MD3515487T2 - Anticorpi bispecifici anti-MUC16-CD3 și conjugate anticorp anti-MUC16-medicament - Google Patents

Anticorpi bispecifici anti-MUC16-CD3 și conjugate anticorp anti-MUC16-medicament Download PDF

Info

Publication number
MD3515487T2
MD3515487T2 MDE20190826T MDE20190826T MD3515487T2 MD 3515487 T2 MD3515487 T2 MD 3515487T2 MD E20190826 T MDE20190826 T MD E20190826T MD E20190826 T MDE20190826 T MD E20190826T MD 3515487 T2 MD3515487 T2 MD 3515487T2
Authority
MD
Moldova
Prior art keywords
antigen
muc16
binding
antibody
amino acid
Prior art date
Application number
MDE20190826T
Other languages
English (en)
Inventor
Lauric Haber
Eric Smith
Marcus Kelly
Jessica R Kirshner
Sandra Coetzee
Alison Crawford
Thomas Nittoli
Yashu Liu
Original Assignee
Regeneron Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Regeneron Pharma filed Critical Regeneron Pharma
Publication of MD3515487T2 publication Critical patent/MD3515487T2/ro

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3076—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
    • C07K16/3092—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties against tumour-associated mucins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6869—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from a cell of the reproductive system: ovaria, uterus, testes, prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5758—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites
    • G01N33/5759—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites involving compounds localised on the membrane of tumour or cancer cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Prezenta invenţie se referă la anticorpi anti-mucină 16: anticorpi bispecifici (bsAbs) care se leagă atât la MUC16, cât şi la CD3 şi activează celulele T prin intermediul complexului CD3 în prezenţa tumorilor care exprimă MUC16, anticorpi IgG umani care se leagă la andMUC16 umani (anticorpi monospecifici), anticorpi anti-MUC16 conjugaţi cu medicamente care inhibă creşterea tumorală in vivo. Anticorpii sunt utili pentru tratamentul diferitelor tipuri de cancer, inclusiv al cancerului ovarian.

Description

DOMENIUL INVENTIEI
Prezenta invenţie se referă, la anticorpi bispecifici sau fragmente de legare la antigen ai acestora care leagă (MUC16) şi CD3 şi metode de utilizare a acestora.
STADIUL TEHNICII
Mucina 16 (MUC16), cunoscută şi sub denumirea de antigen de cancer 125, antigen de carcinom 125, antigen de carbohidraţi 125 sau CA-125, este o glicoproteină membranară integrală cu un singur domeniu transmembranar foarte glicozilat, care este foarte exprimată în cancerul ovarian. MUC16 constă din trei domenii majore: un domeniu N-terminal extracelular, un domeniu mare repetat în tandem intercalate cu domenii de spermă de arici de mare, enterokinază şi agrină (SEA) şi un domeniu carboxil terminal care cuprinde un segment al regiunii transmembranare şi o coadă citoplasmatică scurtă. Clivajul proteolitic are ca rezultat eliminarea unei mari părţi a porţiunii extracelulare a MUC16 în fluxul sanguin. MUC16 este supraexprimat în tipuri de cancer, inclusiv cancer ovarian, cancer de sân, cancer pancreatic, cancer pulmonar fără celule mici, colangiocarcinom intrahepatic cu formare de masă, adenocarcinom al colului uterin şi adenocarcinom al tractului gastric, precum şi în boli şi afecţiuni, inclusiv inflamatorii. boli intestinale, ciroză hepatică, insuficienţă cardiacă, infecţie peritoneală şi intervenţii chirurgicale abdominale. (Haridas, D. şi colab., 2014, FASEB J., 28:4183-4199). Expresia pe celulele canceroase este demonstrat că protejează celulele tumorale de sistemul imunitar. (Felder, M. et al., 2014, Molecular Cancer, 13: 129) Au fost investigate metode de tratare a cancerului ovarian folosind anticorpi la MUC16. Oregovomab şi abgovomab sunt anticorpi anti-MUC16 care au avut un succes limitat. (Felder, supra, Das, S. şi Batra, S. K. 2015, Cancer Res. 75:4660-4674. )
CD3 este un antigen homodimeric sau heterodimeric exprimat pe celulele T în asociere cu complexul receptor al celulelor T (TCR) şi este necesar pentru activarea celulelor T. CD3 funcţional este format din asocierea dimerică a două din cele patru lanţuri diferite: epsilon, zeta, delta şi gamma. Aranjamentele dimerice CD3 includ gama/epsilon, delta/epsilon şi zeta/zeta. S-a demonstrat că anticorpii împotriva CD3 grupează CD3 pe celulele T, provocând astfel activarea celulelor T într-un mod similar cu angajarea TCR de către moleculele MHC încărcate cu peptide. Astfel, anticorpii anti-CD3 au fost propuşi în scopuri terapeutice care implică activarea celulelor T. În plus, anticorpii bispecifici care sunt capabili să lege CD3 şi un antigen ţintă au fost propuşi pentru utilizări terapeutice care implică ţintirea răspunsurilor imune ale celulelor T la ţesuturi şi celule care exprimă antigenul ţintă. Următorul document este relevant pentru stadiul tehnicii:WO2016149368, „Anticorpi anti-MUC16 şi utilizări ale acestora», publicat pe 22 septembrie 2016.
Moleculele care leagă antigenul care ţintesc MUC16, inclusiv conjugaţii anticorp-medicament, precum şi moleculele bispecifice care leagă antigenul care leagă atât MUC16, cât şi CD3 ar fi utile în setările terapeutice în care ţintirea specifică şi uciderea mediată de celulele T a celulelor care exprimă MUC16 sunt utile. dorit.
SCURT REZUMAT AL INVENŢIEI
Într-un prim aspect, prezenta invenţie furnizează anticorpi bispecifici şi fragmente de legare la antigen ale acestora care se leagă la MUC16 uman şi CD3 uman. Anticorpii bispecifici sunt utili, inter alia, pentru ţintirea celulelor T care exprimă CD3 şi pentru stimularea activării celulelor T, de exemplu, în circumstanţe în care uciderea mediată de celule T a celulelor care exprimă MUC16 este benefică sau de dorit. De exemplu, anticorpii bispecifici pot direcţiona activarea celulelor T mediată de CD3 către celule specifice care exprimă MUC16, cum ar fi celulele tumorale ovariene. Anticorpii sau fragmentele acestora de legare la antigen, cuprind un domeniu de legare la antigen care leagă în mod specific MUC16 uman şi cuprinde setul de secvenţe de aminoacizi de HCDR1-HCDR2-HCDR3- LCDR1-LCDR2-LCDR3 ale SEQ ID NO: 20-22-24-28-30-32 (de exemplu, H1 H8767P). Invenţia furnizează de asemenea compoziţii farmaceutice care cuprind anticorpii bispecifici. Invenţia este definită prin revendicări.
REZUMATUL ÎNVĂŢĂTURILOR TEHNICE
Informaţiile tehnice prezentate mai jos pot, în unele privinţe, să depăşească invenţia, care este definită exclusiv de revendicările anexate. Informaţiile tehnice suplimentare sunt furnizate pentru a plasa invenţia reală într-un context tehnic mai larg şi pentru a ilustra posibilele dezvoltări tehnice conexe. Astfel de informaţii tehnice suplimentare care nu intră în sfera revendicărilor anexate, nu fac parte din invenţie.
Anticorpul izolat sau fragmentul de legare la antigen al acestuia din prezenta dezvăluire leagă MUC16 uman în unul sau mai multe dintre cele cinci domenii SEA proximale ale membranei ale MUC 16 uman (SEQ ID NO: 1899). Cele cinci domenii SEA proximale ale membranei corespund resturilor 13791-14451 ale SEQ ID NO: 1899. În unele cazuri, anticorpul sau fragmentul de legare la antigen se leagă cu un KD mai mic de aproximativ 60 nM, măsurat într-un test de rezonanţă cu plasmon de suprafaţă la 25° C. În unele cazuri, anticorpul sau fragmentul de legare la antigen se leagă în resturile 14237 până la 14290 din SEQ ID NO: 1899. De exemplu, al doilea domeniu de legare a antigenului care leagă în mod specific MUC16 uman poate cuprinde o pereche HCVR/LCVR care cuprinde secvenţele de aminoacizi. din SEQ ID NO: 18/26.
Anticorpii sau fragmentele acestora de legare la antigen din prezenta dezvăluire pot fi utilizaţi în conjugate anticorp-medicament cuprinzând anticorpul sau fragmentul de legare la antigen al acestora şi un agent terapeutic (de exemplu, un agent citotoxic). în unele cazuri, anticorpul sau fragmentul de legare la antigen şi agentul citotoxic sunt ataşaţi covalent printr-un linker, aşa cum s-a discutat aici.
În unele cazuri, agentul citotoxic este selectat dintre o auristatină, un maitansinoid, o tubulizină, o tomaimicină derivată sau un derivat al dolastatinei. În unele cazuri, agentul citotoxic este o auristatina selectată dintre MMAE sau MMAF, sau un maitansinoid selectat dintre DM1 sau DM4. În unele cazuri, agentul citotoxic este un maitansinoid având structura cu Formula (I) sau Formula (II), aşa cum s-a discutat aici.
În unele cazuri, agentul citotoxic este un maitansinoid având structura:
În unele cazuri, agentul citotoxic este un maitansinoid având structura:
În unele cazuri, conjugatul anticorp-medicament cuprinde un anticorp anti-MUC16 sau un fragment al acestuia şi
în care este o legătură la anticorpul anti-MUC16 sau fragment al acestuia.
În unele cazuri, conjugatul anticorp-medicament cuprinde un anticorp anti-MUC16 sau un fragment al acestuia şi
în care este o legătură la anticorpul anti-MUC16 sau fragmentul acestuia.
În unele cazuri, conjugatul anticorp-medicament cuprinde un anticorp anti-MUC16 sau fragment al acestuia, şi
în care este o legătură la anticorpul anti-MUC16 sau fragment al acestuia.
În unele cazuri, legătura intră în contact cu anticorpul sau fragmentul acestuia prin intermediul unui constituent de sulf al unui rest de cisteină.
În unele cazuri, conjugatul anticorp-medicament cuprinde un anticorp anti-MUC16 sau un fragment al acestuia şi
sau un amestec al acestora,
în care este o legătură la anticorpul anti-MUC16 sau fragmentul acestuia.
În unele cazuri, legătura contactează anticorpul sau fragmentul acestuia prin intermediul unui constituent de azot al unui rest de lizină.
în oricare dintre diferitele realizări ale conjugatelor anticorp-medicament discutate mai sus sau aici, conjugatul anticorp-medicament poate cuprinde de la 1 până la 4 agenţi citotoxici per anticorp anti-MUC16 sau fragment al acestuia.
Prezenta invenţie furnizează molecule bispecifice de legare a antigenului (de exemplu, anticorpi) care leagă MUC16 şi CD3. Astfel de molecule bispecifice de legare a antigenului sunt, de asemenea, denumite aici "molecule bispecifice anti-MUC16/anti-CD3", "molecule bispecifice anti-CD3/anti-MUC16" sau "bsAbs MUC16xCD3". „Porţiunea anti-MUC16 a moleculei bispecifice anti-MUC16/anti-CD3 este utilă pentru ţintirea celulelor (de exemplu, celule tumorale) care exprimă MUC16 (de exemplu, tumori ovariene), iar porţiunea anti-CD3 a moleculei bispecifice este utilă. pentru activarea celulelor T. Legarea simultană a MUC16 pe o celulă tumorală şi CD3 pe o celulă T facilitează uciderea direcţionată (liza celulară) a celulei tumorale vizate de către celula T activată. Moleculele bispecifice anti-MUC16/anti-CD3 ale dezvăluirii sunt, prin urmare, utile, inter alia, pentru tratarea bolilor şi tulburărilor legate de sau cauzate de tumorile care exprimă MUC16 (de exemplu, cancerul ovarian).
Moleculele bispecifice de legare a antigenului conform acestui aspect al prezentei invenţii cuprind un prim domeniu de legare a antigenului care leagă în mod specific CD3 uman şi un al doilea domeniu de legare a antigenului care leagă în mod specific MUC16, în care al doilea
domeniul de legare a antigenului cuprinde domeniile HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3, respectiv, cuprinzând secvenţele de aminoacizi ale SEQ ID NO: 20-22-24-28-30-32.. Prezenta dezvăluire include molecule bispecifice anti-MUC16/anti-CD3 (de exemplu, anticorpi bispecifici) în care fiecare domeniu de legare la antigen cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu (HCVR) asociată cu o regiune variabilă a lanţului uşor (LCVR). În anumite cazuri exemplificative ale dezvăluirii, domeniul de legare a antigenului anti-CD3 şi domeniul de legare a antigenului anti-MUC16 cuprind fiecare HCVR-uri diferite, distincte, asociate cu un LCVR comun. De exemplu, aşa cum este ilustrat în exemplul 3 de aici, anticorpii bispecifici au fost construiţi cuprinzând un prim domeniu de legare la antigen care leagă în mod specific CD3, în care primul domeniu de legare la antigen cuprinde un HCVR derivat dintr-un anticorp anti-CD3 asociat cu un LCVR derivat dintr-un anticorp anti-MUC16 (de exemplu, acelaşi LCVR care este inclus în domeniul de legare a antigenului anti-MUC16); şi un al doilea domeniu de legare a antigenului care leagă în mod specific MUC16, în care al doilea domeniu de legare a antigenului cuprinde un HCVR/LCVR derivat dintr-un anticorp anti-MUC16. Cu alte cuvinte, în moleculele exemplificative dezvăluite aici, împerecherea unui HCVR de la un anticorp anti-CD3 cu un LCVR de la un anticorp anti-M UC16 creează un domeniu de legare la antigen care leagă în mod specific CD3 (dar nu leagă M UC16) . În astfel de cazuri, primul şi al doilea domeniu de legare la antigen cuprind HCVR anti-CD3 şi anti-MUC16 distincte, dar au o LCVR comună anti-MUC16. în alte cazuri, moleculele bispecifice de legare a antigenului cuprind HCVR anti-CD3 şi anti-MUC16 distincte, dar au o LCVR comună. Şoarecii modificaţi genetic pot fi utilizaţi pentru a produce molecule de legare a antigenului bispecific complet uman, cuprinzând două lanţuri grele diferite care se asociază cu un lanţ uşor identic care cuprinde un domeniu variabil derivat dintr-unul dintre cele două segmente ale genei diferite ale regiunii variabile ale lanţului uşor uman. Alternativ, lanţurile grele variabile pot fi asociate cu un lanţ uşor comun şi exprimate recombinant în celulele gazdă. Ca atare, anticorpii conform invenţiei pot cuprinde lanţuri grele de imunoglobuline asociate cu un singur lanţ uşor rearanjat. În unele cazuri, lanţul uşor cuprinde un domeniu variabil derivat dintr-un segment de genă VK1-39 umană sau un segment de genă VK3-20. În alte cazuri, lanţul uşor cuprinde un domeniu variabil derivat dintr-un segment de genă umană VK1-39 rearanjat cu un segment de genă umană JK5 sau JK1 umană.
În unele cazuri, primul domeniu de legare a antigenului care leagă în mod specific CD3 cuprinde oricare dintre secvenţele de aminoacizi HCVR, oricare dintre secvenţele de aminoacizi LCVR, oricare dintre secvenţele de aminoacizi HCVR/LCVR. perechi de secvenţe acide, oricare dintre secvenţele de aminoacizi a lanţului greu CDR1-CDR2-CDR3 sau oricare dintre secvenţele de aminoacizi a lanţului uşor CDR1-CDR2-CDR3, aşa cum este menţionat în publicaţia SUA 2014/0088295 publicată pe 27 martie 2014 şi PCT/US2016 /044732 depus la 29 iulie 2016.
În unele cazuri, primul domeniu de legare a antigenului care leagă în mod specific CD3 cuprinde oricare dintre secvenţele de aminoacizi HCVR, aşa cum este prezentat în Tabelele 16, 18 şi 22 de aici. Primul domeniu de legare la antigen care leagă în mod specific CD3 poate cuprinde, de asemenea, oricare dintre secvenţele de aminoacizi LCVR, aşa cum sunt prezentate în Tabelele 1, 16, 19 şi 23 de aici. Conform anumitor cazuri, primul domeniu de legare la antigen care leagă în mod specific CD3 cuprinde oricare dintre perechile de secvenţe de aminoacizi HCVR/LCVR aşa cum este prezentat în Tabelele 16, 18, 19, 22 şi 23 de aici. Prezenta dezvăluire furnizează, de asemenea, molecule bispecifice anti-CD3/anti-MUC16, în care primul domeniu de legare la antigen care leagă în mod specific CD3 cuprinde oricare dintre secvenţele de aminoacizi a lanţului greu CDR1-CDR2-CDR3, aşa cum este prezentat în tabelele 16, 18 şi 22 de aici şi/sau oricare dintre secvenţele de aminoacizi CDR1-CDR2-CDR3 ale lanţului uşor, aşa cum sunt prezentate în Tabelele 1, 16, 19 şi 23 de aici.
În unele cazuri, primul domeniu de legare a antigenului care leagă în mod specific CD3 cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu (HCVR) având o secvenţă de aminoacizi aşa cum este prezentată în Tabelele 16, 18, şi 22 de aici sau o secvenţă substanţial similară a acesteia având cel puţin 90%, cel puţin 95%, cel puţin 98% sau cel puţin 99% identitate de secvenţă.
În unele cazuri, primul domeniu de legare a antigenului care leagă în mod specific CD3 cuprinde o regiune variabilă a lanţului uşor (LCVR) având o secvenţă de aminoacizi aşa cum este prezentată în tabelele 1, 6, 19, şi 23 de aici, sau o secvenţă substanţial similară a acesteia având cel puţin 90%, cel puţin 95%, cel puţin 98% sau cel puţin 99% identitate de secvenţă.
În unele cazuri, primul domeniu de legare a antigenului care leagă în mod specific CD3 cuprinde un HCVR şi LCVR. perechea de secvenţe de aminoacizi (HCVR/LCVR) aşa cum este prezentat în Tabelele 16, 18, 19, 22 şi 23 de aici.
În unele cazuri, primul domeniu de legare a antigenului care leagă în mod specific CD3 cuprinde un lanţ greu CDR3 domeniu (HCDR3) având o secvenţă de aminoacizi aşa cum este prezentată în tabelele 16, 18 şi 22 de aici, sau o secvenţă substanţial similară cu aceasta având cel puţin 90%, cel puţin 95%, cel puţin 98% sau cel puţin 99% identitate de secvenţă ; şi un domeniu CDR3 al lanţului uşor (LCDR3) având o secvenţă de aminoacizi aşa cum este prezentată în Tabelele 1, 16, 19 şi 23 de aici, sau o secvenţă substanţial similară a acestuia având cel puţin 90%, cel puţin 95%, cel puţin 98% sau cel puţin 99% identitate de secvenţă.
