TW202219064A - 用於預防或治療ｈｉｖ感染之三特異性及／或三價結合蛋白 - Google Patents
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Abstract
本發明提供包含三特異性和/或三價結合蛋白的組合物，所述三特異性和/或三價結合蛋白包含形成3個抗原結合位點的4條多肽鏈，所述3個抗原結合位點特異性結合一個或多個HIV靶蛋白或一個或多個T細胞受體，其中形成所述結合蛋白的第一對多肽具有雙重可變域，其具有交叉(cross-over)取向，且其中形成所述結合蛋白的第二對多肽具有單一可變域。本文還提供用於製備三特異性和/或三價結合蛋白的方法和此類結合蛋白用於治療和/或預防HIV/AIDS的用途。
Description
本申請案主張申請日為2015年10月25日的美國臨時申請序號62/246,113、申請日為2016年2月24日的歐洲專利申請No.EP16305211.1、申請日為2016年4月13日的美國臨時申請序號62/322,029、以及申請日為2016年5月3日的美國臨時申請序號62/331,169的優先權權益，其通過提述以其整體並入本文。
本發明通過執行與國立衛生研究院(National Institutes of Health，健康與人類服務部的一個機構)的合作研發協議(NIAID #2014-0038)而完成。美國政府對本發明具有某些權利。
如下提交的ASCII文本文件的內容通過提述以其整體並入本文：計算機可讀形式(CRF)的序列表(文件名：183952027041SEQLIST.txt，記錄日期：2016年10月19日，大小：1,064KB)。
本發明涉及三特異性和/或三價結合蛋白，其包含形成3個抗原結合位點的4條多肽鏈，所述3個抗原結合位點特異性結合一個或多個HIV靶蛋白，其中形成所述結合蛋白的第一對多肽具有雙重可變域，其具有交叉(cross-over)取向，且其中形成所述結合蛋白的第二對多肽具有單一可變域。本發明還涉及用於製備三特異性和/或三價結合蛋白的方法和此類結合
蛋白用於治療和/或預防HIV/AIDS的用途。
用中和抗體治療HIV/AIDS中的挑戰之一是由於HIV-1病毒的的高突變率所致的潜在性突破感染(breakthrough infection)。此外，HIV-1傳播後前幾周中的病毒學事件構成了終身慢性感染的基礎，其用現有的組合抗逆轉錄病毒治療(cART)仍是無法治愈的。這是由於(至少部分由於)病毒庫(viral reservoir)的早期建立所致，包括潜伏感染的細胞，其即便在cART條件下也依然持續，這導致在治療中斷時的復發感染。新發現的抗HIV-1中和抗體具有改進的幅度和效力，其可以為HIV/AIDS治療和預防提供更多選擇；然而，突破感染仍然是該領域中的主要問題。
在一個實施方案中，本發明提供包含形成3個抗原結合位點的4條多肽鏈的結合蛋白，所述3個抗原結合位點特異性結合一個或多個HIV靶蛋白，其中第一多肽鏈包含如下式表示的結構：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]；
第二多肽鏈包含如下式表示的結構：
VH1-L3-VH2-L4-CH1 [II]；
第三多肽鏈包含如下式表示的結構；
VH3-CH1 [III]；
且第四多肽鏈包含如下式表示的結構：
VL3-CL [IV]；
其中
VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變域；
VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變域；
VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變域；
VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變域；
VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變域；
VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變域；
CL是免疫球蛋白輕鏈恒定域；
CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恒定域；且
L1、L2、L3和L4是胺基酸連接子；
且其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對。
在一些實施方案中，所述第二多肽鏈還包含與CH1相連的Fc區，所述Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域。在一些實施方案中，所述第三多肽鏈還包含與CH1相連的Fc區，所述Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域。在一些實施方案中，所述第二多肽鏈還包含與CH1相連的第一Fc區，所述第一Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域，其中所述第一Fc區在對應於人IgG1的位置354和366的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為S354C和T366W；且其中所述第三多肽鏈還包含與CH1相連的第二Fc區，所述第二Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域，其中所述第二Fc區在對應於人IgG1的位置349、366、368和407的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為Y349C、T366S、L368A和Y407V。在一些實施方案中，所述第二多肽鏈還包含與CH1相連的第一Fc區，所述第一Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域，其中所述第一Fc區在對應於人IgG1的位置349、366、368和407的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為Y349C、T366S、L368A和Y407V；且其中所述第三多肽鏈還包含與CH1相連的第二Fc區，所述第二Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域，其中所述第二Fc區在對應於人IgG1的位置354和366的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為S354C和T366W。在一些實施方案中，所述第二多肽鏈還包含與CH1相連的第一Fc區，所述第一Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域，且其中所述第三多肽鏈還包含與CH1相連的第二Fc區，所述第二Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋
白重鏈恒定域；其中所述第一和第二Fc區在對應於人IgG1的位置428和434的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為M428L和N434S。
在一個實施方案中，本發明提供包含形成3個抗原結合位點的4條多肽鏈的結合蛋白，所述3個抗原結合位點特異性結合一個或多個HIV靶蛋白，其中第一多肽鏈包含如下式表示的結構：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽鏈包含如下式表示的結構：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [II]
且第三多肽鏈包含如下式表示的結構：
VH3-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [III]
且第四多肽鏈包含如下式表示的結構：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變域；
VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變域；
VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變域；
VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變域；
VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變域；
VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變域；
CL是免疫球蛋白輕鏈恒定域；
CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恒定域；
CH2是免疫球蛋白CH2重鏈恒定域；
CH3是免疫球蛋白CH3重鏈恒定域；
鉸鏈是連接CH1和CH2域的免疫球蛋白鉸鏈區；且
L1、L2、L3和L4是胺基酸連接子；
且其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對。
在一些實施方案中，所述第二多肽鏈的CH3域在對應於人IgG1的位置354和366的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所
述胺基酸取代為S354C和T366W；且其中所述第三多肽鏈的CH3域在對應於人IgG1的位置349、366、368和407的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為Y349C、T366S、L368A和Y407V。在一些實施方案中，所述第二多肽鏈的CH3域在對應於人IgG1的位置349、366、368和407的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為Y349C、T366S、L368A和Y407V；且其中所述第三多肽鏈的CH3域在對應於人IgG1的位置354和366的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為S354C和T366W。在一些實施方案中，所述第二和第三多肽鏈的CH3域均在對應於人IgG1的位置428和434的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為M428L和N434S。
在一些實施方案中，所述一個或多個HIV靶蛋白選自由下列組成之群組：糖蛋白120、糖蛋白41和糖蛋白160。在一些實施方案中，所述結合蛋白是三特異性的且能够特異性結合單個HIV靶蛋白上的3個不同表位。在一些實施方案中，所述結合蛋白是三特異性的，且能够特異性結合第一HIV靶蛋白上的2個不同表位以及第二HIV靶蛋白上的1個表位，其中所述第一和第二HIV靶蛋白是不同的。在一些實施方案中，所述結合蛋白是三特異性的，且能够特異性結合3個不同的抗原靶標。在一些實施方案中，所述結合蛋白能够抑制所述一個或多個HIV靶蛋白的功能。在一些實施方案中，VL1包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其分別包含SEQ ID NO：266、267和268中所示序列；分別包含SEQ ID NO：269、270和271中所示序列；分別包含SEQ ID NO：500、501和274中所示序列；分別包含SEQ ID NO：275、276和277中所示序列；分別包含SEQ ID NO：281、282和283中所示序列；或分別包含SEQ ID NO：278、279和280中所示序列。在一些實施方案中，VL1包含輕鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述輕鏈可變域包含序列，該序列選自由下列組成之群組：SEQ ID NO：512、513、514、515、516、517、518、519、520和521。在一些實施方案中，VL1包含輕鏈可變域，其包含序列，該序列選自由下列組成之群組：SEQ ID NO：512、513、514、515、516、517、518、519、520和521。在
一些實施方案中，VL2包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其分別包含SEQ ID NO：266、267和268中所示序列；分別包含SEQ ID NO：269、270和271中所示序列；分別包含SEQ ID NO：500、501和274中所示序列；分別包含SEQ ID NO：275、276和277中所示序列；分別包含SEQ ID NO：281、282和283中所示序列；或分別包含SEQ ID NO：278、279和280中所示序列。在一些實施方案中，VL2包含輕鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述輕鏈可變域包含序列，該序列選自由下列組成之群組：SEQ ID NO：512、513、514、515、516、517、518、519、520和521。在一些實施方案中，VL2包含輕鏈可變域，其包含序列，該序列選自由下列組成之群組：SEQ ID NO：512、513、514、515、516、517、518、519、520和521。在一些實施方案中，VL3包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其分別包含SEQ ID NO：266、267和268中所示序列；分別包含SEQ ID NO：269、270和271中所示序列；分別包含SEQ ID NO：500、501和274中所示序列；分別包含SEQ ID NO：275、276和277中所示序列；分別包含SEQ ID NO：281、282和283中所示序列；或分別包含SEQ ID NO：278、279和280中所示序列。在一些實施方案中，VL3包含輕鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述輕鏈可變域包含序列，該序列選自由下列組成之群組：SEQ ID NO：512、513、514、515、516、517、518、519、520和521。在一些實施方案中，VL3包含輕鏈可變域，其包含序列，該序列選自由下列組成之群組：SEQ ID NO：512、513、514、515、516、517、518、519、520和521。在一些實施方案中，VH1包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其分別包含SEQ ID NO：248、497和250中所示序列；分別包含SEQ ID NO：251、252和253中所示序列；分別包含SEQ ID NO：254、255和256中所示序列；分別包含SEQ ID NO：254、255和498中所示序列；分別包含SEQ ID NO：257、258和259中所示序列；分別包含SEQ ID NO：263、264和265中所示序列；或分別包含SEQ ID NO：499、261和262中所示序列。在一些實施方案中，VH1包含重鏈可變域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述重鏈可變域包含序列，該序列選自由下列組成之群組：SEQ ID NO：502、503、504、505、506、507和508。在一些實
施方案中，VH1包含重鏈可變域，其包含序列，該序列選自由下列組成之群組：SEQ ID NO：502、503、504、505、506、507和508。在一些實施方案中，VH2包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其分別包含SEQ ID NO：248、497和250中所示序列；分別包含SEQ ID NO：251、252和253中所示序列；分別包含SEQ ID NO：254、255和256中所示序列；分別包含SEQ ID NO：254、255和498中所示序列；分別包含SEQ ID NO：257、258和259中所示序列；分別包含SEQ ID NO：263、264和265中所示序列；或分別包含SEQ ID NO：499、261和262中所示序列。在一些實施方案中，VH2包含重鏈可變域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述重鏈可變域包含序列，該序列選自由下列組成之群組：SEQ ID NO：502、503、504、505、506、507和508。在一些實施方案中，VH2包含重鏈可變域，其包含序列，該序列選自由下列組成之群組：SEQ ID NO：502、503、504、505、506、507和508。在一些實施方案中，VH3包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其分別包含SEQ ID NO：248、497和250中所示序列；分別包含SEQ ID NO：251、252和253中所示序列；分別包含SEQ ID NO：254、255和256中所示序列；分別包含SEQ ID NO：254、255和498中所示序列；分別包含SEQ ID NO：257、258和259中所示序列；分別包含SEQ ID NO：263、264和265中所示序列；或分別包含SEQ ID NO：499、261和262中所示序列。在一些實施方案中，VH3包含重鏈可變域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述重鏈可變域包含序列，該序列選自由下列組成之群組：SEQ ID NO：502、503、504、505、506、507和508。在一些實施方案中，VH3包含重鏈可變域，其包含序列，該序列選自由下列組成之群組：SEQ ID NO：502、503、504、505、506、507和508。在一些實施方案中，VL1包含：含有SEQ ID NO：500的序列的CDR-L1，含有SEQ ID NO：501的序列的CDR-L2，和含有SEQ ID NO：274的序列的CDR-L3；VL2包含：含有SEQ ID NO：275的序列的CDR-L1，含有SEQ ID NO：276的序列的CDR-L2，和含有SEQ ID NO：277的序列的CDR-L3；VL3包含：含有SEQ ID NO：266的序列的CDR-L1，含有SEQ ID NO：267的序列的CDR-L2；和含有SEQ ID NO：268的序列的CDR-L3；VH1包含：含有
SEQ ID NO：254的序列的CDR-H1，含有SEQ ID NO：255的序列的CDR-H2，和含有SEQ ID NO：256的序列的CDR-H3；VH2包含：含有SEQ ID NO：257的序列的CDR-H1，含有SEQ ID NO：258的序列的CDR-H2，和含有SEQ ID NO：259的序列的CDR-H3；且VH3包含：含有SEQ ID NO：248的序列的CDR-H1，含有SEQ ID NO：497的序列的CDR-H2，和含有SEQ ID NO：250的序列的CDR-H3。在一些實施方案中，VL1包含輕鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述輕鏈可變域包含SEQ ID NO：518的輕鏈可變域序列；VL2包含輕鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述輕鏈可變域包含SEQ ID NO：519的輕鏈可變域序列；VL3包含輕鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述輕鏈可變域包含SEQ ID NO：512的輕鏈可變域序列；VH1包含重鏈可變域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述重鏈可變域包含SEQ ID NO：504的重鏈可變域序列；VH2包含重鏈可變域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述重鏈可變域包含SEQ ID NO：506的重鏈可變域序列；且VH3包含重鏈可變域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述重鏈可變域包含SEQ ID NO：502的重鏈可變域序列。在一些實施方案中，VL1包含含有SEQ ID NO：518的序列的輕鏈可變域；VL2包含含有SEQ ID NO：519的序列的輕鏈可變域；VL3包含含有SEQ ID NO：512的序列的輕鏈可變域；VH1包含含有SEQ ID NO：504的序列的重鏈可變域；VH2包含含有SEQ ID NO：506的序列的重鏈可變域；且VH3包含含有SEQ ID NO：502的序列的重鏈可變域。在一些實施方案中，VL1包含：含有SEQ ID NO：500的序列的CDR-L1，含有SEQ ID NO：501的序列的CDR-L2，和含有SEQ ID NO：274的序列的CDR-L3；VL2包含：含有SEQ ID NO：275的序列的CDR-L1，含有SEQ ID NO：276的序列的CDR-L2，和含有SEQ ID NO：277的序列的CDR-L3；VL3包含：含有SEQ ID NO：269的序列的CDR-L1，含有SEQ ID NO：270的序列的CDR-L2，和含有SEQ ID NO：271的序列的CDR-L3；VH1包含：含有SEQ ID NO：254的序列的CDR-H1，含有SEQ ID NO：255的序列的CDR-H2，和含有SEQ ID NO：256的序列的CDR-H3；VH2包含：含有SEQ ID NO：257的序列的CDR-H1，含有SEQ ID NO：258的序列的CDR-
H2，和含有SEQ ID NO：259的序列的CDR-H3；且VH3包含：含有SEQ ID NO：251的序列的CDR-H1，含有SEQ ID NO：252的序列的CDR-H2，和含有SEQ ID NO：253的序列的CDR-H3。在一些實施方案中，VL1包含輕鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述輕鏈可變域包含SEQ ID NO：518的輕鏈可變域序列；VL2包含輕鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述輕鏈可變域包含SEQ ID NO：519的輕鏈可變域序列；VL3包含輕鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述輕鏈可變域包含SEQ ID NO：513的輕鏈可變域序列；VH1包含重鏈可變域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述重鏈可變域包含SEQ ID NO：504的重鏈可變域序列；VH2包含重鏈可變域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述重鏈可變域包含SEQ ID NO：506的重鏈可變域序列；且VH3包含重鏈可變域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述重鏈可變域包含SEQ ID NO：503的重鏈可變域序列。在一些實施方案中，VL1包含含有SEQ ID NO：518的序列的輕鏈可變域；VL2包含含有SEQ ID NO：519的序列的輕鏈可變域；VL3包含含有SEQ ID NO：513的序列的輕鏈可變域；VH1包含含有SEQ ID NO：504的序列的重鏈可變域；VH2包含含有SEQ ID NO：506的序列的重鏈可變域；且VH3包含含有SEQ ID NO：503的序列的重鏈可變域。在一些實施方案中，VL1包含：含有SEQ ID NO：275的序列的CDR-L1，含有SEQ ID NO：276的序列的CDR-L2，和含有SEQ ID NO：277的序列的CDR-L3；VL2包含：含有SEQ ID NO：500的序列的CDR-L1，含有SEQ ID NO：501的序列的CDR-L2，和含有SEQ ID NO：274的序列的CDR-L3；VL3包含：含有SEQ ID NO：269的序列的CDR-L1，含有SEQ ID NO：270的序列的CDR-L2，和含有SEQ ID NO：271的序列的CDR-L3；VH1包含：含有SEQ ID NO：257的序列的CDR-H1，含有SEQ ID NO：258的序列的CDR-H2，和含有SEQ ID NO：259的序列的CDR-H3；VH2包含：含有SEQ ID NO：254的序列的CDR-H1，含有SEQ ID NO：255的序列的CDR-H2，和含有SEQ ID NO：256的序列的CDR-H3；且VH3包含：含有SEQ ID NO：251的序列的CDR-H1，含有SEQ ID NO：252的序列的CDR-H2，和含有SEQ ID NO：253的序列的CDR-H3。在一些實施方案中，VL1包含
輕鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述輕鏈可變域包含SEQ ID NO：519的輕鏈可變域序列；VL2包含輕鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述輕鏈可變域包含SEQ ID NO：518的輕鏈可變域序列；VL3包含輕鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述輕鏈可變域包含SEQ ID NO：513的輕鏈可變域序列；VH1包含重鏈可變域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述重鏈可變域包含SEQ ID NO：506的重鏈可變域序列；VH2包含重鏈可變域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述重鏈可變域包含SEQ ID NO：504的重鏈可變域序列；且VH3包含重鏈可變域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述重鏈可變域包含SEQ ID NO：503的重鏈可變域序列。在一些實施方案中，VL1包含含有SEQ ID NO：519的序列的輕鏈可變域；VL2包含含有SEQ ID NO：518的序列的輕鏈可變域；VL3包含含有SEQ ID NO：513的序列的輕鏈可變域；VH1包含含有SEQ ID NO：506的序列的重鏈可變域；VH2包含含有SEQ ID NO：504的序列的重鏈可變域；且VH3包含含有SEQ ID NO：503的序列的重鏈可變域。在一些實施方案中，L1、L2、L3、或L4的至少一個獨立地長度為0個胺基酸。在一些實施方案中，L1、L2、L3、或L4各自獨立地長度為至少1個胺基酸。在一些實施方案中，L1包含Asp-Lys-Thr-His-Thr(SEQ ID NO：525)。
在一個實施方案中，本發明提供結合蛋白，其包含形成3個抗原結合位點的4條多肽鏈，其中第一多肽鏈包含如下式表示的結構：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽鏈包含如下式表示的結構：
VH1-L3-VH2-L4-CH1 [II]
且第三多肽鏈包含如下式表示的結構：
VH3-CH1 [III]
且第四多肽鏈包含如下式表示的結構：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變域；
VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變域；
VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變域；
VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變域；
VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變域；
VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變域；
CL是免疫球蛋白輕鏈恒定域；
CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恒定域；且
L1、L2、L3和L4是胺基酸連接子；
其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對；
其中：
(a)VL1、VL2和VL3各自獨立地是衍生自SEQ ID NO：2、4、10、12、18、20、26、28、34、36、42、44、50、52、58、60、66、68、74、76、82、84、90、92、98、100、106、108、114、116、122、124、130、132、138、140、146、148、154、156、162、164、170、172、178、180、186、188、194、196、202、204、210、212、218、220、226、228、233、235、241、243任一項所示胺基酸序列的可變域；或
(b)VL1、VL2和VL3各自獨立地包含可變域的輕鏈互補决定區，所述可變域包含SEQ ID NO：266-283任一項中所示的胺基酸序列；且
其中：
(a)VH1、VH2和VH3各自獨立地是衍生自SEQ ID NO：1、3、9、11、17、10、25、27、33、35、41、43、49、51、57、59、65、67、73、75、81、83、89、91、97、99、105、107、113、115、121、123、129、131、137、139、145、147、153、155、161、163、169、171、177、179、185、187、193、195、201、203、209、211、217、219、225、227、232、234、240、242任一項所示胺基酸序列的可變域；或
(b)VH1、VH2和VH3各自獨立地包含可變域的重鏈互補决定區，所述可變域包含SEQ ID NO：248-265任一項中所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，所述第二多肽鏈還包含與CH1相連的Fc區，所述Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域。在一些實施方案中，所述第三多肽鏈還包含與CH1相連的Fc區，所述Fc區包
含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域。在一些實施方案中，所述第二多肽鏈還包含與CH1相連的第一Fc區，所述第一Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域，其中所述第一Fc區在對應於人IgG1的位置354和366的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為S354C和T366W；且其中所述第三多肽鏈還包含與CH1相連的第二Fc區，所述第二Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域，其中所述第二Fc區在對應於人IgG1的位置349、366、368和407的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為Y349C、T366S、L368A和Y407V。在一些實施方案中，所述第二多肽鏈還包含與CH1相連的第一Fc區，所述第一Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域，其中所述第一Fc區在對應於人IgG1的位置349、366、368和407的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為Y349C、T366S、L368A和Y407V；且其中所述第三多肽鏈還包含與CH1相連的第二Fc區，所述第二Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域，其中所述第二Fc區在對應於人IgG1的位置354和366的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為S354C和T366W。在一些實施方案中，所述第二多肽鏈還包含與CH1相連的第一Fc區，所述第一Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域，且其中所述第三多肽鏈還包含與CH1相連的第二Fc區，所述第二Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域；其中所述第一和第二Fc區在對應於人IgG1的位置428和434的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為M428L和N434S。
在一個實施方案中，本發明提供一種結合蛋白，其包含形成3個抗原結合位點的4條多肽鏈，其中第一多肽鏈包含如下式表示的結構：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽鏈包含如下式表示的結構：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [II]
且第三多肽鏈包含如下式表示的結構：
VH3-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [III]
且第四多肽鏈包含如下式表示的結構：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變域；
VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變域；
VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變域；
VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變域；
VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變域；
VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變域；
CL是免疫球蛋白輕鏈恒定域；
CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恒定域；
CH2是免疫球蛋白CH2重鏈恒定域；
CH3是免疫球蛋白CH3重鏈恒定域；
鉸鏈是連接CH1和CH2域的免疫球蛋白鉸鏈區；且
L1、L2、L3和L4是胺基酸連接子；
其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對；
其中：
(a)VL1、VL2和VL3各自獨立地是衍生自SEQ ID NO：2、4、10、12、18、20、26、28、34、36、42、44、50、52、58、60、66、68、74、76、82、84、90、92、98、100、106、108、114、116、122、124、130、132、138、140、146、148、154、156、162、164、170、172、178、180、186、188、194、196、202、204、210、212、218、220、226、228、233、235、241、243任一項所示胺基酸序列的可變域；或
(b)VL1、VL2和VL3各自獨立地包含可變域的輕鏈互補决定區，所述可變域包含SEQ ID NO：266-283任一項中所示的胺基酸序列；且
其中：
(a)VH1、VH2和VH3各自獨立地是衍生自SEQ ID NO：1、3、9、11、
17、10、25、27、33、35、41、43、49、51、57、59、65、67、73、75、81、83、89、91、97、99、105、107、113、115、121、123、129、131、137、139、145、147、153、155、161、163、169、171、177、179、185、187、193、195、201、203、209、211、217、219、225、227、232、234、240、242任一項所示胺基酸序列的可變域；或
(b)VH1、VH2和VH3各自獨立地包含可變域的重鏈互補决定區，所述可變域包含SEQ ID NO：248-265任一項中所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，所述第二多肽鏈的CH3域在對應於人IgG1的位置354和366的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為S354C和T366W；且其中所述第三多肽鏈的CH3域在對應於人IgG1的位置349、366、368和407的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為Y349C、T366S、L368A和Y407V。在一些實施方案中，所述第二多肽鏈的CH3域在對應於人IgG1的位置349、366、368和407的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為Y349C、T366S、L368A和Y407V；且其中所述第三多肽鏈的CH3域在對應於人IgG1的位置354和366的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為S354C和T366W。在一些實施方案中，所述第二和第三多肽鏈的CH3域均在對應於人IgG1的位置428和434的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為M428L和N434S。
在一些實施方案中，L1、L2、L3、或L4的至少一個獨立地長度為0個胺基酸。在一些實施方案中，L1、L2、L3、或L4各自獨立地長度為至少1個胺基酸。在一些實施方案中，L1包含Asp-Lys-Thr-His-Thr(SEQ ID NO：525)。
在一個實施方案中，本發明提供三特異性和/或三價結合蛋白，其包含形成3個抗原結合位點的4條多肽鏈，所述3個抗原結合位點特性結合3個不同的HIV靶蛋白，其中第一多肽鏈具有下式表示的結構：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽鏈具有下式表示的結構：
VH1-L3-VH2-L4-CH1 [II]
且第三多肽鏈具有下式表示的結構：
VH3-CH1 [III]
且第四多肽鏈具有下式表示的結構：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變域；
VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變域；
VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變域；
VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變域；
VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變域；
VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變域；
CL是免疫球蛋白輕鏈恒定域；
CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恒定域；且
L1、L2、L3和L4是胺基酸連接子；
且其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對。
在一個實施方案中，本發明提供結合蛋白，其包含形成3個抗原結合位點的4條多肽鏈，其中第一多肽鏈具有下式表示的結構：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽鏈具有下式表示的結構：
VH1-L3-VH2-L4-CH1 [II]
且第三多肽鏈具有下式表示的結構：
VH3-CH1 [III]
且第四多肽鏈具有下式表示的結構：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變域；
VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變域；
VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變域；
VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變域；
VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變域；
VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變域；
CL是免疫球蛋白輕鏈恒定域；
CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恒定域；且
L1、L2、L3和L4是胺基酸連接子；
其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對；
其中：
(a)VL1、VL2和VL3各自獨立地是衍生自SEQ ID NO：2、4、10、12、18、20、26、28、34、36、42、44、50、52、58、60、66、68、74、76、82、84、90、92、98、100、106、108、114、116、122、124、130、132、138、140、146、148、154、156、162、164、170、172、178、180、186、188、194、196、202、204、210、212、218、220、226、228、233、235、241、243任一項所示胺基酸序列的可變域；或
(b)VL1、VL2和VL3各自獨立地包含可變域的輕鏈互補决定區，所述可變域包含SEQ ID NO：266-283任一項中所示的胺基酸序列；且
其中：
(a)VH1、VH2和VH3各自獨立地是衍生自SEQ ID NOs：1、3、9、11、17、10、25、27、33、35、41、43、49、51、57、59、65、67、73、75、81、83、89、91、97、99、105、107、113、115、121、123、129、131、137、139、145、147、153、155、161、163、169、171、177、179、185、187、193、195、201、203、209、211、217、219、225、227、232、234、240、242任一項所示胺基酸序列的可變域；或
(b)VH1、VH2和VH3各自獨立地包含可變域的重鏈互補决定區，所述可變域包含SEQ ID NO：248-265任一項中所示的胺基酸序列。
在另一個實施方案中，本發明提供包含第一多肽鏈、第二多肽鏈、第三多肽鏈和第四多肽鏈的結合蛋白，其中：
(a)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：4的胺基酸序列或與SEQ ID NO：4的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含
SEQ ID NO：3的胺基酸序列或與SEQ ID NO：3的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：1的胺基酸序列或與SEQ ID NO：1的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：2的胺基酸序列或與SEQ ID NO：2的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(b)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：12的胺基酸序列或與SEQ ID NO：12的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：11的胺基酸序列或與SEQ ID NO：11的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：9的胺基酸序列或與SEQ ID NO：9的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：10的胺基酸序列或與SEQ ID NO：10的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(c)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：20的胺基酸序列或與SEQ ID NO：20的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：19的胺基酸序列或與SEQ ID NO：19的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：17的胺基酸序列或與SEQ ID NO：17的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：18的胺基酸序列或與SEQ ID NO：18的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(d)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：28的胺基酸序列或與SEQ ID NO：28的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列或與SEQ ID NO：27的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：25的胺基酸序列或與SEQ ID NO：25的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：26的胺基酸序列或與SEQ ID NO：26的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(e)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：36的胺基酸序列或與SEQ ID NO：36的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：35的胺基酸序列或與SEQ ID NO：35的胺基酸序列至少95%
相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：33的胺基酸序列或與SEQ ID NO：33的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：34的胺基酸序列或與SEQ ID NO：34的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(f)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：44的胺基酸序列或與SEQ ID NO：44的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：43的胺基酸序列或與SEQ ID NO：43的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：41的胺基酸序列或與SEQ ID NO：41的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：42的胺基酸序列或與SEQ ID NO：42的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(g)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：52的胺基酸序列或與SEQ ID NO：52的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：51的胺基酸序列或與SEQ ID NO：51的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：49的胺基酸序列或與SEQ ID NO：49的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：50的胺基酸序列或與SEQ ID NO：50的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(h)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：60的胺基酸序列或與SEQ ID NO：60的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：59的胺基酸序列或與SEQ ID NO：59的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：57的胺基酸序列或與SEQ ID NO：57的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：58的胺基酸序列或與SEQ ID NO：58的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(i)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：68的胺基酸序列或與SEQ ID NO：68的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：67的胺基酸序列或與SEQ ID NO：67的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：65的胺基酸序列或
與SEQ ID NO：65的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：66的胺基酸序列或與SEQ ID NO：66的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(j)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：76的胺基酸序列或與SEQ ID NO：76的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：75的胺基酸序列或與SEQ ID NO：75的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：73的胺基酸序列或與SEQ ID NO：73的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：74的胺基酸序列或與SEQ ID NO：74的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(k)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：84的胺基酸序列或與SEQ ID NO：84的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：83的胺基酸序列或與SEQ ID NO：83的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：81的胺基酸序列或與SEQ ID NO：81的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：82的胺基酸序列或與SEQ ID NO：82的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(l)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：92的胺基酸序列或與SEQ ID NO：92的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：91的胺基酸序列或與SEQ ID NO：91的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：89的胺基酸序列或與SEQ ID NO：89的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：90的胺基酸序列或與SEQ ID NO：90的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(m)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：100的胺基酸序列或與SEQ ID NO：100的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：99的胺基酸序列或與SEQ ID NO：99的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：97的胺基酸序列或與SEQ ID NO：97的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四
多肽鏈包含SEQ ID NO：98的胺基酸序列或與SEQ ID NO：98的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(n)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：108的胺基酸序列或與SEQ ID NO：108的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：107的胺基酸序列或與SEQ ID NO：107的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：105的胺基酸序列或與SEQ ID NO：105的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：106的胺基酸序列或與SEQ ID NO：106的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(o)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：116的胺基酸序列或與SEQ ID NO：116的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：115的胺基酸序列或與SEQ ID NO：115的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：113的胺基酸序列或與SEQ ID NO：113的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：114的胺基酸序列或與SEQ ID NO：114的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(p)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：124的胺基酸序列或與SEQ ID NO：124的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：123的胺基酸序列或與SEQ ID NO：123的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：121的胺基酸序列或與SEQ ID NO：121的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：122的胺基酸序列或與SEQ ID NO：122的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(q)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：132的胺基酸序列或與SEQ ID NO：132的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：131的胺基酸序列或與SEQ ID NO：131的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：129的胺基酸序列或與SEQ ID NO：129的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：130的胺基酸序列或與SEQ ID NO：130的
胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(r)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：140的胺基酸序列或與SEQ ID NO：140的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：139的胺基酸序列或與SEQ ID NO：139的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：137的胺基酸序列或與SEQ ID NO：137的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：138的胺基酸序列或與SEQ ID NO：138的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(s)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：148的胺基酸序列或與SEQ ID NO：148的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：147的胺基酸序列或與SEQ ID NO：147的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：145的胺基酸序列或與SEQ ID NO：145的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：146的胺基酸序列或與SEQ ID NO：146的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(t)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：156的胺基酸序列或與SEQ ID NO：156的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：155的胺基酸序列或與SEQ ID NO：155的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：153的胺基酸序列或與SEQ ID NO：153的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：154的胺基酸序列或與SEQ ID NO：154的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(u)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：164的胺基酸序列或與SEQ ID NO：164的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：163的胺基酸序列或與SEQ ID NO：163的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：161的胺基酸序列或與SEQ ID NO：161的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：162的胺基酸序列或與SEQ ID NO：162的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(v)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：172的胺基酸序列或與SEQ ID NO：172的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：171的胺基酸序列或與SEQ ID NO：171的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：169的胺基酸序列或與SEQ ID NO：169的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：170的胺基酸序列或與SEQ ID NO：170的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(w)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：180的胺基酸序列或與SEQ ID NO：180的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：179的胺基酸序列或與SEQ ID NO：179的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：177的胺基酸序列或與SEQ ID NO：177的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：178的胺基酸序列或與SEQ ID NO：178的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(x)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：188的胺基酸序列或與SEQ ID NO：188的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：187的胺基酸序列或與SEQ ID NO：187的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：185的胺基酸序列或與SEQ ID NO：185的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：186的胺基酸序列或與SEQ ID NO：186的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(y)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：196的胺基酸序列或與SEQ ID NO：196的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：195的胺基酸序列或與SEQ ID NO：195的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：193的胺基酸序列或與SEQ ID NO：193的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：194的胺基酸序列或與SEQ ID NO：194的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(z)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：204的胺基酸序列或與SEQ ID
NO：204的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：203的胺基酸序列或與SEQ ID NO：203的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：201的胺基酸序列或與SEQ ID NO：201的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：202的胺基酸序列或與SEQ ID NO：202的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(aa)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：212的胺基酸序列或與SEQ ID NO：212的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：211的胺基酸序列或與SEQ ID NO：211的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：209的胺基酸序列或與SEQ ID NO：209的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：210的胺基酸序列或與SEQ ID NO：210的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(bb)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：220的胺基酸序列或與SEQ ID NO：220的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：219的胺基酸序列或與SEQ ID NO：219的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：217的胺基酸序列或與SEQ ID NO：217的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：218的胺基酸序列或與SEQ ID NO：218的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(cc)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：228的胺基酸序列或與SEQ ID NO：228的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：227的胺基酸序列或與SEQ ID NO：227的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：225的胺基酸序列或與SEQ ID NO：225的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：226的胺基酸序列或與SEQ ID NO：226的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(dd)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：235的胺基酸序列或與SEQ ID NO：235的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包
含SEQ ID NO：234的胺基酸序列或與SEQ ID NO：234的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：232的胺基酸序列或與SEQ ID NO：232的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：233的胺基酸序列或與SEQ ID NO：233的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；或
(ee)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：243的胺基酸序列或與SEQ ID NO：243的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：242的胺基酸序列或與SEQ ID NO：242的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：240的胺基酸序列或與SEQ ID NO：240的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：241的胺基酸序列或與SEQ ID NO：241的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
在一個實施方案中，本發明提供結合蛋白，其包含形成3個抗原結合位點的4條多肽鏈，所述3個抗原結合位點特異性結合一個或多個HIV靶蛋白及一個或多個T細胞靶蛋白，其中第一多肽鏈包含如下式表示的結構：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]；
第二多肽鏈包含如下式表示的結構：
VH1-L3-VH2-L4-CH1 [II]；
第三多肽鏈包含如下式表示的結構：
VH3-CH1 [III]；
且第四多肽鏈包含如下式表示的結構：
VL3-CL [IV]；
其中
VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變域；
VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變域；
VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變域；
VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變域；
VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變域；
VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變域；
CL是免疫球蛋白輕鏈恒定域；
CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恒定域；且
L1、L2、L3和L4是胺基酸連接子；
且其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對。
在一些實施方案中，所述第二多肽鏈還包含與CH1相連的Fc區，所述Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域。在一些實施方案中，所述第三多肽鏈還包含與CH1相連的Fc區，所述Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域。在一些實施方案中，所述第二多肽鏈還包含與CH1相連的第一Fc區，所述第一Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域，其中所述第一Fc區在對應於人IgG1的位置354和366的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為S354C和T366W；且其中所述第三多肽鏈還包含與CH1相連的第二Fc區，所述第二Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域，其中所述第二Fc區在對應於人IgG1的位置349、366、368和407的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為Y349C、T366S、L368A和Y407V。在一些實施方案中，所述第二多肽鏈還包含與CH1相連的第一Fc區，所述第一Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域，其中所述第一Fc區在對應於人IgG1的位置349、366、368和407的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為Y349C、T366S、L368A和Y407V；且其中所述第三多肽鏈還包含與CH1相連的第二Fc區，所述第二Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域，其中所述第二Fc區在對應於人IgG1的位置354和366的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為S354C和T366W。在一些實施方案中，所述第二多肽鏈還包含與CH1相連的第一Fc區，所述第一Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域，且其中所述第三多肽鏈還包含與CH1相連的第二Fc區，所述第二Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋
白重鏈恒定域；其中所述第一和第二Fc區在對應於人IgG1的位置428和434的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為M428L和N434S。
在一個實施方案中，本發明提供結合蛋白，其包含形成3個抗原結合位點的4條多肽鏈，所述3個抗原結合位點特異性結合一個或多個HIV靶蛋白及一個或多個T細胞靶蛋白，其中第一多肽鏈包含如下式表示的結構：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]；
第二多肽鏈包含如下式表示的結構：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [II]；
第三多肽鏈包含如下式表示的結構：
VH3-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [III]；
且第四多肽鏈包含如下式表示的結構：
VL3-CL [IV]；
其中
VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變域；
VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變域；
VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變域；
VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變域；
VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變域；
VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變域；
CL是免疫球蛋白輕鏈恒定域；
CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恒定域；
CH2是免疫球蛋白CH2重鏈恒定域；
CH3是免疫球蛋白CH3重鏈恒定域；
鉸鏈是連接CH1和CH2域的免疫球蛋白鉸鏈區；且
L1、L2、L3和L4是胺基酸連接子；
且其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對。
在一些實施方案中，所述第二多肽鏈的CH3域在對應於人IgG1的位
置354和366的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為S354C和T366W；且其中所述第三多肽鏈的CH3域在對應於人IgG1的位置349、366、368和407的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為Y349C、T366S、L368A和Y407V。在一些實施方案中，所述第二多肽鏈的CH3域在對應於人IgG1的位置349、366、368和407的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為Y349C、T366S、L368A和Y407V；且其中所述第三多肽鏈的CH3域在對應於人IgG1的位置354和366的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為S354C和T366W。在一些實施方案中，所述第二和第三多肽鏈的CH3域均在對應於人IgG1的位置428和434的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為M428L和N434S。
在一些實施方案中，所述一個或多個HIV靶蛋白選自由下列組成之群組：糖蛋白120、糖蛋白41和糖蛋白160。在一些實施方案中，所述一個或多個T細胞靶蛋白是CD3或CD28。在一些實施方案中，所述結合蛋白是三特異性的，且能够特異性結合一個HIV靶蛋白和單個T細胞靶蛋白上的兩個不同表位。在一些實施方案中，所述結合蛋白是三特異性的，且能够特異性結合一個HIV靶蛋白和兩個不同的T細胞靶蛋白。在一些實施方案中，所述結合蛋白是三特異性的，且能够特異性結合一個T細胞靶蛋白和單個HIV靶蛋白上的兩個不同表位。在一些實施方案中，所述結合蛋白是三特異性的，且能够特異性結合一個T細胞靶蛋白和兩個不同的HIV靶蛋白。在一些實施方案中，所述第一和第二多肽鏈形成兩個抗原結合位點，其特異性靶向兩個T細胞靶蛋白，且所述第三和第四多肽鏈形成抗原結合位點，其特異性結合HIV靶蛋白。在一些實施方案中，VL1包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其包含分別如SEQ ID NO：266、267和268中所示序列；分別如SEQ ID NO：269、270和271中所示序列；分別如SEQ ID NO：500、501和274中所示序列；分別如SEQ ID NO：275、276和277中所示序列；分別如SEQ ID NO：281、282和283中所示序列；分別如SEQ ID NO：278、279和280中所示序列；分別如SEQ ID NO：488、
489和490中所示序列；分別如SEQ ID NO：491、492和493中所示序列；或分別如SEQ ID NO：494、495和496中所示序列。在一些實施方案中，VL1包含輕鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述輕鏈可變域包含序列，該序列選自由下列組成之群組：SEQ ID NO：512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523和524。在一些實施方案中，VL1包含輕鏈可變域，其包含序列，該序列選自由下列組成之群組：SEQ ID NO：512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523和524。在一些實施方案中，VL2包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其包含分別如SEQ ID NO：266、267和268中所示序列；分別如SEQ ID NO：269、270和271中所示序列；分別如SEQ ID NO：500、501和274中所示序列；分別如SEQ ID NO：275、276和277中所示序列；分別如SEQ ID NO：281、282和283中所示序列；分別如SEQ ID NO：278、279和280中所示序列；分別如SEQ ID NO：488、489和490中所示序列；分別如SEQ ID NO：491、492和493中所示序列；或分別如SEQ ID NO：494、495和496中所示序列。在一些實施方案中，VL2包含輕鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述輕鏈可變域包含序列，該序列選自由下列組成之群組：SEQ ID NO：512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523和524。在一些實施方案中，VL2包含輕鏈可變域，其包含序列，該序列選自由下列組成之群組：SEQ ID NO：512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523和524。在一些實施方案中，VL3包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其包含分別如SEQ ID NO：266、267和268中所示序列；分別如SEQ ID NO：269、270和271中所示序列；分別如SEQ ID NO：500、501和274中所示序列；分別如SEQ ID NO：275、276和277中所示序列；分別如SEQ ID NO：281、282和283中所示序列；分別如SEQ ID NO：278、279和280中所示序列；分別如SEQ ID NO：488、489和490中所示序列；分別如SEQ ID NO：491、492和493中所示序列；或分別如SEQ ID NO：494、495和496中所示序列。在一些實施方案中，VL3包含輕鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述輕鏈可變域包含序列，該序列選自由下列組成之群組：SEQ ID NO：512、513、514、
515、516、517、518、519、520、521、522、523和524。在一些實施方案中，VL3包含輕鏈可變域，其包含序列，該序列選自由下列組成之群組：512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523和524。在一些實施方案中，VH1包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其包含分別如SEQ ID NO：248、497和250中所示序列；分別如SEQ ID NO：251、252和253中所示序列；分別如SEQ ID NO：254、255和256中所示序列；分別如SEQ ID NO：254、255和498中所示序列；分別如SEQ ID NO：257、258和259中所示序列；分別如SEQ ID NO：263、264和265中所示序列；分別如SEQ ID NO：499、261和262中所示序列；分別如SEQ ID NO：479、480和481中所示序列；分別如SEQ ID NO：482、483和484中所示序列；或分別如SEQ ID NO：485、486和487中所示序列。在一些實施方案中，VH1包含重鏈可變域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述重鏈可變域包含序列，該序列選自由下列組成之群組：SEQ ID NO：502、503、504、505、506、507、508、509、510和511。在一些實施方案中，VH1包含重鏈可變域，其包含序列，該序列選自由下列組成之群組：SEQ ID NO：502、503、504、505、506、507、508、509、510和511。在一些實施方案中，VH2包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其包含分別如SEQ ID NO：248、497和250中所示序列；分別如SEQ ID NO：251、252和253中所示序列；分別如SEQ ID NO：254、255和256中所示序列；分別如SEQ ID NO：254、255和498中所示序列；分別如SEQ ID NO：257、258和259中所示序列；分別如SEQ ID NO：263、264和265中所示序列；分別如SEQ ID NO：499、261和262中所示序列；分別如SEQ ID NO：479、480和481中所示序列；分別如SEQ ID NO：482、483和484中所示序列；或分別如SEQ ID NO：485、486和487中所示序列。在一些實施方案中，VH2包含重鏈可變域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述重鏈可變域包含序列，該序列選自由下列組成之群組：SEQ ID NO：502、503、504、505、506、507、508、509、510和511。在一些實施方案中，VH2包含重鏈可變域，其包含序列，該序列選自由下列組成之群組：SEQ ID NO：502、503、504、505、506、507、508、509、510和511。在一些實施方案中，VH3包含CDR-H1、
CDR-H2和CDR-H3，其包含分別如SEQ ID NO：248、497和250中所示序列；分別如SEQ ID NO：251、252和253中所示序列；分別如SEQ ID NO：254、255和256中所示序列；分別如SEQ ID NO：254、255和498中所示序列；分別如SEQ ID NO：257、258和259中所示序列；分別如SEQ ID NO：263、264和265中所示序列；分別如SEQ ID NO：499、261和262中所示序列；分別如SEQ ID NO：479、480和481中所示序列；分別如SEQ ID NO：482、483和484中所示序列；或分別如SEQ ID NO：485、486和487中所示序列。在一些實施方案中，VH3包含重鏈可變域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述重鏈可變域包含序列，該序列選自由下列組成之群組：SEQ ID NO：502、503、504、505、506、507、508、509、510和511。在一些實施方案中，VH3包含重鏈可變域，其包含序列，該序列選自由下列組成之群組：SEQ ID NO：502、503、504、505、506、507、508、509、510和511。在一些實施方案中，VL1包含：含有SEQ ID NO：488的序列的CDR-L1，含有SEQ ID NO：489的序列的CDR-L2，和含有SEQ ID NO：490的序列的CDR-L3；VL2包含：含有SEQ ID NO：494的序列的CDR-L1，含有SEQ ID NO：495的序列的CDR-L2，和含有SEQ ID NO：496的序列的CDR-L3；VL3包含：含有SEQ ID NO：269的序列的CDR-L1，含有SEQ ID NO：270的序列的CDR-L2，和含有SEQ ID NO：271的序列的CDR-L3；VH1包含：含有SEQ ID NO：479的序列的CDR-H1，含有SEQ ID NO：480的序列的CDR-H2，和含有SEQ ID NO：481的序列的CDR-H3；VH2包含：含有SEQ ID NO：485的序列的CDR-H1，含有SEQ ID NO：486的序列的CDR-H2，和含有SEQ ID NO：487的序列的CDR-H3；且VH3包含：含有SEQ ID NO：251的序列的CDR-H1，含有SEQ ID NO：252的序列的CDR-H2，和含有SEQ ID NO：253的序列的CDR-H3。在一些實施方案中，VL1包含輕鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述輕鏈可變域包含SEQ ID NO：522的輕鏈可變域序列；VL2包含輕鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述輕鏈可變域包含SEQ ID NO：524的輕鏈可變域序列；VL3包含輕鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述輕鏈可變域包含SEQ ID NO：513的輕鏈可變域序列；VH1
包含重鏈可變域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述重鏈可變域包含SEQ ID NO：509的重鏈可變域序列；VH2包含重鏈可變域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述重鏈可變域包含SEQ ID NO：511的重鏈可變域序列；且VH3包含重鏈可變域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述重鏈可變域包含SEQ ID NO：503的重鏈可變域序列。在一些實施方案中，VL1包含含有SEQ ID NO：522的序列的輕鏈可變域；VL2包含含有SEQ ID NO：524的序列的輕鏈可變域；VL3包含含有SEQ ID NO：513的序列的輕鏈可變域；VH1包含含有SEQ ID NO：509的序列的重鏈可變域；VH2包含含有SEQ ID NO：511的序列的重鏈可變域；且VH3包含含有SEQ ID NO：503的序列的重鏈可變域。在一些實施方案中，VL1包含：含有SEQ ID NO：494的序列的CDR-L1，含有SEQ ID NO：495的序列的CDR-L2，和含有SEQ ID NO：496的序列的CDR-L3；VL2包含：含有SEQ ID NO：488的序列的CDR-L1，含有SEQ ID NO：489的序列的CDR-L2，和含有SEQ ID NO：490的序列的CDR-L3；VL3包含：含有SEQ ID NO：269的序列的CDR-L1，含有SEQ ID NO：270的序列的CDR-L2，和含有SEQ ID NO：271的序列的CDR-L3；VH1包含：含有SEQ ID NO：485的序列的CDR-H1，含有SEQ ID NO：486的序列的CDR-H2，和含有SEQ ID NO：487的序列的CDR-H3；VH2包含：含有SEQ ID NO：479的序列的CDR-H1，含有SEQ ID NO：480的序列的CDR-H2，和含有SEQ ID NO：481的序列的CDR-H3；且VH3包含：含有SEQ ID NO：251的序列的CDR-H1，含有SEQ ID NO：252的序列的CDR-H2，和含有SEQ ID NO：253的序列的CDR-H3。在一些實施方案中，VL1包含輕鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述輕鏈可變域包含SEQ ID NO：524的輕鏈可變域序列；VL2包含輕鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述輕鏈可變域包含SEQ ID NO：522的輕鏈可變域序列；VL3包含輕鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述輕鏈可變域包含SEQ ID NO：513的輕鏈可變域序列；VH1包含重鏈可變域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述重鏈可變域包含SEQ ID NO：511的重鏈可變域序列；VH2包含重鏈可變域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述重鏈可變域包含SEQ ID NO：509的
重鏈可變域序列；且VH3包含重鏈可變域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述重鏈可變域包含SEQ ID NO：503的重鏈可變域序列。在一些實施方案中，VL1包含含有SEQ ID NO：524的序列的輕鏈可變域；VL2包含含有SEQ ID NO：522的序列的輕鏈可變域；VL3包含含有SEQ ID NO：513的序列的輕鏈可變域；VH1包含含有SEQ ID NO：511的序列的重鏈可變域；VH2包含含有SEQ ID NO：509的序列的重鏈可變域；且VH3包含含有SEQ ID NO：503的序列的重鏈可變域。在一些實施方案中，L1、L2、L3、或L4的至少一個獨立地長度為0個胺基酸。在一些實施方案中，L1、L2、L3、或L4各自獨立地長度為至少1個胺基酸。在一些實施方案中，L1是Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO：299)。
在一個實施方案中，本發明提供結合蛋白，其包含形成3個抗原結合位點的4條多肽鏈，其中第一多肽鏈包含如下式表示的結構：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽鏈包含如下式表示的結構：
VH1-L3-VH2-L4-CH1 [II]
且第三多肽鏈包含如下式表示的結構：
VH3-CH1 [III]
且第四多肽鏈包含如下式表示的結構：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變域；
VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變域；
VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變域；
VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變域；
VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變域；
VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變域；
CL是免疫球蛋白輕鏈恒定域；
CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恒定域；且
L1、L2、L3和L4是胺基酸連接子；
其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對；
其中：
(a)VL1、VL2和VL3各自獨立地是衍生自SEQ ID NO：303、305、311、313、319、321、327、329、335、337、343、345、351、353、359、361、367、369、375、377、383、385、391、393、399、401、407、409、415、417、423、425、431、433、439、441、447、449、455、457、463、465、471、473任一項所示胺基酸序列的可變域；或
(b)VL1、VL2和VL3各自獨立地包含可變域的輕鏈互補决定區，所述可變域包含SEQ ID NO：266-271、275-277、488-496任一項中所示的胺基酸序列；且
其中：
(a)VH1、VH2和VH3各自獨立地是衍生自SEQ ID NO：302、304、310、312、318、320、326、328、334、336、342、344、350、352、358、360、366、368、374、376、382、384、390、392、398、400、406、408、414、416、422、424、430、432、438、440、446、448、454、456、462、464、470、472任一項所示胺基酸序列的可變域；或
(b)VH1、VH2和VH3各自獨立地包含可變域的重鏈互補决定區，所述可變域包含SEQ ID NO：248-253、257-259、479-487任一項中所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，所述第二多肽鏈還包含與CH1相連的Fc區，所述Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域。在一些實施方案中，所述第三多肽鏈還包含與CH1相連的Fc區，所述Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域。在一些實施方案中，所述第二多肽鏈還包含與CH1相連的第一Fc區，所述第一Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域，其中所述第一Fc區在對應於人IgG1的位置354和366的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為S354C和T366W；且其中所述第三多肽鏈還包含與CH1相連的第二Fc區，所述第二Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域，其中所述第二Fc區在對應
於人IgG1的位置349、366、368和407的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為Y349C、T366S、L368A和Y407V。在一些實施方案中，所述第二多肽鏈還包含與CH1相連的第一Fc區，所述第一Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域，其中所述第一Fc區在對應於人IgG1的位置349、366、368和407的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為Y349C、T366S、L368A和Y407V；且其中所述第三多肽鏈還包含與CH1相連的第二Fc區，所述第二Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域，其中所述第二Fc區在對應於人IgG1的位置354和366的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為S354C和T366W。在一些實施方案中，所述第二多肽鏈還包含與CH1相連的第一Fc區，所述第一Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域，且其中所述第三多肽鏈還包含與CH1相連的第二Fc區，所述第二Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域；其中所述第一和第二Fc區在對應於人IgG1的位置428和434的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為M428L和N434S。
在一個實施方案中，本發明提供結合蛋白，其包含形成3個抗原結合位點的4條多肽鏈，其中第一多肽鏈包含如下式表示的結構：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽鏈包含如下式表示的結構：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [II]
且第三多肽鏈包含如下式表示的結構：
VH3-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [III]
且第四多肽鏈包含如下式表示的結構：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變域；
VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變域；
VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變域；
VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變域；
VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變域；
VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變域；
CL是免疫球蛋白輕鏈恒定域；
CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恒定域；
CH2是免疫球蛋白CH2重鏈恒定域；
CH3是免疫球蛋白CH3重鏈恒定域；
鉸鏈是連接CH1和CH2域的免疫球蛋白鉸鏈區；且
L1、L2、L3和L4是胺基酸連接子；
其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對；
其中
(a)VL1、VL2和VL3各自獨立地是衍生自SEQ ID NO：303、305、311、313、319、321、327、329、335、337、343、345、351、353、359、361、367、369、375、377、383、385、391、393、399、401、407、409、415、417、423、425、431、433、439、441、447、449、455、457、463、465、471、473任一項所示胺基酸序列的可變域；或
(b)VL1、VL2和VL3各自獨立地包含可變域的輕鏈互補决定區，所述可變域包含SEQ ID NO：266-271、275-277、488-496任一項中所示的胺基酸序列；且
其中：
(a)VH1、VH2和VH3各自獨立地是衍生自SEQ ID NO：302、304、310、312、318、320、326、328、334、336、342、344、350、352、358、360、366、368、374、376、382、384、390、392、398、400、406、408、414、416、422、424、430、432、438、440、446、448、454、456、462、464、470、472任一項所示胺基酸序列的可變域；或
(b)VH1、VH2和VH3各自獨立地包含可變域的重鏈互補决定區，所述可變域包含SEQ ID NO：248-253、257-259、479-487任一項中所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，所述第二多肽鏈的CH3域在對應於人IgG1的位置354和366的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為S354C和T366W；且其中所述第三多肽鏈的CH3域在對應於人IgG1的位置349、366、368和407的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為Y349C、T366S、L368A和Y407V。所述第二多肽鏈的CH3域在對應於人IgG1的位置349、366、368和407的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為Y349C、T366S、L368A和Y407V；且其中所述第三多肽鏈的CH3域在對應於人IgG1的位置354和366的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為S354C和T366W。在一些實施方案中，所述第二和第三多肽鏈的CH3域均在對應於人IgG1的位置428和434的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為M428L和N434S。
在一些實施方案中，L1、L2、L3、或L4的至少一個獨立地長度為0個胺基酸。在一些實施方案中，L1、L2、L3、或L4各自獨立地長度為至少1個胺基酸。在一些實施方案中，L1是Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO：299)。
在一個實施方案中，本發明提供結合蛋白，其包含形成3個抗原結合位點的4條多肽鏈，其中第一多肽鏈具有下式表示的結構：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽鏈具有下式表示的結構：
VH1-L3-VH2-L4-CH1 [II]
且第三多肽鏈具有下式表示的結構：
VH3-CH1 [III]
且第四多肽鏈具有下式表示的結構：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變域；
VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變域；
VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變域；
VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變域；
VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變域；
VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變域；
CL是免疫球蛋白輕鏈恒定域；
CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恒定域；且
L1、L2、L3和L4是胺基酸連接子；
其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對；
其中：
(a)VL1、VL2和VL3各自獨立地是衍生自SEQ ID NO：303、305、311、313、319、321、327、329、335、337、343、345、351、353、359、361、367、369、375、377、383、385、391、393、399、401、407、409、415、417、423、425、431、433、439、441、447、449、455、457、463、465、471、473任一項所示胺基酸序列的可變域；或
(b)VL1、VL2和VL3各自獨立地包含可變域的輕鏈互補决定區，所述可變域包含SEQ ID NO：266-271、275-277、488-496任一項中所示的胺基酸序列；且
其中：
(a)VH1、VH2和VH3各自獨立地是衍生自SEQ ID NO：302、304、310、312、318、320、326、328、334、336、342、344、350、352、358、360、366、368、374、376、382、384、390、392、398、400、406、408、414、416、422、424、430、432、438、440、446、448、454、456、462、464、470、472任一項所示胺基酸序列的可變域；或
(b)VH1、VH2和VH3各自獨立地包含可變域的重鏈互補决定區，所述可變域包含SEQ ID NO：248-253、257-259、479-487任一項中所示的胺基酸序列。
在另一個實施方案中，本發明提供包含第一多肽鏈、第二多肽鏈、第三多肽鏈和第四多肽鏈的結合蛋白，其中：
(a)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：305的胺基酸序列或與SEQ ID
NO：305的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：304的胺基酸序列或與SEQ ID NO：304的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：302的胺基酸序列或與SEQ ID NO：302的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：303的胺基酸序列或與SEQ ID NO：303的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(b)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：313的胺基酸序列或與SEQ ID NO：313的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：312的胺基酸序列或與SEQ ID NO：312的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：310的胺基酸序列或與SEQ ID NO：310的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：311的胺基酸序列或與SEQ ID NO：311的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(c)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：321的胺基酸序列或與SEQ ID NO：321的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：320的胺基酸序列或與SEQ ID NO：320的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：318的胺基酸序列或與SEQ ID NO：318的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：319的胺基酸序列或與SEQ ID NO：319的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(d)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：329的胺基酸序列或與SEQ ID NO：329的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：328的胺基酸序列或與SEQ ID NO：328的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：326的胺基酸序列或與SEQ ID NO：326的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：327的胺基酸序列或與SEQ ID NO：327的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(e)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：337的胺基酸序列或與SEQ ID NO：337的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含
SEQ ID NO：336的胺基酸序列或與SEQ ID NO：336的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：334的胺基酸序列或與SEQ ID NO：334的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：335的胺基酸序列或與SEQ ID NO：335的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(f)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：345的胺基酸序列或與SEQ ID NO：345的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：344的胺基酸序列或與SEQ ID NO：344的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：342的胺基酸序列或與SEQ ID NO：342的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：343的胺基酸序列或與SEQ ID NO：343的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(g)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：353的胺基酸序列或與SEQ ID NO：353的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：352的胺基酸序列或與SEQ ID NO：352的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：350的胺基酸序列或與SEQ ID NO：350的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：351的胺基酸序列或與SEQ ID NO：351的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(h)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：361的胺基酸序列或與SEQ ID NO：361的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：360的胺基酸序列或與SEQ ID NO：360的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：358的胺基酸序列或與SEQ ID NO：358的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：359的胺基酸序列或與SEQ ID NO：359的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(i)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：369的胺基酸序列或與SEQ ID NO：369的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：368的胺基酸序列或與SEQ ID NO：368的胺基酸序列至少
95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：366的胺基酸序列或與SEQ ID NO：366的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：367的胺基酸序列或與SEQ ID NO：367的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(j)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：377的胺基酸序列或與SEQ ID NO：377的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：376的胺基酸序列或與SEQ ID NO：376的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：374的胺基酸序列或與SEQ ID NO：374的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：375的胺基酸序列或與SEQ ID NO：375的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(k)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：385的胺基酸序列或與SEQ ID NO：385的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：384的胺基酸序列或與SEQ ID NO：384的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：382的胺基酸序列或與SEQ ID NO：382的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：383的胺基酸序列或與SEQ ID NO：383的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(l)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：393的胺基酸序列或與SEQ ID NO：393的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：392的胺基酸序列或與SEQ ID NO：392的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：390的胺基酸序列或與SEQ ID NO：390的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：391的胺基酸序列或與SEQ ID NO：391的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(m)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：401的胺基酸序列或與SEQ ID NO：401的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：400的胺基酸序列或與SEQ ID NO：400的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：398的胺基酸序
