL
[0317]尺寸：1 mL預填裝柱
[0318]默認流速：1 mL/min
[0319]樣品輸入：來自KS樹脂的中和蛋白洗脫物
[0320]載入體積：使用4-5 mg人類IgG/mL樹脂床計算需要多少蛋白-L樹脂。
[0321]柱操作：
1) 就地清洗10 CV緩衝液F持續15分鐘接觸時間。將柱留在該高pH緩衝液中過長時間將使柱損壞。
2) 用5 CV MilliQ水沖洗
3) 用10 CV緩衝液B平衡
4) 將來自KappaSelect步驟的中和蛋白洗脫物載入到一個或多個蛋白-L柱
5) 用10 CV緩衝液B洗滌
6) 用5 CV緩衝液G在含有1/10體積1M Tris（pH 9）的管中洗脫以中和至pH 7-8。收集包含多價抗體的級分。
7) 將柱用10 CV緩衝液F清洗。
8) 用5 CV MilliQ水沖洗
9) 用10 CV緩衝液B重平衡
10) 用10 CV緩衝液E洗滌並且儲存在4ºC。
實例 9. 另外的 KappaSelect （ KS ） KO 突變的開發 [0322]設計並且測試抗體輕鏈（LC）的CL結構域中的其他系列的胺基酸取代，以鑒定減少或完全根除輕鏈與KS配體和KS親和樹脂的結合的取代或取代組合（參見例如，
實例 2 ）。將阿達木單抗（一種包含κ輕鏈和含有L234A和L235A突變（其中胺基酸編號是根據EU索引）的人類IgG Fc區變體的抗人類TNFα抗體）用作示例性抗體。在HEK293T細胞中表現包含兩條突變LC的阿達木單抗變體，所述兩條突變LC包含
(i) H198R取代，其中胺基酸編號是根據EU索引，
(ii) Q199W取代，其中胺基酸編號是根據EU索引，或
(iii) T109R和S202R取代，其中胺基酸編號是根據EU索引。經由蛋白A生物感測器使用生物膜干涉法確定每種阿達木單抗變體的表現力價。參見下
表 A 。經由蛋白A層析純化上清液，並且使用UV-280吸收確定純化的蛋白質的濃度。參見下
表 A 。
[0323]經由生物膜干涉法（BLI）分析阿達木單抗變體與Kappa Select柱配體的結合。將配體（TPP-13443、EFF-18-070-1、美洲駝抗人類LC-κ VHH單結構域抗體 [生物素]（目錄號：NABG-118）https://www.creativebiolabs.net/Anti-LC-kappa-VHH-Single-Domain-Antibody-Biotin-19155.htm）載入到鏈黴親和素-生物感測器上並且測量變體的親和力。結果呈現於下
表 A 中。（參見柱BLI（以%計的反應））。
表 A
[0324]使用來自GE Healthcare Life Science的HiTrap Kappa Select柱和ÄKTA Pure確認阿達木單抗變體與Kappa Select柱的相互作用的喪失。包含His198Arg取代的輕鏈的阿達木單抗變體的層析圖示出於
圖 25A中並且包含Gln199Trp取代的輕鏈的阿達木單抗變體的層析圖示出於
圖 25B中。
[0325]為了確認阿達木單抗變體與靶TNFα的結合的穩定性和特異性未受輕鏈取代影響，進行分析型尺寸排阻層析（方法：TSKgel SuperSW3000）和表面等離子體共振（Biacore 8K，方法：TOS,AG-514（來自酵母的人類TNFα Miltenyi，目錄號130-094）。結果示出於下
表 B 和
表 C 。
表 B. 尺寸排阻層析
表 C. 表面等離子體共振
[0326]已根據由本發明人發現或提出的特定實施例描述了本發明，以包括用於實踐本發明的優選模式。本領域具有通常知識者將理解，根據本公開文本，在不脫離本發明的預期範圍的情況下，可以對示例的具體實施例進行多種修改和改變。例如，由於密碼子冗餘，可以在不影響蛋白質序列的情況下對潛在的DNA序列做出改變。此外，由於對生物學功能的等效性考慮，可以在不影響生物學作用的種類或量的情況下對蛋白質結構進行改變。所有此類修改均旨在被包括在所附申請專利範圍的範圍內。
| 一個或多個輕鏈突變 ( 根據 EU 索引的胺基酸編號 ) | 表現產量 (mg) | 蛋白 A 純化後的最終蛋白質量 (mg) | 與野生型相比構築體的 BLI 反應 % (= 與 κ 配體的結合 %) |
| His198Arg | 15 | 10.3 | 7.87 |
| Gln199Trp | 54.7 | 30.2 | 1.66 |
| Thr109Arg + Ser202Arg | 70.0 | 35.0 | 12.47 |
| WT輕鏈(無突變) | 無數據 | 無數據 | 100.00 |
| 一個或多個輕鏈突變 ( 根據 EU 索引的胺基酸編號 ) | 純度 (%) | 高 MW 種類 - 聚集 (%) | 相對野生型的純度 % | 相對野生型的高 MW 種類 - 聚集 % |
| His198Arg | 90.50 | 9.50 | 91.04 | 1610.17 |
| Gln199Trp | 98.41 | 1.59 | 98.99 | 269.49 |
| Thr109Arg + Ser202Arg | 99.16 | 0.84 | 99.75 | 142.37 |
| WT輕鏈(無突變) | 99.41 | 0.59 | 100.00 | 100.00 |
| 一個或多個輕鏈突變 ( 根據 EU 索引的胺基酸編號 ) | KD(nM) | k on(1/(M*s)) | k off(1/s) | 相對野生型的 KD% | 相對野生型的 k on% | 相對野生型的 k off% | 結合 ( 定性 ) |
| His198Arg | 5.53E-11 | 3.80E+06 | 2.10E-04 | 104.14 | 92.68 | 92.68 | 是 |
| Gln199Trp | 5.28E-11 | 3.94E+06 | 2.08E-04 | 99.44 | 96.10 | 96.10 | 是 |
| Thr109Arg+Ser202Arg | 5.83E-11 | 3.71E+06 | 2.16E-04 | 109.79 | 90.49 | 90.49 | 是 |
| WT輕鏈(無突變) | 5.31E-11 | 4.10E+06 | 2.17E-04 | 100.00 | 100.00 | 100.00 | 是 |
無
[0042] 圖 1A是示例性二價結合蛋白的示意圖。
[0043] 圖 1B是示例性Triomab
®二價結合蛋白的示意圖。
[0044] 圖 1C是示例性Duomab
®二價結合蛋白的示意圖。
[0045] 圖 1D是具有附接到「杵」重鏈的scFv的示例性Ab-Nb三價結合蛋白的示意圖。
[0046] 圖 1E是具有附接到「杵」重鏈的VHH的示例性Ab-Nb三價結合蛋白的示意圖。
[0047] 圖 1F是包含在左側的CODV臂和在右側的Fab臂的示例性CODV多價結合蛋白的示意圖。
[0048] 圖 1G是包含兩條CODV臂的示例性CODV多價結合蛋白的示意圖。
[0049] 圖 1H是示例性交叉mab二價結合蛋白的示意圖，其中所述結合蛋白的一條臂的CL和CH1結構域進行了交換。
[0050] 圖 1I是示例性交叉mab二價結合蛋白的示意圖，其中所述結合蛋白的一條臂的VL和VH結構域進行了交換。
[0051] 圖 1J是示例性串聯Fab多價結合蛋白的示意圖，其中每個可變結構域包含VL、CL、VH和CH1結構域。
[0052] 圖 1K是示例性串聯Fab多價結合蛋白的示意圖，其中N末端可變結構域包含VL和VH結構域，並且C末端可變結構域包含VL、CL、VH和CH1結構域。
[0053] 圖 1L是包含Fab臂和融合蛋白臂的示例性多價結合蛋白的示意圖。Fab臂包含單一Fab。
[0054] 圖 1M是包含Fab臂和融合蛋白臂的示例性多價結合蛋白的示意圖。Fab臂包含串聯Fab。
[0055] 圖 2是用於純化CODV多價結合蛋白的代表性三步方法的示意圖。所需產物示出於虛線框中。CODV包含杵和臼取代。CODV的杵臂包含KappaSelect KO突變（例如，減少VL結構域與KappaSelect層析介質的結合的突變）。CODV的臼臂包含蛋白L KO突變（例如，減少CL結構域與蛋白L的結合的突變）和CH3結構域的RF突變（例如，H435R和436F突變，其中胺基酸編號是根據EU索引）（參見例如，Edelman等人, 1969,
Proc Natl Acad Sci USA63: 78-85）。代表性錯配產物示出在緊挨著所需產物的左上方。所述方法中的三個步驟包括蛋白A層析（例如，MabSelectSure®，（MSS）），然後是蛋白L層析，然後是KappaSelect（KS）層析。示出了錯配蛋白質的去除。
[0056] 圖 3示出了不同VLκ和λ亞型的胺基酸序列的比對。摘自Graille等人,
Structure, 第9卷, 679-687, 2001年8月。
[0057] 圖 4示出了篩選潛在ProL KO突變的結果。上部小圖示出了評價的突變。下部小圖示出了基於MabSelect
®Sure層析後的蛋白質產率的結果。
[0058] 圖 5示出了阿達木單抗（Adalimumab）ProL KO變體與ProL配體的生物膜干涉法（BLI）結合評估。
[0059] 圖 6示出了阿達木單抗ProL KO變體與TNFα的BLI結合評估。
[0060] 圖 7示出了阿達木單抗ProL KO變體相比於野生型與蛋白-L樹脂的結合的評價。
[0061] 圖 8示出了篩選潛在KS KO突變的結果。上部小圖示出了評價的突變。下部小圖顯示了基於MabSelect
®Sure層析後的蛋白質產率的結果
[0062] 圖 9示出了阿達木單抗KS KO變體與KS配體的BLI結合評估。
[0063] 圖 10示出了阿達木單抗KS KO變體與TNFα的BLI結合評估。
[0064] 圖 11示出了阿達木單抗KS KO變體相比於野生型與KS樹脂的結合的評價。
[0065] 圖 12示出了包含具有proL KO突變的Vk2 Fab臂LC和能夠結合pro-L的Vk1 CODV臂LC的含有三特異性CODV的抗體的兩步層析的示意圖。第一步是MSS層析。然後在第二步中透過蛋白-L樹脂進一步純化含有目的triAb以及2xFabLC和2xCODV LC錯配種類的MSS洗脫材料。
[0066] 圖 13示出了來自三特異性CODV的2步純化的樣品的考馬斯染色SDS-PAGE凝膠。
[0067] 圖 14示出了MSS純化後阿達木單抗的野生型和ProL KO突變形式的分析型尺寸排阻層析（aSEC）資料。示出了預期主峰的百分比。
[0068] 圖 15示出了在穩定性加速測試（40ºC持續2週）結束時取得的WT阿達木單抗和S12P-R18P突變體的樣品的分析。上部小圖示出了非還原樣品和還原樣品的考馬斯染色SDS-PAGE凝膠。下部小圖示出了每種相應樣品的aSEC資料。示出了預期主峰的百分比。
[0069] 圖 16示出了WT阿達木單抗和S12P-R18P突變體的差示掃描螢光測定術（nano-DSF）資料和得出的Tm。
[0070] 圖 17示出了MSS純化後阿達木單抗的野生型和KS KO突變形式的分析型尺寸排阻層析（aSEC）資料。示出了預期主峰的百分比。
[0071] 圖 18示出了在穩定性加速測試（40ºC持續2週）結束時取得的WT阿達木單抗和三種CL突變體的樣品的分析。上部小圖示出了非還原樣品和還原樣品的考馬斯染色SDS-PAGE凝膠。下部小圖示出了每種相應樣品的aSEC資料。預期主峰的百分比。
[0072] 圖 19示出了源自WT阿達木單抗和三種KS KO突變體的F(ab)'2的DSC分析。
[0073] 圖 20示出了WT阿達木單抗和三種KS KO突變體的nano-DSF資料和得出的Tm。