În unele cazuri, primul domeniu de legare a antigenului care leagă în mod specific CD3 cuprinde o pereche de secvenţă de aminoacizi HCDR3/LCDR3 aşa cum este prezentat în Tabelele 16, 18, 19, 22 şi 23 de aici.
În unele cazuri, primul domeniu de legare a antigenului care leagă în mod specific CD3 cuprinde un domeniu CDR1 cu lanţ greu (HCDR1) având un aminoacid aşa cum este prezentat în tabelele 16, 18. , şi 22 de aici, sau o secvenţă substanţial similară a acesteia având cel puţin 90%, cel puţin 95%, cel puţin 98% sau cel puţin 99% identitate de secvenţă; un domeniu CDR2 cu lanţ greu (HCDR2) având un aminoacid aşa cum este prezentat în tabelele 16, 18 şi 22, sau o secvenţă substanţial similară a acestuia având cel puţin 90%, cel puţin 95%, cel puţin 98% sau cel puţin 99% identitatea secvenţei; un domeniu CDR3 cu lanţ greu (HCDR3) având un aminoacid aşa cum este prezentat în tabelele 16, 18 şi 22, sau o secvenţă substanţial similară a acestuia având cel puţin 90%, cel puţin 95%, cel puţin 98% sau cel puţin 99% identitatea secvenţei; un domeniu CDR1 al lanţului uşor (LCDR1) având o secvenţă de aminoacizi aşa cum este prezentată în Tabelele 1, 16, 19 şi 23 de aici, sau o secvenţă substanţial similară a acestuia având cel puţin 90%, cel puţin 95%, cel puţin 98% sau identitate de secvenţă de cel puţin 99%; un domeniu CDR2 al lanţului uşor (LCDR2) având o secvenţă de aminoacizi aşa cum este prezentată în tabelele 1, 16, 19 şi 23 de aici, sau o secvenţă substanţial similară a acestuia având cel puţin 90%, cel puţin 95%, cel puţin 98% sau identitate de secvenţă de cel puţin 99% şi un domeniu CDR3 al lanţului uşor (LCDR3) având o secvenţă de aminoacizi aşa cum este prezentată în Tabelele 1, 16, 19 şi 23 de aici, sau o secvenţă substanţial similară a acesteia având cel puţin 90%, cel puţin 95%, cel puţin 98% sau cel puţin 99% identitate de secvenţă.
Anumite molecule bispecifice de legare a antigenului anti-CD3/anti-MUC16 exemplificative, nelimitative din dezvăluire includ un prim domeniu de legare la antigen care leagă în mod specific CD3 cuprinzând domeniile HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3, respectiv, având secvenţe de aminoacizi aşa cum sunt prezentate în Tabelele 16, 18, 19, 22 şi 23 de aici.
În anumite cazuri primul domeniu de legare a antigenului care leagă în mod specific CD3 uman cuprinde regiuni de determinare a complementarităţii lanţului greu (HCDR1, HCDR2 şi HCDR3) dintr-o regiune variabilă a lanţului greu (HCVR) care cuprinde o secvenţă de aminoacizi aşa cum este prezentată în Tabelul 16, Tabelul 18 sau Tabelul 22 şi regiuni de determinare a complementarităţii lanţului uşor (LCDR1, LCDR2 şi LCDR3) dintr-o regiune variabilă a lanţului uşor (LCVR) care cuprinde o secvenţă de aminoacizi aşa cum este prezentată în Tabelul 1, Tabelul 16, Tabelul 19 sau Tabelul 23.
În unele cazuri primul domeniu de legare a antigenului care leagă în mod specific CD3 uman cuprinde regiuni de determinare a complementarităţii lanţului greu (HCDR1, HCDR2 şi HCDR3) dintr-o regiune variabilă a lanţului greu (HCVR) selectată din grupul constând din SEQ ID NO: 1730, 1762, 1778, 1786 şi 1866 şi regiuni de determinare a complementarităţii lanţului uşor (LCDR1, LCDR2 şi LCDR3) dintr-o regiune variabilă a lanţului uşor (LCVR) care cuprinde o secvenţă de aminoacizi a SEQ ID NO: 26.
În unele cazuri primul domeniu de legare a antigenului care leagă în mod specific CD3 uman cuprinde trei regiuni de determinare a complementarităţii lanţului grele. (A1-HCDR1, A1-HCDR2 şi A1-HCDR3) şi trei regiuni de determinare a complementarităţii lanţului uşor (A1-LCDR1, A1-LCDR2 şi A1-LCDR3), în care A1-HCDR1 cuprinde o secvenţă de aminoacizi selectată din grup constând din SEQ ID NO: 1732, 1764, 1780, 1788 şi 1868; A1-HCDR2 cuprinde o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SEQ ID NO: 1734, 1766, 1782, 1790 şi 1870; A1-HCDR3 cuprinde o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SEQ ID NO: 1736, 1768, 1784, 1792 şi 1872; A1-LCDR1 cuprinde o secvenţă de aminoacizi a SEQ ID NO:28; A1-LCR2 cuprinde o secvenţă de aminoacizi a SEQ ID NO:30; şi A1-LCDR3 cuprinde o secvenţă de aminoacizi a SEQ ID NO:32.
În unele cazuri primul domeniu de legare a antigenului care leagă în mod specific CD3 uman cuprinde CDR-urile cu lanţ greu şi uşor ale unei perechi de secvenţe de aminoacizi HCVR/LCVR selectate din grupul constând din: SEQ ID NO: 1730/26, 1762/26, 1778/26, 1786/26 şi 1866/26
În unele czuri primul domeniu de legare a antigenului care leagă în mod specific CD3 uman cuprinde trei regiuni care determină complementaritatea lanţului greu (A1-HCDR1, A1-HCDR2 şi A1-HCDR3) şi trei lanţuri uşoare. regiuni de determinare a complementarităţii (A1-LCDR1, A1-LCDR2 şi A1-LCDR3) şi în care al doilea domeniu de legare la antigen care leagă în mod specific MUC16 uman cuprinde trei regiuni de determinare a complementarităţii lanţului greu (A2-HCDR1, A2-HCDR2 şi A2-HCDR3) şi trei regiuni care determină complementaritatea lanţului uşor (A2-LCDR1, A2-LCDR2 şi A2-LCDR3); în care A1-HCDR1 cuprinde o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SEQ ID NO: 1732, 1764, 1780, 1788 şi 1868; A1-HCDR2 cuprinde o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SEQ ID NO: 1734, 1766, 1782, 1790 şi 1870; A1-HCDR3 cuprinde o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SEQ ID NO: 1736, 1768, 1784, 1792 şi 1872; A1-LCDR1 cuprinde o secvenţă de aminoacizi a SEQ ID NO:28; A1-LCDR2 cuprinde o secvenţă de aminoacizi a SEQ ID NO:30; şi A1-LCDR3 cuprinde o secvenţă de aminoacizi a SEQ ID NO:32; şi în care A2-HCDR1 cuprinde o secvenţă de aminoacizi a SEQ ID NO:20; A2-HCDR2 cuprinde o secvenţă de aminoacizi a SEQ ID NO:22; A2-HCDR3 cuprinde o secvenţă de aminoacizi a SEQ ID NO:24; A2-LCDR1 cuprinde o secvenţă de aminoacizi a SEQ ID NO:28; A2-LCDR2 cuprinde o secvenţă de aminoacizi a SEQ ID NO:30; şi A2-LCDR3 cuprinde o secvenţă de aminoacizi a SEQ ID NO:32.
Anumite molecule bispecifice de legare la antigen anti-CD3/anti-MUC16, nelimitative, exemplificative ale dezvăluirii includ un prim domeniu de legare la antigen care leagă în mod specific CD3 cuprinzând un lanţ greu cuprinzând regiuni cadru de domeniu variabil având o secvenţă de aminoacizi selectată dintre FR1 ( SEQ ID NO: 1903), FR2 (SEQ ID NO: 1904), FR3 (SEQ ID NO: 1905) şi FR4 (SEQ ID NO: 1906).
În mai multe cazuri, moleculele exemplificative de legare la antigen anti-CD3/anti-MUC16 ale invenţiei includ o moleculă bispecifică de legare la antigen în care primul domeniu de legare la antigen care leagă în mod specific CD3 uman cuprinde un HCVR care cuprinde HCDR1-HCDR2-HCDR3 având secvenţe de aminoacizi ale SEQ ID NO: 1907-1908-1909.
În unele cazuri, al doilea domeniu de legare a antigenului care se leagă în mod specific MUC16 cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu (HCVR) având secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 18 sau o secvenţă substanţial similară a acesteia având cel puţin 90%, cel puţin 95 %, cel puţin 98% sau cel puţin 99% identitate de secvenţă.
În unele cazuri, al doilea domeniu de legare a antigenului care se leagă în mod specific MUC16 cuprinde o regiune variabilă a lanţului uşor (LCVR) având secvenţa de aminoacizi a SECV ID Nr.:26 sau o secvenţă substanţial similară a acesteia având cel puţin 90%, cel puţin 95 %, cel puţin 98% sau cel puţin 99% identitate de secvenţă.
În unele cazuri, al doilea domeniu de legare la antigen care se leagă în mod specific MUC16 cuprinde un HCVR şi LCVR (HCVR/LCVR) pereche de secvenţă de aminoacizi a SEQ ID NO:18/26.
Anticorpul bispecific sau fragmentul acestuia de legare la antigen din dezvăluire poate avea următoarele proprietăţi: leagă celulele umane care exprimă CD3 uman şi celulele de maimuţă cynomolgus care exprimă CD3 cynomolgus; leagă celule umane care exprimă MUC16 uman; inhibă creşterea tumorii la şoarecii imunocompromişi care poartă cancer ovarian uman xenogrefe; suprimă creşterea tumorii a tumorilor stabilite la şoarecii imunocompromişi care poartă cancer ovarian uman xenogrefe; primul domeniu de legare a antigenului leagă în mod specific o celulă efectoră cu o valoare EC50 mai mare de aproximativ 4 nM şi, şi al doilea domeniu de legare la antigen leagă în mod specific o celulă tumorală ovariană umană ţintă cu un EC50 valoare mai mică de 3 nM, în care o astfel de valoare de legare EC50 este măsurată într-un test de legare FACS in vitro; al doilea domeniu de legare la antigen leagă în mod specific celula tumorală ovariană ţintă cu o valoare EC50 mai mică de aproximativ 2 nM; primul domeniu de legare la antigen leagă în mod specific fiecare dintre CD3 uman şi CD3 cynomolgus cu o valoare EC50 mai mare de aproximativ 40 nM, mai mare de aproximativ 100 nM, mai mare de aproximativ 200 nM, mai mare de aproximativ 300 nM, mai mare de aproximativ 400 nM, mai mare de aproximativ 500 nM, sau mai mare de aproximativ 1 µM; primul domeniu de legare la antigen leagă în mod specific fiecare dintre CD3 uman şi CD3 de cynomolgus cu legare sau afinitate de legare slabă sau fără măsurare; induce uciderea celulelor tumorale mediată de celule T cu o valoare EC50 mai mică de aproximativ 31 pM, măsurată într-un test in vitro de ucidere a celulelor tumorale mediate de celule T, de exemplu, în care celulele tumorale sunt celule OVCAR3; primul domeniu de legare la antigen leagă CD3 uman cu o valoare KD mai mare de aproximativ 11 nM, măsurată într-un test in vitro de legare a rezonanţei plasmonilor de suprafaţă; primul domeniu de legare la antigen leagă fiecare dintre CD3 uman şi CD3 cynomolgus cu o valoare KD mai mare de aproximativ 15 nM, mai mare de aproximativ 30 nM, mai mare de aproximativ 60 nM, mai mare de aproximativ 120 nM, mai mare de aproximativ 300 nM, sau mai mare de aproximativ 500 nM măsurată într-un test in vitro de legare a rezonanţei plasmonilor de suprafaţă.
În anumite cazuri, anticorpii anti-CD3 conform invenţiei, fragmentele de legare la antigen şi anticorpii bispecifici ai acestora au fost obţinuţi prin înlocuirea reziduurilor de aminoacizi ale unui parental într-o manieră treptată, pe baza diferenţelor dintre secvenţa liniei germinale şi secvenţa anticorpului parental.
În unele cazuri, primul domeniu de legare a antigenului concurează pentru legarea la CD3 uman cu o proteină de referinţă care leagă antigenul cuprinzând trei regiuni care determină complementaritatea lanţului greu (A1-HCDR1, A1-HCDR2 şi A1-HCDR3) şi trei regiuni care determină complementaritatea lanţului uşor (A1-LCDR1, A1-LCDR2 şi A1-LCDR3), A1-HCDR1 cuprinde o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SEQ ID NO: 1732, 1764, 1780, 1788 , şi 1868; A1-HCDR2 cuprinde o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SEQ ID NO: 1734, 1766, 1782, 1790 şi 1870; A1-HCDR3 cuprinde o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SEQ ID NO: 1736, 1768, 1784, 1792 şi 1872; A1-LCDR1 cuprinde o secvenţă de aminoacizi SEQ ID NO: 28; A1-LCDR2 cuprinde o secvenţă de aminoacizi a SEQ ID NO: 30; şi A1-LCDR3 cuprinde o secvenţă de aminoacizi a SEQ ID NO: 32. În unele cazuri primul domeniu de legare a antigenului concurează pentru legarea la CD3 uman cu o proteină de referinţă de legare a antigenului care cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu (HCVR) care cuprinde o secvenţă de aminoacizi selectată dintre grupul constând din SEQ ID NO: 1730, 1762, 1778, 1786 şi 1866 şi o regiune variabilă a lanţului uşor (LCVR) care cuprinde o secvenţă de aminoacizi a SEQ ID NO:26.
Într-un aspect, dezvăluirea furnizează o compoziţie farmaceutică care cuprinde o moleculă de legare a antigenului bispecific anti-MUC16/anti-CD3 şi un purtător sau diluant acceptabil farmaceutic. Dezvăluirea furnizează în plus molecula bispecifică de legare la antigen anti-MUC16/anti-CD3, sau fragmentul acesteia de legare la antigen, din dezvăluire pentru utilizare într-o metodă de tratare a unui cancer la un subiect, metoda cuprinzând administrarea la subiect a compoziţiei farmaceutice cuprinzând o moleculă de legare a antigenului anti-MUC16 sau o moleculă de legare a antigenului bispecific anti-MUC16/anti-CD3 şi un purtător sau diluant acceptabil farmaceutic. În unele cazuri, cancerul este selectat din grupul constând din cancere incluzând cancer ovarian, cancer de sân, cancer pancreatic, cancer pulmonar fără celule mici, colangiocarcinom intrahepatic cu formare de masă, adenocarcinom al colului uterin şi adenocarcinom gastric. tract. În unele cazuri, cancerul este cancer ovarian. Cu toate acestea, metodele de tratament nu fac parte din invenţia revendicată.
Prezenta dezvăluire furnizează molecule de acid nucleic care codifică oricare dintre secvenţele HCVR, LCVR sau CDR ale moleculelor bispecifice de legare la antigen anti-CD3/anti-MUC16 descrise aici, Sunt dezvăluite molecule de acid nucleic cuprinzând secvenţele de polinucleotide aşa cum este prezentat în Tabelele 2, 17, 20, 21, 23 şi 25 de aici, precum şi molecule de acid nucleic care cuprind două sau mai multe dintre secvenţele de polinucleotide aşa cum sunt prezentate în tabelele 2, 17, 20, 21, 23 şi 25 în orice combinaţie funcţională sau amenajarea acestuia. Vectorii de expresie recombinanţi care poartă acizii nucleici conform invenţiei şi celulele gazdă în care au fost introduşi astfel de vectori sunt, de asemenea, cuprinşi de invenţie, la fel ca şi metodele de producere a anticorpilor prin cultivarea celulelor gazdă în condiţii care permit producerea anticorpilor şi recuperarea anticorpilor produşi. Cu toate acestea, acizii nucleici, vectorii, celulele gazdă şi metodele de producere a anticorpilor nu fac parte din invenţia revendicată.
Prezenta dezvăluire include molecule bispecifice de legare la antigen anti-CD3/anti-MUC16 având un model de glicozilare modificat. În unele aplicaţii, modificarea pentru a îndepărta situsurile de glicozilare nedorite poate fi utilă sau un anticorp lipsit de o porţiune fucoză prezentă pe lanţul de oligozaharide, de exemplu, pentru a creşte funcţia de citotoxicitate celulară dependentă de anticorpi (ADCC) (vezi Shield şi colab. (2002) JBC 277:26733). În alte aplicaţii, se poate face modificarea galactozilării pentru a modifica citotoxicitatea dependentă de complement (CDC).
Într-un alt aspect, dezvăluiea furnizează o compoziţie farmaceutică care cuprinde o moleculă bispecifică de legare la antigen anti-CD3/anti-MUC16 aşa cum este dezvăluită aici şi un purtător acceptabil farmaceutic. De asemenea, aici este descriso compoziţie care este o combinaţie între o moleculă bispecifică de legare a antigenului anti-CD3/anti-MUC16 şi un al doilea agent terapeutic. De exemplu, al doilea agent terapeutic poate fi orice agent care este combinat în mod avantajos cu o moleculă bispecifică de legare a antigenului anti-CD3/anti-MUC16. Exemple de agenţi care pot fi combinaţi în mod avantajos cu o moleculă bispecifică de legare la antigen anti-CD3/anti-MUC16 sunt discutaţi în detaliu în altă parte aici.
Într-un alt aspect, dezvăluirea furnizează anticorpul bispecific sau fragmentul acestuia de legare la antigen al dezvăluirii pentru utilizare în metode terapeutice pentru ţintirea/uciderea celulelor tumorale care exprimă MUC16 folosind o moleculă bispecifică de legare a antigenului anti-CD3/anti-MUC16 conform invenţiei, în care metodele terapeutice cuprind administrarea unei cantităţi eficiente terapeutic dintr-o compoziţie farmaceutică. cuprinzând o moleculă bispecifică de legare a antigenului anti-CD3/anti-MUC16 conform invenţiei la un subiect care are nevoie de aceasta.
Metode pentru utilizarea anticorpilor invneţiei sunt descrişi aici, incluzând o metodă de detectare a MUC16 într-o probă biologică, cuprinzând: obţinerea unei probe biologice de la un subiect şi detectarea dacă MUC16 este prezent în proba biologică prin contactarea probei biologice cu un anticorp anti-MUC16 sau fragment de legare la antigen al acestuia şi detectarea legării dintre MUC16 şi anticorpul anti-MUC16 sau fragmentul de legare la antigen. În unele cazuri, proba biologică este o probă de ţesut sau de lichid selectată dintre plasmă, ser, ascită, ovar, uter, col uterin, ficat, vezică urinară, pancreas, stomac, intestin subţire sau gros, vezică biliară, sân, plămân, rinichi, salivare şi glandele lacrimale sau orice malignitate epitelioidă a acestora.
