ES2894304T3

ES2894304T3 - Proteínas de unión triespecíficas y/o trivalentes para la prevención o tratamiento de infección por VIH

Info

Publication number: ES2894304T3
Application number: ES16794472T
Authority: ES
Inventors: Zhi-Yong Yang; Gary Nabel; Ling Xu; Ronnie Wei; Huawei Qiu; Jochen Beninga; Jochen Kruip; Ercole Rao; Wulf Leuschner; Christian Beil; Christian Lange; Mark Connors; John Mascola; Richard Koup; Jinghe Huang; Nicole Doria-Rose; Tongqing Zhou; Peter Kwong; Young Kwon; Amarendra Pegu
Original assignee: Sanofi SA; US Department of Health and Human Services
Current assignee: Sanofi SA; US Department of Health and Human Services
Priority date: 2015-10-25
Filing date: 2016-10-24
Publication date: 2022-02-14
Anticipated expiration: 2036-10-24
Also published as: CA3002664A1; JP2018537966A; MA42641A1; MX2022014631A; SI3365366T1; EP3365366A1; HRP20211528T1; TW202219064A; US20220226495A1; JP7169190B2; HK1253385A1; MX2018005048A; UY36965A; DOP2018000102A; HUE056608T2; CN109311966A; IL258822A; IL258822B1; WO2017074878A8; CL2018001065A1

Abstract

Una proteína de unión que comprende cuatro cadenas polipeptídicas que forman tres sitios de unión a antígeno que se unen específicamente a una o más proteínas diana de VIH, en la que una primera cadena polipeptídica comprende una estructura representada por la fórmula: VL2- L1-VL1- L2-CL [I] y una segunda cadena polipeptídica comprende una estructura representada por la fórmula: VH1- L3-VH2- L4-CH1-bisagra-CH2-CH3 [II] y una tercera cadena polipeptídica comprende una estructura representada por la fórmula: VH3-CH1-bisagra-CH2-CH3 [III] y una cuarta cadena polipeptídica comprende una estructura representada por la fórmula: VL3-CL [IV] en la que: VL1 es un primer dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina; VL2 es un segundo dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina; VL3 es un tercer dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina; VH1 es un primer dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina; VH2 es un segundo dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina; VH3 es un tercer dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina; CL es un dominio constante de la cadena ligera de inmunoglobulina; CH1 es un dominio constante de la cadena pesada CH1 de inmunoglobulina; CH2 es un dominio constante de la cadena pesada CH2 de inmunoglobulina; CH3 es un dominio constante de la cadena pesada CH3 de inmunoglobulina; bisagra es una región bisagra de inmunoglobulina que conecta los dominios CH1 y CH2; y L1, L2, L3 y L4 son conectores de aminoácidos; y en la que el polipéptido de fórmula I y el polipéptido de fórmula II forman un par de cadena ligera-cadena pesada cruzada, y en la que: (a) VL1 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 500, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 501, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 274; VL2 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 275, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 276, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 277; VL3 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 266, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 267, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 268; VH1 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 254, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 255, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 256; VH2 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 257, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 258, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 259; y VH3 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 248, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 497, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 250; o (b) VL1 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 500, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 501, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 274; VL2 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 275, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 276, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 277; VL3 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 269, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 270, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 271; VH1 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 254, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 255, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 256; VH2 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 257, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 258, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 259; y VH3 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 251, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 252, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 253; o (c) VL1 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 275, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 276, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 277; VL2 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 500, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 501, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 274; VL3 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 269, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 270, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 271; VH1 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 257, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 258, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 259; VH2 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 254, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 255, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 256; y VH3 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 251, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 252, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 253.

Description

DESCRIPCIÓN

Proteínas de unión triespecíficas y/o trivalentes para la prevención o tratamiento de infección por VIH REFERENCIAS CRUZADAS CON SOLICITUDES RELACIONADAS

Esta solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la Solicitud Provisional de EE.UU. con número de serie 62/246.113, presentada el 25 de octubre de 2015, la Solicitud de EP núm. EP16305211.1, presentada el 24 de febrero de 2016, la Solicitud provisional de EE.UU. con número de serie 62/322.029, presentada el 13 de abril de 2016, y la Solicitud provisional de EE.UU. con núm. de serie 62/331.169, presentada el 03 de mayo de 2016.

Esta invención se creó en el cumplimiento de un Acuerdo cooperativo de investigación y desarrollo (NIAID núm. 2014 0038) con los Institutos Nacionales de Salud, una agencia del Departamento de Salud y Servicios Humanos. El gobierno de los Estados Unidos tiene ciertos derechos en esta invención.

PRESENTACIÓN DEL LISTADO DE SECUENCIAS EN EL ARCHVO DE TEXTO ASCII

El contenido de la siguiente presentación en el archivo de texto ASCII es una forma legible por ordenador (CRF) del Listado de secuencias (nombre del archivo: 183952027041SEQLIST.txt, fecha grabada: 19 de octubre de 2016, tamaño: 1.064 KB).

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La descripción se refiere a proteínas de unión triespecíficas y/o trivalentes que comprenden cuatro cadenas polipeptídicas que forman tres sitios de unión a antígeno que se unen específicamente a una o más proteínas diana de VIH, en las que un primer par de polipéptidos que forman la proteína de unión poseen dominios variables duales que tienen una orientación cruzada y en las que un segundo par de polipéptidos que forman la proteína de unión poseen un único dominio variable. La descripción también se refiere a métodos para hacer proteínas de unión triespecíficas y/o trivalentes y usos de dichas proteínas de unión para tratar y/o prevenir el VIH/SIDA.

ANTECEDENTES

Uno de los desafíos en el tratamiento de VIH/SIDA con anticuerpos de neutralización es el potencial rebrote de la infección debido a la alta tasa de mutación de los virus de VIH-1. Además, los sucesos virológicos en las primeras semanas después de la transmisión de VIH-1 preparan el camino para la infección crónica de por vida que permanece incurable con la terapia anti-retroviral de combinación (cART) disponible actualmente. Esto es debido, al menos en parte, al establecimiento temprano de reservorios virales, que incluyen células infectadas de forma latente, que persisten a pesar de cART, llevando al recrudecimiento de la infección cuando se interrumpe el tratamiento. Los anticuerpos de neutralización de anti-VIH-1 recientemente descubiertos con amplitud y potencia mejoradas pueden proporcionar más opciones para el tratamiento y prevención del VIH/SIDA; sin embargo, el rebrote de la infección sigue siendo un problema principal en el campo.

El documento WO 2012/158948 describe un anticuerpo de VIH aislado. Sin embargo, el documento WO 2012/158948 no proporciona o menciona anticuerpos tri-específicos.

BREVE COMPENDIO

En una realización, la descripción proporciona una proteína de unión que comprende cuatro cadenas polipeptídicas que forman tres sitios de unión al antígeno que se unen específicamente a una o más proteína diana de VIH, en las que una primera cadena polipeptídica comprende una estructura representada por la fórmula:

Vl²- L¹-VL¹- L²-Cl [I];

una segunda cadena polipeptídica comprende una estructura representada por la fórmula:

Vh¹- L3-VH2- L⁴-CH¹[II];

una tercera cadena polipeptídica comprende una estructura representada por la fórmula:

VH3-CH1 [III];

y una cuarta cadena polipeptídica comprende una estructura representada por la fórmula:

VL3-CL [IV];

en las que

VL¹es un primer dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;

VL²es un segundo dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;

Vl³es un tercer dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;

Vhi es un primer dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;

Vh2 es un segundo dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;

Vh³es un tercer dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;

Cl es un dominio constante de la cadena ligera de inmunoglobulina;

Ch1 es un dominio constante de la cadena pesada Ch1 de inmunoglobulina; y

L¹, L², L³y L⁴son conectores de aminoácidos;

y en las que el polipéptido de fórmula I y el polipéptido de fórmula II forman un par de cadena ligera-cadena pesada cruzado, y en las que

(a) Vl1 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 500, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 501, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 274; Vl2 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 275, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 276, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 277; Vl³comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 266, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 267, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 268; Vh1 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 254, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 255, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 256; Vh2 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ iD NO: 257, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 258, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 259; y Vh³comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 248, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 497, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 250; o

(b) Vl1 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 500, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 501, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 274; Vl2 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 275, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 276, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 277; Vl³comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 269, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 270, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 271; Vh1 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 254, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 255, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 256; Vh2 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ iD NO: 257, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 258, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 259; y Vh³comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 251, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 252, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 253; o

(c) Vl1 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 275, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 276, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 277; Vl2 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 500, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 501, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 274; Vl³comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 269, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 270, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 271; Vh1 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 257, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 258, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 259; Vh2 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ iD NO: 254, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 255, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 256; y Vh³comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 251, una CDR-H2 que comprende la SEQ ID NO: 252, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 253.

En una realización preferida, la proteína de unión de la presente invención comprende

(a) Vl1 comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 518; Vl2 comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia SEQ ID NO: 519; Vl³comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 512; Vh1 comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 504; Vh2 comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 506; y Vh³comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia SEQ ID NO: 502; o

(b) Vl1 comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 518; Vl2 comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 519; Vl³comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 513; Vh1 comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 504; Vh2 comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 506; y Vh³comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 503; o

(c) Vli comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 519; Vl2 comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 518; Vl³comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 513; Vh1 comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 506; Vh2 comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 504; y Vh³comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 503.

En una realización más preferida, la proteína de unión de la presente invención se caracteriza en que

(a) el dominio Ch3 de la segunda cadena polipeptídica comprende sustituciones de aminoácidos en posiciones que corresponden a las posiciones 354 y 366 de la IgG1 humana según el índice UE, en el que las sustituciones de aminoácidos son S354C y T366W; y en el que el dominio Ch³de la tercera cadena polipeptídica comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones que corresponden a las posiciones 349, 366, 368 y 407 de la IgG1 humana según el índice UE, en la que las sustituciones de aminoácidos son Y349C, T366S, L368A e Y407V; o

(b) el dominio Ch³de la segunda cadena polipeptídica comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones que corresponden a las posiciones 349, 366, 368 y 407 de la IgG1 humana según el índice UE, en la que las sustituciones de aminoácidos son Y349C, T366S, L368A e Y407V; y en la que el dominio Ch³de la tercera cadena polipeptídica comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones que corresponden a las posiciones 354 y 366 de la IgG1 humana según el índice UE, en la que las sustituciones de aminoácidos son S354C y T366W.

En una realización más preferida, los dominios Ch3 de la segunda y tercera cadenas polipeptídicas comprenden ambos sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 428 y 434 de la IgG1 humana según el índice UE, en la que las sustituciones de aminoácidos son M428L y N434S.

En una realización más preferida, (a) al menos uno de L¹, L², L³o L⁴es independientemente 0 aminoácidos de longitud; o (b) L¹, L², L³o L⁴son cada uno independientemente de al menos un aminoácido de longitud.

En una realización más preferida L¹, L², L³y/o L⁴comprenden la secuencia Asp-Lys-Thr-His-Thr (SEQ ID NO: 525).

En otra realización, la presente descripción proporciona una proteína de unión que comprende una primera cadena polipeptídica, una segunda cadena polipeptídica, una tercera cadena polipeptídica y una cuarta cadena polipeptídica en las que:

(a) la primera cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; la segunda cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; la tercera cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; y la cuarta cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2;

(b) la primera cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; la segunda cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; la tercera cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; y la cuarta cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10;

(c) la primera cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; la segunda cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; la tercera cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; y la cuarta cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18.

En otra realización la presente descripción proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de unión de la presente invención.

En otra realización, la presente descripción proporciona un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de la presente invención.

En una realización adicional, la presente descripción proporcionó un sistema vectorial que comprende uno o más vectores que codifican una primera, segunda, tercera y cuarta cadenas polipeptídicas de una proteína de unión de la presente invención, en la que opcionalmente:

(a) el sistema vectorial comprende un primer vector que codifica la primera cadena polipeptídica de la proteína de unión, un segundo vector que codifica la segunda cadena polipeptídica de la proteína de unión, un tercer vector que codifica la tercera cadena polipeptídica de la proteína de unión, y un cuarto vector que codifica la cuarta cadena polipeptídica de la proteína de unión o

(b) el sistema vectorial comprende un primer vector que codifica la primera y segunda cadenas polipeptídicas de la proteína de unión, y un segundo vector que codifica la tercera y cuarta cadenas polipeptídicas de la proteína de unión.

En otra realización, la presente descripción proporciona una célula huésped aislada que comprende la molécula de ácido nucleico de la presente invención, el vector de expresión de la presente invención, o el sistema vectorial de la presente invención, en la que opcionalmente la célula huésped es una célula de mamífero o una célula de insecto.

En una realización adicional, la presente descripción proporciona un método de producción de una proteína de unión, comprendiendo el método:

a) cultivar una célula huésped de la presente invención en condiciones tales que la célula huésped exprese la proteína de unión; y

b) aislar la proteína de unión de la célula huésped.

En otra realización, la presente descripción proporcionó una proteína de unión de la presente invención para usar en un método de prevención y/o tratamiento de infección por VIH en un paciente, que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína de unión, en la que la proteína de unión se co-administra opcionalmente con terapia anti-retroviral estándar, y en la que el paciente es opcionalmente un ser humano.

Las realizaciones específicas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción más detallada de ciertas realizaciones y las reivindicaciones.

Se va a entender que una, alguna o todas las propiedades de las diversas realizaciones descritas en la presente memoria pueden combinarse para formar otras realizaciones de la presente invención. Estos y otros aspectos de la invención serán evidentes para un experto en la técnica.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Las FIGS. 1A-D muestran representaciones esquemáticas de proteínas de unión triespecíficas que comprenden cuatro cadenas polipeptídicas que forman tres sitios de unión a antígeno que se unen específicamente a tres epítopos diferentes en uno o más antígenos, en las que un primer par de polipéptidos poseen dominios variables duales que tienen una orientación cruzada que forman dos sitios de unión a antígeno (que comprenden Vh¹-Vl¹y Vh²-Vl²) y en la que un segundo par de polipéptidos poseen un único sitio de unión a antígeno (que comprende Vh³-Vl³), de acuerdo con algunas realizaciones. La FIG. 1A muestra una proteína de unión triespecífica que comprende una modificación de “botones en ojales”, en la que el botón está en el primer par de polipéptidos. La FIG. 1B muestra una proteína de unión triespecífica que comprende una modificación de “botones en ojales”, en la que el botón está en el segundo par de polipéptidos. La FIG. 1C muestra la orientación de dominios variables en las cadenas polipeptídicas, y la orientación botón/ojal para las proteínas de unión 1-31 mostradas en las Tablas 1 y 2. “Cadena pesada A” (p.ej., una tercera cadena polipeptídica de la presente descripción) indica el dominio variable de la cadena pesada A. “Cadena ligera A” (p.ej., una cuarta cadena polipeptídica de la presente descripción) indica el dominio variable de la cadena ligera A. “Cadena pesada B” (p.ej., una segunda cadena polipeptídica de la presente descripción) indica el dominio variable 1 y el dominio variable 2 de la cadena pesada B. “Cadena ligera B” (p.ej., una primera cadena polipeptídica de la presente descripción) indica el dominio variable 1 y el dominio variable 2 de la cadena ligera B. La FIG. 1D muestra la orientación de los dominios variables en las cadenas polipeptídicas, y la orientación botón/ojal para las proteínas de unión 32-53 mostradas en las Tablas 1 y 2. “Cadena pesada A” (p.ej., una tercera cadena polipeptídica de la presente descripción) indica el dominio variable de la cadena pesada A. “Cadena ligera A” (p.ej., una cuarta cadena polipeptídica de la presente descripción) indica el dominio variable de la cadena ligera A. “Cadena pesada B” (p.ej., una segunda cadena polipeptídica de la presente descripción) indica el dominio variable 1 y el dominio variable 2 de la cadena pesada B. “Cadena ligera B” (p.ej., una primera cadena polipeptídica de la presente descripción) indica el dominio variable 1 y el dominio variable 2 de la cadena ligera B.

Las FIGS. 2A-B muestran la purificación de tres proteínas de unión triespecíficas usando primero cromatografía de afinidad, y después usando cromatografía preparativa de exclusión de tamaño. La FIG. 2A muestra el perfil de elución de las proteínas de unión triespecíficas durante la purificación usando la cromatografía de afinidad de la proteína A. La FIG. 2B muestra la purificación de proteínas monoméricas mediante cromatografía de exclusión de tamaño Superdex200.

Las FIGS. 3A-B muestran la purificación de los anticuerpos parentales Ab MPER, Ab CD4BS “b” y Ab dirigido a V1/V2 “a” usando primero cromatografía de afinidad, y después usando cromatografía preparativa de exclusión de tamaño. La FIG. 3A muestra el perfil de elución en los anticuerpos parentales durante la purificación usando cromatografía de afinidad a proteína A. la FIG. 3B muestra la purificación de proteínas monoméricas mediante cromatografía de exclusión de tamaño Superdex200.

Las FIGS. 4A-B muestran los perfiles de cromatografía de exclusión de tamaño de proteínas de unión biespecíficas y triespecíficas. La FIG. 4A muestra los perfiles de cromatografía de exclusión de tamaño de las proteínas de unión biespecíficas. La FIG. 4B muestra los perfiles de cromatografía de exclusión de tamaño de las proteínas de unión triespecíficas.