[0074] 圖 21示出了三步純化方法後的非還原樣品和還原樣品的考馬斯染色SDS-PAGE凝膠。所選的高分子量條帶的身份在左邊示出。
[0075] 圖 22示出了三步純化方法後的非還原樣品和還原樣品的考馬斯染色SDS-PAGE凝膠。所選的高分子量條帶的身份在左邊示出。
[0076] 圖 23A示出了作為三步純化方法的一部分的具有KS KO和ProL KO突變的雙特異性抗體的MSS純化的層析圖。MSS步驟、KS步驟和ProL步驟的層析圖示出在
圖 23B中。
[0077] 圖 24示出了來自三特異性CODV純化的樣品的考馬斯染色SDS-PAGE凝膠。
[0078] 圖 25A提供了包含His198Arg取代的輕鏈的阿達木單抗變體的層析圖，其中胺基酸編號是根據EU索引。
[0079] 圖 25B提供了包含Gln199Trp取代的輕鏈的阿達木單抗變體的層析圖，其中胺基酸編號是根據EU索引。
TW202417480A_112121459_SEQL.xml
無。
Claims (157)
- 一種多價結合蛋白，該多價結合蛋白包含形成兩個抗原結合結構域的四條多肽鏈；其中該四條多肽鏈包括： 第一重鏈多肽，其包含由下式表示的結構： VH 1-CH1 [I]， 第一輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構： VL 1-CL 1[II]， 第二重鏈多肽，其包含由下式表示的結構： VH 2-CH1 [III]， 和第二輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構： VL 2-CL 2[IV]； 其中： VL 1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域； VL 2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域，其中VL 2是κ1、κ3或κ4亞型輕鏈可變結構域， CL 1是第一免疫球蛋白輕鏈恆定結構域，其中CL 1是Cκ亞型輕鏈恆定結構域； CL 2是第二免疫球蛋白輕鏈恆定結構域； VH 1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域； VH 2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域； CH1是免疫球蛋白重鏈恆定結構域； 其中CL 1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的CL 1相比，該一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合， 其中VL 2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的VL 2相比，該一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且 其中VH 1與VL 1締合以形成第一抗原結合結構域，並且VH 2與VL 2締合以形成第二抗原結合結構域。
- 一種多價結合蛋白，該多價結合蛋白包含形成兩個抗原結合結構域的四條多肽鏈；其中該四條多肽鏈包括： 第一重鏈多肽，其包含由下式表示的結構： VH 1-CH1-CH2-CH3 [I]， 第一輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構： VL 1-CL 1[II]， 第二重鏈多肽，其包含由下式表示的結構： VH 2-CH1-CH2-CH3 [III]， 和第二輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構： VL 2-CL 2[IV]； 其中： VL 1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域； VL 2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域； CL 1是第一免疫球蛋白輕鏈恆定結構域； CL 2是第二免疫球蛋白輕鏈恆定結構域； VH 1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域； VH 2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域； CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恆定結構域， CH2是免疫球蛋白CH2重鏈恆定結構域，並且 CH3是免疫球蛋白CH3重鏈恆定結構域； 其中CL 1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的CL 1相比，該一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合， 其中VL 2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的VL 2相比，該一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且 其中VH 1與VL 1締合以形成第一抗原結合結構域，並且VH 2與VL 2締合以形成第二抗原結合結構域。
- 如請求項1或請求項2所述的多價結合蛋白，其中與沒有該一個或多個胺基酸取代的CL 1相比，包含該一個或多個取代的該CL 1與KappaSelect的結合減少了約90%。
- 如請求項1至3中任一項所述的多價結合蛋白，其中與沒有該一個或多個胺基酸取代的VL 2相比，包含該一個或多個取代的該VL 2與該蛋白L層析材料的結合減少了約90%。
- 如請求項1至4中任一項所述的多價結合蛋白，其中包含該一個或多個取代的該CL 1中的該一個或多個胺基酸取代在對應於109、110或199的位置處，其中編號是根據EU索引。
- 如請求項5所述的多價結合蛋白，其中包含該一個或多個取代的該CL 1中的該一個或多個胺基酸取代是T109A取代、V110D取代、Q199K取代、T109A-V110D取代或T109A-V110D-Q199K取代，其中胺基酸編號是根據EU索引。
- 如請求項1至4中任一項所述的多價結合蛋白，其中包含該一個或多個取代的該CL 1中的該一個或多個胺基酸取代在對應於109、198、199或202的位置處，其中編號是根據EU索引。
- 如請求項7所述的多價結合蛋白，其中包含該一個或多個取代的該CL 1中的該一個或多個胺基酸取代是H198R取代、Q199W取代或T109A-S202R取代，其中胺基酸編號是根據EU索引。
- 如請求項1至8中任一項所述的多價結合蛋白，其中包含該一個或多個取代的該VL 2中的該一個或多個胺基酸取代是架構胺基酸的取代。
- 如請求項1至9中任一項所述的多價結合蛋白，其中包含該一個或多個取代的該VL 2中的該一個或多個胺基酸取代在對應於12或18的位置處，其中編號是根據Kabat。
- 如請求項10所述的多價結合蛋白，其中包含該一個或多個取代的該VL 2中的該一個或多個胺基酸取代是S12P取代、R18P取代、R18Q取代、S12P-R18P取代或S12P-R18Q取代，其中編號是根據Kabat。
- 如請求項2至11中任一項所述的多價結合蛋白，其中該第一重鏈多肽的CH3結構域和/或該第二重鏈多肽的CH3結構域是人類IgG1或IgG4 CH3結構域。
- 如請求項2至12中任一項所述的多價結合蛋白，其中該第一重鏈多肽的CH3結構域包含對應於人類IgG1的位置354和366的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引，其中該胺基酸取代是S354C和T366W；其中該第二重鏈多肽的CH3結構域包含對應於人類IgG1的位置349、366、368、407、435和436的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引，其中該胺基酸取代是Y349C、T366S、L368A和Y407V。
- 如請求項2至13中任一項所述的多價結合蛋白，其中該第一重鏈多肽的CH3結構域包含對應於人類IgG1的位置349、366、368、407、435和436的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引，其中該胺基酸取代是Y349C、T366S、L368A和Y407V；其中該第二重鏈多肽的CH3結構域包含對應於人類IgG1的位置354和366的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引，其中該胺基酸取代是S354C和T366W。
- 如請求項13所述的多價結合蛋白，其中該第二重鏈多肽的CH3包含減少與蛋白A的結合的一個或多個胺基酸取代。
- 如請求項14所述的多價結合蛋白，其中該第一重鏈多肽的CH3包含減少與蛋白A的結合的一個或多個胺基酸取代。
- 如請求項15或16所述的多價結合蛋白，其中減少與蛋白A的結合的一個或多個胺基酸取代是對應於人類IgG1的位置435和436的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引。
- 如請求項17所述的多價結合蛋白，其中該胺基酸取代是H435R和Y436F，其中胺基酸編號是根據EU索引。
- 如請求項2至18中任一項所述的多價結合蛋白，其中該第一重鏈多肽的CH1、CH2和CH3結構域不同於該第二重鏈多肽的CH1、CH2和CH3結構域。
- 如請求項2至19中任一項所述的多價結合蛋白，其中該第一重鏈多肽源自與該第二重鏈多肽不同的物種。
- 如請求項2至11、19或20中任一項所述的多價結合蛋白，其中該第一重鏈多肽和該第一輕鏈多肽源自小鼠重鏈免疫球蛋白和小鼠輕鏈免疫球蛋白，並且該第二重鏈多肽和該第二輕鏈多肽源自大鼠重鏈免疫球蛋白和大鼠輕鏈免疫球蛋白。
- 如請求項2至11中任一項所述的多價結合蛋白，其中該第一重鏈多肽和該第二重鏈多肽各自包含IgG4 CH3結構域。
- 如請求項22所述的多價結合蛋白，其中該第一重鏈多肽包含K409R胺基酸取代，並且該第二重鏈多肽包含F405L胺基酸取代，其中編號是根據EU索引。
- 如請求項1至23中任一項所述的多價結合蛋白，其中該多價結合蛋白是雙特異性抗原結合蛋白。
- 如請求項1至24中任一項所述的多價結合蛋白，其中該第一抗原結合結構域和該第二抗原結合結構域結合不同的抗原。
- 如請求項2至18中任一項所述的多價結合蛋白， 其中該第一重鏈多肽鏈包含由下式表示的結構： VH 1-CH1-CH2-CH3-VH 3-L-VL 3[Ia]， 其中該第二重鏈多肽包含由下式表示的結構： VH 2-CH1-CH2-CH3 [IIIa]， 其中： VL 3是第三免疫球蛋白輕鏈可變結構域； VH 3是第三免疫球蛋白重鏈可變結構域； L是胺基酸連接子； 其中VH 3與VL 3締合以形成第三抗原結合結構域。
- 如請求項2至18中任一項所述的多價結合蛋白， 其中該第一重鏈多肽鏈包含由下式表示的結構： VH 1-CH1-CH2-CH3-VH 3[Ib]， 其中該第二重鏈多肽包含由下式表示的結構： VH 2-CH1-CH2-CH3 [IIIb]， 其中： VH 3是第三免疫球蛋白重鏈可變結構域。
