KR20220151172A - 항-gitr 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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드루 더전
유 후앙
로살린 몰덴
윌리엄 올슨
매튜 슬리만
디미트리스 스코코스
베이 왕
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리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드
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Abstract

글루코코르티코이드-유도 종양 괴사 인자 수용체(GITR)에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 항원 결합 단편, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물, 및 예를 들어 이를 사용하는 치료 방법을 포함하여, 이를 사용하는 방법이 본원에 제공된다.

Description

항-GITR 항체 및 이의 용도
본 개시는 글루코코르티코이드-유도 종양 괴사 인자 수용체(GITR)에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 항원 결합 단편 및 이의 사용 방법에 관한 것이다.
서열 목록
서열 목록의 공식 사본은, 2021년 3월 5일자로 생성되고 10671WO01_Sequence_Listing_ST25.TXT의 파일명을 가진 약 60 KB 크기의 ASCII 형식의 서열 목록으로서, EFS-Web을 통해 본 명세서와 동시에 전자 방식으로 제출된다. 본 ASCII 형식의 문헌에 포함된 서열 목록은 본 명세서의 일부이며 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
글루코코르티코이드-유도 종양 괴사 인자 수용체(GITR)는 종양 괴사 인자 수용체 상과(TNFRSF)의 구성원이다. GITR 발현은 조절 T 세포 상에서 구성적으로 높고, 미노출 T 세포, NK 세포, 및 과립구 상에서 낮거나 중간 정도이며, 활성화 시 유도 가능하다. GITR은 항원 제시 세포에서 주로 발현되는 이의 리간드인 GITRL과 상호작용한다. GITR 수용체 활성화는 효과기 T 세포 증식 및 기능을 증강시킬 뿐만 아니라 조절 T 세포에 의해 유도된 억제를 약화시킬 수도 있다. 결과적으로, GITR 활성의 조절은 암 면역 요법 및 면역 장애에 대한 근거로서의 역할을 할 수 있다. 따라서, GITR의 활성을 조절하는 제제, 예를 들어 항체가 필요하다.
본 개시는 글루코코르티코이드-유도 종양 괴사 인자 수용체(GITR)에 결합하는 항체 및 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 본원에 제공된 항체는 면역 세포, 예를 들어 효과기 T 세포, 조절 T 세포, 및 GITR을 발현하는 자연 살해(NK) 세포를 표적화하는 데 특히 유용하다. 항체는 항체의 생체 내 절단이 최소화된다는 점에서 특히 유용하다.
본원에서 제공된 항체는 전장(예를 들어, IgG1 또는 IgG4 항체)이거나 항원 결합 부분(예를 들어, Fab, F(ab’)2, 또는 scFv 단편)만을 포함할 수 있고, 기능에 영향을 미치도록 변형되어, 예를 들어, 잔류 효과기 기능을 제거할 수 있다(Reddy 등의 2000, J. Immunol. 164:1925-1933 참조).
본원에 제공된 예시적인 항-GITR 항체는 표 7, 8, 및 9에 열거되어 있다. 표 7은 예시적인 항-GITR 항체의 중쇄 가변 영역(HCVR), 경쇄 가변 영역(LCVR), 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR1, HCDR2 및 HCDR3), 및 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)의 아미노산 서열 식별자를 제시한다. 표 8은 예시적인 항-GITR 항체의 HCVR, LCVR, HCDR1, HCDR2 HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 핵산 서열 식별자를 제시한다. 표 9는 예시적인 항-GITR 항체의 전장 중쇄 및 경쇄 서열에 대한 서열 식별자를 제공한다.
본 개시는 GITR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하며, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 22, 28, 34, 및 40으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역(HCVR) 아미노산 서열 내에 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3)을 포함하고; 서열번호 10의 경쇄 아미노산 영역(LCVR) 아미노산 서열 내에 3개의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3)을 포함한다.
본 개시는 GITR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하며, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 22, 28, 34, 및 40으로 이루어진 군으로부터 선택된 HCVR 아미노산 서열; 및 서열번호 10의 LCVR 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시는 GITR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하며, 여기서 항체는 서열번호 26, 32, 38, 및 44로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 아미노산 서열; 및 서열번호 20의 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시는 GITR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하며, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 N101D, N101E, N101S, 또는 N101T 돌연변이로 변형된 서열번호 2의 HCVR 아미노산 서열 내에 3개의 중쇄 CDR를 포함하고; 서열번호 10의 LCVR 아미노산 서열 내에 3개의 경쇄 CDR을 포함한다.
본 개시는 GITR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하며, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 N101A, N101F, N101G, N101H, N101I, N101K, N101L, N101M, N101P, N101Q, N101R, N101V, N101W, 또는 N101Y 돌연변이로 변형된 서열번호 2의 HCVR 아미노산 서열 내에 3개의 중쇄 CDR을 포함하고; 서열번호 10의 LCVR 아미노산 서열 내에 3개의 경쇄 CDR을 포함한다.
본 개시는 GITR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하며, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 S103A, S103D, S103E, S103F, S103G, S103H, S103I, S103K, S103L, S103M, S103N, S103P, S103Q, S103R, S103T, S103V, S103W, 또는 S103Y 돌연변이로 변형된 서열번호 2의 HCVR 아미노산 서열 내에 3개의 중쇄 CDR을 포함하고; 서열번호 10의 LCVR 아미노산 서열 내에 3개의 경쇄 CDR을 포함한다.
본원에 표 1에 제공되어 있고 U.S. 2017/0355774A1에 개시된 항체로서, HCVR에서 N101 또는 S103 돌연변이가 결여된 항체는 명시적으로 배제된다.
본 개시는 GITR에 특이적으로 결합하고, HCVR 및 LCVR을 포함하는 항원 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하며, 여기서 HCVR은 표 7에 열거된 HCDR3 아미노산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 HCDR3 아미노산 서열을 포함한다. 추가로, HCVR은 표 7에 열거된 HCVR 아미노산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이와 실질적으로 유사한 서열을 포함할 수 있다. LCVR은 표 7에 열거된 LCVR 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이와 실질적으로 유사한 서열을 포함할 수 있다.
본 개시는 또한, GITR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 표 7에 열거된 LCVR 아미노산 서열 및 이와 쌍을 형성한 표 7에 열거된 HCVR 아미노산 서열을 포함하는 HCVR 및 LCVR 아미노산 서열 쌍(HCVR/LCVR)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 소정의 구현예에 따르면, 본 개시는 표 7에 열거된 예시적인 항-GITR 항체 중 어느 하나에 함유된 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 소정의 구현예에서, HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍은 서열번호 22/10, 28/10, 34/10, 및 40/10으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 개시는 또한, GITR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 표 7에 열거된 HCDR3 아미노산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 중쇄 CDR3(HCDR3)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 개시는 또한, GITR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 표 7에 열거된 LCDR3 아미노산 서열 및 이와 쌍을 형성한 표 7에 열거된 HCDR3 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 HCDR3 및 LCDR3 아미노산 서열 쌍(HCDR3/LCDR3)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 소정의 구현예에 따르면, 본 개시는 표 7에 열거된 예시적인 항-GITR 항체 중 어느 하나에 함유된 HCDR3/LCDR3 아미노산 서열 쌍을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 소정의 구현예에서, HCDR3/LCDR3 아미노산 서열 쌍은 서열번호 24/16, 30/16, 36/16, 및 42/16으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 개시는 또한, GITR에 특이적으로 결합하고 표 7에 열거된 예시적인 항-GITR 항체 중 어느 하나에 함유된 6개의 CDR 세트(즉, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 소정의 구현예에서, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 아미노산 서열 세트는 서열번호 4-6-24-12-14-16, 4-6-30-12-14-16, 4-6-36-12-14-16, 및 4-6-42-12-14-16로 이루어진 군으로부터 선택된다.
관련 구현예에서, 본 개시는 GITR에 특이적으로 결합하고 표 7에 열거된 예시적인 항-GITR 항체 중 어느 하나에 의해 정의된 것과 같은 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍 내에 함유된 6개의 CDR 세트(즉, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 예를 들어, 본 개시는 GITR에 특이적으로 결합하고 서열번호 24/16, 30/16, 36/16, 및 42/16으로 이루어진 군으로부터 선택된 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍에 함유된 HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 아미노산 서열 세트를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
본 개시는 또한 항-GITR 항체 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 예를 들어, 본 개시는 표 7에 열거된 HCVR 아미노산 서열 중 어느 하나를 암호화하는 핵산 분자를 제공하며; 특정 구현예에서, 핵산 분자는 표 8에 열거된 HCVR 핵산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.
본 개시는 또한, 표 7에 열거된 LCVR 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자를 제공하며; 소정의 구현예에서, 핵산 분자는 표 8에 열거된 LCVR 핵산 서열의 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.
본 개시는 또한, 표 7에 열거된 HCDR3 아미노산 서열 중 어느 하나를 암호화하는 핵산 분자를 제공하며; 특정 구현예에서, 핵산 분자는 표 8에 열거된 HCDR3 핵산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.
본 개시는 또한, HCVR을 암호화하는 핵산 분자를 제공하며, 여기에서 HCVR은 3개의 CDR 세트(즉, HCDR1-HCDR2-HCDR3)를 포함하되, HCDR1-HCDR2-HCDR3 아미노산 서열 세트는 표 7에 열거된 예시적인 항-GITR 항체 중 어느 하나에 의해 정의된 바와 같다.
본 개시는 또한 HCVR 및 LCVR 둘 모두를 암호화하는 핵산 분자를 제공하며, 여기에서 HCVR은 표 7에 열거된 HCVR 아미노산 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고, LCVR은 표 7에 열거된 LCVR 아미노산 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 핵산 분자는 표 8에 열거된 HCVR 핵산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열, 및 표 8에 열거된 LCVR 핵산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 포함한다. 본원에 제공된 이러한 양태에 따른 소정의 구현예에서, 핵산 분자는 HCVR 및 LCVR을 암호화하되, HCVR 및 LCVR 둘 모두는 표 7에 열거된 동일한 항-GITR 항체로부터 유래된다.
본 개시는 또한, 항-GITR 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 발현할 수 있는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 예를 들어, 본 개시는 전술한 핵산 분자 중 어느 하나, 즉 표 7에 제시된 바와 같은 HCVR, LCVR, 및/또는 CDR 서열 중 어느 하나를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 포함한다. 숙주 세포, 예를 들어 이러한 벡터가 도입된 포유류 숙주 세포와 같은 진핵 숙주 세포도 본 개시의 범주에 포함된다. 예시적인 진핵 숙주 세포는 효모 및 포유류 세포, 예를 들어 마우스, 랫트, 원숭이, 또는 인간 세포주와 같은 척추동물 세포, 예를 들어 HKB11 세포, PER.C6 세포, HEK 세포, 또는 CHO 세포를 포함한다. 항체 또는 항체 단편의 생산을 가능하게 하는 조건 하에서 숙주 세포를 배양하고 그렇게 생산된 항체 및 항체 단편을 회수함으로써 항체 또는 이의 일부분을 생산하는 방법이 또한 본원에 제공된다.
본 개시는 변형된 당질화 패턴을 갖는 항-GITR 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 예를 들어 항체 의존적 세포 독성(ADCC) 기능을 증가시키기 위해 바람직하지 않은 당질화 부위를 제거하는 변형이 유용하거나, 올리고당 사슬에 존재하는 푸코오스 모이어티가 결여된 항체가 유용할 수 있다(Shield 등의 문헌[(2002) JBC 277:26733] 참조). 다른 응용예에서, 보체 의존적 세포독성(CDC)을 변형시키기 위해 갈락토실화 변형이 이뤄질 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 GITR에 특이적으로 결합하는 재조합 인간 항체 또는 이의 단편, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 관련된 양태에서, 본 개시는 항-GITR 항체 및 제2 치료제의 조합인 조성물을 포함한다. 일 구현예에서, 제2 치료제는 항-GITR 항체와 유리하게 조합되는 임의의 제제이다. 본 개시는 또한 세포독성제에 접합된 항-GITR 항체를 포함하는 항체-약물 접합체(ADC)를 제공한다. 본 개시의 항-GITR 항체를 포함하는 예시적인 병용 요법 및 공동-제형이 본원의 다른 곳에서 개시된다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 GITR에 특이적으로 결합하는 재조합 인간 항체 또는 이의 단편을 포함하는 약학적 조성물로서, 종양 세포를 살해하거나, 종양 세포 성장을 억제 또는 약화시키거나, 달리 암환자를 치료하기 위한 의약의 제조에 사용하기 위한 약학적 조성물을 제공한다. 일부 양태에서, 약학적 조성물은 제2 치료제와 치료적으로 조합된다. 일부 양태에서, 제2 치료제는 PD-1 억제제이다. 일부 양태에서, PD-1 억제제는 세미플리맙(cemiplimab)이다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 본원에 제공된 항-GITR 항체 또는 항체의 항원 결합 부분을 사용하여, 종양 세포를 살해하거나, 종양 세포 성장을 억제 또는 약화시키거나, 달리 암환자를 치료하기 위한 치료 방법을 제공한다. 본원에 제공된 이러한 양태에 따른 치료 방법은 본원에 제공된 항체 또는 항체의 항원 결합 단편을 포함하는 약학적 조성물의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 치료되는 장애는, GITR을 표적화하고/하거나, T 세포 증식 또는 기능을 증가시키고/시키거나, 조절 T 세포에 의해 유도된 억제 활성을 억제함으로써 개선되거나, 완화되거나, 억제되거나, 예방되는 임의의 질환 또는 병태이다. 일부 양태에서, 상기 방법은 제2 치료제를 이를 필요로 하는 환자 또는 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 제2 치료제는 PD-1 억제제이다. 일부 양태에서, PD-1 억제제는 세미플리맙이다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 GITR에 특이적으로 결합하는 재조합 인간 항체 또는 이의 단편, 또는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약학적 조성물로서, 종양 세포를 살해하거나, 종양 세포 성장을 억제 또는 약화시키거나, 달리 암환자를 치료하기 위한 의약의 제조에 사용하기 위한 항체 또는 이의 단편 또는 이들을 포함하는 약학적 조성물의 용도를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 항-GITR 항체 또는 항-GITR 항체의 항원 결합 부분을 및 항-PD1 항체 또는 항-PD1 항체의 항원 결합 부분의 조합을 사용하여, 종양 세포를 살해하거나, 종양 세포 성장을 억제 또는 약화시키거나, 달리 암환자를 치료하기 위한 치료 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 항-PD1 항체는 세미플리맙이다. 본원에 제공된 이러한 양태에 따른 치료 방법은 항-GITR 및 항-PD1 항체의 조합을 포함하는 약학적 조성물 또는 항원 결합 단편 조성물의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 치료되는 장애는 GITR 및 PD1 둘 다를 표적화함으로써 개선되거나, 경감되거나, 억제되거나, 예방되는 임의의 질환 또는 병태이다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 암을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (i) 다음을 포함하는 항-GITR 항체 또는 이의 항원 결합 단편: 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3, 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3; 및 (ii) 세미플리맙을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 암은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 편평 세포 피부암, 피부 편평 세포 암종(CSCC), 골수종, 폐암, 흑색종, 두경부 편평 세포 암종(SCCHN), 소세포 폐암, 비소세포 폐암(NSCLC), 자궁경부암(예를 들어 자궁경부 편평 세포 암종(자궁경부 SCC)), 유방암, 및 신장 세포 암종(RCC), 선암종, 결장암(CRC), 췌장 암종, 두경부암, 전립선암, 다형성 교아종, 악성 신경교종, 골육종, 결장암, 위암(예: MET 증폭이 있는 위암), 악성 중피종, 다발성 골수종, 난소암, 윤활막 육종, 갑상선암, 유방암(삼중 음성 유방암 포함), 고환암, 식도암, 자궁암, 자궁내막암, 간암, 면역 관문 차단(ICB) 미노출 암, ICB에 노출된 암.
또 다른 양태에서, 본 개시는 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하는 방법에 사용하기 위한 의약의 제조에 있어서, 다음을 포함하는 항-GITR 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 사용 방법을 제공한다: 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3, 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3. 상기 방법은 항-GITR 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 세미플리맙을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 암은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 편평 세포 피부암, 피부 편평 세포 암종(CSCC), 골수종, 폐암, 흑색종, 두경부 편평 세포 암종(SCCHN), 소세포 폐암, 비소세포 폐암(NSCLC), 자궁경부암(예를 들어 자궁경부 편평 세포 암종(자궁경부 SCC)), 유방암, 및 신장 세포 암종(RCC), 선암종, 결장암(CRC), 췌장 암종, 두경부암, 전립선암, 다형성 교아종, 악성 신경교종, 골육종, 결장암, 위암(예: MET 증폭이 있는 위암), 악성 중피종, 다발성 골수종, 난소암, 윤활막 육종, 갑상선암, 유방암(삼중 음성 유방암 포함), 고환암, 식도암, 자궁암, 자궁내막암, 간암, 면역 관문 차단(ICB) 미노출 암, ICB에 노출된 암.
또 다른 양태에서, 본 개시는 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하는 방법에 사용하기 위한 항-GITR 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하며, 상기 방법은 (i) 다음을 포함하는 항-GITR 항체 또는 이의 항원 결합 단편: 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3, 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3; 및 (ii) 세미플리맙을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 암은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 편평 세포 피부암, 피부 편평 세포 암종(CSCC), 골수종, 폐암, 흑색종, 두경부 편평 세포 암종(SCCHN), 소세포 폐암, 비소세포 폐암(NSCLC), 자궁경부암(예를 들어 자궁경부 편평 세포 암종(자궁경부 SCC)), 유방암, 및 신장 세포 암종(RCC), 선암종, 결장암(CRC), 췌장 암종, 두경부암, 전립선암, 다형성 교아종, 악성 신경교종, 골육종, 결장암, 위암(예: MET 증폭이 있는 위암), 악성 중피종, 다발성 골수종, 난소암, 윤활막 육종, 갑상선암, 유방암(삼중 음성 유방암 포함), 고환암, 식도암, 자궁암, 자궁내막암, 간암, 면역 관문 차단(ICB) 미노출 암, ICB에 노출된 암.
다른 구현예는 다음의 상세한 설명을 검토함으로써 명백해질 것이다.
도 1은 CompAb1을 원숭이 혈청 및 PBS에서 배양했을 때 관찰된 CompAb1의 절단 증가를 도시한 것이다. 원숭이 혈청에서의 추정 절단 속도는 대략 1.5%/일이었고, PBS에서는 대략 0.5%/일이었다.
도 2는 마우스에게 CompAb1를 10 mg/kg으로 투여했을 때 관찰된 CompAb1의 절단 증가를 도시한 것이다. CompAb1을 마우스 혈청 및 PBS에 첨가한 후, 0일차 대조군으로서 풀 다운(친화도 정제)하였다.
도 3은 IgG-고갈 인간 혈청에서 인큐베이션 후 CompAb1 항체에서 절단 증가가 관찰되고 변이체 mAb1 또는 mAb2에서는 변화가 없음을 도시한 것이다. CompAb1 항체는 C-말단에서 1.9%/일 및 N-말단에서 0.7%/일의 절단 속도를 나타냈다.
도 4는 마우스 혈청에서 시험관 내 인큐베이션 후 CompAb1 항체(CompAb1로도 지칭됨)에서 절단 증가가 관찰되고 변이체 mAb1 또는 mAb2에서는 변화가 없음을 도시한 것이다. 마우스 혈청에서, CompAb1 항체에 대한 추정 절단 속도는 적어도 1.7%/일이었다.
도 5a, 도 5b, 및 도 5c는 18pM 내지 300nM의 농도 범위에서 mAb1 및 IgG1 이소형 대조군이 저캇/hCD20(도 5a), 저캇/hCD20/hGITR(도 5b), 및 저캇/hCD20/MfGITR(도 5c) 세포에 표면 결합하는 것을 도시한 것이다. 결합은 Alexa647-표지된 항-인간 IgG를 사용해 유세포 계측법으로 검출하였다. 형광 강도를 기하학적 MFI로서 도표화하였다. h, 인간; Mf, 필리핀 원숭이(Macaca fascicularis)(시노몰구스 원숭이).
도 6은 활성화된 (CD25+) 인간 일차 T 세포에 대한 항체 결합을 도시한 것이다. 4명의 별도 공여자의 일차 인간 T 세포를 항-CD2/항-GITR/항-CD28로 코팅된 비드로 시험관 내에서 자극하였다. 8pM 내지 200nM의 농도 범위에서 AF647-접합된 mAb1 및 AF647-접합된 IgG1 이소형 대조군이 CD25+ 및 CD25- 인간 일차 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 세포 표면 결합하는 것은 유세포 계측법을 사용해 검출하였다. 형광 강도는 기하 MFI로서 도표화하였다. Hu, 인간
도 7은 CD69+ 시노몰구스 원숭이 일차 T 세포에 대한 항체 결합을 도시한 것이다. 4명의 별도 공여자의 일차 시노몰구스 원숭이 T 세포를 항-CD2/항-CD3/항-CD28로 코팅된 비드로 시험관 내에서 자극하였다. 8pM 내지 200nM의 농도 범위에서 AF647-접합된 mAb1 및 AF647-접합된 IgG1 이소형 대조군이 CD69+ 및 CD69- 시노몰구스 원숭이 일차 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 세포 표면 결합하는 것은 유세포 계측법을 사용해 검출하였다. 형광 강도는 기하 MFI로서 도표화하였다. Mf, Macaca fascicularis (시노몰구스 원숭이)
도 8a, 도 8b, 도 8c, 및 도 8d는 저캇/NFAT-Luc/hFcγR3a 및 저캇/NFAT-Luc/MfFcγR3a 효과기 세포에서 Fc-매개 NFAT 활성을 도시한 것이다. 무항체 대조군 및 저캇/hCD20 (도 8a, 8c) 또는 저캇/hCD20/hGITR (도 8b) 또는 저캇/hCD20/MfGITR (도 8d) 세포가 존재하는 가운데 저캇/NFAT-Luc/hFcγR3a 및 저캇/NFAT-Luc/MfFcγR3a을(1:2의 효과기 세포:표적 세포 비율) 916fM 내지 60nM의 mAb1 또는 IgG1 이소형 대조군 또는 45.8fM 내지 3nM의 항-CD20 IgG1과 함께 인큐베이션하였다. 저캇/NFAT-Luc/hFcγR3a 및 저캇/NFAT-Luc/MfFcγR3a 세포에서의 신호전달은 루시퍼라아제 활성으로서 검출하고, 발광 신호의 정량화에 의해 측정하여 상대적 광 단위(RLU)로서 보고하였다. 2개의 웰에서 수행한 검정 데이터는 평균 ±SD로서 도표화하였다.
도 9a, 9b, 9c, 9d, 9e, 및 9f는 인간 또는 시노몰구스 원숭이 GITR을 발현하도록 조작된 저캇 T 세포에 대한 항체 매개 ADCC를 도시한 것이다. 저캇/hCD20(도 9a, 9d), 저캇/hCD20/hGITR(도 9b, 9e), 또는 저캇/hCD20/MfGITR(도 9c, 9f) 표적 세포를 9.5 fM 내지 10 nM 농도 범위의 인간 NK 세포(5:1의 효과기 세포 대 표적 세포 비율) 및 mAb1, IgG1 이소형 대조군, 및 항-CD20 IgG1과 함께 3.5시간 동안 인큐베이션하였다. 세포독성은, 발광 판독을 사용하여 세포 집단에서 사멸 세포의 상대 수를 측정하는 발광 세포독성 검정인, 상업적으로 이용 가능한 CytoTox-Glo 검정을 사용하여 결정하였다. 각 그래프의 점선은 항체가 없을 때 NK 세포를 첨가했을 때 관찰된 비특이적 세포독성의 수준을 나타낸다. 3개의 웰에서 수행된 검정의 데이터를 평균 ±SD로서 도표화하였다.
도 10a, 10b, 도 10c, 및 도 10d는 인간 일차 T 세포에 대한 ADCC의 항체 매개를 도시한다. 인간 일차 Treg(도 10a, 10c) 및 CD8+ T 세포(도 10b, 10d)(표적 세포)를 PBMC(3명의 공여자)로부터 단리하고, 배양물에서 자극하고 증식시킨 다음, 전혈(2명의 공여자)로부터 단리한 인간 일차 NK 세포(효과기 세포)와 함께 인큐베이션하였다(5:1의 효과기 세포 대 표적 세포 비율). 169 fM 내지 10 nM의 농도 범위의 mAb1, IgG1 이소형 대조군, 또는 항-GITR IgG1을 효과기 세포 및 표적 세포와 함께 3.5시간 동안 인큐베이션하였다. 세포독성은, 세포 집단에서 사멸 세포의 상대 수를 측정하는 발광 세포독성 검정인, 상업적으로 이용 가능한 CytoTox-Glo 검정을 사용하여 결정하였다. 각 그래프의 점선은 항체가 없을 때 NK 세포를 첨가했을 때 관찰된 비특이적 세포독성의 수준을 나타낸다. 3개의 웰에서 수행된 검정의 데이터를 평균 ±SD로서 도표화하였다.
도 11a, 11b, 및 11c는 인간 또는 시노몰구스 원숭이 GITR을 발현하도록 조작된 저캇 T 세포에 대한 항체 매개 ADCP를 도시한 것이다. CellTrace CFSE 염료로 표지된 저캇/hCD20(도 11a), 저캇/hCD20/hGITR(도 11b), 또는 저캇/hCD20/MfGITR(도 11c) 표적 세포를, 무항체 대조군을 포함하여, CellTrace Far Red 염료로 표지된 인간 1차 단핵구-유래 식세포 및 mAb1, IgG1 이소형 대조군, 또는 항-CD20 IgG1(381 fM 내지 100 nM의 농도 범위)과 함께 1 내지 2시간 동안 인큐베이션하였다. 식균작용은 Opera Phoenix High-Content 스크리닝 시스템을 이용해 형광 영상화로 분석하고, Far Red-표지된 세포 집단(Far Red 염료로 표지된 식세포, 647 nm 방출 채널에서 검출됨) 내에서 녹색 형광의 강도(CFSE로 표지된 표적 세포, 488 nm 방출 채널에서 검출됨)로서 측정하고, 상대 형광 단위(RFU)로 보고하였다. 2개의 웰에서 수행한 검정 데이터는 평균 ±SD로서 도표화하였다.
도 12a, 12b, 12c, 12d, 12e, 및 12f는 항-GITR-매개 일차 CD4+ T 세포 증식에 항-GITR 항체가 미치는 영향을 도시한다. 풍부한 인간 일차 T 세포(6명의 공여자)를, 고정 농도(2 nM)의 자극성 항-CD3 및 HEK293/FcγR2b 부속 세포가 존재하는 가운데, 일정 농도 범위의(32 fM 내지 133 nM) mAb1 또는 IgG1 이소형 대조군의 연속 희석물과 함께 인큐베이션하였다. 3개의 웰에서 수행한 검정의 데이터는 평균 ±SD로서 도표화하였다. T 세포 증식은 (분열하는 세포 내에 혼입된 삼중수소화 티미딘으로부터) 삼중수소 붕괴의 검출을 통해 측정하였고, CPM으로서 보고하였다. 각 그래프의 점선은 적정된 항체가 없는 상태에서 자극성 항-GITR을 첨가했을 때 관찰된 증식 수준을 나타낸다.
도 13은 인간 GITR-L에 대한 인간 GITR 결합에 항-GITR 항체가 미치는 영향을 도시한다. 고정된 인간 GITR-L에 대한 일정 농도 범위(3.4 pM 내지 200 nM)의 인간 GITR 단백질인 hGITR.mmH의 결합을 ELISA에 의해 평가하고, 결합에 대한 EC50 값을 결정하였다. hGITR-L에 대한 결합에 대해 계산한 EC50 값에 기초하여, 고정 농도의 재조합 hGITR.mmH(1.5 nM)를 일정 농도(51 pM 내지 3 μM)의 mAb1 또는 IgG1 이소형 대조군과 함께 사전 인큐베이션하고, 고정된 인간 GITR-L을 함유하는 웰에 첨가하여, 고정된 인간 GITR-L에 대한 hGITR.mmH 결합을 차단하는 항체의 능력을 결정하였다. hGITR.mmH의 결합은 TMB 기질을 사용하여 HRP-접합된 cMyc 항체로 검출하고, 분광 광도법으로 OD450을 측정하였다.
도 14는 항-GITR 항체가 ADC에 미치는 영향을 보여준다. 5% NHS가 있거나 없는 상태에서, 저캇/hCD20, 저캇/hCD20/hGITR, 또는 저캇/hCD20/MfGITR 표적 세포를, 119 fM으로 설정된 무항체 대조군을 포함하여, 477 fM 내지 500 nM의 농도 범위의 mAb1, IgG1 이소형 대조군, 및 항-CD20 IgG1과 함께 3.5시간 동안 인큐베이션하였다. 세포독성은, 세포 집단에서 사멸 세포의 상대 수를 측정하는 발광 세포독성 검정인, 상업적으로 이용 가능한 CytoTox-Glo 검정을 사용하여 결정하였다. 각 그래프의 점선은 항체가 없을 때 5% NHS를 첨가했을 때 관찰된 비특이적 세포독성의 수준을 나타낸다. 3개의 웰에서 수행된 검정의 데이터를 평균 ±SD로서 도표화하였다.
도 15a 및 도 15b는 가용성 GITR과 함께 인큐베이션했을 때, 항-GITR 항체가 C1q에 결합할 수 있는 면역 복합체를 형성하지 못함을 입증한다. 30 nM의 GITR mAb1 또는 IgG1 이소형 대조군을 재조합 인간 GITR 엑토 도메인 단백질 단량체인 hGITR.mmH(도 15a), 또는 이량체 hGITR.mFc(도 15b)와 1:1의 몰비로 함께 인큐베이션하였다. 항체, hGITR.mmH, 또는 hGITR.mFc만을 함유하는 대조군 웰을 또한 평가하였다. 분석 전에 모든 샘플을 키트 검정 용액으로 50배 희석하였다. 높은 HAGG 양성 대조군(38 μg Eq/mL) 및 낮은 HAGG 양성 대조군(15 μg Eq/mL)을 병렬로 분석하였으며, 각 대조군 샘플의 C1q 결합은 각각 11 내지 26 μg Eq/mL 및 4 μg Eq/mL 미만의 예상 범위 내에서 관찰되었다. 점선은 4 μg Eq/mL를 나타낸다. 3회 시험한 샘플의 데이터는 평균 ± SD로서 도표화되어 있다.
도 16a 및 도 16b는 인간 PD-L1이 존재하는 가운데 세미플리맙으로 처리한 항-GITR-자극 일차 CD3+ T 세포, 공여자 555105(도 16a), 및 공여자 555130(도 16b)로부터 IL-2 방출이 향상되었음을 도시한 것이다. 풍부한 인간 일차 T 세포를, 고정 농도(20 nM)의 세미플리맙이 존재하는 가운데 mAb1 또는 IgG1 이소형 대조군의 연속 희석물; 또는 RBL-2H3/αCD3 또는 RBL-2H3/αCD3/hPD-L1이 1:2의 항원 제시 세포 대 T 세포 비율로 존재하는 가운데 76 fM 내지 200 nM의 농도 범위의 IgG4P 이소형 대조군의 연속 희석물과 함께 인큐베이션하였다. 3개의 웰에서 수행한 검정의 데이터는 평균 ±SD로서 도표화하였다. IL-2 방출은 제조사의 프로토콜에 따라 PerkinElmer의 인간 IL-2 키트를 사용해 측정하였다.
도 17은 MC38 마우스 결장 종양 세포를 피하 접종한 GITR/GITR-L 인간화 마우스에서 항-GITR 항체에 의한 종양 내 T 조절 세포의 고갈 및 CD8+ T 세포/T 조절 세포 비율의 증가를 도시한 것이다.
도 18은 GITR/GITR-L-PD-1 인간화 마우스에서 1 mg/kg의 세미플리맙과 10 mg/kg mAb1의 병용 요법이 세미플리맙 단독요법과 비교하여 MC38 종양 성장의 더 크게 감소시킨다는 것을 보여준다.
도 19a, 19b, 도 19c, 도 19d, 및 도 19e는 세미플리맙 단독요법(도 19b)에 비해 1 mg/kg의 세미플리맙과 0.1 mg/kg의 mAb1(도 19e), 1.0 mg/kg의 mAb1(도 19d), 및 10 mg/kg의 mAb1(도 19c)으로 병용 치료한 마우스에서 MC38 종양이 더 높은 빈도로 제거됨을 보여준다. 이소형 대조군을 이용한 치료는 도 19a에 도시되어 있다.
