KR20230070259A - Cd38 및/또는 cd28에 결합하는 항원 결합 분자, 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

CD38은 악성 형질 세포에서 발현된다. CD28은 T 세포 활성화 및 생존에 필요한 공자극 분자이다. 항-CD38 항체, 항-CD28 항체, 및 이중특이적 항체(bsAb)가 본원에 제공되며, 상기 이중특이적 항체는 CD38과 CD28 모두에 결합하고, CD80 및/또는 CD86에 대한 결합을 통해 T 세포를 활성화시키는 공자극제로서 작용한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자는 CD38을 발현하는 종양의 성장을 억제할 수 있다. 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자는, CD38을 표적으로 하는 면역 반응의 상향조절 또는 유도가 바람직하고/하거나 치료적으로 유익한 질환 또는 장애를 치료하는 데 유용하다. 예를 들어, 본 발명의 이중특이적 항체는 다발성 골수종, 림프종, 및 백혈병을 포함하는 다양한 암의 치료에 유용하다.

Description

CD38 및/또는 CD28에 결합하는 항원 결합 분자, 및 이의 용도
본 발명은 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함하고 CD38 및/또는 CD28에 특이적인 항원 결합 분자, 및 CD38 및/또는 CD28에 특이적인 이중특이적 항원 결합 분자(예를 들어 이중특이적 항체), 및 이의 사용 방법에 관한 것이다.
서열 목록
서열 목록의 공식 사본은, 2021년 9월 17일자로 생성되고 "10786WO01_Sequence_Listing_ST25"의 파일명을 가진 약 56 KB 크기의 ASCII 형식의 서열 목록으로서, EFS-Web을 통해 전자 방식으로 명세서와 함께 동시에 제출된다. 본 ASCII 형식의 문헌에 포함된 서열 목록은 본 명세서의 일부이며 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
다발성 골수종(MM)은 비호지킨 림프종에 이어서 두 번째로 흔한 혈액암으로서, 미국에서만 약 120,000명의 유병자가 있고, 매년 약 30,000건의 새로운 증례가 발생하고 13,000명이 사망한다. MM은 조절되지 않은 방식으로 사이토카인을 분비하는 악성 형질 세포의 클론 증식을 특징으로 한다. 사이토카인, 특히 IL-6의 생산은 골수종과 연관된 많은 증상의 원인이 되는 기관 및 조직의 국소화된 손상을 야기한다. MM을 가진 대상체는 골 통증과 골다공증, 빈혈, 신장 기능 손상과 신부전, 박테리아 감염, 신경학적 장애로 고통받는다. MM은 치유되는 경우가 드물며, 기대 여명 중앙값은 4~5년이다. MM 치료에 있어서 진전이 있었지만, 새로운 치료법은 젊은 환자들에게 불균형적으로 혜택을 주었다. 재발성 MM 환자의 예후는 좋지 않으며, 새로운 치료 접근법이 시급하다.
환형 ADP 리보스 가수분해효소로도 알려진 CD38은 흉선세포, 일부 활성화된 말초 혈액 T 세포 및 B 세포, 형질 세포, 및 수지상 세포에서 발현되는 45 KDa의 표면 당단백질이다. CD38은 세포외 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD+) 및 세포질 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트(NADP)의 대사에 관여하는 세포외 효소로서 기능하여(Howard 등의 문헌[Formation and hydrolysis of cyclic ADP-ribose catalyzed by lymphocyte antigen CD38.　Science　(1993) 262:1056-9]), 환형 아데노신 이인산(ADP) 리보오스, ADP 리보오스(ADPR), 및 니코틴산 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트와 같은 Ca2+-동원 화합물의 생산을 유발한다. 칼슘 조절은 림프구 증식, 췌장에 의한 인슐린 방출, 심근 수축, 호중구 화학주성, 및 T 세포 활성화를 포함하는 광범위한 생리학적 기능을 조절하는 신호 전달 경로를 활성화시킨다. CD38 효소 활성은 NAD+수준을 조절하고 프로테아좀 억제제의 기능을 개선한다(Cagnetta 등의 문헌[Intracellular NAD(+) depletion enhances bortezomib-induced anti-myeloma activity.　Blood　(2013) 122:1243-55]). 또한, ADPR은 CD203a/PC-1 및 CD73에 의해 대사되어 면역억제 분자 아데노신(ADO)을 생산하여, 면역계의 조절로부터 종양 세포가 이탈하는 것을 용이하게 할 수 있다(Chillemi 등의 문헌[Roles and modalities of ectonucleotidases in remodeling the multiple myeloma niche. Front Immunol. (2017) 8:305]). CD38은 B-만성 백혈병/소림프구성 림프종의 증식 가능성에 기여하는 것으로 보이며; 골수 내 악성 형질 세포는 높고 균일한 수준의 CD38을 발현하는 것으로 보인다. 항-CD38 mAb는 골수 유래 억제 세포, 조절 T 세포, 및 조절 B 세포와 같은 CD38+ 면역억제 세포를 고갈시켜, 면역 효과기 세포의 항종양 활성을 증가시키는 것으로 여겨진다. 항-CD38 항체인 다라투무맙은 고전적 요법에 불응성인 다발성 골수종 환자용으로 승인되었다.
T 세포 활성화는, 클래스 II 주요 조직적합성(MHC) 복합체 상에 특이적 항원을 제시하는 항원 제시 세포(예컨대 수지상 세포)가 고도로 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 자극하는 것을 포함하는데, 이는 CD28과 같은 공자극 분자에 의해 촉진될 수 있다. CD28은 5개의 상이한 부위에서 당질화되는 44 KDa 이황화-결합된 동종이량체 수용체이다. CD28은 T 세포(인간 말초 혈액 중 휴지기 CD4+ 세포의 95% 및 휴지기 CD8+ T 세포의 50%) 및 형질모세포 상에서 발현되며, T 세포 활성화 및 생존에 필요한 공자극 신호전달을 제공한다. 공자극은 T 세포의 표면 상의 CD28이 항원 제시 세포 상의 CD80(B7-1) 및 CD86(B7-2)과 결합할 때 발생한다. CD80 발현은 항원 제시 세포(APC)가 활성화되고 APC 상에서 CD86이 APC 상에서 구성적으로 발현될 때, APC에서 상향 조절된다. T 헬퍼 세포의 CD28 공자극은 IL-2R 및 IL-2의 전사를 향상시키고(T 세포 증식을 유도함), Bcl-XL의 발현을 유도하며(T 세포 생존을 강화함), IL-4, IFNγ, IL-1, TNF, IL-5, 다양한 케모카인, 및 이들의 수용체의 생산을 증가시킨다(IL-4의 생산 증가는 Th2 분화를 유도함). 또한, CD28은 T-B 세포 상호작용에 필요한 CD40L 분자와 함께 ICOS, 4-1BB, 및 CTLA-4를 포함하는 몇몇 다른 공자극 분자 및 조절 분자의 발현 또는 상향조절을 유도한다. Mak 및 Saunders의 문헌[The Immune Response, Basic and Clinical Principles, Academic Press, 2006]. TGN1412는 TCR의 공자극이 없는 상태에서 조절 T(TReg) 세포를 우선적으로 활성화시키는 CD28 초작용제 단클론 항체이다. Attarwala의 문헌[TGN1412: From Discovery to Disaster. J Young Pharm. 2010, 2(3): 332-6]. 유감스럽게도, 제1상 임상시험은 6명의 자원자들 모두의 중증 사이토카인 방출 증후군(사이토카인 폭풍)으로 인해 급성 다발성 장기 부전을 초래하였다. Id.
따라서, 당업계에는 암을 치료하기 위한 대안적인 접근법이 필요하다.
본 발명은, 부분적으로, CD38 또는 CD28에 결합하는 단일특이적 항체 및 CD38 및 CD28 모두에 결합하는 이중특이적 항체, 및 암을 포함하는 다양한 치료하는 데 있어서 이들의 용도에 관한 것이다.
항체 또는 이중특이적 항체는 CD38을 발현하는 암을 치료하기 위해 단독으로 사용되거나 다른 제제와 병용으로 사용될 수 있다.
항-CD38 항체 및 이의 항원 결합 단편
일 양태에서, 인간 CD38에 결합하는 항체 및 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다. 항체는, CD38을 발현하는 세포를 표적화하고/하거나 세포자멸사를 유도하는 데 특히 유용할 수 있다. 특정 구현예에서, 항체는 CD38+ 암세포에 대한 항체 의존성 세포 세포독성(ADCC) 및/또는 보체 매개 세포독성(CDC)을 매개하는 데 유용할 수 있다. 본원에 제공된 항-CD38 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 종양 세포와 같은 특정 세포 유형의 CD38을 표적으로 하는 세포독성을 촉진하는 이중특이적 항체의 일부로서 포함될 수 있다.
본원에 제공된 예시적인 항-CD38 항체는 표 1 및 2에 열거되어 있다. 표 1은 예시적인 항-CD38 항체의 중쇄 가변 영역(HCVR) 및 경쇄 가변 영역(LCVR)뿐만 아니라, 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR1, HCDR2 및 HCDR3) 및 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)의 아미노산 서열 식별자를 제시한다. 표 2는 예시적인 항-CD38 항체의 HCVR, LCVR, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3를 암호화하는 핵산 분자의 서열 식별자를 제시한다.
표 1에 열거된 HCVR 아미노산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 HCVR을 포함하는 항-CD38 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다.
표 1에 열거된 LCVR 아미노산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 LCVR을 포함하는 항-CD38 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 또한 본원에 제공된다.
표 1에 열거된 LCVR 아미노산 서열 중 어느 하나 및 이와 쌍을 이룬 표 1에 열거된 HCVR 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 HCVR과 LCVR 아미노산 서열 쌍(HCVR/LCVR)을 포함하는 항-CD38 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다. 특정 구현예에 따르면, 본 발명은 표 1에 열거된 예시적인 항-CD38 항체 중 어느 하나 내에 함유된 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 특정 구현예에서, HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍은 서열번호 2/18(예: mAb1) 및 32/48(예: mAb2)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
표 1에 열거된 HCDR1 아미노산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 중쇄 CDR1(HCDR1)을 포함하는, 항-CD38 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다.
표 1에 열거된 HCDR2 아미노산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 중쇄 CDR2(HCDR2)를 포함하는, 항-CD38 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다.
표 1에 열거된 HCDR3 아미노산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 중쇄 CDR3(HCDR3)을 포함하는, 항-CD38 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다.
표 1에 열거된 LCDR1 아미노산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는, 경쇄 CDR1(LCDR1)을 포함하는, 항-CD38 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다.
표 1에 열거된 LCDR2 아미노산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는, 경쇄 CDR2(LCDR2)를 포함하는, 항-CD38 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다.
표 1에 열거된 LCDR3 아미노산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는, 경쇄 CDR3(LCDR2)을 포함하는, 항-CD38 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다.
표 1에 열거된 LCDR3 아미노산 서열 중 어느 하나 및 이와 쌍을 이룬 표 1에 열거된 HCDR3 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 HCDR3 및 LCDR3 아미노산 서열 쌍(HCDR3/LCDR3)을 포함하는 항-CD38 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다. 특정 구현예에 따르면, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 표 1에 열거된 예시적인 항-CD38 항체 중 어느 하나에 함유된 HCDR3/LCDR3 아미노산 서열 쌍을 포함한다. 특정 구현예에서, HCDR3/LCDR3 아미노산 서열 쌍은 서열번호 8/24(예: mAb1); 38/54(예: mAb2)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
표 1에 열거된 예시적인 항-CD38 항체 중 어느 하나에 함유된 6개의 CDR 세트(즉, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다. 특정 구현예에서, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR1-LCDR2-LCDR3 아미노산 서열 세트는 서열번호 4-6-8-20-22-24(예: mAb1) 및 서열번호 34-36-38-50-52-54(예: mAb2)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
관련 구현예에서, 표 1에 열거된 예시적인 항-CD38 항체 중 어느 하나에 의해 정의된 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍 내에 함유된 6개의 CDR 세트(즉, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다. 예를 들어, 서열번호 2/18(예: mAb1) 및 서열번호 32/48(예: mAb2)로 이루어진 군으로부터 선택된 HCVR/LCVR 서열 쌍 내에 함유된 HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 아미노산 서열 세트를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다.
본원에 제공된 일 구현예에서, 항-CD38 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다:
다음 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1: GFTFDDYA(서열번호 4; 또는 이의 변이체); 다음 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2: ISWKSDNI(서열번호 6; 또는 이의 변이체); 및 다음 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3: AKALGGWKFDYYYGMDV(서열번호 8; 또는 이의 변이체); 및
다음 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1: QSISSY(서열번호 20; 또는 이의 변이체); 다음 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2: AAS(서열번호 22; 또는 이의 변이체); 및 다음 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3: QQSYSTPPIT(서열번호 24; 또는 이의 변이체).
본원에 제공된 일 구현예에서, 항-CD38 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다:
다음 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1: GGPFRSSS(서열번호 34; 또는 이의 변이체); 다음 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2: IIPILGKT(서열번호 36; 또는 이의 변이체); 및 다음 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3: VRGSSLFDY(서열번호 38; 또는 이의 변이체); 및
다음 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1: QSVSSSY(서열번호 50; 또는 이의 변이체); 다음 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2: GAS(서열번호 52; 또는 이의 변이체); 및 다음 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3: QQYGSSPWT(서열번호 54; 또는 이의 변이체).
본원에 제공된 일 구현예에서, 항-CD38 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다:
다음 아미노산 서열을 포함하는 HCVR1: EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWKSDNIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKALGGWKFDYYYGMDVWGQGTTVTVSS (서열번호 2; 또는 이의 변이체); 및
다음 아미노산 서열을 포함하는 LCVR1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPITFGQGTRLEIK (서열번호 18; 또는 이의 변이체).
본원에 제공된 일 구현예에서, 항-CD38 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다:
다음 아미노산 서열을 포함하는 HCVR1: QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGPFRSSSFSWVRQAPGQGLEWMGGIIPILGKTNYAQKFQGRITIVTDESTTTVYMELSSLRSEDTAVFYCVRGSSLFDYWGQGTLVTVSS (서열번호 32; 또는 이의 변이체); 및
다음 아미노산 서열을 포함하는 LCVR1: EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIK (서열번호 48; 또는 이의 변이체).
항-CD38 항체 또는 이의 일부분을 암호화하는 핵산 분자가 또한 본원에 제공된다. 예를 들어, 본 발명은 표 1에 열거된 HCVR 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자를 제공하며; 특정 구현예에서, 핵산 분자는 표 2에 열거된 HCVR 핵산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.
표 1에 열거된 LCVR 아미노산 서열 중 어느 하나를 암호화하는 핵산 분자가 본원에 제공되며; 특정 구현예에서, 핵산 분자는 표 2에 열거된 LCVR 핵산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.
표 1에 열거된 HCDR1 아미노산 서열 중 어느 하나를 암호화하는 핵산 분자가 본원에 제공되며; 특정 구현예에서, 핵산 분자는 표 2에 열거된 HCDR1 핵산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.
표 1에 열거된 HCDR2 아미노산 서열 중 어느 하나를 암호화하는 핵산 분자가 본원에 제공되며; 특정 구현예에서, 핵산 분자는 표 2에 열거된 HCDR2 핵산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.
표 1에 열거된 HCDR3 아미노산 서열 중 어느 하나를 암호화하는 핵산 분자가 본원에 제공되며; 특정 구현예에서, 핵산 분자는 표 2에 열거된 HCDR3 핵산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.
표 1에 열거된 LCDR1 아미노산 서열 중 어느 하나를 암호화하는 핵산 분자가 본원에 제공되며; 특정 구현예에서, 핵산 분자는 표 2에 열거된 LCDR1 핵산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.
표 1에 열거된 LCDR2 아미노산 서열 중 어느 하나를 암호화하는 핵산 분자가 본원에 제공되며; 특정 구현예에서, 핵산 분자는 표 2에 열거된 LCDR2 핵산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.
표 1에 열거된 LCDR3 아미노산 서열 중 어느 하나를 암호화하는 핵산 분자가 본원에 제공되며; 특정 구현예에서, 핵산 분자는 표 2에 열거된 LCDR3 핵산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.
HCVR을 암호화하는 핵산 분자가 본원에 제공되며, 여기서 HCVR은 3개의 CDR 세트(즉, HCDR1-HCDR2-HCDR3)를 포함하고, HCDR1-HCDR2-HCDR3 아미노산 서열 세트는 표 1에 열거된 예시적인 항-CD38 항체 중 어느 하나에 의해 정의된 바와 같다.
LCVR을 암호화하는 핵산 분자가 본원에 제공되며, 여기서 LCVR은 3개의 CDR 세트(즉, LCDR1-LCDR2-LCDR3)를 포함하고, LCDR1-LCDR2-LCDR3 아미노산 서열 세트는 표 1에 열거된 예시적인 항-CD38 항체 중 어느 하나에 의해 정의된 바와 같다.
HCVR 및 LCVR 둘 다를 암호화하는 핵산 분자가 본원에 제공되며, 여기서 HCVR은 표 1에 열거된 HCVR 아미노산 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고, LCVR은 표 1에 열거된 LCVR 아미노산 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 소정의 구현예에서, 핵산 분자는 표 2에 열거된 HCVR 핵산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열, 및 표 2에 열거된 LCVR 핵산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 포함한다. 본 발명의 이러한 양태에 따른 특정 구현예에서, 핵산 분자는 HCVR 및 LCVR을 암호화하되, HCVR 및 LCVR 둘 다는 표 1에 열거된 동일한 항-CD38 항체로부터 유래된다.
항-CD38 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 발현할 수 있는 재조합 발현 벡터가 본원에 제공된다. 예를 들어, 전술한 핵산 분자 중 어느 하나, 즉 표 1에 제시된 것과 같은 HCVR, LCVR, 및/또는 CDR 서열 중 어느 하나를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터가 본원에 제공된다. 본 개시의 범주에는, 이러한 벡터가 도입된 숙주 세포뿐만 아니라, 항체 또는 항체 단편의 생산을 가능하게 하는 조건 하에서 숙주 세포를 배양하고 그렇게 생산된 항체 및 항체 단편을 회수함으로써 항체 또는 이의 일부분을 생산하는 방법 또한 포함된다.
변형된 당단백질 패턴을 갖는 항-CD38 항체가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 예를 들어 항체 의존적 세포의 세포 독성(ADCC) 기능과 같은 항종양 활성을 증가시키기 위해, 바람직하지 않은 당질화 부위를 제거하는 변형이 유용하거나, 올리고당 사슬에 존재하는 푸코오스 모이어티가 결여된 항체가 유용할 수 있다(Shield 등의 문헌[JBC 277:26733 2002] 참조). 다른 응용예에서, 보체 의존적 세포독성(CDC)을 변형시키기 위해 갈락토실화 변형이 이뤄질 수 있다.
또 다른 양태에서, CD38에 특이적으로 결합하는 재조합 인간 항체 또는 이의 단편, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, 본 발명은 항-CD38 항체 및 제2 치료제의 조합인 조성물을 포함한다. 일 구현예에서, 제2 치료제는 항-CD38 항체와 유리하게 조합되는 임의의 제제이다. 항-CD38 항체와 유리하게 조합될 수 있는 예시적인 제제는, CD38에 결합하고/하거나 CD38 신호전달을 활성화하는 제제(다른 항체 또는 이의 항원 결합 단편 등을 포함함) 및/또는 CD38에 직접 결합하지는 않지만 면역 세포를 활성화하거나 면역 세포 활성화를 자극하는 다른 제제를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 본 발명의 항-CD38 항체를 포함하는 추가적인 병용 요법 및 공제형은 본원의 다른 곳에서 개시된다.
또 다른 양태에서, 본원에 개시된 항-CD38 항체 또는 항-CD38 항체의 항원 결합 부분을 사용해 암치료를 용이하게 하는 치료 방법이 본원에 제공되며, 상기 치료 방법은 항체 또는 항-CD38 항체의 항원 결합 단편을 포함하는 약학적 조성물의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 치료되는 장애는 CD38 활성 또는 신호전달의 억제에 의해 개선, 경감, 억제 또는 예방되는 임의의 질환 또는 병태이다.
항-CD28 항체 및 이의 항원 결합 단편
또 다른 양태에서, 인간 CD28에 결합하는 항체 및 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다. 본 발명의 이러한 양태에 따른 항체는, CD4+, CD8+, 형질 세포, 및 자연 살해 세포를 포함하여 CD28을 발현하는 면역 세포에 결합하는 데 특히 유용하고, 예를 들어 T 세포 매개 살해가 유익하거나 바람직한 환경 하에서, T 세포 활성화를 공동 자극하는 데 유용하다. 본 발명의 항-CD28 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 종양 세포와 같은 특정 세포 유형에 대해 T 세포 활성화를 유도하는 이중특이적 항체의 일부로서 포함될 수 있다.
본원에 제공된 예시적인 항-CD28 항체는 본원의 표 4 및 5에 열거되어 있다. 표 4는 예시적인 항-CD28 항체의 중쇄 가변 영역(HCVR) 및 경쇄 가변 영역(LCVR)뿐만 아니라, 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR1, HCDR2 및 HCDR3) 및 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)의 아미노산 서열 식별자를 제시한다. 표 5는 예시적인 항-CD28 항체의 HCVR, LCVR, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3를 암호화하는 핵산 분자의 서열 식별자를 제시한다.
표 4에 열거된 HCVR 아미노산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 HCVR을 포함하는 항-CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다.
표 4에 열거된 LCVR 아미노산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 LCVR을 포함하는 항-CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다.
표 4에 열거된 LCVR 아미노산 서열 중 어느 하나 및 이와 쌍을 이룬 표 4에 열거된 HCVR 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 HCVR과 LCVR 아미노산 서열 쌍(HCVR/LCVR)을 포함하는 항-CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다. 특정 구현예에 따르면, 본 개시는 표 4에 열거된 예시적인 항-CD28 항체 중 어느 하나에 함유된 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 특정 구현예에서, HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍은 서열번호 10/18(예: mAb3) 및 40/48(예: mAb4)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
표 4에 열거된 HCDR1 아미노산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 중쇄 CDR1(HCDR1)을 포함하는, 항-CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다.
표 4에 열거된 HCDR2 아미노산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 중쇄 CDR2(HCDR2)를 포함하는, 항-CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다.
표 4에 열거된 HCDR3 아미노산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 중쇄 CDR3(HCDR3)을 포함하는, 항-CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다.
표 4에 열거된 LCDR1 아미노산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는, 경쇄 CDR1(LCDR1)을 포함하는, 항-CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다.
표 4에 열거된 LCDR2 아미노산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는, 경쇄 CDR2(LCDR2)를 포함하는, 항-CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다.
표 4에 열거된 LCDR3 아미노산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는, 경쇄 CDR3(LCDR2)을 포함하는, 항-CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다.
표 4에 열거된 LCDR3 아미노산 서열 중 어느 하나 및 이와 쌍을 이룬 표 4에 열거된 HCDR3 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 HCDR3 및 LCDR3 아미노산 서열 쌍(HCDR3/LCDR3)을 포함하는 항-CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다. 특정 구현예에 따르면, 본 개시는 표 4에 열거된 예시적인 항-CD28 항체 중 어느 하나에 함유된 HCDR3/LCDR3 아미노산 서열 쌍을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 특정 구현예에서, HCDR3/LCDR3 아미노산 서열 쌍은 서열번호 16/24(예: mAb3) 및 46/54(예: mAb4)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명은 또한, 표 4에 열거된 예시적인 항-CD28 항체 중 어느 하나에 함유된 6개의 CDR로 이루어진 세트(즉, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 특정 구현예에서, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR1-LCDR2-LCDR3 아미노산 서열 세트는 서열번호 12-14-16-20-22-24(예: mAb3) 및 서열번호 42-44-46-50-52-54(예: mAb4)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
관련 구현예에서, 본 개시는 표 4에 열거된 예시적인 항-CD28 항체 중 어느 하나에 의해 정의된 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍 내에 함유된 6개의 CDR로 이루어진 세트(즉, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 예를 들어, 서열번호 10/18(예: mAb3) 및 서열번호 40/48(예: mAb4)로 이루어진 군으로부터 선택된 HCVR/LCVR 서열 쌍 내에 함유된 HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 아미노산 서열 세트를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다.
본원에 제공된 일 구현예에서, 항-CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다:
다음 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1: GFTFSRNN(서열번호 12; 또는 이의 변이체); 다음 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2: ISSNGGRT(서열번호 14; 또는 이의 변이체); 및 다음 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3: TRDDELLSFDY(서열번호 16; 또는 이의 변이체); 및/또는
다음 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1: QSISSY(서열번호 20; 또는 이의 변이체); 다음 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2: AAS(서열번호 22; 또는 이의 변이체); 및 다음 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3: QQSYSTPPIT(서열번호 24; 또는 이의 변이체).
본원에 제공된 일 구현예에서, 항-CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다:
다음 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1: GGSISSYY(서열번호 42; 또는 이의 변이체); 다음 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2: IYYSGIT(서열번호 44; 또는 이의 변이체); 및 다음 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3: ARWGVRRDYYYYGMDV(서열번호 46; 또는 이의 변이체); 및
다음 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1: QSVSSSY(서열번호 50; 또는 이의 변이체); 다음 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2: GAS(서열번호 52; 또는 이의 변이체); 및 다음 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3: QQYGSSPWT(서열번호 54; 또는 이의 변이체).
본원에 제공된 일 구현예에서, 항-CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다:
다음 아미노산 서열을 포함하는 HCVR1: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRNNMHWVRQAPGKGLEYVSGISSNGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMGGLRAADMAVYFCTRDDELLSFDYWGQGTLVTVSS (서열번호 10; 또는 이의 변이체); 및
다음 아미노산 서열을 포함하는 LCVR1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPITFGQGTRLEIK (서열번호 18; 또는 이의 변이체).
본원에 제공된 일 구현예에서, 항-CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다:
다음 아미노산 서열을 포함하는 HCVR1: QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGITHYNPSLKSRVTISVDTSKIQFSLKLSSVTAADTAVYYCARWGVRRDYYYYGMDVWGQGTTVTVSS (서열번호 40; 또는 이의 변이체); 및
다음 아미노산 서열을 포함하는 LCVR1: EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIK (서열번호 48; 또는 이의 변이체).
항-CD28 항체 또는 이의 일부분을 암호화하는 핵산 분자가 또한 본원에 제공된다. 예를 들어, 본 발명은 표 4에 열거된 HCVR 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자를 제공하며; 특정 구현예에서, 핵산 분자는 표 5에 열거된 HCVR 핵산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.
표 4에 열거된 LCVR 아미노산 서열 중 어느 하나를 암호화하는 핵산 분자가 본원에 제공되며; 특정 구현예에서, 핵산 분자는 표 5에 열거된 LCVR 핵산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.
표 4에 열거된 HCDR1 아미노산 서열 중 어느 하나를 암호화하는 핵산 분자가 본원에 제공되며; 특정 구현예에서, 핵산 분자는 표 5에 열거된 HCDR1 핵산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.
표 4에 열거된 HCDR2 아미노산 서열 중 어느 하나를 암호화하는 핵산 분자가 본원에 제공되며; 특정 구현예에서, 핵산 분자는 표 5에 열거된 HCDR2 핵산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.
표 4에 열거된 HCDR3 아미노산 서열 중 어느 하나를 암호화하는 핵산 분자가 본원에 제공되며; 특정 구현예에서, 핵산 분자는 표 5에 열거된 HCDR3 핵산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.
표 4에 열거된 LCDR1 아미노산 서열 중 어느 하나를 암호화하는 핵산 분자가 본원에 제공되며; 특정 구현예에서, 핵산 분자는 표 5에 열거된 LCDR1 핵산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.
표 4에 열거된 LCDR2 아미노산 서열 중 어느 하나를 암호화하는 핵산 분자가 본원에 제공되며; 특정 구현예에서, 핵산 분자는 표 5에 열거된 LCDR2 핵산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.
표 4에 열거된 LCDR3 아미노산 서열 중 어느 하나를 암호화하는 핵산 분자가 본원에 제공되며; 특정 구현예에서, 핵산 분자는 표 5에 열거된 LCDR3 핵산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.
HCVR을 암호화하는 핵산 분자가 본원에 제공되며, 여기서 HCVR은 3개의 CDR 세트(즉, HCDR1-HCDR2-HCDR3)를 포함하고, HCDR1-HCDR2-HCDR3 아미노산 서열 세트는 표 4에 열거된 예시적인 항-CD28 항체 중 어느 하나에 의해 정의된 바와 같다.
LCVR을 암호화하는 핵산 분자가 본원에 제공되며, 여기서 LCVR은 3개의 CDR 세트(즉, LCDR1-LCDR2-LCDR3)를 포함하고, LCDR1-LCDR2-LCDR3 아미노산 서열 세트는 표 4에 열거된 예시적인 항-CD28 항체 중 어느 하나에 의해 정의된 바와 같다.
HCVR 및 LCVR 둘 다를 암호화하는 핵산 분자가 본원에 제공되며, 여기서 HCVR은 표 4에 열거된 HCVR 아미노산 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고, LCVR은 표 4에 열거된 LCVR 아미노산 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 핵산 분자는 표 5에 열거된 HCVR 핵산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열, 및 표 5에 열거된 LCVR 핵산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 핵산 분자는 HCVR 및 LCVR을 암호화하며, 여기에서 HCVR 및 LCVR 둘 모두는 표 4에 열거된 동일한 항-CD28 항체로부터 유래된다.
항-CD28 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 발현할 수 있는 재조합 발현 벡터가 본원에 제공된다. 예를 들어, 본 개시는 전술한 핵산 분자 중 어느 하나, 즉 표 4에 제시된 바와 같은 HCVR, LCVR, 및/또는 CDR 서열 중 어느 하나를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 포함한다. 본 개시의 범주에는, 이러한 벡터가 도입된 숙주 세포뿐만 아니라, 항체 또는 항체 단편의 생산을 가능하게 하는 조건 하에서 숙주 세포를 배양하고 그렇게 생산된 항체 및 항체 단편을 회수함으로써 항체 또는 이의 일부분을 생산하는 방법 또한 포함된다.
변형된 당단백질 패턴을 갖는 항-CD28 항체가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 항체 의존적 세포 독성(ADCC) 기능을 증가시키기 위해 바람직하지 않은 글리코실화 부위를 제거하는 변형이 유용하거나, 올리고당 사슬에 존재하는 푸코오스 모이어티가 결여된 항체가 유용할 수 있다(Shield 외, JBC 277:26733(2002) 참조). 다른 응용예에서, 보체 의존적 세포독성(CDC)을 변형시키기 위해 갈락토실화 변형이 이뤄질 수 있다.
CD28에 특이적으로 결합하는 재조합 인간 항체 또는 이의 단편, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, 본 개시는 항-CD28 항체 및 제2 치료제의 조합인 조성물을 포함한다. 일 구현예에서, 제2 치료제는 항-CD28 항체와 유리하게 조합되는 임의의 제제이다. 항-CD28 항체와 유리하게 조합될 수 있는 예시적인 제제는, 면역 세포를 활성화하거나 면역 세포 활성화를 자극하는 다른 제제(다른 한체 또는 이의 항원 결합 단편 등을 포함함) 및/또는 CD28에 직접 결합하지는 않지만 항종양 반응을 촉진하는 제제를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 본 개시의 항-CD28 항체를 포함하는 추가적인 병용 요법 및 공제형이 본원의 다른 곳에서 개시된다.
또 다른 양태에서, 항-CD28 항체 또는 항체의 항원 결합 부분을 사용해 T 세포 활성화를 자극하는 치료 방법이 본원에 제공되며, 상기 치료 방법은 항체 또는 항-CD28 항체의 항원 결합 단편을 포함하는 약학적 조성물의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 치료되는 장애는 CD28 활성 또는 신호전달의 자극에 의해 개선, 경감, 억제 또는 예방되는 임의의 질환 또는 병태이다.
항-CD38 및 항-CD28 항원 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체
또 다른 양태에 따르면, 본 개시는 CD28 및 표적 항원에 결합하는 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다. 또 다른 양태에 따르면, 본 개시는 CD38 및 공자극 분자에 결합하는 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다. 특정 예시적인 구현예에 따르면, 이중특이적 항원 결합 분자는 CD38 및 CD28에 결합하며; 이러한 이중특이적 항원 결합 분자는 본원에서 "항-CD38/항-CD28 이중특이적 분자"로도 지칭된다.
항-CD38/항-CD28 이중특이적 분자의 항-CD38 부분은 CD38을 발현하는 종양 세포(예를 들어 혈질 세포)를 표적화하는 데 유용하고, 이중특이적 분자의 항-CD28 부분은 동족 MHC 펩티드 또는 종양에 표적화된 CD3 이중특이적 항체에 의해 활성화된 T 세포의 공동자극을 제공하는 데 유용하다. 종양 세포 상의 CD38 및 T 세포 상의 CD28에 동시 결합하는 것은 활성화된 T 세포에 의해 표적화된 종양 세포의 사멸 유도(세포 용해)를 용이하게 한다. 따라서, 본 발명의 항-CD38/항-CD28 이중특이적 분자는 CD38-발현 종양과 관련되었거나 이에 의해 유발된 질환 또는 장애(예를 들어 림프종, 백혈병, 및 다발성 골수종)를 치료하는 데 특히 유용하다.
본원에 제공된 이중특이적 항원 결합 분자는 인간 CD38에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 도메인, 및 CD28에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 도메인을 포함한다. 본 개시는 항-CD38/항-CD28 이중특이적 분자(예를 들어 이중특이적 항체)를 포함하며, 여기서 각각의 항원 결합 도메인은 경쇄 가변 영역(LCVR)과 쌍을 이룬 중쇄 가변 영역(HCVR)을 포함한다. 본 발명의 특정 예시적인 구현예에서, 항-CD38 항원 결합 도메인 및 항-CD28 항원 결합 도메인은 공통 LCVR과 쌍을 이룬 상이하고 구별되는 HCVR을 각각 포함한다. 예를 들어, 본원의 실시예 4에 예시된 바와 같이, CD38에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 도메인 및 CD28에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체를 작제하였으며, 여기서 제1 항원 결합 도메인은 항-CD38 항체로부터 유래된 HCVR/LCVR 쌍을 포함하고; 제2 항원 결합 도메인은 항-CD38 항체로부터 유래된 LCVR(예를 들어 항-CD38 항원 결합 도메인에 포함된, 동일한 LCVR)과 쌍을 이룬 항-CD28 항체로부터 유래된 HCVR을 포함한다. 이러한 구현예에서, 제1 및 제2 항원 결합 도메인은 구별되는 항-CD38 HCVR 및 항-CD28 HCVR을 포함하지만 공통의 항-CD38 LCVR을 공유한다.
항-CD38/항-CD28 이중특이적 분자가 본원에 제공되며, 여기서 CD38에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 도메인은 표 1에 제시된 것과 같은 HCVR 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함한다. CD38에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 도메인도 표 1에 제시된 것과 같은 LCVR 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 특정 구현예에 따르면, CD38에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 도메인은 표 1에 제시된 것과 같은 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 본 개시는 또한 항-CD38/항-CD28 이중특이적 분자를 제공하며, 여기서 CD38에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 도메인은 표 1에 제시된 것과 같은 중쇄 CDR1-CDR2-CDR3 아미노산 서열 중 어느 하나 및/또는 표 1에 제시된 것과 같은 경쇄 CDR1-CDR2-CDR3 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함한다.
특정 구현예에 따르면, 항-CD38/항-CD28 이중특이적 분자가 본원에 제공되며, 여기서 CD38에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 도메인은 서열번호 2 및 32로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR)을 포함한다.
특정 구현예에 따르면, 항-CD38/항-CD28 이중특이적 분자가 본원에 제공되며, 여기서 CD38에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 도메인은 서열번호 18 및 48로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR)을 포함한다.
항-CD38/항-CD28 이중특이적 분자가 본원에 제공되며, 여기서 CD38에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 도메인은 서열번호 2/18 및 32/48로 이루어진 군으로부터 선택된 HCVR 및 LCVR(HCVR/LCVR) 아미노산 서열 쌍을 포함한다.
항-CD38/항-CD28 이중특이적 분자가 본원에 제공되며, 여기서 CD38에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 도메인은 서열번호 8 및 38로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 갖는 중쇄 CDR3(HCDR3) 도메인; 및 서열번호 24 및 54로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 갖는 경쇄 CDR3(LCDR3) 도메인을 포함한다.
특정 구현예에서, CD38에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 도메인은 서열번호 8/24 및 38/54로 이루어진 군으로부터 선택된 HCDR3/LCDR3 아미노산 서열 쌍을 포함한다.
항-CD38/항-CD28 이중특이적 항원 결합 분자가 본원에 제공되며, 여기서 CD38에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 도메인은 서열번호 4 및 34로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 갖는 중쇄 CDR1(HCDR1) 도메인; 서열번호 6 및 36으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 갖는 중쇄 CDR2(HCDR2) 도메인; 서열번호 20 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 갖는 경쇄 CDR1(LCDR1) 도메인; 및 서열번호 22 및 52로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 갖는 경쇄 CDR2(LCDR2) 도메인을 포함한다.
본 발명의 특정 비제한적인, 예시적인 항-CD38/항-CD28 이중특이적 항원 결합 분자는 CD38에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 도메인을 포함하고, 제1 항원 결합 도메인은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 각각 갖는 HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 도메인을 포함한다: 서열번호 4-6-8-20-22-24 (예: bsAb6031) 및 34-36-38-50-52-54 (예: bsAb7945).
항-CD38/항-CD28 이중특이적 분자가 본원에 제공되며, 여기서 CD28에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 도메인은 표 4에 제시된 것과 같은 HCVR 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함한다. CD28에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 도메인도 표 4에 제시된 것과 같은 LCVR 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 특정 구현예에 따르면, CD28에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 도메인은 표 4에 제시된 것과 같은 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 본 개시는 또한 항-CD38/항-CD28 이중특이적 분자를 제공하며, 여기서 CD28에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 도메인은 표 4에 제시된 것과 같은 중쇄 CDR1-CDR2-CDR3 아미노산 서열 중 어느 하나 및/또는 표 4에 제시된 것과 같은 경쇄 CDR1-CDR2-CDR3 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함한다.
특정 구현예에 따르면, 항-CD38/항-CD28 이중특이적 분자가 본원에 제공되며, 여기서 CD28에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 도메인은 서열번호 10 및 40으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR)을 포함한다.
특정 구현예에 따르면, 항-CD38/항-CD28 이중특이적 분자가 본원에 제공되며, 여기서 CD28에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 도메인은 서열번호 18 및 48로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함한다.
항-CD38/항-CD28 이중특이적 분자가 본원에 제공되며, 여기서 CD28에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 도메인은 서열번호 10/18 및 40/48로 이루어진 군으로부터 선택된 HCVR 및 LCVR(HCVR/LCVR) 아미노산 서열 쌍을 포함한다.
항-CD38/항-CD28 이중특이적 분자가 본원에 제공되며, 여기서 CD28에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 도메인은 서열번호 16 및 46으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 갖는 중쇄 CDR3(HCDR3) 도메인; 및 서열번호 24 및 54로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 갖는 경쇄 CDR3(LCDR3) 도메인을 포함한다.
특정 구현예에서, CD28에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 도메인은 서열번호 16/24 및 46/54로 이루어진 군으로부터 선택된 HCDR3/LCDR3 아미노산 서열 쌍을 포함한다.
항-CD38/항-CD28 이중특이적 항원 결합 분자가 본원에 제공되며, 여기서 CD28에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 도메인은 서열번호 12 및 42로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 갖는 중쇄 CDR1(HCDR1) 도메인; 서열번호 14 및 44로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 갖는 중쇄 CDR2(HCDR2) 도메인; 서열번호 20 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 갖는 경쇄 CDR1(LCDR1) 도메인; 및 서열번호 22 및 52로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 갖는 경쇄 CDR2(LCDR2) 도메인을 포함한다.
본 발명의 특정 비제한적인, 예시적인 항-CD38/항-CD28 이중특이적 항원 결합 분자는 CD28에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 도메인을 포함하고, 제2 항원 결합 도메인은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 각각 갖는 HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 도메인을 포함한다: 서열번호 12-14-16-20-22-24 (예: bsAb6031) 및 42-44-46-50-52-54 (예: bsAb7945).