La FIG. 5 muestra los sensogramas Biacore de las cinéticas de unión de tres proteínas de unión triespecíficas y el anticuerpo Ab MPER parental para un péptido derivado de gp41 de VIH (el sitio de unión MPER), como se evalúa por el ensayo cinético basado en Biacore estándar.

La FIG. 6 muestra los sensogramas Biacore de las cinéticas de unión de tres proteínas de unión triespecíficas y el anticuerpo Ab CD4BS “b” para gp120 de VIH recombinante, como se evalúa por el ensayo cinético basado en Biacore estándar.

La FIG.7 muestra los resultados de un estudio farmacocinético (PK) de las proteínas indicadas después de la inyección intravenosa (IV) en macacos rhesus.

Las FIGS. 8A-8B muestran las representaciones esquemáticas de acopladores de células T triespecíficos, según algunas realizaciones. Los sitios de unión se indican mediante los círculos de puntos.

La FIG. 9 muestra las propiedades de unión de las proteínas de unión triespecíficas “proteína de unión 32” y “CD3 x CD28 /Ab CD4BS “b” a c D3 (CD3E representa la proteína CD3épsilon; CD3D representa la proteína CD3delta), CD28 y la proteína de núcleo estabilizado acondicionado 3 (RSC3) de gp120, además de un control negativo (IgG humana).

La FIG. 10 muestra la activación de células T CD8 usando las proteínas triespecíficas “proteína de unión 32” y “CD3 x CD28 /Ab CD4BS “b” en comparación con el anticuerpo CD4BS IgG4 parental, además de un control negativo (no mAb).

La FIG. 11 muestra la activación de células T CD4 usando las proteínas triespecíficas “proteína de unión 32” y “CD3 x CD28 / Ab CD4BS “b” en comparación con el anticuerpo IgG4 CD4BS parental, además de un control negativo (no mAb).

La FIG. 12 muestra la regulación a la baja de CD3 después de la activación de células T mediante las proteínas triespecíficas “proteína de unión 32” y “CD3 x CD28 / Ab CD4BS “b” en comparación con el anticuerpo IgG4 CD4BS parental, además de un control negativo (no mAb).

Las FIGS. 13A-C muestran los resultados del ensayo de citotoxicidad basados en la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) para proteínas de unión triespecíficas frente a células T VIH-1+ infectadas de forma latente. La FIG. 13A muestra los resultados para proteínas de unión triespecíficas incubadas con células CEM-BaL. La FIG.

13B muestra los resultados para las proteínas de unión triespecíficas incubadas con células ACH2. La FIG. 13C muestra los resultados para las proteínas de unión triespecíficas incubadas con células J1.1.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

La presente descripción proporciona proteínas de unión triespecíficas y/o trivalentes que comprenden cuatro cadenas polipeptídicas que forman tres sitios de unión a antígeno que se unen específicamente a una o más proteínas diana del virus de inmunodeficiencia humana (VIH) y/o una o más proteínas diana del receptor de células T, en las que un primer par de polipéptidos que forman la proteína de unión poseen dominios variables duales que tienen una orientación cruzada y en las que un segundo par de polipéptidos que forman la proteína de unión poseen un único dominio variable.

La siguiente descripción describe métodos ejemplares, parámetros y similares.

Definiciones

Como se utilizan según la presente descripción, los siguientes términos, a menos que se indique lo contrario, se entenderá que tienen los siguientes significados. A menos que se necesite otra cosa por contexto, los términos singulares incluirán plurales y los términos plurales incluirán el singular.

El término “polinucleótido” como se usa en la presente memoria se refiere a polímeros de ácido nucleico monocatenarios o bicatenarios de al menos 10 nucleótidos de longitud. En ciertas realizaciones, los nucleótidos que comprenden el polinucleótido pueden ser ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. Dichas modificaciones incluyen modificaciones de base tal como bromuridina, modificaciones de ribosa tal como arabinósido y 2’,3’-didesoxirribosa, y modificaciones de unión internucleótido tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato y fosforamidato. El término “polinucleótido” incluye específicamente formas monocatenarias y bicatenarias de ADN.

Un “polinucleótido aislado” es un polinucleótido de origen genómico, ADNc o sintético o alguna combinación de los mismos, que: (¹) no está asociado con todo o una parte de un polinucleótido en que el polinucleótido aislado se encuentra en la naturaleza, (2) está unido a un polinucleótido al que no está unido en la naturaleza, o (3) no se da en la naturaleza como parte de una secuencia mayor.

Un “polipéptido aislado” es uno que: (1) está libre de al menos algunos otros polipéptidos con los que se encontraría normalmente, (2) está esencialmente libre de otros polipéptidos de la misma fuente, p.ej., de la misma especie, (3) se expresa por una célula de una especie diferente, (4) se ha separado de al menos aproximadamente el 50 por ciento de polinucleótidos, lípidos, carbohidratos, u otros materiales con los que está asociado en la naturaleza, (5) no está asociado (mediante interacción covalente o no covalente) con partes de un polipéptido con el que el “polipéptido aislado” está asociado en la naturaleza, (⁶) está asociado de forma operable (mediante interacción covalente o no covalente) con un polipéptido con el que no está asociado en la naturaleza, o (7) no se da en la naturaleza. Dicho polipéptido aislado puede codificarse mediante ADN genómico, ADNc, ARNm u otro ARN, de origen sintético, o cualquier combinación de los mismos. Preferiblemente, el polipéptido aislado está sustancialmente libre de polipéptidos u otros contaminantes que se encuentran en su medio natural que interferirían con su uso (terapéutico, diagnóstico, profiláctico, de investigación u cualquier otro).

Los anticuerpos que se dan de forma natural comprenden típicamente un tetrámero. Cada uno de dichos tetrámeros está compuesto típicamente por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada para una cadena “ligera” de longitud completa (que tiene típicamente un peso molecular de aproximadamente 25 kDa) y una cadena “pesada” de longitud completa (que tiene típicamente un peso molecular de aproximadamente 50-70 kDa). Los términos “cadena pesada” y “cadena ligera” como se usan en la presente memoria se refieren a cualquier polipéptido de inmunoglobulina que tenga suficiente secuencia de dominio variable para dar especificidad por un antígeno diana. La parte aminoterminal de cada cadena ligera y pesada incluye típicamente un dominio variable de aproximadamente ¹⁰⁰a ^{11 0}o más aminoácidos que típicamente es responsable del reconocimiento del antígeno. La parte carboxi-terminal de cada cadena típicamente define un dominio constante responsable de la función efectora. Por consiguiente, en un anticuerpo que se da de forma natural, un polipéptido de inmunoglobulina de cadena pesada de longitud completa incluye un dominio variable (Vh) y tres dominios constantes (Ch1, Ch2, y Cm), en que el domino Vh está en el extremo amino del polipéptido y el dominio Ch³está en el extremo carboxilo, y un polipéptido de inmunoglobulina de cadena ligera de longitud completa incluye un dominio variable (Vl) y un dominio constante (Cl), en que el dominio VL está en el extremo amino del polipéptido y el dominio Cl está en el extremo carboxilo.

Las cadenas ligeras humanas se clasifican típicamente como cadenas ligeras kappa y lambda, y las cadenas pesadas humanas se clasifican típicamente como mu, delta, gamma, alfa, o épsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. IgG tienen varias subclases, que incluyen, pero no están limitadas a IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. IgM tiene subclases que incluyen, pero no están limitadas a, IgM1 e IgM2. IgA se subdivide de forma similar en subclases que incluyen, pero no están limitadas a, IgA1 e IgA2. Dentro de las cadenas ligeras y pesadas de longitud completa, los dominios variables y constantes típicamente están unidos por una región “J” de aproximadamente 12 o más aminoácidos, con la cadena pesada incluyendo también una región “D” de aproximadamente 10 aminoácidos más. Véase, p.ej., FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul, W., ed., Raven Press, 2a ed., 1989). Las regiones variables de cada par de cadenas ligera/pesada forman típicamente un sitio de unión a antígeno. Los dominios variables de anticuerpos que se dan de forma natural muestran típicamente la misma estructura general de regiones marco (FR) relativamente conservadas unidas por tres regiones hipervariables, también denominadas regiones que determinan la complementariedad o CDRs. Las CDRs de las dos cadenas de cada par típicamente se alinean mediante las regiones marco que pueden permitir la unión a un epítopo específico. Desde el extremo amino al extremo carboxilo, los dominios variables de cadena tanto ligera como pesada comprenden típicamente los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4.

El término “conjunto CDR” se refiere a un grupo de tres CDRs que se da en una única región variable capaz de unirse al antígeno. Los límites exactos de estos CDRs se han definido de forma diferente según sistemas diferentes. El sistema descrito por Kabat (Kabat et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) y (1991)) no solo proporciona un sistema de numeración de residuos inequívoco aplicable a cualquier región variable de un anticuerpo, sino que también proporciona límites de residuo precisos que definen las tres CDRs. Estas CDRs pueden denominarse como CDRs de Kabat. Chothia y colaboradores (Chothia y Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-17; Chothia et al., 1989, Nature 342: 877-83) encontró que ciertas sub porciones en las CDRs de Kabat adoptan conformaciones de estructura peptídica casi idénticas, a pesar de que tienen gran diversidad al nivel de secuencia de aminoácidos. Estas sub-porciones se designaron como L1, L2 y L3 o H1, H2 y H3 donde la “L” y la “H” designan las regiones de cadena ligera y cadena pesada, respectivamente. Estas regiones pueden denominarse como CDRs de Chothia, que tienen límites que solapan con las CDRs de Kabat. Otros límites que definen las CDRs que solapan con las CDRs de Kabat se han descrito por Padlan, 1995, FASEB J. 9: 133-39; MacCallum, 1996, J. Mol. Biol.262(5): 732-45; y Lefranc, 2003, Dev. Comp. Immunol. 27: 55-77. Aún otras definiciones del límite de la CDR pueden no seguir estrictamente uno de los sistemas de la presente memoria, pero no obstante solaparán con las CDRs de Kabat, aunque pueden acortarse o alargarse a la luz de la predicción o descubrimientos experimentales de que residuos particulares o grupos de residuos o incluso CDRs enteras no impactan significativamente en la unión al antígeno. Los métodos usados en la presente memoria pueden utilizar CDRs definidas según cualquiera de estos sistemas, aunque ciertas realizaciones usan CDRs definidas por Kabat o Chothia. La identificación de CDRs predichas usando la secuencia de aminoácidos se conoce bien en el campo, tal como en Martin, A.C. “Protein sequence and structure analysis of antibody variable domains”, In Antibody Engineering, Vol. 2, Kontermann R., Dübel S., eds. Springer-Verlag, Berlín, págs. 33-51 (2010). La secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada y/o ligera puede inspeccionarse también para identificar las secuencias de las CDRs por otros métodos convencionales, p.ej., por comparación con secuencias conocidas de aminoácidos de otras regiones variables de cadena pesada y ligera para determinar las regiones de hipervariabilidad de secuencia. Las secuencias numeradas pueden alinearse a ojo, o empleando un programa de alineación tal como uno del paquete de programas CLUSTAL, como se describe en Thompson, 1994, Nucleic Acids Res. 22: 4673-80. Los modelos moleculares se usan convencionalmente para delinear correctamente el marco y las regiones CDR y así corregir las asignaciones basadas en la secuencia.

El término “Fc” como se usa en la presente memoria se refiere a una molécula que comprende la secuencia de un fragmento de no unión a antígeno que resulta de la digestión de un anticuerpo o producido por otros medios, en forma monomérica o multimérica, y puede contener la región bisagra. La fuente original de inmunoglobulina del Fc nativo es preferiblemente de origen humano y puede ser cualquiera de las inmunoglobulinas, aunque se prefieren IgG1 e IgG2. Las moléculas Fc están constituidas por polipéptidos monoméricos que pueden unirse en formas diméricas o multiméricas mediante asociación covalente (es decir, enlaces disulfuro) y no covalente. El número de enlaces disulfuro intermoleculares entre subunidades monoméricas de moléculas Fc nativas oscila de 1 a 4 dependiendo de la clase (p.ej., IgG, IgA e IgE) o subclase (p.ej., IgG1, IgG2, IgG3, IgA1 e IgGA2). Un ejemplo de un Fc es un dímero unido a disulfuro que resulta de la digestión por papaína de una IgG. El término “Fc” como se usa en la presente memoria es genérico para las formas monomérica, dimérica y multimérica.

Un fragmento F(ab) incluye típicamente una cadena ligera y los dominios Vh y Ch¹de una cadena pesada, en la que la parte de cadena pesada Vh-Ch¹del fragmento F(ab) no puede formar un enlace disulfuro con otro polipéptido de cadena pesada. Como se usa en la presente memoria, un fragmento F(ab) puede incluir también una cadena ligera que contiene dos dominios variables separados por un conector de aminoácidos y una cadena pesada que contiene dos dominios variables separados por un conector de aminoácidos y un dominio Ch¹.

Un fragmento F(ab’) típicamente incluye una cadena ligera y una parte de una cadena pesada que contiene más de la región constante (entre los dominios Ch¹y Ch²), de manera que puede formarse un enlace disulfuro intercadena entre dos cadenas pesadas para formar una molécula F(ab’)².

El término “proteína de unión” como se usa en la presente memoria se refiere a una molécula que no se da de forma natural (o recombinante o diseñada) que se une específicamente a al menos un antígeno diana, y que comprende cuatro cadenas polipeptídicas que forman al menos tres sitios de unión al antígeno, en la que una primera cadena polipeptídica tiene una estructura representada por la fórmula:

Vl²- L¹-VL¹- L²-Cl [I]

y una segunda cadena polipeptídica tiene una estructura representada por la fórmula:

VH¹- L³-VH²- L⁴-CH¹[II]

y una tercera cadena polipeptídica tiene una estructura representada por la fórmula:

VH3-CH1 [III]

y una cuarta cadena polipeptídica tiene una estructura representada por la fórmula:

VL3-CL [IV]

en la que:

Vl¹es un primer dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;

Vl²es un segundo dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;

VL3 es un tercer dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;

Vh¹es un primer dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;

VH²es un segundo dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;

VH3 es un tercer dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;

CL es un dominio constante de la cadena ligera de inmunoglobulina;

Ch¹es el dominio constante de la cadena pesada Ch¹de inmunoglobulina; y

Li, L², L³y L⁴son conectores de aminoácidos;

y en la que el polipéptido de formula I y el polipéptido de formula II forman un par de cadena ligera-cadena pesada cruzado.

Una molécula “recombinante” es una que se ha preparado, expresado, creado o aislado por medios recombinantes.

Una realización de la descripción proporciona proteínas de unión que tienen especificidad biológica e inmunológica a entre uno y tres antígenos diana. Otra realización de la descripción proporciona moléculas de ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican cadenas polipeptídicas que forman dichas proteínas de unión. Otra realización de la descripción proporciona vectores de expresión que comprenden moléculas de ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican cadenas polipeptídicas que forman dichas proteínas de unión. Otra realización más de la descripción proporciona células huésped que expresan dichas proteínas de unión (es decir, que comprenden moléculas de ácido nucleico o vectores que codifican cadenas polipeptídicas que forman dichas proteínas de unión).

El término “capacidad de cambio” como se usa en la presente memoria se refiere a la capacidad de intercambio de dominios variables en el formato de proteína de unión y con retención del plegado y afinidad de unión última. “Capacidad de cambio total” se refiere a la capacidad de cambiar el orden de los dominios tanto Vh¹como Vh², y por 10 tanto el orden de los dominios Vl¹y Vl², en la cadena polipeptídica de fórmula I o la cadena polipeptídica de fórmula 11 (es decir, invertir el orden) mientras se mantiene toda la funcionalidad de la proteína de unión como se evidencia por la retención de la afinidad de unión. Además, debería notarse que las designaciones Vh y Vl se refieren solo a la posición del dominio en una cadena proteica particular en el formato final. Por ejemplo, Vh¹y Vh²podrían derivarse de los dominios Vl¹y Vl²en los anticuerpos parentales y situarse en las posiciones Vh¹y Vh²en la proteína de unión. Asimismo, Vl¹y Vl²podrían derivarse de los dominios Vh¹y Vh²en los anticuerpos parentales y situarse en las posiciones VH¹y VH²en la proteína de unión. Por consiguiente, las designaciones VH y VL se refieren a la actual posición y no a la posición original en un anticuerpo parental. Los dominios Vh y Vl son, por tanto, “cambiables”.

El término “antígeno” o “antígeno diana” o “diana de antígeno” como se usan en la presente memoria se refiere a una molécula o una parte de una molécula que es capaz de unirse mediante una proteína de unión, y además es capaz de usarse en un animal para producir anticuerpos capaces de unirse a un epítopo de ese antígeno. Un antígeno diana puede tener uno o más epítopos. Con respecto a cada antígeno diana reconocido por una proteína de unión, la proteína de unión es capaz de competir con un anticuerpo intacto que reconoce el antígeno diana.