도 20은 세미플리맙 단독요법과 비교하여 1 mg/kg의 세미플리맙 및 10 mg/kg mAb1로 병용치료했을 때, MC38 종양을 가진 마우스에서 생존율이 더 높음을 도시한 것이다.
종양 내 면역 세포를 표적화함으로써 종양 미세환경을 조절하는 것은 암 치료를 위한 치료 접근법이다. 구체적으로, 종양 내 T 세포의 세포 표면에서 발현된 공자극 및 공억제 면역 관문 수용체를 표적화하는 것은 종양 세포에 대한 세포독성을 강화하고 국소 면역 억제를 하향 조절함으로써 내인성 항종양 반응을 촉진할 수 있다.
글루코코르티코이드-유도 종양 괴사 인자 수용체-관련 단백질(GITR)로도 알려진 종양 괴사 인자 수용체 상과 구성원 18(TNFRSF18)은, 조절 T 세포(Treg) 및 비-Treg(종래 T 세포로서 지칭됨)뿐만 아니라 면역 체계의 다른 세포 상에서도 발현되는 공자극 수용체이다. GITR은 휴지 T 세포 상에서 낮은 수준으로 발현되고 T 세포 활성화 후 상향 조절되는데, 활성화된 Treg 상에서의 발현은 활성화된 종래 T 세포보다 더 높다(Shimizu 등의 문헌[Nature Immunology, 23(2): 135-142, 2002]; Krausz 등의 문헌[The Scientific World Journal, 7: 533-66, 2007]; Knee 등의 문헌[European Journal of Cancer, 67: 1-10, 2016]). 활성화된 Treg 상에서 GITR의 차등 발현 프로파일은, GITR을, 활성화된 종양 내 Treg를 우선적으로 고갈시켜 항종양 면역성을 촉진하는 매력적인 표적으로 만든다.
mAb1 및 mAb2는 활성화된 Treg를 우선적으로 고갈시키는 인간 IgG1 GITR 작용제 항체이다. GITR 작용제 항체는, GITR 세포 표면 발현과 상관이 있는 종양 내 Treg를 FcγR 의존성 방식으로 우선적으로 고갈시킴으로써 (예를 들어 항체 의존성 세포 세포독성/포식작용[ADCC/ADCP]) 항종양 면역성을 유도할 수 있다. 이들 GITR 항체는 예정 세포 사멸-1(PD-1) 관문 차단과 상승작용하여, 전임상 모델에서 장기적인 항종양 반응을 유도할 수 있다. 일부 양태에서, 항-GITR 항체는 PD-1 억제제, 예를 들어 세미플리맙과 조합된다. 이론에 구속되고자 하는 것은 아니지만, PD-1 억제제는 항-GITR-자극된 T 세포 활성화를 향상시키는 항-GITR 항체의 능력을 회복시킬 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 항-GITR 항체를 PD-1 억제제와 치료적으로 조합하면 PD-1 억제제 단독에 비해 종양 성장을 더 크게 감소시킨다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 항-GITR 항체를 PD-1 억제제와 치료적으로 조합하면 PD-1 억제제 단독에 비해 더 높은 빈도로 종양을 제거한다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 항-GITR 항체를 PD-1 억제제와 치료적으로 조합하면 PD-1 억제제 단독에 비해 종양을 가진 대상체의 생존율을 더 개선한다.
본 개시를 기술하기에 앞서, 본 개시는 기술된 특정 방법 및 실험 조건에 한정되지 않는다는 것을 이해해야 하며, 이는 이러한 방법 및 조건이 다양할 수 있기 때문이다. 또한 본 개시의 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 한정되므로 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 기술하기 위한 목적이며, 한정하는 것으로 의도되지 않음을 이해해야 한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속한 당해 기술분야의 통상의 기술을 가진 자에 의해 널리 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 설명에 사용된 용어 "약"은 인용된 특정 수치와 관련하여 사용될 때, 이러한 값이 인용된 값과 1% 이내에서 다를 수 있음을 의미한다. 예를 들어 본 설명에 사용된 바와 같이, 표현 "약 100"은 99와 101을 포함하고 그 사이의 모든 값(예: 99.1, 99.2, 99.3, 99.4 등)을 포함한다.
본 개시에 기재된 방법 및 재료와 유사 또는 동등한 어떠한 방법 및 재료도 본 개시의 실시 또는 검사에 사용될 수 있으나, 바람직한 방법 및 재료를 지금부터 설명한다. 본 명세서에 언급된 모든 특허, 출원 및 비 특허 공개문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
글루코코르티코이드-유도 종양 괴사 인자 수용체
본원에서 사용되는 바와 같이, 글루코코르티코이드-유도 종양 괴사 인자 수용체, “GITR” 등은 서열번호 49(NCBI 수탁 번호 NP_004186.1)에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 포함하는 인간 글루코코르티코이드-유도 종양 괴사 인자 수용체를 지칭한다. “GITR”이란 표현은 단량체 및 다량체 GITR 분자 모두를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, “단량체 인간 GITR”이란 표현은, 임의의 다량체화 도메인을 함유하거나 갖지 않으며, 다른 GITR 분자에 대한 직접적인 물리적 연결 없이 단일 GITR 분자로서 정상적인 조건 하에 존재하는 GITR 단백질 또는 이의 일부분을 의미한다. 예시적인 단량체 GITR 분자는 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 “hGITR.mmh”로서 본원에서 지칭되는 분자이다(예를 들어, 본원의 실시예 3 참조). 본원에서 사용된 바와 같이, “이량체 인간 GITR”이란 표현은 링커, 공유 결합, 비공유 결합을 통해 서로 연결되거나 항체 Fc 도메인과 같은 다량체화 도메인을 통해 서로 연결된 2개의 GITR 분자를 포함하는 작제물을 의미한다. 예시적인 이량체 GITR 분자는, 서열번호 46 및 서열번호 47의 아미노산 서열을 각각 포함하고 본원에서 “hGITR.mFc” 및 “hGITR.hFc”로서 지칭되는 분자를 포함한다.
본원의 단백질, 폴리펩티드 및 단백질 단편에 대한 모든 언급은, 비인간-종에서 유래된 것으로서 명시적으로 달리 명시되지 않는 한, 각각의 단백질, 폴리펩티드 또는 단백질 단편의 인간 버전을 지칭하도록 의도된다. 따라서, “GITR”이란 표현은 비인간 종에서 유래된 것, 예를 들어, “마우스 GITR”, “원숭이 GITR” 등으로서 달리 명시되지 않는 한 인간 GITR을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, “세포 표면-발현된 GITR”이란 표현은, GITR 단백질의 적어도 일부가 세포막의 세포 외 측면에 노출되고 항체의 항원 결합 부분에 접근할 수 있도록, 시험관 내 또는 생체 내 세포의 표면 상에서 발현되는 하나 이상의 GITR 단백질(들) 또는 이의 세포 외 도메인을 의미한다. “세포 표면-발현된 GITR”은 정상적으로 GITR 단백질을 발현하는 세포의 표면에서 발현된 GITR 단백질을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 대안적으로, “세포 표면-발현된 GITR”은 정상적으로는 그 표면에서 인간 GITR을 발현하지 않지만, 그 표면에서 GITR을 발현하도록 인공적으로 조작된 세포의 표면에서 발현된 GITR 단백질을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.
항체 및 항체의 항원 결합 단편
본원에서 사용되는 용어 "항체"는 특정 항원(예를 들어 GITR)과 특이적으로 결합하거나 상호 작용하는 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 임의의 항원 결합 분자 또는 분자 복합체를 의미한다. 용어 “항체”는 4개의 폴리펩티드 사슬, 즉 이황화 결합에 의해 상호 연결된 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함하는 면역글로불린 분자뿐만 아니라 이의 다량체(예를 들어 IgM)도 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 HCVR 또는 VH로 약칭됨)과 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 LCVR 또는 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인을 포함한다(CL1). VH 영역 및 VL 영역은, 더 보존적인 영역(프레임워크 영역(FR)으로 지칭됨)이 중간에 끼어 있는 초가변 영역(상보성 결정 영역(CDR)으로 지칭됨)으로 추가로 세분화될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노 말단에서 카르복시 말단의 방향으로 다음 순서로 배열된 3개의 CDR과 4개의 FR을 포함한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 본원에 제공된 다른 구현예에서, 항-GITR 항체(또는 이의 항원 결합 부분)의 FR은 인간 생식선 서열과 동일하거나, 자연적으로 또는 인공적으로 변형될 수 있다. 아미노산 공통 서열은 둘 이상의 CDR의 병렬 분석에 기초하여 정의될 수 있다.
본원에 제공된 소정의 구현예에서, 본원에 제공된 항-GITR 항체는 인간 항체이다. 본원에서 사용되는 용어 “인간 항체”는 인간 생식선 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하도록 의도된다. 본원에 제공된 인간 항체는 인간 생식선 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않은 아미노산 잔기(예를 들어 시험관 내 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이 유발에 의해 도입되거나 생체 내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를, 예를 들어 CDR에, 구체적으로는 CDR3에 포함할 수 있다. 그러나 본원에서 사용되는 용어 "인간 항체"는 또 다른 포유류 종, 예를 들면 마우스의 생식선으로부터 유도된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 위로 그래프트되어 있는 항체를 포함하도록 의도되지는 않는다. 용어 “인간 항체”는 자연적으로 발생하는, 살아있는 미변형 유기체에 변형 또는 인간의 개입/조작 없이 정상적으로 존재하는 자연 발생 분자를 포함하지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "항-GITR 항체"라는 표현은 단일 특이성을 갖는 1가 및 2가 항체 뿐만 아니라, GITR에 결합하는 제1 아암 및 제2 (표적) 항원에 결합하는 제2 아암을 포함하는 이중특이적 항체 둘 다를 포함하며, 여기서 항-GITR 아암은 본원의 표 7에 제시된 것과 같은 HCVR/LCVR 또는 CDR 서열 중 어느 하나를 포함한다. “항-GITR 항체”라는 표현은 또한, 약물 또는 독소(즉 세포독성제)에 접합된 항-GITR 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 항체-약물 접합체(ADC)를 포함한다. “항-GITR 항체”라는 표현은 또한, 방사성 핵종에 접합된 항-GITR 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 항체-방사성 핵종 접합체(ARC)를 포함한다.
본원에 제공된 항체는, 일부 구현예에서 재조합 인간 항체일 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 “재조합 인간 항체”는 재조합 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 또는 분리된 모든 인간 항체, 예를 들어 숙주 세포 안에 형질전환된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체(아래에서 상세하게 설명됨), 재조합된 조합 인간 항체 라이브러리로부터 분리된 항체(아래에서 상세하게 설명됨), 인간 면역글로불린 유전자에 대해 유전자가 도입된 동물(예를 들어, 마우스)로부터 분리된 항체(예를 들어 Taylor 등의 문헌[(1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295] 참조) 또는 다른 DNA 서열에 대해 인간 면역글로불린 유전자 서열의 스플라이싱을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 또는 분리된 항체를 포함하고자 한 것이다. 이러한 재조합 인간 항체는 인간 생식선 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는다. 그러나 일부 구현예에서, 이러한 재조합 인간 항체는 시험관 내 돌연변이 유발(또는 인간 Ig 서열에 대해 유전자 도입된 동물이 사용되는 경우에서의, 생체 내 체세포성 돌연변이 유발)을 거치므로, 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 인간 생식선 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 이들과 관련되지만, 생체 내에서 인간 항체 생식선 레퍼토리 내에 자연적으로 존재하지 않을 수 있다.
용어 "특이적으로 결합하는” 또는 “~에 특이적으로 결합하는" 등은 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 생리학적 조건 하에서 비교적 안정한 항원과 복합체를 형성하는 것을 의미한다. 특이적 결합은 적어도 약 1x10-8 M 이하의 평형 해리 상수를 특징으로 할 수 있다(예를 들어, KD가 작을수록 결합이 더 밀접함). 2개의 분자가 특이적으로 상호 간에 결합하는지 여부를 결정하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 예를 들어, 평형 투석(equilibrium dialysis), 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance) 등을 포함한다. 본원에 기술된 바와 같이, 항체는 GITR에 특이적으로 결합하는 Octet® HTX 바이오센서를 이용한 실시간 비표지 바이오층 간섭계 검정에 의해 식별되었다. 또한, GITR 내의 하나의 도메인 및 하나 이상의 추가 항원에 결합하는 다중특이적 항체 및 GITR의 2개의 상이한 영역에 결합하는 이중특이적 항체는, 그럼에도 불구하고 본원에서 사용되는 바와 같이 “특이적으로 결합하는”항체로서 간주된다.
용어 “고 친화도” 항체는, Octet® HTX 바이오센서와 같은 실시간 비표지 바이오층 간섭계 검정 또는 BIACORE™과 같은 표면 플라스몬 공명 또는 용액-친화도 ELISA에 의해 측정했을 때 적어도 약 10-8 M; 적어도 약 10-9 M; 적어도 약 10-10 M; 또는 적어도 약 10-11 M의 KD로 표현되는, hGITR에 대한 결합 친화도를 갖는 단클론 항체를 지칭한다.
용어 “느린 해리 속도”, “Koff” 또는 “kd”는 Octet® HTX 바이오센서와 같은 실시간 비표지 바이오층 간섭계 검정 또는 BIACORE™과 같은 표면 플라스몬 공명에 의해 측정했을 때, 항체가 1 x 10-3 s-1 이하, 또는 1 x 10-4 s-1 이하의 속도 상수로 GITR로부터 해리되는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "KD"는 특정 항체-항원 상호 작용의 평형 해리 상수를 지칭하도록 의도된다.
본원에 제공된 항체는 단리된 항체일 수 있다. 본원에서 사용되는 “단리된 항체”는 이의 자연 환경의 적어도 하나의 성분으로부터 식별되어 분리되었고/되었거나 회수된 항체를 의미한다. 예를 들어, 유기체의 적어도 하나의 성분으로부터 분리 또는 제거된 항체, 또는 항체가 자연적으로 존재하거나 자연적으로 생산되는 조직이나 세포로부터 분리 또는 제거된 항체가 본 개시의 목적에 맞는 “단리된 항체”이다. 단리된 항체는 재조합 세포 내의 인 시튜(in situ) 항체 또한 포함한다. 단리된 항체는 적어도 하나의 정제 또는 단리 단계를 거친 항체이다. 소정의 구현예에 따르면, 단리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학 물질을 실질적으로 갖지 않을 수 있다.
본원에서 사용되는 용어, 항체의 "항원 결합 부분", 항체의 "항원 결합 단편" 등은 항원에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하는 임의의 자연적인, 또는 효소에 의해 수득할 수 있는, 또는 합성, 또는 유전자 조작된 폴리펩티드 또는 당단백질을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어, 항체의 "항원 결합 단편" 또는 "항체 단편"은 GITR에 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "항체"는 전체 항체 분자의 항원 결합 단편을 또한 포함한다. 본원에서 사용되는 용어, 항체의 "항원 결합 부분", 항체의 "항원 결합 단편" 등은 항원에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하는 임의의 자연적인, 또는 효소에 의해 수득할 수 있는, 또는 합성, 또는 유전자 조작된 폴리펩티드 또는 당단백질을 포함한다. 항체의 항원 결합 단편은, 예를 들어 단백질 가수분해와 같은 임의의 적합한 표준 기술 또는 항체 가변 도메인 및 임의로 불변 도메인을 암호화하는 DNA의 조작 및 발현을 포함하는 재조합 유전자 조작 기술을 사용해 전체 항체 분자로부터 유도될 수 있다. 이러한 DNA는 공지되어 있고/있거나, 예를 들어 상업적인 공급원, (예를 들어, 파지-항체 라이브러리 포함하는) DNA 라이브러리로부터 용이하게 이용할 수 있거나, 합성될 수 있다. 이러한 DNA는 서열화될 수 있고, 예를 들어 하나 이상의 가변 및/또는 불변 도메인을 적절한 구성으로 배열하기 위해, 또는 코돈을 도입하고, 시스테인 잔기를 생성하며, 아미노산을 변형, 첨가 또는 결실시키기 위해서 등, 화학적으로 또는 분자 생물학 기법을 사용하여 조작될 수 있다.
항원 결합 단편의 비제한적 예는: (i) Fab 단편; (ii) F(ab')2 단편; (iii) Fd 단편; (iv) Fv 단편; (v) 단쇄 Fv(scFv) 분자; (vi) dAb 단편; 및 (vii) 항체의 초가변 영역(예를 들어, CDR3 펩티드와 같은 단리된 상보성 결정 영역(CDR))을 모방하는 아미노산 잔기, 또는 제한된 FR3-CDR3-FR4 펩티드로 이루어진 최소 인지 단위를 포함한다. 다른 조작된 분자, 예를 들어, 도메인 특이적 항체, 단일 도메인 항체, 도메인-결실 항체, 키메라 항체, CDR-이식 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 미니바디, 나노바디(예를 들어, 1가 나노바디, 2가 나노바디 등), 작은 모듈형 면역치료제(SMIP), 및 상어 가변 IgNAR 도메인 등도 본원에서 사용되는 “항원 결합 단편”이란 표현에 포함된다.
항체의 항원 결합 단편은 일반적으로 적어도 하나의 가변 도메인을 포함하게 된다. 이러한 가변 도메인은 임의의 크기 또는 아미노산 조성일 수 있고, 일반적으로 하나 이상의 프레임워크 서열에 인접하거나 그것과 한 프레임에 있는 적어도 하나의 CDR을 포함할 것이다. VL 도메인과 결합된 VH 도메인을 갖는 항원 결합 단편에서, VH 및 VL 도메인은 임의의 적절한 배열로 서로에 대해 위치할 수 있다. 예를 들어, 가변 영역은 이량체로서, VH-VH, VH VL 또는 VL-VL 이량체를 포함할 수 있다. 대안적으로, 항체의 항원 결합 단편은 단량체 VH 또는 VL 도메인을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 항체의 항원 결합 단편은 적어도 하나의 불변 도메인에 공유 결합된 적어도 하나의 가변 도메인을 포함할 수 있다. 본 개시의 항체의 항원 결합 단편 내에서 발견될 수 있는 가변 및 불변 도메인의 비제한적인 예시적 구성은 다음을 포함한다: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2-CH3; (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (x) VL-CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; 및 (xiv) VL-CL. 위에서 열거된 임의의 예시적인 구성을 포함하는 가변 및 불변 도메인의 임의의 구성에서, 이러한 가변 및 불변 도메인은 직접적으로 상호간에 연결되거나 또는 전체 또는 부분적인 힌지 또는 링커 영역에 의해 연결될 수 있다. 힌지 영역은 단일 폴리펩티드 분자의 인접한 가변 및/또는 불변 도메인 사이에 가요성 또는 반 가요성 연결을 초래하는 적어도 2개(예컨대 5, 10, 15, 20, 40, 60 이상)의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 또한, 본 개시의 항체의 항원 결합 단편은 위에서 열거된 가변 및 불변 도메인 구성 중 어느 하나의 동종-이량체 또는 이종-이량체(또는 다른 다량체)를 (예를 들어, 이황화 결합(들)에 의해) 서로 및/또는 하나 이상의 단량체 VH 또는 VL 도메인과의 비공유 결합으로 포함할 수 있다.
완전 항체 분자와 마찬가지로, 항원 결합 단편은 단일특이적이거나 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)일 수 있다. 항체의 다중특이적 항원 결합 단편은 일반적으로 적어도 2개의 상이한 가변 도메인을 포함하게 되며, 여기에서 각각의 가변 도메인은 별도의 항원에 특이적으로 결합할 수 있거나 동일한 항원 상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 본원에 개시된 예시적인 이중특이적 항체 포맷을 포함하여, 임의의 다중특이적 항체 포맷은 당업계에서 이용할 수 있는 일상적인 기술을 사용하여 본 개시의 항체의 항원 결합 단편의 맥락에서 사용하기에 적합할 수 있다.
인간 항체는 2가지 형태로 존재할 수 있는데, 이는 힌지의 이질성과 연관이 있다. 제1 형태로, 면역글로불린 분자는 대략 150~160 kDa의 안정적인 4쇄 작제물을 포함하며, 여기에서 이량체는 사슬 간 중쇄 이황화 결합에 의해 함께 유지된다. 제2 형태에서, 이량체는 사슬 간 이황화 결합을 통해 연결되지 않으며, 공유 결합된 경쇄 및 중쇄(반수 항체)로 구성된 약 75~80 kDa의 분자가 형성된다. 이러한 형태는 친화성 정제 후에도 분리하기가 매우 어렵다.
다양한 온전한 IgG 이소형에서 제2 형태의 출현 빈도는 항체의 힌지 영역 이소형과 관련된 구조적 차이로 인한 것이지만, 이에 한정되지는 않는다. 인간 IgG4 힌지의 힌지 영역에서의 단일 아미노산 치환은 인간 IgG1 힌지를 사용하여 전형적으로 관찰되는 수준으로 제2 형태의 외관을 상당히 감소시킬 수 있다(Angal 등의 문헌[(1993) Molecular Immunology 30:105]). 본 발명은 힌지, CH2 또는 CH3 영역에서 하나 이상의 돌연변이를 갖는 항체를 포함하며, 이는 예를 들어 생산에서 원하는 항체 형태의 수율을 개선하는 데 바람직할 수 있다.
항체 및 이의 항원 결합 단편에 대한 변형
본원에 개시된 항-GITR 항체는 본원에 제공된 항체의 서열과 비교했을 때 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 프레임워크 영역 및/또는 CDR 영역에서 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입, 및/또는 결실을 포함하거나, 자연적으로 또는 인공적으로 변형될 수 있다. 소정의 구현예에서, 항체(또는 이의 항원 결합 단편)의 프레임워크 영역은 인간 생식선 서열과 동일하거나, 예를 들어, 본원에 제공된 항체의 서열과 동일할 수 있거나, 또는 자연적으로 또는 인공적으로 변형될 수 있다. 주어진 프레임워크 영역(또는 하나 이상의 프레임워크 영역)에서 하나 이상의 아미노산이 치환될 수 있고, 치환(들)은 보존적 또는 비보존적 치환일 수 있다. 하나 이상의 CDR 잔기의 치환 또는 하나 이상의 CDR의 생략도 가능하다. 결합을 위해 1개 또는 2개의 CDR이 분배될 수 있는 항체가 과학 문헌에 기술되어 왔다. Padlan 등은항체와 이들의 항원 간의 접촉 영역을 공개된 결정 구조에 기초하여 분석하였고, CDR 잔기의 약 1/5 내지 1/3만이 항원과 실제로 접촉한다고 결론지었다(문헌[1995 FASEB J. 9:133-139] 참조). Padlan은 또한 항원과 접촉하는 아미노산이 없는 1개 또는 2개의 CDR을 가진 많은 항체를 발견하였다(Vajdos 등의 문헌[2002 J Mol Biol 320:415-428]도 참조). 따라서, 본원에 제공된 항체는 변형된 항체가 하나 이상의 바람직한 특징을 유지하는 한 (예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 단편이, N101 또는 S103 변형이 결여된 항체와 비교했을 때 약 10-9 M 미만의 EC50에서 hGITR에 결합하고/하거나; 절단 속도의 감소를 나타내는 한) CDR 영역 및/또는 프레임워크 영역에서 효과적으로 변형될 수 있다.
주어진 CDR에 대한 변형은 본원에 제공된 항체로부터의 CDR 서열에 대해 이루어질 수 있고, 변형은 보존적 또는 비보존적 치환을 포함할 수 있다. 바람직한 치환은 분자 모델링 및/또는 경험적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 CDR 잔기들이 또 다른 인간 항체 서열에서 상응하는 위치를 차지하는 아미노산 또는 이러한 서열의 공통 서열로 치환될 수 있다.
또한, 변형된 항체(항원 결합 단편이라고도 함)가 hGITR에 대한 결합을 유지하는 한, 이의 항원 결합 단편은 본원에 개시된 항체일 수 있지만, 하나 이상의 CDR 및/또는 하나 이상의 프레임워크 영역을 생략하도록 변형될 수 있다.
항원과 접촉하지 않는 CDR 잔기는 분자 모델링에 의해/의하거나 경험적으로 Chotia CDR의 외부에 위치하는 Kabat CDR의 영역으로부터 이전 연구(예를 들어, HCDR2에서의 잔기 H60-H65는 종종 필요하지 않음)에 기초하여 식별될 수 있다. 본원에 제공된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 주어진 CDR, 특히 항원과 접촉하지 않는 CDR을 제거 또는 대체하도록 변형될 수 있다. 경쇄 CDR은, 예를 들어, 범용 경쇄 CDR로 대체될 수 있다.
본원에 제공된 완전한 인간 항-GITR 단클론 항체는 이에 상응하는 생식계열 서열 또는 본원에 제공된 서열에 비해 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 프레임워크에 포함할 수 있고/있거나 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 CDR 영역을 포함할 수 있다. 이러한 변형 또는 돌연변이는, 본원에 개시된 아미노산 서열을, 예를 들어, 공공 항체 서열 데이터베이스로부터 이용 가능한 생식선 서열과 비교함으로써, 또는 아미노산 서열을 본원에 제공된 항체의 서열, 예를 들어, 표 7에 제공된 항체 서열 중 어느 하나와 비교함으로써 용이하게 확인할 수 있다.
본 개시는 본원에 개시된 아미노산 서열 중 어느 하나로부터 유래된 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 변형된 항체가 하나 이상의 바람직한 특성을 갖는 한, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 약 10-9 M 미만의 EC50으로 hGITR에 결합하고/하거나; 생체 내 또는 시험관 내에서 절단 속도의 감소를 나타내는 한, 하나 이상의 프레임워크 영역 및/또는 CDR 영역 내의 하나 이상의 아미노산이 변형된다. 일단 수득되면, 프레임워크 영역 및/또는 CDR 영역에 대한 하나 이상의 변형을 포함하는 항체 및 항원 결합 단편은, 개선된 결합 특이성, 증가된 결합 친화도, 개선되거나 강화된 길항성 또는 작동성 생물학적 특성(경우에 따라), 감소된 면역원성 등과 같은 하나 이상의 원하는 특성에 대해 용이하게 시험될 수 있다. 이러한 일반적인 방식으로 수득된 항체 및 항원 결합 단편은 본 개시에 포함된다.
본 개시는 본원에 개시된 아미노산 서열 중 어느 하나로부터 유래된 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함하되, 하나 이상의 프레임워크 영역 및/또는 CDR 영역 내의 하나 이상의 아미노산은 항체가 유래된 생식계열 서열의 상응하는 잔기(들)로 돌연변이되거나, 또 다른 인간 생식계열 서열의 상응하는 잔기(들)로 돌연변이되거나, 상응하는 생식계열 잔기(들)의 보존적 아미노산 치환으로 돌연변이될 수 있다(이러한 서열 변화는 본원에서 “생식계열 돌연변이”로서 통칭한다). 당업자는, 본원에 개시된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열에서 출발하여, 하나 이상의 개별 생식선 돌연변이 또는 이들의 조합을 포함하는 다수의 항체 및 항원 결합 단편을 쉽게 생산할 수 있다. 소정의 구현예에서, V H 및/또는 V L 도메인 내의 프레임워크 및/또는 CDR 잔기의 전부는, 항체가 유래된 원래의 생식선 서열에서 발견되는 잔기로 다시 돌연변이된다. 다른 구현예에서, 특정한 잔기만이, 예를 들어, FR1의 처음 8개의 아미노산 또는 FR4의 마지막 8개의 아미노산 내에서 발견되는 돌연변이된 잔기, 또는 CDR1, CDR2 또는 CDR3에서 발견되는 돌연변이된 잔기만이 원래의 생식선 서열로 다시 돌연변이된다. 다른 구현예에서, 프레임워크 및/또는 CDR 잔기(들) 중 하나 이상은 상이한 생식선 서열(즉, 항체가 유래된 원래의 생식선 서열과 상이한 생식선 서열)의 상응하는 잔기(들)로 돌연변이된다. 또한, 본 개시의 항체는 프레임워크 및/또는 CDR 영역 내의 2개 이상의 생식계열 돌연변이의 임의의 조합을 함유할 수 있는데, 예를 들어, 특정 개별 잔기는 특정 생식계열 서열의 상응하는 잔기로 돌연변이되는 반면, 원래의 생식계열 서열과 상이한 특정한 다른 잔기는 유지되거나, 상이한 생식계열 서열의 상응하는 잔기로 돌연변이된다. 일단 획득되면, 하나 이상의 생식선 돌연변이를 포함하는 항체 및 항원 결합 단편은, 개선된 결합 특이성, 증가된 결합 친화도, 개선되거나 강화된 길항성 또는 작용성 생물학적 특성(경우에 따라), 감소된 면역원성 등과 같은 하나 이상의 원하는 특성에 대해 쉽게 시험될 수 있다. 이러한 일반적인 방식으로 수득된 항체 및 항원 결합 단편은 본 개시에 포함된다.
본 개시는 본원에 개시된, 하나 이상의 보존적 치환을 갖는 HCVR, LCVR, 및/또는 CDR 아미노산 서열 중 어느 하나의 변이체를 포함하는 완전한 항-GITR 항체를 또한 포함한다. 예를 들어, 본 개시는 본원의 표 7에 제시된 HCVR, LCVR, 및/또는 CDR 아미노산 서열에 비해, 예를 들어 10개 이하, 8개 이하, 6개 이하, 4개 이하 등의 보존적 아미노산 치환을 갖는 HCVR, LCVR, 및/또는 CDR 아미노산 서열을 갖는 항-GITR 항체를 포함한다.
핵산 또는 이의 단편을 지칭할 때의 "실질적 동일성" 또는 "실질적으로 동일한"이란 용어는, 적절한 뉴클레오티드 삽입 또는 결실을 또 다른 핵산(또는 이의 상보성 가닥)과 최적으로 정렬한 경우, 후술한 바와 같은 임의의 알려진 서열 동일성 알고리즘(예: FASTA, BLAST 또는 Gap)에 의해 측정했을 때 뉴클레오티드 염기의 적어도 95%, 더 바람직하게는 적어도 96%, 97%, 98%, 또는 99%에서 뉴클레오티드 서열 동일성이 있음을 나타낸다. 기준 핵산 분자에 대한 실질적 동일성을 갖는 핵산 분자는, 특정 경우, 기준 핵산 분자에 의해 암호화된 폴리펩티드와 동일하거나 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화할 수 있다.
폴리펩티드에 적용된 바와 같이, 용어 “실질적 유사성” 또는 “실질적으로 유사한”은 2개의 펩티드 서열이, 예컨대 디폴트 갭 가중치를 사용하는 GAP 또는 BESTFIT 프로그램에 의해, 최적으로 정렬될 때, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 서열 동일성을 공유하는 것을 의미한다. 일부 양태에서, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환만큼 상이하다. “보존적 아미노산 치환”은 아미노산 잔기가 유사한 화학적 성질(예를 들어, 전하 또는 소수성)을 갖는 측쇄(R기)를 갖는 또 다른 아미노산 잔기에 의해 치환되는 것이다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 기능적 성질을 실질적으로 변화시키지 않을 것이다. 2개 이상의 아미노산 서열이 보존적 치환만큼 서로 상이한 경우, 서열 동일성 백분율 또는 유사성의 정도는 상향으로 조정되어 치환의 보존적 성질을 보정할 수 있다. 이러한 조정을 만드는 수단은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 본원에 참조로서 통합된 Pearson의 문헌[(1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331] 참조. 화학적 성질이 유사한 측쇄를 갖는 아미노산의 군의 예는 다음을 포함한다: (1) 지방족 측쇄: 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신; (2) 지방족-히드록실 측쇄: 세린 및 트레오닌; (3) 아미드 함유 측쇄: 아스파라긴 및 글루타민; (4) 방향족 측쇄: 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판; (5) 염기성 측쇄: 리신, 아르기닌, 및 히스티딘; (6) 산성 측쇄: 아스파르트산염 및 글루탐산염; 및 (7) 황 함유 측쇄: 시스테인 및 메티오닌. 바람직한 보존적 아미노산 치환기는: 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루탐산염-아스파르트산염, 및 아스파라긴-글루타민이다. 대안적으로, 보존적 치환은 Gonnet 등의 문헌에 개시된 PAM250 로그 우도 매트릭스에서 양의 값을 갖는 임의의 변화이다(Gonnet 등의 문헌[(1992) Science 256: 1443-1445]을 참조하고, 동 문헌은 본원에 참조로서 통합됨). “적당한 보존적” 치환은 PAM250 로그 우도 매트릭스에서 음의 값을 갖는 임의의 변화이다.