De asemena eset descrisă o metodă de detectare a MUC16 la un pacient, cuprinzând: obţinerea unei probe de ţesut de la pacient; şi detectarea dacă MUC16 este prezent în proba de ţesut prin contactarea probei de ţesut cu un anticorp anti-MUC16 şi detectarea legării dintre MUC16 şi anticorpul anti-MUC16. În unele cazuri, metoda mai cuprinde diagnosticarea pacientului cu cancer atunci când este detectată prezenţa MUC16 în proba de ţesut. Într-un caz, proba de ţesut este ţesut ovarian. Totuşi, numai anticorpii definiţi în revendicări intră în domeniul de aplicare al invenţiei.
De asmenea eset descrisă o metodă de detectare a MUC16 la un pacient, cuprinzând: obţinerea unei probe de plasmă de la pacient; şi detectarea dacă MUC16 este prezent în proba de plasmă prin contactarea probei de plasmă cu un anticorp anti-MUC16 şi detectarea legării dintre MUC16 şi anticorp anti-MUC16. În unele cazuri, metoda mai cuprinde diagnosticarea pacientului cu cancer atunci când este detectată prezenţa MUC16 în proba de plasmă. În unele cazuri, metoda mai cuprinde administrarea unei cantităţi eficiente de anticorp bispecific anti-CD3xMUC16 la pacientul diagnosticat. în unele cazuri, metoda mai cuprinde administrarea unei cantităţi eficiente dintr-un ADC care cuprinde un anticorp anti-MUC16 sau un fragment al acestuia de legare la antigen şi un agent citotoxic la pacientul diagnosticat. Totuşi, numai anticorpii definiţi în revendicări intră în domeniul de aplicare al invenţiei.
Alte cazuri vor deveni evidente dintr-o revizuire a descrierii detaliate care urmează. Invenţia este definită în revendicările independente. Alte aspecte şi cazuri preferate sunt definite în revendicările dependente. Orice aspecte, cazuri şi exemple ale prezentei dezvăluiri care nu intră în scopul revendicărilor anexate nu fac parte din invenţie şi sunt furnizate doar în scopuri ilustrative.
SCURTĂ DESCRIERE A DESENELOR
Figurile 1, 2 şi 3 ilustrează profilurile farmacocinetice ale anticorpilor bispecifici anti-MUC16 x CD3 la şoareci de tip sălbatic (Fig. 1), şoareci CD3 umanizaţi (Fig. 2) sau şoareci MUC16 x CD3 umanizaţi (Fig.3).
Figura 4 prezintă rezultatele studiului model OVCAR-3 1 (Avg Radiance [p/s/cm2/sr] în ziua 6). Toate grupurile au avut o sarcină tumorală similară cu cea evaluată de BLI înainte de începerea dozării. Datele prezentate sunt sarcina tumorală, aşa cum a fost evaluată de BLI în ziua 6 după implantarea tumorii. Semnificaţia statistică a fost determinată utilizând teste t Mann-Whitney neparametrice nepereche. Nu a existat nicio diferenţă semnificativă în sarcina tumorală între grupuri.
Figura 5 prezintă rezultatele studiului model OVCAR-3 1 (Avg Radiance [p/s/cm22/sr] în ziua 20). BSMUC16/CD3-001 reduce semnificativ sarcina tumorală la 0,1 şi 0,5 mg/kg. Şoarecii NSG grefaţi cu celule T umane au fost implantaţi cu celule OVCAR-3/Luc umane. Tratamentul a început la 6 zile după implantarea tumorii. Şoarecii au fost trataţi în Zilele 6, 10, 13, 16 şi 21 cu 0,01, 0,1 sau 0,5 mg/kg BSMUC16/CD3-001 administrat IP sau trataţi cu un control de legare la CD3 sau un control fără legare (0,5 mg/kg IP ). Datele prezentate sunt sarcina tumorală, aşa cum a fost evaluată de BLI în ziua 20 după implantarea tumorii. Semnificaţia statistică a fost determinată utilizând teste t Mann-Whitney neparametrice nepereche. Tratamentul cu BSMUC16/CD3-001 a fost comparat cu controlul fără legare (** p < 0,01 pentru 0,5 mg/kg, # p < 0,05 pentru 0,1 mg/kg BSMUC16/CD3-001).
Figura 6 prezintă rezultatele studiului model OVCAR-3 1 (Schimbarea plierii în tumorile evidente BLI între D6 şi D20). BSMUC16/CD3-001 reduce semnificativ modificarea orificiului în sarcina tumorii la 0,01, 0,1 şi 0,5 mg/kg. Şoarecii NSG grefaţi cu celule T umane au fost implantaţi cu celule OVCAR-3/Luc umane. Şoarecii au fost trataţi în Zilele 6, 10, 13, 16 şi 21 cu 0,01, 0,1 sau 0,5 mg/kg BSMUC16/CD3-001 administrat IP sau trataţi cu un control care leagă CD3 sau un control fără legare (0,5 mg/kg IP) . Datele prezentate sunt modificarea orificiilor în sarcina tumorală de la prima măsurare (luată înainte de începerea tratamentului) şi în ziua 20 la sfârşitul studiului. Semnificaţia statistică a fost determinată folosind teste t Mann-Whitney neparametrice nepereche. Tratamentul cu BSMUC16/CD3-001 a fost comparat cu controlul nelegator (** p < 0,01 pentru 0,5 mg/kg, # p < 0,05 pentru 0,1 mg/kg, $ p < 0,05 pentru 0,01 mg/kg BSMUC16/CD3- 001).
Figura 7 prezintă rezultatele studiului 2 al modelului OVCAR-3 (Avg Radiance [p/s/cm2/sr] în ziua 4). Toate grupurile au avut o sarcină tumorală similară cu cea evaluată de BLI înainte de începerea dozării. Datele prezentate sunt sarcina tumorală, aşa cum a fost evaluată de BLI în ziua 4 după implantarea tumorii. Semnificaţia statistică a fost determinată utilizând teste t Mann-Whitney neparametrice nepereche. Nu a existat nicio diferenţă semnificativă în sarcina tumorii în ziua 4 între grupuri.
Figura 8 prezintă rezultatele studiului model OVCAR-3 2 (Avg Radiance [p/s/cm22/sr] în ziua 25). BSMUC16/CD3-005 reduce semnificativ sarcina tumorală la 0,5, 1 şi 5 mg/kg. Şoarecii NSG grefaţi cu celule T umane au fost implantaţi cu celule OVCAR-3/Luc umane. Tratamentul a început la 5 zile după implantarea tumorii. Şoarecii au fost trataţi în zilele 5, 8, 12, 15, 19 şi 22 cu 0,1, 0,5, 1 sau 5 mg/kg REGN4019 administrat IV sau un control care se leagă de CD3 sau un control fără legare (5 mg/kg IV ). Datele prezentate sunt sarcina tumorală, aşa cum a fost evaluată de BLI în ziua 25 după implantarea tumorii. Semnificaţia statistică a fost determinată utilizând teste t Mann-Whitney nepereche. Tratamentul cu BSMUC16/CD3-005 a fost comparat cu controlul nelegator (** p < 0,01 pentru 5 mg/kg, ## p < 0,01 pentru 1 mg/kg, $$ p < 0,01 pentru 0,5 mg/kg BSMUC16/ CD3-005).
Figura 9 prezintă rezultatele studiului model OVCAR-3 2 (Schimbarea plierii în tumorile evidente BLI între D4 şi D25). BSMUC16/CD3-005 reduce semnificativ creşterea tumorii la 0,5, 1 şi 5 mg/kg. Şoarecii NSG grefaţi cu celule T umane au fost implantaţi cu celule OVCAR-3/Luc umane. Şoarecii au fost trataţi în zilele 5, 8, 12, 15, 19 şi 22 cu 0,1, 0,5, 1 sau 5 mg/kg REGN4019 administrat IV sau trataţi cu un control care se leagă de CD3 sau cu un control fără legare (5 mg/kg IV). Datele prezentate sunt modificarea ori mai mare a sarcinii tumorale de la prima măsurare (luată cu o zi înainte de începerea tratamentului) şi în ziua 25, la sfârşitul studiului. Semnificaţia statistică a fost determinată utilizând teste t Mann-Whitney neparametrice nepereche. Tratamentul cu BSMUC16/CD3-005 a fost comparat cu controlul nelegator (** p < 0,01 pentru 5 mg/kg, ## p < 0,01 pentru 1 mg/kg, $$ p < 0,01 pentru 0,5 mg/kg REGN4019) .
Figura 10 prezintă rezultatele modelului ID8-VEGF/huMUC16. Dimensiunea tumorii în ziua 47 după implantare BSMUC16/CD3-001 reduce semnificativ creşterea tumorii într-un model singeneic atunci când tratamentul începe fie în ziua implantării, fie la 10 zile după implantarea tumorii. Şoarecii care exprimă CD3 uman în loc de CD3 de şoarece şi o moleculă MUC16 himerică au fost implantaţi cu linia tumorală ovariană murină care exprimă o porţiune de MUC16 umană. S-au administrat şoareci BSMUC16/CD3-001 (100 ug I P) în ziua implantării sau la 10 zile după implantare sau control administrat de legare la CD3 (100 ug I P) în ziua implantării. Şoarecii au fost trataţi în zilele 0, 4, 7, 10, 13, 17, 20 sau 24 pentru grupurile cu tratament imediat şi în zilele 10, 13, 17, 20 şi 24 pentru grupul în care doza a început în D10. Datele prezentate sunt volumul tumorii în ziua 47 după implantare. Semnificaţia statistică a fost determinată utilizând teste t Mann-Whitney neparametrice nepereche. Tratamentul cu BSMUC16/CD3-001 a fost comparat cu controlul de legare la CD3 (** p < 0,01 începând cu DO, * p < 0,05 începând cu D10).
Figurile 11A-11C ilustrează rezultatele analizei citometrice în flux (sau FACS) a legării anticorpilor bispecifici selecţi la PEO-1, OVCAR3-Luc, celulele Jurkat şi celulele T cynomolgus. Analiza de titrare a fost efectuată prin testarea unei game de diluţii în serie ale fiecărui anticorp: fie Anticorpi bispecifici MUC16xCD3 BSM UC16/CD3-001, BSMUC16/CD3-002 sau BSMUC16/CD3-003 sau un prim sau al doilea anticorp de control izotip (care nu are reactivitate încrucişată cu CD3 sau MUC16).
Figurile 12A şi 12B prezintă exemple de PEO-1 (Fig. 12A) sau OVCAR3-Luc (Fig. 12B) distrugerea celulelor într-un test de citotoxicitate de 48 de ore după tratamentul anti-MUC16xanti-CD3 în prezenţa PBMC-urilor umane.
DESCRIERE DETALIATA
Informaţiile tehnice prezentate mai jos pot, în anumite privinţe, să depăşească dezvăluirea dezvăluirii, care este definită exclusiv de revendicările anexate. Informaţiile tehnice suplimentare sunt furnizate pentru a plasa dezvăluirea reală într-un context tehnic mai larg şi pentru a ilustra posibilele evoluţii tehnice conexe. Astfel de informaţii tehnice suplimentare care nu intră în domeniul de aplicare al revendicărilor anexate nu fac parte din dezvăluire.
Înainte ca prezenta invenţie să fie descrisă, trebuie să se înţeleagă că această invenţie nu este limitată la anumite metode şi condiţii experimentale descrise, deoarece astfel de metode şi condiţii pot varia. De asemenea, trebuie înţeles că terminologia utilizată aici are doar scopul de a descrie cazuri particulare şi nu se intenţionează să fie limitativă, deoarece scopul prezentei invenţii va fi limitat doar de revendicările anexate.
Dacă nu este definit altfel, toţi termenii tehnici şi ştiinţifici utilizaţi aici au aceeaşi semnificaţie pe care o înţeleg în mod obişnuit de către o persoană cu calificare obişnuită în domeniul căruia îi aparţine această invenţie. Aşa cum este utilizat aici, termenul "aproximativ", atunci când este utilizat cu referire la o anumită valoare numerică citată, înseamnă că valoarea poate varia de la valoarea indicată cu nu mai mult de 1 %. De exemplu, aşa cum este utilizată aici, expresia „aproximativ 100» include 99 şi 101 şi toate valorile dintre acestea (de exemplu, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4 etc.).
Deşi orice metode şi materiale similare sau echivalente cu cele descrise aici pot fi utilizate în practica sau testarea prezentei invenţii, metodele şi materialele preferate sunt acum descrise.
Definiţii
Expresia "CD3", aşa cum este utilizată aici, se referă la un antigen care este exprimat pe celulele T ca parte a receptorului de celule T multimolecular (TCR) şi care constă dintr-un homodimer sau heterodimer format din asocierea a două dintre cele patru lanţuri de receptor: CD3-epsilon, CD3-delta, CD3-zeta şi CD3-gamma. CD3-epsilon uman cuprinde secvenţa de aminoacizi aşa cum este prezentată în SEQ ID NO: 1897; CD3-delta umană cuprinde secvenţa de aminoacizi aşa cum este prezentată în SEQ ID NO: 1898. Toate referinţele la proteine, polipeptide şi fragmente de proteine de aici sunt destinate să se refere la versiunea umană a respectivei proteine, polipeptide sau fragmente proteice, dacă nu se specifică în mod explicit ca fiind dintr-o specie non-umană. Astfel, expresia "CD3" înseamnă CD3 uman, dacă nu este specificat ca fiind dintr-o specie non-umană, de exemplu, "CD3 de şoarece", "CD3 de maimuţă" etc.
Aşa cum este utilizat aici, „un anticorp care leagă CD3» sau un „anticorp anti-CD3» include anticorpi şi fragmente ale acestora de legare la antigen care recunosc în mod specific o singură subunitate CD3 (de exemplu, epsilon, delta, gamma sau zeta), precum şi anticorpi şi fragmente ale acestora de legare la antigen care recunosc în mod specific un complex dimeric din două subunităţi CD3 (de exemplu, dimeri CD3 gamma/epsilon, delta/epsilon şi zeta/zeta). Anticorpii şi fragmentele de legare la antigen pot lega CD3 solubil şi/sau CD3 exprimat la suprafaţa celulară. CD3 solubil include proteine CD3 naturale, precum şi variante de proteine CD3 recombinante, cum ar fi, de exemplu, construcţii CD3 monomerice şi dimerice, cărora le lipseşte un domeniu transmembranar sau sunt altfel neasociate cu o membrană celulară.
Aşa cum este utilizată aici, expresia „CD3 exprimat la suprafaţa celulei» înseamnă una sau mai multe proteine CD3 care este/sunt exprimate pe suprafaţa unei celule in vitro sau in vivo, astfel încât cel puţin o parte a unei proteine CD3 este expus la partea extracelulară a membranei celulare şi este accesibil unei porţiuni de legare a antigenului a unui anticorp. „CD3 exprimat pe suprafaţa celulei» include proteine CD3 conţinute în contextul unui receptor funcţional al celulei T în membrana unei celule. Expresia „CD3 exprimat la suprafaţa celulei» include proteina CD3 exprimată ca parte a unui homodimer sau heterodimer pe suprafaţa unei celule (de exemplu, dimeri CD3 gamma/epsilon, delta/epsilon şi zeta/zeta). Expresia „CD3 exprimat la suprafaţa celulei» include, de asemenea, un lanţ CD3 (de exemplu, CD3-epsilon, CD3-delta sau CD3-gamma) care este exprimat singur, fără alte tipuri de lanţ CD3, pe suprafaţa unei celule. Un „CD3 exprimat la suprafaţa celulei» poate cuprinde sau consta dintr-o proteină CD3 exprimată pe suprafaţa unei celule care exprimă în mod normal proteina CD3. Alternativ, "CD3 exprimat la suprafaţa celulei" poate cuprinde sau consta din proteina CD3 exprimată pe suprafaţa unei celule care în mod normal nu exprimă CD3 uman pe suprafaţa sa, dar a fost concepută artificial pentru a exprima CD3 pe suprafaţa sa.
Expresia "MUC16", aşa cum este utilizată aici, se referă la mucină 16. MUC16 este o glicoproteină membranară integrală cu un singur domeniu transmembranar foarte glicozilat, care este foarte exprimată în cancerul ovarian. Secvenţa de aminoacizi a MUC16 uman este prezentată în SEQ ID NO:1899.
Aşa cum este utilizat aici, "un anticorp care leagă MUC16" sau un "anticorp anti-MUC16" include anticorpi şi fragmente ale acestora de legare la antigen care recunosc în mod specific MUC16.
Termenul "moleculă de legare la antigen" include anticorpi şi fragmente de anticorpi de legare la antigen, incluzând, de exemplu, anticorpi bispecifici.
Termenul "anticorp", aşa cum este utilizat aici, înseamnă orice moleculă de legare la antigen sau complex molecular care cuprinde cel puţin o regiune de determinare a complementarităţii (CDR) care se leagă în mod specific la sau interacţionează cu un anumit antigen (de exemplu, MUC16 sau CD3). Termenul "anticorp" include molecule de imunoglobulină cuprinzând patru lanţuri polipeptidice, două lanţuri grele (H) şi două lanţuri uşoare (L) interconectate prin legături disulfurice, precum şi multimeri ai acestora (de exemplu, IgM). Fiecare lanţ greu cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu (abreviată aici ca HCVR sau VH) şi o regiune constantă a lanţului greu. Regiunea constantă a lanţului greu cuprinde trei domenii, CH1, CH2 şi CH3. Fiecare lanţ uşor cuprinde o regiune variabilă a lanţului uşor (abreviată aici ca LCVR sau VL) şi o regiune constantă a lanţului uşor. Regiunea constantă a lanţului uşor cuprinde un domeniu (CL1). Regiunile VH şi VL pot fi subdivizate în continuare în regiuni de hipervariabilitate, numite regiuni de determinanre a complementăţii (CDR), intercalate cu regiuni care sunt mai conservate, numite regiuni cadru (FR). Fiecare VH şi VL este compus din trei CDR-uri şi patru FR-uri, aranjate de la amino-terminal la carboxi-terminal în următoarea ordine: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. În diferite cazuri, FR-urile anticorpului anti-MUC16 sau anticorpului anti-CD3 (sau porţiunea de legare a antigenului) pot fi identice cu secvenţele liniei germinale umane sau pot fi modificate în mod natural sau artificial. O secvenţă consens de aminoacizi poate fi definită pe baza unei analize alăturate a două sau mai multe CDR-uri.
