KR20210104758A - 이중특이적 항-muc16 x 항-cd28 항체 및 이의 용도 - Google Patents

이중특이적 항-muc16 x 항-cd28 항체 및 이의 용도 Download PDF

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KR20210104758A
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디미트리스 스코코스
쟈넬 웨이트
에리카 울만
아이누르 헤르만
에릭 스미스
로릭 하버
조지 디. 얀코포울러스
알리슨 크로퍼드
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리제너론 파아마슈티컬스, 인크.
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Abstract

본 발명은 인간 CD28에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인 및 인간 MUC16에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항원-결합 분자를 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 항원- 결합 분자는 MUC16를 발현하는 종양, 예컨대 난소 종양의 성장을 저해할 수 있다. 본 발명의 항체 및 이중특이적 항원-결합 분자는, 상향조절된 또는 유도된 표적화 면역 반응이 요망되고/되거나 치료적으로 유익한 질환 및 장애의 치료에 유용하다.

Description

이중특이적 항-MUC16 X 항-CD28 항체 및 이의 용도
관련 출원
본 출원은 2018년 12월 19일에 출원된 미국 임시출원 제62/782,142호 및 2019년 3월 8일에 출원된 미국 임시출원 제62/815,861호에 관한 것이며, 이들의 우선권을 주장한다. 상기 출원의 전체 내용은 참조로써 본원에 명백하게 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출되었고 그 전체가 참조에 의해 본원에 포함된 서열 목록을 함유한다. 2019년 12월 18일에 생성된 상기 ASCII 복사본은 명칭이 10493WO01_118003_49320_SeqLst.txt이고 크기가 38,372 바이트이다.
기술분야
본 발명은 CD28 및 표적 분자, 예컨대 MUC16에 결합하는 이중특이적 항원-결합 분자, 및 이의 사용 방법에 관한 것이다.
CD28은, 동종이량체로서 조립된 단일한 세포외 Ig-V-유사 도메인을 갖고 T 세포의 표면 상에서 발현되는 I형 막관통 단백질이다. CD28은 CD80(B7.1) 및 CD86(B7.2) 단백질에 대한 수용체이고, 항원-제시 세포(APC) 상에서 발현되는 CD80 또는 CD86에 의해 활성화된다. CD80 또는 CD86으로의 CD28의 결합은 T 세포 활성화 및 생존에 중요한 공동-자극성 신호를 제공한다. T-세포 수용체(TCR) 외에도 CD28을 통한 T 세포 자극은 다양한 인터루킨의 생성을 위한 강력한 신호를 제공한다. CD28은 TCR 활성화 후 NFκB 전사 인자에 의해 제어되는 경로와 같은 세포성 신호를 또한 강화시킨다. CD28 공동-신호는 T 세포 분화, 증식, 사이토카인 방출 및 세포-사멸과 같은 효과적인 T-세포 활성화에 중요하다.
항-CD28 항체는 T 세포의 활성화를 수반하는 치료적 목적을 위해 제안되어왔다. 하나의 특정 항-CD28 항체인 TGN1412(항-CD28 슈퍼작용제)는 2006년에 임상 시험에 사용되었다. 6명의 건강한 지원자는 0.1 mg/kg 용량의 TGN1412(항-CD28 슈퍼작용제)를 정맥내로 투약받았다. 2시간 이내에, 모든 6명의 환자는 유의한 염증 반응(사이토카인 폭풍)을 겪었고, 모든 환자들은 16시간 이내에 다기관 부전을 겪었다. 대상체는 코르티코스테로이드로 치료를 받았고, 사이토카인 수준은 2일 내지 3일 이내에 정상으로 되돌아갔다. 1상 연구에서 0.1 mg/kg의 시작 용량은 시노몰구스(cynomolgus) 원숭이에서 50 mg/kg의 무영향 관찰 용량(no-observed-adverse-effect-level) ("NOAEL")의 500-배 배수를 기초로 하였다(문헌[Suntharalingam, 등, Cytokine Storm in a Phase 1 Trial of the Anti-CD28 Monoclonal Antibody TGN1412, NEJM 355:1018-1028 (2006)]). 불행하게도, TGN1412에 의해 유도된 사이토카인 폭풍은 생체외 인간 PBMC 연구에서 또는 시노몰구스 원숭이에서 독성학 연구에 의해 예측되지 않았다.
암 항원 125, 암종 항원 125, 탄수화물 항원 125, 또는 CA-125로도 알려진 뮤신 16(Mucin 16; MUC16)은 고도로 글리코실화된 통합 막 당단백질이다. MUC16은 하기의 3가지 주요 도메인을 포함한다: 세포외 N-말단 도메인, 성게 정자, 엔테로키나아제, 아그린(agrin) (SEA) 도메인에 개재된 대 탠덤 반복 도메인 및 막관통 영역의 세그먼트 및 짧은 세포질 꼬리를 포함하는 카르복실 말단 도메인. 단백질분해 절단으로 MUC16의 세포외 부분이 혈류로 흘러가게 된다. MUC16은 난소암, 유방암, 췌장암, 비-소세포 폐암, 간내 담관암-덩어리 형성 유형(intrahepatic cholangiocarcinoma-mass forming type), 자궁경부의 선암종, 및 위장관의 선암종을 포함한 암에서 그리고 염증성 장 질환, 간경변, 심부전, 복막 감염 및 복부 수술을 비롯한 질환 및 병태에서 과발현된다. (Haridas, D. et al., 2014, FASEB J., 28:4183-4199). 암 세포 상 MUC16의 발현은 암 세포를 면역계로부터 보호하는 것으로 밝혀졌다. (Felder, M. et al., 2014, Molecular Cancer, 13:129).
MUC16에 대한 항체를 이용하는 난소암의 치료 방법이 조사되어 왔다. 그러나, 모노클로날 항체인 오레고보맙(oregovomab) 및 압고보맙(abgovomab)은 제한적인 성공을 거두었었다. (Felder, supra, Das, S. and Batra, S.K. 2015, Cancer Res. 75:4660-4674.) 따라서, 암을 치료하기 위한 개선된 MUC16 항체가 당업계에서 요구된다.
나아가, CD28과 표적 항원(예컨대 MUC16) 둘 다에 결합하는 이중특이적 항원-결합 분자는, 종양 세포에 대한 특이적인 표적화 및 상기 표적 항원을 발현하는 세포의 T 세포 매개 사멸화가 요망되는 치료적인 설정에서 유용할 것이다.
제1 양태에서, 본 발명은 또한 본원에서 "항-CD28/항-MUC16 이중특이적 분자"로도 지칭되는, CD28 및 MUC16을 결합하는 이중특이적 항원-결합 분자를 제공한다. 항-CD28/항-MUC16 이중특이적 분자의 항-MUC16 부분은 MUC16를 발현하는 종양 세포(예를 들어, 난소 종양 세포)를 표적화하는 데 유용하고, 상기 이중특이적 분자의 항-CD28 부분은 T-세포를 활성화하는 데 유용하다. 종양 세포 상의 MUC16와 T-세포 상의 CD28의 동시 결합은 활성화된 T-세포에 의한 표적화된 종양 세포의 겨냥된 사멸화(세포 용해)를 용이하게 한다. 따라서, 본 발명의 항-CD28/항-MUC16 이중특이적 분자는 특히 MUC16-발현 종양(예컨대, 난소암)과 관련되거나 이로 인해 유발되는 질환 및 장애의 치료에 유용하다.
본 발명의 이러한 양태에 따른 이중특이적 항원-결합 분자는, 인간 CD28에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인 및 MUC16에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 도메인을 포함한다. 본 발명은 항-CD28/항-MUC16 이중특이적 분자(예를 들어, 이중특이적 항체)를 포함하며, 여기서, 각각의 항원-결합 도메인은 경쇄 가변 영역(LCVR)과 쌍을 이룬 중쇄 가변 영역(HCVR)을 포함한다. 본 발명의 소정의 예시적인 구현예에서, 항-CD28 항원-결합 도메인 및 항-MUC16 항원 결합 도메인은 각각 공통의 LCVR과 쌍을 이룬 상이한 별개의 HCVR을 포함한다.
본 발명은 항-CD28/항-MUC16 이중특이적 분자를 제공하며, 여기서 CD28에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인은 표 3에 제시된 바와 같은 임의의 HCVR 아미노산 서열을 포함한다. CD28에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인은 또한, 표 3에 제시된 바와 같은 임의의 LCVR 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 소정의 구현예에 따르면, CD28에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인은 표 3에 제시된 바와 같은 임의의 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍을 포함한다. 본 발명은 또한, 항-CD28/항-MUC16 이중특이적 분자를 제공하며, 여기서 CD28에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인은 표 3에 제시된 바와 같은 임의의 중쇄 CDR1-CDR2-CDR3 아미노산 서열, 및/또는 표 3에 제시된 바와 같은 임의의 경쇄 CDR1-CDR2-CDR3 아미노산 서열을 포함한다.
소정의 구현예에 따르면, 본 발명은 항-CD28/항-MUC16 이중특이적 분자를 제공하며, 여기서 CD28에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인은 SEQ ID NO: 18 및 42로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 중쇄 가변 영역(HCVR)을 포함한다.
본 발명은 또한, 항-CD28/항-MUC16 이중특이적 분자를 제공하며, 여기서 CD28에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인은 SEQ ID NO: 10 및 34로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함한다.
본 발명은 또한, 항-CD28/항-MUC16 이중특이적 분자를 제공하며, 여기서 CD28에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인은 SEQ ID NO: 18/10 및 42/34으로 이루어진 군으로부터 선택되는 HCVR 및 LCVR(HCVR/LCVR) 아미노산 서열 쌍을 포함한다.
본 발명은 또한, 항-CD28/항-MUC16 이중특이적 분자를 제공하며, 여기서 CD28에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인은 SEQ ID NO: 24 및 48로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 중쇄 CDR3(HCDR3) 도메인; 및 SEQ ID NO: 16 및 40로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 경쇄 CDR3(LCDR3) 도메인을 포함한다.
소정의 구현예에서, CD28에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인은 SEQ ID NO: 24/16 및 48/40로 이루어진 군으로부터 선택되는 HCDR3/LCDR3 아미노산 서열 쌍을 포함한다.
본 발명은 또한, 항-CD28/항-MUC16 이중특이적 항원-결합 분자를 제공하며, 여기서 CD28에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인은 SEQ ID NO: 20 및 44로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 중쇄 CDR1(HCDR1) 도메인; SEQ ID NO: 22 및 46로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 중쇄 CDR2(HCDR2) 도메인; SEQ ID NO: 12 및 36로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 경쇄 CDR1(LCDR1) 도메인; 및 SEQ ID NO: 14 및 38로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 경쇄 CDR2(LCDR2) 도메인을 포함한다.
본 발명의 소정의 비제한적으로 예시적인 항-CD28/항-MUC16 이중특이적 항원-결합 분자는 SEQ ID NO: 20-22-24-12-14-16 및 44-46-48-36-38-40로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 각각 갖는 HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 도메인을 포함하는 CD28에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인을 포함한다.
본 발명은 또한, 항-CD28/항-MUC16 이중특이적 분자를 제공하며, 여기서 MUC16에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 도메인은 SEQ ID NO: 2 및 26으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 중쇄 가변 영역(HCVR)을 포함한다.
본 발명은 또한, 항-CD28/항-MUC16 이중특이적 분자를 제공하며, 여기서 MUC16에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 도메인은 SEQ ID NO: 10 및 34로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함한다.
본 발명은 또한, 항-CD28/항-MUC16 이중특이적 분자를 제공하며, 여기서 MUC16에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 도메인은 SEQ ID NO: 2/10 및 26/34으로 이루어진 군으로부터 선택되는 HCVR 및 LCVR(HCVR/LCVR) 아미노산 서열 쌍을 포함한다.
본 발명은 또한, 항-CD28/항-MUC16 이중특이적 분자를 제공하며, 여기서 MUC16에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 도메인은 SEQ ID NO: 8 및 32로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이와 실질적으로 유사한 서열을 갖는 중쇄 CDR3(HCDR3) 도메인; 및 SEQ ID NO: 16 및 40으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이와 실질적으로 유사한 서열을 갖는 경쇄 CDR3(LCDR3) 도메인을 포함한다.
소정의 구현예에서, MUC16에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 도메인은 SEQ ID NO: 8/16 및 32/40로 이루어진 군으로부터 선택되는 HCDR3/LCDR3 아미노산 서열 쌍을 포함한다.
본 발명은 또한, 항-CD28/항-MUC16 이중특이적 항원-결합 분자를 제공하며, 여기서 MUC16에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 도메인은 SEQ ID NO: 4 및 28로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 중쇄 CDR1(HCDR1) 도메인; SEQ ID NO: 6 및 30으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 중쇄 CDR2(HCDR2) 도메인; SEQ ID NO: 12 및 36으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 경쇄 CDR1(LCDR1) 도메인; 및 SEQ ID NO: 14 및 38로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 경쇄 CDR2(LCDR2) 도메인을 포함한다.
본 발명의 소정의 비제한적으로 예시적인 항-CD28/항-MUC16 이중특이적 항원-결합 분자는 SEQ ID NO: 4-6-8-12-14-16 및 28-30-32-36-38-40로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 각각 갖는 HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 도메인을 포함하는 MUC16에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 도메인을 포함한다.
관련된 구현예에서, 본 발명은 항-CD28/항-MUC16 이중특이적 항원-결합 분자를 포함하며, 여기서 MUC16에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 도메인은 SEQ ID NO: 2/10 및 26/34로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 및 경쇄 가변 영역(HCVR/LCVR) 서열 내에 함유된 중쇄 및 경쇄 CDR 도메인을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 임의의 기능성 조합 또는 이의 배열에서 본원의 표 2 및/또는 표 4에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자, 뿐만 아니라 표 2 및/또는 표 4에 제시된 바와 같은 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는, 본원에 개시된 항-CD28/항-MUC16 이중특이적 항원-결합 분자의 임의의 HCVR, LCVR 또는 CDR 서열을 인코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 본 발명의 핵산을 운반하는 재조합 발현 벡터 및 이러한 벡터가 도입된 숙주 세포 또한 본 발명에 의해 포괄되고, 항체의 생성을 허용하는 조건 하에 숙주 세포를 배양함으로써 항체를 생성하는 방법, 및 생성된 항체를 회수하는 방법 역시 마찬가지로 포괄된다.
본 발명은 항-CD28/항-MUC16 이중특이적 항원-결합 분자를 포함하는데, 여기서, CD28에 특이적으로 결합하는 임의의 앞서 언급한 항원-결합 도메인은 MUC16에 특이적으로 결합하는 임의의 앞서 언급한 항원-결합 도메인과 조합되거나, 연결되거나 또는 이와 달리 회합되어, CD28 및 MUC16에 결합하는 이중특이적 항원-결합 분자를 형성한다.
본 발명은 변형된 글리코실화 패턴을 갖는 항-CD28/항-MUC16 이중특이적 항원-결합 분자를 포함한다. 일부 적용에서, 바람직하지 않은 글리코실화 부위를 제거하기 위한 변형이 유용할 수 있거나, 또는 예를 들어 항체 의존적 세포의 세포독성(ADCC) 기능을 증가시키기 위해 올리고당 쇄 상에 존재하는 푸코스 모이어티가 결여된 항체가 유용할 수 있다(문헌[Shield 등 (2002) JBC 277:26733] 참조). 다른 적용에서, 보체 의존성 세포독성(CDC)을 변형시키기 위해 갈락토실화의 변형이 수행될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 바와 같은 항-CD28/항-MUC16 이중특이적 항원-결합 분자 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 관련 양태에서, 본 발명은 항-CD28/항-MUC16 이중특이적 항원-결합 분자 및 제2 치료제의 조합인 조성물을 특징으로 한다. 일 구현예에서, 제2 치료제는 항-CD28/항-MUC16 이중특이적 항원-결합 분자와 유리하게 조합된 임의의 제제이다. 항-CD28/항-MUC16 이중특이적 항원-결합 분자와 유리하게 조합될 수 있는 예시적인 제제는 본원의 어디에서나 상세하게 논의된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 항-CD28/항-MUC16 이중특이적 항원-결합 분자를 사용하여 MUC16를 발현하는 종양 세포를 표적화/사멸화하기 위한 치료 방법을 제공하며, 여기서 상기 치료 방법은 종양 세포의 표적화/사멸화가 필요한 대상체에게 본 발명의 항-CD28/항-MUC16 이중특이적 항원-결합 분자를 포함하는 약제학적 조성물을 치료적 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한, MUC16 발현과 관련되거나 이에 의해 야기된 질환 또는 장애의 치료를 위한 의약의 제조에서 본 발명의 항-CD28/항-MUC16 이중특이적 항원-결합 분자의 용도를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 항-CD28/항-MUC16 이중특이적 항원-결합 분자를 사용하여 MUC16를 발현하는 종양 세포를 표적화/사멸화하기 위한 치료 방법을 제공하며, 여기서 상기 항-CD28/항-MUC16 이중특이적 항원-결합 분자는 CD3에 결합하는 다른 항-종양 이중특이적 항원-결합 분자와 조합된다(예를 들어, 항-CD3/항-MUC16 항체와 조합된 항-CD28/항-MUC16).
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 항-CD28/항-MUC16 이중특이적 항원-결합 분자를 사용하여 MUC16를 발현하는 종양 세포를 표적화/사멸화하기 위한 치료 방법을 제공하며, 여기서 상기 항-CD28/항-MUC16 이중특이적 항원-결합 분자는 예를 들어, PD-1, PD-L1 또는 CTLA-4를 표적화하는 체크포인트 저해제와 조합된다(예를 들어, 항-PD-1 항체와 조합된 항-CD28/항-MUC16). 소정의 구현예에서, 본 발명의 항-CD28/항-MUC16 항체는 펨브롤리주맙(Keytruda®), 니볼루맙(Opdivo®), 또는 세미플리맙(Libtayo®)과 같이, PD-1을 표적화하는 제제와 조합될 수 있는 것으로 예상된다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 항-CD28/항-MUC16 항체는 아테졸리주맙(Tecentriq®), 아벨루맙(Bavencio®), 또는 두르발루맙(Imfinzi®)과 같이, PD-L1을 표적화하는 제제와 조합될 수 있는 것으로 예상된다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 항-CD28/항-MUC16 항체는 이필리무맙(Yervoy®)과 같이, CTLA-4을 표적화하는 제제와 조합될 수 있는 것으로 예상된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 항-CD28/항-MUC16 이중특이적 항원-결합 분자를 사용하여 MUC16를 발현하는 종양 세포를 표적화/사멸화하기 위한 치료 방법을 제공하며, 여기서 상기 항-CD28/항-MUC16 이중특이적 항원-결합 분자는 CD3에 결합하는 다른 항-종양 이중특이적 항원-결합 분자(예를 들어, 항-CD3/항-MUC16 이중특이적 항체와 조합된 항-CD28/항-MUC16) 및 PD-1, PDL-1 또는 CTLA-4을 표적화하는 체크포인트 저해제(예를 들어, 항-PD-1 항체와 조합된 항-CD28/항-MUC16)와 조합된다.
다른 구현예는 하기의 상세한 설명의 검토로부터 명백해질 것이다.
도 1은 공동-자극성 리간드 발현이 도입된 조작된 세포주에서의 종양 성장 저해를 도시하는 그래프이다. 3개의 종양 세포주, B16F10.9, EL4 및 MC38은 공동-자극성 리간드 또는 GFP를 또는 빈 벡터를 대조군으로서 발현하도록 조작되었다. 조작된 종양 세포를 C57BL/6 마우스에 주입하였다. 데이터는 평균 ± SEM을 나타낸다. 데이터는 그룹 당 다섯(5) 마리의 마우스가 있는 적어도 하나의 실험을 대표한다.
그래프는 하기와 같이 계산된 대조군의 백분율로서 종양 성장을 나타낸다.
Figure pct00001

도 2a 내지 2i는 본 발명의 예시의 항-MUC16xCD28이 내생적 MUC16을 갖는 암 세포주(PEO1) 및 항-MUC16xCD3에 의한 TCR 자극의 존재 하에서 T 세포 작용을 강화한다는 점을 도시하는 개략도 및 그래프이다. 도 2b 내지 2e는 인간 PBMC에 대한 데이터를 도시하는 그래프이다. 도 2f 내지 2h는 시노몰구스 원숭이 PBMC에 대한 데이터를 도시하는 그래프이다. 인간 T 세포(도 2b 내지 2e의 경우) 또는 시노몰구스 T 세포(도 2f 내지 2h의 경우)는 내생성 MUC16 발현이 있는 암 표적 세포(난소암주 PEO-1) 및 지시된 이중특이적 항체와 함께 96시간 동안 배양되었다.
도 2a는 검정법 설정의 개략도이다.
도 2b는 종양 세포의 사멸화를 도시하는 그래프이다. Y축의 값은 생존 가능한 PEO1 세포의 백분율을 지칭한다.
도 2c는 IFNγ 방출을 도시하는 그래프이다.
도 2d는 CD4 T 세포 카운트, 및 CD4 T 세포에서 CD25+ 세포의 백분율로서 나타내어진 CD25+ 세포의 빈도를 도시하는 그래프이다.
도 2e는 CD8 T 세포 카운트, 및 CD8 T 세포에서 CD25+ 세포의 백분율로서 나타내어진 CD25+ 세포의 빈도를 도시하는 그래프이다.
도 2f는 종양 세포의 사멸화를 도시하는 그래프이다. Y축의 값은 생존 가능한 PEO1 세포의 백분율을 지칭한다.
도 2g는 CD4 T 세포 카운트, 및 CD4 T 세포에서 CD25+ 세포의 백분율로서 나타내어진 CD25+ 세포의 빈도를 도시하는 그래프이다.
도 2h는 CD4 T 세포 카운트 및 CD8 T 세포 카운트 및 CD4 T 세포 및 CD8 T 세포에서 CD25+ 세포의 백분율로서 나타내어진 CD25+ 세포의 빈도를 도시하는 그래프이다.
도 2i는 유세포분석법에 의해 측정된, 세포성 표적으로의 항체 결합을 도시하는 그래프이다.
도 3a-3c는 본 발명의 예시적 항-MUC16xCD28 이중특이적 항체가 항-MUC16xCD3 유도된 T 세포 활성화에 의한 항-종양 면역성을 증강시킨다는 점을 보여주는 그래프이다.
도 3a는 시간에 따른 평균 라디언스(radiance)(평균 라디언스 [p/s/cm2/sr])에 의해 측정된 바와 같은 종양 부담(burden)을 도시하는 그래프이다. 그 값은 그룹 중앙값 플러스 범위를 나타낸다. P 값은 각 시점에서 Mann Whitney 시험으로 산출되었다. *, p<0.05 또는 **, p<0.01 (MUC16xCD3 및 EGFRvIIIxCD3 비교). ##, p<0.01 (MUC16xCD3 + MUC16xCD28 및 EGFRvIIIxCD3 비교). 인간 PBMC 생착 NSG 마우스는 복강내 주사로써 OVCAR3-Luc가 이식되었다. 마우스에 제5일 및 제8일(화살표)에 IV로 투약하였다. 마우스는 2.5 μg MUC16xCD3 또는 2.5 μg EGFRvIIIxCD3를 수여받았다. 마우스 중 일부는 또한 MUC16xCD28를 100 μg 투여받았다. 종양 부담은, 시간에 따른 생물발광을 모니터링함으로써 종양 이식 후 제4일, 제8일, 제12일, 제15일, 제20일 및 제25일에 BLI에 의해 평가되었다. N= 그룹당 5 마리의 마우스
도 3b는 도 3a에 도시된 동일한 실험에서 첫번째 투여 후 4시간째에 수득한 혈액의 혈청 사이토카인 수준을 도시하는 그래프를 제공한다. P 값은 1-원 ANOVA(owo-way ANOVA)로 계산되었다. ##, p<0.01 또는 ####, p<0.0001 (MUC16xCD3 + MUC16xCD28 및 EGFRvIIIxCD3 비교). @@@, p<0.005 (MUC16xCD3 + MUC16xCD28 및 MUC16xCD3 비교). ^, p<0.01, ^^, p<0.005, ^^^^P<0.0001 (MUC16xCD3 + MUC16xCD28 및 EGFRvIIIxCD3 + MUC16xCD28 비교).
도 3c는 제26일에 혈청 내 CA-125 수준에 대한 종양 부담 및 상관관계를 도시하는 그래프를 제공한다. N=도 3a에 도시된 동일 실험으로부터의 그룹당 5 마리의 마우스.
도 4a는 시간에 따른 평균 라디언스(평균 라디언스 [p/s/cm2/sr])에 의해 측정된 바와 같은 종양 부담을 도시하는 그래프이다. 그 값은 그룹 중앙값 플러스 범위를 나타낸다. P 값은 각 시점에서 Mann Whitney 시험으로 산출되었다. **, p<0.01 (MUC16xCD3 및 EGFRvIIIxCD3 비교). ##, p<0.01 (MUC16xCD3 + MUC16xCD28 및 EGFRvIIIxCD3 비교). @, p<0.05 (MUC16xCD3 + MUC16xCD28 및 MUC16xCD3 비교). 인간 PBMC 생착 NSG 마우스는 복강내 주사로써 OVCAR3-Luc가 이식되었다. 마우스를 IV로 0.5 mg/kg MUC16xCD3 또는 0.5 mg/kg EGFRvIIIxCD3로 처리하였다. 마우스 중 일부는 또한 MUC16xCD28를 0.2mg/kg로 제5일 및 제8일(화살표)에 투여받았다. 종양 부담은, 시간에 따른 생물발광을 모니터링함으로써 종양 이식 후 제4일, 제8일, 제11일, 제14일, 제21일, 제28일 및 제34일에 BLI에 의해 평가되었다. N= 그룹당 5 또는 6 마리의 마우스
도 4b는 도 4a에 도시된 동일한한 실험에서 첫번째 투여 후 4시간째에 수득한 혈액의 혈청 사이토카인 수준을 도시하는 그래프를 제공한다. P 값은 1-원 ANOVA로 계산되었다. *, p<0.05 (MUC16xCD3 및 EGFRvIIIxCD3 비교) ##, p<0.01 또는 ###, p<0.001 또는 ####, p<0.0001 (MUC16xCD3 + MUC16xCD28 및 EGFRvIIIxCD3 비교). @, p<0.05 또는 @@@@, p<0.0001 (MUC16xCD3 + MUC16xCD28 및 MUC16xCD3 비교). ^^, p<0.001 또는 ^^^P<0.001 또는 ^^^P<0.0001 (MUC16xCD3 + MUC16xCD28 및 EGFRvIIIxCD3 + MUC16xCD28 비교).
도 5는 시간 경과에 따른 생존율을 도시하는 그래프이다. ID8-VEGF/hMUC16 세포를 hCD3/hCD28/hMUC16에 대한 인간화된 마우스의 복강 내로 이식하였다. 마우스를 화살표로 지시한 바와 같이 종양 이식 후 제3일, 제6일 및 제10일에, 또는 1mg/kg로 EGFRvIIIxCD3 또는 MUC16xCD3로 정맥내 치료하였다. 일부 마우스는 또한 1mg/kg의 MUC16xCD28를 투여받았다. P 값은 각 시점에서 Mantel-Cox 시험으로 산출되었다. **, p<0.01 (MUC16xCD3 및 EGFRvIIIxCD3 비교). ##, p<0.01 (MUC16xCD3 + MUC16xCD28 및 EGFRvIIIxCD3 비교). @, p<0.05 (MUC16xCD3 + MUC16xCD28 및 MUC16xCD3 비교).
도 6a는 시간 경과에 따른 종양 부피를 도시하는 그래프이다. MC38/hMUC16 종양 세포가 hCD3/hMUC16 인간화 마우스에 피하 이식되었다. 마우스를, 제0일에 시작하여 주 당 2회 지시한 바와 같이(화살표) 0.01 mg/kg의 항-MUC16xCD3, 0.5 mg/kg의 본 발명의 예시의 항-MUC16xmCD28 이중특이적 항체로 치료하였다. 종양 부피를 시간에 따라 캘리퍼 측정으로써 모니터링하였다. 나타낸 값은 평균±SEM이다. 데이터는 세가지(3) 실험을 나타낸다. N = 그룹당 7 마리의 마우스. P 값은, 이소타입 대조군과 비교하여 2원 ANOVA로 계산하였다(**, p<0.01 및 ****, P<0.0001 ( MUC16xCD3+MUC16xmCD28 및 이소타입 대조군 비교); #, p<0.05 (MUC16xCD3 및 이소타입 대조군 비교); $, p<0.05 (MUC16xmCD28 및 이소타입 대조군 비교)).
도 6b는 도 6a에 도시된 동일한 실험에서 지시된 시점에 수득한 혈액의 혈청 사이토카인 수준을 도시하는 그래프를 제공한다.
도 6c 및 도 6d는 사이토카인 수준을 도시하는 그래프이다. 제7일에서의 투약 후 4시간째에 혈청 사이토카인을 위해 마우스로부터 채혈하였다. 통계학적 유의성은 이소타입과 비교하여 1-원 ANOVA로 계산되었다 **p<0.01 및 ****p<0.0001. n=그룹당 7 마리의 마우스. 데이터는 3회의 실험을 대표한다.
도 7은 건식-코팅 또는 습식-코팅 방법을 이용하여 검정 플레이트에 MUC16xCD28을 고정시키는 것은 CD28 슈퍼작용제와 대조적으로 CD3 자극의 부재하에서 T 세포 활성화를 유도하지 않는다는 점을 나타내는 그래프이다.
도 8a 내지 8c는 MUC16xCD28 단독 또는 조합 요법이 전신 T 세포 활성화를 유도하지 않는다는 점을 나타내는 그래프이다. 시노몰구스 원숭이는 1 또는 10 mg/kg(괄호 안에 표시)의 단일 용량의 이중특이적 항체를 수여받았다. 추가적인 그룹이 반복 투여로 지시된 총 4회의 용량을 수여받았다. 투여 후 지시된 시간에(시) 채혈하였다. 도 8a: 혈청 사이토카인, 도 8b: 상대적인 T 세포 카운트 및 도 8c: Ki67+ 및 ICOS+ T 세포(CD3의 %)의 빈도를 도시한다. 데이터는 평균+/- SEM을 나타낸다. N=그룹당 3 마리의 동물. P 값은 이소타입 대조군과 비교하여 2-원 ANOVA로 계산되었다. (**, p<0.01; ***, p<0.001 및 ****, p<0.0001).
도 9a 및 9b는 MUCxCD28 및 MUC16xCD3 이중특이적 항체가 가용성 CA-125의 존재 하에서 MUC-발현 세포에 결합할 수 있음을 나타낸다. OVCAR-3 세포를, 30분 동안 4℃에서 유세포분석 완충액(PBS+1%FBS) 중, 증가하는 농도의 가용성 CA-125(도 9a) 또는 MUC16 nub(도 9b)의 존재 하에서 Alexa647로 표지된 8 nM의 지시된 항체에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포는 유세포분석 완충액으로 세척되고, 유세포분석법에 의해 분석되었다.
도 10은 T 세포/항원-제시 세포-기반 리포터 생물검정의 개략도이다.
도 11a 및 11b는 bs24963D(또한 REGN5668로 지칭됨)이MUC16을 발현하는 자극성 항원-제시 세포의 존재 하에서 조작된 T 세포에서 NF-kB 신호전달을 강화시킨다는 점을 보여준다. 요약하면, J.RT3.T3.5/NF-κB-Luc/1G4AB/hCD8αβ/hCD28 리포터 세포를, bs24963D 또는 CD28 비-가교 대조군 이중특이적 항체 (비-TAAxCD28)와, 항체 대조군이 부재한 것을 포함해 다양한 농도로(39 pM 내지 10nM), 3.33:1 리포터 세포 대 자극성 3T3 세포 비율로 3T3/hβ2M/HLA-A2/NYESO1p/hMUC16 (도 11a) 및 3T3/hβ2M/HLA-A2/NYESO1p 세포(도 11b)의 존재 하 인큐베이션하였다. NF-κB 신호전달은 루시퍼라아제 활성으로서 검출하였고, 상대적 광 단위(relative light unit; RLU)로서 보고되는 발광 신호의 정량화에 의해 측정되었다. 중복 웰에서 수행된 검정으로부터의 데이터를 평균 ± SD로서 플롯팅한다.
도 12는 bs24963D(또한, REGN5668로도 지칭됨)이 OVCAR-3 및 PEO1 표적 세포와 REGN4018의 존재 하에서(WO2017/053856A1, REGN4018인 BSMUC16/CD3-001 참조) 인간 1차 T 세포로부터 농도-의존성 IL-2 방출을 매개한다는 점을 도시한다. 요약하면, 풍부한 인간 1차 T 세포를, bs24963D 또는 CD28 비-가교 대조군 이중특이적 항체(비-TAAxCD28)와, 항체가 없는 대조군을 포함해서 다양한 농도로 (7.6pM 내지 500nM), 고정된 농도(5 nM)의 REGN4018 또는 CD3 비-가교 대조군 이중특이적 항체(비-TAAxCD3) 둘 중 하나, 및 인간 난소암 세포주 OVCAR-3 또는 PEO1의 존재 하에서, 10:1 또는 4:1의 효과기 대 표적 세포 비율로 각각 인큐베이션하였다. 데이터는 삼중 웰에서 수행된 검정의 것이며 평균± SD로 플롯팅된다. IL-2 방출을, 제조자 프로토콜에 따라 인간 IL-2 면역검정을 이용하여 측정하였다.
도 13은 bs24963D(또한, REGN5668로도 지칭됨)이 OVCAR-3 및 PEO1 표적 세포와 REGN4018의 존재 하에서 인간 1차 T 세포의 증식의 농도-의존적 향상을 매개한다는 점을 도시한다. 요약하면, 풍부한 인간 1차 T 세포를, bs24963D 또는 CD28 비-가교 대조군 이중특이적 항체(비-TAAxCD28)와 항체가 없는 대조군을 포함해서 다양한 농도로 (7.6pM 내지 500nM), 고정된 농도(5 nM)의 REGN4018 또는 CD3 비-가교 대조군 이중특이적 항체(비-TAAxCD3) 둘 중 하나 및 인간 난소암 세포주 OVCAR-3 및 PEO1의 존재 하에서 10:1 또는 4:1의 효과기 대 표적 세포 비율로 각각 인큐베이션하였다. 데이터는 삼중 웰에서 수행된 검정의 것이며 평균 ± SD로 플롯팅된다. T-세포 증식을, (분할 세포로 통합된 삼중 수소 티미딘으로부터) 삼중 수소 붕괴의 검출을 통해 측정하고, CPM으로 보고되었다.
도 14는 bs24963D(또한 REGN5668로도 지칭됨)이 농도-의존성 IL-2 방출을 매개하고, 세미플리맙의 첨가가 SW1990 및 SW1990/hPD-L1 표적 세포와 함께 인간 1차 T 세포로부터 IL-2 방출을 적당히 증가시킨다는 점을 나타낸다. 요약하면, 풍부한 인간 1차 T 세포를, bs24963D 또는 CD28 비-가교 대조군 이중특이적 항체(비-TAAxCD28)와, 항체가 없는 대조군을 비롯해서 다양한 농도로 (7.6pM 내지 500nM), 고정된 농도(20 nM)의 세미플리맙 또는 IgG4P 대조군 및 SW1990 및 SW1990/hPD-L1 인간 췌장암 세포주의 존재 하에서 2:1의 효과기 대 표적 세포 비율로 인큐베이션하였다. 데이터는 삼중 웰에서 수행된 검정의 것이며 평균 ± SD로 플롯팅된다. IL-2 방출을, 제조자 프로토콜에 따라 인간 IL-2 면역검정을 이용하여 측정하였다. 통계 분석을 2-원 ANOVA를 이용하여 수행했다. 차이는 p<0.05일 때 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. bs24963D + 세미플리맙이 SW1990/hPD-L1 세포에서 REGN5668 + IgG4P 대조군과 비교 시 IL-2 방출에서 통계적으로 유의한 증가를 보여주었다(p<0.0001).