폴리펩티드에 대한 서열 동일성 및/또는 유사성은 일반적으로 서열 분석 소프트웨어를 사용해 측정된다. 단백질 분석 소프트웨어는 보존적 아미노산 치환을 포함하는 다양한 치환, 결실 및 기타 변형에 배정된 유사성 측정치를 사용하여 유사한 서열들을 대조한다. 예를 들어, GCG 소프트웨어는, 상이한 종의 유기체 유래의 상동성 폴리펩티드와 같은 밀접하게 연관된 폴리펩티드 간의 서열 상동성이나 서열 동일성, 또는 야생형 단백질과 이의 뮤테인 사이의 서열 상동성이나 서열 동일성을 결정하기 위한 디폴트 파라미터와 함께 사용될 수 있는 Gap 및 Bestfit과 같은 프로그램을 포함한다. 예를 들어, GCG 버전 6.1 참조. 폴리펩티드 서열은 또한 GCG 버전 6.1의 프로그램인 FASTA를 사용해, 디폴트 파라미터 또는 권장 파라미터를 사용해 비교할 수 있다. FASTA(예를 들어 FASTA2 및 FASTA3)는 쿼리 및 검색 서열 사이의 가장 중첩된 영역의 정렬 및 서열 동일성 백분율을 제공한다(Pearson의 전술한 (2000) 문헌). 서열은 또한, 12의 갭 개방 페널티 및 2개의 갭 연장 페널티를 갖는 아핀 갭 검색, 62개의 BLOSUM 매트릭스를 사용하는 Smith-Waterman 상동성 검색 알고리즘을 사용하여 비교될 수 있다. 본원에 제공된 서열을 상이한 유기체의 다수의 서열이 포함된 데이터베이스와 비교할 때 바람직한 또 다른 알고리즘은 디폴트 파라미터를 사용하는 컴퓨터 프로그램인 BLAST, 특히 BLASTP 또는 TBLASTN이다. 예를 들어, Altschul 등의 문헌[(1990) J. Mol. Biol. 215:403-410] 및 Altschul 등의 문헌[(1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402]을 참조하고, 이들 각각은 참조로서 본원에 통합된다.
N101 또는 S103 변형을 포함하는 항-GITR 항체
본 개시의 소정의 구현예에 따르면, HCVR에서 N101 또는 S103 변형을 갖는 항-GITR 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공된다. 이러한 변형은 시험관 내 및 생체 내 안정성에 있어서 바람직한 특성을 개시된 항체에게 제공한다.
본원의 표 1에 제공되어 있고 U.S. 2017/0355774에 개시된 항체로서, HCVR에서 N101 또는 S103 돌연변이가 결여된 항체는 명시적으로 배제된다.
일부 양태에서, HCVR에서 N101 또는 S103 변형을 갖는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다. 이러한 변형을 갖는 항-GITR 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 특성을 추가로 나타낼 수 있다:
(a) 인간, 원숭이, 또는 마우스 혈청에서 0.5%/일 미만의 절단 속도를 가짐; 및
(b) 마우스에서 약 0%의 생체 내 절단 속도를 가짐.
절단 속도는, 예를 들어 실시예 2, 5, 및 6에 기술된 검정에 의해 결정될 수 있다.
일부 양태에서, 항-GITR 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 22, 28, 34, 및 40으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역(HCVR) 아미노산 서열 내에 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3)을 포함하고; 서열번호 10의 경쇄 아미노산 영역(LCVR) 아미노산 서열 내에 3개의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3)을 포함한다.
일부 양태에서, 항-GITR 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 22, 28, 34, 및 40으로 이루어진 군으로부터 선택된 HCVR 아미노산 서열; 및 서열번호 10의 LCVR 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 항-GITR 항체는 서열번호 26, 32, 38, 및 44로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 아미노산 서열; 및 서열번호 20의 경쇄 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 항-GITR 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 N101A, N101F, N101G, N101H, N101I, N101K, N101L, N101M, N101P, N101Q, N101R, N101V, N101W, 또는 N101Y 돌연변이로 변형된 서열번호 2의 HCVR 아미노산 서열 내에 3개의 중쇄 CDR을 포함할 수 있고; 서열번호 10의 LCVR 아미노산 서열 내에 3개의 경쇄 CDR을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항-GITR 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 N101D, N101E, N101S, 또는 N101T 돌연변이로 변형된 서열번호 2의 HCVR 아미노산 서열 내에 3개의 중쇄 CDR을 포함할 수 있고; 서열번호 10의 LCVR 아미노산 서열 내에 3개의 경쇄 CDR을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 항-GITR 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 S103A, S103D, S103E, S103F, S103G, S103H, S103I, S103K, S103L, S103M, S103N, S103P, S103Q, S103R, S103T, S103V, S103W, 또는 S103Y 돌연변이로 변형된 서열번호 2의 HCVR 아미노산 서열 내에 3개의 중쇄 CDR을 포함할 수 있고; 서열번호 10의 LCVR 아미노산 서열 내에 3개의 경쇄 CDR을 포함할 수 있다.
본원의 표 1에 제공되고 U.S. 2017/0355774에 개시된 항체는 명시적으로 배제된다. 이러한 항체는 HCVR에서 N101 또는 S103 변형 또는 돌연변이가 결여되어 있다.
Fc 변이체를 포함하는 항-GITR 항체
본 개시의 소정의 구현예에 따르면, 예를 들어 중성 pH에 비해 산성 pH에서, FcRn 수용체에 대한 항체 결합을 강화시키거나 감쇠시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인을 포함하는 항-GITR 항체가 제공된다. 예를 들어, 본 개시는 Fc 도메인의 CH2 또는 CH3 영역에서 돌연변이를 포함하는 항-GITR 항체를 포함하되, 돌연변이(들)는 산성 환경에서(예를 들어, pH가 약 5.5 내지 6.0 범위인 엔도솜에서) FcRn에 대한 Fc 도메인의 친화도를 증가시킨다. 이러한 돌연변이는, 동물에게 투여되는 경우 항체의 혈청 반감기를 증가시킬 수 있다. 이러한 Fc 변형의 비제한적인 예는, 예를 들어 위치 250에서의 변형(예: E 또는 Q); 위치 250 및 428에서의 변형(예: L 또는 F); 위치 252에서의 변형(예: L/Y/F/W 또는 T), 위치 254에서의 변형(예: S 또는 T), 및 위치 256에서의 변형(예: S/R/Q/E/D 또는 T); 또는 위치 428 및/또는 433에서의 변형(예: H/L/R/S/P/Q 또는 K) 및/또는 위치 434에서의 변형(예: H/F 또는 Y); 또는 위치 250 및/또는 428에서의 변형; 또는 위치 307 또는 308에서의 변형(예: 308F, V308F) 및 434에서의 변형을 포함한다. 일 구현예에서, 변형은 428L(예컨대, M428L) 및 434S(예컨대, N434S) 변형; 428L, 259I(예컨대, V259I), 및 308F(예컨대, V308F) 변형; 433K(예컨대, H433K) 및 434(예컨대, 434Y) 변형; 252, 254, 및 256(예컨대, 252Y, 254T, 및 256E) 변형; 250Q 및 428L 변형(예컨대, T250Q 및 M428L); 및 307 및/또는 308 변형(예컨대, 308F 또는 308P)을 포함한다.
예를 들어, 본 개시는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 돌연변이의 하나 이상의 쌍 또는 군을 포함하는 Fc 도메인을 포함하는 항-GITR 항체를 포함한다: 250Q 및 248L(예: T250Q 및 M248L); 252Y, 254T 및 256E(예: M252Y, S254T 및 T256E); 428L 및 434S(예: M428L 및 N434S); 및 433K 및 434F(예: H433K 및 N434F). 전술한 Fc 도메인 돌연변이 및 본원에 개시된 항체 가변 도메인 내의 다른 돌연변이의 모든 가능한 조합은 본 개시의 범위 내에 있는 것으로 고려된다.
항-GITR 항체의 생물학적 특성
본 개시는 높은 친화도로 단량체 인간 GITR에 결합하는 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 예를 들어, 본 개시는, 예를 들어 정제된 항체를 사용해 본원의 실시예 3에서 정의된 것과 같은 검정 포맷을 사용해 25℃에서 표면 플라스몬 공명 또는 실질적으로 유사한 검정에 의해 측정했을 때, 약 12.0 nM 미만의 KD로 단량체 인간 GITR(예: hGITR.mmh)에 결합하는 항-GITR 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 예를 들어 본원의 실시예 3에 정의된 것과 같은 검정 포맷을 사용해 표면 플라스몬 공명 또는 실질적으로 유사한 검정에 의해 측정했을 때, 25℃에서 약 12 nM 미만, 약 10 nM 미만, 약 5 nM 미만, 또는 약 2.0 nM 미만의 KD로 단량체 인간 GITR에 결합하는 항-GITR 항체가 제공된다. 본 개시는 또한, 본원의 실시예 3에 제공된 것과 같은 검정 포맷을 사용해 25℃에서 표면 플라스몬 공명에 의해 측정했을 때, 약 110 nM 미만, 약 90 nM 미만, 약 70 nm 미만, 약 50 nM 미만, 약 25 nM 미만, 또는 약 15 nM 미만의 KD로 단량체 인간 GITR에 결합하는 항-GITR 항체를 포함하며, 여기서 항체는 컨디셔닝된 배양물에서 분비된다.
본 개시는 또한, 예를 들어 본원의 실시예 3에 정의된 것과 같은 검정 포맷을 사용해 25℃에서 표면 플라스몬 공명 또는 실질적으로 유사한 검정에 의해 측정했을 때, 약 2분을 초과하는 해리 반감기(t½)로 단량체 인간 GITR(예: hGITR.mmh)에 결합하는 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 소정의 구현예에 따르면, 예를 들어 본원의 실시예 3에 정의된 것과 같은 검정 포맷을 사용해 표면 플라스몬 공명 또는 실질적으로 유사한 검정에 의해 측정했을 때, 25℃에서 약 2분 초과, 약 4분 초과, 약 6분 초과, 약 7분 초과 또는 그 이상의 t½로 단량체 인간 GITR에 결합하는 항-GITR 항체가 제공된다.
본 개시는 또한, 높은 친화도로 이량체 인간 GITR(예: hGITR.mFc)에 결합하는 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 예를 들어, 본 개시는, 예를 들어 본원의 실시예 3에 정의된 것과 같은 검정 포맷을 사용해 25℃에서 표면 플라스몬 공명 또는 실질적으로 유사한 검정에 의해 측정했을 때, 약 1 nM 미만의 KD로 이량체 인간 GITR에 결합하는 항-GITR 항체를 포함한다. 소정의 구현예에 따르면, 예를 들어 본원의 실시예 3에 정의된 것과 같은 검정 포맷을 사용해 표면 플라스몬 공명 또는 실질적으로 유사한 검정에 의해 측정했을 때, 25℃에서 약 1 nM 미만, 약 900 pM 미만, 약 800 pM 미만, 약 700 pM 미만, 약 600 pM 미만, 약 500 pM 미만, 약 400 pM 미만, 약 300 pM 미만, 약 200 pM 미만, 약 100 pM 미만의 KD로 이량체 인간 GITR에 결합하는 항-GITR 항체가 제공된다. 본 개시는 또한, 본원의 실시예 3에 제공된 것과 같은 검정 포맷을 사용하여 25℃에서 표면 플라스몬 공명에 의해 측정했을 때, 약 5 nM 미만, 약 1 nM 미만, 약 300 pM 미만, 또는 약 100 pM 미만의 KD로 이량체 인간 GITR에 결합하는 항-GITR 항체를 포함하며, 여기서 항체는 컨디셔닝된 배양물에서 분비된다.
본 발명은 또한, 예를 들어 본원의 실시예 3에 정의된 것과 같은 검정 포맷을 사용해 25℃에서 표면 플라스몬 공명 또는 실질적으로 유사한 검정에 의해 측정했을 때, 약 4분을 초과하는 해리 반감기(t½)로 이량체 인간 GITR(예: hGITR.mFc)에 결합하는 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 소정의 구현예에 따르면, 예를 들어 본원의 실시예 3에 정의된 것과 같은 검정 포맷을 사용해 표면 플라스몬 공명 또는 실질적으로 유사한 검정에 의해 측정했을 때, 25℃에서 약 4분 초과, 약 9분 초과, 약 10분 초과, 약 35분 초과, 또는 약 70분 초과 또는 그 이상의 t½로 이량체 인간 GITR에 결합하는 항-GITR 항체가 제공된다.
본 개시는 또한, 인간 또는 원숭이 GITR을 발현하는 저캇/hCD20 표적 세포에 결합하는 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 예를 들어, 인간 GITR 또는 원숭이 GITR 발현 저캇/hCD20 세포에 높은 친화도로 결합하는 항체가 본원에 제공된다. 예를 들어, 본 개시는, 예를 들어 본원의 실시예 7에 정의된 것과 같은 검정 포맷을 사용해 평균 형광 강도(MFI) 또는 실질적으로 유사한 검정에 의해 측정했을 때, 약 4 nM 미만의 EC50으로 인간 GITR 발현 저캇/hCD20 표적 세포에 결합하는 항-GITR 항체를 포함한다. 소정의 구현예에서, 예를 들어 본원의 실시예 7에 정의된 것과 같은 검정 포맷을 사용해 MFR 또는 실질적으로 유사한 검정에 의해 측정했을 때 약 4 nM 미만, 약 3 nM 미만, 약 2 nM 미만의 EC50으로 인간 또는 원숭이 GITR 발현 저캇/hCD20 표적 세포에 결합하는 항-GITR 항체가 제공된다.
본 개시는 또한, 항-GITR/항-CD28-자극된 인간 및 시노몰구스 원숭이 일차 T 세포에 결합하는 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함한다. CD25 및 CD69는 각각 인간 및 시노몰구스 원숭이 일차 T 세포 활성화에 대한 대리 마커이다. 예를 들어, 본원의 실시예 8에 정의된 것과 같은 검정 포맷을 사용하거나 실질적으로 유사한 검정을 사용했을 때, 높은 친화도로 항-GITR/항-CD28-자극된 인간 및 시노몰구스 원숭이 일차 T 세포에 결합하는 항체가 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 항-GITR 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 세미플리맙과 같은 PD-1 억제제와 조합될 수 있다. 이론에 구속되고자 하는 것은 아니지만, 억제 PD-L1/PD1 신호전달이 존재할 때, 세미플리맙은 항-CD3-자극된 T 세포 활성화를 향상시키는 항-GITR 항체의 능력을 회복시킬 수 있다.
본 개시는 또한, 인간 또는 시노몰구스 원숭이 FcγR3a(ADCC를 매개하고 대부분 NK 세포에서 발현되는 Fc 수용체)를 통해 NFAT 활성화를 매개하는 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 예를 들어, ADCC 리포터 생물검정에서 평가된 것과 같이, 인간 또는 시노몰구스 원숭이 FcγR3a를 통해 NFAT 활성화를 매개하는 항체가 본원에 제공된다. 예를 들어, 본 개시는, 예를 들어 본원의 실시예 9에 정의된 것과 같은 검정 포맷을 사용해 발광 또는 실질적으로 유사한 검정에 의해 측정했을 때 약 32 pM 미만의 EC50으로, ADCC 리포터 생물검정에서 인간 또는 시노몰구스 원숭이 FcγR3a를 통해 NFAT 활성화를 매개하는 항-GITR 항체를 포함한다. 소정의 구현예에서, 예를 들어 본원의 실시예 9에 정의된 것과 같은 검정 포맷을 사용해 발광 또는 실질적으로 유사한 검정에 의해 측정했을 때 약 32 pM 미만, 또는 약 16 pM 미만의 EC50으로, 인간 또는 시노몰구스 원숭이 FcγR3a를 통해 NFAT 활성화를 매개하는 항-GITR 항체가 제공된다.
본 개시의 항체는 보체 의존성 세포독성(CDC) 또는 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC)을 통해 기능할 수 있다. “보체-의존성 세포독성”(CDC)은 보체의 존재 하에 본원에 제공된 항체에 의해 항원-발현 세포가 용해되는 것을 지칭한다. “항체-의존성 세포-매개 세포독성”(ADCC)은 Fc 수용체(FcR)를 발현하는 비특이적 세포독성 세포(예를 들어 자연 살해(NK) 세포, 호중구, 및 대식세포)가 표적 세포 상에서 결합된 항체를 인식하여 표적 세포의 용해를 유도하는 세포-매개 반응을 지칭한다. CDC 및 ADCC는 당업계에 공지되어 있고 이용 가능한 분석법을 사용하여 측정될 수 있다. (예를 들어, 미국 특허 제5,500,362호 및 제5,821,337호, 및 Clynes 등의 문헌[(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:652-656] 참조). 항체의 불변 영역은 보체를 고정하고 세포 의존적 세포독성을 매개하는 항체의 능력에 있어서 중요하다. 따라서, 항체의 이소형은 항체가 세포독성을 매개하는 것이 바람직한지 여부를 기준으로 선택될 수 있다.
본 개시는 또한, ADCC를 매개하는 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 예를 들어, 인간 일차 NK 세포(효과기 세포)의 존재 하에 저캇/hCD20/hGITR 및 저캇/hCD20/MfGITR(표적 세포)에 대한 ADCC를 매개하는 항체가 본원에 제공된다. 예를 들어, 본 개시는, 예를 들어 본원의 실시예 10에 정의된 것과 같은 검정 포맷을 사용해 발광 또는 실질적으로 유사한 검정에 의해 측정했을 때, 약 14 pM 미만의 EC50으로, 인간 일차 NK 세포의 존재 하에, 저캇/hCD20/hGITR 및 저캇/hCD20/MfGITR에 대한 ADCC를 매개하는 항-GITR 항체를 포함한다. 소정의 구현예에서, 예를 들어 본원의 실시예 10에 정의된 것과 같은 검정 포맷을 사용해 발광 또는 실질적으로 유사한 검정에 의해 측정했을 때, 약 14 pM 미만, 또는 약 13 pM 미만, 또는 약 12 pM 미만, 또는 약 11 pM 미만, 또는 약 10 pM 미만의 EC50으로, 인간 일차 NK 세포의 존재 하에, 저캇/hCD20/hGITR 및 저캇/hCD20/MfGITR에 대한 ADCC를 매개한다.
추가의 예에서, 인간 일차 NK 세포(효과기 세포)의 존재 하에 인간 일차 T 세포(표적 세포)에 대한 ADCC를 매개하는 항체가 본원에 제공된다. 예를 들어, 본 개시는, 예를 들어 본원의 실시예 11에 정의된 것과 같은 검정 포맷을 사용해 발광 또는 실질적으로 유사한 검정에 의해 측정했을 때, 1나노몰 미만의 EC50으로, 인간 일차 NK 세포의 존재 하에, 인간 일차 T 세포에 대한 ADCC를 매개하는 항-GITR 항체를 포함한다.
본 개시는 또한, ADCP를 매개하는 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 예를 들어, 인간 일차 단핵구 유래 식세포(효과기 세포)의 존재 하에 저캇/hCD20/hGITR 및 저캇/hCD20/MfGITR(표적 세포)의 농도 의존적 ADCP를 매개하는 항체가 본원에 제공된다. 예를 들어, 본 개시는, 예를 들어 본원의 실시예 12에 정의된 것과 같은 검정 포맷을 사용해 녹색 형광 강도 또는 실질적으로 유사한 검정에 의해 측정했을 때, 1나노몰 미만의 EC50으로, 인간 일차 단핵구 유래 식세포의 존재 하에, 저캇/hCD20/hGITR 및 저캇/hCD20/MfGITR의 농도 의존적 ADCP를 매개하는 항-GITR 항체를 포함한다.
본 개시는 또한, 항-CD3-매개 T 세포 증식을 향상시키는 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 예를 들어, HEK293/FcγR2b 부속 세포의 존재 하에 자극성 GITR 항체에 의해 매개되는 일차 CD4+ T 세포 증식을 향상시키는 항체가 본원에 제공된다. 예를 들어, 본 개시는, 예를 들어 본원의 실시예 13에 정의된 것과 같은 검정 포맷을 사용하거나 실질적으로 유사한 검정을 사용했을 때, 1나노몰 미만의 EC50 값으로, HEK293/FcγR2b 부속 세포의 존재 하에, 자극성 CD3 항체에 의해 매개된 일차 CD4+ T 세포 증식을 향상시키고, (삼중수소 붕괴 시의 CPM으로서 측정했을 때) 최대 T 세포 증식을 배경 대비 2.3배 내지 3.1배 증가시키는 항-GITR 항체를 포함한다.
일부 양태에서, HCVR에서 아미노산 서열에서 N101 또는 S103 변형을 갖는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다. 이러한 변형을 갖는 항-GITR 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 특성을 추가로 나타낼 수 있다:
(a) 표면 플라스몬 공명에 의해 측정했을 때, 25℃에서 약 12 nM 미만의 KD로 단량체 인간 GITR에 결합함;
(b) 25℃에서 약 2분 초과의 t1/2로 단량체 인간 GITR에결합함;
(c) 25℃에서 표면 플라스몬 공명으로 측정했을 때, 약 1 nM 미만의 KD로 이량체 인간 GITR에 결합함; 및
(d) 25℃에서 약 5분 초과의 t1/2로 이량체 인간 GITR에결합함.
일부 양태에서, HCVR에서 아미노산 서열에서 N101 또는 S103 변형을 갖는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다. 이러한 변형을 갖는 항-GITR 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 특성을 추가로 나타낼 수 있다:
(a) 약 4 nM 미만의 EC50으로 세포 표면 인간 및 시노몰구스 원숭이 GITR에 결합함;
(b) 약 40 pM 미만의 EC50으로 저캇/NFAT-Luc/hFcγR3a 및/또는 저캇/NFAT-Luc/MfFcγR3a 효과기 세포에서 Fc-매개 NFAT 활성을 향상시킴;
(c) 약 20 pM 미만의 EC50으로, 인간 일차 NK 세포의 존재 하에, 인간 일차 T 세포에 대한 ADCC를 매개함;
(d) 인간 또는 시노몰구스 원숭이 GITR을 발현하도록 조작된 저캇 T 세포에서, 비-GITR 발현 저캇 T 세포에 비해 적어도 약 5배만큼 ADCP를 매개함;
(e) 항-GITR-매개 일차 CD4+ T 세포 증식을 향상시킴;
(f) FcγR-의존적 방식으로 종양내 Treg를 우선적으로 고갈시킴으로써 항종양 면역을 유도함; 및
(g) 약 7 nM 미만의 IC50으로, 인간 GITR 리간드에 대한 인간 단량체 GITR 결합을 차단함.
본 개시의 항체는 전술한 생물학적 특징 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 가질 수 있다. 본원에 제공된 항체의 생물학적 특징에 대한 전술한 목록은 완전한 것으로 의도되지는 않는다. 본 개시의 항체의 다른 생물학적 특성은 본원의 실제 실시예를 포함하여 본 개시를 검토함으로써 당업자에게 명백해질 것이다.
GITR 리간드에 대한 GITR 결합을 차단하는 항체
본 개시는, 예를 들어 본원의 실시예 14에 기술된 검정 포맷으로 결정했을 때, 인간 GITR에 대한 인간 GITR 리간드(hGITRL) 결합을 차단하는 항체를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 인간 GITR 리간드(hGITRL)를 차단한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항체 결합 단편은, 실시예 14에 기술된 바와 같이 또는 실질적으로 유사한 검정 포맷을 사용했을 때, 약 7.0 nM 미만의 IC50에서 약 90%를 초과하는 차단 백분율로 인간 GITR 리간드를 차단한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항체 결합 단편은, 실시예 14에 기술된 바와 같이 또는 실질적으로 유사한 검정 포맷을 사용했을 때, 약 10 nM 미만, 약 7.0 nM 미만, 약 5.0 nM, 또는 약 3.0 nM 미만의 IC50에서 약 90%를 초과하거나, 약 95%를 초과하거나, 약 98%를 초과하는 차단 백분율로 인간 GITR 리간드를 차단한다.
에피토프 맵핑 및 관련 기술
용어 “에피토프”는 파라토프로서 알려진 항체 분자의 가변 영역에서 특이적 항원 결합 부위와 상호 작용하는 항원 결정기를 지칭한다. 단일 항원은 둘 이상의 에피토프를 가질 수 있다. 따라서, 상이한 항체는 항원 상의 상이한 영역에 결합할 수 있고 상이한 생물학적 효능을 가질 수 있다. 에피토프는 입체적이거나 선형일 수 있다. 입체적 에피토프는 선형 폴리펩티드 사슬의 상이한 분절에서 유래된 공간적으로 병치된 아미노산에 의해 생산된다. 선형 에피토프는 폴리펩티드 사슬 내 인접한 아미노산 잔기에 의해 생성된 것이다. 특정 상황에서, 에피토프는 당류, 포스포릴기, 또는 술포닐기의 모이어티를 항원 상에 포함할 수 있다.
본 개시의 항체가 결합하는 에피토프는 GITR 단백질의 3개 이상의 (예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상의) 아미노산의 단일 연속 서열로 이루어질 수 있다. 대안적으로, 에피토프는 GITR의 복수의 비연속 아미노산(또는 아미노산 서열)으로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 에피토프는 GITR의 GITR-결합 도메인 상에 위치하거나 그 근처에 위치한다. 다른 구현예에서, 에피토프는 GITR의 GITR-결합 도메인의 외부에, 예를 들어 항체가 이러한 에피토프에 결합할 때 GITR에 대한 GITRL 결합을 방해하지 않는, GITR의 표면 상의 위치에 위치한다.
당업자에게 공지된 다양한 기술들이 항체가 폴리펩티드 또는 단백질 내의 “하나 이상의 아미노산과 상호작용”하는지의 여부를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 예시적인 기술은, 예를 들어, Harlow와 Lane의 문헌[Antibodies, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY]에 기술된 것과 같은 일상적인 교차 차단 검정(cross-blocking assay), 알라닌 스캐닝 돌연변이 분석, 펩티드 블롯 분석(Reineke의 문헌[2004, GITRhods Mol Biol 248:443-463]), 및 펩티드 절단 분석을 포함한다. 또한, 에피토프 절제, 에피토프 추출 및 항원의 화학적 변형과 같은 방법이 사용될 수 있다(Tomer의 문헌[2000, Protein Science 9:487-496] 참조). 항체가 상호 작용하는 폴리펩티드 내의 아미노산을 식별하는데 사용될 수 있는 또 다른 방법은 질량 분석법에 의해 검출되는 수소/중수소 교환이다. 일반적으로 말하자면, 수소/중수소 교환 방법은 관심 단백질을 중수소-표지하는 단계, 이어서 항체를 중수소-표지된 단백질에 결합시키는 단계를 포함한다. 다음으로, 단백질/항체 복합체가 물로 옮겨져 (중수소 표지된 상태의) 항체에 의해 보호되는 잔기를 제외한 모든 잔기에서 수소-중수소 교환을 일어나게 한다. 항체 해리 후, 표적 단백질을 대상으로 프로테아제 절단 및 질량 분광 분석을 수행하여, 항체가 상호 작용하는 특정 아미노산에 상응하는 중수소-표지된 잔기를 밝혀낸다. 예를 들어, Ehring의 문헌[(1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259]; Engen 및 Smith의 문헌[(2001) Anal. Chem. 73:256A-265A]을 참조한다.
본 개시는 본원에 기술된 특정 예시적인 항체 중 어느 하나(예를 들어, 본원의 표 7에 제시된 것과 같은 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 항체)와 동일한 에피토프에 결합하는 항-GITR 항체를 추가로 포함한다. 마찬가지로, 본 개시는 또한, GITR에 결합하기 위해 본원에 기술된 특정 예시적인 항체 중 어느 하나(예를 들어 본원의 표 7에 제시된 것과 같은 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 항체)와 경쟁하는 항-GITR 항체를 포함한다.
당업자는, 당업계에 알려져 있고 본원에 예시된 일상적인 방법을 사용해 항체가 기준 항-GITR 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지, 또는 결합을 위해 기준 항-GITR 항체와 경쟁하는지 여부를 쉽게 결정할 수 있다. 예를 들어, 시험 항체가 본원에 제공된 기준 항-GITR 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지 여부를 결정하기 위해, 기준 항체를 GITR 단백질에 결합시킬 수 있다. 이어서, GITR 분자에 결합하는 시험 항체의 능력을 평가한다. 기준 항-GITR 항체와의 포화 결합 후에 시험 항체가 GITR에 결합할 수 있다면, 시험 항체가 기준 항-GITR 항체와 다른 에피토프에 결합하는 것으로 결론을 내릴 수 있다. 반면, 기준 항-GITR 항체와의 포화 결합 후에 시험 항체가 GITR에 결합할 수 없다면, 시험 항체는 본원에 제공된 기준 항-GITR 항체가 결합된 에피토프와 동일한 에피토프에 결합할 수 있다. 그런 다음, 추가의 일상적인 실험(예: 펩티드 돌연변이 및 결합 분석)을 수행하여, 시험 항체의 관찰된 결합 결여가 실제로 기준 항체와 동일한 에피토프에 대한 결합으로 인한 것인지, 또는 입체적 차단(또는 다른 현상)이 관찰된 결합 결여의 원인인지 여부를 확인할 수 있다. 이러한 정렬 실험은 ELISA, RIA, Biacore, 유세포 계측법 또는 당업계에서 이용할 수 있는 임의의 다른 정량적 또는 정성적 항체 결합 분석법을 사용하여 수행될 수 있다. 본 개시의 소정의 구현예에 따르면, 경쟁 결합 검정에서 측정했을 때, 예를 들어 하나의 항체의 1, 5, 10, 20, 또는 100배 과량이 다른 하나의 결합을 적어도 50%, 바람직하게는 75%, 90%, 또는 심지어 99%만큼 억제하는 경우, 2개의 항체는 동일한 (또는 중첩하는) 에피토프에 결합한다(예를 들어, Junghans 등의 문헌[Cancer Res. 1990:50:1495-1502] 참조). 대안적으로, 항원에서 하나의 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 본질적으로 모든 아미노산 돌연변이가 다른 하나의 결합을 감소시키거나 제거하는 경우, 2개의 항체는 동일한 에피토프에 결합하는 것으로 간주된다. 하나의 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 아미노산 돌연변이의 하위집합만이 다른 하나의 결합을 감소시키거나 제거하는 경우, 2개의 항체는 “중첩하는 에피토프”를 갖는 것으로 간주된다.
항체가 결합을 위해 기준 항-GITR 항체와 경쟁하는지 (또는 결합을 위해 교차 경쟁하는지) 여부를 결정하기 위해, 전술한 결합 방법론은 2개의 배향으로 수행된다: 제1 배향에서, 포화 조건 하에서 기준 항체를 GITR 단백질에 결합시키고, 이어서 GITR 분자에 대한 시험 항체의 결합을 평가한다. 제2 배향에서, 포화 조건 하에서 시험 항체를 GITR 분자에 결합시키고, 이어서 GITR 분자에 대한 기준 항체의 결합을 평가한다. 2가지 배향 모두에서, 제1 (포화) 항체만이 GITR 분자에 결합할 수 있다면, 시험 항체 및 기준 항체가 GITR에 결합하기 위해 경쟁하는 것으로 결론을 내린다. 당업자가 이해할 수 있듯이, 결합을 위해 기준 항체와 경쟁하는 항체는 기준 항체와 동일한 에피토프에 결합할 필요는 없지만, 중첩 또는 인접한 에피토프에 결합함으로써 기준 항체의 결합을 입체적으로 차단할 수 있다.
인간 항체의 제조
본 개시의 항-GITR 항체는 완전한 인간 항체일 수 있다. 완전한 인간 단클론 항체를 포함하여 단클론 항체를 생성하는 방법이 당업계에 공지되어 있다. 이러한 임의의 공지된 방법을 본 개시의 맥락에서 사용하여 인간 GITR에 특이적으로 결합하는 인간 항체를 제조할 수 있다.
예를 들어, 완전한 인간 단클론 항체를 생성하기 위한 VELOCIMMUNE™ 기술 또는 임의의 다른 알려진 유사한 방법을 사용해 GITR에 대한 고 친화도 키메라 항체(인간 가변 영역과 마우스 불변 영역을 가짐)를 먼저 단리한다. 하기 실험 섹션에서와 같이, 친화도, 리간드 차단 활성, 선택도, 에피토프 등을 포함하는 바람직한 특성에 대해 항체의 특성을 분석하고 이에 대해 항체를 선택한다. 필요에 따라, 마우스 불변 영역을 원하는 인간 불변 영역(예를 들어 야생형 또는 변형된 IgG1 또는 IgG4)와 치환하여 완전한 인간 항-GITR 항체를 생성한다. 선택된 불변 영역은 특이적 용도에 따라 매우 다양할 수 있지만, 고친화도 항원 결합 특성 및 표적 특이성 특성은 가변 영역에 존재한다. 특정한 경우에, 완전한 인간 항-GITR 항체는 항원-양성 B 세포로부터 직접 단리된다.