Termenul "anticorp", aşa cum este utilizat aici, include de asemenea fragmente de legare la antigen ale moleculelor de anticorp complet. Termenii „porţiune de legare la antigen» a unui anticorp, „fragment de legare la antigen» a unui anticorp şi altele asemenea, aşa cum sunt utilizate aici, includ orice polipeptidă sau glicoproteină care se leagă în mod specific la o polipeptidă naturală, obţinută enzimatic, sintetică sau modificată genetic antigenul pentru a forma un complex. Fragmentele de legare la antigen ale unui anticorp pot fi derivate, de exemplu, din molecule de anticorp complet folosind orice tehnici standard adecvate, cum ar fi digestia proteolitică sau tehnici de inginerie genetică recombinată care implică manipularea şi exprimarea ADN-ului care codifică domenii variabile şi opţional constante ale anticorpului. Un astfel de ADN este cunoscut şi/sau este uşor disponibil din, de exemplu, surse comerciale, biblioteci de ADN (inclusiv, de exemplu, biblioteci de anticorpi fagi) sau poate fi sintetizat. ADN-ul poate fi secvenţiat şi manipulat chimic sau prin utilizarea tehnicilor de biologie moleculară, de exemplu, pentru a aranja unul sau mai multe domenii variabile şi/sau constante într-o configuraţie adecvată sau pentru a introduce codoni, a crea resturi de cisteină, a modifica, adăuga sau şterge aminoacizi. , etc.
Exemple nelimitative de fragmente de legare la antigen includ: (i) fragmente Fab; (ii) fragmente F(ab')2; (iii) fragmente Fd; (iv) fragmente Fv; (v) molecule Fv (scFv) cu catenă unică; (vi) fragmente dAb; şi (vii) unităţi minime de recunoaştere constând din resturile de aminoacizi care imită regiunea hipervariabilă a unui anticorp (de exemplu, o regiune izolată de determinare a complementarităţii (CDR) cum ar fi o peptidă CDR3) sau o peptidă FR3-CDR3-FR4 constrânsă. Alte molecule modificate, cum ar fi anticorpi specifici unui domeniu, anticorpi cu un singur domeniu, anticorpi cu deleţie de domeniu, anticorpi himerici, anticorpi grefaţi cu CDR, diacorpi, triacorpi, tetracorpi, minicorpi, nanocorpi (de exemplu, nanocorpi monovalenţi, nanocorpi bivalenţi etc.), mici imunofarmaceutice modulare (SMIP) şi domenii variabile IgNAR de rechin, sunt de asemenea cuprinse în expresia "fragment de legare la antigen", aşa cum este utilizat aici.
Un fragment de legare la antigen al unui anticorp va cuprinde de obicei cel puţin un domeniu variabil. Domeniul variabil poate fi de orice dimensiune sau compoziţie de aminoacizi şi va cuprinde în general cel puţin un CDR care este adiacent sau în cadru cu una sau mai multe secvenţe cadru. În fragmentele de legare la antigen care au un domeniu VH\tab asociat cu un domeniu VL, domeniile VH şi VL pot fi situate unul faţă de celălalt în orice aranjament adecvat. De exemplu, regiunea variabilă poate fi dimerică şi conţine dimeri VH-VH, VH-VL sau VL-VL . Alternativ, fragmentul de legare la antigen al unui anticorp poate conţine un domeniu VH sau VL monomeric.
În anumite cazuri, un fragment de legare la antigen al unui anticorp poate conţine cel puţin un domeniu variabil legat covalent la cel puţin un domeniu constant. Configuraţiile exemplificative, nelimitative ale domeniilor variabile şi constante care pot fi găsite într-un fragment de legare la antigen al unui anticorp din prezenta invenţie includ: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2-CH3; (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (x) VL-CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; şi (xiv) VL-CL. în orice configuraţie de domenii variabile şi constante, incluzând oricare dintre configuraţiile exemplificative enumerate mai sus, domeniile variabile şi constante pot fi fie legate direct între ele, fie pot fi legate printr-o balama sau o regiune de legătură completă sau parţială. O regiune balama poate consta din cel puţin 2 (de exemplu, 5, 10, 15, 20, 40, 60 sau mai mulţi) aminoacizi care au ca rezultat o legătură flexibilă sau semiflexibilă între domenii variabile şi/sau constante adiacente într-o singură polipeptidă moleculă. Mai mult, un fragment de legare la antigen al unui anticorp poate cuprinde un homo-dimer sau hetero-dimer (sau alt multimer) al oricăreia dintre configuraţiile de domenii variabile şi constante enumerate mai sus în asociere necovalentă unul cu celălalt şi/ sau cu unul sau mai multe domenii VH sau VL monomerice {de exemplu, prin legătură(e) disulfurică).
Ca şi în cazul moleculelor de anticorp complet, fragmentele de legare la antigen pot fi monospecifice sau multispecifice (de exemplu, bispecifice). Un fragment de legare la antigen multispecific al unui anticorp va cuprinde în mod tipic cel puţin două domenii variabile diferite, în care fiecare domeniu variabil este capabil să se lege în mod specific la un antigen separat sau la un epitop diferit de pe acelaşi antigen. Orice format de anticorp multispecific, inclusiv formatele de anticorp bispecific exemplificative dezvăluite aici, poate fi adaptat pentru utilizare în contextul unui fragment de legare la antigen al unui anticorp utilizând tehnici de rutină disponibile în domeniu.
Anticorpii pot funcţiona prin citotoxicitate dependentă de complement (CDC) sau citotoxicitate mediată celular dependentă de anticorpi (ADCC). „Citotoxicitatea dependentă de complement» (CDC) se referă la liza celulelor care exprimă antigenul de către un anticorp în prezenţa complementului. „Citotoxicitatea mediată de celule dependentă de anticorpi» (ADCC) se referă la o reacţie mediată de celule în care celulele citotoxice nespecifice care exprimă receptori Fc (FcRs) (de exemplu, celulele Natural Killer (NK), neutrofilele şi macrofagele) recunosc anticorpul legat pe o celulă ţintă şi astfel conduc la liza celulei ţintă. CDC şi ADCC pot fi măsurate utilizând teste care sunt bine cunoscute şi disponibile în domeniu. (A se vedea, de exemplu, brevetele SUA nr. 5.500.362 şi 5.821.337 şi Clynes şi colab. ( 1998) Proc. Natl. Acad. Sci. (SUA) 95:652-656). Regiunea constantă a unui anticorp este importantă în capacitatea unui anticorp de a fixa complementul şi de a media citotoxicitatea dependentă de celule. Astfel, izotipul unui anticorp poate fi selectat pe baza faptului dacă este de dorit ca anticorpul să medieze citotoxicitatea.
În anumite cazuri, anticorpii monospecifici anti-MUC16 sau anticorpii bispecifici anti-MUC16/anti-CD3 sunt anticorpi umani. Termenul "anticorp uman", aşa cum este utilizat aici, este destinat să includă anticorpi având regiuni variabile şi constante derivate din secvenţele de imunoglobuline ale liniei germinale umane. Anticorpii umani pot include resturi de aminoacizi necodificate de secvenţe de imunoglobuline ale liniei germinale umane (de exemplu, mutaţii introduse prin mutageneză aleatorie sau specifică locului in vitro sau prin mutaţie somatică in vivo), de exemplu în CDR-uri şi în special CDR3. Cu toate acestea, termenul "anticorp uman", aşa cum este utilizat aici, nu este destinat să includă anticorpi în care secvenţele CDR derivate din linia germinativă a unei alte specii de mamifere, cum ar fi un şoarece, au fost grefate pe secvenţe cadru umane.
Anticorpii pot fi, în unele cazuri, anticorpi umani recombinanţi. Termenul „anticorp uman recombinant», aşa cum este utilizat aici, este destinat să includă toţi anticorpii umani care sunt preparaţi, exprimaţi, creaţi sau izolaţi prin mijloace recombinante, cum ar fi anticorpii exprimaţi folosind un vector de expresie recombinant transfectat într-o celulă gazdă (descris mai jos). ), anticorpi izolaţi dintr-o bibliotecă de anticorpi umani recombinanţi, combinatori (descrişi mai jos), anticorpi izolaţi de la un animal (de exemplu, un şoarece) care este transgenic pentru genele imunoglobulinei umane (vezi de exemplu, Taylor şi colab. ( 1992) Nucl. Acizi Res. 20:6287-6295) sau anticorpi preparaţi, exprimaţi, creaţi sau izolaţi prin orice alte mijloace care implică despicarea secvenţelor genei de imunoglobuline umane la alte secvenţe ADN. Astfel de anticorpi umani recombinanţi au regiuni variabile şi constante derivate din secvenţele de imunoglobulină germinativă umană. În anumite cazuri, totuşi, astfel de anticorpi umani recombinanţi sunt supuşi mutagenezei in vitro (sau, atunci când se utilizează un animal transgenic pentru secvenţe Ig umane, mutagenezei somatice in vivo) şi astfel secvenţele de aminoacizi ale regiunilor VH şi VL ale anticorpilor recombinanţi sunt secvenţe care, deşi derivate din şi legate de secvenţele VH şi VL ale liniei germinale umane, pot să nu existe în mod natural în repertoriul liniei germinale de anticorpi umani in vivo.
Anticorpii umani pot exista în două forme care sunt asociate cu eterogenitatea balamalei. Într-o formă, o moleculă de imunoglobulină cuprinde o construcţie stabilă cu patru lanţuri de aproximativ 150-160 kDa în care dimerii sunt ţinuţi împreună printr-o legătură disulfurică a lanţului greu intercatenar. Într-o a doua formă, dimerii nu sunt legaţi prin legături disulfurice inter-lanţuri şi se formează o moleculă de aproximativ 75-80 kDa compusă dintr-un lanţ uşor şi greu cuplat covalent (jumătate de anticorp). Aceste forme au fost extrem de greu de separat, chiar şi după purificarea prin afinitate.
Frecvenţa de apariţie a celei de-a doua forme în diferite izotipuri IgG intacte se datorează, dar nu se limitează la, diferenţelor structurale asociate cu izotipul regiunii balama a anticorpului. O singură substituţie de aminoacid în regiunea balama a balamalei lgG4 umană poate reduce semnificativ aspectul celei de-a doua forme (Angal şi colab. 1993) Molecular Immunology 30: 105) la niveluri observate în mod tipic utilizând o balama lgG1 umană. Prezenta invenţie cuprinde anticorpi având una sau mai multe mutaţii în balama, regiunea CH2 sau CH3 care pot fi de dorit, de exemplu, în producţie, pentru a îmbunătăţi randamentul formei de anticorpi dorite.
Anticorpii pot fi anticorpi izolaţi. Un "anticorp izolat", aşa cum este utilizat aici, înseamnă un anticorp care a fost identificat şi separat şi/sau recuperat din cel puţin o componentă a mediului său natural. De exemplu, un anticorp care a fost separat sau îndepărtat din cel puţin o componentă a unui organism, sau dintr-un ţesut sau celulă în care anticorpul există în mod natural sau este produs în mod natural, este un "anticorp izolat" pentru scopurile prezentei dezvăluiri. Un anticorp izolat include, de asemenea, un anticorp in situ într-o celulă recombinată. Anticorpii izolaţi sunt anticorpi care au fost supuşi la cel puţin o etapă de purificare sau izolare. Conform anumitor cazuri, un anticorp izolat poate fi în mod substanţial lipsit de alte materiale celulare şi/sau substanţe chimice.
De asemenea sunt descrişi anticorpi cu un singur braţ care leagă MUC16. Aşa cum este utilizat aici, un "anticorp cu un singur braţ" înseamnă o moleculă de legare la antigen care cuprinde un singur lanţ greu de anticorp şi un singur lanţ uşor de anticorp. Anticorpii cu un singur braţ pot cuprinde oricare dintre secvenţele de aminoacizi HCVR/LCVR sau CDR aşa cum sunt prezentate în Tabelul 1.
Anticorpii anti-MUC16 sau anti-MUC16/anti-CD3 dezvăluiţi aici pot cuprinde una sau mai multe substituţii de aminoacizi, inserţii şi/sau deleţii în cadrul şi/sau regiunile CDR ale domeniilor variabile ale lanţului greu şi uşor în comparaţie cu cele corespunzătoare. secvenţe germinale din care au fost derivaţi anticorpii. Astfel de mutaţii pot fi constatate cu uşurinţă prin compararea secvenţelor de aminoacizi dezvăluite aici cu secvenţele liniei germinale disponibile, de exemplu, din bazele de date publice de secvenţe de anticorpi. Prezenta dezvăluire include anticorpi şi fragmente ale acestora de legare la antigen, care sunt derivate din oricare dintre secvenţele de aminoacizi dezvăluite aici, în care unul sau mai mulţi aminoacizi din unul sau mai multe regiuni cadru şi/sau CDR sunt mutaţi la restul reziduurile corespunzătoare din secvenţa de linie germinală din care a fost derivat anticorpul, sau la restul(ele) corespunzător(e) din altă secvenţă germinală umană, sau la o substituţie conservatoare de aminoacizi a restului(lor) de linie germinativă (asemenea modificări de secvenţă sunt menţionate aici în mod colectiv). ca „mutaţii ale liniei germinale»). O persoană cu calificare obişnuită în domeniu, începând cu secvenţele de regiune variabilă a lanţului greu şi uşor descrise aici, poate produce cu uşurinţă numeroşi anticorpi şi fragmente de legare la antigen care cuprind una sau mai multe mutaţii individuale ale liniei germinale sau combinaţii ale acestora. În anumite cazuri, toate resturile cadru şi/sau CDR din domeniile VH şi/sau VL sunt mutate înapoi la resturile găsite în secvenţa germinativă originală din care a fost derivat anticorpul. În alte cazuri, numai anumite reziduuri sunt mutate înapoi la secvenţa originală a liniei germinale, de exemplu, numai resturile mutante găsite în primii 8 aminoacizi ai FR1 sau în ultimii 8 aminoacizi ai FR4, sau numai resturile mutante găsite în CDR1, CDR2 sau CDR3. În alte czuri, unul sau mai multe dintre resturile cadru şi/sau CDR sunt mutate la restul (reziduurile) corespunzătoare ale unei secvenţe de linie germinală diferită (adică, o secvenţă de linie germinală care este diferită de secvenţa de linie germinală din care a fost anticorpul). derivate iniţial). Mai mult, anticorpii prezentei invenţii pot conţine orice combinaţie de două sau mai multe mutaţii ale liniei germinale în cadrul regiunilor cadru şi/sau CDR, de exemplu, în care anumite resturi individuale sunt mutate la restul corespunzător al unei anumite secvenţe de linie germinală, în timp ce anumite alte resturi care diferă. din secvenţa originală a liniei germinale sunt menţinute sau sunt mutate la reziduul corespunzător al unei secvenţe de linie germinală diferită. Odată obţinute, anticorpii şi fragmentele de legare la antigen care conţin una sau mai multe mutaţii ale liniei germinale pot fi testate cu uşurinţă pentru una sau mai multe proprietăţi dorite, cum ar fi specificitatea de legare îmbunătăţită, legarea crescută (de exemplu, măsurată prin titrarea legăturii celulare sau legarea FACS) sau legarea. afinitate (de exemplu, KD), proprietăţi biologice antagoniste sau agoniste îmbunătăţite sau îmbunătăţite (după caz), imunogenitate redusă etc. Anticorpii şi fragmentele de legare la antigen obţinute în acest mod general sunt cuprinse în prezenta dezvăluireC u toate acestea, doar un anticorp sau un fragment de legare la antigen al acestuia care cuprinde un prim domeniu de legare la antigen care leagă în mod specific CD3 uman şi un al doilea domeniu de legare la antigen care leagă în mod specific MUC16 uman, în care al doilea domeniu de legare la antigen cuprinde HCDR1-HCDR2-HCDR3- Domeniile LCDR1-LCDR2-LCDR3, respectiv, cuprinzând secvenţele de aminoacizi ale SEQ ID NO: 20-22-24-28-30-32, aşa cum sunt definite în revendicări, sunt în sfera anticorpilor din invenţia revendicată.
De asemenea sunt descrişi, anticorpi anti-MUC16 sau anti-MUC16/anti-CD3 cuprinzând variante ale oricăreia dintre secvenţele de aminoacizi HCVR, LCVR şi/sau CDR descrise aici având una sau mai multe substituţii conservatoare. De exemplu, anticorpi anti-MUC16 sau anti-MUC16/anti-CD3 având secvenţe de aminoacizi HCVR, LCVR şi/sau CDR cu, de exemplu, 10 sau mai puţine, 8 sau mai puţine, 6 sau mai puţine, 4 sau mai puţine, etc. substituţii conservatoare de aminoacizi în raport cu oricare dintre secvenţele de aminoacizi HCVR, LCVR şi/sau CDR prezentate în Tabelul 1 de aici sau aşa cum este descris în Tabelele 16, 18, 19, 22 şi 23 de aici.
Termenul "epitop" se referă la un determinant antigenic care interacţionează cu un situs specific de legare a antigenului în regiunea variabilă a unei molecule de anticorp cunoscută ca paratop. Un singur antigen poate avea mai mult de un epitop. Astfel, anticorpi diferiţi se pot lega la diferite zone ale unui antigen şi pot avea efecte biologice diferite. Epitopii pot fi fie conformaţionali, fie liniari. Un epitop conformaţional este produs de aminoacizi juxtapuşi spaţial din diferite segmente ale lanţului polipeptidic linear. Un epitop liniar este unul produs de resturile de aminoacizi adiacente dintr-un lanţ polipeptidic. în anumite circumstanţe, un epitop poate include fragmente de zaharide, grupări fosforil sau grupări sulfonil de pe antigen.
Termenul „identitate substanţială» sau „substanţial identic», atunci când se referă la un acid nucleic sau fragment al acestuia, indică faptul că, atunci când este aliniat în mod optim cu inserţii sau deleţii adecvate de nucleotide cu un alt acid nucleic (sau catena sa complementară), există identitate de secvenţă de nucleotide. în cel puţin aproximativ 95% şi mai preferabil cel puţin aproximativ 96%, 97%, 98% sau 99% din baze nucleotidice, măsurate prin orice algoritm binecunoscut de identitate de secvenţă, cum ar fi FASTA, BLAST sau Gap, ca discutat mai jos. O moleculă de acid nucleic având identitate substanţială cu o moleculă de acid nucleic de referinţă poate, în anumite cazuri, să codifice o polipeptidă având aceeaşi secvenţă de aminoacizi sau substanţial similară cu polipeptida codificată de molecula de acid nucleic de referinţă.