El término “VIH” como se usa en la presente memoria significa virus de inmunodeficiencia humana. Como se usa en la presente memoria, el término “infección por VIH” generalmente incluye la infección de un huésped, particularmente un huésped humano, por la familia de retrovirus del virus de inmunodeficiencia humana (VIH) que incluyen, aunque no están limitados a, VIH I, VIH II, VIH III (también conocidos como HTLV-II, LAV-1, LAV-2). VIH puede usarse en la presente memoria para referirse a cualquier cepa, forma, subtipo, clado y variación en la familia de VIH. Por consiguiente, tratar la infección por VIH incluirá el tratamiento de una persona que es un portador de cualquiera de la familia de retrovirus de VIH o una persona que está diagnosticada con SIDA activo, además del tratamiento o profilaxis de las condiciones relacionadas con el SIDA en dichas personas.

El término “SIDA” como se usa en la presente memoria significa síndrome de inmunodeficiencia adquirida. El SIDA está provocado por el VIH.

El término “CD4bs” o “sitio de unión a CD4” se refiere al sitio de unión para CD4 (clúster de diferenciación 4), que es una glicoproteína encontrada en la superficie de células inmunes tales como células T auxiliares, monocitos, macrófagos y células dendríticas.

El término “CD3” es el polipéptido del clúster del factor de diferenciación 3 y es una proteína de superficie de las células T que es típicamente parte del complejo receptor de las células T (TCR).

"CD28" es el polipéptido del clúster de diferenciación 28 y es una proteína de superficie de las células T que proporciona señales co-estimuladoras para la activación y supervivencia de las células T.

El término “glicoproteína 160” o “proteína gp160” se refiere al complejo de glicoproteínas de envoltura del VIH y que es un homotrímero que se escinde en las subunidades gp120 y gp41.

El término “MPER” se refiere a la región externa proximal a la membrana de la glicoproteína 41 (gp41), que es una subunidad del complejo de proteína de envoltura de los retrovirus, incluyendo VIH.

El término “glicano” se refiere a la parte de carbohidrato de un glicoconjugado, como una glicoproteína, glicolípido o un proteoglicano. En las proteínas de unión descritas, glicano se refiere a la glicoproteína de envoltura del VIH-1 gp120.

El término “acoplador de células T” se refiere a proteínas de unión dirigidas al sistema inmune de un huésped, más específicamente la actividad citotóxica de las células T además de dirigidas a una proteína diana de VIH.

El término “trímero de la punta” se refiere a la punta de la glicoproteína de envoltura de VIH-1 gp120.

El término “proteína de unión monoespecífica” se refiere a una proteína de unión que se une específicamente a una diana de antígeno.

El término “proteína de unión monovalente” se refiere a una proteína de unión que tiene un sitio de unión al antígeno.

El término “proteína de unión biespecífica” se refiere a una proteína de unión que se une específicamente a dos dianas de antígeno diferentes.

El término “proteína de unión bivalente” se refiere a una proteína de unión que tiene dos sitios de unión.

El término “proteína de unión triespecífica” se refiere a una proteína de unión que se une específicamente a tres dianas de antígeno diferentes.

El término “proteína de unión trivalente” se refiere a una proteína de unión que tiene tres sitios de unión. En realizaciones particulares la proteína de unión trivalente puede unirse a una diana de antígeno. En otras realizaciones, la proteína de unión trivalente puede unirse a dos dianas de antígeno. En otras realizaciones, la proteína de unión trivalente puede unirse a tres dianas de antígeno.

Una proteína de unión “aislada” es una que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su medio natural. Los componentes contaminantes de su medio natural son materiales que interferirían con los usos diagnósticos o terapéuticos para la proteína de unión, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteínicos o no proteínicos. En algunas realizaciones, la proteína de unión se purificará: (1) a más del 95% en peso del anticuerpo como se determina por el método de Lowry, y lo más preferiblemente más del 99% en peso, (2) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de taza giratoria, o (3) hasta homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras usando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción de plata. Las proteínas de unión aisladas incluyen la proteína de unión in situ en células recombinantes ya que al menos un componente del medio natural de la proteína de unión no estará presente.

Los términos “sustancialmente puro” o “sustancialmente purificado” como se usan en la presente memoria se refieren a un compuesto o especie que es la especie predominante presente (es decir, en una base molar es más abundante que cualquier otra especie individual en la composición). En algunas realizaciones, una fracción sustancialmente purificada es una composición en la que la especie comprende al menos aproximadamente 50% (en una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. En otras realizaciones, una composición sustancialmente pura comprenderá más de aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95% o 99% de todas las especies macromoleculares presentes en la composición. En otras realizaciones más, la especie se purifica hasta homogeneidad esencial (las especies contaminantes no pueden detectarse en la composición mediante métodos de detección convencionales) en la que la composición consiste esencialmente en una única especie macromolecular.

Una proteína de unión “de neutralización” como se usa en la presente memoria se refiere a una molécula que es capaza de bloquear o reducir sustancialmente una función efectora de un antígeno diana al que se une. Como se usa en la presente memoria, “reducir sustancialmente” significa al menos aproximadamente el 60%, preferiblemente al menos aproximadamente el 70%, más preferiblemente al menos aproximadamente el 75%, incluso más preferiblemente al menos aproximadamente el 80%, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 85%, lo más preferiblemente al menos aproximadamente el 90% de reducción de una función efectora del antígeno diana.

El término “epítopo” incluye cualquier determinante, preferiblemente un determinante polipeptídico, capaz de unirse específicamente a una inmunoglobulina o receptor de células T. En ciertas realizaciones, los determinantes de epítopo incluyen agrupaciones de superficie químicamente activas de moléculas como aminoácidos, cadenas laterales de azúcares, grupos fosforilo, o grupos sulfonilo, y, en ciertas realizaciones, pueden tener características estructurales tridimensionales específicas y/o características de carga específicas. Un epítopo es una región de un antígeno que está unido por un anticuerpo o proteína de unión. En ciertas realizaciones, una proteína de unión se dice que se une específicamente a un antígeno cuando reconoce preferentemente su antígeno diana en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas. En algunas realizaciones, una proteína de unión se dice que se une específicamente a un antígeno cuando la constante de disociación de equilibrio es <10-8 M, más preferiblemente cuando la constante de disociación de equilibrio es <10-9 M, y lo más preferiblemente cuando la constante de disociación es <10-10 M.

La constante de disociación (Kd) de una proteína de unión puede determinarse, por ejemplo, por resonancia de plasmón superficial. Generalmente, el análisis de la resonancia de plasmón superficial mide las interacciones de unión en tiempo real entre el ligando (un antígeno diana en una matriz biosensora) y el analito (una proteína de unión en disolución) mediante resonancia de plasmón superficial (SPR) usando el sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ). El análisis de plasmón superficial puede realizarse también inmovilizando el analito (proteína de unión en una matriz biosensora) y presentando el ligando (antígeno diana). El término “Kd”, como se usa en la presente memoria se refiere a la constante de disociación de la interacción entre una proteína de unión particular y un antígeno diana.

El término “une específicamente” como se usa en la presente memoria se refiere a la capacidad de una proteína de unión o un fragmento de unión a antígeno de la misma para unirse a un antígeno que contiene un epítopo con una Kd de al menos aproximadamente 1 x 10-6 M, 1 x 10-7 M, 1 x 10-8 M, 1 x 10-9 M, 1 x 10-10 M, 1 x 10-11 M,1 x 10-12 M, o más, y/o para unirse a un epítopo con una afinidad que es al menos dos veces mayor que su afinidad por un antígeno no específico.

El término “conector” como se usa en la presente memoria se refiere a uno o más residuos de aminoácido insertados entre los dominios de inmunoglobulina para proporcionar suficiente movilidad para que los dominios de las cadenas ligera y pesada se plieguen en inmunoglobulinas de región variable dual cruzada. Un conector se inserta en la transición entre dominios variables o entre dominios variables y constantes, respectivamente, al nivel de secuencia. La transición entre dominios puede identificarse porque el tamaño aproximado de los dominios de la inmunoglobulina se entiende bien. La posición precisa de una transición de dominio puede determinarse localizando tramos peptídicos que no forman elementos estructurales secundarios tales como beta-láminas o alfa-hélices como se demuestra por datos experimentales o como puede asumirse por técnicas de modelado o predicción de estructura secundaria. Los conectores descritos en la presente memoria se denominan como L¹, que está situado en la cadena ligera entre el extremo C del Vl²y el extremo N del dominio V u ; y L², que está situado en la cadena ligera entre el extremo C del Vl¹y el extremo N del dominio Cl. Los conectores de la cadena pesada se conocen como L³, que está situado entre el extremo C del Vh¹y el extremo N del dominio Vh²; y L⁴, que está situado entre el extremo C del Vh²y el extremo N del dominio Ch¹.

El término “vector” como se usa en la presente memoria se refiere a cualquier molécula (p.ej., ácido nucleico, plásmido o virus) que se usa para transferir información de codificación a una célula huésped. El término “vector” incluye una molécula de ácido nucleico que es capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un “plásmido”, que se refiere a una molécula de ADN bicatenaria circular en que se pueden insertar segmentos adicionales de ADN. Otro tipo de vector es un vector viral, en el que los segmentos adicionales de ADN pueden insertarse en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped en la que se introducen (p.ej., vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores episomales de mamíferos). Otros vectores (p.ej., vectores no episomales de mamíferos) pueden integrarse en el genoma de una célula huésped tras la introducción en la célula huésped y replicarse así junto con el genoma huésped. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que se unen de forma operativa. Dichos vectores se denominan en la presente memoria como “vectores de expresión recombinantes” (o simplemente, “vectores de expresión”). En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante están a menudo en forma de plásmidos. Los términos “plásmido” y “vector” pueden usarse de forma intercambiable en la presente memoria, ya que un plásmido es la forma más normalmente usada de vector. Sin embargo, la descripción pretende incluir otras formas de vectores de expresión, tales como vectores virales (p.ej., retrovirus de replicación defectuoso, adenovirus y virus adeno-asociados), que cumplen funciones equivalentes.

La frase “célula huésped recombinante” (o “célula huésped”) como se usa en la presente memoria se refiere a una célula en la que se ha introducido un vector de expresión recombinante. Una célula huésped recombinante o célula huésped sirve para referirse no solo a la célula objeto particular, sino también a la progenie de dicha célula. Como ciertas modificaciones pueden darse en las siguientes generaciones debido o a mutación o influencias ambientales, dicha progenie puede, de hecho, no ser idéntica a la célula parental, pero dichas células todavía están incluidas en el alcance del término “célula huésped” como se usa en la presente memoria. Una amplia variedad de sistemas de expresión de células huésped puede usarse para expresar las proteínas de unión, que incluyen sistemas de expresión bacterianos, de levadura, baculoviral y de mamíferos (además de sistemas de expresión de presentación de fagos). Un ejemplo de un vector de expresión bacteriana adecuado es pUC19. Para expresar una proteína de unión de forma recombinante, una célula huésped se transforma o transfecta con uno o más vectores de expresión recombinantes que portan fragmentos de ADN que codifican las cadenas polipeptídicas de la proteína de unión de manera que las cadenas polipeptídicas se expresan en la célula huésped y, preferiblemente, se secretan en el medio en que se cultivan las células huésped, a partir de cuyo medio puede recuperarse la proteína de unión.

El término “transformación” como se usa en la presente memoria se refiere a un cambio en las características genéticas de una célula, y una célula se ha transformado cuando se ha modificado para contener un nuevo ADN. Por ejemplo, una célula se transforma donde se modifica genéticamente a partir de su estado nativo. Después de la transformación, el ADN de transformación puede recombinarse con el de la célula integrándose físicamente en un cromosoma de la célula, o puede mantenerse temporalmente como un elemento episomal sin replicarse, o puede replicarse independientemente como un plásmido. Se considera que una célula se ha transformado establemente cuando el ADN se replica con la división de la célula. El término “transfección” como se usa en la presente memoria se refiere a la captación de ADN extraño o exógeno por una célula, y una célula se ha “transfectado” cuando el ADN exógeno se ha introducido dentro de la membrana celular. Un número de técnicas de transfección se conocen bien en la técnica. Dichas técnicas pueden usarse para introducir una o más moléculas de ADN exógeno en células huésped adecuadas.

El término “que se da de forma natural” como se usa en la presente memoria y se aplica a un objeto se refiere al hecho de que el objeto puede encontrarse en la naturaleza y no se ha manipulado por el hombre. Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido que está presente en un organismo (incluyendo virus) que puede aislarse de una fuente en la naturaleza y que no se ha modificado intencionadamente por el hombre se da de forma natural. De forma similar, “que no se da de forma natural” como se usa en la presente memoria se refiere a un objeto que no se encuentra en la naturaleza o que se ha modificado estructuralmente o sintetizado por el hombre.

Como se usa en la presente memoria, los veinte aminoácidos convencionales y sus abreviaturas siguen el uso convencional. Los estereoisómeros (p.ej., D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales; aminoácidos no naturales y análogos tales como aminoácidos a ,a-disustituidos, N-alquilaminoácidos, ácido láctico, y otros aminoácidos no convencionales pueden también ser componentes adecuados para las cadenas polipeptídicas de las proteínas de unión. Ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen: 4-hidroxiprolina, Y-carboxiglutamato, £-N,N,N-trimetil-lisina, e-N-acetil-lisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, o-N-metilarginina, y otros aminoácidos e iminoácidos similares (p.ej., 4-hidroxiprolina). En la notación polipeptídica usada en la presente memoria, la dirección izquierda es la dirección amino terminal y la dirección derecha es la dirección carboxilo terminal, de acuerdo con el uso estándar y la convención.

Los residuos que se dan de forma natural pueden dividirse en clases en base a las propiedades de la cadena lateral común:

(1) hidrófobo: Met, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Tyr, Pro;

(2) hidrófilo polar: Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, His, Lys, Ser, Thr;

(3) alifático: Ala, Gly, Ile, Leu, Val, Pro;

(4) hidrófobo alifático: Ala, Ile, Leu, Val, Pro;

(5) hidrófilo neutro: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(6) ácido: Asp, Glu;

(7) básico: His, Lys, Arg;

(8) residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro;

(9) aromático: His, Trp, Tyr, Phe; y

(10) hidrófobo aromático: Phe, Trp, Tyr.

Las sustituciones de aminoácidos conservativas pueden implicar el intercambio de un miembro de una de estas clases con otro miembro de la misma clase. Las sustituciones no conservativas pueden implicar el intercambio de un miembro de una de estas clases por un miembro de otra clase.

Un experto será capaz de determinar variantes adecuadas de las cadenas polipeptídicas de las proteínas de unión usando técnicas bien conocidas. Por ejemplo, un experto en la técnica puede identificar áreas adecuadas de una cadena polipeptídica que pueden cambiarse sin destruir la actividad dirigiéndose a regiones que no se cree que sean importantes para la actividad. Alternativamente, un experto en la técnica puede identificar residuos y partes de las moléculas que se conservan entre polipéptidos similares. Además, incluso áreas que pueden ser importantes para la actividad biológica o para la estructura pueden someterse a sustituciones de aminoácidos conservativas sin destruir la actividad biológica o sin afectar de forma adversa a la estructura polipeptídica.

El término “paciente” como se usa en la presente memoria incluye sujetos humanos y animales.

Los términos “tratamiento” o “tratar” como se usan en la presente memoria se refieren tanto a tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen aquellos que tienen el trastorno además de los propensos a tener un trastorno o aquellos en que el trastorno se va a evitar. En realizaciones particulares, las proteínas de unión pueden usarse para tratar seres humanos infectados con VIH, o seres humanos susceptibles a la infección por VIH, o mejorar la infección por VIH en un sujeto humano infectado con VIH. Las proteínas de unión pueden usarse también para prevenir el VIH en un paciente humano.

Debería entenderse que tratar seres humanos infectados con VIH incluye a aquellos sujetos que están en cualquiera de las diversas etapas de la progresión de la infección por VIH, que, por ejemplo, incluyen síndrome de infección primaria aguda (que puede ser asintomática o estar asociada con una enfermedad tipo gripe con fiebres, malestar general, diarrea y síntomas neurológicos tales como dolor de cabeza), infección asintomática (que es el largo periodo latente con una disminución gradual en el número de células T CD4+ circulantes), y SIDA (que se define por enfermedad que define el SIDA más seria y/o una disminución en el conteo de células CD4 circulantes a por debajo de un nivel que es compatible con la función inmune eficaz). Además, tratar o prevenir la infección por VIH incluirá también tratar la infección sospechada por VIH después de la exposición pasada sospechada a VIH mediante p.ej., contacto con sangre contaminada con VIH, transfusión de sangre, intercambio de fluidos corporales, sexo “no seguro” con una persona infectada, pinchazo con aguja accidental, recibir un tatuaje o acupuntura con instrumentos contaminados, o transmisión del virus de una madre a un niño durante el embarazo, parto o poco después.

Los términos “composición farmacéutica” o “composición terapéutica” como se usa en la presente memoria se refieren a un compuesto o composición capaz de inducir un efecto terapéutico deseado cuando se administra apropiadamente a un paciente.

El término “vehículo farmacéuticamente aceptable” o “vehículo fisiológicamente aceptable” como se usa en la presente memoria se refiere a uno o más materiales de formulación adecuados para conseguir o mejorar la distribución de una proteína de unión.