생물학적 동등물
본 개시의 항-GITR 항체 및 항체 단편은 기술된 항체의 아미노산 서열과는 다르지만 인간 GITR에 결합하는 능력을 보유하는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 이러한 변이체 항체 및 항체 단편은 부모 서열과 비교했을 때 아미노산의 하나 이상의 추가, 결실 또는 치환을 포함하지만, 기술된 항체와 본질적으로 동등한 생물학적 활성을 나타낸다. 마찬가지로, 본 개시의 항-GITR 항체를 암호화하는 DNA 서열은 개시된 서열과 비교했을 때, 뉴클레오티드의 하나 이상의 추가, 결실, 또는 치환을 포함하되, 본원에 제공된 항-GITR 항체 또는 항체 단편과 본질적으로 생물학적으로 동등한 항-GITR 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 서열을 포함한다. 이러한 변이체 아미노산 및 DNA 서열의 예는 위에서 논의된다.
2개의 항원 결합 단백질 또는 항체가, 예를 들어, 유사한 실험 조건 하에 동일한 몰 투여량(1회 투여량 또는 다회 투여량)으로 투여되었을 때 흡수 속도 및 정도에 있어서 유의한 차이를 보이지 않는 약학적 등가물 또는 약학적 대안인 경우, 이들은 생물학적으로 동등한 것으로 간주된다. 일부 항체가 흡수 정도에 있어서는 동등하지만 흡수 속도가 다른 경우, 이들은 등가물 또는 약학적 대안으로서 간주될 것이고, 여전히 생물학적으로 동등한 것으로 간주될 수 있는데, 그 이유는, 흡수 속도에 있어서의 이러한 차이는 의도적이고 표지에 반영되어 있으며, 예를 들어, 만성적으로 사용될 때 효과적인 신체 약물 농도를 달성하는 데 반드시 필요하지 않으며, 특정한 연구 의약품에 대해 의학적으로 유의하지 않은 것으로 간주되기 때문이다.
일 구현예에서, 2개의 항원 결합 단백질이 안전성, 순도 및 효능에 있어서 임상적으로 의미 있는 차이가 없는 경우, 이들은 생물학적으로 동등하다.
일 구현예에서, 환자가 기준 생성물을 사용하는 치료와 생물학적 생성물을 사용하는 치료 사이에서 1회 이상 전환할 수 있고, 이러한 전환이 없는 연속 요법과 비교했을 때 면역원성에 있어서의 임상적으로 유의한 변화를 포함하여 예상되는 이상 반응의 위험 증가 또는 효과의 감소가 없는 경우, 2개의 항원 결합 단백질은 생물학적으로 동등하다.
일 구현예에서, 2개의 항원 결합 단백질 둘 모두가 사용 조건(들)에 대한 공통의 메커니즘 또는 공통의 작용 메커니즘(들)에 의해 이러한 메커니즘이 알려진 정도까지 작용하는 경우, 이들은 생물학적으로 동등하다.
생물학적 동등성은 생체 내 방법 및 시험관 내 방법에 의해 입증될 수 있다. 생물학적 동등성 측정에는, 예를 들어: (a) 항체의 농도 또는 이의 대사가 혈액, 혈장, 혈청, 또는 기타 생물학적 유체에서 시간의 함수로서 측정되는, 인간 또는 다른 포유동물의 생체 내 시험; (b) 인간의 생체 내 생체이용율 데이터와 연관되었거나 이를 합리적으로 예측할 수 있게 하는 시험관 내 시험; (c) 항체(또는 이의 표적)의 적절한 급성 약리학적 효과가 시간의 함수로서 측정되는, 인간 또는 다른 포유동물의 생체 내 시험; 및 (d) 항체의 안전성, 효능, 또는 생체이용률이나 생물학적 동등성을 확립하는 잘 조절된 임상 시험이 있다.
본원에 제공된 항-GITR 항체의 생물학적으로 동등한 변이체는, 예를 들어, 잔기 또는 서열의 다양한 치환을 만들거나 생물학적 활성에 필요하지 않은 말단 또는 내부 잔기 또는 서열을 결실함으로써 작제할 수 있다. 예를 들어, 생물학적 활성에 필수적인 시스테인 잔기를 결실시키거나 다른 아미노산과 치환하여, 변성 시에 불필요하거나 부정확한 분자내 이황화 브리지가 형성되는 것을 방지할 수 있다. 다른 맥락에서, 생물학적으로 등등한 항체는 항체의 당질화 특성을 바꾸는 아미노산 변화, 예를 들어, 당질화를 제거하거나 없애는 돌연변이를 포함하는 항-GITR 항체 변이체를 포함할 수 있다.
종 선택도 및 종 교차 반응성
소정의 구현예에 따르면, 본 개시는 인간 GITR에 결합하지만 다른 종의 GITR에는 결합하지 않는 항-GITR 항체를 제공한다. 본 개시는 또한, 인간 GITR 및 하나 이상의 비인간 종의 GITR에 결합하는 항-GITR 항체를 포함한다. 예를 들어, 본원에 제공된 항-GITR 항체는 인간 GITR에 결합할 수 있고, 경우에 따라 마우스, 랫트, 기니피그, 햄스터, 저빌 쥐, 돼지, 고양이, 개, 토끼, 염소, 양, 소, 말, 낙타, 시노몰구스, 마모셋, 붉은털 원숭이, 또는 침팬지 GITR 중 하나 이상에 결합하거나 결합하지 않을 수 있다. 본 개시의 소정의 예시적 구현예에 따르면, 인간 GITR 및 시노몰구스 원숭이(예를 들어 필리핀 원숭이(Macaca fascicularis)) GITR에 특이적으로 결합하는 항-GITR 항체가 제공된다. 본원에 제공된 다른 항-GITR 항체는 인간 GITR에 결합하지만 시노몰구스 원숭이 GITR에는 결합하지 않거나 약하게만 결합한다.
다중특이적 항체
본 개시의 항체는 단일특이적이거나 다중특이적(예: 이중특이적)일 수 있다. 다중특이적 항체는 하나의 표적 폴리펩티드의 상이한 에피토프에 특이적이거나 둘 이상의 표적 폴리펩티드에 특이적인 항원 결합 도메인을 함유할 수 있다. 예를 들어, Tutt 등의 문헌[1991, J. Immunol. 147:60-69]; Kufer 등의 문헌[2004, Trends Biotechnol. 22:238-244] 참조. 본 개시의 항-GITR 항체는 또 다른 기능성 분자, 예를 들어 또 다른 펩티드 또는 단백질에 연결되거나, 이들과 공동-발현될 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 이의 단편은 (예를 들어 화학적 결합, 유전적 융합, 비공유 결합에 의하거나 그 외의 방법으로) 하나 이상의 다른 분자 엔티티, 예컨대 또 다른 항체 또는 항체 단편에 연결되어 제2 결합 특이성을 갖는 이중특이적 또는 다중특이적 항체를 생산할 수 있다.
본 개시는 면역글로불린의 하나의 아암이 인간 GITR에 결합하고 면역글로불린의 다른 하나의 아암은 제2 항원에 특이적인 이중특이적 항체를 포함한다. GITR-결합 아암은 본원의 표 7에 제시된 것과 같은 HCVR/LCVR 또는 CDR 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 소정의 구현예에서, GITR-결합 아암은 인간 GITR에 결합하여 GITR에 대한 GITRL 결합을 차단한다. 다른 구현예에서, GITR-결합 아암은 인간 GITR에 결합하지만 GITR에 대한 GITRL 결합을 차단하지는 않는다. 일부 구현예에서, GITR 결합 아암은 인간 GITR에 결합하여 GITR 신호전달을 활성화한다. 다른 구현예에서, GITR 결합 아암은 GITRL 매개 수용체 자극을 차단한다. 본 개시는 또한, 항체의 하나의 아암이 인간 GITR의 제1 에피토프에 결합하고, 상기 항체의 다른 하나의 아암은 인간 GITR의 구별되는 제2 에피토프에 결합하는 이중특이적 항체를 포함한다.
본 개시의 맥락에서 사용될 수 있는 예시적인 이중특이적 항체 포맷은 제1 면역글로불린(Ig) CH3 도메인 및 제2 Ig CH3 도메인을 사용하는 것을 포함하며, 여기서 제1 및 제2 Ig CH3 도메인은 적어도 하나의 아미노산만큼 서로 상이하며, 적어도 하나의 아미노산 차이는 아미노산 차이가 없는 이중특이적 항체와 비교했을 때 단백질 A에 대한 이중특이적 항체의 결합을 감소시킨다. 일 구현예에서, 제1 Ig CH3 도메인은 단백질 A에 결합하고, 제2 Ig CH3 도메인은 H95R 변형(IMGT 엑손 넘버링에 의함; EU 넘버링에 의하면 H435R임)과 같이 단백질 A 결합을 감소시키거나 제거하는 돌연변이를 함유한다. 제2 CH3은 Y96F 변형(IMGT 넘버링에 의함; EU 넘버링은 Y436F)을 추가로 포함할 수 있다. 제2 CH3에서 발견할 수 있는 추가의 변형은 다음을 포함한다: IgG1 항체의 경우 D16E, L18M, N44S, K52N, V57M 및 V82I(IMGT에 의함; EU에 의하면 D356E, L358M, N384S, K392N, V397M 및 V422I); IgG2 항체의 경우 N44S, K52N 및 V82I(IMGT에 의함; EU에 의하면 N384S, K392N 및 V422I); 및 IgG4 항체의 경우 Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q 및 V82I(IMGT에 의함; EU에 의하면 Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q 및 V422I). 전술한 이중특이적 항체 포맷에 대한 변형은 본 개시의 범위에 포함되는 것으로 고려된다.
본 개시의 맥락에서 사용될 수 있는 다른 예시적인 이중특이적 포맷은 예를 들어, scFv-기반 또는 디아바디 이중특이적 포맷, IgG-scFv 융합체, 이중 가변 도메인(DVD)-Ig, 콰드로마, 놉-인투-홀(knobs-into-holes), 공통 경쇄(예를 들어, 놉-인투-홀을 가지는 공통 경쇄 등), CrossMab, CrossFab, (SEED)바디, 류신 지퍼, 듀오바디, IgG1/IgG2, 이중 작용 Fab (DAF)-IgG, 및 Mab2 이중특이적 포맷을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다(전술한 포맷에 대한 검토는 예를 들어, Klein 등의 문헌[2012, mAbs 4:6, 1-11], 및 동 문헌에 인용된 참고문헌을 참조한다). 이중특이적 항체는 펩티드/핵산 접합을 사용해 작제될 수도 있는데, 예를 들어, 여기서 직교 화학 반응성을 갖는 비천연 아미노산은 부위특이적 항체-올리고뉴클레오티드 접합체를 생성하는 데 사용되고, 이는 정의된 조성, 원자가 및 기하학적 구조를 갖는 다량체 복합체로 자기 조립된다. (예를 들어 Kazane 등의 문헌[J. Am. Chem. Soc. [Epub: Dec. 4, 2012]] 참조).
치료 제형 및 투여
본 개시는 본 개시의 항-GITR 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 본원에 제공된 약학적 조성물은 수송, 전달, 내성 등을 개선하는 적절한 담체, 부형제, 및 기타 제제와 함께 제형화된다. 다수의 적절한 제형은 모든 약사들에게 이전에 공지된 다음의 문헌에서 확인할 수 있다: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. 이러한 제형은, 예를 들어, 분말, 고약, 연고, 젤리, 왁스, 오일, 지질, 지질(양이온성 또는 음이온성) 함유 소포체(예를 들어, LIPOFECTIN™, Life Technologies, Carlsbad, CA), DNA 접합체, 무수 흡수 연고제, 수중유 및 유중수 유화제, 카보왁스 유화제(다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜), 반고형성 겔, 및 카보왁스를 함유하는 반고형성 혼합물을 포함한다. Powell 등의 문헌 ["Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311]도 참조함.
환자에게 투여되는 항체의 투여량은 환자의 연령 및 크기, 표적 질환, 병태, 투여 경로 등에 따라 달라질 수 있다. 바람직한 투여량은 일반적으로 체중 또는 신체 표면적에 따라 계산된다. 성인 환자의 경우, 일반적으로 본 개시의 항체를 체중 1 kg 당 약 0.01 내지 약 20 mg, 더 바람직하게는 체중 1 kg 당 약 0.02 내지 약 7 mg, 약 0.03 내지 약 5 mg 또는 약 0.05 내지 약 3 mg의 1회 투여량으로 정맥 내 투여하는 것이 유리할 수 있다. 병태의 중증도에 따라, 치료의 빈도와 기간을 조정할 수 있다. 항-GITR 항체를 투여하기 위한 효과적인 투여량과 일정은 경험적으로 결정될 수 있으며; 예를 들어, 환자의 진행 상황에 대한 주기적 평가에 의해 모니터링하고 이에 따라 투여량을 조정할 수 있다. 또한, 투여량의 종간 스케일링은 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 수행될 수 있다(예를 들어, Mordenti 등의 문헌[1991, Pharmaceut. Res. 8:1351] 참조).
리포좀 캡슐화, 마이크로입자, 마이크로캡슐, 돌연변이체 바이러스를 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체 매개 엔도시토시스와 같은 다양한 전달 시스템이 알려져 있고, 본원에 제공된 약학적 조성물을 투여하는 데 사용될 수 있다(예를 들어, Wu 등의 문헌[1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432] 참조). 도입 방법은 피내, 근육 내, 복강 내, 정맥 내, 피하, 비강 내, 경막 외 및 구강 경로를 포함하되 이들로 제한되지는 않는다. 조성물은 임의의 편리한 경로에 의해, 예를 들면 주입 또는 볼루스 주사에 의해, 상피 또는 점막피부의 내벽(예를 들어 구강 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있고, 기타 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신 투여이거나 국소 투여일 수 있다.
본 개시의 약학적 조성물은 표준 바늘 및 주사기를 사용하여 피하 전달되거나 정맥 내 전달될 수 있다. 또한, 피하 전달의 경우, 본 개시의 약학적 조성물을 전달하는 데 펜 전달 장치가 용이하게 적용된다. 이러한 펜 전달 장치는 재사용식이거나 일회용일 수 있다. 재사용식 펜 전달 장치에는 일반적으로 약학적 조성물이 담긴 교체식 카트리지가 사용된다. 일단 카트리지 내의 모든 약학적 조성물이 투여되어 카트리지가 비면, 빈 카트리지를 쉽게 폐기하고 약학적 조성물이 담긴 새로운 카트리지로 교체할 수 있다. 그러면, 펜 전달 장치를 재사용할 수 있다. 일회용 펜 전달 장치에는 교체식 카트리지가 없다. 오히려, 일회용 펜 전달 장치는 약학적 조성물이 장치 내의 저장조에 미리 담긴 상태로 제공된다. 일단 저장조의 약학적 조성물이 소진되면, 전체 장치가 폐기된다.
다수의 재사용식 펜 전달 장치 및 자가주입 전달 장치가 본 개시의 약학적 조성물을 피하 전달하는 데 적용된다. 예로서 몇 가지만 거명하자면, AUTOPEN™(Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK), DISETRONIC™ 펜(Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Switzerland), HUMALOG MIX 75/25™ 펜, HUMALOG™ 펜, HUMALIN 70/30™ 펜(Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN), NOVOPEN™ I, II 및 III(Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), NOVOPEN JUNIOR™(Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), BD™ 펜(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™, 및 OPTICLIK™(sanofi-aventis, Frankfurt, Germany)이 포함되지만, 이들로 한정되지는 않는다. 본 개시의 약학적 조성물을 피하 전달하는 데 적용되는 일회용 펜 전달 장치의 몇 가지만 거명하자면, SOLOSTAR™ 펜(sanofi-aventis), FLEXPEN™(Novo Nordisk), 및 KWIKPEN™(Eli Lilly), SURECLICK™ Autoinjector(Amgen, 캘리포니아주 싸우전 오크스 소재), PENLET™(Haselmeier, Stuttgart, Germany), EPIPEN(Dey, L.P.) 및 HUMIRA™ 펜(Abbott Labs, Abbott Park IL)이 포함되지만, 이들로 한정되지는 않는다.
특정 상황에서는, 약학적 조성물이 방출 조절 시스템으로 전달될 수 있다. 일 구현예에서, 펌프가 사용될 수 있다(Langer의 전술한 문헌; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201(1987) 참조). 또 다른 구현예에서, 중합체 물질이 사용될 수 있다(Langer 및 Wise (eds.)의 문헌[Medical Applications of Controlled Release, 1974, CRC Pres., Boca Raton, Florida] 참조). 또 다른 구현예에서, 방출 조절 시스템은 조성물의 표적에 근접하여 배치될 수 있으며, 따라서 전신 투여량의 단지 일부만을 필요로 한다(예를 들어, 전술한 Goodson, 1984, Medical Applications of Controlled Release, vol. 2, 115-138 참조). 다른 조절 방출 시스템은 Lange, Science 249:1527-1533(1990)에서 검토된 내용에 논의되어 있다.
주사식 제제는 정맥 내, 피하, 피 내 및 근육 내 주사, 적가 주입 등을 위한 투여량 형태를 포함할 수 있다. 이들 주사식 제제는 공지의 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 주사식 제제는, 예를 들어 주사용으로 종래에 사용되는 멸균 수성 매질 또는 유성 매질에 전술한 항체 또는 이의 염을 용해, 현탁 또는 유화시킴으로써 제조될 수 있다. 주사용 수성 매질로서는, 예를 들어, 생리 식염수, 알코올(예를 들어, 에탄올)과 같은 적절한 가용화제와 조합하여 사용할 수 있고 글루코오스 및 기타 보조제 등을 함유하는 등장성 용액, 다가알코올(예를 들어, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜), 비이온성 계면활성제[예를 들어, 폴리소르베이트 80, HCO-50(수소 첨가 피마자유의 폴리옥시에틸렌 (50 몰) 부가물)] 등이 있다. 유성 매질로서는, 예를 들어, 벤질 벤조에이트, 벤질 알코올 등과 같은 가용화제와 조합하여 사용할 수 있는 참기름, 대두유 등이 사용된다. 따라서, 제조된 주사제는 바람직하게는 적절한 앰플에 채워진다.
유리하게는, 전술한 경구 또는 비경구적으로 사용하기 위한 약학적 조성물은 활성 성분의 투여량에 적절히 맞춰진 단위 투여량의 투약 형태로 제조된다. 이러한 투여량 형태는, 예를 들어, 정제, 알약, 캡슐, 주사제(앰플), 좌제 등을 포함한다. 전술한 항체의 함유량은 일반적으로 단위 투여량의 투여 형태 당 약 5 내지 약 500 mg이고; 특히 주사제 형태로는, 전술한 항체가 약 5 내지 약 100 mg으로 함유되고, 다른 투여 형태에 대해서는 약 10 내지 약 250 mg으로 함유되는 것이 바람직하다.
항체의 치료적 용도
본 개시는 항-GITR 항체(예를 들어, 본원의 표 7에 제시된 것과 같은 HCVR/LCVR 또는 CDR 서열 중 임의의 것을 포함하는 항-GITR 항체)를 포함하는 치료 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다. 치료 조성물은 본원에 개시된 항-GITR 항체, 이의 항원 결합 단편, 또는 본원에 개시된 ADC 중 어느 하나 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다.
본원에 제공된 항체는, GITR 발현 또는 활성과 연관이 있거나 이에 의해 매개되는 임의의 질환 또는 장애, 또는 GITR과 GITRL 사이의 상호작용을 차단하고/하거나 GITR 활성 및/또는 신호전달을 자극함으로써 치료될 수 있는 임의의 질환 또는 장애의 치료, 예방, 및/또는 완화에 특히 유용하다. 예를 들어, 본 개시의 항체 및 항원 결합 단편은, 예를 들어 GITR 활성화를 통해 면역 반응, 즉 항종양 반응을 조절함으로써 면역 및 증식성 질환 또는 장애(예를 들어 암)를 치료하는 데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 항체는 예를 들어 ADCC를 통한 이들의 리간드 차단 능력과 무관하게, 높은 수준의 GITR을 발현하는 세포를 고갈시킨다. 본 개시의 항체 및 항원 결합 단편은 면역 반응을 향상시킴으로써 질환 또는 장애를 치료하는 데 사용될 수 있다. 본 개시는 대상체에서 항종양 면역 반응을 조절하는 방법을 포함하며, 상기 방법은 본원에 기술된 항-GITR 항체 또는 항원 결합 단편을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 항체 또는 항원 결합 단편은 치료적 이익에 도움이 되도록 종양 내 T 효과기 세포/T 조절 세포 비율을 향상시킨다. 일부 구현예에서, 본 개시의 항체 또는 항원 결합 단편은 치료적 이익에 도움이 되도록 종양 내 T 조절 세포 고갈을 향상시킨다. 일부 구현예에서, 본 개시의 항체 또는 항원 결합 단편은 치료적 이익에 도움이 되도록 CD8+ T 세포/T 조절 세포 비율을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 본 개시의 항체 또는 항원 결합 단편은 T 세포 생존을 촉진한다.
항체 및 항원 결합 단편에 의해 치료될 수 있는 예시적인 질환 또는 장애는 면역 및 증식성 질환 또는 장애(예를 들어 암)을 포함한다. 본 개시의 항체 및 항원 결합 단편은 뇌 및 수막, 구인두, 폐 및 기관지 수상구조, 위장관, 남성 및 여성 생식관, 근육, 뼈, 피부 및 부속물, 결합 조직, 비장, 면역계, 혈액 형성 세포 및 골수, 간 및 요로, 및 눈과 같은 특수 감각 기관에서 발생하는 원발성 및/또는 전이성 종양을 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시의 항체 및 항원 결합 단편은 고형 종양 또는 혈액-매개 종양을 치료하는 데 사용된다. 소정의 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 다음 중 하나 이상을 치료하는 데 사용된다: 편평 세포 피부암, 피부 편평 세포 암종(CSCC), 골수종, 폐암, 흑색종, 두경부 편평 세포 암종(SCCHN), 소세포 폐암, 비소세포 폐암(NSCLC), 자궁경부암(예를 들어 자궁경부 편평 세포 암종(자궁경부 SCC)), 유방암, 및 신장 세포 암종(RCC), 선암종, 결장암(CRC), 췌장 암종, 두경부암, 전립선암, 악성 신경교종, 골육종, 결장암, 위암(예: MET 증폭이 있는 위암), 악성 중피종, 다발성 골수종, 난소암, 윤활막 육종, 갑상선암, 유방암(삼중 음성 유방암 포함), 고환암, 식도암, 자궁암, 자궁내막암, 또는 간암. 일부 양태에서, 본 개시의 항체는 면역 관문 차단(ICB) 미노출 암을 치료하는 데 사용된다. 일부 양태에서, 본 개시의 항체는 ICB에 노출된 암을 치료하는 데 사용된다.
일부 양태에서, 본 개시의 항체는 결장직장암을 치료하는 데 사용된다. 일부 양태에서, 본 개시의 항체는 두경부 편평 세포 암종(HNSCC 또는 SCCHN)을 치료하는 데 사용된다. 일부 양태에서, 본 개시의 항체는 피부 편평 세포 암종(CSCC)을 치료하는 데 사용된다. 일부 양태에서, 본 개시의 항체는 위암을 치료하는 데 사용된다. 일부 양태에서, 본 개시의 항체는 비소세포 폐암(NSCLC)을 치료하는 데 사용된다. 일부 양태에서, 본 개시의 항체는 자궁경부암을 치료하는 데 사용된다. 일부 양태에서, 본 개시의 항체는 식도암을 치료하는 데 사용된다. 일부 양태에서, 본 개시의 항체는 흑색종을 치료하는 데 사용된다. 일부 양태에서, 본 개시의 항체는 삼중 음성 유방암을 치료하는 데 사용된다. 일부 양태에서, 본 개시의 항체는 신세포 암종을 치료하는 데 사용된다. 일부 양태에서, 본 개시의 항체는 유방암을 치료하는 데 사용된다.
소정의 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 다음을 포함하지만 이들로 한정되지 않는 자가면역 질환을 치료하는 데 유용하다: 원형 탈모증, 자가면역 간염, 복강병, 그레이브스병, 귈랑-바레 증후군, 하시모토병, 용혈성 빈혈, 염증성 장 질환, 염증성 근육병증, 다발성 경화증, 원발성 담즙성 간경화증, 건선, 류마티스 관절염, 피부경화증, 쇼그렌 증후군, 전신성 홍반성 루푸스, 백반증, 자가면역 췌장염, 자가면역 두드러기, 자가면역 혈소판감소성 자반증, 크론병, 1형 당뇨병, 호산구성 근막염, 호산구성 장내세동염, 굿파스쳐 증후군, 중증근무력증, 건선성 관절염, 류마티스 열, 궤양성 대장염, 혈관염, 및 베게너 육아종증.
본원에 기술된 치료 방법의 맥락에서, 항-GITR 항체는 단일 요법(즉, 유일한 치료제)으로서 투여되거나 하나 이상의 추가적인 치료제(이의 예는 본원의 다른 곳에서 기술됨)와 병용 투여될 수 있다.
병용 요법 및 제형
본 개시의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 유리하게 조합될 수 있는 임의의 추가 치료제와 본 개시의 항-GITR 항체를 이용하는 병용 요법이 또한 본원에 제공된다.
본 개시는 본원에 기술된 항-GITR 항체 중 어느 하나를 하나 이상의 추가적인 치료적 활성 성분과 조합으로 포함하는 조성물 및 치료 제형, 및 이러한 조합물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법을 포함한다.
본 개시의 항체는 암을 치료하는 데 사용되는 하나 이상의 항암제 또는 요법과 상승적으로 조합될 수 있다. 예를 들어, 소정의 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 다음 중 하나 이상을 치료하는 데 사용된다: 편평 세포 피부암, 피부 편평 세포 암종(CSCC), 골수종, 폐암, 흑색종, 두경부 편평 세포 암종(SCCHN), 소세포 폐암, 비소세포 폐암(NSCLC), 자궁경부암(예를 들어 자궁경부 편평 세포 암종(자궁경부 SCC)), 유방암, 및 신장 세포 암종(RCC), 선암종, 결장암(CRC), 췌장 암종, 두경부암, 전립선암, 다형성 교아종, 악성 신경교종, 골육종, 결장암, 위암(예: MET 증폭이 있는 위암), 악성 중피종, 다발성 골수종, 난소암, 윤활막 육종, 갑상선암, 유방암(삼중 음성 유방암 포함), 고환암, 식도암, 자궁암, 자궁내막암, 또는 간암. 일부 양태에서, 본 개시의 항체는 면역 관문 차단(ICB) 미노출 암을 치료하는 데 사용된다. 일부 양태에서, 본 개시의 항체는 ICB에 노출된 암을 치료하는 데 사용된다.
일부 양태에서, 본 개시의 항체는 결장직장암을 치료하는 데 사용된다. 일부 양태에서, 본 개시의 항체는 두경부 편평 세포 암종(HNSCC 또는 SCCHN)을 치료하는 데 사용된다. 일부 양태에서, 본 개시의 항체는 피부 편평 세포 암종(CSCC)을 치료하는 데 사용된다. 일부 양태에서, 본 개시의 항체는 위암을 치료하는 데 사용된다. 일부 양태에서, 본 개시의 항체는 비소세포 폐암(NSCLC)을 치료하는 데 사용된다. 일부 양태에서, 본 개시의 항체는 자궁경부암을 치료하는 데 사용된다. 일부 양태에서, 본 개시의 항체는 식도암을 치료하는 데 사용된다. 일부 양태에서, 본 개시의 항체는 흑색종을 치료하는 데 사용된다. 일부 양태에서, 본 개시의 항체는 삼중 음성 유방암을 치료하는 데 사용된다. 일부 양태에서, 본 개시의 항체는 신세포 암종을 치료하는 데 사용된다. 일부 양태에서, 본 개시의 항체는 유방암을 치료하는 데 사용된다.
종양 성장을 억제하고/하거나 암 환자의 생존률을 향상시키기 위해 면역자극 요법 및/또는 면역지원 요법과 조합하여 본원에 제공된 항-GITR 항체를 사용하는 것이 본원에서 고려된다. 면역자극 요법은, 억제된 면역 세포에 대한 “억제를 해제하거나(releasing the brake)” 면역 세포를 “활성화시켜(stepping on the gas)” 면역 반응을 활성화함으로써 면역 세포 활성을 증가시키는 직접 면역자극 요법을 포함한다. 예로는 다른 관문 수용체를 표적화하는 것, 백신접종, 및 애쥬번트가 있다. 면역지원 요법은 면역원성 세포 사멸, 염증을 촉진함으로써 종양의 항원성을 증가시키거나, 항종양 면역 반응을 촉진하는 다른 간접 효과를 가질 수 있다. 예로는 방사선, 화학요법, 항혈관형성제, 및 수술이 있다.
본 개시는 대상체에서 항종양 면역 반응을 조절하는 방법을 포함하며, 상기 방법은 항-GITR 항체를 활성화 수용체에 대한 하나 이상의 작용제 항체 및 T 세포 자극을 향상시켜 종양 파괴를 촉진하는 억제 수용체에 대한 하나 이상의 차단 항체와 조합하여 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 개시는 대상체에서 항종양 면역 반응을 조절하는 방법을 포함하며, 상기 방법은 본원에 기술된 항-GITR 항체 또는 항원 결합 단편을 제2 T 세포 활성화 수용체(즉 GITR 이외의 수용체)에 결합하는 하나 이상의 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 조합하여 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 T 세포 활성화 수용체는 CD28, OX40, CD137, CD27, 또는 VEM이다. 본 개시는 또한, 본원에 제공된 항-GITR 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 상기 제2 T 세포 활성화 수용체에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 제형을 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 개시의 하나 이상의 항체는 다음과 조합하여 사용될 수 있다: PD-L1에 대한 항체, PD-1에 대한 항체(예를 들어 니볼루맙, 세미플리맙), LAG-3 억제제, CTLA-4 억제제(예를 들어 이필리무맙), TIM3 억제제, BTLA 억제제, TIGIT 억제제, CD47 억제제, 다른 T 세포 공동-억제제 또는 리간드에 대한 길항제(예를 들어 CD-28, 2B4, LY108, LAIR1, ICOS, CD160, 또는 VISTA에 대한 항체), 인돌아민-2,3-디옥시게나아제 (IDO) 억제제, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 길항제[예를 들어 미국 특허 제7,087,411호에 제시된 것과 같은 애플리버셉트 또는 다른 VEGF-억제 융합 단백질과 같은 “VEGF-덫(Trap)”, 또는 항-VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어 베바시주맙, 또는 라니비주맙) 또는 VEGF 수용체의 소분자 키나아제 억제제(예를 들어 수니티닙, 소라페닙, 또는 파조파닙)], Ang2 억제제(예를 들어 네스바쿠맙), 형질전환 성장 인자 베타 (TGFβ) 억제제, 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 억제제(예를 들어 엘로티닙, 세툭시맙), 공동자극 수용체에 대한 작용제(예를 들어 글루코코르티코이드-유도 TNFR-관련 단백질에 대한 작용제), 종양-특이적 항원(예를 들어 CA9, CA125, 흑색종 관련 항원 3(MAGE3), 암배아 항원(CEA), 비멘틴, 종양-M2-PK, 전립선-특이적 항원 (PSA), 뮤신-1, MART-1, 및 CA19-9)에 대한 항체, 백신(예를 들어, 칼메트-구에린 간균(BCG), 암 백신), 항원 제시를 증가시키는 애쥬번트(예를 들어 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자), 이중특이적 항체(예를 들어 CD3xCD20 이중특이적 항체, PSMAxCD3 이중특이적 항체), 세포독소, 화학요법제(예를 들어 다카바진, 테모졸로미드, 시클로포스파미드, 도세탁셀, 독소루비신, 다우노루비신, 시스플라틴, 카보플라틴, 젬시타빈, 메토트렉세이트, 미톡산트론, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 및 빈크리스틴), 시클로포스파미드, 방사선요법, IL-6R 억제제(예를 들어 사릴루맙), IL-4R 억제제(예를 들어 두필루맙), IL-10 억제제, 사이토카인(예를 들어 IL-2, IL-7, IL-21, 및 IL-15), 항체-약물 접합체(ADC)(예를 들어 항-CD19-DM4 ADC, 및 항-DS6-DM4 ADC), 항염증제(예를 들어 코르티코스테로이드 및 비스테로이드성 항염증제), 항산화제와 같은 식이 보충제, 또는 암 치료를 위한 임의의 완화 요법. 소정의 구현예에서, 본 개시의 항-GITR 항체는 항종양 반응을 증강시키기 위해 수지상 세포 백신, 종양 분해 바이러스(oncolytic virus), 종양 세포 백신 등을 포함하는 암 백신과 병용으로 사용될 수 있다. 본 개시의 항-GITR 항체와 병용으로 사용될 수 있는 암 백신의 예는 흑색종 및 방광암용 MAGE3 백신, 유방암용 MUC1 백신, 뇌암(다형성 교아종 포함)용 EGFRv3, 또는 CEA+ 암용 ALVAC-CEA를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 하나 이상의 항-GITR 항체는, 미국 특허 공개 제2015/0203579호 및 미국 특허 제9,987,500호(이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨)에 기술된 것을 포함하되 이에 한정되지 않는 하나 이상의 항-PD1 항체와 병용으로 투여된다. 일부 구현예에서, 항-GITR 항체는 본원에 기술된 바와 같이 변형된 U.S. 2017/0355774A1의 항체이다. 일부 구현예에서, 항-PD1 항체는 세미플리맙, 펨브롤리주맙, 또는 니볼루맙이다.