Aşa cum se aplică polipeptidelor, termenul „asemănare substanţială» sau „substanţial asemănător» înseamnă că două secvenţe de peptide, atunci când sunt aliniate optim, cum ar fi prin programele GAP sau BESTFIT, folosind ponderi implicite ale intervalului, împărtăşesc cel puţin 95% identitate de secvenţă, chiar mai preferabil. cel puţin 98% sau 99% identitate de secvenţă. De preferinţă, poziţiile reziduurilor care nu sunt identice diferă prin substituţii conservatoare de aminoacizi. O „substituţie conservatoare de aminoacid» este una în care un rest de aminoacid este substituit cu un alt rest de aminoacid având o catenă laterală (grupare R) cu proprietăţi chimice similare (de exemplu, sarcină sau hidrofobicitate). În general, o substituţie conservatoare a aminoacizilor nu va schimba substanţial proprietăţile funcţionale ale unei proteine. În cazurile în care două sau mai multe secvenţe de aminoacizi diferă una de cealaltă prin substituţii conservatoare, identitatea secvenţei procentuale sau gradul de similaritate poate fi ajustat în sus pentru a corecta natura conservatoare a substituţiei. Mijloacele pentru realizarea acestei ajustări sunt binecunoscute specialiştilor în domeniu. Vezi, de exemplu, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. Exemple de grupuri de aminoacizi care au catene laterale cu proprietăţi chimice similare includ (1) catene laterale alifatice: glicină, alanină, valină, leucină şi izoleucină; (2) catene laterale alifatic-hidroxil: serină şi treonină; (3) lanţuri laterale care conţin amidă: asparagină şi glutamina; (4) lanţuri laterale aromatice: fenilalanină, tirozină şi triptofan; (5) lanţuri laterale de bază: lizină, arginină şi histidină; (6) lanţuri laterale acide: aspartat şi glutamat şi (7) lanţuri laterale care conţin sulf sunt cisteină şi metionină. Grupările de substituţie a aminoacizilor conservatoare preferate sunt: valină-leucină-izoleucină, fenilalanină-tirozină, lizină-arginină, alanină-valină, glutamat-aspartat şi asparagină-glutamina. Alternativ, o înlocuire conservatoare este orice modificare care are o valoare pozitivă în matricea log-probabilităţii PAM250 dezvăluită în Gonnet şi colab. (1992) Science 256: 1443-1445. O înlocuire „moderat conservatoare» este orice modificare care are o valoare nenegativă în matricea log-probabilităţii PAM250.
Asemănarea secvenţei pentru polipeptide, la care se face referire şi ca identitate de secvenţă, este măsurată în mod obişnuit folosind software-ul de analiză a secvenţei. Software-ul de analiză a proteinelor potriveşte secvenţe similare folosind măsuri de similitudine atribuite diferitelor substituţii, deleţii şi alte modificări, inclusiv substituţii conservatoare de aminoacizi. De exemplu, software-ul GCG conţine programe precum Gap şi Bestfit care pot fi utilizate cu parametrii impliciti pentru a determina omologia secvenţei sau identitatea secvenţei între polipeptide strâns legate, cum ar fi polipeptide omoloage din diferite specii de organisme sau între o proteină de tip sălbatic şi o muteină a acesteia. . Vezi, de exemplu, GCG Versiunea 6.1. Secvenţele de polipeptide pot fi, de asemenea, comparate folosind FASTA utilizând parametrii impliciti sau recomandaţi, un program din GCG Versiunea 6.1. FASTA (de exemplu, FASTA2 şi FASTA3) furnizează aliniamente şi identitate de secvenţă procentuală a regiunilor cu cea mai bună suprapunere între secvenţele de interogare şi de căutare (Pearson (2000) supra). Un alt algoritm preferat atunci când se compară o secvenţă a invenţiei cu o bază de date care conţine un număr mare de secvenţe din diferite organisme este programul de calculator BLAST, în special BLASTP sau TBLASTN, folosind parametrii impliciti. Vezi, de exemplu, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 şi Altschul şi colab. (1997) Acizi nucleici Res. 25:3389-402.
Mutaţii ale liniei germinale
Anticorpii conform invenţiei sunt definiţi prin revendicări. Alţi anticorpi sunt, de asemenea, descrişi aici . Anticorpii anti-CD3 dezvăluiţi aici cuprind una sau mai multe substituţii de aminoacizi, inserţii şi/sau deleţii în cadru şi/sau regiuni CDR ale domeniilor variabile ale lanţului greu în comparaţie cu secvenţele germinale corespunzătoare din care au fost derivaţi anticorpii.
Sunt descrişi anticorpi şi fragmente ale acestora care leagă antigenul, care sunt derivate din oricare dintre secvenţele de aminoacizi descrise aici, în care unul sau mai mulţi aminoacizi din unul sau mai multe regiuni cadru şi/sau CDR sunt mutaţi la restul(ri) corespunzător (are) a secvenţei de linie germinativă din care a fost derivat anticorpul, sau la restul(rile) corespunzător(are) al altei secvenţe de linie germinală umană, sau la o substituţie conservativă de aminoacizi a restului(or) corespunzător(are) de linie germinală (asemenea modificări de secvenţă sunt menţionate aici colectiv ca „mutaţii ale liniei germinale») şi care au legare slabă sau deloc detectabilă la un antigen CD3. Câţiva astfel de anticorpi exemplari care recunosc CD3 sunt descrişi în Tabelele 16, 18, 19, 22 şi 23 de aici. Cu toate acestea, doar un anticorp sau un fragment de legare la antigen al acestuia care cuprinde un prim domeniu de legare la antigen care leagă în mod specific CD3 uman şi un al doilea domeniu de legare la antigen care leagă în mod specific MUC16 uman, în care al doilea domeniu de legare la antigen cuprinde HCDR1-HCDR2- Domeniile HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3, respectiv, cuprinzând secvenţele de aminoacizi ale SEQ ID NO: 20-22-24-28-30-32, aşa cum sunt definite în revendicări, se încadrează în domeniul de aplicare al anticorpilor invenţiei revendicate.
Mai mult, anticorpii pot conţine orice combinaţie de două sau mai multe mutaţii ale liniei germinale în cadrul regiunilor cadru şi/sau CDR, de exemplu, în care anumite resturi individuale sunt mutate la restul corespunzător al unei anumite secvenţe de linie germinală, în timp ce anumite alte resturi care diferă. din secvenţa originală a liniei germinale sunt menţinute sau sunt mutate la reziduul corespunzător al unei secvenţe de linie germinală diferită. Odată obţinute, anticorpii şi fragmentele de legare la antigen care conţin una sau mai multe mutaţii ale liniei germinale pot fi testate pentru una sau mai multe proprietăţi dorite, cum ar fi specificitatea de legare îmbunătăţită, legare sau afinitate de legare slabă sau redusă, proprietăţi farmacocinetice îmbunătăţite sau îmbunătăţite, imunogenitate redusă etc. .
De asemenea sunt descrşi aici anticorpi anti-CD3 cuprinzând variante ale oricăreia dintre secvenţele de aminoacizi HCVR, LCVR şi/sau CDR dezvăluite aici având una sau mai multe substituţii conservatoare. De exemplu, anticorpi anti-CD3 având secvenţe de aminoacizi HCVR, LCVR şi/sau CDR cu, de exemplu, 10 sau mai puţine, 8 sau mai puţine, 6 sau mai puţine, 4 sau mai puţine, etc. substituţii conservatoare de aminoacizi relativ la oricare dintre secvenţele de aminoacizi HCVR, LCVR şi/sau CDR prezentate în Tabelele 16, 18, 19, 22 şi 23 de aici. Anticorpii şi moleculele bispecifice de legare a antigenului pot cuprinde una sau mai multe substituţii de aminoacizi, inserţii şi/sau deleţii în cadrul şi/sau regiunile CDR ale domeniilor variabile ale lanţului greu şi uşor, în comparaţie cu secvenţele germinale corespunzătoare din care au fost derivate domeniile individuale de legare a antigenului, menţinând sau îmbunătăţind în acelaşi timp legarea dorită, slab sau deloc detectabilă, la antigenul CD3. O „substituţie conservatoare de aminoacid» este una în care un rest de aminoacid este substituit cu un alt rest de aminoacid având o catenă laterală (grupare R) cu proprietăţi chimice similare (de exemplu, sarcină sau hidrofobicitate). În general, o substituţie conservatoare a aminoacizilor nu va schimba substanţial proprietăţile funcţionale ale unei proteine, adică substituţia aminoacizilor menţine sau îmbunătăţeşte legarea sau afinitatea de legare slabă până la deloc detectabilă dorită în cazul moleculelor de legare anti-CD3. Exemple de grupuri de aminoacizi care au catene laterale cu proprietăţi chimice similare includ (1) catene laterale alifatice: glicină, alanină, valină, leucină şi izoleucină; (2) catene laterale alifatic-hidroxil: serină şi treonină; (3) lanţuri laterale care conţin amidă: asparagină şi glutamina; (4) lanţuri laterale aromatice: fenilalanină, tirozină şi triptofan; (5) lanţuri laterale de bază: lizină, arginină şi histidină; (6) lanţuri laterale acide: aspartat şi glutamat şi (7) lanţuri laterale care conţin sulf sunt cisteină şi metionină. Grupările de substituţie de aminoacizi conservatoare preferate sunt: valină-leucină-izoleucină, fenilalanină-tirozină, lizină-arginină, alanină-valină, glutamat-aspartat şi asparagină-glutamina. Alternativ, o înlocuire conservatoare este orice modificare care are o valoare pozitivă în matricea log-probabilităţii PAM250 dezvăluită în Gonnet şi colab. ( 1992) Science 256: 1443-1445. O înlocuire „moderat conservatoare» este orice modificare care are o valoare nenegativă în matricea log-probabilităţii PAM250.
De asemenea sunt descrise aici molecule de legare a antigenului care cuprind un domeniu de legare a antigenului cu o secvenţă de aminoacizi HCVR şi/sau CDR care este substanţial identică cu oricare dintre secvenţele de aminoacizi HCVR şi/sau CDR descrise aici, menţinând sau îmbunătăţind în acelaşi timp afinitate slabă pentru antigenul CD3. Termenul „identitate substanţială» sau „substanţial identic», atunci când se referă la o secvenţă de aminoacizi, înseamnă că două secvenţe de aminoacizi, atunci când sunt aliniate optim, cum ar fi prin programele GAP sau BESTFIT, folosind ponderi implicite ale intervalului, împărtăşesc o identitate de secvenţă de cel puţin 95% , chiar mai preferabil cel puţin 98% sau 99% identitate de secvenţă. De preferinţă, poziţiile resturilor care nu sunt identice diferă prin substituţii conservatoare de aminoacizi. În cazurile în care două sau mai multe secvenţe de aminoacizi diferă una de cealaltă prin substituţii conservatoare, identitatea secvenţei procentuale sau gradul de similaritate poate fi ajustat în sus pentru a corecta natura conservatoare a substituţiei. Mijloacele pentru realizarea acestei ajustări sunt binecunoscute specialiştilor în domeniu. Vezi, de exemplu, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331.
Asemănarea secvenţei pentru polipeptide, la care se face referire şi ca identitate de secvenţă, este măsurată în mod obişnuit folosind software-ul de analiză a secvenţei. Software-ul de analiză a proteinelor potriveşte secvenţe similare folosind măsuri de similitudine atribuite diferitelor substituţii, deleţii şi alte modificări, inclusiv substituţii conservatoare de aminoacizi. De exemplu, software-ul GCG conţine programe precum Gap şi Bestfit care pot fi utilizate cu parametrii impliciti pentru a determina omologia secvenţei sau identitatea secvenţei între polipeptide strâns legate, cum ar fi polipeptide omoloage din diferite specii de organisme sau între o proteină de tip sălbatic şi o muteină a acesteia. . Vezi, de exemplu, GCG Versiunea 6.1. Secvenţele de polipeptide pot fi, de asemenea, comparate folosind FASTA utilizând parametrii impliciti sau recomandaţi, un program din GCG Versiunea 6.1. FASTA (de exemplu, FASTA2 şi FASTA3) furnizează aliniamente şi identitate de secvenţă procentuală a regiunilor cu cea mai bună suprapunere între secvenţele de interogare şi de căutare (Pearson (2000) supra). Un alt algoritm preferat atunci când se compară o secvenţă cu o bază de date care conţine un număr mare de secvenţe din diferite organisme este programul de calculator BLAST, în special BLASTP sau TBLASTN, folosind parametrii impliciti. Vezi, de exemplu, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 şi Altschul şi colab. (1997) Acizi nucleici Res. 25:3389-402.
Odată obţinute, domeniile de legare la antigen care conţin una sau mai multe mutaţii ale liniei germinale au fost testate pentru legare sau afinitate de legare scăzută utilizând una sau mai multe teste in vitro. Deşi anticorpii care recunosc un anumit antigen sunt de obicei analizaţi pentru scopul lor prin testarea unei legături mari (adică puternice) sau a afinităţii de legare la antigen, anticorpii prezentei invenţii prezintă legare slabă sau nicio legare detectabilă. Moleculele bispecifice de legare a antigenului care cuprind unul sau mai multe domenii de legare a antigenului obţinute în acest mod general s-au dovedit a fi avantajoase ca terapii tumorale determinate de aviditate.
Beneficii neaşteptate, de exemplu, proprietăţi farmacocinetice îmbunătăţite şi toxicitate scăzută pentru pacient pot fi realizate din metodele descrise aici.
Proprietăţile de legare ale anticorpilor
Aşa cum este utilizat aici, termenul „legare» în contextul legării unui anticorp, imunoglobulina, fragmentul de legare a anticorpilor sau proteina care contine Fc la oricare, de exemplu, un antigen predeterminat, cum ar fi o proteina de suprafata celulara sau un fragment al acesteia, se refera de obicei la o interactiune sau asociere intre cel putin doua entitati sau structuri moleculare, cum ar fi o interacţiune anticorp-antigen.
De exemplu, afinitatea de legare corespunde în mod obişnuit unei valori KD de aproximativ 10-7 M sau mai puţin, cum ar fi aproximativ 10-8 M sau mai puţin, cum ar fi aproximativ 10-9 M sau mai puţin atunci când este determinată, de exemplu, de tehnologia rezonanţei plasmonilor de suprafaţă (SPR) în un instrument BIAcore 3000 care utilizează antigenul ca ligand şi anticorpul, Ig, fragmentul de legare a anticorpului sau proteina care conţine Fc ca analit (sau antiligand). Strategiile de legare pe bază de celule, cum ar fi testele de legare de sortare a celulelor activate cu fluorescent (FACS), sunt de asemenea utilizate în mod obişnuit, iar datele FACS se corelează bine cu alte metode, cum ar fi legarea competiţiei radioligand şi SPR (Benedict, CA, J Immunol Methods, 1997, 201 (2): 223-31; Geuijen, CA, et al. J Immunol Methods. 2005, 302(1 -2):68-77).
În consecinţă, anticorpul sau proteina de legare a antigenului se leagă la antigenul predeterminat sau la molecula de suprafaţă celulară (receptor) având o afinitate corespunzătoare unei valori KD care este de cel puţin zece ori mai mică decât afinitatea sa pentru legarea la un antigen nespecific. (de exemplu, BSA, cazeină). Afinitatea unui anticorp care corespunde unei valori KD care este egală cu sau mai mică de zece ori mai mică decât un antigen nespecific poate fi considerată legare nedetectabilă, totuşi un astfel de anticorp poate fi asociat cu un al doilea. braţul de legare a antigenului pentru producerea unui anticorp bispecific.
Termenul "KD" (M) se referă la constanta de echilibru de disociere a unei anumite interacţiuni anticorp-antigen sau constanta de echilibru de disociere a unui anticorp sau fragment de legare a anticorpului care se leagă la un antigen. Există o relaţie inversă între KD şi afinitatea de legare, prin urmare, cu cât valoarea KD este mai mică, cu atât este mai mare, adică mai puternică, afinitatea. Astfel, termenii „afinitate mai mare» sau „afinitate mai puternică» se referă la o capacitate mai mare de a forma o interacţiune şi, prin urmare, o valoare KD mai mică şi, invers, termenii „afinitate mai scăzută» sau „afinitate mai slabă» se referă la o capacitate mai mică de a forma o interacţiune. şi, prin urmare, o valoare KD mai mare. În anumite circumstanţe, o afinitate mai mare de legare (sau KD) a unei anumite molecule (de exemplu, anticorp) la molecula sa parteneră interactivă (de exemplu, antigenul X) în comparaţie cu afinitatea de legare a moleculei (de exemplu, anticorpul) la o altă moleculă parteneră interactivă (de exemplu, antigenul). Y) poate fi exprimat ca un raport de legare determinat prin împărţirea valorii KD mai mare (afinitate mai mică sau mai slabă) la KD mai mică (afinitate mai mare sau mai puternică), de exemplu exprimată ca afinitate de legare de 5 ori sau de 10 ori mai mare , după caz.
Termenul "kd" (sec -1 sau 1/s) se referă la constanta vitezei de disociere a unei anumite interacţiuni anticorp-antigen sau la constanta vitezei de disociere a unui anticorp sau fragment de legare a anticorpului. Valoarea menţionată mai este denumită şi valoarea koff.
Termenul "ka" (M-1 x sec-1 sau 1/M) se referă la constanta vitezei de asociere a unei anumite interacţiuni anticorp-antigen sau la constanta vitezei de asociere a unui anticorp sau fragment de legare a anticorpului.
Termenul "KA" (M-1 sau 1/M) se referă la constanta de echilibru de asociere a unei anumite interacţiuni anticorp-antigen sau la constanta de echilibru de asociere a unui anticorp sau fragment de legare la anticorp. Constanta de echilibru de asociere se obţine prin împărţirea ka prin kd.
Termenul „EC50» sau „EC50» se referă la jumătatea concentraţiei efective maxime, care include concentraţia unui anticorp care induce un răspuns la jumătatea distanţei dintre linia de bază şi maximă după un timp de expunere specificat. EC50 reprezintă în esenţă concentraţia unui anticorp în care se observă 50% din efectul său maxim. În anumite cazuri, valoarea EC50 este egală cu concentraţia unui anticorp conform invenţiei care dă legarea semimaximală la celulele care exprimă CD3 sau antigenul asociat tumorii, aşa cum este determinat de, de ex. un test de legare FACS. Astfel, se observă o legare redusă sau mai slabă cu o EC50 crescută sau jumătate din valoarea concentraţiei efective maxime.
Într-o variantă de realizare, legare scăzută poate fi definită ca o concentraţie crescută de anticorpi EC50 care permite legarea la jumătatea cantităţii maxime de celule ţintă.
Într-o altă variantă de realizare, valoarea EC50 reprezintă concentraţia unui anticorp conform invenţiei care determină epuizarea semimaximală a celulelor ţintă prin activitatea citotoxică a celulelor T. Astfel, activitatea citotoxică crescută (de ex. uciderea celulelor tumorale mediată de celulele T) se observă cu o EC50 scăzută sau la jumătate din valoarea concentraţiei efective maxime.
Molecule bispecifice de legare a antigenului
Anticorpii descrşi aici pot fi monospecifici, bispecifici sau multispecifici. Anticorpii conform invenţiei sunt bispecifici, aşa cum sunt definiţi în revendicări. Anticorpii multispecifici pot fi specifici pentru diferiţi epitopi ai unei polipeptide ţintă sau pot conţine domenii de legare la antigen specifice pentru mai mult de o polipeptidă ţintă. Vezi, de exemplu, Tutt şi colab., 1991, J. Immunol. 147:60-69; Kufer ef a/., 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244. Anticorpii monospecifici anti-MUC16 sau anticorpii bispecifici anti-MUC16/anti-CD3 din prezenta invenţie pot fi legaţi sau co-exprimaţi cu o altă moleculă funcţională, de exemplu, o altă peptidă sau proteină. De exemplu, un anticorp sau un fragment al acestuia poate fi legat funcţional (de exemplu, prin cuplare chimică, fuziune genetică, asociere necovalentă sau în alt mod) la una sau mai multe alte entităţi moleculare, cum ar fi un alt anticorp sau fragment de anticorp pentru a produce un bispecific sau un fragment de anticorp. anticorp multispecific cu o a doua sau suplimentară specificitate de legare.