列或與SEQ ID NO：398的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：399的胺基酸序列或與SEQ ID NO：399的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(n)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：409的胺基酸序列或與SEQ ID NO：409的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：408的胺基酸序列或與SEQ ID NO：408的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：406的胺基酸序列或與SEQ ID NO：406的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：407的胺基酸序列或與SEQ ID NO：407的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(p)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：417的胺基酸序列或與SEQ ID NO：417的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：416的胺基酸序列或與SEQ ID NO：416的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：414的胺基酸序列或與SEQ ID NO：414的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：415的胺基酸序列或與SEQ ID NO：415的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(q)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：425的胺基酸序列或與SEQ ID NO：425的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：424的胺基酸序列或與SEQ ID NO：424的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：422的胺基酸序列或與SEQ ID NO：422的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：423的胺基酸序列或與SEQ ID NO：423的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(r)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：433的胺基酸序列或與SEQ ID NO：433的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：432的胺基酸序列或與SEQ ID NO：432的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：430的胺基酸序列或與SEQ ID NO：430的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所
述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：431的胺基酸序列或與SEQ ID NO：431的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(s)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：441的胺基酸序列或與SEQ ID NO：441的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：440的胺基酸序列或與SEQ ID NO：440的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：438的胺基酸序列或與SEQ ID NO：438的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：439的胺基酸序列或與SEQ ID NO：439的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(t)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：449的胺基酸序列或與SEQ ID NO：449的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：448的胺基酸序列或與SEQ ID NO：448的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：446的胺基酸序列或與SEQ ID NO：446的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：447的胺基酸序列或與SEQ ID NO：447的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(u)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：457的胺基酸序列或與SEQ ID NO：457的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：456的胺基酸序列或與SEQ ID NO：456的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：454的胺基酸序列或與SEQ ID NO：454的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：455的胺基酸序列或與SEQ ID NO：455的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(v)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：465的胺基酸序列或與SEQ ID NO：465的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：464的胺基酸序列或與SEQ ID NO：464的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：462的胺基酸序列或與SEQ ID NO：462的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：463的胺基酸序列或與SEQ ID NO：463的
胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；或
(w)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：473的胺基酸序列或與SEQ ID NO：473的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：472的胺基酸序列或與SEQ ID NO：472的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：470的胺基酸序列或與SEQ ID NO：470的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：471的胺基酸序列或與SEQ ID NO：471的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
在一個實施方案中，本發明提供單離的核酸分子，其包含編碼上述實施方案任一項的結合蛋白的核苷酸序列。在一個實施方案中，本發明提供表現載體，其包含上述實施方案任一項的核酸分子。在一個實施方案中，本發明提供單離的宿主細胞，其包含上述實施方案任一項的核酸分子。在一個實施方案中，本發明提供單離的宿主細胞，其包含上述實施方案任一項的表現載體。在一個實施方案中，所述單離的宿主細胞是哺乳動物細胞或昆蟲細胞。在一個實施方案中，本發明提供一種載體系統，其包含一個或多個編碼上述實施方案任一項的結合蛋白的第一、第二、第三和第四多肽鏈的載體。在一個實施方案中，所述載體系統包含編碼所述結合蛋白的第一多肽鏈的第一載體，編碼所述結合蛋白的第二多肽鏈的第二載體，編碼所述結合蛋白的第三多肽鏈的第三載體，和編碼所述結合蛋白的第四多肽鏈的第四載體。在一個實施方案中，所述載體系統包含編碼所述結合蛋白的第一和第二多肽鏈的第一載體，及編碼所述結合蛋白的第三和第四多肽鏈的第二載體。在一個實施方案中，所述一個或多個載體是表現載體。在一個實施方案中，本發明提供單離的宿主細胞，其包含上述實施方案任一項的載體系統。在一個實施方案中，所述單離的宿主細胞是哺乳動物細胞或昆蟲細胞。在一個實施方案中，本發明提供一種生產結合蛋白的方法，該方法包括：a)在使宿主細胞表現所述結合蛋白的條件下培養上述實施方案任一項的宿主細胞；和b)從該宿主細胞分離所述結合蛋白。
在一個實施方案中，本發明提供一種預防和/或治療患者中的HIV感染的方法，包括對所述患者投予治療有效量的上述實施方案任一項的至少
一種結合蛋白。在一些實施方案中，所述結合蛋白與標準抗逆轉錄病毒治療共同投予。在一些實施方案中，所述至少一種結合蛋白的投予導致一個或多個HIV病毒體的中和。在一些實施方案中，所述至少一種結合蛋白的投予導致所述患者中一個或多個潜伏和/或慢性HIV感染的細胞的清除。在一些實施方案中，所述患者是人。
在一個實施方案中，本發明提供上述實施方案任一項的結合蛋白，其用於預防或治療患者中的HIV感染。在一些實施方案中，所述結合蛋白與標準抗逆轉錄病毒治療共同投予。在一些實施方案中，所述結合蛋白引起所述患者中一個或多個HIV病毒體的中和。在一些實施方案中，所述結合蛋白引起所述患者中一個或多個潜伏和/或慢性HIV感染的細胞的清除。在一些實施方案中，所述患者是人。
本發明的具體實施方案可由下文對一些實施方案的更具體描述以及權利要求書而變得明顯。
應當理解的是，本文描述的各種實施方案的一個、一些、或全部特徵可以進行組合以形成本發明的其他實施方案。本發明的這些及其他態樣對于本領域技術人員而言是明顯的。
圖1A-D顯示了三特異性結合蛋白的示意圖，所述結合蛋白包含形成3個抗原結合位點的4條多肽鏈，所述3個抗原結合位點特異性結合一個或多個抗原上的3個不同表位，其中第一對多肽具有雙重可變域(其具有交叉取向)，形成2個抗原結合位點(包含VH1-VL1和VH2-VL2)，且其中第二對多肽具有單個抗原結合位點(包含VH3-VL3)，其依據一些實施方式。圖1A顯示了包含“節-入-穴(knobs-into-holes)”修飾的三特異性結合蛋白，其中所述節在第一對多肽上。圖1B顯示了包含“節-入-穴”修飾的三特異性結合蛋白，其中所述節在第二對多肽上。圖1C顯示了表1和2中所示結合蛋白1-31的多肽鏈上可變域的取向，以及節/穴取向。“重鏈A”(例如本發明的第三多肽鏈)指示重鏈A的可變域。“輕鏈A”(例如本發明的第四多肽鏈)指示輕鏈A的可變域。“重鏈B”(例如本發明的第二多肽鏈)指示重鏈B的可
變域1和可變域2。“輕鏈B”(例如本發明的第一多肽鏈)指示輕鏈B的可變域1和可變域2。圖1D顯示了表1和2中所示結合蛋白32-53的多肽鏈上可變域的取向，以及節/穴取向。“重鏈A”(例如本發明的第三多肽鏈)指示重鏈A的可變域。“輕鏈A”(例如本發明的第四多肽鏈)指示輕鏈A的可變域。“重鏈B”(例如本發明的第二多肽鏈)指示重鏈B的可變域1和可變域2。“輕鏈B”(例如本發明的第一多肽鏈)指示輕鏈B的可變域1和可變域2。
圖2A-B顯示了三特異性結合蛋白的純化，其首先使用親和色譜，然後用製備型大小排阻色譜來進行。圖2A顯示了三特異性結合蛋白在用蛋白A親和色譜純化過程中的洗脫概貌。圖2B顯示了通過Superdex200大小排阻色譜對單體蛋白的純化。
圖3A-B顯示了MPER Ab、CD4BS Ab“b”和針對V1/V2的Ab“a”親本抗體的純化，其首先使用親和色譜，然後用製備型大小排阻色譜來進行。圖3A顯示了親本抗體在用蛋白A親和色譜純化過程中的洗脫概貌。圖3B顯示了通過Superdex200大小排阻色譜對單體蛋白的純化。
圖4A-B顯示了雙特異性和三特異性結合蛋白的大小排阻色譜概貌。圖4A顯示了雙特異性結合蛋白的大小排阻色譜概貌。圖4B顯示了三特異性結合蛋白的大小排阻色譜概貌。
圖5顯示了三種三特異性結合蛋白和針對HIV gp41來源的肽(MPER結合位點)的親本MPER Ab抗體的結合動力學的Biacore傳感圖(sensograms)，如通過基于標準Biacore的動力學測定所評估的。
圖6顯示了三種三特異性結合蛋白和針對重組HIV gp120的親本CD4BS Ab“b”抗體的結合動力學的Biacore傳感圖，如通過基于標準Biacore的動力學測定所評估的。
圖7顯示了在靜脈內(IV)注射入恒河猴(rhesus macaques)後所述蛋白的藥代動力學(PK)研究的結果。
圖8A-8B顯示了三特異性T細胞銜接體的示意圖，其根據一些實施方案。結合位點通過虛綫圈表示。
圖9顯示了三特異性結合蛋白“結合蛋白32”和“CD3 x CD28/CD4BS Ab‘b’”對gp120的CD3(CD3E代表CD3ε蛋白；CD3D代表CD3δ蛋白)、
CD28、以及表面重塑穩定化核心3(Resurfaced Stabilized Core3,RSC3)蛋白的結合特性，以及對陰性對照(人IgG)的結合特性。
圖10顯示了CD8 T細胞激活，其使用三特異性蛋白“結合蛋白32”和“CD3 x CD28/CD4BS Ab‘b’”對比親本CD4BS IgG4抗體，以及陰性對照(無mAb)來進行。
圖11顯示了CD4 T細胞激活，其使用三特異性蛋白“結合蛋白32”和“CD3 x CD28/CD4BS Ab‘b’”對比親本CD4BS IgG4抗體，以及陰性對照(無mAb)來進行。
圖12顯示了T細胞激活之後的CD3下調，其通過三特異性蛋白“結合蛋白32”和“CD3 x CD28/CD4BS Ab‘b’”對比親本CD4BS IgG4抗體，以及陰性對照(無mAb)來進行。
圖13A-C顯示了三特異性結合蛋白針對潜伏感染的HIV-1+ T細胞的基于熒光激活細胞分選(FACS)的細胞毒性測定結果。圖13A顯示了與CEM-BaL細胞一起溫育的三特異性結合蛋白的結果。圖13B顯示了與ACH2細胞一起溫育的三特異性結合蛋白的結果。圖13C顯示了與J1.1細胞一起溫育的三特異性結合蛋白的結果。
本發明提供三特異性和/或三價結合蛋白，其包含形成3個抗原結合位點的4條多肽鏈，所述3個抗原結合位點特異性結合至一個或多個人類免疫缺陷病毒(HIV)靶標蛋白和/或一個或多個T細胞受體靶標蛋白，其中形成所述結合蛋白的第一對多肽具有雙重可變域，其具有交叉取向，且其中形成所述結合蛋白的第二對多肽具有單一可變域。
如下說明示出了示例性的方法、參數等等。然而應當理解的是，此說明並非意欲限制本發明的範圍，而是作為示例性實施方案的描述而提供。
定義
如本發明所使用的，下列術語除非另有說明，否則應理解為具有下列含義。除非文中另有要求，否則單數術語應包括複數，複數術語應包括單數。
本文所用術語“多核苷酸”是指長度為至少10個核苷酸的單鏈或雙鏈核酸聚合物。在一些實施方案中，包含多核苷酸的核苷酸可以是核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或任一核苷酸類型的修飾形式。所述修飾包括碱基修飾例如溴尿苷、核糖修飾例如阿拉伯糖苷和2',3'-雙脫氧核糖及核苷酸間鍵修飾例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯、phosphoroanilothioate、phoshoraniladate和胺基磷酸酯(phosphoroamidate)。術語“多核苷酸”明確包括DNA的單鏈和雙鏈形式。
“單離的多核苷酸”是基因組、cDNA或合成來源的或其一些組合的多核苷酸，其：(1)不與單離的多核苷酸天然存在於其中的多核苷酸的全部或部分締合，(2)與其天然不與其連接的多核苷酸連接，或(3)不作為較大序列的部分天然存在。
“單離的多肽”是這樣的多肽：(1)不含正常與其一起存在的至少一些其它多肽，(2)基本不含來自相同來源(例如來自相同物種)的其它多肽，(3)由來自不同物種的細胞表現，(4)已從其與之天然締合的至少約50%的多核苷酸、脂質、碳水化合物或其它物質分離，(5)不與“單離的多肽”天然與之締合的多肽的部分締合(通過共價或非共價相互作用)，(6)與其與之天然不締合的多肽可操作地締合(通過共價或非共價相互作用)，或(7)天然不存在。所述單離的多肽可由合成來源的基因組DNA、cDNA、mRNA或其它RNA或其任何組合編碼。優選地，單離的多肽基本不含在其自然環境中存在的可能干擾其用途(治療、診斷、預防、研究或其它)的多肽或其它污染物。
天然存在的抗體通常包含四聚體。每個此種四聚體通常由兩個相同的多肽鏈對組成，每對具有一條全長“輕”鏈(通常分子量為約25kDa)和一條全長“重”鏈(通常分子量為約50-70kDa)。本文所用術語“重鏈”和“輕鏈”是指任何具有足以賦予針對靶抗原的特異性的可變域序列的免疫球蛋白多肽。各輕鏈和重鏈的胺基端部分通常包括約100-110個或更多個胺基酸的可變結構域，其通常負責抗原識別。各鏈的羧基端部分通常限定負責效應子功能的恒定域。因此，在天然存在的抗體中，全長重鏈免疫球蛋白多肽包含可變域(VH)和3個恒定域(CH1、CH2和CH3)，其中VH域位於多肽的胺
基端，CH3域位於羧基端，而全長輕鏈免疫球蛋白多肽包含可變域(VL)和恒定域(CL)，其中VL域位於多肽的胺基端，CL域位於羧基端。
人輕鏈通常分類為κ和λ輕鏈，人重鏈通常分類為μ、δ、γ、α或ε，分別限定抗體的同種型為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有若干亞類，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM具有亞類，包括但不限于IgM1和IgM2。IgA同樣被細分為亞類，包括但不限于IgA1和IgA2。在全長輕鏈和重鏈內，可變域和恒定域通常通過約12個或更多個胺基酸的“J”區連接，其中重鏈還包含約10個以上胺基酸的“D”區。參見例如FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY(Paul,W編，Raven Press，第二版，1989)，其通過提述以其整體並入用於所有目的。各輕鏈/重鏈對的可變區通常形成抗原結合位點。天然存在的抗體的可變域通常顯示出由3個高變區(亦稱互補决定區或CDR)連接的相對保守的框架區(FR)的同樣的通用結構。每對的兩條鏈的CDR通常通過框架區對齊，這可以使得能够結合特定的表位。從胺基端到羧基端，輕鏈和重鏈可變域二者通常包含域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。
術語“CDR組”意指在能够結合抗原的單個可變區中存在的一組3個CDR。這些CDR的確切邊界已根據不同系統進行了不同定義。由Kabat描述的系統(Kabat等，SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST(National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1987)和(1991))不僅提供了可應用於抗體的任何可變區的明確殘基編號系統，而且還提供了限定3個CDR的精確殘基邊界。這些CDR可以被稱為Kabat CDR。Chothia和同事(Chothia和Lesk,1987,J.Mol.Biol.196：901-17；Chothia等，1989,Nature 342：877-83)發現在Kabat CDR內的特定亞部分採用幾乎相同的肽主鏈構象，儘管在胺基酸序列水平上具有很大的多樣性。這些亞部分指定為L1、L2和L3或H1、H2和H3，其中“L”和“H”分別指定輕鏈和重鏈區。這些區域可以稱為Chothia CDR，其具有與KabatCDR重叠的邊界。限定與Kabat CDR重叠的CDR的其他邊界已由Padlan,1995,FASEBJ.9：133-39；MacCallum,1996,J.Mol.Biol.262(5)：732-45；和Lefranc,2003,Dev.Comp.Immunol.27：55-77描述。另外其他的CDR邊界
定義可能不嚴格遵循上述系統之一，但仍會與Kabat CDR重叠，儘管它們可以按照下述預測或實驗發現來加以縮短或延長：特定殘基或殘基組或甚至整個CDR不顯著影響抗原結合。本文使用的方法可以利用根據這些系統中任一種定義的CDRs，儘管具體實施方案使用Kabat或Chothia定義的CDR。對使用所述胺基酸序列預測的CDR進行的鑑定是本領域所熟知的，如Martin,A.C."Protein sequence and structure analysis of antibody variable domains,"In Antibody Engineering,Vol.2.Kontermann R.,Dübel S編.Springer-Verlag,Berlin,p.33-51(2010)中所述。還可以通過其他常規方法來檢查重鏈和/或輕鏈可變域的胺基酸序列以鑑定CDR的序列，所述其他常規方法例如通過與已知的其他重鏈和輕鏈可變區的胺基酸序列進行比較以確定序列高可變性的區域。編號的序列可以通過肉眼進行比對，或者通過採用比對程序如CLUSTAL程序套組中之一來比對，如Thompson,1994,Nucleic Acids Res.22：4673-80中所述。慣常使用分子模型來正確地描繪框架區和CDR區，並因而對基于序列的分配(assignment)加以校正。
本文所用術語“Fc”是指這樣的分子，其包含因抗體消化得到的或通過其它方法產生的非抗原結合片段的序列，不論呈單體還是多聚體形式，並可含有鉸鏈區。天然Fc的原始免疫球蛋白來源優選為人源的，並可以是任何的免疫球蛋白，儘管優選的是IgG1和IgG2。Fc分子由單體多肽組成，所述單體多肽可通過共價(即二硫鍵)和非共價締合連接成為二聚或多聚體形式。天然Fc分子單體亞基間的分子間二硫鍵的數量範圍為1-4，這取决于類別(例如IgG、IgA和IgE)或亞類(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgA1和IgGA2)。Fc的一個實例是自木瓜蛋白酶消化IgG所得的二硫鍵鍵合的二聚體。本文所用術語“Fc”是單體、二聚和多聚體形式的通稱。
F(ab)片段通常包含一條輕鏈及一條重鏈的VH和CH1域，其中F(ab)片段的VH-CH1重鏈部分無法與另一重鏈多肽形成二硫鍵。本文所用的F(ab)片段還可包含一條輕鏈(其含有被胺基酸連接子分隔開的2個可變域)和一條重鏈(其含有被胺基酸連接子分隔開的2個可變域和CH1域)。
F(ab')片段通常包含一條輕鏈和含有更多恒定區(在CH1與CH2域間)的一條重鏈的一部分，使得可在兩條重鏈間形成鏈間二硫鍵以形成F(ab')2分
子。
本文使用的術語“結合蛋白”意指這樣的非天然存在的(或是重組的或工程化的)分子，其特異性結合至少一個靶抗原，並且其包含形成3個抗原結合位點的4條多肽鏈，其中第一多肽鏈具有下式表示的結構：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽鏈具有下式表示的結構：
VH1-L3-VH2-L4-CH1 [II]
且第三多肽鏈具有下式表示的結構：
VH3-CH1 [III]
且第四多肽鏈具有下式表示的結構：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變域；
VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變域；
VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變域；
VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變域；
VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變域；
VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變域；
CL是免疫球蛋白輕鏈恒定域；
CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恒定域；且
L1、L2、L3和L4是胺基酸連接子；
且其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對。
“重組的”分子是通過重組方法製備、表現、產生或單離的分子。
本發明的一個實施方案提供了具有生物學和免疫學特異性的結合蛋白，所述特異性是針對1-3個靶抗原。本發明的另一個實施方案提供了包含核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列編碼形成此類結合蛋白的多肽鏈。本發明的另一個實施方案提供了包含核酸分子的表現載體，所述核酸分子包含編碼形成此類結合蛋白的多肽鏈的核苷酸序列。本發明的又一個實施方案提供了表現此類結合蛋白(即包含編碼形成此類結合蛋白的多肽鏈
的核酸分子或載體)的宿主細胞。
本文所用術語“可交換性”是指結合蛋白形式內的且保持折叠和最終結合親和力的可變域的可互換性。“完全可交換性”是指在式I的多肽鏈或式II的多肽鏈中交換VH1和VH2域兩者的順序並因此交換VL1和VL2域的順序(即，顛倒順序)，同時保持所述結合蛋白的完整功能性的能力，如通過結合親和力的保留來證實。而且，應注意的是，標識VH和VL僅是指最終形式中特定蛋白質鏈上的域位置。例如，VH1和VH2可來源于親本抗體中的VL1和VL2域，並被置于結合蛋白中的VH1和VH2位置中。同樣地，VL1和VL2可來源于親本抗體中的VH1和VH2域，並被置于結合蛋白中的VH1和VH2位置中。因此，VH和VL標識是指現在的位置，而非親本抗體中的原始位置。因而VH和VL域是“可交換的”。
本文所用的術語“抗原”或“靶抗原”或“抗原靶標”是指這樣的分子或分子的部分，其能够被結合蛋白結合，且額外能够用於動物以產生能與該抗原的表位結合的抗體。靶抗原可具有一個或多個表位。關于被結合蛋白識別的各個靶抗原而言，結合蛋白能够與識別靶抗原的完整抗體競爭。
本文所用的術語“HIV”是指人類免疫缺陷病毒。如本文所用的術語“HIV感染”通常包括逆轉錄病毒的人類免疫缺陷病毒(HIV)家族對宿主(尤其是人宿主)的感染，所述病毒包括但不限于HIV I、HIV II、HIV III(也稱為HTLV-II、LAV-1、LAV-2)。HIV在本文中可用於意指HIV家族中的任何株、形式、亞型、進化枝及變異。因此，治療HIV感染會涵蓋治療其為逆轉錄病毒的任何HIV家族的携帶者的人或其被診斷為具有活性AIDS的人，以及在這些人中治療或預防AIDS相關的病况。
本文使用的術語“AIDS”意指獲得性免疫缺陷綜合征。AIDS由HIV引起。
術語“CD4bs”或“CD4結合位點”是指CD4(分化簇4(cluster of differentiation 4))的結合位點，其是一種糖蛋白，見于免疫細胞如T輔助細胞、單核細胞、巨噬細胞和樹突細胞的表面。
術語“CD3”是分化因子簇3多肽且是T細胞表面蛋白，其通常是T細胞受體(TCR)複合體的一部分。
“CD28”是分化簇28多肽並且是T細胞表面蛋白，其提供共-刺激信號用於T細胞激活和存活。
術語“糖蛋白160”或“gp160蛋白”是指HIV的包膜糖蛋白複合體，並且其是一種同型三聚體，其切割為gp120和gp41亞基。
術語“MPER”是指糖蛋白41(gp41)的膜鄰近外部區，其是逆轉錄病毒(包括HIV)的包膜蛋白複合體的亞基。
術語“聚糖”是指糖綴合物(如糖蛋白、糖脂或蛋白聚糖)的糖部分。在公開的結合蛋白中，聚糖是指HIV-1包膜糖蛋白gp120。
術語“T細胞銜接體”是指針對宿主免疫系統(更具體而言是T細胞的胞毒活性)以及針對HIV靶蛋白的結合蛋白。
術語“三聚體尖端”是指HIV-1包膜糖蛋白gp120的尖端(apex)。
術語“單特異性結合蛋白”是指特異性結合至一個抗原靶標的結合蛋白。
術語“單價結合蛋白”是指具有一個抗原結合位點的結合蛋白。
術語“雙特異性結合蛋白”是指特異性結合至兩個不同抗原靶標的結合蛋白。
術語“二價結合蛋白”是指具有兩個結合位點的結合蛋白。
術語“三特異性結合蛋白”是指特異性結合至三個不同抗原靶標的結合蛋白。
術語“三價結合蛋白”是指具有三個結合位點的結合蛋白。在具體的實施方案中，三價結合蛋白能結合至1個抗原靶標。在其他實施方案中，三價結合蛋白能結合至2個抗原靶標。在其他實施方案中，三價結合蛋白能結合至3個抗原靶標。
“單離的”結合蛋白指已從其天然環境的污染組分中鑑定和分離和/或回收的多肽。其天然環境的污染組分是干擾多肽的診斷或治療用途的材料，其可以包括酶、激素和其他蛋白質性質或非蛋白質性質的溶質。在一些實施方案中，將所述多肽純化：(1)至如通過Lowry法確定的以重量計大于95%，且最優選以重量計大于99%的抗體，(2)至通過使用轉杯式(spinning cup)測序儀足以獲得至少15個N-末端或內部胺基酸序列殘基的程度，或者(3)使用考馬斯藍或優選銀染在還原或非還原條件下通過SDS-PAGE得到
的同質性(homogeneity)。單離的結合蛋白包括在重組細胞內原位的結合蛋白，因為結合蛋白天然環境中的至少一種組分是不存在的。
本文所用術語“基本純的”或“基本純化的”是指是存在的主要種類的任何化合物或種類(即以摩爾濃度基礎計，比組成物中的任何其它各個種類豐富)。在一些實施方案中，基本純化的部分是其中所述種類包含存在的所有大分子種類的至少約50%(以摩爾濃度基礎計)的組合物。在其它實施方案中，基本純的組合物包含存在於組合物中的所有大分子種類的大于約80%、85%、90%、95%或99%。在另外其它的實施方案中，該種類被純化至基本同質性(通過常規檢測方法無法在組合物中檢出污染種類)，其中組合物基本由單一大分子種類組成。
本文所用的“中和”結合蛋白意指能阻遏或顯著降低其結合的靶抗原的效應子功能的分子。本文所用的“顯著降低”意指靶抗原的效應子功能至少約60%、優選為至少約70%、更優選為至少約75%、更優選為至少約80%、更優選為至少約85%、最優選為至少約90%的降低。
術語“表位”包括任何决定簇，優選為能够與免疫球蛋白或T細胞受體特異性結合的多肽决定簇。在一些實施方案中，表位决定簇包括例如胺基酸、糖側鏈、磷醯基或磺醯基等分子的化學活性表面群聚，並且在一些實施方案中，可具有特定的三維結構特徵和/或特定的電荷特徵。表位是被抗體或結合蛋白結合的抗原的區域。在一些實施方案中，當結合蛋白優先識別其在蛋白質和/或大分子的複雜混合物中的靶抗原時，將其稱為與抗原特異性結合。在一些的實施方案中，當平衡解離常數
10-8M、更優選當平衡解離常數
10-9M、最優選當解離常數
10-10M時，結合蛋白被稱為與抗原特異性結合。
可通過例如表面等離振子共振來測定結合蛋白的解離常數(KD)。一般而言，通過採用BIAcore系統(Pharmacia Biosensor；Piscataway，NJ)的表面等離振子共振(SPR)，表面等離振子共振分析測量配體(生物傳感器基質上的靶抗原)和分析物(溶液中的結合蛋白)之間的實時結合相互作用。表面等離振子分析也可通過固定分析物(將結合蛋白固定在生物傳感器基質上)和呈現配體(靶抗原)來進行。本文所用術語“KD”是指具體結合蛋白和靶抗
原間的相互作用的解離常數。
本文所用術語“特異性結合”是指結合蛋白或其抗原結合片段以至少約1 x 10-6M、1 x 10-7M、1 x 10-8M、1 x 10-9M、1 x 10-10M、1 x 10-11M、1 x 10-12M或更大的Kd與含有表位的抗原結合和/或以其對非特異性抗原的親和力至少大2倍的親和力與表位結合的能力。
本文所用術語“連接子”是指插入免疫球蛋白域中為輕鏈和重鏈的域提供足够的可動性以折叠成交叉雙重可變區免疫球蛋白的一個或多個胺基酸殘基。在序列水平上，連接子分別在可變域之間或可變和恒定域之間的轉換處插入。可以鑑定域間的轉換，因為已完全瞭解免疫球蛋白域的近似大小。域轉換的確切位置可通過定位不形成二級結構單元例如β-折叠或α-螺旋的肽段來確定，其通過實驗數據證實或可通過建模技術或二級結構預測來假設。本文所述連接子稱為L1，其位於VL2的C端和VL1域的N端之間的輕鏈上；以及L2，其位於VL1的C端和CL域的N端之間的輕鏈上。重鏈連接子稱為L3，其位於VH1的C和VH2域的N端之間；和L4，其位於VH2的C端和CH1域的N端之間。
本文所用術語“載體”是指用於將編碼信息轉移至宿主細胞中的任何分子(例如核酸、質體或病毒)。術語“載體”包括能够將其已連接的另一個核酸轉運的核酸分子。載體的一個類型是“質體”，其是指可向其中插入另外的DNA區段的環狀雙鏈DNA分子。載體的另一個類型是病毒載體，其中另外的DNA區段可插入病毒基因組中。某些載體能够在其所導入的宿主細胞中自主複製(例如具有細菌複製起點的細菌載體和附加型(episomal)哺乳動物載體)。其它載體(例如非附加型哺乳動物載體)可在導入宿主細胞中時整合到宿主細胞的基因組中，由此與宿主基因組一起複製。此外，一些載體能够指導其與之有效連接的基因的表現。此類載體在本文稱為“重組表現載體”(或簡稱“表現載體”)。一般而言，在重組DNA技術中實用的表現載體常常為質體的形式。術語“質體”和“載體”在本文可互換使用，因為質體是最常使用的載體形式。然而，本發明意欲包括表現載體的其它形式，例如病毒載體(例如複製缺陷型逆轉錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)，其起等同功能的作用。
本文所用短語“重組宿主細胞”(或“宿主細胞”)是指其中已導入重組表現載體的細胞。重組宿主細胞或宿主細胞不僅意指特定的受試細胞，而且還指這類細胞的子代。由於因其突變或環境影響所致某些修飾可發生在後代中，因此儘管這樣的後代實際上可能與母細胞不同，但這樣的細胞仍包括在本文所用術語“宿主細胞”的範圍內。可使用各種宿主細胞表現系統來表現結合蛋白，包括細菌、酵母、杆狀病毒和哺乳動物表現系統(以及噬菌體展示表現系統)。合適細菌表現載體的一個實例為pUC19。為了重組表現結合蛋白，用一個或多個携帶編碼結合蛋白的多肽鏈的DNA片段的重組表現載體轉化或轉染宿主細胞，使得多肽鏈在宿主細胞中表現，並優選分泌到其中培養宿主細胞的培養基中，可從所述培養基中回收結合蛋白。
本文所用術語“轉化”是指細胞遺傳特性的改變，當細胞被修飾以含有新的DNA時，細胞被轉化。例如，當細胞自其天然狀態被遺傳修飾時，細胞被轉化。在轉化後，轉化的DNA可通過物理上整合至細胞染色體中而與細胞重組，或可作為附加型元件瞬時保持而不複製，或可作為質體獨立複製。當DNA隨細胞分裂而複製時，細胞被視為已穩定轉化。本文所用術語“轉染”是指異質或外源DNA被細胞攝取，當外源DNA被導入細胞膜內時，細胞被“轉染”。多種轉染技術是本領域所熟知的。可採用這類技術將一個或多個外源DNA分子導入合適的宿主細胞中。
本文所用和應用於客體的術語“天然存在的”是指該客體可存在於大自然中並且未經人為操作的事實。例如，存在於可從天然來源單離的生物(包括病毒)中且未被人為有意修飾的多核苷酸或多肽是天然存在的。類似地，本文所用的“非天然存在的”是指自然中不存在或已人為進行結構修飾或合成的客體。
如本文所用，20個常規胺基酸及其縮寫按照常規用法。20個常用胺基酸的立體異構體(例如D-胺基酸)；非天然胺基酸例如α-、α-二取代的胺基酸、N-烷基胺基酸、乳酸和其它非常規胺基酸也可以是結合蛋白的多肽鏈的合適組分。非常規胺基酸的實例包括：4-羥脯胺酸、γ-羧基谷胺酸、ε-N,N,N-三甲基賴胺酸、ε-N-乙醯基賴胺酸、O-磷酸絲胺酸、N-乙醯絲胺酸、N-甲醯甲硫胺酸、3-甲基組胺酸、5-羥賴胺酸、σ-N-甲基精胺酸和其它類
似胺基酸和亞胺基酸(例如4-羥脯胺酸)。在本文所用多肽表示法中，按照標準用法和慣例，左側方向為胺基端方向，右側方向為羧基端方向。
可基于共同的側鏈性質，將天然存在的殘基分類：
(1)疏水：Met、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Tyr、Pro；
(2)極性親水：Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、His、Lys、Ser、Thr；
(3)脂肪族：Ala、Gly、Ile、Leu、Val、Pro；
(4)脂肪族疏水：Ala、Ile、Leu、Val、Pro；
(5)中性親水：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(6)酸性：Asp、Glu；
(7)鹼性：His、Lys、Arg；
(8)影響鏈取向的殘基：Gly、Pro；
(9)芳香族：His、Trp、Tyr、Phe；和
(10)芳香族疏水：Phe、Trp、Tyr。
保守胺基酸取代可涉及這些類別之一的成員與同一類別的另一成員的交換。非保守取代可涉及這些類別之一的成員與另一類別的成員的交換。
採用衆所周知的技術，技術人員會能够確定結合蛋白的多肽鏈的合適變體。例如，通過靶向被視為對活性不重要的區域，本領域的技術人員可鑑定可被改變而不破壞活性的多肽鏈的合適區域。或者，本領域的技術人員可鑑定在類似多肽中保守的殘基和分子部分。此外，甚至可以將對生物活性或對結構可能是重要的區域進行保守胺基酸取代而不破壞生物活性或對多肽結構沒有不利影響。
本文所用術語“患者”包括人和動物受試者。
本文所用術語“治療(treatment)”或“治療(treat)”是指任何治療性治療和預防或預防性措施二者。需要治療的受試者包括患有病症的受試者以及易患病症的受試者或要對其病症進行預防的受試者。在具體實施方案中，結合蛋白可以用於治療感染HIV的人，或易感HIV感染的人，或在感染HIV的人受試者中减輕HIV感染。結合蛋白還可用於預防人患者中的HIV。
應當理解的是，治療感染HIV的患者包括處於若干HIV感染進展階段的任一階段的受試者，其包括例如急性原發性感染綜合征(其可以是無症
狀的或與具有發熱，不適，腹瀉和神經學症狀(如頭痛)的流感樣疾病相關)，無症狀感染(其是循環CD4+T細胞數目逐漸下降的長期潜伏期)和AIDS(其由更嚴重的AIDS限定性疾病和/或循環CD4細胞計數的下降而定義，所述下降為降至低於與有效免疫功能相容的水平)。此外，治療或預防HIV感染還涵蓋了治療在懷疑過去暴露于HIV之後懷疑的HIV感染，所述接觸HIV是通過例如接觸HIV污染的血液、輸血、體液交換、與受感染的人進行的“不安全的”性行為、意外針刺、接受了用污染的器材進行的紋身或針刺、或懷孕、分娩期間或其後短時間內由母親至嬰兒的病毒傳播。
本文所用術語“醫藥組合物”或“治療組合物”是指當適當地投予于患者時能够引起所需治療效果的任何化合物或組合物。
本文所用術語“藥學上可接受的載劑”或“生理學上可接受的載劑”是指適于實現或增强結合蛋白遞送的一種或多種製劑材料。
術語“有效量”和“治療有效量”當用於涉及包含一種或多種結合蛋白的醫藥組合物時，是指足以產生所需治療結果的量或劑量。更具體地說，治療有效量是足以抑制與待治療病况相關的一個或多個臨床上確定的病理過程達一定時間的結合蛋白的量。有效量可隨所使用的具體結合蛋白而變化，也可取决于與受治療患者相關的各種因素和狀况和病症的嚴重程度。例如，如果結合蛋白是進行體內投予，則例如患者的年齡、體重和健康狀况以及在臨床前動物研究中獲得的劑量反應曲綫和毒性數據等因素將在所考慮的那些因素內。給定醫藥組合物的有效量或治療有效量的確定完全在本領域技術人員的能力範圍內。
本發明的一個實施方案提供包含藥學上可接受的載劑和治療有效量的結合蛋白的醫藥組合物。
三特異性和/或三價結合蛋白
在一些實施方案中，本發明的結合蛋白是三特異性和/或三價結合蛋白，其包含形成3個抗原結合位點的4條多肽鏈，所述3個抗原結合位點特異性結合一個或多個(例如3個不同的)HIV靶蛋白，其中第一多肽鏈包含如下式表示的結構：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽鏈包含如下式表示的結構：
VH1-L3-VH2-L4-CH1 [II]
且第三多肽鏈包含如下式表示的結構：
VH3-CH1 [III]
且第四多肽鏈包含如下式表示的結構：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變域；
VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變域；
VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變域；
VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變域；
VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變域；
VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變域；
CL是免疫球蛋白輕鏈恒定域；
CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恒定域；且
L1、L2、L3和L4是胺基酸連接子；
且其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對。
在一些實施方案中，本發明的結合蛋白是三特異性和/或三價結合蛋白，其包含形成3個抗原結合位點的4條多肽鏈，所述3個抗原結合位點特異性結合一個或多個(例如3個不同的)HIV靶蛋白，其中第一多肽鏈包含如下式表示的結構：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽鏈包含如下式表示的結構：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [II]
且第三多肽鏈包含如下式表示的結構：
VH3-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [III]
且第四多肽鏈包含如下式表示的結構：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變域；
VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變域；
VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變域；
VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變域；
VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變域；
VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變域；
CL是免疫球蛋白輕鏈恒定域；
CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恒定域；
CH2是免疫球蛋白CH2重鏈恒定域；
CH3是免疫球蛋白CH3重鏈恒定域；
鉸鏈是連接CH1和CH2域的免疫球蛋白鉸鏈區；且
L1、L2、L3和L4是胺基酸連接子；
且其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對。
在一些實施方案中，所述第一多肽鏈和第二多肽鏈具有交叉取向，其形成兩個不同的抗原結合位點。在一些實施方案中，VH1和VL1形成結合對並形成第一抗原結合位點。在一些實施方案中，VH2和VL2形成結合對並形成第二抗原結合位點。在一些實施方案中，所述第三和第四多肽形成第三抗原結合位點。在一些實施方案中，VH3和VL3形成結合對並形成第三抗原結合位點。
在一些實施方案中，VL1、VL2和VL3各自獨立地是衍生自SEQ ID NO：2、4、10、12、18、20、26、28、34、36、42、44、50、52、58、60、66、68、74、76、82、84、90、92、98、100、106、108、114、116、122、124、130、132、138、140、146、148、154、156、162、164、170、172、178、180、186、188、194、196、202、204、210、212、218、220、226、228、233、235、241、243任一項所示胺基酸序列的可變域；且VH1、VH2和VH3各自獨立地是衍生自SEQ ID NO：1、3、9、11、17、10、25、27、33、35、41、43、49、51、57、59、65、67、73、75、81、83、89、91、97、99、105、107、113、115、121、123、129、131、137、139、145、
147、153、155、161、163、169、171、177、179、185、187、193、195、201、203、209、211、217、219、225、227、232、234、240、242任一項所示胺基酸序列的可變域。在其他實施方案中，VL1、VL2和VL3各自獨立地包含可變域的輕鏈互補决定區，所述可變域包含SEQ ID NO：266-283任一項中所示的胺基酸序列；且VH1、VH2和VH3各自獨立地包含可變域的重鏈互補决定區，所述可變域包含SEQ ID NO：248-265任一項中所示的胺基酸序列。在一些實施方案中，VL1、VL2和VL3各自獨立地是輕鏈可變域，所述輕鏈可變域包含本文所述的抗體CD4BS“a”、CD4BS“b”、MPER、MPER_100W、針對V1/V2的“a”、針對V1/V2的“b”、或針對V3(V3 directed)的輕鏈可變域序列。在一些實施方案中，VH1、VH2和VH3各自獨立地是重鏈可變域，所述重鏈可變域包含本文所述的抗體CD4BS“a”、CD4BS“b”、MPER、MPER_100W、針對V1/V2的“a”、針對V1/V2的“b”、或針對V3(V3 directed)的重鏈可變域序列。在一些實施方案中，VL1、VL2和VL3各自獨立地是輕鏈可變域，所述輕鏈可變域包含本文所述的抗體CD4BS“a”、CD4BS“b”、MPER、MPER_100W、針對V1/V2的“a”、針對V1/V2的“b”、或針對V3(V3 directed)的輕鏈可變域序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些實施方案中，VH1、VH2和VH3各自獨立地是重鏈可變域，所述重鏈可變域包含本文所述的抗體CD4BS“a”、CD4BS“b”、MPER、MPER_100W、針對V1/V2的“a”、針對V1/V2的“b”、或針對V3(V3 directed)的重鏈可變域序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。
在一些實施方案中，VL1、VL2和VL3各自獨立地是衍生自SEQ ID NO：303、305、311、313、319、321、327、329、335、337、343、345、351、353、359、361、367、369、375、377、383、385、391、393、399、401、407、409、415、417、423、425、431、433、439、441、447、449、455、457、463、465、471、473任一項所示胺基酸序列的可變域；且VH1、VH2和VH3各自獨立地是衍生自SEQ ID NO：302、304、310、312、318、320、326、328、334、336、342、344、350、352、358、360、366、368、374、376、382、384、390、392、398、400、406、408、414、416、422、424、430、432、438、440、446、448、454、456、462、464、470、472
任一項所示胺基酸序列的可變域。在其他實施方案中，VL1、VL2和VL3各自獨立地包含可變域的輕鏈互補决定區，所述可變域包含SEQ ID NO：266-271、275-277、488-496任一項中所示的胺基酸序列；且VH1、VH2和VH3各自獨立地包含可變域的重鏈互補决定區，所述可變域包含SEQ ID NO：248-253、257-259、479-487任一項中所示的胺基酸序列。
在具體的實施方案中，式I的多肽鏈或式II的多肽鏈中VH1和VH2域的順序是互相調換的(即順序顛倒)，並且因此VL1和VL2的順序也是互相調換的。
在一些實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：4的胺基酸序列或與SEQ ID NO：4的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：3的胺基酸序列或與SEQ ID NO：3的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：1的胺基酸序列或與SEQ ID NO：1的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：2的胺基酸序列或與SEQ ID NO：2的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
在一些實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：12的胺基酸序列或與SEQ ID NO：12的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：11的胺基酸序列或與SEQ ID NO：11的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：9的胺基酸序列或與SEQ ID NO：9的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：10的胺基酸序列或與SEQ ID NO：10的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
在其他實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：20的胺基酸序列或與SEQ ID NO：20的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：19的胺基酸序列或與SEQ ID NO：19的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：17的胺基酸序列或與SEQ ID NO：17的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：18的胺基酸序列或與SEQ ID NO：18的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
在其他實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：28的胺基酸序列或與SEQ ID NO：28的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列或與SEQ ID NO：27的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：25的胺基酸序列或與SEQ ID NO：25的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：26的胺基酸序列或與SEQ ID NO：26的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
在其他實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：36的胺基酸序列或與SEQ ID NO：36的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：35的胺基酸序列或與SEQ ID NO：35的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：33的胺基酸序列或與SEQ ID NO：33的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：34的胺基酸序列或與SEQ ID NO：34的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
在其他實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：44的胺基酸序列或與SEQ ID NO：44的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：43的胺基酸序列或與SEQ ID NO：43的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：41的胺基酸序列或與SEQ ID NO：41的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：42的胺基酸序列或與SEQ ID NO：42的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
在其他實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：52的胺基酸序列或與SEQ ID NO：52的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：51的胺基酸序列或與SEQ ID NO：51的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：49的胺基酸序列或與SEQ ID NO：49的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：50的胺基酸序列或與SEQ ID NO：50的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
在其他實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：60的胺基酸序
列或與SEQ ID NO：60的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：59的胺基酸序列或與SEQ ID NO：59的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：57的胺基酸序列或與SEQ ID NO：57的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：58的胺基酸序列或與SEQ ID NO：58的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
在其他實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：68的胺基酸序列或與SEQ ID NO：68的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：67的胺基酸序列或與SEQ ID NO：67的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：65的胺基酸序列或與SEQ ID NO：65的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：66的胺基酸序列或與SEQ ID NO：66的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
在其他實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：76的胺基酸序列或與SEQ ID NO：76的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：75的胺基酸序列或與SEQ ID NO：75的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：73的胺基酸序列或與SEQ ID NO：73的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：74的胺基酸序列或與SEQ ID NO：74的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