도 15는 bs24963D(또한 REGN5668로도 지칭됨)이 농도-의존성 증식 향상을 매개하고, 세미플리맙의 첨가가 SW1990 및 SW1990/hPD-L1와 함께 인간 1차 T 세포의 증식을 적당히 증가시킨다는 점을 나타낸다. 요약하면, 풍부한 인간 1차 T 세포를, bs24963D 또는 CD28 비-가교 대조군 이중특이적 항체(비-TAAxCD28)와, 항체가 없는 대조군을 비롯해서 다양한 농도로 (7.6pM 내지 500nM), 고정된 농도(20 nM)의 세미플리맙 또는 IgG4P 대조군 및 SW1990 및 SW1990/hPD-L1 인간 췌장암 세포주의 존재 하에서 2:1의 효과기 대 표적 세포 비율로 인큐베이션하였다. 데이터는 삼중 웰에서 수행된 검정의 것이며 평균 ± SD로 플롯팅된다. T-세포 증식을, (분할 세포로 통합된 삼중 수소 티미딘으로부터) 삼중 수소 붕괴의 검출을 통해 측정하고, CPM으로 보고되었다. 통계 분석을 2-원 ANOVA를 이용하여 수행했다. 차이는 p<0.05일 때 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. bs24963D + 세미플리맙이 SW1990/hPD-L1 세포에서 bs24963D + IgG4P 대조군과 비교 시 증식에서 통계적으로 유의한 증가를 보여주었다(p<0.0001).
본 방법이 설명되기 전에, 본 발명은 기재된 특정 방법 및 실험 조건으로 제한되지 않으며, 이러한 방법 및 조건이 달라질 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이기 때문에, 본원에 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 설명하는 목적을 위한 것이며, 제한하려는 의도는 아님을 이해해야 한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자가 일반적으로 이해하고 있는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 특정한 나열된 수치에 관하여 사용될 때, 그 값이 나열된 값과 1% 이하만큼 달라질 수 있음을 의미한다. 예를 들어 본원에 사용된 바와 같이, 표현 "약 100"은 99과 101 및 그 사이의 모든 값(예를 들어, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4 등)을 포함한다.
본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실행 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질은 이제 설명된다. 본 명세서에 언급된 모든 특허, 출원 및 비-특허 공개는 그 전문이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
정의
본원에 사용된 바와 같이, 표현 "CD28"은 T 세포 상에서 공동자극성 수용체로서 발현되는 항원을 지칭한다. 인간 CD28은 SEQ ID NO: 50에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고/하거나 NCBI 기탁 번호 NP_006130.1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다. 마우스 Fc를 가진 인간 CD28 엑토 도메인(N19-P152)은 SEQ ID NO: 52에 나타낸다. myc-myc-his 태그를 가진 인간 CD28 엑토 도메인(N19-P152)은 SEQ ID NO: 53에 나타낸다. 본원에서 단백질, 폴리펩타이드 및 단백질 단편에 대한 모든 지칭은 비-인간 종으로부터 유래된 것으로 분명하게 명시되지 않는 한, 각각의 단백질, 폴리펩타이드 또는 단백질 단편의 인간 버전을 지칭하고자 한다. 그러므로, 표현 "CD28"은 비-인간 종, 예를 들어, "마우스 CD28", "원숭이 CD28" 등으로부터 유래된 것으로 명시되지 않는 한, 인간 CD28을 의미한다. myc-myc-his 태그를 가진 마우스 CD28 엑토 도메인(기탁 번호 NP_031668.3)은 SEQ ID NO: 54에 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, "CD28에 결합하는 항체" 또는 "항-CD28 항체"는 단량체성 CD28을 특이적으로 인식하는 항체 및 이의 항원-결합 단편, 뿐만 아니라 이량체성 CD28을 특이적으로 인식하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 본 발명의 항체 및 이의 항원-결합 단편은 가용성 CD28 및/또는 세포 표면 발현된 CD28에 결합할 수 있다. 가용성 CD28은, 막관통 도메인이 결여되어 있거나 다르게는 세포막과 해리된, 천연 CD28 단백질뿐만 아니라 재조합 CD28 단백질 변이체, 예컨대 단량체성 및 이량체성 CD28 구축물을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 표현 "세포 표면-발현된 CD28"은 CD28 단백질의 적어도 일부가 세포막의 세포외 측면에 노출되고 항체의 항원-결합 부분에 대해 접근 가능하도록 시험관내에서 또는 생체내에서 세포 표면 상에서 발현된 하나 이상의 CD28 단백질(들)을 의미한다. "세포 표면-발현된 CD28"은 세포의 막에서 기능성 T 세포 공동자극성 수용체의 맥락 내에 함유된 CD28 단백질을 포함한다. 표현 "세포 표면-발현된 CD28"은 세포 표면 상에서 동종이량체의 부분으로서 발현된 CD28 단백질을 포함한다. "세포 표면-발현된 CD28"은 CD28 단백질을 정상적으로 발현하는 세포 표면 상에서 발현된 CD28 단백질을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 대안적으로, "세포 표면-발현된 CD28"은 세포 표면 상에서 인간 CD28을 정상적으로 발현하지는 않지만 세포 표면 상에서 CD28을 발현하도록 인공적으로 조작된 세포의 표면 상에서 발현된 CD28 단백질을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 표현 "항-CD28 항체"는 단일 특이성을 갖는 1가 항체, 뿐만 아니라 CD28에 결합하는 제1 아암(arm) 및 제2(표적) 항원에 결합하는 제2 아암을 포함하는 이중특이적 항체 둘 다 포함하며, 여기서, 항-CD28 아암은 본원의 표 3에 제시된 바와 같은 임의의 HCVR/LCVR 또는 CDR 서열을 포함한다. 항-CD28 이중특이적 항체의 예는 본원 어디에나 기재되어 있다. 용어 "항원-결합 분자"는, 예를 들어 이중특이적 항체를 포함하는 항체 및 항체의 항원-결합 단편을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "MUC16"는 비-인간 종으로부터 유래된 것(예를 들어, "마우스 MUC16", "원숭이 MUC16" 등)으로 명시되지 않는 한 인간 MUC16 단백질을 지칭한다. 인간 MUC16 단백질은 SEQ ID NO: 49에 제시된 아미노산 서열을 포함하고/하거나 NCBI 기탁 번호 NP_078966에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다. myc-myc-his 태그를 가진 인간 MUC16 막 근위부 도메인 (P13810-P14451)은 SEQ ID NO: 51에 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "MUC16에 결합하는 항체" 또는 "항-MUC16 항체"는 가용성 MUC16 및/또는 세포 표면 발현된 MUC16에 결합할 수 있는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 가용성 MUC16은, 막관통 도메인이 결여되어 있거나 다르게는 세포막과 해리된, 천연 MUC16 단백질뿐만 아니라 재조합 MUC16 단백질 변이체, 예컨대 예를 들어 MUC16 구축물을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 표현 "항-MUC16 항체"는 단일 특이성을 갖는 1가 항체, 뿐만 아니라 MUC16에 결합하는 제1 아암(arm) 및 제2(표적) 항원에 결합하는 제2 아암을 포함하는 이중특이적 항체 둘 다 포함하며, 여기서 항-MUC16 아암은 본원의 표 1에 제시된 바와 같은 임의의 HCVR/LCVR 또는 CDR 서열을 포함한다. 항-MUC16 이중특이적 항체의 예는 본원 어디에나 기재되어 있다. 용어 "항원-결합 분자"는, 예를 들어, 이중특이적 항체를 포함하는 항체 및 항체의 항원-결합 단편을 포함한다.
용어 "항원-결합 분자"는, 예를 들어, 이중특이적 항체를 포함하는 항체 및 항체의 항원-결합 단편을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 특정 항원(예를 들어, CD28)에 특이적으로 결합하거나 이와 상호작용하는 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 임의의 항원-결합 분자 또는 분자 복합체를 의미한다. 용어 "항체"는 이황화 결합에 의해 상호-연결된 4개의 폴리펩타이드 사슬인 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함하는 면역글로불린 분자, 뿐만 아니라 이의 다량체(예를 들어, IgM)를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 HCVR 또는 VH로 약칭) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 LCVR 또는 VL로 약칭) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인(CL1)을 포함한다. VH 및 VL 영역은, 프레임워크 영역(FR)이라고 하는 보다 보존된 영역이 개재된(interspersed), 상보성 결정 영역(CDR)이라고 하는 초가변 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단부터 카르복시-말단까지 하기 순서: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어진다. 본 발명의 상이한 구현예에서, 항-CD28 및/또는 항-MUC16 항체(또는 이들의 항원-결합 부분)의 FR은 인간 생식계열 서열과 동일할 수 있거나, 천연적으로 또는 인공적으로 변형될 수 있다. 아미노산 공통(consensus) 서열은 2개 이상의 CDR의 병렬 분석에 기초하여 정의될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 또한, 완전(full) 항체 분자의 항원-결합 단편을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 항체의 "항원-결합 부분", 항체의 "항원-결합 단편" 등은 항원에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하는 임의의 천연적으로 발생하는, 효소적으로 수득 가능한, 합성적인, 또는 유전적으로 조작된 폴리펩타이드 또는 당단백질을 포함한다. 항체의 항원-결합 단편은 예를 들어, 단백분해 절단(proteolytic digestion)과 같은 임의의 적합한 표준 기법, 또는 항체 가변 및 선택적으로 불변 도메인을 인코딩하는 DNA의 조작 및 발현을 수반하는 재조합 유전공학적 기법을 사용하여 완전 항체 분자로부터 유래될 수 있다. 이러한 DNA는 알려져 있고/있거나, 예를 들어 상업적인 출처인 DNA 라이브러리(예를 들어, 파지-항체 라이브러리 포함)로부터 용이하게 입수 가능하거나, 합성될 수 있다. DNA는, 예를 들어, 하나 이상의 가변 도메인 및/또는 불변 도메인을 적합한 구성(configuration)으로 배열시키기 위해, 또는 코돈을 도입하기 위해, 시스테인 잔기를 생성하기 위해, 아미노산을 변형, 첨가 또는 결실시키는 등을 수행하기 위해 화학적으로 또는 분자생물학 기법을 사용함으로써 시퀀싱되고, 조작될 수 있다.
항원-결합 단편의 비제한적인 예는: (i) Fab 단편; (ii) F(ab')2 단편; (iii) Fd 단편; (iv) Fv 단편; (v) 단쇄 Fv(scFv) 분자; (vi) dAb 단편; 및 (vii) 항체의 초가변 영역을 모방하는 아미노산 잔기로 구성된 최소 인식 단위(예를 들어, 단리된 상보성 결정 영역(CDR), 예컨대 CDR3 펩타이드) 또는 구속형(constrained) FR3-CDR3-FR4 펩타이드를 포함한다. 다른 조작된 분자, 예컨대 도메인-특이적 항체, 단일 도메인 항체, 도메인-결실 항체, 키메라 항체, CDR-이식 항체, 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody), 미니바디(minibody), 나노바디(nanobody)(예를 들어, 1가 나노바디, 2가 나노바디 등), 소형 모듈식 면역약제(SMIP; small modular immunopharmaceutical), 및 상어 가변 IgNAR 도메인이 또한, 본원에 사용된 바와 같은 표현 "항원-결합 단편" 내에 포괄된다.
항체의 항원-결합 단편은 전형적으로 적어도 하나의 가변 도메인을 포함할 것이다. 가변 도메인은 임의의 크기 또는 아미노산 조성을 가질 수 있고, 일반적으로 하나 이상의 프레임워크 서열에 인접하거나 이와 프레임을 맞춘 적어도 하나의 CDR을 포함할 것이다. VL 도메인과 회합된 VH 도메인을 갖는 항원 결합 단편에서, VH 도메인 및 VL 도메인은 서로에 대해 임의의 적합한 배열로 배치될 수 있다. 예를 들어, 가변 영역은 이량체성일 수 있고 VH-VH, VH-VL 이량체 또는 VL-VL 이량체를 함유할 수 있다. 대안적으로, 항체의 항원-결합 단편은 단량체성 VH 도메인 또는 VL 도메인을 함유할 수 있다.
소정의 구현예에서, 항체의 항원-결합 단편은 적어도 하나의 불변 도메인에 공유 연결된 적어도 하나의 가변 도메인을 함유할 수 있다. 본 발명의 항체의 항원-결합 단편 내에서 발견될 수 있는 가변 도메인 및 불변 도메인의 비제한적인 예시적인 구성은 (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2-CH3; (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (x) VL-CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; 및 (xiv) VL-CL을 포함한다. 상기 나열된 임의의 예시적인 구성을 비롯한 가변 도메인 및 불변 도메인의 임의의 구성에서, 가변 도메인 및 불변 도메인은 서로 직접 연결될 수 있거나, 완전 또는 부분 힌지 또는 링커 영역에 의해 연결될 수 있다. 힌지 영역은 단일 폴리펩타이드 분자에서 인접한 가변 도메인 및/또는 불변 도메인 사이의 가요성 또는 반-가요성 연결을 초래하는, 적어도 2개(예를 들어, 5, 10, 15, 20, 40 또는 60개 이상)의 아미노산으로 구성될 수 있다. 더욱이, 항원-결합 단편은 서로 및/또는 하나 이상의 단량체성 VH 도메인 또는 VL 도메인과 (예를 들어, 이황화 결합(들)에 의해) 비-공유 회합된 상기 나열된 임의의 가변 도메인 및 불변 도메인 구성의 동종이량체 또는 이종이량체(또는 다른 다량체)를 포함할 수 있다.
완전 항체 분자와 마찬가지로, 항원-결합 단편은 단일특이적 또는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)일 수 있다. 항체의 다중특이적 항원-결합 단편은 전형적으로, 적어도 2개의 상이한 가변 도메인을 포함할 것이며, 여기서 각각의 가변 도메인은 별개의 항원에, 또는 동일한 항원 상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 본원에 개시된 예시적인 이중특이적 항체 형식을 포함한 임의의 다중특이적 항체 형식은 본 발명의 항체의 항원-결합 단편의 맥락에서 사용하기 위해 당업계에서 이용 가능한 일상적인 기법을 사용하여 개조될 수 있다.
본 발명의 항체는 보체-의존적 세포독성(CDC) 또는 항체-의존적 세포-매개 세포독성(ADCC)을 통해 작용할 수 있다. "보체-의존적 세포독성"(CDC)은 보체의 존재 하에 본 발명의 항체에 의한 항원-발현 세포의 용해를 지칭한다. "항체-의존적 세포-매개 세포독성"(ADCC)은 Fc 수용체(FcR)를 발현하는 비특이적 세포독성 세포(예를 들어, 자연 살해(NK: Natural Killer) 세포, 호중구 및 대식세포)가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인식하고, 이로써 표적 세포의 용해를 유발하는 세포-매개 반응을 지칭한다. CDC 및 ADCC는 잘 알려져 있고 당업계에서 이용 가능한 검정법을 사용하여 측정될 수 있다. (예를 들어, 미국 특허 제5,500,362호 및 제5,821,337호, 및 문헌[Clynes 등, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:652- 656] 참조). 항체의 불변 영역은 보체를 고정시키고 세포-의존적 세포독성을 매개하는 항체의 능력에 있어서 중요하다. 그러므로, 항체의 이소타입은 세포독성을 매개하기 위해 그것이 항체에 대해 바람직한지의 여부에 기초하여 선택될 수 있다.
본 발명의 소정의 구현예에서, 본 발명의 항-CD28 및/또는 항-MUC16 항체(단일특이적 또는 다중특이적)는 인간 항체이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "인간 항체"는 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하고자 한다. 본 발명의 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 인코딩되지 않는 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관내에서 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이발생에 의해 또는 생체내에서 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 예를 들어 CDR, 특히 CDR3에 포함할 수 있다. 그러나, 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "인간 항체"는 또 다른 포유류 종, 예컨대 마우스의 생식계열로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 상에 이식되어 있는 항체를 포함하지 않고자 한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 재조합 인간 항체일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "재조합 인간 항체"는, 숙주 세포 내로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체(하기에 추가로 기재됨), 재조합, 조합적 항체 라이브러리로부터 단리된 항체(하기에 추가로 기재됨), 인간 면역글로불린 유전자에 대해 유전자이식(transgenic)인 동물(예를 들어 마우스)로부터 단리된 항체(예를 들어 문헌[Taylor 등(1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295] 참조) 또는 다른 DNA 서열로의 인간 면역글로불린 유전자 서열의 스플라이싱을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체와 같이 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 인간 항체를 포함하고자 한다. 이러한 재조합 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역 및 불변 영역을 갖는다. 그러나 소정의 구현예에서, 이러한 재조합 인간 항체는 시험관내 돌연변이발생(또는 인간 Ig 서열에 대한 유전자이식 동물이 사용되는 경우, 생체내 체세포 돌연변이발생)을 받고, 그러므로, 재조합 항체의 VH 영역 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 인간 생식계열 VH 서열 및 VL 서열로부터 유래되고 이와 관련이 있는 한편 생체내에서 인간 항체 생식계열 레파토리 내에서 천연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다.
인간 항체는 힌지 이종성(heterogeneity)과 관련된 2가지 형태로 존재할 수 있다. 제1 형태에서, 면역글로불린 분자는 약 150 kDa 내지 160 kDa의 안정한 4개 사슬 구축물을 포함하며, 이러한 구축물 내에서 이량체는 사슬간 중쇄 이황화 결합에 의해 함께 고정된다. 제2 형태에서, 이량체는 사슬간 이황화 결합을 통해 연결되지 않고, 공유 결합된 경쇄 및 중쇄로 이루어진 약 75 kDa 내지 80 kDa의 분자(반(half)-항체)가 형성된다. 이들 형태는 친화성 정제 후에도 분리하기가 극히 어려웠다.
다양한 온전한 IgG 이소타입에서 제2 형태의 출현 빈도는 항체의 힌지 영역 이소타입과 관련된 구조적 차이로 인한 것이지만 이로 한정되는 것은 아니다. 인간 IgG4 힌지의 힌지 영역에서의 단일 아미노산 치환은 제2 형태(문헌[Angal 등 (1993) Molecular Immunology 30:105])의 출현을, 인간 IgG1 힌지를 사용하여 전형적으로 관찰되는 수준까지 유의하게 감소시킬 수 있다. 본 발명은 요망되는 항체 형태의 수율을 향상시키기 위해 예를 들어, 생성 시에 바람직할 수 있는 하나 이상의 돌연변이를 힌지, CH2 또는 CH3 영역에 갖는 항체를 포괄한다.
본 발명의 항체는 단리된 항체일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "단리된 항체"는 이의 천연 환경의 적어도 하나의 구성요소로부터 식별되고 분리되고/되거나 회수된 항체를 의미한다. 예를 들어, 유기체의 적어도 하나의 구성요소로부터, 또는 항체가 천연적으로 존재하거나 천연적으로 생성되는 조직 또는 세포로부터 분리되거나 제거된 항체는 본 발명의 목적을 위한 "단리된 항체"이다. 단리된 항체는 또한, 재조합 세포 내에서 인 시추(in situ) 항체를 포함한다. 단리된 항체는 적어도 하나의 정제 또는 단리 단계를 받은 항체이다. 소정의 구현예에 따르면, 단리된 항체에는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다.
본 발명은 또한, CD28 및/또는 MUC16에 결합하는 1-아암 항체를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "1-아암 항체"는 단일 항체 중쇄 및 단일 항체 경쇄를 포함하는 항원-결합 분자를 의미한다. 본 발명의 1-아암 항체는 표 1 및 표 3에 제시된 바와 같은 임의의 HCVR/LCVR 또는 CDR 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본원에서 항-CD28 및/또는 항-MUC16 항체 또는 이의 항원-결합 도메인은, 항원-결합 단백질 또는 항원-결합 도메인이 유래된 상응하는 생식계열 서열과 비교하여, 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인의 프레임워크 및/또는 CDR 영역에 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함할 수 있다. 이러한 돌연변이는, 본원에 개시된 아미노산 서열을 예를 들어, 공개된 항체 서열 데이터베이스로부터 입수 가능한 생식계열 서열과 비교함으로써 용이하게 확인될 수 있다. 본 발명은 본원에 개시된 임의의 아미노산 서열로부터 유래된 항체 및 이의 항원-결합 도메인을 포함하고, 여기서, 하나 이상의 프레임워크 및/또는 CDR 영역 내의 하나 이상의 아미노산은, 상기 항체가 유래된 생식계열 서열의 상응하는 잔기(들)로, 또는 또 다른 인간 생식계열 서열의 상응하는 잔기(들)로, 또는 상응하는 생식계열 잔기(들)의 보존적 아미노산 치환으로 돌연변이된다(이러한 서열 변화는 본원에서 종합적으로 "생식계열 돌연변이"로 지칭됨). 당업자는, 본원에 개시된 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열로 시작하여, 하나 이상의 개별적인 생식계열 돌연변이 또는 이의 조합을 포함하는 수많은 항체 및 항원-결합 단편을 용이하게 생성할 수 있다. 소정의 구현예에서, VH 도메인 및/또는 VL 도메인 내의 모든 프레임워크 및/또는 CDR 잔기는, 상기 항체가 유래된 원래의 생식계열 서열에서 발견되는 잔기로 역돌연변이된다. 다른 구현예에서, 단지 소정의 잔기, 예를 들어, FR1의 처음 8개 아미노산 내에서 또는 FR4의 마지막 8개 아미노산 내에서 발견되는 돌연변이된 잔기, 또는 CDR1, CDR2 또는 CDR3 내에서 발견되는 돌연변이된 잔기만 원래의 생식계열 서열로 역돌연변이된다. 다른 구현예에서, 프레임워크 및/또는 CDR 잔기(들) 중 하나 이상은 상이한 생식계열 서열(즉, 항체가 원래 유래된 생식계열 서열과 상이한 생식계열 서열)의 상응하는 잔기(들)로 돌연변이된다. 더욱이, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 도메인은 프레임워크 및/또는 CDR 영역 내에서 2개 이상의 생식계열 돌연변이의 임의의 조합을 함유할 수 있고, 예를 들어, 소정의 개별 잔기는 특정 생식계열 서열의 상응하는 잔기로 돌연변이되는 한편, 원래의 생식계열 서열과 상이한 소정의 다른 잔기는 유지되거나 상이한 생식계열 서열의 상응하는 잔기로 돌연변이된다. 하나 이상의 생식계열 돌연변이를 함유하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 일단 수득되면, 하나 이상의 요망되는 특성, 예컨대 향상된 결합 특이성, 증가된 결합 친화도, 향상되거나 증강된 길항제성 또는 작용제성 생물학적 특성(경우에 따라), 감소된 면역원성 등에 대해 용이하게 시험될 수 있다. 이러한 일반적인 방식으로 수득된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 본 발명 내에 포괄된다.
본 발명은 또한, 본원에 개시된 임의의 HCVR, LCVR 및/또는 CDR 아미노산 서열의 변이체를 포함하는 항-CD28 및/또는 MUC16 항체 및 항원-결합 분자를 포함한다. 본 발명의 이러한 양태 내에 포함된 예시적인 변이체는, 하나 이상의 보존적 치환을 갖는 본원에 개시된 임의의 HCVR, LCVR 및/또는 CDR 아미노산 서열의 변이체를 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 본원의 표 3에 제시된 임의의 HCVR, LCVR 및/또는 CDR 아미노산 서열에 비해 예를 들어, 10개 이하, 8개 이하, 6개 이하 또는 4개 이하 등의 보존적 아미노산 치환을 갖는 HCVR, LCVR 및/또는 CDR 아미노산 서열을 갖는 항-CD28 항체 및 항원-결합 도메인을 포함한다.
용어 "에피토프"는 파라토프로 알려진 항체 분자의 가변 영역 내 특이적인 항원 결합 부위와 상호작용하는 항원 결정기를 지칭한다. 단일 항원은 하나 초과의 에피토프를 가질 수 있다. 그러므로, 상이한 항체는 항원 상의 상이한 영역에 결합할 수 있고, 상이한 생물학적 효과를 가질 수 있다. 에피토프는 형태적(conformational) 또는 선형일 수 있다. 형태적 에피토프는 선형 폴리펩타이드 사슬의 상이한 분절로부터 공간적으로 병치된 아미노산에 의해 생성된다. 선형 에피토프는 폴리펩타이드 사슬에서 인접한 아미노산 잔기에 의해 생성된 에피토프이다. 소정의 상황에서, 에피토프는 항원 상에 당류, 포스포릴기 또는 설포닐기의 모이어티를 포함할 수 있다.
핵산 또는 이의 단편을 지칭할 때 용어 "실질적인 동일성" 또는 "실질적으로 동일한"은, 적절한 뉴클레오타이드 삽입 또는 결실을 동반하여 또 다른 핵산(또는 이의 상보적 가닥)과 최적으로 정렬될 때, 하기에 논의된 바와 같이 FASTA, BLAST 또는 Gap과 같은 임의의 잘 알려진 서열 동일성 알고리즘에 의해 측정된 바와 같이, 뉴클레오타이드 염기의 적어도 약 95%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 96%, 97%, 98% 또는 99%에서 뉴클레오타이드 서열 동일성이 존재함을 나타낸다. 기준 핵산 분자와 실질적인 동일성을 갖는 핵산 분자는, 소정의 경우에, 기준 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드와 동일하거나 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩할 수 있다.
폴리펩타이드에 적용된 바와 같이, 용어 "실질적인 유사성" 또는 "실질적으로 유사한"은, 2개의 펩타이드 서열이, 예컨대 디폴트 갭 중량을 사용하여 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해 최적으로 정렬될 때, 적어도 95%의 서열 동일성, 보다 더 바람직하게 적어도 98% 또는 99%의 서열 동일성을 공유함을 의미한다. 바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 달라진다. "보존적 아미노산 치환"은, 아미노산 잔기가 유사한 화학적 특성(예를 들어, 전하 또는 소수성)을 갖는 측쇄(R기)를 갖는 또 다른 아미노산 잔기에 의해 치환되는 것이다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 기능적 특성을 실질적으로 변화시키지 않을 것이다. 2개 이상의 아미노산 서열이 보존적 치환에 의해 서로 달라지는 경우, 서열 동일성의 백분율 또는 유사성의 정도는 치환의 보존적 성질을 교정하기 위해 상향 조정될 수 있다. 이러한 조정을 수행하기 위한 수단은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331]을 참조한다. 유사한 화학적 특성을 갖는 측쇄를 가진 아미노산 그룹의 예는, (1) 지방족 측쇄: 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신; (2) 지방족-하이드록실 측쇄: 세린 및 트레오닌; (3) 아미드-함유 측쇄: 아스파라긴 및 글루타민; (4) 방향족 측쇄: 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판; (5) 염기성 측쇄: 라이신, 아르기닌 및 히스티딘; (6) 산성 측쇄: 아스파르테이트 및 글루타메이트, 및 (7) 황-함유 측쇄: 시스테인 및 메티오닌을 포함한다. 바람직한 보존적 아미노산 치환 그룹은, 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 라이신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루타메이트-아스파르테이트 및 아스파라긴-글루타민이다. 대안적으로, 보존적 대체는 문헌[Gonnet 등 (1992) Science 256: 1443-1445]에 개시된 PAM250 로그-유사 행렬에서 양의 값을 갖는 임의의 변화이다. "적당한 보존적" 대체는 PAM250 로그-유사 행렬에서 음이 아닌 값을 갖는 임의의 변화이다.
서열 동일성으로도 지칭되는 폴리펩타이드에 대한 서열 유사성은 전형적으로 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 측정된다. 단백질 분석 소프트웨어는 보존적 아미노산 치환을 포함한 다양한 치환, 결실 및 다른 변형에 할당된 유사성 척도를 사용하여 유사한 서열을 매칭시킨다. 예를 들어, GCG 소프트웨어는 상이한 유기체 종으로부터의 상동성 폴리펩타이드와 같은 밀접하게 관련된 폴리펩타이드 사이의, 또는 야생형 단백질과 이의 뮤테인(mutein) 사이의 서열 상동성 또는 서열 동일성을 결정하기 위해 디폴트 매개변수와 함께 사용될 수 있는 Gap 및 Bestfit과 같은 프로그램을 포함한다. 예를 들어, GCG 버전 6.1을 참조한다. 폴리펩타이드 서열은 또한, 디폴트 또는 권장된 매개변수를 사용하는, GCG 버전 6.1의 프로그램인 FASTA를 사용하여 비교될 수 있다. FASTA(예를 들어, FASTA2 및 FASTA3)는 쿼리 및 서치 서열(상기 Pearson, 2000) 사이의 최적의 중첩 영역의 정렬 및 서열 동일성 백분율을 제공한다. 본 발명의 서열을 상이한 유기체로부터의 다수의 서열을 포함하는 데이터베이스와 비교할 때 또 다른 바람직한 알고리즘은 디폴트 매개변수를 사용하는 컴퓨터 프로그램 BLAST, 특히 BLASTP 또는 TBLASTN이다. 예를 들어, 문헌[Altschul 등 (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410] 및 문헌[Altschul 등 (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402]를 참조한다.
이중특이적 항원-결합 분자
본 발명의 항체는 단일특이적, 이중특이적, 또는 다중특이적일 수 있다. 다중특이적 항체는 하나의 표적 폴리펩타이드의 상이한 에피토프에 특이적일 수 있거나, 하나 초과의 표적 폴리펩타이드에 특이적인 항원-결합 도메인을 함유할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Tutt 등, 1991, J. Immunol. 147:60-69]; [Kufer 등, 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244]를 참조한다. 본 발명의 항-CD28 및/또는 항-MUC16 항체는 또 다른 기능성 분자, 예를 들어 또 다른 펩타이드 또는 단백질에 연결되거나 이와 함께 공동-발현될 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 이의 단편은 하나 이상의 다른 분자 독립체(entity)에, 예컨대 또 다른 항체 또는 항체 단편에 (예를 들어, 화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유 회합 또는 기타에 의해) 기능적으로 연결되어, 제2 결합 특이성을 갖는 이중-특이적 항체 또는 다중-특이적 항체를 생성할 수 있다.
본원의 표현 "항-CD28 항체" 및/또는 "항-MUC16 항체"의 사용은 단일특이적 항-CD28 항체 및/또는 항-MUC16 항체, 뿐만 아니라 CD28-결합 아암 또는 MUC16-결합 아암 및 표적 항원에 결합하는 제2 아암을 포함하는 이중특이적 항체를 포함하고자 한다. 그러므로, 본 발명은 이중특이적 항체를 포함하며, 여기서, 면역글로불린의 하나의 아암은 인간 CD28 또는 MUC16에 결합하고, 면역글로불린의 다른 아암은 표적 항원에 특이적이다. CD28 또는 MUC16 이중특이적 항체의 다른 아암이 결합하는 표적 항원은, 표적화된 면역 반응이 요망되는 세포, 조직, 기관, 미생물 또는 바이러스 상에서 또는 그 주변에서 발현되는 임의의 항원일 수 있다. CD28-결합 아암은 본원의 표 3에 제시된 바와 같은 임의의 HCVR/LCVR 또는 CDR 아미노산 서열을 포함할 수 있다. MUC16-결합 아암은 본원의 표 1에 제시된 바와 같은 임의의 HCVR/LCVR 또는 CDR 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 소정의 구현예에서, CD28-결합 아암은 인간 CD28에 결합하고, 인간 T 세포 증식을 유도한다.
항체의 하나의 아암이 CD28에 결합하고 다른 아암이 표적 항원에 결합하는 본 발명의 이중특이적 항체의 맥락에서, 표적 항원은 MUC16와 같은 종양-관련 항원일 수 있다.
소정의 예시적인 구현예에 따르면, 본 발명은 CD28 및 MUC16에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항원-결합 분자를 포함한다. 이러한 분자는 본원에서 예를 들어, "항-CD28/항-MUC16," 또는 "항-CD28xMUC16," 또는 "CD28xMUC16" 또는 "항-MUC16/항-CD28," 또는 "항-MUC16xCD28," 또는 "MUC16xCD28" 이중특이적 분자, 또는 다른 유사한 용어로 지칭될 수 있다.
도면에 도시된 바와 같이 소정의 예시적인 구현예에 따르면, 이중특이적 항원-결합 분자(예를 들어, 이중특이적 항체)는 효과기 아암 및 표적화 아암을 가질 수 있다. 효과기 아암은 효과기 세포(예를 들어, T 세포) 상의 항원에 결합하는 제1 항원-결합 도메인(예를 들어, 항-CD28 항체)일 수 있다. 표적화 아암은 표적 세포(예를 들어, 종양 세포) 상의 항원에 결합하는 제2 항원-결합 도메인(예를 들어, 항-MUC16 항체)일 수 있다. 소정의 예시적인 구현예에 따르면, 효과기 아암은 CD28에 결합하고, 표적화 아암은 MUC16에 결합한다. 이중특이적 항-CD28/MUC16는 효과기 세포(예를 들어, T 세포)에 공동-자극성 신호를 제공할 수 있다. 효과기 아암은 군집화 없이 T 세포를 자극하는 효과를 갖지 않는다. 군집화 시, 효과기 아암 단독은 T 세포를 자극하는 효과를 거의 갖지 않는다. 표적화 아암과 조합되어, 효과기 아암은 T 세포를 자극한다. 종양 표적화 아암은 불완전한 종양 특이성을 가질 수 있다. 표적화 아암의 표적인 항원(예를 들어, MUC16)은 종양 세포의 분획 상에서 발현될 수 있다. 종양 표적화 아암의 특이성은 항-CD3 이중특이적 항원-결합 분자(예를 들어, 항-CD3/MUC16 이중특이적 항체)와 조합되어 중첩됨으로써 증가될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 표현 "항원-결합 분자"는 단독으로 또는 하나 이상의 부가적인 CDR 및/또는 프레임워크 영역(FR)과 조합하여 특정 항원에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하거나 또는 이로 구성된 단백질, 폴리펩타이드 또는 분자 복합체를 의미한다. 소정의 구현예에서, 항원-결합 분자는 해당 용어가 본원의 어디에나 정의된 바와 같은 항체 또는 항체의 단편이다.
본원에 사용된 바와 같이, 표현 "이중특이적 항원-결합 분자"는 적어도 제1 항원-결합 도메인 및 제2 항원-결합 도메인을 포함하는 단백질, 폴리펩타이드 또는 분자 복합체를 의미한다. 이중특이적 항원-결합 분자 내의 각각의 항원-결합 도메인은 단독으로 또는 하나 이상의 부가적인 CDR 및/또는 FR과 조합되어 특정 항원에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 CDR을 포함한다. 본 발명의 맥락에서, 제1 항원-결합 도메인은 제1 항원(예를 들어, CD28)에 특이적으로 결합하고, 제2 항원-결합 도메인은 제2 별개의 항원(예를 들어, MUC16)에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 소정의 예시적인 구현예에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 이중특이적 항체이다. 이중특이적 항체의 각각의 항원-결합 도메인은 중쇄 가변 도메인(HCVR) 및 경쇄 가변 도메인(LCVR)을 포함한다. 제1 및 제2 항원-결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항원-결합 분자(예를 들어, 이중특이적 항체)의 맥락에서, 제1 항원-결합 도메인의 CDR은 접두사 "D1"로 표기될 수 있고, 제2 항원-결합 도메인의 CDR은 접두사 "D2"로 표기될 수 있다. 그러므로, 제1 항원-결합 도메인의 CDR은 본원에서 D1-HCDR1, D1-HCDR2, 및 D1-HCDR3으로 지칭될 수 있고; 제2 항원-결합 도메인의 CDR은 본원에서 D2-HCDR1, D2-HCDR2, 미 D2-HCDR3으로 지칭될 수 있다.
제1 항원-결합 도메인 및 제2 항원-결합 도메인은 서로 직접적으로 또는 간접적으로 연결되어, 본 발명의 이중특이적 항원-결합 분자를 형성할 수 있다. 대안적으로, 제1 항원-결합 도메인 및 제2 항원-결합 도메인은 각각 별개의 다량체화 도메인에 연결될 수 있다. 또 다른 다량체화 도메인과 하나의 다량체화 도메인의 회합은 2개의 항원-결합 도메인 사이의 회합을 용이하게 함으로써, 이중특이적 항원-결합 분자를 형성한다. 본원에 사용된 바와 같이, "다량체화 도메인"은 동일한 또는 유사한 구조 또는 구성의 제2 다량체화 도메인과 회합하는 능력을 갖는 임의의 거대분자, 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 아미노산이다. 예를 들어, 다량체화 도메인은 면역글로불린 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드일 수 있다. 다량체화 구성요소의 비제한적인 예는 면역글로불린의 Fc 부분(CH2-CH3 도메인을 포함함), 예를 들어, 이소타입 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4, 뿐만 아니라 각각의 이소타입 그룹 내의 임의의 알로타입(allotype)으로부터 선택되는 IgG의 Fc 도메인이다.