Los términos “cantidad eficaz” y “cantidad terapéuticamente eficaz” cuando se usan en referencia a una composición farmacéutica que comprende una o más proteínas de unión se refieren a una cantidad o dosis suficiente para producir un resultado terapéutico deseado. Más específicamente, una cantidad terapéuticamente eficaz es una cantidad de una proteína de unión suficiente para inhibir, durante algún periodo de tiempo, uno o más de los procesos patológicos definidos clínicamente asociados con la condición que se trata. La cantidad eficaz puede variar dependiendo de la proteína de unión específica que se usa, y también depende de una variedad de factores y condiciones relacionadas con el paciente que se trata y la gravedad del trastorno. Por ejemplo, si la proteína de unión se va a administrar in vivo, factores como la edad, peso, y salud del paciente además de las curvas de respuesta a la dosis y datos de toxicidad obtenidos en el trabajo animal preclínico estarían entre los factores considerados. La determinación de una cantidad eficaz o cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica dada está bien dentro de la capacidad de los expertos en la técnica.

Una realización de la descripción proporciona una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión.

Proteínas de unión triespecíficas y/o trivalentes

En una realización, la proteína de unión de la descripción es una proteína de unión triespecífica y/o trivalente que comprende cuatro cadenas polipeptídicas que forman tres sitios de unión a antígeno que se unen específicamente a una o más (p.ej., tres diferentes) proteínas diana de VIH, en las que una primera cadena polipeptídica comprende una estructura representada por la fórmula:

VL2- L1-VL1- L2-Cl [I]

y una segunda cadena polipeptídica comprende una estructura representada por la fórmula:

Vh¹- L3-VH2- L⁴-CH¹[II]

y una tercera cadena polipeptídica comprende una estructura representada por la fórmula:

VH3-CH1 [III]

VL3-CL [IV]

en la que:

VL¹es un primer dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;

VL2 es un segundo dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;

VL3 es un tercer dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;

VH¹es un primer dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;

VH²es un segundo dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;

VH³es un tercer dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;

CL es un dominio constante de la cadena ligera de inmunoglobulina;

CH¹es un dominio constante de la cadena pesada CH¹de inmunoglobulina; y

L¹, L², L³y L⁴son conectores de aminoácido;

y en la que el polipéptido de fórmula I y el polipéptido de fórmula II forman un par de cadena ligera-cadena pesada cruzado, y en la que

(a) VL¹comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 500, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 501, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 274; Vl²comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 275, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 276, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 277; Vl3 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 266, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 267, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 268; Vh¹comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 254, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 255, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 256; Vh²comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 257, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 258, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 259; y Vh³comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 248, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 497, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 250; o

(b) Vl¹comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 500, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 501, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 274; Vl²comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 275, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 276, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 277; Vl³comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 269, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 270, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 271; Vh¹comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 254, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 255, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 256; Vh²comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ iD NO: 257, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 258, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 259; y Vh³comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 251, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 252, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 253; o

(c) Vl¹comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 275, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 276, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 277; Vl²comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 500, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 501, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 274; Vl³comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 269, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 270, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 271; Vh¹comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 257, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 258, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 259; Vh²comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ iD NO: 254, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 255, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 256; y Vh³comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 251, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 252, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 253.

(a) Vl¹comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 518; Vl²comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 519; Vl³comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 512; Vh¹comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 504; Vh²comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 506; y Vh³comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 502; o

(b) Vl¹comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 518; Vl²comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 519; Vl³comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 513; Vh¹comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 504; Vh²comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 506; y Vh³comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 503; o

(c) Vl¹comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 519; Vl²comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 518; Vl³comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 513; Vh¹comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 506; Vh²comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 504; y Vh³comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 503.

(a) el dominio Ch³de la segunda cadena polipeptídica comprende sustituciones de aminoácidos en posiciones que corresponden a las posiciones 354 y 366 de IgG1 humana según el índice UE, en el que las sustituciones de aminoácidos son S354C y T366W; y en la que el domino Ch³de la tercera cadena polipeptídica comprende las sustituciones de aminoácidos en posiciones que corresponden a las posiciones 349, 366, 368 y 407 de IgG ¹humana según el índice UE, en la que las sustituciones de aminoácidos son Y349C, T366S, L368A e Y407V; o

(b) el dominio Ch³de la segunda cadena polipeptídica comprende sustituciones de aminoácidos en posiciones correspondientes a las posiciones 349, 366, 368 y 407 de IgG 1 humana según el índice UE, en la que las sustituciones de aminoácidos son Y349C, T366S, L368A e Y407V; y en la que el dominio Ch³de la tercera cadena polipeptídica comprende sustituciones de aminoácidos en posiciones correspondientes a posiciones 354 y 366 de IgG1 humana según el índice UE, en la que las sustituciones de aminoácidos son S354C y T366W.

En una realización más preferida, los dominios Ch3 de la segunda y la tercera cadenas polipeptídicas comprenden ambas sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a la posición 428 y 434 de IgG1 humana según el índice UE, en la que las sustituciones de aminoácidos son M428L y N434S.

En una realización más preferida, L¹, L², L³y/o L⁴comprende la secuencia Asp-Lys-Thr-His-Thr (SEQ ID NO: 525).

En otra realización, la presente descripción proporciona una proteína de unión que comprende una primera cadena polipeptídica, una segunda cadena polipeptídica, una tercera cadena polipeptídica y una cuarta cadena polipeptídica en la que:

(a) la primera cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; la segunda cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; la tercera cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; y la cuarta cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 2 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2;

(b) la primera cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; la segunda cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; la tercera cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; y la cuarta cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10;

(c) la primera cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; la segunda cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; la tercera cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; y la cuarta cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18.

En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica tienen una orientación cruzada que forma dos sitios de unión a antígeno distintos. En algunas realizaciones, el Vh¹y Vl¹forman un par de unión y forman el primer sitio de unión a antígeno. En algunas realizaciones, el Vh²y Vl²forman un par de unión y forman el segundo sitio de unión a antígeno. En algunas realizaciones, el tercer polipéptido y el cuarto polipéptido forman un tercer sitio de unión al antígeno. En algunas realizaciones, el Vh3 y Vl3 forman un par de unión y forman el tercer sitio de unión a antígeno.

En realizaciones particulares, se cambia el orden de los dominios Vh¹y Vh², y por lo tanto el orden de los dominios Vl¹y Vl², en la cadena polipeptídica de fórmula I o la cadena polipeptídica de fórmula II (es decir, invertir del orden).

Proteínas diana

En una realización, las proteínas de unión se unen específicamente a una o más proteínas diana de VIH. En algunas realizaciones, las proteínas de unión son triespecíficas y se unen específicamente a MPER de la proteína gp41 de VIH-1, un sitio de unión a CD4 de la proteína gp120 de VIH-1, un glicano en el bucle V3 de la proteína gp120 de VIH-1, un trímero de la punta de la proteína gp120 de VIH-1 o gp160. En otras realizaciones, las proteínas de unión se unen específicamente a una o más proteína diana de VIH y una o más proteínas diana en una célula T que incluye el complejo receptor de la célula T. Estas proteínas de unión al acoplador de la célula T son capaces de reclutar células T temporalmente para dirigirse a células y, al mismo tiempo, activar la actividad citolítica de las células T. Los anticuerpos triespecíficos del acoplador de la célula T pueden usarse para activar los reservorios de VIH-1 y redirigir/activar las células T para lisar las células T infectadas con VIH-1+ de forma latente. Ejemplos de proteínas diana en las células T incluyen aunque no están limitadas a CD3 y CD28, entre otras. En algunas realizaciones, las proteínas de unión triespecíficas pueden generarse combinando los dominios de unión al antígeno de dos o más anticuerpos monoespecíficos (anticuerpos parentales) en un anticuerpo. Véanse las Publicaciones Internacionales núms. WO 2011/038290 A2, WO 2013/086533 A1, WO 2013/070776 A1, WO 2012/154312 A1 y WO 2013/163427 A1. Las proteínas de unión de la descripción pueden prepararse usando dominios o secuencias obtenidas o derivadas de cualquier anticuerpo humano o no humano, incluyendo, por ejemplo, anticuerpos humanos, murinos o humanizados.

En algunas realizaciones de la descripción, la proteína de unión trivalente es capaz de unirse a tres dianas de antígeno diferentes. En una realización, la proteína de unión es triespecífica y un par de cadena ligera-cadena pesada es capaz de unirse a dos dianas de antígeno o epítopos diferentes y un par de cadena ligera-cadena pesada es capaz de unirse a una diana de antígeno o epítopo. En otra realización, la proteína de unión es capaz de unirse a tres dianas de antígeno de VIH diferentes que están situadas en la estructura de glicoproteína de la envoltura de VIH compuesta por las subunidades gp120 y gp41. En otras realizaciones, la proteína de unión es capaz de inhibir la función de una o más dianas de antígeno.

En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente descripción se une a una o más proteínas diana de VIH. En algunas realizaciones, la proteína de unión es capaz de unirse específicamente a tres epítopos diferentes en una única proteína diana de VIH. En algunas realizaciones, la proteína de unión es capaz de unirse a dos epítopos diferentes en una primera proteína diana de VIH, y un epítopo en una segunda proteína diana de VIH. En algunas realizaciones, la primera y segunda proteínas diana de VIH son diferentes. En algunas realizaciones, la proteína de unión es capaz de unirse específicamente a tres proteínas diana de VIH diferentes. En algunas realizaciones, la una o más proteínas diana de VIH son una o más de glicoproteína 120, glicoproteína 41 y glicoproteína 160.

En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente descripción se une a una o más proteínas diana de VIH y una o más proteínas diana de la célula T. En algunas realizaciones, la proteína de unión es capaz de unirse específicamente a una proteína diana de VIH y dos epítopos diferentes en una única proteína diana de la célula T. En algunas realizaciones, la proteína de unión es capaz de unirse específicamente a una proteína diana de VIH y dos diferentes proteínas diana de la célula T (p.ej., CD28 y CD3). En algunas realizaciones, la proteína de unión es capaz de unirse específicamente a una proteína diana de la célula T y dos epítopos diferentes en una única proteína diana de VIH. En algunas realizaciones, la proteína de unión es capaz de unirse específicamente a una proteína diana de célula T y dos proteínas diana de VIH diferentes. En algunas realizaciones, la primera y segunda cadenas polipeptídicas de la proteína de unión forman dos sitios de unión a antígeno que se dirigen específicamente a dos proteínas diana de la célula T, y la tercera y cuarta cadenas polipeptídicas de la proteína de unión forman un sitio de unión al antígeno que se une específicamente a una proteína diana de VIH. En algunas realizaciones, la una o más proteínas diana de VIH son una o más de glicoproteína 120, glicoproteína 41 y glicoproteína 160. En algunas realizaciones, la una o más proteínas diana de la célula T son una o más de CD3 y CD28.

Conectores

En algunas realizaciones, los conectores L¹, L², L³y L⁴oscilan de ningún aminoácido (longitud = ⁰) a aproximadamente 100 aminoácidos de largo, o menos de 100, 50, 40, 30, 20 o 15 aminoácidos o menos. Los conectores pueden tener también ^{1 0}, 9, ⁸, 7, ⁶, 5, 4, 3, ²o ¹aminoácidos de longitud. L¹, L², L³y L⁴en una proteína de unión pueden tener todos la misma secuencia de aminoácidos o pueden tener todos diferentes secuencias de aminoácidos.

Ejemplos de conectores adecuados incluyen un único residuo de glicina (Gly); un péptido de diglicina (Gly-Gly); un tripéptido (Gly-Gly-Gly); un péptido con cuatro residuos de glicina (Gly-Gly-Gly-Gly; SEQ ID NO: 285); un péptido con cinco residuos de glicina (G ly-G ly-G ly-Gly-G ly; SEQ ID NO: 286); un péptido con seis residuos de glicina (Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly; SEQ ID NO: ^{2 8 7}); un péptido con siete residuos de glicina (G ly-G ly-Gly-G ly-G ly-Gly-G ly; SEQ iD n O: 288); un péptido con ocho residuos de glicina (G ly-G ly-Gly-G ly-G ly-Gly-G ly-G ly; SEQ ID NO: 289). Otras combinaciones de residuos de aminoácido pueden usarse como el péptido Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 290), el péptido Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 291) y el péptido Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 292). Otros conectores adecuados incluyen una única Ser, y residuo Val; el dipéptido Arg-Thr, Gln-Pro, Ser-Ser, Thr-Lys, y Ser-Leu; Thr-Lys-Gly-Pro-Ser (SEQ ID NO: 293); Thr-Val-Ala-Ala-Pro (SEQ ID NO: 294), Gln-Pro-Lys-Ala-Ala (SEQ ID NO: 295), Gln-Arg-Ile-Glu-Gly (SEQ ID NO: 296); Ala-Ser-Thr-Lys-Gly-Pro-Ser (SEQ ID NO: 297), Arg-Thr-Val-Ala-Pro-Ser (SEQ ID NO: 298), Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro (SEQ ID NO: 299), e His-Ile-Asp-Ser-Pro-Asn-Lys (SEQ ID NO: 300). Los conectores que comprenden aminoácidos aleatoriamente seleccionados del grupo que consiste en valina, leucina, isoleucina, serina, treonina, lisina, arginina, histidina, aspartato, glutamato, asparagina, glutamina, glicina y prolina se ha mostrado que son adecuados en las proteínas de unión.

La identidad y secuencia de los residuos de aminoácido en el conector pueden variar dependiendo del tipo de elemento estructural secundario necesario para conseguir en el conector. Por ejemplo, glicina, serina y alanina son los mejores para conectores que tienen máxima flexibilidad. Algunas combinaciones de glicina, prolina, treonina y serina son útiles si es necesario un conector más rígido y extenso. Cualquier residuo de aminoácido puede considerarse como un conector en combinación con otros residuos de aminoácido para construir conectores peptídicos mayores según se necesiten dependiendo de las propiedades deseadas.

En algunas realizaciones, la longitud de L¹es al menos dos veces la longitud de L³. En algunas realizaciones, la longitud de L²es al menos dos veces la longitud de L⁴. En algunas realizaciones, la longitud de L¹es al menos dos veces la longitud de L³, y la longitud de L²es al menos dos veces la longitud de L⁴. En algunas realizaciones, L¹es de 3 a 12 residuos de aminoácido de longitud, L²es de 3 a 14 residuos de aminoácido de longitud, L³es de 1 a ⁸residuos de aminoácido de longitud y L4 es de 1 a 3 residuos de aminoácido de longitud. En algunas realizaciones, L¹es de 5 a 10 residuos de aminoácido de longitud, L²es de 5 a ⁸residuos de aminoácido de longitud, L³es de 1 a 5 residuos de aminoácido de longitud y L4 es de 1 a 2 residuos de aminoácido de longitud. En algunas realizaciones, L¹es de 7 residuos de aminoácido de longitud, L²es de 5 residuos de aminoácido de longitud, L³es de 1 residuo de aminoácido de longitud y L⁴es de 2 residuos de aminoácido de longitud.

En algunas realizaciones, L¹, L², L³y/o L⁴comprenden la secuencia Asp-Lys-Thr-His-Thr (SEQ ID NO: 525). En algunas realizaciones, L¹comprende la secuencia Asp-Lys-Thr-His-Thr (SEQ ID NO: 525). En algunas realizaciones, L³comprende la secuencia Asp-Lys-Thr-His-Thr (SEQ ID NO: 525).

En algunas realizaciones, L¹, L², L³y/o L⁴comprenden la secuencia Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro (SEQ ID NO: 299). En algunas realizaciones, L¹comprende la secuencia Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro (SEQ ID NO: 299). En algunas realizaciones, L¹comprende la secuencia Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro (SEQ ID NO: 299), L²comprende la secuencia Thr-Lys-Gly-Pro-Ser-Arg (SEQ ID NO: 526), L³comprende la secuencia Ser, y L⁴comprende la secuencia Arg-Thr. En algunas realizaciones, L³comprende la secuencia Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro (SEQ ID NO: 299). En algunas realizaciones, L¹comprende la secuencia Ser, L²comprende la secuencia Arg-Thr, L³comprende la secuencia Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro (SEQ ID NO: 299) y L⁴comprende la secuencia Thr-Lys-Gly-Pro-Ser-Arg (SEQ ID NO: 526).

Regiones Fc y dominios constantes

En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente descripción comprende una segunda cadena polipeptídica que comprende además una región Fc unida a Ch¹, comprendiendo la región Fc una región bisagra de inmunoglobulina y los dominios constantes de la cadena pesada de inmunoglobulina Ch²y Ch3. En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente descripción comprende una tercera cadena polipeptídica que comprende además una región Fc unida a Ch¹, comprendiendo la región Fc una región bisagra de inmunoglobulina y los dominios constantes de cadena pesada de inmunoglobulina Ch²y Ch³. En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente descripción comprende una segunda cadena polipeptídica que comprende además una región Fc unida a Ch¹, comprendiendo la región Fc una región bisagra de inmunoglobulina y los dominios constantes de cadena pesada de inmunoglobulina Ch²y Ch3, y una tercera cadena polipeptídica que comprende además una región Fc unida a Ch¹, comprendiendo la región Fc una región bisagra de inmunoglobulina y los dominios constantes de cadena pesada de inmunoglobulina Ch²y Ch3.