在其他實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：84的胺基酸序列或與SEQ ID NO：84的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：83的胺基酸序列或與SEQ ID NO：83的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：81的胺基酸序列或與SEQ ID NO：81的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：82的胺基酸序列或與SEQ ID NO：82的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
在其他實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：92的胺基酸序列或與SEQ ID NO：92的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第
二多肽鏈包含SEQ ID NO：91的胺基酸序列或與SEQ ID NO：91的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：89的胺基酸序列或與SEQ ID NO：89的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：90的胺基酸序列或與SEQ ID NO：90的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
在其他實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：100的胺基酸序列或與SEQ ID NO：100的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：99的胺基酸序列或與SEQ ID NO：99的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：97的胺基酸序列或與SEQ ID NO：97的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：98的胺基酸序列或與SEQ ID NO：98的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
在其他實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：108的胺基酸序列或與SEQ ID NO：108的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：107的胺基酸序列或與SEQ ID NO：107的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：105的胺基酸序列或與SEQ ID NO：105的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：106的胺基酸序列或與SEQ ID NO：106的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
在其他實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：116的胺基酸序列或與SEQ ID NO：116的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：115的胺基酸序列或與SEQ ID NO：115的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：113的胺基酸序列或與SEQ ID NO：113的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：114的胺基酸序列或與SEQ ID NO：114的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
在其他實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：124的胺基酸序列或與SEQ ID NO：124的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：123的胺基酸序列或與SEQ ID NO：123的
胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：121的胺基酸序列或與SEQ ID NO：121的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：122的胺基酸序列或與SEQ ID NO：122的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
在其他實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：132的胺基酸序列或與SEQ ID NO：132的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：131的胺基酸序列或與SEQ ID NO：131的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：129的胺基酸序列或與SEQ ID NO：129的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：130的胺基酸序列或與SEQ ID NO：130的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
在其他實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：140的胺基酸序列或與SEQ ID NO：140的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：139的胺基酸序列或與SEQ ID NO：139的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：137的胺基酸序列或與SEQ ID NO：137的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：138的胺基酸序列或與SEQ ID NO：138的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
在其他實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：148的胺基酸序列或與SEQ ID NO：148的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：147的胺基酸序列或與SEQ ID NO：147的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：145的胺基酸序列或與SEQ ID NO：145的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：146的胺基酸序列或與SEQ ID NO：146的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
在其他實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：156的胺基酸序列或與SEQ ID NO：156的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：155的胺基酸序列或與SEQ ID NO：155的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：
153的胺基酸序列或與SEQ ID NO：153的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：154的胺基酸序列或與SEQ ID NO：154的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
在其他實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：164的胺基酸序列或與SEQ ID NO：164的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：163的胺基酸序列或與SEQ ID NO：163的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：161的胺基酸序列或與SEQ ID NO：161的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：162的胺基酸序列或與SEQ ID NO：162的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
在其他實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：172的胺基酸序列或與SEQ ID NO：172的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：171的胺基酸序列或與SEQ ID NO：171的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：169的胺基酸序列或與SEQ ID NO：169的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：170的胺基酸序列或與SEQ ID NO：170的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
在其他實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：180的胺基酸序列或與SEQ ID NO：180的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：179的胺基酸序列或與SEQ ID NO：179的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：177的胺基酸序列或與SEQ ID NO：177的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：178的胺基酸序列或與SEQ ID NO：178的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
在其他實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：188的胺基酸序列或與SEQ ID NO：188的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：187的胺基酸序列或與SEQ ID NO：187的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：185的胺基酸序列或與SEQ ID NO：185的胺基酸序列至少95%相同的胺基
酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：186的胺基酸序列或與SEQ ID NO：186的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
在其他實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：196的胺基酸序列或與SEQ ID NO：196的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：195的胺基酸序列或與SEQ ID NO：195的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：193的胺基酸序列或與SEQ ID NO：193的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：194的胺基酸序列或與SEQ ID NO：194的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
在其他實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：204的胺基酸序列或與SEQ ID NO：204的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：203的胺基酸序列或與SEQ ID NO：203的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：201的胺基酸序列或與SEQ ID NO：201的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：202的胺基酸序列或與SEQ ID NO：202的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
在其他實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：212的胺基酸序列或與SEQ ID NO：212的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：211的胺基酸序列或與SEQ ID NO：211的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：209的胺基酸序列或與SEQ ID NO：209的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：210的胺基酸序列或與SEQ ID NO：210的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
在其他實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：220的胺基酸序列或與SEQ ID NO：220的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：219的胺基酸序列或與SEQ ID NO：219的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：217的胺基酸序列或與SEQ ID NO：217的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：218的胺基酸序列或與SEQ
ID NO：218的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
在其他實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：228的胺基酸序列或與SEQ ID NO：228的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：227的胺基酸序列或與SEQ ID NO：227的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：225的胺基酸序列或與SEQ ID NO：225的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：226的胺基酸序列或與SEQ ID NO：226的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
在其他實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：235的胺基酸序列或與SEQ ID NO：235的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：234的胺基酸序列或與SEQ ID NO：234的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：232的胺基酸序列或與SEQ ID NO：232的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：233的胺基酸序列或與SEQ ID NO：233的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
在其他實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：243的胺基酸序列或與SEQ ID NO：243的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：242的胺基酸序列或與SEQ ID NO：242的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：240的胺基酸序列或與SEQ ID NO：240的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：241的胺基酸序列或與SEQ ID NO：241的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
在另一個實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：305的胺基酸序列或與SEQ ID NO：305的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：304的胺基酸序列或與SEQ ID NO：304的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：302的胺基酸序列或與SEQ ID NO：302的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：303的胺基酸序列或與SEQ ID NO：303的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
在另一個實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：313的胺基酸序列或與SEQ ID NO：313的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：312的胺基酸序列或與SEQ ID NO：312的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：310的胺基酸序列或與SEQ ID NO：310的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：311的胺基酸序列或與SEQ ID NO：311的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
在另一個實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：321的胺基酸序列或與SEQ ID NO：321的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：320的胺基酸序列或與SEQ ID NO：320的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：318的胺基酸序列或與SEQ ID NO：318的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：319的胺基酸序列或與SEQ ID NO：319的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
在另一個實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：329的胺基酸序列或與SEQ ID NO：329的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：328的胺基酸序列或與SEQ ID NO：328的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：326的胺基酸序列或與SEQ ID NO：326的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：327的胺基酸序列或與SEQ ID NO：327的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
在另一個實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：337的胺基酸序列或與SEQ ID NO：337的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：336的胺基酸序列或與SEQ ID NO：336的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：334的胺基酸序列或與SEQ ID NO：334的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：335的胺基酸序列或與SEQ ID NO：335的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
在另一個實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：345的胺基
酸序列或與SEQ ID NO：345的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：344的胺基酸序列或與SEQ ID NO：344的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：342的胺基酸序列或與SEQ ID NO：342的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：343的胺基酸序列或與SEQ ID NO：343的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
在另一個實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：353的胺基酸序列或與SEQ ID NO：353的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：352的胺基酸序列或與SEQ ID NO：352的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：350的胺基酸序列或與SEQ ID NO：350的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：351的胺基酸序列或與SEQ ID NO：351的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
在另一個實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：361的胺基酸序列或與SEQ ID NO：361的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：360的胺基酸序列或與SEQ ID NO：360的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：358的胺基酸序列或與SEQ ID NO：358的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：359的胺基酸序列或與SEQ ID NO：359的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
在另一個實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：369的胺基酸序列或與SEQ ID NO：369的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：368的胺基酸序列或與SEQ ID NO：368的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：366的胺基酸序列或與SEQ ID NO：366的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：367的胺基酸序列或與SEQ ID NO：367的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
在另一個實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：377的胺基酸序列或與SEQ ID NO：377的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：376的胺基酸序列或與SEQ ID NO：376的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：374的胺基酸序列或與SEQ ID NO：374的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：375的胺基酸序列或與SEQ ID NO：375的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
在另一個實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：385的胺基酸序列或與SEQ ID NO：385的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：384的胺基酸序列或與SEQ ID NO：384的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：382的胺基酸序列或與SEQ ID NO：382的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：383的胺基酸序列或與SEQ ID NO：383的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
在另一個實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：393的胺基酸序列或與SEQ ID NO：393的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：392的胺基酸序列或與SEQ ID NO：392的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：390的胺基酸序列或與SEQ ID NO：390的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：391的胺基酸序列或與SEQ ID NO：391的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
在另一個實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：401的胺基酸序列或與SEQ ID NO：401的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：400的胺基酸序列或與SEQ ID NO：400的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：398的胺基酸序列或與SEQ ID NO：398的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：399的胺基酸序列或與SEQ ID NO：399的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
在另一個實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：409的胺基酸序列或與SEQ ID NO：409的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：408的胺基酸序列或與SEQ ID NO：408
的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：406的胺基酸序列或與SEQ ID NO：406的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：407的胺基酸序列或與SEQ ID NO：407的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
在另一個實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：417的胺基酸序列或與SEQ ID NO：417的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：416的胺基酸序列或與SEQ ID NO：416的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：414的胺基酸序列或與SEQ ID NO：414的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：415的胺基酸序列或與SEQ ID NO：415的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
在另一個實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：425的胺基酸序列或與SEQ ID NO：425的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：424的胺基酸序列或與SEQ ID NO：424的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：422的胺基酸序列或與SEQ ID NO：422的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：423的胺基酸序列或與SEQ ID NO：423的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
在另一個實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：433的胺基酸序列或與SEQ ID NO：433的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：432的胺基酸序列或與SEQ ID NO：432的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：430的胺基酸序列或與SEQ ID NO：430的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：431的胺基酸序列或與SEQ ID NO：431的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
在另一個實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：441的胺基酸序列或與SEQ ID NO：441的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：440的胺基酸序列或與SEQ ID NO：440的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID
NO：438的胺基酸序列或與SEQ ID NO：438的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：439的胺基酸序列或與SEQ ID NO：439的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
在另一個實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：449的胺基酸序列或與SEQ ID NO：449的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：448的胺基酸序列或與SEQ ID NO：448的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：446的胺基酸序列或與SEQ ID NO：446的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：447的胺基酸序列或與SEQ ID NO：447的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
在另一個實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：457的胺基酸序列或與SEQ ID NO：457的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：456的胺基酸序列或與SEQ ID NO：456的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：454的胺基酸序列或與SEQ ID NO：454的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：455的胺基酸序列或與SEQ ID NO：455的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
在另一個實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：465的胺基酸序列或與SEQ ID NO：465的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：464的胺基酸序列或與SEQ ID NO：464的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：462的胺基酸序列或與SEQ ID NO：462的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：463的胺基酸序列或與SEQ ID NO：463的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
在另一個實施方案中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：473的胺基酸序列或與SEQ ID NO：473的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：472的胺基酸序列或與SEQ ID NO：472的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：470的胺基酸序列或與SEQ ID NO：470的胺基酸序列至少95%相同的
胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：471的胺基酸序列或與SEQ ID NO：471的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
在其他實施方案中，本發明的結合蛋白是三特異性和/或三價結合蛋白，其包含形成3個抗原結合位點的4條多肽鏈，所述3個抗原結合位點特異性結合一個或多個(例如3個)HIV靶抗原，其中第一多肽鏈具有下式表示的結構：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽鏈具有下式表示的結構：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-鉸鏈-CH2-CH3(穴)[II]
且第三多肽鏈具有下式表示的結構：
VH3-CH1-鉸鏈-CH2-CH3(節) [III]
且第四多肽鏈具有下式表示的結構：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變域；
VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變域；
VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變域；
VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變域；
VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變域；
VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變域；
CL是免疫球蛋白輕鏈恒定域；
CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恒定域；且
L1、L2、L3和L4是胺基酸連接子；
且其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對。
在其他實施方案中，本發明的結合蛋白是三特異性和/或三價結合蛋白，其包含形成3個抗原結合位點的4條多肽鏈，所述3個抗原結合位點特異性結合一個或多個(例如3個)HIV靶抗原，其中第一多肽鏈具有下式表示的結構：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽鏈具有下式表示的結構：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-鉸鏈-CH2-CH3(節) [II]
且第三多肽鏈具有下式表示的結構：
VH3-CH1-鉸鏈-CH2-CH3(穴) [III]
且第四多肽鏈具有下式表示的結構：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變域；
VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變域；
VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變域；
VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變域；
VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變域；
VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變域；
CL是免疫球蛋白輕鏈恒定域；
CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恒定域；且
L1、L2、L3和L4是胺基酸連接子；
且其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對。
三特異性結合蛋白的其他實例
在一些實施方案中，VL1、VL2和VL3各自獨立地是包含SEQ ID NO：512、513、514、515、516、517、518、519、520和521中任一項所示胺基酸序列的可變域。在一些實施方案中，VL1、VL2和VL3各自獨立地是包含胺基酸序列的可變域，所述胺基酸序列與SEQ ID NO：512、513、514、515、516、517、518、519、520和521中任一項所示序列具有至少約80%、至少約81%、至少約82%、至少約83%、至少約84%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列同一性。
在一些實施方案中，VH1、VH2和VH3各自獨立地是包含SEQ ID NO：
502、503、504、505、506、507和508中任一項所示胺基酸序列的可變域。在一些實施方案中，VH1、VH2和VH3各自獨立地是包含胺基酸序列的可變域，所述胺基酸序列與SEQ ID NO：502、503、504、505、506、507和508中任一項所示序列具有至少約80%、至少約81%、至少約82%、至少約83%、至少約84%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列同一性。
在一些實施方案中，VL1、VL2和VL3分別包含如SEQ ID NO：518、519和512所示的胺基酸序列，且VH1、VH2和VH3分別包含如SEQ ID NO：504、506和502所示的胺基酸序列。在一些實施方案中，VL1、VL2和VL3分別包含如SEQ ID NO：518、519和513所示的胺基酸序列，且VH1、VH2和VH3分別包含如SEQ ID NO：504、506和503所示的胺基酸序列。在一些實施方案中，VL1、VL2和VL3分別包含如SEQ ID NO：519、518和513所示的胺基酸序列，且VH1、VH2和VH3分別包含如SEQ ID NO：506、504和503所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，VL1、VL2和VL3各自獨立地是包含輕鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的可變域，所述輕鏈可變域包含序列，該序列選自由下列組成之群組：SEQ ID NO：512、513、514、515、516、517、518、519、520和521。在一些實施方案中，VH1、VH2和VH3各自獨立地是包含重鏈可變域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的可變域，所述重鏈可變域包含序列，該序列選自由下列組成之群組：SEQ ID NO：502、503、504、505、506、507和508。在一些實施方案中，VL1、VL2和VL3各自獨立地是包含輕鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的可變域，所述輕鏈可變域包含表C中示出的輕鏈可變域序列。在一些實施方案中，VH1、VH2和VH3各自獨立地是包含重鏈可變域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的可變域，所述重鏈可變域包含表C中示出的重鏈可變域序列。
在一些實施方案中，VL1是包含輕鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的可變域，所述輕鏈可變域包含SEQ ID NO：518的序列，VL2是
包含輕鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的可變域，所述輕鏈可變域包含SEQ ID NO：519的序列，VL3是包含輕鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的可變域，所述輕鏈可變域包含SEQ ID NO：512的序列，VH1是包含重鏈可變域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的可變域，所述重鏈可變域包含SEQ ID NO：504的序列，VH2是包含重鏈可變域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的可變域，所述重鏈可變域包含SEQ ID NO：506的序列，且VH3是包含重鏈可變域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的可變域，所述重鏈可變域包含SEQ ID NO：502的序列。在一些實施方案中，VL1是包含輕鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的可變域，所述輕鏈可變域包含SEQ ID NO：518的序列，VL2是包含輕鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的可變域，所述輕鏈可變域包含SEQ ID NO：519的序列，VL3是包含輕鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的可變域，所述輕鏈可變域包含SEQ ID NO：513的序列，VH1是包含重鏈可變域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的可變域，所述重鏈可變域包含SEQ ID NO：504的序列，VH2是包含重鏈可變域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的可變域，所述重鏈可變域包含SEQ ID NO：506的序列，且VH3是包含重鏈可變域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的可變域，所述重鏈可變域包含SEQ ID NO：503的序列。在一些實施方案中，VL1是包含輕鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的可變域，所述輕鏈可變域包含SEQ ID NO：519的序列，VL2是包含輕鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的可變域，所述輕鏈可變域包含SEQ ID NO：518的序列，VL3是包含輕鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的可變域，所述輕鏈可變域包含SEQ ID NO：513的序列，且VH1是包含重鏈可變域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的可變域，所述重鏈可變域包含SEQ ID NO：506的序列，VH2是包含重鏈可變域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的可變域，所述重鏈可變域包含SEQ ID NO：504的序列，且VH3是包含重鏈可變域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的可變域，所述重鏈可變域包含SEQ ID NO：503的序列。
在一些實施方案中，VL1、VL2和VL3各自獨立地是包含如下的可變域：
(a)包含選自下組的序列的CDR-L1：SEQ ID NO：266、269、275、278、281和500；(b)包含選自下組的序列的CDR-L2：SEQ ID NO：267、270、276、279、282和501；和/或(c)包含選自下組的序列的CDR-L3：SEQ ID NO：268、271、274、277、280和283。在一些實施方案中，VL1、VL2和VL3各自獨立地是包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的可變域，所述CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3包含表B中所示的胺基酸序列。在一些實施方案中，VL1、VL2和VL3各自獨立地是包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的可變域，所述CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3分別包含SEQ ID NO：266、267和268中所示序列；分別包含SEQ ID NO：269、270和271中所示序列；分別包含SEQ ID NO：500、501和274中所示序列；分別包含SEQ ID NO：275、276和277中所示序列；分別包含SEQ ID NO：281、282和283中所示序列；或分別包含SEQ ID NO：278、279和280中所示序列。
在一些實施方案中，VH1、VH2和VH3各自獨立地是包含如下的可變域：(a)包含選自下組的序列的CDR-H1：SEQ ID NO：248、251、254、257、263和499；(b)包含選自下組的序列的CDR-H2：SEQ ID NO：252、255、258、261、264和497；和/或(c)包含選自下組的序列的CDR-H3：SEQ ID NO：250、253、256、259、262、265和498。在一些實施方案中，VH1、VH2和VH3各自獨立地是包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的可變域，所述CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3包含如表B中所示的胺基酸序列。在一些實施方案中，VH1、VH2和VH3各自獨立地是包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的可變域，其分別包含SEQ ID NO：248、497和250中所示序列；分別包含SEQ ID NO：251、252和253中所示序列；分別包含SEQ ID NO：254、255和256中所示序列；分別包含SEQ ID NO：254、255和498中所示序列；分別包含SEQ ID NO：257、258和259中所示序列；分別包含SEQ ID NO：263、264和265中所示序列；或分別包含SEQ ID NO：499、261和262中所示序列。
在一些實施方案中，VL1包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其分別包含SEQ ID NO：500、501和274的序列；VL2包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其分別包含SEQ ID NO：275、276和277的序列；VL3包含
CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其分別包含SEQ ID NO：266、267和268的序列；VH1包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其分別包含SEQ ID NO：254、255和256的序列；VH2包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其分別包含SEQ ID NO：257、258和259的序列；且VH3包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其分別包含SEQ ID NO：248、497、250的序列。在一些實施方案中，VL1包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其分別包含SEQ ID NO：500、501和274的序列；VL2包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其分別包含SEQ ID NO：275、276和277的序列；VL3包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其分別包含SEQ ID NOs：269、270和271的序列；VH1包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其分別包含SEQ ID NO：254、255和256；VH2包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其分別包含SEQ ID NO：257、258和259的序列；且VH3包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其分別包含SEQ ID NO：251、252和253。在一些實施方案中，VL1包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其分別包含SEQ ID NO：275、276和277的序列；VL2包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其分別包含SEQ ID NO：500、501和274的序列；VL3包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其分別包含SEQ ID NO：269、270和271；VH1包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其分別包含SEQ ID NO：257、258和259的序列；VH2包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其分別包含SEQ ID NO：254、255和256；且VH3包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其分別包含SEQ ID NO：251、252和253。
靶向一個或多個HIV靶蛋白和一個或多個T細胞靶蛋白的其他三特異性結合蛋白
在一些實施方案中，本發明的結合蛋白包含形成3個抗原結合位點的4條多肽鏈，所述3個抗原結合位點特異性結合一個或多個(例如1個或2個)HIV靶蛋白和一個或多個(例如1個或2個)T細胞靶蛋白，其中第一多肽鏈具有下式表示的結構：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]；
第二多肽鏈具有下式表示的結構：
VH1-L3-VH2-L4-CH1 [II]；
第三多肽鏈具有下式表示的結構：
VH3-CH1 [III]；
且四多肽鏈具有下式表示的結構：
VL3-CL [IV]；
其中
VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變域；
VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變域；
VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變域；
VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變域；
VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變域；
VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變域；
CL是免疫球蛋白輕鏈恒定域；
CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恒定域；且
L1、L2、L3和L4是胺基酸連接子；
且其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對。
在一些實施方案中，本發明的結合蛋白包含形成3個抗原結合位點的4條多肽鏈，所述3個抗原結合位點特異性結合一個或多個(例如1個或2個)HIV靶蛋白和一個或多個(例如1個或2個)T細胞靶蛋白，其中第一多肽鏈具有下式表示的結構：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]；
第二多肽鏈具有下式表示的結構：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [II]；
第三多肽鏈具有下式表示的結構：
VH3-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [III]；
且第四多肽鏈具有下式表示的結構：
VL3-CL [IV]；
其中
VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變域；
VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變域；
VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變域；
VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變域；
VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變域；
VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變域；