본원에 제공된 일 구현예에서, CD38 및 CD28에 결합하는 다중특이적(예: 이중특이적) 항원 결합 분자(예: 항체 또는 이의 항원 결합 단편)는 다음을 포함한다:
(1)
다음을 포함하는 항-CD38 결합 아암:
다음 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1: GFTFDDYA(서열번호 4; 또는 이의 변이체); 다음 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2: ISWKSDNI(서열번호 6; 또는 이의 변이체); 다음 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3: AKALGGWKFDYYYGMDV(서열번호 8; 또는 이의 변이체); 다음 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1: QSISSY(서열번호 20; 또는 이의 변이체); 다음 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2: AAS(서열번호 22; 또는 이의 변이체); 및 다음 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3: QQSYSTPPIT(서열번호 24; 또는 이의 변이체); 및
다음을 포함하는 항-CD28 결합 아암:
다음 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1: GFTFSRNN(서열번호 12; 또는 이의 변이체); 다음 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2: ISSNGGRT(서열번호 14; 또는 이의 변이체); 다음 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3: TRDDELLSFDY(서열번호 16; 또는 이의 변이체); 다음 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1: QSISSY(서열번호 20; 또는 이의 변이체); 다음 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2: AAS(서열번호 22; 또는 이의 변이체); 및 다음 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3: QQSYSTPPIT(서열번호 24; 또는 이의 변이체);
(2)
다음을 포함하는 항-CD38 결합 아암:
다음 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1: GGPFRSSS(서열번호 34; 또는 이의 변이체); 다음 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2: IIPILGKT(서열번호 36; 또는 이의 변이체); 다음 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3: VRGSSLFDY(서열번호 38; 또는 이의 변이체); 다음 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1: QSVSSSY(서열번호 50; 또는 이의 변이체); 다음 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2: GAS(서열번호 52; 또는 이의 변이체); 및 다음 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3: QQYGSSPWT(서열번호 54; 또는 이의 변이체); 및
다음을 포함하는 항-CD28 결합 아암:
다음 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1: GGSISSYY(서열번호 42; 또는 이의 변이체); 다음 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2: IYYSGIT(서열번호 44; 또는 이의 변이체); 다음 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3: ARWGVRRDYYYYGMDV(서열번호 46; 또는 이의 변이체); 다음 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1: QSVSSSY(서열번호 50; 또는 이의 변이체); 다음 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2: GAS(서열번호 52; 또는 이의 변이체); 및 다음 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3: QQYGSSPWT(서열번호 54; 또는 이의 변이체);
(3)
다음을 포함하는 항-CD38 결합 아암:
다음 아미노산 서열을 포함하는 HCVR1: EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWKSDNIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKALGGWKFDYYYGMDVWGQGTTVTVSS (서열번호 2; 또는 이의 변이체); 및 다음 아미노산 서열을 포함하는 LCVR1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPITFGQGTRLEIK (서열번호 18; 또는 이의 변이체); 및
다음을 포함하는 항-CD28 결합 아암:
다음 아미노산 서열을 포함하는 HCVR1: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRNNMHWVRQAPGKGLEYVSGISSNGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMGGLRAADMAVYFCTRDDELLSFDYWGQGTLVTVSS (서열번호 10; 또는 이의 변이체); 및 다음 아미노산 서열을 포함하는 LCVR1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPITFGQGTRLEIK (서열번호 18; 또는 이의 변이체);
(4)
다음을 포함하는 항-CD38 결합 아암:
다음 아미노산 서열을 포함하는 HCVR1: QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGPFRSSSFSWVRQAPGQGLEWMGGIIPILGKTNYAQKFQGRITIVTDESTTTVYMELSSLRSEDTAVFYCVRGSSLFDYWGQGTLVTVSS (서열번호 32; 또는 이의 변이체); 및 다음 아미노산 서열을 포함하는 LCVR1: EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIK (서열번호 48; 또는 이의 변이체); 및
다음을 포함하는 항-CD28 결합 아암:
다음 아미노산 서열을 포함하는 HCVR1: QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGITHYNPSLKSRVTISVDTSKIQFSLKLSSVTAADTAVYYCARWGVRRDYYYYGMDVWGQGTTVTVSS (서열번호 40; 또는 이의 변이체); 및 다음 아미노산 서열을 포함하는 LCVR1: EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIK (서열번호 48; 또는 이의 변이체);
(5)
다음을 포함하는 항-CD38 결합 아암:
다음 아미노산 서열을 포함하는 중쇄: EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWKSDNIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKALGGWKFDYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK* (서열번호 26, 또는 이의 변이체); 및
다음 아미노산 서열을 갖는 경쇄: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPITFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC* (서열번호 30, 또는 이의 변이체); 및
다음을 포함하는 항-CD28 결합 아암:
다음 아미노산 서열을 포함하는 중쇄: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRNNMHWVRQAPGKGLEYVSGISSNGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMGGLRAADMAVYFCTRDDELLSFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK* (서열번호 28, 또는 이의 변이체); 및
다음 아미노산 서열을 포함하는 경쇄: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPITFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC* (서열번호 30, 또는 이의 변이체); 또는
(6)
다음을 포함하는 항-CD38 결합 아암:
다음 아미노산 서열을 포함하는 중쇄: QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGPFRSSSFSWVRQAPGQGLEWMGGIIPILGKTNYAQKFQGRITIVTDESTTTVYMELSSLRSEDTAVFYCVRGSSLFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK* (서열번호 56, 또는 이의 변이체); 및
다음 아미노산 서열을 포함하는 경쇄: EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC* (서열번호 60, 또는 이의 변이체); 및
다음을 포함하는 항-CD28 결합 아암:
다음 아미노산 서열을 포함하는 중쇄: QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGITHYNPSLKSRVTISVDTSKIQFSLKLSSVTAADTAVYYCARWGVRRDYYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK* (서열번호 58, 또는 이의 변이체); 및
다음 아미노산 서열을 포함하는 경쇄: EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC* (서열번호 60, 또는 이의 변이체).
본원에 제공된 일 구현예에서, CD38 및 CD28에 결합하는 다중특이적(예: 이중특이적) 항원 결합 분자(예: 항체 또는 이의 항원 결합 단편)는 다음을 포함한다:
(1)
다음을 포함하는 항-CD38 결합 아암:
다음 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1: GFTFDDYA(서열번호 4; 또는 이의 변이체); 다음 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2: ISWKSDNI(서열번호 6; 또는 이의 변이체); 다음 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3: AKALGGWKFDYYYGMDV(서열번호 8; 또는 이의 변이체); 다음 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1: QSISSY(서열번호 20; 또는 이의 변이체); 다음 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2: AAS(서열번호 22; 또는 이의 변이체); 및 다음 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3: QQSYSTPPIT(서열번호 24; 또는 이의 변이체); 및
다음을 포함하는 항-CD28 결합 아암:
다음 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1: GGSISSYY(서열번호 42; 또는 이의 변이체); 다음 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2: IYYSGIT(서열번호 44; 또는 이의 변이체); 다음 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3: ARWGVRRDYYYYGMDV(서열번호 46; 또는 이의 변이체); 다음 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1: QSVSSSY(서열번호 50; 또는 이의 변이체); 다음 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2: GAS(서열번호 52; 또는 이의 변이체); 및 다음 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3: QQYGSSPWT(서열번호 54; 또는 이의 변이체);
(2)
다음을 포함하는 항-CD38 결합 아암:
다음 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1: GGPFRSSS(서열번호 34; 또는 이의 변이체); 다음 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2: IIPILGKT(서열번호 36; 또는 이의 변이체); 다음 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3: VRGSSLFDY(서열번호 38; 또는 이의 변이체); 다음 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1: QSVSSSY(서열번호 50; 또는 이의 변이체); 다음 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2: GAS(서열번호 52; 또는 이의 변이체); 및 다음 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3: QQYGSSPWT(서열번호 54; 또는 이의 변이체); 및
다음을 포함하는 항-CD28 결합 아암:
다음 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1: GFTFSRNN(서열번호 12; 또는 이의 변이체); 다음 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2: ISSNGGRT(서열번호 14; 또는 이의 변이체); 다음 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3: TRDDELLSFDY(서열번호 16; 또는 이의 변이체); 다음 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1: QSISSY(서열번호 20; 또는 이의 변이체); 다음 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2: AAS(서열번호 22; 또는 이의 변이체); 및 다음 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3: QQSYSTPPIT(서열번호 24; 또는 이의 변이체);
(3)
다음을 포함하는 항-CD38 결합 아암:
다음 아미노산 서열을 포함하는 HCVR1: EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWKSDNIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKALGGWKFDYYYGMDVWGQGTTVTVSS (서열번호 2; 또는 이의 변이체); 및 다음 아미노산 서열을 포함하는 LCVR1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPITFGQGTRLEIK (서열번호 18; 또는 이의 변이체); 및
다음을 포함하는 항-CD28 결합 아암:
다음 아미노산 서열을 포함하는 HCVR1: QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGITHYNPSLKSRVTISVDTSKIQFSLKLSSVTAADTAVYYCARWGVRRDYYYYGMDVWGQGTTVTVSS (서열번호 40; 또는 이의 변이체); 및 다음 아미노산 서열을 포함하는 LCVR1: EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIK (서열번호 48; 또는 이의 변이체);
(4)
다음을 포함하는 항-CD38 결합 아암:
다음 아미노산 서열을 포함하는 HCVR1: QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGPFRSSSFSWVRQAPGQGLEWMGGIIPILGKTNYAQKFQGRITIVTDESTTTVYMELSSLRSEDTAVFYCVRGSSLFDYWGQGTLVTVSS (서열번호 32; 또는 이의 변이체); 및 다음 아미노산 서열을 포함하는 LCVR1: EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIK (서열번호 48; 또는 이의 변이체); 및
다음을 포함하는 항-CD28 결합 아암:
다음 아미노산 서열을 포함하는 HCVR1: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRNNMHWVRQAPGKGLEYVSGISSNGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMGGLRAADMAVYFCTRDDELLSFDYWGQGTLVTVSS (서열번호 10; 또는 이의 변이체); 및 다음 아미노산 서열을 포함하는 LCVR1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPITFGQGTRLEIK (서열번호 18; 또는 이의 변이체);
(5)
다음을 포함하는 항-CD38 결합 아암:
다음 아미노산 서열을 포함하는 중쇄: EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWKSDNIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKALGGWKFDYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK* (서열번호 26, 또는 이의 변이체); 및
다음 아미노산 서열을 갖는 경쇄: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPITFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC* (서열번호 30, 또는 이의 변이체); 및
다음을 포함하는 항-CD28 결합 아암:
다음 아미노산 서열을 포함하는 중쇄: QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGITHYNPSLKSRVTISVDTSKIQFSLKLSSVTAADTAVYYCARWGVRRDYYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK* (서열번호 58, 또는 이의 변이체); 및
다음 아미노산 서열을 포함하는 경쇄: EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC* (서열번호 60, 또는 이의 변이체); 또는
(6)
다음을 포함하는 항-CD38 결합 아암:
다음 아미노산 서열을 포함하는 중쇄: QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGPFRSSSFSWVRQAPGQGLEWMGGIIPILGKTNYAQKFQGRITIVTDESTTTVYMELSSLRSEDTAVFYCVRGSSLFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK* (서열번호 56, 또는 이의 변이체); 및
다음 아미노산 서열을 포함하는 경쇄: EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC* (서열번호 60, 또는 이의 변이체); 및
다음을 포함하는 항-CD28 결합 아암:
다음 아미노산 서열을 포함하는 중쇄: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRNNMHWVRQAPGKGLEYVSGISSNGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMGGLRAADMAVYFCTRDDELLSFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK* (서열번호 28, 또는 이의 변이체); 및
다음 아미노산 서열을 포함하는 경쇄: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPITFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC* (서열번호 30, 또는 이의 변이체).
또 다른 양태에서, 본원에 개시된 항-CD38/항-CD28 이중특이적 항원 결합 분자의 HCVR, LCVR, 또는 CDR 서열 중 어느 하나를 암호화하는 핵산 분자가 본원에 제공되며, 이에는 본원의 표 2에 제시된 것과 같은 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자 뿐만 아니라 본원의 표 5에 제시된 것과 같은 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자 및 이들의 임의의 기능적 조합 또는 배열이 포함된다. 항체의 생산을 허용하는 조건 하에서 숙주 세포를 배양하고 생성된 항체를 회수함으로써 항체를 생산하는 방법과 마찬가지로, 본 발명의 핵산을 보유한 재조합 발현 벡터 및 이러한 벡터가 도입된 숙주 세포 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명은 항-CD38/항-CD28 이중특이적 항원 결합 분자를 포함하며, 여기서 CD38에 특이적으로 결합하는 전술한 항원 결합 도메인 중 어느 하나는 CD28에 특이적으로 결합하는 전술한 항원 결합 도메인 중 어느 하나와 조합되거나, 연결되거나, 또는 달리 연관되어 CD38 및 CD28에 결합하는 이중특이적 항원 결합 분자를 형성한다.
변형된 당질화 패턴을 갖는 항-CD38/항-CD28 이중특이적 항원 결합 분자가 본원에 제공된다. 일부 응용예에서, 예를 들어, 항체 의존적 세포 독성(ADCC) 기능을 증가시키기 위해 바람직하지 않은 글리코실화 부위를 제거하는 변형이 유용하거나, 올리고당 사슬에 존재하는 푸코오스 모이어티가 결여된 항체가 유용할 수 있다(Shield 등의 JBC 277:26733(2002) 참조). 다른 응용예에서, 보체 의존적 세포독성(CDC)을 변형시키기 위해 갈락토실화 변형이 이뤄질 수 있다.
또 다른 양태에서, 본원에 개시된 것과 같은 항-CD38/항-CD28 이중특이적 항원 결합 분자 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물이 본원에 제공한다. 관련된 양태에서, 본 발명은 항-CD38/항-CD28 이중특이적 항원 결합 분자 및 제2 치료제의 조합인 조성물을 특징으로 한다. 일 구현예에서, 제2 치료제는 항-CD38/항-CD28 이중특이적 항원 결합 분자와 유리하게 조합되는 임의의 제제이다. 항-CD38/항-CD28 이중특이적 항원 결합 분자와 유리하게 조합될 수 있는 예시적인 제제는 본원의 다른 곳에서 상세히 논의된다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 항-CD38/항-CD28 이중특이적 항원 결합 분자를 사용하여 CD38을 발현하는 종양 세포를 표적화/살해하기 위한 치료 방법이 본원에 제공되며, 상기 치료 방법은 본원에 제공된 항-CD38/항-CD28 이중특이적 항원 결합 분자를 포함하는 약학적 조성물의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 개시는 또한, CD38 발현과 관련되었거나 이에 의해 유발된 질환 또는 장애의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서 본원에 제공된 항-CD38/항-CD28 이중특이적 항원 결합 분자의 용도를 포함한다.
다른 구현예는 다음의 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용을 검토함으로써 명백해질 것이다.
도 1 내지 도 4는 공자극 항-CD38xCD28 이중특이적 항체 bsAb6031 및 bsAb7954로 치료한 후 H929 종양 세포에서 세포독성, T 세포 활성화, T 세포 증식, 및 사이토카인 방출을 보여준다. bsAb7954
도 5 내지 도 10은 공자극 항-CD38xCD28 이중특이적 항체 bsAb6031 및 bsAb7954 단독의 생체 내 항종양 활성 또는 BCMAxCD3 bsAb와 조합되었을 때의 생체 내 항종양 활성을 보여준다.
본 발명을 기술하기 전에, 본 발명은 기술된 특정 방법 및 실험 조건에 한정되지 않는 다는 것을 이해해야 하는데, 이는 이러한 방법 및 조건이 다양할 수 있기 때문이다. 또한 본 발명의 범위는 첨부된 청구항에 의해서만 한정되므로 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 기술하기 위한 목적이며, 한정하는 것으로 의도되지 않음을 이해해야 한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속한 당해 기술분야의 통상의 기술을 가진 자에 의해 널리 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 설명에 사용된 용어 "약"은 인용된 특정 수치와 관련하여 사용될 때, 이러한 값이 인용된 값과 1% 이내에서 다를 수 있음을 의미한다. 예를 들어 본 설명에 사용된 바와 같이, 표현 "약 100"은 99와 101을 포함하고 그 사이의 모든 값(예, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4 등)을 포함한다.
본 발명에 기재된 방법 및 재료와 유사 또는 동등한 어떠한 방법 및 재료도 본 발명의 실시 또는 검사에 사용될 수 있으나, 바람직한 방법 및 재료를 지금부터 설명한다. 본 명세서에 언급된 모든 특허, 출원 및 비 특허 공개문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
정의
본원에 사용된 바와 같이, "CD28"이란 표현은 동종이량체로서 T 세포 상에서 발현되는 항원을 지칭한다. 인간 CD28은 서열번호 61에 제시된 것과 같은 아미노산 서열(인간 CD28 세포외 도메인 (N19-P152).mFc)을 포함하고/하거나, NCBI 수탁번호 NM_006139.3에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖고/갖거나, 인간 CD28 >NP_006130.1 T 세포 특이적 표면 당단백질 CD28 이소형 1 전구체(서열번호 63)의 아미노산 서열을 갖는다.
인간 CD28 세포외 도메인 (N19-P152).mFc ( 면역원 ) 아미노산 서열
NKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK* (서열번호 61) 밑줄 친 것이 mFc 서열임
본원의 단백질, 폴리펩티드 및 단백질 단편에 대한 모든 언급은, 비인간-종에서 유래된 것으로서 명시적으로 달리 명시되지 않는 한, 각각의 단백질, 폴리펩티드 또는 단백질 단편의 인간 버전을 지칭하도록 의도된다. 따라서, "CD28"이란 표현은 비-인간 종에서 유래된 것, 예를 들어, "마우스 CD28", "원숭이 CD28" 등으로서 달리 명시되지 않는 한 인간 CD28을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "CD28에 결합하는 항체" 또는 "항-CD28 항체"는 하나의 CD3 단위를 특이적으로 인식하는 항체 및 이의 항원 결합 단편을 비롯하여, 2개의 CD3 서브유닛으로 이루어진 이량체 복합체를 특이적으로 인식하는 항체 및 이의 항원 결합 단편도 포함한다. 본 발명의 항체 및 항원 결합 단편은 가용성 CD28 및/또는 세포 표면에서 발현되는 CD28에 결합할 수 있다. 가용성 CD28은 천연 CD28 단백질을 비롯하여 재조합 CD28 단백질 변이체, 예컨대 막관통 도메인이 없거나 달리 세포막과 결합되지 않는 단량체 또는 이량체 CD28 작제물을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "세포 표면에서 발현되는 CD28"이란 표현은, CD28 단백질의 적어도 일부분이 세포막의 세포외 측면에 노출되어 항체의 항원 결합 부분에 접근할 수 있도록 시험관 내에서 또는 생체 내에서 세포의 표면 상에서 발현되는 하나 이상의 CD28 단백질(들)을 의미한다. "세포 표면에서 발현되는 CD28"은 세포막 내 기능적 T 세포 수용체의 맥락에 함유된 CD28 단백질을 포함한다. "세포 표면에서 발현되는 CD28"이란 표현은 세포 표면에서 동종이량체의 일부로서 발현되는 CD28 단백질을 포함한다. "세포 표면에서 발현되는 CD28"은 정상적으로 CD28 단백질을 발현하는 세포의 표면에서 발현되는 CD28 단백질을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 대안적으로, "세포 표면에서 발현되는 CD28"은 정상적으로는 그 표면에서 인간 CD28을 발현하지 않지만, 그 표면에서 CD28을 발현하도록 인공적으로 조작된 세포의 표면에서 발현된 CD28 단백질을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 환형 ADP 리보스 가수분해효소로도 알려진 "CD38"이란 표현은 악성 형질 세포에서 발현되는 당단백질을 지칭한다. CD38은 세포 내 칼슘 수준을 조절하는 데 있어서 중심적인 역할을 한다. 단백질은 N-말단 세포질 꼬리, 단일 막-겹침 도메인, 및 4개의 N-당질화 부위를 갖는 C-말단 세포외 영역을 갖는다.　
본원에서 사용되는 바와 같이 "CD38에 결합하는 항체" 또는 "항-CD38 항체"는 CD38을 특이적으로 인식하는 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
용어 "항원 결합 분자"는 항체 및 항체(예: 이중특이적 항체)의 항원 결합 단편을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 특정 항원(예컨대 CD38 또는 CD28)과 특이적으로 결합하거나 상호 작용하는 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 임의의 항원 결합 분자 또는 분자 복합체를 의미한다. 용어 "항체"는 4개의 폴리펩티드 사슬, 즉 이황화 결합에 의해 상호 연결된 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함하는 면역글로불린 분자뿐만 아니라 이의 다량체(예를 들어 IgM)도 포함한다. 용어 "항체"는 또한 4개의 폴리펩티드 사슬, 즉 이황화 결합에 의해 상호 연결된 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)로 이루어진 면역글로불린 분자를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 HCVR 또는 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 LCVR 또는 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인을 포함한다(CL1). VH 영역 및 VL 영역은, 더 보존적인 영역(프레임워크 영역(FR)으로 지칭됨)이 중간에 끼어 있는 초가변 영역(상보성 결정 영역(CDR)으로 지칭됨)으로 추가로 세분화될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노 말단에서 카르복시 말단의 방향으로 다음 순서로 배열된 3개의 CDR과 4개의 FR을 포함한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 본 발명의 상이한 구현예에서, 항-CD38 항체 또는 항-CD28 항체(또는 이의 항원 결합 부분)의 FR은 인간 생식선 서열과 동일하거나, 자연적으로 또는 인공적으로 변형될 수 있다. 아미노산 공통 서열은 둘 이상의 CDR의 병렬 분석에 기초하여 정의될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "항체"는 전체 항체 분자의 항원 결합 단편을 또한 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 항체의 "항원 결합 부분", 항체의 "항원 결합 단편" 등은 항원에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하는 임의의 자연적인, 또는 효소에 의해 수득할 수 있는, 또는 합성, 또는 유전자 조작된 폴리펩티드 또는 당단백질을 포함한다. 항체의 항원 결합 단편은, 예를 들어 단백질 가수분해와 같은 임의의 적합한 표준 기술 또는 항체 가변 도메인 및 임의로 불변 도메인을 암호화하는 DNA의 조작 및 발현을 포함하는 재조합 유전자 조작 기술을 사용해 전체 항체 분자로부터 유도될 수 있다. 이러한 DNA는 공지되어 있고/있거나, 예를 들어 상업적인 공급원, (예를 들어, 파지-항체 라이브러리 포함하는) DNA 라이브러리로부터 용이하게 이용할 수 있거나, 합성될 수 있다. 이러한 DNA는 서열화될 수 있고, 예를 들어 하나 이상의 가변 및/또는 불변 도메인을 적절한 구성으로 배열하기 위해, 또는 코돈을 도입하고, 시스테인 잔기를 생성하며, 아미노산을 변형, 첨가 또는 결실시키기 위해서 등, 화학적으로 또는 분자 생물학 기법을 사용하여 조작될 수 있다.
항원 결합 단편의 비제한적 실시예는: (i) Fab 단편; (ii) F(ab')2 단편; (iii) Fd 단편; (iv) Fv 단편; (v) 단쇄 Fv(scFv) 분자; (vi) dAb 단편; 및 (vii) 항체의 초가변 영역(예를 들어, CDR3 펩티드와 같은 단리된 상보성 결정 영역(CDR))을 모방하는 아미노산 잔기, 또는 제한된 FR3-CDR3-FR4 펩티드로 이루어진 최소 인지 단위를 포함한다. 다른 조작된 분자, 예를 들어, 도메인 특이적 항체, 단일 도메인 항체, 도메인-결실 항체, 키메라 항체, CDR-이식 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 미니바디, 나노바디(예를 들어, 1가 나노바디, 2가 나노바디 등), 작은 모듈형 면역치료제(SMIP), 및 상어 가변 IgNAR 도메인 등도 본원에서 사용되는 "항원 결합 단편"이란 표현에 포함된다.
항체의 항원 결합 단편은 일반적으로 적어도 하나의 가변 도메인을 포함하게 된다. 이러한 가변 도메인은 임의의 크기 또는 아미노산 조성일 수 있고, 일반적으로 하나 이상의 프레임워크 서열에 인접하거나 그것과 한 프레임에 있는 적어도 하나의 CDR을 포함할 것이다. VL 도메인과 결합된 VH 도메인을 갖는 항원 결합 단편에서, VH 및 VL 도메인은 임의의 적절한 배열로 서로에 대해 위치할 수 있다. 예를 들어, 가변 영역은 이량체로서, VH-VH, VH VL 또는 VL-VL 이량체를 포함할 수 있다. 대안적으로, 항체의 항원 결합 단편은 단량체 VH 또는 VL 도메인을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 항체의 항원 결합 단편은 적어도 하나의 불변 도메인에 공유 결합된 적어도 하나의 가변 도메인을 포함할 수 있다. 본 발명의 항체의 항원 결합 단편 내에서 발견될 수 있는 가변 및 불변 도메인의 비제한적인 예시적 구성은 다음을 포함한다: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2-CH3; (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (x) VL-CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; 및 (xiv) VL-CL. 위에서 열거된 임의의 예시적인 구성을 포함하는 가변 및 불변 도메인의 임의의 구성에서, 이러한 가변 및 불변 도메인은 직접적으로 상호간에 연결되거나 또는 전체 또는 부분적인 힌지 또는 링커 영역에 의해 연결될 수 있다. 힌지 영역은 단일 폴리펩티드 분자의 인접한 가변 및/또는 불변 도메인 사이에 가요성 또는 반 가요성 연결을 초래하는 적어도 2개(예를 들어 5, 10, 15, 20, 40, 60개 또는 그 이상)의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 또한, 본 발명의 항체의 항원 결합 단편은 위에서 열거된 가변 및 불변 도메인 구성 중 어느 하나의 동종-이량체 또는 이종-이량체(또는 다른 다량체)를 포함할 수 있으며, 이들은 (예를 들어, 이황화 결합(들)에 의해) 서로 비공유 결합되고/되거나, 하나 이상의 단량체 VH 또는 VL 도메인과 비공유 결합된다.
완전 항체 분자와 마찬가지로, 항원 결합 단편은 단일특이적이거나 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)일 수 있다. 항체의 다중특이적 항원 결합 단편은 일반적으로 적어도 2개의 상이한 가변 도메인을 포함하게 되며, 여기에서 각각의 가변 도메인은 별도의 항원에 특이적으로 결합할 수 있거나 동일한 항원 상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 본원에 개시된 예시적인 이중특이적 항체 포맷을 포함하여, 임의의 다중특이적 항체 포맷은 당업계에서 이용할 수 있는 일상적인 기술을 사용하여 본 발명의 항체의 항원 결합 단편의 맥락에서 사용하기에 적합할 수 있다.
본 발명의 항체는 보체 의존성 세포독성(CDC) 또는 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC)을 통해 기능할 수 있다. "보체-의존성 세포독성"(CDC)은 보체의 존재 하에 본 발명의 항체에 의한 항원-발현 세포의 용해를 지칭한다. "항체-의존성 세포-매개 세포독성"(ADCC)은 Fc 수용체(FcR)를 발현하는 비특이적 세포독성 세포(예를 들어 자연 살해(NK) 세포, 호중구, 및 대식세포)가 표적 세포 상에서 결합된 항체를 인식하여 표적 세포의 용해를 유도하는 세포-매개 반응을 지칭한다. CDC 및 ADCC는 당업계에 공지되어 있고 이용 가능한 분석법을 사용하여 측정될 수 있다. (예를 들어 미국 특허 제5,500,362호 및 제5,821,337호, 및 Clynes 등의 문헌[(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:652-656] 참조). 항체의 불변 영역은 보체를 고정하고 세포 의존적 세포독성을 매개하는 항체의 능력에 있어서 중요하다. 따라서, 항체의 이소형은 항체가 세포독성을 매개하는 것이 바람직한지 여부를 기준으로 선택될 수 있다.
본 발명의 특정 구현예에서, 본원에 제공된 항-CD38 단일특이적 항체, 항-CD28 단일특이적 항체, 또는 항-CD38/항-CD28 이중특이적 항체는 인간 항체이다. 본원에서 사용되는 용어 "인간 항체"는 인간 생식선 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하도록 의도된다. 본 발명의 인간 항체는 인간 생식선 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않은 아미노산 잔기(예컨대, 시험관 내 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체 내 체세포성 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 예를 들어 CDR에 포함할 수 있고, 특히 CDR3에 포함할 수 있다. 그러나 본원에서 사용되는 용어 "인간 항체"는 또 다른 포유류 종, 예를 들면 마우스의 생식선으로부터 유도된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 위로 그래프트되어 있는 항체를 포함하도록 의도되지는 않는다.
본 발명의 항체는 일부 구현예에서, 재조합 인간 항체일 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 또는 분리된 모든 인간 항체, 예를 들어 숙주 세포 안에 형질전환된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체(아래에서 상세하게 설명됨), 재조합된 조합 인간 항체 라이브러리로부터 분리된 항체(아래에서 상세하게 설명됨), 인간 면역글로불린 유전자에 대해 유전자가 도입된 동물(예를 들어, 마우스)로부터 분리된 항체(예를 들어, Taylor 외, Nucl. Acids Res. 20:6287-6295(1992) 참조) 또는 다른 DNA 서열에 대해 인간 면역글로불린 유전자 서열의 스플라이싱을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 또는 분리된 항체를 포함하고자 한 것이다. 이러한 재조합 인간 항체는 인간 생식선 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는다. 그러나 일부 구현예에서, 이러한 재조합 인간 항체는 시험관 내 돌연변이 유발(또는 인간 Ig 서열에 대해 유전자 도입된 동물이 사용되는 경우에서의, 생체 내 체세포성 돌연변이 유발)을 거치므로, 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 인간 생식선 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 이들과 관련되지만, 생체 내에서 인간 항체 생식선 레퍼토리 내에 자연적으로 존재하지 않을 수 있다.
인간 항체는 힌지 비균질성과 연관된 2가지 형태로 존재할 수 있다. 제1 형태로, 면역글로불린 분자는 대략 150~160 kDa의 안정적인 4쇄 작제물을 포함하며, 여기에서 이량체는 사슬 간 중쇄 이황화 결합에 의해 함께 유지된다. 제2 형태에서, 이량체는 사슬 간 이황화 결합을 통해 연결되지 않으며, 공유 결합된 경쇄 및 중쇄(반수 항체)로 구성된 약 75~80 kDa의 분자가 형성된다. 이러한 형태는 친화성 정제 후에도 분리하기가 매우 어렵다.
다양한 온전한 IgG 이소형에서 제2 형태의 출현 빈도는 항체의 힌지 영역 이소형과 관련된 구조적 차이로 인한 것이지만, 이에 한정되지는 않는다. 인간 IgG4 힌지의 힌지 영역에서의 단일 아미노산 치환은 인간 IgG1 힌지를 사용하여 전형적으로 관찰되는 수준으로 제2 형태의 외관을 상당히 감소시킬 수 있다(Angal 등의 문헌[(1993) Molecular Immunology 30:105]). 본 발명은 힌지, CH2 또는 CH3 영역에서 하나 이상의 돌연변이를 갖는 항체를 포함하며, 이는 예를 들어 생산에서 원하는 항체 형태의 수율을 개선하는 데 바람직할 수 있다.
본 발명의 항체는 단리된 항체일 수 있다. 본원에서 사용되는 "단리된 항체"는 이의 자연 환경의 적어도 하나의 성분으로부터 식별되어 분리되었고/되었거나 회수된 항체를 의미한다. 예를 들어, 유기체의 적어도 하나의 성분으로부터 분리 또는 제거된 항체, 또는 항체가 자연적으로 존재하거나 자연적으로 생산되는 조직이나 세포로부터 분리 또는 제거된 항체가 본 발명의 목적에 맞는 "단리된 항체"이다. 단리된 항체는 재조합 세포 내의 인 시튜(in situ) 항체 또한 포함한다. 단리된 항체는 적어도 하나의 정제 또는 단리 단계를 거친 항체이다. 특정 구현예에 따르면, 단리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학 물질을 실질적으로 갖지 않을 수 있다.
본 발명은 CD38 또는 CD28에 결합하는 단일 아암 항체를 또한 포함한다. 본원에서 사용되는 "단일 아암 항체"는 단일 항체 중쇄 및 단일 항체 경쇄를 포함하는 항원 결합 분자를 의미한다. 본 개시의 단일 아암 항체는 본원의 표 1 또는 표 4에 제시된 것과 같은 HCVR/LCVR 또는 CDR 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
본원에 개시된 항-CD38 항체, 항-CD28 항체, 또는 항-CD38 x 항-CD28 항체는, 항체가 유래된 상응하는 생식선 서열과 비교했을 때 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 프레임워크 및/또는 CDR 영역에서 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입, 및/또는 결실을 포함할 수 있다. 이러한 돌연변이는 본원에 개시된 아미노산 서열을, 예를 들어, 공개된 항체 서열 데이터베이스로부터 이용할 수 있는 생식선 서열과 비교함으로써 쉽게 확인할 수 있다. 본 개시는 본원에 개시된 아미노산 서열 중 어느 하나로부터 유래된 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함하되, 하나 이상의 프레임워크 영역 및/또는 CDR 영역 내의 하나 이상의 아미노산은 항체가 유래된 생식계열 서열의 상응하는 잔기(들)로 돌연변이되거나, 또 다른 인간 생식계열 서열의 상응하는 잔기(들)로 돌연변이되거나, 상응하는 생식계열 잔기(들)의 보존적 아미노산 치환으로 돌연변이될 수 있다(이러한 서열 변화는 본원에서 "생식계열 돌연변이"로서 통칭한다). 당업자는, 본원에 개시된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열에서 출발하여, 하나 이상의 개별 생식선 돌연변이 또는 이들의 조합을 포함하는 다수의 항체 및 항원 결합 단편을 쉽게 생산할 수 있다. 특정 구현예에서, V H 및/또는 V L 도메인 내의 프레임워크 및/또는 CDR 잔기의 전부는, 항체가 유래된 원래의 생식선 서열에서 발견되는 잔기로 다시 돌연변이된다. 다른 구현예에서, 특정한 잔기만이, 예를 들어, FR1의 처음 8개의 아미노산 또는 FR4의 마지막 8개의 아미노산 내에서 발견되는 돌연변이된 잔기, 또는 CDR1, CDR2 또는 CDR3에서 발견되는 돌연변이된 잔기만이 원래의 생식선 서열로 다시 돌연변이된다. 다른 구현예에서, 프레임워크 및/또는 CDR 잔기(들) 중 하나 이상은 상이한 생식선 서열(즉, 항체가 유래된 원래의 생식선 서열과 상이한 생식선 서열)의 상응하는 잔기(들)로 돌연변이된다.
또한, 본 발영의 항체는 프레임워크 및/또는 CDR 영역 내의 2개 이상의 생식계열 돌연변이의 임의의 조합을 함유할 수 있는데, 예를 들어, 특정 개별 잔기는 특정 생식계열 서열의 상응하는 잔기로 돌연변이 되는 반면, 원래의 생식계열 서열과 상이한 특정한 다른 잔기는 유지되거나, 상이한 생식계열 서열의 상응하는 잔기로 돌연변이 된다. 일단 획득되면, 하나 이상의 생식선 돌연변이를 포함하는 항체 및 항원 결합 단편은, 개선된 결합 특이성, 증가된 결합 친화도, 개선되거나 강화된 길항성 또는 작용성 생물학적 특성(경우에 따라), 감소된 면역원성 등과 같은 하나 이상의 원하는 특성에 대해 쉽게 시험될 수 있다. 이러한 일반적인 방식으로 수득된 항체 및 항원 결합 단편은 본 발명에 포함된다.
하나 이상의 보존적 치환을 갖는, 본원에 개시된 HCVR, LCVR, 및/또는 CDR 아미노산 서열 중 어느 하나의 변이체를 포함하는 항-CD38 항체, 항-CD28 항체, 또는 항-CD38 x 항-CD28 항체가 본원에 제공된다. 예를 들어, 본 개시는 본원의 표 1, 4, 또는 7에 제시된 HCVR, LCVR, 및/또는 CDR 서열 중 어느 하나에 비해 예를 들어 10개 이하, 8개 이하, 6개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개, 또는 1개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 HCVR, LCVR, 및/또는 CDR 아미노산 서열을 갖는 항-CD38 항체, 항-CD28 항체, 또는 항-CD38 x 항-CD28 항체체를 포함한다.
용어 "에피토프"는 파라토프로 알려진 항체 분자의 가변 영역에서 특이적 항원 결합 부위와 상호 작용하는 항원 결정자를 지칭한다. 단일 항원은 하나 이상의 에피토프를 가질 수 있다. 따라서, 상이한 항체는 항원 상의 상이한 영역에 결합할 수 있고 상이한 생물학적 효능을 가질 수 있다. 에피토프는 입체적이거나 선형일 수 있다. 입체적 에피토프는 선형 폴리펩티드 사슬의 상이한 분절에서 유래된 공간적으로 병치된 아미노산에 의해 생산된다. 선형 에피토프는 폴리펩티드 사슬 내 인접한 아미노산 잔기에 의해 생성된 것이다. 특정 상황에서, 에피토프는 항원 상에 당류, 포스포릴기, 또는 술포닐기의 모이어티를 포함할 수 있다.
핵산 또는 이의 단편을 지칭할 때의 "실질적 동일성" 또는 "실질적으로 동일한"이란 용어는, 적절한 뉴클레오티드 삽입 또는 결실을 또 다른 핵산(또는 이의 상보성 가닥)과 최적으로 정렬한 경우, 후술한 바와 같은 임의의 알려진 서열 동일성 알고리즘(예: FASTA, BLAST 또는 Gap)에 의해 측정했을 때 뉴클레오티드 염기의 적어도 95%, 더 바람직하게는 적어도 96%, 97%, 98%, 또는 99%에서 뉴클레오티드 서열 동일성이 있음을 나타낸다. 기준 핵산 분자에 대한 실질적 동일성을 갖는 핵산 분자는, 특정 경우, 기준 핵산 분자에 의해 암호화된 폴리펩티드와 동일하거나 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화할 수 있다.
폴리펩티드에 적용되는 바와 같이, 용어 "실질적인 유사성" 또는 "실질적으로 유사한"은, 예를 들어, 디폴트 갭 가중치를 사용하는 GAP 또는 BESTFIT 프로그램에 의해 최적으로 정렬되었을 때, 2개의 펩티드 서열이 적어도 95% 서열 동일성, 더욱 더 바람직하게는 적어도 98% 또는 99%의 서열 동일성을 공유함을 의미한다. 바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환만큼 상이하다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 화학적 성질(예: 전하 또는 소수성)을 갖는 측쇄(R기)를 갖는 또 다른 아미노산 잔기에 의해 치환되는 것이다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 기능적 성질을 실질적으로 변화시키지 않을 것이다. 2개 이상의 아미노산 서열이 보존적 치환만큼 서로 상이한 경우, 서열 동일성 백분율 또는 유사성의 정도는 상향으로 조정되어 치환의 보존적 성질을 보정할 수 있다. 이러한 조정을 만드는 수단은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어 Pearson의 문헌[(1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331]을 참조하며, 동 문헌은 참조로서 본원에 통합된다. 화학적 성질이 유사한 측쇄를 갖는 아미노산의 군의 예는 다음을 포함한다: (1) 지방족 측쇄: 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신; (2) 지방족-히드록실 측쇄: 세린 및 트레오닌; (3) 아미드 함유 측쇄: 아스파라긴 및 글루타민; (4) 방향족 측쇄: 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판; (5) 염기성 측쇄: 리신, 아르기닌, 및 히스티딘; (6) 산성 측쇄: 아스파르트산염 및 글루탐산염; 및 (7) 황 함유 측쇄: 시스테인 및 메티오닌. 바람직한 보존적 아미노산 치환기는: 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루탐산염-아스파르트산염, 및 아스파라긴-글루타민이다. 대안적으로, 보존적 치환은 Gonnet 등의 문헌에 개시된 PAM250 로그 우도 매트릭스에서 양의 값을 갖는 임의의 변화이다(Gonnet 등의 문헌[(1992) Science 256: 1443-1445]을 참조하고, 동 문헌은 본원에 참조로서 통합됨). "적당한 보존적" 치환은 PAM250 로그 우도 매트릭스에서 음의 값을 갖는 임의의 변화이다.