- 如請求項26所述的多價結合蛋白，其中VL 3包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的VL 3相比，該一個或多個胺基酸取代減少與該蛋白L層析材料的結合。
- 如請求項26所述的多價結合蛋白，其中VL 3是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2免疫球蛋白輕鏈可變結構域。
- 如請求項26至29中任一項所述的多價結合蛋白，其中該多價結合蛋白是雙特異性的或三特異性的。
- 如請求項26至30中任一項所述的多價結合蛋白，其中該第一抗原結合結構域、該第二抗原結合結構域結合和該第三抗原結合結構域結合兩種或三種不同的抗原。
- 如請求項26至30中任一項所述的多價結合蛋白，其中該第一抗原結合結構域結合第一抗原，該第二抗原結合結構域結合第二抗原，並且該第三抗原結合結構域結合第三抗原。
- 如請求項26至30中任一項所述的多價結合蛋白，其中該第一抗原結合結構域和該第二抗原結合結構域結合第一抗原，並且該第三抗原結合結構域結合第二抗原。
- 一種多價結合蛋白，該多價結合蛋白包含形成三個抗原結合結構域的四條多肽鏈；其中該四條多肽鏈包括： 第一重鏈多肽，其包含由下式表示的結構： VH 1-L 3-VH 2-L 4-CH1 [I]， 第一輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構： VL 2-L 1-VL 1-L 2-CL 1[II]， 第二重鏈多肽，其包含由下式表示的結構： VH 3-CH1 [III]， 和第二輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構： VL 3-CL 2[IV] 其中： VL 1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域； VL 2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域； VL 3是第三免疫球蛋白輕鏈可變結構域； VH 1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域； VH 2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域； VH 3是第三免疫球蛋白重鏈可變結構域； CL 1是第一免疫球蛋白輕鏈恆定結構域； CL 2是第二免疫球蛋白輕鏈恆定結構域； CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恆定結構域；並且 L 1、L 2、L 3和L 4是胺基酸連接子； 其中該式I的多肽和該式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對； 其中VH 1與VL 1締合以形成第一抗原結合結構域，VH 2與VL 2締合以形成第二抗原結合結構域，並且VH 3與VL 3締合以形成第三抗原結合結構域；並且 其中： a) CL 1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的CL 1相比，該一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL 3包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的VL 3相比，該一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合； b) CL 2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的CL 2相比，該一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL 1和VL 2各自包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的VL 1和VL 2相比，該一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合； c) CL 2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的CL 2相比，該一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL 1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的VL 1相比，該一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且其中VL 2是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域；或 d) CL 2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的CL 2相比，該一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL 2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的VL 2相比，該一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且其中VL 1是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域。
- 一種多價結合蛋白，該多價結合蛋白包含形成三個抗原結合結構域的四條多肽鏈；其中該四條多肽鏈包括： 第一重鏈多肽，其包含由下式表示的結構： VH 1-L 3-VH 2-L 4-CH1-CH2-CH3 [Ia]， 第一輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構： VL 2-L 1-VL 1-L 2-CL 1[II]， 第二重鏈多肽，其包含由下式表示的結構： VH 3-CH1-CH2-CH3 [IIIa]， 和第二輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構： VL 3-CL 2[IV] 其中： VL 1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域； VL 2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域； VL 3是第三免疫球蛋白輕鏈可變結構域； VH 1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域； VH 2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域； VH 3是第三免疫球蛋白重鏈可變結構域； CL 1是第一免疫球蛋白輕鏈恆定結構域； CL 2是第二免疫球蛋白輕鏈恆定結構域； CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恆定結構域； CH2是免疫球蛋白CH2重鏈恆定結構域； CH3是免疫球蛋白CH3重鏈恆定結構域；並且 L 1、L 2、L 3和L 4是胺基酸連接子； 其中該式I的多肽和該式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對； 其中VH 1與VL 1締合以形成第一抗原結合結構域，VH 2與VL 2締合以形成第二抗原結合結構域，並且VH 3與VL 3締合以形成第三抗原結合結構域；並且 其中： a) CL 1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的CL 1相比，該一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL 3包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的VL 3相比，該一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合； b) CL 2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的CL 2相比，該一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL 1和VL 2各自包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的VL 1和VL 2相比，該一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合； c) CL 2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的CL 2相比，該一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL 1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的VL 1相比，該一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且其中VL 2是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型輕鏈可變免疫球蛋白結構域；或 d) CL 2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的CL 2相比，該一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL 2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的VL 2相比，該一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且其中VL 1是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型輕鏈可變免疫球蛋白結構域。
- 如請求項34或35所述的多價結合蛋白，其中該結合蛋白是三特異性的並且能夠特異性結合三種不同抗原標靶。
- 如請求項34至36中任一項所述的多價結合蛋白，其中L 1、L 2、L 3和/或L 4中的至少一個的長度各自獨立地是0個胺基酸。
- 如請求項34至36中任一項所述的多價結合蛋白，其中L 1、L 2、L 3和/或L 4的長度各自獨立地是至少一個胺基酸。