Para mejorar los rendimientos de las proteínas de unión, en algunas realizaciones, los dominios Ch3 pueden alterarse mediante la tecnología “botón en ojal” que se describe en detalle con varios ejemplos en, por ejemplo, la Publicación Internacional núm. WO 96/027011, Ridgway et al., 1996, Protein Eng. 9:617-21; y Merchant et al., 1998, Nat. Biotechnol. 16:677-81. Específicamente, las superficies de interacción de los dos dominios Ch3 se alteran para aumentar la heterodimerización de ambas cadenas pesadas que contienen estos dos dominios CH³. Cada uno de los dos dominios Ch3 (de las dos cadenas pesadas) pueden ser el “botón”, mientras que el otro es el “ojal”. La introducción de un puente disulfuro estabiliza más los heterodímeros (Merchant et al., 1998; Atwell et al., 1997, J. Mol. Biol. 270: 26-35) y aumenta el rendimiento. En realizaciones particulares, el botón está en el segundo par de polipéptidos con un único dominio variable. En otras realizaciones, el botón está en el primer par de polipéptidos que tienen la orientación cruzada. En otras realizaciones más, los dominios Ch3 no incluyen un botón en ojal.

En algunas realizaciones, la proteína de unión de la presente descripción comprende una mutación “botón” en la segunda cadena polipeptídica y una mutación “ojal” en la tercera cadena polipeptídica. En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente descripción comprende una mutación “botón” en la tercera cadena polipeptídica y una mutación “ojal” en la segunda cadena polipeptídica. En algunas realizaciones, la mutación “botón” comprende sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 354 y 366 de la IgG1 humana según el índice UE. En algunas realizaciones, las sustituciones de aminoácidos son S354C y T366W. En algunas realizaciones, la mutación “ojal” comprende sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 349, 366, 368 y 407 de la IgG1 humana según el índice UE. En algunas realizaciones, las sustituciones de aminoácidos son Y349C, T366S, L368A e Y407V. En algunas realizaciones, la segunda cadena polipeptídica comprende además una primera región Fc unida a Ch¹, comprendiendo la primera región Fc una región bisagra de inmunoglobulina y los dominios constantes de la cadena pesada de inmunoglobulina Ch²y Ch3, en la que la primera región Fc comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 354 y 366 de la IgG 1 humana según el índice UE, en la que las sustituciones de aminoácidos son S354C y T366W; y en la que la tercera cadena polipeptídica comprende además una segunda región Fc unida a Ch¹, comprendiendo al segunda región Fc una región bisagra de inmunoglobulina y los dominios constantes de la cadena pesada de inmunoglobulina CH²y CH³, en la que la segunda región Fc comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 349, 366, 368 y 407 de la IgG 1 humana según el índice UE, en la que las sustituciones de aminoácidos son Y349C, T366S, L368A e Y407V. En algunas realizaciones, la segunda cadena polipeptídica comprende además una primera región Fc unida a Ch¹, comprendiendo la primera región Fc una región bisagra de inmunoglubulina y los dominios constantes de la cadena pesada de inmunoglobulina Ch²y Ch3, en la que la primera región Fc comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 349, 366, 368 y 407 de la IgG1 humana según el índice UE, en la que las sustituciones de aminoácidos son Y349C, T366S, L368A e Y407V; y en la que la tercera cadena polipeptídica comprende además una segunda región Fc unida a Ch¹, comprendiendo la segunda región Fc una región bisagra de inmunoglobulina y los dominios constantes de la cadena pesada de inmunoglobulina Ch²y Ch3, en la que la segunda región Fc comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 354 y 366 de la IgG1 humana según el índice UE, en la que las sustituciones de aminoácidos son S354C y T366W.

En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente descripción comprende una o más mutaciones para mejorar la vida media en suero (véase p.ej., Hinton, P.R. et al. (2006) J. Immunol. 176(1):346-56). En algunas realizaciones, la mutación comprende sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 428 y 434 de la IgG1 humana según el índice UE, en la que las sustituciones de aminoácidos son M428L y N434S. En algunas realizaciones, la proteína de unión comprende una segunda cadena polipeptídica que comprende además una primera región Fc unida a Ch1, comprendiendo la primera región Fc una región bisagra de inmunoglobulina y los dominios constantes de la cadena pesada de inmunoglobulina Ch2 y Ch3, y una tercera cadena polipeptídica que comprende además una segunda región Fc unida a Ch1, comprendiendo la segunda región Fc una región bisagra de inmunoglobulina y los dominios constantes de la cadena pesada de inmunoglobulina Ch2 y Ch³, en la que la primera y segunda regiones Fc comprenden sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 428 y 434 de la IgG1 humana según el índice UE, en la que las sustituciones de aminoácidos son M428L y N434S. En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente descripción comprende mutaciones de botón en ojal y una o más mutaciones para mejorar la vida media en suero.

En algunas realizaciones, Ch1, Ch2, Ch³y Cl de las proteína de unión triespecíficas descritas en la presente memoria pueden comprender cualquiera de las secuencias Ch1, Ch2, Ch³y Cl de las proteínas de unión ¹-53.

Ácidos nucleicos

Las metodologías estándar de ADN recombinante se usan para construir los polinucleótidos que codifican los polipéptidos que forman las proteínas de unión, incorporar estos polinucleótidos en vectores de expresión recombinante, e introducir dichos vectores en células huésped. Véase p.ej., Sambrook et al., 2001, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3a Ed.). Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación pueden llevarse a cabo según las especificaciones del fabricante, como normalmente se consiguen en la técnica, o como se describen en la presente memoria. A menos que se proporcionen definiciones específicas, la nomenclatura utilizada en conexión con, y los procedimientos de laboratorio y técnicas de, química analítica, química orgánica sintética, y química médica y farmacéutica descritas en la presente memoria son las bien conocidas y usadas normalmente en la técnica. De forma similar, pueden usarse técnicas convencionales para síntesis químicas, análisis químicos, preparación farmacéutica, formulación, distribución y tratamiento de pacientes.

Otros aspectos de la presente descripción se refieren a moléculas aisladas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifican cualquiera de las proteínas de unión descritas en la presente memoria. En algunas realizaciones, el ácido nucleico aislado se une de forma operable a un promotor heterólogo para la transcripción directa de la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de unión. Un promotor puede referirse a secuencias de control del ácido nucleico que realizan la transcripción directa de un ácido nucleico. Una primera secuencia de ácido nucleico se une de forma operable a una segunda secuencia de ácido nucleico cuando la primera secuencia de ácido nucleico se sitúa en una relación funcional con la segunda secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor se une de forma operable a una secuencia de codificación de una proteína de unión si el promotor afecta a la transcripción o expresión de la secuencia de codificación. Ejemplos de promotores pueden incluir, aunque no están limitados a, promotores obtenidos de los genomas de virus (tales como virus de polioma, virus de la viruela aviar, adenovirus (tal como Adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B, virus del simio 40 (SV40), y similares), de promotores eucarióticos heterólogos (tal como el promotor de actina, un promotor de inmunoglobulina, de promotores de choque térmico, y similares), el promotor de CAG (Niwa et al., Gene 108(2): 193-9, 1991), el promotor de fosfoglicerato quinasa (PGK), un promotor inducible por tetraciclina (Masui et al., Nucleic Acids Res. 33:e43, 2005), el sistema lac, el sistema trp, el sistema tac, el sistema trc, regiones principales del operador y promotor del fago lambda, el promotor para 3-fosfoglicerato quinasa, los promotores de la fosfatasa ácida de levadura, y el promotor de los factores de apareamiento alfa de la levadura. Los polinucleótidos que codifican proteínas de unión de la presente descripción pueden estar bajo el control de un promotor constitutivo, un promotor inducible o cualquier otro promotor adecuado descrito en la presente memoria u otro promotor adecuado que se reconocerá fácilmente por un experto en la técnica.

En algunas realizaciones, el ácido nucleico aislado se incorpora en un vector. En algunas realizaciones, el vector es un vector de expresión. Los vectores de expresión pueden incluir una o más secuencias reguladoras unidas de forma operativa al polinucleótido a expresar. El término “secuencia reguladora” incluye promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (p.ej., señales de poliadenilación). Los ejemplos de potenciadores adecuados pueden incluir, aunque no están limitados a, secuencias potenciadoras de genes de mamíferos (tales como globina, elastasa, albúmina, a-fetoproteína, insulina y similares), y secuencias potenciadoras de un virus de célula eucariota (tal como potenciador de SV40 en el lado tardío del origen de replicación (pb 100-270), el potenciador del promotor temprano del citomegalovirus, el potenciador del polioma en el lado tardío del origen de replicación, potenciadores del adenovirus, y similares). Ejemplos de vectores adecuados pueden incluir, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, episomas, transposones y vectores virales (p.ej., vectores adenoviral, viral vacuna, viral de Sindbis, del sarampión, viral del herpes, lentiviral, retroviral, viral adeno-asociado, etc.). Los vectores de expresión pueden usarse para transfectar células huésped, tales como, por ejemplo, células bacterianas, células de levadura, células de insectos, y células de mamíferos. Los vectores de ADN viral y plásmido biológicamente funcionales capaces de expresión y replicación en un huésped se conocen en la técnica, y pueden usarse para transfectar cualquier célula de interés.

Otros aspectos de la presente descripción se refieren a un sistema vectorial que comprende uno o más vectores que codifican una primera, segunda, tercera y cuarta cadena polipeptídica de cualquiera de las proteínas de unión descritas en la presente memoria. En algunas realizaciones, el sistema vectorial comprende un primer vector que codifica la primera cadena polipeptídica de la proteína de unión, un segundo vector que codifica la segunda cadena polipeptídica de la proteína de unión, un tercer vector que codifica la tercera cadena polipeptídica de la proteína de unión, y un cuarto vector que codifica la cuarta cadena polipeptídica de la proteína de unión. En algunas realizaciones, el sistema vectorial comprende un primer vector que codifica la primera y segunda cadenas polipeptídicas de la proteína de unión, y un segundo vector que codifica la tercera y cuarta cadenas polipeptídicas de la proteína de unión. En algunas realizaciones, el sistema vectorial comprende un primer vector que codifica la primera y tercera cadenas polipeptídicas de la proteína de unión, y un segundo vector que codifica la segunda y cuarta cadenas polipeptídicas de la proteína de unión. En algunas realizaciones, el sistema vectorial comprende un primer vector que codifica la primera y cuarta cadenas polipeptídicas de la proteína de unión, y un segundo vector que codifica la segunda y tercera cadenas polipeptídicas de la proteína de unión. En algunas realizaciones, el sistema vectorial comprende un primer vector que codifica la primera, segunda, tercera y cuarta cadenas polipeptídicas de la proteína de unión. El uno o más vectores del sistema vectorial puede ser cualquiera de los vectores descritos en la presente memoria. En algunas realizaciones, el uno o más vectores son vectores de expresión.

Células huésped

Otros aspectos de la presente descripción se refieren a una célula huésped (p.ej., una célula huésped aislada) que comprende uno o más polinucleótidos, vectores y/o sistemas vectoriales aislados descritos en la presente memoria. En algunas realizaciones, una célula huésped aislada de la presente descripción se cultiva in vitro. En algunas realizaciones, la célula huésped es una célula bacteriana (p.ej., una célula E. coli). En algunas realizaciones, la célula huésped es una célula de levadura (p.ej., una célula de S. cerevisiae). En algunas realizaciones, la célula huésped es una célula de insecto. Ejemplos de células huésped de insecto pueden incluir, por ejemplo, células de Drosophila (p.ej., células S2), células de Trichoplusia ni (p.ej., células High FiveTM), y células de Spodoptera frugiperda (p.ej., células Sf21 o Sf9). En algunas realizaciones, la célula huésped es una célula de mamífero. Ejemplos de células huésped de mamífero incluyen, por ejemplo, células renales embrionarias humanas (p.ej., células 293 o 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo en suspensión), células Expi293TM, células CHO, células renales de hámster infantil (p.ej., BHK, ATCC CCL10), células de Sertoli de ratón (p.ej., células TM4), células renales de mono (p.ej., CV1 ATc C CCL 70), células renales de mono verde africano (p.ej., VERO-76, ATCC CRL-1587), células de carcinoma cervical humano (p.ej., HELA, ATCC CCL 2), células renales caninas (p.ej., MDCK, ATCC CCL 34), células hepáticas de rata búfalo (p.ej., BRL 3A, ATCC Cr L 1442), células pulmonares humanas (p.ej., W138, a Tc C CCL 75), células hepáticas humanas (p.ej., Hep G2, HB 8065), células de tumor mamario de ratón (p.ej., MMT 060562, ATCC CCL51), células TRI, células MRC 5, células FS4, una línea de hepatoma humano (p.ej., Hep G2), y células de mieloma (p.ej. células NS0 y Sp2/0).

Otros aspectos de la presente descripción se refieren a un método para producir cualquiera de las proteínas de unión descritas en la presente memoria. En algunas realizaciones, el método incluye a) cultivar una célula huésped (p.ej., cualquiera de las células huésped descritas en la presente memoria) que comprende un ácido nucleico, vector y/o sistema vectorial aislado (p.ej., cualquiera de los ácidos nucleicos, vectores y/o sistemas vectoriales aislados descritos en la presente memoria) en condiciones tales que la célula huésped exprese la proteína de unión; y b) aislar la proteína de unión de la célula huésped. Los métodos de cultivo de células huésped en condiciones para la expresión de una proteína se conocen bien por un experto en la técnica. Los métodos de aislamiento de proteínas desde las células huésped cultivadas se conocen bien por un experto en la técnica, que incluyen, por ejemplo, por cromatografía de afinidad (p.ej., cromatografía de afinidad en dos etapas que comprende la cromatografía de afinidad de la proteína A seguida por cromatografía de exclusión de tamaño).

Uso de las proteínas de unión

Las proteínas de unión pueden emplearse en cualquier método de ensayo conocido, tal como ensayos de unión competitiva, ensayos en sándwich directos e indirectos, y ensayos de inmunoprecipitación para la detección y cuantificación de uno o más antígenos diana. Las proteínas de unión se unirán al uno o más antígenos diana con una afinidad que es apropiada para el método de ensayo que se emplea.

Para aplicaciones diagnósticas, en ciertas realizaciones, las proteínas de unión pueden marcarse con un resto detectable. El resto detectable puede ser cualquiera que sea capaz de producir, o bien directamente o indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, el resto detectable puede ser un radioisótopo, tal como 3H, 14C, 32P, 35S, 125I, 99Tc, 111In o 67Ga; un compuesto fluorescente o quimioluminiscente, tal como isotiocianato de fluoresceína, rodamina o luciferina; o una enzima, tal como fosfatasa alcalina, p-galactosidasa o peroxidasa de rábano picante.

Las proteínas de unión también son útiles para la formación de imágenes in vivo. Una proteína de unión marcada con un resto detectable puede administrarse a un animal, p.ej., en la corriente sanguínea, y ensayarse la presencia y situación del anticuerpo marcado en el huésped. La proteína de unión puede marcarse con cualquier resto que sea detectable en un animal, por resonancia magnética nuclear, radiología u otro medio de detección conocido en la técnica.

La descripción también se refiere a un kit que comprende una proteína de unión y otros reactivos útiles para detectar los niveles de antígeno diana en muestras biológicas. Dichos reactivos pueden incluir una marca detectable, suero de bloqueo, muestras de control positivas y negativas, y reactivos de detección. En algunas realizaciones, el kit comprende una composición que comprende cualquier proteína de unión, polinucleótido, vector, sistema vectorial, y/o célula huésped descrita en la presente memoria. En algunas realizaciones, el kit comprende un recipiente y una etiqueta o folleto en o asociado con el recipiente. Recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas, bolsas de solución IV, etc. Los recipientes pueden estar formados por una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que es por sí misma o combinada con otra composición eficaz para tratar, prevenir y/o diagnosticar una condición (p.ej., infección por VIH) y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tenga un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). En algunas realizaciones, la etiqueta o folleto indica que la composición se usa para prevenir, diagnosticar y/o tratar la condición de elección. Alternativamente, o adicionalmente, el artículo de fabricación o kit puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para la inyección (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y utilitario, que incluyen otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.

Las composiciones terapéuticas o farmacéuticas que comprenden proteínas de unión están dentro del alcance de la descripción. Dichas composiciones terapéuticas o farmacéuticas pueden comprender una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión, o conjugado de proteína de unión-fármaco, mezclado con un agente de formulación farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable seleccionado para que sea adecuado con el modo de administración.

Los materiales de formulación aceptables son no tóxicos para los recipientes a las dosis y concentraciones empleadas.