서열 동일성으로도 지칭되는, 폴리펩티드에 대한 서열 유사성은 일반적으로 서열 분석 소프트웨어를 사용해 측정된다. 단백질 분석 소프트웨어는 보존적 아미노산 치환을 포함하는 다양한 치환, 결실 및 기타 변형에 배정된 유사성 측정치를 사용하여 유사한 서열들을 대조한다. 예를 들어, GCG 소프트웨어는, 상이한 종의 유기체 유래의 상동성 폴리펩티드와 같은 밀접하게 연관된 폴리펩티드 간의 서열 상동성이나 서열 동일성, 또는 야생형 단백질과 이의 뮤테인 사이의 서열 상동성이나 서열 동일성을 결정하기 위한 디폴트 파라미터와 함께 사용될 수 있는 Gap 및 Bestfit과 같은 프로그램을 포함한다. 예를 들어, GCG 버전 6.1 참조. 폴리펩티드 서열은 또한 GCG 버전 6.1의 프로그램인 FASTA를 사용해, 디폴트 파라미터 또는 권장 파라미터를 사용해 비교할 수 있다. FASTA(예를 들어, FASTA2 및 FASTA3)는 쿼리 및 검색 서열 사이의 가장 중첩된 영역의 정렬 및 서열 동일성 백분율을 제공한다(전술한 Pearson(2000) 참조). 상이한 유기체 유래의 다수의 서열이 포함된 데이터베이스와 본 발명의 서열을 비교할 때 바람직한 또 다른 알고리즘은 디폴트 파라미터를 사용하는 컴퓨터 프로그램인 BLAST, 특히 BLASTP 또는 TBLASTN이다. 예를 들어, Altschul 등의 문헌[(1990) J. Mol. Biol. 215:403-410] 및 Altschul 등의 문헌[(1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402]을 참조하고, 이들 각각은 참조로서 본원에 통합된다.
생식선 돌연변이
본원에 개시된 항-CD38 항체, 항-CD28 항체, 및 항-CD38/항-CD28 이중특이적 항원 결합 분자는, 항체가 유래된 상응하는 생식선 서열과 비교했을 때 중쇄 가변 도메인의 프레임워크 영역 및/또는 CDR 영역에서 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입, 및/또는 결실을 포함할 수 있다.
본원에 개시된 아미노산 서열 중 어느 하나로부터 유래되는 항체 및 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되며, 여기서 하나 이상의 프레임워크 영역 및/또는 CDR 영역 내의 하나 이상의 아미노산은 항체가 유래된 생식선 서열의 상응하는 잔기(들)로 돌연변이되거나, 또 다른 인간 생식선 서열의 상응하는 잔기(들)로 돌연변이되거나, 상응하는 생식선 잔기(들)의 보존적 아미노산 치환으로 돌연변이될 수 있고(이러한 서열 변화는 본원에서 "생식선 돌연변이"로서 통칭함), CD38 항원 또는 CD28 항원에 대해 약하거나 검출 불가능한 결합을 갖는다.
항체의 결합 특성
본원에서 사용되는 바와 같이, 예를 들어, 소정의 항원(예: 세포 표면 단백질 또는 이의 단편)에 대한 항체, 면역글로불린, 항체 결합 단편, 또는 Fc-함유 단백질의 결합의 맥락에서 "결합(binding)"이라는 용어는 최소 2개의 엔티티 또는 분자 구조 간의 상호작용 또는 결합, 예컨대 항체-항원 상호작용을 일반적으로 지칭한다.
예를 들어, 결합 친화도는 항원을 리간드로서 사용하고 항체, Ig, 항체 결합 단편, 또는 Fc-함유 단백질을 분석물(또는 항-리간드)로서 사용해, 예를 들어, BIAcore 기기에서 표면 플라스몬 공명(SPR) 기술로 결정했을 때, 약 10-7 M 이하, 예컨대 약 10-8 M 이하, 예컨대 약 10-9 M 이하의 KD 값에 상응한다. 형광 활성화 세포 분류(FACS) 결합 검정과 같은 세포 기반 결합 전략도 일상적으로 사용되며, FACS 데이터는 방사성 리간드 경쟁 결합 및 SPR과 같은 다른 방법과 잘 상관된다(Benedict, CA의 문헌[J Immunol Methods. 1997, 201(2):223-31]; Geuijen, CA 등의 문헌[J Immunol Methods. 2005, 302(1-2):68-77]).
따라서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단백질은 비특이적 항원(예: BSA, 카제인)에 결합하기 위한 친화도보다 적어도 10배 더 낮은 KD 값에 상응하는 친화도를 갖는 소정의 항원 또는 세포 표면 분자(수용체)에 결합한다. 본 개시에 따르면, 비특이적 항원보다 10배 이하인 KD 값에 상응하는 항체의 친화도는 검출 불가능한 결합으로 간주될 수 있지만, 이러한 항체는 본 발명의 이중특이적 항체의 생산을 위해 제2 항원 결합 아암과 쌍을 이룰 수 있다.
용어 "KD"(M)는 특정 항체-항원 상호작용의 평형 해리 상수, 또는 항원에 결합하는 항체 또는 항체-결합 단편의 평형 해리 상수를 지칭한다. KD와 결합 친화도 사이에는 역관계가 존재하므로, KD 값이 작을수록 친화도가 높아진다(강해진다). 따라서, "더 높은 친화도" 또는 "더 강한 친화도"란 용어는 상호작용을 형성하는 더 높은 능력, 따라서 더 작은 KD 값에 관한 것이고; 반대로 "더 낮은 친화도" 또는 "더 약한 친화도"란 용어는 상호작용을 형성하는 더 낮은 능력, 따라서 더 큰 KD 값에 관한 것이다. 일부 경우에, 특정 분자(예: 항체)의 또 다른 상호작용 파트너 분자(예: 항원 Y)에 대한 결합 친화도(또는 KD)와 비교했을 때 동 분자(예: 항체)의 이의 상호 작용 파트너 분자(예: 항원 X)에 대한 더 높은 결합 친화도는 더 큰 KD 값(더 낮거나, 더 약한 친화도)을 더 작은 KD(더 높거나, 더 강한 친화도) 나누어서 결정된 결합비로서 표현될 수 있으며, 경우에 따라, 예를 들어 5배 또는 10배 더 큰 결합 친화도로서 표현될 수 있다.
용어 "kd"(sec-1 또는 1/s)는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도 상수, 또는 항체 또는 항체-결합 단편의 해리 속도 상수를 지칭한다. 상기 값은 koff 값으로도 지칭된다.
용어 "ka"(M-1 x sec-1 또는 1/M/s)는 특정 항체-항원 상호작용의 결합 속도 상수, 또는 항체 또는 항체-결합 단편의 결합 속도 상수를 지칭한다.
용어 "KA"(M-1 또는 1/M)는 특정 항체-항원 상호작용의 결합 평형 상수, 또는 항체 또는 항체-결합 단편의 결합 평형 상수를 지칭한다. 결합 평형 상수는 ka를 kd로 나누어서 구한다.
용어 "EC50" 또는 "EC50"은 반수 최대 유효 농도를 지칭하며, 베이스라인과 특정 노출 시간 후 최대 반응의 절반에 해당하는 반응을 유도하는 항체 농도를 포함한다. EC50은 본질적으로 항체의 최대 효과의 50%가 관찰되는 항체의 농도를 나타낸다. 특정 구현예에서, EC50 값은, 예를 들어, FACS 결합 검정에 의해 결정했을 때, CD28 또는 종양 연관 항원(예: CD38)을 발현하는 세포에 대한 본 발명의 항체의 최대 결합의 절반을 제공하는 농도와 동일하다. 따라서, EC50 또는 반수 최대 유효 농도 값이 증가하면 감소되거나 더 약한 결합이 관찰된다.
일 구현예에서, 결합 감소는 반수 최대량으로 표적 세포에 결합할 수 있게 하는 EC50 항체 농도의 증가로서 정의될 수 있다.
또 다른 구현예에서, EC50 값은 T 세포 세포독성 활성에 의해 표적 세포의 반수 최대 고갈을 유도하는 본 발명의 항체의 농도를 나타낸다. 따라서, 세포독성 활성(예: T 세포 매개 종양 세포 살해)의 증가는 EC50 또는 반수 최대 유효 농도 값이 감소할 때 관찰된다.
이중특이적 항원 결합 분자
본 발명의 항체는 단일특이적, 이중특이적, 또는 다중특이적일 수 있다. 다중특이적 항체는 하나의 표적 폴리펩티드의 상이한 에피토프에 특이적이거나 둘 이상의 표적 폴리펩티드에 특이적인 항원 결합 도메인을 함유할 수 있다. 예를 들어, Tutt 등의 문헌[1991, J. Immunol. 147:60-69]; Kufer 등의 문헌[2004, Trends Biotechnol. 22:238-244] 참조. 본 개시의 항-CD38 단일특이적 항체, 항-CD28 단일특이적 항체, 또는 항-CD38 x 항-CD28 이중특이적 항체는 또 다른 기능적 분자(예를 들어 또 다른 펩티드 또는 단백질)에 연결되거나 이와 공동 발현될 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 이의 단편은 (예를 들어, 화학적 결합, 유전적 융합, 비공유 결합에 의하거나 그 외의 방법으로) 하나 이상의 다른 분자 엔티티, 예컨대 또 다른 항체 또는 항체 단편에 연결되어 제2 또는 추가의 결합 특이성을 갖는 이중특이적 또는 다중특이적 항체를 생산할 수 있다.
본원에서 "항-CD28 항체" 또는 "항-CD38 항체"라는 표현의 사용은 단일특이적 항-CD28 또는 항-CD38 항체 둘 다를 비롯하여, CD28-결합 아암 및 CD38-결합 아암을 포함하는 이중특이적 항체도 포함하도록 의도된다. 따라서, 본 개시는 면역글로불린의 하나의 아암이 인간 CD328 결합하고 면역글로불린의 다른 하나의 아암은 인간 CD38에 특이적인 이중특이적 항체를 포함한다. CD28-결합 아암은 본원의 표 4에 제시된 것과 같은 HCVR/LCVR 또는 CDR 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, CD28-결합 아암은 인간 CD28에 결합하여 인간 T 세포 활성화를 촉진한다. 특정 구현예에서, CD28-결합 아암은 인간 CD28에 결합하여 인간 T 세포 활성화를 유도한다. 다른 구현예에서, CD28-결합 아암은 인간 CD28에 약하게 결합하여, 이중특이적 또는 다중특이적 항체의 맥락에서, 종양 연관 항원 발현 세포 살해를 유도한다. CD38-결합 아암은 본원의 표 1에 제시된 것과 같은 HCVR/LCVR 또는 CDR 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
특정 예시적인 구현예에 따르면, 본 발명은 CD28 및 CD38에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항원 결합 분자를 포함한다. 이러한 분자는, 예를 들어 "항-CD38 x 항-CD28" 또는 "항-CD38/항-CD28" 또는 "CD38xCD28" 이중특이적 분자, 또는 다른 유사한 용어(예: 항-CD28/항-CD38)로서 본원에서 지칭될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "CD38"은 비인간 종으로부터 유래된 것(예를 들어, "마우스 CD38", "원숭이 CD38" 등)으로 명시되지 않는 한 인간 CD38 단백질을 지칭한다. 인간 CD38 단백질은 서열 번호 62(인간 CD38 세포외 도메인 (V43-I300).mFc)에 도시된 아미노산 서열, 및/또는 NCBI 수탁번호 NP_001766.2 또는 NM_001775.3에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는다.
인간 CD38 세포외 도메인 (V43-I300).mFc ( 면역원 ) 아미노산 서열
VPRWRQQWSGPGTTKRFPETVLARCVKYTEIHPEMRHVDCQSVWDAFKGAFISKHPCNITEEDYQPLMKLGTQTVPCNKILLWSRIKDLAHQFTQVQRDMFTLEDTLLGYLADDLTWCGEFNTSKINYQSCPDWRKDCSNNPVSVFWKTVSRRFAEAACDVVHVMLNGSRSKIFDKNSTFGSVEVHNLQPEKVQTLEAWVIHGGREDSRDLCQDPTIKELESIISKRNIQFSCKNIYRPDKFLQCVKNPEDSSCTSEIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK* (서열번호 62) 밑줄 친 것이 mFc 서열임
CD38 및 CD28에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항원 결합 분자는 시험관 내 친화도 결합 검정에 의해 측정했을 때 약한 결합 친화도로 CD28에 결합하는, 예컨대 약 200 nM 초과의 KD를 나타내는 항-CD28 항원 결합 분자를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "항원 결합 분자"라는 표현은 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하거나 이로 이루어지는 단백질, 폴리펩티드, 또는 분자 복합체를 의미하며, 여기서 상기 적어도 하나의 상보성 결정 영역은 단독으로, 또는 하나 이상의 추가 CDR 및/또는 프레임워크 영역(FR)과 함께 특정 항원에 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 항원 결합 분자는 항체 또는 항체의 단편이며, 이러한 용어들은 본원의 다른 곳에서 정의된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "이중특이적 항원 결합 분자"라는 표현은 적어도 제1 항원 결합 도메인 및 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 단백질, 폴리펩티드, 또는 분자 복합체를 의미한다. 이중특이적 항원 결합 분자 내의 각각의 항원 결합 도메인은, 단독으로 또는 하나 이상의 추가 CDR 및/또는 FR과 함께 특정 항원에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 CDR을 포함한다. 본 발명의 맥락에서, 제1 항원 결합 도메인은 제1 항원(예: CD38)에 특이적으로 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 구별되는 제2 항원(예: CD28)에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 특정 예시적인 구현예에서, 이중특이적 항원 결합 분자는 이중특이적 항체이다. 이중특이적 항체의 각 항원 결합 도메인은 중쇄 가변 도메인(HCVR) 및 경쇄 가변 도메인(LCVR)을 포함한다. 제1 및 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자(예를 들어, 이중특이적 항체)의 맥락에서, 제1 항원 결합 도메인의 CDR은 접두어 "D1"과 함께 지정될 수 있고, 제2 항원 결합 도메인의 접두어 "D2"와 함께 지정될 수 있다. 따라서, 제1 항원 결합 도메인의 CDR은 본원에서 D1-HCDR1, D1-HCDR2, 및 D1-HCDR3로서 지칭될 수 있고; 제2 항원 결합 도메인의 CDR은 본원에서 D2-HCDR1, D2-HCDR2, 및 D2-HCDR3로 지칭될 수 있다.
특정 예시적인 구현예에서, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자는: (a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR) 내에 함유된 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3); 및 (b) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR) 내의 3개의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3)을 포함한다. 일부 경우에, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자는 다음을 포함하는 제1 항원 결합 도메인을 포함한다: 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3. 일부 경우에, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함한다. 일부 경우에, 제1 항원 결합 도메인은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR을 포함한다.
특정 예시적인 구현예에서, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자는 다음을 포함하는 제2 항원 결합 도메인을 포함한다: (a) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR) 내에 함유된 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3); 및 (b) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR) 내에 함유된 3개의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3). 일부 경우에, 제2 항원 결합 도메인은 다음을 포함한다: 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1; 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2; 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3. 일부 경우에, 제2 항원 결합 도메인은 다음을 포함한다: 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1; 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2; 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3. 　 일부 경우에, 제2 항원 결합 도메인은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR을 포함한다. 　
특정 예시적인 구현예에서, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자는 다음을 포함하는 제1 항원 결합 도메인을 포함한다: (a) 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR) 내에 함유된 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3); 및 (b) 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR) 내의 3개의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3). 　 일부 경우에, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함한다. 　 일부 경우에, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함한다. 일부 경우에, 제1 항원 결합 도메인은 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR을 포함한다. 　
특정 예시적인 구현예에서, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자는 다음을 포함하는 제2 항원 결합 도메인을 포함한다: (a) 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR) 내에 함유된 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3); 및 (b) 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR) 내에 함유된 3개의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3). 　 일부 경우에, 제2 항원 결합 도메인은 다음을 포함한다: 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1; 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2; 및 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3. 　 일부 경우에, 제2 항원 결합 도메인은 다음을 포함한다: 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1; 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2; 및 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3. 　 일부 경우에, 제2 항원 결합 도메인은 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR을 포함한다. 　
특정 예시적인 구현예에서, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자는 다음을 포함한다: (a) 서열번호 4의 HCDR1 아미노산 서열, 서열번호 6의 HCDR2 아미노산 서열, 및 서열번호 8의 HCDR3 아미노산 서열을 포함하는 제1 항원 결합 도메인; 및 (b) 서열번호 12의 HCDR1 아미노산 서열; 서열번호 14의 HCDR2 아미노산 서열, 및 서열번호 16의 HCDR3 아미노산 서열을 포함하는 제2 항원 결합 도메인. 　 일부 경우에, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 20의 LCDR1 아미노산 서열, 서열번호 22의 LCDR2 아미노산 서열, 및 서열번호 24의 LCDR3 아미노산 서열을 포함한다. 　
특정 예시적인 구현예에서, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자는 다음을 포함한다: (a) 서열번호 34의 HCDR1 아미노산 서열, 서열번호 36의 HCDR2 아미노산 서열, 및 서열번호 38의 HCDR3 아미노산 서열을 포함하는 제1 항원 결합 도메인; 및 (b) 서열번호 42의 HCDR1 아미노산 서열; 서열번호 44의 HCDR2 아미노산 서열, 및 서열번호 46의 HCDR3 아미노산 서열을 포함하는 제2 항원 결합 도메인. 　 일부 경우에, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 50의 LCDR1 아미노산 서열, 서열번호 52의 LCDR2 아미노산 서열, 및 서열번호 54의 LCDR3 아미노산 서열을 포함한다. 　
특정 예시적인 구현예에서, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자는 다음을 포함한다: (a) 서열번호 4의 HCDR1 아미노산 서열, 서열번호 6의 HCDR2 아미노산 서열, 및 서열번호 8의 HCDR3 아미노산 서열; 서열번호 20의 LCDR1 아미노산 서열, 서열번호 22의 LCDR2 아미노산 서열, 및 서열번호 24의 LCDR3 아미노산 서열을 포함하는 제1 항원 결합 도메인; 및 (b) 서열번호 12의 HCDR1 아미노산 서열, 서열번호 14의 HCDR2 아미노산 서열, 및 서열번호 16의 HCDR3 아미노산 서열; 서열번호 20의 LCDR1 아미노산 서열, 서열번호 22의 LCDR2 아미노산 서열, 및 서열번호 24의 LCDR3 아미노산 서열을 포함하는 제2 항원 결합 도메인. 　 일부 경우에, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자는 다음을 포함한다: (a) 서열번호 2의 HCVR 아미노산 서열 및 서열번호 18의 LCVR 아미노산 서열을 포함하는 제1 항원 결합 도메인; 및 (b) 서열번호 10의 HCVR 아미노산 서열 및 서열번호 18의 LCVR 아미노산 서열을 포함하는 제2 항원 결합 도메인. 　
특정 예시적인 구현예에서, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자는 다음을 포함한다: (a) 인간 CD38에 특이적으로 결합하고, 서열번호 2 및 32로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 CDR 및 서열번호 18 및 48로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 CDR을 포함하는 제1 항원 결합 도메인; 및 (b) 인간 CD28에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 도메인. 일부 경우에, 제1 항원 결합 도메인은 서열번호 2/18 및 32/48로 이루어진 군으로부터 선택된 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍으로부터의 CDR을 포함한다. 일부 경우에, 제1 항원 결합 도메인은 서열번호 4-6-8-20-22-24 및 34-36-38-50-52-54로 이루어진 군으로부터 선택된 HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 도메인을 각각 포함한다. 일부 경우에, 제1 항원 결합 도메인은 서열번호 2/18 및 32/48로 이루어진 군으로부터 선택된 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍을 포함한다. 일부 경우에, 제2 항원 결합 도메인은 서열번호 10/18 및 40/48로 이루어진 군으로부터 선택된 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍을 포함한다.
특정 예시적인 구현예에서, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자는 CD38에 결합하기 위해 경쟁하거나, CD38 상에서 기준 항체와 동일한 에피토프에 결합하며, 여기서 기준 항체는 본원에 제시된 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 이중특이적 항-CD38/CD28 항체를 포함한다.
특정 예시적인 구현예에서, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자는 인간 CD3에 결합하기 위해 경쟁하거나, 인간 CD3 상에서 기준 항체와 동일한 에피토프에 결합하며, 여기서 기준 항체는 본원에 제시된 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 이중특이적 항-CD38/CD28 항체를 포함한다.
위에서 또는 본원에서 논의된 이중특이적 항원 결합 분자는 이중특이적 항체일 수 있다. 일부 경우에, 이중특이적 항체는 인간 IgG 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 경우에, 인간 IgG 중쇄 불변 영역은 이소형 IgG1이다. 일부 경우에, 인간 IgG 중쇄 불변 영역은 이소형 IgG4이다. 다양한 구현예에서, 이중특이적 항체는 동일한 이소형의 야생형 힌지에 비해 Fc 수용체 결합을 감소시키는 키메라 힌지를 포함한다.
제1 항원 결합 도메인 및 제2 항원 결합 도메인은 직접적으로 또는 간접적으로 서로 연결되어 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자를 형성할 수 있다. 대안적으로, 제1 항원 결합 도메인과 제2 항원 결합 도메인은 각각 별도의 다량체화 도메인에 연결될 수 있다. 하나의 다량체화 도메인과 또 다른 다량체화 도메인을 결합시키면 2개의 항원 결합 도메인 간의 결합이 용이해져, 이중특이적 항원 결합 분자가 형성된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "다량체화 도메인"은 동일하거나 유사한 구조 또는 구성의 제2 다량체화 도메인과 결합하는 능력이 있는 임의의 거대분자, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드 또는 아미노산이다. 예를 들어, 다량체화 도메인은 면역글로불린 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다. 다량체화 도메인의 비제한적인 예는 (CH2-CH3 도메인을 포함하는) 면역글로불린의 Fc 부분, 예를 들어 이소형 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4뿐만 아니라 각 이소형 군 내의 임의의 알로타입(allotype)으로부터 선택된 IgG의 Fc 도메인이다.
본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자는 일반적으로 2개의 다량체화 도메인, 예를 들어, 각각이 별개 항체 중쇄의 개별적으로 일부분인 2개의 Fc 도메인을 포함하게 된다. 제1 및 제2 다량체화 도메인은, 예를 들어, IgG1/IgG1, IgG2/IgG2, IgG4/IgG4와 같은 동일한 IgG 이소형일 수 있다. 대안적으로, 제1 및 제2 다량체화 도메인은 예를 들어, IgG1/IgG2, IgG1/IgG4, IgG2/IgG4 등과 같은 상이한 IgG 이소형일 수 있다.
특정 구현예에서, 다량체화 도메인은 Fc 단편 또는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 함유하는 1개 내지 약 200개 아미노산 길이의 아미노산 서열이다. 다른 구현예에서, 다량체화 도메인은 시스테인 잔기, 또는 짧은 시스테인을 함유하는 펩티드이다. 다른 다량체화 도메인은 류신 지퍼, 나선-루프 모티프 또는 이중 코일 모티프를 포함하거나 이들로 구성된 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함한다.
임의의 이중특이적 항체 포맷 또는 기술을 사용하여 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자를 제조할 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 이의 단편은 (예를 들어, 화학적 결합, 유전자 융합, 비공유 결합 또는 다른 것에 의해) 하나 이상의 다른 분자 엔티티, 예컨대, 제2 항원 결합 특이성을 갖는 또 다른 항체 또는 항체 단편에 기능적으로 연결되어 이중특이적 항원 결합 분자를 생산할 수 있다. 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 특정 예시적인 이중특이적 포맷은 예를 들어, scFv-기반 또는 디아바디 이중특이적 포맷, IgG-scFv 융합체, 이중 가변 도메인(DVD)-Ig, 콰드로마, 놉-인투-홀(knobs-into-holes), 공통 경쇄(예를 들어, 놉-인투-홀을 가지는 공통 경쇄 등), CrossMab, CrossFab, (SEED)바디, 류신 지퍼, 듀오바디, IgG1/IgG2, 이중 작용 Fab (DAF)-IgG, 및 Mab2 이중특이적 포맷을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다(전술한 포맷에 대한 검토는 예를 들어, Klein 등의 문헌[2012, mAbs 4:6, 1-11], 및 동 문헌에 인용된 참고문헌을 참조한다).
본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자의 맥락에서, 다량체화 도메인(예: Fc 도메인)은 Fc 도메인의 자연 발생 버전인 야생형과 비교했을 때 하나 이상의 아미노산 변화(예: 삽입, 결실, 또는 치환)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 Fc 도메인에서 하나 이상의 변형을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자를 포함하며, 이러한 변형은 Fc 도메인을 변형시켜 Fc와 FcRn 사이에서 변형된 결합 상호작용(예를 들어, 강화 또는 감소)을 야기한다. 일 구현예에서, 이중특이적 항원 결합 분자는 CH2 또는 CH3 영역에서 변형을 포함하며, 변형은 산성 환경(예를 들어, pH가 약 5.5 내지 약 6.0인 엔도솜)에서 FcRn에 대한 Fc 도메인의 친화도를 증가시킨다. 이러한 Fc 변형의 비제한적인 예는, 예를 들어 위치 250에서의 변형(예: E 또는 Q); 위치 250 및 428에서의 변형(예: L 또는 F); 위치 252에서의 변형(예: L/Y/F/W 또는 T), 위치 254에서의 변형(예: S 또는 T), 및 위치 256에서의 변형(예: S/R/Q/E/D 또는 T); 또는 위치 428 및/또는 433에서의 변형(예: L/R/S/P/Q 또는 K), 및/또는 위치 434에서의 변형(예: H/F 또는 Y); 또는 위치 250 및/또는 428에서의 변형; 또는 위치 307 또는 308에서의 변형(예: 308F, V308F) 및 434에서의 변형을 포함한다. 일 구현예에서, 변형은 428L(예컨대, M428L) 및 434S(예컨대, N434S) 변형; 428L, 259I(예컨대, V259I), 및 308F(예컨대, V308F) 변형; 433K(예컨대, H433K) 및 434(예컨대, 434Y) 변형; 252, 254, 및 256(예컨대, 252Y, 254T, 및 256E) 변형; 250Q 및 428L 변형(예컨대, T250Q 및 M428L); 및 307 및/또는 308 변형(예컨대, 308F 또는 308P)을 포함한다.
본 개시는 또한, 제1 CH3 도메인 및 제2 Ig CH3 도메인을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자를 포함하며, 제1 및 제2 Ig CH3 도메인은 적어도 하나의 아미노산만큼 서로 상이하고, 적어도 하나의 아미노산 차이는, 아미노산 차이가 없는 이중특이적 항체와 비교해 단백질 A에 대한 이중특이적 항체의 결합을 감소시킨다. 일 구현예에서, 제1 Ig CH3 도메인은 단백질 A에 결합하고, 제2 Ig CH3 도메인은 H95R 변형(IMGT 엑손 넘버링에 의함; EU 넘버링에 의하면 H435R임)과 같이 단백질 A 결합을 감소시키거나 제거하는 돌연변이를 함유한다. 제2 CH3은 Y96F 변형(IMGT 넘버링에 의함; EU 넘버링은 Y436F)을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제8,586,713호를 참조한다. 제2 CH3에서 발견할 수 있는 추가의 변형은 다음을 포함한다: IgG1 항체의 경우 D16E, L18M, N44S, K52N, V57M 및 V82I(IMGT에 의함; EU에 의하면 D356E, L358M, N384S, K392N, V397M 및 V422I); IgG2 항체의 경우 N44S, K52N 및 V82I(IMGT에 의함; EU에 의하면 N384S, K392N 및 V422I); 및 IgG4 항체의 경우 Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q 및 V82I(IMGT에 의함; EU에 의하면 Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q 및 V422I).
특정 구현예에서, Fc 도메인은 둘 이상의 면역글로불린 이소형으로부터 유래된 Fc 서열을 조합하는 키메라일 수 있다. 예를 들어, 키메라 Fc 도메인은 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 CH2 영역 유래의 CH2 서열의 일부 또는 전부를 포함할 수 있고, 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 유래의 CH3 도메인의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다. 키메라 Fc 도메인은 또한 키메라 힌지 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 키메라 힌지는 인간 IgG1, 인간 IgG2, 또는 인간 IgG4 힌지 영역 유래의 "하부 힌지" 서열과 조합된, 인간 IgG1, 인간 IgG2, 또는 인간 IgG4 힌지 영역 유래의 "상부 힌지" 서열을 포함할 수 있다. 본원에 제시된 항원 결합 분자 중 어느 하나에 포함될 수 있는 키메라 Fc 도메인의 특정 실시예는 N-말단에서 C-말단 방향으로 다음을 포함한다: [IgG4 CH1] - [IgG4 상부 힌지] - [IgG2 하부 힌지] - [IgG4 CH2] - [IgG4 CH3]. 본원에 제시된 항원 결합 분자 중 어느 하나에 포함될 수 있는 키메라 Fc 도메인의 또 다른 실시예는 N-말단에서 C-말단 방향으로 다음을 포함한다: [IgG1 CH1] - [IgG1 상부 힌지] - [IgG2 하부 힌지] - [IgG4 CH2] - [IgG1 CH3]. 본 발명의 항원 결합 분자 중 어느 하나에 포함될 수 있는 키메라 Fc 도메인의 이런 저런 예시는 2014년 8월 28일에 공개된 미국 특허 공개 2014/0243504에 기술되어 있으며, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 이들 일반적인 구조적 배열을 갖는 키메라 Fc 도메인 및 이의 변이체는 변경된 Fc 수용체 결합을 가질 수 있고, 이는 결국 Fc 작동자 기능에 영향을 미친다.
서열 변이체
본 발명의 항체 및 이중특이적 항원 결합 분자는 개별 항원 결합 도메인이 유래된 상응하는 생식선 서열과 비교했을 때 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 프레임워크 및/또는 CDR 영역에서 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함할 수 있다. 이러한 돌연변이는 본원에 개시된 아미노산 서열을, 예를 들어, 공개된 항체 서열 데이터베이스로부터 이용할 수 있는 생식선 서열과 비교함으로써 쉽게 확인할 수 있다. 본 발명의 항원 결합 분자는 본원에 개시된 예시적인 아미노산 서열 중 어느 하나로부터 유래된 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 하나 이상의 프레임워크 영역 및/또는 CDR 영역 내의 하나 이상의 아미노산은 항체가 유래된 생식선 서열의 상응하는 잔기(들)로 돌연변이 되거나, 또 다른 인간 생식선 서열의 상응하는 잔기(들)로 돌연변이 되거나, 상응하는 생식선 잔기(들)의 보존적 아미노산 치환으로 돌연변이 될 수 있다(이러한 서열 변화는 본원에서 "생식선 돌연변이"로서 통칭한다). 당업자는, 본원에 개시된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열에서 출발하여, 하나 이상의 개별 생식선 돌연변이 또는 이들의 조합을 포함하는 다수의 항체 및 항원 결합 단편을 쉽게 생산할 수 있다. 특정 구현예에서, V H 및/또는 V L 도메인 내의 프레임워크 및/또는 CDR 잔기의 전부는, 항원 결합 도메인이 유래된 원래의 생식선 서열에서 발견되는 잔기로 다시 돌연변이된다. 다른 구현예에서, 특정한 잔기만이, 예를 들어, FR1의 처음 8개의 아미노산 또는 FR4의 마지막 8개의 아미노산 내에서 발견되는 돌연변이된 잔기, 또는 CDR1, CDR2 또는 CDR3에서 발견되는 돌연변이된 잔기만이 원래의 생식선 서열로 다시 돌연변이된다. 다른 구현예에서, 프레임워크 및/또는 CDR 잔기(들) 중 하나 이상은 상이한 생식선 서열(즉, 항원 결합 도메인이 유래된 원래의 생식선 서열과 상이한 생식선 서열)의 상응하는 잔기(들)로 돌연변이된다.
또한, 항원 결합 도메인은 프레임워크 및/또는 CDR 영역 내의 2개 이상의 생식선 돌연변이의 임의의 조합을 함유할 수 있는데, 예를 들어, 특정 개별 잔기는 특정 생식선 서열의 상응하는 잔기로 돌연변이 되는 반면, 원래의 생식선 서열과 상이한 특정한 다른 잔기는 유지되거나, 상이한 생식선 서열의 상응하는 잔기로 돌연변이 된다. 일단 획득되면, 하나 이상의 생식선 돌연변이를 포함하는 항원 결합 단편은, 개선된 결합 특이성, 증가된 결합 친화도, 개선되거나 강화된 길항성 또는 작용성 생물학적 특성(경우에 따라), 감소된 면역원성 등과 같은 하나 이상의 원하는 특성에 대해 쉽게 시험될 수 있다. 이러한 일반적인 방식으로 획득된 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자는 본 발명에 포함된다.
pH 의존적 결합
본 발명은 pH 의존적 결합 특성을 갖는 항-CD38 항체 및 항-CD28 항체, 및 항-CD38/항-CD28 이중특이적 항원 결합 분자를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 항-CD38 항체는 중성 pH에 비해 산성 pH에서 CD38에 대한 결합 감소를 나타낼 수 있다. 대안적으로는, 본 발명의 항-CD38 항체는 중성 pH에 비해 산성 pH에서 CD38에 대한 강화된 결합을 나타낼 수 있다. "산성 pH"란 표현은 약 6.2 미만, 예를 들어, 약 6.0, 5.95, 5.9, 5.85, 5.8, 5.75, 5.7, 5.65, 5.6, 5.55, 5.5, 5.45, 5.4, 5.35, 5.3, 5.25, 5.2, 5.15, 5.1, 5.05, 5.0, 또는 그 이하의 pH 값을 포함한다. 본 설명에서 사용된 표현 "중성 pH"는 약 7.0 내지 약 7.4의 pH를 의미한다. 표현 "중성 pH"는 약 7.0, 7.05, 7.1, 7.15, 7.2, 7.25, 7.3, 7.35 및 7.4의 pH 값을 포함한다.
특정 경우에, "중성 pH와 비교해 산성 pH에서??에 대한 결합 감소"는, 산성 pH에서 이의 항원에 결합하는 항체의 KD 값 대 중성 pH에서 이의 항원에 결합하는 항체의 KD 값의 비(또는 그 반대의 비)로서 표현된다. 예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 약 3.0 이상의 산성 KD/중성 KD 비를 나타내는 경우, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 본 발명의 목적을 위해, "중성 pH에 비해 산성 pH에서 CD38에 대한 결합 감소"를 나타내는 것으로서 간주될 수 있다. 특정 예시적인 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편에 대한 산성 KD/중성 KD 비는 약 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 10.5, 11.0, 11.5, 12.0, 12.5, 13.0, 13.5, 14.0, 14.5, 15.0, 20.0, 25.0, 30.0, 40.0, 50.0, 60.0, 70.0, 100.0, 또는 그 이상일 수 있다.
pH-의존적 결합 특징을 나타내는 항체는, 예를 들면 중성 pH에 비해 산성 pH에서 특정 항원에 대한 결합이 감소된(또는 강화된) 항체 집단을 스크리닝함으로써 수득할 수 있다. 추가적으로, 아미노산 수준에서 항원 결합 도메인을 변형시켜 pH 의존적 특징을 갖는 항체를 수득할 수 있다. 예를 들어, (예를 들어, CDR 내의) 항원 결합 도메인의 하나 이상의 아미노산을 히스티딘 잔기로 치환함으로써, 중성 pH에 비해 산성 pH에서 항원 결합이 감소된 항체를 수득할 수 있다.
Fc 변이체를 포함하는 항체
본 발명의 특정 구현예에 따르면, 예를 들어 중성 pH에 비해 산성 pH에서 FcRn 수용체에 대한 항체 결합을 강화시키거나 감쇠시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인을 포함하는 항-CD38 항체, 항-CD28 항체, 및 항-CD38 x 항-CD28 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다. 예를 들어, 본 발명은 Fc 도메인의 CH2 또는 CH3 영역에서 돌연변이를 포함하는 항체를 포함하며, 여기서 돌연변이(들)는 산성 환경에서(예를 들어, pH가 약 5.5 내지 6.0 범위인 엔도솜에서) FcRn에 대한 Fc 도메인의 친화도를 증가시킨다. 이러한 돌연변이는, 동물에게 투여되는 경우 항체의 혈청 반감기를 증가시킬 수 있다. 이러한 Fc 변형의 비제한적인 예는, 예를 들어, 위치 250(예: E 또는 Q)에서의 변형; 250 및 428(예: L 또는 F)에서의 변형; 252(예: L/Y/F/W 또는 T), 254(예: S 또는 T), 및 256(예: S/R/Q/E/D 또는 T)에서의 변형; 또는 위치 428 및/또는 433(예: H/L/R/S/P/Q 또는 K) 및/또는 434(예: H/F 또는 Y)에서의 변형; 또는 위치 250 및/또는 428에서의 변형; 또는 위치 307 또는 308(예: 308F, V308F) 및 434에서의 변형을 포함한다. 일 구현예에서, 변형은 428L(예컨대, M428L) 및 434S(예컨대, N434S) 변형; 428L, 259I(예컨대, V259I), 및 308F(예컨대, V308F) 변형; 433K(예컨대, H433K) 및 434(예컨대, 434Y) 변형; 252, 254, 및 256(예컨대, 252Y, 254T, 및 256E) 변형; 250Q 및 428L 변형(예컨대, T250Q 및 M428L); 및 307 및/또는 308 변형(예컨대, 308F 또는 308P)을 포함한다.
예를 들어, 본 개시는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 돌연변이의 하나 이상의 쌍 또는 군을 포함하는 Fc 도메인을 포함하는 항-CD38 항체, 항-CD28 항체체, 및 항-CD38 x 항-CD28 이중특이적 항원 결합 분자를 포함한다: 250Q 및 248L(예: T250Q 및 M248L); 252Y, 254T 및 256E(예: M252Y, S254T 및 T256E); 428L 및 434S(예: M428L 및 N434S); 및 433K 및 434F(예: H433K 및 N434F). 전술한 Fc 도메인 돌연변이 및 본원에 개시된 항체 가변 도메인 내의 다른 돌연변이의 모든 가능한 조합은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 고려된다.
항체 및 이중특이적 항원 결합 분자의 생물학적 특성
본 발명은 높은 친화도로(예를 들어 나노몰 또는 준나노몰의 KD 값으로) 인간 CD38 및/또는 CD28에 결합하는 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
특정 구현예에 따르면, 본 발명은, 예를 들어 본원의 실시예 5에서 정의된 것과 같은 검정 포맷을 사용해 표면 플라스몬 공명에 의해 측정했을 때 (예를 들어 25℃에서) 약 10 nM 미만의 KD로 인간 CD38에 결합하는 항체, 항체의 항원 결합 단편, 및 이중특이적 항체을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은, 예를 들어 본원의 실시예 5에서 정의된 것과 같은 검정 포맷 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용해 표면 플라스몬 공명에 의해 측정했을 때, 약 20 nM 미만, 약 10 nM 미만, 약 8 nM 미만, 약 7 nM 미만, 약 6 nM 미만, 약 5 nM 미만, 약 4 nM 미만, 약 3 nM 미만, 약 2 nM 미만, 약 1 nM 미만, 약 800 pM 미만, 약 700 pM 미만, 약 500 pM 미만, 약 400 pM 미만, 약 300 pM 미만, 약 200 pM 미만, 약 100 pM 미만, 약 50 pM 미만, 또는 약 25 pM 미만의 KD로 CD38에 결합한다.
특정 구현예에 따르면, 본 발명은, 예를 들어 본원의 실시예 5에서 정의된 것과 같은 검정 포맷을 사용해 표면 플라스몬 공명에 의해 측정했을 때 (예를 들어 25℃에서) 약 26 nM 미만의 KD로 인간 CD28에 결합하는 항체, 항체의 항원 결합 단편, 및 이중특이적 항체을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은, 예를 들어 본원의 실시예 5에서 정의된 것과 같은 검정 포맷 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용해 표면 플라스몬 공명에 의해 측정했을 때, 약 20 nM 미만, 약 10 nM 미만, 약 8 nM 미만, 약 7 nM 미만, 약 6 nM 미만, 약 5 nM 미만, 약 4 nM 미만, 약 3 nM 미만, 약 2 nM 미만, 약 1 nM 미만, 약 800 pM 미만, 약 700 pM 미만, 약 500 pM 미만, 약 400 pM 미만, 약 300 pM 미만, 약 200 pM 미만, 약 100 pM 미만, 약 50 pM 미만, 또는 약 25 pM 미만의 KD로 CD28에 결합한다. 본 개시는 또한, 본원의 실시예 5에서 정의된 것과 같은 검정 포맷 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용해 25℃에서 표면 플라스몬 공명에 의해 측정했을 때, 약 8분 초과 또는 약 15분 초과의 해리 반감기(t½)로 CD38에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은, 예를 들어 본원의 실시예 5에서 정의된 것과 같은 검정 포맷 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용해 25℃에서 표면 플라스몬 공명에 의해 측정했을 때 약 3분 초과, 약 4분 초과, 약 10분 초과, 약 20분 초과, 약 30분 초과, 약 40분 초과, 약 50분 초과, 약 60분 초과, 약 70분 초과, 약 80분 초과, 약 90분 초과, 약 100분 초과, 약 110분 초과, 또는 약 120분 초과의 t½로 CD38에 결합한다. 본 발명은, 예를 들어 본원의 실시예 5에 정의된 것과 같은 검정 포맷 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용해 25℃에서 표면 플라스몬 공명에 의해 측정했을 때, 약 10분 초과로 CD38에 결합하는 이중특이적 항원 결합 분자(예: 이중특이적 항체)를 포함한다.