CL是免疫球蛋白輕鏈恒定域；
CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恒定域；
CH2是免疫球蛋白CH2重鏈恒定域；
CH3是免疫球蛋白CH3重鏈恒定域；
鉸鏈是連接CH1和CH2域的免疫球蛋白鉸鏈區；且
L1、L2、L3和L4是胺基酸連接子；
且其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對。
在一些實施方案中，所述第一多肽鏈和第二多肽鏈具有交叉取向，其形成2個獨特的抗原結合位點。在一些實施方案中，VH1和VL1形成結合對且形成第一抗原結合位點。在一些實施方案中，VH2和VL2形成結合對且形成第二抗原結合位點。在一些實施方案中，所述第三多肽和第四多肽形成第三抗原結合位點。在一些實施方案中，VH3和VL3形成結合對且形成第三抗原結合位點。
在一些實施方案中，VL1、VL2和VL3各自獨立地是包含SEQ ID NO：512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523和524中任一項所示胺基酸序列的可變域。在一些實施方案中，VL1、VL2和VL3各自獨立地是包含胺基酸序列的可變域，所述胺基酸序列與SEQ ID NO：512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523和524中任一項所示序列具有至少約80%、至少約81%、至少約82%、至少約83%、至少約84%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列同一性。
在一些實施方案中，VH1、VH2和VH3各自獨立地是包含SEQ ID NO：502、503、504、505、506、507、508、509、510和511中任一項所示胺基酸序列的可變域。在一些實施方案中，VH1、VH2和VH3各自獨立地是包含胺基酸序列的可變域，所述胺基酸序列與SEQ ID NO：502、503、504、505、506、507、508、509、510和511中任一項所示序列具有至少約80%、至少約81%、至少約82%、至少約83%、至少約84%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列同一性。
在一些實施方案中，VL1、VL2和VL3分別包含SEQ ID NO：522、524和513所示的胺基酸序列；且VH1、VH2和VH3分別包含SEQ ID NO：509、511和503所示的胺基酸序列。在一些實施方案中，VL1、VL2和VL3分別包含SEQ ID NO：524、522和513所示的胺基酸序列；且VH1、VH2和VH3分別包含SEQ ID NO：511、509和503所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，VL1、VL2和VL3各自獨立地是包含輕鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的可變域，所述輕鏈可變域包含序列，該序列選自由下列組成之群組：SEQ ID NO：512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523和524。
在一些實施方案中，VH1、VH2和VH3各自獨立地是包含重鏈可變域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的可變域，所述重鏈可變域包含序列，該序列選自由下列組成之群組：SEQ ID NO：502、503、504、505、506、507、508、509、510和511。
在一些實施方案中，VL1是包含輕鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的可變域，所述輕鏈可變域包含SEQ ID NO：522的序列，VL2是包含輕鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的可變域，所述輕鏈可變域包含SEQ ID NO：524的序列，VL3是包含輕鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的可變域，所述輕鏈可變域包含SEQ ID NO：513的序列，VH1是包含重鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3可變域，所述重鏈可變域包含SEQ ID NO：509的序列，VH2是包含重鏈可變域的CDR-
L1、CDR-L2和CDR-L3可變域，所述重鏈可變域包含SEQ ID NO：511的序列，且VH3是包含重鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3可變域，所述重鏈可變域包含SEQ ID NO：503的序列。在一些實施方案中，VL1是包含輕鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的可變域，所述輕鏈可變域包含SEQ ID NO：524的序列，VL2是包含輕鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的可變域，所述輕鏈可變域包含SEQ ID NO：522的序列，VL3是包含輕鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的可變域，所述輕鏈可變域包含SEQ ID NO：513的序列，VH1是包含重鏈可變域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的可變域，所述重鏈可變域包含SEQ ID NO：511的序列，VH2是包含重鏈可變域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的可變域，所述重鏈可變域包含SEQ ID NO：509的序列，且VH3是包含重鏈可變域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的可變域，所述重鏈可變域包含SEQ ID NO：503的序列。
在一些實施方案中，VL1、VL2和VL3各自獨立地是包含如下的可變域：(a)包含選自下組的序列的CDR-L1：SEQ ID NO：266、269、275、278、281、488、491、494和500；(b)包含選自下組的序列的CDR-L2：SEQ ID NO：267、270、276、279、282、489、492、495和501，和(c)包含選自下組的序列的CDR-L3：SEQ ID NO：268、271、274、277、280、283、490、493和496。在一些實施方案中，VL1、VL2和VL3各自獨立地是包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的可變域，所述CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3包含如表B中所示的胺基酸序列。在一些實施方案中，VL1、VL2和VL3各自獨立地是包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的可變域，所述CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3分別包含SEQ ID NO：266、267和268所示的序列；分別包含SEQ ID NO：269、270和271中所示序列；分別包含SEQ ID NO：500、501和274中所示序列；分別包含SEQ ID NO：275、276和277中所示序列；分別包含SEQ ID NO：281、282和283中所示序列；分別包含SEQ ID NO：278、279和280中所示序列；分別包含SEQ ID NO：488、489和490中所示序列；分別包含SEQ ID NO：491、492和493中所示序列；或分別包含SEQ ID NO：494、495和496中所示序列。
在一些實施方案中，VH1、VH2和VH3各自獨立地是包含如下的可變域：(a)包含選自下組的序列的CDR-H1：SEQ ID NO：248、251、254、257、263、479、482、485和499；(b)包含選自下組的序列的CDR-H2：SEQ ID NO：252、255、258、261、264、480、483、486和497；和(c)包含選自下組的序列的CDR-H3：SEQ ID NO：250、253、256、259、262、265、481、484、487和498。在一些實施方案中，VH1、VH2和VH3各自獨立地是包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的可變域，所述CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3包含如表B中所示的胺基酸序列。在一些實施方案中，VH1、VH2和VH3各自獨立地是包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的可變域，所述CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3分別包含SEQ ID NO：248、497和250中所示序列；分別包含SEQ ID NO：251、252和253中所示序列；分別包含SEQ ID NO：254、255和256中所示序列；分別包含SEQ ID NO：254、255和498中所示序列；分別包含SEQ ID NO：257、258和259中所示序列；分別包含SEQ ID NO：263、264和265中所示序列；分別包含SEQ ID NO：499、261和262中所示序列；分別包含SEQ ID NO：479、480和481中所示序列；分別包含SEQ ID NO：482、483和484中所示序列；或分別包含SEQ ID NO：485、486和487中所示序列。
在一些實施方案中，VL1包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其分別包含SEQ ID NO：488、489和490的序列；VL2包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其分別包含ID NO：494、495和496的序列；VL3包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其分別包含SEQ ID NO：269、270和271的序列；VH1包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其分別包含SEQ ID NO：479、480和481的序列；VH2包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其分別包含SEQ ID NO：485、486和487的序列；且VH3包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其分別包含SEQ ID NO：251、252和253的序列。在一些實施方案中，VL1包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其分別包含SEQ ID NO：494、495和496的序列；VL2包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其分別包含SEQ ID NO：488、489和490的序列；VL3包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其分別包含SEQ ID NO：269、270和271的序列；VH1包含
CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其分別包含SEQ ID NO：485、486和487的序列；VH2包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其分別包含SEQ ID NO：479、480和481的序列；且VH3包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其分別包含SEQ ID NO：251、252和253的序列。
在一些實施方案中，VL1和VH1是輕鏈和重鏈可變域，其包含本文所述的抗體CD28或CD28_2的輕鏈和重鏈可變序列，VL2和VH2是輕鏈和重鏈可變域，其包含本文所述的抗體CD3的輕鏈和重鏈可變序列，且VL3和VH3是輕鏈和重鏈可變域，其包含本文所述的抗體CD4BS“a”、CD4BS“b”、MPER、MPER_100W、針對V1/V2的“a”、針對V1/V2的“b”、或針對V3(V3 directed)的輕鏈和重鏈可變序列。在一些實施方案中，VL1和VH1是輕鏈和重鏈可變域，其包含本文所述的抗體CD28或CD28_2的6個CDR，VL2和VH2是輕鏈和重鏈可變域，其包含本文所述的抗體CD3的6個CDR，且VL3和VH3是輕鏈和重鏈可變域，其包含本文所述的抗體CD4BS“a”、CD4BS“b”、MPER、MPER_100W、針對V1/V2的“a”、針對V1/V2的“b”、或針對V3(V3 directed)的6個CDR。
在一些實施方案中，VL1和VH1是輕鏈和重鏈可變域，其包含本文所述的抗體CD28或CD28_2的輕鏈和重鏈可變序列，VL2和VH2是輕鏈和重鏈可變域，其包含本文所述的抗體CD4BS“a”、CD4BS“b”、MPER、MPER_100W、針對V1/V2的“a”、針對V1/V2的“b”、或針對V3(V3 directed)的輕鏈和重鏈可變序列，且VL3和VH3是輕鏈和重鏈可變域，其包含本文所述的抗體CD3的輕鏈和重鏈可變序列。在一些實施方案中，VL1和VH1是輕鏈和重鏈可變域，其包含本文所述的抗體CD28或CD28_2的6個CDR，VL2和VH2是輕鏈和重鏈可變域，其包含本文所述的抗體CD4BS“a”、CD4BS“b”、MPER、MPER_100W、針對V1/V2的“a”、針對V1/V2的“b”、或針對V3(V3 directed)的6個CDR，且VL3和VH3是輕鏈和重鏈可變域，其包含本文所述的抗體CD3的6個CDR。
在一些實施方案中，VL1和VH1是輕鏈和重鏈可變域，其包含本文所述的抗體CD3的輕鏈和重鏈可變序列，VL2和VH2是輕鏈和重鏈可變域，其包含本文所述的抗體CD28或CD28_2的輕鏈和重鏈可變序列，且VL3
和VH3是輕鏈和重鏈可變域，其包含本文所述的抗體CD4BS“a”、CD4BS“b”、MPER、MPER_100W、針對V1/V2的“a”、針對V1/V2的“b”、或針對V3(V3 directed)的輕鏈和重鏈可變序列。在一些實施方案中，VL1和VH1是輕鏈和重鏈可變域，其包含本文所述的抗體CD3的6個CDR，VL2和VH2是輕鏈和重鏈可變域，其包含本文所述的抗體CD28或CD28_2的6個CDR，且VL3和VH3是輕鏈和重鏈可變域，其包含本文所述的抗體CD4BS“a”、CD4BS“b”、MPER、MPER_100W、針對V1/V2的“a”、針對V1/V2的“b”、或針對V3(V3 directed)的6個CDR。
在一些實施方案中，VL1和VH1是輕鏈和重鏈可變域，其包含本文所述的抗體CD3的輕鏈和重鏈可變序列，VL2和VH2是輕鏈和重鏈可變域，其包含本文所述的抗體CD4BS“a”、CD4BS“b”、MPER、MPER_100W、針對V1/V2的“a”、針對V1/V2的“b”、或針對V3(V3 directed)的輕鏈和重鏈可變序列，且VL3和VH3是輕鏈和重鏈可變域，其包含本文所述的抗體CD28或CD28_2的輕鏈和重鏈可變序列。在一些實施方案中，VL1和VH1是輕鏈和重鏈可變域，其包含本文所述的抗體CD3的6個CDR，VL2和VH2是輕鏈和重鏈可變域，其包含本文所述的抗體CD4BS“a”、CD4BS“b”、MPER、MPER_100W、針對V1/V2的“a”、針對V1/V2的“b”、或針對V3(V3 directed)的6個CDR，且VL3和VH3是輕鏈和重鏈可變域，其包含本文所述的抗體CD28或CD28_2的6個CDR。
在一些實施方案中，VL1和VH1是輕鏈和重鏈可變域，其包含本文所述的抗體CD4BS“a”、CD4BS“b”、MPER、MPER_100W、針對V1/V2的“a”、針對V1/V2的“b”、或針對V3(V3 directed)的輕鏈和重鏈可變序列，VL2和VH2是輕鏈和重鏈可變域，其包含本文所述的抗體CD28或CD28_2的輕鏈和重鏈可變序列，且VL3和VH3是輕鏈和重鏈可變域，其包含本文所述的抗體CD3的輕鏈和重鏈可變序列。在一些實施方案中，VL1和VH1是輕鏈和重鏈可變域，其包含本文所述的抗體CD4BS“a”、CD4BS“b”、MPER、MPER_100W、針對V1/V2的“a”、針對V1/V2的“b”、或針對V3(V3 directed)的6個CDR，VL2和VH2是輕鏈和重鏈可變域，其包含本文所述的抗體CD28或CD28_2的6個CDR，且VL3和VH3是輕鏈和重鏈可變
域，其包含本文所述的抗體CD3的6個CDR。
在一些實施方案中，VL1和VH1是輕鏈和重鏈可變域，其包含本文所述的抗體CD4BS“a”、CD4BS“b”、MPER、MPER_100W、針對V1/V2的“a”、針對V1/V2的“b”、或針對V3(V3 directed)的輕鏈和重鏈可變序列，VL2和VH2是輕鏈和重鏈可變域，其包含本文所述的抗體CD3的輕鏈和重鏈可變序列，且VL3和VH3是輕鏈和重鏈可變域，其包含本文所述的抗體CD28或CD28_2的輕鏈和重鏈可變序列。在一些實施方案中，VL1和VH1是輕鏈和重鏈可變域，其包含本文所述的抗體CD4BS“a”、CD4BS“b”、MPER、MPER_100W、針對V1/V2的“a”、針對V1/V2的“b”、或針對V3(V3 directed)的6個CDR，VL2和VH2是輕鏈和重鏈可變域，其包含本文所述的抗體CD3的6個CDR，且VL3和VH3是輕鏈和重鏈可變域，其包含本文所述的抗體CD28或CD28_2的6個CDR。
靶蛋白
在一個實施方案中，結合蛋白特異性結合至一個或多個HIV靶蛋白。在一些實施方案中，所述結合蛋白是三特異性的且特異性結合至HIV-1 gp41蛋白的MPER、HIV-1 gp120蛋白的CD4結合位點、HIV-1 gp120蛋白的V3環中的聚糖、HIV-1 gp120蛋白或gp160的三聚體尖端。在其他實施方案中，所述結合蛋白特異性結合至一個或多個HIV靶蛋白及一個或多個T細胞上的靶蛋白，包括T細胞受體複合體。這些T細胞銜接體結合蛋白能將T細胞瞬時招募至靶細胞，並同時激活T細胞的溶胞活性。T細胞銜接體三特異性抗體能用於激活HIV-1庫(reservoirs)及重定向/激活T細胞以裂解潜伏感染的HIV-1+ T細胞。T細胞上的靶蛋白的實例包括但不限于CD3和CD28，以及其他。在一些實施方案中，三特異性結合蛋白可以通過將一個或多個單特異性抗體(親本抗體)的抗原結合域組合入一個抗體中而產生。參見國際公開號WO 2011/038290 A2、WO 2013/086533 A1、WO 2013/070776 A1、WO 2012/154312 A1和WO 2013/163427 A1，其在此通過提述以其整體並入本文。本發明的結合蛋白可以用獲取自或來源于人或非人抗體(包括例如人、鼠、或人源化抗體)的域或序列來製備。
在本發明的一些實施方案中，三價結合蛋白能結合三個不同的抗原靶標。在一些實施方案中，所述結合蛋白是三特異性的且一個輕鏈-重鏈對能結合兩個不同的抗原靶標或表位而一個輕鏈-重鏈對能結合一個抗原靶標或表位。在另一個實施方案中，所述結合蛋白能結合三個不同的HIV抗原靶標，所述HIV抗原靶標定位在由gp120和gp41亞基組成的HIV包膜糖蛋白結構上。在其他實施方案中，所述結合蛋白能抑制一個或多個抗原靶標的功能。
在一些實施方案中，本發明的結合蛋白結合一個或多個HIV靶蛋白。在一些實施方案中，所述結合蛋白能特異性結合單個HIV靶蛋白上三個不同表位。在一些實施方案中，所述結合蛋白能結合第一HIV靶蛋白上的兩個不同表位，以及第二HIV靶蛋白上的一個表位。在一些實施方案中，所述第一和第二HIV靶蛋白是不同的。在一些實施方案中，所述結合蛋白能特異性結合三個不同的HIV靶蛋白。在一些實施方案中，所述一個或多個HIV靶蛋白是糖蛋白120、糖蛋白41和糖蛋白160的一種或多種。
在一些實施方案中，本發明的結合蛋白結合一個或多個HIV靶蛋白及一個或多個T細胞靶蛋白。在一些實施方案中，所述結合蛋白能够特異性結合一個HIV靶蛋白和單個T細胞靶蛋白上的兩個不同表位。在一些實施方案中，所述結合蛋白能特異性結合一個HIV靶蛋白和兩個不同的T細胞靶蛋白(例如CD28和CD3)。在一些實施方案中，所述結合蛋白能特異性結合一個T細胞靶蛋白和單個HIV靶蛋白上的兩個不同表位。在一些實施方案中，所述結合蛋白能特異性結合一個T細胞靶蛋白和兩個不同的HIV靶蛋白。在一些實施方案中，所述結合蛋白的第一和第二多肽鏈形成兩個抗原結合位點，其特異性靶向兩種T細胞靶蛋白，而結合蛋白的第三和第四多肽鏈形成一個抗原結合位點，其特異性結合HIV靶蛋白。在一些實施方案中，所述一個或多個HIV靶蛋白是糖蛋白120、糖蛋白41和糖蛋白160的一種或多種。在一些實施方案中，所述一個或多個T細胞靶蛋白是CD3和CD28的一種或多種。
連接子
在一些實施方案中，連接子L1、L2、L3和L4範圍為無胺基酸(長度=0)至約100個胺基酸長，或低於100、50、40、30、20、或15個胺基酸或更少。連接子還可以是10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1個胺基酸長。一個結合蛋白中的L1、L2、L3和L4可以全部具有相同的胺基酸序列或具有不同的胺基酸序列。
合適的連接子包括單個甘胺酸(Gly)殘基；二甘胺酸(Gly-Gly)；三甘胺酸(Gly-Gly-Gly)；具有4個甘胺酸殘基的肽(Gly-Gly-Gly-Gly；SEQ ID NO：285)；具有5個甘胺酸殘基的肽(Gly-Gly-Gly-Gly-Gly；SEQ ID NO：286)；具有6個甘胺酸殘基的肽(Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly；SEQ ID NO：287)；具有7個甘胺酸殘基的肽(Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly；SEQ ID NO：288)；具有8個甘胺酸殘基的肽(Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly；SEQ ID NO：289)。還可以使用其他胺基酸殘基的組合，如肽Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：290)、肽Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：291)和肽Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：292)。其他合適的連接子包括單個Ser和Val殘基；二肽Arg-Thr、Gln-Pro、Ser-Ser、Thr-Lys和Ser-Leu；Thr-Lys-Gly-Pro-Ser(SEQ ID NO：293)、Thr-Val-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO：294)、Gln-Pro-Lys-Ala-Ala(SEQ ID NO：295)、Gln-Arg-Ile-Glu-Gly(SEQ ID NO：296)；Ala-Ser-Thr-Lys-Gly-Pro-Ser(SEQ ID NO：297)、Arg-Thr-Val-Ala-Ala-Pro-Ser(SEQ ID NO：298)、Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO：299)和His-Ile-Asp-Ser-Pro-Asn-Lys(SEQ ID NO：300)。上文列出的實例並非意欲以任何方式限制本發明的範圍，並且包含隨機選擇的胺基酸的連接子已顯示出適于所述結合蛋白，所述隨機選擇的胺基酸選自由下列組成之群組：纈胺酸，亮胺酸，異亮胺酸，絲胺酸，蘇胺酸，賴胺酸，精胺酸，組胺酸，天冬胺酸，谷胺酸，天冬醯胺，穀氨醯胺，甘胺酸和脯胺酸。
連接子中胺基酸殘基的序列和同一性可以取决于二級結構元件的類型而變化，所述二級結構元件是所述連接子中所必需達到的。例如，甘胺酸、絲胺酸和丙胺酸是具有最大柔性的最佳連接子。如果需要更剛性且延長的連接子，可以採用甘胺酸、脯胺酸、蘇胺酸和絲胺酸的一些組合。可
以考慮將任何胺基酸殘基與其他胺基酸組合作為連接子以構建更大的肽連接子，視所需特性的需要而定。
在一些實施方案中，L1的長度是L3的長度的至少兩倍。在一些實施方案中，L2的長度是L4的長度的至少兩倍。在一些實施方案中，L1的長度是L3的長度的至少兩倍，且L2的長度是L4的長度的至少兩倍。在一些實施方案中，L1長度是3至12個胺基酸殘基，L2長度是3至14個胺基酸殘基，L3長度是1至8個胺基酸殘基，L4長度是1至3個胺基酸殘基。在一些實施方案中，L1長度是5至10個胺基酸殘基，L2長度是5至8個胺基酸殘基，L3長度是1至5個胺基酸殘基，L4長度是1至2個胺基酸殘基。在一些實施方案中，L1長度是7個胺基酸殘基，L2長度是5個胺基酸殘基，L3長度是1個胺基酸殘基，L4長度是2個胺基酸殘基。
在一些實施方案中，L1、L2、L3和/或L4包含序列Asp-Lys-Thr-His-Thr(SEQ ID NO：525)。在一些實施方案中，L1包含序列Asp-Lys-Thr-His-Thr(SEQ ID NO：525)。在一些實施方案中，L3包含序列Asp-Lys-Thr-His-Thr(SEQ ID NO：525)。
在一些實施方案中，L1、L2、L3和/或L4包含序列Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO：299)。在一些實施方案中，L1包含序列Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO：299)。在一些實施方案中，L1包含序列Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO：299)，L2包含序列Thr-Lys-Gly-Pro-Ser-Arg(SEQ ID NO：526)，L3包含序列Ser，且L4包含序列Arg-Thr。在一些實施方案中，L3包含序列Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO：299)。在一些實施方案中，L1包含序列Ser，L2包含序列Arg-Thr，L3包含序列Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO：299)，且L4包含序列Thr-Lys-Gly-Pro-Ser-Arg(SEQ ID NO：526)。
Fc區和恒定域
在一些實施方案中，本發明的結合蛋白包含第二多肽鏈，所述第二多肽鏈還包含與CH1相連的Fc區，所述Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域。在一些實施方案中，本發明的結合蛋
白包含第三多肽鏈，所述第三多肽鏈還包含與CH1相連的Fc區，所述Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域。在一些實施方案中，本發明的結合蛋白包含第二多肽鏈和第三多肽鏈，所述第二多肽鏈還包含與CH1相連的Fc區，所述Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域，所述第三多肽鏈還包含與CH1相連的Fc區，所述Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域。
為了改進結合蛋白的產量，在一些實施方案中，可以通過“節-入-穴(knob-into-holes)”技術來改造CH3域，所述技術詳細描述于一些實例中，例如國際公開No.WO 96/027011，Ridgway等，1996,Protein Eng.9：617-21；和Merchant等，1998,Nat.Biotechnol.16：677-81中。具體而言，對兩個CH3域的相互作用表面進行改造以增加含有這兩個CH3域的兩條重鏈的異二聚體化。(兩條重鏈的)兩個CH3域各自可以是“節”，而另一個則是“穴”。導入二硫橋進一步將異二聚體穩定化並增加產量(Merchant等，1998；Atwell等，1997,J.Mol.Biol.270：26-35)。在具體的實施方案中，所述節在具有單一可變域的第二對多肽上在其他實施方案中，所述節在具有交叉取向的第一對多肽上。在另一些實施方案中，CH3域不包含節入穴。
在一些實施方案中，本發明的結合蛋白包含第二多肽鏈上的“節”突變和第三多肽鏈上的“穴”突變。在一些實施方案中，本發明的結合蛋白包含第三多肽鏈上的“節”突變和第二多肽鏈上的“穴”突變。在一些實施方案中，所述“節”突變在對應於人IgG1的位置354和366的位置處包含取代，所述位置根據EU索引。在一些實施方案中，所述胺基酸取代為S354C和T366W。在一些實施方案中，所述“穴”突變在對應於人IgG1的位置349、366、368和407的位置處包含取代，所述位置根據EU索引。在一些實施方案中，所述胺基酸取代為Y349C、T366S、L368A和Y407V。在一些實施方案中，所述第二多肽鏈還包含與CH1相連的第一Fc區，所述第一Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域，其中所述第一Fc區在對應於人IgG1的位置354和366的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為S354C和T366W；且其中第三多肽鏈還包含與CH1相連的第二Fc區，所述第二Fc區包含免疫球蛋
白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域，其中所述第二Fc區在對應於人IgG1的位置349、366、368和407的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為Y349C、T366S、L368A和Y407V。在一些實施方案中，所述第二多肽鏈還包含與CH1相連的第一Fc區，所述第一Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域，其中所述第一Fc區在對應於人IgG1的位置349、366、368和407的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為Y349C、T366S、L368A和Y407V；且其中所述第三多肽鏈還包含與CH1相連的第二Fc區，所述第二Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域，其中所述第二Fc區在對應於人IgG1的位置354和366的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為S354C和T366W。
在一些實施方案中，本發明的結合蛋白包含一個或多個突變以改進血清半衰期(參見例如Hinton,P.R.等(2006)J.Immunol.176(1)：346-56)。在一些實施方案中，所述突變在對應於人IgG1的位置428和434的位置處包含取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為M428L和N434S。在一些實施方案中，所述結合蛋白包含第二多肽鏈和第三多肽鏈，所述第二多肽鏈還包含與CH1相連的第一Fc區，所述第一Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域，所述第三多肽鏈還包含與CH1相連的第一Fc區，所述第一Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域，其中所述第一和第二Fc區在對應於人IgG1的位置428和434的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為M428L和N434S。在一些實施方案中，本發明的結合蛋白包含節和穴突變，以及一個或多個改進血清半衰期的突變。
在一些實施方案中，本文所述的三特異性結合蛋白的CH1、CH2、CH3和CL可以包含結合蛋白1-53的CH1、CH2、CH3和CL序列的任一者。
核酸
採用標準重組DNA方法來構建編碼形成所述結合蛋白的多肽的多核
苷酸，將這些多核苷酸摻入重組表現載體中，並將這類載體導入宿主細胞中。參見例如Sambrook等，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第三版)。酶促反應和純化技術可按照生產商的說明書、按本領域通常實現的或按本文描述的進行。除提供特定的定義外，與本文所述分析化學、合成有機化學及醫學和製藥化學的實驗室程序和技術聯用的術語是本領域熟知和常用的術語。類似地，常規技術可用於化學合成、化學分析、藥物製備、配製、遞送和患者治療。
本發明的其他態樣涉及單離的核酸分子，其包含編碼本文所述任何結合多肽的核苷酸序列。在一些實施方案中，所述分離核酸可操作地連接至異源性啟動子以指導編碼結合蛋白的核酸序列的轉錄。啟動子可以指指導核酸轉錄的核酸控制序列。當第一核酸序列置于與第二核酸序列的功能性聯繫中時，則第一核酸序列可操作地連接至第二核酸序列。例如，如果啟動子影響該編碼序列的轉錄或表現，則所述啟動子可操作地連接至結合蛋白的編碼序列。啟動子的實例包括但不限于自病毒基因組獲得的啟動子(如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細胞病毒、逆轉錄病毒、乙型肝炎病毒、猿猴病毒40(SV40)等等)，來自異源真核啟動子(如肌動蛋白啟動子、免疫球蛋白啟動子、來自熱休克啟動子，等等)，CAG-啟動子(Niwa等，Gene 108(2)：193-9,1991)，磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動子，四環素誘導型啟動子(Masui等，Nucleic Acids Res.33：e43,2005)，lac系統，trp系統，tac系統，trc系統，噬菌體λ的主要操縱基因和啟動子區，3-磷酸甘油酸激酶的啟動子，酵母酸性磷酸酶的啟動子，和酵母α-交配因子的啟動子。編碼本發明結合蛋白的多核苷酸可以受到如下啟動子的控制：組成型啟動子、誘導型啟動子、或本文描述的任何其他合適的啟動子或本領域技術人員容易公認的其他合適的啟動子。
在一些實施方案中，分離核酸被摻入至載體中。在一些實施方案中，所述載體是表現載體。表現載體可以包括一個或多個可操作地連接至待表現多核苷酸的調控序列。術語“調控序列”包括啟動子、增强子和其他表現控制元件(例如多腺苷酸化信號)。合適的增强子的實例包括但不限于來自哺乳動物基因(例如球蛋白，彈性蛋白酶，白蛋白，甲胎蛋白(α-fetoprotein)，
胰島素等等)的增强子，以及來自真核細胞病毒的增强子序列(如位於複製起點的晚期側(late side)的SV40增强子(bp 100-270)，巨細胞病毒早期啟動子增强子，如位於複製起點的晚期側的多瘤病毒增强子，腺病毒增强子等等)。合適的載體的實例可以包括例如質體、粘粒、附加體、轉座子和病毒載體(例如腺病毒，牛痘病毒，辛德畢斯病毒(Sindbis-viral)，麻疹病毒，疱疹病毒，慢病毒，逆轉錄病毒，腺相關病毒載體等)。表現載體可用於轉染宿主細胞，如例如細菌細胞、酵母細胞、昆蟲細胞和哺乳動物細胞。能在宿主中表現和複製的生物功能性病毒和質體DNA載體是本領域已知的，並能用於轉染任何目的細胞。
本發明的其他態樣涉及包含一個或多個載體的載體系統，其編碼本文所述的任意結合蛋白的第一、第二、第三和第四多肽鏈。在一些實施方案中，所述載體系統包含編碼結合蛋白的第一多肽鏈的第一載體，編碼結合蛋白的第二多肽鏈的第二載體，編碼結合蛋白的第三多肽鏈的第三載體，和編碼結合蛋白的第四多肽鏈的第四載體。在一些實施方案中，載體系統包含編碼結合蛋白的第一和第二多肽鏈的第一載體，以及編碼結合蛋白的第三和第四多肽鏈的第二載體。在一些實施方案中，載體系統包含編碼結合蛋白的第一和第三多肽鏈的第一載體，以及編碼結合蛋白的第二和第四多肽鏈的第二載體。在一些實施方案中，載體系統包含編碼結合蛋白的第一和第四多肽鏈的第一載體，以及編碼結合蛋白的第二和第三多肽鏈的第二載體。在一些實施方案中，載體系統包含編碼結合蛋白的第一、第二、第三和第四多肽鏈的第一載體。載體系統的一個或多個載體可以是本文所述的任何載體。在一些實施方案中，所述一個或多個載體是表現載體。
宿主細胞
本發明的其他態樣涉及包含一個或多個本文所述單離的多核苷酸、載體和/或載體系統的宿主細胞(例如單離的的宿主細胞)。在一些實施方案中，本發明的單離的的宿主細胞是體外培養的。在一些實施方案中，宿主細胞是細菌細胞(例如大腸杆菌(E.coli)細胞)。在一些實施方案中，宿主細胞是酵母細胞(例如釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞)。在一些實施方案中，宿主
細胞是昆蟲細胞。昆蟲細胞的實例可以包括例如果蠅(Drosophila)細胞(例如S2細胞)，粉紋夜蛾(Trichoplusiani)細胞(例如High FiveTM細胞)，和草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞(例如Sf21或Sf9細胞)。在一些實施方案中，宿主細胞是哺乳動物細胞。哺乳動物宿主細胞的實例可以包括例如人胚腎細胞(例如293或經亞克隆用於在懸浮培養中生長的293細胞)，Expi293TM細胞，CHO細胞，幼倉鼠腎細胞(例如BHK，ATCC CCL 10)，小鼠sertoli細胞(例如TM4細胞)，猴腎細胞(例如CV1 ATCC CCL 70)，非洲綠猴腎細胞(例如VERO-76，ATCC CRL-1587)，人宮頸癌細胞(例如HELA，ATCC CCL2)，犬腎細胞(例如MDCK，ATCC CCL 34)，布法羅大鼠肝細胞(例如BRL 3A，ATCC CRL 1442)，人肺細胞(例如W138，ATCC CCL 75)，人肝細胞(例如Hep G2，HB 8065)，小鼠乳腺腫瘤細胞(例如MMT 060562，ATCC CCL51)，TRI細胞，MRC 5細胞，FS4細胞，人肝細胞瘤細胞系(例如Hep G2)，及骨髓瘤細胞(例如NS0和Sp2/0細胞)。
本發明的其他態樣涉及生產本文所述的任何結合蛋白的方法。在一些實施方案中，所述方法包括a)在適合宿主細胞表現所述結合蛋白的條件下培養包含分離核酸、載體和/或載體系統(例如本文所述的任何分離核酸、載體和/或載體系統)的宿主細胞(例如本文所述的任何宿主細胞)；和b)從宿主細胞分離所述結合蛋白。在適于表現蛋白的條件下培養宿主細胞的方法是本領域普通技術人員所熟知的。從培養的宿主細胞分離蛋白的方法是本領域普通技術人員所熟知的，其包括例如通過親和色譜(例如兩步親和色譜法，其包括蛋白A親和色譜，然後是大小排阻色譜)進行。
結合蛋白的用途
所述結合蛋白可應用於任何已知的測定方法，如競爭性結合測定法、直接和間接夾心測定法和用於一種或多種靶抗原的檢測和定量的免疫沉澱測定法。所述結合蛋白以適于所應用的測定方法的親和力結合一個或多個靶抗原。
對于診斷應用，在一些實施方案中，可以用可檢測模塊來標記結合蛋白。可檢測模塊可以是能够產生直接或間接的可檢測信號的任一種。例
如，可檢測模塊可以是放射性同位素，如3H、14C、32P、35S、125I、99Tc、111In、或67Ga；熒光或化學發光化合物，如異硫氰酸熒光素、羅丹明、或熒光素；或酶，如鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、或辣根過氧化物酶。
所述結合蛋白還可用於體內成像。可以將用可檢測模塊標記的結合蛋白投予于動物，例如使用至血液中，並測定宿主中帶標記的抗體的存在和定位。可以用動物中可檢測的任何模塊來標記結合蛋白，無論是通過核磁共振、放射學、或本領域所知的其他方法可檢測的。
本發明還涉及包含結合蛋白和其他試劑的套組，其可用於檢測生物樣品中的靶抗原水平。此類試劑包括可檢測標記、封閉血清、陽性和陰性對照樣品、以及檢測試劑。在一些實施方案中，套組包含組合物，所述組合物包含本文所述的任何結合蛋白、多核苷酸、載體、載體系統和/或宿主細胞。在一些實施方案中，套組包含容器及標簽或包裝插頁，其位於所述容器上或與容器相連。合適的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、IV溶液袋等。所述容器可由多種材料形成，如玻璃或塑料。所述容器盛有組合物，所述組合物是單獨的或與另一組合物組合，其對于治療、預防和/或診斷病况(例如HIV感染)是有效的，並且所述容器可以具有無菌入口(例如所述容器可以是靜脈內溶液袋或小瓶，其具有可由皮下注射針刺穿的塞子)。在一些實施方案中，所述標簽或包裝插頁說明了該組合物用於預防、診斷和/或治療選擇的病况。或者或此外，製品或套組還可以包含第二(或第三)容器，其包含藥學上可接受的緩衝劑，如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、Ringer's溶液和右旋糖溶液。其還可以包括從商業和用戶角度所需的其他材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑、濾器、針和注射器。
包含結合蛋白的治療性組合物或醫藥組合物在本發明的範圍內。此類治療性組合物或醫藥組合物可以包含治療有效量的結合蛋白、或結合蛋白-藥物綴合物，與藥學上或生理學上可接受的配製劑(其根據與投予模式的適應性而選出)混合。
可接受的配製材料在所採用的劑量和濃度處對于受試者是非毒性的。
所述醫藥組合物可以含有用於改變、維持、或保留組合物的例如pH、滲透壓(osmolarity)、粘度、澄清度、顏色、等張性、氣味、無菌度、穩定
度、溶解或釋放速率、吸附、或滲透的配製材料。合適的製劑材料包括但不限于胺基酸(例如甘胺酸、穀氨醯胺、天冬醯胺、精胺酸或賴胺酸)、抗微生物劑、抗氧化劑(例如抗壞血酸、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉)、緩衝劑(例如硼酸鹽、碳酸氫鹽、Tris-HCl、檸檬酸鹽、磷酸鹽或其它有機酸)、填充劑(例如甘露糖醇或甘胺酸)、螯合劑(例如乙二胺四乙酸(EDTA))、絡合劑(例如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-環糊精或羥丙基-β-環糊精)、填料、單糖、雙糖和其它碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖或糊精)、蛋白質(例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白)、著色劑、矯味劑和稀釋劑、乳化劑、親水聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮)、低分子量多肽、成鹽平衡離子(例如鈉)、防腐劑(例如苯扎氯銨、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞、苯乙醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或過氧化氫)、溶劑(例如甘油、丙二醇或聚乙二醇)、糖醇(例如甘露糖醇或山梨醇)、懸浮劑、表面活性劑或潤濕劑(例如普朗尼克類(pluronics)、PEG、山梨聚糖酯類(sorbitan esters)、聚山梨醇酯類如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80、triton、氨丁三醇、卵磷脂、膽固醇或tyloxapal)、穩定增强劑(如蔗糖或山梨醇)、張度增强劑(例如鹼金屬鹵化物(例如氯化鈉或氯化鉀)或甘露醇、山梨醇)、遞送介質、稀釋劑、賦形劑和/或藥學佐劑(參見例如REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES(第18版，A.R.Gennaro編，Mack Publishing Company 1990)和其後續版本，通過提述並入本文用於任何目的)。
根據例如所欲的投予途徑、遞送形式和所需劑量，技術人員可確定最適醫藥組合物。所述組合物可影響結合蛋白的物理狀態、穩定性、體內釋放速率和體內清除速率。
醫藥組合物中主要的介質或載劑在性質上可以是水性的或非水性的。例如，合適的注射用介質或載劑可以是水、生理鹽水溶液或人工腦脊液，可能補充有用於胃腸外投予的組合物中常見的其它物質。中性緩衝的鹽水或與血清白蛋白混合的鹽水是其它的示例性介質。其它示例性的醫藥組合物包含約pH 7.0-8.5的Tris緩衝液，或約pH 4.0-5.5的乙酸鹽緩衝液，其還可包括山梨醇或合適的代替物。在本發明的一個實施方案中，可通過將所選的具有所需純度的組合物與任選的配製劑混合，來製備呈凍乾餅或水
溶液形式的結合蛋白組合物用於儲存。另外，可使用合適的賦形劑(例如蔗糖)，將結合蛋白製成凍乾物。
可選擇本發明的醫藥組合物用於胃腸外遞送或皮下使用。或者，組合物可選擇用於吸入或用於通過消化道遞送，例如口服。這類藥學上可接受的組合物的製備屬本領域的技術範圍內。
製劑組分以投予部位可接受的濃度存在。例如，使用緩衝劑使組合物保持在生理pH或在略微較低的pH，通常在約5至約8的pH範圍。
當考慮胃腸外投予時，用於本發明的治療組合物可呈無熱原、胃腸外可接受的水溶液形式，其包含藥學上可接受的介質中的所需結合蛋白。用於胃腸外注射的特別合適的介質是無菌蒸餾水，其中結合蛋白被配製為適當防腐的無菌等滲溶液。另一種製備物可涉及所需分子與作用劑的配製物，所述作用劑如可注射微球、生物可侵蝕粒子、聚合化合物(如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠或脂質體，其提供產品的控釋或緩釋，然後產品通過積存注射(depot injection)遞送。還可使用透明質酸，其可具有促進維持循環中的持續時間的作用。用於引入所需分子的其它合適方法包括可植入藥物遞送裝置。
在一個實施方案中，醫藥組合物可配製來用於吸入。例如，結合蛋白可配製成幹粉劑用於吸入。結合蛋白吸入溶液還可與推進劑(propellant)配製在一起用於氣霧劑遞送。在又一個實施方案中，可使溶液劑成霧狀。
還考慮某些配製物可口服投予。在本發明的一個實施方案中，以這種方式投予的結合蛋白可與或不與常用於固體劑型(例如片劑和膠囊劑)混配的那些載劑配製在一起。例如，膠囊劑可設計成在胃腸道某點上釋放製劑的活性部分，此時生物利用度被最大化且內吸收前降解被最小化。可包括其它作用劑以促進結合蛋白的吸收。還可使用稀釋劑、矯味劑、低熔點蠟、植物油、潤滑劑、懸浮劑、片劑崩解劑和粘合劑。
另一種醫藥組合物可涉及與適于製造片劑的無毒賦形劑混合的有效量的結合蛋白。可通過將片劑溶于無菌水或另一種合適的介質來製備呈單位劑型的溶液劑。合適的賦形劑包括但不限于惰性稀釋劑，如碳酸鈣、碳酸鈉或碳酸氫鈉、乳糖或磷酸鈣；或結合劑，如澱粉、明膠或阿拉伯膠；
或潤滑劑如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。
本發明的其它醫藥組合物對本領域技術人員而言會是顯然的，包括這樣的配製物，所述配製物涉及呈緩釋或控釋配製物的結合蛋白。用於配製各種其它緩釋或控釋方法的技術，例如脂質體載體、生物可蝕解微粒或多孔珠粒和積存注射，也是本領域技術人員所知的。緩釋配製物的其它實例包括呈成型製品形式的半滲透聚合物基質，例如膜劑或微囊劑。緩釋基質可包括聚酯、水凝膠、聚乳酸、L-谷胺酸和γ乙基-L-谷胺酸的共聚物、聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)、乙烯乙酸乙烯酯或聚-D(-)-3-羥基丁酸。緩釋組合物還可包括脂質體，其可通過本領域已知的幾種方法中的任一種製備。
用於體內投予的本發明的醫藥組合物通常必須是無菌的。這可通過經無菌濾膜過濾實現。當組合物是凍乾的時，採用該方法的滅菌可在凍乾和複溶之前或之後進行。用於胃腸外投予的組合物可以凍乾形式保存或在溶液中保存。另外，通常將胃腸外組合物裝入具有無菌入口的容器中，例如靜脈內溶液袋或小瓶，其具有可通過皮下注射針刺穿的塞子。
一旦醫藥組合物製成，便可將其作為溶液、懸液、凝膠、乳液、固體或作為脫水或凍乾粉劑儲存在無菌小瓶中。這類製劑可以即用形式或以需要在投予前複溶的形式(例如凍乾)儲存。
本發明還包括用於產生單劑投予單位的套組。套組可各含有具有乾燥蛋白質的第一容器和具有含水製劑的第二容器。含有單室和多室預填藥注射器(例如液體注射器和lyosyringes)的套組也包括在本發明的範圍內。
待治療性應用的結合蛋白醫藥組合物的有效量取决于例如治療背景和目的。本領域的技術人員會瞭解，用於治療的合適劑量水平會因此部分地隨所遞送的分子、使用結合蛋白所針對的適應症、投予途徑和患者尺寸(體重、體表面或器官大小)和一般狀况(年齡和一般健康狀况)而變化。因此，臨床醫師可滴定劑量和修改投予途徑以獲得最佳治療效果。
投予頻率會取决于待使用製劑中的結合蛋白的藥代動力學參數。通常，臨床醫師會投予組合物直至達到獲得所需效果的劑量。組合物因此可如下投予：作為單劑、隨時間推移作為兩劑或更多劑(其可含或不含相同量的所需分子)或作為經植入裝置或導管的連續輸注。適當劑量的進一步改進
按常規由本領域普通技術人員進行，這屬他們常規進行的任務的範圍內。合適的劑量可通過利用合適的劑量-響應數據來確定。
醫藥組合物的投予途徑遵循已知方法，例如口服；通過經由靜脈內、腹膜內、大腦內(實質內)、腦室內、肌內、眼內、動脈內、門靜脈內(intraportal)或病灶內途徑的注射；通過緩釋系統；或通過植入裝置。需要時，組合物通過推注或通過連續輸注或通過植入裝置投予。
還可通過植入其中已吸附或包封所需分子的膜、海綿或其它合適的材料，來局部投予組合物。在使用植入裝置時，可將裝置植入任何合適的組織或器官中，並且所需分子的遞送可以是通過擴散、定時釋放推注或連續投予。
醫藥組合物可用於預防和/或治療HIV感染。醫藥組合物可用作單獨治療或與標準抗逆轉錄病毒治療組合。
在一些實施方案中，本發明涉及預防和/或治療患者中的HIV感染的方法。在一些實施方案中，所述方法包括對該患者投予治療有效量的本文所述結合蛋白的至少一種。在一些實施方案中，所述至少一種結合蛋白與抗逆轉錄病毒治療(例如抗HIV治療)一起投予。在一些實施方案中，所述至少一種結合蛋白在抗逆轉錄病毒治療之前投予。在一些實施方案中，所述至少一種結合蛋白與抗逆轉錄病毒治療同時投予。在一些實施方案中，所述至少一種結合蛋白在抗逆轉錄病毒治療之後投予。在一些實施方案中，所述至少一種結合蛋白與本領域已知的任何標準抗逆轉錄病毒治療共同投予。在一些實施方案中，所述至少一種結合蛋白的投予導致一個或多個HIV病毒體的中和。在一些實施方案中，所述至少一種結合蛋白的投予導致患者中一個或多個潜伏和/或慢性HIV感染的細胞的清除。在一些實施方案中，所述至少一種結合蛋白的投予導致一個或多個HIV病毒體的中和並導致患者中一個或多個潜伏和/或慢性HIV感染的細胞的清除。在一些實施方案中，所述患者是人。
在不限制本發明的前提下，下文描述了一些本發明的實施方案用於說明目的。
項1：一種結合蛋白，其包含形成3個抗原結合位點的4條多肽鏈，
所述3個抗原結合位點特異性結合一個或多個HIV靶蛋白，其中第一多肽鏈包含如下式表示的結構：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽鏈包含如下式表示的結構：
VH1-L3-VH2-L4-CH1 [II]
且第三多肽鏈包含如下式表示的結構：
VH3-CH1 [III]
且第四多肽鏈包含如下式表示的結構：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變域；
VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變域；
VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變域；
VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變域；
VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變域；
VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變域；
CL是免疫球蛋白輕鏈恒定域；
CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恒定域；且
L1、L2、L3和L4是胺基酸連接子；
且其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對。
項2：一種結合蛋白，其包含形成3個抗原結合位點的4條多肽鏈，所述3個抗原結合位點特異性結合一個或多個HIV靶蛋白，其中第一多肽鏈包含如下式表示的結構：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽鏈包含如下式表示的結構：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [II]
且第三多肽鏈包含如下式表示的結構：
VH3-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [III]
且第四多肽鏈包含如下式表示的結構：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變域；
VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變域；
VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變域；
VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變域；
VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變域；
VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變域；
CL是免疫球蛋白輕鏈恒定域；
CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恒定域；
CH2是免疫球蛋白CH2重鏈恒定域；
CH3是免疫球蛋白CH3重鏈恒定域；
鉸鏈是連接CH1和CH2域的免疫球蛋白鉸鏈區；且
L1、L2、L3和L4是胺基酸連接子；
且其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對。
項3：項1或項2的結合蛋白，其中所述一個或多個HIV靶蛋白選自由下列組成之群組：糖蛋白120、糖蛋白41和糖蛋白60。
項4：項1或項2的結合蛋白，其中所述結合蛋白是三特異性的且能够特異性結合單個HIV靶蛋白上的3個不同表位。
項5：項1或項2的結合蛋白，其中所述結合蛋白是三特異性的，且能够特異性結合第一HIV靶蛋白上的2個不同表位以及第二HIV靶蛋白上的1個表位，其中所述第一和第二HIV靶蛋白是不同的。
項6：項1或項2的結合蛋白，其中所述結合蛋白是三特異性的，且能够特異性結合3個不同的抗原靶標。
項7：項1或項2的結合蛋白，其中所述結合蛋白能够抑制所述一個或多個HIV靶蛋白的功能。
項8：項1-7任一項的結合蛋白，其中VL1包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其分別包含SEQ ID NO：266、267和268中所示序列；分別包含SEQ ID NO：269、270和271中所示序列；分別包含SEQ ID NO：500、
501和274中所示序列；分別包含SEQ ID NO：275、276和277中所示序列；分別包含SEQ ID NO：281、282和283中所示序列；或分別包含SEQ ID NO：278、279和280中所示序列。
項9：項1-7任一項的結合蛋白，其中VL1包含輕鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述輕鏈可變域包含序列，該序列選自由下列組成之群組：SEQ ID NO：512、513、514、515、516、517、518、519、520和521。
項10：項1-9任一項的結合蛋白，其中VL1包含輕鏈可變域，其包含序列，該序列選自由下列組成之群組：SEQ ID NO：512、513、514、515、516、517、518、519、520和521。
項11：項1-10任一項的結合蛋白，其中VL2包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其分別包含SEQ ID NO：266、267和268中所示序列；分別包含SEQ ID NO：269、270和271中所示序列；分別包含SEQ ID NO：500、501和274中所示序列；分別包含SEQ ID NO：275、276和277中所示序列；分別包含SEQ ID NO：281、282和283中所示序列；或分別包含SEQ ID NO：278、279和280中所示序列。
項12：項1-10任一項的結合蛋白，其中VL2包含輕鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述輕鏈可變域包含序列，該序列選自由下列組成之群組：SEQ ID NO：512、513、514、515、516、517、518、519、520和521。
項13：項1-12任一項的結合蛋白，其中VL2包含輕鏈可變域，其包含序列，該序列選自由下列組成之群組：SEQ ID NO：512、513、514、515、516、517、518、519、520和521。