- 如請求項34或35所述的多價結合蛋白，其中： 該第二重鏈多肽包含由下式表示的結構： VH 3-L 5-VH 4-L 6-CH1 [IIIb]， 和第二輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構： VL 4-L 7-VL 3-L 8-CL 2[IVa] 其中： VL 4是第四免疫球蛋白輕鏈可變結構域； VH 4是第四免疫球蛋白重鏈可變結構域； L 5、L 6、L 7和L 8是胺基酸連接子； 其中該式IIIa的多肽和該式IVa的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對； 其中VH 4與VL 4締合以形成第四抗原結合結構域；並且 其中： a) CL 1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的CL 1相比，該一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL 3和VL 4各自包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的VL 3和VL 4相比，該一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合； b) CL 1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的CL 1相比，該一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL 3包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的VL 3相比，該一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且其中VL 4是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域； c) CL 1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的CL 1相比，該一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL 4包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的VL 4相比，該一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且其中VL 3是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域； d) CL 2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的CL 2相比，該一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL 1和VL 2各自包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的VL 1和VL 2相比，該一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合； e) CL 2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的CL 2相比，該一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL 1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的VL 1相比，該一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且其中VL 2是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域；或 f) CL 2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的CL 2相比，該一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL 2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的VL 2相比，該一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且其中VL 1是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域。
- 如請求項39所述的多價結合蛋白，其中： 該第二重鏈多肽包含由下式表示的結構： VH 3-L 5-VH 4-L 6-CH1-CH2-CH3 [IIIc]， 其中： CH2是免疫球蛋白CH2重鏈恆定結構域，並且 CH3是免疫球蛋白CH3重鏈恆定結構域。
- 如請求項39或40所述的多價結合蛋白，其中該結合蛋白是四特異性的並且能夠特異性結合四種不同抗原標靶。
- 如請求項39至41中任一項所述的多價結合蛋白，其中L 1、L 2、L 3、L 4、L 5、L 6、L 7和/或L 8中的至少一個的長度各自獨立地是0個胺基酸。
- 如請求項39至41中任一項所述的多價結合蛋白，其中L 1、L 2、L 3、L 4、L 5、L 6、L 7和/或L 8的長度各自獨立地是至少一個胺基酸。
- 如請求項34至43中任一項所述的多價結合蛋白，其中與沒有該一個或多個胺基酸取代的CL 1或CL 2相比，包含該一個或多個胺基酸取代的CL 1或CL 2與該KappaSelect層析材料的結合減少了約90%。
- 如請求項34至44中任一項所述的多價結合蛋白，其中與沒有該一個或多個胺基酸取代的VL 1、VL 2、VL 3和/或VL 4相比，包含該一個或多個取代的VL 1、VL 2、VL 3和/或VL 4與該蛋白L層析材料的結合減少了約90%。
- 如請求項34至45中任一項所述的多價結合蛋白，其中該CL 1或該CL 2中的該一個或多個胺基酸取代在對應於109、110或199的位置處，其中編號是根據EU索引。
- 如請求項46所述的多價結合蛋白，其中包含該一個或多個胺基酸取代的CL 1或CL 2中的該一個或多個胺基酸取代是T109A取代、V110D取代、Q199K取代、T109A-V110D取代或T109A-V110D-Q199K取代，其中胺基酸編號是根據EU索引。
- 如請求項34至45中任一項所述的多價結合蛋白，其中包含該一個或多個取代的CL 1或CL 2中的該一個或多個胺基酸取代在對應於109、198、199或202的位置處，其中編號是根據EU索引。
- 如請求項48所述的多價結合蛋白，其中包含該一個或多個取代的CL 1或CL 2中的該一個或多個胺基酸取代是H198R取代、Q199W取代或T109A-S202R取代，其中胺基酸編號是根據EU索引。
- 如請求項34至49中任一項所述的多價結合蛋白，其中包含該一個或多個取代的VL 1、VL 2、VL 3和/或VL 4中的該一個或多個胺基酸取代是架構胺基酸的取代。
- 如請求項34至50中任一項所述的多價結合蛋白，其中包含該一個或多個取代的VL 1、VL 2、VL 3和/或VL 4中的該一個或多個胺基酸取代在對應於12或18的位置處，其中編號是根據Kabat。
- 如請求項51所述的多價結合蛋白，其中包含該一個或多個取代的VL 1、VL 2、VL 3和/或VL 4中的該一個或多個胺基酸取代是S12P取代、R18P取代、R18Q取代、S12P-R18P取代或S12P-R18Q取代，其中編號是根據Kabat。
- 如請求項35至38和40至52中任一項所述的多價結合蛋白，其中該第一重鏈多肽的CH3結構域和/或該第二重鏈多肽的CH3結構域是人類IgG1或IgG4 CH3結構域。
- 如請求項35至38和40至53中任一項所述的多價結合蛋白，其中該第一重鏈多肽的CH3結構域包含對應於人類IgG1的位置354和366的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引，其中該胺基酸取代是S354C和T366W；其中該第二重鏈多肽的CH3結構域包含對應於人類IgG1的位置349、366、368、407、435和436的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引，其中該胺基酸取代是Y349C、T366S、L368A和Y407V。
- 如請求項35至38和40至53中任一項所述的多價結合蛋白，其中該第一重鏈多肽的CH3結構域包含對應於人類IgG1的位置349、366、368、407、435和436的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引，其中該胺基酸取代是Y349C、T366S、L368A和Y407V；其中該第二重鏈多肽的CH3結構域包含對應於人類IgG1的位置354和366的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引，其中該胺基酸取代是S354C和T366W。
- 如請求項54所述的多價結合蛋白，其中該第二重鏈多肽的CH3包含減少與蛋白A的結合的一個或多個胺基酸取代。
- 如請求項55所述的多價結合蛋白，其中該第一重鏈多肽的CH3包含減少與蛋白A的結合的一個或多個胺基酸取代。
- 如請求項56或57所述的多價結合蛋白，其中減少與蛋白A的結合的一個或多個胺基酸取代是對應於人類IgG1的位置435和436的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引。
- 如請求項58所述的多價結合蛋白，其中該胺基酸取代是H435R和Y436F，其中胺基酸編號是根據EU索引。
- 一種多價結合蛋白，該多價結合蛋白包含形成兩個抗原結合結構域的四條多肽鏈；其中該四條多肽鏈包括： 第一重鏈多肽，其包含由下式表示的結構： VH 1-CH1 [I]， 第一輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構： VL 1-CL 1[II]， 第二重鏈多肽，其包含由下式表示的結構： VH 2-CL 2[III]， 和第二輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構： VL 2-CH1 [IV]； 其中： VL 1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域； VL 2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域； CL 1是第一免疫球蛋白輕鏈恆定結構域； CL 2是第二免疫球蛋白輕鏈恆定結構域； VH 1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域； VH 2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域； CH1是免疫球蛋白重鏈恆定結構域 其中 a) CL 2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的CL 2相比，該一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL 1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的VL 1相比，該一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，或 b) CL 1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的CL 1相比，該一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL 2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的VL 2相比，該一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合； 並且其中VH 1與VL 1締合以形成第一抗原結合結構域，並且VH 2與VL 2締合以形成第二抗原結合結構域。