La composición farmacéutica puede contener materiales de formulación para modificar, mantener o conservar, por ejemplo, el pH, osmolaridad, viscosidad, claridad, color, isotonicidad, olor, esterilidad, estabilidad, velocidad de disolución o liberación, adsorción o penetración de la composición. Los materiales de formulación adecuados incluyen, aunque no están limitados a, aminoácidos (tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina),agentes antimicrobianos, antioxidantes (tales como ácido ascórbico, sulfito sódico, o sulfito de hidrógeno y sodio), tampones (tales como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos u otros ácidos orgánicos), agentes espesantes (tales como manitol o glicina), agentes quelantes (tal como ácido etilendiaminatetraacético (EDTA)), agentes complejantes (tales como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina o hidroxipropil-beta-ciclodextrina), cargas, monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos (tales como glucosa, manosa o dextrinas), proteínas (tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas), agentes colorantes, aromatizantes y diluyentes, agentes emulgentes, polímeros hidrófilos (tal como polivinilpirrolidona), polipéptidos de bajo peso molecular, contraiones formadores de sales (tal como sodio), conservantes (tales como cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, alcohol de fenetilo, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico o peróxido de hidrógeno), disolventes (tales como glicerina, propilenglicol o polietilenglicol), alcoholes de azúcar (tales como manitol o sorbitol), agentes de suspensión, tensioactivos o agentes humectantes (tales como plurónicos; PEG; ésteres de sorbitán; polisorbatos tales como polisorbato 20 o polisorbato 80; tritón; trometamina; lecitina; colesterol o tiloxapal), agentes potenciadores de la estabilidad (tales como sacarosa o sorbitol), agentes potenciadores de la tonicidad (tales como haluros de metal alcalino - p.ej., cloruro de sodio o potasio - o manitol sorbitol), vehículos de distribución, diluyentes, excipientes y/o adyuvantes farmacéuticos (véase, p.ej., REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES (18a Ed., A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company 1990), y ediciones posteriores del mismo.

La composición farmacéutica óptima se determinará por un experto dependiendo, por ejemplo, de la ruta prevista de administración, formato de distribución y dosis deseada. Dichas composiciones pueden influir en el estado físico, estabilidad, velocidad de liberación in vivo, y velocidad de aclaramiento in vivo de la proteína de unión.

El vehículo o transporte principal en una composición farmacéutica puede ser de naturaleza acuosa o no acuosa. Por ejemplo, un vehículo o transporte adecuado para la inyección puede ser agua, solución salina fisiológica, o fluido cerebroespinal artificial, posiblemente suplementado con otros materiales comunes en composiciones para administración parenteral. La solución salina tamponada neutra o solución salina mezclada con albúmina sérica son vehículos ejemplares adicionales. Otras composiciones farmacéuticas ejemplares comprenden tampón Tris de aproximadamente pH 7,0-8,5, o tampón acetato de aproximadamente pH 4,0-5,5, que puede incluir además sorbitol o un sustituto adecuado. En una realización de la descripción, las composiciones de proteína de unión pueden prepararse para el almacenaje mezclando la composición seleccionada que tiene el grado deseado de pureza con agentes de formulación opcionales en forma de una torta liofilizada o una solución acuosa. Además, la proteína de unión puede formularse como un liofilizado usando excipientes apropiados tales como sacarosa.

Las composiciones farmacéuticas de la descripción pueden seleccionarse para distribución parenteral o subcutánea. De forma alternativa, las composiciones pueden seleccionarse para inhalación o para distribución a través del tracto digestivo, tal como oralmente. La preparación de dichas composiciones farmacéuticamente aceptables está dentro de las competencias de la técnica.

Los componentes de la formulación están presentes en concentraciones que son aceptables para el sitio de administración. Por ejemplo, los tampones se usan para mantener la composición a pH fisiológico o a un pH ligeramente menor, típicamente en un intervalo de pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 8.

Cuando se contempla la administración parenteral, las composiciones terapéuticas para el uso pueden estar en forma de una disolución acuosa, parenteralmente aceptable, libre de pirógenos, que comprende la proteína de unión deseada en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un vehículo particularmente adecuado para la inyección parenteral es agua destilada estéril en que una proteína de unión se formula como una solución isotónica, estéril, conservada apropiadamente. Aún otra preparación puede implicar la formulación de la molécula deseada con un agente, tal como microesferas inyectables, partículas bio-erosionables, compuestos poliméricos (tales como ácido poliláctico o ácido poliglicólico), perlas, o liposomas, que proporciona la liberación controlada o prolongada del producto que puede distribuirse después por medio de una inyección de depósito. También puede usarse ácido hialurónico, y esto puede tener el efecto de promover la duración prolongada en la circulación. Otros medios adecuados para la introducción de la molécula deseada incluyen dispositivos de distribución de fármacos implantables.

En una realización, una composición farmacéutica puede formularse para inhalación. Por ejemplo, una proteína de unión puede formularse como un polvo seco para la inhalación. Las soluciones de inhalación de proteína de unión pueden formularse además con un propelente para la distribución en aerosol. En otra realización más, las soluciones pueden nebulizarse.

También se contempla que ciertas formulaciones pueden administrarse oralmente. En una realización de la descripción, las proteínas de unión que se administran de esta forma pueden formularse con o sin los transportes usados habitualmente en la composición de formas de dosificación sólidas como comprimidos y cápsulas. Por ejemplo, una cápsula puede diseñarse para liberar la parte activa de la formulación en el punto del tracto gastrointestinal donde la biodisponibilidad se maximiza y la degradación pre-sistémica se minimiza. Pueden incluirse agentes adicionales para facilitar la absorción de la proteína de unión. También pueden emplearse diluyentes, aromatizantes, ceras de bajo punto de fusión, aceites vegetales, lubricantes, agentes de suspensión, agentes disgregantes del comprimido y aglutinantes.

Otra composición farmacéutica puede implicar una cantidad eficaz de proteínas de unión en una mezcla con excipientes no tóxicos que son adecuados para la fabricación de comprimidos. Disolviendo los comprimidos en agua estéril, u otro vehículo apropiado, pueden prepararse disoluciones en forma de dosis unitaria. Excipientes adecuados incluyen, aunque no están limitados a, diluyentes inertes, tales como carbonato de calcio, carbonato sódico o bicarbonato, lactosa, o fosfato de calcio; o agentes aglutinantes, tales como almidón, gelatina o goma arábiga; o agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, ácido esteárico o talco.

Composiciones farmacéuticas adicionales de la descripción serán evidentes para los expertos en la técnica, incluyendo formulaciones que implican proteínas de unión en formulaciones de distribución prolongada o controlada. Técnicas para formular una variedad de otros medios de distribución prolongada o controlada, tales como transportes de liposoma, micropartículas bio-erosionables o perlas porosas e inyecciones de depósito, también se conocen por los expertos en la técnica. Ejemplos adicionales de preparados de liberación prolongada incluyen matrices poliméricas semipermeables en forma de artículos conformados, p.ej., películas o microcápsulas. Las matrices de liberación prolongada pueden incluir poliésteres, hidrogeles, polilactidas, copolímeros de ácido L-glutámico y gamma etil-L-glutamato, poli(2-hidroxietil-metacrilato), acetato de etilenvinilo, o ácido poli-D(-)-3-hidroxibutírico. Las composiciones de liberación prolongada pueden incluir además liposomas, que pueden prepararse mediante cualquiera de los diversos métodos conocidos en la técnica.

Las composiciones farmacéuticas a usar para la administración in vivo típicamente deben ser estériles. Esto puede conseguirse mediante filtración a través de membranas de filtración estériles. Cuando la composición se liofiliza, la esterilización usando este método puede realizarse antes o después de la liofilización y reconstitución. La composición para la administración parenteral puede almacenarse en forma liofilizada o en una disolución. Además, las composiciones parenterales generalmente se colocan en un recipiente que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica.

Una vez que la composición farmacéutica se ha formulado, puede almacenarse en viales estériles como una disolución, suspensión, gel, emulsión, sólido, o como un polvo deshidratado o liofilizado. Dichas formulaciones pueden almacenarse o en una forma lista para usar o en una forma (p.ej., liofilizada) que necesita reconstitución antes de la administración.

La descripción también incluye kits para producir una unidad de administración de dosis única. Los kits pueden contener cada uno tanto un primer recipiente que tiene una proteína seca como un segundo recipiente que tiene una formulación acuosa. También se incluyen en el alcance de esta descripción kits que contienen jeringas pre-rellenas de cámara sencilla y múltiple (p.ej., jeringas líquidas y liojeringas).

La cantidad eficaz de una composición farmacéutica de proteína de unión a emplear terapéuticamente dependerá, por ejemplo, del contexto terapéutico y los objetivos. Un experto en la técnica apreciará que los niveles de dosificación apropiados para el tratamiento variarán por tanto dependiendo, en parte, de la molécula distribuida, la indicación para la que se usa la proteína de unión, la ruta de administración y el tamaño (peso corporal, superficie corporal o tamaño del órgano) y condición (la edad y salud general) del paciente. Por consiguiente, el médico puede titular la dosificación y modificar la ruta de administración para obtener el efecto terapéutico óptimo.

La frecuencia de dosificación dependerá de lo parámetros farmacocinéticos de la proteína de unión en la formulación que se usa. Típicamente, un médico administrará la composición hasta que se alcance la dosificación que proporciona el efecto deseado. La composición puede administrarse por lo tanto como una única dosis, como dos o más dosis (que pueden o no contener la misma cantidad de la molécula deseada) en el tiempo, o como una infusión continua por medio de un dispositivo de implantación o catéter. El ajuste adicional de la dosis apropiada se hace de forma rutinaria por el experto en la técnica y está dentro del ámbito de tareas realizadas de forma rutinaria por los mismos. Las dosificaciones apropiadas pueden determinarse mediante el uso de datos apropiados de respuesta a la dosis.

La ruta de administración de la composición farmacéutica está de acuerdo con métodos conocidos, p.ej., oralmente; a través de inyección mediante rutas intravenosa, intraperitoneal, intracerebral (intraparenquimal), intracerebroventricular, intramuscular, intraocular, intraarterial, intraportal o intralesional; mediante sistemas de liberación prolongada; o mediante dispositivos de implantación. Cuando se desee, las composiciones pueden administrarse mediante inyección de bolo o de forma continua mediante infusión, o mediante un dispositivo de implantación.

La composición también puede administrarse localmente por medio de la implantación de una membrana, esponja u otro material apropiado en el que se ha absorbido o encapsulado la molécula deseada. Cuando se usa un dispositivo de implantación, el dispositivo puede implantarse en cualquier tejido u órgano adecuado, y la distribución de la molécula deseada puede ser por medio de difusión, bolo de liberación temporizada o administración continua.

Las composiciones farmacéuticas pueden usarse para prevenir y/o tratar la infección por VIH. Las composiciones farmacéuticas pueden usarse como una terapia independiente o en combinación con terapia anti-retroviral estándar.

En algunas realizaciones, la presente descripción se refiere a la proteína de unión de la presente invención para usar en un método de prevención y/o tratamiento de infección por VIH en un paciente. En algunas realizaciones, la proteína de unión para el uso de la presente invención comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos una de las proteínas de unión descritas en la presente memoria. En algunas realizaciones, la al menos una proteína de unión se administra en combinación con una terapia anti-retroviral (p.ej., una terapia anti-VIH). En algunas realizaciones, la al menos una proteína de unión se administra antes de la terapia anti-retroviral. En algunas realizaciones, la al menos una proteína de unión se administra simultáneamente con la terapia anti-retroviral. En algunas realizaciones, la al menos una proteína de unión se administra después de la terapia anti-retroviral. En algunas realizaciones, la al menos una proteína de unión se co-administra con cualquier terapia anti-retroviral estándar conocida en la técnica. En algunas realizaciones, la administración de la al menos una proteína de unión da por resultado la neutralización de uno o más viriones de VIH. En algunas realizaciones, la administración de la al menos una proteína de unión da por resultado la eliminación de una o más células infectadas por VIH de forma latente y/o crónica en el paciente. En algunas realizaciones, la administración de la al menos una proteína de unión da por resultado la neutralización de uno o más viriones de VIH y da por resultado la eliminación de una o más células infectadas con VIH de forma latente y/o crónica en el paciente. En algunas realizaciones, el paciente es un ser humano.

EJEMPLOS

Los ejemplos que siguen son ilustrativos de realizaciones específicas de la descripción, y diversos usos de las mismas.

Ejemplo 1: producción de proteínas de unión triespecíficas dirigidas a la glicoproteína Env de VIH-1

La glicoproteína de envoltura de VIH-1 (Env/gp160) está situada en la superficie de la partícula viral, y está compuesta por un homo-trímero que comprende tres complejos gp41 y gp120 transmembrana unidos de forma no covalente. Env permite la entrada viral en células diana mediante la unión de gp120 al receptor principal de VIH (CD4) y el co-receptor (CCR5 o CXCR4), seguido por la inducción de la fusión de la membrana viral/celular facilitada por los cambios conformacionales en gp41, dando por resultado la entrada de la cápside viral y la distribución del genoma viral en la célula huésped. Además, Env se expresa en la superficie de células infectadas.

Env actúa como la única diana para los anticuerpos de neutralización en el virión de VIH-1. La unión de anticuerpos de neutralización a Env viral inhibe el acoplamiento/entrada viral. Además, la unión de anticuerpos de neutralización a células que expresan Env, infectadas con VIH-1, lleva a su destrucción mediante la citotoxicidad mediada por la célula dependiente del anticuerpo (ADCC) y la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), dando por resultado la reducción del reservorio viral latente. Por consiguiente, los anticuerpos de neutralización dirigidos a Env son un área atractiva para el desarrollo de terapia anti-viral. Sin embargo, debido a la alta diversidad de secuencia y tasa de mutación del virus VIH-1, el desarrollo de anticuerpos de neutralización dirigidos a Env ha resultado un desafío debido a la alta probabilidad de que una cepa dada de VIH-1 o carezca del epítopo de cualquier anticuerpo de neutralización dado, o la cepa haya desarrollado una mutación que lo haga resistente al anticuerpo. Deben desarrollarse estrategias para mitigar el rebrote de cepas virales cuando se desarrollan nuevos anticuerpos de neutralización dirigidos a VIH-1. Los estudios descritos en la presente memoria exploran el desarrollo de nuevas proteínas de unión triespecíficas que comprenden cuatro polipéptidos que forman tres sitios de unión al antígeno que se unen específicamente a tres epítopos diferentes en la glicoproteína Env de VIH, y el uso de estas nuevas proteínas de unión triespecíficas en la neutralización de VIH-1.

Métodos

Producción y purificación de pro teína de unión

Los vectores que expresan las proteínas de unión triespecíficas se construyeron insertando los genes de cadena pesada y ligera diseñados en un vector de expresión de mamífero. El emparejamiento correspondiente de la cadena pesada y ligera se dio de forma espontánea, y la formación del heterodímero se promovió mediante mutaciones botón en ojal construidas en la región Fc.

Las proteínas de unión se produjeron en células Expi293 mediante co-transfección de cuatro plásmidos de expresión (Life Technologies, Expi293TM Expression System Kit, núm. de cat. A14635). Las proteínas de unión se purificaron usando un esquema de purificación de dos etapas. Primero, las proteínas de unión se capturaron en resina de cromatografía de afinidad de proteína A, se lavaron, y después se eluyeron en glicina a pH 3,0. Las proteínas eluidas se dializaron después en PBS, se concentraron y se filtraron. Los anticuerpos filtrados se purificaron adicionalmente usando una columna Superdex 200 SEC para obtener proteínas de unión monoméricas.

Medidas de afinidad de las proteínas de unión

Las afinidades de unión de proteínas de unión triespecíficas de anti-VIH se midieron mediante resonancia de plasmón superficial (SPR) usando un instrumento Biacore 3000 (GE Healthcare). El tampón de ensayo usado fue HBS-EP (GE Healthcare).

La afinidad de las proteínas indicadas para el sitio de unión MPER en la proteína de VIH-1 gp41 se midió mediante análisis de resonancia de plasmón superficial (SPR) usando un instrumento Biacore como sigue: las proteínas de unión se capturaron primero en un chip CM5 acoplado con anticuerpo Fc anti-humano, seguido por flujo a través de concentraciones variables (100 nM - 6,25 nM) del péptido de unión MPER (acetil-RRRNEQELLELDKWASLWNWFDITNWLWYIRRR-Ttds-Lys-(Biotina)-NH²) (SEQ ID NO: 284) a 30 pL por minuto, y la unión se detectó por la medida de la asociación durante 240 segundos, y disociación durante 300 segundos en un Biacore 3000 a 25°C. El tampón HBS-EP se usó para la dilución de la muestra, además de tampón de la marcha. La regeneración del chip se hizo con MgCl²3 M a 30 pL por minuto. Para el análisis de datos se usó el software BIAevaluation v.4.1 (GE Healthcare). Los datos se ajustaron globalmente usando un modelo de Langmuir 1:1 con transferencia de masa. Después del ajuste de la curva basada en el software, las tasas ON y OFF a cada concentración de péptido de unión MPER se calcularon y se usaron para obtener una afinidad de unión para cada proteína de unión.

La afinidad de las proteínas indicadas para el sitio de unión CD4BS en la proteína de VIH-1 gp120 se midió por SPR como sigue: se capturó proteína gp120 de VIH-1 recombinante (Thr27-Arg498) (VIH-1/Clado B/C (CN54), ARCO Biosystems (núm. de catálogo GP4-V15227)) en un chip CM5, seguido por flujo a través de concentraciones variables (100 nM - 6,25 nM) de las proteínas de unión, y se detectó la unión por la medida de asociación durante 240 segundos, y disociación durante 300 segundos en un Biacore 3000 a 25°C. Se usó tampón HBS-EP para la dilución de la muestra, además de tampón de la marcha. La regeneración del chip se hizo con MgCl²3 M a 30 pL por minuto. Para el análisis de datos se usó el software BIAevaluation v.4.1 (GE Healthcare). Los datos se ajustaron globalmente usando un modelo de Langmuir 1:1 con transferencia de masa. Después del ajuste de la curva basada en el software, se calcularon las tasas ON y OFF a cada concentración de la proteína de unión y se usaron para obtener una afinidad de unión para cada proteína de unión.