項14：項1-13任一項的結合蛋白，其中VL3包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其分別包含SEQ ID NO：266、267和268中所示序列；分別包含SEQ ID NO：269、270和271中所示序列；分別包含SEQ ID NO：500、501和274中所示序列；分別包含SEQ ID NO：275、276和277中所示序列；分別包含SEQ ID NO：281、282和283中所示序列；或分別包含SEQ ID NO：278、279和280中所示序列。
項15：項1-13任一項的結合蛋白，其中VL3包含輕鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述輕鏈可變域包含序列，該序列選自由下列組成之群組：SEQ ID NO：512、513、514、515、516、517、518、519、520和521。
項16：項1-15任一項的結合蛋白，其中VL3包含輕鏈可變區，其包含序列，該序列選自由下列組成之群組：SEQ ID NO：512、513、514、515、516、517、518、519、520和521。
項17：項1-16任一項的結合蛋白，其中VH1包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其分別包含SEQ ID NO：248、497和250中所示序列；分別包含SEQ ID NO：251、252和253中所示序列；分別包含SEQ ID NO：254、255和256中所示序列；分別包含SEQ ID NO：254、255和498中所示序列；分別包含SEQ ID NO：257、258和259中所示序列；分別包含SEQ ID NO：263、264和265中所示序列；或分別包含SEQ ID NO：499、261和262中所示序列。
項18：項1-16任一項的結合蛋白，其中VH1包含重鏈可變域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述重鏈可變域包含序列，該序列選自由下列組成之群組：SEQ ID NO：502、503、504、505、506、507和508。
項19：項1-18任一項的結合蛋白，其中VH1包含重鏈可變域，其包含序列，該序列選自由下列組成之群組：SEQ ID NO：502、503、504、505、506、507和508。
項20：項1-19任一項的結合蛋白，其中所述VH2包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其分別包含SEQ ID NO：248、497和250中所示序列；分別包含SEQ ID NO：251、252和253中所示序列；分別包含SEQ ID NO：254、255和256中所示序列；分別包含SEQ ID NO：254、255和498中所示序列；分別包含SEQ ID NO：257、258和259中所示序列；分別包含SEQ ID NO：263、264和265中所示序列；或分別包含SEQ ID NO：499、261和262中所示序列。
項21：項1-19任一項的結合蛋白，其中VH2包含重鏈可變域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述重鏈可變域包含序列，該序列選自由
下列組成之群組：SEQ ID NO：502、503、504、505、506、507和508。
項22：項1-21任一項的結合蛋白，其中VH2包含重鏈可變域，其包含序列，該序列選自由下列組成之群組：SEQ ID NO：502、503、504、505、506、507和508。
項23：項1-22任一項的結合蛋白，其中VH3包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其分別包含SEQ ID NO：248、497和250中所示序列；分別包含SEQ ID NO：251、252和253中所示序列；分別包含SEQ ID NO：254、255和256中所示序列；分別包含SEQ ID NO：254、255和498中所示序列；分別包含SEQ ID NO：257、258和259中所示序列；分別包含SEQ ID NO：263、264和265中所示序列；或分別包含SEQ ID NO：499、261和262中所示序列。
項24：項1-22任一項的結合蛋白，其中VH3包含重鏈可變域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述重鏈可變域包含序列，該序列選自由下列組成之群組：SEQ ID NO：502、503、504、505、506、507和508。
項25：項1-24任一項的結合蛋白，其中VH3包含重鏈可變域，其包含序列，該序列選自由下列組成之群組：SEQ ID NO：502、503、504、505、506、507和508。
項26：項1-25任一項的結合蛋白，其中VL1包含：含有SEQ ID NO：500的序列的CDR-L1，含有SEQ ID NO：501的序列的CDR-L2，和含有SEQ ID NO：274的序列的CDR-L3；VL2包含：含有SEQ ID NO：275的序列的CDR-L1，含有SEQ ID NO：276的序列的CDR-L2，和含有SEQ ID NO：277的序列的CDR-L3；VL3包含：含有SEQ ID NO：266的序列的CDR-L1，含有SEQ ID NO：267的序列的CDR-L2；和含有SEQ ID NO：268的序列的CDR-L3；VH1包含：含有SEQ ID NO：254的序列的CDR-H1，含有SEQ ID NO：255的序列的CDR-H2，和含有SEQ ID NO：256的序列的CDR-H3；VH2包含：含有SEQ ID NO：257的序列的CDR-H1，含有SEQ ID NO：258的序列的CDR-H2，和含有SEQ ID NO：259的序列的CDR-H3；且VH3包含：含有SEQ ID NO：248的序列的CDR-H1，含有SEQ ID NO：497的序列的CDR-H2，和含有SEQ ID NO：250的序列的
CDR-H3。
項27：項1-25任一項的結合蛋白，其中VL1包含輕鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述輕鏈可變域包含SEQ ID NO：518的輕鏈可變域序列；VL2包含輕鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述輕鏈可變域包含SEQ ID NO：519的輕鏈可變域序列；VL3包含輕鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述輕鏈可變域包含SEQ ID NO：512的輕鏈可變域序列；VH1包含重鏈可變域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述重鏈可變域包含SEQ ID NO：504的重鏈可變域序列；VH2包含重鏈可變域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述重鏈可變域包含SEQ ID NO：506的重鏈可變域序列；且VH3包含重鏈可變域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述重鏈可變域包含SEQ ID NO：502的重鏈可變域序列。
項28：項1-27任一項的結合蛋白，其中VL1包含含有SEQ ID NO：518的序列的輕鏈可變域；VL2包含含有SEQ ID NO：519的序列的輕鏈可變域；VL3包含含有SEQ ID NO：512的序列的輕鏈可變域；VH1包含含有SEQ ID NO：504的序列的重鏈可變域；VH2包含含有SEQ ID NO：506的序列的重鏈可變域；且VH3包含含有SEQ ID NO：502的序列的重鏈可變域。
項29：項1-25任一項的結合蛋白，其中VL1包含：含有SEQ ID NO：500的序列的CDR-L1，含有SEQ ID NO：501的序列的CDR-L2，和含有SEQ ID NO：274的序列的CDR-L3；VL2包含：含有SEQ ID NO：275的序列的CDR-L1，含有SEQ ID NO：276的序列的CDR-L2，和含有SEQ ID NO：277的序列的CDR-L3；VL3包含：含有SEQ ID NO：269的序列的CDR-L1，含有SEQ ID NO：270的序列的CDR-L2，和含有SEQ ID NO：271的序列的CDR-L3；VH1包含：含有SEQ ID NO：254的序列的CDR-H1，含有SEQ ID NO：255的序列的CDR-H2，和含有SEQ ID NO：256的序列的CDR-H3；VH2包含：含有SEQ ID NO：257的序列的CDR-H1，含有SEQ ID NO：258的序列的CDR-H2，和含有SEQ ID NO：259的序列的CDR-H3；且VH3包含：含有SEQ ID NO：251的序列的CDR-H1，含有SEQ ID NO：252的序列的CDR-H2，和含有SEQ ID NO：253的序列的
CDR-H3。
項30：項1-25任一項的結合蛋白，其中VL1包含輕鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述輕鏈可變域包含SEQ ID NO：518的輕鏈可變域序列；VL2包含輕鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述輕鏈可變域包含SEQ ID NO：519的輕鏈可變域序列；VL3包含輕鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述輕鏈可變域包含SEQ ID NO：513的輕鏈可變域序列；VH1包含重鏈可變域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述重鏈可變域包含SEQ ID NO：504的重鏈可變域序列；VH2包含重鏈可變域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述重鏈可變域包含SEQ ID NO：506的重鏈可變域序列；且VH3包含重鏈可變域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述重鏈可變域包含SEQ ID NO：503的重鏈可變域序列。
項31：項1-25和29-30任一項的結合蛋白，其中VL1包含含有SEQ ID NO：518的序列的輕鏈可變域；VL2包含含有SEQ ID NO：519的序列的輕鏈可變域；VL3包含含有SEQ ID NO：513的序列的輕鏈可變域；VH1包含含有SEQ ID NO：504的序列的重鏈可變域；VH2包含含有SEQ ID NO：506的序列的重鏈可變域；且VH3包含含有SEQ ID NO：503的序列的重鏈可變域。
項32：項1-25任一項的結合蛋白，其中VL1包含：含有SEQ ID NO：275的序列的CDR-L1，含有SEQ ID NO：276的序列的CDR-L2，和含有SEQ ID NO：277的序列的CDR-L3；VL2包含：含有SEQ ID NO：500的序列的CDR-L1，含有SEQ ID NO：501的序列的CDR-L2，和含有SEQ ID NO：274的序列的CDR-L3；VL3包含：含有SEQ ID NO：269的序列的CDR-L1，含有SEQ ID NO：270的序列的CDR-L2，和含有SEQ ID NO：271的序列的CDR-L3；VH1包含：含有SEQ ID NO：257的序列的CDR-H1，含有SEQ ID NO：258的序列的CDR-H2，和含有SEQ ID NO：259的序列的CDR-H3；VH2包含：含有SEQ ID NO：254的序列的CDR-H1，含有SEQ ID NO：255的序列的CDR-H2，和含有SEQ ID NO：256的序列的CDR-H3；且VH3包含：含有SEQ ID NO：251的序列的CDR-H1，含有
SEQ ID NO：252的序列的CDR-H2，和含有SEQ ID NO：253的序列的CDR-H3。
項33：項1-25任一項的結合蛋白，其中VL1包含輕鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述輕鏈可變域包含SEQ ID NO：519的輕鏈可變域序列；VL2包含輕鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述輕鏈可變域包含SEQ ID NO：518的輕鏈可變域序列；VL3包含輕鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述輕鏈可變域包含SEQ ID NO：513的輕鏈可變域序列；VH1包含重鏈可變域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述重鏈可變域包含SEQ ID NO：506的重鏈可變域序列；VH2包含重鏈可變域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述重鏈可變域包含SEQ ID NO：504的重鏈可變域序列；且VH3包含重鏈可變域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述重鏈可變域包含SEQ ID NO：503的重鏈可變域序列。
項34：項1-25和32-33任一項的結合蛋白，其中VL1包含含有SEQ ID NO：519的序列的輕鏈可變域；VL2包含含有SEQ ID NO：518的序列的輕鏈可變域；VL3包含含有SEQ ID NO：513的序列的輕鏈可變域；VH1包含含有SEQ ID NO：506的序列的重鏈可變域；VH2包含含有SEQ ID NO：504的序列的重鏈可變域；且VH3包含含有SEQ ID NO：503的序列的重鏈可變域。
項35：項1的結合蛋白，其中所述第二多肽鏈還包含與CH1相連的Fc區，所述Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域。
項36：項1的結合蛋白，其中所述第三多肽鏈還包含與CH1相連的Fc區，所述Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域。
項37：項1的結合蛋白，其中所述第二多肽鏈還包含與CH1相連的第一Fc區，所述第一Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域，其中所述第一Fc區在對應於人IgG1的位置354和366的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為
S354C和T366W；且其中所述第三多肽鏈還包含與CH1相連的第二Fc區，所述第二Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域，其中所述第二Fc區在對應於人IgG1的位置349、366、368和407的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為Y349C、T366S、L368A和Y407V。
項38：項1的結合蛋白，其中所述第二多肽鏈還包含與CH1相連的第一Fc區，所述第一Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域，其中所述第一Fc區在對應於人IgG1的位置349、366、368和407的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為Y349C、T366S、L368A和Y407V；且其中所述第三多肽鏈還包含與CH1相連的第二Fc區，所述第二Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域，其中所述第二Fc區在對應於人IgG1的位置354和366的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為S354C和T366W。
項39：項1的結合蛋白，其中所述第二多肽鏈還包含與CH1相連的第一Fc區，所述第一Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域，且其中所述第三多肽鏈還包含與CH1相連的第二Fc區，所述第二Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域；其中所述第一和第二Fc區在對應於人IgG1的位置428和434的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為M428L和N434S。
項40：項2的結合蛋白，其中所述第二多肽鏈的CH3域在對應於人IgG1的位置354和366的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為S354C和T366W；且其中所述第三多肽鏈的CH3域在對應於人IgG1的位置349、366、368和407的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為Y349C、T366S、L368A和Y407V。
項41：項2的結合蛋白，其中所述第二多肽鏈的CH3域在對應於人IgG1的位置349、366、368和407的位置處包含胺基酸取代，所述位置根
據EU索引，其中所述胺基酸取代為Y349C、T366S、L368A和Y407V；且其中所述第三多肽鏈的CH3域在對應於人IgG1的位置354和366的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為S354C和T366W。
項42：項2的結合蛋白，其中所述第二和第三多肽鏈的CH3域均在對應於人IgG1的位置428和434的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為M428L和N434S。
項43：項1或項2的結合蛋白，其中L1、L2、L3、或L4的至少一個獨立地長度為0個胺基酸。
項44：項1或項2的結合蛋白，其中L1、L2、L3、或L4各自獨立地長度為至少1個胺基酸。
項45：項1-44任一項的結合蛋白，其中L1包含Asp-Lys-Thr-His-Thr(SEQ ID NO：525)。
項46：一種結合蛋白，其包含形成3個抗原結合位點的4條多肽鏈，其中第一多肽鏈包含如下式表示的結構：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽鏈包含如下式表示的結構：
VH1-L3-VH2-L4-CH1 [II]
且第三多肽鏈包含如下式表示的結構：
VH3-CH1 [III]
且第四多肽鏈包含如下式表示的結構：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變域；
VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變域；
VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變域；
VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變域；
VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變域；
VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變域；
CL是免疫球蛋白輕鏈恒定域；
CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恒定域；且
L1、L2、L3和L4是胺基酸連接子；
其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對；
其中：
(a)VL1、VL2和VL3各自獨立地是衍生自SEQ ID NO：2、4、10、12、18、20、26、28、34、36、42、44、50、52、58、60、66、68、74、76、82、84、90、92、98、100、106、108、114、116、122、124、130、132、138、140、146、148、154、156、162、164、170、172、178、180、186、188、194、196、202、204、210,212、218、220、226、228、233、235、241、243任一項所示胺基酸序列的可變域；或
(b)VL1、VL2和VL3各自獨立地包含可變域的輕鏈互補决定區，所述可變域包含SEQ ID NO：266-283任一項中所示的胺基酸序列；且
其中：
(a)VH1、VH2和VH3各自獨立地是衍生自SEQ ID NO：1、3、9、11、17、10、25、27、33、35、41、43、49、51、57、59、65、67、73、75、81、83、89、91、97、99、105、107、113、115、121、123、129、131、137、139、145、147、153、155、161、163、169、171、177、179、185、187、193、195、201、203、209、211、217、219、225、227、232、234、240、242任一項所示胺基酸序列的可變域；或
(b)VH1、VH2和VH3各自獨立地包含可變域的重鏈互補决定區，所述可變域包含SEQ ID NO：248-265任一項中所示的胺基酸序列。
項47：一種結合蛋白，其包含形成3個抗原結合位點的4條多肽鏈，其中第一多肽鏈包含如下式表示的結構：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽鏈包含如下式表示的結構：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [II]
且第三多肽鏈包含如下式表示的結構：
VH3-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [III]
且第四多肽鏈包含如下式表示的結構：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變域；
VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變域；
VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變域；
VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變域；
VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變域；
VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變域；
CL是免疫球蛋白輕鏈恒定域；
CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恒定域；
CH2是免疫球蛋白CH2重鏈恒定域；
CH3是免疫球蛋白CH3重鏈恒定域；
鉸鏈是連接CH1和CH2域的免疫球蛋白鉸鏈區；且
L1、L2、L3和L4是胺基酸連接子；
其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對；
其中：
VL1、VL2和VL3各自獨立地是衍生自SEQ ID NO：2、4、10、12、18、20、26、28、34、36、42、44、50、52、58、60、66、68、74、76、82、84、90、92、98、100、106、108、114、116、122、124、130、132、138、140、146、148、154、156、162、164、170、172、178、180、186、188、194、196、202、204、210,212、218、220、226、228、233、235、241、243任一項所示胺基酸序列的可變域；或
(b)VL1、VL2和VL3各自獨立地包含可變域的輕鏈互補决定區，所述可變域包含SEQ ID NO：266-283任一項中所示的胺基酸序列；且
其中：
(a)VH1、VH2和VH3各自獨立地是衍生自SEQ ID NO：1、3、9、11、17、10、25、27、33、35、41、43、49、51、57、59、65、67、73、75、81、83、89、91、97、99、105、107、113、115、121、123、129、131、
137、139、145、147、153、155、161、163、169、171、177、179、185、187、193、195、201、203、209、211、217、219、225、227、232、234、240、242任一項所示胺基酸序列的可變域；或
(b)VH1、VH2和VH3各自獨立地包含可變域的重鏈互補决定區，所述可變域包含SEQ ID NO：248-265任一項中所示的胺基酸序列。
項48：項46的結合蛋白，其中所述第二多肽鏈還包含與CH1相連的Fc區，所述Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域。
項49：項46的結合蛋白，其中所述第三多肽鏈還包含與CH1相連的Fc區，所述Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域。
項50：項46的結合蛋白，其中所述第二多肽鏈還包含與CH1相連的第一Fc區，所述第一Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域，其中所述第一Fc區在對應於人IgG1的位置354和366的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為S354C和T366W；且其中所述第三多肽鏈還包含與CH1相連的第二Fc區，所述第二Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域，其中所述第二Fc區在對應於人IgG1的位置349、366、368和407的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為Y349C、T366S、L368A和Y407V。
項51：項46的結合蛋白，其中所述第二多肽鏈還包含與CH1相連的第一Fc區，所述第一Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域，其中所述第一Fc區在對應於人IgG1的位置349、366、368和407的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為Y349C、T366S、L368A和Y407V；且其中所述第三多肽鏈還包含與CH1相連的第二Fc區，所述第二Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域，其中所述第二Fc區在對應於人IgG1的位置354和366的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為S354C和T366W。
項52：項46的結合蛋白，其中所述第二多肽鏈還包含與CH1相連的第一Fc區，所述第一Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域，且其中所述第三多肽鏈還包含與CH1相連的第二Fc區，所述第二Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域；其中所述第一和第二Fc區在對應於人IgG1的位置428和434的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為M428L和N434S。
項53：項47的結合蛋白，其中所述第二多肽鏈的CH3域在對應於人IgG1的位置354和366的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為S354C和T366W；且其中所述第三多肽鏈的CH3域在對應於人IgG1的位置349、366、368和407的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為Y349C、T366S、L368A和Y407V。
項54：項47的結合蛋白，其中所述第二多肽鏈的CH3域在對應於人IgG1的位置349、366、368和407的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為Y349C、T366S、L368A和Y407V；且其中所述第三多肽鏈的CH3域在對應於人IgG1的位置354和366的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為S354C和T366W。
項55：項47的結合蛋白，其中所述第二和第三多肽鏈的CH3域均在對應於人IgG1的位置428和434的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為M428L和N434S。
項56：項46或項47的結合蛋白，其中L1、L2、L3、或L4的至少一個獨立地長度為0個胺基酸。
項57：項46或項47的結合蛋白，其中L1、L2、L3、或L4各自獨立地長度為至少1個胺基酸。
項58：項46-57任一項的結合蛋白，其中L1包含Asp-Lys-Thr-His-Thr(SEQ ID NO：525)。
項59：一種結合蛋白，其包含第一多肽鏈、第二多肽鏈、第三多肽
鏈和第四多肽鏈，其中：
(a)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：4的胺基酸序列或與SEQ ID NO：4的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：3的胺基酸序列或與SEQ ID NO：3的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：1的胺基酸序列或與SEQ ID NO：1的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：2的胺基酸序列或與SEQ ID NO：2的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(b)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：12的胺基酸序列或與SEQ ID NO：12的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：11的胺基酸序列或與SEQ ID NO：11的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：9的胺基酸序列或與SEQ ID NO：9的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：10的胺基酸序列或與SEQ ID NO：10的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(c)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：20的胺基酸序列或與SEQ ID NO：20的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：19的胺基酸序列或與SEQ ID NO：19的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：17的胺基酸序列或與SEQ ID NO：17的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：18的胺基酸序列或與SEQ ID NO：18的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(d)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：28的胺基酸序列或與SEQ ID NO：28的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列或與SEQ ID NO：27的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：25的胺基酸序列或與SEQ ID NO：25的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：26的胺基酸序列或與SEQ ID NO：26的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(e)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：36的胺基酸序列或與SEQ ID NO：36的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：35的胺基酸序列或與SEQ ID NO：35的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：33的胺基酸序列或與SEQ ID NO：33的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：34的胺基酸序列或與SEQ ID NO：34的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(f)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：44的胺基酸序列或與SEQ ID NO：44的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：43的胺基酸序列或與SEQ ID NO：43的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：41的胺基酸序列或與SEQ ID NO：41的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：42的胺基酸序列或與SEQ ID NO：42的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(g)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：52的胺基酸序列或與SEQ ID NO：52的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：51的胺基酸序列或與SEQ ID NO：51的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：49的胺基酸序列或與SEQ ID NO：49的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：50的胺基酸序列或與SEQ ID NO：50的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(h)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：60的胺基酸序列或與SEQ ID NO：60的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：59的胺基酸序列或與SEQ ID NO：59的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：57的胺基酸序列或與SEQ ID NO：57的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：58的胺基酸序列或與SEQ ID NO：58的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(i)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：68的胺基酸序列或與SEQ ID
NO：68的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：67的胺基酸序列或與SEQ ID NO：67的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：65的胺基酸序列或與SEQ ID NO：65的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：66的胺基酸序列或與SEQ ID NO：66的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(j)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：76的胺基酸序列或與SEQ ID NO：76的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：75的胺基酸序列或與SEQ ID NO：75的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：73的胺基酸序列或與SEQ ID NO：73的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：74的胺基酸序列或與SEQ ID NO：74的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(k)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：84的胺基酸序列或與SEQ ID NO：84的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：83的胺基酸序列或與SEQ ID NO：83的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：81的胺基酸序列或與SEQ ID NO：81的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：82的胺基酸序列或與SEQ ID NO：82的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(l)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：92的胺基酸序列或與SEQ ID NO：92的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：91的胺基酸序列或與SEQ ID NO：91的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：89的胺基酸序列或與SEQ ID NO：89的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：90的胺基酸序列或與SEQ ID NO：90的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(m)第一多肽鏈包含SEQ ID NO：100的胺基酸序列或與SEQ ID NO：100的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ
ID NO：99的胺基酸序列或與SEQ ID NO：99的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：97的胺基酸序列或與SEQ ID NO：97的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：98的胺基酸序列或與SEQ ID NO：98的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(n)所述第一多肽包含SEQ ID NO：108的胺基酸序列或與SEQ ID NO：108的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：107的胺基酸序列或與SEQ ID NO：107的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：105的胺基酸序列或與SEQ ID NO：105的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：106的胺基酸序列或與SEQ ID NO：106的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(o)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：116的胺基酸序列或與SEQ ID NO：116的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：115的胺基酸序列或與SEQ ID NO：115的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：113的胺基酸序列或與SEQ ID NO：113的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：114的胺基酸序列或與SEQ ID NO：114的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(p)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：124的胺基酸序列或與SEQ ID NO：124的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：123的胺基酸序列或與SEQ ID NO：123的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：121的胺基酸序列或與SEQ ID NO：121的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：122的胺基酸序列或與SEQ ID NO：122的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(q)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：132的胺基酸序列或與SEQ ID NO：132的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：131的胺基酸序列或與SEQ ID NO：131的胺基酸序列至少
95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：129的胺基酸序列或與SEQ ID NO：129的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：130的胺基酸序列或與SEQ ID NO：130的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(r)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：140的胺基酸序列或與SEQ ID NO：140的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：139的胺基酸序列或與SEQ ID NO：139的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：137的胺基酸序列或與SEQ ID NO：137的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：138的胺基酸序列或與SEQ ID NO：138的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(s)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：148的胺基酸序列或與SEQ ID NO：148的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：147的胺基酸序列或與SEQ ID NO：147的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：145的胺基酸序列或與SEQ ID NO：145的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：146的胺基酸序列或與SEQ ID NO：146的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(t)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：156的胺基酸序列或與SEQ ID NO：156的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：155的胺基酸序列或與SEQ ID NO：155的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：153的胺基酸序列或與SEQ ID NO：153的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：154的胺基酸序列或與SEQ ID NO：154的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(u)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：164的胺基酸序列或與SEQ ID NO：164的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：163的胺基酸序列或與SEQ ID NO：163的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：161的胺基酸序
列或與SEQ ID NO：161的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：162的胺基酸序列或與SEQ ID NO：162的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(v)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：172的胺基酸序列或與SEQ ID NO：172的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：171的胺基酸序列或與SEQ ID NO：171的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：169的胺基酸序列或與SEQ ID NO：169的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：170的胺基酸序列或與SEQ ID NO：170的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(w)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：180的胺基酸序列或與SEQ ID NO：180的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：179的胺基酸序列或與SEQ ID NO：179的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：177的胺基酸序列或與SEQ ID NO：177的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：178的胺基酸序列或與SEQ ID NO：178的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(x)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：188的胺基酸序列或與SEQ ID NO：188的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：187的胺基酸序列或與SEQ ID NO：187的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：185的胺基酸序列或與SEQ ID NO：185的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：186的胺基酸序列或與SEQ ID NO：186的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(y)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：196的胺基酸序列或與SEQ ID NO：196的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：195的胺基酸序列或與SEQ ID NO：195的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：193的胺基酸序列或與SEQ ID NO：193的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所
述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：194的胺基酸序列或與SEQ ID NO：194的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(z)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：204的胺基酸序列或與SEQ ID NO：204的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：203的胺基酸序列或與SEQ ID NO：203的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：201的胺基酸序列或與SEQ ID NO：201的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：202的胺基酸序列或與SEQ ID NO：202的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(aa)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：212的胺基酸序列或與SEQ ID NO：212的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：211的胺基酸序列或與SEQ ID NO：211的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：209的胺基酸序列或與SEQ ID NO：209的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：210的胺基酸序列或與SEQ ID NO：210的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(bb)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：220的胺基酸序列或與SEQ ID NO：220的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：219的胺基酸序列或與SEQ ID NO：219的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：217的胺基酸序列或與SEQ ID NO：217的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：218的胺基酸序列或與SEQ ID NO：218的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(cc)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：228的胺基酸序列或與SEQ ID NO：228的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：227的胺基酸序列或與SEQ ID NO：227的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：225的胺基酸序列或與SEQ ID NO：225的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：226的胺基酸序列或與SEQ ID NO：226的
胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(dd)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：235的胺基酸序列或與SEQ ID NO：235的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：234的胺基酸序列或與SEQ ID NO：234的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：232的胺基酸序列或與SEQ ID NO：232的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：233的胺基酸序列或與SEQ ID NO：233的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；或
(ee)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：243的胺基酸序列或與SEQ ID NO：243的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：242的胺基酸序列或與SEQ ID NO：242的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：240的胺基酸序列或與SEQ ID NO：240的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：241的胺基酸序列或與SEQ ID NO：241的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
項60：一種結合蛋白，其包含形成3個抗原結合位點的4條多肽鏈，所述3個抗原結合位點特異性結合一個或多個HIV靶蛋白和一個或多個T細胞靶蛋白，其中第一多肽鏈包含如下式表示的結構：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]；
第二多肽鏈包含如下式表示的結構：
VH1-L3-VH2-L4-CH1 [II]；
第三多肽鏈包含如下式表示的結構：
VH3-CH1 [III]；
且第四多肽鏈包含如下式表示的結構：
VL3-CL [IV]；
其中
VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變域；
VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變域；
VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變域；
VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變域；
VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變域；
VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變域；
CL是免疫球蛋白輕鏈恒定域；
CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恒定域；且
L1、L2、L3和L4是胺基酸連接子；
且其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對。
項61：一種結合蛋白，其包含形成3個抗原結合位點的4條多肽鏈，所述3個抗原結合位點特異性結合一個或多個HIV靶蛋白和一個或多個T細胞靶蛋白，其中第一多肽鏈包含如下式表示的結構：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]；
第二多肽鏈包含如下式表示的結構：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [II]；
第三多肽鏈包含如下式表示的結構：
VH3-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [III]；
且第四多肽鏈包含如下式表示的結構：