Utilizarea expresiei "anticorp anti-CD3" sau "anticorp anti-MUC16" de aici este destinată să includă atât anticorpi monospecifici anti-CD3 sau anti-MUC16, cât şi anticorpi bispecifici cuprinzând un braţ de legare a CD3 şi un braţ de legare a MUC16. Astfel, prezenta invenţie se referă anticorpi bispecifici în care un braţ al unei imunoglobuline leagă CD3 uman, iar celălalt braţ al imunoglobulinei este specific pentru MUC16 uman. Braţul de legare CD3 poate cuprinde oricare dintre secvenţele de aminoacizi HCVR/LCVR sau CDR, aşa cum este prezentat în Tabelele 1, 16, 18, 19, 22 şi 23 de aici.
În anumite cazuri, braţul care leagă CD3 se leagă de CD3 uman şi induce activarea celulelor T umane. În anumite cazuri, braţul care leagă CD3 se leagă slab de CD3 uman şi induce activarea celulelor T umane. În alte cazuri, braţul care leagă CD3 se leagă slab la CD3 uman şi induce uciderea celulelor care exprimă antigenul asociat tumorii în contextul unui anticorp bispecific sau multispecific. În alte cazuri, braţul care leagă CD3 se leagă sau se asociază slab cu CD3 uman şi cynomolgus (maimuţă), dar interacţiunea de legare nu este detectabilă prin testele in vitro cunoscute în domeniu. Braţul de legare a MUC16 poate cuprinde oricare dintre secvenţele de aminoacizi HCVR/LCVR sau CDR aşa cum este prezentat în Tabelul 1 de aici.
Prezenta invenţie se referă la anticorpi bispecifici şi fragmente ale acestora de legare la antigen care leagă în mod specific CD3 şi MUC16, aşa cum este definit în revendicări.. Astfel de molecule pot fi denumite aici, de exemplu, "anti-CD3/anti-MUC16" sau "anti-CD3xMUC16" sau "CD3xMUC16" molecule bispecifice, sau altă terminologie similară (de exemplu, anti-MUC16/anti-CD3). Aici sunt descrise molecule bispecifice de legare a antigenului construite cu un prim braţ de legare a antigenului care leagă MUC16 şi un al doilea braţ de legare a antigenului care leagă CD3. În unele cazuri, braţul anti-CD3 cuprinde un lanţ greu derivat din IGHV3-9*01, IGHJ6*02, IGHD5-12*01. ln altele cazuri, molecula bispecifică de legare a antigenului activează celulele PBMC umane şi/sau induce activitate citotoxică pe liniile celulare care exprimă antigenul tumoral.
Termenul "MUC16", aşa cum este utilizat aici, se referă la proteina MUC16 umană, cu excepţia cazului în care este specificat ca fiind dintr-o specie non-umană (de exemplu, "şoarece MUC16", "maimuţă MUC16" etc.). Proteina MUC16 umană are secvenţa de aminoacizi prezentată în SEQ ID NO: 1899.
Moleculele bispecifice de legare la antigen menţionate mai sus care leagă în mod specific CD3 şi MUC16 pot cuprinde o moleculă de legare a antigenului anti-CD3 care se leagă la CD3 cu o afinitate de legare slabă, cum ar fi prezentând un KD mai mare de aproximativ 40 nM, măsurat printr-o afinitate in vitro test de legare. Moleculele bispecifice de legare a antigenului menţionate mai sus pot cuprinde o moleculă de legare a antigenului anti-CD3 care se leagă la CD3 şi prezintă o EC50 mai mare de aproximativ 100 nM, măsurată printr-un test de titrare FACS. Moleculele bispecifice de legare a antigenului menţionate mai sus pot cuprinde o moleculă de legare a antigenului anti-CD3 care nu prezintă nicio legare măsurabilă sau observabilă la CD3, măsurată printr-un test de legare a afinităţii in vitro sau un test de titrare FACS, dar păstrează capacitatea de a activa celulele PBMC umane. şi/sau induce activitate citotoxică pe liniile celulare care exprimă antigenul tumoral.
Aşa cum este utilizată aici, expresia „moleculă de legare la antigen» înseamnă o proteină, polipeptidă sau complex molecular care cuprinde sau constă din cel puţin o regiune determinantă a complementarităţii (CDR) care singură sau în combinaţie cu unul sau mai multe CDR şi/sau regiuni cadru suplimentare. (FRs), se leagă în mod specific la un anumit antigen. în anumite variante de realizare, o moleculă de legare a antigenului este un anticorp sau un fragment al unui anticorp, aşa cum aceşti termeni sunt definiţi în altă parte aici.
Aşa cum este utilizată aici, expresia "moleculă bispecifică de legare a antigenului" înseamnă o proteină, polipeptidă sau complex molecular care cuprinde cel puţin un prim domeniu de legare a antigenului şi un al doilea domeniu de legare a antigenului. Fiecare domeniu de legare a antigenului din molecula bispecifică de legare a antigenului cuprinde cel puţin un CDR care singur, sau în combinaţie cu unul sau mai multe CDR-uri şi/sau FR-uri suplimentare, se leagă în mod specific la un anumit antigen. În contextul prezentei invenţii, primul domeniu de legare la antigen se leagă în mod specific la un prim antigen (de exemplu, CD3), iar al doilea domeniu de legare la antigen se leagă în mod specific la un al doilea antigen distinct (de exemplu, MUC16).
În prezenta invenţie, molecula bispecifică de legare la antigen este un anticorp bispecific sau un fragment de legare la antigen al acestuia, aşa cum este definit în revendicări. Fiecare domeniu de legare la antigen al unui anticorp bispecific cuprinde un domeniu variabil al lanţului greu (HCVR) şi un domeniu variabil al lanţului uşor (LCVR). În contextul unei molecule bispecifice de legare la antigen care cuprinde un prim şi un al doilea domeniu de legare la antigen (de exemplu, un anticorp bispecific), CDR-urile primului domeniu de legare la antigen pot fi desemnate cu prefixul „A1» şi CDR-urile de al doilea domeniu de legare la antigen poate fi desemnat cu prefixul "A2". Astfel, CDR-urile primului domeniu de legare la antigen pot fi denumite aici A1-HCDR1, A1-HCDR2 şi A1-HCDR3; şi CDR-urile celui de-al doilea domeniu de legare la antigen pot fi denumite aici A2-HCDR1, A2-HCDR2 şi A2-HCDR3.
Primul domeniu de legare a antigenului şi al doilea domeniu de legare a antigenului pot fi conectate direct sau indirect unul la altul pentru a forma o moleculă bispecifică de legare a antigenului. Alternativ, primul domeniu de legare a antigenului şi al doilea domeniu de legare a antigenului pot fi fiecare conectat la un domeniu de multimerizare separat. Asocierea unui domeniu de multimerizare cu un alt domeniu de multimerizare facilitează asocierea dintre cele două domenii de legare a antigenului, formând astfel o moleculă bispecifică de legare a antigenului. După cum este utilizat aici, un "domeniu de multimerizare" este orice macromoleculă, proteină, polipeptidă, peptidă sau aminoacid care are capacitatea de a se asocia cu un al doilea domeniu de multimerizare cu aceeaşi structură sau constituţie sau similară. De exemplu, un domeniu de multimerizare poate fi o polipeptidă cuprinzând un domeniu al imunoglobulinei CH3. Un exemplu nelimitativ de componentă de multimerizare este o porţiune Fc a unei imunoglobuline (cuprinzând un domeniu CH2-CH3), de exemplu, un domeniu Fc al unei IgG selectate dintre izotipurile lgG1, lgG2, lgG3 şi lgG4, precum şi orice alotip în cadrul fiecărui grup de izotip.
Moleculele bispecifice de legare a antigenului vor cuprinde în mod tipic două domenii de multimerizare, de exemplu, două domenii Fc care sunt fiecare parte individual a unui lanţ greu de anticorp separat. Primul şi al doilea domeniu de multimerizare pot fi de acelaşi izotip IgG, cum ar fi, de exemplu, lgG1/lgG1, lgG2/lgG2, lgG4/lgG4. Alternativ, primul şi al doilea domeniu de multimerizare pot fi de izotipuri IgG diferite, cum ar fi, de exemplu, lgG1/lgG2, lgG1/lgG4, lgG2/lgG4 etc.
În anumite cazuri, domeniul de multimerizare este un fragment Fc sau o secvenţă de aminoacizi cu lungime de la 1 până la aproximativ 200 de aminoacizi care conţine cel puţin un rest de cisteină. În alte cazuri, domeniul de multimerizare este un rest de cisteină sau o peptidă scurtă care conţine cisteină. Alte domenii de multimerizare includ peptide sau polipeptide care cuprind sau constau dintr-un fermoar de leucină, un motiv cu buclă helix sau un motiv cu bobină încolăcită.
Orice format sau tehnologie de anticorp bispecific poate fi utilizat pentru a produce moleculele bispecifice de legare la antigen descrise aici. De exemplu, un anticorp sau fragment al acestuia având o primă specificitate de legare la antigen poate fi legat funcţional (de exemplu, prin cuplare chimică, fuziune genetică, asociere necovalentă sau altfel) la una sau mai multe alte entităţi moleculare, cum ar fi un alt anticorp sau fragment de anticorp având o a doua specificitate de legare a antigenului pentru a produce o moleculă bispecifică de legare a antigenului. Formatele bispecifice exemplificative specifice care pot fi utilizate includ, fără limitare, de exemplu, formate bispecifice bazate pe scFv sau diabody, fuziuni IgG-scFv, domeniu dublu variabil (DVD)-lg, Quadroma, butoane-în- găuri, lanţ uşor comun (de exemplu, lanţ uşor comun cu butoane în găuri etc.), CrossMab, CrossFab, corp (SEED), fermoar cu leucină, Duobody, lgG1/lgG2, Fab cu dublă acţiune (DAF)-lgG şi Formate specifice Mab2bi (a se vedea, de exemplu, Klein et al. 2012, mAbs 4:6, 1-11, şi referinţele citate aici, pentru o revizuire a formatelor de mai sus).
Domeniile de multimerizare, de exemplu, domeniile Fc, pot cuprinde una sau mai multe modificări de aminoacizi (de exemplu, inserţii, deleţii sau substituţii) în comparaţie cu cele de tip sălbatic, care apar în mod natural. versiunea domeniului Fc. De exemplu, molecule bispecifice de legare a antigenului cuprinzând una sau mai multe modificări în domeniul Fc care are ca rezultat un domeniu Fc modificat având o interacţiune de legare modificată (de exemplu, îmbunătăţită sau diminuată) între Fc şi FcRn. De exemplu, molecula bispecifică de legare a antigenului cuprinde o modificare într-o regiune CH2 sau CH3, în care modificarea creşte afinitatea domeniului Fc pentru FcRn într-un mediu acid (de exemplu, într-un endozom în care pH-ul variază de la aproximativ 5,5 la aproximativ 6,0). Exemple nelimitative de astfel de modificări Fc includ, de exemplu, o modificare la poziţia 250 (de exemplu, E sau Q); 250 şi 428 (de exemplu, L sau F); 252 (de exemplu, L/Y/F/W sau T), 254 (de exemplu, S sau T) şi 256 (de exemplu, S/R/Q/E/D sau T); sau o modificare la poziţia 428 şi/sau 433 (de exemplu, L/R/S/P/Q sau K) şi/sau 434 (de exemplu, H/F sau Y); sau o modificare la poziţia 250 şi/sau 428; sau o modificare la poziţia 307 sau 308 (de exemplu, 308F, V308F) şi 434. De exemplu, modificarea cuprinde o modificare 428L (de exemplu, M428L) şi 434S (de exemplu, N434S); o modificare 428L, 259I (de exemplu, V259I) şi 308F (de exemplu, V308F); o modificare 433K (de exemplu, H433K) şi o modificare 434 (de exemplu, 434Y); o modificare 252, 254 şi 256 (de exemplu, 252Y, 254T şi 256E); o modificare 250Q şi 428L (de exemplu, T250Q şi M428L); şi o modificare 307 şi/sau 308 (de exemplu, 308F sau 308P).
De asemenea aici sunt descrise molecule bispecifice de legare a antigenului cuprinzând un prim domeniu CH3 şi un al doilea domeniu Ig CH3, în care primul şi al doilea domeniu Ig CH3 diferă unul de celălalt prin cel puţin un aminoacid şi în care cel puţin o diferenţă de aminoacid reduce legarea anticorpului bispecific la proteina A în comparaţie cu un anticorp bispecific lipsit de diferenţa de aminoacizi. De exemplu, primul domeniu Ig CH3 se leagă la proteina A, iar al doilea domeniu Ig CH3 conţine o mutaţie care reduce sau elimină legarea proteinei A, cum ar fi o modificare H95R (prin numerotarea exonului IMGT; H435R prin numerotarea EU). Al doilea CH3 poate cuprinde în plus o modificare Y96F (prin IMGT; Y436F de către EU). A se vedea, de exemplu, brevetul SUA nr. 8,586,713. Alte modificări care pot fi găsite în al doilea CH3 includ: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M şi V82I (de IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M şi V422I de EU) în cazul anticorpilor lg1; N44S, K52N şi V82I (IMGT; N384S, K392N şi V422I de către UE) în cazul anticorpilor lgG2; şi Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q şi V82I (de IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q şi V422I de UE) în cazul anticorpilor lgG4.
În anumite cazuri, domeniul Fc poate fi himeric, combinând secvenţe Fc derivate din mai mult de un izotip de imunoglobulină. De exemplu, un domeniu Fc himeric poate cuprinde o parte sau întreaga secvenţă CH2 derivată dintr-o regiune CH2 umană lgG1, lgG2 umană sau lgG4 umană şi o parte sau toată secvenţa CH3 derivată dintr-o lgG1 umană, lgG2 umană sau lgG4 umană. Un domeniu Fc himeric poate conţine, de asemenea, o regiune balama himeric. De exemplu, o balama himerică poate cuprinde o secvenţă de „balama superioară», derivată dintr-un lgG1 uman, un lgG2 uman sau o regiune balama lgG4 umană, combinată cu o secvenţă „balama inferioară», derivată dintr-un lgG1 uman, un lgG2 uman sau o regiune balama lgG4 umană. Un exemplu particular de domeniu Fc himeric care poate fi inclus în oricare dintre moleculele de legare la antigen prezentate aici cuprinde, de la N- la C-terminal: [lgG4 CH1] - [balama superioară lgG4] - [balama inferioară lgG2] - [lgG4 CH2] - [lgG4 CH3]. Un alt exemplu de domeniu himeric Fc care poate fi inclus în oricare dintre moleculele de legare la antigen prezentate aici cuprinde, de la N- la C-terminal: [lgG1 CH1] - [balama superioară lgG1] - [balama inferioară lgG2] - [ lgG4 CH2] - [lgG1 CH3]. Acestea şi alte exemple de domenii Fc himerice care pot fi incluse în oricare dintre moleculele de legare a antigenului sunt descrise în Publicaţia SUA 2014/0243504, publicată la 28 august 2014. Domeniile Fc himerice având aceste aranjamente structurale generale şi variante ale acestora pot avea legarea modificată la receptorul Fc, care la rândul său afectează funcţia efector Fc.
În anumite cazuri, invenţia furnizează un lanţ greu de anticorp în care regiunea constantă a lanţului greu (CH) cuprinde o secvenţă de aminoacizi cel puţin 95%, cel puţin 96%, cel puţin 97%, cel puţin 98%, cel puţin 99% identic cu oricare dintre SEQ ID NO: 1911, SEQ ID NO: 1912, SEQ ID NO: 1913, SEQ ID NO: 1914, SEQ ID NO: 1915, SEQ ID NO: 1916, SEQ ID NO: 1917, SEQ ID NO: 1918, SEQ ID NO: 1919 sau SEQ ID NO: 1920. În unele cazuri, regiunea constantă a lanţului greu (CH) cuprinde o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SEQ ID NO: 1911, SEQ ID NO: 1912, SEQ ID NO: 1913, SEQ ID NO: 1914, SEQ ID NO: 1914 NR: 1915, SEQ ID NO: 1916, SEQ ID NO: 1917, SEQ ID NO: 1918, SEQ ID NO: 1919 şi SEQ ID NO: 1920.
De asemenea, aici, este descris un lanţ greu de anticorp în care domeniul Fc cuprinde o secvenţă de aminoacizi cel puţin 95%, cel puţin 96%, cel puţin 97%, cel puţin 98%, cel puţin 99% identică cu oricare dintre SECV. ID SECV NR: 1921, SEQ ID NO: 1922, SEQ ID NO: 1923 SEQ ID NO: 1924 SEQ ID NO: 1925, SEQ ID NO: 1926, SEQ ID NO: 1927, SEQ ID NO: 1928, SEQ ID NO: 1929 sau SEQ ID NO: 1930. În unele cazuri, domeniul Fc cuprinde o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SEQ ID NO: 1921, SEQ ID NO: 1922, SEQ ID NO: 1923 SEQ ID NO: 1924 SEQ ID NO: 1925, SEQ ID NO: 1926, SEQ ID NO: 1927, SEQ ID NO: 1928, SEQ ID NO: 1929 şi SEQ ID NO: 1930.