소정의 구현예에서, 본원에 제공된 항-GITR 항체는 장기 지속성 항종양 반응을 생성하는 방법 및/또는 암환자의 생존률을 향상시키는 방법에서 방사선 치료와 병용으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 항-GITR 항체는 암 환자에게 방사선 요법을 투여하기 전, 동시에, 또는 후에 투여될 수 있다. 예를 들어, 방사선 요법이 종양 병변에 1회 이상의 투여량으로 투여되고, 이어서 본원에 제공된 항-GITR 항체의 1회 이상의 투여량이 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 방사선 요법은 환자의 종양의 국소 면역원성을 강화시키기 위해(보조 방사선) 및/또는 종양 세포를 사멸시키기 위해(절제 방사선) 1회 이상의 투여량으로 종양 병변에 국소 투여되고, 이어서 본원에 제공된 항-GITR 항체가 전신 투여될 수 있다. 예를 들어, 두개내 방사선(intracranial radiation)은 본원에 제공된 항-GITR 항체의 전신 투여와 병용으로 뇌암(예: 다형성 교아종) 환자에게 투여될 수 있다. 소정의 구현예에서, 본원에 제공된 항-GITR 항체는 방사선 요법 및 화학요법제(예: 테모졸로미드) 또는 VEGF 길항제(예: 애플리버셉트)와 병용으로 투여될 수 있다.
소정의 구현예에서, 본원에 제공된 항-GITR 항체는 LCMV, HIV, HPV, HBV, 또는 HCV에 의해 야기된 만성 바이러스 감염증을 치료하기 위해 하나 이상의 항바이러스성 약물과 병용으로 투여될 수 있다. 항바이러스성 약물의 예는 지도부딘(zidovudine), 라미부딘(lamivudine), 아바카비르(abacavir), 리바비린(ribavirin), 로피나비르(lopinavir), 에파비렌즈(efavirenz), 코비시스타트(cobicistat), 테노포비르(tenofovir), 릴피비린(rilpivirine) 및 코르티코스테로이드(corticosteroid)를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 항-GITR 항체는 만성 바이러스 감염증을 치료하기 위해 LAG3 억제제, CTLA-4 억제제, 또는 다른 T 세포 공동-억제제의 임의의 길항제와 병용으로 투여될 수 있다.
소정의 구현예에서, 본원에 제공된 항-GITR 항체는 자가면역 질환의 치료를 위해 면역 세포 상의 Fc 수용체에 대한 항체와 조합될 수 있다. 일 구현예에서, 본원에 제공된 항체 또는 이의 단편은 자가면역 조직에 특이적인 항원을 표적으로 하는 항체 또는 항원 결합 단백질과 병용으로 투여된다. 소정의 구현예에서, 본원에 제공된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Fcα(예: CD89), Fc 감마(예: CD64, CD32, CD16a, 및 CD16b), CD19 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는, T 세포 수용체 또는 B 세포 수용체를 표적으로 하는 항체 또는 항원 결합 단백질과 병용으로 투여된다. 본원에 제공된 항체는 다음을 포함하지만 이들로 한정되지 않는 자가면역 질환 또는 장애를 치료하기 위해 당업계에 알려진 임의의 약물 또는 요법(예를 들어 코르티코스테로이드 및 기타 면역억제제)와 병용으로 사용될 수 있다: 원형 탈모증, 자가면역 간염, 복강병, 그레이브스병, 귈랑-바레 증후군, 하시모토병, 용혈성 빈혈, 염증성 장 질환, 염증성 근육병증, 다발성 경화증, 원발성 담즙성 간경화증, 건선, 류마티스 관절염, 피부경화증, 쇼그렌 증후군, 전신성 홍반성 루푸스, 백반증, 자가면역 췌장염, 자가면역 두드러기, 자가면역 혈소판감소성 자반증, 크론병, 1형 당뇨병, 호산구성 근막염, 호산구성 장내세동염, 굿파스쳐 증후군, 중증근무력증, 건선성 관절염, 류마티스 열, 궤양성 대장염, 혈관염, 및 베게너 육아종증.
본 개시는 또한, 대상체에서 항종양 면역 반응을 조절하는 방법을 포함하며, 상기 방법은 본원에 기술된 항-GITR 항체 또는 항원 결합 단편을 T 세포 억제 수용체에 결합하는 하나 이상의 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 병용으로 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, T 세포 억제 수용체는 CTLA-4, PD-1, TIM-3, BTLA, VISTA, 또는 LAG-3이다. 본 개시는 또한, 본원에 제공된 항-GITR 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 상기 T 세포 억제 수용체에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 제형을 포함한다. 일부 양태에서, 예를 들어, PD1 신호전달이 존재할 때, 세미플리맙은 항-CD3-자극된 T 세포 활성화를 향상시키는 항-GITR 항체의 능력을 회복시켰다.
본 개시는 또한, 본원에 기술된 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 제형을 방사선 또는 화학요법과 함께 대상체에게 투여함으로써 암을 치료하는 방법을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 항-GITR 항체는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가 치료적 활성 성분(들)과 조합하여 공동 제형화되고/되거나 투여된다: EGFR 길항제(예를 들어 항-EGFR 항체[예를 들어 세툭시맙 또는 파니투무맙] 또는 EGFR의 소분자 억제제[예를 들어 게피티닙 또는 엘로티닙]), Her2/ErbB2, ErbB3, 또는 ErbB4와 같은 EGFR 계열 구성원의 길항제(예를 들어 항-ErbB2[예를 들어 트라스투주맙 또는 T-DM1 {KADCYLA®}], 항-ErbB3 또는 항-ErbB4 항체 또는 ErbB2, ErbB3, 또는 ErbB4 활성의 소분자 억제제), EGFRvIII의 길항제(예를 들어 EGFRvIII에 특이적으로 결합하는 항체), cMET 길항제(예를 들어 항-cMET 항체), IGF1R 길항제(예를 들어 항-IGF1R 항체), B-raf 억제제(예를 들어 베무라페닙, 소라페닙, GDC-0879, PLX-4720), PDGFR-α 억제제(예를 들어 항-PDGFR-α 항체), PDGFR-β 억제제(예를 들어 항PDGFR-β 항체, 또는 예를 들어 이마티닙 메실레이트 또는 수니티닙 말레이트와 같은 소분자 키나아제 억제제), PDGF 리간드 억제제(예를 들어 항-PDGF-A, -B, -C, 또는 -D 항체, 앱타머, siRNA 등). VEGF 길항제(예를 들어 애플리버셉트와 같은 VEGF-덫, 예를 들어 미국 특허 제7,087,411호 참조(“VEGF-억제 융합 단백질”로도 본원에서 지칭됨), 항-VEGF 항체(예: 베바시주맙), VEGF 수용체의 소분자 키나아제 억제제(예: 수니티닙, 소라페닙, 또는 파조파닙)), DLL4 길항제(예: US 2009/0142354에 개시된 항-DLL4 항체, 예컨대 REGN421), Ang2 길항제(예를 들어 US 2011/0027286에 개시된 항-Ang2 항체, 예컨대 H1H685P), FOLH1 길항제(예를 들어 항-FOLH1 항체), STEAP1 또는 STEAP2 길항제(예를 들어 항-STEAP1 항체 또는 항-STEAP2 항체), TMPRSS2 길항제(예를 들어 항-TMPRSS2 항체), MSLN 길항제(예를 들어 항-MSLN 항체), CA9 길항제(예를 들어 항-CA9 항체), 우로플라킨 길항제(예를 들어 항-우로플라킨 [예를 들어 항-UPK3A] 항체), MUC16 길항제(예를 들어 항-MUC16 항체), Tn 항원 길항제(예를 들어 항-Tn 항체), CLEC12A 길항제(예를 들어 항-CLEC12A 항체), TNFRSF17 길항제(예를 들어 항-TNFRSF17 항체), LGR5 길항제(예를 들어 항-LGR5 항체), 1가 CD20 길항제(예를 들어 리툭시맙과 같은 1가 항-CD20 항체, 등. 본원에 제공된 항체와 유익하게 병용 투여할 수 있는 다른 제제는, 예를 들어, 타목시펜, 아로마타제 억제제, 및 사이토카인 억제제를 포함하며, 사이토카인 억제제에는 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18과 같이 사이토카인에 결합하거나 이들 각각의 수용체에 결합하는 저분자 사이토카인 억제제 및 항체가 포함된다.
본 개시는 본원에 기술된 항-GITR 항체 중 어느 하나를 하나 이상의 화학요법제와 조합하여 포함하는 조성물 및 치료 제형을 포함한다. 화학요법제의 예는: 티오테파(thiotepa) 및 시클로포스파미드(cyclosphosphamide)(Cytoxan™)와 같은 알킬화제; 부설판(busulfan), 임프로설판(improsulfan), 및 피포설판(piposulfan)과 같은 알킬 설폰네이트; 벤조도파(benzodopa), 카보쿠온(carboquone), 메투레도파(GITRuredopa), 및 우레도파(uredopa)와 같은 아지리딘(aziridines); 알트레타민(altretamine), 트리에틸렌멜라민(triethylenemelamine), 트리에틸렌포스포라미드(trietylenephosphoramide), 트리에틸렌티오포스포라미드(triethylenethiophosphaoramide), 및 트리메틸롤멜라민(triGITRhylolomelamine)을 포함하는 에틸렌이민(ethylenimines) 및 메틸라멜라민(GITRhylamelamines); 클로람부실(chlorambucil), 클로르나파진(chlornaphazine), 클로로포스파미드(cholophosphamide), 에스트라머스틴(estramustine), 이포스파미드(ifosfamide), 메클로르에타민(mechlorethamine), 메클로르에타민 옥사이드 하이드로클로라이드(mechlorethamine oxide hydrochloride), 멜팔란(melphalan), 노벰비친(novembichin), 펜에스테린(phenesterine), 프레드시머스틴(prednimustine), 트로포스파미드(trofosfamide), 우라실 머스타드(uracil mustard)와 같은 질소 머스타드(nitrogen mustards); 카머스틴(carmustine), 클로로조토신(chlorozotocin), 포테머스틴(fotemustine), 로머스틴(lomustine), 니머스틴(nimustine), 라니머스틴(ranimustine)와 같은 니트로소우레아(nitrosureas); 아클리시노마이신(aclacinomysins), 액티노마이신(actinomycin), 안트라마이신(authramycin), 아자세린(azaserine), 블레오마이신(bleomycins), 칵티노마이신(cactinomycin), 칼리키마이신(calicheamicin), 카라비신(carabicin), 카미노마이신(carminomycin), 카지노필린(carzinophilin), 크로노마이신(chromomycins), 닥티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 데토루비신(detorubicin), 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신(doxorubicin), 에피루비신(epirubicin), 에소루비신(esorubicin), 이다루비신(idarubicin), 마셀로마이신(marcellomycin), 미토마이신(mitomycins), 마이코페놀산(mycophenolic acid), 노갈라마이신(nogalamycin), 올리보마이신(olivomycins), 페플로마이신(peplomycin), 포트피로마이신(potfiromycin), 퓨로마이신(puromycin), ?quot;라마이신(quelamycin), 로도루비신(rodorubicin), 스트렙토니그린(streptonigrin), 스트렙토조신(streptozocin), 투베르시딘(tubercidin), 우베니멕스(ubenimex), 지노스타틴(zinostatin), 조루비신(zorubicin)과 같은 항생제; 메토트렉세이트(GITRhotrexate) 및 5-플루오로우라실(5-FU)과 같은 항대사물질(anti-GITRabolites); 데노프테린(denopterin), 메토트렉세이트, 프테로프테린(pteropterin), 트리메트렉세이트(triGITRrexate)와 같은 엽산 유사체; 플루다라빈(fludarabine), 6-메캅토퓨린(mercaptopurine), 티아미프린(thiamiprine), 티오구아닌(thioguanine)과 같은 퓨린 유사체; 안시타빈(ancitabine), 아자시티딘(azacitidine), 6-아자우리딘(azauridine), 카모푸르(carmofur), 시타라빈(cytarabine), 디데옥시우리딘(dideoxyuridine), 독시플루리딘(doxifluridine), 에노시타빈(enocitabine), 플록스우리딘(floxuridine)과 같은 피리미딘 유사체; 칼루스테론(calusterone), 드로모스타놀론 프로피오네이트(dromostanolone propionate), 에피티오스타놀(epitiostanol), 메피티오스탄(mepitiostane), 테스토락톤(testolactone)과 같은 안드로겐(androgen); anti-adrenals such as 아미노글루테티미드(aminoglutethimide), 미토탄(mitotane), 트릴로스탄(trilostane)과 같은 항부신제; 프롤린산(frolinic acid)과 같은 엽산 보충제; 아세글라톤(aceglatone); 알도포스파미드 글리코시드(aldophosphamide glycoside); 아미노레불린산(aminolevulinic acid); 암사크린(amsacrine); 베스트라부실(bestrabucil); 비산트렌(bisantrene); 에다트렉세이트(edatraxate); 데포파민(defofamine); 데메콜신(demecolcine); 디자이쿠온(diaziquone); 에플로르니틴(elfornithine); 엘립티늄 아세테이트(elliptinium acetate); 에토글루시드(etoglucid); 질산갈륨(gallium nitrate); 하이드록시우레아(hydroxyurea); 렌티난(lentinan); 로니다민(lonidamine); 미토구아존(mitoguazone); 미톡산트론(mitoxantrone); 모피다몰(mopidamol); 니트라크린(nitracrine); 펜토스타틴(pentostatin); 페나메트(phenaGITR); 피라루비신(pirarubicin); 포도필린산(podophyllinic acid); 2-에틸하이드라지드; 프로카바진(procarbazine); PSK™; 라족산(razoxane); 시조피란(sizofiran); 스피로게르마늄(spirogermanium); 테누아존산(tenuazonic acid); 트리아지쿠온(triaziquone); 2,2',2''-트리클로로트리에틸아민; 우레탄(urethan); 빈데신(vindesine); 다카바진(dacarbazine); 만노머스틴(mannomustine); 미토브로니톨(mitobronitol); 미토락톨(mitolactol); 피포브로만(pipobroman); 가시토신(gacytosine); 아라비노시드(arabinoside)(“Ara-C”); 시클로포스파미드(cyclophosphamide); 티오테파(thiotepa); 파클리탁셀(paclitaxel)(Taxol™, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) 및 도세탁셀(Taxotere™; Aventis Antony, France)과 같은 탁산(taxanes); 클로람부실(chlorambucil); 젬시타빈(gemcitabine); 6-티오구아닌; 머캅토퓨린(mercaptopurine); 메토트렉세이트; 시스플라틴(cisplatin) 및 카보플라틴(carboplatin)과 같은 백금 유사체; 빈블라스틴(vinblastine); 백금(platinum); 에토포시드(etoposide)(VP-16); 이포스파미드(ifosfamide); 미토마이신 C; 미톡산트론(mitoxantrone); 빈크리스틴(vincristine); 비노렐빈(vinorelbine); 나벨빈(navelbine); 노반트론(novantrone); 테니포시드(teniposide); 다우노마이신(daunomycin); 아미노프테린(aminopterin); 젤로다(xeloda); 이반드로네이트(ibandronate); CPT-11; 토포이소머라아제 억제제(topoisomerase inhibitor) RFS 2000; 디블루오로메틸오르니틴(difluoroGITRhylornithine, DMFO); 레티노산(retinoic acid); 에스페라마이신(esperamicins); 카페시타빈(capecitabine); 및 전술한 것 중 어느 하나의 약학적으로 허용 가능한 염, 산, 또는 유도체를 포함한다. 또한, 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 억제하도록 작용하는 항-호르몬제, 예컨대, 예를 들어, 타목시펜(tamoxifen), 랄록시펜(raloxifene), 아로마타아제 억제 4(5)-이미다졸, 4-하이드록시타목시펜, 트리옥시펜(trioxifene), 케옥시펜(keoxifene), LY 117018, 오나프리스톤(onapristone), 및 토레미펜(toremifene)(Fareston)을 포함하는 항-에스트로겐제; 및 플루타미드(flutamide), 닐루타미드(nilutamide), 비칼루타미드(bicalutamide), 류프롤리드(leuprolide), 및 고세렐린(goserelin)과 같은 항-안드로겐제; 및 전술한 것 중 어느 하나의 약학적으로 허용 가능한 염, 산, 또는 유도체가 본 정의에 포함된다.
본원에 제공된 항-GITR 항체는 항바이러스제, 항생제, 진통제, 코르티코스테로이드, 스테로이드, 산소, 항산화제, COX 억제제, 심장 보호제, 금속 킬레이트제, IFN-감마, 및/또는 NSAID와 조합하여 투여되고/되거나 공동 제형화될 수도 있다.
추가적인 치료적 활성 성분(들), 예를 들어, 위에 열거된 제제 중 어느 하나 또는 이의 변이체는 본 개시의 항-GITR 항체의 투여 직전에, 동시에, 또는 직후에 투여될 수 있다; (본 개시의 목적을 위해, 이러한 투여 요법은 항-GITR 항체가 추가적인 치료적 활성 성분과 “병용(in combination with)” 투여되는 것으로 간주된다). 본 개시는, 본 개시의 항-GITR 항체가 본 개시의 다른 곳에 기술된 것과 같은 하나 이상의 추가적인 치료적 활성 성분(들)과 공동으로 제형화된 약학적 조성물을 포함한다.
추가의 치료적 활성 성분(들)은 본 개시의 항-GITR 항체의 투여 이전에 대상체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 제1 성분이 제2 성분을 투여하기 1주일 전, 72시간 전, 60시간 전, 48시간 전, 36시간 전, 24시간 전, 12시간 전, 6시간 전, 5시간 전, 4시간 전, 3시간 전, 2시간 전, 1시간 전, 30분 전, 15분 전, 10분 전, 5분 전, 또는 1분 미만 전에 투여되는 경우, 제1 성분은 제2 성분 “이전에” 투여되는 것으로 간주될 수 있다. 다른 구현예에서, 추가의 치료적 활성 성분(들)은 본 개시의 항-GITR 항체의 투여 이후에 대상체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 제1 성분이 제2 성분을 투여하고 1분 후, 5분 후, 10분 후, 15분 후, 30분 후, 1시간 후, 2시간 후, 3시간 후, 4시간 후, 5시간 후, 6시간 후, 12시간 후, 24시간 후, 36시간 후, 48시간 후, 60시간 후, 72시간 후에 투여되는 경우, 제1 성분은 제2 성분 “이후에” 투여되는 것으로 간주될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 추가의 치료적 활성 성분(들)은 본 개시의 항-GITR 항체의 투여와 동시에 대상체에게 투여될 수 있다. 본 개시의 목적을 위해, "동시" 투여는, 예를 들어 항-GITR 항체 및 추가의 치료적 활성 성분을 단일 투여 형태로 (예를 들어 공동 제형화된 형태로) 대상체에게 투여하는 것, 또는 별도의 투여 형태로 서로 약 30분 이내의 간격을 두고 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 별도의 투여 형태로 투여되는 경우, 각 투여 형태는 동일한 경로를 통해 투여될 수 있고(예를 들어, 항-GITR 항체 및 추가의 치료적 활성 성분 모두 정맥 내, 피하 등으로 투여될 수 있음); 대안적으로, 각 투여 형태는 상이한 경로를 통해 투여될 수 있다(예를 들어, 항-GITR 항체는 정맥 내 투여되고, 추가의 치료적 활성 성분은 피하 투여될 수 있음). 어떤 경우에도, 본 발명의 목적을 위해, 조성물을 단일 투여 형태로 투여하거나, 동일한 경로에 의해 별도의 투여 형태로 투여하거나, 상이한 경로에 의해 별도의 투여 형태로 투여하는 것은 모두 “동시 투여”로서 간주된다. 본 개시의 목적을 위해, 항-GITR 항체를 추가의 치료적 활성 성분의 투여 “이전”, “동시” 또는 “이후”(이들 용어는 위의 본원에 정의되어 있음)에 투여하는 것은 항-GITR 항체를 추가의 치료적 활성 성분과 “병용” 투여하는 것으로 간주된다.
본 개시는, 본 개시의 항-GITR 항체가 본 개시의 다른 곳에 기술된 바와 같은 하나 이상의 추가적인 치료적 활성 성분(들)과, 다양한 투여량 조합을 사용해 공동으로 제형화된 약학적 조성물을 포함한다.
본원에 제공된 항-GITR 항체가 VEGF 길항제(예를 들어 애플리버셉트와 같은 VEGF 덫)와 병용 투여되는(항-GITR 항체 및 VEGF 길항제를 포함하는 공동제형을 투여하는 것을 포함함) 예시적인 구현예에서, 개별 성분은 다양한 투여량 조합을 사용해 대상체에게 투여되고/되거나 공동제형화될 수 있다. 예를 들어, 항-GITR 항체는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 양으로 대상체에게 투여되고/되거나 공동제형에 함유될 수 있고: 0.01 mg, 0.02 mg, 0.03 mg, 0.04 mg, 0.05 mg, 0.1 mg, 0.2 mg, 0.3 mg, 0.4 mg, 0.5 mg, 0.6 mg, 0.7 mg, 0.8 mg, 0.9 mg, 1.0 mg, 1.5 mg, 2.0 mg, 2.5 mg, 3.0 mg, 3.5 mg, 4.0 mg, 4.5 mg, 5.0 mg, 6.0 mg, 7.0 mg, 8.0 mg, 9.0 mg, 및 10.0 mg; VEGF 길항제(예를 들어 애플리버셉트와 같은 VEGF 덫)는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 양으로 대상체에게 투여되고/되거나 공동제형에 함유할 수 있다: 0.1 mg, 0.2 mg, 0.3 mg, 0.4 mg, 0.5 mg, 0.6 mg, 0.7 mg, 0.8 mg, 0.9 mg, 1.0 mg, 1.1 mg, 1.2 mg, 1.3 mg, 1.4 mg, 1.5 mg, 1.6 mg, 1.7 mg, 1.8 mg, 1.9 mg, 2.0 mg, 2.1 mg, 2.2 mg, 2.3 mg, 2.4 mg, 2.5 mg, 2.6 mg, 2.7 mg, 2.8 mg, 2.9 mg, 및 3.0 mg. 조합/공동제형은, 예를 들어 주 2회, 매주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 매월 1회, 2개월마다 1회, 3개월마다 1회, 4개월마다 1회, 5개월마다 1회, 6개월마다 1회 등을 포함하여, 본원의 다른 곳에 개시된 임의의 투여 계획 중 어느 하나에 따라 대상체에게 투여될 수 있다.
투여 요법
본 개시의 소정의 구현예에 따르면, 항-GITR 항체(또는 항-GITR 항체와 본원에서 언급된 추가 치료적 활성제 중 어느 하나의 조합을 포함하는 약학적 조성물)의 다회 투여량이 정의된 시간 과정에 걸쳐 대상체에게 투여될 수 있다. 본원에 제공된 이러한 양태에 따른 방법은 본원에 제공된 항-GITR 항체의 다회 투여량을 대상체에게 순차적으로 투여하는 단계를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, “순차적 투여”는 항-GITR 항체의 각 투여량이 상이한 시점에, 예를 들어 소정의 간격(예: 시간, 일, 주, 또는 월)만큼 분리된 상이한 날에 대상체에게 투여됨을 의미한다. 본 개시는 항-GITR 항체의 1회 초기 투여량에 이어서 항-GITR 항체의 1회 이상의 2차 투여량을 환자에게 순차적으로 투여하고, 이어서 항-GITR 항체의 1회 이상의 3차 투여량을 임의로 투여하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다.
용어 “초기 투여량”, “2차 투여량” 및 “3차 투여량”은 본원에 제공된 항-GITR 항체의 시간적 투여 순서를 지칭한다. 따라서, “초기 투여량”은 치료 처방의 시작 시 투여되는 투여량(“베이스라인 투여량”으로도 지칭됨); “2차 투여량”은 초기 투여 후 투여되는 투여량이고; “3차 투여량”은 2차 투여 후 투여되는 투여량이다. 초기, 2차, 및 3차 투여량은 모두 동일한 양의 항-GITR 항체를 함유할 수 있지만, 일반적으로 투여 빈도의 관점에서 서로 다를 수 있다. 그러나, 소정의 구현예에서, 초기, 2차, 및/또는 3차 투여량에 함유된 항-GITR 항체의 양은 치료 과정 동안 서로 다를 수 있다(예를 들어, 적절하게 상향 또는 하향 조절됨). 소정의 구현예에서, 2회 이상의(예: 2, 3, 4, 또는 5회) 투여량이 치료 요법 시작 시 “로딩 투여량”으로서 투여되고, 이어서 적은 빈도수 기준으로 투여되는 후속 투여량(예: “유지 투여량”)이 투여된다.
본 개시의 예시적인 소정의 구현예에서, 각각의 2차 및/또는 3차 투여량은 직전 투여량의 1 내지 26주 후에 (예를 들어, 1, 1½, 2, 2½, 3, 3½, 4, 4½, 5, 5½, 6, 6½, 7, 7½, 8, 8½, 9, 9½, 10, 10½, 11, 11½, 12, 12½, 13, 13½, 14, 14½, 15, 15½, 16, 16½, 17, 17½, 18, 18½, 19, 19½, 20, 20½, 21, 21½, 22, 22½, 23, 23½, 24, 24½, 25, 25½, 26, 26½주 또는 더 이상 후에) 투여된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, “직전 투여량(the immediately preceding dose)”라는 문구는, 다회 투여의 순서에 있어서, 순서 상 바로 다음 투여량이 환자에게 투여되기 전에 투여되는 항-GITR 항체의 투여량을 의미하고, 이들 사이에 개재되는 투여량이 없음을 의미한다.
본원에 제공된 이러한 양태에 따른 방법은 항-GITR 항체의 임의의 수의 제2 및/또는 제3 투여량을 환자에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 소정의 구현예에서, 2차 투여량은 1회만 환자에게 투여된다. 다른 구현예에서, 2회 이상의 (예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8회 또는 그 이상의) 2차 투여량이 환자에게 투여된다. 마찬가지로, 소정의 구현예에서, 3차 투여량은 1회만 환자에게 투여된다. 다른 구현예에서, 2회 이상의 (예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8회 또는 그 이상의) 3차 투여량이 환자에게 투여된다. 투여 요법은 특정 대상체의 수명에 걸쳐 수행되거나, 이러한 치료가 더 이상 치료적으로 필요하지 않거나 유리하지 않을 때까지 무기한으로 수행될 수 있다.
다회의 2차 투여량을 포함하는 구현예에서, 각각의 2차 투여량은 다른 2차 투여량과 동일한 빈도로 투여될 수 있다. 예를 들어, 각각의 2차 투여량은 직전 투여량이 투여되고 1 내지 2주 후 또는 1 내지 2개월 후에 환자에게 투여될 수 있다. 유사하게, 다회의 3차 투여량을 포함하는 구현예에서, 각각의 3차 투여량은 다른 3차 투여량과 동일한 빈도로 투여될 수 있다. 예를 들어, 각각의 3차 투여량은 직전 투여량이 투여되고 2 내지 12주 후에 환자에게 투여될 수 있다. 본원에 제공된 소정의 구현예에서, 2차 및/또는 3차 투여량이 환자에게 투여되는 빈도는 치료 요법의 과정에 걸쳐 달라질 수 있다. 투여 빈도는 임상 검사 후 개별 환자의 필요에 따라 의사가 치료 과정 동안 조정할 수도 있다.
본 개시는, 2 내지 6회의 로딩 투여량이 제1 빈도로 (예를 들어 주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 월 1회, 2개월마다 1회 등) 환자에게 투여되고, 이어서 2회 이상의 유지 투여량이 더 낮은 빈도로 환자에게 투여되는 투여 요법을 포함한다. 예를 들어, 본원에 제공된 이러한 양태에 따르면, 로딩 투여량이 월 1회의 빈도로 투여되는 경우, 유지 투여량은 6주마다 1회, 2개월마다 1회, 3개월마다 1회 등으로 환자에게 투여될 수 있다.
항체의 진단적 사용
본 개시의 항-GITR 항체는 샘플에서 GITR 또는 GITR 발현 세포를 검출 및/또는 측정하는 데, 예를 들어 진단 목적으로 사용될 수도 있다. 예를 들어, 항-GITR 항체 또는 이의 단편은 GITR의 비정상 발현(예: 과발현, 발현 부족, 발현 결여 등)을 특징으로 하는 병태 또는 질환을 진단하는 데 사용될 수 있다. GITR에 대한 예시적인 진단 검정은, 예를 들어 환자로부터 수득된 샘플을 본원에 제공된 항-GITR 항체와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 항-GITR 항체는 검출 가능한 표지 또는 리포터 분자로 표지된다. 대안적으로, 표지되지 않은 항-GITR 항체가 자체적으로 검출 가능하게 표지된 보조 항체와 병용으로 진단 용도에 사용될 수 있다. 검출 가능한 표지 또는 리포터 분자는 3H, 14C, 32P, 35S 또는 125I와 같은 방사성 동위원소; 플루오레세인 또는 로다민과 같은 형광 모이어티 또는 화학발광 모이어티; 또는 알칼라인 포스파타아제, 베타-갈락토시다아제, 서양 고추냉이 퍼옥시다아제, 또는 루시페라아제와 같은 효소일 수 있다. 샘플에서 GITR를 검출하거나 측정하는 데 사용할 수 있는 특정 예시적인 검정은 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA), 방사성 면역검정(RIA), 면역-PET(예: 89Zr, 64Cu 등), 및 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 포함한다.
본 개시에 따른 GITR 진단 검정에 사용될 수 있는 샘플에는 환자로부터 얻을 수 있는 임의의 조직 또는 체액 샘플이 포함되며, 이러한 샘플은 정상적인 또는 병리학적 조건 하에서 검출 가능한 양의 GITR 단백질 또는 이의 단편을 함유한다. 일반적으로는, 건강한 환자(예를 들어 비정상적인 GITR 수준 또는 활성과 연관이 있는 질환 또는 병태로 고통받지 않는 환자)로부터 수득한 특정 샘플에서 GITR의 수준을 측정하여 GITR의 베이스라인 수준 또는 표준 수준을 먼저 확립하게 된다. 그런 다음, GITR의 이러한 베이스라인 수준을 GITR 관련 질환이나 병태를 갖는 것으로 의심되는 개체로부터 수득한 샘플에서 측정한 GITR의 수준과 비교할 수 있다.
실시예
다음 실시예들은 당업자에게 본원에 제공된 조성물을 제조하고 이를 사용하는 방법을 완전하게 개시하고 설명하기 위해 제시된 것으로서, 본 발명자들이 발명으로 간주하는 것의 범주를 제한하고자 하는 것이 아니다. 사용된 숫자(예를 들어 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위한 노력을 기울였으나 약간의 실험 오차와 편차에 대해서는 설명되어야 한다. 달리 표시되지 않는 한, 부(parts)는 중량 부(parts by weight)이고, 분자량은 평균 분자량이며, 온도는 섭씨 온도이고, 압력은 대기압이거나 거의 대기압이다.