- 一種多價結合蛋白，該多價結合蛋白包含形成兩個抗原結合結構域的四條多肽鏈；其中該四條多肽鏈包括： 第一重鏈多肽，其包含由下式表示的結構： VH 1-CH1-CH2-CH3 [I]， 第一輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構： VL 1-CL 1[II]， 第二重鏈多肽，其包含由下式表示的結構： VH 2-CL 2-CH2-CH3 [III]， 和第二輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構： VL 2-CH1 [IV]； 其中： VL 1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域； VL 2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域； CL 1是第一免疫球蛋白輕鏈恆定結構域； CL 2是第二免疫球蛋白輕鏈恆定結構域； VH 1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域； VH 2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域； CH1是免疫球蛋白重鏈恆定結構域； CH2是免疫球蛋白CH2重鏈恆定結構域；並且 CH3是免疫球蛋白CH3重鏈恆定結構域 其中 a) CL 2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的CL 2相比，該一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL 1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的VL 1相比，該一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，或 b) CL 1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的CL 1相比，該一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL 2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的VL 2相比，該一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合； 並且其中VH 1與VL 1締合以形成第一抗原結合結構域，並且VH 2與VL 2締合以形成第二抗原結合結構域。
- 一種多價結合蛋白，該多價結合蛋白包含形成兩個抗原結合結構域的四條多肽鏈；其中該四條多肽鏈包括： 第一重鏈多肽，其包含由下式表示的結構： VH 1-CH1 [I]， 第一輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構： VL 1-CL 1[II]， 第二重鏈多肽，其包含由下式表示的結構： VL 2-CH1 [III]， 和第二輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構： VH 2-CL 2[IV]； 其中： VL 1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域； VL 2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域； CL 1是第一免疫球蛋白輕鏈恆定結構域； CL 2是第二免疫球蛋白輕鏈恆定結構域； VH 1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域； VH 2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域； CH1是免疫球蛋白重鏈恆定結構域； CH2是免疫球蛋白CH2重鏈恆定結構域；並且 CH3是免疫球蛋白CH3重鏈恆定結構域； 其中 a) CL 2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的CL 2相比，該一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL 1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的VL 1相比，該一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，或 b) CL 1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的CL 1相比，該一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL 2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的VL 2相比，該一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合； 並且其中VH 1與VL 1締合以形成第一抗原結合結構域，並且VH 2與VL 2締合以形成第二抗原結合結構域。
- 一種多價結合蛋白，該多價結合蛋白包含形成兩個抗原結合結構域的四條多肽鏈；其中該四條多肽鏈包括： 第一重鏈多肽，其包含由下式表示的結構： VH 1-CH1-CH2-CH3 [I]， 第一輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構： VL 1-CL 1[II]， 第二重鏈多肽，其包含由下式表示的結構： VH 2-CH1-CH2-CH3 [III]， 和第二輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構： VL 2-CL 2[IV]； 其中： VL 1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域； VL 2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域； CL 1是第一免疫球蛋白輕鏈恆定結構域； CL 2是第二免疫球蛋白輕鏈恆定結構域； VH 1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域； VH 2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域； CH1是免疫球蛋白重鏈恆定結構域； CH2是免疫球蛋白CH2重鏈恆定結構域；並且 CH3是免疫球蛋白CH3重鏈恆定結構域； 其中 a) CL 2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的CL 2相比，該一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL 1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的VL 1相比，該一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，或 b) CL 1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的CL 1相比，該一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL 2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的VL 2相比，該一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合； 並且其中VH 1與VL 1締合以形成第一抗原結合結構域，並且VH 2與VL 2締合以形成第二抗原結合結構域。
- 如請求項60至63中任一項所述的多價結合蛋白，其中與沒有該一個或多個胺基酸取代的CL 1或CL 2相比，包含該一個或多個胺基酸取代的CL 1或CL 2與該KappaSelect層析材料的結合減少了約90%。
- 如請求項60至64中任一項所述的多價結合蛋白，其中與沒有該一個或多個胺基酸取代的VL 1或VL 2相比，包含該一個或多個胺基酸取代的VL 1或VL 2與該蛋白L層析材料的結合減少了約90%。
- 如請求項60至65中任一項所述的多價結合蛋白，其中包含該一個或多個胺基酸取代的CL 1或CL 2中的該一個或多個胺基酸取代在對應於109、110或199的位置處，其中編號是根據EU索引。
- 如請求項66所述的多價結合蛋白，其中包含該一個或多個胺基酸取代的CL 1或CL 2中的該一個或多個胺基酸取代是T109A取代、V110D取代、Q199K取代、T109A-V110D取代或T109A-V110D-Q199K取代。
- 如請求項60至65中任一項所述的多價結合蛋白，其中包含該一個或多個取代的CL 1或CL 2中的該一個或多個胺基酸取代在對應於109、198、199或202的位置處，其中編號是根據EU索引。
- 如請求項68所述的多價結合蛋白，其中包含該一個或多個取代的CL 1或CL 2中的該一個或多個胺基酸取代是H198R取代、Q199W取代或T109A-S202R取代，其中胺基酸編號是根據EU索引。
- 如請求項60至69中任一項所述的多價結合蛋白，其中包含該一個或多個胺基酸取代的VL 1或VL 2中的該一個或多個胺基酸取代是架構胺基酸的取代。
- 如請求項60至70中任一項所述的多價結合蛋白，其中包含該一個或多個胺基酸取代的VL 1或VL 2中的該一個或多個胺基酸取代是在對應於12或18的位置處，其中編號是根據Kabat。
- 如請求項71所述的多價結合蛋白，其中包含該一個或多個胺基酸取代的VL 1或VL 2中的該一個或多個胺基酸取代是S12P取代、R18P取代、R18Q取代、S12P-R18P取代或S12P-R18Q取代，其中編號是根據Kabat。
- 如請求項57至66中任一項所述的多價結合蛋白，其中該第一重鏈多肽的CH3結構域和/或該第二重鏈多肽的CH3結構域是人類IgG1或IgG4 CH3結構域。
- 如請求項61至73中任一項所述的多價結合蛋白，其中該第一重鏈多肽的CH3結構域包含對應於人類IgG1的位置354和366的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引，其中該胺基酸取代是S354C和T366W；其中該第二重鏈多肽的CH3結構域包含對應於人類IgG1的位置349、366、368、407、435和436的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引，其中該胺基酸取代是Y349C、T366S、L368A和Y407V。