본 발명의 이중특이적 항원-결합 분자는 전형적으로 2개의 다량체화 도메인, 예를 들어, 별개의 항체 중쇄의 각각의 개별적인 부분인 2개의 Fc 도메인을 포함할 것이다. 제1 및 제2 다량체화 도메인은 예를 들어, IgG1/lgG1, IgG2/lgG2, IgG4/lgG4와 같은 동일한 IgG 이소타입일 수 있다. 대안적으로, 제1 및 제2 다량체화 도메인은 예를 들어, IgG1/lgG2, IgG1/lgG4, IgG2/lgG4 등과 같은 상이한 IgG 이소타입일 수 있다.
소정의 구현예에서, 다량체화 도메인은 Fc 단편, 또는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 함유하는 1 내지 약 200개 아미노산 길이의 아미노산 서열이다. 다른 구현예에서, 다량체화 도메인은 시스테인 잔기, 또는 짧은 시스테인-함유 펩타이드이다. 다른 다량체화 도메인은 류신 지퍼, 나선-루프 모티프 또는 꼬인-나선 모티프를 포함하거나 또는 이로 구성된 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 포함한다.
임의의 이중특이적 항체 형식 또는 기술은 본 발명의 이중특이적 항원-결합 분자를 제조하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 제1 항원 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 단편은 하나 이상의 다른 분자 독립체, 예컨대 이중특이적 항원-결합 분자를 생성하기 위해 제2 항원-결합 특이성을 갖는 또 다른 항체 또는 항체 단편에 (예를 들어, 화학적 커플링, 유전자 융합, 비공유 회합 또는 기타에 의해) 작용적으로 연결될 수 있다. 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 특정 예시적인 이중특이적 형식은, 비제한적으로, scFv-기반 또는 디아바디 이중특이적 형식, IgG-scFv 융합, 이중 가변 도메인(OVO)-Ig, 쿼드로마(Quadroma), 노브-인투-홀(knobs-into-holes), 공통 경쇄(예를 들어, 노브-인투-홀을 갖는 공통 경쇄 등), CrossMab, CrossFab, (SEEO)바디, 류신 지퍼, 오유오바디(Ouobody), IgG1/IgG2, 이중 작용성 Fab(OAF)-IgG 및 Mab2 이중특이적 형식을 포함한다(앞서 언급한 형식의 검토를 위해, 예를 들어, 문헌[Klein 등 2012, mAbs 4:6, 1-11], 및 이에 인용된 참고문헌을 참조).
본 발명의 이중특이적 항원-결합 분자의 맥락에서, 다량체화 도메인, 예를 들어, Fc 도메인은 Fc 도메인의 야생형, 천연 발생 버전과 비교하여 하나 이상의 아미노산 변화(예를 들어, 삽입, 결실 또는 치환)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 Fc와 FcRn 사이에 변형된 결합 상호작용(예를 들어, 증강 또는 저하)을 갖는 변형된 Fc 도메인을 초래하는, Fc 도메인에서 하나 이상의 변형을 포함하는 이중특이적 항원-결합 분자를 포함한다. 일 구현예에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 CH2 또는 CH3 영역에서 변형을 포함하며, 여기서, 변형은 산성 환경에서(예를 들어, pH가 약 5.5 내지 약 6.0의 범위인 엔도좀에서) FcRn에 대한 Fc의 친화도를 증가시킨다. 이러한 Fc 변형의 비제한적인 예는 예를 들어, 위치 250(예를 들어, E 또는 Q); 250 및 428(예를 들어, L 또는 F); 252(예를 들어, LN/FIW 또는 T), 254(예를 들어, S 또는 T) 및 256(예를 들어, S/R/Q/EID 또는 T)에서의 변형; 또는 위치 428 및/또는 433(예를 들어, UR/S/P/Q 또는 K) 및/또는 434(예를 들어, H/F 또는 V)에서의 변형; 또는 위치 250 및/또는 428에서의 변형; 또는 위치 307 또는 308(예를 들어, 308F, V308F) 및 434에서의 변형을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 변형은 428L(예를 들어, M428L) 및 434S(예를 들어, N434S) 변형; 428L, 2591(예를 들어, V2591) 및 308F(예를 들어, V308F) 변형; 433K(예를 들어, H433K) 및 434(예를 들어, 434Y) 변형; 252, 254 및 256(예를 들어, 252Y, 254T 및 256E) 변형; 250Q 및 428L 변형(예를 들어, T250Q 및 M428L); 및 307 및/또는 308 변형(예를 들어, 308F 또는 308P)을 포함한다.
본 발명은 또한, 제1 CH3 도메인 및 제2 Ig CH3 도메인을 포함하는 이중특이적 항원-결합 분자를 포함하며, 여기서, 제1 및 제2 Ig CH3 도메인은 적어도 하나의 아미노산만큼 서로 상이하고, 적어도 하나의 아미노산 차이는 아미노산 차이가 결여된 이중특이적 항체와 비교하여 단백질 A에 대한 이중특이적 항체의 결합을 감소시킨다. 일 구현예에서, 제1 Ig CH3 도메인은 단백질 A에 결합하고, 제2 Ig CH3 도메인은 H95R 변형(IMGT 엑손 넘버링에 의함; EU 넘버링에 의하면 H435R임)과 같이 단백질 A 결합을 감소시키거나 또는 없애는 돌연변이를 함유한다. 제2 CH3은 Y96F 변형(IMGT에 의함; EU에 의하면 Y436F임)을 추가로 포함할 수 있다. 제2 CH3 내에서 발견될 수 있는 추가의 변형은: IgG1 항체의 경우에 D16E, L18M, N44S, K52N, V57M, 및 V821(IMGT에 의함; EU에 의하면 D356E, L358M, N384S, K392N, V397M 및 V4221임); IgG2 항체의 경우에 N44S, K52N 및 V821(IMGT; EU에 의하면 N384S, K392N 및 V4221임); 및 IgG4 항체의 경우에 Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q 및 V821(IMGT에 의함; EU에 의하면 Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q 및 V4221임)을 포함한다.
소정의 구현예에서, Fc 도메인은 하나 초과의 면역글로불린 이소타입으로부터 유래된 Fc 서열을 조합하는 키메라일 수 있다. 예를 들어, 키메라 Fc 도메인은 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 CH2 영역으로부터 유래되는 부분적인 또는 모든 CH2 서열, 및 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4로부터 유래되는 부분적인 또는 모든 CH3 서열을 포함할 수 있다. 키메라 Fc 도메인은 또한, 키메라 힌지 영역을 함유할 수 있다. 예를 들어, 키메라 힌지는 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 힌지 영역으로부터 유래되는 "하부 힌지" 서열과 조합된, 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 힌지 영역으로부터 유래되는 "상부 힌지" 서열을 포함할 수 있다. 본원에 제시된 임의의 항원-결합 분자에 포함될 수 있는 키메라 Fc 도메인의 특정 예는 N-말단으로부터 C-말단까지: [lgG4 CH1] - [lgG4 상부 힌지] - [lgG2 하부 힌지] - [lgG4 CH2] - [lgG4 CH3]을 포함한다. 본원에 제시된 임의의 항원-결합 분자에 포함될 수 있는 키메라 Fc 도메인의 또 다른 예는 N-말단으로부터 C-말단까지: [lgG1 CH1] - [lgG1 상부 힌지] - [lgG2 하부 힌지] - [lgG4 CH2] - [lgG1 CH3]을 포함한다. 본 발명의 임의의 항원-결합 분자에 포함될 수 있는 키메라 Fc 도메인의 이들 및 다른 예는 WO2014/022540 A1에 기재되어 있으며, 이들 일반적인 구조적 배열을 가진 키메라 Fc 도메인 및 그의 변이체는 변경된 Fc 수용체 결합을 가질 수 있고, 이는 결국 Fc 효과기 기능에 영향을 미친다.
서열 변이체
본 발명의 항체 및 이중특이적 항원-결합 분자는 개별적인 항원-결합 도메인이 유래된 상응하는 생식계열 서열과 비교하여 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 프레임워크 및/또는 CDR 영역에 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함할 수 있다. 이러한 돌연변이는, 본원에 개시된 아미노산 서열을 예를 들어, 공개된 항체 서열 데이터베이스로부터 입수 가능한 생식계열 서열과 비교함으로써 용이하게 확인될 수 있다. 본 발명의 항원-결합 분자는 본원에 개시된 임의의 예시적인 아미노산 서열로부터 유래된 항원-결합 도메인을 포함할 수 있으며, 여기서, 하나 이상의 프레임워크 및/또는 CDR 영역 내의 하나 이상의 아미노산은 항체가 유래된 생식계열 서열의 상응하는 잔기(들)로, 또는 또 다른 인간 생식계열 서열의 상응하는 잔기(들)로, 또는 상응하는 생식계열 잔기(들)의 보존적 아미노산 치환으로 돌연변이된다(이러한 서열 변화는 본원에서 총괄적으로 "생식계열 돌연변이"로 지칭됨). 당업자는 본원에 개시된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열로 시작하여, 하나 이상의 개별적인 생식계열 돌연변이 또는 이의 조합을 포함하는 수많은 항체 및 항원-결합 단편을 용이하게 생성할 수 있다. 소정의 구현예에서, VH 및/또는 VL 도메인 내의 모든 프레임워크 및/또는 CDR 잔기는, 항원-결합 도메인이 원래 유래되는, 원래의 생식계열 서열에서 발견되는 잔기로 역돌연변이된다. 다른 구현예에서, 단지 소정의 잔기, 예를 들어, FR1의 처음 8개 아미노산 내에서 또는 FR4의 마지막 8개 아미노산 내에서 발견되는 돌연변이된 잔기, 또는 CDR1, CDR2 또는 CDR3 내에서 발견되는 돌연변이된 잔기만 원래의 생식계열 서열로 역돌연변이된다. 다른 구현예에서, 프레임워크 및/또는 CDR 잔기(들) 중 하나 이상은 상이한 생식계열 서열(즉, 항원-결합 도메인이 원래 유래되는, 생식계열 서열과 상이한 생식계열 서열)의 상응하는 잔기(들)로 돌연변이된다. 더욱이, 항원-결합 도메인은 프레임워크 및/또는 CDR 영역 내에 2개 이상의 생식계열 돌연변이의 임의의 조합을 함유할 수 있으며, 예를 들어, 소정의 개별적인 잔기는 특정 생식계열 서열의 상응하는 잔기로 돌연변이되는 한편, 원래의 생식계열 서열과 상이한 소정의 다른 잔기는 유지되거나, 상이한 생식계열 서열의 상응하는 잔기로 돌연변이된다. 하나 이상의 생식계열 돌연변이를 함유하는 항원-결합 도메인은, 일단 수득되면, 하나 이상의 요망되는 특성, 예컨대 향상된 결합 특이성, 증가된 결합 친화도, 향상되거나 증강된 길항제성 또는 작용제성 생물학적 특성(경우에 따라), 감소된 면역원성 등에 대해 용이하게 시험될 수 있다. 이러한 일반적 방식으로 수득되는 하나 이상의 항원-결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항원-결합 분자는 본 발명 내에 포괄된다.
본 발명은 또한, 항원-결합 분자를 포함하는데, 여기서, 항원-결합 도메인의 하나 또는 둘 다는 하나 이상의 보존적 치환을 갖는 본원에 개시된 임의의 HCVR, LCVR 및/또는 CDR 아미노산 서열의 변이체를 포함한다. 예를 들어, 본 발명은, 본원에 개시된 임의의 HCVR, LCVR 및/또는 CDR 아미노산 서열과 비교하여, 예를 들어, 10개 이하, 8개 이하, 6개 이하, 또는 4개 이하 등의 보존적 아미노산 치환을 갖는 HCVR, LCVR 및/또는 CDR 아미노산 서열을 갖는 항원-결합 도메인을 포함하는 항원-결합 분자를 포함한다. "보존적 아미노산 치환"은, 아미노산 잔기가 유사한 화학적 특성(예를 들어, 전하 또는 소수성)을 갖는 측쇄(R기)를 갖는 또 다른 아미노산 잔기에 의해 치환되는 것이다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 기능적 특성을 실질적으로 변화시키지 않을 것이다. 유사한 화학적 특성을 갖는 측쇄를 가진 아미노산 그룹의 예는, (1) 지방족 측쇄: 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신; (2) 지방족-하이드록실 측쇄: 세린 및 트레오닌; (3) 아미드-함유 측쇄: 아스파라긴 및 글루타민; (4) 방향족 측쇄: 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판; (5) 염기성 측쇄: 라이신, 아르기닌 및 히스티딘; (6) 산성 측쇄: 아스파르테이트 및 글루타메이트, 및 (7) 황-함유 측쇄: 시스테인 및 메티오닌을 포함한다. 바람직한 보존적 아미노산 치환 그룹은, 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 라이신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루타메이트-아스파르테이트 및 아스파라긴-글루타민이다. 대안적으로, 보존적 대체는 문헌[Gonnet 등 (1992) Science 256: 1443-1445]에 개시된 PAM250 로그-유사 행렬에서 양의 값을 갖는 임의의 변화이다. "적당한 보존적" 대체는 PAM250 로그-유사 행렬에서 음이 아닌 값을 갖는 임의의 변화이다.
본 발명은 또한, 본원에 개시된 임의의 HCVR, LCVR 및/또는 CDR 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 HCVR, LCVR 및/또는 CDR 아미노산 서열을 갖는 항원-결합 도메인을 포함하는 항원-결합 분자를 포함한다. 아미노산 서열을 지칭할 때 용어 "실질적인 동일성" 또는 "실질적으로 동일한"은, 예컨대 디폴트 갭 가중치를 이용하는 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해 최적으로 정렬될 때 2개의 아미노산 서열이 적어도 95% 서열 동일성, 더욱 더 바람직하게는 적어도 98% 또는 99% 서열 동일성을 공유함을 의미한다. 바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 달라진다. 2개 이상의 아미노산 서열이 보존적 치환에 의해 서로 달라지는 경우, 서열 동일성의 백분율 또는 유사성의 정도는 치환의 보존적 성질을 교정하기 위해 상향 조정될 수 있다. 이러한 조정을 수행하기 위한 수단은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331]을 참조한다.
서열 동일성으로도 지칭되는 폴리펩타이드에 대한 서열 유사성은 전형적으로 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 측정된다. 단백질 분석 소프트웨어는 보존적 아미노산 치환을 포함한 다양한 치환, 결실 및 다른 변형에 할당된 유사성 척도를 사용하여 유사한 서열을 매칭시킨다. 예를 들어, GCG 소프트웨어는 상이한 유기체 종으로부터의 상동성 폴리펩타이드와 같은 밀접하게 관련된 폴리펩타이드 사이의, 또는 야생형 단백질과 이의 뮤테인(mutein) 사이의 서열 상동성 또는 서열 동일성을 결정하기 위해 디폴트 매개변수와 함께 사용될 수 있는 Gap 및 Bestfit과 같은 프로그램을 포함한다. 예를 들어, GCG 버전 6.1을 참조한다. 폴리펩타이드 서열은 또한, 디폴트 또는 권장된 매개변수를 사용하는, GCG 버전 6.1의 프로그램인 FASTA를 사용하여 비교될 수 있다. FASTA(예를 들어, FASTA2 및 FASTA3)는 쿼리 및 서치 서열(상기 Pearson, 2000) 사이의 최적의 중첩 영역의 정렬 및 서열 동일성 백분율을 제공한다. 본 발명의 서열을 상이한 유기체로부터의 다수의 서열을 포함하는 데이터베이스와 비교할 때 또 다른 바람직한 알고리즘은 디폴트 매개변수를 사용하는 컴퓨터 프로그램 BLAST, 특히 BLASTP 또는 TBLASTN이다. 예를 들어, 문헌[Altschul 등 (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410] 및 문헌[Altschul 등 (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402]를 참조한다.
pH-의존적 결합
본 발명은 pH-의존적 결합 특징을 갖는 항-CD28/항-MUC16 이중특이적 항원-결합 분자를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 항-CD28 항체는 중성 pH와 비교하여 산성 pH에서 CD28에 대해 감소된 결합을 나타낼 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 항-MUC16 항체는 중성 pH와 비교하여 산성 pH에서 MUC16에 대해 증강된 결합을 나타낼 수 있다. 표현 "산성 pH"는 약 6.2 미만, 예를 들어 약 6.0, 5.95, 5.9, 5.85, 5.8, 5.75, 5.7, 5.65, 5.6, 5.55, 5.5, 5.45, 5.4, 5.35, 5.3, 5.25, 5.2, 5.15, 5.1, 5.05, 5.0 이하의 pH 값을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 표현 "중성 pH"는 약 7.0 내지 약 7.4의 pH를 의미한다. 표현 "중성 pH"는 약 7.0, 7.05, 7.1, 7.15, 7.2, 7.25, 7.3, 7.35 및 7.4의 pH 값을 포함한다.
소정의 예에서, "중성 pH와 비교하여 산성 pH에서 감소된 결합 ... "은 산성 pH에서 항원으로의 항체 결합의 KD 값 대 중성 pH에서 항원으로의 항체의 KD 값의 비(또는 그 반대)로 표현된다. 예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 약 3.0 이상의 산성/중성 KD 비를 나타낸다면, 본 발명의 목적을 위해 "중성 pH에 비해 산성 pH에서 CD28에 대한 감소된 결합"을 나타내는 것으로 간주될 수 있다. 소정의 예시적인 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편에 대한 산성/중성 KD 비는 약 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 10.5, 11.0, 11.5, 12.0, 12.5, 13.0, 13.5, 14.0, 14.5, 15.0, 20.0, 25.0, 30.0, 40.0, 50.0, 60.0, 70.0, 100.0 이상일 수 있다.
pH-의존적 결합 특징을 갖는 항체는 예를 들어, 중성 pH와 비교하여 산성 pH에서 특정 항원으로의 감소된(또는 증강된) 결합에 대해 항체 집단을 스크리닝함으로써 수득될 수 있다. 부가적으로, 아미노산 수준에서 항원-결합 도메인의 변형은 pH-의존적 특징을 갖는 항체를 산출할 수 있다. 예를 들어, 항원-결합 도메인(예를 들어 CDR 내의)의 하나 이상의 아미노산을 히스티딘 잔기로 치환함으로써, 중성 pH와 비교하여 산성 pH에서 감소된 항원-결합을 갖는 항체가 수득될 수 있다.
Fc 변이체를 포함하는 항체
본 발명의 소정의 구현예에 따르면, 예를 들어, 중성 pH와 비교하여 산성 pH에서, FcRn 수용체로의 항체 결합을 증강시키거나 약화시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인을 포함하는 항-CD28/항-MUC16 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다. 예를 들어, 본 발명은 Fc 도메인의 CH2 또는 CH3 영역에 돌연변이를 포함하는 항체 및 항원 결합 분자를 포함하며, 여기서, 돌연변이(들)는 산성 환경에서(예를 들어, pH가 약 5.5 내지 약 6.0의 범위인 엔도좀에서) FcRn에 대한 Fc 도메인의 친화도를 증가시킨다. 이러한 돌연변이는 동물에게 투여될 때 항체의 혈청 반감기를 증가시킬 수 있다. 이러한 Fc 변형의 비제한적인 예는, 예를 들어, 위치 250(예를 들어, E 또는 Q)에서의 변형; 250 및 428(예를 들어, L 또는 F); 252(예를 들어, L/Y/F/W 또는 T), 254(예를 들어, S 또는 T) 및 256(예를 들어, S/R/Q/E/D 또는 T)에서의 변형; 또는 위치 428 및/또는 433(예를 들어, H/L/R/S/P/Q또는 K) 및/또는 434(예를 들어, H/F 또는 Y)에서의 변형; 또는 위치 250 및/또는 428에서의 변형; 또는 위치 307 또는 308(예를 들어, 308F, V308F) 및 434에서의 변형을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 변형은 428L(예를 들어, M428L) 및 434S(예를 들어, N434S) 변형; 428L, 259I(예를 들어, V259I), 및 308F(예를 들어, V308F) 변형; 433K(예를 들어, H433K) 및 434(예를 들어, 434Y) 변형; 252, 254 및 256(예를 들어, 252Y, 254T 및 256E) 변형; 250Q 및 428L 변형(예를 들어, T250Q 및 M428L); 및 307 및/또는 308 변형(예를 들어, 308F 또는 308P)을 포함한다.
예를 들어, 본 발명은 250Q 및 248L(예를 들어, T250Q 및 M248L); 252Y, 254T 및 256E(예를 들어, M252Y, S254T 및 T256E); 428L 및 434S(예를 들어, M428L 및 N434S); 및 433K 및 434F(예를 들어, H433K 및 N434F)로 이루어진 군으로부터 선택되는 돌연변이의 하나 이상의 쌍 또는 그룹을 포함하는 Fc 도메인을 포함하는 항-CD28/항-MUC16 이중특이적 항원-결합 분자를 포함한다. 전술한 Fc 도메인 돌연변이, 및 본원에 개시된 항체 가변 도메인 내의 다른 돌연변이의 모든 가능한 조합이 본 발명의 범위 내에서 고려된다.
항체 및 항원-결합 분자의 생물학적 특징
본 발명은 높은 친화도로 인간 CD28 및/또는 MUC16에 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 본 발명은 또한, 요망되는 치료적 내용 및 특정 표적화 특성에 따라, 중간 또는 낮은 친화도로 인간 CD28 및/또는 MUC16에 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 예를 들어, 하나의 아암이 CD28에 결합하고 또 다른 아암이 표적 항원(예를 들어, MUC16)에 결합하는 이중특이적 항원-결합 분자의 맥락에서, 표적 항원-결합 아암이 높은 친화도로 표적 항원에 결합하는 반면, 항-CD28 아암은 단지 중간 또는 낮은 친화도로 CD28에 결합하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 방식으로, 표적 항원을 발현하는 세포로의 항원-결합 분자의 우선적인 표적화가 달성되는 한편, 일반적인/비표적화된 CD28 결합 및 이와 관련된 결과적인 유해한 부작용을 피할 수 있다.
소정의 구현예에 따르면, 본 발명은 예를 들어, 본원의 실시예 4에 정의된 바와 같은 검정법 형식을 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된 바와 같이 약 165 nM 미만의 KD로(예를 들어, 37℃에서) 인간 CD28에 결합하는 항체 및 항체의 항원-결합 단편을 포함한다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은, 예를 들어, 본원의 실시예 4에 정의된 바와 같은 검정법 형식 또는 실질적으로 유사한 검정법을 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된 바와 같이 약 150 nM 미만, 약 130 nM 미만, 약 120 nM 미만, 약 100 nM 미만, 약 50 nM 미만, 약 80 nM 미만, 약 60 nM 미만, 약 40 nM 미만, 또는 약 30 nM 미만의 KD로 CD28에 결합한다.
본 발명은 또한, 예를 들어, 본원의 실시예 4에 정의된 바와 같은 검정법 형식 또는 실질적으로 유사한 검정법을 사용하여 37℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된 바와 같이 약 2.1분 초과의 해리 반감기(t½)로 CD28에 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은, 예를 들어, 본원의 실시예 4에 정의된 바와 같은 검정법 형식 또는 실질적으로 유사한 검정법을 사용하여 25℃ 또는 37℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된 바와 같이 약 5분 초과, 약 10분 초과, 약 20분 초과, 약 30분 초과, 약 40분 초과, 약 50분 초과, 약 60분 초과, 약 70분 초과, 약 80분 초과, 약 90분 초과, 약 100분 초과, 약 200분 초과, 약 300분 초과, 약 400분 초과, 약 500분 초과, 약 600분 초과, 약 700분 초과, 약 800분 초과, 약 900분 초과, 약 1000분 초과, 또는 약 1200분 초과의 t½로 CD28에 결합한다.
본 발명은 인간 CD28 및 인간 MUC16에 동시에 결합할 수 있는 이중특이적 항원-결합 분자(예를 들어, 이중특이적 항체)를 포함한다. 소정의 구현예에 따르면, 본 발명의 이중특이적 항원-결합 분자는 CD28 및/또는 MUC16를 발현하는 세포와 특이적으로 상호작용한다. 이중특이적 항원-결합 분자가 CD28 및/또는 MUC16를 발현하는 세포에 결합하는 정도는 본원의 실시예 5에 예시된 바와 같이 형광 활성 세포 분류(FACS)에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 본 발명은, MUC16가 아니라 CD28을 발현하는 인간 또는 시노몰구스 원숭이 세포(예를 들어 T 세포), 및 CD28이 아니라 MUC16를 발현하는 인간 난소 암종 세포주(예를 들어, OVCAR-3, 또는 PEO1)에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항원-결합 분자를 포함한다. 본 발명은 또한, 실시예 4에 제시된 바와 같은 FACS 검정법 또는 실질적으로 유사한 검정법을 사용하여 결정된 바와 같이, 약 9.2x10-6 내지 약 2.8x10-10 이하의 EC50 값으로 임의의 상기 언급된 세포 및 세포주에 결합하는 이중특이적 항원-결합 분자를 포함한다.
본 발명은 또한, 종양 세포의 T 세포-매개 사멸화를 유도하거나 증가시키는 항-CD28/항-MUC16 이중특이적 항원-결합 분자를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 예를 들어, 본원의 실시예 7(예를 들어, 항-CD28xMUC16 항체의 존재 하에 인간 또는 시노몰구스 PBMC에 의한 PEO1 종양 세포 사멸화의 정도를 평가함)에 정의된 바와 같은 검정법 형식 또는 실질적으로 유사한 검정법을 사용하여 시험관내 T 세포-매개 종양 세포 사멸화 검정법에서 측정된 바와 같이, 약 392 pM 미만의 EC50으로 종양 세포의 T 세포-매개 사멸화를 유도하거나 증가시키는 항-CD28xMUC16 항체를 포함한다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은, 예를 들어, 본원의 실시예 7에 정의된 바와 같은 검정법 형식 또는 실질적으로 유사한 검정법을 사용하여 시험관내 T 세포 매개 종양 세포 사멸화 검정법에 의해 측정된 바와 같이 약 200 pM 미만, 약 150 pM 미만, 약 100 pM 미만, 약 75 pM 미만, 약 50 pM 미만, 약 25 pM 미만, 약 10 pM 미만, 약 5.0 pM 미만, 약 4.0 pM 미만, 약 3.0 pM 미만, 약 2.5 pM 미만, 약 2.0 pM 미만, 약 1.5 pM 미만, 또는 약 1.45 pM 미만의 EC50 값으로 T 세포-매개 종양 세포 사멸화(예를 들어, PEO1 세포의 PBMC 매개 사멸화)를 유도한다.
본 발명은 또한, 1.0 pM 내지 10 μM의 EC50 값으로 CD28-발현 인간 및/또는 시노몰구스 T-세포에 결합하는 항-CD28/항-MUC16 이중특이적 항원-결합 분자를 포함한다. 소정의 구현예에서, 항-CD28/항-MUC16 이중특이적 항원-결합 분자는 9.2 μM 내지 120 nM의 EC50 값으로 CD28-발현 인간 및/또는 시노몰구스 T-세포에 결합한다. 예를 들어, 본 발명은 약 1 pM, 약 10 pM, 약 100 pM, 약 500 pM, 약 1 nM, 약 2 nM, 약 5 nM, 약 10 nM, 약 20 nM, 약 30 nM, 약 40 nM, 약 50 nM 약 60 nM, 약 70 nM, 약 80 nM, 약 90 nM, 약 100 nM, 약 200 nM, 약 300 nM, 약 500 nM, 약 800 nM, 약 1000 nM, 약 2 μM, 약 4 μM, 약 6 μM, 약 8 μM, 약 10 μM 이상의 EC50 값으로 CD28-발현 인간 T-세포에 결합하는 항-CD28/항-MUC16 이중특이적 항원-결합 분자를 포함한다.
본 발명은 또한, (a) T-세포를 활성화시키고, IL-2 방출 및 CD25+ 및 PD-1 상향조절을 인간 PBMC에서 유도시키는 것(예를 들어 본원의 실시예 6 및 7 참조); (b) MUC16 발현 세포주 상에서 인간 또는 시노몰구스 T-세포 매개 세포독성을 증가시키는 것(예를 들어, 본원의 실시예 7 참조); (c) MUC16 발현 세포주 상에서 미접촉(naive) 영장류 T 세포-매개 세포독성을 유도하는 것(예를 들어, 본원의 실시예 7 참조); (e) 마우스에서 종양 세포를 고갈시키는 것(예를 들어, 본원의 실시예 8 참조); (f) 마우스에서 종양 청소를 증강시키는 것(예를 들어, 본원의 실시예 8 참조); (g) 시노몰구스 원숭이에서 전신 T 세포 활성화를 유도하지 않는 것으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 나타내는 항-CD28/항-MUC16 이중특이적 항원-결합 분자를 포함한다.
본 발명은 대상체에서 종양 세포를 고갈시킬 수 있는 항-CD28/항-MUC16 이중특이적 항원-결합 분자를 포함한다(예를 들어, 실시예 9 참조). 예를 들어, 소정의 구현예에 따르면, 항-CD28/항-MUC16 이중특이적 항원-결합 분자가 제공되며, 여기서, 대상체로의 이중특이적 항원-결합 분자의 이중 투여(예를 들어, 약 5.0 mg/kg, 약 2.5 mg/kg, 약 1.0 mg/kg 약 0.5 mg/kg, 약 0.2 mg/kg, 약 0.1 mg/kg, 약 0.05 mg/kg, 약 0.02mg/kg, 약 0.01mg/kg 이하의 용량에서)는 상기 대상체에서 종양 세포의 수의 감소를 야기한다. 소정의 구현예에 따르면, 항-CD28/항-MUC16 이중특이적 항원-결합 분자가 제공되며, 여기서, 대상체로의 이중특이적 항원-결합 분자의 이중 투여(예를 들어, 약 2500 mg, 약 1000 mg, 약 500 mg, 약 200 mg, 약 100 mg, 약 50 mg/kg, 약 25 mg/kg 이하의 용량에서)는 상기 대상체에서 종양 세포의 수의 감소를 야기한다.
에피토프 맵핑 및 관련 기술
본 발명의 항원-결합 분자가 결합하는 CD28 및/또는 MUC16 상의 에피토프는 CD28 단백질 또는 MUC16 단백질의 3개 이상(예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상)의 아미노산의 단일 인접 서열로 구성될 수 있다. 대안적으로, 에피토프는 CD28 또는 MUC16의 복수의 비인접 아미노산(또는 아미노산 서열)으로 구성될 수 있다. 본 발명의 항체는 CD28 단량체 내에 함유된 아미노산과 상호작용할 수 있거나, CD28 이량체의 2개의 상이한 CD28 쇄 상의 아미노산과 상호작용할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "에피토프"는 파라토프로 알려진 항체 분자의 가변 영역 내 특이적인 항원 결합 부위와 상호작용하는 항원 결정기를 지칭한다. 단일 항원은 하나 초과의 에피토프를 가질 수 있다. 그러므로, 상이한 항체는 항원 상의 상이한 영역에 결합할 수 있고, 상이한 생물학적 효과를 가질 수 있다. 에피토프는 형태적(conformational) 또는 선형일 수 있다. 형태적 에피토프는 선형 폴리펩타이드 사슬의 상이한 분절로부터 공간적으로 병치된 아미노산에 의해 생성된다. 선형 에피토프는 폴리펩타이드 사슬에서 인접한 아미노산 잔기에 의해 생성된 에피토프이다. 소정의 상황에서, 에피토프는 항원 상에 당류, 포스포릴기 또는 설포닐기의 모이어티를 포함할 수 있다.
항체의 항원-결합 도메인이 폴리펩타이드 또는 단백질 내의 "하나 이상의 아미노산과 상호작용"하는지의 여부를 결정하는 데에는 당업자에게 알려진 다양한 기법이 사용될 수 있다. 특정 항체의 에피토프 또는 결합 도메인 또는 항원-결합 도메인을 결정하는 데 사용될 수 있는 예시적인 기법은, 예를 들어, 일상적인 교차차단 검정법, 예컨대 문헌[Antibodies, Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY)]에 기재된 것, 점 돌연변이발생(예를 들어, 알라닌 스캐닝 돌연변이발생, 아르기닌 스캐닝 돌연변이발생 등), 펩타이드 블롯 분석(문헌[Reineke, 2004, Methods Mol Biol 248:443-463]), 프로테아제 보호, 및 펩타이드 절단 분석을 포함한다. 게다가, 에피토프 삭제(excision), 에피토프 추출 및 항원의 화학적 변형과 같은 방법이 이용될 수 있다(문헌[Tomer, 2000, 단백질 Science 9:487-496] 참조). 항체가 상호작용하는 폴리펩타이드 내의 아미노산을 식별하는 데 사용될 수 있는 또 다른 방법은 질량 분광법에 의해 검출되는 수소/중수소 교환이다. 일반적으로, 수소/중수소 교환 방법은 관심 단백질을 중수소-표지하고, 뒤이어 항체를 중수소-표지된 단백질에 결합시키는 단계를 수반한다. 다음으로, 단백질/항체 복합체는 물에 전달되어 (중수소-표지된 채로 남아있는) 항체에 의해 보호되는 잔기를 제외하고는 모든 잔기에서 수소-중수소 교환이 발생할 수 있게 한다. 항체의 해리 후, 표적 단백질은 프로테아제 절단 및 질량 분광법 분석을 받아, 이로써 항체가 상호작용하는 특이적인 아미노산에 상응하는 중수소-표지된 잔기를 드러낸다. 예를 들어, 문헌[Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259]; [Engen and Smith (2001) Anal. Chem. 73:256A-265A]를 참조한다. X-선 결정 구조 분석은 또한, 항체가 상호작용하는 폴리펩타이드 내의 아미노산을 식별하는 데 사용될 수 있다.
본 발명은 본원에 기재된 임의의 특정 예시적인 항체(예를 들어, 본원의 표 1 및 3에 제시된 바와 같은 임의의 아미노산 서열을 포함하는 항체)와 동일한 에피토프에 결합하는 항-CD28 항체 및 항-MUC16 항체를 추가로 포함한다. 마찬가지로, 본 발명은 또한, CD28 및/또는 MUC16에 결합하기 위해 본원에 기재된 임의의 특정 예시적인 항체(예를 들어, 본원의 표 1에 제시된 바와 같은 임의의 아미노산 서열을 포함하는 항체)와 경쟁하는 항-CD28 항체 및/또는 항-MUC16 항체를 포함한다.
본 발명은 또한, 인간 CD28에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인 및 인간 MUC16에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항원-결합 분자를 포함하며, 여기서 제1 항원-결합 도메인은 본원에 기재된 임의의 특정 예시적인 CD28-특이적 항원-결합 도메인과 동일한 CD28 상의 에피토프에 결합하고/하거나 제2 항원-결합 도메인은 본원에 기재된 임의의 특정 예시적인 MUC16-특이적 항원-결합 도메인과 동일한 MUC16 상의 에피토프에 결합한다.
마찬가지로, 본 발명은 또한, 인간 CD28에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인 및 인간 MUC16에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항원-결합 분자를 포함하며, 여기서 제1 항원-결합 도메인은 CD28에 결합하기 위해 본원에 기재된 임의의 특정 예시적인 CD28-특이적 항원-결합 도메인과 경쟁하고/하거나 제2 항원-결합 도메인은 MUC16에 결합하기 위해 본원에 기재된 임의의 특정 예시적인 MUC16-특이적 항원-결합 도메인과 경쟁한다.