본 개시는 또한, 본원의 실시예 5에서 정의된 것과 같은 검정 포맷 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용해 25℃에서 표면 플라스몬 공명에 의해 측정했을 때, 약 5분 초과 또는 약 18분 초과의 해리 반감기(t½)로 CD28에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은, 예를 들어 본원의 실시예 5에서 정의된 것과 같은 검정 포맷 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용해 25℃에서 표면 플라스몬 공명에 의해 측정했을 때 약 3분 초과, 약 4분 초과, 약 10분 초과, 약 20분 초과, 약 30분 초과, 약 40분 초과, 약 50분 초과, 약 60분 초과, 약 70분 초과, 약 80분 초과, 약 90분 초과, 약 100분 초과, 약 110분 초과, 또는 약 120분 초과의 t½로 CD28에 결합한다. 본 발명은, 예를 들어 본원의 실시예 5에 정의된 것과 같은 검정 포맷 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용해 25℃에서 표면 플라스몬 공명에 의해 측정했을 때, 약 10분 초과로 CD38에 결합하는 이중특이적 항원 결합 분자(예: 이중특이적 항체)를 포함한다.
본 개시는 또한, 실시예 9 내지 14에 제시된 바와 같은 생체 내 이종 종양 연구 또는 실질적으로 유사한 검정에 의해 결정했을 때, 내인성 CD38을 발현하는 인간 세포주(예: NCI-H929, MOLP-8, 또는 WSU-DLCL2 종양 세포)에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
본 개시는 또한 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 특성을 나타내는 항-CD38 x 항-CD28 이중특이적 항원 결합 분자를 포함한다: (a) 인간 다발성 골수종 이종이식편을 보유한 면역손상 마우스에서 종양 성장을 억제함; (b) 인간 다발성 골수종 이종이식편을 보유한 면역손상 마우스에서 확립된 종양의 종양 성장을 억제함(예: 실시예 9 내지 14 참조), 및 (c) 면역적격 마우스에서 인간 CD38을 발현하도록 조작된 동계 흑색종 세포의 종양 성장을 억제함.
본 개시는 인간 CD38 및 인간 CD28에 동시에 결합할 수 있는 이중특이적 항원 결합 분자(예: 이중특이적 항체)를 포함한다. CD38 및/또는 CD28을 발현하는 세포에 이중특이적 항원 결합 분자가 결합하는 정도는 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 의해 평가될 수 있다.
예를 들어, 본 발명은 CD38을 발현하지만 CD28은 발현하지 않는 인간 T 세포주 및/또는 BCMA-발현 세포에 특이적으로 결합하는 항체, 이의 항원 결합 단편, 및 이중특이적 항체를 포함한다.
본 개시는 인간 CD38 및/또는 CD28에 결합하여 T 세포 활성화를 유도하는 항체, 이의 항원 결합 단편, 및 이중특이적 항체를 포함한다.
본 발명은 대상체에서 종양 항원-발현 세포를 고갈시키거나 감소시킬 수 있는 항-CD38 x 항-CD28 이중특이적 항원 결합 분자를 포함한다(예를 들어 실시예 9 내지 12, 또는 실질적으로 유사한 검정참조). 예를 들어, 특정 구현예에 따르면, 항-CD38 x 항-CD28 이중특이적 항원 결합 분자가 제공되며, 여기서 0.04 mg/kg, 0.4 mg/kg, 또는 4 mg/kg의 이중특이적 항원 결합 분자를 대상체에게 1회 투여하거나 다회 투여하면 대상체에서 CD38-발현 세포의 수가 감소한다(예를 들어 대상체에서 종양 성장이 저해되거나 억제됨).
에피토프 맵핑 및 관련 기술
본 발명의 항원 결합 분자가 결합하는 CD38 및/또는 CD28 상의 에피토프는 CD38 또는 CD28 단백질의 3개 이상의 (예를 들어 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상의) 아미노산으로 이루어진 단일 연속 서열로 이루어질 수 있다. 대안적으로, 에피토프는 CD38 또는 CD28의 복수의 비연속 아미노산(또는 아미노산 서열)으로 이루어질 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "에피토프"는 파라토프로 알려진 항체 분자의 가변 영역에서 특이적 항원 결합 부위와 상호 작용하는 항원 결정자를 지칭한다. 단일 항원은 하나 이상의 에피토프를 가질 수 있다. 따라서, 상이한 항체는 항원 상의 상이한 영역에 결합할 수 있고 상이한 생물학적 효능을 가질 수 있다. 에피토프는 입체적이거나 선형일 수 있다. 입체적 에피토프는 선형 폴리펩티드 사슬의 상이한 분절에서 유래된 공간적으로 병치된 아미노산에 의해 생산된다. 선형 에피토프는 폴리펩티드 사슬 내 인접한 아미노산 잔기에 의해 생성된 것이다. 특정 상황에서, 에피토프는 항원 상에 당류, 포스포릴기, 또는 술포닐기의 모이어티를 포함할 수 있다.
당업자에게 공지된 다양한 기술을 사용해 항체의 항원 결합 도메인이 폴리펩티드 또는 단백질 내의 "하나 이상의 아미노산과 상호작용하는지" 여부를 결정할 수 있다. 예시적인 기술은, 예를 들어, Harlow와 Lane의 문헌[Antibodies, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY]에 기술된 것과 같은 일상적인 교차 차단 검정(cross-blocking assay), 알라닌 스캐닝 돌연변이 분석, 펩티드 블롯 분석(Reineke의 문헌[2004, GITRhods Mol Biol 248:443-463]), 및 펩티드 절단 분석을 포함한다. 또한, 에피토프 절제, 에피토프 추출 및 항원의 화학적 변형과 같은 방법이 사용될 수 있다(Tomer의 문헌[2000, Protein Science 9:487-496] 참조). 항체의 항원 결합 도메인과 상호 작용하는 폴리펩티드 내의 아미노산을 식별하는데 사용될 수 있는 또 다른 방법은 질량 분석법에 의해 검출되는 수소/중수소 교환이다. 일반적으로 말하자면, 수소/중수소 교환 방법은 관심 단백질을 중수소-표지하는 단계, 이어서 항체를 중수소-표지된 단백질에 결합시키는 단계를 포함한다. 다음으로, 단백질/항체 복합체가 물로 옮겨져 (중수소 표지된 상태의) 항체에 의해 보호되는 잔기를 제외한 모든 잔기에서 수소-중수소 교환을 일어나게 한다. 항체 해리 후, 표적 단백질을 대상으로 프로테아제 절단 및 질량 분광 분석을 수행하여, 항체가 상호 작용하는 특정 아미노산에 상응하는 중수소-표지된 잔기를 밝혀낸다. 예를 들어 Ehring의 문헌[1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259]; Engen 및 Smith의 문헌[(2001) Anal. Chem. 73:256A-265A]을 참조한다. 항원/항체 복합체의 X-선 결정학이 에피토프 맵핑 목적으로 사용될 수도 있다.
본원에 기술된 특정 예시적인 항체 중 어느 하나(예를 들어 본원의 표 1에 제시된 것과 같은 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 항체)와 동일한 에피토프에 결합하는 항-CD38 항체가 본원에 제공된다. 마찬가지로, 본 발명은 또한, CD38에 결합하기 위해 본원에 기술된 특정 예시적인 항체 중 어느 하나(예를 들어 본원의 표 1에 제시된 것과 같은 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 항체)와 경쟁하는 항-CD38 항체를 포함한다.
본원에 기술된 특정 예시적인 항체 중 어느 하나(예를 들어 본원의 표 4에 제시된 것과 같은 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 항체)와 동일한 에피토프에 결합하는 항-CD28 항체가 본원에 제공된다. 마찬가지로, 본 발명은 또한, CD28에 결합하기 위해 본원에 기술된 특정 예시적인 항체 중 어느 하나(예를 들어 본원의 표 4에 제시된 것과 같은 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 항체)와 경쟁하는 항-CD28 항체를 포함한다.
마찬가지로, 인간 CD38에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 도메인 및 인간 CD28에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자가 본원에 제공되며, 여기서 제1 항원 결합 도메인은 CD38에 결합하기 위해 본원에 기술된 특정 예시적인 CD38-특이적 항원 결합 도메인 중 어느 하나와 경쟁하고/하거나, 제2 항원 결합 도메인은 CD28에 결합하기 위해 본원에 기술된 특정 예시적인 CD28-특이적 항원 결합 도메인 중 어느 하나와 경쟁한다.
특정 항원 결합 분자(예: 항체) 또는 이의 항원 결합 도메인이 본 발명의 기준 항원 결합 분자와 동일한 에피토프에 결합하는지, 또는 결합을 위해 본 개시의 기준 항원 결합 분자와 경쟁하는지 여부는 당업계에 공지된 일상적인 방법을 사용해 쉽게 결정할 수 있다. 예를 들어, 시험 항체가 CD38(또느 CD28) 상에서 본 개시의 기준 이중특이적 항원 결합 분자와 동일한 에피토프에 결합하는지 여부를 결정하기 위해, 기준 이중특이적 분자를 CD38 단백질(또는 CD28 단백질)에 먼저 결합시킨다. 그 다음으로, 시험 항체가 CD38(또는 CD28) 분자에 결합하는 능력을 평가한다. 기준 이중특이적 항원 결합 분자와의 포화 결합 후에 시험 항체가 CD38(또는 CD28)에 결합할 수 있다면, 시험 항체는 기준 이중특이적 항원 결합 분자와는 상이한 CD38(또는 CD28)의 에피토프에 결합하는 것으로 결론을 내릴 수 있다. 한편, 기준 이중특이적 항원 결합 분자와의 포화 결합 후에 시험 항체가 CD38(또는 CD28) 분자에 결합할 수 없다면, 시험 항체는 본 발명의 기준 이중특이적 항원 결합 분자가 결합한 에피토프와 동일한 CD38(또는 CD28)의 에피토프에 결합할 수 있다. 그런 다음, 추가의 일상적인 실험(예: 펩티드 돌연변이 및 결합 분석)을 수행하여, 시험 항체의 관찰된 결합 결여가 실제로 기준 이중특이적 항원 결합 분자와 동일한 에피토프에 대한 결합으로 인한 것인지, 또는 입체적 차단(또는 다른 현상)이 관찰된 결합 결여의 원인인지 여부를 확인할 수 있다. 이러한 정렬 실험은 ELISA, RIA, Biacore, 유세포 계측법 또는 당업계에서 이용할 수 있는 임의의 다른 정량적 또는 정성적 항체 결합 분석법을 사용하여 수행될 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 경쟁적 결합 분석에서 측정했을 때, 예를 들어 1배, 5배, 10배, 20배, 또는 100배 과량인 하나의 항원 결합 단백질이 다른 하나의 결합을 적어도 50%, 바람직하게는 75%, 90% 또는 심지어 99%만큼 억제하는 경우, 2개의 항원 결합 단백질은 동일한 (또는 중첩하는) 에피토프에 결합한다(예를 들어, Junghans 등의 문헌[Cancer Res. 1990:50:1495-1502] 참조). 대안적으로, 하나의 항원 결합 단백질의 결합을 감소시키거나 제거하는 항원 내 본질적으로 모든 아미노산 돌연변이가 다른 하나의 결합을 감소시키거나 제거하는 경우, 2개의 항원 결합 단백질은 동일한 에피토프에 결합하는 것으로 간주된다. 하나의 항원 결합 단백질의 결합을 감소시키거나 제거하는 아미노산 돌연변이의 하위집합만이 다른 하나의 결합을 감소시키거나 제거하는 경우, 2개의 항원 결합 단백질은 "중첩하는 에피토프"를 갖는 것으로 간주된다.
항체 또는 항원 결합 도메인이 결합을 위해 기준 항원 결합 분자와 경쟁하는지 여부를 결정하기 위해, 전술한 결합 방법론은 다음의 2개의 방향으로 수행된다: 제1 방향으로는, 포화 조건 하에 기준 항원 결합 분자를 CD38 단백질(또는 CD28 단백질)에 결합시키고, 이어서 CD38(또는 CD28) 분자에 대한 시험 항체의 결합을 평가한다. 제2 방향으로는, 포화 조건 하에 시험 항체를 CD38(또는 CD28) 분자에 결합시키고, 이어서 CD38(또는 CD28) 분자에 대한 기준 항원 결합 분자의 결합을 평가한다. 만약, 2가지 방향 모두에서, 제1 (포화) 항원 결합 분자만이 CD38(또는 CD28) 분자에 결합할 수 있다면, 시험 항체 및 기준 항원 결합 분자는 CD38(또는 CD28)에 결합하기 위해 경쟁하는 것으로 결론을 내린다. 당업자가 이해할 수 있듯이, 결합을 위해 기준 항원 결합 분자와 경쟁하는 항체는 기준 항체와 동일한 에피토프에 결합할 필요는 없지만, 중첩하거나 또는 인접한 에피토프에 결합함으로써 기준 항체의 결합을 입체적으로 차단할 수 있다.
항원 결합 도메인의 제조 및 이중특이적 분자의 작제
특정 항원에 특이적인 항원 결합 도메인은 당업계에 공지된 임의의 항체 생성 기술에 의해 제조할 수 있다. 일단 수득되면, 2개의 상이한 항원(예를 들어, CD38 및 CD28)에 특이적인 2개의 상이한 항원 결합 도메인을 일상적인 방법을 사용하여 서로에 대해 적절히 배열하여 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자를 생성할 수 있다. (본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자를 작제하는 데 사용될 수 있는 예시적인 이중특이적 항체 포맷에 대한 논의는 본원의 다른 곳에서 제공된다). 특정 구현예에서, 본 발명의 다중특이적 항원 결합 분자의 개별 성분(예: 중쇄 및 경쇄) 중 하나 이상은 키메라 인간화 항체 또는 완전한 인간 항체로부터 유래된다. 이러한 항체를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자의 중쇄 및/또는 경쇄 중 하나 이상은 VELOCIMMUNE?? 기술을 사용해 제조할 수 있다. VELOCIMMUNE?? 기술(또는 임의의 다른 인간 항체 생성 기술)을 사용해, 인간 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 갖고 특정 항원(예: CD38 또는 CD28)에 대한 고 친화도 키메라 항체를 먼저 단리한다. 항체의 특성을 분석하여 친화도, 선택도, 에피토프 등을 포함하는 바람직한 특성에 맞게 선택한다. 마우스 불변 영역을 원하는 인간 불변 영역으로 치환하여 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자에 혼입될 수 있는 완전한 인간 중쇄 및/또는 경쇄를 생성한다.
유전자 조작된 동물을 사용해 인간 이중특이적 항원 결합 분자를 만들 수도 있다. 예를 들어, 내인성 마우스 면역글로불린 경쇄 가변 서열을 재배열할 수 없고 발현할 수 없는 유전적으로 변형된 마우스를 사용될 수 있으며, 여기서 마우스는 내인성 마우스 카파 유전자좌에서 마우스 카파 불변 유전자에 작동 가능하게 연결된 인간 면역글로불린 서열에 의해 암호화된 1개 또는 2개의 인간 경쇄 가변 도메인만을 발현한다. 이러한 유전적으로 변형된 마우스를 사용해, 1개 또는 2개의 상이한 인간 경쇄 가변 영역 유전자 분절로부터 유래된 가변 도메인을 포함하는 동일한 경쇄와 결합되는 2개의 상이한 중쇄를 포함하는 완전한 인간 이중특이적 항원 결합 분자를 생성할 수 있다. (예를 들어 US 2011/0195454 참조). 완전한 인간은 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 면역글로불린 도메인의 각 폴리펩티드의 전장에 걸쳐 인간 서열로부터 유래된 DNA에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 항체, 또는 이의 항원 결합 단편 또는 면역글로불린 도메인을 지칭한다. 일부 경우에, 완전한 인간 서열은 인간에 대한 내인성 단백질로부터 유래된다. 다른 경우에, 완전한 인간 단백질 또는 단백질 서열은 각각의 성분 서열이 인간 서열로부터 유래된 키메라 서열을 포함한다. 임의의 하나의 이론에 구속되는 것은 아니지만, 키메라 단백질 또는 키메라 서열은 일반적으로, 예를 들어 임의의 야생형 인간 면역글로불린 영역 또는 도메인과 비교하여, 성분 서열의 접합부에서 면역원성 에피토프의 생성을 최소화하도록 설계된다.
생물학적 동등물
본 발명은, 본원에 개시된 예시적인 분자의 아미노산 서열과는 다르지만 CD38 및/또는 CD28에 결합하는 능력을 보유한 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 분자를 포함한다. 이러한 변이체 분자는 부모 서열과 비교했을 때 아미노산의 하나 이상의 추가, 결실 또는 치환을 포함하지만, 기술된 이중특이적 항원 결합 분자와 본질적으로 동등한 생물학적 활성을 나타낸다.
본 발명은 본원에 제시된 예시적인 항원 결합 분자 중 어느 하나와 생물학적으로 동등한 항원 결합 분자를 포함한다. 2개의 항원 결합 단백질 또는 항체가, 예를 들어, 유사한 실험 조건 하에 동일한 몰 투여량(1회 투여량 또는 다회 투여량)으로 투여되었을 때, 흡수 속도 및 정도에 있어서 유의한 차이를 보이지 않는 약학적 등가물 또는 약학적 대안인 경우, 이들은 생물학적으로 동등한 것으로 간주된다. 일부 항원 결합 단백질이 흡수 정도에 있어서는 동등하지만 흡수 속도가 다른 경우, 이들은 등가물 또는 약학적 대안으로서 간주될 것이고, 여전히 생물학적으로 동등한 것으로 간주될 수 있는데, 그 이유는, 흡수 속도에 있어서의 이러한 차이는 의도적이고 표지에 반영되어 있으며, 예를 들어, 만성적으로 사용될 때 효과적인 신체 약물 농도를 달성하는 데 반드시 필요하지 않으며, 특정한 연구 의약품에 대해 의학적으로 유의하지 않은 것으로 간주되기 때문이다.
일 구현예에서, 2개의 항원 결합 단백질이 안전성, 순도 및 효능에 있어서 임상적으로 의미 있는 차이가 없는 경우, 이들은 생물학적으로 동등하다.
일 구현예에서, 환자가 기준 생성물을 사용하는 치료와 생물학적 생성물을 사용하는 치료 사이에서 1회 이상 전환할 수 있고, 이러한 전환이 없는 연속 요법과 비교했을 때 면역원성에 있어서의 임상적으로 유의한 변화를 포함하여 예상되는 이상 반응의 위험 증가 또는 효과의 감소가 없는 경우, 2개의 항원 결합 단백질은 생물학적으로 동등하다.
일 구현예에서, 2개의 항원 결합 단백질 둘 모두가 사용 조건(들)에 대한 공통의 메커니즘 또는 공통의 작용 메커니즘(들)에 의해 이러한 메커니즘이 알려진 정도까지 작용하는 경우, 이들은 생물학적으로 동등하다.
생물학적 동등성은 생체 내 방법 및 시험관 내 방법에 의해 입증될 수 있다. 생물학적 동등성 측정에는, 예를 들어: (a) 항체의 농도 또는 이의 대사가 혈액, 혈장, 혈청, 또는 기타 생물학적 유체에서 시간의 함수로서 측정되는, 인간 또는 다른 포유동물의 생체 내 시험; (b) 인간의 생체 내 생체이용율 데이터와 연관되었거나 이를 합리적으로 예측할 수 있게 하는 시험관 내 시험; (c) 항체(또는 이의 표적)의 적절한 급성 약리학적 효과가 시간의 함수로서 측정되는, 인간 또는 다른 포유동물의 생체 내 시험; 및 (d) 항원 결합 단백질의 안전성, 효능, 또는 생체이용률이나 생물학적 동등성을 확립하는 잘 조절된 임상 시험이 있다.
본원에서 제시된 예시적인 이중특이적 항원 결합 분자의 생물학적으로 동등한 변이체는, 예를 들어, 잔기 또는 서열의 다양한 치환을 만들거나 생물학적 활성에 필요하지 않은 말단 또는 내부 잔기 또는 서열을 결실함으로써 작제할 수 있다. 예를 들어, 생물학적 활성에 필수적인 시스테인 잔기를 결실시키거나 다른 아미노산과 치환하여, 변성 시에 불필요하거나 부정확한 분자내 이황화 브리지가 형성되는 것을 방지할 수 있다. 다른 맥락에서, 생물학적으로 동등한 항원 결합 단백질은 분자의 글리코실화 특징을 변형시키는, 예를 들어, 글리코실화를 제거하거나 없애는 돌연변이를 일으키는 아미노산 변화를 포함하는, 본원에서 제시된 예시적인 이중특이적 항원 결합 분자의 변이체를 포함할 수 있다.
종 선택도 및 종 교차 반응성
본 발명의 특정 구현예에 따르면, 인간 CD28에 결합하지만 다른 종의 CD28에는 결합하지 않는 항원 결합 분자가 제공된다. 또한, 인간 38에 결합하지만 다른 종의 CD38에는 결합하지 않는 항원 결합 분자가 제공된다. 본 발명은 또한, 인간 CD28 및 하나 이상의 비인간 종 유래의 CD38에 결합하는 이중특이적 항원 결합 분자; 및/또는 인간 CD28 및 하나 이상의 비인간 종 유래의 CD28에 결합하는 이중특이적 항원 결합 분자를 포함한다.
본 발명의 특정 예시적인 구현예에 따르면, 인간 CD38 및/또는 인간 CD28에 결합하고, 경우에 따라, 마우스, 랫트, 기니피그, 햄스터, 저빌 쥐, 돼지, 고양이, 개, 토끼, 염소, 양, 소, 말, 낙타, 시노몰구스, 마모셋, 붉은털 원숭이, 또는 침팬지 CD38 및/또는 CD28 중 하나 이상에는 결합하거나 결합하지 않을 수 있는 항원 결합 분자가 제공된다. 예를 들어, 본원에 개시된 특정 예시적인 구현예에서, 인간 CD38 및 시노몰구스 CD38에 결합하는 제1 항원 결합 도메인, 및 인간 CD28에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자; 또는 인간 CD38 및 시노몰구스 CD38에 결합하는 제1 항원 결합 도메인, 및 인간 CD28에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다.
치료 제형 및 투여
본 발명은 본 발명의 항원 결합 분자를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 약학적 조성물은 적절한 담체, 부형제 및 수송, 전달, 내성 등을 개선하는 기타 제제와 함께 제형화된다. 다수의 적절한 제형은 모든 약사들에게 이전에 공지된 다음의 문헌에서 확인할 수 있다: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. 이러한 제형은, 예를 들어, 분말, 고약, 연고, 젤리, 왁스, 오일, 지질, 지질(양이온성 또는 음이온성) 함유 소포체(예를 들어, LIPOFECTIN??, Life Technologies, Carlsbad, CA), DNA 접합체, 무수 흡수 연고제, 수중유 및 유중수 유화제, 카보왁스 유화제(다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜), 반고형성 겔, 및 카보왁스를 함유하는 반고형성 혼합물을 포함한다. Powell 외, "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311 참조.
환자에게 투여되는 항원 결합 분자의 투여량은 환자의 연령 및 크기, 표적 질환, 병태, 투여 경로 등에 따라 달라질 수 있다. 바람직한 투여량은 일반적으로 체중 또는 신체 표면적에 따라 계산된다. 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자가 성인 환자에게 치료 목적으로 사용될 경우, 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자를 일반적으로 체중 1 kg당 약 0.01 내지 약 20 mg, 보다 바람직하게는 체중 1 kg당 약 0.02 내지 약 7 mg, 약 0.03 내지 약 5 mg, 또는 약 0.05 내지 약 3 mg의 1회 투여량으로 정맥내 투여하는 것이 유리할 수 있다. 병태의 중증도에 따라, 치료의 빈도와 기간을 조정할 수 있다. 이중특이적 항원 결합 분자를 투여하기 위한 효과적인 투여량과 일정은 경험적으로 결정될 수 있으며; 예를 들어, 환자의 진행 상황에 대한 주기적 평가에 의해 모니터링하고 이에 따라 투여량을 조정할 수 있다. 또한, 투여량의 종간 스케일링은 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 수행될 수 있다(예를 들어, Mordenti 등의 문헌[1991, Pharmaceut. Res. 8:1351] 참조).
다양한 전달 시스템이 공지되어 있고, 본원의 약학적 조성물, 예를 들어, 캡슐화된 리포좀, 극미립자, 마이크로캡슐, 돌연변이체 바이러스를 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체 매개 엔도시토시스를 투여하는 데 사용될 수 있다(예를 들어, Wu 등의 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 참조). 도입 방법은 피내, 근육 내, 복강 내, 정맥 내, 피하, 비강 내, 경막 외 및 구강 경로를 포함하되 이들로 제한되지는 않는다. 조성물은 임의의 편리한 경로에 의해, 예를 들면 주입 또는 볼루스 주사에 의해, 상피 또는 점막피부의 내벽(예를 들어, 구강 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있고, 기타 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신 투여이거나 국소 투여일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 표준 바늘 및 주사기를 사용하여 피하로 또는 정맥 내로 전달될 수 있다. 또한, 피하 전달의 경우, 펜 전달 장치가 본 발명의 약학적 조성물을 전달하는 데 용이하게 적용된다. 이러한 펜 전달 장치는 재사용식이거나 일회용일 수 있다. 재사용식 펜 전달 장치에는 일반적으로 약학적 조성물이 담긴 교체식 카트리지가 사용된다. 일단 카트리지 내의 모든 약학적 조성물이 투여되어 카트리지가 비면, 빈 카트리지를 쉽게 폐기하고 약학적 조성물이 담긴 새로운 카트리지로 교체할 수 있다. 그러면, 펜 전달 장치를 재사용할 수 있다. 일회용 펜 전달 장치에는 교체식 카트리지가 없다. 오히려, 일회용 펜 전달 장치는 약학적 조성물이 장치 내의 저장조에 미리 담긴 상태로 제공된다. 일단 저장조의 약학적 조성물이 비게 되면, 전체 장치가 폐기된다.
다수의 재사용식 펜 전달 장치 및 자가주입 전달 장치가 본 발명의 약학적 조성물을 피하 전달하는 데 적용된다. 예로서 몇 가지만 거명하자면, AUTOPEN??(Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK), DISETRONIC?? 펜(Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Switzerland), HUMALOG MIX 75/25?? 펜, HUMALOG?? 펜, HUMALIN 70/30?? 펜(Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN), NOVOPEN?? I, II 및 III(Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), NOVOPEN JUNIOR??(Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), BD?? 펜(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN??, OPTIPEN PRO??, OPTIPEN STARLET??, 및 OPTICLIK??(sanofi-aventis, Frankfurt, Germany)이 포함되지만, 이들로 한정되지는 않는다. 본 발명의 약학적 조성물을 피하 전달하는 데 적용되는 일회용 펜 전달 장치의 몇 가지만 거명하자면, SOLOSTAR?? 펜(sanofi-aventis), FLEXPEN??(Novo Nordisk), 및 KWIKPEN??(Eli Lilly), SURECLICK?? Autoinjector(Amgen, 캘리포니아주 싸우전 오크스 소재), PENLET??(Haselmeier, Stuttgart, Germany), EPIPEN(Dey, L.P.) 및 HUMIRA?? 펜(Abbott Labs, Abbott Park IL)이 포함되지만, 이들로 한정되지는 않는다.
특정 상황에서는, 약학적 조성물이 방출 조절 시스템으로 전달될 수 있다. 일 구현예에서, 펌프가 사용될 수 있다(Langer의 전술한 문헌; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201(1987) 참조). 또 다른 구현예에서, 중합체 물질이 사용될 수 있다(Langer 및 Wise (eds.)의 문헌[Medical Applications of Controlled Release, 1974, CRC Pres., Boca Raton, Florida] 참조). 또 다른 구현예에서, 방출 조절 시스템은 조성물의 표적에 근접하여 배치될 수 있으며, 따라서 전신 투여량의 단지 일부만을 필요로 한다(예를 들어 Goodson의 전술한 문헌[1984, in Medical Applications of Controlled Release, vol. 2, pp 115-138] 참조). 다른 조절 방출 시스템은 Lange, Science 249:1527-1533(1990)에서 검토된 내용에 논의되어 있다.
주사식 제제는 정맥 내, 피하, 피 내 및 근육 내 주사, 적가 주입 등을 위한 투여량 형태를 포함할 수 있다. 이들 주사식 제제는 공지의 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 주사식 제제는, 예를 들어 주사용으로 종래에 사용되는 멸균 수성 매질 또는 유성 매질에 전술한 항체 또는 이의 염을 용해, 현탁 또는 유화시킴으로써 제조될 수 있다. 주사용 수성 매질로서는, 예를 들어, 생리 식염수, 알코올(예를 들어, 에탄올)과 같은 적절한 가용화제와 조합하여 사용할 수 있고 글루코오스 및 기타 보조제 등을 함유하는 등장성 용액, 다가알코올(예: 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜), 비이온성 계면활성제[예를 들어, 폴리소르베이트 80, HCO-50(수소 첨가 피마자유의 폴리옥시에틸렌 (50 몰) 부가물)] 등이 있다. 유성 매질로서는, 예를 들어, 벤질 벤조에이트, 벤질 알코올 등과 같은 가용화제와 조합하여 사용할 수 있는 참기름, 대두유 등이 사용된다. 따라서, 제조된 주사제는 바람직하게는 적절한 앰플에 채워진다.
유리하게는, 전술한 경구 또는 비경구적으로 사용하기 위한 약학적 조성물은 활성 성분의 투여량에 적절히 맞춰진 단위 투여량의 투약 형태로 제조된다. 이러한 투여량 형태는, 예를 들어, 정제, 알약, 캡슐, 주사제(앰플), 좌제 등을 포함한다. 전술한 항체의 함유량은 일반적으로 단위 투여량의 투여 형태 당 약 5 내지 약 500 mg이고; 특히 주사제 형태로는, 전술한 항체가 약 5 내지 약 100 mg으로 함유되고, 다른 투여 형태에 대해서는 약 10 내지 약 250 mg으로 함유되는 것이 바람직하다.
항원 결합 분자의 치료적 용도
본 발명은, 항-CD38 항체, 항-CD28 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 CD38 및 CD28에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항원 결합 분자를 포함하는 치료 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다. 치료 조성물은 본원에 개시된 것과 같은 항체 또는 또는 이중특이적 항원 결합 분자 중 어느 하나 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "이를 필요로 하는 대상체"라는 표현은 암의 하나 이상의 증상 또는 징후를 나타내거나(예를 들어, 종양을 발현하거나, 아래 본원에 언급된 암 중 어느 하나를 앓고 있는 대상체), 달리 CD38 활성의 억제 또는 감소 또는 CD38+ 세포(예: 다발성 골수종 세포)의 고갈로부터 혜택을 얻게 되는 인간 또는 비인간 동물을 의미한다.
본 발명의 항체 및 이중특이적 항원 결합 분자(및 이를 포함하는 치료 조성물)는, 면역 반응의 자극, 활성화, 및/또는 표적화가 유익한 임의의 질환 또는 장애를 치료하는 데 특히 유용하다. 특히, 본 발명의 항-CD38 항체, 항-CD28 항체, 또는 항-CD38 x 항-CD28 이중특이적 항원 결합 분자는 CD39 및/또는 BCMA의 발현 또는 CD38+ 및/또는 BCMA+ 세포의 활성과 연관이 있거나 이에 의해 매개되는 임의의 질환 또는 장애를 치료, 예방, 및/또는 완화시키는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 치료 방법이 달성되는 작용 메커니즘은 효과기 세포의 존재 하에 CD38을 발현하는 세포를, 예를 들어, CDC, 세포자멸사, ADCC, 식균작용에 의해, 또는 이들 메커니즘 중 둘 이상의 조합에 의해 살해하는 것을 포함한다. 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자를 사용하여 억제하거나 살해할 수 있는 CD38 발현 세포는, 예를 들어 다발성 골수종 세포를 포함한다.
본 개시의 항체 및 항원 결합 분자는, 예를 들어 다발성 골수종, B-세포 백혈병, 간세포 암종, 비소세포 폐암, 흑색종, 췌장관 선암종, 신경교종, 또는 유방암, 또는 부분적을 CD38+ 세포를 갖는 것을 특징으로 하는 또 다른 암을 포함하여, CD38 발현과 연관된 질환 또는 장애를 치료하는 데 사용될 수 있다.
특정 구현예에 따르면, 항-CD38 x 항-CD28 항체 또는 항-CD38 항체 또는 항-CD28 항체는, 예를 들어 BCMA 또는 CD20을 발현하는 종양 세포를 치료하는 데 유용하다. 본원에 제공된 항원 결합 분자는 또한, 예를 들어 다발성 골수종 또는 다른 B-세포 또는 형질 세포 암(예: 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 버킷 림프종, 및 미만성 거대 B-세포 림프종, 비호지킨 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 엽포성 림프종, 외투 세포 림프종, 변연 세포 림프종, 림프형질세포성 림프종, 및 호지킨 림프종)을 포함하는 암을 포함하여, BCMA 발현과 연관된 질환 또는 장애를 치료하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 항-CD38 x 항-CD28 항체 또는 항-CD38 항체 또는 항-CD28 항체는 다발성 골수종 환자를 치료하는 데 유용하다. 본 발명의 다른 관련 구현예에 따르면, BCMA 또는 CD20을 발현하는 암세포를 가진 환자에게 본원에 제공된 항-CD38 x CD28 이중특이적 항체를 본원에 개시된 것과 같은 항-BCMA 항체, 또는 항-BCMA x 항-CD3 이중특이적 항원 결합 분자, 또는 항-CD20 x 항-CD3 이중특이적 항원 결합 분자와 병용으로 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 종양 스캐닝 등과 같이 당업계에 공지된 분석/진단 방법을 사용해 환자가 다발성 골수종 또는 다른 B-세포 계통 암을 가지고 있는지 여부를 확인할 수 있다.
또한, 본 발명은 대상체에서 잔존 암을 치료하는 방법을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "잔존 암(residual cancer)"은 항암 요법으로 치료한 후 대상체에서 하나 이상의 암 세포가 존재하거나 지속되는 것을 의미한다.
특정 양태에 따르면, 본 발명은 CD38 발현과 연관된 질환 또는 장애(예를 들어 다발성 골수종)를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 대상체가 다발성 골수종을 앓고 있는 것으로 결정된 후 본원의 다른 곳에서 기술된 항-CD38 항체, 항-CD28 항체, 또는 이중특이적 항원 결합 분자 중 하나 이상을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 다발성 골수종을 치료하는 방법을 포함하며, 상기 방법은, 대상체가 면역요법 또는 화합요법으로 치료를 받은지 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주 또는 4주, 2개월, 4개월, 6개월, 8개월, 1년 또는 그 이상 후에 이 환자에게 항-CD38 항체, 항-CD28 항체, 또는 항-CD38 x 항-CD28 이중특이적 항원 결합 분자를 투여하는 단계를 포함한다.
병용 요법 및 제형
본 발명은 본원에 기술된 예시적인 항체 및 이중특이적 항원 결합 분자 중 어느 하나를 포함하는 약학적 조성물을 하나 이상의 추가 치료제와 병용 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 본 발명의 항원 결합 분자와 조합되거나 병용 투여될 수 있는 예시적인 추가의 치료제는, 예를 들어 항종양제(예를 들어 멜팔란, 빈크리스틴(Oncovin), 시클로포스파미드(Cytoxan), 에토포시드(VP-16), 독소루비신(Adriamycin), 리포좀 독소루비신(Doxil), 오바무스틴(Trenda)을 포함하는 화학요법제 또는 대상체에서 형질 세포 종양을 치료하는 데 효과적인 것으로 알려진 임의의 다른 것들)를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 치료제는 스테로이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 치료제는 새로 진단된 환자의 치료용으로 승인된 요법인 탈리도마이드, 레날리도마이드, 및 보르테조밉을 포함하는 표적 치료제를 포함한다. 레날리도마이드, 포말리도마이드, 보르테조밉, 카르필조밉, 파노비노스타트, 익사조밉, 엘로투주맙, 및 다라투무맙은 재발성 골수종을 치료하는 데 효과적인 제2 치료제의 예이다.
일부 구현예에서, 제2 치료제는 항-BCMAxCD3 이중특이적 항체이다. 예시적인 항-BCMAxCD3 이중특이적 항체는 본원에 참조로서 통합된 U.S. 2020/0024356호에 개시되어 있다. U.S. 2020/0024356에 개시된 것과 같은 예시적인 항-BCMAxCD3 이중특이적 항체는 REGN5458이며, U.S. 2020/0024356 서열 목록에 제공된 것과 같은 서열번호 66/82의 HCVR/LCVR을 갖는 항-BCMA 결합 도메인 및 서열번호 90/82의 HCVR/LCVR을 갖는 항-CD3 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 치료제는 항-CD20xCD3 이중특이적 항체이다. 예시적인 항-CD20xCD3 이중특이적 항체는 본원에 참조로서 통합된 미국 특허 제9,657,102호에 개시되어 있다. 미국 특허 제9,657,102호에 개시된 예시적인 항-CD20xCD3 이중특이적 항체는 REGN1979이며, 미국 특허 제9,657,102호 서열 목록에 제공된 것과 같은 서열번호 1242/1258의 HCVR/LCVR을 갖는 항-CD20 결합 도메인 및 서열번호 1250/1258의 HCVR/LCVR을 갖는 항-CD3 결합 도메인을 포함한다.
특정 구현예에서, 제2 치료제는 방사선요법 또는 줄기 세포 이식을 포함하는 요법이다. 특정 구현예에서, 제2 치료제는 면역조절제일 수 있다. 특정 구현예에서, 제2 치료제는 보르테조밉(Velcade), 카르필조밉(Kyprolis), 익사조밉(Ninlaro)을 포함하는 프로테아좀 억제제일 수 있다. 특정 구현예에서, 제2 치료제는 파노비노스타트(Farydak)와 같은 히스톤 탈아세틸화효소 억제제일 수 있다. 특정 구현예에서, 제2 치료제는 단클론 항체, 항체 약물 접합체, 항종양제에 접합된 이중특이적 항체, 관문 억제제, 또는 이들의 조합일 수 있다. 본 발명의 항원 결합 분자와 유익하게 병용 투여할 수 있는 다른 제제는, 사이토카인 억제제를 포함하며, 사이토카인 억제제에는 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18과 같이 사이토카인에 결합하거나 이들 각각의 수용체에 결합하는 저분자 사이토카인 억제제 및 항체가 포함된다. 본 발명의 약학적 조성물(예를 들어 본원에 개시된 것과 같은 항-CD38 x 항-CD28 이중특이적 항원 결합 분자를 포함하는 약학적 조성물)은 다음으로부터 선택된 하나 이상의 치료 조합을 포함하는 치료 요법의 일부로서 투여될 수도 있다: 형질 세포 표면에서 상이한 항원과 상호작용할 수 있는, 본원에 기술된 것 이외의 단클론 항체; 종양 세포 표면 상에서 항원에 결합하는 하나의 아암 및 T 세포 상에서 항원에 결합하는 다른 하나의 아암을 갖는 이중특이적 항체; 항체-약물 접합체; 항종양제와 접합된 이중특이적 항체; 관문 억제제, 예를 들어 PD-1 또는 CTLA-4를 표적으로 하는 것; 또는 이들의 조합. 특정 구현예에서, 관문 억제제는 펨브롤리주맙(Keytruda), 니볼루맙(Opdivo), 또는 세미플리맙(REGN2810; 서열번호 162/170의 HCVR/LCVR 쌍을 갖는, 미국 특허 제9,987,500호에 제시된 PD-1 억제제 참조)과 같은 PD-1 억제제로부터 선택될 수 있다. 특정 구현예에서, 관문 억제제는 아테졸리주맙(Tecentriq), 아벨루맙(Bavencio), 또는 더발루맙(Imfinzi)과 같은 PD-L1 억제제로부터 선택될 수 있다. 특정 구현예에서, 관문 억제제는 이필리무맙(Yervoy)과 같은 CTLA-4 억제제로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 항체와 함께 사용될 수 있는 다른 조합은 전술되어 있다.