실시예 1. 항-GITR 항체의 생성
VELOCIMMUNE® 마우스(즉, 인간 면역글로불린 중쇄 및 카파 경쇄 가변 영역을 암호화하는 DNA를 포함하는 조작된 마우스)를 인간 GITR의 가용성 이량체 엑토도메인을 포함하는 면역원으로 면역화하여 항-GITR 항체를 수득하였다. 항체 면역 반응은 GITR 특이적 면역 검정으로 모니터링하였다. U.S. 2007/0280945A1에 기술된 것과 같이, 항원-양성 B 세포를 골수종 세포와 융합시키지 않고, 항원-양성 B 세포로부터 여러 개의 완전한 인간 항-GITR 항체를 직접 단리하였다.
표 1은 U.S. 2017/0355774A1에서 이전에 개시된 것과 같이, 선택된 항-GITR 항체인 CompAb1 항체항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 및 CDR의 아미노산 서열 식별자를 제시한다. 상응하는 핵산 서열 식별자는 표 2에 제시된다. 표 3은 CompAb1 항체에 대한 전장 중쇄 및 경쇄 서열을 제공한다.
아미노산 서열 식별자
서열번호
항체 명칭 HCVR HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCVR LCDR1 LCDR2 LCDR3
CompAb1 2 4 6 8 10 12 14 16
핵산 서열 식별자
서열번호
항체 명칭 HCVR HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCVR LCDR1 LCDR2 LCDR3
CompAb1 1 3 5 7 9 11 13 15
전장 중쇄 및 경쇄 서열
서열번호
항체 명칭 전장 중쇄 전장 경쇄
핵산 아미노산 핵산 아미노산
CompAb1 17 19 19 20
실시예 2. 항-GITR 항체인 CompAb1에서 절단의 평가 및 정량화
CompAb1 항체의 특성분석을 통해 단백질 발현 중에 일부분이 절단됨을 관찰하였다. 절단이 일어나고 있는 지점을 식별하고 절단되는 항체의 양을 결정하기 위해 다음의 분석을 수행하였다.
CompAb1 항체의 샘플을 UV 검출기 및 인라인 Waters Vion IMS QTof 질량 분광계가 구비된 역상 액체 크로마토그래피를 사용하여 온전한 질량 분석에 의해 분석하여 항체 및 이의 변이체의 분자량을 결정하였다. 샘플 주입 전에 99%의 이동상 A(Milli-Q 정제수 중 0.1% 포름산) 및 1%의 이동상 B(아세토니트릴 중 0.1% 포름산)로 평형화된 Waters ACQUITY UPLC BEH300 C4 컬럼(1.7 μm, 2.1 mm × 50 mm) 상에 각각의 항체 샘플을 주입하였다. 컬럼 온도를 80℃로 유지하였다. 0.25 mL/분의 유속으로 Waters ACQUITY UPLC 시스템을 사용하여 단백질을 용리시켰다. 샘플 주입 후, 전체 이동상 구배를 첫 3분 동안은 1% 이동상 B로 유지한 다음, 2분 동안 이동상 B를 1%에서 20%로 선형 증가시키고, 15분 동안 이동상 B를 20%에서 35%로 두 번째로 선형 증가시킨 다음, 5분 동안 이동상 B를 35%에서 70%로 증가시키고, 이어서 마지막으로 2분에 걸쳐 이동상 B를 90%로 증가시켰다. 광다이오드 어레이 검출기를 사용해 215 nm에서 용리된 단백질의 용리 프로파일을 모니터링하고, Waters Vion IMS QTof 질량 분광계를 사용해 용리된 단백질의 질량을 측정하였다.
이 공정을 사용하여, 전장 GITR 항체 CompAb1의 절단된 변이체를 식별하였다. 항체의 절단된 형태는 UV 크로마토그램에서 전장 항체보다 일찍 용리되었다. 절단된 형태의 질량은 CompAb1 중쇄의 CDR3 영역에서 잔기 N101과 P102 사이를 절단한 것에 상응하였다. 절단된 형태의 풍부도는 다수의 CompAb1 로트에 대한 UV 크로마토그램 피크 면적을 기준으로 총 항체의 약 5%인 것으로 추정되었다. 이들 절단의 위치를 환원된 펩티드 맵핑 분석에 의해 검증하고(여기서 CompAb1은 트립신을 사용하여 리신 또는 아르기닌으로 끝나는 펩티드로 분해됨), 역상 LC 분리에 이어서 Q Exactive 질량 분광계를 이용해 질량 분광분석에 의해 분석하였다. 전장 항체에 대응하는 트립신 분해 펩티드를 비롯하여, CDR3에서의 절단 부위에 상응하고 N101 및 P102에서 끝나는 더 짧은 펩티드를 이들의 정확한 질량 및 단편화 스펙트럼에 기초하여 식별하였다.
시험관 내 및 생체 내에서, 시간 경과에 따라 CompAb1의 절단 수준은 혈청에서 증가한다:
시험관 내 생리학적 조건 하에서 CompAb1의 안정성을 연구하기 위해, CompAb1을 37℃의 인산염 완충 식염수(PBS) 및 원숭이 혈청 중에서 최대 28일 동안 인큐베이션하였다. 또한, 생체 내에서 CompAb1의 안정성을 연구하기 위해 마우스에게 10 mg/kg의 CompAb1을 투여하고, 1일차 및 8일차에 혈청을 채취하였다.
항-인간 Fc 항체로 코팅된 자성 비드를 사용하여 CompAb1을 혈청 샘플로부터 정제하였다. 정제된 CompAb1을 산성 조건 하에 비드로부터 용리한 다음, 전장 항체를 리신에서 종결되는 펩티드로 절단하는 효소 Lys-C를 사용해 분해하였다. 역상 LC 구배를 사용하여 샘플을 분리하고 Q Exactive HF 질량 분광기로 분석하였다. 전장 항체에 상응하는 Lys-C로 생성된 펩티드 및 N101/P102에서 절단된 항체를 이들의 정확한 질량 및 단편화 스펙트럼을 기준으로 모든 샘플에서 식별하였다. 온전한 항체와 절단된 항체의 질량에 상응하는 추출된 이온 크로마토그램 피크 면적을 사용하여 각 샘플에서 절단 백분율을 계산하였다.
결과는, PBS에서의 인큐베이션이 28일에 걸쳐 CompAb1 절단을 10.3%에서 24.5%로 증가시켰고, 원숭이 혈청에서의 인큐베이션이 28일에 걸쳐 동일한 CompAb1 절단을 7.4%에서 48.7%로 증가시켰음을 보여주었다(도 1). 투여된 마우스의 혈청 중 CompAb1의 절단 수준은 7.7%의 시작 수준에서 8일 후 54%로 증가하였다(도 2).
실시예 3. GITR에 대한 결합을 유지하는 항-GITR 항체 CompAb1의 중쇄 변이체의 생성
항-GITR의 기능을 유지하면서 CDR3의 아미노산 101NP102 또는 102PS103에서의 절단을 방지하는 CompAb1 중쇄(HC)의 변이체를 식별하기 위해 스크리닝을 수행하였다. CompAb1 중쇄(HC) 가변 도메인의 변이체를 나타내는 이중 가닥 DNA 단편(gBlock Gene Fragments)을 IDT에게 주문하여 합성한 다음, 인간 IgG1 중쇄 불변 영역을 함유하는 발현 벡터 내로 클로닝하였다. CompAb1 HC의 N101 또는 S103을 시스테인을 제외한 모든 아미노산으로 치환함으로써 총 36개의 변이체를 생성하였다. 표 4 참조.
CHO 세포에서 각 HC 변이체 및 CompAb1 경쇄(1-39 생식선 범용 경쇄)를 일시적으로 발현시킨 후 항체를 생산하였다.
CompAb1 중쇄 변이체
샘플 번호 HC
변이체 		경쇄
(1~39 생식선 ULC)
1 야생형 야생형
2 N101A 야생형
3 N101D 야생형
4 N101E 야생형
5 N101F 야생형
6 N101G 야생형
7 N101H 야생형
8 N101I 야생형
9 N101K 야생형
10 N101L 야생형
11 N101M 야생형
12 N101P 야생형
13 N101Q 야생형
14 N101R 야생형
15 N101S 야생형
16 N101T 야생형
17 N101V 야생형
18 N101W 야생형
19 N101Y 야생형
20 S103A 야생형
21 S103D 야생형
22 S103E 야생형
23 S103F 야생형
24 S103G 야생형
25 S103H 야생형
26 S103I 야생형
27 S103K 야생형
28 S103L 야생형
29 S103M 야생형
30 S103N 야생형
31 S103P 야생형
32 S103Q 야생형
33 S103R 야생형
34 S103T 야생형
35 S103V 야생형
36 S103W 야생형
37 S103Y 야생형
항체 함유 상청액을 수집하고, GITR 결합을 측정하기 위해 Biacore에게 스크리닝을 의뢰하였다.
인간 항-GITR 항체의 결합 친화도 및 동역학 상수를 표면 플라스몬 공명으로 결정하였다.
컨디셔닝된 배양 배지에서 분비된 항체에 대한 Biacore 실험을 다음과 같이 수행하였다. 25℃에서 Biacore 2000 기기를 사용하여, CM5 항-인간Fc 결합 표면 상에 8 uL/분의 유속으로 80초 동안 항체를 포획하였다. 약 1000 내지 2000 RU의 각 항체를 포획하였다. 100nM hGITR.mmH(가용성 단량체 hGITR, 서열번호 45) 또는 50nM hGITR.mFc(이량체 필리핀 원숭이 GITR, 서열번호 46)를 2분 동안 50uL/분의 유속으로 이 표면에 주입하였다. 해리를 2분 동안 측정하였다. 이중 기준 센서그램을 1:1 결합 모델에 피팅하여 KD 및 t1/2을 계산하였다.
Biacore 결합 친화도: CHOt 상청액
샘플 번호 HC
변이체 		hGITR.mmH hGITR.mFc
K D (M) t 1/2 (분) K D (M) t 1/2 (분)
1 야생형 2.49E-08 4.56 2.01E-10 194.05
2 N101A NB NB 4.24E-08 0.47
3 N101D 1.48E-08 7.52 8.13E-11 344.98
4 N101E 1.09E-07 0.99 1.27E-09 34.90
5 N101F NB NB NB NB
6 N101G IC IC IC IC
7 N101H NB NB NB NB
8 N101I 3.29E-07 1.32 2.75E-08 0.72
9 N101K 1.70E-08 4.91 2.69E-08 0.99
10 N101L NB NB 5.75E-08 0.45
11 N101M 1.52E-07 1.93 2.40E-08 0.82
12 N101P NB NB NB NB
13 N101Q 3.41E-09 16.70 9.98E-09 3.86
14 N101R IC IC 2.94E-08 0.86
15 N101S 8.19E-08 0.92 9.08E-10 37.73
16 N101T 6.13E-08 1.52 2.84E-10 109.58
17 N101V 2.91E-08 3.46 2.39E-08 0.98
18 N101W NB NB NB NB
19 N101Y NB NB NB NB
20 S103A 1.08E-07 0.83 5.29E-10 50.28
21 S103D 7.71E-08 1.01 5.95E-10 65.00
22 S103E 1.19E-07 0.76 7.42E-10 42.43
23 S103F 7.35E-09 13.61 2.33E-09 12.84
24 S103G IC IC 5.56E-09 7.40
25 S103H 1.26E-08 16.45 6.68E-09 4.63
26 S103I 1.01E-08 11.49 6.51E-09 4.41
27 S103K NB NB 4.75E-08 0.64
28 S103L 8.52E-08 4.59 1.59E-08 1.66
29 S103M 4.62E-09 15.21 1.04E-09 27.30
30 S103N 1.19E-07 0.95 1.01E-09 41.43
31 S103P 2.84E-08 11.18 7.79E-09 2.92
32 S103Q 9.68E-08 0.92 2.55E-10 123.85
33 S103R NB NB 4.56E-08 0.75
34 S103T 2.96E-08 3.88 1.27E-10 248.92
35 S103V 7.39E-09 14.70 3.82E-09 7.80
36 S103W 1.16E-07 0.94 1.61E-09 27.03
37 S103Y 4.39E-09 26.65 3.03E-09 10.41
NB= 사용된 조건 하에서 결합이 관찰되지 않음
IC: 비확정적 데이터
CHOt 상청액의 Biacore 결과는 적어도 4개의 HC 변이체(N101D, N101E, N101S, 및 N101T)가 CompAb1과 비교하여 단량체(hGITR.mmh) 및 이량체(hGITR.mFc) GITR에 대한 유사한 결합을 유지하였음을 시사했다. 표 5 참조.
특히, 많은 변이체는 부모 항체에 의한 GITR 결합에 비해 GITR 결합을 상실하였다. 추가의 특성 분석을 위해, CompAb1과 비교했을 때 GITR에 대한 유사한 결합을 유지한 N101 변이체 후보 중 4개를 선택하였다. 이들 변이체를 CHO 안정(CHO) 세포주에서 생산하고, 후속하여 정제하였다.
정제된 항체의 경우, 다음과 같이 Biacore 실험을 수행하였다. Biacore T-200 기기를 사용하여, CM5 항-인간Fc 결합 표면 상에서 8 uL/분의 유속으로 30초 동안 항체를 포획하였다. 약 120 RU의 각 항체를 포획하였다. 10nM hGITR.mmH(가용성 단량체 hGITR, 서열번호 45) 또는 5nM hGITR.mFc(이량체 필리핀 원숭이 GITR, 서열번호 46)를 5분 동안 50uL/분의 유속으로 이 표면에 주입하였다. 해리를 10분 동안 측정하였다. 이중 기준 센서그램을 1:1 결합 모델에 피팅하여 KD 및 t1/2을 계산하였다.
CompAb1과 비교하여 단량체(hGITR.mmh) 및 이량체(hGITR.mFc) GITR에 대한 4개의 정제된 N101 변이체의 KD 및 t1/2을 표 6에 나타냈다.
CHO 세포에 의해 생산된 변이체의 Biacore 결합 친화도
hGITR.mmH hGITR.mFc
항-GITR mAb Ref # KD (M) t1/2 (분) KD (M) t1/2 (분)
CompAb1 CompAb1 1.51E-09 6.75 1.37E-10 35.57
N101D 변이체 mAb1 1.18E-09 7.58 1.04E-10 71.74
N101E 변이체 mAb2 1.13E-08 2.80 9.02E-10 9.55
N101S 변이체 mAb3 6.05E-09 4.65 8.82E-10 5.56
N101T 변이체 mAb4 8.00E-09 2.25 6.63E-10 10.03
실시예 4. 중쇄 및 경쇄 가변 영역 아미노산 및 핵산 서열
표 7은 CompAb1 항체의 항-GITR 항체 변이체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 및 CDR의 아미노산 서열 식별자를 제시한다. 상응하는 핵산 서열 식별자는 표 8에 제시되어 있다.
아미노산 서열 식별자
서열번호
항체 명칭 HCVR HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCVR LCDR1 LCDR2 LCDR3
mAb1 22 4 6 24 10 12 14 16
mAb2 28 4 6 30 10 12 14 16
mAb3 34 4 6 36 10 12 14 16
mAb4 40 4 6 42 10 12 14 16
핵산 서열 식별자
서열번호
항체 명칭 HCVR HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCVR LCDR1 LCDR2 LCDR3
mAb1 21 3 5 23 9 11 13 15
mAb2 27 3 5 29 9 11 13 15
mAb3 33 3 5 35 9 11 13 15
mAb4 39 3 5 41 9 11 13 15
당업자가 이해할 수 있듯이, 특정 Fc 이소형을 갖는 항체는 다른 Fc 이소형을 갖는 항체로 변환될 수 있지만, 어떤 경우에도, 표 7 및 8에 나타낸 수치 식별자에 의해 표시되는 가변 도메인(CDR 포함)은 동일하게 유지될 것이고, 결합 특성은 Fc 도메인의 성질에 상관 없이 동일하거나 실질적으로 유사할 것으로 예상된다.
표 9는 선택된 항-GITR 항체에 대한 예시적인 전장 중쇄(HC) 및 경쇄(LC) 핵산 및 아미노산 서열 식별자를 제공한다.
예시적인 항-GITR 항체의 전장 중쇄 및 경쇄 서열에 대한 서열 식별자
서열번호
항체 명칭 전장 중쇄 전장 경쇄
핵산 아미노산 핵산 아미노산
mAb1 25 26 19 20
mAb2 31 32 19 20
mAb3 37 38 19 20
mAb4 43 44 19 20
실시예 5. 항-GITR 항체 CompAb1의 변이체에서 절단의 평가 및 정량화
전술한 바와 같이, 전장 항-GITR 항체 CompAb1의 절단된 변이체를 식별하였다. 절단된 형태의 질량은 CompAb1 중쇄의 CDR3 영역에서 잔기 N101과 P102 사이를 절단한 것에 상응하였다. CompAb1의 N101/P102 절단 부위의 N101 위치에서 단일 아미노산 치환을 갖는 새로운 항체 변이체를 후속하여 생성하였다. 이들 새로운 항체 변이체를 분석하여 이들의 동일성을 확인하고, 새로운 변이체가 절단을 나타내는지 여부를 결정하였다.
변성 SEC(낮은 온도와 중간 정도의 pH에서 실행됨)를 사용하여 변이체 절단을 분석하였다. CompAb1 및 mAb1을 1 mg/mL로 희석하고, 5 μg의 각 샘플을 Waters ACQUITY UPLC BEH200 SEC 컬럼(1.7 μm, 4.6 mm x 300 mm) 상에 주입하였다. 샘플 주입 전에, 컬럼을 100%의 이동상 A(Milli-Q 정제수 중 30% 아세토니트릴, 0.1% 포름산, 0.1% 트리플루오로아세트산)로 평형화시켰다. 컬럼 온도는 기록되지 않았다. Waters ACQUITY UPLC 시스템을 100% 이동상 A로 사용해 0.10 mL/분의 유속으로 5분에 걸쳐 단백질을 등용매 방식으로 용리하였다.
컬럼 가열 없이 SEC-MS를 변성시켜 온전한 항체를 분석한 결과, mAb1 및 mAb2에서 절단이 나타나지 않았다(표 10). 이들 결과는 변이체를 환원 펩티드 맵핑 및 LC-MS에 의해 분석할 때 확인하였다(데이터 미도시).
CompAb1 및 N 101 변이체에서 측정된 절단 백분율.
샘플 명칭 변이체 SEC-MS에 의한 절단 백분율(%)
CompAb1 N/A 3.7
mAb1 N101D 0
mAb2 N101E 0
mAb3 N101S NA
mAb4 N101T NA
NA: 분석되지 않음
실시예 6: 혈청 안정성 분석에서 CompAb1의 N101D 및 N101E 변이체에서는 절단이 관찰되지 않음
CompAb1, 및 Biacore를 통한 인간 GITR 단백질에 대한 결합의 측면에서 원래 후보 물질과 가장 유사했던 변이체 후보물질인 mAb1(N101D) 및 mAb2(N101E)(이전 실시예 참조)를 37℃에서 IgG가 고갈된 인간 혈청 및 마우스 혈청 및 HEPES 완충액에서 인큐베이션하여 생리학적 조건 하에서 이들의 안정성을 시험하였다. 또한, CompAb1, mAb1, 및 mAb2를 마우스에게 투여하고(10 mg/kg), 4시간, 1, 2, 4, 및 8일 후에 혈청을 채취하였다. 항체를 항-Fc 풀다운에 의해 친화도 정제하고, Lys-C를 사용해 분해하였다. Lys-C 분해 및 LC-MS 방법은 항체 변성을 위해 낮은 온도만을 사용하였고, N101D 변이체의 인공 절단을 방지하기 위해 낮은 컬럼 온도만을 사용하였다. 절단 수준은 혈청 인큐베이션 후 CompAb1 분자에서 증가하였지만, mAb1 또는 mAb2의 경우 시간 과정 전반에 걸쳐 절단이 검출되지 않았다(도 3 및 도 4). 유사하게, CompAb1을 투여한 마우스에서 절단이 다양한 수준으로 검출되었지만, 변이체 mAb1 또는 mAb2에서는 검출되지 않았다. 표 11 참조.
mAb1 및 mAb2의 시험관 내 및 생체 내 안정성
항체 안정성 CompAb1 mAb1 (N101D) mAb2 (N101E)
검정 절단율 (%) 절단율 (%) 절단율 (%)
시험관 내 혈청 인큐베이션 인간 N-말단 단편:
(T=0): 5.2%; (T=14): 15.0%
비율: 0.7%/일
C-말단 단편:
(T=0): 16.7%; (T=14): 45.0%
비율: 1.9%/일 		검출되지 않음 검출되지 않음
마우스 N-말단 단편:
(T=0): 5.0%; (T=16): 33.0%
비율: 1.8%/일
C-말단 단편:
(T=0): 22.0%; (T=16): 50%
비율: 1.7%/일 		검출되지 않음 검출되지 않음
생체 내 안정성 마우스 다양한 수준의 절단이 관찰됨 검출되지 않음 검출되지 않음
실시예 7: 세포 표면 GITR에 대한 항-GITR 항체 결합
유세포 분석을 사용하여 저캇/hCD20/hGITR 세포 및 저캇/hCD20/MfGITR 세포에 대한 mAb1 결합을 평가하였다. 저캇/hCD20 세포를 GITR 결합에 대한 음성 대조군 세포주로서 사용하였다. 세포를 96-웰 V-바닥 플레이트에 첨가하고(2x105 내지 4x105 세포/웰) Fc 차단 용액에서 인큐베이션한 후, 18 pM 내지 300 nM 범위의 최종 농도의 일차 항체(mAb1 또는 IgG1 이소형 대조군) 및 5 μg/mL의 이차 항체(AF647-접합된 항-인간 IgG)와 함께 얼음 상에서 연속 배양하였다. 그런 다음, 제조사의 지침에 따라 Live/Dead Fixable Green Dead Cell 염색으로 세포를 염색하였다. 세포를 BD Cytofix로 고정시키고, AcroPrep Advance 필터 플레이트를 통해 여과한 후, Intellicyt iQue Screener PLUS 유세포 분석기를 이용해 수득하였다. FlowJo 소프트웨어로 데이터를 분석하였다. EC50 (50% 활성 시의 유효 농도) 결정을 위해, 측정된 기하 MFI 값을 GraphPad Prism을 이용해 9-점 반응 곡선에 대한 4-파라미터 로지스틱 방정식을 사용하여 분석하였다. 배수 결합은 곡선 상의 최고 MFI 대 2차 항체만을 함유하는 웰의 MFI의 비율을 취해 결정하였다.
mAb1은 hGITR 또는 MfGITR 세포를 발현하도록 조작된 저캇/hCD20 세포에 대해 나노몰 범위의 EC50 값에서 농도 의존적 결합을 나타냈고; 저캇/hCD20 세포에 대한 결합은 검출되지 않았다(도 5). IgG1 이소형 대조군은 시험된 3개의 세포주 중 어느 것에 대해서도 결합을 나타내지 않았다. mAb1 및 IgG1 이소형 대조군에 대한 EC50 값(해당되는 경우), 최대 MFI(시험된 투여량 범위 내의 최고 평균 MFI), 및 배경을 초과하는 최대 MFI로서 계산된 배수 결합(이차 항체 단독)을 보고하였다. 결과를 표 12에 요약하였다.
인간 또는 시노몰구스 원숭이 GITR을 발현하도록 조작된 저캇 T 세포에 결합하는 항체
항체 저캇/hCD20 저캇/hCD20/hGITR 저캇/hCD20/MfGITR
최대 MFI a 결합배수 b EC 50 (M) 최대 MFI a 결합 배수 b EC 50 (M) 최대 MFI a 결합 배수 b EC 50 (M)
mAb1 980 1.06 ND 289003 290 1.96E-09 342865 277 3.52E-09
IgG1 이소형 대조군 1071 1.15 ND 1090 1.09 ND 1361 1.10 ND
a 최대 MFI는 시험된 농도 범위(18 pM 내지 300 nM) 내에서 가장 높은 평균 MFI 값이었다.
b 배수 결합은 배경을 초과하는 최대 MFI로서 계산하였다(2차 항체 단독).
h, 인간; Mf, Macaca fascicularis(시노몰구스 원숭이); ND, 농도 의존적 결합이 관찰되지 않았으므로 결정되지 않음
요약하면, mAb1은 유사한 효능(EC50) 및 배수 최대 결합으로 인간 또는 원숭이 GITR을 발현하는 저캇/hCD20 표적 세포에 대한 농도 의존적 결합을 나타냈다.
실시예 8: 활성화된 인간 및 시노몰구스 원숭이 일차 T 세포에 대한 항-GITR 항체 결합
본 실험에서, 항-CD3/항-CD28-자극된 인간 및 시노몰구스 원숭이 일차 T 세포에 대한 mAb1 결합을 평가하였다. CD25 및 CD69를 인간 및 시노몰구스 원숭이 일차 T 세포 활성화에 대한 대리 마커로서 각각 사용하였다.
말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 SepMate 튜브(인간 PBMC의 경우) 또는 50 mL 원뿔형 튜브(시노몰구스 원숭이 PBMC의 경우)에서 Ficoll-Paque PLUS를 통한 밀도 원심분리를 사용해 인간 또는 시노몰구스 원숭이 전혈(각각 4명(마리)의 공여자)로부터 단리하고, 적혈구(RBC) 용해 완충액에서 인큐베이션하기 위해 새로운 원뿔형 튜브로 옮겼다. 그런 다음, PBMC를 세척하고, 인간 또는 비인간 영장류용 T 세포 활성화/증식 키트를 사용한 T 세포 활성화 및 증식을 위해 TT75 배양 플라스크로 옮겼다. 4일 후, MACSiMAG 분리기를 사용해 활성화 비드를 배양물로부터 제거하고, 세포를 수집하여 계수하였다.
유세포 계측을 사용해, 활성화된 PBMC에서 인간 또는 시노몰구스 원숭이 T 세포에 대한 mAb1 결합을 평가하였다. 세포를 96-웰 V-바닥 플레이트에 첨가하고(3x105 세포/웰) Fc 차단/단핵구 차단 용액에서 인큐베이션한 다음, 형광단-접합된 항체(항-CD3, 항-CD4, 항-CD8, 및 항-CD25[인간 T 세포에 대한 활성화 마커] 또는 항-CD69[시노몰구스 원숭이 T 세포에 대한 활성화 마커]), AF647-접합된 mAb1, 또는 AF647-접합된 IgG1 이소형 대조군(8 pM 내지 200 nM 범위의 최종 농도)과 함께 얼음 상에서 인큐베이션하고, (제조업체의 지침에 따라) Live/Dead Fixable Blue Dead Cell 염색을 수행하였다. 세포를 BD 안정화 고정액으로 고정시키고, AcroPrep Advance 필터 플레이트를 통해 여과한 후, BD LSRFortessa X-20 유세포 계측기를 이용해 수득하였다. FlowJo 소프트웨어로 데이터를 분석하였다. EC50 결정을 위해, 측정된 기하 MFI 값을 GraphPad Prism을 이용해 12-점 반응 곡선에 대한 4-파라미터 로지스틱 방정식을 사용하여 분석하였다.
mAb1은 활성화된 인간 및 시노몰구스 원숭이 일차 T 세포에 대한 농도 의존적 결합을 나타냈다. mAb1은 활성화되지 않은 인간 및 시노몰구스 원숭이 일차 T 세포에 대해, IgG1 이소형 대조군과 유사하게 최소 결합을 나타냈다(도 6 및 도 7). mAb1 및 IgG1 이소형 대조군 결합에 대한 최대 MFI 값(시험된 최고 농도인 200 nM에서 검출됨)은 표 13 및 14에 요약되어 있다.
활성화된(CD25+) 인간 일차 T 세포 및 비활성화된(CD25-) 인간 일차 T 세포에 결합하는 항-GITR 항체
인간 일차 T 세포 하위집합 공여자 최대 MFI a
mAb1 IgG1 이소형 대조군
CD4 + CD25 + 7900C 11113 2283
8700C 13815 1921
26001 4537 1227
2700 * 4694 2085
CD4 + CD25 - 7900C 2324 1331
8700C 2085 1056
26001 1367 827
2700 * 1331 1406
CD8 + CD25 + 7900C 9180 2086
8700C 18177 1971
26001 7308 1102
2700 * 6183 1991
CD8 + CD25 - 7900C 1375 1139
8700C 3243 1778
26001 1082 644
2700 * 835 1126
a 최대 MFI는 200 nM의 비포화 농도(시험한 최고 농도)에서 결정하였다.
활성화된(CD69 + ) 시노몰구스 원숭이 일차 T 세포 및 비활성화된(CD69 - ) 시노몰구스 원숭이 일차 T 세포에 대한 결합
시노몰구스 원숭이 일차 T 세포 하위집합 공여자 최대 MFI a
mAb1 IgG1 이소형 대조군
CD4 + CD69 + 58945 4454 1112
58946 3496 803
58947 2624 1229
58948 3856 1027
CD4 + CD69 - 58945 818 730
58946 798 650
58947 803 825
58948 987 817
CD8 + CD69 + 58945 2909 1093
58946 1909 650
58947 1185 921
58948 2250 1128
CD8 + CD69 - 58945 479 565
58946 584 455
58947 458 601
58948 558 512
a 최대 MFI는 200 nM의 비포화 농도(시험한 최고 농도)에서 결정하였다.
실시예 9. 조작된 저캇 T 세포에서 FcγR3a를 통한 NFAT 활성화
인간 또는 시노몰구스 원숭이 FcγR3a(ADCC를 매개하고 주로 NK 세포에서 발현되는 Fc 수용체)를 통해, 활성화된 T 세포의 핵 인자(NFAT) 활성화를 매개하는 mAb1의 능력을 평가하기 위해 ADCC 리포터 생물검정(Parekh 등의 문헌[mAbs, 4(3): 310-318, 2012])을 개발하였다. 저캇/NFAT-Luc/hFcγR3a 또는 저캇/NFAT-Luc/MfFcγR3a 효과기 세포 및 저캇/hCD20/hGITR 또는 저캇/hCD20/MfGITR 표적 세포를 이들 검정에 사용하였다. 저캇/hCD20 세포를 대조군 표적 세포로서 평가하였다.
mAb1 또는 IgG1 이소형 대조군(916 fM 내지 60 nM 범위의 최종 농도) 또는 항-CD20 IgG1(45.8 fM 내지 3 nM 범위의 최종 농도)을 저캇 완전 배지(10% 소태아 혈정(FBS), 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 및 292 μg/mL L-글루타민으로 보충된 RPMI)에서 표적 세포(5x104 세포/웰)가 존재하는 가운데 효과기 세포(2.5x104 세포/웰)와 함께 2회 인큐베이션하였다. 항체가 포함되지 않은 웰을 배경 신호전달을 위한 대조군으로서 포함시켰다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 5시간동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 플레이트를 10분 동안 실온으로 평형화시킨 다음, 웰에 One-Glo 루시페라아제 기질을 3분 동안 첨가하였다. 루시페라아제 활성을 발광 신호로서 포착하고, ENVISION 플레이트 판독기를 사용하여 상대 광 단위(RLU)로서 표현하였다. EC50 결정을 위해, RLU 값은 GraphPad Prism을 이용해 9-점 반응 곡선에 대한 4-파라미터 로지스틱 방정식을 사용하여 분석하였다. 활성의 배수 변화는 곡선 상의 최고 RLU 대 항체가 포함되지 않은 웰의 RLU의 비율을 취해 결정하였다.
결과는 표 15에 요약되어 있다. mAb1은 저캇/hCD20/hGITR 또는 저캇/hCD20/MfGITR이 존재하는 가운데, 저캇/NFAT-Luc/hFcγR3a 및 저캇/NFAT-Luc/MfFcγR3a에서 각각 1나노 몰 미만의 EC50 값으로 NFAT 신호 전달의 농도 의존적 증가를 매개하였다(도 8). 양성 검정 대조군인 항-CD20 IgG1은, 저캇/hCD20 및 저캇/hCD20/hGITR 또는 저캇/hCD20/MfGITR 중 하나가 존재하는 가운데, 저캇/NFAT-Luc/hFcγR3a 및 저캇/NFAT-Luc/MfFcγR3a에서 각각 1나노 몰 미만의 EC50 값으로 NFAT 신호전달의 농도 의존적 증가를 매개하였다. 표적 세포가 없는 상태에서 (즉, 효과기 세포 이외에 다른 세포가 없는 배지에서) mAb1 또는 항-CD20 IgG1의 경우, 또는 시험된 임의의 조건에서 IgG1 이소형 대조군의 경우 베이스라인 NFAT 활성화의 증가는 관찰되지 않았다.