당업자는, 특정 항원-결합 분자(예를 들어, 항체) 또는 이의 항원-결합 도메인이 본 발명의 기준 항원-결합 분자와 동일한 에피토프에 결합하는지 또는 결합하기 위해 상기 기준 항원-결합 분자와 경쟁하는지의 여부를 당업계에 알려진 일상적인 방법을 사용함으로써 용이하게 결정할 수 있다. 예를 들어, 시험 항체가 본 발명의 기준 이중특이적 항원-결합 분자와 동일한 CD28(또는 MUC16) 상의 에피토프에 결합하는지의 여부를 결정하기 위해, 기준 이중특이적 분자는 우선 CD28 단백질(또는 MUC16 단백질)에 결합하게 된다. 다음으로, CD28(또는 MUC16) 분자에 결합하는 시험 항체의 능력이 평가된다. 시험 항체가 기준 이중특이적 항원-결합 분자와의 포화 결합한 후 CD28(또는 MUC16)에 결합할 수 있다면, 시험 항체는 기준 이중특이적 항원-결합 분자와 상이한 CD28(또는 MUC16) 에피토프에 결합하는 것으로 결론내려질 수 있다. 한편, 시험 항체가 기준 이중특이적 항원-결합 분자와의 포화 결합한 후 CD28(또는 MUC16) 분자에 결합할 수 없다면, 시험 항체는 본 발명의 기준 이중특이적 항원-결합 분자에 의해 결합되는 에피토프와 동일한 CD28(또는 MUC16) 에피토프에 결합할 수 있다. 그 후에, 시험 항체 결합의 관찰된 결여가 사실상 기준 이중특이적 항원-결합 분자와 동일한 에피토프에 대한 결합으로 인한 것인지의 여부 또는 입체 차단(또는 또 다른 현상)이 관찰된 결합의 결여를 초래하는지의 여부를 확인하기 위해 부가적인 일상적 실험(예를 들어, 펩타이드 돌연변이 및 결합 분석)이 수행될 수 있다. 이러한 부류의 실험은 ELISA, RIA, Biacore, 유세포분석법 또는 당업계에서 이용 가능한 임의의 다른 정량적 또는 정성적 항체-결합 분석을 사용하여 수행될 수 있다. 본 발명의 소정의 구현예에 따르면, 2개의 항원-결합 단백질은, 하나의 항원-결합 단백질의, 예를 들어, 1-, 5-, 10-, 20- 또는 100-배 과량이 경쟁적 결합 검정법에서 측정된 바와 같이 적어도 50%만큼, 그러나 바람직하게는 75%, 90% 또는 심지어 99%만큼 다른 항원-결합 단백질의 결합을 저해한다면, 동일한(또는 중첩) 에피토프에 결합한다(예를 들어, 문헌[Junghans 등, Cancer Res. 1990:50:1495-1502] 참조). 대안적으로, 2개의 항원-결합 단백질은, 하나의 항원-결합 단백질의 결합을 감소시키거나 없애는 항원 내의 본질적으로 모든 아미노산 돌연변이가 다른 항원-결합 단백질의 결합을 감소시키거나 없애는 경우, 동일한 에피토프에 결합하는 것으로 여겨진다. 2개의 항원-결합 단백질은, 하나의 항원-결합 단백질의 결합을 감소시키거나 없애는 아미노산 돌연변이의 서브세트만이 다른 항원-결합 단백질의 결합을 감소시키거나 없애는 "중첩 에피토프"를 갖는 것으로 여겨진다.
항체 또는 이의 항원-결합 도메인이 결합을 위해 기준 항원-결합 분자와 경쟁하는지의 여부를 결정하기 위해, 상기 기재된 결합 방법론이 2가지 배향으로 수행된다: 제1 배향에서, 기준 항원-결합 분자는 포화 조건 하에 CD28 단백질(또는 MUC16 단백질)에 결합하게 되고, 뒤이어 CD28(또는 MUC16) 분자로의 시험 항체의 결합이 평가된다. 제2 배향에서, 시험 항체는 포화 조건 하에 CD28(또는 MUC16) 분자에 결합하게 되며, 뒤이어 CD28(또는 MUC16) 분자로의 기준 항원-결합 분자의 결합이 평가된다. 상기 두 배향 모두에서, 제1(포화) 항원-결합 분자만 CD28(또는 MUC16) 분자에 결합할 수 있는 경우, 시험 항체와 기준 항원-결합 분자는 CD28(또는 MUC16)에 결합하기 위해 경쟁하는 것으로 결론내려진다. 당업자라면 알게 되는 바와 같이, 결합하기 위해 기준 항원-결합 분자와 경쟁하는 항체는, 기준 항체와 동일한 에피토프에 반드시 결합하지 않을 수도 있지만, 중첩 또는 인접한 에피토프에 결합함으로써 기준 항체의 결합을 입체적으로 차단시킬 수 있다.
항원-결합 도메인의 제조 및 이중특이적 분자의 구축
특정 항원에 특이적인 항원-결합 도메인은 당업계에 알려진 임의의 항체 생성 기술에 의해 제조될 수 있다. 일단 수득되면, 2개의 상이한 항원(예를 들어, CD28 및 MUC16)에 특이적인 2개의 상이한 항원-결합 도메인은 일상적인 방법을 사용하여 본 발명의 이중특이적 항원-결합 분자를 생성하도록 서로에 대해 적절하게 배열될 수 있다. (본 발명의 이중특이적 항원-결합 분자를 구축하는 데 사용될 수 있는 예시적인 이중특이적 항체의 형식에 대한 논의는 본원의 어디에나 제공되어 있음). 소정의 구현예에서, 본 발명의 다중특이적 항원-결합 분자의 하나 이상의 개별적인 구성요소(예를 들어, 중쇄 및 경쇄)는 키메라, 인간화 또는 완전 인간 항체로부터 유래된다. 이러한 항체를 제조하기 위한 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 본 발명의 이중특이적 항원-결합 분자의 중쇄 및/또는 경쇄 중 하나 이상은 VELOCIMMUNETM 기술을 사용하여 제조될 수 있다. VELOCIMMUNETM 기술(또는 임의의 다른 항체 생성 기술)을 사용하여, 인간 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 갖는, 특정 항원(예를 들어, CD28 또는 MUC16)에 대한 고친화도 키메라 항체가 초기에 단리된다. 상기 항체는 친화도, 선택성, 에피토프 등을 포함하는 바람직한 특징에 대해 특징화되고 선택된다. 마우스 불변 영역은 본 발명의 이중특이적 항원-결합 분자 내로 혼입될 수 있는 완전 인간 중쇄 및/또는 경쇄를 생성시키기 위해 요망되는 인간 불변 영역으로 대체된다.
인간 이중특이적 항원-결합 분자를 제조하기 위해 유전자 조작된 동물이 사용될 수 있다. 예를 들어, 내생적 마우스 면역글로불린 경쇄 가변 서열을 재배열할 수 없고 발현할 수 없는 유전자 변형 마우스가 사용될 수 있으며, 여기서 마우스는 내생성 마우스 카파 좌위에서 마우스 카파 불변 유전자에 작동 가능하게 연결된 인간 면역글로불린 서열에 의해 인코딩된 단지 1개 또는 2개의 인간 경쇄 가변 도메인을 발현한다. 2개의 상이한 인간 경쇄 가변 영역 유전자 분절 중 하나로부터 유래된 가변 도메인을 포함하는 동일한 경쇄와 회합하는 2개의 상이한 중쇄를 포함하는 완전 인간 이중특이적 항원-결합 분자를 생성하기 위해, 이러한 유전자 변형 마우스가 사용될 수 있다. (예를 들어, 이러한 조작된 마우스 및 이중특이적 항원-결합 분자를 생성하기 위한 이의 용도의 상세한 논의에 대해서는 US 2011/0195454 참조).
생체등가물
본 발명은 기재된 항체의 아미노산 서열과 다르지만 CD28 및/또는 MUC16에 결합하는 능력을 보유하는 아미노산 서열을 갖는 항원-결합 분자를 포괄한다. 이러한 변이체 분자는 부모 서열과 비교될 때 아미노산의 하나 이상의 첨가, 결실 또는 치환을 포함하지만, 기재된 항원-결합 분자와 본질적으로 등가인 생물학적 활성을 나타낸다. 마찬가지로, 본 발명의 항체 결합 분자-인코딩 DNA 서열은, 개시된 서열과 비교될 때 뉴클레오타이드의 하나 이상의 첨가, 결실 또는 치환을 포함하지만, 본 발명의 기재된 항체-결합 분자와 본질적으로 생체등가 항원 결합 분자를 인코딩하는 서열을 포괄한다. 이러한 변이체 아미노산 및 DNA 서열의 예는 상기에 논의되어 있다.
본 발명은 본원에 제시된 임의의 예시적인 항원-결합 분자에 대해 생체등가물인 항원-결합 분자를 포함한다. 2개의 항원-결합 단백질 또는 항체는, 예를 들어, 흡수 속도 및 정도가 단일 용량 또는 다중 용량으로 유사한 실험 조건 하에 동일한 몰 용량으로 투여될 때, 이들이 유의한 차이를 제시하지 않는 약제학적 등가물 또는 약제학적 대안물인 경우 생체등가물로 고려된다. 일부 항체는, 이들이 흡수 정도는 동등하지만 흡수 속도가 동등하지 않으며, 이러한 흡수 속도에서의 이러한 차이가 의도적이고 표지화에 반영되고, 예를 들어 만성적인 사용 시 효과적인 신체 약물 농도의 달성에 필수적이지 않으며, 연구된 특정 약물에 대해 의학적으로 유의하지 않은 것으로 간주되기 때문에, 여전히 생체등가인 것으로 간주될 수 있는 경우, 등가물 또는 약제학적 대용물로 간주될 것이다.
일 구현예에서, 2개의 항원-결합 단백질은 이의 안전성, 순도 또는 약효에서 임상적으로 유의미한 차이가 없는 경우 생체등가이다.
일 구현예에서, 2개의 항원-결합 단백질은, 전환 없이 지속되는 치료법과 비교하여, 면역원성의 임상적으로 유의한 변화, 또는 감소된 효과성을 포함한 예상되는 유해 효과의 위험의 증가 없이 환자가 기준 생성물과 생물학적 생성물 사이에서 1회 이상 전환될 수 있는 경우 생체등가이다.
일 구현예에서, 2개의 항원-결합 단백질은 이들 단백질이 둘 다 사용 조건 또는 조건들에 대한 공통의 작용 기전 또는 기전들에 의해 이러한 기전이 알려져 있는 정도까지 작용하는 경우 생체등가이다.
생체등가물은 생체내 및 시험관내 방법에 의해 실증될 수 있다. 생체등가물의 측정은, 예를 들어, (a) 항체 또는 이의 대사산물의 농도가 혈액, 혈장, 혈청, 또는 다른 생물학적 유체에서 시간의 함수로서 측정되는, 인간 또는 다른 포유류에서의 생체내 시험; (b) 인간 생체내 생체이용률 데이터와 상관관계가 있고 이를 합리적으로 예측하는 시험관내 시험; (c) 항체(또는 이의 표적)의 적절한 급성 약리학적 효과가 시간의 함수로서 측정되는, 인간 또는 다른 포유류에서의 생체내 시험; 및 (d) 항체의 안전성, 효능, 또는 생체이용률 또는 생체등가를 확립하는 잘 제어된 임상 시험을 포함한다.
본원에 제시된 예시적인 이중특이적 항원-결합 분자의 생체등가 변이체는, 예를 들어, 잔기 또는 서열의 다양한 치환의 형성 또는 생물학적 활성에 필요하지 않은 말단 또는 내부 잔기 또는 서열의 결실에 의해 구축될 수 있다. 예를 들어, 생물학적 활성에 필수적이지 않은 시스테인 잔기는 복원 시 불필요한 또는 부정확한 분자내 이황화 가교의 형성을 방지하기 위해 결실되거나 다른 아미노산으로 대체될 수 있다. 다른 맥락에서, 생체등가 항체는 항체의 글리코실화 특징을 변형하는 아미노산 변화, 예를 들어, 글리코실화를 없애거나 또는 제거하는 돌연변이를 포함하는 본원에 제시된 예시적인 이중특이적 항원-결합 분자의 변이체를 포함할 수 있다.
종 선택성 및 종 교차-반응성
소정의 구현예에 따르면, 본 발명은 인간 CD28에 결합하지만 다른 종으로부터의 CD28에 결합하지 않는 항원-결합 분자를 제공한다. 본 발명은 또한, 인간 MUC16에 결합하지만 다른 종으로부터의 MUC16에 결합하지 않는 항원-결합 분자를 제공한다. 본 발명은 또한, 인간 CD28에 그리고 하나 이상의 비-인간 종으로부터의 CD28에 결합하는 항원-결합 분자; 및/또는 인간 MUC16에 그리고 하나 이상의 비-인간 종으로부터의 MUC16에 결합하는 항원-결합 분자를 포함한다.
본 발명의 소정의 예시적인 구현예에 따르면, 인간 CD28 및/또는 인간 MUC16에 결합하고 경우에 따라 마우스, 래트, 기니피그, 햄스터, 게르빌루스쥐, 돼지, 고양이, 개, 토끼, 염소, 양, 소, 말, 낙타, 시노몰구스, 마모셋, 레서스 또는 침팬지 CD28 및/또는 MUC16 중 하나 이상에 결합할 수 있거나 결합하지 않을 수 있는 항원-결합 분자가 제공된다. 예를 들어, 본 발명의 특정 예시적인 구현예에서, 인간 CD28 및 시노몰구스 CD28에 결합하는 제1 항원-결합 도메인, 및 인간 MUC16에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항원-결합 분자가 제공된다.
면역접합체
본 발명은 치료적 모이어티("면역접합체"), 예컨대 세포독소, 화학치료적 약물, 면역억제제 또는 방사성 동위원소에 접합된 항원-결합 분자를 포괄한다. 세포독성제는 세포에 유해한 임의의 제제를 포함한다. 면역접합체를 형성하는 데 적합한 세포독성제 및 화학치료제의 예는 당업계에 알려져 있다(예를 들어, WO 05/103081 참조).
치료 제형 및 투여
본 발명은 본 발명의 항원-결합 분자를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 향상된 이전(transfer), 전달, 관용성 등을 제공하는 적합한 담체, 부형제 및 다른 제제와 함께 제형화된다. 다수의 적절한 제형은 모든 제약화학자에게 알려져 있는 처방집인 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA]에서 찾을 수 있다. 이들 제형은 예를 들어, 분말, 페이스트, 연고, 젤리, 왁스, 오일, 지질, 소포를 함유한 지질(양이온성 또는 음이온성)(예를 들어, LIPOFECTIN™, Life Technologies, 미국 캘리포니아주 칼즈배드 소재), DNA 접합체, 무수 흡수성 페이스트, 수-중-유 및 유-중-수 에멀젼, 에멀젼 카르보왁스(다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜), 반-고체 겔, 및 카르보왁스를 함유한 반-고체 혼합물을 포함한다. 또한, 문헌[Powell 등 "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311]을 참조한다.
환자에게 투여되는 항원-결합 분자의 용량은 환자의 연령과 체격, 표적 질환, 상태, 투여 경로 등에 따라 달라질 수 있다. 바람직한 용량은 전형적으로 체중 또는 체표면적에 따라 계산된다. 본 발명의 이중특이적 항원-결합 분자가 성인 환자의 치료 목적으로 사용되는 경우, 본 발명의 이중특이적 항원-결합 분자를 통상적으로 약 0.01 내지 약 20 mg/kg 체중, 보다 바람직하게는 약 0.02 내지 약 7, 약 0.03 내지 약 5, 또는 약 0.05 내지 약 3 mg/kg 체중의 단일 용량으로 정맥내 투여하는 것일 유리할 수 있다. 질병의 중증도에 따라, 치료의 빈도 및 기간이 조정될 수 있다. 이중특이적 항원-결합 분자의 투여에 효과적인 투약량 및 스케쥴은 경험적으로 결정될 수 있으며; 예를 들어, 환자 진행이 주기적인 평가로 모니터링될 수 있고, 그에 따라 용량이 조정될 수 있다. 더욱이, 당업계에 잘 알려져 있는 방법(예를 들어, 문헌[Mordenti 등, 1991, Pharmaceut. Res. 8:1351])을 사용하여 투약량의 종간(interspecies) 스케일링을 수행할 수 있다.
다양한 전달 시스템, 예를 들어, 리포좀 내 캡슐화, 마이크로입자, 마이크로캡슐, 돌연변이체 바이러스를 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체 매개 세포내이입이 알려져 있고 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하는 데 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌 [Wu 등 (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432] 참조). 도입 방법은 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비강내, 경막외 및 경구 경로를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 상기 조성물은 임의의 편리한 경로, 예를 들어, 주입 또는 볼루스 주사(bolus injection)에 의해, 상피 또는 점막피부 내벽(예를 들어, 구강 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있고, 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신적 또는 국소적일 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 표준 바늘 및 주사기를 이용하여 피하로 또는 정맥내로 전달될 수 있다. 게다가, 피하 전달과 관련하여, 펜 전달 장치는 본 발명의 약제학적 조성물을 전달하는 데 용이하게 적용된다. 이러한 펜 전달 장치는 재사용 가능하거나 일회용일 수 있다. 재사용 가능한 펜 전달 장치는 일반적으로, 약제학적 조성물을 함유하는 교체 가능한 카트리지를 이용한다. 일단 카트리지 내의 모든 약제학적 조성물이 투여되고 카트리지가 비워지면, 빈 카트리지는 용이하게 폐기되고, 상기 약제학적 조성물을 함유하는 새로운 카트리지로 대체될 수 있다. 그 후에, 상기 펜 전달 장치는 재사용될 수 있다. 일회용 펜 전달 장치에는 교체 가능한 카트리지가 없다. 그보다는, 상기 일회용 펜 전달 장치는 상기 장치 내의 저장조에 보유된 약제학적 조성물로 사전충전된다. 일단 저장조에서 약제학적 조성물이 비워지면, 전체 장치가 폐기된다.
다수의 재사용 가능한 펜 및 자동주사기 전달 장치가 본 발명의 약제학적 조성물의 피하 전달에 적용된다. 예는 몇 가지 언급하자면, AUTOPEN™(Owen Mumford, Inc., 영국 우드스톡 소재), DISETRONIC™ 펜(Disetronic Medical Systems, 스위스 베르그도프 소재), HUMALOG MIX 75/25™ 펜, HUMALOG™ 펜, HUMALIN 70/30™ 펜(Eli Lilly and Co., 미국 인디애나주 인디애나폴리스 소재), NOVOPEN™ I, II 및 III(Novo Nordisk, 덴마크 코펜하겐 소재), NOVOPEN JUNIOR™(Novo Nordisk, 덴마크 코펜하겐 소재), BD™ 펜(Becton Dickinson, 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™, 및 OPTICLIK™(Sanofi-aventis, 독일 프랑크푸르트 소재)을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물의 피하 전달에 적용되는 일회용 펜 전달 장치의 예는 일부만 언급하자면, SOLOSTAR™ 펜(Sanofi-aventis), FLEXPEN™(Novo Nordisk) 및 KWIKPEN™(Eli Lilly), SURECLICK™ 자동주사기(Amgen, 미국 캘리포니아주 사우전드 오크스 소재), PENLET™(Haselmeier, 독일 스투트가르트 소재), EPIPEN(Dey, L.P.) 및 HUMIRA™ 펜(Abbott Labs, 미국 일리노이주 애봇 파크 소재)을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
소정의 상황에서, 상기 약제학적 조성물은 제어된 방출 시스템에서 전달될 수 있다. 일 구현예에서, 펌프가 사용될 수 있다(상기 Langer; 문헌[Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201] 참조). 또 다른 구현예에서, 중합체성 물질이 사용될 수 있으며; 문헌[Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise(eds.), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Florida]를 참조한다. 더 다른 구현예에서, 제어 방출 시스템은 조성물의 표적 근처에 배치될 수 있어서, 전신 용량의 일부만을 필요로 한다(예를 들어, 문헌[Goodson, 1984, Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138] 참조). 다른 제어 방출 시스템은 문헌[Langer, 1990, Science 249:1527-1533]에 의한 검토에서 논의된다.
주사 가능한 조제물은 정맥내, 피하, 피부내 및 근육내 주사, 드립 주입 등을 위한 투약 형태를 포함할 수 있다. 이들 주사 가능한 조제물은 공개적으로 알려진 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기 주사 가능한 조제물은, 예컨대 주사에 통상적으로 사용되는 멸균 수성 배지 또는 유성 배지에 상기 기재된 항체 또는 이의 염을 용해시키거나, 현탁시키거나 또는 에멀젼화함으로써 제조될 수 있다. 주사용 수성 배지로서, 예를 들어, 생리 식염수, 글루코스 및 다른 보조제를 함유하는 등장성 용액 등이 있으며, 이들은 적절한 가용화제, 예를 들어 알코올(예를 들어, 에탄올), 폴리알코올(예를 들어, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜), 비이온성 계면활성제[예를 들어, 폴리소르베이트 80, HCO-50(수소화된 피마자유의 폴리옥시에틸렌(50 몰) 부가물)] 등과 조합하여 사용될 수 있다. 유성 매질로서, 벤질 벤조에이트, 벤질 알코올 등과 같은 가용화제와 조합하여 사용될 수 있는 예를 들어, 참기름, 대두유 등이 이용된다. 그러므로 제조된 주사액은 바람직하게는, 적절한 앰플에 충전된다.
유리하게는, 상기 기재된 경구 또는 비경구 용도를 위한 약제학적 조성물은 활성 성분의 용량에 맞춰진 단위 용량의 투약 형태로 제조된다. 단위 용량의 이러한 투약 형태는 예를 들어, 정제, 알약, 캡슐, 주사액(앰플), 좌제 등을 포함한다. 함유된 전술된 항체의 양은 일반적으로 단위 용량 투약 형태 당 약 5 내지 약 500 mg이고; 특히 주사 형태의 경우에는, 전술된 항체가 다른 투약 형태에 대해 약 5 내지 약 100 mg 및 약 10 내지 약 250 mg으로 함유되는 것이 바람직하다.
항원-결합 분자의 치료적 용도
본 발명은 CD28 및 표적 항원(예를 들어, MUC16)에 특이적으로 결합하는 항-CD28 항체 또는 이중특이적 항원-결합 분자를 포함하는 치료적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다. 치료적 조성물은 본원에 개시된 바와 같은 임의의 항체 또는 이중특이적 항원-결합 분자 및 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 표현 "이를 필요로 하는 대상체"는 암의 하나 이상의 증상 또는 적응증을 나타내는 인간 또는 비-인간 동물(예를 들어, 종양을 나타내거나 본원 하기에 언급된 임의의 암을 앓고 있는 대상체), 또는 MUC16 활성의 억제 또는 감소로부터 또는 MUC16 + 세포의 고갈로부터 이익을 얻을 대상체를 의미한다.
본 발명의 항체 또는 이중특이적 항원-결합 분자(및 이를 포함하는 치료적 조성물)은, 그 중에서도, 면역 반응의 자극, 활성화, 및/또는 표적화가 유익할 임의의 질환 또는 장애의 치료에 유용하다. 특히, 본 발명의 항-CD28/항-MUC16 이중특이적 항원-결합 분자는 MUC16 발현 또는 MUC16+ 세포의 활성 또는 증식과 관련되거나 이에 의해 매개되는 임의의 질환 또는 장애의 치료, 예방 및/또는 개선에 사용될 수 있다. 본 발명의 치료적 방법이 달성되는 작용 기전은 효과기 세포, 예를 들어, T 세포의 존재 하에 MUC16를 발현하는 세포의 사멸화를 포함한다. 본 발명의 이중특이적 항원-결합 분자를 사용하여 저해되거나 사멸화될 수 있는 MUC16를 발현하는 세포는 예를 들어, 종양원성 난소 세포를 포함한다.
본 발명의 항원-결합 분자는, 예를 들어, 결장암, 폐암, 유방암, 신장암, 및/또는 하위유형의 방광암에서 발생하는 1차 및/또는 전이성 종양을 치료하는 데 사용될 수 있다. 소정의 예시적인 구현예에 따르면, 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자는 난소암을 치료하는 데 사용된다.
본 발명은 또한, 대상체에서 잔류암을 치료하는 방법을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "잔류암"은 대상체에서 항암 요법 치료법에 의한 치료 후 하나 이상의 암성 세포가 존재하거나 지속되는 것을 의미한다.
소정의 양태에 따르면, 본 발명은, 대상체가 다른 유형의 항암 치료법에 비-반응성인 것으로 제시된 후에, 본원 어디에나 기재된 하나 이상의 이중특이적 항원-결합 분자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, MUC16 발현과 관련된 질환 또는 장애(예를 들어, MUC16 발현암, 예컨대 난소암)를 치료하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은, 대상체가 암, 예를 들어, 난소암을 앓고 있는 환자에 대한 표준 치료를 받은 후 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주 또는 4주, 2개월, 4개월, 6개월, 8개월, 1년 이상째에 항-CD28/항-MUC16 이중특이적 항원-결합 분자를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 난소암을 치료하는 방법을 포함한다. 다른 양태에서, IgG4 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이적 항원-결합 분자(항-CD28/항-MUC16 이중특이적 항원 결합 분자)는 처음에 하나 이상의 시점에서 대상체에게 투여되며(예를 들어, 난소암 세포의 강력한 초기 고갈을 제공하기 위해), 뒤이어 상이한 IgG 도메인, 예컨대 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 동등한 이중특이적 항원-결합 분자가 후속한 시점에 투여된다. 본 발명의 항-CD28/항-MUC16 항체는 다른 이중특이적 항원 결합 분자, 예컨대 항-MUC16/항-CD3 이중특이적 항체와 함께 사용될 수 있는 것으로 간주된다. 본 발명의 이중특이적 항체는 체크포인트 저해제, 예를 들어, PD-1 및 CTLA-4 및 다른 표적을 표적화하는 것들과 함께 사용될 것으로 간주된다. 동일한 종양 항원(예를 들어, MUC16)을 표적화하는 2가지 이중특이적 항체를 조합하는 것이 유리할 수 있으나, 이때, 이중특이적 항체 중 하나는 T 세포 상의 CD3을 표적화하고 다른 이중특이적 항체는 CD28과 같은 공동-자극자 분자를 표적화한다. 이러한 조합은 종양 세포 사멸화를 증강시키기 위해 단독으로 사용될 수 있거나, 체크포인트 저해제와 조합하여 사용될 수 있다.
예의 MUC16 발현암은 난소암, 유방암, 자궁내막암, 췌장암, 비-소세포 폐암, 간내 담관암-덩어리 형성 유형(intrahepatic cholangiocarcinoma-mass forming type), 자궁경부의 선암종, 및 위장관의 선암종을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
조합 치료법 및 제형
본 발명은 본원에 기재된 임의의 예시적인 항체 및 이중특이적 항원-결합 분자를 하나 이상의 부가적인 치료적 활성 구성요소와 조합하여 포함하는 조성물 및 치료 제형, 및 이러한 조합을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법을 포함한다.
본 발명의 항원-결합 분자와 조합되거나 조합되어 투여될 수 있는 예시적인 부가적인 치료제는 예를 들어, 화학치료법, 방사선 치료법, PD-1(예를 들어, 항-PD-1 항체, 예컨대 펨브롤리주맙, 니볼루맙 또는 세미플리맙(US9,987,500 참조)), CTLA-4, LAG3, TIM3, 및 다른 것들을 표적화하는 체크포인트 저해제, 분자, 예컨대 GITR, OX40, 4-1BB 및 다른 것들을 표적화하는 공동자극성 작용제 2가 항체, CD3x 이중특이적 항체(예를 들어, WO2017/053856A1, WO2014/047231A1, WO2018/067331A1 및 WO2018/058001A1 참조), MUC16 X CD3을 표적화하는 다른 항체(예를 들어, WO2017/053856A1 참조) 및 다른 공동자극성 CD28 이중특이적 항체를 포함한다.
본 발명의 항체와 조합되어 유익하게 투여될 수 있는 다른 제제는 예를 들어, 타목시펜(tamoxifen), 아로마타제(aromatase) 저해제, 및 사이토카인, 예컨대 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18, 또는 이들의 각각의 수용체에 결합하는 저분자 사이토카인 저해제 및 항체를 포함한 사이토카인 저해제를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물(예를 들어, 본 명세서에 개시된 바와 같은 항-CD28/항-MUC16 이중특이적 항원-결합 분자를 포함하는 약제학적 조성물)은 또한, "ICE": 이포스파마이드(예를 들어, Ifex®), 카보플라틴(예를 들어, Paraplatin®), 에토포사이드(예를 들어, Etopophos®, Toposar®, VePesid®, VP-16); "DHAP": 덱사메타손(예를 들어, Decadron®), 시타라빈(예를 들어, Cytosar-U®, 시토신 아라비노사이드, ara-C), 시스플라틴(예를 들어, Platino®-AQ); 및 "ESHAP": 에토포사이드(예를 들어, Etopophos®, Toposar®, VePesid®, VP-16), 메틸프레드니솔론(예를 들어, Medrol®), 고용량 시타라빈, 시스플라틴(예를 들어, Platinol®-AQ)으로부터 선택되는 하나 이상의 치료적 조합을 포함하는 치료 요법의 부분으로서 투여될 수 있다.
본 발명은 또한, 본원에 언급된 임의의 항원-결합 분자 및 VEGF, Ang2, DLL4, EGFR, ErbB2, ErbB3, ErbB4, EGFRvIII, cMet, IGF1 R, B-raf, PDGFR-o, PDGFR-I3, FOLH1, PRLR, STEAP1, STEAP2, TMPRSS2, MSLN, CA9, 유로플라킨, 또는 임의의 앞서 언급된 사이토카인 중 하나 이상의 저해제를 포함하는 치료적 조합을 포함하며, 여기서 저해제는 앱타머, 안티센스 분자, 리보자임, siRNA, 펩티바디, 나노바디 또는 항체 단편(예를 들어, Fab 단편; F(ab')2 단편; Fd 단편; Fv 단편; scFv; dAb 단편; 또는 다른 조작된 분자, 예컨대 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 미니바디 및 최소 인식 단위)을 포함한다. 본 발명의 항원-결합 분자는 또한, 항바이러스제, 항생제, 진통제, 코르티코스테로이드 및/또는 NSAID와 조합되어 투여되고/되거나 공동-제형화될 수 있다. 본 발명의 항원-결합 분자는 또한, 방사선 치료 및/또는 통상적인 화학치료법, 또는 체크포인트 저해제 또는 다른 이중특이적 항체를 포함한 생물학적 물질을 이용한 치료를 포함하는 치료 요법의 부분으로서 투여될 수 있다.
본 발명은 하나 이상의 화학치료제와 조합된 본원에 기재된 임의의 항원-결합 분자를 포함하는 조성물 및 치료적 제형을 포함한다. 화학치료제의 예는 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 사이클로포스파미드(Cytoxan™); 알킬 설포네이트, 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카르보쿠온(carboquone), 메투레도파(meturedopa), 및 우레도파(uredopa); 에틸렌이민 및 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스파오라미드 및 트리메틸올로멜라민을 포함하는 메틸아멜라민; 질소 머스타드, 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비신, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴; 항생제, 예컨대 아클라시노마이신, 액티노마이신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르루신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 대사 길항 물질, 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU); 엽산 유사체, 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르(carmofur), 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-부신제(anti-adrenal), 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충물, 예컨대 프롤린산; 아세글락톤; 알도포스파미드 글리코사이드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸하이드라자이드; 프로카르바진; PSK™; 라족산; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2''-트리클로로트리에틸아민; 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노사이드("Ara-C"); 사이클로포스파미드; 티오테파; 탁산, 예를 들어, 파클리탁셀(Taxol™, Bristol-Myers Squibb Oncology, 미국 뉴저지주 프린스턴) 및 도세탁셀(Taxotere™; Aventis Antony, 프랑스); 클로람부실; 겜시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예컨대 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포사이드(VP-16); 이포스파미드; 미토마이신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포사이드; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다(xeloda); 이반드로네이트; CPT-11; 토포이소머라제 저해제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴(DMFO); 레티노산; 에스퍼아미신; 카페시타빈; 및 상기 중 임의의 약제학적으로 허용 가능한 염, 산 또는 유도체를 포함한다. 또한, 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 저해하는 작용을 하는 항-호르몬제, 예를 들어, 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타제 저해적 4(5)-이미다졸, 4-하이드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY 117018, 오나프리스톤, 및 토레미펜(Fareston)을 포함한 항-에스트로겐; 및 플루타마이드, 닐루타마이드, 비칼루타마이드, 류프롤라이드, 및 고세렐린과 같은 항-안드로겐; 및 상기 중 임의의 약제학적으로 허용 가능한 염, 산 또는 유도체가 이 정의에 포함된다.
부가적인 치료적 활성 구성요소(들)는 본 발명의 항원-결합 분자의 투여 바로 전에, 동시에 또는 직후에 투여될 수 있다; (본 발명의 목적을 위해, 이러한 투여 요법은 부가적인 치료적 활성 구성요소와 "조합된" 항원-결합 분자의 투여인 것으로 간주됨).
본 발명은 본 발명의 항원-결합 분자가 본원의 어디에나 기재된 바와 같은 부가적인 치료적 활성 구성요소(들) 중 하나 이상과 함께 공동-제형화되는 약제학적 조성물을 포함한다.
투여 요법
본 발명의 특정 구현예에 따르면, 항원-결합 분자(예를 들어, MUC16 및 CD28에 특이적으로 결합하는 항-CD28 항체 또는 이중특이적 항원-결합 분자)의 다중 투여량이 대상에게 정해진 시간 과정에 걸쳐 투여될 수 있다. 본 발명의 이러한 양태에 따른 방법은 본 발명의 항원-결합 분자의 다중 용량을 대상체에게 순차적으로 투여하는 단계를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "순차적으로 투여하는"은, 각각의 용량의 항원-결합 분자가 상이한 시점에, 예를 들어 사전에 결정된 간격(예를 들어, 시간, 일, 주 또는 개월)으로 분리된 상이한 일수로 대상체에게 투여된다는 것을 의미한다. 본 발명은 환자에게 단일 초기 용량의 항원-결합 분자, 뒤이어 하나 이상의 2차 용량의 항원-결합 분자, 및 선택적으로 뒤이어 하나 이상의 3차 용량의 항원-결합 분자를 순차적으로 투여하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다.
용어 "초기 용량", "2차 용량" 및 "3차 용량"은 본 발명의 항원-결합 분자의 시간적 투여 순서를 지칭한다. 따라서, "초기 용량"은 치료 요법의 시작 시 투여되는 용량이며("기준선 용량"으로도 지칭됨); "2차 용량"은 초기 용량 이후에 투여되는 용량이고; "3차 용량"은 2차 용량 이후에 투여되는 용량이다. 초기, 2차 및 3차 용량은 모두 동일한 양의 항원-결합 분자를 함유할 수 있지만, 일반적으로 투여 빈도의 측면에서 서로 상이할 수 있다. 그러나, 소정의 구현예에서, 초기, 2차 및/또는 3차 용량에 함유된 항원-결합 분자의 양은 치료 과정 동안 서로 다르다(예를 들어, 적절하다면 상향 또는 하향 조정됨). 소정의 구현예에서, 2회 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 또는 5회)의 용량이 "로딩 용량"으로서 치료 요법의 시작 시 투여되고, 뒤이어 덜 빈번한 기준으로 투여되는 후속 용량(예를 들어, "유지 용량")이 투여된다.
본 발명의 하나의 예시적인 구현예에서, 각각의 2차 및/또는 3차 용량은 바로 이전의 용량 이후에 1 내지 26주(예를 들어, 1, 1½, 2, 2½, 3, 3½, 4, 4½, 5, 5½, 6, 6½, 7, 7½, 8, 8½, 9, 9½, 10, 10½, 11, 11½, 12, 12½, 13, 13½, 14, 14½, 15, 15½, 16, 16½, 17, 17½, 18, 18½, 19, 19½, 20, 20½, 21, 21½, 22, 22½, 23, 23½, 24, 24½, 25, 25½, 26, 26½주 이상)에 투여된다. 본원에 사용된 바와 같이, 어구 "바로 이전의 용량"은, 다중 투여 순서에서, 순서상 개입(intervening) 용량 없이 바로 다음 용량의 투여 전에 환자에게 투여되는 항원-결합 분자의 용량을 의미한다.
본 발명의 이 양태에 따른 방법은 환자에게 2차 및/또는 3차 용량의 항원-결합 분자(예를 들어, MUC16 및 CD28에 특이적으로 결합하는 항-CD28 항체 또는 이중특이적 항원-결합 분자)를 임의의 횟수로 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 소정의 구현예에서, 단일 2차 용량만 환자에게 투여된다. 다른 구현예에서, 2회 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8회 이상)의 2차 용량이 환자에게 투여된다. 마찬가지로, 소정의 구현예에서, 단일 3차 용량만 환자에게 투여된다. 다른 실시형태에서, 2회 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8회 이상)의 3차 용량이 환자에게 투여된다.
다중 2차 용량을 수반하는 구현예에서, 각각의 2차 용량은 다른 2차 용량과 동일한 빈도로 투여될 수 있다. 예를 들어, 각각의 2차 용량은 바로 앞의 용량 후 1주 내지 2주째에 환자에게 투여될 수 있다. 유사하게는, 다중 3차 용량을 수반하는 구현예에서, 각각의 3차 용량은 다른 3차 용량과 동일한 빈도로 투여될 수 있다. 예를 들어, 각각의 3차 용량은 바로 앞의 용량 후 2주 내지 4주째에 환자에게 투여될 수 있다. 대안적으로, 2차 및/또는 3차 용량이 환자에게 투여되는 빈도는 치료 요법 과정에 걸쳐 다를 수 있다. 투여 빈도는 또한, 치료 과정 동안 임상 시험 후 개별적인 환자의 필요에 따라 의사에 의해 조정될 수 있다.