본 발명은 또한, 본원에 언급된 항원 결합 분자 중 어느 하나 및 다음 중 하나 이상으로 이루어진 억제제를 포함하는 병용 치료제를 포함하며: VEGF, Ang2, DLL4, EGFR, ErbB2, ErbB3, ErbB4, EGFRvIII, cMet, IGF1R, B-raf, PDGFR-α, PDGFR-β, FOLH1(PSMA), PRLR, STEAP1, STEAP2, TMPRSS2, MSLN, CA9, 우로플라킨, 또는 전술한 사이토카인 중 어느 하나, 여기서 억제제는 앱타머, 안티센스 분자, 리보자임, siRNA, 펩티바디, 나노바디 또는 항체 단편(예: Fab 단편; F(ab')2 단편; Fd 단편; Fv 단편; scFv; dAb 단편; 또는 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 미니바디 및 최소 인식 단위와 같은 기타 조작된 분자)이다. 본 발명의 항원 결합 분자는 항바이러스제, 항생제, 진통제, 코르티코스테로이드, 및/또는 NSAID와 병용 투여될 수도 있고/있거나 공동으로 제형화될 수도 있다. 본 발명의 항원 결합 분자는 방사선 치료 및/또는 종래의 화학요법을 또한 포함하는 치료 요법의 일부로서 투여될 수도 있다.
추가적인 치료적 활성 성분(들)은 본 발명의 항원 결합 분자의 투여 직전에, 동시에, 또는 직후에 투여될 수 있다; (본 개시의 목적을 위해, 이러한 투여 요법은 항원 결합 분자를 추가적인 치료적 활성 성분과 "병용" 투여하는 것으로 간주된다).
본 발명은, 본 발명의 항원 결합 분자가 본원의 다른 곳에서 기술된 것과 같은 하나 이상의 추가적인 치료적 활성 성분(들)과 공동 제형화된 약학적 조성물을 포함한다.
투여 요법
본 발명의 특정 구현예에 따르면, 항원 결합 분자(예: 항-CD38 항체 또는 항-CD28 항체항체, 또는 CD38 및 CD28에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항원 결합 분자)의 다회 투여량이 정의된 시간 과정에 걸쳐 대상체에게 투여될 수 있다. 본 발명의 이러한 양태에 따른 방법은 본 발명의 항원 결합 분자의 다회 투여량을 순차적으로 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "순차적 투여"는 항원 결합 분자의 각 투여량이 상이한 시점에, 예를 들어, 소정의 간격(예: 시간, 일, 주, 또는 월)만큼 이격된 상이한 날에 대상체에게 투여됨을 의미한다. 본 발명은, 항원 결합 분자의 최초 1회 투여량에 이어서 항원 결합 분자의 하나 이상의 2차 투여량, 및 이어서 임의로 항원 결합 분자의 하나 이상의 3차 투여량을 순차적으로 투여하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다.
용어 "최초 투여량", "2차 투여량" 및 "3차 투여량"은 본 발명의 결합 분자의 시간적 투여 순서를 지칭한다. 따라서, "초기 투여량"은 치료 처방의 시작 시 투여되는 투여량("베이스라인 투여량"으로도 지칭됨); "2차 투여량"은 초기 투여 후 투여되는 투여량이고; "3차 투여량"은 2차 투여 후 투여되는 투여량이다. 최초, 2차 및 3차 투여량은 모두 동일한 양의 항원 결합 분자를 함유할 수 있지만, 일반적으로 투여 빈도에서 서로 다를 수 있다. 그러나, 특정 구현예에서, 최초, 2차 및/또는 3차 투여량에 함유된 항원 결합 분자의 양은 치료 과정 동안 서로 다를 수 있다(예를 들어, 적절하게 상향 또는 하향 조절됨). 특정 구현예에서, 2가지 이상의(예: 2, 3, 4, 또는 5가지) 투여량이 치료 요법 시작 시 "로딩 투여량"으로서 투여되고, 적은 빈도수 기준으로 투여되는 후속 투여량(예: "유지 투여량")이 이어진다.
본 발명의 예시적인 일 구현예에서, 각각의 2차 및/또는 3차 투여량은 직전 투여량의 1 내지 26주 후에 (예를 들어, 1, 1½, 2, 2½, 3, 3½, 4, 4½, 5, 5½, 6, 6½, 7, 7½, 8, 8½, 9, 9½, 10, 10½, 11, 11½, 12, 12½, 13, 13½, 14, 14½, 15, 15½, 16, 16½, 17, 17½, 18, 18½, 19, 19½, 20, 20½, 21, 21½, 22, 22½, 23, 23½, 24, 24½, 25, 25½, 26, 26½주 또는 더 이상 후에) 투여된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "직전 투여량(the immediately preceding dose)"라는 문구는, 다회 투여의 순서에 있어서, 순서 상 바로 다음 투여량이 환자에게 투여되기 전에 투여되는 항원 결합 분자의 투여량을 의미하고, 이들 사이에 개재되는 투여량이 없음을 의미한다.
본 발명의 이러한 양태에 따른 방법은 항원 결합 분자(예: 항-CD38 항체, 항-CD28 항체, 또는 CD38 또는 CD28에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항원 결합 분자)의 임의의 회수의 2차 및/또는 3차 투여량을 환자에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 2차 투여량은 1회만 환자에게 투여된다. 다른 구현예에서, 2회 이상의 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8회 또는 그 이상의) 2차 투여량이 환자에게 투여된다. 마찬가지로, 특정 구현예에서, 3차 투여량은 1회만 환자에게 투여된다. 다른 구현예에서, 2회 이상의 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8회 또는 그 이상의) 3차 투여량이 환자에게 투여된다.
다회의 2차 투여량을 포함하는 구현예에서, 각각의 2차 투여량은 다른 2차 투여량과 동일한 빈도로 투여될 수 있다. 예를 들어, 각각의 2차 투여량은 직전 투여량의 투여 후 1 내지 2주차에 환자에게 투여될 수 있다. 유사하게, 다회의 3차 투여량을 포함하는 구현예에서, 각각의 3차 투여량은 다른 3차 투여량과 동일한 빈도로 투여될 수 있다. 예를 들어, 각각의 3차 투여량은 직전 투여량의 투여 후 2 내지 4주차에 환자에게 투여될 수 있다. 대안적으로, 2차 및/또는 3차 투여량이 환자에게 투여되는 빈도는 치료 요법의 과정에 걸쳐 달라질 수 있다. 투여 빈도는 임상 검사 후 개별 환자의 필요에 따라 의사가 치료 과정 동안 조정할 수도 있다.
항체의 진단적 용도
본원에 개시된 항-CD38 항체는 예를 들어 진단을 목적으로 샘플에서 CD38 또는 CD38-발현 세포를 검출 및/또는 측정하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 항-CD38 항체 또는 이의 단편은 CD38의 비정상 발현(예: 과발현, 발현 부족, 발현 결여 등)을 특징으로 하는 병태 또는 질환을 진단하는 데 사용될 수 있다. CD38에 대한 예시적인 진단 검정은, 예를 들어 환자로부터 수득된 샘플을 본원에 개시된 항-CD38 항체와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 항-CD38 항체는 검출 가능한 표지 또는 리포터 분자로 표지된다. 대안적으로, 표지되지 않은 항-CD38 항체가 자체적으로 검출 가능하게 표지된 보조 항체와 병용으로 진단 용도에 사용될 수 있다. 검출 가능한 표지 또는 리포터 분자는 3H, 14C, 32P, 35S 또는 125I와 같은 방사성 동위원소; 플루오레세인 이소티오시아네이트 또는 로다민과 같은 형광 모이어티 또는 화학발광 모이어티; 또는 알칼라인 포스파타아제, 베타-갈락토시다아제, 서양 고추냉이 퍼옥시다아제, 또는 루시페라아제와 같은 효소일 수 있다. 본 발명의 항-CD38 항체의 또 다른 예시적인 진단적 용도는 대상체에서 종양 세포를 비침습적으로 식별하고 추적(예: 양전자 방출 단층촬영(PET) 영상화)하기 위한 목적으로 89Zr-표지된 항체, 예컨대 89Zr-데스페리옥사민-표지된 항체를 포함한다. (예를 들어, Tavare, R. 등의 문헌[Cancer Res. 2016 Jan 1;76(1):73-82]; 및 Azad, BB. 등의 문헌[Oncotarget. 2016 Mar 15;7(11):12344-58] 참조.) 샘플에서 CD38을 검출하거나 측정하는 데 사용할 수 있는 특정 예시적인 검정은 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA), 방사성 면역분석(RIA) 및 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 포함한다.
본 발명에 따른 CD38 진단 검정에 사용될 수 있는 샘플에는 환자로부터 얻을 수 있는 임의의 조직 또는 체액 샘플이 포함되며, 이러한 샘플은 정상적인 또는 병리학적 조건 하에서 검출 가능한 양의 CD38 단백질 또는 이의 단편을 함유한다. 일반적으로, 건강한 대상체(예: 비정상적인 CD38 수준 또는 활성과 관련이 있는 질환 또는 병태를 앓지 않는 환자)로부터 수득한 특정 샘플에서 CD38의 수준을 측정하여 CD38의 베이스라인 수준 또는 표준 수준을 먼저 확립하게 된다. 그런 다음, CD38의 이러한 베이스라인 수준을 CD38 관련 질환(예: CD38 발현 세포를 함유하는 종양)이나 병태를 갖는 것으로 의심되는 개체로부터 수득한 샘플에서 측정한 CD38의 수준과 비교할 수 있다.
장치
본 발명은 또한, 본원에 기재된 이중특이적 항원 결합 분자(예: 이의 약학적 제형)을 포함하는 용기(예: 바이알 또는 크로마토그래피 컬럼) 또는 주사 장치(예: 주사기, 미리 채워진 주사기 또는 자동 주입기)를 제공한다. 용기 또는 주사 장치는 키트로 포장될 수 있다.
주사 장치는 비경구 경로(예를 들어, 안구 내, 유리체 내, 근육 내, 피하 또는 정맥 내)를 통해 대상체(예: 인간)의 신체 내에 물질을 도입하는 장치이다. 예를 들어, 주사 장치는, 예를 들어, 주사할 유체(예를 들어, 항체 또는 이의 단편 또는 약학적 제형을 포함함)를 담기 위한 실린더나 통(barrel); 유체의 주입을 위해 피부, 혈관 또는 다른 조직을 관통하기 위한 바늘; 유체를 실린더 밖으로 밀어 내고, 바늘 구멍을 통해 대상체의 신체 내로 밀어넣기 위한 플런저(plunger)를 포함하는 주사기(예: 약학적 조성물로 미리 채워진, 예컨대 자동 주입기)일 수 있다.
본원에 제공된 약학적 조성물은 표준 바늘 및 주사기를 사용하여 피하 전달되거나 정맥내 전달될 수 있다. 또한, 피하 전달의 경우, 펜 전달 장치가 본 발명의 약학적 조성물을 전달하는 데 용이하게 적용된다. 이러한 펜 전달 장치는 재사용식이거나 일회용일 수 있다. 재사용식 펜 전달 장치에는 일반적으로 약학적 조성물이 담긴 교체식 카트리지가 사용된다. 일단 카트리지 내의 모든 약학적 조성물이 투여되어 카트리지가 비면, 빈 카트리지를 쉽게 폐기하고 약학적 조성물이 담긴 새로운 카트리지로 교체할 수 있다. 그러면, 펜 전달 장치를 재사용할 수 있다. 일회용 펜 전달 장치에는 교체식 카트리지가 없다. 오히려, 일회용 펜 전달 장치는 약학적 조성물이 장치 내의 저장조에 미리 담긴 상태로 제공된다. 일단 저장조의 약학적 조성물이 비게 되면, 전체 장치가 폐기된다.
다수의 재사용식 펜 전달 장치 및 자가주입 전달 장치가 본 발명의 약학적 조성물을 피하 전달하는 데 적용된다. 예로서 몇 가지만 거명하자면, AUTOPEN??(Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK), DISETRONIC?? 펜(Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Switzerland), HUMALOG MIX 75/25?? 펜, HUMALOG?? 펜, HUMALIN 70/30?? 펜(Eli Lilly and Co., Indianapolis, Ind.), NOVOPEN?? I, II 및 III(Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), NOVOPEN JUNIOR??(Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), BD?? 펜(Becton Dickinson, Franklin Lakes, N.J.), OPTIPEN??, OPTIPEN PRO??, OPTIPEN STARLET??, 및 OPTICLIK??(sanofi-aventis, Frankfurt, Germany)이 포함되지만, 이들로 한정되지는 않는다. 본 발명의 약학적 조성물을 피하 전달하는 데 적용되는 일회용 펜 전달 장치의 몇 가지만 거명하자면, SOLOSTAR?? 펜(sanofi-aventis), FLEXPEN??(Novo Nordisk), 및 KWIKPEN??(Eli Lilly), SURECLICK?? Autoinjector(Amgen, Thousand Oaks, Calif), PENLET??(Haselmeier, Stuttgart, Germany), EPIPEN(Dey, L.P.) 및 HUMIRA?? 펜(Abbott Labs, Abbott Park Ill.)이 포함되지만, 이들로 한정되지는 않는다.
본 개시의 이중특이적 항원 결합 분자를 투여하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 주입 장치를 사용해 대상체의 신체 내에 분자를 도입(예: 주입)하는 단계를 포함한다.
발현 방법
본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 면역글로불린 사슬을 만들기 위한 재조합 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 (i) 예를 들어, 이러한 이중특이적 항원 결합 분자의 경쇄 및/또는 중쇄 면역글로불린 사슬을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내에 도입하는 단계로서, 폴리뉴클레오티드는 벡터 내에 있고/있거나 숙주 세포 염색체에 통합되고/되거나 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 단계; (ii) 폴리뉴클레오티드의 발현에 유리한 조건 하에 숙주 세포(예: 포유동물, 진균류, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO), 피치아 또는 피치아 파스토리스)를 배양하는 단계; 및 (iii) 임의로, 이중특이적 항원 결합 분자 또는 면역글로불린 사슬을 숙주 세포 및/또는 숙주 세포를 성장시키는 배지로부터 단리하는 단계를 포함한다. 이러한 방법의 생성물은 또한 이의 약학적 조성물과 함께 본 개시의 일부를 형성한다.
일 구현예에서, 이중특이적 항원 결합 분자를 제조하는 방법은, 예를 들어, 컬럼 크로마토그래피, 침전 및/또는 여과에 의해 분자를 정제하는 방법을 포함한다. 이러한 방법의 생성물은 또한 이의 약학적 조성물과 함께 본 개시의 일부를 형성한다.
본 개시의 이중특이적 항원 결합 분자 및/또는 (예를 들어, 벡터 내에서) 이러한 분자의 면역글로불린 사슬을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포 또한 본 발명의 일부이다. 숙주 세포는, 예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포와 같은 포유동물 세포 및 피치아 세포(예: P. pastoris)와 같은 진균류 세포를 포함한다.
실시예
다음 실시예는 당업자에게 본 발명의 방법 및 조성물을 제조하고 사용하는 방법의 완전한 개시 및 설명을 제공하기 위해 제시된 것으로, 본 발명자들이 발명으로 간주하는 것의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다. 사용된 숫자(예를 들어, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위한 노력을 기울였으나 약간의 실험 오차와 편차에 대해서는 설명되어야 한다. 달리 표시되지 않는 한, 부(parts)는 중량 부(parts by weight)이고, 분자량은 평균 분자량이며, 온도는 섭씨 온도이고, 압력은 대기압이거나 거의 대기압이다.
실시예 9 내지 12에 사용된 대조군 항체는 CD3-결합 음성 대조군 이중특이적 Ab(H4sH17664D) 및 CD28-결합 음성 대조군 이중특이적 Ab(bsAb5671)를 포함한다.
적절한 T 세포 활성화를 위해 "신호 1" 및 "신호 2"의 2개의 신호가 요구된다. "신호 1"은 T 세포 상의 T 세포 수용체(TCR)를 항원 제시 세포(APC) 상의 펩티드-결합 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자에 결합함으로써 유도된다. "신호 2"는 T 세포 상의 공동 자극 CD28 수용체를 APC 상에 존재하는 이의 리간드 분화 클러스터 80 또는 86(CD80/CD86)과 결합시킴으로써 제공된다. T 세포의 활성화, 즉 "신호 1"은 종양 연관 항원(TAA)xCD3 이중특이적 항체, 예컨대 CD20xCD3 이중특이적 항체(bsAb1979) 또는 BCMAxCD3 이중특이적 항체(bsAb5458)로 치료함으로써 제공될 수 있다.
전체적으로 언급된 이소형 대조군은 IsoC-1(IgG4P-PVA로도 지칭되는, CD20xCD3 이중특이적 항체(bsAb1979)에 대한 이소형 대조군) 및 IsoC-2(IgG4P로도 지칭되는, 세미플리맙에 대한 이소형 대조군)를 포함한다.
실시예 1. 항-CD38 항체 및 항-CD28 항체의 생성
인간 면역글로불린 중쇄 및 카파 경쇄 가변 영역을 암호화하는 DNA를 포함하는 유전적으로 조작된 마우스를 CD38을 발현하는 세포 또는 CD38을 암호화하는 DNA로 면역화함으로써 항-CD38 항체를 수득하였다. 항체 면역 반응은 CD38 특이적 면역검정으로 모니터링하였다. 원하는 면역 반응이 달성되면 비장 세포를 채취하고, 마우스 골수종 세포와 융합시켜 이들의 생존력을 보존하고 불멸 하이브리도마 세포주를 형성하였다. 하이브리도마 세포주를 스크리닝하고 선별하여 CD38 특이적 항체를 생산하는 세포주를 식별하였다. 이러한 기술을 사용하여, 여러가지 항-CD38 키메라 항체(즉, 인간 가변 도메인 및 설치류 불변 도메인을 갖는 항체)를 수득하였다. 추가로, 여러 개의 완전한 인간 항-CD38 항체를 골수종 세포와 융합시키지 않고, US 2007/0280945A1에 기술된 것과 같이 항원-양성 B 세포로부터 직접 단리하였다.
마찬가지로, 인간 면역글로불린 중쇄 및 카파 경쇄 가변 영역을 암호화하는 DNA를 포함하는 유전적으로 조작된 마우스를 CD28을 발현하는 세포 또는 CD28을 암호화하는 DNA로 면역화함으로써 항-CD28 항체를 수득하였다. 항체 면역 반응은 CD28 특이적 면역검정으로 모니터링하였다. 원하는 면역 반응이 달성되면 비장 세포를 채취하고, 마우스 골수종 세포와 융합시켜 이들의 생존력을 보존하고 불멸 하이브리도마 세포주를 형성하였다. 하이브리도마 세포주를 스크리닝하고 선별하여 CD28 특이적 항체를 생산하는 세포주를 식별하였다. 이러한 기술을 사용하여, 여러가지 항-CD28 키메라 항체(즉, 인간 가변 도메인 및 설치류 불변 도메인을 갖는 항체)를 수득하였다. 추가로, 여러 개의 완전한 인간 항-CD28 항체를 골수종 세포와 융합시키지 않고, US 2007/0280945A1에 기술된 것과 같이 항원-양성 B 세포로부터 직접 단리하였다.
항체의 특성을 분석하여 친화도, 선택도 등을 포함하는 바람직한 특성에 맞게 선택하였다. 필요에 따라, 마우스 불변 영역을 원하는 인간 불변 영역(예를 들어 야생형 또는 변형된 IgG1 또는 IgG4 불변 영역)과 치환하여 완전한 인간 항-CD38 항체 또는 완전한 인간 항-CD28 항체를 생성하였다. 선택된 불변 영역은 특이적 용도에 따라 매우 다양할 수 있지만, 고친화도 항원 결합 특성 및 표적 특이성 특성은 가변 영역에 존재한다.
본 실시예의 방법에 따라 생성된 예시적인 항-CD38 항체 및 항-CD28 항체 및 이로부터 작제한 이중특이적 항체의 특정 생물학적 특성은 아래에 제시된 실시예에서 상세히 기술된다.
실시예 2. 항-CD38 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 아미노산 및 핵산 서열
표 1은 본 발명의 선택된 항-CD38 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 및 CDR의 아미노산 서열 식별자를 제시한다. 상응하는 핵산 서열 식별자는 표 2에 제시된다. 완전한 중쇄 및 경쇄 아미노산 및 핵산 서열은 표 3에 제공된다.
항-CD38 아미노산 서열 식별자
서열번호
항체 명칭 HCVR HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCVR LCDR1 LCDR2 LCDR3
mAb1 2 4 6 8 18 20 22 24
mAb2 32 34 36 38 48 50 52 54
항-CD38 핵산 서열 식별자
서열번호
항체 명칭 HCVR HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCVR LCDR1 LCDR2 LCDR3
mAb1 1 3 5 7 17 19 21 23
mAb2 31 33 35 37 47 49 51 53
항-CD38 중쇄 및 경쇄 서열 식별자
서열번호
항체 명칭 HC 아미노산, LC 아미노산, HC 핵산 LC 핵산
mAb1 26 30 25 29
mAb2 56 60 55 59
본원에 제공된 항체는 임의의 이소형 항체일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항-CD38 항체는 표 1 및 표 2에 제시된 바와 같은 가변 도메인 및 CDR 서열 및 이소형 IgG4, IgG1 등의 인간 Fc 도메인을 포함할 수 있다. 특정 응용 분야 또는 실험의 경우, Fc 도메인은 마우스 Fc 도메인일 수 있다. 당업자가 이해할 수 있듯이, 특정 Fc 이소형을 갖는 항체는 다른 Fc 이소형을 갖는 항체로 변환될 수 있지만(예를 들어, 마우스 IgG4 Fc를 갖는 항체는 인간 IgG1을 갖는 항체 등으로 변환될 수 있지만), 어떤 경우에도, 표 1 및 표 2에 나타낸 수치 식별자에 의해 표시되는 가변 도메인(CDR 포함)은 동일하게 유지될 것이고, 결합 특성은 Fc 도메인의 성질에 상관없이 동일하거나 실질적으로 유사할 것으로 예상된다.
실시예 3: 항-CD28 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 아미노산 및 핵산 서열
표 4는 본 발명의 선택된 항-CD28 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 및 CDR의 아미노산 서열 식별자를 제시한다. 상응하는 핵산 서열 식별자는 표 5에 제시된다. 완전한 중쇄 및 경쇄 아미노산 및 핵산 서열은 표 6에 제공된다.
항-CD28 아미노산 서열 식별자
서열번호
항체 명칭 HCVR HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCVR LCDR1 LCDR2 LCDR3
mAb3 10 12 14 16 18 20 22 24
mAb4 40 42 44 46 48 50 52 54
항-CD28 핵산 서열 식별자
서열번호
항체 명칭 HCVR HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCVR LCDR1 LCDR2 LCDR3
mAb3 9 11 13 15 17 19 21 23
mAb4 39 41 43 45 47 49 51 53
항-CD28 중쇄 및 경쇄 서열 식별자
서열번호
항체 명칭 HC 아미노산, LC 아미노산, HC 핵산 LC 핵산
mAb3 28 30 27 29
mAb4 58 60 57 59
본 발명의 항체는 임의의 이소형 항체일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항-CD28 항체는 표 4 및 표 5에 제시된 바와 같은 가변 도메인 및 CDR 서열 및 이소형 IgG4, IgG1 등의 인간 Fc 도메인을 포함할 수 있다. 특정 응용 분야 또는 실험의 경우, Fc 도메인은 마우스 Fc 도메인일 수 있다. 당업자가 이해할 수 있듯이, 특정 Fc 이소형을 갖는 항체는 다른 Fc 이소형을 갖는 항체로 변환될 수 있지만(예를 들어, 마우스 IgG4 Fc를 갖는 항체는 인간 IgG1을 갖는 항체 등으로 변환될 수 있지만), 어떤 경우에도 - 표 4 및 표 5에 나타낸 수치 식별자에 의해 표시되는 - 가변 도메인(CDR 포함)은 동일하게 유지될 것이고, 결합 특성은 Fc 도메인의 성질에 상관없이 동일하거나 실질적으로 유사할 것으로 예상된다.
실시예 4: CD38 및 CD28에 결합하는 이중특이적 항체의 생성
CD28 및 CD38에 결합하는 이중특이적 항원 결합 분자가 본원에 제공되며; 이러한 이중특이적 항원 결합 분자는 본원에서 "항-CD38 x 항-CD28" 또는 "항-CD28x항-CD38" 또는 "항-CD38 x 항-CD28 이중특이적 분자", 또는 "항-CD38/항-CD28", 또는 "CD38xCD28 이중특이적 분자", 또는 "CD38xCD28 bsAb"로도 지칭된다. 항-CD38/항-CD28 이중특이적 분자의 항-CD38 부분은 CD38을 발현하는 종양 세포를 표적화하는 데 유용하고, 이중특이적 분자의 항-CD28 부분은 T 세포를 활성화하는 데 유용하다. 종양 세포 상의 CD38 및 T 세포 상의 CD28에 동시 결합하는 것은 활성화된 T 세포에 의해 표적화된 종양 세포의 사멸 유도(세포 용해)를 용이하게 한다.
항-CD38 특이적 결합 도메인 및 항-CD28 특이적 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체는, 항-CD38 항체 유래의 중쇄 및 경쇄를 항-CD28 항체 유래의 중쇄와 조합하는 표준 방법론을 사용하여 작제하였다. 예시적인 이중특이적 항체에서, 분자는 항-CD38 항체의 중쇄, 항-CD28 항체의 중쇄, 및 항-CD38 항체의 공통 경쇄를 사용해 작제하였다. 다른 경우에, 이중특이적 항체는 항-CD28 항체의 중쇄, 항-CD38 항체의 중쇄, 및 다양한 중쇄 아암과 효과적으로 혼화되거나 쌍을 이루는 것으로 알려진 항체 경쇄를 사용하여 작제할 수 있다.
본 실시예에 따라 제조된 다양한 이중특이적 항체의 항원 결합 도메인의 성분 부분에 대한 요약은 표 7에 제시되어 있다.
Figure pct00001
실시예 5: 항-CD38 항체 및 항-CD28 항체의 Biacore 결합 동역학
CD38xCD28 이중특이적 항체에 결합하는 CD38 및 CD28에 대한 동역학 파라미터를 결정하기 위해 표면 플라스몬 공명(SPR) 동역학을 수행하였다.
CD38 동역학 결정을 위해, 25℃서 Biacore 3000 기기를 사용하여 SPR 실험을 수행하였다. CM5 항-인간Fc-(bsAb2567)-결합 표면 상에 8 uL/분의 유속으로 37초 동안 항체를 포획하였다. 약 230 RU의 각 항체을 포획하였다. C-말단 myc-myc-헥사히스티딘 태그를 가진 90, 30, 10, 3.33, 1.11, 또는 0.37 nM의 농도의 단량체 인간 CD38(hCD38.mmH, bsAb3305)을 50uL/분의 유속으로 5분 동안 이 표면 위로 주입하였다. 10분 동안 해리를 측정하였다. 이중 기준 센서그램을 1:1 결합 모델에 피팅하여 KD 및 t1/2을 계산하였다.
CD28 동역학 결정을 위해, 25℃서 Biacore 3000 기기를 사용하여 SPR 실험을 수행하였다. c-말단 마우스 Fc 태그를 갖는 이량체 인간 CD28(hCD28.mFc, bsAb2012)을 CM5 항-마우스Fc-(GE)-결합 표면 상에 8 uL/분의 유속으로 37초 동안 포획하였다. 약 150 RU의 hCD28.mFc를 포획하였다. 90, 30, 10, 3.33, 1.11, 또는 0.37 nM 농도의 CD38xCD28 이중특이적 항체(bsAb7945 및 bsAb6031)를 50uL/분의 유속으로 5분 동안 이 표면 위로 주입하였다. 10분 동안 해리를 측정하였다. 이중 기준 센서그램을 1:1 결합 모델에 피팅하여 KD 및 t1/2을 계산하였다.
25℃에서 본 발명의 상이한 2개의 CD38 x CD28 이중특이적 항체에 결합하는 hCD38.mmH 및 hCD28.mFc에 대한 결합 동역학 파라미터는 표 8 및 9에 나타나 있다. 표 8에 나타낸 바와 같이, 2개의 이중특이적 항체는 약 10 nM 미만의 KD로 인간 CD38에 결합하고; 표 9에서는 약 26 nM 미만의 KD로 인간 CD28에 결합한다.
CD38 x CD28 이중특이적 항체에 대한 hCD38.mmH의 결합 동역학
hCD38.mmH
bsAb # ka (M -1 s -1 ) kd (s -1 ) KD (M) t1/2 (분)
bsAb6031 1.06E+05 7.48E-04 7.08E-09 15.4
bsAb7945 9.57E+05 1.44E-03 1.50E-09 8.0
CD38 x CD28 이중특이적 항체에 대한 hCD28.mFc의 결합 동역학
hCD28.mFc
bsAb # ka (M -1 s -1 ) kd (s -1 ) KD (M) t1/2 (분)
bsAb6031 5.74E+04 1.49E-03 2.59E-08 7.8
bsAb7945 1.78E+05 2.36E-03 1.33E-08 4.9
실시예 6: BCMA를 내인성으로 발현하는 CD38+ HEK93 세포 또는 MOLP8 세포가 존재할 때 CD38 x CD28 이중특이적 항체에 의한 T 세포 활성화
전술한 바와 같이, 적절한 T 세포 활성화를 위해 "신호 1" 및 "신호 2"의 2개의 신호가 요구된다. "신호 1"은 T 세포 상의 T 세포 수용체(TCR)를 항원 제시 세포(APC) 상의 펩티드-결합 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자에 결합함으로써 유도된다. "신호 2"는 T 세포 상의 공동 자극 CD28 수용체를 APC 상에 존재하는 이의 리간드 분화 클러스터 80 또는 86(CD80/CD86)과 결합시킴으로써 제공된다(Martin 등의 문헌[A 44 kilodalton cell surface homodimer regulates interleukin 2 production by activated human T lymphocytes. Journal of immunology, 1986; 136(9): 3282-7]; June 등의 문헌[T-cell proliferation involving the CD28 pathway is associated with cyclosporine-resistant interleukin 2 gene expression. Molecular and cellular biology. 1987; 7(12): 4472-81]; Harding 등의 문헌[CD28-mediated signalling co-stimulates murine T cells and prevents induction of anergy in T-cell clones. Nature. 1992;356(6370):607-9]). 따라서, CD28 신호전달의 활성화는 기존의 TCR 신호전달을 향상시키기 위한 표적화된 접근법을 제공한다.
본원에 제공된 CD38xCD28 이중특이적 항체는, 종양 연관 항원(TAA) x CD3 이중특이적 항체에 의해 제공된 "신호 1" 또는 APC에 의해 제공된 동종이형 반응이 존재할 때 T 세포의 활성화를 향상시키기 위해, CD38+ 표적 세포를 CD28+ T 세포와 가교하여 "신호 2"를 제공함으로써, CD28의 천연 리간드를 모방하도록 설계하였다.
본 실시예에서, IL2 방출, IFNγ 방출, 및 T 세포 증식에 의해 결정했을 때, CD38 및 CD28을 결합시켜 "신호 2"를 전달함으로써 인간 일차 T 세포를 활성화시키는 CD38xCD28 이중특이적 항체의 능력을, "신호 1"의 역할을 하도록 bsAb1979(CD20xCD3)을 사용해 hCD20 및 hCD38을 발현하도록 조작된 인간 배아 신장신장암 세포주(HEK293/hCD20/hCD38)의 존재 하에 평가하였다. hCD20만을 발현하는 HEK293 세포를 대조군으로서 포함시켜, APC 상에 CD38이 없을 때 발생할 수 있는 활성을 측정하였다. 또한, hCD38, MOLP8을 내인성으로 발현하는 다발성 골수종 세포주를 CD38xCD28 이중특이적 항체를 시험하는 데 포함시켰다. MOLP8 세포 또한 BCMA를 내인성으로 발현하므로, "신호 1"의 역할을 하도록 bsAb5458(BCMAxCD3)을 포함시켰다. 참고로, HEK293 세포와 달리, MOLP8 세포는 bsAb5458에 의해 제공되는 CD3 자극이 없을 때, "신호 1"의 역할을 하는, T 세포의 검출 가능한 동종 자극을 제공할 수 있다.
인간 일차 CD3 + T 세포의 단리:
제조사의 권장 프로토콜에 따라, EasySep?? 인간 PBMC 직접 단리 키트(Direct Human PBMC Isolation Kit)를 사용하여, Precision for Medicine의 건강한 공여자 백혈구 팩(공여자 555130)팩으로부터 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 단리하고 냉동시켰다. StemCell Technologies의 EasySep?? 인간 CD3+ T 세포 단리 키트를 사용하여 제조사의 권장 지침에 따라, 해동된 PBMC로부터 CD3+ T 세포를 단리하였다.
IL2 및 IFNγ 방출 검정:
농축된 CD3+ T 세포를 자극 배지에 재현탁하고, 96-웰 둥근 바닥 플레이트에 1x105 세포/웰의 농도로 첨가하였다. 성장이 정지된 HEK293/hCD20/hCD38 또는 HEK293/hCD20을 1 x 104 세포/웰의 최종 농도로 CD3+ T 세포에 첨가하였다. 성장이 정지된 MOLP8을 5 x 104 세포/웰의 최종 농도로 CD3+ T 세포에 첨가하였다. 세포 첨가 후, 0.1 nM bsAb1979 또는 일치하는 이소형 대조군(IsoC-1)의 일정량을 HEK293/hCD20/hCD38 또는 HEK2933/hCD20이 담긴 웰에 첨가하였다. 0.5 nM bsAb5458 또는 IsoC-1의 일정량을 MOLP8 세포가 담긴 웰에 첨가하였다. 이어서, bsAb6031, bsAb7945, 및 IsoC-1을 3pM 내지 200nM의 1:4 희석물로 적정하여 웰에 첨가하였다. 10점 희석의 마지막 지점에는 적정된 항체가 포함되지 않았다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 48시간 동안 인큐베이션하고, 및 5 mL의 총 상청액을 꺼내서 이를 사용해 IL2를 측정하였다. 72시간차에, 45 mL의 총 상청액을 꺼내서 5 mL를 사용해 IFNγ를 측정하였다. 검정 상청액 중 사이토카인의 양을 제조사의 프로토콜에 따라 PerkinElmer의 AlphaLisa 키트를 사용하여 결정하였다. Perkin Elmer의 다중 표지 플레이트 판독기 Envision을 이용해 사이토카인 측정치를 획득하고, 값을 pg/mL 단위로 보고하였다. 모든 연속 희석물은 중복 시험하였다.
항체의 EC50 값은 GraphPad Prism?? 소프트웨어를 사용해 10점 투여량-반응 곡선에 대한 4-파라미터 로지스틱 방정식으로 결정하였다. 최대 IL2 및 IFNγ는 시험된 투여량 범위 내에서 검출된 평균 최대 반응으로 주어진다.
T 세포 증식 검정:
72시간차에 최종 상청액을 꺼낸 후, 0.25 Ci/웰의 적정된 티미딘을 웰에 첨가하고, 플레이트를 6시간 동안 인큐베이션하였다. 분열 세포의 새로 합성된 DNA에 티미딘이 (당연히 삼중수소도) 더 많은 양으로 혼입될 것이다. 6시간의 인큐베이션 후, 세포를 96-웰 UniFilter 플레이트 상에 수확하고, 30 μL의 섬광액을 각 웰에 첨가하였다. 삼중수소의 혼입은 마이크로플레이트 섬광 및 발광 계수기인 TopCount NXT 기기를 사용하여 분당 계수(CPM)로서 측정하였다. 모든 연속 희석물은 중복 시험하였다.
항체의 EC50 값은 GraphPad Prism?? 소프트웨어를 사용해 10점 투여량-반응 곡선에 대한 4-파라미터 로지스틱 방정식으로 결정하였다. 최대 CPM은 시험된 투여량 범위 내에서 검출된 평균 최대 반응으로 주어진다.
결과:
HEK293/hCD20 및 HEK293/hCD20/hCD38
bsAb1979에 의해 제공된 표적 및 "신호 1"이 존재할 때, CD38xCD28 항체 치료제(bsAb6031 및 bsAb7945)는 일치하는 이소형 대조군 IsoC-1에 비해 더 높은 사이토카인 및 증식 반응을 유도하였다. 그러나, 표적 또는 "신호 1"이 없을 때, CD38xCD28 항체 치료제는 T 세포로부터 사이토카인 방출을 향상시키거나 T 세포의 증식을 향상시키지 않았다. 도 10, 11, 및 12 참조.
MOLP8
동종 MOLP8 세포가 존재하고 bsAb5458이 없을 때, CD38xCD28 항체 치료제(bsAb6031 및 bsAb7945)는 일치하는 이소형 대조군에 비해 IL2 방출 및 증식을 투여량 의존적으로 증가시켰다. "신호 1"은 동종 MOLP8 세포에 의해 제공될 수 있지만, bsAb5458의 첨가도 평가하였다. 이들 조건 하에서, CD38xCD28 항체 치료제(bsAb6031 및 bsAb7945)는 일치하는 이소형 대조군 IsoC-1에 비해 IL2 방출 및 IFNg 방출을 투여량 의존적으로 증가시켰다. 증식은 민감한 판독이므로, CD38xCD28가 없을 때 bsAb5458의 첨가를 MOLP8 세포가 제공하는 동종 자극과 합쳐, 증식에 대한 포화 신호를 유도하여, 검출될 CD38xCD28의 영향을 방지하였다. 도 10, 11, 및 12 참조.
따라서, IL2 방출 및 IFNγ 방출 및 T 세포 증식의 투여량 의존적 증가에 의해 결정된 것과 같이, "신호 1"이 존재할 때, CD38xCD28 이중특이적 항체는 "신호 2"를 전달함으로써 인간 일차 T 세포를 활성화시킨다.
항체의 최대 IL2 방출 및 역가 값
HEK293/hCD20/hCD38 HEK293/hCD20 MOLP8
항체 최대 (pg/mL) EC 50 [M] 최대 (pg/mL) EC 50 [M] 최대 (pg/mL) EC 50 [M]
bsAb6031 + TAAxCD3 1642 1.99E-10 48.01 ND 5864 1.02E-09
bsAb6031 + IgG4P 1 ND 1 ND 2821 6.53E-10
bsAb7945 + TAAxCD3 3878 5.02E-12 416.4 NC 9109 NC
bsAb7945 + IgG4P 143.7 4.14E-08 48.85 NC 4880 9.71E-12
IgG4P-PVA + TAAxCD3 7.221 ND 32.16 ND 152.3 ND
IgG4P-PVA + IgG4P 1 ND 1 ND 715.1 ND
약어: ND: 미결정; NC: 데이터가 4-파라미터 로지스틱 방정식에 적합하지 않았기 때문에 계산되지 않음.
항체의 최대 IFNγ 방출 및 역가 값
HEK293/hCD20/hCD38 HEK293/hCD20 MOLP8
항체 최대 (pg/mL) EC 50 [M] 최대 (pg/mL) EC 50 [M] 최대 (pg/mL) EC 50 [M]
bsAb6031 + TAAxCD3 1306 2.94E-10 1 ND 1578 7.48E-10
bsAb6031 + IgG4P 1 ND 1 ND 40.66 NC
bsAb7945 + TAAxCD3 3120 1.23E-10 226.1 NC 1759 4.24E-12
bsAb7945 + IgG4P 1 ND 1 ND 90.52 NC
IgG4P-PVA + TAAxCD3 1 ND 1 ND 1 ND
IgG4P-PVA + IgG4P 1 ND 1 ND 715.1 ND
약어: ND: 미결정; NC: 데이터가 4-파라미터 로지스틱 방정식에 적합하지 않았기 때문에 계산되지 않음.