VL3-CL [IV]；
其中
VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變域；
VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變域；
VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變域；
VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變域；
VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變域；
VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變域；
CL是免疫球蛋白輕鏈恒定域；
CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恒定域；
CH2是免疫球蛋白CH2重鏈恒定域；
CH3是免疫球蛋白CH3重鏈恒定域；
鉸鏈是連接CH1和CH2域的免疫球蛋白鉸鏈區；且
L1、L2、L3和L4是胺基酸連接子；
且其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對。
項62：項60或項61的結合蛋白，其中所述一個或多個HIV靶蛋白選自由下列組成之群組：糖蛋白120、糖蛋白41和糖蛋白160。
項63：項60或項61的結合蛋白，其中所述一個或多個T細胞靶蛋白是CD3或CD28。
項64：項60或項61的結合蛋白，其中所述結合蛋白是三特異性的，且能够特異性結合HIV靶蛋白及單個T細胞靶蛋白上的兩個不同的表位。
項65：項60或項61的結合蛋白，其中所述結合蛋白是三特異性的，且能够特異性結合HIV靶蛋白和兩個不同的T細胞靶蛋白。
項66：項60或項61的結合蛋白，其中所述結合蛋白是三特異性的，且能够特異性結合T細胞靶蛋白及單個HIV靶蛋白上的兩個不同的表位。
項67：項60或項61的結合蛋白，其中所述結合蛋白是三特異性的，且能够特異性結合T細胞靶蛋白和兩個不同的HIV靶蛋白。
項68：項60或項61的結合蛋白，其中所述第一和第二多肽鏈形成兩個抗原結合位點，其特異性靶向兩個T細胞靶蛋白，且所述第三和第四多肽鏈形成抗原結合位點，其特異性結合HIV靶蛋白。
項69：項60-68任一項的結合蛋白，其中VL1包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其分別包含SEQ ID NO：266、267和268中所示序列；分別包含SEQ ID NO：269、270和271中所示序列；分別包含SEQ ID NO：500、501和274中所示序列；分別包含SEQ ID NO：275、276和277中所示序列；分別包含SEQ ID NO：281、282和283中所示序列；分別包含SEQ ID NO：278、279和280中所示序列；分別包含SEQ ID NO：488、489和490中所示序列；分別包含SEQ ID NO：491、492和493中所示序列；或分別包含SEQ ID NO：494、495和496中所示序列。
項70：項60-68任一項的結合蛋白，其中VL1包含輕鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述輕鏈可變域包含序列，該序列選自由下列組成之群組：SEQ ID NO：512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523和524。
項71：項60-70任一項的結合蛋白，其中VL1包含輕鏈可變域，其包含序列，該序列選自由下列組成之群組：SEQ ID NO：512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523和524。
項72：項60-71任一項的結合蛋白，其中VL2包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其分別包含SEQ ID NO：266、267和268中所示序列；分別包含SEQ ID NO：269、270和271中所示序列；分別包含SEQ ID NO：500、501和274中所示序列；分別包含SEQ ID NO：275、276和277中所示序列；分別包含SEQ ID NO：281、282和283中所示序列；分別包含SEQ ID NO：278、279和280中所示序列；分別包含SEQ ID NO：488、489和490中所示序列；分別包含SEQ ID NO：491、492和493中所示序列；或分別包含SEQ ID NO：494、495和496中所示序列。
項73：項60-71任一項的結合蛋白，其中VL2包含輕鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述輕鏈可變域包含序列，該序列選自由下列組成之群組：SEQ ID NO：512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523和524。
項74：項60-73任一項的結合蛋白，其中VL2包含輕鏈可變域，其包含序列，該序列選自由下列組成之群組：SEQ ID NO：512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523和524。
項75：項60-74任一項的結合蛋白，其中VL3包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其分別包含SEQ ID NO：266、267和268中所示序列；分別包含SEQ ID NO：269、270和271中所示序列；分別包含SEQ ID NO：500、501和274中所示序列；分別包含SEQ ID NO：275、276和277中所示序列；分別包含SEQ ID NO：281、282和283中所示序列；分別包含SEQ ID NO：278、279和280中所示序列；分別包含SEQ ID NO：488、489和490中所示序列；分別包含SEQ ID NO：491、492和493中所示序列；或分別包含SEQ ID NO：494、495和496中所示序列。
項76：項60-74任一項的結合蛋白，其中VL3包含輕鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述輕鏈可變域包含序列，該序列選自由下列組成之群組：SEQ ID NO：512、513、514、515、516、517、518、
519、520、521、522、523和524。
項77：項60-76任一項的結合蛋白，其中VL3包含輕鏈可變域，其包含序列，該序列選自由下列組成之群組：SEQ ID NO：512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523和524。
項78：項60-77任一項的結合蛋白，其中VH1包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其分別包含SEQ ID NO：248、497和250中所示序列；分別包含SEQ ID NO：251、252和253中所示序列；分別包含SEQ ID NO：254、255和256中所示序列；分別包含SEQ ID NO：254、255和498中所示序列；分別包含SEQ ID NO：257、258和259中所示序列；分別包含SEQ ID NO：263、264和265中所示序列；分別包含SEQ ID NO：499、261和262中所示序列；分別包含SEQ ID NO：479、480和481中所示序列；分別包含SEQ ID NO：482、483和484中所示序列；或分別包含SEQ ID NO：485、486和487中所示序列。
項79：項60-77任一項的結合蛋白，其中VH1包含重鏈可變域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述重鏈可變域包含序列，該序列選自由下列組成之群組：SEQ ID NO：502、503、504、505、506、507、508、509、510和511。
項80：項60-79任一項的結合蛋白，其中VH1包含重鏈可變域，其包含序列，該序列選自由下列組成之群組：SEQ ID NO：502、503、504、505、506、507、508、509、510和511。
項81：項60-80任一項的結合蛋白，其中VH2包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其分別包含SEQ ID NO：248、497和250中所示序列；分別包含SEQ ID NO：251、252和253中所示序列；分別包含SEQ ID NO：254、255和256中所示序列；分別包含SEQ ID NO：254、255和498中所示序列；分別包含SEQ ID NO：257、258和259中所示序列；分別包含SEQ ID NO：263、264和265中所示序列；分別包含SEQ ID NO：499、261和262中所示序列；分別包含SEQ ID NO：479、480和481中所示序列；分別包含SEQ ID NO：482、483和484中所示序列；或分別包含SEQ ID NO：485、486和487中所示序列。
項82：項60-80任一項的結合蛋白，其中VH2包含重鏈可變域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述重鏈可變域包含序列，該序列選自由下列組成之群組：SEQ ID NO：502、503、504、505、506、507、508、509、510和511。
項83：項60-82任一項的結合蛋白，其中VH2包含重鏈可變域，其包含序列，該序列選自由下列組成之群組：SEQ ID NO：502、503、504、505、506、507、508、509、510和511。
項84：項60-83任一項的結合蛋白，其中VH3包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其分別包含SEQ ID NO：248、497和250中所示序列；分別包含SEQ ID NO：251、252和253中所示序列；分別包含SEQ ID NO：254、255和256中所示序列；分別包含SEQ ID NO：254、255和498中所示序列；分別包含SEQ ID NO：257、258和259中所示序列；分別包含SEQ ID NO：263、264和265中所示序列；分別包含SEQ ID NO：499、261和262中所示序列；分別包含SEQ ID NO：479、480和481中所示序列；分別包含SEQ ID NO：482、483和484中所示序列；或分別包含SEQ ID NO：485、486和487中所示序列。
項85：項60-83任一項的結合蛋白，其中VH3包含重鏈可變域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述重鏈可變域包含序列，該序列選自由下列組成之群組：SEQ ID NO：502、503、504、505、506、507、508、509、510和511。
項86：項60-85任一項的結合蛋白，其中VH3包含重鏈可變域，其包含序列，該序列選自由下列組成之群組：SEQ ID NO：502、503、504、505、506、507、508、509、510和511。
項87：項60-86任一項的結合蛋白，其中VL1包含：含有SEQ ID NO：488的序列的CDR-L1，含有SEQ ID NO：489的序列的CDR-L2，和含有SEQ ID NO：490的序列的CDR-L3；VL2包含：含有SEQ ID NO：494的序列的CDR-L1，含有SEQ ID NO：495的序列的CDR-L2，和含有SEQ ID NO：496的序列的CDR-L3；VL3包含：含有SEQ ID NO：269的序列的CDR-L1，含有SEQ ID NO：270的序列的CDR-L2，和含有SEQ ID NO：
271的序列的CDR-L3；VH1包含：含有SEQ ID NO：479的序列的CDR-H1，含有SEQ ID NO：480的序列的CDR-H2，和含有SEQ ID NO：481的序列的CDR-H3；VH2包含：含有SEQ ID NO：485的序列的CDR-H1，含有SEQ ID NO：486的序列的CDR-H2，和含有SEQ ID NO：487的序列的CDR-H3；且VH3包含：含有SEQ ID NO：251的序列的CDR-H1，含有SEQ ID NO：252的序列的CDR-H2，和含有SEQ ID NO：253的序列的CDR-H3。
項88：項60-86任一項的結合蛋白，其中VL1包含輕鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述輕鏈可變域包含SEQ ID NO：522的輕鏈可變域序列；VL2包含輕鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述輕鏈可變域包含SEQ ID NO：524的輕鏈可變域序列；VL3包含輕鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述輕鏈可變域包含SEQ ID NO：513的輕鏈可變域序列；VH1包含重鏈可變域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述重鏈可變域包含SEQ ID NO：509的重鏈可變域序列；VH2包含重鏈可變域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述重鏈可變域包含SEQ ID NO：511的重鏈可變域序列；且VH3包含重鏈可變域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述重鏈可變域包含SEQ ID NO：503的重鏈可變域序列。
項89：項60-88任一項的結合蛋白，其中VL1包含含有SEQ ID NO：522的序列的輕鏈可變域；VL2包含含有SEQ ID NO：524的序列的輕鏈可變域；VL3包含含有SEQ ID NO：513的序列的輕鏈可變域；VH1包含含有SEQ ID NO：509的序列的重鏈可變域；VH2包含含有SEQ ID NO：511的序列的重鏈可變域；且VH3包含含有SEQ ID NO：503的序列的重鏈可變域。
項90：項60-86任一項的結合蛋白，其中VL1包含：含有SEQ ID NO：494的序列的CDR-L1，含有SEQ ID NO：495的序列的CDR-L2，和含有SEQ ID NO：496的序列的CDR-L3；VL2包含：含有SEQ ID NO：488的序列的CDR-L1，含有SEQ ID NO：489的序列的CDR-L2，和含有SEQ ID NO：490的序列的CDR-L3；VL3包含：含有SEQ ID NO：269的序列的CDR-L1，含有SEQ ID NO：270的序列的CDR-L2，和含有SEQ ID NO：
271的序列的CDR-L3；VH1包含：含有SEQ ID NO：485的序列的CDR-H1，含有SEQ ID NO：486的序列的CDR-H2，和含有SEQ ID NO：487的序列的CDR-H3；VH2包含：含有SEQ ID NO：479的序列的CDR-H1，含有SEQ ID NO：480的序列的CDR-H2，和含有SEQ ID NO：481的序列的CDR-H3；且VH3包含：含有SEQ ID NO：251的序列的CDR-H1，含有SEQ ID NO：252的序列的CDR-H2，和含有SEQ ID NO：253的序列的CDR-H3。
項91：項60-86任一項的結合蛋白，其中VL1包含輕鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述輕鏈可變域包含SEQ ID NO：524的輕鏈可變域序列；VL2包含輕鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述輕鏈可變域包含SEQ ID NO：522的輕鏈可變域序列；VL3包含輕鏈可變域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述輕鏈可變域包含SEQ ID NO：513的輕鏈可變域序列；VH1包含重鏈可變域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述重鏈可變域包含SEQ ID NO：511的重鏈可變域序列；VH2包含重鏈可變域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述重鏈可變域包含SEQ ID NO：509的重鏈可變域序列；且VH3包含重鏈可變域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述重鏈可變域包含SEQ ID NO：503的重鏈可變域序列。
項92：項60-86和90-91任一項的結合蛋白，其中VL1包含含有SEQ ID NO：524的序列的輕鏈可變域；VL2包含含有SEQ ID NO：522的序列的輕鏈可變域；VL3包含含有SEQ ID NO：513的序列的輕鏈可變域；VH1包含含有SEQ ID NO：511的序列的重鏈可變域；VH2包含含有SEQ ID NO：509的序列的重鏈可變域；且VH3包含含有SEQ ID NO：503的序列的重鏈可變域。
項93：項60的結合蛋白，其中所述第二多肽鏈還包含與CH1相連的Fc區，所述Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域。
項94：項60的結合蛋白，其中所述第三多肽鏈還包含與CH1相連的Fc區，所述Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒
定域。
項95：項60的結合蛋白，其中所述第二多肽鏈還包含與CH1相連的第一Fc區，所述第一Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域，其中所述第一Fc區在對應於人IgG1的位置354和366的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為S354C和T366W；且其中所述第三多肽鏈還包含與CH1相連的第二Fc區，所述第二Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域，其中所述第二Fc區在對應於人IgG1的位置349、366、368和407的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為Y349C、T366S、L368A和Y407V。
項96：項60的結合蛋白，其中所述第二多肽鏈還包含與CH1相連的第一Fc區，所述第一Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域，其中所述第一Fc區在對應於人IgG1的位置349、366、368和407的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為Y349C、T366S、L368A和Y407V；且其中所述第三多肽鏈還包含與CH1相連的第二Fc區，所述第二Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域，其中所述第二Fc區在對應於人IgG1的位置354和366的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為S354C和T366W。
項97：項60的結合蛋白，其中所述第二多肽鏈還包含與CH1相連的第一Fc區，所述第一Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域，且其中所述第三多肽鏈還包含與CH1相連的第二Fc區，所述第二Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域；其中所述第一和第二Fc區在對應於人IgG1的位置428和434的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為M428L和N434S。
項98：項61的結合蛋白，其中所述第二多肽鏈的CH3域在對應於人IgG1的位置354和366的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為S354C和T366W；且其中所述第三多肽鏈的CH3域
在對應於人IgG1的位置349、366、368和407的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為Y349C、T366S、L368A和Y407V。
項99：項61的結合蛋白，其中所述第二多肽鏈的CH3域在對應於人IgG1的位置349、366、368和407的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為Y349C、T366S、L368A和Y407V；且其中所述第三多肽鏈的CH3域在對應於人IgG1的位置354和366的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為S354C和T366W。
項100：項61的結合蛋白，其中所述第二和第三多肽鏈的CH3域均在對應於人IgG1的位置428和434的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為M428L和N434S。
項101：項60或項61的結合蛋白，其中L1、L2、L3、或L4的至少一個獨立地長度為0個胺基酸。
項102：項60或項61的結合蛋白，其中L1、L2、L3、或L4各自獨立地長度為至少1個胺基酸。
項103：項60-102任一項的結合蛋白，其中L1是Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO：299)。
項104：一種結合蛋白，其包含形成3個抗原結合位點的4條多肽鏈，其中第一多肽鏈包含如下式表示的結構：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽鏈包含如下式表示的結構：
VH1-L3-VH2-L4-CH1 [II]
且第三多肽鏈包含如下式表示的結構：
VH3-CH1 [III]
且第四多肽鏈包含如下式表示的結構：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變域；
VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變域；
VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變域；
VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變域；
VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變域；
VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變域；
CL是免疫球蛋白輕鏈恒定域；
CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恒定域；且
L1、L2、L3和L4是胺基酸連接子；
其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對；
其中：
(a)VL1、VL2和VL3各自獨立地是衍生自SEQ ID NO：303、305、311、313、319、321、327、329、335、337、343、345、351、353、359、361、367、369、375、377、383、385、391、393、399、401、407、409、415、417、423、425、431、433、439、441、447、449、455、457、463、465、471、473中任一項所示胺基酸序列的可變域；或
(b)VL1、VL2和VL3各自獨立地包含可變域的輕鏈互補决定區，所述可變域包含SEQ ID NO：266-271、275-277、488-496任一項中所示的胺基酸序列；且
其中：
(a)VH1、VH2和VH3各自獨立地是衍生自SEQ ID NO：302、304、310、312、318、320、326、328、334、336、342、344、350、352、358、360、366、368、374、376、382、384、390、392、398、400、406、408、414、416、422、424、430、432、438、440、446、448、454、456、462、464、470、472中任一項所示胺基酸序列的可變域；或
(b)VH1、VH2和VH3各自獨立地包含可變域的重鏈互補决定區，所述可變域包含SEQ ID NO：248-253、257-259、479-487任一項中所示的胺基酸序列。
項105：一種結合蛋白，其包含形成3個抗原結合位點的4條多肽鏈，其中第一多肽鏈包含如下式表示的結構：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
且第二多肽鏈包含如下式表示的結構：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [II]
且第三多肽鏈包含如下式表示的結構：
VH3-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [III]
且第四多肽鏈包含如下式表示的結構：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變域；
VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變域；
VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變域；
VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變域；
VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變域；
VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變域；
CL是免疫球蛋白輕鏈恒定域；
CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恒定域；
CH2是免疫球蛋白CH2重鏈恒定域；
CH3是免疫球蛋白CH3重鏈恒定域；
鉸鏈是連接CH1和CH2域的免疫球蛋白鉸鏈區；且
L1、L2、L3和L4是胺基酸連接子；
其中所述式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對；
其中：
(a)VL1、VL2和VL3各自獨立地是衍生自SEQ ID NO：303、305、311、313、319、321、327、329、335、337、343、345、351、353、359、361、367、369、375、377、383、385、391、393、399、401、407、409、415、417、423、425、431、433、439、441、447、449、455、457、463、465、471、473中任一項所示胺基酸序列的可變域；或
(b)VL1、VL2和VL3各自獨立地包含可變域的輕鏈互補决定區，所述可變域包含SEQ ID NO：266-271、275-277、488-496任一項中所示的胺基
酸序列；且
其中：
(a)VH1、VH2和VH3各自獨立地是衍生自SEQ ID NO：302、304、310、312、318、320、326、328、334、336、342、344、350、352、358、360、366、368、374、376、382、384、390、392、398、400、406、408、414、416、422、424、430、432、438、440、446、448、454、456、462、464、470、472中任一項所示胺基酸序列的可變域；或
(b)VH1、VH2和VH3各自獨立地包含可變域的重鏈互補决定區，所述可變域包含SEQ ID NO：248-253、257-259、479-487任一項中所示的胺基酸序列。
項106：項104的結合蛋白，其中所述第二多肽鏈還包含與CH1相連的Fc區，所述Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域。
項107：項104的結合蛋白，其中所述第三多肽鏈還包含與CH1相連的Fc區，所述Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域。
項108：項104的結合蛋白，其中所述第二多肽鏈還包含與CH1相連的第一Fc區，所述第一Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域，其中所述第一Fc區在對應於人IgG1的位置354和366的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為S354C和T366W；且其中所述第三多肽鏈還包含與CH1相連的第二Fc區，所述第二Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域，其中所述第二Fc區在對應於人IgG1的位置349、366、368和407的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為Y349C、T366S、L368A和Y407V。
項109：項104的結合蛋白，其中所述第二多肽鏈還包含與CH1相連的第一Fc區，所述第一Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域，其中所述第一Fc區在對應於人IgG1的位置349、366、368和407的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述
胺基酸取代為Y349C、T366S、L368A和Y407V；且其中所述第三多肽鏈還包含與CH1相連的第二Fc區，所述第二Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域，其中所述第二Fc區在對應於人IgG1的位置354和366的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為S354C和T366W。
項110：項104的結合蛋白，其中所述第二多肽鏈還包含與CH1相連的第一Fc區，所述第一Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域，且其中所述第三多肽鏈還包含與CH1相連的第二Fc區，所述第二Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定域；其中所述第一和第二Fc區在對應於人IgG1的位置428和434的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為M428L和N434S。
項111：項105的結合蛋白，其中所述第二多肽鏈的CH3域在對應於人IgG1的位置354和366的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為S354C和T366W；且其中所述第三多肽鏈的CH3域在對應於人IgG1的位置349、366、368和407的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為Y349C、T366S、L368A和Y407V。
項112：項105的結合蛋白，其中所述第二多肽鏈的CH3域在對應於人IgG1的位置349、366、368和407的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為Y349C、T366S、L368A和Y407V；且其中所述第三多肽鏈的CH3域在對應於人IgG1的位置354和366的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為S354C和T366W。
項113：項105的結合蛋白，其中所述第二和第三多肽鏈的CH3域均在對應於人IgG1的位置428和434的位置處包含胺基酸取代，所述位置根據EU索引，其中所述胺基酸取代為M428L和N434S。
項114：項104或項105的結合蛋白，其中L1、L2、L3、或L4的至少一個獨立地長度為0個胺基酸。
項115：項104或項105的結合蛋白，其中L1、L2、L3、或L4各自獨立地長度為至少1個胺基酸。
項116：項104-115任一項的結合蛋白，其中L1是Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO：299)。
項117：一種結合蛋白，其包含第一多肽鏈、第二多肽鏈、第三多肽鏈和第四多肽鏈，其中：
(a)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：305的胺基酸序列或與SEQ ID NO：305的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：304的胺基酸序列或與SEQ ID NO：304的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：302的胺基酸序列或與SEQ ID NO：302的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：303的胺基酸序列或與SEQ ID NO：303的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(b)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：313的胺基酸序列或與SEQ ID NO：313的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：312的胺基酸序列或與SEQ ID NO：312的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：310的胺基酸序列或與SEQ ID NO：310的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：311的胺基酸序列或與SEQ ID NO：311的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(c)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：321的胺基酸序列或與SEQ ID NO：321的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：320的胺基酸序列或與SEQ ID NO：320的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：318的胺基酸序列或與SEQ ID NO：318的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：319的胺基酸序列或與SEQ ID NO：319的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(d)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：329的胺基酸序列或與SEQ ID NO：329的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含
SEQ ID NO：328的胺基酸序列或與SEQ ID NO：328的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：326的胺基酸序列或與SEQ ID NO：326的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：327的胺基酸序列或與SEQ ID NO：327的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(e)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：337的胺基酸序列或與SEQ ID NO：337的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：336的胺基酸序列或與SEQ ID NO：336的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；第三多肽鏈包含SEQ ID NO：334的胺基酸序列或與SEQ ID NO：334的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：335的胺基酸序列或與SEQ ID NO：335的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(f)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：345的胺基酸序列或與SEQ ID NO：345的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：344的胺基酸序列或與SEQ ID NO：344的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：342的胺基酸序列或與SEQ ID NO：342的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：343的胺基酸序列或與SEQ ID NO：343的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(g)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：353的胺基酸序列或與SEQ ID NO：353的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：352的胺基酸序列或與SEQ ID NO：352的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：350的胺基酸序列或與SEQ ID NO：350的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：351的胺基酸序列或與SEQ ID NO：351的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(h)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：361的胺基酸序列或與SEQ ID NO：361的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：360的胺基酸序列或與SEQ ID NO：360的胺基酸序列至少
95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：358的胺基酸序列或與SEQ ID NO：358的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：359的胺基酸序列或與SEQ ID NO：359的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(i)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：369的胺基酸序列或與SEQ ID NO：369的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：368的胺基酸序列或與SEQ ID NO：368的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：366的胺基酸序列或與SEQ ID NO：366的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：367的胺基酸序列或與SEQ ID NO：367的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(j)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：377的胺基酸序列或與SEQ ID NO：377的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：376的胺基酸序列或與SEQ ID NO：376的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：374的胺基酸序列或與SEQ ID NO：374的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：375的胺基酸序列或與SEQ ID NO：375的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(k)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：385的胺基酸序列或與SEQ ID NO：385的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：384的胺基酸序列或與SEQ ID NO：384的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：382的胺基酸序列或與SEQ ID NO：382的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：383的胺基酸序列或與SEQ ID NO：383的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(l)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：393的胺基酸序列或與SEQ ID NO：393的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：392的胺基酸序列或與SEQ ID NO：392的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：390的胺基酸序
列或與SEQ ID NO：390的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：391的胺基酸序列或與SEQ ID NO：391的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(m)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：401的胺基酸序列或與SEQ ID NO：401的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：400的胺基酸序列或與SEQ ID NO：400的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：398的胺基酸序列或與SEQ ID NO：398的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：399的胺基酸序列或與SEQ ID NO：399的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(n)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：409的胺基酸序列或與SEQ ID NO：409的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：408的胺基酸序列或與SEQ ID NO：408的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：406的胺基酸序列或與SEQ ID NO：406的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：407的胺基酸序列或與SEQ ID NO：407的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(p)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：417的胺基酸序列或與SEQ ID NO：417的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：416的胺基酸序列或與SEQ ID NO：416的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：414的胺基酸序列或與SEQ ID NO：414的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：415的胺基酸序列或與SEQ ID NO：415的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(q)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：425的胺基酸序列或與SEQ ID NO：425的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：424的胺基酸序列或與SEQ ID NO：424的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：422的胺基酸序列或與SEQ ID NO：422的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所
述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：423的胺基酸序列或與SEQ ID NO：423的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(r)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：433的胺基酸序列或與SEQ ID NO：433的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：433的胺基酸序列或與SEQ ID NO：432的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：430的胺基酸序列或與SEQ ID NO：430的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：431的胺基酸序列或與SEQ ID NO：431的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(s)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：441的胺基酸序列或與SEQ ID NO：441的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：440的胺基酸序列或與SEQ ID NO：440的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：438的胺基酸序列或與SEQ ID NO：438的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：439的胺基酸序列或與SEQ ID NO：439的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(t)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：449的胺基酸序列或與SEQ ID NO：449的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：448的胺基酸序列或與SEQ ID NO：448的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：446的胺基酸序列或與SEQ ID NO：446的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：447的胺基酸序列或與SEQ ID NO：447的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(u)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：457的胺基酸序列或與SEQ ID NO：457的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：456的胺基酸序列或與SEQ ID NO：456的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：454的胺基酸序列或與SEQ ID NO：454的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：455的胺基酸序列或與SEQ ID NO：455的
胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；
(v)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：465的胺基酸序列或與SEQ ID NO：465的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：464的胺基酸序列或與SEQ ID NO：464的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：462的胺基酸序列或與SEQ ID NO：462的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：463的胺基酸序列或與SEQ ID NO：463的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；或
(w)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：473的胺基酸序列或與SEQ ID NO：473的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：472的胺基酸序列或與SEQ ID NO：472的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：470的胺基酸序列或與SEQ ID NO：470的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：471的胺基酸序列或與SEQ ID NO：471的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
項118：一種單離的核酸分子，其包含編碼項1-117任一項的結合蛋白的核苷酸序列。
項119：一種表現載體，其包含項118的核酸分子。
項120：一種單離的宿主細胞，其包含項118的核酸分子。
項121：一種單離的宿主細胞，其包含項119的表現載體。
項122：項120或項121的單離的宿主細胞，其中所述宿主細胞是哺乳動物細胞或昆蟲細胞。
項123：一種載體系統，其包含一個或多個編碼項1-117任一項的結合蛋白的第一、第二、第三和第四多肽鏈的載體。
項124：項123的載體系統，其中所述載體系統包含編碼所述結合蛋白的第一多肽鏈的第一載體，編碼所述結合蛋白的第二多肽鏈的第二載體，編碼所述結合蛋白的第三多肽鏈的第三載體，和編碼所述結合蛋白的第四多肽鏈的第四載體。
項125：項123的載體系統，其中所述載體系統包含編碼所述結合蛋
白的第一和第二多肽鏈的第一載體，及編碼所述結合蛋白的第三和第四多肽鏈的第二載體。
項126：項123-125任一項的載體系統，其中所述一個或多個載體是表現載體。
項127：一種單離的宿主細胞，其包含項123-126任一項的載體系統。
項128：項127的單離的宿主細胞，其中所述宿主細胞是哺乳動物細胞或昆蟲細胞。
項129：一種生產結合蛋白的方法，該方法包括：
a)在使宿主細胞表現所述結合蛋白的條件下培養項120-122和項127-128任一項的宿主細胞；和
b)從該宿主細胞分離所述結合蛋白。
項130：一種預防和/或治療患者中的HIV感染的方法，包括對所述患者投予治療有效量的項1-117的任一項的至少一種結合蛋白。
項131：項130的方法，其中所述結合蛋白與標準抗逆轉錄病毒治療共同投予。
項132：項130或項131的方法，其中所述至少一種結合蛋白的投予導致一個或多個HIV病毒體的中和。
項133：項130-132任一項的方法，其中所述至少一種結合蛋白的投予導致所述患者中一個或多個潜伏和/或慢性HIV感染的細胞的清除。
項134：項130-133任一項的方法，其中所述患者是人。
如下實施例用於說明本發明的具體實施方案，及其多種用途。將它們示出僅出于例示目的，而不應當認為是以任何方式限定本發明的範圍。
實施例1：靶向HIV Env糖蛋白的三特異性結合蛋白的生產
HIV-1包膜糖蛋白(Env/gp160)定位於病毒顆粒的表面上，且是由同二聚體組成，所述同二聚體包含3個非共價連接的跨膜gp41和gp120複合體。Env使病毒能够通過如下進入靶細胞：與HIV的主要受體(CD4)和輔
助受體(CCR5或CXCR4)結合，然後誘導由gp41的構象變化促進的病毒/細菌膜融合，導致病毒衣殼的進入和病毒基因組遞送進入宿主細胞。此外，Env在感染的細胞表面表現。
Env作為中和抗體在HIV-1病毒體上的唯一靶標。中和抗體對病毒Env的結合抑制病毒附著/進入。此外，中和抗體與HIV-1感染的、表現Env的細胞的結合導致所述細胞被抗體依賴性細胞介導的胞毒作用(ADCC)和補體依賴性胞毒作用(CDC)破壞，導致潜伏病毒庫的减少。因此，靶向Env的中和抗體是抗病毒治療開發的一片引人注目的領域。然而，由於HIV-1病毒的高序列多樣性和突變率，已經證明靶向Env的中和抗體的開發是具有挑戰性的，這是由於給出的HIV-1株很可能缺乏任何給出的中和抗體的表位，或是已演化出突變而變得耐受該抗體。在開發靶向HIV-1的新的中和抗體時，必須開發出策略來减緩病毒株的快速進展(breakthrough)。本文描述的研究探索了新的三特異性結合蛋白的開發，所述三特異性結合蛋白包含形成3個抗原結合位點的4個多肽，所述3個抗原結合位點特異性結合HIV Env糖蛋白上的3個不同表位，本發明還探索了這些新的三特異性結合蛋白在中和HIV-1中的用途。
方法
結合蛋白生產和純化
通過將設計的重鏈和輕鏈基因摻入哺乳動物表現載體中，而構建了表現三特異性結合蛋白的載體。自發地發生對應的重鏈和輕鏈配對，並且通過Fc區中工程化的節-入-穴突變來促進異二聚體形成。
在Expi293細胞中通過共轉染4個表現質體而產生結合蛋白(Life Technologies,Expi293TM表現系統套組，目錄號A14635)。用兩步純化策略純化結合蛋白。首先，將結合蛋白捕獲于蛋白A親和色譜樹脂上，洗滌，然後在pH 3.0的甘胺酸中洗脫。然後將洗脫的蛋白在PBS中進行透析，濃縮，並過濾。用Superdex 200 SEC柱將過濾的抗體進一步純化以獲得單體結合蛋白。
結合蛋白的親和力測量
通過用Biacore3000儀器(GE Healthcare)進行表面等離子體共振(SPR)，測量抗HIV三特異性結合蛋白的結合親和力。
通過使用Biacore儀器的表面等離子體共振(SPR)分析，按照如下測量了指定的蛋白對于HIV-1蛋白gp41上的MPER結合位點的親和力：首先在與抗人Fc抗體偶聯的CM5芯片上捕獲結合蛋白，然後是30μL/分鐘的多個濃度(100nM-6.25nM)的MPER結合肽(乙醯基-RRRNEQELLELDKWASLWNWFDITNWLWYIRRR-Ttds-Lys-(生物素)-NH2)(SEQ ID NO：284)穿過物(flowthrough)，並通過在Biacore 3000上于25℃測量240秒的締合(association)和300秒的解離來檢測結合。用HBS-EP緩衝劑進行樣品稀釋，以及運行緩衝劑。用3M MgCl2以30μL/分鐘進行芯片再生。用BIA評估軟件v.4.1(GE Healthcare)進行數據分析。用1：1 Langmuir模型與傳質(mass transfer)對數據進行全域擬合(fit globally)。在基于軟件的曲綫擬合後，計算MPER結合肽的各個濃度處的ON和OFF率(reates)並將其用於獲得各個結合蛋白的結合親和力。