일 구현예에서, 항원-결합 분자(예를 들어, MUC16 및 CD28에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항원-결합 분자)의 대상에게 체중-기반 용량으로 투여된다. "체중-기반 용량"(예를 들어, mg/kg의 용량)은 대상의 체중에 따라 변할 수 있는 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 이중특이적 항원-결합 분자의 용량이다.
또 다른 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 이중특이적 항원-결합 분자는 고정된 용량으로 대상에게 투여된다. "고정 용량"(예를 들어, mg의 용량)은, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 이중특이적 항원-결합 분자의 1회 용량이 체중과 같은 임의의 특정 대상-관련 인자들과 관계 없이 모든 대상에 사용된다는 점을 의미한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 이중특이적 항원-결합 분자의 고정 용량은 미리결정된 체중 또는 연령을 기준으로 한다.
일반적으로, 본 발명의 항원 결합 분자의 적합한 용량은 수용자의 체중 1 kg 당 약 0.001 내지 약 200.0 밀리그램, 일반적으로는 체중 1 kg 당 약 1 내지 50 mg의 범위일 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 이중특이적 항원-결합 분자는 단일 용량 당 약 0.1 mg/kg, 약 0.2 mg/kg, 약 0.5 mg/kg, 약 1 mg/kg, 약 1.5 mg/kg, 약 2 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 10 mg/kg, 약 15 mg/kg, 약 20 mg/kg, 약 25 mg/kg, 약 30 mg/kg, 약 40 mg/kg, 약 50 mg/kg로 투여될 수 있다. 언급된 값에 대해 중간치의 값 및 범위는 또한 본 발명의 일부로 의도된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 약 25 mg 내지 약 2500 mg의 고정 용량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 약 25 mg, 약 30 mg, 약 50 mg, 약 75 mg, 약 100 mg, 약 125 mg, 약 150 mg, 약 175 mg, 200 mg, 약 225 mg, 약 250 mg, 약 275 mg, 약 300 mg, 약 325 mg, 약 350 mg, 약 375 mg, 약 400 mg, 약 425 mg, 약 450 mg, 약 475 mg, 약 500 mg, 약 525 mg, 약 550 mg, 약 575 mg, 약 600 mg, 약 625 mg, 약 650 mg, 약 675 mg, 약 700 mg, 약 725 mg, 약 750 mg, 약 775 mg, 약 800 mg, 약 825 mg, 약 850 mg, 약 875 mg, 약 900 mg, 약 925 mg, 약 950 mg, 약 975 mg, 약 1000 mg, 약 1500 mg, 약 2000 mg, 또는 약 2500 mg의 고정 용량으로 투여된다. 언급된 값에 대해 중간치의 값 및 범위는 또한 본 발명의 일부로 의도된다.
항체의 진단적 용도
본 발명의 이중특이적 항체는 또한, 예를 들어, 진단 목적의 시료에서 CD28 또는 MUC16, 또는 CD28-발현 세포 또는 MUC16-발현 세포를 검출하고/하거나 측정하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 항-CD28 x MUC16 항체 또는 이의 단편은 CD28 또는 MUC16의 비정상 발현(예를 들어, 과발현, 저발현, 발현 결여 등)을 특징으로 하는 질병 또는 질환을 진단하는 데 사용될 수 있다. CD28 또는 MUC16를 위한 예시적인 진단 분석은, 예를 들어, 환자로부터 수득된 시료를 본 발명의 항체와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서, 항체는 검출 가능한 표지 또는 리포터 분자로 표지된다. 대안적으로, 비표지 항체는 그 자체가 검출 가능하게 표지되는 2차 항체와 조합되어 진단 용도에 사용될 수 있다. 검출 가능한 표지 또는 리포터 분자는 방사성 동위원소, 예컨대 3H, 14C, 32P, 35S 또는 125I; 형광 또는 화학발광 모이어티, 예컨대 플루오레세인 이소티오시아네이트 또는 로다민; 또는 효소, 예컨대 알칼린 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 또는 루시퍼라아제일 수 있다. 시료에서 CD28 또는 MUC16를 검출하거나 측정하는 데 사용될 수 있는 구체적인 예시적 분석은 효소-연결 면역흡착 검정법(ELISA), 방사선 면역검정법(RIA), 및 형광-활성화 세포 분류(FACS)를 포함한다. 본 발명에 따른 CD28 또는 MUC16 진단 검정법에 사용될 수 있는 시료는 정상적인 또는 병리학적 조건 하에, 검출 가능한 양의 CD28 또는 MUC16 단백질 또는 이의 단편을 함유하는 환자로부터 수득 가능한 임의의 조직 또는 유체 시료를 포함한다. 일반적으로, 기준선 또는 표준 CD28 또는 MUC16 수준을 처음에 확립하기 위해 건강한 환자(예를 들어, 비정상적인 CD28 또는 MUC16 수준 또는 활성과 관련된 질환 또는 질병을 앓고 있지 않는 환자)로부터 수득된 특정 시료 내 CD28 또는 MUC16 수준이 측정될 것이다. 그 후에, CD28 또는 MUC16의 이러한 기준선 수준은 CD28 또는 MUC16 관련 질환 또는 질병을 갖는 것으로 의심되는 개체로부터 수득된 시료에서 측정된 CD28 또는 MUC16 수준에 비교될 수 있다.
실시예
하기 실시예는 당업자에게 본 발명의 방법 및 조성물을 제조하고 사용하는 방법에 대한 완전한 개시 및 설명을 제공하기 위해 제시되며, 본 발명자들이 그들의 발명으로 간주하는 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다. 사용된 숫자(예를 들어, 양, 온도 등)의 측면에서 정확성을 보장하고자 노력하였지만, 일부 실험적 오차 및 편차가 고려되어야 한다. 다르게 지시되지 않는 한, 부(part)는 중량부이고, 분자량은 평균 분자량이며, 온도는 섭씨도이고, 압력은 대기압에 또는 대기압 근처이다.
배경기술
T 세포 활성화는 T 세포 수용체(TCR)/CD3 복합체가 펩타이드-MHC 복합체에 결합하는 경우 개시되며("신호 1"); 그 후에, 활성화는 T 세포가 표적 세포 상의 이의 동족(cognate) 리간드(들)에 결합 시 제2 "공동-자극성" 수용체, 예컨대 CD28 수용체의 연대에 의해 증강된다("신호 2"). 최근 기재된 CD3-기초 "이중특이적 항체"는 종래의 신호 1을 대체하며, 종양-특이적 항원(TSA)을 이중특이적 항체의 하나의 아암과 결합함으로써 T 세포를 종양 세포에 연결하고, TCR/CD3을 다른 것에 가교시킴으로써 작용한다. 이들 소위 TSAxCD3 이중특이적 항체 중 일부가 암 환자에서 유망한 항-종양 효능을 실증하긴 하였지만, 이들의 활성은 여전히 최적화되어야 한다. 본원 어디에나 기재된 바와 같이, 제2 TSA를 T 세포 상의 공동-자극성 CD28 수용체에 가교시킴으로써 신호 2를 모방하는 신규 클래스의 이중특이적 항체가 본 발명에 도입된다. 이들 이중특이적 항체는 TSAxCD28 이중특이적 항체로 명명되었다. 본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 하나의 예시적인 항체는 난소암 항원(예를 들어, MUC16)에 특이적이다. T 세포를 광범위하게 활성화시키고 초기 임상 시험에서 뚜렷한 독성을 초래한 CD28 슈퍼작용제와는 달리, 이들 TSAxCD28 이중특이적 항체는 유전적으로-인간화된 면역-적격 마우스 모델에서, 또는 영장류에서 단독으로 사용된 경우 제한된 활성을 제시하고 독성을 제시하지 않는다. 그러나, TSAxCD3 이중특이적 항체와 조합된 경우, 본 발명의 예시적인 항체는 각종 이종 및 동계 종양 모델에서 T 세포와 이의 표적 세포 사이에서 인공 시냅스를 증강시키며, T 세포 활성화를 증대시키고, CD3-이중특이적 항체의 항-종양 활성을 두드러지게 향상시켰다. 이러한 신규 클래스의 CD28-공동-자극성 이중특이적 항체와 신생 클래스의 TSAxCD3 이중특이적 항체의 조합은 잠재적으로 증강된 항-종양 효능을 갖는 잘-관용화된,"기성품의(off-the-shelf)" 항체 치료법을 제공할 수 있다.
T 세포가 이의 세포성 표적 - 예컨대 바이러스-감염 세포 또는 종양 세포 - 를 인식하고 사멸화시키는 능력은 상호작용의 조화된 세트에 따라 달라진다. 이들 중에서도 TCR 복합체(회합된 CD3 γ, δ, ε, ζ 사슬을 포함함)에 의한 표적 세포의 인식 및 결합이 있고; 이러한 상호작용은 T 세포 활성화를 위한 "신호 1"로서 지칭되었다. TCR은 표적 세포의 표면 상에서 발현되는 MHC 단백질의 홈(groove)에 제시된 바이러스 또는 종양 세포를 인식할 수 있다. 이러한 결합은 전형적으로 낮은-친화성을 가지며; 따라서, 신호 1의 성공적인 촉발은, T 세포와 이의 표적 세포 사이의 계면을 따라 많은 TCR 복합체의 군집화를 요구하며, 이러한 계면은 면역 시냅스로 지칭되어 왔다(문헌[J. B. Huppa, M. M. Davis, T-cell-antigen recognition and the immunological synapse. Nat Rev Immunol 3, 973-983 (2003)]). 그 후에, T 세포 활성화 및 증식은 공동자극성 수용체, 예컨대 CD28과의 부가적인 상호작용에 의해 추가로 촉진된다("신호 2")(문헌[J. H. Esensten, Y. A. Helou, G. Chopra, A. Weiss, J. A. Bluestone, CD28 Costimulation: From Mechanism to Therapy. Immunity 44, 973-988 (2016)]). T 세포가 TCR 복합체를 통해 표적 세포를 인식하고, CD28이 프로페셔널 항원 제시 세포 또는 표적 세포 상의 이의 동족 리간드(들)(CD80/B7.1 및/또는 CD86/B7.2)에 결합하는 것을 통해 신호 2와 연대하는 경우, T 세포 활성화가 증강된다. 신호 1과 마찬가지로, CD28-매개 신호 2는 면역 시냅스에서 공동군집화를 통해 발생하는 것으로 생각된다.
종양-특이적 항원(TSA)에 대해 표적화된 종래의 모노클로날 항체는 지난 20년에 걸쳐 항-종양 치료제로서 사용되어 왔다(문헌[G. Salles 등, Rituximab in B-Cell Hematologic Malignancies: A Review of 20 Years of Clinical Experience. Adv Ther 34, 2232-2273 (2017)]; 문헌[M. V. Mateos 등, Daratumumab plus Bortezomib, Melphalan, and Prednisone for Untreated Myeloma. N Engl J Med 378, 518-528 (2018): W. Eiermann, G. International Herceptin Study, Trastuzumab combined with chemotherapy for the treatment of HER2-positive metastatic breast cancer: pivotal trial data. Ann Oncol 12 Suppl 1, S57-62 (2001)]; 문헌[J. M. Connors 등, Brentuximab Vedotin with Chemotherapy for Stage III or IV Hodgkin's Lymphoma. N Engl J Med 378, 331-344 (2018)]; 문헌[V. Dieras 등, Trastuzumab emtansine versus capecitabine plus lapatinib in patients with previously treated HER2-positive advanced breast cancer (EMILIA): a descriptive analysis of final overall survival results from a randomised, open-label, phase 3 trial. Lancet Oncol 18, 732-742 (2017)]). 그러나, 이러한 클래스의 항체는 T 세포 매개 세포독성을 유도하는 제한된 능력을 갖고 있으며, 그 대신에 항체-의존적 세포성 세포독성(ADCC) 및/또는 보체-의존적 세포독성(CDC)을 촉진함으로써, 또는 독소를 종양 세포에 전달함으로써 작용하였다. 최근, T 세포를 종양 세포에 연결하고 CD3/TCR 복합체(통상 CD3의 e 사슬을 통해)를 대리(surrogate) 기전을 통해 활성화시켜 신호 1을 모방함으로써 종양 세포의 T 세포-매개 사멸화를 효율적으로 촉발할 수 있는 새로운 클래스의 이중특이적 항체(TSAxCD3)가 출현하였다. 초기 버전의 이러한 이중특이적 항체(하나의 아암은 백혈병 세포 상의 CD19에 결합하는 한편, 다른 아암은 CD3에 결합함)는 최근에, B 세포 급성 림프모구성 백혈병에 대한 규제 승인을 받았다(문헌[R. Bargou 등, Tumor regression in cancer patients by very low doses of a T cell engaging antibody. Science 321, 974-977 (2008)]; 문헌[H. Kantarjian 등, Blinatumomab versus Chemotherapy for Advanced Acute Lymphoblastic Leukemia. N Engl J Med 376, 836-847 (2017)]). 최근, 더욱 진행된 버전의 이중특이적 항체는 비-호지킨 림프종 상의 CD20을 표적화하여 상기 림프종에 대해 양호한 활성을 갖는 것으로 제시되었다(문헌[E. J. Smith 등, A novel, native-format bispecific antibody triggering T-cell killing of B cells is robustly active in mouse tumor models and cynomolgus monkeys. Sci Rep 5, 17943 (2015)]; 문헌[L. L. Sun 등, Anti-CD20/CD3 T cell-dependent bispecific antibody for the treatment of B cell malignancies. Sci Transl Med 7, 287ra270 (2015)]; 문헌[M. Bacac 등, CD20-TCB with Obinutuzumab Pretreatment as Next-Generation Treatment of Hematologic Malignancies. Clin Cancer Res 24, 4785-4797 (2018)]; 문헌[R. Bannerji 등, Emerging Clinical Activity of REGN1979, an Anti-CD20 x Anti-CD3 Bispecific Antibody, in Patients with Relapsed/Refractory Follicular Lymphoma (FL), Diffuse Large B-Cell Lymphoma (DLBCL), and Other B-Cell Non-Hodgkin Lymphoma (B-NHL) Subtypes. American Society of Hematology, (2018)]; 문헌[L. Budde 등, Mosunetuzumab, a Full-Length Bispecific CD20/CD3 Antibody, Displays Clinical Activity in Relapsed/Refractory B-Cell Non-Hodgkin Lymphoma (NHL): Interim Safety and Efficacy Results from a Phase 1 Study. American Society of Hematology, (2018)]). 그러나, TSAxCD3 이중특이적 항체가 혈액학적 악성물에서 중요한 새로운 클래스의 면역치료법으로서 출현하긴 하지만, 교차-연구 비교(문헌[E. A. Zhukovsky, R. J. Morse, M. V. Maus, Bispecific antibodies and CARs: generalized immunotherapeutics harnessing T cell redirection. Curr Opin Immunol 40, 24-35 (2016)])는, 일부 경우에 이들이 개인화된 키메라 항원 수용체 T 세포(CAR-T) 치료법에서 나타나는 효능의 수준을 달성하지 않을 수 있음을 시사한다.
CAR-T 치료법의 강한 효능에 대한 이유 중 하나는, 키메라 항원 수용체(CAR)가 종양 세포 상의 이의 표적에 결합 시 신호 1(CD3z 사이토도메인의 일부를 통해)과 신호 2(예를 들어, CD28 사이토도메인의 일부를 통해) 둘 다를 제공하도록 조작된다는 것이다. 2가지 CAR-T 세포 치료법은 최근, B-세포 악성물에 대한 FDA 승인을 받았으며, 이들 둘 다 항원 CD19에 결합하고 이를 표적화함으로써 작용한다(문헌[S. S. Neelapu 등, Axicabtagene Ciloleucel CAR T-Cell Therapy in Refractory Large B Cell Lymphoma. N Engl J Med 377, 2531-2544 (2017)]; 문헌[S. J. Schuster 등, Chimeric Antigen Receptor T Cells in Refractory B-Cell Lymphomas. N Engl J Med 377, 2545-2554 (2017)]). CAR-T 세포 접근법은 중증 유해 효과, 예컨대 사이토카인 방출 증후군(CRS) 및 신경독성과 관련이 있을 수 있으며(문헌[S. S. Neelapu 등, Chimeric antigen receptor T-cell therapy - assessment and management of toxicities. Nat Rev Clin Oncol 15, 47-62 (2018)]; 문헌[J. Gust 등, Endothelial Activation and Blood-Brain Barrier Disruption in Neurotoxicity after Adoptive Immunotherapy with CD19 CAR-T Cells. Cancer Discov 7, 1404-1419 (2017)]; 문헌[A. Shimabukuro-Vornhagen 등, Cytokine release syndrome. J Immunother Cancer 6, 56 (2018)]); 화학치료적 요법을 예비조건화하기 위한 고도로-개인화된 제조 과정 및 요건으로 인해(문헌[S. S. Neelapu 등, Axicabtagene Ciloleucel CAR T-Cell Therapy in Refractory Large B Cell Lymphoma. N Engl J Med 377, 2531-2544 (2017)]; 문헌[S. J. Schuster 등, Chimeric Antigen Receptor T Cells in Refractory B-Cell Lymphomas. N Engl J Med 377, 2545-2554 (2017)]; 문헌[P. Salmikangas, N. Kinsella, P. Chamberlain, Chimeric Antigen Receptor T-Cells (CART-Cells) for Cancer Immunotherapy - Moving Target for Industry? Pharm Res 35, 152 (2018)]), 많은 환자는 적합한 후보인 것으로 여겨지지 않는다.
더 넓은 환자 집단에 대한 상대적으로 잘-관용되고 "기성품의" 치료적 해결방안으로서의 TSAxCD3 이중특이적 항체의 이점은, 상기 항체의 항-종양 활성이 추가로 최적화될 수 있을 경우, 특히 이것이 관용성을 희생시키지 않으면서 수행될 수 있을 경우, 또는 아마도 심지어 정상 세포와 대조적으로 종양 세포에 대한 특이성을 증가시킬 수 있을 경우, 증강될 것이다. 이를 위해, TSAxCD3 이중특이적 항체를, 신호 2를 독립적으로 활성화시키는 신규 클래스의 이중특이적 항체와 쌍을 이루는 것은 증강된 특이성에 대한 기회뿐만 아니라 잠재적인 증가된 효능을 제공할 수 있을 것으로 가정되었다. 따라서, 제2 클래스의 이중특이적 항체가 설계되었다. 이들 이중특이적 항체는 동일한 종양-특이적 항원 상의 제2 에피토프 또는 제2 별개의 종양 항원과 연대할 수 있을 것이며, 이때, 공동-자극성 수용체 CD28(TSAxCD28 이중특이적 항체)는 T 세포 상에 발현된다. TSA1xCD3과 TSA2xCD28의 조합은 신호 1과 신호 2 둘 다를 촉발하고, 이때 특이성은 두 에피토프 모두 또는 두 항원 모두를 발현하는 종양 세포에 대해서만 표적화되어 있으며, 증가된 특이성에 대한 기회와 함께 더 큰 항-종양 활성을 가능하게 함으로써 T 세포의 겨냥되고 증강된 대리 활성화를 가능하게 해야 한다.
난소 종양 바이오마커 CA-125를 방출하기 위해 절단되고(문헌[I. Mylonas 등, Immunohistochemical expression of the tumour marker CA-125 in normal, hyperplastic and malignant endometrial tissue. Anticancer Res 23, 1075-1080 (2003)]), 난소암을 표적으로 하는 TSAxCD28 공동자극성 이중특이적 항체(특정 암에서 높은 수준으로 발현되는 큰 통합 막 당단백질인 MUC16에 결합하는 MUC16xCD28 (문헌[H. Suh, K. Pillai, D. L. Morris, Mucins in pancreatic cancer: biological role, implications in carcinogenesis and applications in diagnosis and therapy. Am J Cancer Res 7, 1372-1383 (2017)]))의 생성 및 테스트를 본원에 기술한다. 유전적으로-인간화된 면역적격 마우스에서, 뿐만 아니라 시노몰구스 원숭이에서의 독성학 연구는, 이들 이중특이적 항체가 단일 제제로서 제한된 활성을 나타내고 독성을 나타내지 않음을 실증한다. 그러나, 이들 신규 공동-자극성 이중특이적 항체는 신생 클래스의 TSAxCD3 이중특이적 항체와 효과적으로 조합되어, 이종 및 동계 종양 모델에서 항-종양 반응을 증대시킬 수 있다. 종합하여, 이들 데이터는, 이러한 신규 클래스의 CD28-기초 이중특이적 항체(TSAxCD28)와 CD3-기초 이중특이적 항체(TSAxCD3)의 조합이 두드러지게 증강되고 상승작용적인 항-종양 활성을 갖는 잘-관용화된, "기성품의" 생물학적 해결방안을 제공할 수 있음을 시사한다.
실시예 1. 항-MUC16xCD28 항체의 구축
항-CD28 항체의 생성
VELOCIMMUNE® 마우스(즉, 인간 면역글로불린 중쇄 및 카파 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 DNA를 포함하는 조작된 마우스)를 마우스 IgG2a의 Fc 부분에 융합된 인간 CD28을 발현하는 세포와, 또는 CD28을 발현하는 세포, 또는 CD28을 인코딩하는 DNA로 면역화함으로써 항-CD28 항체를 수득하였다. 항체 면역 반응을 CD28-특이적 면역검정법에 의해 모니터링하였다. 요망되는 면역 반응이 달성되면, 비장 세포를 수합하고 마우스 골수종 세포와 융합하여, 상기 비장 세포의 생존력을 보존하고 하이브리도마 세포주를 형성시켰다. 하이브리도마 세포주를 스크리닝하고 선별하여, CD28-특이적 항체를 생성하는 세포주를 식별하였다. 이 기법을 사용하여, 몇몇 항-CD28 키메라 항체(즉, 인간 가변 도메인 및 마우스 불변 도메인을 소유하는 항체)를 수득하였다. 또한, 몇몇 완전 인간 항-CD28 항체를 US 2007/0280945A1에 기재된 바와 같이, 골수종 세포와의 융합 없이 항원-양성 B 세포로부터 직접적으로 단리하였다.
이 실시예의 방법에 따라 생성된 예시적인 항-CD28 항체의 소정의 생물학적 특성은 하기 제시된 실시예에서 상세히 기재된다.
항-MUC16 항체의 생성
유전자 변형된 마우스를 인간 MUC16 항원으로 면역화함으로써 또는 인간 면역글로불린 중쇄 및 카파 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 DNA를 포함하는 조작된 마우스를 인간 MUC16 항원으로 면역화함으로써 항-MUC16 항체를 수득하였다.
유전적으로 변형된 마우스를 hMUC16.nub(Mucin-16 (SEQ ID: 49)의 마지막 5개의 SEA 도메인을 포함하는 절단된 포맷)으로 면역화하거나, OVCAR-3 세포와 같은 hMUC16-발현 세포주로 면역화하였다. 면역화 후, 각각의 마우스로부터 비장 세포를 수합하고, (1) 마우스 골수종 세포와 융합하여, 상기 비장 세포의 생존력을 보존하고 하이브리도마 세포를 형성하며, MUC16 특이성에 대해 스크리닝하거나, (2) 인간 MUC16 단편을, 반응성 항체(항원-양성 B 세포)에 결합하고 식별하는 분류 시약으로서 사용하여 B-세포를 분류하였다(US 2007/0280945A1에 기재된 바와 같이).
인간 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 갖는, MUC16에 대한 키메라 항체를 먼저 단리하였다. 상기 항체를 친화도, 선택도 등을 포함하는 바람직한 특징에 대해 특징화하고, 선택하였다. 필요하다면, 마우스 불변 영역을 요망되는 인간 불변 영역, 예를 들어, 야생형 또는 변형된 IgG1 또는 IgG4 불변 영역으로 대체하여, 완전 인간 항-MUC16 항체를 생성시켰다. 선택된 불변 영역이 특정 용도에 따라 달라질 수 있긴 하지만, 고 친화도 항원-결합 및 표적 특이성 특징은 가변 영역에 존재한다.
이 실시예의 방법에 따라 생성된 예시적인 항-MUC16 항체의 소정의 생물학적 특성은 하기 제시된 실시예에서 상세히 기재된다.
CD28 및 MUC16에 결합하는 이중특이적 항체의 생성
항-MUC16-특이적 결합 도메인 및 항-CD28-특이적 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체를 표준 방법론을 사용하여 구축하고, 여기서, 항-MUC16 항원 결합 도메인 및 항-CD28 항원 결합 도메인은 각각 공통의 LCVR과 쌍을 이룬 상이한, 별개의 HCVR을 포함한다. 일부 상황에서, 항-CD28 항체로부터의 중쇄, 항-MUC16 항체로부터의 중쇄 및 공통 경쇄(표 5 참조)를 이용하여 이중특이적 항체를 구축하였다.
본 실시예에 따라 생성된 이중특이적 항체는 2개의 별개의 항원-결합 도메인(즉, 결합 아암)을 포함한다. 제1 항원-결합 도메인은 항-CD28 항체로부터 유래된 중쇄 가변 영역("CD28-VH")을 포함하고, 제2 항원-결합 도메인은 항-MUC16 항체로부터 유래된 중쇄 가변 영역("MUC16-VH")을 포함한다. 항-MUC16와 항-CD28 둘 다 공통 경쇄를 공유한다. CD28-VH/MUC16-VH 쌍형성(pairing)은 T 세포 상의 CD28 및 종양 세포 상의MUC16을 특이적으로 인식하는 항원-결합 도메인을 생성한다.
실시예 2. 중쇄 및 경쇄 가변 영역 아미노산 및 핵산 서열
표 1은 본 발명의 선택된 항-MUC16 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 및 CDR의 아미노산 서열 식별자를 제시한다. 상응하는 핵산 서열 식별자는 표 2에 제시되어 있다.
Figure pct00002
Figure pct00003
표 3은 본 발명의 선택된 항-CD28 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역(HCVR 및 LCVR), CDR의 아미노산 서열 식별자를 제시한다. 상응하는 핵산 서열 식별자는 표 4에 제시되어 있다.
Figure pct00004
Figure pct00005
구축된 다양한 항-MUC16xCD3 이중특이적 항체의 성분 부분의 요약을 표 5에 제시한다. 표 6 및 7은 이중특이적 항체의 HCVR, LCVR, CDR 및 중쇄 및 경쇄 서열 식별자를 나열한다.
Figure pct00006
표 6은 본원에 예시된 이중특이적 항-MUC16 x 항-CD28 항체에 대한 아미노산 서열 식별자를 보여준다. 상응하는 핵산 서열 식별자는 표 7에 제시되어 있다.
Figure pct00007
Figure pct00008
실시예 3. CD28은 강력한 공동자극성 수용체이다.
T 세포 활성화에 중요한 공동자극 신호를 제공하는 데 있어서 공동자극성 수용체가 효과적인지 결정하기 위해, 동계 종양 패널(표 8, 및 도 1) 상에서 공동자극성 리간드의 강제 발현에 의해 수행된 공동자극성 경로의 맹검 스크린은 4-1BB와 함께 가장 강력한 공동자극성 수용체 중 하나로서 CD28을 확립하였다. 표 8은 맹검 스크린에서 종양 부재 마우스의 수를 요약한 것이다. 일곱 개의 상이한 공동-자극성 리간드를 발현하도록 조작된 세 개의 상이한 종양 세포주 상에서 검정법을 수행하였다. 각 세포에서 숫자는 총 5 마리의 마우스 중에서 종양이 없는 마우스의 수를 나타낸다.
Figure pct00009
실시예 4. 항-MUC16xCD28 이중특이적 항체의 표면 플라즈몬 공명 유래 결합 친화도 및 동역학적 상수
본 발명의 예시적인 항-MUC16xCD28 이중특이적 모노클로날 항체의 결합 동역학을 결정하기 위해, MUC16 및/또는 CD28에 대한 항-MUC16xCD28 이중특이적 항체의 표면 플라즈몬 공명 유래 결합 친화도 및 동역학적 상수를 결정하였다.
본 발명의 정제된 예시의 항-MUC16xCD28 이중특이적 모노클로날 항체로의 hMUC16.mmh (SEQ ID NO: 51), hCD28.mmh (SEQ ID NO: 53) 및 mCD28.mmh (뮤린(murine) CD28.mmh; SEQ ID NO: 54) 결합에 대한 평형 해리 상수(K D 값)를 Biacore T-200 기구를 사용하는 실시간 표면 플라즈몬 공명 바이오센서를 사용하여 결정하였다. 본 발명의 정제된 예시의 항-MUC16xCD28 이중특이적 항체를 포착하기 위해 모노클로날 마우스 항-인간 Fc 항체와의 아민 커플링에 의해 CM5 Biacore 센서 표면을 유도체화하였다. 2개의 예시의 이중특이적 항체인 bs24963D 및 REGN4615를 테스트하였다. REGN4615는 인간 MUC16 및 뮤린 CD28을 인지하는 항체/scFv이며, 종종 항-MUC16xmsCD28 항체로서 지칭된다. REGN4615에서 MUC16 아암은 mAb8794P2에 대한 표 1에서 상기에 나타낸 바와 같은 VH 및 VK-ULC 1-39 서열을 이용한다. mCD28 (PV-1)는 US2004/0116675에 기재되어 있으며, SEQ ID NO: 11의 경쇄(US2004/0116675의 도 15의 A를 또한 참조) 및 SEQ ID NO:13의 중쇄(도 15 참조)를 갖고, 이는 본원에 설명된 실험을 위해 scFv로 다시-포맷되었다.
이러한 SPR 결합 연구를, 0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl 0.05% v/v 계면활성제 P20, pH 7.4으로 이루어진 완충액(HBS-ET 전개 완충액(running buffer))에서 수행하였다. 상이한 농도의, C 말단 myc-myc-6xHis 태그를 가진 hMUC16(hMUC16.mmh), C-말단 myc-myc-6xHis 태그를 가진 hCD28(hCD28.mmh), 및 C-말단 myc-myc-6xHis 태그를 가진 mCD28(mCD28.mmh)을, 항-MUC16xCD28 이중특이적 및 항-MUC16xmCD28 이중특이적 항체에 대한 친화도 측정을 위해, 연속의 3-배 희석물로서 3.33nM 내지 90nM (hMuc16 경우) 또는 22.2nM 내지 600nM (hCD28 또는 mCD28 경우) 범위로 HBS-ET 전개 완충액에서 제조하였다.
MASS-2 고용량 아민 센서 표면을, 먼저 모노클로날 마우스 항-인간 Fc 항체와의 아민 커플링으로써 유도체화하여 대략 500-900 RU 항-MUC16xCD28 또는 항-MUC16xmCD28 이중특이적 모노클로날 항체를 포획했다. 1 RU(반응 단위)는 제조업체에 의해 정의된 바와 같이, mm2당 1 pg의 단백질을 나타낸다. 상이한 농도의 C 말단 myc-myc-6xHis 태그를 가진 hMUC16(hMUC16.mmh), C-말단 myc-myc-6xHis 태그를 가진 hCD28(hCD28.mmh), 및 C-말단 myc-myc-6xHis 태그를 가진 mCD28(mCD28.mmh)을, 연속의 3-배 희석물로서 3.33nM 내지 90nM (hMuc16 경우) 또는 22.2nM 내지 600nM (hCD28 또는 mCD28 경우) 범위로 HBS-ET 전개 완충액에서 제조하고, 항-인간 Fc 포획된 항-MUC16xCD28 또는 항-MUC16xmCD28 이중특이적 모노클로날 항체 표면에 50μL/분의 유속으로 5분 동안 주입하였다. 결합된 hMUC16, hCD28, 및 mCD28 시약의 해리를 HBS-ET 전개 완충액에서 10분 동안 모니터링하였다. Scrubber 평가 소프트웨어 버전 2.0c를 사용하여 질량 수송 제한이 있는 1:1 결합 모델에 실시간 결합 센서그램을 피팅함으로써 결합(k a) 및 해리(k d) 속도 상수를 결정하였다. 결합 해리 평형 상수(KD) 및 해리 반감기(t½)를 동역학적 속도 상수로부터 하기와 같이 계산하였다:
Figure pct00010
37℃에서 정제된 hMUC16, hCD28, mCD28 재조합 단백질에 대한 예시의 이중특이적 항체 결합의 결합 동역학적 매개변수는 하기 표 9-12에 제시되어 있다.
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
실시예 5. T 세포 및 표적 세포로의 항-MUC16xCD28 이중특이적 모노클로날 항체의 결합
인간 및 시노몰구스 T 세포 및 표적 세포에 대한 본 발명의 예시적인 이중특이적 항체의 결합을 밝혀내기 위해, 유세포분석을 이용하여 OVACR-3, PEO1, 음성 대조군 Raji 세포, 인간 및 시노몰구스 T 세포에 대한 MUC16xCD28 이중특이적 항체의 결합을 알아낸 후 피코에리트린(PE)-표지 또는 Alexa-647-표지된 항-인간 IgG 항체로 검출하였다. 간략하게는, 1x105개 세포/웰을, 인간 및 시노몰구스 T 세포의 경우에는 133 nM 내지 32.6pM 범위에서 그리고 Muc16 발현 세포 및 음성 대조군 Raji 세포의 경우에는 133 nM 내지 8.14pM 범위에서, 인간 또는 시노몰구스 CD28에 대한 교차-반응성 없이 인간 항원에 결합하는 예시적인 MUC16xCD28 이중특이적 항체 또는 인간 IgG4 항체 이소타입 대조군의 연속 희석물과 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 1% 여과된 FBS를 함유하는 차가운 PBS로 2회 세척하고, PE-접합 또는 Alexa647-접합 항-인간 2차 항체를 MUC16 발현 세포 또는 인간/시노 T 세포에 각각 첨가하고 추가 30분 동안 인큐베이션하였다. 생/사(Live/Dead) 염료를 인간 및 시노몰구스 T 세포 인큐베이션에 첨가하였다. 항체가 없거나 또는 2차만을 함유하는 웰을 대조군으로서 사용하였다.
MUC16 발현 세포와 함께 인큐베이션한 후, 세포를 세척하며, 1% 여과된 FBS를 함유하는 200 μL의 차가운 PBS에 재현탁시키고, BD FACS Canto II 상에서 유세포분석법에 의해 분석하였다.
인간 또는 시노몰구스 T 세포와 함께 인큐베이션한 후, 세포를 세척하고, Brilliant Stain 완충액 중 항-CD2, 항-CD16, 항-CD4, 및 항-CD8 항체의 칵테일로 4℃에서 추가의 20분 동안 인큐베이션하여 염색하였다. 세척 후, 세포를 1% 여과된 FBS를 함유하는 200 μL의 차가운 PBS에 재현탁시키고, 생/CD2+/CD4+/CD16- 또는 생/CD2+/CD8+/CD16- 게이트에서 게이팅하고, BD FACS LSR-Fortessa-X20 상에서 유세포분석법에 의해 분석하였다.
인간 T 세포의 표면으로의 예시적인 MUC16xCD28 이중특이적 항체의 결합을 유세포분석법에 의해 시험하였다. bs24963D는 CD4+T 세포에 2.61 x 10-7 M의 EC50값으로 결합하였다. 이것은 CD8+T 세포에 2.53 x 10-7 M의 EC50 값으로 결합하였다. bs32897D는 CD4+ T 세포에 9.16 x 10-6M의 EC50값으로 약하게 결합하였다. 이것은 CD8+ T 세포에 7.58 x 10-6M의 EC50 값으로 약하게 결합하였다. 그 결과를 표 13에 요약하였다.
Figure pct00015
시노몰구스 T 세포의 표면으로의 예시적인 MUC16xCD28 이중특이적 항체의 결합을 유세포분석법에 의해 시험하였다. 예시적인 bs24963D는 CD4+T 세포에 2.03 x 10-7 M의 EC50 값으로 결합하였다. 이것은 CD8+T 세포에 1.22 x 10-7 M의 EC50 값으로 결합하였다. 예시적인 bs32897D는 2.87 x -10M 및 5.96 x 10-10M의 EC50 값으로 OVCAR-3 및 PEO1 세포에 각각 결합하였다. 예시적인 bs24963D는 MUC16-음성 대조군 RAJI 세포와 어떠한 결합도 보이지 않았다. 그 결과를 표 14에 요약하였다.
Figure pct00016
MUC16을 발현하는 세포주의 표면으로의 예시적인 MUC16xCD28 이중특이적 항체의 결합을 유세포분석법에 의해 시험하였다. bs24963D는 각각 6.09 x 10-10M 및 4.67 x 10-10M의 EC50 값으로 OVCAR-3 및 PEO1 세포에 결합하였다. bs32897D는 MUC16-음성 대조군 RAJI 세포와 어떠한 결합도 보이지 않았다. bs24963D는 각각 2.87 x 10-10M 및 5.96 x 10-10M의 EC50 값으로 OVCAR-3 및 PEO1 세포에 결합하였다. bs24963D는 MUC16-음성 대조군 RAJI 세포와 어떠한 결합도 보이지 않았다. 이소타입 대조군 항체는 인간 또는 시노몰구스 T 세포에 대한 어떠한 결합도 나타내지 않았으며, MUC16을 발현하는 세포주에도 결합하지 않았다. 그 결과를 표 15에 요약하였다.