Estabilidad conformacional y ensayos de agregación

La estabilidad conformacional de las proteínas de unión triespecíficas se evaluó determinando el punto de fusión Tm y la temperatura de comienzo de agregación (Tagg).

Las medidas del punto de fusión Tm se realizaron mediante fluorimetría de barrido diferencial (DSF). Las muestras se diluyeron en tampón D-PBS (Invitrogen) a una concentración final de 0,2 pg/pL incluyendo una disolución de concentración 4X de tinte SYPRO-Naranja (Invitrogen, existencias de 5000X en DMSO) en D-PBS en placas de 96 pocillos con semi-faldón blancas (BIORAD). Todas las medidas se hicieron por duplicado usando un instrumento de PCR a tiempo real MyiQ2 (BIORAD). Las curvas derivadas primeras negativas (-d(RFU)/dT) de las curvas de fusión se generaron en el software iQ5 v2.1 (BIORAD). Los datos se exportaron luego a Excel para la determinación de Tm y la representación gráfica.

El punto de fusión Tm y la temperatura de comienzo de agregación (Tagg) se midieron también mediante dispersión de luz estática (SLS) usando un instrumento Unit (Unchained Labs). Se cargaron 9 pL de cada muestra sin diluir en una matriz multicubeta. Las muestras se calentaron entonces de 20°C a 95°C a una velocidad de calentamiento de 0,3°C/minuto. El medio baricéntrico (BCM) de los espectros de fluorescencia del triptófano se usó para medir la curva de fusión de la proteína, y determinar los valores de Tm. La señal de dispersión de luz estática (SLS) a 266 nm se usó para medir la curva de agregación y determinar la Tagg. El análisis de datos se realizó usando el software de análisis Unit v2.1.

Resultados

Se desarrolló una nueva estrategia para mejorar la eficacia del anticuerpo de neutralización frente al VIH-1, mientras se limitaba simultáneamente la probabilidad de rebrote viral debido a la alta diversidad de secuencia y/o mutación viral. Esta estrategia implicó la generación de proteínas de unión triespecíficas que comprenden cuatro polipéptidos que formaron tres sitios de unión al antígeno que se unen específicamente a tres epítopos diferentes en la glicoproteína Env de VIH (FIG.

1). Cada sitio de unión al antígeno comprendía el dominio Vh y Vl de un diferente anticuerpo de neutralización de VIH-1 que se dirigía a distintos epítopos en la glicoproteína Env. Las proteínas de unión triespecíficas contenían un primer par de polipéptidos que poseían dominios variables duales que tenían una orientación cruzada que formaban dos sitios de unión al antígeno distintos (denominados el formato Ig de CODV), y un segundo par de polipéptidos, cada uno con un único dominio variable que formaban un tercer sitio de unión al antígeno (FIGS. 1A y 1B).

El primer par de polipéptidos (que poseía los dominios variables duales) comprendía un primer polipéptido que tenía la estructura VL²-Conector-VL¹-Conector-dominio constante de la cadena ligera de inmunoglobulina, y un segundo polipéptido que tenía la estructura Vm-Conector-VH²-Conector-dominios constantes de la cadena pesada Ch¹, bisagra, CH²y CH³de inmunoglobulina, dando por resultado un par de polipéptidos que tenían una orientación cruzada que formaba dos sitios de unión al antígeno distintos: Vh¹-Vl¹y Vh²-Vl²(FIGS. 1C y 1D, véanse las cadenas B ligera y pesada). El segundo par de polipéptidos (que cada uno poseía un único dominio variable) comprendía un primer polipéptido que tenía la estructura VH3-dominios constantes de la cadena pesada Ch¹, bisagra, Ch²y Ch3 de inmunoglobulina, y un segundo polipéptido que tenía la estructura VL3-dominio constante de la cadena ligera de inmunoglobulina, dando por resultado un par de polipéptidos que formaban un tercer sitio de unión al antígeno: VH³-Vl3 (FIGS. 1C y 1D, véanse las cadenas A ligera y pesada). Además, las proteínas de unión triespecíficas se construyeron para incluir una mutación LS. Además, las proteínas de unión triespecíficas se construyeron de manera que dentro de una proteína de unión, un dominio CH³incluía una mutación botón y el otro dominio CH³incluía una mutación ojal para facilitar la heterodimerización de las cadenas pesadas (FIG. 1).

Usando el enfoque descrito anteriormente para el diseño de la proteína de unión trivalente, se generaron tres proteínas de unión triespecíficas (proteínas de unión 2, 3 y 24). Estas proteínas de unión triespecíficas se crearon injertando en un marco de proteína de unión triespecífica los dominios Vh y Vl aislados de anticuerpos que se dirigen a tres epítopos distintos en la glicoproteína Env de VIH-1: Ab MPER (que se dirige al epítopo MPER en gp41), Ab CD4BS “b” (que se dirige al sitio de unión CD4 en gp120), y Ab dirigido a V1/V2 “a” (que se dirige al dominio V1/V2 en gp120). La proteína de unión 2 se construyó de manera que el primer par de polipéptidos (que formaba dos sitios de unión al antígeno) se dirigía a los epítopos de glicoproteína Env de VIH-1 MPER y V1/V2, y el segundo par de polipéptidos (que formaba el único sitio de unión al antígeno) se dirigía al epítopo de glicoproteína Env de VIH-1 CD4BS (proteína de unión 2 = MPER x V1/V2/CD4BS). La proteína de unión 3 se construyó de manera que el primer par de polipéptidos (que formaba dos sitios de unión al antígeno) se dirigía a los epítopos de glicoproteína Env de VIH-1 V1/V2 y MPER, y el segundo par de polipéptidos (que formaba el sitio de unión al antígeno único) se dirigía al epítopo de glicoproteína Env de VIH-1 CD4Bs (proteína de unión 3 = V1/V2 x MPER/CD4BS). La proteína de unión 24 se construyó de manera que el primer par de polipéptidos (que formaba dos sitios de unión al antígeno) se dirigía a los epítopos de glicoproteína Env de VIH-1 V1/V2 y CD4BS, y el segundo par de polipéptidos (que formaba el sitio de unión al antígeno único) se dirigía al epítopo de glicoproteína Env de VIH-1 MPER (proteína de unión 24 = V1/V2 x CD4BS / MPER). Las tres proteínas de unión triespecíficas, además de sus anticuerpos parentales, se purificaron en resina de afinidad de proteína A (FIGS. 2A y 3A) seguido por cromatografía de exclusión de tamaño (FIGS. 2B y 3B) para obtener proteínas monoméricas adecuadas para la caracterización adicional. Las tres proteínas de unión triespecíficas eran estables y formaron monómeros a alta frecuencia.

Para probar el potencial para desarrollar proteínas de unión que se dirigen a dos diferentes epítopos de proteína Env de VIH-1 (en vez de tres), se diseñaron proteínas de unión biespecíficas en base al formato Ig CODV descrito anteriormente (véase el documento WO 2012/135345), usando dos dominios Vh y Vl diferentes a partir de los mismos anticuerpos parentales usados para crear las proteínas de unión triespecíficas. Sin embargo, las proteínas de unión biespecíficas con estos dominios variables específicos no se purificaron bien como monómeros, mostrando una formación de agregado significativamente mayor cuando se compara con las correspondientes proteínas de unión triespecíficas (FIG. 4A y 4B).

Después, se midió la afinidad de unión de las proteínas de unión triespecíficas purificadas (y sus anticuerpos parentales) para los epítopos de glicoproteína Env de VIH-1 en gp41 y gp120. Primero, se midió la afinidad de unión para gp41 para las tres proteínas de unión triespecíficas, además del anticuerpo MPER parental, mediante ensayo Biacore usando el péptido de unión MPER (FIG. 5). Se calculó que la afinidad de unión para el anticuerpo MPER era 18,7 nM. Sorprendentemente, las tres proteínas de unión triespecíficas tenían todas una mayor afinidad por el péptido de unión MPER que la del anticuerpo parental (Tabla 3), teniendo la proteína de unión 2 una afinidad aproximadamente 3,1 veces mayor que el anticuerpo MPER (6,05 nM frente a 18,7 nM, respectivamente).

Tabla 3: Medidas de afinidad para el péptido de unión MPER

De forma similar, la afinidad de unión por el sitio de unión CD4 en gp120 se midió para las tres proteínas de unión triespecíficas, además del anticuerpo CD4BS parental, mediante ensayo Biacore (FIG. 6). Las tres proteínas de unión triespecíficas tenían todas una afinidad similar por el sitio de unión CD4 cuando se comparan con el anticuerpo parental (Tabla 4).

Tabla 4: Medidas de afinidad para el sitio de unión CD4BS

Por consiguiente, las proteínas de unión triespecíficas fueron capaces de unirse a ambos de los epítopos diana probados en la glicoproteína Env de VIH-1 (Tabla 5). Además, las tres proteínas de unión triespecíficas se unieron a los epítopos diana con afinidades aproximadamente iguales a o que exceden a las de sus anticuerpos parentales. La afinidad de unión del Ab dirigido a V1/V2 “a”, además de los sitios de unión de Ab dirigido a V1/V2 “a” en las tres proteínas de unión triespecíficas 2, 3 y 24 no pudo determinarse por análisis Biacore porque esto necesitaba un antígeno de proteína gp120 específico que no estaba disponible.

Tabla 5: Compendio de las capacidades de unión de las proteínas de unión probadas

Las propiedades biofísicas se probaron para las proteínas de unión triespecíficas y anticuerpos parentales (Tabla 6). Todas las proteínas probadas tenían estabilidades similares y propensiones limitadas a formar agregados.

Tabla 6: Estabilidad conformacional/agregación de las proteínas de unión

Estos experimentos indicaron que las proteínas de unión triespecíficas, monoméricas, estables, que se dirigen a tres epítopos distintos en la glicoproteína Env de VIH-1 podían construirse y purificarse de forma eficaz. Además, las proteínas de unión triespecíficas retuvieron su capacidad de unirse a sus epítopos diana, teniendo afinidad similar o mejorada respecto a sus anticuerpos parentales. Finalmente, las proteínas de unión triespecíficas tenían propiedades biofísicas adecuadas, y mostraron una agregación significativamente menor que las correspondientes proteínas de unión biespecíficas.

Ejemplo 2: caracterización de las proteínas de unión

Debido al éxito del desarrollo de tres proteínas de unión triespecíficas con propiedades biofísicas y capacidades de unión apropiadas (como se describe en el ejemplo 1), se desarrollaron y probaron 21 proteínas de unión triespecíficas adicionales. Los experimentos descritos en la presente memoria exploraron la capacidad de las 24 proteínas de unión triespecíficas para neutralizar VIH-1 in vitro, y las propiedades farmacocinéticas de un número de estas proteínas de unión triespecíficas in vivo.

Los ensayos de neutralización se realizaron usando el ensayo TZM-b1 que mide la neutralización como una función de reducciones en la expresión del gen reportero de luciferasa de luciérnaga (Luc) regulado por Tat de VIH-1 después de una única ronda de infección con virus pseudotipados con Env. Los ensayos se realizaron como se describe en Marcella Sarzotti-Kelsoe et al., J. Immunological Methods, 409:131-146 (2014). Los resultados de neutralización de varios anticuerpos se muestran en las Tablas 8-10.

Métodos

Producción de virus pseudotipados con Env

Las existencias de ensayo de virus pseudotipados con Env se produjeron en células 293T/17 por co-transfección con dos plásmidos: un plásmido de expresión de Env y un plásmido que expresa el genoma entero de VIH-1 excepto por Env. La co-transfección de estos plásmidos produjo partículas infecciosas de pseudovirus que eran capaces de distribuir el gen Tat en las células diana, pero las infecciones con estos pseudoviriones no pudieron producir a sí mismo progenie viral infecciosa.

Ensayo de neutralización viral

La neutralización de la infección por VIH usando células TZM-b1 (también conocidas como células JC53BL-13) se realizó como se describe anteriormente (Marcella Sarzotti-Kelsoe et al., J. Immunological Methods, 409:131-146 (2014)). Brevemente, una única ronda de infección usando los viriones de VIH-1 pseudotipados con Env se realizó en células TZM-b1 (un clon celular de HeLa CXCR-4-positivo). Las células TZM-b1 se diseñaron para expresar CD4 y CCR5, y para contener genes reporteros integrados por luciferasa de luciérnaga y p-galactosidasa de E. coli bajo el control de una repetición terminal larga de VIH. La expresión del gen reportero se indujo in trans mediante la proteína Tat viral (distribuida por los virus pseudotipados) justo después de la infección de ciclo único. La actividad de la luciferasa se cuantificó como unidades de luminiscencia relativa (RLU), y fue directamente proporcional al número de partículas infecciosas de virus presentes en el inóculo inicial durante un amplio intervalo de valores. La neutralización se midió como una función de la expresión del gen reportero de luciferasa de luciérnaga (Luc) regulada por Tat disminuida después de la administración de concentraciones variables de las proteínas de unión indicadas. Las titulaciones de neutralización se identificaron como la dilución de proteína a la que las RLUs se reducen en el 80% en comparación con los pocillos de control del virus después de la resta de las RLUs de fondo. El ensayo se realizó en placas de 96 pocillos por la alta capacidad de rebrote, y las cepas de referencia bien caracterizadas se utilizaron para la uniformidad a través de los estudios.

Medidas farmacocinéticas (PK)

Macacos rhesus indios hembra que pesaban entre 3 y 6 kg se asignaron aleatoriamente a grupos según el peso corporal (dos macacos por grupo) y se inyectaron de forma intravenosa con la concentración indicada de proteínas de unión. Se recogió sangre de los animales antes de la inyección en el día 0, y 30 minutos, 6 horas, 1 día, 2 días, 4 días, 7 días, 14 días, 21 días y 28 días después de la inyección. La concentración en suero de cada proteína de unión se cuantificó en el plasma a partir de la sangre recogida usando un ensayo ELISA basado en RSC3.

Resultados

21 proteínas de unión triespecíficas adicionales que se dirigen a tres epítopos de glicoproteína Env de VIH-1 distintos se generaron y se purificaron como se describe en el ejemplo 1. Estas 21 proteínas de unión triespecíficas adicionales (proteínas de unión 1 y 4-23) se crearon por injerto en un marco de proteína de unión triespecífica los dominios Vh y Vl aislados de anticuerpos que se dirigen a distintos epítopos de VIH-1 en la glicoproteína Env de VIH-1: los anticuerpos anti-MPER Ab MPER “a” y Ab MPER “b” (que se dirigen al epítopo MPER en gp41), los anticuerpos anti-CD4BS Ab CD4BS “a” y Ab CD4BS “b” (que se dirigen al sitio de unión CD4 en gp120), los anticuerpos anti-V1/V2 Ab dirigido a V1/V2 “a” y Ab dirigido a V1/V2 “b” (que se dirigen al dominio V1/V2 en gp120), y el anticuerpo anti-V3 Ab dirigido a V3 (que se dirige al bucle V3 en gp120) (Tabla 7).

Tabla 7: Composición del sitio de unión al epítopo de las proteínas de unión triespecíficas

Las capacidades de neutralización viral de cinco de las proteínas de unión triespecíficas (y sus anticuerpos parentales) a concentraciones variables se probaron frente a un panel de 208 virus pseudotipados con Env de VIH-1 diferentes (Tabla 8). La neutralización mediada por la proteína de unión de los aislados de VIH-1 pseudotipados se midió usando el ensayo del gen reportero de luciferasa TZM-b1. La dosis inhibidora para cada proteína de unión se calculó para cada virus pseudotipado como la dilución que provocó un 80% de reducción en la luminiscencia (IC⁸⁰) después de la infección. Sorprendentemente, la media geométrica de IC⁸⁰calculada para cada una de las proteínas de unión triespecíficas probadas fue menor que los anticuerpos parentales, sugiriendo que estas proteínas de unión triespecíficas eran más potentes en la neutralización de VIH-1 pseudotipado que sus anticuerpos de neutralización parentales.

Después, las capacidades de neutralización viral de un panel mayor de proteínas de unión triespecíficas (y sus anticuerpos parentales) a concentraciones variables se probaron frente a 20 virus psedotipados que representaban 10 clados de VIH-1 diferentes (Tabla 9). Las proteínas de unión triespecíficas proporcionaron una robusta protección frente a la infección con estos 20 virus (Tabla 10).

Tabla 10: Medidas de ICs⁰de un ensayo de neutralización viral de 20 virus representativos

Finalmente, las farmacocinéticas (PK) de un subconjunto de las proteínas de unión triespecíficas y anticuerpos parentales se probaron en macacos rhesus. Brevemente, 10 o 20 mg/kg de las proteínas se inyectaron de forma intravenosa en macacos rhesus hembra, y se realizaron ensayos ELISA en el plasma de las muestras de sangre tomadas antes de la inyección, y en el plasma de las muestras de sangre tomadas en muchos puntos temporales después de la inyección (hasta 42 días) (FIG. 7). Todas las proteínas de unión triespecíficas pudieron detectarse al menos 14 días después de la administración IV, permaneciendo la proteína de unión 1 detectable al menos 35 días después de la inyección, mostrando que las proteínas de unión eran estables in vivo.