指定的蛋白對于HIV-1蛋白gp120上的CD4BS結合位點的親和力通過SPR按照如下來測量：在CM5芯片上捕獲重組HIV-1 gp120(Thr27-Arg498)蛋白(HIV-1/進化枝(Clade)B/C(CN54),ARCO Biosystems(目錄號GP4-V15227))，然後是30μL/分鐘的多個濃度(100nM-6.25nM)的結合蛋白穿過物，並通過在Biacore 3000上于25℃測量240秒的締合和300秒的解離來檢測結合。用HBS-EP緩衝劑進行樣品稀釋，以及運行緩衝劑。用3M MgCl2以30μL/分鐘進行芯片再生。用BIA評估軟件v.4.1(GE Healthcare)進行數據分析。用1：1 Langmuir模型與傳質對數據進行全域擬合。在基于軟件的曲綫擬合後，計算結合蛋白的各個濃度處的ON和OFF率並將其用於獲得各個結合蛋白的結合親和力。
構象穩定性和聚集測定
通過確定熔點Tm和聚集起始溫度(Tagg)來測定三特異性結合蛋白的構象穩定性。
通過差示掃描熒光測定法(DSF)來進行熔點Tm測量。將樣品于D-
PBS緩衝劑(Invitrogen)中稀釋至0.2μg/μL的終濃度，包括白色Sem-skirt 96孔板(BIORAD)中的SYPRO-橙染料(Invitrogen，于DMSO中的5000X儲液)在D-PBS中的4X濃縮溶液。所有測量用MyiQ2實時PCR儀(BIORAD)以一式兩份進行。熔點曲綫的負一階微分曲綫(Negative first derivative curves)(-d(RFU)/dT)在iQ5軟件v2.1(BIORAD)中生成。然後將數據導出至Excel中用於Tm確定和圖形顯示。
還通過靜態光散射(SLS)使用Unit儀器(Unchained Labs)測量了熔點Tm和聚集起始溫度(Tagg)。將9μL的各樣品未經稀釋地加載至多槽陣列中。然後將樣品以0.3℃/分鐘的速率從20℃加熱至95℃。將色胺酸熒光光譜的重心均值(barycentric mean,BCM)用於測量蛋白熔解曲綫，並確定Tm值。用266nm靜態光散射(SLS)信號來測量聚集曲綫並確定Tagg。用Unit分析軟件v2.1來進行數據分析。
結果
開發了新策略用於改進中和抗體對HIV-1的效力，並同時限制病毒由於高序列多樣性和/或病毒突變所致的突破性進展的可能性。該策略涉及三特異性結合蛋白的產生，所述三特異性結合蛋白包含形成3個抗原結合位點的4個多肽，所述3個抗原結合位點特異性結合HIV Env糖蛋白上的三個不同表位(圖1)。每個抗原結合位點包含來自靶向Env糖蛋白上不同表位的不同的HIV-1中和抗體的VH和VL域。三特異性結合蛋白含有第一對多肽和第二對多肽，所述第一對多肽具有雙重可變域，其具有交叉取向，形成兩個不同的抗原結合位點(稱為CODV Ig形式)，所述第二對多肽各自具有單一可變域，其形成第三抗原結合位點(圖1A和1B)。
第一對多肽(其具有雙重可變域)包含具有結構VL2-連接子-VL1-連接子-免疫球蛋白輕鏈恒定域的第一多肽，和具有結構VH1-連接子-VH2-連接子-免疫球蛋白CH1、鉸鏈、CH2和CH3重鏈恒定域的第二多肽，產生具有交叉取向的多肽對，其形成兩個不同的抗原結合位點：VH1-VL1和VH2-VL2(圖1C和1D，參見輕鏈和重鏈B)。第二對多肽(其各自具有單一可變域)包含具有結構VH3-免疫球蛋白CH1、鉸鏈、CH2和CH3重鏈恒定域的第一多肽，
以及具有結構VL3-免疫球蛋白輕鏈恒定域的第二多肽，產生一對多肽，其形成第三抗原結合位點：VH3-VL3(圖1C和1D，參見輕鏈和重鏈A)。此外，構建三特異性結合蛋白以包括LS突變。另外，構建三特異性結合蛋白從而使得在一個結合蛋白內一個CH3域包括節突變而另一個CH3包括穴突變，以促進重鏈的異二聚體化(圖1)。
使用上述用於三價結合蛋白設計的方法，生成了3種三特異性結合蛋白(結合蛋白2、3和24)。這些三特異性結合蛋白通過如下而產生：將分離自(三個)抗體的VH和VL域移接到三特異性結合蛋白框架上，所述(三個)抗體靶向HIV-1 Env糖蛋白上的3個獨特表位，所述(三個)抗體為：MPER Ab(靶向gp41上的MPER表位)、CD4BS Ab“b”(靶向gp120上的CD4結合位點)和針對V1/V2的Ab“a”(靶向gp120上的V1/V2域)。構建結合蛋白2使得第一對多肽(其形成2個抗原結合位點)靶向HIV-1 Env糖蛋白表位MPER和V1/V2，且第二對多肽(其形成單個抗原結合位點)靶向HIV-1 Env糖蛋白表位CD4BS(結合蛋白2=MPER x V1/V2/CD4BS)。構建結合蛋白3使得第一對多肽(其形成2個抗原結合位點)靶向HIV-1Env糖蛋白表位V1/V2和MPER，且第二對多肽(其形成單個抗原結合位點)靶向HIV-1 Env糖蛋白表位CD4BS(結合蛋白3=V1/V2 x MPER/CD4BS)。構建結合蛋白24使得第一對多肽(其形成2個抗原結合位點)靶向HIV-1Env糖蛋白表位V1/V2和CD4BS，且第二對多肽(其形成單個抗原結合位點)靶向HIV-1 Env糖蛋白表位MPER(結合蛋白24=V1/V2 x CD4BS/MPER)。將3種三特異性結合蛋白及其親本抗體在蛋白A親和樹脂上純化(圖2A和3A)，然後通過大小排阻色譜純化(圖2B和3B)以得到適于進一步表徵的單體蛋白。所有3種三特異性結合蛋白均是穩定的且以高頻率形成單體。
為了測試開發靶向兩個不同HIV-1 Env蛋白表位(而非3個)的結合蛋白的潜在可能，基于上文所述的CODV Ig形式設計了雙特異性結合蛋白(參見WO 2012/135345)，所述設計使用來自親本抗體的兩個不同的VH和VL域來進行，所述親本抗體與用於生成所述三特異性結合蛋白的是相同的。然而，具有這些特異性可變域的雙特異性結合蛋白並未充分純化為單體，在與對應的三特異性結合蛋白相比時顯示出顯著增加的聚集體形成(圖4A 和4B)。
然後，測量了純化的三特異性結合蛋白(及其親本抗體)對gp41和gp120上的HIV-1 Env糖蛋白表位的結合親和力。首先，通過Biacore測定使用MPER結合肽測量了3種三特異性結合蛋白以及親本MPER抗體對gp41的結合親和力(圖5)。計算出對MPER抗體的結合親和力為18.7nM。令人驚奇地，3種三特異性結合蛋白對于MPER結合肽都具有比親本抗體更高的親和力(表3)，而結合蛋白2具有為MPER抗體約3.1倍高的親和力(分別為6.05nM對18.7nM)。
類似地，通過Biacore測定來測量了3種三特異性結合蛋白以及親本CD4BS抗體對gp120上的CD4結合位點的結合親和力(圖6)。所述3種三特異性結合蛋白對于CD4結合位點都具有與親本抗體相比相似的親和力(表4)。
因此，三特異性結合蛋白能够結合兩種測試的HIV-1 Env糖蛋白上的靶標表位(表5)。此外，全部3種三特異性結合蛋白都以與其親本抗體近似相等或更高的親和力結合靶標表位。針對V1/V2的Ab“a”的結合親和力，以及3種三特異性結合蛋白2、3和24內的針對V1/V2的Ab“a”結合位點無法通過Biacore分析來確定，因為這需要特定的gp120蛋白抗原，其是不可獲得的。
測試了三特異性結合蛋白和親本抗體的生物物理學特性(表6)。所有測試蛋白均具有相似的穩定性和有限的形成聚集體的傾向。
這些實驗表明能够構建並有效地純化靶向HIV-1 Env糖蛋白上3個不同表位的穩定的單體三特異性結合蛋白。此外，所述三特異性結合蛋白保留其結合靶標表位的能力，並具有相較于其親本抗體相似的或改進的親和力。最後，所述三特異性結合蛋白具有合適的生物物理學特性，並顯示出
比對應的雙特異性結合蛋白顯著更少的聚集。
實施例2：結合蛋白的表徵
由於成功開發了3種具有適當生物物理學特性和結合能力的三特異性結合蛋白(如實施例1所示)，開發並測試了21種其他的三特異性結合蛋白。本文所述的實驗探索了24種三特異性結合蛋白在體外中和HIV-1的能力，以及這些三特異性結合蛋白的一些在體內的藥代動力學特性。
用TZM-bl測定法進行了測量中和的中和測定，所述中和作為單輪Env-假型病毒感染後HIV-1 Tat調控的螢火蟲熒光素酶(Luc)報告基因表現降低的函數。所述測定如Marcella Sarzotti-Kelsoe等，J.Immunological Methods,409：131-146(2014)中所述進行。多種抗體的中和結果示于表8-10中。
方法
Env-假型病毒的產生
Env-假型病毒的測定儲存物通過用兩種質體共轉染而產生于293T/17細胞中，所述質體為：Env表現質體和表現除Env之外的完整HIV-1基因組的質體。這些質體的共轉染產生感染性假病毒顆粒，其能够將Tat基因遞送至靶細胞中，但用這些假病毒體的感染本身不能產生感染性的病毒後代。
病毒中和測定
使用TZM-b1細胞(也稱為JC53BL-13細胞)如前文所述進行了HIV感染的中和(Marcella Sarzotti-Kelsoe等，J.Immunological Methods,409：131-146(2014))。簡言之，在TZM-b1細胞(CXCR-4-陽性的HeLa細胞克隆)中用Env-假型化的HIV-1病毒體進行了單輪感染。工程改造TZM-b1細胞以表現CD4和CCR5，並含有整合的用於螢火蟲熒光素酶和大腸杆菌β-半乳糖苷酶的報告基因，其處於HIV長末端重複的控制下。在單輪感染後不久，由病毒Tat蛋白(通過假型化的病毒遞送)以反式誘導報告基因表現。將熒光素酶活性按相對熒光單位(RLU)進行定量，並在很廣範圍的數值內與初始接種體中存在的感染性病毒顆粒的數量成正比。測量中和，其作為在投
予不同濃度的指定結合蛋白後降低的Tat調控的螢火蟲熒光素酶(Luc)報告基因表現的函數。按照蛋白稀釋度來鑑定中和效價，在所述稀釋度處RLU在减去背景RLU後與病毒對照孔相比降低80%。在96孔板中進行測定用於高通量能力，並且利用充分表徵的參考株用於研究之間的統一性。
藥代動力學(PK)測量
將重量為3-6kg的雌性印度恒河猴(rhesus macaques)根據體重隨機分配至各組(每組兩隻恒河猴)並以指定的結合蛋白濃度靜脈內注射。在注射前第0天和注射後第30分鐘、第6小時、第1天、第2天、第4天、第7天、第14天、第21天和第28天從動物收集血液。用基于RSC3的ELISA測定在來自收集血液的血漿中對各個結合蛋白的血清濃度進行定量。
結果
按照實施例1中所述生成並純化了靶向3個獨特HIV-1 Env糖蛋白表位的21個其他的三特異性結合蛋白。這21個其他的三特異性結合蛋白(結合蛋白1和4-23)通過如下產生：將分離自(數個)抗體的VH和VL域移接至三特異性結合蛋白框架上，所述(數個)抗體靶向HIV-1 Env糖蛋白上不同的HIV-1表位，所述(數個)抗體為：抗MPER抗體MPER Ab“a”和MPER Ab“b”(靶向gp41上的MPER表位)、抗CD4BS抗體CD4BS Ab“a”和CD4BS Ab“b”(靶向gp120上的CD4結合位點)、抗V1/V2抗體針對V1/V2的Ab“a”和針對V1/V2的Ab“b”(靶向gp120上的V1/V2域)和抗V3抗體針對V3的Ab(靶向gp120上的V3環)(表7)。
針對一組208種不同HIV-1 Env-假型化病毒測試了5個三特異性結合蛋白(及其親本抗體)在不同濃度處的病毒中和能力(表8)。用TZM-b1熒光素酶報告基因測定測量了結合蛋白介導的對假型化HIV-1分離株的中和。按照稀釋度計算各個結合蛋白的抑制劑量，所述稀釋度在感染後引起發光的80%降低(IC80)。令人驚奇地，對各個測試三特異性結合蛋白計算出的IC80幾何平均數低於親本抗體，表明這些三特異性結合蛋白中和假型化HIV-1的效力比其親本中和抗體更强有力。
然後，針對代表10個不同HIV-1進化枝的20種假型化病毒測試了不同濃度處的一大組三特異性結合蛋白(及其親本抗體)的病毒中和能力(表9)。三特異性結合蛋白針對這20種病毒的感染提供了穩固的保護(表10)。
最終，在恒河猴中測試了一個亞組的三特異性結合蛋白和親本抗體的藥代動力學(PK)特徵。簡言之，將10或20mg/kg的蛋白靜脈內注射至雌性恒河猴中，並對來自注射前取得的血液樣品的血漿進行ELISA測定，並對來自注射後許多時間點(直至42天)處取得的血液樣品的血漿進行ELISA測定(圖7)。所有的三特異性結合蛋白都能在IV投予後至少14天檢測到，其中結合蛋白1在注射後至少35天仍是可檢測到的，說明結合蛋白在體內是穩定的。
總而言之，這項數據說明可以構建廣泛的中和性三特異性結合蛋白，其靶向HIV-1 Env糖蛋白上的3個獨特表位。這些結合蛋白顯示出相較于
親本中和抗體相似的或增加的效力/大幅改進的中和能力(幅度)。此外，這些三特異性結合蛋白表現為在體內是充分耐受的。不願受理論的束縛，廣泛的針對HIV上多個表位的中和性三特異性結合蛋白的開發可以得到相對于單特異性或雙特異性抗體改進的抗病毒治療，而HIV病毒顆粒對中和性三特異性結合蛋白上的所有3個抗原結合位點有抗性的可能性比分別對單特異性或雙特異性中和抗體上的單一或雙抗原結合位點有抗性的可能性更低。
實施例3：T細胞銜接體的表徵
如上文所述，Env表現于HIV感染的細胞表面上。因此，Env可以充當抗體靶標來鑑定感染的細胞，並誘導抗體依賴性細胞介導的胞毒作用(ADCC)和補體依賴性胞毒作用(CDC)，導致潜伏病毒庫的减少。本文所述的研究探索了新的三特異性結合蛋白(稱為“T細胞銜接體”)的開發，所述三特異性結合蛋白含有3個抗原結合位點，其靶向3個不同的抗原(HIV-1 Env糖蛋白、CD3和CD28)。這些新蛋白不僅包括來自中和抗體的抗原結合位點，還包括結合效應T細胞的能力，將其帶至極為接近感染的靶細胞，從而誘導HIV感染細胞的裂解。
方法
T細胞銜接體的結合特性
通過ELISA測定來測量了T細胞銜接體的結合特性，其通過使用辣根過氧化物酶綴合的抗Fab探針來檢測結合至用gp120的CD3、CD28、或表面重塑穩定化核心3(RSC3)蛋白塗覆的ELISA平板表面的T細胞銜接體來進行。來自Cambridge Biologics,MA,USA的人CD3ge-hIgG4(KIH)(目錄號：03-01-0051)；來自Cambridge Biologics,MA,USA的人CD28-hIgG4(目錄號：03-01-0303)。
T細胞激活測定
按照如下來測量CD4和CD8 T細胞激活：從獲取自未處理的(naïve)供體(NIH血庫)的血沉棕黃層(buffy coat)用磁珠(Miltenyi Biotec)富集外周血單核細胞(PBMC)。將這些細胞與未感染的或HIV-1感染的CEM細胞在
增加濃度(0.01-1.0μg/mL)的結合蛋白及布雷菲德菌素A(brefeldin A)存在下共培養14-16小時。然後將細胞針對T細胞標志物(CD3、CD4和CD8)和激活標志物(CD25和CD69)的表面表現進行染色，然後用熒光綴合的抗體(BD Biosciences,eBiosciences,Biolegend)對細胞因子(IFN-γ、TNF-α和IL-2)進行細胞內染色。表現各細胞因子或激活標志物的CD4和CD8 T細胞的數量通過如下來確定：在LSRII流式細胞儀上運行樣品並用Flowjo軟件(Treeestar)分析數據。
CD3下調
通過用非競爭性小鼠抗人CD3抗體對激活的PBMC進行染色，來測量由T細胞銜接體導致的T細胞激活後的CD3下調，並用流式細胞術來定量。
細胞毒性測定
T細胞銜接體對CEM-BaL、ACH2和J1.1細胞的細胞毒性通過流式細胞術按照如下進行監測：從NIH AIDS Reagent Program獲取潜伏細胞系(ACH2、J1.1、OM10)。這些細胞的激活通過如下來進行：在TNF-α(10ng/mL)的存在或不存在下培養細胞14-16小時。通過確定細胞表面HIV包膜糖蛋白的表現來測量激活，所述確定通過流式細胞術用綴合有別藻藍蛋白的抗HIV Env抗體(2G12)來進行。用膜染料PKH-26(Sigma)來標記CEM-IIIb、ACH2、J1.1和OM10細胞並將所述細胞用作細胞毒性測定中的靶細胞。將這些帶標記的靶細胞與作為效應細胞的富集的人T細胞以10：1的E：T比率在增加量的結合蛋白存在下共培養14-16小時。通過如下來確定靶細胞中細胞裂解的程度：用活/死細胞標志物(Life technologies)染色並測量帶標記的靶細胞群體中死細胞的數量，所述測量通過在LSRII流式細胞儀上運行所述樣品然後用Flowjo軟件(Treestar)分析來進行。
結果
探索了開發具有抗原結合位點的T細胞銜接體的能力，所述抗原結合位點靶向T細胞表面蛋白和HIV-1上的中和表位二者。構建了這樣的T細胞銜接體，其含有靶向兩個不同T細胞表面受體(CD3和CD28)的兩個抗原結合位點，以及靶向HIV-1 Env糖蛋白的第三抗原結合位點(圖8A和 8B)。此外，構建T細胞銜接體以包括LS突變。此外，構建T細胞銜接體從而使得在一個結合蛋白內，一個CH3域包括節突變而另一個CH3域包括穴突變，以促進重鏈的異二聚體化(圖8A和8B)。
使用該技術，構建兩個T細胞銜接體，其靶向T細胞表面蛋白和HIV-1 Env糖蛋白二者(結合蛋白32和CD3 x CD28/CD4BS“b”Ab)。這兩個T細胞銜接體通過如下來生成：將分離自親本抗體(靶向T細胞表面蛋白CD3和CD28)和抗HIV-1抗體CD4BS Ab“b”(靶向gp120上的CD4結合位點)的VH和VL域移接至三特異性結合蛋白上。構建結合蛋白32從而使第一對多肽(其形成2個抗原結合位點)靶向T細胞表面受體CD28和CD3，而第二對多肽(其形成單個抗原結合位點)靶向HIV-1抗原CD4BS(結合蛋白32=CD28 x CD3/CD4BS)。構建CD3 x CD28/CD4BS“b”Ab三特異性結合蛋白從而使第一對多肽(其形成2個抗原結合位點)靶向T細胞表面受體CD3和CD28，且第二對多肽(其形成單個抗原結合位點)靶向HIV-1抗原CD4BS(表11)。
2個T細胞銜接體結合其3個靶標抗原的每一個的能力通過ELISA測定來測試。所述T細胞銜接體能够以T細胞銜接體的雙特異性臂中的CD3和CD28抗原結合位點按任一方向來結合CD3和CD28 T細胞表面蛋白二者(即CD3 x CD28針對CD3 x CD28/CD4BS Ab“b”或CD28 x CD3針對結合蛋白32)。兩個T細胞銜接體均能够結合至gp120(如使用HIV-1 RSC3蛋白(一種缺乏V1、V2和V3可變區的gp120變體)所測得的)(圖9)。
然後測試兩種T細胞銜接體對T細胞活性的效果。T細胞銜接體與單核細胞的溫育揭示了T細胞銜接體誘導穩固的CD8+ T細胞激活(圖10)。類似地，T細胞銜接體能够單獨在PBMC或在與HIV-1感染的T細胞系
CEM-NKr細胞或CEM-BaL細胞任一者一起溫育的PBMC上誘導顯著的CD4+ T細胞激活(圖11)。此外，兩種T細胞銜接體均降低CD3的在激活的T細胞上的細胞表面表現(圖12)。
最終，測試了T細胞銜接體誘導HIV感染的細胞裂解的能力。將T細胞銜接體(及靶向CD3和HIV抗原的陽性和陰性對照雙特異性結合蛋白)與HIV-1感染的T細胞系CEM-BaL細胞一起溫育。將T細胞銜接體與感染的細胞一起溫育在廣範圍的濃度誘導了穩固的細胞裂解(圖13A)。同樣地，對這些T細胞銜接體的溫育誘導潜伏感染的T細胞系ACH2細胞(圖13B)及J1.1細胞(圖13C)的裂解。令人驚奇地，所述T細胞銜接體顯示出與雙特異性結合蛋白相比相當的或更佳的針對慢性或潜伏HIV感染的細胞系的細胞毒性活性。
總而言之，本文所述的新的T細胞銜接體保留了來自其親本抗體的結合其在HIV-1 Env糖蛋白gp120上的靶標抗原的能力，以及結合細胞表面暴露的T細胞蛋白CD3和CD28的能力。T細胞銜接體誘導穩固的CD4+和CD8+ T細胞激活，並减弱CD3表面表現。最終，這些T細胞銜接體誘導HIV-1感染的T細胞的顯著裂解。不願受理論束縛，通過HIV/AIDS患者中的T細胞銜接而减少/清除潜伏病毒庫，這些T細胞銜接體可能為抗病毒治療提供新的策略。
雖然本發明包括了多種實施方案，應當理解對本領域技術人員可以出現變化和修飾。因此，意欲所附的權利要求書涵蓋所有的此類等同變化，其落在本發明的範圍內。此外，本文所用的章節標題僅出于組織的目的，而不應理解為對所述主題進行限制。
除非清楚的相反指示外，本文所述的各個實施方案可以與任何其他一個或多個實施方案進行組合。具體而言，除非清楚的相反指示外，指示為優選的或有利的任何特徵或實施方案可以與指示為優選的或有利的任何其他一個或多個特徵或一個或多個實施方案進行組合。
本申請引用的所有文獻通過提述明確並入本文。
表1：結合蛋白1-53及所述結合蛋白所針對的靶抗原的重鏈和輕鏈序列號(SEQ ID NO)。
表C：親本抗體的可變域序列
CDR序列以下劃綫表示。
可變域修飾以粗體和斜體顯示。
<110> 法商賽諾菲公司(SANOFI) 美國衛生及公共服務部(THE UNITED STATES OF AMERICA,AS REPRESENTED BY THE SECRETARY,DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES)
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<223> 合成構建體
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成構建體
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<212> PRT
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<220>
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<220>
<223> 合成構建體
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<210> 523
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成構建體
<400> 523
<210> 524
<211> 112
<212> PRT
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<220>
<223> 合成構建體
<400> 524
<210> 525
<211> 5
<212> PRT
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<220>
<223> 合成構建體
<400> 525
<210> 526
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 526
Claims (22)
- 一種結合蛋白，其包含形成3個抗原結合位點的4條多肽鏈，該3個抗原結合位點特異性結合一或多個HIV靶蛋白以及一或多個T細胞靶蛋白，其中第一多肽鏈包含如下式表示的結構：VL2-L1-VL1-L2-CL [I]且第二多肽鏈包含如下式表示的結構：VH1-L3-VH2-L4-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [II]且第三多肽鏈包含如下式表示的結構：VH3-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [III]且第四多肽鏈包含如下式表示的結構：VL3-CL [IV]其中：VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變域；VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變域；VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變域；VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變域；VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變域；VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變域；CL是免疫球蛋白輕鏈恒定域；CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恒定域；CH2是免疫球蛋白CH2重鏈恒定域；CH3是免疫球蛋白CH3重鏈恒定域；鉸鏈是連接CH1和CH2域的免疫球蛋白鉸鏈區；且L1、L2、L3和L4是胺基酸連接子；其中該式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對。
- 如請求項1的結合蛋白，其中該一或多個HIV靶蛋白為糖蛋白120、糖蛋白41及糖蛋白160中的一或多個；一或多個T細胞靶蛋白為CD3或CD28；且其中：(a)所述結合蛋白是三特異性的，且能夠特異性結合HIV靶蛋白以及單一T細胞靶蛋白上的2個不同表位；(b)所述結合蛋白是三特異性的，且能夠特異性結合HIV靶蛋白以及2個不同的T細胞靶蛋白；(c)所述結合蛋白是三特異性的，且能夠特異性結合T細胞靶蛋白以及單一HIV靶蛋白上的2個不同表位；(d)所述結合蛋白是三特異性的，且能夠特異性結合T細胞靶蛋白以及2個不同的HIV靶蛋白；或(e)所述第一和第二多肽鏈形成兩個抗原結合位點，其特異性地靶向兩個T細胞靶蛋白，且所述第三和第四多肽鏈形成抗原結合位點，其特異性結合HIV靶蛋白。
- 如請求項1或2的結合蛋白，其中：(a)VL1包含含有以下項目的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3：分別為SEQ ID NO：266、267及268的序列；分別為SEQ ID NO：269、270及271的序列；分別為SEQ ID NO：500、501及274的序列；分別為SEQ ID NO：275、276及277的序列；分別為SEQ ID NO：281、282及283的序列；分別為SEQ ID NO：275、276及277的序列；分別為SEQ ID NO：281、282及283的序列；分別為SEQ ID NO：278、279及280的序列；分別為SEQ ID NO：488、489及490的序列；分別為SEQ ID NO：491、492及493的序列；或分別為SEQ ID NO：494、495及496的序列；(b)VL1包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域含有選自由以下所組成之群組的序列：SEQ ID NO：512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523，以及524；(c)VL2包含含有以下項目的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3：分別為SEQ ID NO：266、267及268的序列；分別為SEQ ID NO：269、270及271 的序列；分別為SEQ ID NO：500、501及274的序列；分別為SEQ ID NO：275、276及277的序列；分別為SEQ ID NO：281、282及283的序列；分別為SEQ ID NO：278、279及280的序列；分別為SEQ ID NO：488、489及490的序列；分別為SEQ ID NO：491、492及493的序列；或分別為SEQ ID NO：494、495及496的序列；(d)VL2包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域含有選自由以下所組成之群組的序列：SEQ ID NO：512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523，以及524；(e)VL3包含含有以下項目的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3：分別為SEQ ID NO：266、267及268的序列；分別為SEQ ID NO：269、270及271的序列；分別為SEQ ID NO：500、501及274的序列；分別為SEQ ID NO：275、276及277的序列；分別為SEQ ID NO：281、282及283的序列；分別為SEQ ID NO：278、279及280的序列；分別為SEQ ID NO：488、489及490的序列；分別為SEQ ID NO：491、492及493的序列；或分別為SEQ ID NO：494、495及496的序列；(f)VL3包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域含有選自由以下所組成之群組的序列：SEQ ID NO：512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523，以及524；(g)VH1包含含有以下項目的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3：分別為SEQ ID NO：248、497及250的序列；分別為SEQ ID NO：251、252及253的序列；分別為SEQ ID NO：254、255及256的序列；分別為SEQ ID NO：254、255及498的序列；分別為SEQ ID NO：257、258及259的序列；分別為SEQ ID NO：263、264及265的序列；分別為SEQ ID NO：499、261及262的序列；分別為SEQ ID NO：479、480及481的序列；分別為SEQ ID NO：482、483及484的序列；或分別為SEQ ID NO：485、486及487的序列；(h)VH1包含重鏈可變域，該重鏈可變域含有選自由以下所組成之群組的序列：SEQ ID NO：502、503、504、505、506、507、508、509、510，以及511；(i)VH2包含含有以下項目的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3：分別為SEQ ID NO：248、497及250的序列；分別為SEQ ID NO：251、252及253的序列；分別為SEQ ID NO：254、255及256的序列；分別為SEQ ID NO：254、255及498的序列；分別為SEQ ID NO：257、258及259的序列；分別為SEQ ID NO：263、264及265的序列；分別為SEQ ID NO：499、261及262的序列；分別為SEQ ID NO：479、480及481的序列；分別為SEQ ID NO：482、483及484的序列；或分別為SEQ ID NO：485、486及487的序列；(j)VH2包含重鏈可變域，該重鏈可變域含有選自由以下所組成之群組的序列：SEQ ID NO：502、503、504、505、506、507、508、509、510，以及511；(k)VH3包含含有以下項目的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3：分別為SEQ ID NO：248、497及250的序列；分別為SEQ ID NO：251、252及253的序列；分別為SEQ ID NO：254、255及256的序列；分別為SEQ ID NO：254、255及498的序列；分別為SEQ ID NO：257、258及259的序列；分別為SEQ ID NO：263、264及265的序列；分別為SEQ ID NO：499、261及262的序列；分別為SEQ ID NO：479、480及481的序列；分別為SEQ ID NO：482、483及484的序列；或分別為SEQ ID NO：485、486及487的序列；及/或(l)VH3包含重鏈可變域，該重鏈可變域含有選自由以下所組成之群組的序列：SEQ ID NO：502、503、504、505、506、507、508、509、510，以及511。
- 如請求項1或2的結合蛋白，其中：(a)VL1包含：含有SEQ ID NO：488的序列的CDR-L1，含有SEQ ID NO：489的序列的CDR-L2，和含有SEQ ID NO：490的序列的CDR-L3；VL2包含：含有SEQ ID NO：494的序列的CDR-L1，含有SEQ ID NO：495的序列的CDR-L2，和含有SEQ ID NO：496的序列的CDR-L3；VL3包含：含有SEQ ID NO：269的序列的CDR-L1，含有SEQ ID NO：270的序列的 CDR-L2，和含有SEQ ID NO：271的序列的CDR-L3；VH1包含：含有SEQ ID NO：479的序列的CDR-H1，含有SEQ ID NO：480的序列的CDR-H2，和含有SEQ ID NO：481的序列的CDR-H3；VH2包含：含有SEQ ID NO：485的序列的CDR-H1，含有SEQ ID NO：486的序列的CDR-H2，和含有SEQ ID NO：487的序列的CDR-H3；且VH3包含：含有SEQ ID NO：251的序列的CDR-H1，含有SEQ ID NO：252的序列的CDR-H2，和含有SEQ ID NO：253的序列的CDR-H3；或(b)VL1包含：含有SEQ ID NO：494的序列的CDR-L1，含有SEQ ID NO：495的序列的CDR-L2，和含有SEQ ID NO：496的序列的CDR-L3；VL2包含：含有SEQ ID NO：488的序列的CDR-L1，含有SEQ ID NO：489的序列的CDR-L2，和含有SEQ ID NO：490的序列的CDR-L3；VL3包含：含有SEQ ID NO：269的序列的CDR-L1，含有SEQ ID NO：270的序列的CDR-L2，和含有SEQ ID NO：271的序列的CDR-L3；VH1包含：含有SEQ ID NO：485的序列的CDR-H1，含有SEQ ID NO：486的序列的CDR-H2，和含有SEQ ID NO：487的序列的CDR-H3；VH2包含：含有SEQ ID NO：479的序列的CDR-H1，含有SEQ ID NO：480的序列的CDR-H2，和含有SEQ ID NO：481的序列的CDR-H3；且VH3包含：含有SEQ ID NO：251的序列的CDR-H1，含有SEQ ID NO：252的序列的CDR-H2，和含有SEQ ID NO：253的序列的CDR-H3。
- 如請求項1或2的結合蛋白，其中：(a)VL1包含含有SEQ ID NO：522的序列的輕鏈可變域；VL2包含含有SEQ ID NO：524的序列的輕鏈可變域；VL3包含含有SEQ ID NO：513的序列的輕鏈可變域；VH1包含含有SEQ ID NO：509的序列的重鏈可變域；VH2包含含有SEQ ID NO：511的序列的重鏈可變域；且VH3包含含有SEQ ID NO：503的序列的重鏈可變域；或(b)VL1包含含有SEQ ID NO：524的序列的輕鏈可變域；VL2包含含有SEQ ID NO：522的序列的輕鏈可變域；VL3包含含有SEQ ID NO：513的序列的輕鏈可變域；VH1包含含有SEQ ID NO：511的序列的重鏈可變域； VH2包含含有SEQ ID NO：509的序列的重鏈可變域；且VH3包含含有SEQ ID NO：503的序列的重鏈可變域。
- 如請求項1或2的結合蛋白，其中：(a)該第二多肽鏈的CH3域在對應於人IgG1的位置354和366的位置處包含胺基酸取代，該位置根據EU索引，其中該胺基酸取代為S354C和T366W；且其中該第三多肽鏈的CH3域在對應於人IgG1的位置349、366、368和407的位置處包含胺基酸取代，該位置根據EU索引，其中該胺基酸取代為Y349C、T366S、L368A和Y407V；或(b)該第二多肽鏈的CH3域在對應於人IgG1的位置349、366、368和407的位置處包含胺基酸取代，該位置根據EU索引，其中該胺基酸取代為Y349C、T366S、L368A和Y407V；且其中該第三多肽鏈的CH3域在對應於人IgG1的位置354和366的位置處包含胺基酸取代，該位置根據EU索引，其中該胺基酸取代為S354C和T366W。
- 如請求項1或2的結合蛋白，其中該第二和第三多肽鏈的CH3域均在對應於人IgG1的位置428和434的位置處包含胺基酸取代，該位置根據EU索引，其中該胺基酸取代為M428L和N434S。
- 如請求項1或2的結合蛋白，其中：(a)L1、L2、L3、或L4的至少一個獨立地長度為0個胺基酸；或(b)L1、L2、L3、或L4各自獨立地長度為至少1個胺基酸。
- 如請求項5的結合蛋白，其中L1、L2、L3、及/或L4包含序列Asp-Lys-Thr-His-Thr(SEQ ID NO：525)。
- 一種結合蛋白，其包含第一多肽鏈、第二多肽鏈、第三多肽鏈和第四多肽鏈，其中：(a)該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：305的胺基酸序列或與SEQ ID NO：305的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：304的胺基酸序列或與SEQ ID NO：304的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；該第三多肽鏈包含SEQ ID NO：302的胺基酸序列或與SEQ ID NO：302的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且該第四多肽鏈包含SEQ ID NO：303的胺基酸序列或與SEQ ID NO：303的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；(b)該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：313的胺基酸序列或與SEQ ID NO：313的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：312的胺基酸序列或與SEQ ID NO：312的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；該第三多肽鏈包含SEQ ID NO：310的胺基酸序列或與SEQ ID NO：310的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且該第四多肽鏈包含SEQ ID NO：311的胺基酸序列或與SEQ ID NO：311的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；(c)該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：321的胺基酸序列或與SEQ ID NO：321的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：320的胺基酸序列或與SEQ ID NO：320的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；該第三多肽鏈包含SEQ ID NO：318的胺基酸序列或與SEQ ID NO：318的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且該第四多肽鏈包含SEQ ID NO：319的胺基酸序列或與SEQ ID NO：319的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；(d)該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：329的胺基酸序列或與SEQ ID NO：329的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：328的胺基酸序列或與SEQ ID NO：328的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；該第三多肽鏈包含SEQ ID NO：326的胺基酸序列或與SEQ ID NO：326的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且該第四多肽鏈包含SEQ ID NO：327的胺基酸序列或與SEQ ID NO：327的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；(e)該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：337的胺基酸序列或與SEQ ID NO：337的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：336的胺基酸序列或與SEQ ID NO：336的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；該第三多肽鏈包含SEQ ID NO：334的胺基酸序列或與SEQ ID NO：334的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且該第四多肽鏈包含SEQ ID NO：335的胺基酸序列或與SEQ ID NO：335的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；(f)該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：345的胺基酸序列或與SEQ ID NO：345的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：344的胺基酸序列或與SEQ ID NO：344的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；該第三多肽鏈包含SEQ ID NO：342的胺基酸序列或與SEQ ID NO：342的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且該第四多肽鏈包含SEQ ID NO：343的胺基酸序列或與SEQ ID NO：343的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；(g)該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：353的胺基酸序列或與SEQ ID NO：353的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：352的胺基酸序列或與SEQ ID NO：352的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；該第三多肽鏈包含SEQ ID NO：350的胺基酸序列或與SEQ ID NO：350的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且該第四多肽鏈包含SEQ ID NO：351的胺基酸序列或與SEQ ID NO：351的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；(h)該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：361的胺基酸序列或與SEQ ID NO：361的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：360的胺基酸序列或與SEQ ID NO：360的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；該第三多肽鏈包含SEQ ID NO：358的胺基酸序列或與SEQ ID NO：358的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且該第四多肽鏈包含SEQ ID NO：359的胺基酸序列或與SEQ ID NO：359的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；(i)該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：369的胺基酸序列或與SEQ ID NO：369的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：368的胺基酸序列或與SEQ ID NO：368的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；該第三多肽鏈包含SEQ ID NO：366的胺基酸序列或與SEQ ID NO：366的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且該第四多肽鏈包含SEQ ID NO：367的胺基酸序列或與SEQ ID NO：367的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；(j)該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：377的胺基酸序列或與SEQ ID NO：377的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：376的胺基酸序列或與SEQ ID NO：376的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；該第三多肽鏈包含SEQ ID NO：374的胺基酸序列或與SEQ ID NO：374的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且該第四多肽鏈包含SEQ ID NO：375的胺基酸序列或與SEQ ID NO：375的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；(k)該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：385的胺基酸序列或與SEQ ID NO：385的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：384的胺基酸序列或與SEQ ID NO：384的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；該第三多肽鏈包含SEQ ID NO：382的胺基酸序列或與SEQ ID NO：382的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且該第四多肽鏈包含SEQ ID NO：383的胺基酸序列或與SEQ ID NO：383的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；(l)該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：393的胺基酸序列或與SEQ ID NO：393的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：392的胺基酸序列或與SEQ ID NO：392的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；該第三多肽鏈包含SEQ ID NO：390的胺基酸序列或與SEQ ID NO：390的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且該第四多肽鏈包含SEQ ID NO：391的胺基酸序列或與SEQ ID NO：391的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；(m)該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：401的胺基酸序列或與SEQ ID NO：401的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：400的胺基酸序列或與SEQ ID NO：400的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；該第三多肽鏈包含SEQ ID NO：398的胺基酸序列或與SEQ ID NO：398的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且該第四多肽鏈包含SEQ ID NO：399的胺基酸序列或與SEQ ID NO：399的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；(n)該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：409的胺基酸序列或與SEQ ID NO：409的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：408的胺基酸序列或與SEQ ID NO：408的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；該第三多肽鏈包含SEQ ID NO：406的胺基酸序列或與SEQ ID NO：406的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且該第四多肽鏈包含SEQ ID NO：407的胺基酸序列或與SEQ ID NO：407的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；(p)該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：417的胺基酸序列或與SEQ ID NO：417的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：416的胺基酸序列或與SEQ ID NO：416的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；該第三多肽鏈包含SEQ ID NO：414的胺基酸序列或與SEQ ID NO：414的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且該第四多肽鏈包含SEQ ID NO：415的胺基酸序列或與SEQ ID NO：415的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；(q)該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：425的胺基酸序列或與SEQ ID NO：425的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：424的胺基酸序列或與SEQ ID NO：424的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；該第三多肽鏈包含SEQ ID NO：422的胺基酸序列或與SEQ ID NO：422的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且該第四多肽鏈包含SEQ ID NO：423的胺基酸序列或與SEQ ID NO：423的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；(r)該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：433的胺基酸序列或與SEQ ID NO：433的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：432的胺基酸序列或與SEQ ID NO：432的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；該第三多肽鏈包含SEQ ID NO：430的胺基酸序列或與SEQ ID NO：430的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且該第四多肽鏈包含SEQ ID NO：431的胺基酸序列或與SEQ ID NO：431的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；(s)該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：441的胺基酸序列或與SEQ ID NO：441的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：440的胺基酸序列或與SEQ ID NO：440的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；該第三多肽鏈包含SEQ ID NO：438的胺基酸序列或與SEQ ID NO：438的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且該第四多肽鏈包含SEQ ID NO：439的胺基酸序列或與SEQ ID NO：439的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；(t)該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：449的胺基酸序列或與SEQ ID NO：449的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：448的胺基酸序列或與SEQ ID NO：448的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；該第三多肽鏈包含SEQ ID NO：446的胺基酸序列或與SEQ ID NO：446的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且該第四多肽鏈包含SEQ ID NO：447的胺基酸序列或與SEQ ID NO：447的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；(u)該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：457的胺基酸序列或與SEQ ID NO：457的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；該第二多狀鏈包含SEQ ID NO：456的胺基酸序列或與SEQ ID NO：456的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；該第三多肽鏈包含SEQ ID NO：454的胺基酸序列或與SEQ ID NO：454的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且該第四多肽鏈包含SEQ ID NO：455的胺基酸序列或與SEQ ID NO：455的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；(v)該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：465的胺基酸序列或與SEQ ID NO：465的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：464的胺基酸序列或與SEQ ID NO：464的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；該第三多肽鏈包含SEQ ID NO：462的胺基酸序列或與SEQ ID NO：462的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且該第四多肽鏈包含SEQ ID NO：463的胺基酸序列或與SEQ ID NO：463的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；或(w)該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：473的胺基酸序列或與SEQ ID NO：473的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：472的胺基酸序列或與SEQ ID NO：472的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；該第三多肽鏈包含SEQ ID NO：470的胺基酸序列或與SEQ ID NO：470的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；且該第四多肽鏈包含SEQ ID NO：471的胺基酸序列或與SEQ ID NO：471的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
- 一種單離的核酸分子，其包含編碼如請求項1-10中任一項的結合蛋白的核苷酸序列。
- 一種表現載體，其包含如請求項11的核酸分子。
- 一種載體系統，其包含一個或多個編碼如請求項1-10中任一項的結合蛋白的第一、第二、第三和第四多肽鏈的載體。
- 如請求項13的載體系統，其包含編碼結合蛋白的第一多肽鏈的第一載體、編碼結合蛋白的第二多肽鏈的第二載體、編碼結合蛋白的第三多肽鏈的第三載體及編碼結合蛋白的第四多肽鏈的第四載體。
- 如請求項13的載體系統，其包含編碼結合蛋白的第一與第二多肽鏈的第一載體，及編碼結合蛋白的第三與第四多肽鏈的第二載體。
- 一種單離的宿主細胞，其包含如請求項11的核酸分子、如請求項12的表現載體或如請求項13-15中任一項的載體系統。
- 如請求項16的宿主細胞，其中該宿主細胞是哺乳動物細胞。
- 如請求項16的宿主細胞，其中該宿主細胞是昆蟲細胞。
- 一種生產結合蛋白的方法，該方法包括：a)在使宿主細胞表現該結合蛋白的條件下培養如請求項16-18中任一項的宿主細胞；和b)從該宿主細胞分離該結合蛋白。
- 一種治療有效量之至少一種如請求項1-10中任一項的結合蛋白的用途，其用於製備預防和/或治療患者中HIV感染的藥物。
- 如請求項20的用途，其中該結合蛋白與標準抗逆轉錄病毒治療共同投予。
- 如請求項20或21的用途，其中該患者為人類。
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