Figure pct00017
실시예 6: MUC16xCD28 이중특이적 항체에 대한 1차 생물검정
T-세포 활성화는 항원-제시 세포(APC) 상의 주 조직적합성 복합체 클래스 I 또는 II(MHCI 또는 MHCII) 단백질에 의해 제시되는 특정 펩타이드를 인식하는 T-세포 수용체(TCR)를 자극시킴으로써 달성된다(문헌[Goldrath 등, Selecting and maintaining a diverse T-cell repertoire, Nature 402, 255-262 (1999)]). 활성화된 TCR은 이어서, 신호전달 사건의 캐스케이드를 개시하고, 이러한 사건은 다양한 전사 인자, 예컨대 활성화제-단백질 1(AP-1), 활성화된 T 세포의 핵 인자(NFAT) 또는 활성화된 B 세포의 핵 인자 카파-경쇄-인핸서(NFκB)에 의해 추진되는 리포터 유전자에 의해 모니터링될 수 있다. 그 후에, T-세포 반응은 T-세포 상에서 구성적으로 또는 유도적으로 발현되는 공동-수용체, 예를 들어 CD28, CTLA-4(세포독성 T-림프구-관련 단백질 4), PD-1(프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1), LAG-3(림프구-활성화 유전자 3) 또는 다른 분자의 연대를 통해 추가로 개선된다(문헌 [Sharpe 등, The B7-CD28 Superfamily, Nat. Rev. Immunol., 2(2): 116-26 (2002)]). 공동-자극성 분자, CD28은 APC 상에서 발현되는 이의 내생성 리간드 CD80 또는 CD86에 의해 활성화된다. CD28은 TCR 활성화 후 NFκB 전사 인자에 의해 제어되는 경로와 같은 세포성 신호를 강화시킨다. CD28 공동-신호는 T 세포 분화, 증식, 사이토카인 방출 및 세포-사멸과 같은 효과적인 T-세포 활성화에 중요하다(문헌[Smeets 등, NFκB activation induced by T cell receptor/CD28 costimulation is mediated by protein kinase C-θ, PNAS, 97(7):3394-3399 (2012)]).
1차 자극과 MUC16 표적 발현 둘 다의 존재 하에 T 세포 활성을 증강시키는 항체를 식별하기 위해, 인간 1차 T-세포를 사용하는 세포-기반 검정법에 있어서 본 발명의 예시적인 항-MUC16xCD28 이중특이적 항체를 특징화하였다. 상기 검정법은 1차 자극의 존재 및 부재 하에 그리고 표적 발현의 존재 및 부재 하에 항-MUC16/CD28 이중특이적 항체의 거동을 평가하였다.
1차 인간 CD4 + T-세포를 사용한 IL-2 기능적 검정법:
항-MUC16 x CD28 이중특이적 항체와의 연대 시 IL-2 생성에 미치는 CD28 활성화의 효과를 평가하기 위해 1차 CD4+ T-세포/APC 기능적 검정법을 개발하였다.
a) 인간 1차 CD4+ T-세포 단리:
인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 건강한 공여자의 백혈구 팩으로부터 단리하였다. 50 mL SepMate™ 튜브를 제조업체의 권장 프로토콜에 따라 사용하여 밀도 구배 원심분리에 의해 PBMC 단리를 달성하였다. 간략하게는, 15 mL의 FicollPaque PLUS를 50 mL SepMate 튜브 내로 층층이 놓고, 뒤이어 D-PBS와 함께 1:2로 희석된 30 mL의 백혈구를 첨가하였다. 후속 단계는 SepMate 제조업체의 프로토콜에 따라 이어졌다. 후속적으로, CD4+ T-세포를 Miltenyi Biotec로부터의 인간 CD4 Microbead 키트를 제조업체의 설명서에 따라 사용하여 PBMC로부터 단리하였다. 단리된 CD4+ T-세포를, 10% DMSO를 함유하는 FBS에서 바이얼당 5 ㅧ 106개 세포의 농도로 냉동시켰다.
b) CD28 항체로 처리된 1차 CD4 + T-세포로부터의 IL-2 방출:
이 검정에서, 인간 1차 CD4+ T-세포를, 세포 표면 상에서 Muc16을 발현하는, 인간 표적 세포, OVCAR3 또는 PEO-1와 함께 인큐베이션된 αMuc16 x αCD3 이중특이적 항체(REGN4018)를 이용해 T-세포 수용체(TCR)와의 복합체에서 CD3 분자의 가교를 통해 활성화시킨다. REGN4018의 Muc16 아암의 Muc16 발현하는 표적 세포와의 결합은 CD3 분자의 군집화를 유도하고, 동종 반응의 부가로 또는 부재시에 T-세포 자극에 필수적인 첫 번째 신호를 제공한다. 그러나, 이 검정에서, T-세포 활성화를 완료하고, IL-2 방출의 수준을 증가시키기 위해서는, CD28 분자를 가교시킴으로써 제공된 공동-자극이 필수적이다. 여기서, 이중특이적 CD28 항체는 CD4+ T-세포 상의 CD28 및 OVCAR3 또는 PEO-1 세포 상의 Muc16와 상호작용하고, 공동자극성 분자인 CD28의 활성화 - 군집화를 추진한다. 조합된 TCR 및 CD28 연대는 증강된 IL-2 생성을 유발하며, 이 IL-2는 세포 배양 배지 내로 방출된다. 균질한 무세척 AlphaLisa 키트(PerkinElmer)를 사용하여 IL-2를 세포 상청액으로부터 검출하고 정량화한다.
이전에 단리되고 냉동된 인간 CD4+ T-세포(공여자 104유래)를 검정법 일자에 50 U/ml 벤조나제 뉴클레아제를 함유하는 자극 배지(10% FBS, HEPES, NaPyr, NEAA, 및 0.01 mM BME가 보충된 X-VIVO 15 세포 배양 배지)에서 해동시켰다. 세포를 1200 rpm에서 10분 동안 원심분리하며, 자극 배지에 재현탁시키고, 96-웰 둥근 바닥 플레이트 내로 1 x 105개 세포/웰의 농도로 플레이팅하였다. OVCAR3 및 PEO-1 세포를, OVCAR3의 경우 25 μg/mL의 미토신 C 및 PEO-1의 경우 10 μg/mL를 이용하여 1차 자극 배지에서 미토신 C로 처리하였다. 37℃, 5% CO2에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 표적 세포를 세척 완충액(PBS+2% FBS)로 3회 세척하고, 웰 당 1 × 104 OVCAR3 또는 2.5 × 104 PEO-1 세포의 최종 농도로 CD4+ T-세포를 함유하는 웰에 첨가했다. 후속해서, 3 pM 내지 200 nM 범위의, 1:4으로 순차적으로 희석된 CD28 이중특이적 항체 또는 대조군 항체를 5nM 일정한 REGN4018 (αMuc16 x αCD3) 또는 음성 대조군 항체(hIgG4 이소타입 대조군 = H4sH)의 존재 하에 상기 웰에 첨가하였다. 10-점 희석물의 최종점은 배경 신호인 CD28 항체를 함유하지 않았으며, 이는 배경 신호이다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 72시간 동안 인큐베이션한 후, 이들 플레이트를 원심분리하여 세포를 펠렛화하고, 20 μL의 배지 상청액을 수집하였다. 상기 상청액으로부터, 5 μL를 인간 IL-2 AlphaLISA 검정법에서 제조업체의 프로토콜에 따라 시험하였다. 다중표지 플레이트 판독기 Envision 상에서 측정값을 획득하고, 원(raw) RLU(상대적 광 단위) 값을 플롯팅하였다. 모든 순차적 희석물을 이중으로 시험하였다.
GraphPad PrismTM 소프트웨어를 사용하여 10-점 용량-반응 곡선에 걸쳐 데이터를 4-매개변수 로지스틱 방정식에 피팅함으로써 항체의 EC50 값을 결정하였다. 하기 방정식을 사용하여 최대 배수 유도를 계산하였다:
Figure pct00018
CD4+ T-세포의 활성화(IL-2 방출에 의해 측정된 바와 같음)는 1차 자극(항-MUC16xCD3) 및 표적 세포 상 발현된 MUC16의 존재 하에서 hMUC16xhCD28에 의해 증강되었다.
c) 1차 인간 CD4 + T-세포를 사용한 IL-2 기능적 검정법의 결과:
TCR 자극 이중특이적 항체(REGN4018 = 항-Muc16 x 항-CD3)의 부재 또는 존재 하에서, 단리된 CD4+ T-세포 상 CD28을 통한 공동-자극을 제공하기 위한 항-Muc16 x 항-CD28 이중특이적 항체의 능력을, 세포 표면 상에 내생적으로 Muc16을 발현하는 표적 세포(OVAR3 및 PEO-1)와 인큐베이션된 단리된 인간 CD4+ T-세포를 이용하는 기능적 IL-2 방출 검정에서 평가하였다.
배수 유도 값은 5nM의 일정한 hIgG4 H4sH 이소타입 대조군 또는 REGN4018 항-Muc16 x 항-CD3 외에도 OVCAR3 또는 PEO-1 세포와 공동-인큐베이션된 CD4+ T-세포에 대해 표 16 및 17에 요약되어 있다.
단리된 CD4+ T-세포를 일정한 양의 H4sH 이소타입 대조군을 이용하는 REGN4018을 통한 겨냥된 TCR 자극의 부재 하에서 OVCAR3 또는 PEO-1 표적 세포와 함께 인큐베이션하는 경우, 검출된 IL-2 양은 CD28 부모 항체, 이중특이적 항-Muc16 x 항-CD28 항체(bs32897D 및 bs24963D)와 음성 H4sH 이소타입 대조군 항체간에 유사하다. (표 16)
대조적으로, 증가된 IL-2 수준은 항-Muc16 x 항-CD3 (REGN4018)으로 처리된 시료에서 검출된다. 이들 조건 하에서, 인간 CD4+ T-세포를 OVCAR3 또는 PEO-1 세포와 공동-인큐베이션한다면, 두 CD28 이중특이적 항체들은 이들의 각 부모 CD28 항체보다 IL-2 수준을 더 증가시킨다. 예상대로, 이소타입 대조군의 경우에서는 어떠한 최소의 IL-2 방출도 관찰되지 않는다. (표 17)
OVCAR3이 표적 세포로서 이용되는 경우, 유사한 용량-의존적 IL-2 방출이 CD28 이중특이적 항체(bs32897D: 5.63x 및 EC50 = 606pM)와 (bs24963D: 5.32x 및 EC50 = 401pM) 모두에서 측정된다. 반면 PEO-1 세포의 경우 IL-2 수준의 배수 유도에서의 차이가 두 이중특이적 분자 사이에서 관찰될 수 있다. 여기서, bs24963D (10.94x 및 EC50 = 996pM)는 bs32897D 보다 더 높은 IL-2 값을 일으킨다(5.22x 및 EC50은 용량-반응 곡선이 포화에 도달하지 않았기 때문에 결정될 수 없음).
동종 반응을 통해 또는 항-MUC16xCD3에 의해 유도된, TCR 자극의 부재 하에서, OVCAR3 또는 PEO-1 세포의 존재 하 일정한 양의 이소타입 대조군을 함유하는 웰 내 CD28 항체로 측정가능한 IL-2 방출은 관찰되지 않는다(표 16). 표 16은 5nM 일정한 이소타입 대조군 및 OVCAR3 또는 PEO-1과 공동-인큐베이션된 CD4+ T-세포로부터의 IL-2 방출의 EC50 값 및 배수 유도를 요약한다.
Figure pct00019
대조적으로, 항-MUC16xCD3로 처리된 시료에서 측정 가능한 IL-2 수준(RLU)가 검출되었다. 이들 조건 하에서, 인간 CD4+ T-세포를 OVCAR3 또는 PEO-1 세포와 공동-인큐베이션한다면, 두 CD28 이중특이적 항체들은 이것의 부모 CD28 항체보다 IL-2 수준을 더 증가시킨다. 예상한 대로, IL-2 방출이 이소타입 대조군에서는 관찰되지 않았다(표 17) 표 17은 5nM 일정한 5nM 항-MUC16xCD3 및 OVCAR3 또는 PEO-1과 공동-인큐베이션된 CD4+ T-세포로부터의 IL-2 방출의 EC50 값 및 배수 유도를 요약한다.
Figure pct00020
실시예 7. 항-MUC16xCD28 이중특이적 항체는 항-MUC16xCD3에 의한 TCR 자극의 존재 하에 난소 종양 세포에서 T 세포 활성화 및 세포독성을 강화시킨다.
본 발명의 예시적인 항-MUC16xCD28 이중특이적 항체가 난소 종양 세포에 대한 항-MUC16xCD3 매개 T 세포 활성화 및 세포독성을 증강시킬 수 있는지 여부를 조사하기 위해, FACS를 이용하여, MUC16xCD3 단독 또는 MUC16xCD28과 조합한 용량 적정과 더불어 시험관 내 공동-배양 후 종양 세포 및 표현형 T 세포의 생존력을 조사하였다(도 2a). T 세포를 함유하는 인간 말초 혈액 단핵(PBMC) 세포를, 내생성 수준의 MUC16을 발현하는 PEO-1 난소암 세포와 함께 공동-배양하였다(문헌[Coscia, F. 등, Nat. Commun. (2016), August 26;7:12645]).
2가지 FACS 기반 세포독성 연구를 수행하였다. 제1 연구에서, 항-MUC16 x CD28 자극의 존재 또는 부재 하 항-MUC16xCD3 및 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 존재 하 MUC16+ 세포에 대해 FACS 기반 세포독성을 수행하였다(MUC16 세포+인간 PBMC+/-MUC16xCD28 자극 (MUC16xCD28 x Muc16xCD3 매트릭스 설정)에 대한 FACS 기반 세포독성). 제2 연구는, 인간 PBMC 대신에 시노몰구스 PBMC를 사용하는 점을 제외하고는, 제1 연구와 동일하다(MUC16 세포 + 시노몰구스 PBMC +/- MUC16xCD28 자극 (MUC16xCD28 x MUC16xCD3 매트릭스 설정)에 대한 FACS 기반 세포독성).
실험 절차
항-MUC16xCD3 항체 및 본 발명의 예시적인 항-MUC16xCD28 항체의 조합의 존재 하에서 MUC16+ 세포의 사멸화를 모니터링하기 위해, MUC16을 내생적으로 발현하는 세포주(PEO1, MUC16+)를 1μM의 바이올렛 세포 추적기로 표지하고, 37℃에서 밤새 플레이팅하였다. 별도로, 인간 PBMC(New York Blood Center) 또는 시노몰구스 원숭이 PBMC(Covance, 미국 뉴저지주 크랜퍼드 소재)를 보충 RPMI 배지에 1x106개 세포/mL로 플레이팅하고, 부착성 대식세포, 수지상 세포 및 일부 단핵 세포를 고갈시킴으로써 림프구를 농화시키기 위해 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음날, 표적 세포를 부착형 세포-고갈 미접촉 인간 PBMC(효과기/표적 세포 4:1 비), 및 항-MUC16xCD3 또는 비-표적화 CD3-기반 이중특이적 항체(bs17664D)의 순차적 희석물을, 단독으로 또는 고정된 농도(2.5μg/ml)의 예시적인 항-MUC16xCD28 이중특이적 항체와 조합하여 함께, 96시간 동안 37℃에서 공동-인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 트립신-EDTA 해리 완충액을 이용하여 세포 배양 플레이트에서 제거하고, 유세포분석법(FACS)으로써 분석하였다.
FACS 분석을 위해, 세포를 생존력 원 적혈구 추적기(Invitrogen), 및 CD2, CD4, CD8 및 CD25(BD)에 직접적으로 접합된 항체로 염색하였다. 시료를 세포 카운팅용 보정 비드와 함께 전개시켰다. 사멸화의 특이성을 평가하기 위해, 표적 세포를 바이올렛 세포 추적기 양성 집단으로서 게이팅하였다. 생 표적 세포의 백분율을 하기: 생존 세포의 백분율=(R1/R2)*100과 같이 계산하였으며, 이때, R1은 항체의 존재 하에 생 표적 세포의 백분율이고, R2는 시험 항체의 부재 하에 생 표적 세포의 백분율이다. CD2+/CD4+ 또는 CD2+/CD8+ T 세포 중에서 활성화된(CD25+) T 세포의 백분율에 의해 T 세포 활성화를 측정하였다. 세포를 CD2, CD4, CD8, CD25 및 PD-1에 직접 접합된 항체와 함께 인큐베이션하고, 총 T 세포(CD2+) 중 PD-1+ T 세포의 퍼센트를 보고함으로써, PD-1 마커의 상향조절을 평가하였다. 보정 비드 당 생 CD4+ 세포 또는 CD8+ 세포의 수를 계산함으로써 T 세포 카운트를 측정하였다. BD 세포분석 비드 어레이(CBA) 인간 Th1/Th2/Th17 사이토카인 키트를 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하여, 배지에 축적된 사이토카인의 수준을 분석하였다.
결과, 요약 및 결론:
단일 제제로서 또는 공동자극성 항-MUC16xCD28 이중특이적 항체의 존재 하에, 미접촉 인간 T 세포가 인간 MUC16를 발현하는 PEO1 표적 세포를 사멸화하도록 유도하는 능력에 대해 항-MUC16xCD3 이중특이적 항체를 시험하였다. 항-MUC16xCD3 이중특이적 항체는 인간 T 세포가 PEO1 세포를 고갈시키도록 활성화시키고 지시하였다. 더욱이, MUC16xCD3 단독으로 이들의 생존력을 용량 의존 방식으로 ~60%까지 감소시키면서 PEO-1 암 세포의 중간 T 세포 사멸화를 유도했다(도 2b 및 표 18). 표적 세포 사멸화는 항-MUC16xCD3 이중특이적 항체의 존재 하에 관찰되었고, PEO1 세포는 피코몰(picomolar; pM) 수준의 EC50로 용량-의존적 방식으로 사멸화되었다(도 2b). 표적 세포 사멸화는 항-MUC16xCD3가 존재하지 않을 때 관찰되지 않았다(도 2b). 관찰된 표적-세포 용해는 다시 피코몰(pM) 수준의 EC50로 CD2+ T 세포 상에서CD25+ 및 PD-1+ 세포의 상향조절과 관련이 있었다(표 18).
항-MUC16xCD3는 인간 사이토카인의 방출을 유도하였다. 단일 제제로서 항-MUC16xCD3로 관찰된 세포독성 활성은, 본 발명의 예시적인 항-MUC16xCD28 공동자극성 분자, bs24963D 및 bs32897D의 존재 하에서 증강되었다.
본 발명의 예시적인 항-MUC16xCD28의 첨가는 MUC16xCD3에 의해 유도된 세포독성의 깊이 및 효능을 증가시켜, 20% 미만으로 PEO-1 암 세포 생존력을 추가로 감소시킨다는 점이 밝혀졌다(T 세포 사멸화에서 3배 초과 증가)(도 2b). 나아가, 본 발명의 예시적인 항-MUC16xCD28은 MUC16xCD3에 의해 유도된 IFNγ 방출 수준을 10배 초과로 증가시켰다(도 2c). MUC16xCD28과 MUC16xCD3의 조합은 CD4 및 CD8 T 세포를 확대시키고, 활성화 마커 CD25의 발현 수준을 증가시켰다(도 2d-e). 특히, 비-표적 CD3 이중특이적 항체와 조합된 MUC16xCD28은 T 세포 세포독성 또는 활성화를 유도하지 않았다(도 2b).
요약하자면, 공동-자극은, 단일 제제로서 MUC16xCD3에서 관찰된 것과 비교한 경우, T 세포 활성화, PD-1 상향조절, 및 사이토카인 방출을 증가시켰다. 표 18 및 19 및 도 2a-2e는 인간 PBMC를 이용한 실험 결과를 요약한다.
Figure pct00021
단일 제제로서 또는 공동자극성 항-MUC16xCD28 이중특이적 항체의 존재 하에, 미접촉 시노몰구스 T 세포가 인간 MUC16를 발현하는 표적 세포를 사멸화하도록 유도하는 능력에 대해 항-MUC16xCD3 이중특이적 항체를 또한 시험하였다. 동일한 검정을 수행하고, 유사한 결과를 시노몰구스 원숭이의 PBMC를 이용하여 수득하였다(도 2f-h). 도 2i는 본 발명의 예시적인 항-MUC16xCD28 이중특이적 항체가 유세포분석법에 의해 측정된 바와 같이 세포성 표적에 결합함을 도시한다. 이들 결과는, 본 발명의 항-MUC16xCD28 이중특이적 항체가 증식 및 사이토카인 방출뿐만 아니라 세포독성에 의해 MUC16xCD3 매개 T 세포 활성화를 강력하게 증강시킬 수 있음을 실증하였다. 선택된 항체 적정에서, 항-MUC16xCD3 이중특이적 항체는 인간 T 세포를 활성시켰으나, T 세포가 PEO1 세포를 고갈시키도록 겨냥하지 않았다(표 19). 본 발명의 예시적인 항-MUC16xCD28 항체와의 공동-자극은 증가된 T-세포 활성화, 세포독성 활성의 증강, 및 T 세포 상에서 PD-1 마커의 상향조절을 도모하였다(표 19).
Figure pct00022
실시예 8. 항-MUC16xCD28 항체의 생체내 연구
종양 항원 표적화된 항-CD3xMUC16와 항-CD28xMUC16 이중특이적 항체의 조합은 마우스 모델에서 종양 청소를 증강시켰다. 하기에 상세하게 나타낸 바와 같이, OVCAR-3 종양 성장은, 항-CD3xMUC16 단독으로 또는 대조군 이소타입으로 투여된 마우스와 비교할 때 항-CD3xMUC16 및 본 발명의 예시적인 항-CD28xMUC16으로 투여된 마우스에서 유의미하게 저해되었다.
MUC16xCD28이 생체 내에서 MUC16xCD3의 항-종양 효능을 향상시킬 수 있는지 조사하기 위해, 두 개의 별개의 종양 모델인, 종양 이종 복수(ascites) 모델 및 종양 동계 마우스 모델을 하기에 상세히 기재된 바와 같이 이용하였다.
종양 이종 복수 모델
종양 이종 복수 모델에서, 내생적으로 고수준의 MUC16을 발현하는 인간 기원의 고-등급 장액 암종 OVCAR-3 난소암 세포를, 인간 PBMC로 사전-이식된 NSG 마우스에 복강 내 이식하였다(문헌[Crawford A, Haber L, Kelly MP, Vazzana K, Canova L, Ram P, Pawashe A, Finney J, Jalal S, Chiu D, Colleton CA, Garnova E, Makonnen S, Hickey C, Krueger P, Delfino F, Potocky T, Kuhnert J, Godin S, Retter MW, Duramad P, MacDonald D, Olson WC, Fairhurst J, Huang T, Martin J, Lin JC, Smith E, Thurston G, Kirshner JR. A Mucin 16 bispecific T cell-engaging antibody for the treatment of ovarian cancer. Science Translational Medicine 19 Jun 2019:Vol 11, Issue 497, eaau7534]). OVCAR-3 세포는 생체 내 생물발광(BLI)을 이용하여 시간 경과에 따른 종양 성장을 추적하기 위해 루시퍼라아제 리포터와 함께 조작되었다.
실험 절차
실험을 문헌[Crawford A, Haber L, Kelly MP, Vazzana K, Canova L, Ram P, Pawashe A, Finney J, Jalal S, Chiu D, Colleton CA, Garnova E, Makonnen S, Hickey C, Krueger P, Delfino F, Potocky T, Kuhnert J, Godin S, Retter MW, Duramad P, MacDonald D, Olson WC, Fairhurst J, Huang T, Martin J, Lin JC, Smith E, Thurston G, Kirshner JR. A Mucin 16 bispecific T cell-engaging antibody for the treatment of ovarian cancer. Science Translational Medicine 19 Jun 2019:Vol 11, Issue 497, eaau7534]에서 기재된 바와 같이 수행하였다. 요약하면, 마우스에게 PBS에 현탁된 150 mg/kg의 루시퍼라아제 기질 D-루시페린(Perkin Elmer)을 IP 주사하였다. 10분후에, Xenogen IVIS 시스템(Perkin Elmer)을 사용하여 이소플루란 마취 하에 마우스의 BLI 이미지화를 수행하였다. D에서의 시야, 1.5 cm의 피사체 높이, 및 0.5 분 노출 시간 동안 미디엄 비닝 수준(medium binning level)으로 이미지 획득을 수행하였다. BLI 신호는 Living Image 소프트웨어(Xenogen; 캘리포니아주 알라메다 소재)를 이용하여 추출하였다. 각각의 종양 덩어리 주변으로 관심 영역을 그리고, 광자 강도를 p/s/cm2/sr(photons per second per square centimeter per steradian; 스텔디안 당 제곱 센티미터 당 초 당 광자)로서 기록하였다. OVCAR-3/Luc 세포를 수여받지 않은 마우스는 BLI 활성에 대한 기준 판독값의 역할을 하였다. 종양이 없는 이러한 기준 마우스(N=3)를 매일 이미지화하고, 검출 하한(LOD)은 모든 이미지화된 종양이 없는 마우스에 대한 평균 BLI 판독값으로서 계산했다.
팔 내지 십(8-10) 주령 NSG(NOD SCID 감마 쇄 녹-아웃) 마우스(Jackson Laboratory, MD)에 5x106 인간 PBMC(ReachBio, Seattle, WA)을 주입하였다. 십 내지 십사(10-14)일 후, 마우스를 꼬리 정맥을 통해 채혈하여 인간 T 세포 생착을 결정하였다. PBMC가 전달된 후 2주 내에, 이전에 생체 내에서 계대된 OVCAR-3/Luc 세포주로부터의 2x106 복수 세포를, 2주 (제0일) 이내에 복강내(IP) 투여하였다. 마우스를 유세포분석에 의해 T 세포 생착에 대해 체크한 다음, 유사한 종양 부담을 보장하기 위해 BLI를 사용한 그룹에 할당하였다. 종양 이식 후 4일 후에, 마우스를 두 연구에서 중앙 BLI가 각각 1.49x105 또는 3.03x105 p/s/cm2/sr인 5마리의 동물 그룹으로 나눴다. 마우스는 제5일 및 제8일에 지시된 이중특이적 또는 대조군 항체로 처리했다. 마우스에 정맥 내(IV) 주사를 통해 2회 본 발명의 예시적인 항-MUC16xCD28 (bs24963D)과 함께 또는 없이 항-MUC16xCD3 또는 CD3-결합 대조군을 투여하였다. 이미지화를 종양 성장을 추적하기 위해 연구 전반에 걸쳐 여러번 수행하였다.
혈액으로부터 혈청 사이토카인 수준을 또한 지시된 시점에 수득하였다. 지시된 시점에서, 혈액을 턱밑샘 천자(submandibular puncture)에 의해 마이크로테이너(microtainer) 혈청 튜브(BD 365967) 내로 수집하였다. V-plex Human ProInflammatory-10 Plex 키트를 제조업체의 설명서(Meso Scale Diagnostics, 미국 마이애미주 록빌 소재)에 따라 사용하여 사이토카인 수준을 분석하였다.
모든 절차를 NIH의 실험 동물 윤리 위원회의 가이드에 따라 수행하였다. 프로토콜은 Regeneron Pharmaceuticals 동물 실험 윤리 위원회에 의해 승인되었다. 그룹 당 5 마리의 마우스를 대상으로 하는 총 2건의 연구를 완료하였다.
결과, 요약 및 결론
이종 종양 연구를 위해, 두 모델을 이용하였다. 제1 이종 모델의 경우, NSG 마우스에 인간 PBMC로 생착 후 13일 후 생체 내(제0일) 이전에 계대된 OVCAR-3/Luc 세포를 복강 내(IP) 주사하였다. 마우스에 제5일 및 제8일에 IV로 치료하였다. 마우스는 12.5μg 항-MUC16xCD3 또는 12.5μg CD3-결합 대조군(hIgG4P-PVA 이소타입)를 수여받았다. 마우스 중 일부는 또한 본 발명의 예시적인 항-MUC16xCD28(bs24963D)를 100 μg 투여받았다. 종양 부담은, 종양 이식 후 제4일, 제8일, 제12일, 제15일, 제20일 및 제25일에 BLI에 의해 평가되었다. 예시적인 bs24963D가 항-MUC16xCD3 없이 투여되었을 때, 감소된 BLI-확실한 종양이 관찰되지 않았다. 대조적으로, 12.5μg 항-MUC16xCD3로 처리하면 BLI-확실한 종양을 현저하게 감소시키는 반면, 본 발명의 예시적인 항-MUC16xCD28은 항-MUC16xCD3 단독에 비해 효능을 현저하게 향상시켰다(표 20-22).
표 20은 첫 번째 OVCAR-3/Luc 이종 모델에서 종양 이식 후 제4일에 생물발광 수준을 요약한다.
Figure pct00023
표 21은 첫 번째 OVCAR-3/Luc 이종 모델에서 종양 이식 후 제25일에 생물발광 수준을 요약한다.
Figure pct00024
표 22는 첫 번째 OVCAR-3/Luc 이종 모델에서 종양 이식 후 제4일과 제25일 사이에 BLI의 배수 변화를 요약한다.
Figure pct00025
제2 이종 모델의 경우, NSG 마우스에 인간 PBMC로 생착 후 10일 후 생체 내(제0일) 이전에 계대된 OVCAR-3/Luc 세포를 주사하였다. 마우스에 IV로 0.5 mg/kg 항-MUC16xCD3로 처리하거나, 0.5 mg/kg CD3-결합 대조군을 제5일 및 제8일에 투여하였다. 종양 부담은, 제4일, 제8일, 제11일, 제14일, 제21일, 제28일 및 제34일에 BLI에 의해 평가되었다. 마우스 중 일부는 또한 본 발명의 예시적인 항-MUC16xCD28(bs24963D)를 0.2mg/kg, 1mg/kg, 또는 5mg/kg 투여받았다. 예시적인 bs24963D는 항-MUC16xCD3 없이 투여시 종양 부담을 감소시키지 않았다. 대조적으로, 0.5mg/kg 항-MUC16xCD3로 처리는 BLI-확실한 종양을 현저하게 감소시키는 반면, 본 발명의 예시적인 항-MUC16xCD28은 항-MUC16xCD3 단독에 비해 효능을 현저하게 향상시켰다(표 23-25 및 도 4a).
표 23은 두 번째 OVCAR-3/Luc 이종 모델에서 종양 이식 후 제4일에 생물발광 수준을 요약한다.
Figure pct00026
표 24는 두 번째 OVCAR-3/Luc 이종 모델에서 종양 이식 후 제25일에 생물발광 수준을 요약한다.
Figure pct00027
표 25는 두 번째 OVCAR-3/Luc 이종 모델에서 종양 이식 후 제4일과 제34일 사이에 BLI의 배수 변화를 요약한다.
Figure pct00028
상이한 용량을 이용한 두번째 이종 모델의 다른 결과는 도 3a에 도시되어 있다. 종양 이식 후 제5일 및 제8일에 2.5μg으로 MUC16xCD3로 처리한 마우스는, CD3-결합 대조군 항체(EGFRvIIIxCD3)로 처리된 마우스에 비해 종양 부담이 현저히 감소했지만 OVCAR-3/Luc 종양 세포를 완전히 제거하지는 않았다(도 3a). 2.5μg의 MUC16xCD3와 100μg의 MUC16xCD28의 조합은 시간이 경과됨에 따라 종양 세포를 더 오래 거부하여 추가로 종양 성장을 저해하였다(도 3a). 동일 실험에서, 혈청 사이토카인 수준을 또한 수득하였다. 도 3b는 상이한 항체 및/또는 항체 조합으로 처리된 마우스에서 사이토카인 수준(pg/ml)을 도시한다. 도 3c는 제26일에 혈청 내 CA-125 수준에 대한 종양 부담 및 상관관계를 도시한다.
CD28- 및 CD3-이중특이적 항체의 생체 내 종양 사멸화 촉진 능력을 시험하기 위해, 잘 확립된 이종 복강내 난소 OVCAR-3 종양 모델을 이용하였다. 이 모델에서, 종양 세포를 인간 PBMC로 재구성된 면역결핍 마우스에 도입한다. 다른 난소암 세포주와 같이, OVCAR-3 세포는 MUC16을 발현한다. 이식 전에, OVCAR-3 세포는 생물발광(BLI)을 이용하여 시간 경과에 따른 종양 성장을 생체 내 추적하는 것을 허용하도록 루시퍼라아제 리포터로 조작되었다. 이식된 OVCAR-3 종양은 EGFRvIIIxCD3 이중특이적 항체, 이들 세포에 결합하지 않은 대조군 CD3-이중특이적 항체로 처리된 마우스에서 및 MUC16xCD28 이중특이적 항체로만 처리된 마우스에서 줄지 않고 성장했다(도 3a). MUC16xCD3 이중특이적 항체 단독으로 현저한 항-종양 활성을 입증했음에도 불구하고, OVCAR-3 종양을 완전히 제거하지는 못한 반면(도 3a), MUC16xCD3 이중특이적 항체에 MUC16xCD28 이중특이적 항체의 첨가는 MUC16xCD3 단독보다 생체 내 항-종양 효과를 증강시켰다(도 3a). 증강된 항-종양 활성과 일치하게, 두 이중특이적 항체의 조합은 또한 순환하는 사이토카인의 분비를 증가시켰다(도 3b).
MUC16-이중특이적 항체는, 단백질분해 절단이 예후의 난소암 바이오마커 CA-125를 방출한 후 난소암 세포 표면 상 MUC16의 나머지 "nub"(절단 및 CA-125의 방출 후 세포 표면 잔류물) 에 결합하나(문헌[I. Mylonas 등, Immunohistochemical expression of the tumour marker CA-125 in normal, hyperplastic and malignant endometrial tissue. Anticancer Res 23, 1075-1080 (2003)]) 가용성 CA-125를 결합하지 않는다(도 9a 및 9b). MUC16xCD28 이중특이적 항체가 난소 종양 부담에 대한 바이오마커로서 CA-125를 이용하는 능력을 교란시키는지 여부를 알아내기 위해, 마우스에서 CA-125 수준을 측정하였다. CA-125 수준은 치료와 관련 없이 종양 부담과 상관 관계가 있었다. 가장 낮은 CA-125 수준이 MUC16xCD3 이중특이적 항체에 대해 앞서 입증된 바와 같이 이중특이적 항체의 조합(도 3c)으로 처리된 마우스에서 보였다.
동계 마우스 모델
실험 절차
이전에 설명한 바와 같이(문헌[Valenzuela 등, (2003) Nat. Biotechnol. June; 21(6):652-9]), VelociGene® 기술을 이용하여 MC38 연구를 위해 인간 MUC16의 일부 및 인간 CD3을 발현하도록 유전적으로 변형된 마우스에서 동계 연구를 실시했다(문헌[Crawford A, Haber L, Kelly MP, Vazzana K, Canova L, Ram P, Pawashe A, Finney J, Jalal S, Chiu D, Colleton CA, Garnova E, Makonnen S, Hickey C, Krueger P, Delfino F, Potocky T, Kuhnert J, Godin S, Retter MW, Duramad P, MacDonald D, Olson WC, Fairhurst J, Huang T, Martin J, Lin JC, Smith E, Thurston G, Kirshner JR. A Mucin 16 bispecific T cell-engaging antibody for the treatment of ovarian cancer. Science Translational Medicine 19 Jun 2019:Vol 11, Issue 497, eaau7534]). 인간 CD3, 인간 CD28 및 인간 MUC16의 부분을 발현하는 마우스를 ID8-VEGF 연구에 이용했다. CD3의 인간화를 위해, 표적화 벡터를, 마우스 CD3 유전자의 세포외 부분(γδε)을 상기 유전자의 상응하는 인간 영역으로 대체하는 조작을 하였다. CD28의 인간화를 위해, 표적화 벡터를, 마우스 CD28 유전자의 세포외 부분을 상기 유전자의 상응하는 인간 영역으로 대체하는 조작을 하였다. MUC16에 있어서, 마우스의 SEA 반복부 13-17을 인간 SEA 반복부 12-16으로 대체하였다. 각각의 인간화 마우스에 있어서, F1H4(C57BL/6 × 129 하이브리드) 배아 줄기(ES) 세포 클론에서 올바른 유전자 표적화를 이전에 기재된 바와 같이 대립유전자 소실 검정법에 의해 식별하였다(문헌[Poueymirou 등 (2007), Nat. Biotechnol. January; 25(1):91-9]). 표적화된 ES 세포를 8-세포 병기 Swiss Webster 배아 내로 주사하여, C57BL/6N 마우스(Taconic, 미국 뉴욕주 렌설러 소재)와 함께 사육하기 위한 완전 F0 세대 이형접합성 마우스를 동형접합성으로 생성하였다. CD3의 인간 세포외 부분 (γδε), CD28의 인간 세포외 부분 및 인간 MUC16의 부분을 발현하는 마우스를 이어서 동형접합성으로 사육하였다(hCD3/hMuc16 또는 hCD3/hCD28/hMUC16 인간화 마우스로서 지칭).