저캇/NFAT-Luc/hFcγR3a 효과기 세포 및 저캇/NFAT-Luc/MfFcγR3a 효과기 세포에서 mAb1-매개 NFAT 활성화의 요약
저캇/NFAT-Luc/hFcγR3a 효과기 세포
항체 + 저캇/hCD20 표적 세포 + 저캇/hCD20/hGITR 표적 세포
최대 RLU a 활성 변화 배수 b EC 50 (M) 최대 RLU a 활성 변화 배수 b EC 50 (M)
mAb1 1.16E+04 1.01 ND 4.30E+05 38.0 3.20E-11
IgG1 이소형 대조군 1.25E+04 1.12 ND 1.21E+04 1.14 ND
항-CD20 IgG1 3.27E+05 28.1 2.10E-12 5.14E+05 47.0 2.01E-12
저캇/NFAT-Luc/MfFcγR3a
항체 + 저캇/hCD20 표적 세포 + 저캇/hCD20/MfGITR 표적 세포
최대 RLU a 활성 변화 배수 b EC 50 (M) 최대 RLU a 활성 변화 배수 b EC 50 (M)
mAb1 1.25E+04 1.02 ND 2.67E+05 23.9 1.60E-11
IgG1 이소형 대조군 1.31E+04 1.05 ND 1.20E+04 1.09 ND
항-CD20 IgG1 2.83E+05 22.1 9.95E-13 3.15E+05 28.6 1.58E-12
a 최대 RLU는 시험된 농도 범위(mAb1 및 이소형 대조군의 경우 916 fM 내지 60 nM; 항-CD20 IgG1의 경우 45.8 fM 내지 3 nM) 내의 최고 평균 RLU 값으로서 결정하였다.
b 활성의 배수 변화는 배경(항체 없음)을 초과하는 최대 RLU로서 계산하였다.
h, 인간; Mf, Macaca fascicularis(시노몰구스 원숭이); ND, 농도 의존적 루시페라아제 활성이 관찰되지 않았으므로 결정되지 않음
실시예 10: 인간 또는 시노몰구스 원숭이 GITR을 발현하도록 조작된 저캇 T 세포에 대한 ADCC의 항-GITR 항체 매개
인간 또는 시노몰구스 원숭이 GITR을 발현하는 T 세포에 대한 ADCC를 유도하는 mAb1의 능력을 평가하기 위해 ADCC 검정을 수행하였다. 제1 실험에서, 표적 세포는 저캇/hCD20/hGITR 세포 또는 저캇/hCD20/MfGITR 세포를 포함하였고; 저캇/hCD20 세포를 대조군 표적 세포주로서 포함시켰다. 제2 실험에서, 표적 세포는 (동일한 3명의 공여자 유래의) 인간 PBMC에서 자극된/증식된 Treg(조절된 T 세포) 및 CD8+ T 세포를 포함하였다. (조작된 저캇 T 세포를 이용한 검정을 위한 2명의 공여자, 및 일차 T 세포를 이용한 검정을 위한 2명의 공여자 유래의) 백혈구가 풍부한 전혈로부터 단리한 인간 NK 세포를 ADCC 검정에서 효과기 세포로서 사용하였다. IgG1 이소형 대조군을 mAb1과 병렬로 평가하였다. NK 세포가 존재하는 가운데, 조작된 저캇 T 세포 및 인간 일차 T 세포에 대한 ADCC를 유도하기 위한 양성 대조군으로서 항-CD20 IgG1 또는 항-GITR IgG1을 사용하였다.
mAb1은 인간 일차 NK 세포(효과기 세포)가 존재하는 가운데, 저캇/hCD20/hGITR 및 저캇/hCD20/MfGITR(표적 세포)에 대한 농도 의존적 ADCC를 매개하였고; 세포독성에 대한 EC50 값은 1나노 몰 미만의 범위였다. 대조적으로, IgG1 이소형 대조군은 9.5 fM 내지 10 nM 범위의 농도에서 표적 세포주 중 어느 것에 대해서도 ADCC를 매개하지 않았다. 항체 처리 없이 NK 세포를 첨가한 결과, 표적 세포주에 대한 비특이적 세포독성의 백분율이 낮았다.
양성 대조군 항-CD20 IgG1을 사용하여, 동일한 표적 세포주에 대한 ADCC를 유도하는 능력에 대해 NK 세포를 평가하였다. 항-CD20 IgG1은 저캇/hCD20, 저캇/hCD20/hGITR, 및 저캇/hCD20/MfGITR 표적 세포에 대한 ADCC를 농도 의존적 방식으로 매개하였으며, 세포독성에 대한 EC50 값은 1나노 몰 미만이었다. 2명의 인간 NK 공여자에 대한 대표적인 데이터는 도 9에 도시되어 있고 표 16에 요약되어 있다.
조작된 저캇 T 세포에 대한 항체-매개 ADCC
항체 저캇/hCD20 저캇/hCD20/hGITR 저캇/hCD20/MfGITR
공여자 6700R NK Cells 공여자 6500V NK Cells 공여자 6700R NK Cells 공여자 6500V NK Cells 공여자 6700R NK Cells 공여자 6500V NK Cells
최대 세포독성 (%) a EC 50 (M) 최대 세포독성 (%) a EC 50 (M) 최대 세포독성 (%) a EC 50 (M) 최대 세포독성 (%) a EC 50 (M) 최대 세포독성 (%) a EC 50 (M) 최대 세포독성 (%) a EC 50 (M)
mAb1 9 ND 5 ND 27 1.30E-11 30 1.22E-11 26 1.21E-11 34 1.08E-11
IgG1 이소형 대조군 9 ND 9 ND 8 ND 7 ND 3 ND 6 ND
항-CD20 IgG1 28 2.49E-11 37 2.58E-11 35 5.30E-11 43 3.81E-11 34 5.18E-11 36 3.12E-11
a 최대 세포독성(%)은 시험된 농도 범위(9.5 fM 내지 10 nM) 내의 최고 평균 세포독성 백분율 값으로서 결정하였다. h, 인간; Mf, Macaca fascicularis(시노몰구스 원숭이); ND, 농도 의존적 세포독성이 관찰되지 않았기 때문에 결정되지 않음
실시예 11: 인간 일차 T 세포에 대한 ADCC의 항-GITR 항체 매개
PBMC를, 제조사의 권장 프로토콜에 따라, Ficoll-Paque PLUS 밀도 구배 배지 및 SepMate 튜브를 사용하여 밀도 원심분리를 통해 인간 전혈(3명의 공여자)로부터 단리하였다. 이어서, 적혈구(RBC) 용해 완충액을 단리된 PBMC에 첨가하여 원치 않는 RBC를 제거하였다. 그런 다음, PBMC를 세척하고, 제조사의 지침에 따라 CD8 마이크로비드를 사용해 CD8+ T 세포를 단리하였다. 나머지 CD8 음성 세포는 펠릿화하고, 제조사의 프로토콜에 따라 CD4+ CD25+ 조절 T 세포 단리 키트를 사용해 CD4+ CD25+ T 세포를 단리하였다.
CD8+ 및 CD4+/CD25+ T 세포(즉, Treg)의 단리는 유세포 계측법을 사용하여 확인하였다. 제조사의 지침에 따라(비드 1: 세포 1) CD3/CD28 다이나비드(Dynabead)를 사용하여, CD8+ T 세포를 IL-2가 보충된 배지와 함께 증식을 위해 T75 플라스크 내에 시딩하였다. 제조사의 지침에 따라(비드 4: 세포 1) CD3/CD28 MACSiBead 입자를 사용하여, Treg를 IL-2와 라파마이신이 보충된 배지와 함께 증식을 위해 T75 플라스크 내에 시딩하였다. 5일의 배양 후 비드를 제거하고, ADCC 분석에 사용하기 전에 IL-2 또는 라파마이신이 없는 배지에서 세포를 24시간 동안 휴지시켰다.
세포독성 검정 전에, 실시예 8에 기술된 것과 같이 CD8+ T 세포 및 Treg를 염색하고, 포화 조건 하에 세포 표면에 결합된 항체 분자의 수로서 정의된 항체 결합능(ABC)을 유세포 계측법으로 평가하였다. Miltenyi Biotec의 GITR 항체에 대한 ABC는, 제조사의 지침에 따라 Quantum Simply Cellular AF647 MESF(가용성 형광색소 분자) 비드 키트를 사용하여 결정하였다.
표적 세포를 3개의 불투명한 백색 96-웰 평평한 바닥 플레이트에 첨가하고(5x103 세포/웰), 이어서 mAb1, IgG1 이소형 대조군, 또는 항-CD20(조작된 저캇 T 세포의 경우) 또는 항-CD3(인간 일차 T 세포의 경우) IgG1(조작된 저캇 T 세포의 경우 9.5 fM 내지 10 nM의 농도 범위, 인간 일차 T 세포의 경우 169 fM 내지 10 nM의 농도 범위)을 첨가한 다음, 검정 배지(1% 소태아 혈철 알부민(BSA), 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 및 292 μg/mL L-글루타민으로 보충된 RPMI 배지) 중 인간 NK 세포를 첨가하였다(2.5x104 세포/웰). 항체를 제외한 모든 성분을 포함하는 대조군 샘플을 각 실험에 혼입하여 검정(즉, NK 세포가 존재할 때 표적 세포의 비특이적 용해)의 배경 신호를 결정하였다. 자연 용해를 평가하기 위해, 미치료 표적 세포 단독(표적 세포) 및 효과기 세포 단독(효과기 세포)을 별도의 웰에서 인큐베이션하였다.
플레이트를 37℃, 5% CO2에서 3.5시간동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 플레이트를 10분 동안 실온으로 평형화시키고, 이어서 CytoTox Glo 시약을 15분 동안 진탕하면서 웰에 첨가하였다. 발광 신호는 ENVISION 플레이트 판독기를 사용하여 세포독성의 판독으로서 측정하였다.
mAb1은 인간 일차 NK 세포(효과기 세포)가 존재하는 가운데, 시험된 3명의 공여자 중 3명의 인간 일차 T 세포(표적 세포)에 대한 농도 의존적 ADCC를 매개하였고, 세포독성에 대한 EC50 값은 1나노 몰 미만의 범위였다. 6가지 시험 조건 중(효과기 세포 공여자 2 x 표적 세포 공여자 3), mAb1-매개 세포독성은 4가지 조건에서의 CD8+ T 세포와 비교하여 Treg에 대해 유의하게 더 컸다. 도 10 및 표 17 참조.
대조적으로, IgG1 이소형 대조군은 일차 T 세포 공여자 중 어느 것에 대해서도 ADCC를 매개하지 않았다. 항체 처리 없이 NK 세포를 첨가한 결과, 일차 T 세포에 대한 비특이적 세포독성의 백분율이 낮았다.
양성 대조군 항-CD3 IgG1을 사용하여, 동일한 NK 및 T 세포 공여자를 사용한 검정에서 ADCC를 유도하는 능력에 대해서도 NK 세포를 평가하였다. 항-GITR IgG1은 일차 T 세포에 대한 ADCC를 농도 의존적 방식으로 매개하였고, 세포독성에 대한 EC50 값은 1나노 몰 이하였다. 3명의 인간 일차 T 세포 공여자와 함께 시험한 2명의 인간 일차 NK 공여자에 대한 대표적인 데이터는 도 10에 도시되어 있고 표 17에 요약되어 있다.
인간 일차 T 세포에 대한 항체 매개 ADCC
다음의 존재 하에 공여자 04003 NK 세포:
항체 Treg CD8 + T-세포
공여자 5100X
GITR ABC: 57,069 		공여자 0400N
GITR ABC: 58,810 		공여자 0200R
GITR ABC: 57,243 		공여자 5100X
GITR ABC: 38,152 		공여자 0400N
GITR ABC: 12,712 		공여자 0200R
GITR ABC: 21,987
최대 세포독성 (%) a EC 50 (M) 최대 세포독성 (%) a EC 50 (M) 최대 세포독성 (%) a EC 50 (M) 최대 세포독성 (%) a EC 50 (M) 최대 세포독성 (%) a EC 50 (M) 최대 세포독성 (%) a EC 50 (M)
mAb1 b 21 8.88E-11 32 3.72E-11 23 3.99E-11 16 1.28E-10 18 7.64E-11 14 8.41E-11
IgG1 이소형 대조군 0.8 ND 2 ND 0.7 ND 0.5 ND 2 ND 2 ND
항-GITR IgG1 c 25 7.56E-11 29 4.54E-11 20 2.80E-11 27 6.48E-11 30 4.49E-11 26 1.15E-10
다음의 존재 하에 공여자 05001 NK 세포:
항체 Treg CD8 + T-세포
공여자 5100X
GITR ABC: 57,069 		공여자 0400N
GITR ABC: 58,810 		공여자 0200R
GITR ABC: 57,243 		공여자 5100X
GITR ABC: 38,152 		공여자 0400N
GITR ABC: 12,712 		공여자 0200R
GITR ABC: 21,987
최대 세포독성 (%) a EC 50 (M) 최대 세포독성 (%) a EC 50 (M) 최대 세포독성 (%) a EC 50 (M) 최대 세포독성 (%) a EC 50 (M) 최대 세포독성 (%) a EC 50 (M) 최대 세포독성 (%) a EC 50 (M)
mAb1 d 11 8.34E-11 17 4.49E-11 7 6.47E-11 11 9.51E-11 7 1.16E-10 9 1.39E-10
IgG1 이소형 대조군 1 ND 3 ND 0.4 ND 2 ND 0.5 ND 1 ND
항-GITR IgG1 c 11 2.88E-11 12 6.30E-11 8 4.35E-11 16 3.89E-11 13 5.54E-11 12 1.20E-10
a 최대 세포독성(%)은 시험한 농도 범위(169fM 내지 10nM) 내의 최고 평균 세포독성 백분율 값으로 결정하였다.
b mAb1은 공여자 0400N의 CD8+ T 세포와 비교하여 Treg에 대한 ADCC를 유의하게 더 크게 매개하였고(p<0.0001), 공여자 0200R의 Treg와 비교하여 CD8+ T 세포에 대한 ADCC를 유의하게 더 크게 매개하였다(p<0.0001).
c 항-CD3 IgG1은 공여자 5100X 유래의 Treg와 비교하여 CD8+ T 세포에 대한 ADCC를 유의하게 더 크게 매개하였다(p<0.0001).
c mAb1은 모든 3명의 공여자 유래의 CD8+ T 세포와 비교하여 Treg에 대한 ADCC를 유의하게 더 크게 매개하였다(p<0.0001).
각 NK 세포 공여자에 대한 모든 시험 조건에 걸친 ADCC의 통계적 유의성은 투키의 다중 비교 사후 검정(α=0.05)을 이용한 이원 ANOVA에 의해 결정하였다.
ABC, 항체 결합능(세포당 결합된 항체, 유세포 계측에 의해 측정된 형광 강도에 기초하여 계산됨); ND, 농도 의존적 세포독성이 관찰되지 않았기 때문에 결정되지 않음
실시예 12: 인간 또는 시노몰구스 원숭이 GITR을 발현하도록 조작된 저캇 T 세포에 대한 ADCP의 항-GITR 항체 매개
인간 또는 시노몰구스 원숭이 GITR을 발현하는 T 세포의 ADCP를 유도하는 mAb1의 능력을 평가하기 위해 ADCP(항체 의존성 세포 포식작용) 검정을 수행하였다. 표적 세포는 저캇/hCD20/hGITR 세포 또는 저캇/hCD20/MfGITR 세포를 포함하였고; 저캇/hCD20 세포를 대조군 표적 세포주로서 포함시켰다. 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF)의 존재 하에 CD14+ 단핵구로부터 분화된 식세포를 ADCP 검정에서 효과기 세포로서 사용하였다. IgG1 이소형 대조군을 mAb1과 병렬로 평가하였다. 항-CD20 IgG1을, 조작된 저캇 T 세포의 ADCP를 유도하기 위한 양성 대조군으로서 사용하였다.
Lonza로부터 입수한 냉동된 CD14+ 세포를 해동하고, 50 ng/mL GM-CSF로 보충된 세포 배양 배지(10% FBS, 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 및 292 μg/mL L-글루타민, 1% 인간 AB 혈청, NaPyr (피루브산나트륨), HEPES, NEAA(비필수 아미노산), 및 0.01 mM 베타-메르캅토에탄올로 보충된 RPMI)에 재현탁하고, 13일에 걸쳐 식세포로 분화시키기 위해 투명한 바닥의 콜라겐 코팅된 96-웰 흑색 플레이트 내에 5x104 세포/웰로 도말하고, 6일차 및 12일차에 신선한 GM-CSF(50 ng/ml)를 첨가하였다.
ADCP 검정에 앞서, 표지를 위해 표적 세포 및 단핵구-유래 식세포를 각각 CellTrace CFSE(카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르) 염료 또는 CellTrace Far Red 염료와 함께 37℃, 5% CO2에서 15분 동안 인큐베이션하였다.
얼음 상의 검정 배지(10% FBS, 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 및 292 μg/mL L-글루타민이 보충된 RPMI) 중에서 적어도 15분 동안 표적 세포를 96-웰 U-바닥 플레이트에 2회 첨가한 다음(5x105 세포/웰), mAb1, IgG1 이소형 대조군, 또는 항-CD20 IgG1(381 fM 내지 100 nM의 최종 농도 범위)을 첨가하였다. 항체가 없는 표적 세포를 배경 식균작용에 대한 대조군으로서 포함시켰다. 그런 다음, 적정된 항체를 첨가하거나 첨가하지 않은 표적 세포의 혼합물을 접착된 Far Red-표지된 식세포를 함유하는 플레이트로 옮기고, 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 1 내지 2시간 동안 인큐베이션하였다.
인큐베이션 후, 미부착 세포를 함유하는 배지를 웰로부터 제거하고, 웰을 PBS로 헹구었다. PBS 중 3.7% 포름알데히드의 용액을 웰에 첨가하여 세포를 20분 동안 고정시켰다. 웰을 PBS로 세척하고, 분석 시까지 플레이트를 4℃에서 보관하였다.
Opera Phoenix 고함량 스크리닝 시스템을 이용해 Harmony 소프트웨어를 사용해 식균작용을 형광 이미징에 의해 분석하여 488 nm(CFSE 표지된 표적 세포) 및 647 nm(Far Red 표지된 식세포) 방출 채널 둘 다에서 이미지를 획득하였다. Columbus 소프트웨어에서 이미지 분석을 수행하였고, 647 nm 방출 채널에서 이미지 분할을 수행하여 식세포 모집단을 선택하고 각 식세포 내부에서 (CFS 표지된 표적 세포의) 488 nm 형광 강도를 상대 형광 단위(RFU)로서 계산하여 식균작용을 정량화하였다. EC50 결정을 위해, 조작된 저캇 T 세포 또는 인간 일차 T 세포를 사용한 각각의 검정에 대해 GraphPad Prism으로 10점 또는 9점 반응 곡선에 대한 4-파라미터 로지스틱 방정식을 사용하여 RFU 값을 분석하였다. 활성의 배수 변화는 곡선 상의 최고 RFU 대 항체를 함유하지 않은 웰의 RFU의 비율을 취해 결정하였다.
mAb1은 인간 일차 단핵구 유래 식세포(효과기 세포)의 존재 하에 저캇/hCD20/hGITR 및 저캇/hCD20/MfGITR(표적 세포)의 농도 의존적 ADCP를 매개하였다. 4-파라미터 로지스틱 회귀가 단일 값으로 수렴하지 않았기 때문에, 저캇/hCD20/hGITR의 식균작용에 대한 EC50 값을 계산할 수 없었으며; 저캇/hCD20/MfGITR의 식균작용에 대한 EC50 값은 1나노 몰 미만의 범위였다. 저캇/hCD20/hGITR 및 저캇/hCD20/MfGITR 세포의 mAb1-매개 식균작용의 최대 수준은 유사하였으며, 배경(항체 없음)을 초과하는 활성 변화는 각각 5.92배 및 6.98배였다. 대조적으로, IgG1 이소형 대조군은 표적 세포주 중 어느 것의 ADCP도 매개하지 않았다. 1명의 인간 일차 단핵구 유래 식세포 공여자에 대한 데이터는 도 11에 도시되어 있고 표 18에 요약되어 있다.
양성 대조군 항-CD20 IgG1을 사용하여, 인간 일차 단핵구 유래 식세포가 동일한 표적 세포주의 ADCP를 유도하는 능력에 대해 평가하였다. 항-CD20 IgG1은 저캇/hCD20, 저캇/hCD20/hGITR 및 저캇/hCD20/MfGITR 표적 세포의 ADCP를 농도 의존적 방식으로 매개하였고, 식균작용에 대한 EC50 값은 1나노 몰 미만이었다.
조작된 저캇 T 세포의 항체-매개 ADCP
항체 저캇/hCD20 저캇/hCD20/hGITR 저캇/hCD20/MfGITR
최대 RFU a 활성 변화 배수 b EC 50 (M) 최대 RFU a 활성 변화 배수 b EC 50 (M) 최대 RFU a 활성 변화 배수 b EC 50 (M)
mAb1 3.29E+06 1.10 ND 1.76E+07 5.92 NC 2.03E+07 6.98 5.10E-10
IgG1 이소형 대조군 3.25E+06 1.09 ND 3.18E+06 1.07 ND 2.95E+06 1.02 ND
항-CD20 IgG1 1.05E+07 3.73 4.24E-10 1.11E+07 3.60 3.84E-10 1.45E+07 4.57 9.03E-10
a 최대 RFU는 시험한 농도 범위(381 fM 내지 100 nM) 내의 최고 평균 RFU 값으로서 결정하였다.
b 활성의 배수 변화는 배경(항체 없음)을 초과하는 최대 RFU로서 계산하였다.
h, 인간; Mf, Macaca fascicularis (시노몰구스 원숭이); NC, 데이터 세트에 대한 고유한 적합을 찾을 수 없기 때문에 계산되지 않음; ND, 농도 의존적 식균작용이 관찰되지 않았기 때문에 결정되지 않음
실시예 13: 항-CD3-매개 일차 CD4+ T 세포 증식에 항-GITR 항체가 미치는 영향
자극성 CD3 항체에 의해 매개된 일차 CD4+ T 세포 증식에 mAb1이 미치는 영향을 HEK293/FcγR2b 부속 세포가 존재하는 가운데 평가하였다. 6명의 공여자 유래의 인간 일차 CD4+ T 세포를 평가하였다.
HEK293/FcγR2b 세포를 37℃, 5% CO2에서 30분 동안 50 μg/mL 미토마이신 C 중에서 인큐베이션하고, 37℃, 5% CO2에서 바닥이 편평한 96-웰 조직 배양 플레이트에 1x105 세포/웰로 밤새 시딩하였다.
Ficoll-Paque PLUS 구배를 사용해 밀도 구배 원심분리로 6명의 공여자 유래의 PBMC로부터 CD4+ T 세포를 단리한 다음, 제조사의 프로토콜에 따라 인간 CD45RO 마이크로비드를 사용해 메모리 T 세포를 고갈시키고; 미접촉 CD4+ T 세포를 검정 배지(5% 인간 AB 혈청, 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 및 292 μg/mL 글루타민으로 보충된 RPMI)에 재현탁하였다.
검정 당일에, 도말한 HEK293/FcγR2b 세포를 1.2 μg/mL OKT3과 함께 실온에서 20분 동안 사전 인큐베이션한 다음, 5x105 미접촉 CD4+ T 세포/웰 및 mAb1 또는 IgG1 이소형 대조군을 32 fM 내지 133 nM 범위의 최종 농도로 첨가하였다.
플레이트를 37℃, 5% CO2에서 4일 동안 인큐베이션하고, 0.5 uCi 삼중수소 표지된 티미딘을 세포에 첨가하고, 플레이트를 16시간 동안 추가로 인큐베이션하였다. 티미딘과 (당연히 삼중수소도) 더 많은 양으로 분열 세포에 혼입될 것이다.
인큐베이션 후, 세포를 96-웰 UniFilter 플레이트 상에 수확하고, 35 μL의 섬광액을 각 웰에 첨가하였다. 삼중수소의 혼입은 마이크로플레이트 섬광 및 발광 계수기인 TopCount NXT 기기를 사용하여 분당 계수(CPM)로서 측정하였다. 모든 연속 희석물은 중복 시험하였다.
항체의 EC50 값은 GraphPad Prism™ 소프트웨어를 사용해 12점 투여량-반응 곡선에 대한 4-파라미터 로지스틱 방정식으로 결정하였다. 최대 증식은 시험된 농도 범위 내에서 검출된 평균 최대 CPM으로서 결정하였다. 활성의 배수 변화는 곡선 상의 최고 CPM 대 항체가 포함되지 않은 웰의 CPM의 비율을 취해 결정하였다.
mAb1은 1나노 몰 미만의 EC50 값으로 항-CD3-매개 T 세포 증식을 농도 의존적인 방식으로 강화시켰으며(도 12), 이는 배경을 초과하는 최대 T 세포 증식의 2.3배 내지 3.1배 증가(삼중수소 붕괴 시의 CPM으로서 측정됨)와 연관이 있었다. 대조적으로, IgG1 이소형 대조군은 T 세포 증식의 농도 의존적 강화를 촉진하지 않았다. 결과를 표 19에 요약하였다.
항-CD-매개 일차 CD4 + T 세포 증식에 항-GITR 항체가 미치는 영향
공여자 mAb1 IgG1 이소형 대조군
최대 CPM a 활성 변화 배수 b EC 50 (M) 최대 CPM a 활성 변화 배수 b EC 50 (M)
1900G 4875 3.14 4.30E-10 2620 1.69 ND
41003 5774 2.54 NC 2610 1.15 ND
3600Y 2707 2.30 1.72E-08 1720 1.46 ND
34001 1401 2.62 1.93E-10 841 1.57 ND
2000U 10722 2.45 3.91E-11 5631 1.29 ND
3800U 1505 2.45 1.07E-10 1064 1.73 ND
a 최대 CPM은 시험한 농도 범위(32 fM 내지 133 nM) 내의 최고 평균 CPM 값으로 결정하였다.
b 활성의 배수 변화는 배경(항체 없음)을 초과하는 최대 CPM으로서 계산하였다.
NC, 4-파라미터 로지스틱 회귀가 단일 값으로 수렴되지 않았기 때문에 계산되지 않음; ND, 농도 의존적 증식이 관찰되지 않았기 때문에 결정되지 않음
실시예 14: 차단 ELISA에서 GITR-L에 대한 GITR 결합에 항-GITR 항체가 미치는 영향
재조합 hGITR이 이의 리간드인 hGITR-L에 결합하는 것은 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA)-기반 결합 검정을 사용하여 결정하였다. PBS에서 희석된 2 μg/mL 농도의 재조합 hGITR-L을 마이크로역가 플레이트에 수동적으로 흡착시키고, 4℃에서 밤새 인큐베이션한 다음, 0.5% BSA가 포함된 PBS로 차단하였다. 그런 다음, 일정 농도 범위(3.4 pM 내지 200 nM)의 단량체 재조합 인간 GITR 엑토도메인 단백질 hGITR.mmH를 플레이트에 2회 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 0.05% Tween-20(PBST)을 함유하는 PBS로 4회 세척하였다. 플레이트에 결합된 hGITR.mmH를 서양 고추냉이 퍼옥시다아제(HRP)가 접합된 0.33 μg/ml의 염소 항-cMyc 항체로 검출하고, 제조사의 권장 절차에 따라 비색 HRP 기질 3-3’, 5-5’-테트라메틸벤지딘(TMB)을 사용하여 시각화하였다. 450 nm에서의 흡광도 데이터(OD450)를 재조합 hGITR.mmH의 농도의 함수로서 도표화하였다. 배경 신호를 결정하기 위해 완충액 단독 샘플을 포함시켰지만; 이 샘플의 OD450은 반응 곡선에 도표화하지 않았다. 결합 데이터를 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용해 11점 반응 곡선에 대한 4-파라미터 로지스틱 방정식을 사용해 분석하고, EC50 값을 계산하였다. EC50 값은 최대 결합의 50%가 관찰된 hGITR.mmH의 농도로서 정의된다. (선형 범위 내에서) EC50 값에 가까운 농도를 차단 검정을 위한 고정된 hGITR.mmH 농도로서 선택하였다.
hGITR-L에 대한 재조합 인간 GITR(hGITR.mmH)의 결합을 차단하는 mAb1의 능력을 결정하기 위해 ELISA-기반 차단 검정을 개발하였다. 고정된 농도의 재조합 hGITR.mmH(1.5 nM)를 mAb1 또는 IgG1 이소형 대조군(51 pM 내지 3 μM)과 함께 1시간 동안 사전 인큐베이션하였다. 사전 인큐베이션한 용액을, 전술한 바와 같이 GITR-L로 미리 코팅한 마이크로역가 플레이트의 2개의 웰에 옮겼다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, PBST로 4회 세척하고, 플레이트에 결합된 hGITR.mmH를 전술한 바와 같이 검출하였다. OD450에서의 흡광도 데이터는 항체 농도의 함수로서 도표화하였다. 결합 데이터를 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용해 11점 반응 곡선에 대한 4-파라미터 로지스틱 방정식을 사용해 분석하고, IC50 값을 계산하였다. IC50 값은 플레이트에 코팅된 hGITR-L에 대한 hGITR.mmH 결합의 50%를 차단하는 데 필요한 항체의 농도로서 정의된다.
고정된 인간 GITR-L(6His.GCN4.G4Sx3.hGITR-L)에 대한 단량체 재조합 인간 GITR 엑토도메인 단백질(hGITR.mmH) 결합에 mAb1 또는 IgG1 이소형 대조군이 미치는 영향은 도 13에 도시되어 있다. 항체에 대한 IC50 값 및 최대 억제 백분율은 표 20에 요약되어 있다.
고정화된 인간 GITR-L에 대한 hGITR.mmH 결합의 차단
항체 IC 50 (M) 최대 억제 (%)
mAb1 6.66E-09 98
IgG1 이소형 대조군 ND -6
최대 차단 (%) = 항체의 최대 농도에서 차단 백분율
ND, 농도 의존적 결합 억제가 관찰되지 않았으므로 결정되지 않음
재조합 hGITR.mmH는 고정된 인간 GITR-L에 농도 의존적 방식으로 결합하였고, EC50 값은 2.05 nM이었다. (선형 범위 내에서) EC50 값에 가까운 1.5 nM의 농도를 차단 검정을 위한 고정된 hGITR.mmH 농도로서 선택하였다.
mAb1은 hGITR-L에 대한 hGITR.mmH 결합을 농도 의존적 방식으로 차단하였고, 최대 억제율은 98%였고 IC50 값은 6.66 nM이었다. IgG1 이소형 대조군은 시험된 모든 농도에서 인간 GITR-L에 대한 hGITR.mmH 결합을 억제하지 않았다.
실시예 15: 항-GITR 항체가 CDC에 미치는 영향
혈청 보체의 존재 하에, 인간 또는 시노몰구스 원숭이 GITR을 발현하는 조작된 저캇 T 세포에 대한 CDC를 매개하는 mAb1의 능력을 세포독성 검정에서 평가하였다. 최대 세포독성 백분율 및 EC50 값을 보고하였다.
인간 또는 시노몰구스 원숭이 GITR을 발현하는 T 세포에 대한 CDC를 유도하는 mAb1의 능력을 평가하기 위해 CDC 검정을 수행하였다. 표적 세포는 저캇/hCD20/hGITR 세포 또는 저캇/hCD20/MfGITR 세포를 포함하였고; 저캇/hCD20 세포를 대조군 표적 세포주로서 포함시켰다. IgG1 이소형 대조군을 mAb1과 병렬로 평가하였다. 항-CD20 IgG1을, 혈청 보체 인자의 존재 하에, 조작된 저캇 T 세포에 대한 CDC를 유도하기 위한 양성 대조군으로서 사용하였다.
표적 세포(5x103 세포/웰)를 불투명한 백색의 바닥이 평평한 96-웰 플레이트에 3회 첨가하고, 이어서 mAb1, IgG1 이소형 대조군, 또는 항-CD20 IgG1(최종 농도 범위: 477 fM 내지 500 nM)을 첨가한 다음, 검정 배지(1% BSA, 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 및 292 μg/mL -글루타민으로 보충된 RPMI) 중 혈청(5%의 최종 부피)을 첨가하고; 병렬로 검정 배지만을 첨가하여 보체 인자가 없을 때의 세포 용해를 평가하였다. 항체를 제외한 모든 성분을 함유하는 완충액 대조군 샘플을 각각의 실험에 혼입하여 검정의 배경 신호(즉, 표적 세포의 비특이적 용해)를 결정하였다.