Variante de secvenţă
Anticorpii conform invenţiei sunt definiţi prin revendicări. Alţi anticorpi sunt, de asemenea, descrişi aici. Anticorpii şi moleculele bispecifice de legare a antigenului din prezenta invenţie pot cuprinde una sau mai multe substituţii de aminoacizi, inserţii şi/sau deleţii în cadrul şi/sau regiunile CDR ale domeniilor variabile ale lanţului greu şi uşor în comparaţie cu secvenţele corespunzătoare ale liniei germinale din din care au fost derivate domeniile individuale de legare a antigenului. Astfel de mutaţii pot fi constatate cu uşurinţă prin compararea secvenţelor de aminoacizi dezvăluite aici cu secvenţele liniei germinale disponibile, de exemplu, din bazele de date publice de secvenţe de anticorpi. Moleculele de legare a antigenului pot cuprinde domenii de legare a antigenului care sunt derivate din oricare dintre secvenţele de aminoacizi exemplificative descrise aici, în care unul sau mai mulţi aminoacizi dintr-unul sau mai multe regiuni cadru şi/sau CDR sunt mutate la cele corespunzătoare. reziduu(i) al secvenţei de linie germinală din care a derivat anticorpul sau la restul (reziduurile) corespunzătoare ale altei secvenţe de linie germinală umană sau la o substituţie conservativă a aminoacizilor a restului (reziduurilor) corespunzătoare din linia germinativă (se referă la astfel de modificări de secvenţă denumite aici în mod colectiv „mutaţii ale liniei germinale»). O persoană cu calificare obişnuită în domeniu, începând cu secvenţele de regiune variabilă a lanţului greu şi uşor descrise aici, poate produce cu uşurinţă numeroşi anticorpi şi fragmente de legare la antigen care cuprind una sau mai multe mutaţii individuale ale liniei germinale sau combinaţii ale acestora. În anumite cazuri, toate resturile cadru şi/sau CDR din domeniile VH şi/sau VL sunt mutate înapoi la resturile găsite în secvenţa originală a liniei germinale din care a fost derivat iniţial domeniul de legare a antigenului. În alte cazuri, numai anumite reziduuri sunt mutate înapoi la secvenţa originală a liniei germinale, de exemplu, numai resturile mutante găsite în primii 8 aminoacizi ai FR1 sau în ultimii 8 aminoacizi ai FR4, sau numai resturile mutante găsite în CDR1, CDR2 sau CDR3. În alte cazuri, unul sau mai multe dintre resturile cadru şi/sau CDR sunt mutate în restul (residuurile) corespunzătoare ale unei secvenţe de linie germinală diferită (adică, o secvenţă de linie germinală care este diferită de secvenţa de linie germinală din care antigenul- domeniul de legare a fost derivat iniţial). În plus, domeniile de legare la antigen pot conţine orice combinaţie de două sau mai multe mutaţii ale liniei germinale în cadrul regiunilor cadru şi/sau CDR, de exemplu, în care anumite resturi individuale sunt mutate la restul corespunzător al unei anumite secvenţe de linie germinală, în timp ce anumite alte resturi care diferă de secvenţa originală a liniei germinale sunt menţinute sau sunt mutate la reziduul corespunzător al unei secvenţe de linie germinală diferită. Odată obţinute, domeniile de legare a antigenului care conţin una sau mai multe mutaţii ale liniei germinale pot fi testate cu uşurinţă pentru una sau mai multe proprietăţi dorite, cum ar fi specificitatea de legare îmbunătăţită, afinitatea de legare sau de legare crescută, proprietăţi biologice antagoniste sau agoniste îmbunătăţite sau îmbunătăţite (după caz poate fi), imunogenitate redusă etc..
De asemenea sunt descrise aici, molecule de legare la antigen în care unul sau ambele domenii de legare la antigen cuprind variante ale oricăreia dintre secvenţele de aminoacizi HCVR, LCVR şi/sau CDR descrise aici având una sau mai multe substituţii conservatoare. De exemplu, molecule de legare la antigen care cuprind un domeniu de legare la antigen având secvenţe de aminoacizi HCVR, LCVR şi/sau CDR cu, de exemplu, 10 sau mai puţine, 8 sau mai puţine, 6 sau mai puţine, 4 sau mai puţine etc. substituţii conservatoare de aminoacizi în raport cu oricare dintre secvenţele de aminoacizi HCVR, LCVR şi/sau CDR descrise aici. O „substituţie conservatoare de aminoacid» este una în care un rest de aminoacid este substituit cu un alt rest de aminoacid având o catenă laterală (grupare R) cu proprietăţi chimice similare (de exemplu, sarcină sau hidrofobicitate). În general, o substituţie conservatoare a aminoacizilor nu va schimba substanţial proprietăţile funcţionale ale unei proteine. Exemple de grupuri de aminoacizi care au catene laterale cu proprietăţi chimice similare includ (1) catene laterale alifatice: glicină, alanină, valină, leucină şi izoleucină; (2) catene laterale alifatic-hidroxil: serină şi treonină; (3) lanţuri laterale care conţin amidă: asparagină şi glutamina; (4) lanţuri laterale aromatice: fenilalanină, tirozină şi triptofan; (5) lanţuri laterale de bază: lizină, arginină şi histidină; (6) lanţuri laterale acide: aspartat şi glutamat şi (7) lanţuri laterale care conţin sulf sunt cisteină şi metionină. Grupările de substituţie de aminoacizi conservatoare preferate sunt: valină-leucină-izoleucină, fenilalanină-tirozină, lizină-arginină, alanină-valină, glutamat-aspartat şi asparagină-glutamina. Alternativ, o înlocuire conservatoare este orice modificare care are o valoare pozitivă în matricea log-probabilităţii PAM250 dezvăluită în Gonnet ei al. (1992) Science 256: 1443-1445. O înlocuire „moderat conservatoare» este orice modificare care are o valoare nenegativă în matricea log-probabilităţii PAM250.
De asemenea, sunt descrise, aici, molecule de legare la antigen cuprinzând un domeniu de legare la antigen cu o secvenţă de aminoacizi HCVR, LCVR şi/sau CDR care este substanţial identică cu oricare dintre secvenţele de aminoacizi HCVR, LCVR şi/sau CDR descrise aici. Termenul „identitate substanţială» sau „substanţial identic», atunci când se referă la o secvenţă de aminoacizi, înseamnă că două secvenţe de aminoacizi, atunci când sunt aliniate optim, cum ar fi prin programele GAP sau BESTFIT, folosind ponderi implicite ale intervalului, împărtăşesc o identitate de secvenţă de cel puţin 95% , chiar mai preferabil cel puţin 98% sau 99% identitate de secvenţă. De preferinţă, poziţiile resturilor care nu sunt identice diferă prin substituţii conservatoare de aminoacizi. În cazurile în care două sau mai multe secvenţe de aminoacizi diferă una de cealaltă prin substituţii conservatoare, identitatea secvenţei procentuale sau gradul de similaritate poate fi ajustat în sus pentru a corecta natura conservatoare a substituţiei. Mijloacele pentru realizarea acestei ajustări sunt binecunoscute specialiştilor în domeniu. Vezi, de exemplu, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331.
Asemănarea secvenţei pentru polipeptide, la care se face referire şi ca identitate de secvenţă, este măsurată în mod obişnuit folosind software-ul de analiză a secvenţei. Software-ul de analiză a proteinelor potriveşte secvenţe similare folosind măsuri de similitudine atribuite diferitelor substituţii, deleţii şi alte modificări, inclusiv substituţii conservatoare de aminoacizi. De exemplu, software-ul GCG conţine programe precum Gap şi Bestfit care pot fi utilizate cu parametrii impliciti pentru a determina omologia secvenţei sau identitatea secvenţei între polipeptide strâns legate, cum ar fi polipeptide omoloage din diferite specii de organisme sau între o proteină de tip sălbatic şi o muteină a acesteia. . Vezi, de exemplu, GCG Versiunea 6.1. Secvenţele de polipeptide pot fi, de asemenea, comparate folosind FASTA utilizând parametrii impliciti sau recomandaţi, un program din GCG Versiunea 6.1. FASTA (de exemplu, FASTA2 şi FASTA3) furnizează aliniamente şi identitate de secvenţă procentuală a regiunilor cu cea mai bună suprapunere între secvenţele de interogare şi de căutare (Pearson (2000) supra). Un alt algoritm preferat atunci când se compară o secvenţă cu o bază de date care conţine un număr mare de secvenţe din diferite organisme este programul de calculator BLAST, în special BLASTP sau TBLASTN, folosind parametrii impliciti. Vezi, de exemplu, Altschul et al. ( 1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 şi Altschul şi colab. ( 1997) Acizi nucleici Res. 25:3389-402.
Legare dependentă de pH
Aici sunt descrişi anticorpi anti-MUC16 şi molecule bispecifice de legare la antigen anti-CD3/anti-MUC16, cu caracteristici de legare dependente de pH. De exemplu, un anticorp anti-MUC16 poate prezenta legare redusă la MUC16 la pH acid în comparaţie cu pH neutru. Alternativ, anticorpii anti-MUC16 pot prezenta legare sporită la MUC16 la pH acid în comparaţie cu pH neutru. Expresia „pH acid» include valori ale pH-ului mai mici de aproximativ 6,2, de exemplu, aproximativ 6,0, 5,95, 5,9, 5,85, 5,8, 5,75, 5,7, 5,65, 5,6, 5,55, 5,5, 5,45, 5,5, 5,3, 5,5, 5,3 , 5.2, 5.15, 5.1, 5.05, 5.0 sau mai puţin. Aşa cum este utilizată aici, expresia "pH neutru" înseamnă un pH de aproximativ 7,0 până la aproximativ 7,4. Expresia „pH neutru» include valori ale pH-ului de aproximativ 7,0, 7,05, 7,1, 7,15, 7,2, 7,25, 7,3, 7,35 şi 7,4.
În anumite cazuri, „legare redusă... la pH acid în comparaţie cu pH neutru» este exprimată în termeni de raport dintre valoarea KD a anticorpului care se leagă la antigenul său la pH acid şi valoarea KD a anticorpului care se leagă la antigenul său la pH neutru (sau invers). De exemplu, un anticorp sau un fragment al acestuia de legare la antigen poate fi considerat ca prezentând „legare redusă la MUC16 la pH acid în comparaţie cu pH neutru» dacă anticorpul sau fragmentul de legare la antigen al acestuia prezintă un raport KD acid/neutru de aproximativ 3,0 sau mai mare. În anumite cazuri, raportul KD acid/neutru pentru un anticorp sau un fragment de legare la antigen poate fi aproximativ 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,0, 8,0, 8,0. , 9,5, 10,0, 10,5, 11,0, 11,5, 12,0, 12,5, 13,0, 13,5, 14,0, 14,5, 15,0, 20,0. 25.0, 30.0, 40.0, 50.0, 60.0, 70.0, 100.0 sau mai mare.
Anticorpii cu caracteristici de legare dependente de pH pot fi obţinuţi, de exemplu, prin screening-ul unei populaţii de anticorpi pentru legarea redusă (sau îmbunătăţită) la un anumit antigen la pH acid în comparaţie cu pH neutru. În plus, modificările domeniului de legare a antigenului la nivelul aminoacizilor pot produce anticorpi cu caracteristici dependente de pH. De exemplu, prin substituirea unuia sau mai multor aminoacizi ai unui domeniu de legare la antigen (de exemplu, într-un CDR) cu un rest de histidină, se poate obţine un anticorp cu legare de antigen redusă la pH acid relativ la pH neutru.
Anticorpi cuprinzând variante Fc
Anticorpii anti-MUC16 şi moleculele bispecifice de legare la antigen anti-CD3/anti-MUC16 sunt descrişi aici cuprinzând un domeniu Fc care cuprinde una sau mai multe mutaţii care sporesc sau diminuează legarea anticorpului la receptorul FcRn, de exemplu, la pH acid în comparaţie cu pH neutru. De exemplu, anticorpi care cuprind o mutaţie în regiunea CH2 sau CH3 a domeniului Fc, în care mutaţia (mutaţiile) măresc afinitatea domeniului Fc pentru FcRn într-un mediu acid (de exemplu, într-un endozom în care pH-ul) variază de la aproximativ 5,5 până la aproximativ 6,0). Astfel de mutaţii pot duce la o creştere a timpului de înjumătăţire plasmatică a anticorpului atunci când este administrat unui animal. Exemple nelimitative de astfel de modificări Fc includ, de exemplu, o modificare la poziţia 250 (de exemplu, E sau Q); 250 şi 428 (de exemplu, L sau F); 252 (de exemplu, UY/F/W sau T), 254 (de exemplu, S sau T) şi 256 (de exemplu, S/R/Q/E/D sau T); sau o modificare la poziţia 428 şi/sau 433 (de exemplu, H/L/R/S/P/Q sau K) şi/sau 434 {de exemplu, H/F sau Y); sau o modificare la poziţia 250 şi/sau 428; sau o modificare la poziţia 307 sau 308 (de exemplu, 308F, V308F) şi 434. De exemplu, modificarea cuprinde o modificare 428L (de exemplu, M428L) şi 434S (de exemplu, N434S); o modificare 428L, 259I (de exemplu, V259I) şi 308F (de exemplu, V308F); o modificare 433K (de exemplu, H433K) şi o modificare 434 (de exemplu, 434Y); o modificare 252, 254 şi 256 (de exemplu, 252Y, 254T şi 256E); o modificare 250Q şi 428L (de exemplu, T250Q şi M428L); şi o modificare 307 şi/sau 308 (de exemplu, 308F sau 308P).
De exemplu, anticorpi anti-MUC16 şi molecule bispecifice de legare la antigen anti-CD3/anti-MUC16, cuprinzând un domeniu Fc care cuprinde una sau mai multe perechi sau grupuri de mutaţii selectate din grupul constând din: 250Q şi 248L ( de exemplu, T250Q şi M248L); 252Y, 254T şi 256E (de exemplu, M252Y, S254T şi T256E); 428L şi 434S (de exemplu, M428L şi N434S); şi 433K şi 434F (de exemplu, H433K şi N434F). Toate combinaţiile posibile ale mutaţiilor domeniului Fc de mai sus, şi alte mutaţii din domeniile variabile ale anticorpului dezvăluite aici, sunt avute în vedere.
Caracteristicile biologice ale anticorpilor şi moleculelor bispecifice de legare la antigen
Aici sunt descrişi anticorpi şi fragmente ale acestora de legare la antigen care leagă MUC16 uman cu afinitate mare (de exemplu, valori KD subnanomolare).
Conform anumitor cazuri, prezenta dezvăluire include anticorpi şi fragmente de anticorpi care leagă antigenul care leagă MUC16 uman (de exemplu, la 25°C) cu un KDof mai mic de aproximativ 60 nM măsurat prin rezonanţa plasmonului de suprafaţă, de exemplu, folosind un format de analiză aşa cum este definit în Exemplul 4 de aici. În anumite cazuri, anticorpii sau fragmentele de legare la antigen din prezenta dezvăluire leagă MUC16 cu un KD mai mic de aproximativ 60 nM, mai puţin de aproximativ 40 nM, mai puţin de aproximativ 20 nM, mai puţin de aproximativ 10 nM, mai puţin de aproximativ 8 nM, mai puţin de aproximativ 7 nM, mai puţin de aproximativ 6 nM, mai puţin de aproximativ 5 nM, mai puţin de aproximativ 4 nM, mai puţin de aproximativ 3 nM, mai puţin de aproximativ 2 nM, mai puţin de aproximativ 1 nM, mai puţin de aproximativ 800 pM, mai puţin de aproximativ 800 pM aproximativ 700 pM, mai puţin de aproximativ 500 pM, mai puţin de aproximativ 400 pM sau mai puţin de aproximativ 300 pM, aşa cum se măsoară prin rezonanţa plasmonului de suprafaţă, de exemplu, utilizând un format de analiză aşa cum este definit în exemplul 4 de aici (de exemplu, captarea mAb sau antigen - format de captură), sau un test substanţial similar. Prezenta invenţie include molecule bispecifice de legare a antigenului (de exemplu, anticorpi bispecifici care leagă MUC16 cu un KDof mai mic de aproximativ 7 nM, măsurat prin rezonanţa plasmonului de suprafaţă, de exemplu, folosind un format de analiză aşa cum este definit în exemplul 4 de aici (de exemplu, format mAb- de captură sau de captare a antigenului), sau un test substanţial similar.
Prezenta dezvăluire include, de asemenea, anticorpi şi fragmente ale acestora de legare la antigen care leagă MUC16 cu un timp de înjumătăţire disociativ (t1⁄2) mai mare de aproximativ 10 minute sau mai mare de aproximativ 125 de minute, măsurat prin rezonanţa plasmonului de suprafaţă la 25°C, de exemplu, folosind un format de analiză aşa cum este definit în Exemplul 4 de aici, sau un test substanţial similar. În anumite cazuri, anticorpii sau fragmentele de legare la antigen leagă MUC16 cu un t1⁄2 mai mare de aproximativ 10 minute, mai mare de aproximativ 20 de minute, mai mare de aproximativ 30 de minute, mai mare de aproximativ 40 de minute, mai mare de aproximativ 50 de minute. , mai mare de aproximativ 60 de minute, mai mare de aproximativ 70 de minute, mai mare de aproximativ 80 de minute, mai mare de aproximativ 90 de minute, mai mare de aproximativ 100 de minute, mai mare de aproximativ 110 minute sau mai mare de aproximativ 120 de minute, măsurată prin rezonanţa plasmonului de suprafaţă la 25°C, de exemplu, folosind un format de analiză aşa cum este definit în Exemplul 4 de aici (de exemplu, format de captare mAb sau de captare a antigenului), sau un test substanţial similar. Prezenta dezvăluire include molecule bispecifice de legare a antigenului (de exemplu, anticorpi bispecifici care se leagă la MUC16 cu o valoare mai mare de aproximativ 10 minute sau mai mare de aproximativ 20 de minute, măsurată prin rezonanţa plasmonului de suprafaţă la 25°C, de exemplu, utilizând un format de analiză aşa cum este definit în Exemplul 4 de aici, sau un test substanţial similar.
Prezenta dezvăluire include, de asemenea, anticorpi şi fragmente ale acestora de legare la antigen care se leagă în mod specific la liniile celulare umane care exprimă MUC16 endogen (de exemplu, OVCAR-3), aşa cum s-a determinat printr-un test de detecţie bazat pe electrochimioluminiscenţă, aşa cum este prezentat în Exemplul 2 sau un test substanţial similar.
Prezenta dezvăluire include, de asemenea, molecule bispecifice de legare la antigen anti-CD3/anti-MUC16 care prezintă una sau mai multe caracteristici selectate din grupul constând din: (a) inhibarea creşterii tumorii la şoarecii imunocompromişi purtători de xenogrefe de cancer ovarian uman; şi (b); suprimarea creşterii tumorale a tumorilor stabilite la şoarecii imunocompromişi purtători de xenogrefe de cancer ovarian uman (vezi, de exemplu, Exemplul 8).
Prezenta dezvăluire include anticorpi şi fragmente ale acestora de legare la antigen care leagă CD3 uman cu afinitate mare. Prezenta dezvăluire include, de asemenea, anticorpi şi fragmente ale acestora de legare la antigen care leagă CD3 uman cu afinitate medie sau scăzută, în funcţie de contextul terapeutic şi de proprietăţile particulare de ţintire care sunt dorite. În unele cazuri, afinitatea scăzută include anticorpi care leagă CD3 cu un KD sau EC50 (de exemplu, măsurat într-un test de rezonanţă cu plasmoni de suprafaţă) mai mare de 300 nM, mai mare de 500 nM sau mai mare de 1 μM. Prezenta dezvăluire include, de asemenea, anticorpi şi fragmente ale acestora de legare la antigen care leagă CD3 uman fără afinitate măsurabilă. De exemplu, în contextul unei molecule bispecifice de legare a antigenului, în care un braţ leagă CD3 şi un alt braţ leagă un antigen ţintă (de exemplu, MUC16), poate fi de dorit ca braţul de legare a antigenului ţintă să lege antigenul ţintă cu afinitate în timp ce braţul anti-CD3 leagă CD3 doar cu afinitate moderată sau scăzută sau fără afinitate. În acest mod, ţintirea preferenţială a moleculei de legare a antigenului către celulele care exprimă antigenul ţintă poate fi realizată în acelaşi timp evitând legarea CD3 generală/neţintită şi efectele secundare adverse consecvente asociate cu aceasta.