항체의 최대 증식 및 역가 값
HEK293/hCD20/hCD38 HEK293/hCD20 MOLP8
항체 최대 (CPM) EC 50 [M] 최대 (CPM) EC 50 [M] 최대 (CPM) EC 50 [M]
bsAb6031 + TAAxCD3 5543 1.43E-10 2390 ND 6264 ND
bsAb6031 + IgG4P 86.5 ND 97 ND 1269 4.67E-10
bsAb7945 + TAAxCD3 6627 8.94E-13 4162 NC 6682 ND
bsAb7945 + IgG4P 998 4.56E-08 245 ND 2369 NC
IgG4P-PVA + TAAxCD3 842 ND 1825 ND 5446 ND
IgG4P-PVA + IgG4P 112.5 ND 74 ND 818.5 ND
약어: ND: 미결정; NC: 데이터가 4-파라미터 로지스틱 방정식에 적합하지 않았기 때문에 계산되지 않음.
실시예 7: 세미플리맙과 병용 시 CD38xCD28 이중특이적 항체의 특성 분석
전술한 바와 같이, CD38xCD28 이중특이적 항체는, 기존 "신호 1"이 존재할 때 T 세포의 활성화를 향상시키기 위해 공동 자극 "신호 2"를 제공하도록, CD38+ 표적 세포를 CD28+ T 세포와 가교시킴으로써, CD28의 천연 리간드를 모방하도록 설계하였다. 이러한 경우에, 종양 세포주, NALM-6 상에서 비자기 결정인자의 T 세포에 의한 인식은 동종 반응을 유도하여, '신호 1'을 제공한다. 공자극 신호 이외에, T 세포 활성을 감소시키는 역할을 하는 억제 신호도 존재한다. T 세포 상의 세포 예정사멸 단백질 1 수용체(PD-1)를 APC 상의 이의 리간드 PD-L1에 연결하면 CD28 및 TCR 복합체에 대한 포스파타아제가 동원되는데(Zou and Chen의 문헌[Inhibitory B7-family molecules in the tumor microenvironment. Nature Reviews Immunology 2008; 8: 467-477]; Francisco 등의 문헌[The PD-1 pathway in tolerance and autoimmunity. Immunol Rev 2010; 236: 219-242]; Hui 등의 문헌[T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition. Science. 2017;355(6332): 1428-33]), 이는 TCR 신호전달 및 CD28 자극을 차례로 무력화시킨다. CD38xCD28 이중특이적 항체와 조합하여 길항제 항체 세미플리맙과 PD-1/PD-L1의 상호작용을 차단하면 T 세포 기능을 강화시키고 암과 같은 표적 세포의 사멸을 촉진할 수 있다.
본 실시예에서, IL2 및 IFNγ 방출에 의해 결정된 것과 같이, CD38 및 CD28을 결합하여 "신호 2"를 전달함으로써 인간 일차 T 세포를 활성화시키는 CD38xCD28 이중특이적 항체의 능력을, PD-L1을 발현하도록 조작된 CD38+ 인간 급성 림프모구성 백혈병 세포주(NALM-6/hPD-L1)의 존재 하에 평가하였다. NALM-6 세포는 "신호 1"의 역할을 하기에 충분한 동종 TCR 반응을 제공한다. 고정 농도의 PD-1 길항제 항체, 세미플리맙의 첨가도 평가하였다.
인간 일차 CD3 + T 세포의 단리:
제조사의 권장 프로토콜에 따라, EasySep?? 인간 PBMC 직접 단리 키트(Direct Human PBMC Isolation Kit)를 사용하여, Precision for Medicine의 건강한 공여자 백혈구 팩(공여자 555192)팩으로부터 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 단리하고 냉동시켰다. 냉동된 PBMC의 바이알을 해동하여 CD3+ T 세포를 단리하였다. StemCell Technologies의 EasySep?? 인간 CD3+ T 세포 단리 키트를 사용하여 제조사의 권장 지침에 따라, 공여자 PBMC를 CD3+ T 세포에 대해 농축시켰다.
IL2 및 IFNγ 방출 검정:
농축된 CD3+ T 세포를 자극 배지에 재현탁하고, 96-웰 둥근 바닥 플레이트에 1x105 세포/웰의 농도로 첨가하였다. hPD-L1을 발현하도록 조작된 NALM-6 세포 또는 NALM-6 세포를 5 x 104 세포/웰의 최종 농도로 CD3+ T 세포에 첨가하였다. 이어서, bsAb6031, bsAb7945, 및 비-TAAxCD28을 0.76pM 내지 50nM의 1:4 희석물로 적정하여 웰에 첨가하였다. 10점 희석의 마지막 지점에는 적정된 항체가 포함되지 않았다. 적정된 항체를 첨가한 후, 20nM의 세미플리맙 또는 일치하는 이소형 대조군(IsoC-2)의 일정량을 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 72시간 동안 인큐베이션하고, 50 ｕL의 총 상청액을 꺼내고, 수집한 상청액 중 5 ｕL를 사용해 IL2 및 IFNγ를 측정하였다. 검정 상청액 중 사이토카인의 양을 제조사의 프로토콜에 따라 PerkinElmer의 AlphaLisa 키트를 사용하여 결정하였다. Perkin Elmer의 다중 표지 플레이트 판독기 Envision을 이용해 사이토카인 측정치를 획득하고, 값을 pg/mL 단위로 보고하였다. 모든 연속 희석물은 3번 시험하였다.
항체의 EC50 값은 GraphPad Prism?? 소프트웨어를 사용해 10점 투여량-반응 곡선에 대한 4-파라미터 로지스틱 방정식으로 결정하였다. 최대 사이토카인은 시험된 투여량 범위 내에서 검출된 평균 최대 반응으로 주어진다.
결과:
PD-L1을 발현하도록 조작된 동종이형 NALM-6 세포 또는 NALM-6 세포가 존재할 때, CD38xCD28 항체 치료제(bsAb6031 및 bsAb7945)는 일치하는 이소형 대조군(IsoC-1)에 비해 IL-2 방출의 투여량 의존적으로 증가시켰다. NALM-6/PD-L1 세포가 존재하는 조건에서, 최대 IL-2 방출을 NALM-6(PD-L1을 발현하지 않음)과 비교하였다. PD-L1을 발현하지 않는 NALM-6 세포가 존재하는 조건에서, 세미플리맙의 첨가는 IL-2 방출에 영향을 미치지 않았다. 그러나, PD-L1을 발현하는 NALM-6 세포가 존재하는 가운데 세미플리맙을 첨가했을 때, 세미플리맙에 대한 일치하는 이소형 대조군 IsoC-2를 첨가한 후에 방출된 IL-2와 비교하여, 최대 IL-2 방출이 증가하였는데, 이는 PD-1과 PD-L1의 상호작용을 차단하는 것이 T 세포 기능을 강화시킬 수 있음을 시사한다.
따라서, "신호 1"의 역할을 하기에 충분한 CD38+ NALM-6/hPD-L1 세포에 의해 제공된 동종 TCR 반응의 존재할 때, IL2 및 IFNγ 방출에 의해 결정된 것과 같이, CD38xCD28 이중특이적 항체는 CD38과 CD28을 결합하여 "신호 2"를 전달함으로써 인간 일차 T 세포를 활성화시킨다.
항체의 최대 IL2 방출 및 역가 값
NALM-6 NALM-6/hPD-L1
항체 최대 (pg/mL) EC 50 [M] 최대 (pg/mL) EC 50 [M]
bsAb6031 + 세미플리맙 1216.28 2.44E-09 614.28 4.39E-09
bsAb6031 + IgG4P 1219.58 1.68E-09 240.39 2.64E-09
bsAb7945 + 세미플리맙 3978.67 9.81E-11 2462.25 1.43E-10
bsAb7945 + IgG4P 4204.95 1.33E-10 952.66 1.69E-10
비-TAAxCD28 + 세미플리맙 134.53 ND 101.61 ND
비-TAAxCD28 + IgG4P 125.33 ND 31.52 ND
약어: ND: 미 결정
항체의 최대 IFNγ 방출 및 역가 값
NALM-6 NALM-6/hPD-L1
항체 최대 (pg/mL) EC 50 [M] 최대 (pg/mL) EC 50 [M]
bsAb6031 + 세미플리맙 380.19 NC 1.00 NC
bsAb6031 + IgG4P 288.95 NC 1.00 NC
bsAb7945 + 세미플리맙 1619.64 NC 1239.90 NC
bsAb7945 + IgG4P 1649.24 NC 701.11 NC
비-TAAxCD28 + 세미플리맙 332.72 ND 14.07 ND
비-TAAxCD28 + IgG4P 85.64 ND 1.00 ND
약어: ND: 미결정; NC: 데이터가 4-파라미터 로지스틱 방정식에 적합하지 않았기 때문에 계산되지 않음.
실시예 8: 인간 PBMC에서 BCMA 및 CD38 발현 표적 세포에 대한 CD38xCD28 이중특이적 항체
H929 세포(CD38+ 다발성 골수종 세포주)를 표적으로 하는 96시간 세포독성 검정에서 CD38xCD28에 의한 BCMAxCD3 표적화 사멸 강화를 평가하였다. 간략하게, 인간 PBMC를 RPMI 보충 배지에 1x106 세포/mL로 도말하고, 부착성 대식세포, 수지상 세포, 및 일부 단핵구를 고갈시켜 림프구를 농축시키기 위해 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음 날, H929 세포를 1uM의 형광 추적 염료 CFDA-SE로 표지하고, 부착 세포가 고갈된 미접촉 PBMC를 1uM의 형광 추적 염료 CellTrace Violet으로 표지하였다. 표지된 표적 세포 및 PBMC(작동자/표적 세포 4:1 비율)를 고정된 30 pM 농도의 BCMAxCD3(bsAb5458) 또는 IgG4P-PVA 이소형 대조군 H4sH10154P3와 함께 연속 희석물로 공동 배양하였다(농도 범위: 33 nM 내지 0.71 pM). BCMAxCD3 또는 IgG4P-PVA가 포함된 웰도 포함시켰다. 37℃에서 96시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트로부터 세포를 수확하고 FACS BD LSRFortessa-X20을 이용해 FACS로 분석하였다. 사이토카인 분석을 위해 상청액을 제거한 후, 세포를 차가운 PBS로 세척하고, LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell 염색으로 염색하여 생존 세포를 식별하였다. NCI-H929 살해를 평가하기 위해, 살아있는 보라색 표지된 집단에서 세포를 게이팅하였다. 생존 모집단 백분율을 기록하고 생존율 계산에 사용하였다. 생존 백분율을 대조군 조건(PBMC만이 존재할 때의 표적 세포)에 대해 정규화하였다.
T 세포 활성화는, CD2, CD4, CD8, 및 CD25에 직접 접합된 항체와 함께 세포를 인큐베이션하여 평가하였다. CD2+/CD4+ 또는 CD2+/CD8+ T 세포에 대한 CD25의 형광 강도(MFI)의 중앙값을 T 세포 활성화의 척도로서 보고하였다. 또한, T 세포가 증식함에 따라, CellTraceViolet을 희석하여 FACS에 의해 측정했을 때 MFI를 낮춘다. 따라서, T 세포 증식은 CD2+/CD4+ 또는 CD2+/CD8+ T 세포에 대한 CellTraceViolet의 MFI의 감소로서 보고하였다.
사이토카인 수준의 분석을 위해 본 검정의 상청액을 수집하였다. IL 17a, IFNγ, TNFα, IL-10, IL-6, IL-4, 및 IL-2의 농도를 제조사의 지침에 따라 Cytometric Bead Array (CBA) 키트를 사용하여 분석하였다. 사이토카인 수준을 키트 표준물질에 의해 생성된 곡선으로부터 보간하고 pg/mL 단위로 보고하였다. 표적 세포 살해, T 세포 활성화, 증식, 및 사이토카인 수준에 대한 EC50 값, 및 최대 사이토카인 수준을 Prism 소프트웨어에서 4-파라미터 비선형 회귀 분석을 사용하여 계산하였다.
결과:
공자극성 항-CD38xCD28 이중특이적 항체 bsAb6031 및 bsAb7954가 H929 표적 세포 살해를 향상시키고 BCMAxCD3 이중특이적 항체 bsAb5458에 의해 매개된 T 세포 활성화를 향상시키는 능력에 대해 시험하였다. 또한, 비자극성 이소형 대조군이 존재할 때 표적 세포 및 T 세포 활성화를 매개하는 능력에 대해 bsAb6031 및 bsAb7954를 평가하였다.
- bsAb6031 및 bsAb7954는 시험된 2명의 공여자에서 30 pM BCMAxCD3에 의해 매개된 세포독성을 각각 5.2 nM 및 0.24 nM의 평균 EC50으로 강화하였으며, 최대 세포독성은 30 pM BCMAxCD3 하나만 존재할 때의 세포독성에 비해 각각 64% 및 93% 증가하였다. 30 pM 이소형 대조군의 존재 하에, bsAb6031 및 bsAb7954는 중간 정도의 세포독성을 매개하였고, 30 pM 이소형 대조군 하나만 존재할 때에 비해 평균적으로 각각 4% 및 5% 증가하였다(표 15, 도 1).
- 관찰된 표적 세포 용해는 CD4+ 및 CDCD8+ T 세포 상에서 CD25 상향조절에 의해 측정된 것과 같이 T 세포 활성화와 관련이 있었다. bsAb6031 및 bsAb7954는 시험된 2명의 공여자에서 30 pM BCMAxCD3에 의해 매개된 CD4 T 세포 활성화를 강화하였으며, 평균 EC50은 각각 3.1 nM 및 0.20 nM이었고, 최대 CD25 MFI에서 평균 배수 증가는 30 pM BCMAxCD3 하나만 존재할 때의 CD25 MFI에 비해 각각 10배 및 50배였다. bsAb6031 및 bsAb7954는 시험된 2명의 공여자에서 30 pM BCMAxCD3에 의해 매개된 CD8 T 세포 활성화를 강화시켰으며, 평균 EC50은 각각 2.3 nM 및 0.24 nM이었고, 최대 CD25 MFI에서의 평균 배수 증가는 30 pM BCMAxCD3 하나만 존재할 때의 CD25 MFI에 비해 각각 5배 및 8배였다. 30 pM 이소형 대조군이 존재할 때, bsAb6031 및 bsAb7954는 30 pM 이소형 대조군 하나만 존재할 때에 비해 중간 정도의 CD4+ T 세포 활성화(각각 5배 및 8배) 및 CD8+ T 세포 활성화(각각 6.5배 및 10배)를 매개하였다. EC50 값을 얻을 수 없었다(표 16, 도 2).
- 관찰된 표적 세포 용해는 CD4+ 및 CDCD8+ T 세포에서 CellTrace violet 증식 염료의 희석에 의해 측정된 것과 같이 T 세포 증식과 관련이 있었다. bsAb6031은 시험한 2명의 공여자 중 하나에서 30 pM BCMAxCD3에 의해 매개된 CD4 T 세포 및 CD8 T 세포 증식을 향상시켰다. bsAb7954는 시험한 2명의 공여자에서 30 pM BCMAxCD3에 의해 매개된 CD4 T 세포 및 CD8 T 세포 증식을 강화하였으며, 평균 EC50은 각각 0.59 nM 및 0.41 nM이었고, 평균 증식 증가율은 30 pM BCMAxCD3 단독에 의해 매개된 증식에 비해 각각 62배 및 69배였다.
bsAb6031 및 bsAb7945는 30 pM 이소형 대조군이 존재할 때 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 증식을 유도하지 않았다(표 17, 도 3).
- 30 pM BCMAxCD3에 의해 매개된 사이토카인 방출은 bsAb6031 및 bsAb7945이 존재할 때 강화되었다. 구체적으로, bsAb6031은 30 pM BCMAxCD3 단독에 비해 IFNg, IL-2, IL-4, IL-10, 및 TNFa의 최대 농도를 2~7배 증가시켰지만, EC50은 계산할 수 없었다. 30 pM 이소형 대조군이 존재할 때, bsAb6031은 IFNg 및 TNFa 농도를 30 pM 이소형 대조군 단독에 비해 2배 증가시켰다. bsAb7954는 최대 bsAb7954 농도에서 IFNg, IL-2, IL-4, IL-10, 및 TNFa의 농도를 2~13배 증가시켰으며, 계산 가능할 때의 EC50은 0.21 nM~1.5 nM이었다. (표 18, 도 4).
요약하면, 공동 자극은 BCMAxCD3 단독에서 관찰된 것과 비교했을 때, 표적화된 세포독성, T 세포 활성화, 및 사이토카인 방출의 효능을 증가시켰다.
H929 표적에 대한 세포독성의 EC50 값
세포독성
공여자 1 공여자 2
EC50 [M] 최대 증가율 (%) EC50 [M] 최대 증가율 (%)
bsAb6031 + TAAxCD3 5.37E-09 92 4.95E-09 35
bsAb7945 + TAAxCD3 2.86E-10 94 1.87E-10 92
bsAb6031 + IgG4P-PVA ND 5 ND 3
bsAb7945 + IgG4P-PVA ND 0 NC 11
약어: ND: 미결정; NC: 데이터가 4-파라미터 로지스틱 방정식에 적합하지 않았기 때문에 계산되지 않음.
증가율 (%): 100*((생존율(%)(SO) - 생존율(%)(SC))/생존율(%) MFI(SO))
여기서 “SO”는 30pM TAAxCD3 또는 30 pM IgG4P-PVA 단독이고, “SC”는 최고 농도에 CD38xCD28 공동자극이 수반된 30pM TAAxCD3 또는 30 pM IgG4P-PVA임.
T 세포 활성화에 대한 EC50 값(CD25의 상향 조절)
CD4 T 세포 활성화 CD8 T 세포 활성화
공여자 1 공여자 2 공여자 1 공여자 2
EC50 [M] 배수 최대값 (MFI) EC50 [M] 배수 최대값 (MFI) EC50 [M] 배수 최대값 (MFI) EC50 [M] 배수 최대값 (MFI)
bsAb6031 + TAAxCD3 5.22E-09 9 1.06E-09 11 3.63E-09 6 9.86E-10 4
bsAb7945 + TAAxCD3 2.03E-10 11 1.97E-10 89 2.93E-10 6 1.78E-10 10
bsAb6031 + IgG4P-PVA ND 1 ND 0 ND 0 ND 13
bsAb7945 + IgG4P-PVA ND 3 4.59E-10 11 ND 1 NC 19
약어: ND: 미결정; NC: 데이터가 4-파라미터 로지스틱 방정식에 적합하지 않았기 때문에 계산되지 않음.
최대 배수: CD25 MFI(SC) /CD25 MFI(SO)
여기서 “SO”는 30pM TAAxCD3 또는 30 pM IgG4P-PVA 단독이고, “SC”는 최고 농도에 CD38xCD28 공동자극이 수반된 30pM TAAxCD3 또는 30 pM IgG4P-PVA임.
T 세포 증식에 대한 EC50 값 (CellTrace Violet의 희석물)
CD4 T 세포 증식 CD8 T 세포 증식
공여자 1 공여자 2 공여자 1 공여자 2
EC50 [M] 증가율 (%) EC50 [M] 증가율 (%) EC50 [M] 증가율 (%) EC50 [M] 증가율 (%)
bsAb6031 + TAAxCD3 NC 56 ND 0 5.67E-09 56 ND 5
bsAb7945 + TAAxCD3 5.67E-10 70 6.20E-10 54 4.96E-10 64 3.25E-10 74
bsAb6031 + IgG4P-PVA ND 1 ND -2 ND 1 ND 8
bsAb7945 + IgG4P-PVA ND 1 ND 0 ND 0 ND -14
약어: ND: 미결정; NC: 데이터가 4-파라미터 로지스틱 방정식에 적합하지 않았기 때문에 계산되지 않음.
증가율 (%): 100*((CellTraceViolet MFI(SO) - CellTraceViolet MFI(SC))/CellTraceViolet MFI(SO))
여기서 “SO”는 30pM TAAxCD3 또는 30 pM IgG4P-PVA 단독이고, “SC”는 최고 농도에 CD38xCD28 공동자극이 수반된 30pM TAAxCD3 또는 30 pM IgG4P-PVA임.
H929 세포독성 검정 상청액 중 사이토카인(공여자 1만 해당)
bsAb6031 + TAAxCD3 bsAb7945 + TAAxCD3 bsAb6031 + IgG4P-PVA bsAb7945 + IgG4P-PVA
IFNg EC50 NC 5.79E-10 NC ND
최대 23 46 19 4
최대 배수 3 10 4 1
IL2 EC50 NC 4.37E-10 NC ND
최대 20 27 12 11
최대 배수 2 2 1 1
IL4 EC50 NC 1.58E-09 ND ND
최대 17 21 10 10
최대 배수 2 2 1 1
IL6 EC50 ND ND ND ND
최대 39 30 18 14
최대 배수 1 1 1 1
IL-10 EC50 ND ND ND ND
최대 104 160 12 12
최대 배수 7 13 1 1
TNFa EC50 NC 2.11E-10 NC ND
최대 128 201 26 25
최대 배수 3 10 2 1
IL17 EC50 ND ND ND ND
최대 8 8 9 8
최대 배수 1 1 1 1
약어: ND: 미결정; NC: 데이터가 4-파라미터 로지스틱 방정식에 적합하지 않았기 때문에 계산되지 않음.
최대 배수: 사이토카인 pg/ml(SC)/사이토카인 pg/ml(SO)
여기서 “SO”는 30pM TAAxCD3 또는 30 pM IgG4P-PVA 단독이고, “SC”는 최고 농도에 CD38xCD28 공동자극이 수반된 30pM TAAxCD3 또는 30 pM IgG4P-PVA임.
실시예 9: 4 mg/kg BCMA x CD3 이중특이적 항체와 조합된 CD38 x CD28 이중특이적 항체가 BCMA + CD38 + MOLP-8 인간 다발성 골수종 종양 성장에 미치는 생체 내 효능
BCMAxCD33 bsAb와 조합된 CD38xCD28 이중특이적 항체(bsAb)의 생체 내 항종양 효능을 결정하기 위해, 이종 종양 연구를 수행하였다. -13일차에, 면역 결핍 NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) 마우스(8~10주령, Jackson Labs, CAT#: 005557)에게 정상적인 건강한 공여자 유래의 4x106개의 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)(Reach Bio, CAT#: 0500-301, Lot# 0160506)을 복강내 주사하였다. 0일 차에, 마우스에게 반딧불 루시퍼라아제(MOLP-8-루시퍼라아제 세포)를 또한 발현하도록 조작된 2x106개의 BCMA+CD38+ MOLP-8 인간 다발성 골수종 종양 세포(DSMZ, CAT#: ACC569)를 정맥 내 투여하였다. 그 직후에, 마우스(n=5/군)에게 4 mg/kg의 CD3-결합 음성 대조군 이중특이적 Ab(H4sH17664D) 또는 BCMAxCD3(bsAb5458) bsAb를 4 mg/kg의 CD28-결합 음성 대조군 이중특이적 Ab 또는 CD38xCD28 bsAb(bsAb6031 또는 bsAb7945 중 하나)와 병용 투여하였다. 7일차 및 14일차에 마우스에게 이들 항체를 2회 더 투여하여 총 3회 투여량을 투여하였다. 마취된 동물에서 종양 생물발광(BLI)을 측정함으로써 52일에 걸쳐 종양 성장을 평가하였다. 양성 대조군으로서, 마우스 군(n=5)에게는 MOLP-8-루시퍼라아제 세포 및 PBMC만 투여하고, 항체는 투여하지 않았다(PBS-처리군). 배경 BLI 수준을 측정하기 위해, 마우스 군(n=5)을 치료하지 않았고, 종양, PBMC, 또는 항체를 투여받지 않았다(무종양군).
이종 종양 성장의 측정
BLI 이미징을 사용해 종양 부담을 측정하였다. PBS에 현탁한 150 mg/kg의 루시퍼라아제 기질 D-루시페린을 마우스에게 IP 주입하였다. 투여하고 5분 후, 마우스를 이소플루란으로 마취시킨 상태에서 Xenogen IVIS 시스템을 사용하여 BLI 이미징을 수행하였다. 이미지는, 화각: D; 피사체 높이: 1.5 cm; 비닝 수준: 중간(medium)으로 설정항 상태에서 Living Image 소프트웨어에 의해 결정된 자동 노출 시간으로 획득하였다. BLI 신호를 Living Image 소프트웨어를 사용하여 추출하였다: 관심 영역을 각각의 종양 질량 주위에 그리고, 광자 강도를 총 플럭스(광자/초 - p/s)로서 기록하였다.
결과:
BCMAxCD3 bsAb의 단일 요법은 중간 정도의 항종향 효능을 제공하며, 평균 BLI 판독값은 대조군에 비해 감소하였다. CD38xCD28 bsAb6031은 단일 요법으로서는 어떠한 활성도 유도하지 않지만, bsAb7945는 단일 요법 활성을 발휘하고, 평균 BLI 판독값은 대조군에 비해 약간 감소한다. 그러나, BCMAxCD3 bsAb + CD38xCD28 bsAb의 조합은 어떠한 단일 요법보다 낮은 평균 BLI 판독값을 생성한다. 표 19 내지 29 및 도 5 참조.
따라서, 이들 연구는, BCMAxCD3 bsAb 또는 CD38xCD28 bsAb 중 하나를 사용한 단일요법이 적당한 항종양 효능만을 입증하지만, BCMAxCD3 bsAb + CD38xCD28 bsAb를 사용한 병용 치료는 어느 하나의 요법 단독보다 우월한 보다 강력한, 조합 항종양 효능을 생성함을 입증한다.
9일차의 종양 부담 및 생존 마우스
항체
치료 		9일차의 종양 부담 - 평균 총 플럭스(p/s) 9일차의 총 플럭스 SEM 9일차에 여전히 살아있는 마우스의 수
PBS 비히클 5.74E+05 1.39E+04 5/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 6.70E+05 2.94E+04 5/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) + bsAb6031 (4mg/kg) 6.74E+05 3.42E+04 5/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) + bsAb7945 (4mg/kg) 6.41E+05 6.46E+04 5/5
BCMAxCD3 bsAb (4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 6.55E+05 4.61E+04 5/5
BCMAxCD3 bsAb (4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 6.17E+05 2.23E+04 5/5
BCMAxCD3 bsAb (4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 5.97E+05 2.06E+04 5/5
무종양 (배경 BLI) 5.14E+05 6.59E+03 4/4
13일차의 종양 부담 및 생존 마우스
항체
치료 		13일차의 종양 부담 - 평균 총 플럭스(p/s) 13일차의 총 플럭스 SEM 13일차에 여전히 살아있는 마우스의 수
PBS 비히클 1.33E+06 2.90E+05 5/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 1.59E+06 3.30E+05 5/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) + bsAb6031 (4mg/kg) 9.76E+05 2.01E+05 5/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) + bsAb7945 (4mg/kg) 6.17E+05 4.39E+04 5/5
BCMAxCD3 bsAb (4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 6.42E+05 4.02E+04 5/5
BCMAxCD3 bsAb (4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 6.85E+05 5.45E+04 5/5
BCMAxCD3 bsAb (4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 5.55E+05 3.26E+04 5/5
무종양 (배경 BLI) 5.19E+05 4.67E+04 4/4
16일차의 종양 부담 및 생존 마우스
항체
치료 		16일차의 종양 부담 - 평균 총 플럭스(p/s) 16일차의 총 플럭스 SEM 16일차에 여전히 살아있는 마우스의 수
PBS 비히클 5.12E+06 1.68E+06 5/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 7.05E+06 1.64E+06 5/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) + bsAb6031 (4mg/kg) 1.69E+06 5.68E+05 5/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) + bsAb7945 (4mg/kg) 8.81E+05 2.70E+05 5/5
BCMAxCD3 bsAb (4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 6.05E+05 4.20E+04 5/5
BCMAxCD3 bsAb (4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 4.78E+05 1.30E+04 5/5
BCMAxCD3 bsAb (4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 6.99E+05 5.42E+04 5/5
무종양 (배경 BLI) 3.84E+05 2.37E+04 4/4
20일차의 종양 부담 및 생존 마우스
항체
치료 		20일차의 종양 부담 - 평균 총 플럭스(p/s) 20일차의 총 플럭스 SEM 20일차에 여전히 살아있는 마우스의 수
PBS 비히클 1.53E+07 3.29E+06 5/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 1.46E+07 4.10E+06 5/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) + bsAb6031 (4mg/kg) 5.19E+06 2.21E+06 5/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) + bsAb7945 (4mg/kg) 1.17E+06 3.39E+05 5/5
BCMAxCD3 bsAb (4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 7.79E+05 1.27E+05 5/5
BCMAxCD3 bsAb (4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 5.10E+05 1.97E+04 5/5
BCMAxCD3 bsAb (4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 6.56E+05 4.70E+04 5/5
무종양 (배경 BLI) 5.55E+05 2.93E+04 4/4
24일차의 종양 부담 및 생존 마우스
항체
치료 		24일차의 종양 부담 - 평균 총 플럭스(p/s) 24일차의 총 플럭스 SEM 24일차에 여전히 살아있는 마우스의 수
PBS 비히클 4.36E+07 5.76E+06 5/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 4.27E+07 2.03E+07 4/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) + bsAb6031 (4mg/kg) 1.90E+07 4.69E+06 5/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) + bsAb7945 (4mg/kg) 1.78E+06 7.82E+05 5/5
BCMAxCD3 bsAb (4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 1.54E+06 6.90E+05 5/5
BCMAxCD3 bsAb (4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 4.27E+05 1.83E+04 5/5
BCMAxCD3 bsAb (4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 5.45E+05 2.82E+04 5/5
무종양 (배경 BLI) 3.52E+05 3.36E+04 4/4
28일차의 종양 부담 및 생존 마우스
항체
치료 		28일차의 종양 부담 - 평균 총 플럭스(p/s) 28일차의 총 플럭스 SEM 28일차에 여전히 살아있는 마우스의 수
PBS 비히클 8.23E+07 1.52E+07 4/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 6.63E+06 0.00E+00 1/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) + bsAb6031 (4mg/kg) 6.45E+07 1.21E+07 5/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) + bsAb7945 (4mg/kg) 2.99E+06 1.49E+06 5/5
BCMAxCD3 bsAb (4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 3.99E+06 2.11E+06 5/5
BCMAxCD3 bsAb (4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 5.87E+05 9.24E+04 5/5
BCMAxCD3 bsAb (4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 6.06E+05 8.62E+04 5/5
무종양 (배경 BLI) 4.17E+05 1.28E+04 4/4
31일차의 종양 부담 및 생존 마우스
항체
치료 		31일차의 종양 부담 - 평균 총 플럭스(p/s) 31일차의 총 플럭스 SEM 31일차에 여전히 살아있는 마우스의 수
PBS 비히클 1.29E+08 4.60E+07 3/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 4.30E+07 0.00E+00 1/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) + bsAb6031 (4mg/kg) 6.94E+07 1.54E+07 5/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) + bsAb7945 (4mg/kg) 9.25E+06 5.75E+06 5/5
BCMAxCD3 bsAb (4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 8.59E+06 2.73E+06 5/5
BCMAxCD3 bsAb (4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 7.16E+05 1.49E+05 5/5
BCMAxCD3 bsAb (4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 9.85E+05 2.07E+05 5/5
무종양 (배경 BLI) 4.19E+05 6.81E+04 4/4
36일차의 종양 부담 및 생존 마우스
항체
치료 		36일차의 종양 부담 - 평균 총 플럭스(p/s) 36일차의 총 플럭스 SEM 36일차에 여전히 살아있는 마우스의 수
PBS 비히클 0/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 0/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) + bsAb6031 (4mg/kg) 2.72E+08 2.22E+08 3/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) + bsAb7945 (4mg/kg) 1.49E+07 1.01E+07 5/5
BCMAxCD3 bsAb (4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 3.76E+07 2.51E+07 5/5
BCMAxCD3 bsAb (4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 8.78E+05 2.06E+05 5/5
BCMAxCD3 bsAb (4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 2.25E+06 7.72E+05 5/5
무종양 (배경 BLI) 4.45E+05 1.88E+04 4/4
38일차의 종양 부담 및 생존 마우스
항체
치료 		38일차의 종양 부담 - 평균 총 플럭스(p/s) 38일차의 총 플럭스 SEM 38일차에 여전히 살아있는 마우스의 수
PBS 비히클 0/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 0/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) + bsAb6031 (4mg/kg) 4.56E+08 3.74E+08 3/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) + bsAb7945 (4mg/kg) 1.29E+07 7.25E+06 5/5
BCMAxCD3 bsAb (4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 5.80E+07 3.35E+07 5/5
BCMAxCD3 bsAb (4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 1.27E+06 4.32E+05 5/5
BCMAxCD3 bsAb (4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 5.46E+06 2.11E+06 5/5
무종양 (배경 BLI) 5.23E+05 2.30E+04 4/4
45일차의 종양 부담 및 생존 마우스
항체
치료 		45일차의 종양 부담 - 평균 총 플럭스(p/s) 45일차의 총 플럭스 SEM 45일차에 여전히 살아있는 마우스의 수
PBS 비히클 0/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 0/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) + bsAb6031 (4mg/kg) 5.75E+08 2.74E+08 2/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) + bsAb7945 (4mg/kg) 7.04E+06 5.64E+06 4/5
BCMAxCD3 bsAb (4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 8.75E+07 3.56E+07 4/5
BCMAxCD3 bsAb (4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 4.84E+06 2.62E+06 5/5
BCMAxCD3 bsAb (4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 2.10E+07 1.20E+07 5/5
무종양 (배경 BLI) 5.11E+05 2.68E+04 4/4
52일차의 종양 부담 및 생존 마우스
항체
치료 		52일차의 종양 부담 - 평균 총 플럭스(p/s) 52일차의 총 플럭스 SEM 52일차에 여전히 살아있는 마우스의 수
PBS 비히클 0/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 0/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) + bsAb6031 (4mg/kg) 4.47E+08 0.00E+00 1/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) + bsAb7945 (4mg/kg) 1.82E+07 1.73E+07 4/5
BCMAxCD3 bsAb (4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 2.24E+08 9.11E+07 4/5
BCMAxCD3 bsAb (4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 1.26E+07 7.44E+06 5/5
BCMAxCD3 bsAb (4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 3.60E+07 1.92E+07 5/5
무종양 (배경 BLI) 4.40E+05 4.30E+04 4/4
실시예 10: 0.4 mg/kg 또는 0.04 mg/kg BCMA x CD3 이중특이적 항체와 조합된 CD38 x CD28 이중특이적 항체가 BCMA+CD38+ MOLP-8 인간 다발성 골수종 종양 성장에 미치는 생체 내 효능
BCMAxCD33 bsAb와 조합된 CD38xCD28 이중특이적 항체(bsAb)의 생체 내 항종양 효능을 결정하기 위해, BCMA+CD38+ MOLP-8 인간 다발성 골수종 종양 세포로 이종 종양 연구를 수행하였다. 본 실험은 BCMAxCD3 bsAb의 투여량이 4 mg/kg에서 0.4 mg/kg 또는 0.04 mg/kg으로 감소되었다는 것을 제외하고는, 실시예 9에서 전술한 것과 유사하였다. 또한, 본 실시예에서의 실험 기간은 40일로, 실시예 9에서의 52일보다 더 짧았다.
-12일차에, 면역 결핍 NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) 마우스(8~10주령, Jackson Labs, CAT#: 005557)에게 정상적인 건강한 공여자 유래의 4x106개의 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)(Reach Bio, CAT#: 0500-301, Lot# 0180821)을 복강내 주사하였다. 0일 차에, 마우스에게 반딧불 루시퍼라아제(MOLP-8-루시퍼라아제 세포)를 또한 발현하도록 조작된 2x106개의 BCMA+CD38+ MOLP-8 인간 다발성 골수종 종양 세포(DSMZ, CAT#: ACC569)를 정맥 내 투여하였다. 그 직후에, 마우스(n=4~5/군)에게 CD3-결합 음성 대조군 이중특이적 Ab(H4sH17664D, 0.4 mg/kg) 또는 BCMAxCD3 bsAb(bsAb5458; 0.4 mg/kg 또는 0.04 mg/kg)를 4 mg/kg의 CD28-결합 음성 대조군 이중특이적 Ab(bsAb5671) 또는 CD38xCD28 bsAb(bsAb6031 또는 bsAb7945 중 하나)와 병용 투여하였다. 7일차 및 14일차에 마우스에게 이들 Ab를 2회 더 투여하여 총 3회 투여량을 투여하였다. 마취된 동물에서 종양 생물발광(BLI)을 측정함으로써 40일에 걸쳐 종양 성장을 평가하였다. 양성 대조군으로서, 마우스 군(n=4)에게는 MOLP-8-루시퍼라아제 세포 및 PBMC만 투여하고, 항체는 투여하지 않았다(PBS-처리군). 배경 BLI 수준을 측정하기 위해, 마우스 군(n=5)을 치료하지 않았고, 종양, PBMC, 또는 항체를 투여받지 않았다(무종양군).
이종 종양 성장의 측정
BLI 이미징을 사용해 종양 부담을 측정하였다. PBS에 현탁한 150 mg/kg의 루시퍼라아제 기질 D-루시페린을 마우스에게 IP 주입하였다. 투여하고 5분 후, 마우스를 이소플루란으로 마취시킨 상태에서 Xenogen IVIS 시스템을 사용하여 BLI 이미징을 수행하였다. 이미지는, 화각: D; 피사체 높이: 1.5 cm; 비닝 수준: 중간(medium)으로 설정항 상태에서 Living Image 소프트웨어에 의해 결정된 자동 노출 시간으로 획득하였다. BLI 신호를 Living Image 소프트웨어를 사용하여 추출하였다: 관심 영역을 각각의 종양 질량 주위에 그리고, 광자 강도를 총 플럭스(광자/초 - p/s)로서 기록하였다.
결과:
BCMAxCD3 bsAb(0.4 mg/kg 또는 0.04 mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb는 중간 정도 내지는 유의한 항종향 활성을 제공하였으며, 평균 BLI 판독값은 CD3-결합 음성 대조군 bsAb + CD28-결합 음성 대조군 bsAb를 투여한 마우스에 비해 감소하였다(각각 표 30의 3열 및 10열). CD3-결합 음성 대조군 bsAb + CD38xCD28 bsAb(bsAb6031 및 bsAb7945)를 이용한 치료는 CD3-결합 음성 대조군 bsAb + CD28-결합 음성 대조군 bsAb를 투여한 마우스에 비해 평균 BLI 판독?냅? 중간 내지 유의하게 감소시켰다(각각 표 30의 1열 및 2열). 그러나, BCMAxCD3 bsAb(0.4 mg/kg 또는 0.04 mg/kg) + CD38xCD28 bsAb(bsAb6031 및 bsAb7945)의 조합은 BCMAxCD3 bsAb + CD28-결합 음성 대조군 bsAb를 투여한 마우스(표 30의 18, 9, 15, 및 16열), CD3-결합 음성대조군 bsAb + bsAb6031을 투여한 마우스마우스(표 30의 6 및 13열), 또는 CD3-결합 음성 대조군 bsAb + bsAb7945를 투여한 마우스(표 30의 7 및 14열)보다 유의하게 낮은 평균 BLI 판독값을 초래하였다. 또한 표 31~39 및 도 6 참조.
따라서, 이들 연구는, BCMAxCD3 bsAb 또는 CD38xCD28 bsAb 중 하나를 사용한 단일요법이 적당한 항종양 효능만을 입증하지만, BCMAxCD3 bsAb + CD38xCD28 bsAb를 사용한 병용 치료는 어느 하나의 요법 단독보다 우월한 보다 강력한, 조합 항종양 효능을 생성함을 입증한다.