플레이트를 37℃, 5% CO2에서 3.5시간동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 플레이트를 30분 동안 실온으로 평형화시키고, 이어서 CytoTox Glo 시약을 15분 동안 진탕하면서 웰에 첨가하였다. 발광 신호는 ENVISION 플레이트 판독기를 사용하여 세포독성의 판독으로서 측정하였다.
세포독성 반응은 다음과 같이 계산하였다:
Figure pct00001
EC50 결정을 위해, 세포독성 백분율은 GraphPad Prism을 이용해 12점 반응 곡선에 대한 4-파라미터 로지스틱 방정식을 사용하여 분석하였다.
mAb1은 5% NHS가 존재할 때, 477 fM 내지 500 nM의 농도 범위에서 저캇/hCD20, 저캇/hCD20/hGITR, 또는 저캇/hCD20/MfGITR 표적 세포에 대한 CDC를 매개하지 않았다. 마찬가지로, IgG1 이소형 대조군 항체와 함께 인큐베이션한 표적 세포에 대해서도 CDC가 관찰되지 않았다(도 14).
검정에 사용된 NHS를, 양성 대조군인 항-CD20 IgG1을 사용하여, CDC를 유도하는 능력에 대해 동일한 표적 세포주에서 평가하였다. NHS가 존재할 때, 항-CD20 IgG1은 3개의 표적 세포주 모두에 대해 CDC를 농도 의존적 방식으로 매개하였다. NHS가 없을 때, 항-CD20 IgG1은 시험된 모든 표적 세포주에 대해서 용해를 매개하지 않았다.
실시예 16: C1q에 결합할 수 있는 면역 복합체를 형성하는 항-GITR 항체의 능력
C1q에 결합할 수 있는 면역 복합체를 형성하는 mAb1의 능력을, 단량체(hGITR.mmH) 또는 이량체(hGITR.mFc) 형태의 재조합 가용성 GITR 엑토도메인 단백질 및 MicroVue CIC-C1q EIA 키트를 사용해 평가하였다. 양성 대조군으로서, 열응집 감마 글로불린(HAGG)이 C1q에 결합하는 것도 평가하였다.
30 nM의 mAb1 또는 IgG1 이소형 대조군을 hGITR.mmH 또는 hGITR.mFc 중 하나와 함께 1:1 몰비로 인큐베이션하였다. 30 nM mAb1, IgG1 이소형 대조군, hGITR.mmH, 또는 hGITR.mFc을 단독으로 함유하는 대조군도 평가하였다. 샘플을 DPBS(pH 7.4) 중의 0.1%(w/v) 소 혈청 알부민(BSA) 중에서 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 각각의 샘플을 3회 평가하였다.
C1q에 대한 복합체의 결합을 조사하기 위해, 샘플을 C1q 단백질로 코팅된 ELISA 플레이트에서 키트 검정 완충액 내로 50배 희석하고, 실온에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 웰을 세척하여 미결합 단백질을 제거하고, 서양고추냉이 퍼옥시다아제(HRP)-접합된 염소 항-인간 IgG(MicroVue CIC-C1q EIA 키트)를 각 웰에 첨가하여 C1q-결합된 면역 복합체를 검출하였다. 미결합 HRP 접합체를 씻어낸 후, 효소 기질을 첨가하여 결합된 복합체를 검출하였다. Perkin Elmer VICTOR X5 다중 표지 플레이트 판독기를 사용하여 405 nm에서 흡광도를 판독하였다.
CIC-C1q 검정 표준인 HAGG를 사용하여, mL당 0, 15, 및 38 HAGG μg(μg Eq/mL)과 동등한 흡광도 값에 기초하여 선형 기준 곡선을 생성하였다. 각 시험 샘플에 대한 μg Eq/mL 농도는 이 표준 곡선을 참조하여 결정하였다. 높은 및 낮은 HAGG 양성 대조군도 수행하였다. 높은 HAGG 대조군은 검정에서 11 내지 26 μg Eq/mL의 범위를 가질 것으로 예상되며, 낮은 HAGG 대조군은 4 μg Eq/mL 미만일 것으로 예상된다. 키트 제조사는 4 μg Eq/mL 미만의 값을 유의한 수준의 C1q-결합 CIC에 대한 음성으로서 정의한다.
mAb11 및 hGITR.mmH 또는 hGITR.mFc를 함유하는 샘플에서는 C1q 결합이 관찰되지 않았다(도 15). 마찬가지로, IgG1 이소형 대조군 및 hGITR.mmH 또는 hGITR.mFc를 함유하는 샘플에서도 C1q 결합이 관찰되지 않았다. mAb1, IgG1 이소형 대조군, hGITR.mmH, 또는 hGITR.mFc 하나만을 함유하는 샘플에서는 C1q 결합이 관찰되지 않았다. 높은 HAGG 양성 대조군 및 낮은 HAGG 양성 대조군을 병렬로 분석하였으며, 각 샘플의 C1q 결합은 각각의 예상 범위 내에서 관찰되었다.
실시예 17: 조작된 RBL-2H3 세포로 자극한 인간 일차 T 세포로부터의 IL-2 방출에 세미플리맙과 조합된 항-GITR 항체가 미치는 영향
본 실시예는 2명의 공여자 유래의 인간 일차 CD3+ T 세포로부터의 항-GITR-자극에 의한 IL-2 방출에 미치는 mAb1의 작용성 영향을 조사하였다. CD3+ T 세포를 2명의 공여자 유래의 PBMC로부터 단리하였다. 한 공여자의 경우, Ficoll-Paque PLUS 구배를 사용하여 밀도 구배 원심분리로 말초 혈액으로부터 PBMC를 단리하였다. 다른 공여자의 경우, Stem Cell Technologies의 EasySep Direct 인간 PBMC 단리 키트를 제조사의 프로토콜에 따라 사용하여, 건강한 공여자의 말초 혈액으로부터 PBMC를 단리하였다. 두 공여자로부터 단리한 PBMC를 10% DMSO를 함유하는 FBS에서 별도로 동결하였다.
CD3+ T 세포 단리를 위해, 냉동된 PBMC 바이알을 37℃의 수조에서 해동하고, 50 U/ml 벤조나아제 뉴클레아제를 함유하는 자극 배지(10% FBS, HEPES, NaPyr, NEAA, 및 0.01 mM BME로 보충된 X-VIVO 15 세포 배양 배지)에서 희석하였다. 세포를 1200 rpm에서 10분 동안 원심분리하고, EasySep 완충액에 재현탁하고, 제조사의 프로토콜에 따라 StemCell Technologies의 EasySep T-Cell 단리 키트를 사용하여 단리하였다.
CD3+ T 세포를 자극 배지에 재현탁하고, 96-웰 둥근 바닥 플레이트에 1x105 세포/웰의 농도로 도말하였다. RBL-2H3/αGITR 또는 RBL-2H3/αGITR/hPD-L1 세포를 10×106 세포/mL 농도의 1차 자극 배지에서 10 μg/mL의 미토마이신 C로 처리하였다. 37℃, 5% CO2에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 미토마이신 C-처리된 세포를 2% FBS가 포함된 D-PBS로 3회 세척하고, T 세포를 함유하는 웰에 5×104 세포/웰의 최종 농도로 첨가하였다. 이어서, 3 pM 내지 200 nM 범위의 최종 농도의 mAb1 또는 IgG1 이소형 대조군의 항체 조합 및 20 nM의 고정 농도의 세미플리맙 또는 IgG4P 이소형 대조군을 웰에 첨가하였다. 10점 희석의 마지막 지점에는 적정된 항체가 포함되지 않았다. 플레이트를 37℃, 5% CO2 하에 3일 동안 인큐베이션한 다음 원심분리하여 세포를 펠릿화하였다. IL-2 방출을 위해, 제조사의 프로토콜에 따라 PerkinElmer의 인간 IL-2 키트를 사용하여 5 μL의 상청액을 시험하였다. IL-2 측정치는 PerkinElmer의 다중표지 플레이트 판독기 Envision을 이용해 수득하였다. 모든 연속 희석물은 3번 시험하였다.
항체의 EC50 값은 GraphPad Prism™ 소프트웨어를 사용해 10점 투여량-반응 곡선에 대한 4-파라미터 로지스틱 방정식으로 결정하였다. 최대 IL-2 방출은 시험된 농도 범위 내에서 검출된 평균 최대 반응으로서 결정하였다.
RBL-2H3/aGITR 표적 세포 상에 PD-L1이 없는 경우, mAb1은 고정 농도의 세미플리맙과 무관하게 IL-2 방출을 투여량 의존적 방식으로 증가시켰다. T 세포 공여자 모두는 세미플리맙과 무관하게 유사한 EC50 값 및 최대 IL-2 값을 나타냈다(도 16).
RBL-2H3/αCD3 세포 상에 PD-L1이 존재하는 경우, T 세포 공여자 모두에 대한 베이스라인 IL-2 수준은 PD-L1이 결여된 표적 세포 대비 감소하였다. 그러나, 고정 농도의 세미플리맙을 첨가했을 때 베이스라인 IL-2 값이 증가하였다. T 세포 공여자 모두에 대해, mAb1은 세미플리맙과는 무관하게 IL-2를 투여량 의존적으로 증가시켰고, 세미플리맙을 첨가했을 때, 최대 IL-2 수준이 더욱 향상되었다(도 16).
결과를 표 21에 요약하였다.
항-CD3-자극된 일차 T 세포로부터의 IL-2 방출에 세미플리맙과 mAb1의 조합이 미치는 영향 요약
항체 조합 a 공여자 555105 CD3 + T 세포 공여자 555130 CD3 + T 세포
RBL-2H3/αCD3 RBL-2H3/
αCD3/hPD-L1 		RBL-2H3/αCD3 RBL-2H3/
αCD3/hPD-L1
최대 IL-2 b (pg/ml) EC 50 (M) 최대 IL-2 b (pg/ml) EC 50 (M) 최대 IL-2 b (pg/ml) EC 50 (M) 최대 IL-2 b (pg/ml) EC 50 (M)
mAb1
 세미플리맙 33.3 1.95E-10 36.0 1.49E-10 170 7.30E-11 146 1.09E-10
IgG4P 이소형 대조군 38.2 1.19E-10 15.5 2.00E-10 173 8.92E-11 42.3 NC
IgG1 이소형 대조군 세미플리맙 15.7 ND 21.7 ND 55.8 ND 37.3 ND
IgG4P 이소형 대조군 17.4 ND 4.62 ND 63.8 ND 8.85 ND
a 최대 IL-2 농도는 시험된 항체 농도 범위(76 fM 내지 200 nM) 내에서 기록된 최고 평균 IL-2 농도 값이다.
b 세미플리맙 또는 IgG4P 이소형 대조군을 20 nM의 고정 농도로 시험하였다.
NC, 4-파라미터 로지스틱 회귀가 단일 값으로 수렴되지 않았기 때문에 계산되지 않음; ND, 농도 의존적 IL-2 방출이 관찰되지 않았기 때문에 결정되지 않음
요약
위의 실시예들은 mAb1이 T 세포의 세포 표면에서 발현된 인간 및 시노몰구스 원숭이 GITR에 결합할 수 있고, 대리 ADCC 리포터 검정에서 Fcγ 수용체 매개 NFAT 활성화를 향상시킬 수 있음을 입증하였다. 따라서, mAb1은 조작된 T 세포의 ADCP를 유도하였고, CD8+ T 세포 대비 Treg에 대한 우선적 ADCC를 매개하였다. 한편, mAb1은 조작된 GITR-발현 T 세포의 CDC를 매개할 수 없거나, C1q에 결합할 수 있는 면역 복합체를 형성할 수 없었다. mAb1은 또한, 인간 GITR-L에 대한 인간 GITR의 결합을 차단하여 IL-2를 투여량 의존적으로 증가시켰고, 세미플리맙의 첨가는 최대 IL-2 수준을 더욱 향상시켰다.
실시예 18: 항-GITR 항체는 종양 내 T 조절 세포를 고갈시키고 CD8+ T 세포/ T 조절 세포 비율을 증가시킨다
이 실험에서, 부모 항-GITR 항체인 CompAb1 및 연관 변이체인 mAb1 및 mAb2가 T 조절 세포를 종양내에서 고갈시키는 능력을 평가하였다. 12주령의 암컷 GITR/GITR-L 인간화 마우스에게 MC38 마우스 결장 종양 세포(3.0x105 세포/마우스)를 피하 접종하였다. 6일차에, CompAb1, mAb1, 또는 mAb2를 복강 내(i.p.) 주사를 통해 투여하였다. 11일차에, 마우스를 안락사시키고 FACS 분석을 위해 종양 조직을 채취하였다. FACS 샘플은 BD Fortesa X20에 의해 수득하여 Flowjo 소프트웨어로 분석하였다.
데이터는 도 17에 도시되어 있다. 전반적으로, 항-GITR 항체를 사용한 단일 투여량 항체 치료는 종양 내 Treg 세포의 유의한 고갈을 매개하고, CD8+T 세포/T-reg 비율을 증가시켰다. CompAb1 및 N101D 변이체인 mAb1은 NN101E 변이체인 mAb2와 비교하여 보다 일관되게 T-reg를 고갈시켰고, CD8/Treg 비율을 증가시켰다.
실시예 19: GITR/GITR-L-인간화 마우스에서 mAb1 단독요법의 항종양 효능 및 마우스 결장직장 암종 종양을 가진 GITR/GITR-L/PD-1-인간화 마우스에서 mAb1과 세미플리맙의 병용요법의 항종양 효능
0일차에, 9주령 내지 14주령의 암컷 GITR/GITR-L/PD-1 인간화 마우스의 우측 옆구리에 MC38 결장직장 암종 세포(100 μL PBS 중 3 x 105 세포)를 피하 이식하였다. 이식 6일 후에(6일차에), 종양이 평균 43 mm3일 때, 마우스를 5개의 군으로 무작위 배정하고, 제1 투여량으로 10 mg/kg IgG1 이소형 대조군 + 1 mg/kg IgG4P 이소형 대조군(n=7), 10 mg/kg IgG1 이소형 대조군 + 1 mg/kg 세미플리맙(n=7), 10 mg/kg mAb1 + 1 mg/kg 세미플리맙(n=7), 1 mg/kg mAb1 + 1 mg/kg 세미플리맙(n=6), 또는 0.1 mg/kg mAb1 + 1 mg/kg 세미플리맙(n=7)을 투여하였다. 13일차에, 모든 마우스에게 추가 투여량을 투여하여 총 2회 투여량을 투여하였다. 7, 12, 14, 및 20일차에 마우스에서 채혈하여 혈청 내 항체 농도를 모니터링하였다. 종양 성장은 5, 10, 13, 17, 20, 26, 28, 31, 34, 38, 41, 45, 48, 52, 60, 68, 및 75일차에 종양 부피의 캘리퍼 측정에 의해 모니터링하였다. 종양 부담으로 인해 조기에 안락사되지 않은 한, 모든 마우스를 75일차까지 모니터링하였다.
이소형 대조군 항체를 투여한 (1 mg/kg IgG4P 이소형 대조군과 10 mg/kg IgG1 이소형 대조군의 병용 투여한) 마우스에 비해 1 mg/kg 세미플리맙을 0.1, 1, 또는 10 mg/kg mAb1과 병용 투여한 마우스에서 통계적으로 유의한 종양 성장의 감소가 관찰되었다(도 18). 세미플리맙 단독요법(1 mg/kg 세미플리맙과 10 mg/kg IgG1 이소형 대조군의 병용 요법)을 투여한 마우스에 비해 1 mg/kg 세미플리맙을 10 mg/kg mAb1(0.1 또는 1 mg/kg mAb1이 아님)과 병용 투여한 마우스에서 수치적으로 더 큰 종양 성장 감소가 관찰되었지만, 그 차이는 통계적으로 유의하지 않았다(조정된 p=0.0525).
1 mg/kg의 세미플리맙을 단독 투여한 결과 7마리의 마우스 중 2마리에서 종양이 제거되었다(도 19b). 세미플리맙에 mAb1을 첨가하여 투여한 결과, 시험된 최고 투여량인 10 mg/kg mAb1(마우스 7마리 중 5마리; 도 19c)에서 종양 제거 빈도가 증가하였지만, 더 낮은 투여량인 1 및 0.1 mg/kg mAb1(각각 마우스 6마리 중 2마리 및 7마리 중 2마리; 도 19d 및 19e)에서는 그렇지 않았다. 종양이 제거된 모든 마우스는 연구 종료(75일차, 마지막 투여로부터 약 9주 후) 시까지 무종양 상태를 유지하였다. 예상대로, 이소형 대조군 항체가 투여된 마우스에서는 종양 제거가 관찰되지 않았다(도 19a).
옴니버스 Gehan-Breslow-Wilcoxon 검정(p=0.0105)을 사용해 군들 간의 통계적으로 유의한 생존율 차이를 검출하였으며; 군별 비교를 위해 추가의 Gehan-Breslow-Wilcoxon 검정을 수행하였다. 이소형 대조군 항체를 투여한 마우스(생존 없음)와 비교하여, 1 mg/kg 세미플리맙을 1 또는 10 mg/kg mAb1와 병용 투여한 마우스(각각 33% 및 71% 생존율)에서 유의한 생존율 증가가 관찰되었다(도 20). 또한, 세미플리맙 단독요법을 투여한 마우스(29% 생존율)와 비교하여, 1 mg/kg 세미플리맙을 10 mg/kg mAb1과 병용 투여한 마우스에서 유의한 생존율 증가가 관찰되었다(0.1 또는 1 mg/kg mAb1과 병용한 경우는 그렇지 않음).
본 개시는 본원에 기술된 특정 구현예에 의해 그 범위가 제한되지 않는다. 실제로, 본원에 기술된 것들 이외에 본원에 기술된 다양한 변형이 전술된 설명 및 첨부된 도면으로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구범위의 범위 이내에 포함되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc. BABB, Robert DUDGEON, Drew HUANG, Yu MOLDEN, Rosalynn OLSON, William SLEEMAN, Matthew SKOKOS, Dimitris WANG, Bei <120> ANTI-GITR ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> 10671WO01 <140> TBA <141> 2021-03-05 <150> 62/986,494 <151> 2020-03-06 <160> 49 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcattg tctctggtgg ctccatcagt ggttacttct ggaactggat ccggcagccc 120 ccagggaagg gacttgaatg gattggttat atctattaca gtgggaccac catctacaac 180 ccctccctca agagtcgatt caccatatca ctagacacgt ccaagaacca gttctcccta 240 aagctgacct ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtatatt actgtgcgag agagtcgtat 300 aatccctcgc cgcgatattt tgaccactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360 <210> 2 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ile Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Gly Tyr 20 25 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gcagtacaac 900 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 1080 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320 cagaagtccc tctccctgtc tccgggtaaa tga 1353 <210> 18 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 18 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ile Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Gly Tyr 20 25 30 Phe Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Thr Thr Ile Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Phe Thr Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 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atctattaca gtgggaccac catctacaac 180 ccctccctca agagtcgatt caccatatca ctagacacgt ccaagaacca gttctcccta 240 aagctgacct ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtatatt actgtgcgag agagtcgtat 300 gacccctccc cgcgatattt tgaccactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360 <210> 22 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 22 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ile Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Gly Tyr 20 25 30 Phe Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Thr Thr Ile Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Phe Thr Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Glu Ser Tyr Asp Pro Ser Pro Arg Tyr Phe Asp His Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 23 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 23 gcgagagagt cgtatgaccc 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ccctggtcac cgtctcctca 360 gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 660 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 720 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 1080 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac 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900 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 1080 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320 cagaagtccc tctccctgtc tccgggtaaa tga 1353 <210> 38 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 38 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ile Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Gly Tyr 20 25 30 Phe Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Thr Thr Ile Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Phe Thr Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys 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Asp Leu His His His His 180 185 190 His His <210> 49 <211> 241 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 49 Met Ala Gln His Gly Ala Met Gly Ala Phe Arg Ala Leu Cys Gly Leu 1 5 10 15 Ala Leu Leu Cys Ala Leu Ser Leu Gly Gln Arg Pro Thr Gly Gly Pro 20 25 30 Gly Cys Gly Pro Gly Arg Leu Leu Leu Gly Thr Gly Thr Asp Ala Arg 35 40 45 Cys Cys Arg Val His Thr Thr Arg Cys Cys Arg Asp Tyr Pro Gly Glu 50 55 60 Glu Cys Cys Ser Glu Trp Asp Cys Met Cys Val Gln Pro Glu Phe His 65 70 75 80 Cys Gly Asp Pro Cys Cys Thr Thr Cys Arg His His Pro Cys Pro Pro 85 90 95 Gly Gln Gly Val Gln Ser Gln Gly Lys Phe Ser Phe Gly Phe Gln Cys 100 105 110 Ile Asp Cys Ala Ser Gly Thr Phe Ser Gly Gly His Glu Gly His Cys 115 120 125 Lys Pro Trp Thr Asp Cys Thr Gln Phe Gly Phe Leu Thr Val Phe Pro 130 135 140 Gly Asn Lys Thr His Asn Ala Val Cys Val Pro Gly Ser Pro Pro Ala 145 150 155 160 Glu Pro Leu Gly Trp Leu Thr Val Val Leu Leu Ala Val Ala Ala Cys 165 170 175 Val Leu Leu Leu Thr Ser Ala Gln Leu Gly Leu His Ile Trp Gln Leu 180 185 190 Arg Ser Gln Cys Met Trp Pro Arg Glu Thr Gln Leu Leu Leu Glu Val 195 200 205 Pro Pro Ser Thr Glu Asp Ala Arg Ser Cys Gln Phe Pro Glu Glu Glu 210 215 220 Arg Gly Glu Arg Ser Ala Glu Glu Lys Gly Arg Leu Gly Asp Leu Trp 225 230 235 240 Val

Claims (50)

  1. 글루코코르티코이드-유도 종양 괴사 인자 수용체(GITR)에 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 특성을 나타내는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    (a) 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 22, 28, 34, 및 40으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역(HCVR) 아미노산 서열 내에 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3)을 포함하고; 서열번호 10의 경쇄 가변 영역(LCVR) 내에 3개의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3)을 포함함;
    (b) 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 22, 28, 34, 및 40으로 이루어진 군으로부터 선택된 HCVR 아미노산 서열; 및 서열번호 10의 LCVR 아미노산 서열을 포함함;
    (c) 항체는 서열번호 26, 32, 38, 및 44로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 아미노산 서열; 및 서열번호 20의 경쇄 아미노산 서열을 포함함; 및
    (d) 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 N101D, N101E, N101S, 또는 N101T 돌연변이로 변형된 서열번호 2의 HCVR 아미노산 서열 내에 3개의 중쇄 CDR; 및 서열번호 10의 LCVR 아미노산 서열 내에 3개의 경쇄 CDR을 포함함.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 특성을 나타내는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    (a) 표면 플라스몬 공명에 의해 측정했을 때, 25℃에서 약 12 nM 미만의 KD로 단량체 인간 GITR에 결합함;
    (b) 25℃에서 약 2분 초과의 t1/2로 단량체 인간 GITR에결합함;
    (c) 25℃에서 표면 플라스몬 공명으로 측정했을 때, 약 1 nM 미만의 KD로 이량체 인간 GITR에 결합함; 및
    (d) 25℃에서 약 5분 초과의 t1/2로 이량체 인간 GITR에결합함.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 특성을 나타내는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    (a) 인간 또는 마우스 혈청에서 0.5%/일 미만의 절단 속도를 가짐; 및
    (b) 마우스에서 약 0%의 생체 내 절단 속도를 가짐.
  4. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 특성을 나타내는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    (a) 약 4 nM 미만의 EC50으로 세포 표면 인간 및 시노몰구스 원숭이 GITR에 결합함;
    (b) 약 40 pM 미만의 EC50으로 저캇/NFAT-Luc/hFcγR3a 및/또는 저캇/NFAT-Luc/MfFcγR3a 효과기 세포에서 Fc-매개 NFAT 활성을 향상시킴;
    (c) 약 20 pM 미만의 EC50으로, 인간 일차 NK 세포의 존재 하에, 인간 일차 T 세포에 대한 ADCC를 매개함;
    (d) 인간 또는 시노몰구스 원숭이 GITR을 발현하도록 조작된 저캇 T 세포에서, 비-GITR 발현 저캇 T 세포에 비해 적어도 약 5배만큼 ADCP를 매개함;
    (e) 항-GITR-매개 일차 CD4+ T 세포 증식을 향상시킴;
    (f) FcγR-의존적 방식으로 종양내 Treg를 우선적으로 고갈시킴으로써 항종양 면역을유도함; 및
    (g) 약 7 nM 미만의 IC50으로, 인간 GITR 리간드에 대한 인간 단량체 GITR 결합을 차단함.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 22의 아미노산 서열을 갖는 HCVR을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 28의 아미노산 서열을 갖는 HCVR을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 34의 아미노산 서열을 갖는 HCVR을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 40의 아미노산 서열을 갖는 HCVR을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 LCVR을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3, 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3, 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  12. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3, 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  13. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3, 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  14. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR, 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  15. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR, 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  16. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR, 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  17. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR, 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  18. 제1항에 있어서, 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 중쇄는 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  19. 제1항에 있어서, 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 중쇄는 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  20. 제1항에 있어서, 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 중쇄는 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  21. 제1항에 있어서, 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 중쇄는 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  22. 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 경쇄는 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 제시된 것과 같은 항체의 HCVR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
  24. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 제시된 것과 같은 항체의 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
  25. 제23항 또는 제24항의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터.
  26. 제25항의 벡터를 발현하는 단리된 숙주 세포.
  27. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 대상체에서 암을 치료하기 위한 방법에 사용하기 위한, 약학적 조성물.
  29. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 항종양 면역 반응을 조절하는 방법에 사용하기 위한, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  30. 제29항에 따라 사용하기 위한 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 방법은 제2 T 세포 활성화 수용체에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 T 세포 활성화 수용체는 CD28, OX40, CD137, CD27, 또는 HVEM인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  31. 제29항에 따라 사용하기 위한 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 방법은 T 세포 억제 수용체에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 T 세포 억제 수용체는 CTLA-4, PD-1, TIM-3, BTLA, VISTA, 또는 LAG-3인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  32. 제31항에 따라 사용하기 위한 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 T 세포 억제 수용체는 PD1이고, T 세포 수용체에 결합하는 항체는 세미플리맙인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  33. 제29항에 따라 사용하기 위한 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 방법은 방사선 요법을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  34. 제29항에 따라 사용하기 위한 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 방법은 하나 이상의 화학요법제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  35. 제29항에 따라 사용하기 위한 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 암은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편: 편평 세포 피부암, 피부 편평 세포 암종(CSCC), 골수종, 폐암, 흑색종, 두경부 편평 세포 암종(SCCHN), 소세포 폐암, 비소세포 폐암(NSCLC), 자궁경부암(예를 들어 자궁경부 편평 세포 암종(자궁경부 SCC)), 유방암, 및 신장 세포 암종(RCC), 선암종, 결장암(CRC), 췌장 암종, 두경부암, 전립선암, 다형성 교아종, 악성 신경교종, 골육종, 결장암, 위암(예: GITR 증폭이 있는 위암), 악성 중피종, 다발성 골수종, 난소암, 윤활막 육종, 갑상선암, 유방암(삼중 음성 유방암 포함), 고환암, 식도암, 자궁암, 자궁내막암, 간암, 면역 관문 차단(ICB) 미노출 암, ICB에 노출된 암.
  36. 암을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 제27항의 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  37. 항종양 면역 반응을 조절하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  38. 제37항에 있어서, 제2 T 세포 활성화 수용체에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하되, 상기 T 세포 활성화 수용체는 CD28, OX40, CD137, CD27, 또는 HVEM인, 방법.
  39. 제37항에 있어서, T 세포 억제 수용체에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 투여하는 단계를 추가로 포함하되, 상기 T 세포 억제 수용체는 CTLA-4, PD-1, TIM-3, BTLA, VISTA, 또는 LAG-3인, 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 T 세포 억제 수용체는 PD1이고, T 세포 수용체에 결합하는 항체는 세미플리맙인, 방법.
  41. 제37항에 있어서, 방사선 요법을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  42. 제37항에 있어서, 하나 이상의 화학요법제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  43. 제36항에 있어서, 암은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법: 편평 세포 피부암, 피부 편평 세포 암종(CSCC), 골수종, 폐암, 흑색종, 두경부 편평 세포 암종(SCCHN), 소세포 폐암, 비소세포 폐암(NSCLC), 자궁경부암(예를 들어 자궁경부 편평 세포 암종(자궁경부 SCC)), 유방암, 및 신장 세포 암종(RCC), 선암종, 결장암(CRC), 췌장 암종, 두경부암, 전립선암, 다형성 교아종, 악성 신경교종, 골육종, 결장암, 위암(예: GITR 증폭이 있는 위암), 악성 중피종, 다발성 골수종, 난소암, 윤활막 육종, 갑상선암, 유방암(삼중 음성 유방암 포함), 고환암, 식도암, 자궁암, 자궁내막암, 간암, 면역 관문 차단(ICB) 미노출 암, ICB에 노출된 암.
  44. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 2의 HCVR 및 서열번호 10의 LCVR 아미노산 서열을 포함하는 항체를 배제하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편. 　
  45. 암을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은:
    (i) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3, 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 항-GITR 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 및
    (ii) 세미플리맙을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  46. 제45항에 있어서, 암은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법: 편평 세포 피부암, 피부 편평 세포 암종(CSCC), 골수종, 폐암, 흑색종, 두경부 편평 세포 암종(SCCHN), 소세포 폐암, 비소세포 폐암(NSCLC), 자궁경부암(예를 들어 자궁경부 편평 세포 암종(자궁경부 SCC)), 유방암, 및 신장 세포 암종(RCC), 선암종, 결장암(CRC), 췌장 암종, 두경부암, 전립선암, 다형성 교아종, 악성 신경교종, 골육종, 결장암, 위암(예: GITR 증폭이 있는 위암), 악성 중피종, 다발성 골수종, 난소암, 윤활막 육종, 갑상선암, 유방암(삼중 음성 유방암 포함), 고환암, 식도암, 자궁암, 자궁내막암, 간암, 면역 관문 차단(ICB) 미노출 암, ICB에 노출된 암.
  47. 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하는 방법에 사용하기 위한 의약의 제조에 있어서 항-GITR 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3, 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하고; 상기 방법은 항-GITR 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 세미플리맙을 대상체에게 포함하는 단계를 포함하는, 용도.
  48. 제47항에 있어서, 암은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 용도: 편평 세포 피부암, 피부 편평 세포 암종(CSCC), 골수종, 폐암, 흑색종, 두경부 편평 세포 암종(SCCHN), 소세포 폐암, 비소세포 폐암(NSCLC), 자궁경부암(예를 들어 자궁경부 편평 세포 암종(자궁경부 SCC)), 유방암, 및 신장 세포 암종(RCC), 선암종, 결장암(CRC), 췌장 암종, 두경부암, 전립선암, 다형성 교아종, 악성 신경교종, 골육종, 결장암, 위암(예: GITR 증폭이 있는 위암), 악성 중피종, 다발성 골수종, 난소암, 윤활막 육종, 갑상선암, 유방암(삼중 음성 유방암 포함), 고환암, 식도암, 자궁암, 자궁내막암, 간암, 면역 관문 차단(ICB) 미노출 암, ICB에 노출된 암.
  49. 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하는 방법에 사용하기 위한 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 방법은:
    (i) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3, 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 항-GITR 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 및
    (ii) 세미플리맙을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  50. 제49항에 있어서, 암은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편: 편평 세포 피부암, 피부 편평 세포 암종(CSCC), 골수종, 폐암, 흑색종, 두경부 편평 세포 암종(SCCHN), 소세포 폐암, 비소세포 폐암(NSCLC), 자궁경부암(예를 들어 자궁경부 편평 세포 암종(자궁경부 SCC)), 유방암, 및 신장 세포 암종(RCC), 선암종, 결장암(CRC), 췌장 암종, 두경부암, 전립선암, 다형성 교아종, 악성 신경교종, 골육종, 결장암, 위암(예: GITR 증폭이 있는 위암), 악성 중피종, 다발성 골수종, 난소암, 윤활막 육종, 갑상선암, 유방암(삼중 음성 유방암 포함), 고환암, 식도암, 자궁암, 자궁내막암, 간암, 면역 관문 차단(ICB) 미노출 암, ICB에 노출된 암.
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