Tomados en conjunto, estos datos sugieren que pudieron construirse proteínas de unión triespecíficas ampliamente neutralizantes que se dirigían a tres epítopos distintos en la glicoproteína Env de VIH-1. Estas proteínas de unión mostraron potencia similar o aumentada/capacidades de neutralización muy mejoradas (amplitud) respecto a los anticuerpos de neutralización parentales. Además, parece que estas proteínas de unión triespecífica eran bien toleradas in vivo. Sin desear atarse por la teoría, el desarrollo de proteínas de unión triespecíficas de ampliamente neutralizantes que se dirigen a múltiples epítopos en VIH puede permitir una terapia anti-viral mejorada respecto a anticuerpos monoespecíficos o biespecíficos, ya que es menos probable que las partículas virales de VIH sean resistentes a los tres sitios de unión a antígeno en las proteínas de unión triespecíficas de neutralización que los sitios de unión al antígeno individuales o duales en anticuerpos de neutralización monoespecíficos o biespecíficos, respectivamente.

Ejemplo 3: caracterización de acopladores de célula T.

Como se indica anteriormente, Env se expresa en la superficie de células infectadas con VIH. Debido a esto, Env puede actuar como una diana de anticuerpo para identificar células infectadas, e inducir la citotoxicidad mediada por célula dependiente del anticuerpo (ADCC) y la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), dando por resultado la reducción del reservorio viral latente. Los estudios descritos en la presente memoria exploran el desarrollo de nuevas proteínas de unión triespecíficas (denominadas “acopladores de células T”) que contienen tres sitios de unión al antígeno que se dirigen a tres antígenos diferentes (glicoproteína Env de VIH-1, CD3 y CD28). Estas nuevas proteínas no solo incluyen sitios de unión al antígeno de anticuerpos de neutralización, sino también la capacidad de unirse a células T efectoras, acercándolas a células diana infectadas, induciendo así la lisis de la célula infectada con VIH.

Métodos

Propiedades de unión de los acopladores de células T

Las propiedades de unión de los acopladores de la célula T se midieron por ensayo ELISA usando una sonda anti-Fab conjugada con peroxidasa de rábano picante para detectar el acoplador de célula T que se une a la superficie de las placas ELISA recubiertas con proteína CD3, CD28 o de núcleo estabilizado acondicionado 3 (RSC3) de gp120. CD3ge-hIgG4 humano (KIH) (núm. de catálogo: 03-01-0051) de Cambridge Biologics, MA, EE.UU.; CD28-hIgG4 humano (núm. de catálogo: 03-01-0303) de Cambridge Biologics, MA, EE.UU.

Ensayo de activación de la célula T

La activación de células T CD4 y CD8 se midió como sigue: se enriquecieron células mononucleares de la sangre periférica (PBMCs) procedentes de capas leucocitarias obtenidas de donantes inexpertos (banco de sangre de NIH) usando perlas magnéticas (Miltenyi Biotec). Estas células se co-cultivaron durante 14-16 horas con células CEM no infectadas o infectadas con VIH-1 en presencia de concentraciones crecientes de las proteínas de unión (0,01-1,0 pg/mL) con brefeldina A. Las células se tiñeron después para la expresión superficial de marcadores de células T (CD3, CD4 y CD8) y marcadores de activación (CD25 y CD69), seguido por tinción intracelular para citoquinas (IFN-Y, TNF-a e IL-2) usando anticuerpos conjugados de forma fluorescente (BD Biosciences, eBiosciences, Biolegend). El número de células T CD4 y CD8 que expresan cada citoquina o marcador de activación se determinó haciendo pasar las muestras por un citómetro de flujo LSRII y analizando los datos con software Flowjo (Treeestar).

Regulación a la baja de CD3

La regulación a la baja de CD3 después de la activación de las células T mediante los acopladores de células T se midió tiñendo las PBMCs activadas con anticuerpo CD3 anti-humano de ratón no competitivo y se cuantificó usando citometría de flujo.

Ensayo de citotoxicidad

La citotoxicidad de los acopladores de células T a células CEM-BaL, ACH2, y J1.1 se monitorizó mediante citometría de flujo como sigue: se obtuvieron líneas celulares latentes (ACH2, J1.1, OM10) del Programa Reactivo del SIDA de NIH. La activación de estas células se realizó cultivando las células en presencia o ausencia de TNF-a (10 ng/mL) durante 14-16 horas. La activación se midió determinando la expresión de la glicoproteína de envoltura de VIH de la superficie celular mediante citometría de flujo usando un anticuerpo Env anti-VIH conjugado con aloficocianina (2G12). Las células CEM-IIIb, ACH2, J.1.1 y OM10 se marcaron con el tinte de membrana PKH-26 (Sigma) y se usaron como células diana en un ensayo de citotoxicidad. Estas células diana marcadas se co-cultivaron durante 14-16 horas a una relación de E:T de 10:1 con células T humanas enriquecidas como células efectoras en presencia de cantidades crecientes de las proteínas de unión. La extensión de la lisis celular en las células diana se determinó tiñendo con un marcador de célula viva/muerta (Life Technologies) y midiendo el número de células muertas en la población de células diana marcadas haciendo pasar las muestras por un citómetro de flujo LSRII seguido por análisis usando software Flowjo (Treestar).

Resultados

Se exploró la capacidad de desarrollar acopladores de células T con sitios de unión al antígeno que se dirigen tanto a proteínas superficiales de las células T como a epítopos de neutralización en VIH-1. Se construyeron acopladores de células T que contenían dos sitios de unión al antígeno que se dirigían a dos receptores superficiales de las células T diferentes (CD3 y CD28), y un tercer sitio de unión al antígeno que se dirigía a la glicoproteína Env de VIH-1 (FIGS.

8A y 8B). Además, los acopladores de células T se construyeron para incluir una mutación LS. Además, los acopladores de células T se construyeron de manera que en una proteína de unión, un dominio Ch³incluía una mutación botón y el otro dominio Ch³incluía una mutación ojal para facilitar la heterodimerización de las cadenas pesadas (FIGS. ⁸a y ⁸B).

Usando este enfoque, se construyeron dos acopladores de células T que se dirigían tanto a proteínas superficiales de células T como a la glicoproteína Env de VIH-1 (proteína de unión 32 y CD3 x CD28 / Ab CD4BS “b”). Estos dos acopladores de células T se crearon injertando en un marco de proteína de unión triespecífica los dominios Vh y Vl aislados de anticuerpos parentales que se dirigen a las proteínas superficiales de células T CD3 y CD28, y el anticuerpo anti-VIH-1 Ab CD4BS “b” (que se dirige a sitio de unión CD4 en gp120). La proteína de unión 32 se construyó de manera que el primer par de polipéptidos (que formaba dos sitios de unión al antígeno) se dirigió a los receptores superficiales de células T CD28 y CD3, y el segundo par de polipéptidos (que formaba el sitio de unión al antígeno único) se dirigió al antígeno de VIH-1 CD4BS (proteína de unión 32 = CD28 x CD3 / CD4BS). La proteína de unión triespecífica CD3 x CD28 / Ab CD4BS “b” se construyó de manera que el primer par de polipéptidos (que formaba dos sitios de unión al antígeno) se dirigió a los receptores superficiales de células T CD3 y CD28, y el segundo par de polipéptidos (que formaba el sitio de unión al antígeno único) se dirigió al antígeno de VIH^-1CD4Bs (Tabla ^{1 1}).

Tabla 11: Formato de acopladores de células T

La capacidad de los dos acopladores de células T para unirse a cada uno de sus tres antígenos diana se probó por ensayo ELISA. Los acopladores de células T fueron capaces de unirse a las proteínas superficiales de las células T tanto CD3 como CD28 con los sitios de unión al antígeno CD3 y CD28 en cualquier orientación en los brazos biespecíficos de los acopladores de células T (es decir, CD3 x CD28 para CD3 x CD²⁸/ Ab CD4BS “b” o CD28 x CD3 para la proteína de unión 32). Ambos acopladores de células T fueron también capaces de unirse a gp120 (como se mide usando la proteína RSC3 de VIH-1, una variante de gp120 que carece de las regiones variables V1, V2 y V3) (FIG. 9).

El efecto en la actividad de las células T se probó después para ambos acopladores de células T. La incubación de los acopladores de células T con monocitos reveló que los acopladores de células T indujeron una robusta activación de células T CD⁸+ (FIG. 10). De forma similar, los acopladores de células T fueron capaces de inducir una significativa activación de células T CD4+ en PBMCs solos, o PBMCs incubados con cualquiera de las líneas de células T infectadas con VIH-1 células CEM-NKr o células CEM-BaL (FIG. 11). Además, ambos acopladores de células T redujeron la expresión superficial celular de CD3 en células T activadas (FIG. 12).

Finalmente, se probó la capacidad de los acopladores de células T para inducir la lisis de las células infectadas por VIH. Los acopladores de células T (y proteínas de unión biespecíficas de control positivo y negativo que se dirigen a CD3 y un antígeno de VIH) se incubaron con las células CEM-BaL de la línea de células T infectada con VIH-1. La incubación de los acopladores de células T con las células infectadas indujo una robusta lisis celular en un amplio intervalo de concentraciones (FIG. 13A). Asimismo, la incubación de estos acopladores de células T indujo la lisis de las células ACH2 de la línea de células T infectadas de forma latente (FIG. 13B), además de las células J1.1 (FIG.

13C). Sorprendentemente, los acopladores de células T mostraron actividad citotóxica comparable o mejor frente a líneas celulares infectadas con VIH crónicas y latentes cuando se compara con las proteínas de unión biespecífica.

Tomado en conjunto, los nuevos acopladores de células T descritos en la presente memoria retuvieron la capacidad de sus anticuerpos parentales para unirse a sus antígenos diana en la glicoproteína Env de VIH-1 gp120 en células infectadas con VIH, además de las proteínas de células T expuestas en la superficie celular CD3 y CD28. Los acopladores de células T indujeron una robusta activación de células T CD4+ y CD⁸+, y disminuyeron la expresión superficial de CD3. Finalmente, estos acopladores de células T indujeron una lisis significativa de células T infectadas con VIH-1. Sin desear estar atado por la teoría, estos acopladores de células T pueden proporcionar una nueva estrategia para agentes terapéuticos anti-virales reduciendo/eliminando el reservorio viral latente a través del acoplamiento a células T en pacientes con VIH/SIDA.

Cada realización descrita en la presente memoria puede combinarse con cualquier otra realización o realizaciones a menos que claramente se indique lo contrario. En particular, cualquier característica o realización indicada como preferida o ventajosa puede combinarse con cualquier otra característica o características o realización o realizaciones indicadas como preferidas o ventajosas, a menos que claramente se indique lo contrario.

SECUENCIAS

Tabla 1: SEQ ID NOs de cadena pesada y ligera para las proteínas de unión 1 -53 y los antígenos diana a los que se dirigen las proteínas de unión.

Tabla 2: Secuencias de cadena pesada y ligera de proteínas de unión.

Las secuencias de CDR están en negrita y cursiva.

Tabla A: secuencias CDR de las proteínas de unión

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una proteína de unión que comprende cuatro cadenas polipeptídicas que forman tres sitios de unión a antígeno que se unen específicamente a una o más proteínas diana de VIH, en la que una primera cadena polipeptídica comprende una estructura representada por la fórmula:

Vl²- L¹-VL¹- L²-Cl [I]

Vh1- L³-VH²- L4-CH1-bisagra-CH2-CH3 [II]

VH3-CH1-bisagra-CH2-CH3 [III]

Vl3-Cl [IV]

en la que:

VL¹es un primer dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;

Vl²es un segundo dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;

VL³es un tercer dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;

Vh¹es un primer dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;

Vh²es un segundo dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;

VH³es un tercer dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;

CL es un dominio constante de la cadena ligera de inmunoglobulina;

Ch¹es un dominio constante de la cadena pesada Ch¹de inmunoglobulina;

Ch²es un dominio constante de la cadena pesada Ch²de inmunoglobulina;

Ch3 es un dominio constante de la cadena pesada Ch3 de inmunoglobulina;

bisagra es una región bisagra de inmunoglobulina que conecta los dominios Ch¹y Ch²; y

L¹, L², L³y L⁴son conectores de aminoácidos;

y en la que el polipéptido de fórmula I y el polipéptido de fórmula II forman un par de cadena ligera-cadena pesada cruzada, y

en la que:

(a) Vl¹comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 500, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 501, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 274; Vl²comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 275, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 276, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 277; Vl3 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 266, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 267, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 268; Vh¹comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 254, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 255, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 256; Vh²comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ iD NO: 257, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 258, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 259; y Vh3 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 248, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 497, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 250; o

(b) Vl¹comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 500, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 501, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 274; Vl²comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 275, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 276, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 277; Vl3 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 269, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 270, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 271; Vh¹comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 254, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 255, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 256; Vh²comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 257, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 258, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 259; y Vh3 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 251, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 252, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 253; o

(c) Vl¹comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 275, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 276, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 277; Vl²comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 500, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 501, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 274; Vl3 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 269, una CDR-L2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 270, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 271; Vh¹comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 257, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 258, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 259; Vh²comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ iD NO: 254, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 255, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 256; y Vh3 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 251, una CDR-H2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 252, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 253.

2. La proteína de unión según la reivindicación 1, en la que:

(a) Vl¹comprende un dominio variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 518; Vl²comprende un dominio variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 519; Vl3 comprende un dominio variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 512; Vh¹comprende un dominio variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 504; Vh²comprende un dominio variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 506; y Vh3 comprende un dominio variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 502; o

(b) Vl¹comprende un dominio variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 518; Vl²comprende un dominio variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 519; Vl3 comprende un dominio variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 513; Vh¹comprende un dominio variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 504; Vh²comprende un dominio variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 506; y Vh³comprende un dominio variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 503; o

(c) Vl¹comprende un dominio variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 519; Vl²comprende un dominio variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 518; Vl3 comprende un dominio variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 513; Vh¹comprende un dominio variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 506; Vh²comprende un dominio variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 504; y Vh³comprende un dominio variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 503.

3. La proteína de unión según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que:

(a) el dominio Ch3 de la segunda cadena polipeptídica comprende sustituciones de aminoácido en las posiciones correspondientes a las posiciones 354 y 366 de la IgG 1 humana según el índice UE, en la que las sustituciones de aminoácidos son S354C y T366W; y en la que el dominio Ch3 de la tercera cadena polipeptídica comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 349, 366, 368 y 407 de la IgG1 humana según el índice UE, en la que las sustituciones de aminoácidos son Y349C, T366S, L368A e Y407V; o

(b) el dominio Ch3 de la segunda cadena polipeptídica comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 349, 366, 368 y 407 de IgG1 humana según el índice UE, en la que las sustituciones de aminoácidos son Y349C, T366S, L368A e y 407V; y en la que el dominio Ch3 de la tercera cadena polipeptídica comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 354 y 366 de IgG1 humana según el índice UE, en la que las sustituciones de aminoácidos son S354C y T366W.

4. La proteína de unión según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que los dominios Ch3 de la segunda y tercera cadenas polipeptídicas comprenden ambos sustituciones de aminoácidos en posiciones correspondientes a las posiciones 428 y 434 de IgG1 humana según el índice UE, en la que las sustituciones de aminoácidos son M428L y N434S.

5. La proteína de unión según cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, en la que:

(a) al menos uno de L¹, L², L³o L⁴tiene independientemente 0 aminoácidos de longitud; o

(b) L¹, L², L³o L⁴tienen cada uno independientemente al menos un aminoácido de longitud.

6. La proteína de unión según la reivindicación 5, en la que L¹, L², L³y/o L⁴comprenden la secuencia Asp-Lys-Thr-His-Thr (SEQ ID NO: 525).

7. Una proteína de unión que comprende una primera cadena polipeptídica, una segunda cadena polipeptídica, una tercera cadena polipeptídica y una cuarta cadena polipeptídica en la que:

(a) la primera cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; la segunda cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; la tercera cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; y la cuarta cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2;

(c) la primera cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; la segunda cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; la tercera cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; y la cuarta cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 18.

8. Una molécula de ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de unión según cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

9. Un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 8.

10. Un sistema vectorial que comprende uno o más vectores que codifican una primera, segunda, tercera y cuarta cadena polipeptídica de una proteína de unión según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que opcionalmente:

11. Una célula huésped aislada que comprende la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 8, el vector de expresión según la reivindicación 9, o el sistema vectorial según la reivindicación 10 en la que opcionalmente la célula huésped es una célula de mamífero o una célula de insecto.

12. Un método para producir una proteína de unión, comprendiendo el método:

a) cultivar una célula huésped según la reivindicación 11 en condiciones tales que la célula huésped exprese la proteína de unión; y

b) aislar la proteína de unión de la célula huésped.

13. La proteína de unión según cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para el uso en un método de prevención y/o tratamiento de infección por VIH en un paciente, que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína de unión, en la que la proteína de unión se co-administra opcionalmente con terapia anti-retroviral estándar, y en la que el paciente ese opcionalmente un ser humano.