- 如請求項61至74中任一項所述的多價結合蛋白，其中該第一重鏈多肽的CH3結構域包含對應於人類IgG1的位置349、366、368、407、435和436的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引，其中該胺基酸取代是Y349C、T366S、L368A和Y407V；其中該第二重鏈多肽的CH3結構域包含對應於人類IgG1的位置354和366的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引，其中該胺基酸取代是S354C和T366W。
- 如請求項74所述的多價結合蛋白，其中該第二重鏈多肽的CH3包含減少與蛋白A層析材料的結合的一個或多個胺基酸取代。
- 如請求項75所述的多價結合蛋白，其中該第一重鏈多肽的CH3包含減少與蛋白A層析材料的結合的一個或多個胺基酸取代。
- 如請求項76或77所述的多價結合蛋白，其中減少與該蛋白A層析材料的結合的一個或多個胺基酸取代對應於人類IgG1的位置435和436的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引。
- 如請求項78所述的多價結合蛋白，其中該胺基酸取代是H435R和Y436F，其中胺基酸編號是根據EU索引。
- 如請求項56至73中任一項所述的多價結合蛋白，其中該多價結合蛋白是雙特異性抗原結合蛋白。
- 如請求項60至80中任一項所述的多價結合蛋白，其中該第一抗原結合結構域和該第二抗原結合結構域結合不同的抗原。
- 一種多價結合蛋白，該多價結合蛋白包含形成四個抗原結合結構域的四條多肽鏈；其中該四條多肽鏈包括： 第一重鏈多肽，其包含由下式表示的結構： VH 1-CH1 1-L 1-VH 2-CH1 2[I]， 第一輕鏈多肽，其包含由下式表示的結構： VL 1-CL 1-L 2-VL 2-CL 2[II]， 第二重鏈多肽，其包含由下式表示的結構： VH 3-CH1 3-L 3-VH 4-CH1 4[III]， 第二輕鏈多肽，其包含由下式表示的結構： VL 3-CL 3-L 4-VL 4-CL 4[IV] 其中： VL 1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域； VL 2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域； VL 3是第三免疫球蛋白輕鏈可變結構域； VL 4是第四免疫球蛋白輕鏈可變結構域； CL 1是第一免疫球蛋白輕鏈恆定結構域； CL 2是第二免疫球蛋白輕鏈恆定結構域； CL 3是第三免疫球蛋白輕鏈恆定結構域； CL 4是第四免疫球蛋白輕鏈恆定結構域； VH 1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域； VH 2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域； VH 3是第三免疫球蛋白重鏈可變結構域； VH 4是第四免疫球蛋白重鏈可變結構域； CH1 1是第一免疫球蛋白重鏈恆定結構域； CH1 2是第二免疫球蛋白重鏈恆定結構域； CH1 3是第三免疫球蛋白重鏈恆定結構域； CH1 4是第四免疫球蛋白重鏈恆定結構域； 並且 L 1、L 2、L 3和L 4是胺基酸連接子； 其中： a) CL 1和CL 2各自包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的CL 1和CL 2相比，該一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL 3和VL 4各自包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的VL 3和VL 4相比，該一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合； b) CL 1和CL 2各自包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的CL 1和CL 2相比，該一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL 3包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的VL 3相比，該一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且VL 4是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域； c) CL 1和CL 2各自包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的CL 1和CL 2相比，該一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL 4包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的VL 4相比，該一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且其中VL 3是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域； d) CL 1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的CL 1相比，該一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，CL 2是λ亞型免疫球蛋白輕鏈恆定結構域，並且VL 3和VL 4各自包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的VL 1和VL 2相比，該一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合； e) CL 1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的CL 1相比，該一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，CL 2是λ亞型免疫球蛋白輕鏈恆定結構域，VL 3包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的VL 3相比，該一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且VL 4是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域； f) CL 1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的CL 1相比，該一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，CL 2是λ亞型免疫球蛋白輕鏈恆定結構域，VL 4包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的VL 4相比，該一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且其中VL 3是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域； g) CL 2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的CL 2相比，該一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，CL 1是λ亞型免疫球蛋白輕鏈恆定結構域，並且VL 3和VL 4各自包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的VL 3和VL 4相比，該一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合； h) CL 2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的CL 2相比，該一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，CL 1是λ亞型免疫球蛋白輕鏈恆定結構域，VL 3包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的VL 3相比，該一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且VL 4是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域； i) CL 2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的CL 2相比，該一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，CL 1是λ亞型免疫球蛋白輕鏈恆定結構域，VL 4包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的VL 4相比，該一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且其中VL 3是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域； 並且其中VL 1和VH 1形成第一抗原結合結構域，VL 2和VH 2形成第二抗原結合結構域，VL 3和VH 3形成第三抗原結合結構域，並且VL 4和VH 4形成第四抗原結合結構域。
- 如請求項82所述的多價結合蛋白，其中L 1、L 2、L 3或L 4中的至少一個的長度各自獨立地是0個胺基酸。
- 如請求項82或83所述的結合蛋白，其中L 1、L 2、L 3或L 4中的至少一個的長度各自獨立地是至少一個胺基酸。