29일차의 2원 ANOVA 통계:

비교 		29일차의 (2원 ANOVA에 의한) P 값
치료군 1 치료군 2
1 CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + bsAb6031 (4mg/kg) p=0.0214
2 CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + bsAb7945 (4mg/kg) P=0.0024
3 CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) p=0.0147
4 CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) p<0.0001
5 CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) p<0.0001
6 CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) p=0.0005
7 CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) p=0.0005
8 BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) p=0.0001
9 BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) p<0.0001
10 CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) BCMAxCD3 bsAb (0.04mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) p=0.0043
11 CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) BCMAxCD3 bsAb (0.04mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) p<0.0001
12 CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) BCMAxCD3 bsAb (0.04mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) p<0.0001
13 CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) BCMAxCD3 bsAb (0.04mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) p=0.0083
14 CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) BCMAxCD3 bsAb (0.04mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) p=0.0016
15 BCMAxCD3 bsAb (0.04mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) BCMAxCD3 bsAb (0.04mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) p=0.0128
16 BCMAxCD3 bsAb (0.04mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) BCMAxCD3 bsAb (0.04mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) P=0.0008
6일차의 종양 부담 및 생존 마우스
항체
치료 		6일차의 종양 부담 - 평균 총 플럭스(p/s) 6일차의 총 플럭스 SEM 6일차에 여전히 살아있는 마우스의 수
PBS 비히클 4.73E+05 3.23E+04 4/4
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 4.59E+05 2.29E+04 5/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + bsAb6031 (4mg/kg) 5.07E+05 1.18E+04 5/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + bsAb7945 (4mg/kg) 4.41E+05 1.31E+04 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 5.65E+05 3.84E+04 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 5.02E+05 1.47E+04 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 4.45E+05 2.80E+04 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.04mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 5.13E+05 2.88E+04 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.04mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 3.80E+05 2.67E+04 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.04mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 3.79E+05 1.60E+04 4/4
무종양 (배경 BLI) 5.13E+05 2.54E+04 5/5
9일차의 종양 부담 및 생존 마우스
항체
치료 		9일차의 종양 부담 - 평균 총 플럭스(p/s) 9일차의 총 플럭스 SEM 9일차에 여전히 살아있는 마우스의 수
PBS 비히클 5.90E+05 5.72E+04 4/4
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 6.06E+05 2.51E+04 5/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + bsAb6031 (4mg/kg) 4.66E+05 4.43E+04 5/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + bsAb7945 (4mg/kg) 3.49E+05 2.38E+04 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 5.44E+05 1.96E+04 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 4.56E+05 3.44E+04 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 4.19E+05 7.67E+03 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.04mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 6.16E+05 4.20E+04 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.04mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 3.68E+05 2.63E+04 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.04mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 3.90E+05 3.34E+04 4/4
무종양 (배경 BLI) 3.73E+05 1.23E+04 5/5
12일차의 종양 부담 및 생존 마우스
항체
치료 		12일차의 종양 부담 - 평균 총 플럭스(p/s) 12일차의 총 플럭스 SEM 12일차에 여전히 살아있는 마우스의 수
PBS 비히클 1.58E+06 2.88E+05 4/4
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 1.53E+06 1.97E+05 5/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + bsAb6031 (4mg/kg) 6.06E+05 3.81E+04 5/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + bsAb7945 (4mg/kg) 4.23E+05 2.23E+04 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 5.64E+05 3.49E+04 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 4.76E+05 2.40E+04 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 4.73E+05 1.85E+04 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.04mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 6.66E+05 1.02E+05 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.04mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 4.65E+05 1.92E+04 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.04mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 5.46E+05 3.09E+04 4/4
무종양 (배경 BLI) 4.72E+05 1.80E+04 5/5
16일차의 종양 부담 및 생존 마우스
항체
치료 		16일차의 종양 부담 - 평균 총 플럭스(p/s) 16일차의 총 플럭스 SEM 16일차에 여전히 살아있는 마우스의 수
PBS 비히클 6.61E+06 2.28E+06 4/4
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 9.63E+06 1.55E+06 5/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + bsAb6031 (4mg/kg) 1.66E+06 4.59E+05 5/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + bsAb7945 (4mg/kg) 4.91E+05 5.60E+04 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 1.25E+06 2.76E+05 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 4.80E+05 2.95E+04 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 4.89E+05 6.50E+03 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.04mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 2.95E+06 1.17E+06 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.04mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 6.21E+05 4.07E+04 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.04mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 5.54E+05 6.14E+04 4/4
무종양 (배경 BLI) 4.82E+05 3.37E+04 5/5
21일차의 종양 부담 및 생존 마우스
항체
치료 		21일차의 종양 부담 - 평균 총 플럭스(p/s) 21일차의 총 플럭스 SEM 21일차에 여전히 살아있는 마우스의 수
PBS 비히클 2.92E+07 1.81E+06 3/4
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 3.47E+07 7.52E+06 5/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + bsAb6031 (4mg/kg) 9.33E+06 3.19E+06 5/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + bsAb7945 (4mg/kg) 8.61E+05 3.23E+05 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 5.97E+06 2.50E+06 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 5.97E+05 3.55E+04 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 4.90E+05 2.85E+04 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.04mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 1.19E+07 4.65E+06 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.04mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 6.55E+05 1.12E+05 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.04mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 4.80E+05 2.04E+04 4/4
무종양 (배경 BLI) 4.27E+05 1.17E+04 5/5
26일차의 종양 부담 및 생존 마우스
항체
치료 		26일차의 종양 부담 - 평균 총 플럭스(p/s) 26일차의 총 플럭스 SEM 26일차에 여전히 살아있는 마우스의 수
PBS 비히클 5.14E+07 2.24E+07 3/4
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 8.02E+07 1.36E+07 5/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + bsAb6031 (4mg/kg) 3.41E+07 1.15E+07 5/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + bsAb7945 (4mg/kg) 4.59E+06 1.82E+06 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 1.61E+07 3.74E+06 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 9.57E+05 3.41E+05 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 4.78E+05 3.86E+04 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.04mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 3.37E+07 1.27E+07 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.04mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 2.80E+06 1.54E+06 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.04mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 6.59E+05 6.02E+04 4/4
무종양 (배경 BLI) 4.54E+05 2.72E+04 5/5
29일차의 종양 부담 및 생존 마우스
항체
치료 		29일차의 종양 부담 - 평균 총 플럭스(p/s) 29일차의 총 플럭스 SEM 29일차에 여전히 살아있는 마우스의 수
PBS 비히클 4.06E+07 7.54E+06 3/4
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 7.93E+07 3.61E+07 3/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + bsAb6031 (4mg/kg) 4.35E+07 1.48E+07 4/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + bsAb7945 (4mg/kg) 3.89E+07 2.53E+07 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 4.39E+07 7.99E+06 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 2.73E+06 1.80E+06 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 8.08E+05 1.78E+05 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.04mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 4.05E+07 1.90E+07 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.04mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 9.48E+06 5.22E+06 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.04mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 9.18E+05 1.36E+05 4/4
무종양 (배경 BLI) 4.99E+05 2.05E+04 5/5
33일차의 종양 부담 및 생존 마우스
항체
치료 		33일차의 종양 부담 - 평균 총 플럭스(p/s) 33일차의 총 플럭스 SEM 33일차에 여전히 살아있는 마우스의 수
PBS 비히클 0/4
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 0/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + bsAb6031 (4mg/kg) 3.76E+07 2.11E+07 2/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + bsAb7945 (4mg/kg) 2.11E+07 1.05E+07 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 7.44E+07 1.22E+07 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 8.04E+06 6.65E+06 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 1.40E+06 6.40E+05 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.04mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 4.15E+07 3.50E+07 2/5
BCMAxCD3 bsAb (0.04mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 2.58E+07 1.15E+07 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.04mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 1.12E+06 4.20E+05 4/4
무종양 (배경 BLI) 4.90E+05 3.80E+04 5/5
36일차의 종양 부담 및 생존 마우스
항체
치료 		36일차의 종양 부담 - 평균 총 플럭스(p/s) 36일차의 총 플럭스 SEM 36일차에 여전히 살아있는 마우스의 수
PBS 비히클 0/4
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 0/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + bsAb6031 (4mg/kg) 6.01E+07 3.06E+07 2/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + bsAb7945 (4mg/kg) 4.21E+07 2.08E+07 4/5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 1.39E+08 4.35E+07 3/5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 1.14E+07 7.71E+06 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 2.75E+06 1.82E+06 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.04mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 9.62E+07 5.28E+07 2/5
BCMAxCD3 bsAb (0.04mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 9.55E+07 4.38E+07 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.04mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 2.90E+06 9.91E+05 4/4
무종양 (배경 BLI) 5.89E+05 4.29E+04 5/5
40일차의 종양 부담 및 생존 마우스
항체
치료 		40일차의 종양 부담 - 평균 총 플럭스(p/s) 0일차의 총 플럭스 SEM 40일차에 여전히 살아있는 마우스의 수
PBS 비히클 0/4
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 0/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + bsAb6031 (4mg/kg) 1.51E+08 9.84E+07 2/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + bsAb7945 (4mg/kg) 4.85E+07 1.59E+07 4/5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 3.03E+08 4.40E+07 2/5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 1.64E+07 1.18E+07 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 3.55E+06 2.42E+06 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.04mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 5.75E+07 1.43E+07 2/5
BCMAxCD3 bsAb (0.04mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 1.61E+08 7.77E+07 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.04mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 4.77E+06 2.16E+06 4/4
무종양 (배경 BLI) 5.88E+05 3.44E+04 5/5
실시예 11: BCMAxCD3 이중특이적 항체와 조합된 CD38xCD28 이중특이적 항체(bsAb)가 BCMA + CD38 + WSU-DLCL2 종양 세포에 미치는 생체내 항종향 효능
BCMAxCD33 bsAb와 조합된 CD38xCD28 이중특이적 항체(bsAb)의 생체 내 항종양 효능을 결정하기 위해, 이종 종양 연구를 수행하였다. 본 실험에 사용된 종양 세포주가 미만성 거대 B-세포 림프종 세포주인 BCMA+CD38+ WSU-DLCL2이고, 시험된 유일한 CD38/CD28 bsAb가 bsAb6031이라는 점을 제외하고, 본 실험은 위의 실시예 9 및 10과 유사하였다.
0일차에, 면역 결핍 NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) 마우스(8~10주령, Jackson Labs, CAT#: 005557)에게 3x106 WSU-DLCL2 종양 세포(미만성 거대 B 세포 림프종 세포주, DSMZ, CAT#: ACC575) 및 정상적인 공여 유래의 0.5x106 PBMC(Reach Bio, CAT#: 0500-301, Lot#: 0180821)를 50% 매트리겔에서 함께 혼합하여 피하 주사하였다. 1일차에, 마우스(n=5/군)에게 CD3-결합 음성 대조군 이중특이적 Ab(H4sH17664D) 또는 BCMAxCD3 bsAb(bsAb5458)를 4 mg/kg의 CD28-결합 음성 대조군 이중특이적 Ab(bsAb5671)또는 CD38xCD28 bsAb6031 중 하나와 병용 투여하였다. 8일차 및 14일차에 마우스에게 이들 Ab를 2회 더 투여하여 총 3회 투여량을 투여하였다. 종양 부피를 측정함으로써 50일차까지의 종양 성장을 평가하였다.
이종이식 종양의 성장 및 억제의 계산
외부 캘리퍼에 의해 종양 부피를 결정하기 위해, 최대 길이방향 직경(길이 (단위: mm)) 및 최대 가로방향 직경(폭 (단위: mm))을 결정하였다. 캘리퍼 측정에 기초한 종양 부피를 다음 식에 의해 계산하였다: 부피 (mm3) = (길이 x 폭2)/2.
결과:
BCMAxCD3 bsAb + CD28-결합 음성 대조군 bsAb는 중간 정도의 항종향 활성을 제공하였으며, 평균 종양 크기는 CD3-결합 음성 대조군 bsAb + CD28-결합 음성 대조군 bsAb를 투여한 마우스에 비해 감소하였다(이원 ANOVA에 의한 40일차의 p=0.0004; 및 43, 47, 및 50일차의 p<0.0001). CD38xCD28 bsAb(bsAb6031) + CD3-결합 음성 대조군 bsAb로 치료한 경우 평균 종양 크기는 CD3-결합 음성 대조군 bsAb + CD28-결합 음성 대조군 bsAb를 투여한 마우스에 비해 감소하였다(이원 ANOVA에 의한 40일차의 p=0.0007; 및 43, 47, 및 50일차의 p<0.0001). 그러나, BCMAxCD3 bsAb + CD38xCD28 bsAb(bsAb6031)의 조합으로 치료한 경우 평균 종양 크기는 BCMAxCD3 bsAb + CD28-결합 음성 대조군 bsAb를 투여한 마우스(이원 ANOVA에 의한 40일차의 p=0.0069; 및 43, 47, 및 50일차의 p<0.0001) 또는 CD3-결합 음성 대조군 bsAb + CD38xCD28 bsAb6031을 투여한 마우스(이원 ANOVA에 의한 40일차 p=0.0043; 및 43, 47, 및 50일차 p<0.0001)보다 유의하게 낮았다. 표 41~54 및 도 7 참조.
따라서, 이들 연구는, BCMAxCD3 bsAb 또는 CD38xCD28 bsAb 중 하나를 사용한 단일요법이 적당한 항종양 효능을 입증하지만, BCMAxCD3 bsAb + CD38xCD28 bsAb를 사용한 병용 치료는 어느 하나의 요법 단독보다 우월한 보다 강력한, 조합 항종양 효능을 생성함을 입증한다.
5일차의 종양 부담
항체
치료 		5일차의 평균 종양 크기(mm 3 ) 5일차의 종양 크기 SEM
PBS 비히클 58.6 10.6
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 50.8 2.7
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 59.2 5.4
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 53.2 7.5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 51.8 8.1
8일차의 종양 부담
항체
치료 		8일차의 평균 종양 크기(mm 3 ) 8일차의 종양 크기 SEM
PBS 비히클 68.6 7.8
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 36.8 7.7
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 44.6 9.5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 29.6 2.1
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 31.8 10.2
11일차의 종양 부담
항체
치료 		11일차의 평균 종양 크기(mm 3 ) 11일차의 종양 크기 SEM
PBS 비히클 75.0 10.6
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 51.4 7.9
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 28.8 4.9
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 35.0 5.4
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 52.8 19.7
14일차의 종양 부담
항체
치료 		14일차의 평균 종양 크기(mm 3 ) 14일차의 종양 크기 SEM
PBS 비히클 101.6 14.3
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 62.4 9.5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 48.0 11.5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 37.6 6.6
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 45.8 17.1
18일차의 종양 부담
항체
치료 		18일차의 평균 종양 크기(mm 3 ) 18일차의 종양 크기 SEM
PBS 비히클 124.6 14.7
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 81.2 10.3
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 62.6 11.8
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 47.0 5.7
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 40.4 13.4
21일차의 종양 부담
항체
치료 		21일차의 평균 종양 크기(mm 3 ) 21일차의 종양 크기 SEM
PBS 비히클 118.6 18.4
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 110.8 15.3
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 80.4 14.7
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 76.6 17.0
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 45.0 18.6
25일차의 종양 부담
항체
치료 		25일차의 평균 종양 크기(mm 3 ) 25일차의 종양 크기 SEM
PBS 비히클 188.4 25.5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 144.2 11.9
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 103.6 22.9
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 75.0 15.9
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 36.6 14.9
27일차의 종양 부담
항체
치료 		27일차의 평균 종양 크기(mm 3 ) 27일차의 종양 크기 SEM
PBS 비히클 199.0 29.3
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 165.6 18.7
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 115.8 24.6
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 88.2 19.7
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 40.0 16.8
33일차의 종양 부담
항체
치료 		33일차의 평균 종양 크기(mm 3 ) 33일차의 종양 크기 SEM
PBS 비히클 340.2 42.3
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 287.2 27.0
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 172.2 27.6
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 148.2 14.2
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 68.4 29.9
36일차의 종양 부담
항체
치료 		36일차의 평균 종양 크기(mm 3 ) 36일차의 종양 크기 SEM
PBS 비히클 366.8 40.6
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 381.8 40.3
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 193.4 40.2
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 190.0 22.6
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 66.2 30.0
40일차의 종양 부담
항체
치료 		40일차의 평균 종양 크기(mm 3 ) 40일차의 종양 크기 SEM
PBS 비히클 591.2 117.6
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 530.0 39.4
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 294.8 58.4
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 286.0 48.8
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 89.6 40.8
43일차의 종양 부담
항체
치료 		43일차의 평균 종양 크기(mm 3 ) 43일차의 종양 크기 SEM
PBS 비히클 741.0 140.3
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 782.0 45.3
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 461.8 79.3
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 411.6 39.4
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 146.6 58.3
47일차의 종양 부담
항체
치료 		47일차의 평균 종양 크기(mm 3 ) 47일차의 종양 크기 SEM
PBS 비히클 717.8 113.5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 1043.0 113.3
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 572.4 104.0
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 486.8 62.2
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 173.2 82.2
50일차의 종양 부담
항체
치료 		50일차의 평균 종양 크기(mm 3 ) 50일차의 종양 크기 SEM
PBS 비히클 922.8 188.6
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 1155.4 105.6
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 705.8 110.2
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 615.2 86.4
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 197.8 92.0
실시예 12: BCMAxCD3 bsAb와 조합된 CD38xCD28 이중특이적 항체(bsAb)가 BCMA+CD38+ MOLP-8 인간 다발성 골수종 종양 세포 성장에 미치는 생체 내 항종양 효능
BCMAxCD33 bsAb와 조합된 CD38xCD28 이중특이적 항체(bsAb)의 생체 내 항종양 효능을 결정하기 위해, 이종 종양 연구를 수행하였다. 실시예 9 및 10에서의 이전 실험과 마찬가지로, 본 실험은 BCMAxCD3 bsAb의 투여량을 4 mg/kg에서 0.4 mg/kg으로 변경하였고, bsAb6031 및 bsAb7945의 투여량을 0.4 mg/kg으로 변경하였다. 또한, 본 실시예에서의 실험 기간은 44일로, 실시예 9에서의 52일보다 더 짧았다.
이종 종양의 이식 및 측정
-12일차에, 면역 결핍 NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) 마우스(8~10주령, Jackson Labs, CAT#: 005557)에게 정상적인 건강한 공여자 유래의 4x106개의 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)(Reach Bio, CAT#: 0500-301, Lot# 0180821)을 복강내 주사하였다. 0일 차에, 마우스에게 반딧불 루시퍼라아제(MOLP-8-루시퍼라아제 세포)를 또한 발현하도록 조작된 2x106개의 BCMA+CD38+ MOLP-8 인간 다발성 골수종 종양 세포(DSMZ, CAT#: ACC569)를 정맥 내 투여하였다. 그 직후에, 마우스(n=5/군)에게 0.4 mg/kg의 CD3-결합 음성 대조군 이중특이적 Ab(H4sH17664D) 또는 BCMAxCD3 bsAb(bsAb5458)를 4 mg/kg의 CD28-결합 음성 대조군 이중특이적 Ab(bsAb5671) 또는 0.4 mg/kg의 CD38xCD28 bsAb(bsAb6031 또는 bsAb7945)와 병용 투여하였다. 7일차 및 15일차에 마우스에게 이들 Ab를 2회 더 투여하여 총 3회 투여량을 투여하였다. 마취된 동물에서 종양 생물발광(BLI)을 측정함으로써 44일에 걸쳐 종양 성장을 평가하였다. 양성 대조군으로서, 마우스 군(n=5)에게는 MOLP-8-루시퍼라아제 세포 및 PBMC만 투여하고, 항체는 투여하지 않았다(PBS-처리군). 배경 BLI 수준을 측정하기 위해, 마우스 군(n=5)을 치료하지 않았고, 종양, PBMC, 또는 항체를 투여받지 않았다(무종양군).
이종 종양 성장의 측정
BLI 이미징을 사용해 종양 부담을 측정하였다. PBS에 현탁한 150 mg/kg의 루시퍼라아제 기질 D-루시페린을 마우스에게 IP 주입하였다. 투여하고 5분 후, 마우스를 이소플루란으로 마취시킨 상태에서 Xenogen IVIS 시스템을 사용하여 BLI 이미징을 수행하였다. 이미지는, 화각: D; 피사체 높이: 1.5 cm; 비닝 수준: 중간(medium)으로 설정항 상태에서 Living Image 소프트웨어에 의해 결정된 자동 노출 시간으로 획득하였다. BLI 신호를 Living Image 소프트웨어를 사용하여 추출하였다: 관심 영역을 각각의 종양 질량 주위에 그리고, 광자 강도를 총 플럭스(광자/초 - p/s)로서 기록하였다.
결과:
BCMAxCD3 bsAb + CD28-결합 음성 대조군 bsAb는 중간 정도의 항종향 활성을 제공하였으며, 평균 BLI 판독값은 CD3-결합 음성 대조군 bsAb + CD28-결합 음성 대조군 bsAb를 투여한 마우스에 비해 감소하였다. CD3-결합 음성 대조군 bsAb + CD38xCD28 bsAb(bsAb6031 및 bsAb7945)를 이용한 치료는 CD3-결합 음성 대조군 bsAb + CD28-결합 음성 대조군 bsAb를 투여한 마우스에 비해 평균 BLI 판독?냅? 중간 정도로 감소시켰다. 그러나, BCMAxCD3 bsAb + CD38xCD28 bsAb(bsAb6031 및 bsAb7945)의 조합은 BCMAxCD3 bsAb + CD28-결합 음성 대조군 bsAb를 투여한 마우스, CD3-결합 음성대조군 bsAb + bsAb6031을 투여한 마우스마우스, 또는 CD3-결합 음성 대조군 bsAb + bsAb7945를 투여한 마우스보다 낮은 평균 BLI 판독값을 초래하였다. 표 55~64 및 도 8 참조.
따라서, 이들 연구는, BCMAxCD3 bsAb 또는 CD38xCD28 bsAb 중 하나를 사용한 단일요법이 적당한 항종양 효능만을 입증하지만, BCMAxCD3 bsAb + CD38xCD28 bsAb를 사용한 병용 치료는 어느 하나의 요법 단독보다 우월한 보다 강력한, 조합 항종양 효능을 생성함을 입증한다.
9일차의 종양 부담 및 생존 마우스
항체
치료 		9일차의 종양 부담 - 평균 총 플럭스(p/s) 9일차의 총 플럭스 SEM 9일차에 여전히 살아있는 마우스의 수
PBS 비히클 1.66E+06 1.22E+05 5/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 1.98E+06 3.53E+05 5/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (0.4mg/kg) 2.04E+06 5.74E+05 5/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.4mg/kg) 7.65E+05 1.49E+05 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 5.06E+05 1.21E+05 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (0.4mg/kg) 4.52E+05 2.71E+04 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.4mg/kg) 3.57E+05 2.01E+04 4/4
무종양 (배경 BLI) 4.26E+05 2.05E+04 5/5
14일차의 종양 부담 및 생존 마우스
항체
치료 		14일차의 종양 부담 - 평균 총 플럭스(p/s) 14일차의 총 플럭스 SEM 14일차에 여전히 살아있는 마우스의 수
PBS 비히클 2.98E+07 8.54E+06 5/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 3.29E+07 9.51E+06 5/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (0.4mg/kg) 2.74E+07 4.37E+06 5/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.4mg/kg) 9.05E+06 2.97E+06 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 2.48E+06 1.93E+06 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (0.4mg/kg) 5.28E+05 4.62E+04 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.4mg/kg) 4.72E+05 4.23E+04 4/4
무종양 (배경 BLI) 4.15E+05 4.91E+03 5/5
17일차의 종양 부담 및 생존 마우스
항체
치료 		17일차의 종양 부담 - 평균 총 플럭스(p/s) 17일차의 총 플럭스 SEM 17일차에 여전히 살아있는 마우스의 수
PBS 비히클 4.64E+07 1.11E+07 5/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 5.90E+07 9.00E+06 5/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (0.4mg/kg) 4.81E+07 4.48E+06 5/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.4mg/kg) 2.25E+07 6.35E+06 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 9.49E+06 8.38E+06 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (0.4mg/kg) 7.14E+05 1.16E+05 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.4mg/kg) 5.40E+05 4.87E+04 4/4
무종양 (배경 BLI) 4.78E+05 1.75E+04 5/5
21일차의 종양 부담 및 생존 마우스
항체
치료 		21일차의 종양 부담 - 평균 총 플럭스(p/s) 21일차의 총 플럭스 SEM 21일차에 여전히 살아있는 마우스의 수
PBS 비히클 7.45E+07 3.12E+07 5/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 7.45E+07 2.70E+07 5/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (0.4mg/kg) 5.99E+07 1.05E+07 5/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.4mg/kg) 2.62E+07 9.18E+06 4/5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 1.57E+07 1.22E+07 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (0.4mg/kg) 9.49E+05 3.50E+05 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.4mg/kg) 4.49E+05 1.14E+04 4/4
무종양 (배경 BLI) 4.30E+05 1.56E+04 5/5
24일차의 종양 부담 및 생존 마우스
항체
치료 		24일차의 종양 부담 - 평균 총 플럭스(p/s) 24일차의 총 플럭스 SEM 24일차에 여전히 살아있는 마우스의 수
PBS 비히클 0/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 7.38E+06 0.00E+00 1/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (0.4mg/kg) 2.02E+07 0.00E+00 1/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.4mg/kg) 4.19E+07 2.01E+07 2/5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 1.02E+07 5.05E+06 4/5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (0.4mg/kg) 2.49E+06 1.59E+06 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.4mg/kg) 6.60E+05 9.94E+04 4/4
무종양 (배경 BLI) 5.72E+05 3.29E+04 5/5
28일차의 종양 부담 및 생존 마우스
항체
치료 		28일차의 종양 부담 - 평균 총 플럭스(p/s) 28일차의 총 플럭스 SEM 28일차에 여전히 살아있는 마우스의 수
PBS 비히클 0/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 1.13E+07 0.00E+00 1/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (0.4mg/kg) 0/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.4mg/kg) 3.94E+07 0.00E+00 1/5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 4.01E+07 2.14E+07 4/5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (0.4mg/kg) 7.74E+06 5.60E+06 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.4mg/kg) 6.73E+05 1.97E+05 4/4
무종양 (배경 BLI) 3.46E+05 1.10E+04 5/5
31일차의 종양 부담 및 생존 마우스
항체
치료 		31일차의 종양 부담 - 평균 총 플럭스(p/s) 31일차의 총 플럭스 SEM 31일차에 여전히 살아있는 마우스의 수
PBS 비히클 0/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 5.59E+07 0.00E+00 1/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (0.4mg/kg) 0/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.4mg/kg) 7.43E+07 0.00E+00 1/5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 5.53E+07 3.02E+07 4/5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (0.4mg/kg) 3.52E+07 2.13E+07 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.4mg/kg) 1.01E+06 4.56E+05 3/4
무종양 (배경 BLI) 4.53E+05 2.11E+04 5/5
34일차의 종양 부담 및 생존 마우스
항체
치료 		34일차의 종양 부담 - 평균 총 플럭스(p/s) 34일차의 총 플럭스 SEM 34일차에 여전히 살아있는 마우스의 수
PBS 비히클 0/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 7.79E+07 0.00E+00 1/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (0.4mg/kg) 0/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.4mg/kg) 1.37E+08 0.00E+00 1/5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 2.80E+08 1.40E+08 3/5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (0.4mg/kg) 4.41E+07 2.79E+07 5/5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.4mg/kg) 1.68E+06 1.10E+06 3/4
무종양 (배경 BLI) 5.90E+05 3.29E+04 5/5
38일차의 종양 부담 및 생존 마우스
항체
치료 		38일차의 종양 부담 - 평균 총 플럭스(p/s) 38일차의 총 플럭스 SEM 38일차에 여전히 살아있는 마우스의 수
PBS 비히클 0/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 2.64E+08 0.00E+00 1/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (0.4mg/kg) 0/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.4mg/kg) 0/5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 7.07E+08 4.05E+08 3/5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (0.4mg/kg) 7.12E+07 6.96E+07 4/5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.4mg/kg) 4.37E+06 3.87E+06 3/4
무종양 (배경 BLI) 4.86E+05 1.15E+04 5/5
44일차의 종양 부담 및 생존 마우스
항체
치료 		44일차의 종양 부담 - 평균 총 플럭스(p/s) 44일차의 총 플럭스 SEM 44일차에 여전히 살아있는 마우스의 수
PBS 비히클 0/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 1.27E+09 0.00E+00 1/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (0.4mg/kg) 0/5
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.4mg/kg) 0/5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 2.33E+08 1.33E+08 3/5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (0.4mg/kg) 2.49E+08 2.39E+08 3/5
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.4mg/kg) 1.88E+07 1.79E+07 2/4
무종양 (배경 BLI) 6.22E+05 7.86E+04 5/5
실시예 13: CD38 교차 경쟁 분석
CD38xCD28 이중특이적 항체, CD38 부모 항체, 및 CD38 비교자 항체가 hCD38.mmh에 결합하기 위해 서로 경쟁하는 능력을 평가하기 위해 경쟁 결합 검정을 수행하였다.
전체 실험은 25℃의 Octet HBS-EP 완충액(pH 7.4 + 1 mg/mL BSA) 중에서 1000 rpm의 유속으로 수행하였다. 2개의 항체가 C-말단 myc-myc-헥사히스티딘 태그(hCD38-mmH)를 가진 발현된 재조합 인간 CD38 상에서 각각의 에피토프에 결합하기 위해 서로 경쟁할 수 있는지 여부를 평가하기 위해, 50 ug/mL(300 nM)의 hCD38.mmh가 담긴 웰에 고밀도 항-His1K 코팅된 Octet 팁을 5분 동안 침지시켜 약 0.27 nm의 hCD38.mmH를 포획하였다. 그런 다음, 항원이 코팅된 센서 팁을 50 μg/mL의 제1 항-CD38 단클론 항체 또는 이중특이적 항체 용액이 담긴 웰에 5분 동안 넣어 hCD38.mmH 표면을 포화시켰다. 그런 다음, 50 μg/mL의 제2 항-CD38 단클론 항체 또는 이중특이적 항체 용액이 담긴 웰에 센서 팁을 침지하였다. 실험의 모든 단계 사이에, Octet HBS-EP 완충액에서 센서 팁을 세척하였다. 실시간 결합 반응을 실험의 과정 동안 모니터링하고, 모든 단계가 끝난 후 결합 반응을 기록하였다. 제1 항체와 미리 복합체화된 hCD38.mmH에 대한 항체 결합의 반응을 비교하고, 상이한 항-CD38 단클론 항체 및 이중특이적 항체의 경쟁/비경쟁 거동을 결정하였다.
결과: 도시되지 않은 데이터는 CD38xCD28 bsAb7945 및 bsAb6031이 hCD38.mmh에 결합하기 위해 서로 양방향으로 경쟁한다는 것을 나타낸다. 부모 항-CD38 항체는 또한 hCD38.mmh에 결합하기 위해 양방향으로 교차 경쟁하는 것으로 나타났다.
실시예 14: BCMAxCD3 bsAb와 조합된 CD38xCD28 이중특이적 항체(bsAb)가 BCMA + CD38 + WSU-DLCL2 종양 세포 성장에 미치는 생체 내 항종양 효능
BCMAxCD33 bsAb와 조합된 CD38xCD28 이중특이적 항체(bsAb)의 생체 내 항종양 효능을 결정하기 위해, 다음의 이종 종양 연구를 수행하였다. 본 실시예는 실시예 11에서의 이전 실험과 유사하지만, 본 실험에서는 0.4 mg/kg 및 0.04 mg/kg의 bsAb6031 및 bsAb7945 투여량도 조사하였다.
이종 종양의 이식 및 측정
0일차에, 면역 결핍 NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) 마우스에게 3x106 BCMA+CD38+ WSU-DLCL2 종양 세포 및 정상 공여자 유래의 0.5x106 PBMC를 50% 매트리켈에서 혼합하여 피하 주사하였다. 1일차에, 마우스(n=5/군)에게 0.4 mg/kg의 CD3-결합 음성 대조군 이중특이적 Ab(H4sH17664D) 또는 BCMAxCD3 bsAb(bsAb5458)를 4 mg/kg의 CD28-결합 음성 대조군 이중특이적 Ab(bsAb5671) 또는 4 mg/kg, 0.4 mg/kg, 또는 0.04 mg/kg의 CD38xCD28 bsAb(bsAb6031 또는 bsAb7945)와 병용 투여하였다. 8일차 및 15일차에 마우스에게 이들 Ab를 2회 더 투여하여 총 3회 투여량을 투여하였다. 종양 부피를 측정함으로써 50일차까지의 종양 성장을 평가하였다.
이종이식 종양의 성장 및 억제의 계산
외부 캘리퍼에 의해 종양 부피를 결정하기 위해, 최대 길이방향 직경(길이 (단위: mm)) 및 최대 가로방향 직경(폭 (단위: mm))을 결정하였다. 캘리퍼 측정에 기초한 종양 부피를 다음 식에 의해 계산하였다: 부피 (mm3) = (길이 x 폭2)/2.
결과:
BCMAxCD3 bsAb + CD28-결합 음성 대조군 bsAb는 중간 정도의 항종향 활성을 제공하였으며, 평균 종양 크기는 CD3-결합 음성 대조군 bsAb + CD28-결합 음성 대조군 bsAb를 투여한 마우스에 비해 감소하였다(이원 ANOVA에 의한 50일차의 p<0.0001). CD38xCD28 bsAb6031 + CD3-결합 음성 대조군 bsAb로 치료한 경우 평균 종양 크기는 CD3-결합 음성 대조군 bsAb + CD28-결합 음성 대조군 bsAb를 투여한 마우스에 비해 감소하였다(이원 ANOVA에 의한 50일차의 p=0.0089). CD38xCD28 bsAb7945 + CD3-결합 음성 대조군 bsAb로 치료한 경우 평균 종양 크기 또한 CD3-결합 음성 대조군 bsAb + CD28-결합 음성 대조군 bsAb를 투여한 마우스에 비해 감소하였다(이원 ANOVA에 의한 50일차의 p<0.0001). 그러나, 4 mg/kg의 BCMAxCD3 bsAb + CD38xCD28 bsAb6031의 조합으로 치료한 경우 평균 종양 크기는 BCMAxCD3 bsAb + CD28-결합 음성 대조군 bsAb를 투여한 마우스(이원 ANOVA에 의한 50일차의 p<0.0001) 또는 CD3-결합 음성 대조군 bsAb + CD38xCD28 bsAb6031을 투여한 마우스(이원 ANOVA에 의한 50일차 p<0.0001)보다 유의하게 낮았다. 또한, 4 mg/kg 및 0.4 mg/kg의 BCMAxCD3 bsAb + CD38xCD28 bsAb7945의 조합으로 치료한 경우 평균 종양 크기는 BCMAxCD3 bsAb + CD28-결합 음성 대조군 bsAb를 투여한 마우스(양측 이원 ANOVA에 의한 50일차의 p<0.0001) 또는 CD3-결합 음성 대조군 bsAb + CD38xCD28 bsAb6031을 투여한 마우스(양측 이원 ANOVA에 의한 50일차 p<0.0001)보다 유의하게 낮았다. 도 9 및 표 65~78 참조.
이들 연구는, BCMAxCD3 bsAb 또는 CD38xCD28 bsAb 중 하나를 사용한 단일요법이 적당한 항종양 효능을 입증하지만, BCMAxCD3 bsAb + CD38xCD28 bsAb를 사용한 병용 치료는 어느 하나의 요법 단독보다 우월한 보다 강력한, 조합 항종양 효능을 생성함을 확인시켜준다.
4일차의 종양 부담
항체
치료 		4일차의 평균 종양 크기(mm 3 ) 4일차의 종양 크기 SEM
PBS 비히클 85.50 16.18
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 66.10 5.19
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 56.82 4.05
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 66.45 6.01
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 74.71 3.16
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 51.39 5.57
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (0.4mg/kg) 50.11 6.03
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (0.04mg/kg) 83.73 9.58
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 64.12 6.04
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.4mg/kg) 54.57 3.77
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.04mg/kg) 63.14 3.11
8일차의 종양 부담
항체
치료 		8일차의 평균 종양 크기(mm 3 ) 8일차의 종양 크기 SEM
PBS 비히클 55.83 2.38
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 71.47 6.67
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 51.44 3.02
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 56.85 5.01
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 53.51 6.15
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 42.03 4.38
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (0.4mg/kg) 57.05 5.82
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (0.04mg/kg) 73.74 4.07
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 50.21 5.48
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.4mg/kg) 53.78 3.73
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.04mg/kg) 56.03 3.47
12일차의 종양 부담
항체
치료 		12일차의 평균 종양 크기(mm 3 ) 12일차의 종양 크기 SEM
PBS 비히클 85.78 12.07
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 83.84 8.78
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 80.34 4.68
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 85.66 8.35
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 82.00 3.62
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 63.97 7.77
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (0.4mg/kg) 99.11 12.46
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (0.04mg/kg) 97.39 3.49
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 71.13 6.31
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.4mg/kg) 74.53 8.22
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.04mg/kg) 96.15 6.91
15일차의 종양 부담
항체
치료 		15일차의 평균 종양 크기(mm 3 ) 15일차의 종양 크기 SEM
PBS 비히클 96.13 6.95
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 108.55 9.12
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 77.60 4.77
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 95.61 4.30
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 107.35 3.75
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 77.48 7.64
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (0.4mg/kg) 111.19 5.43
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (0.04mg/kg) 131.37 6.27
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 85.93 11.39
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.4mg/kg) 90.88 9.25
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.04mg/kg) 122.56 8.22
18일차의 종양 부담
항체
치료 		18일차의 평균 종양 크기(mm 3 ) 18일차의 종양 크기 SEM
PBS 비히클 106.35 12.16
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 120.82 10.41
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 104.88 9.04
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 116.50 4.33
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 121.23 6.49
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 79.21 6.63
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (0.4mg/kg) 118.88 13.24
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (0.04mg/kg) 148.63 12.24
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 70.63 6.89
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.4mg/kg) 83.16 6.72
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.04mg/kg) 143.53 22.02
22일차의 종양 부담
항체
치료 		22일차의 평균 종양 크기(mm 3 ) 22일차의 종양 크기 SEM
PBS 비히클 146.39 17.98
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 192.17 15.35
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 130.06 14.28
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 160.92 12.52
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 168.61 10.10
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 108.90 12.96
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (0.4mg/kg) 148.48 16.02
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (0.04mg/kg) 189.83 14.62
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 74.83 2.85
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.4mg/kg) 71.89 8.02
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.04mg/kg) 140.61 20.63
26일차의 종양 부담
항체
치료 		26일차의 평균 종양 크기(mm 3 ) 26일차의 종양 크기 SEM
PBS 비히클 204.12 26.45
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 267.72 31.94
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 190.92 13.67
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 244.00 27.60
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 218.67 5.28
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 144.50 13.44
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (0.4mg/kg) 266.65 24.05
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (0.04mg/kg) 323.35 28.97
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 79.75 4.75
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.4mg/kg) 81.49 17.70
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.04mg/kg) 209.38 42.42
29일차의 종양 부담
항체
치료 		29일차의 평균 종양 크기(mm 3 ) 29일차의 종양 크기 SEM
PBS 비히클 240.89 20.67
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 340.58 33.04
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 226.09 16.33
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 300.95 45.46
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 220.35 8.48
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 146.60 15.78
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (0.4mg/kg) 358.00 34.85
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (0.04mg/kg) 408.27 29.03
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 91.00 6.00
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.4mg/kg) 87.99 15.00
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.04mg/kg) 237.40 53.41
33일차의 종양 부담
항체
치료 		33일차의 평균 종양 크기(mm 3 ) 33일차의 종양 크기 SEM
PBS 비히클 322.30 26.49
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 476.53 27.19
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 340.84 40.81
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 406.59 51.88
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 351.79 16.97
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 208.14 28.76
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (0.4mg/kg) 464.58 54.13
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (0.04mg/kg) 590.23 56.94
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 123.92 21.27
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.4mg/kg) 103.05 12.96
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.04mg/kg) 318.65 74.12
36일차의 종양 부담
항체
치료 		36일차의 평균 종양 크기(mm 3 ) 36일차의 종양 크기 SEM
PBS 비히클 409.05 30.64
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 619.65 42.22
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 383.08 61.14
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 446.97 48.15
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 445.04 29.21
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 280.56 34.13
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (0.4mg/kg) 557.24 78.00
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (0.04mg/kg) 648.82 81.16
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 127.30 24.04
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.4mg/kg) 111.12 14.87
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.04mg/kg) 400.33 103.59
39일차의 종양 부담
항체
치료 		39일차의 평균 종양 크기(mm 3 ) 39일차의 종양 크기 SEM
PBS 비히클 502.34 28.84
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 799.34 58.49
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 499.98 49.70
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 605.29 69.33
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 579.16 38.09
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 297.89 36.15
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (0.4mg/kg) 719.36 47.93
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (0.04mg/kg) 925.08 99.40
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 159.10 35.59
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.4mg/kg) 126.81 16.92
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.04mg/kg) 468.32 127.47
43일차의 종양 부담
항체
치료 		43일차의 평균 종양 크기(mm 3 ) 43일차의 종양 크기 SEM
PBS 비히클 704.71 71.69
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 1138.42 65.21
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 731.60 53.59
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 867.05 101.16
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 684.22 17.96
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 427.12 57.21
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (0.4mg/kg) 956.84 102.11
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (0.04mg/kg) 1197.95 138.72
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 204.36 51.71
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.4mg/kg) 176.31 27.26
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.04mg/kg) 666.85 192.44
48일차의 종양 부담
항체
치료 		48일차의 평균 종양 크기(mm 3 ) 48일차의 종양 크기 SEM
PBS 비히클 769.26 65.08
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 1640.91 122.90
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 1008.89 43.06
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 1278.26 154.03
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 958.84 72.53
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 606.92 75.49
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (0.4mg/kg) 1506.77 251.49
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (0.04mg/kg) 1737.78 234.10
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 264.67 74.97
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.4mg/kg) 198.78 30.83
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.04mg/kg) 899.61 263.60
50일차의 종양 부담
항체
치료 		50일차의 평균 종양 크기(mm 3 ) 50일차의 종양 크기 SEM
PBS 비히클 934.63 48.33
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 1829.70 151.42
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 1245.51 46.95
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 1445.19 155.75
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 1023.52 81.70
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (4mg/kg) 730.89 179.00
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (0.4mg/kg) 1591.50 286.71
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb6031 (0.04mg/kg) 1855.56 272.36
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 260.42 60.39
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.4mg/kg) 262.05 30.60
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.04mg/kg) 1038.47 330.97
실시예 15: BCMAxCD3 bsAb와 조합된 CD38xCD28 이중특이적 항체(bsAb)가 BCMA+CD38+ MOLP-8 인간 다발성 골수종 종양 세포 성장에 미치는 생체 내 항종양 효능
BCMAxCD33 bsAb와 CD38xCD28 이중특이적 항체(bsAb)의 생체 내 항종양 효능을 결정하기 위해, 이종 종양 연구를 수행하였다. 본 실시예는 실시예 12에서의 실험과 유사하지만, 본 실험에서은 더 많은 마우스를 시험하였고(10~13마리의 마우스/군 대 실시예 12에서 5마리/군) 본 연구의 지속 기간은 더 길었다(48일 대 실시예 12에서 44일).