면역-적격 모델에서 효능을 조사하기 위해, 녹-인(knock-in) 마우스를 생성했다. 이 마우스의 T 세포는 인간 CD3을 발현하고, 뮤린 MUC16 대신에 본 발명의 예시적인 이중특이적 항체가 결합하는 인간 MUC16의 일부를 함유하는 키메라 분자가 발현된다. 따라서, 항-MUC16xCD3 분자가 이 연구에서 이용될 수 있다. 표적화 CD28 이중특이적 분자의 첨가가 이들 마우스에서 효능을 증강시키는지 여부를 조사하기 위해, 대리 이중특이적 항체를 또한 생성했다. 대리 항체는 인간 MUC16, 그러나 뮤린 CD28을 인식하여 CD28 공동자극의 효과를 조사하고, 이는 때때로 항-MUC16xmCD28로 지칭된다. 동종 종양 모델에서, 인간 MUC16의 부분을 발현하도록 조작된 MC38 세포주를 이용했다. 마우스에 MC38/huMUC16 세포를 피하(SC)로 이식하고, 이식 당일에 0.01mg/kg의 항-MUC16xCD3로 제21일까지 주 당 2회로 처리하였다. 0.01 mg/kg 항-MUC16xCD3로의 처리로 상당한 항-종양 효능이 도모되었고, MUC16xmCD28의 첨가는 이 효과를 향상시켰다. (도 6a, 6b, 6c 및 6d 참조). 동계 종양의 이식 및 측정
상응하는 마우스 유전자좌에서 MUC16의 인간-뮤린 키메라 및 인간 CD3을 발현하는 마우스에, 피하로 1x106 MC38/huMUC16 세포를 이식하였다. 마우스에, 인간 MUC16 및 마우스 CD28을 인식하는 대리 이중특이적 항체와 함께 또는 없이, 항-MUC16xCD3 또는 이소타입 대조군을 복강 내(IP) 제21일까지 연구 기간 내내 주 당 2회 투여하였다. 처리는 이식 당일에 시작되었다. 주 당 2회 캘리퍼를 이용하여 종양 성장을 측정하였다. 종양 이식 후 50일째에 마우스를 희생시켰다.
동계 종양 성장 및 저해의 계산
외부 캘리퍼에 의해 종양 부피를 결정하기 위해, 가장 큰 세로방향 직경(길이) 및 가장 큰 가로방향 직경(너비)을 결정하였다. 캘리퍼 측정에 기초한 종양 부피를 하기 식: 부피 = (길이 x 너비2)/2에 의해 계산하였다. X 및 Y 직경의 캘리퍼 측정을 사용하여 시간 경과에 따라 종양 성장을 모니터링하였다. 종양 크기가 2000 mm3 초과인 경우, 마우스는 안락사되었다. 통계적 유의성은 쌍형성되지 않은 비매개변수적 Mann-Whitney t-시험을 이용해 결정하였다.
결과
상이한 처리 하의 MC38/huMUC16 모델의 종양 크기가 표 26에 요약되어 있다.
Figure pct00029
본 발명의 예시적인 항-MUC16xCD28 이중특이적 항체가 완전히 온전한 면역계를 가진 마우스에서 동계 마우스 모델에서 MUC16xCD3의 항-종양 효능을 향상시킬 수 있는지를 시험하였다. 마우스를 Velocigene 기술을 이용하여 마우스 유전자 대신 인간 CD3 및 인간 MUC16을 발현하도록 유전적으로 조작하였다(문헌[Crawford A, Haber L, Kelly MP, Vazzana K, Canova L, Ram P, Pawashe A, Finney J, Jalal S, Chiu D, Colleton CA, Garnova E, Makonnen S, Hickey C, Krueger P, Delfino F, Potocky T, Kuhnert J, Godin S, Retter MW, Duramad P, MacDonald D, Olson WC, Fairhurst J, Huang T, Martin J, Lin JC, Smith E, Thurston G, Kirshner JR. A Mucin 16 bispecific T cell-engaging antibody for the treatment of ovarian cancer. Science Translational Medicine 19 Jun 2019:Vol 11, Issue 497, eaau7534]). MC38 결장 암종 세포주를 인간 MUC16을 발현하도록 조작하고(pLVX.EF1a.MUC16, MC38/hMUC16) 피하 이식하였다. 마우스에 이소타입 대조군(Iso Ctrl), 0.01mg/kg의 MUC16xCD3, 0.5mg/kg의 MUC16xmCD28 또는 조합을 이식 당일에(제0일) 시작하여 주 당 2회 복강 내 주사로 투여하였다. 종양 성장을 시간 경과에 따라 모니터링하였다(도 6a). MUC16xCD3 또는 MUC16xCD28 단일요법은 종양 성장을 현저히 저해했다. 종양 성장은 추가로, MUC16xCD3와 MUC16xCD28 조합 치료법에 의해 유의하게 저해되었다(표 26). 동일 실험에서, 혈청 사이토카인 수준을 또한 수득하였다. 도 6b는 상이한 항체 및/또는 항체 조합으로 처리된 마우스에서 사이토카인 수준을 도시한다.
적절한 인간화 마우스 MC38/hMUC16는 이식된 종양 세포를 수여받고, 대조군, 개별 CD3- 또는 CD28-이중특이적 항체, 또는 조합으로 치료되었다(도 6a, 6c 및 6d). MUC16 종양 모델에서, CD3- 및 CD28-이중특이적 항체의 조합은 사이토카인 생성 검정에서도 언급된 바와 같이(도 6c 및 6d), 최상의 항-종양 반응를 제공했다(도 6a).
MUC16xCD28 리드(lead)의 표적화 부가가 동계 모델에서 효능을 강화시킬 수 있는지 여부를 조사하기 위해, 뮤린 MUC16 대신 인간 CD3, 뮤린 CD28 대신 인간 CD28, 및 본 발명의 예시적인 이중특이적 항체가 결합한 인간 MUC16의 일부를 함유하는 키메라 분자를 발현하는 마우스를 이용했다. ID8-VEGF 세포주를 인간 MUC16을 발현하도록 조작하고(ID8-VEGF/hMUC16) 복강내 이식하였다. 종양 이식 후 제3일, 제6일 및 제10일에, 1mg/kg EGFRvIIIxCD3 또는 MUC16xCD3를 단독 또는 MUC16xCD28과 조합하여 마우스에 투여하였다. 종양 성장을 체중 증가를 이용하여 모니터링하였다(도 5). 종양 성장은 MUC16xCD3에 의해 저해되었고, MUC16xCD28과의 조합은 추가로 종양 성장을 지연시켰다.
특히, CD28-이중특이적 항체가 매우 제한된 단일-제제 활성을 가졌던 이전의 시험관 내 및 생체 내 분석(상기 참조)과는 달리, 이러한 동계 MC38/MUC16 모델에서의 CD28-이중특이적 항체는 단일 제제로서 더욱 주목할 만한 활성을 가졌다. 이는, "신호 1"이 이러한 MC38 모델에서 이미 어느 정도까지 활성화되고 있었음을 시사하였다. 이와 일관되게, MC38 종양 세포는 재-활성화된 내생성 레트로바이러스 단백질, 예컨대 p15E를 높은 수준으로 발현하고 C57BL6 마우스는 이러한 네오-에피토프를 인식하고 이에 반응하는 내생성 T 세포를 생성시킬 수 있는 것으로 이전에 제시되었다(문헌[J. C. Yang, D. Perry-Lalley, The envelope protein of an endogenous murine retrovirus is a tumor-associated T-cell antigen for multiple murine tumors. J Immunother 23, 177-183 (2000)]; 문헌[H. J. Zeh, 3rd, D. Perry-Lalley, M. E. Dudley, S. A. Rosenberg, J. C. Yang, High avidity CTLs for two self-antigens demonstrate superior in vitro and in vivo antitumor efficacy. J Immunol 162, 989-994 (1999)]). 사실상, 본 발명의 MC38 모델에서, 이러한 p15E 네오-항원에 반응성인 종양내 T 세포는 쉽게 검출될 수 있는 것으로 확인되었다(데이터는 나타내지 않음). 그러므로, 이러한 MUC16 동계 종양 모델에서 CD28-이중특이적 항체는 내생성 TCR/CD3-의존적 T 세포 반응을 부스팅시킬 수 있으며, 상기 T 세포 반응은 그 후에 CD3-이중특이적 항체를 통해 부가적인 "신호 1" 활성화를 제공함으로써 추가로 증강될 수 있다.
TCR 복합체를 통한 T 세포 활성화("신호 1")는, T 세포 상의 CD28 수용체가 표적 세포 상의 이의 리간드(CD80/B7.1 및 CD86/B7.2)와 연대하는 경우 매개되는 것과 같은 공동-자극성 신호("신호 2")에 의해 두드러지게 증강될 수 있는 것으로 오랫동안 이해되어 왔다(문헌[J. H. Esensten, Y. A. Helou, G. Chopra, A. Weiss, J. A. Bluestone, CD28 Costimulation:From Mechanism to Therapy. Immunity 44, 973-988 (2016)]). 본 데이터와 일관되게, T 세포의 항-종양 활성을 증강시키기 위한 CD28-공동자극의 잠재성은, B7 리간드가 종양 세포 상에서 과발현되었다는 연구에 의해 처음으로 실증되었으며(문헌[R. H. Schwartz, Costimulation of T lymphocytes: the role of CD28, CTLA-4, and B7/BB1 in interleukin-2 production and immunotherapy. Cell 71, 1065-1068 (1992)]; 문헌[L. Chen 등, Costimulation of antitumor immunity by the B7 counterreceptor for the T lymphocyte molecules CD28 and CTLA-4. Cell 71, 1093-1102 (1992)]), 이는 이러한 B7-발현 종양의 향상된 T 세포 거부를 제시하였다. 이러한 잠재성은 인간 시험에서 CD28-활성화 항체를 평가하기 위한 노력을 고취시켰다. 안타깝게도, 이러한 항체(TGN1412)의 2006 시험은 대량적인 사이토카인 방출 증후군(CRS)에 의한 다발성 장기 부전으로 인해 모든 6명의 인간 지원자에서 생명-위협적 합병증을 초래하였다(문헌[G. Suntharalingam 등, Cytokine storm in a phase 1 trial of the anti-CD28 monoclonal antibody TGN1412. N Engl J Med 355, 1018-1028 (2006)]). 이러한 곤란은 인간에서 CD28-활성화 항체의 임의의 추가 시험의 중단을 유발하였다.
종양 세포 표면 상에 군집화되지 않는 한, CD28을 직접적으로 활성화하지 않는 CD28-이중특이적 항체는, 통상의 CD28-활성화 항체의 전신 독성 없이, 종양 부위에서만 공동-자극을 촉진할 가능성을 제공했다. 이러한 CD28-이중특이적 항체의 초기 버전이 1990년대에 제안되었고 평가되었으나(문헌 [C. Renner 등, Cure of xenografted human tumors by bispecific monoclonal antibodies and human T cells. Science 264, 833-835 (1994)]; 문헌[G. Jung 등, Local immunotherapy of glioma patients with a combination of 2 bispecific antibody fragments and resting autologous lymphocytes: evidence for in situ t-cell activation and therapeutic efficacy. Int J Cancer 91, 225-230 (2001)]; 문헌[M. Brandl, L. Grosse-Hovest, E. Holler, H. J. Kolb, G. Jung, Bispecific antibody fragments with CD20 X CD28 specificity allow effective autologous and allogeneic T-cell activation against malignant cells in peripheral blood and bone marrow cultures from patients with B-cell lineage leukemia and lymphoma. Exp Hematol 27, 1264-1270 (1999)]); 그러나, 그 당시에 사용가능한 초기 기술은 제안된 바이오치료제를 제조하기 위해 화학적 가교 또는 하이브리드/하이브리도마 융합을 요구했고, 그 결과 종양 세포 상 이들의 군집화와는 관계 없이 자체적으로 심오한 활성을 가진 차선의 시약을 이끌었다(아마도 이들 이중특이적 항체의 비특이적 집합으로 인해 통상의 CD28-항체를 연상시킴). 더욱이, 이들 초기 접근법은 또한 생체 내 임의의 항종양 활성을 관찰하기 위해 시험관 내 T 세포의 사전-활성화를 요구했다. 더불어서, TGN1412 CD28-활성화 항체로의 파국적인 임상 결과뿐 아니라 이들 초기 CD28-이중특이적 항체 접근법의 한계는 이러한 접근법에 대한 추가 탐구를 단념시켰다.
공동-자극성 "신호 2"를 제공함으로써 항-종양 활성을 두드러지게 그리고 안전하게 촉진할 수 있는 신규 클래스의 CD28 공동자극성 이중특이적 항체가 본원에 기재되어 있다. 이들 CD28-이중특이적 항체는 그 자체가 제한된 활성을 갖고 있으나("신호 1"의 부재 하에), 이들 CD28-이중특이적 항체를 신생 클래스의 CD3-이중특이적 항체와 쌍을 이루어서 제공될 수 있는 바와 같이(또는 종양-특이적 T 세포의 내생성 집단이 이미 존재하는 설정에서 이들 CD28-이중특이적 항체가 사용되는 경우), "신호 1"의 설정에서 항-종양 활성을 두드러지게 증강시킬 수 있다. 이 새로운 CD28-이중특이적 항체 접근법의 제작, 테스트 및 성공은 하기에 달려 있다: (1) 초기에 CD3-이중특이적 항체를 생성하기 위해 개발되었고, 이들 CD3-이중특이적 항체에 대해 최근에는 기술적으로 (문헌[E. J. Smith 등, A novel, native-format bispecific antibody triggering T-cell killing of B cells is robustly active in mouse tumor models and cynomolgus monkeys. Sci Rep 5, 17943 (2015)]) 그리고 임상적으로 (문헌[A. Crawford 등, REGN4018, a novel MUC16xCD3 bispecific T-cell engager for the treatment of ovarian cancer. Proceedings of the American Association for Cancer Research Annual Meeting 2018, (2018)]) (Clinicaltrials.gov: NCT02290951, Clinicaltrials.gov: NCT03564340) 검증되고, 특정 "신호 1"의 부재 하에서 최소 활성을 보이는 CD28-이중특이적 항체를 효과적으로 제조하도록 조정된 신규한 이중특이적 플랫폼의 활용; (2) 이들 CD28-이중특이적 항체를 자체적으로, 그리고 CD3-이중특이적 항체와 조합하여 평가하기 위한 다중 이종 및 동계 유전적으로-인간화된(문헌[D. M. Valenzuela 등, High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis. Nat Biotechnol 21, 652-659 (2003)]; 문헌[W. T. Poueymirou 등, F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses. Nat Biotechnol 25, 91-99 (2007)]) 동물 종양 모델의 개발; 및 (3) 사이토카인 방출 증후군 및 이것의 임상 개발에 대한 훨씬 더 깊은 지식과 함께(문헌[A. Shimabukuro-Vornhagen 등, Cytokine release syndrome. J Immunother Cancer 6, 56 (2018)]; 문헌[D. W. Lee 등, Current concepts in the diagnosis and management of cytokine release syndrome. Blood 124, 188-195 (2014)]; 문헌[C. L. Bonifant, H. J. Jackson, R. J. Brentjens, K. J. Curran, Toxicity and management in CAR T-cell therapy. Mol Ther Oncolytics 3, 16011 (2016)]) 이들 CD28-이중특이적 항체의 임의의 잠재적 독성이 통상의 CD28-활성화 항체의 것과 필적될 수 있는 원숭이 모델의 검증.
난소암에 대해 TSA에 대항해 표적화된 TSAxCD28 공동-자극성 이중특이적 항체(MUC16xCD28)의 생성 및 시험이 본원에 기재되어 있다. "신호 1"의 부재 하에, 이들 CD28-이중특이적 항체는 시험관내에서 또는 생체내에서 미미한 활성을 갖는 것으로 제시되었다. 그러나, 이들 CD28-이중특이적 항체는 CD3-이중특이적 항체와 쌍을 이루어, 종양 항원뿐만 아니라 TCR 및 CD28 복합체를 함유하는 인공 "면역 시냅스"를 형성할 수 있다. 더욱이, 시험관내에서 적절한 CD3-이중특이적 항체와 쌍을 이루는 경우, 이들 CD28-이중특이적 항체는 T 세포 활성화 및 종양 세포 사멸화를 항원-의존적 방식으로 효율적으로 그리고 특이적으로 촉진할 수 있다. 더욱이, 이들 CD28-이중특이적 항체는 또한, 이종 및 동계 종양 모델에서 종양 항원-특이적 방식으로, 생체내에서 CD3-이중특이적 항체의 항-종양 활성을 효율적으로 증강시키며; 이러한 모델에서, CD28-이중특이적 항체는 종양-특이적 T 세포가 이미 존재하지 않는 한 미미한 단일-제제 활성을 갖고, 이러한 설정에서 이들은 이러한 특이적인 활성을 종양-항원-의존적 방식으로 증강시키는 것으로 나타난다. 게다가, TSAxCD28 및 TSAxCD3 조합 치료법은 생체내에서 종양내 활성화된/기억 T 세포 표현형의 확장을 유의하게 추진한다. 마지막으로, 유전적으로-인간화된 면역적격 마우스에서, 뿐만 아니라 시노몰구스 원숭이에서의 독성학 연구는, 종래의 CD28-활성화 항체와 직접적으로 비교한 바와 같이, 이들 이중특이적 항체가 단일 제제로서 제한된 활성을 나타내고 독성을 나타내지 않음을 실증한다.
종종, 면역종양학 분야에서 인간-특이적 임상 후보의 특징화는 이식된 인간 면역 세포를 이용한 이종 종양 모델에서의 시험으로 제한된다. 이들 이종 모델(예컨대, 활용된 OVCAR3 모델)이 매우 유용할 수 있긴 하지만, 이들 모델은 한계를 가진다. 이러한 이종 모델에서 사용되는 마우스는 이들 마우스의 정상 조직에서 인간 종양 조직을 발현하지 않으며, 이로써 표적의 정상 조직 발현의 설정에서 시험 제제의 평가를 배제한다. 사실상, 표적이 정상적으로 또한, 정상 조직에서 높은 수준으로 발현되는 경우, 이는 종양으로부터 시험 제제를 전용(divert)함으로써 항-종양 효능을 제한할 것이고, 이들 정상 조직에 독성을 초래할 수 있을 것이지만, 이 중 어느 것도 이종 모델에서는 평가될 수 없었다. 부가적인 한계는 면역결핍 마우스에게 이전된, 이식된 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 활성을 수반할 수 있을 것이며, 이러한 활성은 면역-적격 시스템에서 발견되는 정상적인 숙주 T 세포의 것과 상이할 수 있을 것이다. 이들 한계를 극복하고 인간-특이적 임상 후보를 시험하기에 더 양호한 모델을 제공하기 위해, 생성된 이중 및 삼중 유전적-인간화 마우스가 생성되었다. 이들 모델에서, 종양 항원은 이러한 항원이 적절한 숙주 조직에서 정상적으로 발현할 수 있도록 유전적으로 인간화되었고(MUC16의 경우), CD3 및/또는 CD28 구성요소는 면역적격 숙주 세포가 인간-특이적 임상 후보에 반응할 수 있도록 유전적으로 인간화되었다. 이들 유전적-인간화 면역적격 동계 동물 모델에서, 이종 동물 모델에서와 같이, MUC16 종양 항원에 대한 CD28-이중특이적 항체는 이의 적절한 CD3-이중특이적 항체의 항-종양 활성을 증강시킨 것으로 밝혀졌다. 다수의 예비임상 모델에 걸쳐 상이한 TSAxCD28 이중특이적 항체(예, MUC16 및 PSMA (데이터에는 나타내지 않음))에 의한 항-종양 효능의 유사한 증강은, 이러한 치료적 양상이 강력하며 특이적인 종양 모델로 제한되고, 면역치료법을 위한 신규 조합 표적 클래스로서 더 넓은 유용성을 가질 수 있을 것임을 시사한다. 전반적으로, 이러한 발견은, TSAxCD28 이중특이적 항체가 TSAxCD3 이중특이적 항체와 상승작용할 수 있고, 잘 연구된 TSAxCD3 이중특이적 항체의 효능을 합리적으로 안전하고 잘-관용된 방식으로 두드러지게 증강시켜, 인간 시험에서의 시험을 정당화할 수 있을 것임을 강조한다.
TSAxCD3 이중특이적 항체는 유망한 신생 클래스의 면역치료법을 나타내지만, 항-종양 활성의 추가의 최적화는 많은 경우에 명백히 필수적일 것이다. CAR-T와 같은 접근법이 이의 항-종양 활성을 향상시키기 위해 "신호 1"과 "신호 2" 둘 다를 인공적으로 활성화시키는 키메라 수용체를 이용하였으므로(문헌[E. A. Zhukovsky, R. J. Morse, M. V. Maus, Bispecific antibodies and CARs: generalized immunotherapeutics harnessing T cell redirection. Curr Opin Immunol 40, 24-35 (2016); S. L. Maude 등, Tisagenlecleucel in Children and Young Adults with B-Cell Lymphoblastic Leukemia. N Engl J Med 378, 439-448 (2018)]), 현재, 항-종양 활성을 증강시키기 위해 CD3-특이적 항체("신호 1"을 제공함)를 CD28-이중특이적 항체("신호 2"를 제공함)와 조합하는 잠재적인 이익이 제시되어 있다. 이러한 접근법이 CAR-T 치료법을 능가하여 갖고 있을 실제적인 이익 외에도 - 상기 접근법은 각각의 환자에 대해 개별적으로 맞춰져야 하는 노동집약적인 세포 치료법 제조를 필요로 하지 않거나, 상기 접근법은 환자가 종종 유해 효과와 관련된 이러한 세포 치료법을 받아들일 수 있도록 독성 화학치료법을 통해 우선적으로 "림프구고갈"될 필요가 없다는 점에서(문헌[A. Shimabukuro-Vornhagen 등, Cytokine release syndrome. J Immunother Cancer 6, 56 (2018)]; 문헌[C. H. June, R. S. O'Connor, O. U. Kawalekar, S. Ghassemi, M. C. Milone, CAR T cell immunotherapy for human cancer. Science 359, 1361-1365 (2018)]) - 본 발명에 따른 이중특이적 접근법은 증가된 효능에 대한 잠재성, 뿐만 아니라 작용의 증가된 안전성과 특이성을 제공한다. 즉, 항원 중 단지 하나만 발현하는 정상 세포에서의 "표적외 독성"을 제한하는 한편, 하나의 항원에 대한 CD3-이중특이적 항체를 제2 항원에 특이적인 CD28-이중특이적 항체와 쌍을 이루고 - 증가된 효능은 두 항원 모두를 발현하는 종양 세포 상에서만 발생할 것이며 - 그러므로, 두 항원 모두를 발현하는 종양 세포로만 T 세포 사멸화의 초점을 맞추는 것에 의한 "조합적 표적화"를 이용하는 것이 가능하다. 종합하여, 본원에 제공된 데이터는, CD28-기초 이중특이적 항체와 CD3-기초 이중특이적 항체의 조합이 두드러지게 증강되고 상승작용적인 항-종양 활성을 갖는 잘-관용화된, "기성품의" 생물학적 해결방안을 제공할 수 있음을 입증한다. 인간 시험에서 이러한 확률의 초기 시험은 올해에 수행될 것이다.
실시예 9. 단독으로 또는 조합 치료로 MUC16xCD28은 시노몰구스 원숭이에서 CD28 슈퍼작용제와 비교하여 전신 T 세포 활성화를 유도하지 않는다
본 발명의 예시적인 MUC16xCD28 항체는 시노몰구스 원숭이로부터 T 세포의 MUC16xCD3 활성화를 증대시켰다(도 2f-2h). 단독으로서 또는 항-MUC16xCD3과 조합된 본 발명의 예시적인 항-MUC16xCD28 이중특이적 항체의 안전성 및 관용성을 결정하기 위해, 단일 용량 독성 연구를 시노몰구스 원숭이에서 수행하였다. 암컷 또는 수컷 시노몰구스 원숭이를 표 27에 지시된 바와 같이 치료군으로 할당하였다.
시노몰구스 원숭이 연구를 IACUC 가이드라인에 따라 수행하였다. 수컷 시노몰구스 원숭이(3 마리의 동물/그룹)은 단일 용량의 각각의 시험 물품을 대략 30분 동안 정맥내 주입을 통해 제공받았다(조합 치료는 총 1시간 동안 별개의 주입으로서 투여되었음). 독성 평가는 임상적 관찰, 정성적 먹이 소모율, 체중, 신경학적 검사, 활력 징후(체온, 심박동수, 맥박 산소측정법, 및 호흡률), 및 임상적 및 해부학적 병태에 기초하였다. 사이토카인 분석 면역표현형 분석, 조직병리학 및 독성동역학적 평가를 위해 혈액 및 조직 시료를 수집하였다. CRP 수준을 Roche Modular P 800 시스템 상에서 분석하였다. 사이토카인을 Meso Scale Diagnostics(MSD, 미국 메릴랜드주 록빌 소재)에 의해 측정하였다. 말초 혈액 유세포분석법을 위해, 혈액을 포타슘 EDTA 튜브에 수집하며, 용해시키고, 항-CD3, 항-Ki67 및 항-ICOS(BD Biosciences)로 염색하고, FACS Canto II로 분석하였다.
동물은 단일 용량의 각각의 시험 물품을 대략 30분 동안 정맥내 주입을 통해 제공받았다(조합 치료는 총 1시간 동안 별개의 주입으로서 투여되었음). 독성 평가는 임상적 관찰, 정성적 먹이 소모율, 체중, 신경학적 검사, 활력 징후(체온, 심박동수, 맥박 산소측정법, 및 호흡률), 및 임상적 및 해부학적 병태에 기초하였다. 사이토카인 분석, FACS 면역표현형 분석, 및 독성동역학적 평가를 위해 혈액 시료를 수집하였다. 1 mg/kg 또는 10 mg/kg의 본 발명의 예시적인 항-MUC16xCD28, 또는 1 또는 10mg/kg의 MUC16xCD3 또는 조합 치료의 단일 용량 투여 후, 유의한 사이토카인 방출, T 세포 변연화 또는 T 세포 활성화 마커 상향조절 중 어느 것도 관찰되지 않았다. 표 27은 개별 동물로부터 지시된 시점에서 수득한 혈액의 절대 T 세포 수, T 세포 활성화 마커(Ki67), CRP 및 혈청 사이토카인 수준을 비롯한 상이한 판독값을 요약한다. 나아가, 이들 발견은 건식- 및 습식-코팅된 인간 T 세포 증식 검정을 이용하여 검증되었으며, 이는 건식-코팅 또는 습식-코팅법을 이용하여 검정 플레이트로 MUC16xCD28을 고정하는 것이 CD28 슈퍼작용제 항체와는 대조적으로 CD3 자극의 부재 하에서 T 세포 활성화를 유도하지 않는다는 점을 입증했다(도 7). 사실상, 본 발명의 예시적인 항-MUC16xCD28 이중특이적 항체뿐만 아니라 부모 2가 CD28 항체는 CD28 슈퍼작용제 항체와 비교하여 인간 T 세포 증식을 유도하지 못한다는 점이 밝혀졌다. 전반적으로, 원숭이에서의 탐색 단일-용량 독성학 연구 및 시험관내 인간 T 세포-기반 검정법은, 본 발명의 예시적인 항-MUC16xCD28 이중특이적 항체가 안전하고 잘 관용됨을 시사한다.
Figure pct00030
사이토카인 및 유세포 분석 면역표현형 분석을 위해 혈액 시료를 수집하였다. 원숭이에게 투여된 CD28-SA가 유의한 사이토카인 방출, 림프구 변연화 및 T 세포 활성화를 유도하는 동안, MUC16xCD28의 투여 후에 사이토카인 방출, T 세포 변연화 또는 T 세포 활성화가 관찰되지 않았다는 점이 주목할만하다(도 8a-8c 및 표 27). 전반적으로, 이러한 예비 관찰은, TSAxCD28 이중특이적 항체가 영장류에서 잘 용인되며, CD28-SA에서 볼 수 있는 바와 같이 사이토카인 방출 및 T 세포 활성화를 유도하지 않음을 시사한다(데이터에는 나타내지 않음). 원숭이에서 CD28-SA에 대한 이전의 연구는 인간에서 볼 수 있는 심오한 사이토카인 방출 및 T 세포 활성화를 예측하지 못했고(Tegenaro AG, www.circare.org/foia5/tgn1412investigatorbrochure.pdf), 이것이 원숭이에서 더 낮은 CD28 발현의 원인이 되었다는 점(문헌[D. Eastwood 등, Monoclonal antibody TGN1412 trial failure explained by species differences in CD28 expression on CD4+ effector memory T-cells. Br J Pharmacol 161, 512-526 (2010)])에 유의해야 한다. 비록 시노몰구스 원숭이에서 내약성 연구가 인간의 CRS를 예측하지 못할 수 있지만, 원숭이에서 CD28-SA로 언급된 강력한 신호는, 단순히 이들 반응이 강력하게 관찰될 수 있을 적절한 초기 시점을 조사하지 않았기 때문에 Tegenaro 등이 이것을 놓쳤다는 점을 시사한다.
실시예 10: bs24963D(MUC16 X CD28 Ab, 또한 REGN5668로도 지칭) 및 REGN4018 (MUC16 X CD3)의 인간 또는 시노몰구스 원숭이 MUC16을 발현하는 세포주, 인간 또는 시노몰구스 원숭이 PBMC로부터의 일차 세포, 및 T-세포주로의 결합
실험 절차의 재료 및 방법-요약
유세포분석을 이용하여 내생적으로 인간 MUC16을 발현하는 인간 난소암 세포주(OVCAR-3 및 PEO1)에 대한 bs24963D의 결합 및 인간 또는 시노몰구스 MUC16을 발현하도록 조작된 마우스 ID8 세포에 대한, 인간 MUC16을 발현하도록 조작된 3T3 세포, 인간 및 시노몰구스 원숭이 T 세포에 대한, 및 조작된 리포터 T 세포주에 대한 bs24963D 및 REGN4018의 결합을 결정하기 위해 이용했다.
요약하면, 1x105 세포/웰을, bs24963D, REGN4018 및 대조군 항체(IgG4P-PVA 비결합 대조군 mAb, CD28 비가교 대조군 이중특이적 항체 또는 부모 CD28 또는 CD3 대조군)을 포함한 항체의 연속 희석물과 함께 30분 동안 4℃에서 인큐베이션하였다.
항체 희석 범위는, 인간 및 시노몰구스 원숭이 1차 T 세포 및 조작된 리포터 T 세포터의 경우 12.2pM 내지 200nM인 반면, MUC16+ 표적 세포의 경우 8.1pM 내지 133nM가 선택되었다.
인큐베이션 후, 세포를 1% 여과된 FBS를 포함하는 차가운 PBS로 2회 세척한 다음 피코에리트린(PE)-표지된 항-인간 IgG (MUC16+ 세포) 또는 Alexa647-표지된 항-인간 IgG (CD28+ 세포)로 검출했다.
근적외선(IR) 반응성 생/사 염료를 인간 및 시노몰구스 원숭이 T 세포에 첨가하였다. 항체가 없거나 2차 항체만 함유하는 웰을 대조군으로서 이용하였다.
MUC16+ 세포 또는 J.RT3.T3.5/NF-κB-Luc/1G4AB/hCD8αβ/hCD28 세포주로 인큐베이션한 후, 세포를 세척하며, 200 μL FACS 완충액(1% 여과된 FBS 및 1mM EDTA를 함유하는 차가운 PBS)에서 재현탁시키고, BD FACS Canto II 상에서 유세포분석법에 의해 분석하였다.
인간 또는 시노몰구스 원숭이 T 세포와 함께 인큐베이션한 후, 세포를 세척하며, FACS 완충액 중 항-CD2, 항-CD16, 항-CD4, 및 항-CD8의 칵테일로 4℃에서 20분 동안 염색하였다. 세척 후, 세포를 FACS 완충액에 재현탁시키고, 생/CD2+/CD4+/CD16- 또는 생/CD2+/CD8+/CD16- 상에서 게이팅하고, BD LSRFortessa X-20 상에서 유세포분석법에 의해 분석하였다.
EC50 측정을 위해, 측정된 MFI 값은 GraphPad Prism을 이용해 9-포인트 반응 곡선에 대해 4-매개변수 로지스틱 방정식을 이용하여 분석했다. 최대 MFI에서 배수 증가를, 2차 항체만을 함유하는 웰의 MFI에 대해 검출된 가장 높은 MFI의 비율을 취함으로써 결정하였다.
유세포 측정법을 또한 이용하여 bs24963D 및 상업적인 항-PD-L1 항체의 MUC16+ 인간 췌장 암 세포, SW1990 및 SW1990/hPD-L1 세포의 결합을 결정하였다. 요약하면, 2x105 세포를 5 μL (66.7nM) bs24963D, 항-PD-L1 (2.5 μL), 또는 AlexaFluor647 (bs24963D) 또는 APC (항-PD-L1)와 접합된 비결합 대조군 항체와 함께 인큐베이션하고, 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 염색 완충액으로 1회 세척하고, 원심분리하고 D-PBS로 세척하였다. 세포를 생/사 고정가능한 바이올렛 생존성 염료의 1:1000 희석액 100 μL로 염색하고, 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 3회 염색 완충액에서 세척하고, 100 μL 1:1 염색 완충액 및 세포고정 용액에서 재현탁하고, Cytoflex 세포측정기를 이용하여 유세포분석에 의해 분석했다. 생존율에 대한 배수 결합을 관심 항체의 MFI를 생존율 단독의 MFI로 나누어 계산하였다.
재료 및 방법
NF-κB 루시퍼라아제 리포터 생물검정
bs24963D의 TCR-매개 신호전달 향상 능력을, 도 10에 도시된 바와 같은 조작된 T 세포/항원-제시 세포-기반 리포터 검정에서 평가하였다. TCR은 특정 MHC/펩타이드 복합체를 인식하고, T 세포를, 수많은 전사 인자, 예컨대 활성화 단백질 1(AP-1), 활성화된 T 세포의 핵 인자(NFAT), 또는 활성화된 B 세포의 핵 인자 카파-경쇄-인핸서(NF-κB) (문헌[Goldrath, 1999; Nature 402:255-62])를 통해 활성화시킨다(문헌[Shapiro, 1998; J. Immunology; 161(12):6455-8]). T-세포 반응은 공동-자극성 수용체, 예컨대 CD28의 연대를 통해 추가로 정제되며, 이는 차례로 이것의 내생적 리간드, CD80 또는 CD86에 의해 활성화되고, 후속해서 TCR 활성화 후 NF-κB 전사 인자에 의해 제어된 경로와 같은 세포 신호를 강화시킨다.