- 一種多價結合蛋白，該多價結合蛋白包含形成四個抗原結合結構域的四條多肽鏈；其中該四條多肽鏈包括： 第一重鏈多肽，其包含由下式表示的結構： VH 1-L 1-VH 2-L 2-CH1 1[I]， 第一輕鏈多肽，其包含由下式表示的結構： VL 1-L 3-VL 2-L 4-CL 1[II]， 第二重鏈多肽，其包含由下式表示的結構： VH 3-L 5-VH 4-L 6-CH1 2[III]， 第二輕鏈多肽，其包含由下式表示的結構： VL 3-L 7-VL 4-L 8-CL 2[IV] 其中： VL 1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域； VL 2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域； VL 3是第三免疫球蛋白輕鏈可變結構域； VL 4是第四免疫球蛋白輕鏈可變結構域； CL 1是第一免疫球蛋白輕鏈恆定結構域； CL 2是第二免疫球蛋白輕鏈恆定結構域； VH 1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域； VH 2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域； VH 3是第三免疫球蛋白重鏈可變結構域； VH 4是第四免疫球蛋白重鏈可變結構域； CH1 1是第一免疫球蛋白重鏈恆定結構域； CH1 2是第二免疫球蛋白重鏈恆定結構域； 並且 L 1、L 2、L 3、L 4、L 5、L 6、L 7和L 8是胺基酸連接子； 其中： a) CL 1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的CL 1相比，該一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL 3和VL 4各自包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的VL 3和VL 4相比，該一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合； b) CL 1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的CL 1相比，該一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL 3包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的VL 3相比，該一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且VL 4是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域； c) CL 1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的CL 1相比，該一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL 4包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的VL 4相比，該一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且其中VL 3是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域； 並且其中VL 1和VH 1形成第一抗原結合結構域，VL 2和VH 2形成第二抗原結合結構域，VL 3和VH 3形成第三抗原結合結構域，並且VL 4和VH 4形成第四抗原結合結構域。
- 如請求項85所述的多價結合蛋白，其中L 1、L 2、L 3、L 4、L 5、L 6、L 7或L 8中的至少一個的長度各自獨立地是0個胺基酸。
- 如請求項85或86所述的結合蛋白，其中L 1、L 2、L 3、L 4、L 5、L 6、L 7或L 8中的至少一個的長度各自獨立地是至少一個胺基酸。
- 如請求項82至87中任一項所述的多價結合蛋白，其中與沒有該一個或多個胺基酸取代的CL 1和/或CL 2相比，包含該一個或多個胺基酸取代的CL 1和/或CL 2與該KappaSelect層析材料的結合減少了約90%。
- 如請求項82至88中任一項所述的多價結合蛋白，其中與沒有該一個或多個胺基酸取代的VL 3和/或VL 4相比，包含該一個或多個胺基酸取代的VL 3和/或VL 4與該蛋白L層析材料的結合減少了約90%。
- 如請求項82至89中任一項所述的多價結合蛋白，其中包含該一個或多個胺基酸取代的CL 1和/或CL 2中的該一個或多個胺基酸取代在對應於109、110或199的位置處，其中編號是根據EU索引。
- 如請求項90所述的多價結合蛋白，其中包含該一個或多個胺基酸取代的CL 1和/或CL 2中的該一個或多個胺基酸取代是T109A取代、V110D取代、Q199K取代、T109A-V110D取代或T109A-V110D-Q199K取代，其中胺基酸編號是根據EU索引。
- 如請求項82至89中任一項所述的多價結合蛋白，其中包含該一個或多個取代的CL 1和/或CL 2中的該一個或多個胺基酸取代在對應於109、198、199或202的位置處，其中編號是根據EU索引。
- 如請求項92所述的多價結合蛋白，其中包含該一個或多個取代的CL 1和/或CL 2中的該一個或多個胺基酸取代是H198R取代、Q199W取代或T109A-S202R取代，其中胺基酸編號是根據EU索引。
- 如請求項82至93中任一項所述的多價結合蛋白，其中包含該一個或多個胺基酸取代的VL 3和/或VL 4中的該一個或多個胺基酸取代是架構胺基酸的取代。
- 如請求項82至94中任一項所述的多價結合蛋白，其中包含該一個或多個胺基酸取代的VL 3和/或VL 4中的該一個或多個胺基酸取代是在對應於12或18的位置處，其中編號是根據Kabat。
- 如請求項95所述的多價結合蛋白，其中包含該一個或多個胺基酸取代的VL 3和/或VL 4中的該一個或多個胺基酸取代是S12P取代、R18P取代、R18Q取代、S12P-R18P取代或S12P-R18Q取代，其中編號是根據Kabat。
- 如請求項82或86至96中任一項所述的多價結合蛋白，其中 該第一重鏈多肽包含由下式表示的結構： VH 1-CH1 1-L 1-VH 2-CH1 2-CH2-CH3 [Ia]， 該第二重鏈多肽包含由下式表示的結構： VH 3-CH1 3-L 3-VH 4-CH1 4-CH2-CH3 [IIIa]。
- 如請求項83至96中任一項所述的多價結合蛋白，其中 該第一重鏈多肽包含由下式表示的結構： VH 1-L 1-VH 2-L 2-CH1 1-CH2-CH3 [Ia]， 該第二重鏈多肽包含由下式表示的結構： VH 3-L 5-VH 4-L6-CH1 2-CH2-CH3 [IIIa]。
- 如請求項97所述的多價結合蛋白，其中該第一重鏈多肽的CH3結構域和/或該第二重鏈多肽的CH3結構域是人類IgG1或IgG4 CH3結構域。
- 如請求項97或99所述的多價結合蛋白，其中該第一重鏈多肽的CH3結構域包含對應於人類IgG1的位置354和366的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引，其中該胺基酸取代是S354C和T366W；其中該第二重鏈多肽的CH3結構域包含對應於人類IgG1的位置349、366、368、407、435和436的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引，其中該胺基酸取代是Y349C、T366S、L368A和Y407V。
- 如請求項96至100中任一項所述的多價結合蛋白，其中該第一重鏈多肽的CH3結構域包含對應於人類IgG1的位置349、366、368、407、435和436的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引，其中該胺基酸取代是Y349C、T366S、L368A和Y407V；其中該第二重鏈多肽的CH3結構域包含對應於人類IgG1的位置354和366的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引，其中該胺基酸取代是S354C和T366W。
- 如請求項101所述的多價結合蛋白，其中該第二重鏈多肽的CH3包含減少與蛋白A層析材料的結合的一個或多個胺基酸取代。
- 如請求項101所述的多價結合蛋白，其中該第一重鏈多肽的CH3包含減少與蛋白A層析材料的結合的一個或多個胺基酸取代。
- 如請求項102或103所述的多價結合蛋白，其中減少與該蛋白A層析材料的結合的一個或多個胺基酸取代對應於人類IgG1的位置435和436的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引。
- 如請求項104所述的多價結合蛋白，其中該胺基酸取代是H435R和Y436F，其中胺基酸編號是根據EU索引。
- 如請求項82至105中任一項所述的多價結合蛋白，其中該結合蛋白是四特異性的並且能夠特異性結合四種不同抗原標靶。
- 一種多價結合蛋白，該多價結合蛋白包含形成抗原結合結構域的四條多肽鏈；其中該四條多肽鏈包括： 第一重鏈多肽，其包含由下式表示的結構： VH 1-CH1 1[I]， 第一輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構： VL 1-CL 1[II]， 第二重鏈多肽，其包含由下式表示的結構： 融合多肽-L 1-CH1 2[III]， 和第二輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構： 融合多肽-L 2- CL 2[IV] 其中： VL 1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域； CL 1是第一免疫球蛋白輕鏈恆定結構域； CL 2是第二免疫球蛋白輕鏈恆定結構域； VH 1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域； CH1 1是第一免疫球蛋白重鏈恆定結構域； CH1 2是第二免疫球蛋白重鏈恆定結構域；並且 L 1和L 2是胺基酸連接子； 其中CL 2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的CL 2相比，該一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，並且VL 1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的VL 1相比，該一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合；並且 其中VL 1和VH 1形成抗原結合結構域。
- 如請求項107所述的多價結合蛋白，其中L 1或L 2的長度獨立地是0個胺基酸。
- 如請求項107或108所述的結合蛋白，其中L 1或L 2的長度獨立地是至少一個胺基酸。