이종 종양의 이식 및 측정
-12일차에, 면역 결핍 NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) 마우스에게 정상적인 건강한 공여자 유래의 4x106개의 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)을 복강내 주사하였다. 0일 차에, 마우스에게 반딧불 루시퍼라아제(MOLP-8-루시퍼라아제 세포)를 또한 발현하도록 조작된 2x106개의 BCMA+CD38+ MOLP-8 인간 다발성 골수종 종양 세포를 정맥 내 투여하였다. 그 직후에, 마우스(n=10~13/군)에게 0.4 mg/kg의 CD3-결합 음성 대조군 이중특이적 Ab(H4sH17664D) 또는 BCMAxCD3(bsAb5458) bsAb를 0.4 mg/kg의 CD28-결합 음성 대조군 이중특이적 Ab(bsAb5671) 또는 CD38xCD28 bsAb(bsAb6031 또는 bsAb7945)와 병용 투여하였다. 7일차 및 14일차에 마우스에게 이들 Ab를 2회 더 투여하여 총 3회 투여량을 투여하였다. 마취된 동물에서 종양 생물발광(BLI)을 측정함으로써 48일에 걸쳐 종양 성장을 평가하였다. 양성 대조군으로서, 마우스 군(n=5)에게는 MOLP-8-루시퍼라아제 세포 및 PBMC만 투여하고, 항체는 투여하지 않았다(PBS-처리군). 배경 BLI 수준을 측정하기 위해, 마우스 군(n=5)을 치료하지 않았고, 종양, PBMC, 또는 항체를 투여받지 않았다(무종양군).
이종 종양 성장의 측정
BLI 이미징을 사용해 종양 부담을 측정하였다. PBS에 현탁한 150 mg/kg의 루시퍼라아제 기질 D-루시페린을 마우스에게 IP 주입하였다. 투여하고 5분 후, 마우스를 이소플루란으로 마취시킨 상태에서 Xenogen IVIS 시스템을 사용하여 BLI 이미징을 수행하였다. 이미지는, 화각: D; 피사체 높이: 1.5 cm; 비닝 수준: 중간(medium)으로 설정항 상태에서 Living Image 소프트웨어에 의해 결정된 자동 노출 시간으로 획득하였다. BLI 신호를 Living Image 소프트웨어를 사용하여 추출하였다: 관심 영역을 각각의 종양 질량 주위에 그리고, 광자 강도를 총 플럭스(광자/초 - p/s)로서 기록하였다.
결과:
BCMAxCD3 bsAb + CD28-결합 음성 대조군 bsAb는 약간의 항종향 활성을 제공하였으며, 평균 BLI 판독값은 CD3-결합 음성 대조군 bsAb + CD28-결합 음성 대조군 bsAb를 투여한 마우스에 비해 감소하였다(20, 23, 및 27일차에 이원 ANOVA 분석에 의한 p<0.0001 ). CD3-결합 음성 대조군 bsAb + CD38xCD28 bsAb(bsAb7945)로 치료한 경우 CD3-결합 음성 대조군 bsAb + CD28-결합 음성 대조군 bsAb를 투여한 마우스에 비해 평균 BLI 판독값이 중간정도로 감소하였다(이원 ANOVA 분석에 의한 23일차 p<0.0001). 그러나, 3회 투여량 모두에서 BCMAxCD3 bsAb + CD38xCD28 bsAb(bsAb7945)의 조합은 BCMAxCD3 bsAb + CD28-결합 음성 대조군 bsAb를 투여한 마우스보다 낮은 평균 BLI 판독값을 생성하였다(44일차 이원 ANOVA 분석: bsAb7945의 투여량 4mg/kg에 대해 p<0.0001, bsAb7945의 투여량 0.4 mg/kg에 대해 0=0.0007, 및 bsAb7945의 투여량 0.04mg/kg에 대해 p=0.0018이고; 48일차 이원 ANOVA 분석에 의한 bsAb7945의 3가지 투여량 모두에 대해 p<0.0001). 아래 도 10 및 표 79~90 참조.
따라서, 이들 연구는, BCMAxCD3 bsAb 또는 CD38xCD28 bsAb 중 하나를 사용한 단일요법이 적당한 항종양 효능만을 입증하지만, BCMAxCD3 bsAb + CD38xCD28 bsAb를 사용한 병용 치료는 어느 하나의 요법 단독보다 우월한 보다 강력한, 조합 항종양 효능을 생성함을 입증한다.
9일차의 종양 부담 및 생존 마우스
항체
치료 		9일차의 종양 부담 - 평균 총 플럭스(p/s) 9일차의 총 플럭스 SEM 9일차에 여전히 살아있는 마우스의 수
PBS 비히클 7.13E+05 2.30E+04 10/10
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 7.03E+05 2.63E+04 10/10
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 7.51E+05 2.55E+04 10/10
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 7.15E+05 1.75E+04 10/10
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 7.09E+05 2.28E+04 13/13
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.4mg/kg) 7.55E+05 2.39E+04 12/12
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.04mg/kg) 7.57E+05 3.17E+04 10/10
무종양 (배경 BLI) 7.69E+05 3.56E+04 5/5
13일차의 종양 부담 및 생존 마우스
항체
치료 		13일차의 종양 부담 - 평균 총 플럭스(p/s) 13일차의 총 플럭스 SEM 13일차에 여전히 살아있는 마우스의 수
PBS 비히클 1.41E+06 2.00E+05 10/10
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 1.25E+06 1.32E+05 10/10
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 8.27E+05 2.25E+04 10/10
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 8.83E+05 2.62E+04 10/10
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 7.43E+05 1.83E+04 13/13
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.4mg/kg) 7.68E+05 2.12E+04 12/12
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.04mg/kg) 7.65E+05 2.98E+04 10/10
무종양 (배경 BLI) 7.68E+05 4.85E+04 5/5
16일차의 종양 부담 및 생존 마우스
항체
치료 		16일차의 종양 부담 - 평균 총 플럭스(p/s) 16일차의 총 플럭스 SEM 16일차에 여전히 살아있는 마우스의 수
PBS 비히클 6.55E+06 1.63E+06 10/10
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 4.28E+06 8.89E+05 10/10
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 8.44E+05 2.50E+04 10/10
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 1.79E+06 1.79E+05 9/10
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 8.98E+05 4.57E+04 13/13
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.4mg/kg) 8.96E+05 2.07E+04 12/12
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.04mg/kg) 8.11E+05 2.86E+04 10/10
무종양 (배경 BLI) 8.64E+05 4.19E+04 5/5
20일차의 종양 부담 및 생존 마우스
항체
치료 		20일차의 종양 부담 - 평균 총 플럭스(p/s) 20일차의 총 플럭스 SEM 20일차에 여전히 살아있는 마우스의 수
PBS 비히클 1.70E+07 3.68E+06 9/10
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 1.32E+07 2.66E+06 10/10
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 8.16E+05 5.11E+04 10/10
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 5.41E+06 9.13E+05 9/10
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 9.05E+05 3.30E+04 13/13
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.4mg/kg) 9.25E+05 3.90E+04 12/12
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.04mg/kg) 8.83E+05 3.98E+04 10/10
무종양 (배경 BLI) 8.26E+05 4.69E+04 5/5
23일차의 종양 부담 및 생존 마우스
항체
치료 		23일차의 종양 부담 - 평균 총 플럭스(p/s) 23일차의 총 플럭스 SEM 23일차에 여전히 살아있는 마우스의 수
PBS 비히클 2.87E+07 4.94E+06 8/10
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 2.54E+07 5.18E+06 10/10
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 9.78E+05 1.26E+05 10/10
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 9.16E+06 1.39E+06 9/10
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 8.65E+05 4.55E+04 13/13
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.4mg/kg) 9.32E+05 2.37E+04 12/12
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.04mg/kg) 8.71E+05 4.66E+04 10/10
무종양 (배경 BLI) 8.29E+05 2.83E+04 5/5
27일차의 종양 부담 및 생존 마우스
항체
치료 		27일차의 종양 부담 - 평균 총 플럭스(p/s) 27일차의 총 플럭스 SEM 27일차에 여전히 살아있는 마우스의 수
PBS 비히클 3.68E+07 4.83E+06 6/10
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 1.66E+07 5.05E+06 4/10
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 1.66E+06 4.36E+05 10/10
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 1.55E+07 3.85E+06 8/10
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 9.86E+05 7.69E+04 13/13
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.4mg/kg) 1.03E+06 4.51E+04 12/12
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.04mg/kg) 1.02E+06 1.07E+05 10/10
무종양 (배경 BLI) 8.44E+05 2.71E+04 5/5
30일차의 종양 부담 및 생존 마우스
항체
치료 		30일차의 종양 부담 - 평균 총 플럭스(p/s) 30일차의 총 플럭스 SEM 30일차에 여전히 살아있는 마우스의 수
PBS 비히클 0/10
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 5.50E+07 0.00E+00 1/10
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 3.38E+06 1.63E+06 10/10
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 5.46E+07 2.30E+07 5/10
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 1.17E+06 1.45E+05 13/13
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.4mg/kg) 1.18E+06 1.34E+05 12/12
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.04mg/kg) 1.23E+06 2.79E+05 10/10
무종양 (배경 BLI) 8.94E+05 2.91E+04 5/5
34일차의 종양 부담 및 생존 마우스
항체
치료 		34일차의 종양 부담 - 평균 총 플럭스(p/s) 34일차의 총 플럭스 SEM 34일차에 여전히 살아있는 마우스의 수
PBS 비히클 0/10
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 0/10
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 6.14E+06 2.55E+06 10/10
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 6.54E+07 2.84E+07 2/10
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 1.27E+06 2.15E+05 13/13
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.4mg/kg) 2.50E+06 1.24E+06 12/12
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.04mg/kg) 1.91E+06 8.17E+05 9/10
무종양 (배경 BLI) 7.45E+05 1.33E+04 5/5
37일차의 종양 부담 및 생존 마우스
항체
치료 		37일차의 종양 부담 - 평균 총 플럭스(p/s) 37일차의 총 플럭스 SEM 37일차에 여전히 살아있는 마우스의 수
PBS 비히클 0/10
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 0/10
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 1.02E+07 4.44E+06 10/10
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 0/10
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 1.96E+06 5.75E+05 13/13
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.4mg/kg) 4.04E+06 2.34E+06 12/12
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.04mg/kg) 3.20E+06 1.53E+06 8/10
무종양 (배경 BLI) 9.82E+05 3.75E+04 5/5
41일차의 종양 부담 및 생존 마우스
항체
치료 		41일차의 종양 부담 - 평균 총 플럭스(p/s) 41일차의 총 플럭스 SEM 41일차에 여전히 살아있는 마우스의 수
PBS 비히클 0/10
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 0/10
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 3.17E+07 1.18E+07 10/10
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 0/10
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 2.57E+06 1.03E+06 13/13
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.4mg/kg) 4.74E+06 1.93E+06 12/12
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.04mg/kg) 5.72E+06 3.76E+06 8/10
무종양 (배경 BLI) 8.72E+05 4.59E+04 5/5
44일차의 종양 부담 및 생존 마우스
항체
치료 		44일차의 종양 부담 - 평균 총 플럭스(p/s) 44일차의 총 플럭스 SEM 44일차에 여전히 살아있는 마우스의 수
PBS 비히클 0/10
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 0/10
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 6.82E+07 2.25E+07 10/10
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 0/10
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 2.45E+06 9.91E+05 13/13
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.4mg/kg) 1.57E+07 1.12E+07 12/12
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.04mg/kg) 1.37E+07 9.85E+06 8/10
무종양 (배경 BLI) 6.41E+05 2.20E+04 5/5
48일차의 종양 부담 및 생존 마우스
항체
치료 		48일차의 종양 부담 - 평균 총 플럭스(p/s) 48일차의 총 플럭스 SEM 48일차에 여전히 살아있는 마우스의 수
PBS 비히클 0/10
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 0/10
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD28-결합 음성 대조군 bsAb (4mg/kg) 2.08E+08 7.43E+07 9/10
CD3-결합 음성 대조군 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 0/10
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (4mg/kg) 3.26E+06 1.33E+06 13/13
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.4mg/kg) 1.34E+07 5.57E+06 11/12
BCMAxCD3 bsAb (0.4mg/kg) + CD38xCD28 bsAb7945 (0.04mg/kg) 2.26E+07 1.29E+07 8/10
무종양 (배경 BLI) 8.63E+05 4.83E+04 5/5
본 발명은 본원에 기술된 특정 구현예에 의해 그 범위가 제한되지 않는다. 실제로, 본원에 기술된 것들 외에, 본 발명의 다양한 변형은 전술된 설명 및 첨부된 도면으로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구범위의 범주에 포함되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc. DiLillo, David Hermann, Aynur Kirshner, Jessica Olson, Kara Sineshchekova, Olga Smith, Eric Ullman, Erica <120> ANTIGEN-BINDING MOLECULES THAT BIND CD38 AND/OR CD28, AND USES THEREOF <130> 10786WO01 <140> TBD <141> 2021-09-17 <150> 63080172 <151> 2020-09-18 <160> 63 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 372 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggcaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gattatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120 ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaggt attagttgga aaagtgataa cataggctat 180 gcggactctg tgaagggccg attcaccatt tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240 ctgcaaatga acagtctgag agctgaggac acggccttgt attactgtgc aaaagccctt 300 gggggctgga agttcgacta ctattacggt atggacgttt ggggccaagg gaccacggtc 360 accgtctcct ca 372 <210> 2 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Trp Lys Ser Asp Asn Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ala Leu Gly Gly Trp Lys Phe Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp 100 105 110 Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 3 ggattcacct ttgatgatta tgcc 24 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 4 Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala 1 5 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 5 attagttgga aaagtgataa cata 24 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 6 Ile Ser Trp Lys Ser Asp Asn Ile 1 5 <210> 7 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 7 gcaaaagccc ttgggggctg gaagttcgac tactattacg gtatggacgt t 51 <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 8 Ala Lys Ala Leu Gly Gly Trp Lys Phe Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp 1 5 10 15 Val <210> 9 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 9 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctccggatt caccttcagt aggaataata tgcactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gactggaata tgtttcaggt attagtagta atgggggtcg cacatattat 180 gcagactctg tgaagggcag attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 cttcaaatgg gcggcctgag agctgcggac atggctgtgt atttctgtac gagagatgac 300 gagctgcttt cctttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcactgtctc ctca 354 <210> 10 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 10 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn 20 25 30 Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Ser Asn Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Gly Gly Leu Arg Ala Ala Asp Met Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Thr Arg Asp Asp Glu Leu Leu Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 11 ggattcacct tcagtaggaa taat 24 <210> 12 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 12 Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn Asn 1 5 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 13 attagtagta atgggggtcg caca 24 <210> 14 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 14 Ile Ser Ser Asn Gly Gly Arg Thr 1 5 <210> 15 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 15 acgagagatg acgagctgct ttcctttgac tac 33 <210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> 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Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro 85 90 95 Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 19 cagagcatta gcagctat 18 <210> 20 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 20 Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 1 5 <210> 21 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 21 gctgcatcc 9 <210> 22 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 22 Ala Ala Ser 1 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 23 caacagagtt acagtacccc tccgatcacc 30 <210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 24 Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Ile Thr 1 5 10 <210> 25 <211> 1353 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 25 gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggcaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gattatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120 ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaggt attagttgga aaagtgataa cataggctat 180 gcggactctg tgaagggccg attcaccatt tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240 ctgcaaatga acagtctgag agctgaggac acggccttgt attactgtgc aaaagccctt 300 gggggctgga agttcgacta ctattacggt atggacgttt ggggccaagg gaccacggtc 360 accgtctcct cagcctccac caagggccca tcggtcttcc ccctggcgcc ctgctccagg 420 agcacctccg agagcacagc cgccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg 480 gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc 540 ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcttg 600 ggcacgaaga cctacacctg caacgtagat cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 660 agagttgagt ccaaatatgg tcccccatgc ccaccgtgcc cagcaccacc tgtggcagga 720 ccatcagtct tcctgttccc cccaaaaccc aaggacactc tcatgatctc ccggacccct 780 gaggtcacgt gcgtggtggt ggacgtgagc caggaagacc ccgaggtcca gttcaactgg 840 tacgtggatg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagttcaac 900 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaacggcaag 960 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaaggc ctcccgtcct ccatcgagaa aaccatctcc 1020 aaagccaaag ggcagccccg agagccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccaggaggag 1080 atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc 1140 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaggctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260 caggagggga atgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacaca 1320 cagaagtccc tctccctgtc tctgggtaaa tga 1353 <210> 26 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 26 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Trp Lys Ser Asp Asn Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 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cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt agttactact ggagctggat ccggcagccc 120 ccagggaagg gactggagtg gattgggtat atctattaca gtgggatcac ccactacaac 180 ccctccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagatcca gttctccctg 240 aagctgagtt ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgag atggggggtt 300 cggagggact actactacta cggtatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360 tcctcagcct ctacaaaggg accttctgtg tttcctctgg ctccttgttc tagatctaca 420 tctgaatcta cagctgctct gggatgtctg gtgaaggatt attttcctga acctgtgaca 480 gtgtcttgga attctggagc tctgacatct ggagtgcata catttcctgc tgtgctgcag 540 tcttctggac tgtattctct gtcttctgtg gtgacagtgc cttcttcttc tctgggaaca 600 aagacatata catgtaatgt ggatcataag ccttctaata caaaggtgga taagagagtg 660 gaatctaagt atggacctcc ttgtcctcct tgtcctgctc ctcctgtggc tggaccttct 720 gtgtttctgt ttcctcctaa gcctaaggat acactgatga tctctagaac acctgaagtg 780 acatgtgtgg tggtggatgt gtctcaggaa gatcctgaag tgcagtttaa ttggtatgtg 840 gatggagtgg aagtgcataa tgctaagaca aagcctagag aagaacagtt taattctaca 900 tatagagtgg tgtctgtgct gacagtgctg catcaggatt ggctgaatgg aaaggaatat 960 aagtgtaagg tgtctaataa gggactgcct tcttctatcg aaaagacaat ctctaaggct 1020 aagggacagc ctagagaacc tcaggtgtat acactgcctc cttctcagga agaaatgaca 1080 aagaatcagg tgtctctgac atgtctggtg aagggatttt atccttctga tatcgctgtg 1140 gaatgggaat ctaatggaca gcctgaaaat aattataaga caacacctcc tgtgctggat 1200 tctgatggat ctttttttct gtattctaga ctgacagtgg ataagtctag atggcaggaa 1260 ggaaatgtgt tttcttgttc tgtgatgcat gaagctctgc ataatagatt tacacagaag 1320 tctctgtctc tgtctcctgg aaagtag 1347 <210> 58 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 58 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ile Thr His Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Ile Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Trp Gly Val Arg Arg Asp Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr 210 215 220 Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 59 <211> 648 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 59 gaaatagttt tgacacagag tcccggcaca ctgtcactct ctcccgggga aagagccacc 60 ttgtcatgta gagcaagtca gtcagtctct agctcttatc tcgcctggta ccagcagaag 120 ccgggacagg cccctagact gctgatctac ggggcaagtt ccagggccac cggaatcccc 180 gaccggttca gtggaagcgg aagcggaacc gattttactt tgacgatttc tagactggag 240 ccagaggatt tcgccgttta ctattgtcaa cagtacggaa gcagcccgtg gacgtttggc 300 cagggcacga aggtagaaat caagcgaact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360 ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgttag 648 <210> 60 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 60 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 61 <211> 367 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 61 Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr Asp Asn 1 5 10 15 Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser Arg Glu 20 25 30 Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu Val Cys 35 40 45 Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser Lys Thr 50 55 60 Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr Phe Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys Lys Ile 85 90 95 Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly 100 105 110 Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe 115 120 125 Pro Gly Pro Ser Lys Pro Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys 130 135 140 Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 145 150 155 160 Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser 165 170 175 Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp 180 185 190 Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln 195 200 205 Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser 210 215 220 Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys 225 230 235 240 Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile 245 250 255 Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro 260 265 270 Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met 275 280 285 Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn 290 295 300 Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser 305 310 315 320 Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn 325 330 335 Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu 340 345 350 His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys 355 360 365 <210> 62 <211> 491 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 62 Val Pro Arg Trp Arg Gln Gln Trp Ser Gly Pro Gly Thr Thr Lys Arg 1 5 10 15 Phe Pro Glu Thr Val Leu Ala Arg Cys Val Lys Tyr Thr Glu Ile His 20 25 30 Pro Glu Met Arg His Val Asp Cys Gln Ser Val Trp Asp Ala Phe Lys 35 40 45 Gly Ala Phe Ile Ser Lys His Pro Cys Asn Ile Thr Glu Glu Asp Tyr 50 55 60 Gln Pro Leu Met Lys Leu Gly Thr Gln Thr Val Pro Cys Asn Lys Ile 65 70 75 80 Leu Leu Trp Ser Arg Ile Lys Asp Leu Ala His Gln Phe Thr Gln Val 85 90 95 Gln Arg Asp Met Phe Thr Leu Glu Asp Thr Leu Leu Gly Tyr Leu Ala 100 105 110 Asp Asp Leu Thr Trp Cys Gly Glu Phe Asn Thr Ser Lys Ile Asn Tyr 115 120 125 Gln Ser Cys Pro Asp Trp Arg Lys Asp Cys Ser Asn Asn Pro Val Ser 130 135 140 Val Phe Trp Lys Thr Val Ser Arg Arg Phe Ala Glu Ala Ala Cys Asp 145 150 155 160 Val Val His Val Met Leu Asn Gly Ser Arg Ser Lys Ile Phe Asp Lys 165 170 175 Asn Ser Thr Phe Gly Ser Val Glu Val His Asn Leu Gln Pro Glu Lys 180 185 190 Val Gln Thr Leu Glu Ala Trp Val Ile His Gly Gly Arg Glu Asp Ser 195 200 205 Arg Asp Leu Cys Gln Asp Pro Thr Ile Lys Glu Leu Glu Ser Ile Ile 210 215 220 Ser Lys Arg Asn Ile Gln Phe Ser Cys Lys Asn Ile Tyr Arg Pro Asp 225 230 235 240 Lys Phe Leu Gln Cys Val Lys Asn Pro Glu Asp Ser Ser Cys Thr Ser 245 250 255 Glu Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys 260 265 270 Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 275 280 285 Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr 290 295 300 Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser 305 310 315 320 Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His 325 330 335 Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile 340 345 350 Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn 355 360 365 Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys 370 375 380 Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu 385 390 395 400 Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe 405 410 415 Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu 420 425 430 Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr 435 440 445 Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg 450 455 460 Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His 465 470 475 480 Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys 485 490 <210> 63 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 63 Met Leu Arg Leu Leu Leu Ala Leu Asn Leu Phe Pro Ser Ile Gln Val 1 5 10 15 Thr Gly Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr 20 25 30 Asp Asn Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser 35 40 45 Arg Glu Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu 50 55 60 Val Cys Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser 65 70 75 80 Lys Thr Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr 85 90 95 Phe Tyr Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys 100 105 110 Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser 115 120 125 Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro 130 135 140 Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly 145 150 155 160 Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile 165 170 175 Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met 180 185 190 Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro 195 200 205 Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 210 215 220

Claims (70)

  1. 단리된 이중특이적 항원 결합 분자로서,
    (a) 표적 종양 세포 상에서 인간 CD38에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 도메인; 및
    (b) 약 26 nM 미만의 KD로 인간 CD28에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 도메인을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자.
  2. 제1항에 있어서, 제1 항원 결합 도메인은 표면 플라스몬 공명 검정에서 측정했을 때 약 10 nM 미만의 해리 상수(KD)로 CD38에 결합하는, 이중특이적 항원 결합 분자.
  3. 제1항에 있어서, 제2 항원 결합 도메인은 표면 플라스몬 공명 검정에서 측정했을 때 약 26 nM 미만의 해리 상수(KD)로 CD28에 결합하는, 이중특이적 항원 결합 분자.
  4. 제1항에 있어서, 이중특이적 항체는 다음 특성 중 하나 이상을 갖는, 이중특이적 항원 결합 분자:
    (a) IL2 방출, IFNg 방출, 및 T 세포 증식의 증가에 의해 결정했을 때 인간 일차 T 세포를 활성화시킴;
    (b) BCMAxCD3 이중특이적 항체에 의해 매개된 표적 세포 세포독성을 향상시킴;
    (c) CD4+ 및 CD8+ T 세포 상에서 BCMAxCD3 이중특이적 항체에 의해 매개된 CD25 상향조절에 의해 측정했을 때 T 세포 활성화와 연관된 표적 세포 용해를 향상시킴;
    (d) CD4+ 및 CD8+ T 세포 상에서 BCMAxCD3 이중특이적 항체에 의해 매개된 염료 희석에 의해 측정했을 때 T 세포 증식과 연관된 표적 세포 용해를 향상시킴;
    (e) BCMAxCD3 이중특이적 항체에 의해 매개된 사이토카인 방출을 향상시킴;
    (f) 쥣과 다발성 골수종 모델에서 BCMAxCD3 이중특이적 항체에 의해 매개된 종양 부담의 감소를 나타냄; 또는
    (g) 쥣과 다발성 골수종 모델에서 BCMAxCD3 이중특이적 항체에 의해 매개된 생존율 증가를 나타냄.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항원 결합 분자는 약 1 nM 미만의 EC50으로 CD38+ 세포에서 IL2 방출을 증가시키는, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항원 결합 분자는 약 750 pM 미만의 EC50으로 CD38+ 세포에서 IFNg 방출을 증가시키는, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항원 결합 분자는 약 150 pM 미만의 EC50으로 CD38+ 세포의 증식을 증가시키는, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 종양 세포는 형질 세포인, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 종양 세포는 다발성 골수종, B-세포 백혈병, 간세포 암종, 비소세포 폐암, 흑색종, 췌장관 선암종, 신경교종, 또는 유방암을 앓고 있거나, 부분적으로 CD38+ 세포를 갖는 것을 특징으로 하는 또 다른 암을 앓고 있는 환자에서 유래된 것인, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 종양 세포는 다발성 골수종, 또는 부분적으로 BCMA를 발현하는 B 세포를 갖는 것을 특징으로 하는 또 다른 B 세포 장애를 앓고 있는 환자로부터 유래된 것인, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항원 결합 분자는 약 0.04 mg/kg 내지 약 4.0 mg/kg의 투여량에서 CD38 발현 종양 세포의 증식을 억제하는, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항원 결합 분자는 골수종 세포, 백혈병 세포, 간세포 암종 세포, 비소세포 폐암 세포, 흑색종 세포, 췌장관 선암종 세포, 신경교종 세포, 또는 유방암 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD38+ 종양 세포의 증식을 억제하는, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자.
  13. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항원 결합 분자는 H929 세포, MOLP-8 세포, 및 WSU-DLCL2 종양 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD38+ 종양 세포의 증식을 억제하는, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항원 결합 도메인은 다음을 포함하는, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자:
    (a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR) 내에 함유된 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3); 및
    (b) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR) 내에 함유된 3개의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR1, LCDR2, LCDR3).　
  15. 제14항에 있어서, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자. 　
  17. 제14항에 있어서, 제1 항원 결합 도메인은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자. 　
  18. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항원 결합 도메인은 다음을 포함하는, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자:
    (a) 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR) 내에 함유된 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3); 및
    (b) 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR) 내에 함유된 3개의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR1, LCDR2, LCDR3). 　
  19. 제18항에 있어서, 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자.
  21. 제18항에 있어서, 제1 항원 결합 도메인은 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR 및 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원 결합 도메인은 다음을 포함하는, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자:
    (a) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR) 내에 함유된 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3); 및
    (b) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR) 내에 함유된 3개의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3).
  23. 제22항에 있어서, 제2 항원 결합 도메인은 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 제2 항원 결합 도메인은 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자.
  25. 제22항에 있어서, 제2 항원 결합 도메인은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자.
  26. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원 결합 도메인은 다음을 포함하는, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자:
    (a) 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR) 내에 함유된 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3); 및
    (b) 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR) 내에 함유된 3개의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3).
  27. 제26항에 있어서, 제2 항원 결합 도메인은 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 제2 항원 결합 도메인은 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자.
  29. 제22항에 있어서, 제2 항원 결합 도메인은 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR 및 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR을 포함하는, 이중특이적 항원 결합 분자.
  30. 단리된 이중특이적 항원 결합 분자로서,
    (a) 서열번호 4의 HCDR1 아미노산 서열, 서열번호 6의 HCDR2 아미노산 서열, 및 서열번호 8의 HCDR3 아미노산 서열을 포함하는 제1 항원 결합 도메인; 및
    (b) 서열번호 12의 HCDR1 아미노산 서열, 서열번호 14의 HCDR2 아미노산 서열, 및 서열번호 16의 HCDR3 아미노산 서열을 포함하는 제2 항원 결합 도메인을 포함하는, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자.
  31. 제30항에 있어서, 서열번호 20의 LCDR1 아미노산 서열, 서열번호 22의 LCDR2 아미노산 서열, 및 서열번호 24의 LCDR3 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자.
  32. 제30항에 있어서,
    (a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR을 포함하는 제1 항원 결합 도메인; 및
    (b) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR을 포함하는 제2 항원 결합 도메인을 포함하는, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자.
  33. 제30항 또는 제32항에 있어서, 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR을 포함하는, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자.
  34. 단리된 이중특이적 항원 결합 분자로서,
    (a) 서열번호 34의 HCDR1 아미노산 서열, 서열번호 36의 HCDR2 아미노산 서열, 및 서열번호 38의 HCDR3 아미노산 서열을 포함하는 제1 항원 결합 도메인; 및
    (b) 서열번호 42의 HCDR1 아미노산 서열, 서열번호 44의 HCDR2 아미노산 서열, 및 서열번호 46의 HCDR3 아미노산 서열을 포함하는 제2 항원 결합 도메인을 포함하는, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자.
  35. 제34항에 있어서, 서열번호 50의 LCDR1 아미노산 서열, 서열번호 52의 LCDR2 아미노산 서열, 및 서열번호 54의 LCDR3 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자.
  36. 제34항에 있어서,
    (a) 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR을 포함하는 제1 항원 결합 도메인; 및
    (b) 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR을 포함하는 제2 항원 결합 도메인을 포함하는, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자.
  37. 제34항 또는 제36항에 있어서, 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR을 포함하는, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자.
  38. 단리된 이중특이적 항원 결합 분자로서, CD38에 결합하기 위해 경쟁하거나, CD38 상에서 제30항 내지 제37항 중 어느 한 항에 따른 기준 항체와 동일한 에피토프에 결합하는, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자.
  39. 단리된 이중특이적 항원 결합 분자로서, 인간 CD28에 결합하기 위해 경쟁하거나, 인간 CD28 상에서 제30항 내지 제37항 중 어느 한 항에 따른 기준 항체와 동일한 에피토프에 결합하는, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 이중특이적 항체인 단리된 이중특이적 항원 결합 분자.
  41. 제40항에 있어서, 이중특이적 항체는 인간 IgG 중쇄 불변 영역을 포함하는, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자.
  42. 제41항에 있어서, 인간 IgG 중쇄 불변 영역은 이소형 IgG1인, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자.
  43. 제41항에 있어서, 인간 IgG 중쇄 불변 영역은 이소형 IgG4인, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자.
  44. 제40항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체는 동일한 이소형의 야생형 힌지에 비해 Fc 수용체 결합을 감소시키는 키메라 힌지를 포함하는, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자.
  45. 인간 CD38에 특이적으로 결합하는 단리된 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 항체는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는, 단리된 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    (i) 서열번호 2 또는 32와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역(HCVR) 내에 함유된 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR)(HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3); 및 서열번호 18 또는 48과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역(LCVR) 내에 함유된 3개의 경쇄 CDR(LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3);
    (ii) 서열번호 2의 HCVR 아미노산 서열 내에 함유된 3개의 HCDR 및 서열번호 18의 LCVR 아미노산 서열 내에 함유된 3개의 LCDR1;
    (iii) 서열번호 32의 HCVR 아미노산 서열 내에 함유된 3개의 HCDR 및 서열번호 48의 LCVR 아미노산 서열 내에 함유된 3개의 LCDR1;
    (iv) 서열번호 4-6-8-20-22-24의 HCDR/LCDR 아미노산 서열 조합;
    (v) 서열번호 34-36-38-50-52-54의 HCDR/LCDR 아미노산 서열 조합;
    (vi) 서열번호 2 또는 32를 포함하는 HCVR 아미노산 서열; 및 서열번호 18 또는 48을 포함하는 LCVR 아미노산 서열;
    (vii) 서열번호 2를 포함하는 HCVR 아미노산 서열; 및 서열번호 18을 포함하는 LCVR 아미노산 서열; 및
    (viii) 서열번호 32를 포함하는 HCVR 아미노산 서열; 및 서열번호 48을 포함하는 LCVR 아미노산 서열.
  46. 인간 CD28에 특이적으로 결합하는 단리된 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 항체는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는, 단리된 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    (i) 서열번호 10 또는 40과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역(HCVR) 내에 함유된 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR)(HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3); 및 서열번호 18 또는 48과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역(LCVR) 내에 함유된 3개의 경쇄 CDR(LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3);
    (ii) 서열번호 10의 HCVR 아미노산 서열 내에 함유된 3개의 HCDR 및 서열번호 18의 LCVR 아미노산 서열 내에 함유된 3개의 LCDR;
    (iii) 서열번호 40의 HCVR 아미노산 서열 내에 함유된 3개의 HCDR 및 서열번호 48의 LCVR 아미노산 서열 내에 함유된 3개의 LCDR;
    (iv) 서열번호 12-14-16-20-22-24의 HCDR/LCDR 아미노산 서열 조합;
    (v) 서열번호 42-44-46-50-52-54의 HCDR/LCDR 아미노산 서열 조합;
    (vi) 서열번호 10 또는 40을 포함하는 HCVR 아미노산 서열; 및 서열번호 18 또는 48을 포함하는 LCVR 아미노산 서열;
    (vii) 서열번호 10을 포함하는 HCVR 아미노산 서열; 및 서열번호 18을 포함하는 LCVR 아미노산 서열; 및
    (viii) 서열번호 40을 포함하는 HCVR 아미노산 서열; 및 서열번호 48을 포함하는 LCVR 아미노산 서열.
  47. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 제45항 또는 제46항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물.
  48. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 제45항 또는 제46항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
  49. 제48항의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
  50. 제49항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  51. 대상체에서 형질 세포 종양의 성장을 억제하는 방법으로서, 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항의 단리된 이중특이적 항원 결합 분자 또는 제45항 또는 제46항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 제47항의 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  52. 제51항에 있어서, 형질 세포 종양은 다발성 골수종인, 방법.
  53. 대상체에서 종양의 성장을 억제하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항의 단리된 이중특이적 항원 결합 분자 또는 제45항 또는 제46항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 제47항의 약학적 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하되, 종양은 다발성 골수종, B-세포 백혈병, 간세포 암종, 비소세포 폐암, 흑색종, 췌장관 선암종, 신경교종, 유방암, 또는 CD38+ 세포를 갖는 것을 부분적으로 특징으로 하는 다른 암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  54. 제51항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 치료제 또는 치료 요법을 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  55. 제54항에 있어서, 제2 치료제는 항-BCMA/항-CD3 이중특이적 항원 결합 분자인, 방법.
  56. 제54항에 있어서, 제2 치료제는 항-CD20/항-CD3 이중특이적 항원 결합 분자인, 방법.
  57. 제54항에 있어서, 제2 치료제 또는 치료 요법은 화학요법제, DNA 알킬화제, 면역조절제, 프로테아좀 억제제, 히스톤 탈아세틸화효소 억제제, 방사선요법, 줄기 세포 이식, 상이한 종양 세포 표면 항원 및 T 세포 또는 면역 세포 항원과 상호작용하는 상이한 이중특이적 항체, 항체 약물 접합체, 항종양제에 접합된 이중특이적 항체, PD-1, PD-L1, 또는 CTLA-4 관문 억제제, 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
  58. 다발성 골수종을 앓고 있거나 또 다른 BCMA-발현 B 세포 암을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항의 단리된 이중특이적 항원 결합 분자 또는 제45항 또는 제제46항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 제47항의 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  59. 제58항에 있어서, BCMA-발현 B 세포 암은 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 버킷 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 비호지킨 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 여포성 림프종, 외투 세포 림프종, 변연부 림프종, 림프형질성 림프종, 및 호지킨 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  60. 제58항 또는 제59항에 있어서, 제2 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  61. 제60항에 있어서, 제2 치료제는 항-BCMA/항-CD3 이중특이적 항원 결합 분자인, 방법.
  62. 제60항에 있어서, 제2 치료제 또는 치료 요법은 화학요법제, DNA 알킬화제, 면역조절제, 프로테아좀 억제제, 히스톤 탈아세틸화효소 억제제, 방사선요법, 줄기 세포 이식, 상이한 종양 세포 표면 항원 및 T 세포 또는 면역 세포 항원과 상호작용하는 상이한 이중특이적 항체, 항체 약물 접합체, 항종양제에 접합된 이중특이적 항체, PD-1, PD-L1, 또는 CTLA-4 관문 억제제, 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
  63. CD38+ 종양 및/또는 BCMA-발현 종양을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항의 단리된 이중특이적 항원 결합 분자 또는 제45항 또는 제제46항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 제47항의 약학적 조성물을 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 함께 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  64. 제63항에 있어서, 항-PD-1 항체 또는 항원 결합 단편은 항-PD-1 항체인, 방법.
  65. 제64항에 있어서, 항-PD-1 항체는 세미플리맙(bsAb2810)인, 방법.
  66. CD38 및/또는 BCMA의 발현과 연관된 질환 또는 장애의 치료에 있어서, 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항의 단리된 이중특이적 항원 결합 분자 또는 제45항 또는 제46항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 제47항의 약학적 조성물의 용도.
  67. 제66항에 있어서, 질환 또는 장애는 암인, 용도.
  68. 제67항에 있어서, 암은 다발성 골수종인, 용도.
  69. 제66항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자 또는 약학적 조성물은 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 조합하여 사용하기 위한 것인, 용도.
  70. 제66항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 단리된 이중특이적 항원 결합 분자 또는 약학적 조성물은 정맥 내, 근육 내, 또는 피하 주입되는, 용도.
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