이 검정에서, 조작된 T 세포는, 조작된 항-제시 3T3 세포 상 전시된 hβ2M 및 HLA-A2인 인간 MHC 클래스 I 분자와의 복합체를 이루는 NY-ESO-1 157-165 펩타이드 (NYESO1p)를 인식하는 1G4 TCR (IG4AB)를 통해 직접적으로 활성화된다(문헌[Robbins, 2008; J. of Immunology; 180(9): 6116-31]). TCR 활성화는 루시퍼라아제의 생성을 도모하고, 이는 조작된 리포터 T 세포에서 NF-κB 전사 인자에 의해 구동된다. CD8은 TCR/MHC 상호작용을 용이하게 하고, 림프구-특이적 단백질 티로신 키나아제(Lck)를 TCR/CD3 복합체에 동원시켜 T-세포 활성화를 촉진하고, 이로써 세포내 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)의 인산화를 통해 TCR 신호전달을 향상시킨다(문헌[Cole, 2012; Immunology; 137(2):139-48]) (문헌[Guirado, 2002; Biochem. Biophys. Res. Comm. 291(3):574-81]).
bs24963D, 비-가교 대조군(비-TAAxCD28 이중특이적 항체) 또는 비-결합 대조군의 2-배 연속 희석물(39pM 내지 10nM)을, MUC16- (3T3/hβ2M/HLA-A2/NYESO1p) 또는 MUC16+ (3T3/hβ2M/HLA-A2/NYESO1p/hMUC16)인 1.5x104 항원-제시 세포의 존재 하에서 웰 당 5x104 조작된 리포터 T 세포(J.RT3.T3.5/NF-κB-Luc/1G4AB/hCD8αβ/hCD28)에 이중으로 첨가했다. 항체 희석물 및 생물검정을 완전 배지(10% FBS, 및 페니실린, 스트렙토마이신 및 L-글루타민의 칵테일로 보충된 RPMI)에서 수행하였다. 항체를 함유하지 않는 웰이 추가적인 대조군으로 포함되었고, 활성 및 EC50 값의 배 증가를 계산하는 데 사용되었다. 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 5시간 동안 인큐베이션한 다음, ONE-Glo 루시퍼라아제 기질(100 μL)을 각 웰에 첨가했다. 루시퍼라아제 활성은 상대적 광 단위(RLU)로 표시되는 ENVISION 플레이트 판독기를 이용해 발광 신호로서 기록되었다. 검출된 RLU 값을, GraphPad Prism을 이용하여 10-포인트 응답 곡선에 대한 4-매개변수 로지스틱 방정식으로써 분석했다.
최대 활성화 신호는 시험된 항체 농도 범위 내에서 검출된 평균 최대 RLU 반응으로서 결정되었다. 활성에서 배수 증가는 항체의 부재 하에서 기록된 평균 RLU 값에 대한 시험된 항체 농도 범위 내 기록된 가장 높은 평균 RLU 값의 비율로서 계산되었다.
T-세포 증식 및 IL-2 방출에 대한 T-세포 활성화 검정
일정한 농도의 REGN4018(인간 난소암 세포주 OVCAR-3 및 PEO1에서 평가됨) 또는 일정한 농도의 세미플리맙(인간 췌장암 세포주[SW1990 및 SW1990/hPD-L1]에서 평가됨)의 존재 하에서 IL-2 방출 및 T-세포 증식을 매개하는 bs24963D의 능력을, 각각 3 또는 2명의 공여자로부터 풍부한 인간 1차 T 세포로 T-세포 활성화 검정을 이용해 결정하였다.
인간 1차 T 세포 단리
인간 PBMC를 4개의 건강한 공여자의 백혈구 팩으로부터 단리하였다. 공여자 555014 및 555109의 경우, 밀도 구배 원심분리를 이용하여 말초 혈액으로부터 PBMC를 단리하였다. 요약하면, 15 mL의 Ficoll Plaque Plus를 50 mL 원뿔형 튜브에 첨가하고, 후속해서 2% FBS를 함유하는 PBS로 1:1 희석된 혈액 30 mL을 위에 쌓였다. 400 x g에서 30분 원심분리 후, 브레이크를 해제한 후, 단핵구 세포층을 새 튜브로 옮기고, 2% FBS를 함유하는 PBS로 5x 희석하고, 300 x g로 8분 동안 원심분리했다. 공여자 555131 및 555129의 경우, 제조업체 프로토콜에 따르고 Stem Cell Technologies의 EasySep Direct 인간 PBMC 단리 키트를 이용하여 건강한 공여자의 말초 혈액으로부터 PBMC를 단리했다. 단리된 PBMC를 10% DMSO를 함유한 FBS에서 동결하였다. CD3+ T-세포 단리를 위해, PBMC의 냉동 바이알을 37℃ 수조에서 해동하고, 50 U/mL Benzonase® 뉴클레아제를 함유하는 자극 배지(10% FBS, HEPES, NaPyr, NEAA, 및 0.01mM β-메르캅토에탄올[BME]로 보충된 X-VIVO 15 배양 배지)에서 희석하였다. 세포를 1200 rpm에서 10분 동안 원심분리하고, EasySep 완충액에서 재현탁하고, 제조업체 프로토콜에 따라 StemCell Technologies EasySep T-세포 단리 키트를 이용하여 단리하였다.
인간 OVCAR-3, PEO1, SW1990, SW1990/hPD-L1 세포 및 인간 1차 T 세포를 이용한 T-세포 활성화 검정
자극 배지(10% FBS, HEPES, NaPyr, NEAA, 및 0.01mM BME로 보충된 X-VIVO 15 세포 배양 배지)에서 재현탁된 CD3+ T 세포를, 1x105 세포/웰의 농도로 96-웰 둥근바닥 플레이트에 플레이팅하였다. OVCAR-3, PEO1, SW1990, 또는 SW1990/hPD-L1 세포를, 25 μg/mL (OVCAR-3), 10 μg/mL (PEO1), 또는 30 μg/mL (SW1990 및 SW1990/hPD-L1) 미토마이신 C로 증식을 저지하기 위해 처리했다. 37℃, 5% CO2에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 미토마이신 C-처리 세포를 2% FBS를 함유하는 D-PBS로 3회 세척한 후, 자극 배지에서 최종 재현탁하였다. OVCAR-3, PEO1, SW1990, 및 SW1990/hPD-L1 세포를, CD3+ T 세포를 함유하는 웰에 각각 OVCAR-3, PEO1, 및 두 SW1990에 대해 1x104, 2.5x104 세포, 또는 5x104 세포의 최종 농도로 첨가하였다. 일정한 농도의 REGN4018 또는 CD3 비-가교 대조군 이중특이적 항체(5nM) 또는 세미플리맙 또는 비-결합 IgG4P 대조군(20nM)을 OVCAR-3, PEO1, SW1990, 또는 SW1990/hPD-L1 세포를 함유하는 웰에 첨가했다. 후속적으로, bs24963D, 비-TAAxCD28 대조군 또는 비-결합 대조군, 항체를 1:4 희석 시리즈에서 7.6 pM 내지 500 nM까지 적정하고 웰에 첨가했다. 10-점 농도 곡선의 최종점은 항체를 함유하지 않았고, 이는 활성의 배수 증가를 계산하기 위해 이용되었다. 5% CO2, 37℃에서 72(OVCAR-3 및 PEO1) 또는 96(SW1990 및 SW1990/hPD-L1) 시간 동안 플레이트를 인큐베이션한 후, 50 μL의 배지 상청액을 수집해 증식을 정량화하기 위해 [메틸-3H]-티미딘으로 처리하기에 앞서 IL-2를 측정하였다.
IL-2 방출을 위해, 5 μL (OVCAR-3 및 PEO1 세포를 이용한 검정의 경우) 또는 20 μL (SW1990 및 SW1990/hPD-L1 세포를 이용한 검정의 경우)의 상청액을, 제조업체 프로토콜에 따라 인간 IL-2 AlphaLISA 키트를 이용하여 시험하였다. Perkin Elmer의 다중표지 플레이트 판독기 상에서 IL-2 측정값을 획득하고, 상대 형광 단위(RFU)로 기록하였다.
증식 검정을 위해, 자극 배지에서 2mCi/mL로 희석된 50 μL의 [메틸-3H]-티미딘을 웰에 첨가하고, 플레이트를 6시간(OVCAR-3 및 PEO1 세포를 이용하는 검정의 경우) 또는 16시간(SW1990 및 SW1990/hPD-L1 세포를 이용하는 검정의 경우) 동안 인큐베이션하였다. [메틸-3H]-티미딘은 분열 세포에서 더 많은 양으로 통합될 것이다. 인큐베이션 후, 세포를 필터 플레이트 상으로 수합하고, Microplate Scintillation & Luminescence Counter TopCount NXT 기기 상에서 측정하기 위해 준비하였다.
모든 순차적 희석물을 삼중으로 IL-2 방출 및 증식에 대해 시험하였다. 항체에 대한 EC50 값은 GraphPad PrismTM 소프트웨어를 사용하여 10-점 용량-반응 곡선 상에 걸쳐 4-매개변수 로지스틱 방정식으로부터 측정하였다. IL-2 방출 및 증식의 최대 수준은 시험된 용량 범위 내에서 검출된 평균 최대 반응으로서 제공된다. bs24963D에 의해 매개된 최대 IL-2 방출 또는 T-세포 증식의 배수 증가는 항체가 매개되지 않은 최대 IL-2 방출 또는 증식에 대해 계산되었다.
bs24963D의 T 세포 활성화 능력을, 자극성 항원-제시 세포가 신호 1을 제공하는 검정에서 평가하였다. 이 검정은 NF-κB-루시퍼라아제 리포터, 및 HLA-A2와 복합체로의 NY-ESO-1 펩타이드(NYESO1p)를 인식하는 문헌에 기술된 TCR(1G4), 인간 CD8, 인간 CD28을 발현하도록 조작된 J.RT3.T3.5 리포터 T 세포를 이용했다. 신호 1을 제공하는 자극성 항원-제시 세포는, 인간 MUC16 (hMUC16)이 없거나 이와 함께 HLA-A2, hβ2M, 및 NYESO1p를 발현되도록 조작된 3T3 세포였다. CD28 비-가교 대조군 이중특이적 항체(비-TAAxCD28) 및 비-가교 대조군 mAb(IgG4P-PVA)를 bs24963D와 병행하여 테스트하였다. NF-κB 신호전달은 루시퍼라아제 리포터 활성을 검출하도록 발광 시약을 이용해 측정했다. 결과는 표 28에 요약되어 있다.
이 테스트 시스템에서, bs24963D는 MUC16+ 항원 제시 세포의 존재 하에서 리포터 T 세포에서 NF-κB 신호전달의 농도-의존적 증가를 매개했고; MUC16 발현이 결여된 세포를 이용해서는 어떠한 활성도 관찰되지 않았다(도 11a 및 11b). NF-κB 신호전달의 증가가 CD28 비-가교 대조군 이중특이적 항체로는 관찰되지 않았다.
Figure pct00031
실시예 11. REGN4018 (항-MUC16 X 항-CD3) 또는 세미플리맙(PD-1 길항제 항체)의 존재 또는 부재 하 인간 1차 T 세포의 bs24963D (항-MUC16 X 항-CD28)-매개 IL-2 방출 및 증식의 평가
IL-2 방출 및 T-세포 증식에 의해 결정된 바와 같이, 인간 1차 T 세포를 활성화하는 bs24963D의 능력을, 2개의 상이한 MUC16+ 인간 난소암 세포주(OVCAR-3 및 PEO1)의 존재 하에서 평가하였다. 이들 세포는 동종이계 반응으로부터 충분한 신호 1을 제공하지 않기 때문에, 고정된 농도의 REGN4018 (MUC16 X CD3 이중특이적 항체)를 신호 1을 제공하기 위해 포함하였다. OVCAR-3 및 PEO1 세포에 대한 결과를, 표 29에서는 IL-2 방출에 대해, 표 30에서는 증식에 대해 요약한다.
IL-2 방출 및 T-세포 증식에 의해 결정된 바와 같이, 인간 1차 T 세포를 활성화하는 bs24963D의 능력을, MUC16+ 인간 췌장암 세포주(SW1990) 및 인간 PD-L1을 과발현하도록 조작된 SW1990(SW1990/hPD-L1)의 존재 하에서 평가하였다. 양 세포주 모두 신호 1로 작용하기에 충분한 동종이계 반응을 제공한다. 부가적으로, 고정된 농도의 세미플리맙(20nM)의 bs24963D의 효과를 증대시키기 위한 능력을 또한 평가하였다. SW1990 및 SW1990/hPD-L1 세포에 대한 결과를, 표 31에서는 IL-2 방출에 대해, 표 32에서는 증식에 대해 요약한다.
OVCAR-3 및 PEO1 표적 세포와 함께 REGN4018의 존재 또는 부재 하에서 인간 1차 T 세포로부터의 IL-2 방출 및 이의 증식을 향상시키기 위한 bs24963D (REGN5668)의 능력
OVCAR-3 및 PEO1 암 세포와 함께 인큐베이션 시, bs24963D는 REGN4018의 존재 하에서만 인간 T 세포로부터의 IL-2 방출(도 12) 및 이의 증식(도 13)의 농도-의존적 향상을 매개했다. CD3 및 CD28 비-가교 대조군 이중특이적 항체는 REGN4018의 존재 또는 부재하에서 IL-2 방출을 향상시키지 않았다.
이 검정에서, 5nM REGN4018 단독은 IL-2 방출을 증가시키지 않았지만, 비-결합 대조군에 비해 T-세포 증식의 중간 정도의 향상을 보였다.
Figure pct00032
Figure pct00033
SW1990 및 SW1990/hPD-L1 표적 세포와 함께 세미플리맙의 존재 또는 부재 하에서 인간 1차 T 세포로부터의 IL-2 방출 및 이의 증식을 향상시키기 위한 bs24963D (REGN5668)의 능력
SW1990 및 SW1990/hPD-L1 MUC16+ 인간 췌장암 세포와 함께 인큐베이션 시, bs24963D는 세미플리맙의 존재 및 부재 하에서 인간 T 세포로부터의 IL-2 방출(도 14) 및 이의 증식(도 15)의 농도-의존적 향상을 매개했다. SW1990 세포에서 인간 PD-L1의 과발현은 bs24963D의 존재 하에서 IL-2 및 T-세포 증식을 억제시키고, 이것들은 세미플리맙의 첨가에 의해 적당하게 증가하였다. 고 농도에서, CD28 비-가교 대조군 이중특이적 항체는 SW1990 및 SW1990/hPD-L1 세포의 존재 하에서 일부 IL-2 방출을 매개했다. bs24963D의 부재 하에서, 세미플리맙은 CD28 비-가교 대조군 이중특이적 항체에 비해 IL-2 방출 또는 T-세포 증식을 증가시키지 않았다.
Figure pct00034
Figure pct00035
본 발명은 그 범위가 본원에 기재된 구체적인 구현예에 의해 제한되지 않는다. 사실상, 본원에 기재된 것 이외의 본 발명의 다양한 변형은 상기 상세한 설명 및 첨부된 도면으로부터 당업자에게 명확해질 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구범위의 범위 내에 속하는 것을 의도한다.
SEQUENCE LISTING <110> REGENERON PHARMACEUTICALS, INC. <120> BISPECIFIC ANTI-MUC16 X ANTI-CD28 ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> 10493-WO01/118003-49320 <140> <141> <150> 62/815,861 <151> 2019-03-19 <150> 62/782,142 <151> 2018-12-19 <160> 54 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 387 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 1 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggaacagc cagggcggtc cctgagactc 60 tcctgtacag cttctggatt cgcctttggt gatcatacta tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtaggtttc attagaagta gagcttatgg tgggacaaca 180 gaatacgccg cgtctgtgaa aggcagattc accatctcaa gagatgattc caaaagcatc 240 gcctatctgc aaatggacag cctgaaaacc gaggacacag ccgtgtatta ttgtactagc 300 gggggatatg atagtagtct tcattactac tattactacc acggtatgga cgtctggggc 360 cgagggacca cggtcaccgt ctcctca 387 <210> 2 <211> 129 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Glu Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly 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gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccgtca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccctccgat caccttcggc 300 caagggacac gactggagat taaa 324 <210> 34 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 34 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro 85 90 95 Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 35 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 35 cagagcatta gcagctat 18 <210> 36 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Phe Ser Arg Glu 20 25 30 Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu Val Cys 35 40 45 Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser Lys Thr 50 55 60 Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr Phe Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys Lys Ile 85 90 95 Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly 100 105 110 Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe 115 120 125 Pro Gly Pro Ser Lys Pro Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys 130 135 140 Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 145 150 155 160 Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser 165 170 175 Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp 180 185 190 Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln 195 200 205 Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser 210 215 220 Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys 225 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Asp Pro Thr Gly Pro Gly Leu Asp 50 55 60 Arg Glu Gln Leu Tyr Leu Glu Leu Ser Gln Leu Thr His Ser Ile Thr 65 70 75 80 Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asp Ser Leu Tyr Val Asn Gly 85 90 95 Phe Thr His Arg Ser Ser Val Pro Thr Thr Ser Thr Gly Val Val Ser 100 105 110 Glu Glu Pro Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Asn Asn Leu Arg Tyr Met 115 120 125 Ala Asp Met Gly Gln Pro Gly Ser Leu Lys Phe Asn Ile Thr Asp Asn 130 135 140 Val Met Gln His Leu Leu Ser Pro Leu Phe Gln Arg Ser Ser Leu Gly 145 150 155 160 Ala Arg Tyr Thr Gly Cys Arg Val Ile Ala Leu Arg Ser Val Lys Asn 165 170 175 Gly Ala Glu Thr Arg Val Asp Leu Leu Cys Thr Tyr Leu Gln Pro Leu 180 185 190 Ser Gly Pro Gly Leu Pro Ile Lys Gln Val Phe His Glu Leu Ser Gln 195 200 205 Gln Thr His Gly Ile Thr Arg Leu Gly Pro Tyr Ser Leu Asp Lys Asp 210 215 220 Ser Leu Tyr Leu Asn Gly Tyr Asn Glu Pro Gly Pro Asp Glu Pro Pro 225 230 235 240 Thr Thr Pro Lys Pro Ala Thr Thr Phe Leu Pro Pro Leu Ser Glu Ala 245 250 255 Thr Thr Ala Met Gly Tyr His Leu Lys Thr Leu Thr Leu Asn Phe Thr 260 265 270 Ile Ser Asn Leu Gln Tyr Ser Pro Asp Met Gly Lys Gly Ser Ala Thr 275 280 285 Phe Asn Ser Thr Glu Gly Val Leu Gln His Leu Leu Arg Pro Leu Phe 290 295 300 Gln Lys Ser Ser Met Gly Pro Phe Tyr Leu Gly Cys Gln Leu Ile Ser 305 310 315 320 Leu Arg Pro Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp Thr Thr Cys 325 330 335 Thr Tyr His Pro Asp Pro Val Gly Pro Gly Leu Asp Ile Gln Gln Leu 340 345 350 Tyr Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr His Gly Val Thr Gln Leu Gly Phe 355 360 365 Tyr Val Leu Asp Arg Asp Ser Leu Phe Ile Asn Gly Tyr Ala Pro Gln 370 375 380 Asn Leu Ser Ile Arg Gly Glu Tyr Gln Ile Asn Phe His Ile Val Asn 385 390 395 400 Trp Asn Leu Ser Asn Pro Asp Pro Thr Ser Ser Glu Tyr Ile Thr Leu 405 410 415 Leu Arg Asp Ile Gln Asp Lys Val Thr Thr Leu Tyr Lys Gly Ser Gln 420 425 430 Leu His Asp Thr Phe Arg Phe Cys Leu Val Thr Asn Leu Thr Met Asp 435 440 445 Ser Val Leu Val Thr Val Lys Ala Leu Phe Ser Ser Asn Leu Asp Pro 450 455 460 Ser Leu Val Glu Gln Val Phe Leu Asp Lys Thr Leu Asn Ala Ser Phe 465 470 475 480 His Trp Leu Gly Ser Thr Tyr Gln Leu Val Asp Ile His Val Thr Glu 485 490 495 Met Glu Ser Ser Val Tyr Gln Pro Thr Ser Ser Ser Ser Thr Gln His 500 505 510 Phe Tyr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Pro Tyr Ser Gln Asp Lys 515 520 525 Ala Gln Pro Gly Thr Thr Asn Tyr Gln Arg Asn Lys Arg Asn Ile Glu 530 535 540 Asp Ala Leu Asn Gln Leu Phe Arg Asn Ser Ser Ile Lys Ser Tyr Phe 545 550 555 560 Ser Asp Cys Gln Val Ser Thr Phe Arg Ser Val Pro Asn Arg His His 565 570 575 Thr Gly Val Asp Ser Leu Cys Asn Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val 580 585 590 Asp Arg Val Ala Ile Tyr Glu Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Asn Gly 595 600 605 Thr Gln Leu Gln Asn Phe Thr Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val Asp 610 615 620 Gly Tyr Ser Pro Asn Arg Asn Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser Asp Leu 625 630 635 640 Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Gly Glu Gln Lys 645 650 655 Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu His His His His His His 660 665 <210> 52 <211> 367 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hCD28 ecto (N19-P152).mFc <400> 52 Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr Asp Asn 1 5 10 15 Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser Arg Glu 20 25 30 Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu Val Cys 35 40 45 Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser Lys Thr 50 55 60 Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr Phe Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys Lys Ile 85 90 95 Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly 100 105 110 Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe 115 120 125 Pro Gly Pro Ser Lys Pro Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys 130 135 140 Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 145 150 155 160 Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser 165 170 175 Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp 180 185 190 Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln 195 200 205 Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser 210 215 220 Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys 225 230 235 240 Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile 245 250 255 Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro 260 265 270 Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met 275 280 285 Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn 290 295 300 Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser 305 310 315 320 Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn 325 330 335 Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu 340 345 350 His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys 355 360 365 <210> 53 <211> 162 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hCD28 ecto (N19-P152).mmH <400> 53 Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr Asp Asn 1 5 10 15 Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser Arg Glu 20 25 30 Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu Val Cys 35 40 45 Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser Lys Thr 50 55 60 Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr Phe Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys Lys Ile 85 90 95 Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly 100 105 110 Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe 115 120 125 Pro Gly Pro Ser Lys Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 130 135 140 Gly Gly Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu His His His His 145 150 155 160 His His <210> 54 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse CD28 (Accession# NP_031668.3) mCD28 ecto (N20-L150).mmH <400> 54 Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Leu Leu Val Val Asp Ser Asn 1 5 10 15 Glu Val Ser Leu Ser Cys Arg Tyr Ser Tyr Asn Leu Leu Ala Lys Glu 20 25 30 Phe Arg Ala Ser Leu Tyr Lys Gly Val Asn Ser Asp Val Glu Val Cys 35 40 45 Val Gly Asn Gly Asn Phe Thr Tyr Gln Pro Gln Phe Arg Ser Asn Ala 50 55 60 Glu Phe Asn Cys Asp Gly Asp Phe Asp Asn Glu Thr Val Thr Phe Arg 65 70 75 80 Leu Trp Asn Leu His Val Asn His Thr Asp Ile Tyr Phe Cys Lys Ile 85 90 95 Glu Phe Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Arg Ser Asn Gly 100 105 110 Thr Ile Ile His Ile Lys Glu Lys His Leu Cys His Thr Gln Ser Ser 115 120 125 Pro Lys Leu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Gly Glu 130 135 140 Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu His His His His His His 145 150 155

Claims (54)

  1. 단리된 이중특이적 항원 결합 분자로서,
    a) 37℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된 바와 같이 약 2x10-7 M 미만의 KD로, 인간 CD28에 결합하는 제1 항원-결합 도메인(D1);
    b) 37℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된 바와 같이 약 10-9 M 미만의 KD로, 표적 종양 세포 상의 인간 뮤신 16 막 항원(MUC16)에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 도메인(D2)을 포함하는, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자.
  2. 제1항에 있어서, 이중특이적 항원 결합 분자는 시험관내 FACS 결합 검정법에 의해 측정된 바와 같이 약 10-5 M 미만의 EC50으로, 인간 T 세포의 표면에 결합하는, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자.
  3. 제1항에 있어서, 이중특이적 항원 결합 분자는 시험관내 FACS 결합 검정법에 의해 측정된 바와 같이 약 6x10-6 M 미만의 EC50으로, 시노몰구스(cynomolgus) T 세포의 표면에 결합하는, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자.
  4. 제1항에 있어서, 이중특이적 항원 결합 분자는 시험관내 FACS 결합 검정법에 의해 측정된 바와 같이 약 10-9 M 미만의 EC50으로, MUC16을 발현하는 세포주의 표면에 결합하는, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자.
  5. 제1항에 있어서, 이중특이적 항원 결합 분자는 항-MUC16xCD3 이중특이적 항체와 함께 사용되고 MUC16를 발현하는 표적 세포 상에서 시험되는 경우 공동자극성 효과를 실증하는, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자.
  6. 제5항에 있어서, 공동자극성 효과는 (a) MUC16을 발현하는 표적 세포를 사멸화시키기 위해 인간 T 세포를 활성화시키고 겨냥(direct)시키는 능력; (b) T 세포 상의 PD-1을 상향조절하는 능력; (c) PBMC로부터 사이토카인 IFN 감마의 방출을 증가시키는 능력; (d) 종양 세포를 고갈시키는 능력; (f) 종양 청소(clearance)를 증강시키는 능력; 및/또는 (g) 전신 T 세포 활성화 유도의 결핍 중 하나 이상에 의해 나타내어지는, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자.
  7. 제6항에 있어서, 공동자극성 효과는 추가로 (g) 1차 CD4+T 세포/APC 기능 검정을 사용한 IL-2 사이토카인 생성의 측정에 의해 나타내어지는, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 종양 세포는 난소암 세포인, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원-결합 도메인(D1)은:
    a) SEQ ID NO: 18 및 42로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR) 내에 함유된 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR1, HCDR2 및 HCDR3); 및
    b) SEQ ID NO: 10 및 34로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR) 내에 함유된 3개의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)을 포함하는, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자.
  10. 제9항에 있어서,
    a) SEQ ID NO: 20 및 44로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 22 및 46으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 24 및 48로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자.
  11. 제10항에 있어서,
    a) SEQ ID NO: 12 및 36으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 14 및 38로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 16 및 40으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자.
  12. 제9항에 있어서, 제1 항원-결합 도메인은,
    a) HCVR CDR 세트(HCDR1, HCDR2, HCDR3)이되 상기 세트는 SEQ ID NO: 20, 22, 24 및 44, 46, 48로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 세트, 및 LCVR CDR 세트(LCDR1, LCDR2, LCDR3)이되 상기 세트는 SEQ ID NO: 12, 14, 16 및 36, 38, 40으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 세트를 포함하는, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자.
  13. 제9항에 있어서, 제1 항원-결합 도메인은 SEQ ID NO: 18/10; 및 42/34으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 HCVR/ LCVR 쌍(pair)을 포함하는, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원-결합 도메인은,
    a) SEQ ID NO: 2 및 26으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 HCVR 내에 함유된 3개의 HCDR; 및
    b) SEQ ID NO: 10 및 34로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 LCVR 내에 함유된 3개의 LCDR을 포함하는, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자.
  15. 제14항에 있어서, 제2 항원-결합 도메인은,
    a) SEQ ID NO: 4 및 28로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1;
    b) SEQ ID NO: 6 및 30으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2; 및
    c) SEQ ID NO: 8 및 32로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자.
  16. 제15항에 있어서, 제2 항원-결합 도메인은,
    a) SEQ ID NO: 12 및 36으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 14 및 38로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 16 및 40으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자.
  17. 제16항에 있어서, 제2 항원-결합 도메인은,
    a) HCVR CDR 세트(HCDR1, HCDR2, HCDR3)이되 상기 세트는 SEQ ID NO: 4, 6, 8; 및 28, 30, 32로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 세트, 및 LCVR CDR 세트(LCDR1, LCDR2, LCDR3)이되 상기 세트는 SEQ ID NO: 12, 14, 16; 및 36, 38, 40으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 세트를 포함하는, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) SEQ ID NO: 20, 22, 24의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR CDR, 및 SEQ ID NO: 12, 14, 16의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR CDR을 포함하는 제1 항원-결합 도메인; 및
    b) SEQ ID NO: 4, 6, 8의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR CDR, 및 SEQ ID NO: 12, 14, 16의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR CDR을 포함하는 제2 항원-결합 도메인을 포함하는, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자.
  19. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) SEQ ID NO: 44, 46, 48의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR, 및 SEQ ID NO: 36, 38, 40의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR을 포함하는 제1 항원-결합 도메인; 및
    b) SEQ ID NO: 28, 30, 32의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR, 및 SEQ ID NO: 36, 38, 40의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR을 포함하는 제2 항원-결합 도메인을 포함하는, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자.
  20. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) SEQ ID NO: 18/10의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR/ LCVR 쌍을 포함하는 제1 항원 결합 도메인; 및
    b) SEQ ID NO: 2/10의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR/ LCVR 쌍을 포함하는 제2 항원 결합 도메인을 포함하는, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자.
  21. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 제1 항원 결합 도메인은 SEQ ID NO: 42/34의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR/LCVR 쌍을 포함하고;
    b) 제2 항원 결합 도메인은 SEQ ID NO: 26/34의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR/LCVR 쌍을 포함하는, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자.
  22. MUC16에 결합하기 위해 경쟁하거나 기준 항체와 동일한 MUC16 상의 에피토프에 결합하는 단리된 이중특이적 항원 결합 분자로서, 여기서 기준 항체는 SEQ ID NO: 18/10, 또는 42/34의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR/LCVR 쌍을 갖는 제1 항원-결합 도메인 및 SEQ ID NO: 2/10, 또는 26/34의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR/LCVR 쌍을 갖는 제2 항원-결합 도메인을 포함하는, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자.
  23. 인간 CD28에 결합하기 위해 경쟁하거나 기준 항체와 동일한 인간 CD28 상의 에피토프에 결합하는 단리된 이중특이적 항원 결합 분자로서, 여기서 기준 항체는 SEQ ID NO: 18/10, 또는 42/34의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR/LCVR 쌍을 갖는 제1 항원-결합 도메인 및 SEQ ID NO: 2/10, 또는 26/34의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR/LCVR 쌍을 갖는 제2 항원-결합 도메인을 포함하는, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 이중특이적 항원-결합 분자 및 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함하는, 약제학적 조성물.
  25. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 이중특이적 항체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산.
  26. 제25항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  27. 제26항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  28. 대상체에서 난소 세포 종양의 성장을 저해하는 방법으로서, 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 단리된 이중특이적 항체 또는 제26항의 약제학적 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  29. 제28항에 있어서, 제2 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  30. 제29항에 있어서, 제2 치료제는 항-종양제, 방사선치료법, 항체 약물 접합체, 항-종양제에 접합된 이중특이적 항체, 체크포인트 저해제, 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
  31. 난소암을 앓고 있거나 또 다른 MUC16-발현 세포 악성물을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 단리된 이중특이적 항체 또는 제24항의 약제학적 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 제2 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  33. 제32항에 있어서, 제2 치료제는 항-종양제, 방사선치료법, 항체 약물 접합체, 항-종양제에 접합된 이중특이적 항체, 체크포인트 저해제, 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
  34. 제29항 또는 제32항에 있어서, 제2 치료제는 동일한 종양 표적 항원에 결합하는 제1 항원 결합 도메인 및 T 세포 상의 CD3에 결합하는 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 상이한 이중특이적 항체인, 방법.
  35. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 항원-결합 분자는 인간 난소 세포의 T-세포 매개 세포독성을 유도하는, 단리된 이중특이적 항원 결합 분자.
  36. 인간 CD28에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인 및 인간 MUC16에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항원-결합 분자.
  37. 제36항에 있어서, 항원-결합 분자는 1x10-12 M 내지 10x10-6 M의 EC50 값으로 CD28-발현 인간 T-세포에 결합하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
  38. 제37항에 있어서, 항원-결합 분자는 1x10-9 M 내지 10x10-6 M의 EC50 값으로 CD28-발현 인간 T-세포에 결합하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
  39. 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 항원-결합 분자는 인간 CD28을 발현하는 인간 세포 및 시노몰구스 CD28을 발현하는 시노몰구스 원숭이 세포에 결합하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
  40. 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 항원-결합 분자는 인간 전혈에서 사이토카인 방출 및 CD25 상향조절을 유도하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
  41. 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 항원-결합 분자는 인간 난소 세포의 T-세포 매개 세포독성을 유도하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
  42. 제36항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 CD28에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인은 SEQ ID NO: 18 및 42로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR)으로부터의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR1, HCDR2 및 HCDR3), 및 SEQ ID NO: 10 및 34로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR)으로부터의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)을 포함하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
  43. 제36항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 MUC16에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 도메인은 SEQ ID NO: 2 및 26을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR)으로부터의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR1, HCDR2 및 HCDR3), 및 SEQ ID NO: 10 및 34로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR)으로부터의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)을 포함하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
  44. 제36항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 CD28에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인은 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR1, HCDR2 및 HCDR3) 및 3개의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)을 포함하고, 이때 HCDR1은 SEQ ID NO: 20 및 44로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하며; HCDR2는 SEQ ID NO: 22 및 46으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고; HCDR3은 SEQ ID NO: 24 및 48로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하며, LCDR1은 SEQ ID NO: 12 및 36으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하며, LCDR2는 SEQ ID NO: 14 및 38로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, LCDR3은 SEQ ID NO: 16 및 40으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
  45. 제36항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 MUC16에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 도메인은 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR1, HCDR2 및 HCDR3) 및 3개의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)을 포함하고, 이때 HCDR1은 SEQ ID NO: 4 및 28로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하며; HCDR2는 SEQ ID NO: 6 및 30으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고; HCDR3은 SEQ ID NO: 8 및 32로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하며, LCDR1은 SEQ ID NO: 12 및 36으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하며, LCDR2는 SEQ ID NO: 14 및 38으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, LCDR3은 SEQ ID NO: 16 및 40으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
  46. 제36항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 CD28에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인은 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR1, HCDR2 및 HCDR3) 및 3개의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)을 포함하고, 인간 MUC16에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 도메인은 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR1, HCDR2 및 HCDR3) 및 3개의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)을 포함하며;
    이때 제1 항원-결합 도메인은 SEQ ID NO: 20 및 44로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1을 포함하며; HCDR2는 SEQ ID NO: 22 및 46으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고; HCDR3은 SEQ ID NO: 24 및 48로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하며, LCDR1은 SEQ ID NO: 12 및 36으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하며, LCDR2는 SEQ ID NO: 14 및 38로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, LCDR3은 SEQ ID NO: 16 및 40으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고;
    제2 항원-결합 도메인은 SEQ ID NO: 4 및 28로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1을 포함하며; HCDR2는 SEQ ID NO: 6 및 30으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고; HCDR3은 SEQ ID NO: 8 및 32로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하며, LCDR1은 SEQ ID NO: 12 및 36으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하며, LCDR2는 SEQ ID NO: 14 및 38로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, LCDR3은 SEQ ID NO: 16 및 40으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
  47. 제36항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원-결합 도메인은 인간 CD28에 결합하기 위해 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR1, HCDR2 및 HCDR3) 및 3개의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)을 포함하는 기준 항원 결합 단백질과 경쟁하고, 이때 HCDR1은 SEQ ID NO: 20 및 44으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하며; HCDR2는 SEQ ID NO: 22 및 46으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고; HCDR3은 SEQ ID NO: 24 및 48로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하며, LCDR1은 SEQ ID NO: 12 및 36으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하며, LCDR2는 SEQ ID NO: 14 및 38로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, LCDR3은 SEQ ID NO: 16 및 40으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
  48. 제36항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원-결합 도메인은 인간 CD28에 결합하기 위해 SEQ ID NO: 18 및 42로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR), 및 SEQ ID NO: 10 및 34로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함하는 기준 항원 결합 단백질과 경쟁하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
  49. 제36항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원-결합 도메인은 인간 MUC16에 결합하기 위해 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR1, HCDR2 및 HCDR3) 및 3개의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)을 포함하는 기준 항원 결합 단백질과 경쟁하고, 이때 HCDR1은 SEQ ID NO: 4 및 28로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하며, HCDR2는 SEQ ID NO: 6 및 30으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 SEQ ID NO: 8 및 32로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하며, LCDR1은 SEQ ID NO: 12 및 36으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하며, LCDR2는 SEQ ID NO: 14 및 38로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, LCDR3은 SEQ ID NO: 16 및 40으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
  50. 제36항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원-결합 도메인은 인간 MUC16에 결합하기 위해 SEQ ID NO: 2 및 26으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR), 및 SEQ ID NO: 10 및 34로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함하는 기준 항원 결합 단백질과 경쟁하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
  51. 제36항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원-결합 도메인은 인간 CD28에 결합하기 위해 SEQ ID NO: 18 및 42로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR), 및 SEQ ID NO: 10 및 34로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함하는 기준 항원 결합 단백질과 경쟁하고, 제2 항원-결합 도메인은 인간 MUC16에 결합하기 위해 SEQ ID NO: 2 및 26으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR), 및 SEQ ID NO: 10 및 34로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함하는 기준 항원 결합 단백질과 경쟁하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
  52. 제36항 내지 제51항 중 어느 한 항의 이중특이적 항원-결합 분자 및 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함하는, 약제학적 조성물.
  53. 대상체에서 난소암을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 제52항의 약제학적 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  54. 제28항 내지 제34항 및 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항원-결합 분자는 고정된 용량으로 투여되는, 방법.
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