- 一種多價結合蛋白，該多價結合蛋白包含形成兩個抗原結合結構域的四條多肽鏈；其中該四條多肽鏈包括： 第一重鏈多肽，其包含由下式表示的結構： VH 1-CH1 1-L 1-VH 2-CH1 2[I]， 第一輕鏈多肽鏈，其包含由下式表示的結構： VL 1-CL 1-L 2-VL 2-CL 2[II]， 第二重鏈多肽，其包含由下式表示的結構： 融合多肽-L 3-CH1 3[III]， 和第二輕鏈多肽，其包含由下式表示的結構： 融合多肽-L 4-CL 3[IV] 其中： VL 1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域； VL 2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域； CL 1是第一免疫球蛋白輕鏈恆定結構域； CL 2是第二免疫球蛋白輕鏈恆定結構域； CL 3是第三免疫球蛋白輕鏈恆定結構域； VH 1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域； VH 2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域； CH1 1是第一免疫球蛋白重鏈恆定結構域； CH1 2是第二免疫球蛋白重鏈恆定結構域； CH1 3是第三免疫球蛋白重鏈恆定結構域；並且 L 1、L 2、L 3和L 4是胺基酸連接子； 其中： a) CL 3包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的CL 3相比，該一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL 1和VL 2各自包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的VL 1和VL 2相比，該一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合， b) CL 3包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的CL 3相比，該一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL 1包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的VL 1相比，該一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且VL 2是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白結構域；或 c) CL 3包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的CL 3相比，該一個或多個胺基酸取代減少與KappaSelect層析材料的結合，VL 2包含一個或多個胺基酸取代，與沒有該一個或多個胺基酸取代的VL 2相比，該一個或多個胺基酸取代減少與蛋白L層析材料的結合，並且VL 1是λ亞型免疫球蛋白輕鏈可變結構域或κ2亞型免疫球蛋白結構域；並且 其中VL 1和VH 1形成第一抗原結合結構域並且VL 2和VH 2形成第二抗原結合結構域。
- 如請求項110所述的多價結合蛋白，其中L 1、L 2、L 3或L 4中的至少一個的長度各自獨立地是0個胺基酸。
- 如請求項110或111所述的結合蛋白，其中L 1、L 2、L 3或L 4的長度各自獨立地是至少一個胺基酸。
- 如請求項99至104中任一項所述的多價結合蛋白，其中與沒有該一個或多個胺基酸取代的CL 2或CL 3相比，包含該一個或多個胺基酸取代的CL 2或CL 3與該KappaSelect層析材料的結合減少了約90%。
- 如請求項107至113中任一項所述的多價結合蛋白，其中與沒有該一個或多個胺基酸取代的VL 1和/或VL 2相比，包含該一個或多個胺基酸取代的VL 1和/或VL 2與該蛋白L層析材料的結合減少了約90%。
- 如請求項107至114中任一項所述的多價結合蛋白，其中包含該一個或多個胺基酸取代的CL 2或CL 3中的該一個或多個胺基酸取代在對應於109、110或199的位置處，其中編號是根據EU索引。
- 如請求項115所述的多價結合蛋白，其中包含該一個或多個胺基酸取代的CL 2或CL 3中的該一個或多個胺基酸取代是T109A取代、V110D取代、Q199K取代、T109A-V110D取代或T109A-V110D-Q199K取代。
- 如請求項107至114中任一項所述的多價結合蛋白，其中包含該一個或多個取代的CL 2或CL 3中的該一個或多個胺基酸取代在對應於109、198、199或202的位置處，其中編號是根據EU索引。
- 如請求項117所述的多價結合蛋白，其中包含該一個或多個取代的CL 2或CL 3中的該一個或多個胺基酸取代是H198R取代、Q199W取代或T109A-S202R取代，其中胺基酸編號是根據EU索引。
- 如請求項107至118中任一項所述的多價結合蛋白，其中包含該一個或多個胺基酸取代的VL 1和/或VL 2中的該一個或多個胺基酸取代是架構胺基酸的取代。
- 如請求項107至119中任一項所述的多價結合蛋白，其中包含該一個或多個胺基酸取代的VL 1和/或VL 2中的該一個或多個胺基酸取代是在對應於12或18的位置處，其中編號是根據Kabat。
- 如請求項120所述的多價結合蛋白，其中該VL 1和/或VL 2中的該一個或多個胺基酸取代是S12P取代、R18P取代、R18Q取代、S12P-R18P取代或S12P-R18Q取代，其中編號是根據Kabat。
- 如請求項107至121中任一項所述的多價結合蛋白，其中該第一重鏈多肽包含第一CH2免疫球蛋白重鏈恆定結構域和第一CH3免疫球蛋白重鏈恆定結構域，並且該第二重鏈多肽包含第二CH2免疫球蛋白重鏈恆定結構域和第二CH3免疫球蛋白重鏈恆定結構域。
- 如請求項122所述的多價結合蛋白，其中該第一CH3結構域和/或該CH3結構域是人類IgG1或IgG4 CH3結構域。
- 如請求項122或123中任一項所述的多價結合蛋白，其中該第一CH3結構域包含對應於人類IgG1的位置354和366的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引，其中該胺基酸取代是S354C和T366W；其中第二CH3結構域包含在對應於人類IgG1的位置349、366、368、407、435和436的位置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引，其中該胺基酸取代是Y349C、T366S、L368A和Y407V。
- 如請求項124所述的多價結合蛋白，其中該第二重鏈多肽的CH3包含一個或多個胺基酸取代，該一個或多個胺基酸取代減少與蛋白A的結合。
- 如請求項125所述的多價結合蛋白，其中該第一重鏈多肽的CH3包含一個或多個胺基酸取代，該一個或多個胺基酸取代減少與蛋白A的結合。
- 如請求項126所述的多價結合蛋白，其中減少與蛋白A的結合的一個或多個胺基酸取代是對應於人類IgG1的位置435和436的處置處的胺基酸取代，其中編號是根據EU索引。
- 如請求項127所述的多價結合蛋白，其中該胺基酸取代是H435R和Y436F，其中胺基酸編號是根據EU索引。
- 如請求項1至128中任一項所述的多價結合蛋白，其中該多價結合蛋白是多特異性抗體或其抗原結合片段。
- 一種多核苷酸，該多核苷酸編碼如請求項1至129中任一項所述的多價結合蛋白。
- 一種載體，該載體包含如請求項130所述的多核苷酸。
- 一種宿主細胞，該宿主細胞包含如請求項130所述的多核苷酸或如請求項131所述的載體。
- 一種產生多價結合蛋白的方法，該方法包括培養如請求項122所述的宿主細胞，使得產生該結合蛋白。
- 如請求項133所述的方法，該方法進一步包括從該宿主細胞中回收該結合蛋白。
- 一種醫藥組成物，該醫藥組成物包含如請求項1至129中任一項所述的多價結合蛋白和醫藥上可接受的載劑。
- 一種純化如請求項1至129中任一項所述的多價結合蛋白的方法，該方法包括 a) 使包含該多價結合蛋白的組成物以結合和洗脫模式經受蛋白L層析，以產生蛋白L洗出液，以及 b) 使該蛋白L洗出液以結合和洗脫模式經受KappaSelect層析，以產生KappaSelect洗出液， 其中該KappaSelect洗出液包含該多價結合蛋白並且基本上不含錯配多肽。
- 如請求項136所述的方法，其中該KappaSelect洗出液中的多價結合蛋白的純度至少85%、至少90%或至少95%。
- 如請求項136或137所述的方法，其中該KappaSelect洗出液中小於15%、小於10%或小於5%的該多肽是錯配多肽。
- 一種純化如請求項1至129中任一項所述的多價結合蛋白的方法，該方法包括 a) 使包含該多價結合蛋白和錯配抗體的組成物以結合和洗脫層析經受KappaSelect層析，以產生KappaSelect洗出液，以及 b) 使該KappaSelect洗出液以結合和洗脫模式經受蛋白L層析，以產生蛋白L洗出液， 其中該蛋白L洗出液包含該多價結合蛋白並且基本上不含錯配多肽。
- 如請求項139所述的方法，其中該蛋白L洗出液中的多價結合蛋白的純度至少85%、至少90%或至少95%。
- 如請求項139或140所述的方法，其中該蛋白L洗出液中小於15%、小於10%或小於5%的該多肽是錯配多肽。
- 一種純化如請求項1至129中任一項所述的多價結合蛋白的方法，該方法包括 a) 使包含該多價結合蛋白的組成物以結合和洗脫模式經受蛋白A層析，以產生蛋白A洗出液， b) 使該蛋白A洗出液以結合和洗脫模式經受蛋白L層析，以產生蛋白L洗出液，以及 c) 使該蛋白L洗出液以結合和洗脫模式經受KappaSelect層析，以產生KappaSelect洗出液， 其中該KappaSelect洗出液包含該多價結合蛋白並且基本上不含錯配多肽。
- 如請求項142所述的方法，其中該KappaSelect洗出液中的多價結合蛋白的純度至少85%、至少90%或至少95%。
- 如請求項142或143所述的方法，其中該KappaSelect洗出液中小於15%、小於10%或小於5%的該多肽是錯配多肽。
- 一種純化如請求項1至129中任一項所述的多價結合蛋白的方法，該方法包括 a) 使包含該多價結合蛋白的組成物以結合和洗脫模式經受蛋白A層析，以產生蛋白A洗出液， b) 使該蛋白A洗出液以結合和洗脫模式經受KappaSelect層析，以產生KappaSelect洗出液，以及 c) 使該蛋白KappaSelect洗出液以結合和洗脫模式經受蛋白L層析，以產生蛋白L洗出液， 其中該L洗出液包含該多價結合蛋白並且基本上不含錯配多肽。
- 如請求項145所述的方法，其中該蛋白L洗出液中的多價結合蛋白的純度至少85%、至少90%或至少95%。
- 如請求項145或146所述的方法，其中該蛋白L洗出液中小於15%、小於10%或小於5%的該多肽是錯配多肽。
- 如請求項136至147中任一項所述的方法，其中包含該多價結合蛋白的該組成物源自工程化為表現該多特異性結合蛋白的宿主細胞。
- 如請求項136至148中任一項所述的方法，其中包含該多價結合蛋白的該組成物是宿主細胞培養物上清液。
- 如請求項136至149中任一項所述的方法，其中包含該多價結合蛋白的該組成物進一步包含錯配多肽。
- 如請求項136至150中任一項所述該的方法，其中將包含該多價結合蛋白的該組成物在層析之前過濾。
- 如請求項136至151中任一項所述的方法，該方法進一步包括在KappaSelect或蛋白L層析後的精製步驟。
- 如請求項152所述的方法，其中該精製步驟是尺寸排阻層析。
- 如請求項146至153中任一項所述的方法，其中該蛋白A層析是MabSelect™、MabSelect SuRe™、MabSelect SuRe™ LX、MabSelect PrismA、ProSep®-vA、ProSep® Ultra Plus、蛋白A Sepharose® Fast Flow或Toyopearl® AF-rProtein A層析。
- 如請求項136至154中任一項所述的方法，其中該蛋白L層析是Pierce™蛋白L層析管柱、Capto™ L層析、HiTrap ®蛋白L層析、TOYOPEARL® AF-rProtein L-650F層析或KanCap™ L層析。
- 如請求項136至155中任一項所述的方法，其中該KappaSelect層析是HiTrap™ KappaSelect或CaptureSelect™ Kappa XL層析。
- 如請求項136至156中任一項所述的方法，其中包含該多價結合蛋白的該組成物與醫藥上可接受的載劑組合。
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| US63/350,255 | 2022-06-08 | ||
| EP22315206.7 | 2022-09-08 |
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