Prezenta dezvăluire include molecule bispecifice de legare la antigen (de exemplu, anticorpi bispecifici) care sunt capabile să se lege simultan la CD3 uman şi la un MUC16 uman. Braţul de legare care interacţionează cu celulele care exprimă CD3 poate avea o legare slabă până la deloc detectabilă, aşa cum este măsurată într-un test adecvat de legare in vitro. Măsura în care o moleculă bispecifică de legare a antigenului leagă celulele care exprimă CD3 şi/sau MUC16 poate fi evaluată prin sortarea celulelor activate prin fluorescenţă (FACS), aşa cum este ilustrat în Exemplul 5 de aici.
De exemplu, prezenta invenţie include anticorpi, fragmente de legare la antigen şi anticorpi bispecifici ai acestora care leagă în mod specific liniile de celule T umane care exprimă CD3, dar nu exprimă MUC16 (de exemplu, Jurkat), celule T de primate (de exemplu, sânge periferic cynomolgus). celule mononucleare [PBMC]) şi/sau celule care exprimă MUC16.
Prezenta dezvăluire include anticorpi, fragmente de legare la antigen şi anticorpi bispecifici ai acestora care leagă CD3 uman cu legare sau afinitate de legare slabă (adică scăzută) sau chiar inexistentă.
Prezenta dezvăluire include anticorpi, fragmente de legare la antigen şi anticorpi bispecifici ai acestora care leagă CD3 de maimuţă (adică cynomolgus) cu legare sau afinitate de legare slabă (adică scăzută) sau chiar inexistentă.
Prezenta dezvăluire include anticorpi, fragmente de legare la antigen şi anticorpi bispecifici ai acestora care leagă CD3 uman şi induc activarea celulelor T.
Prezenta dezvăluire include molecule bispecifice de legare a antigenului anti-CD3/anti-MUC16 care sunt capabile să epuizeze celulele care exprimă antigenul tumoral la un subiect (vezi, de exemplu, Exemplul 8, într-un test imagistic bioluminiscent, sau un test substanţial similar). De exemplu, în conformitate cu anumite cazuri, sunt furnizate molecule bispecifice de legare a antigenului anti-CD3/anti-MUC16, în care o singură administrare a 10 μg de moleculă bispecifică de legare a antigenului la un subiect determină o reducere a numărului de exprimă MUC16 celule la subiect (de exemplu, creşterea tumorii la subiect este suprimată sau inhibată). Dacă nu se indică altfel, strălucirea bioluminiscentă se referă la [p/s/cm22/sr].
Prezenta dezvăluire include, de asemenea, conjugaţi de medicament cu anticorpi anti-MUC16 care inhibă creşterea tumorii în modele in vivo de xenogrefă de cancer ovarian MUC16 pozitiv (vezi, de exemplu, Exemplul 10, într-un test imagistic bioluminiscent, sau un test substanţial similar). În anumite cazuri, conjugaţi de medicament cu anticorpi anti-MUC16 cu Compusul 7 în care patru doze o dată pe săptămână administrate la o doză de 85 µg/kg inhibă creşterea intraperitoneală a tumorii OVCAR3/luc in vivo. În anumite cazuri, sunt furnizaţi conjugaţi de medicament cu anticorpi anti-MUC16 cu Compusul 7 în care patru doze o dată pe săptămână administrate la o doză de 85 μg/kg inhibă administrarea subcutanată.
Creşterea tumorii OVCAR3/luc in vivo. În anumite cazuri, sunt furnizaţi conjugaţi de medicament cu anticorpi anti-MUC16 cu Compusul 10 în care o singură doză la o doză de 85 μg/kg, 170 μg/kg sau 340 μg/kg inhibă creşterea tumorii OVCAR3/luc intraperitoneală in vivo. Dacă nu se indică altfel, strălucirea bioluminiscentă se referă la [p/s/cm22/sr].
Prezenta deszvăluire include, de asemenea, molecule bispecifice de legare la antigen anti-CD3/anti-MUC16 care prezintă profiluri farmacocinetice la şoareci MUC16 x CD3 umanizaţi (şoareci homozigoţi pentru expresia MUC16 şi CD3 umane, MUC16hu/hu x CD3hu/hu), şoareci umanizaţi CD3 (şoareci homozigoţi). pentru expresia CD3 umană, CD3hu hu) şi şoareci de tip sălbatic (WT) potriviţi la tulpină (75% C57BL, 25%129Sv), aşa cum este descris în Exemplul 7 şi prezentat în Figurile 1, 2 şi 3.
Cartografierea epitopilor şi tehnologiile conexe
Epitopul de pe CD3 şi/sau MUC16 la care se leagă moleculele de legare a antigenului poate consta dintr-o singură secvenţă adiacentă de 3 sau mai multe (de exemplu, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 sau mai mulţi) aminoacizi ai unei proteine CD3 sau MUC16. Alternativ, epitopul poate consta dintr-o multitudine de aminoacizi necontigui (sau secvenţe de aminoacizi) ai CD3 sau MUC16. Anticorpii pot interacţiona cu aminoacizii conţinuţi într-un singur lanţ CD3 (de exemplu, CD3-epsilon, CD3-delta sau CD3-gamma) sau pot interacţiona cu aminoacizi pe două sau mai multe lanţuri CD3 diferite. Termenul "epitop", aşa cum este utilizat aici, se referă la un determinant antigenic care interacţionează cu un situs specific de legare a antigenului în regiunea variabilă a unei molecule de anticorp cunoscută ca paratop. Un singur antigen poate avea mai mult de un epitop. Astfel, anticorpi diferiţi se pot lega la diferite zone ale unui antigen şi pot avea efecte biologice diferite. Epitopii pot fi fie conformaţionali, fie liniari. Un epitop conformaţional este produs de aminoacizi juxtapuşi spaţial din diferite segmente ale lanţului polipeptidic linear. Un epitop liniar este unul produs de resturile de aminoacizi adiacente dintr-un lanţ polipeptidic. În anumite circumstanţe, un epitop poate include fragmente de zaharide, grupări fosforil sau grupări sulfonil de pe antigen.
Diferite tehnici cunoscute persoanelor de specialitate în domeniu pot fi utilizate pentru a determina dacă un domeniu de legare la antigen al unui anticorp „interacţionează cu unul sau mai mulţi aminoacizi» dintr-o polipeptidă sau proteină. Tehnicile exemplificative includ, de exemplu, analiza de rutină de blocare încrucişată, cum ar fi cea descrisă Antibodies, Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY), analiza mutaţională cu scanare alaninei, analiza pe peptide (Reineke, 2004, Methods Mol Biol). 248:443-463), şi analiza clivajului peptidic. în plus, pot fi folosite metode precum excizia epitopului, extracţia epitopului şi modificarea chimică a antigenelor (Tomer, 2000, Protein Science 9:487-496). O altă metodă care poate fi utilizată pentru a identifica aminoacizii dintr-o polipeptidă cu care interacţionează un domeniu de legare a antigenului al unui anticorp este schimbul de hidrogen/deuteriu detectat prin spectrometrie de masă. În termeni generali, metoda de schimb hidrogen/deuteriu implică marcarea cu deuteriu a proteinei de interes, urmată de legarea anticorpului de proteina marcată cu deuteriu. Apoi, complexul proteină/anticorp este transferat în apă pentru a permite schimbul hidrogen-deuteriu să aibă loc la toate reziduurile, cu excepţia reziduurilor protejate de anticorp (care rămân marcate cu deuteriu). După disociarea anticorpului, proteina ţintă este supusă scindării cu protează şi analizei spectrometriei de masă, dezvăluind astfel reziduurile marcate cu deuteriu care corespund aminoacizilor specifici cu care interacţionează anticorpul. Vezi, de exemplu, Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; Engen şi Smith (2001) Anal. Chim. 73:256A-265A. Cristalografia cu raze X a complexului antigen/anticorp poate fi de asemenea utilizată în scopuri de cartografiere a epitopilor.
Anticorpii conform invenţiei sunt definiţi prin revendicări. Alţi anticorpi sunt, de asemenea, descrişi aici. Prezenta dezvăluire include în plus anticorpi anti-MUC16 care se leagă la acelaşi epitop ca oricare dintre anticorpii exemplificativi specifici descrişi aici (de exemplu, anticorpi cuprinzând oricare dintre secvenţele de aminoacizi, aşa cum este prezentat în Tabelul 1 de aici). De asemenea, prezenta dezvăluire include, de asemenea, anticorpi anti-MUC16 care concurează pentru legarea la MUC16 cu oricare dintre anticorpii exemplificativi specifici descrişi aici (de exemplu, anticorpi care cuprind oricare dintre secvenţele de aminoacizi aşa cum este prezentat în Tabelul 1 de aici). Cu toate acestea, doar un anticorp sau un fragment de legare la antigen al acestuia care cuprinde un prim domeniu de legare la antigen care leagă în mod specific CD3 uman şi un al doilea domeniu de legare la antigen care leagă în mod specific MUC16 uman, în care al doilea domeniu de legare la antigen cuprinde domeniile HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3, respectiv, cuprinzând secvenţele de aminoacizi ale SEQ ID NO: 20-22-24-28-30-32, aşa cum sunt definite în revendicări, sunt în sfera anticorpilor din invenţia revendicată.
Prezenta dezvăluire include, de asemenea, molecule bispecifice de legare a antigenului care cuprind un prim domeniu de legare a antigenului care leagă în mod specific CD3 uman şi/sau cynomolgus CD3 cu legare sau afinitate de legare scăzută sau deloc detectabilă şi un al doilea domeniu de legare la antigen care leagă în mod specific MUC16 uman, în care primul domeniu de legare a antigenului se leagă la acelaşi epitop de pe CD3 ca oricare dintre domeniile de legare a antigenului specific CD3 exemplificative descrise aici şi/sau în care al doilea domeniu de legare a antigenului se leagă la acelaşi epitop pe MUC16 ca oricare dintre exemple specifice de domenii specifice de legare a antigenului MUC16 descrise aici.
De asemenea, prezenta dezvăluire include, de asemenea, molecule bispecifice de legare a antigenului care cuprind un prim domeniu de legare a antigenului care leagă în mod specific CD3 uman şi un al doilea domeniu de legare a antigenului care leagă în mod specific M UC16 uman, în care primul domeniu de legare a antigenului concurează pentru legarea la CD3. cu oricare dintre domeniile specifice de legare a antigenului CD3 exemplificative descrise aici şi/sau în care al doilea domeniu de legare a antigenului concurează pentru legarea la MUC16 cu oricare dintre domeniile specifice de legare a antigenului MUC16 exemplificative descrise aici.
Se poate determina cu uşurinţă dacă o anumită moleculă de legare a antigenului (de exemplu, anticorp) sau domeniul de legare a antigenului al acesteia se leagă de acelaşi epitop ca, sau concurează pentru legarea cu, o moleculă de legare a antigenului de referinţă prin utilizarea metodelor de rutină cunoscute. în art. De exemplu, pentru a determina dacă un anticorp de testat se leagă de acelaşi epitop pe MUC16 (sau CD3) ca o moleculă de referinţă bispecifică de legare a antigenului, moleculei bispecifice de referinţă i se permite mai întâi să se lege la o proteină MUC16 (sau proteină CD3). Apoi, se evaluează capacitatea unui anticorp de testare de a se lega la molecula MUC16 (sau CD3). Dacă anticorpul de testat este capabil să se lege la MUC16 (sau CD3) după legarea prin saturaţie cu molecula de referinţă bispecifică de legare a antigenului, se poate concluziona că anticorpul de testat se leagă la un epitop diferit de MUC16 (sau CD3) decât antigenul bispecific de referinţă -molecula de legare. Pe de altă parte, dacă anticorpul de testat nu este capabil să se lege la molecula MUC16 (sau CD3) după legarea prin saturaţie cu molecula de referinţă de legare a antigenului bispecific, atunci anticorpul de testat se poate lega de acelaşi epitop al MUC16 (sau CD3) ca epitop legat de molecula bispecifică de referinţă de legare la antigen. Experimentarea de rutină suplimentară (de exemplu, mutaţia peptidei şi analizele de legare) pot fi apoi efectuate pentru a confirma dacă lipsa observată de legare a anticorpului de testat se datorează, de fapt, legării la acelaşi epitop ca molecula bispecifică de referinţă de legare la antigen sau dacă este steric. blocarea (sau alt fenomen) este responsabilă pentru lipsa legăturii observate. Experimentele de acest fel pot fi efectuate utilizând ELISA, RIA, Biacore, citometrie în flux sau orice alt test cantitativ sau calitativ de legare a anticorpilor disponibil în domeniu. În conformitate cu anumite cazuri ale prezentei invenţii, două proteine de legare la antigen se leagă la acelaşi epitop (sau care se suprapun) dacă, de exemplu, un exces de 1, 5, 10, 20 sau 100 de ori dintr-o legare la antigen. proteina inhibă legarea celeilalte cu cel puţin 50%, dar de preferinţă 75%, 90% sau chiar 99%, măsurată într-un test de legare competitivă (vezi, de exemplu, Junghans şi colab., Cancer Res. 1990:50: 1495-1502). Alternativ, se consideră că două proteine de legare la antigen se leagă la acelaşi epitop dacă în esenţă toate mutaţiile de aminoacizi din antigen care reduc sau elimină legarea unei proteine de legare la antigen reduc sau elimină legarea celeilalte. Se consideră că două proteine de legare la antigen au „epitopi suprapuneri» dacă doar un subset de mutaţii de aminoacizi care reduc sau elimină legarea unei proteine de legare la antigen reduce sau elimină legarea celeilalte.
Pentru a determina dacă un anticorp sau un domeniu de legare la antigen al acestuia concurează pentru legarea cu o moleculă de legare a antigenului de referinţă, metodologia de legare descrisă mai sus este efectuată în două orientări: într-o primă orientare, moleculei de legare a antigenului de referinţă i se permite să se lege la o proteină MUC16 (sau proteină CD3) în condiţii de saturare urmată de evaluarea legării anticorpului de testat la molecula MUC16 (sau CD3). Într-o a doua orientare, anticorpul de testat este lăsat să se lege la o moleculă MUC16 (sau CD3) în condiţii de saturare urmată de evaluarea legării moleculei de legare a antigenului de referinţă la molecula MUC16 (sau CD3). Dacă, în ambele orientări, numai prima moleculă (saturatoare) de legare a antigenului este capabilă să se lege de molecula MUC16 (sau CD3), atunci se ajunge la concluzia că anticorpul de testat şi molecula de referinţă de legare a antigenului concurează pentru legarea la MUC16 ( sau CD3). După cum va fi apreciat de o persoană cu calificare obişnuită în domeniu, un anticorp care concurează pentru legarea cu o moleculă de legare a antigenului de referinţă poate să nu se lege neapărat de acelaşi epitop ca şi anticorpul de referinţă, dar poate bloca steric legarea anticorpului de referinţă prin legând un epitop suprapus sau adiacent.
Prepararea domeniilor de legare a antigenului şi construcţia moleculelor bispecifice
Domeniile de legare a antigenului specifice pentru antigeni particulari pot fi preparate prin orice tehnologie de generare a anticorpilor cunoscută în domeniu. Odată obţinute, două domenii diferite de legare la antigen, specifice pentru doi antigene diferiţi (de exemplu, CD3 şi MUC16), pot fi aranjate în mod corespunzător unul faţă de celălalt pentru a produce o moleculă bispecifică de legare a antigenului utilizând metode de rutină. (O discuţie despre formatele de anticorpi bispecifice exemplificative care pot fi utilizate pentru a construi moleculele bispecifice de legare a antigenului este furnizată în altă parte aici). În anumite cazuri, una sau mai multe dintre componentele individuale (de exemplu, lanţuri grele şi uşoare) ale moleculelor de legare la antigen multispecifice ale invenţiei sunt derivate din anticorpi himeric, umanizaţi sau complet umani. Metodele pentru producerea unor astfel de anticorpi sunt bine cunoscute în domeniu. De exemplu, unul sau mai multe dintre lanţurile grele şi/sau uşoare ale moleculelor bispecifice de legare a antigenului pot fi preparate utilizând tehnologia VELOCIMM UNE™. Folosind Tehnologia VELOCIMMUNE™ (sau orice altă tehnologie de generare a anticorpilor umani), anticorpii himeric de mare afinitate la un anumit antigen (de exemplu, CD3 sau MUC16) sunt iniţial izolaţi având o regiune variabilă umană şi o regiune constantă de şoarece. Anticorpii sunt caracterizaţi şi selectaţi pentru caracteristicile dorite, inclusiv afinitatea, selectivitatea, epitopul etc. Regiunile constante de şoarece sunt înlocuite cu o regiune constantă umană dorită pentru a genera lanţuri grele şi/sau uşoare complet umane care pot fi încorporate în moleculele bispecifice de legare a antigenului.
[Animalele modificate genetic pot fi utilizate pentru a face molecule umane bispecifice de legare a antigenului. De exemplu, poate fi utilizat un şoarece modificat genetic care este incapabil să rearanjeze şi să exprime o secvenţă variabilă de lanţ uşor de imunoglobuline de şoarece endogene, în care şoarecele exprimă doar unul sau două domenii variabile ale lanţului uşor uman codificate de secvenţe de imunoglobuline umane legate operabil la kappa de şoarece. genă constantă la locusul kappa endogen al şoarecelui. Astfel de şoareci modificaţi genetic pot fi utilizaţi pentru a produce molecule de legare a antigenului bispecific complet uman, cuprinzând două lanţuri grele diferite care se asociază cu un lanţ uşor identic care cuprinde un domeniu variabil derivat dintr-unul dintre cele două segmente de gene diferite ale regiunii variabile ale lanţului uşor uman. (A se vedea, de exemplu, US 2011/0195454). Complet uman se referă la un anticorp, sau fragment de legare la antigen sau domeniu de imunoglobulină al acestuia, cuprinzând o secvenţă de aminoacizi codificată de un ADN derivat dintr-o secvenţă umană pe toată lungimea fiecărei polipeptide a anticorpului sau fragment de legare la antigen sau domeniul de imunoglobulină al acestuia. În unele cazuri, secvenţa complet umană este derivată dintr-o proteină endogenă unui om. în alte cazuri, proteina sau secvenţa proteică complet umană cuprinde o secvenţă himerică în care fiecare secvenţă componentă este derivată din secvenţa umană. Deşi nu sunt legate de nicio teorie, proteinele himerice sau secvenţele himerice sunt în general concepute pentru a minimiza crearea de epitopi imunogeni în joncţiunile secvenţelor componente, de ex. comparativ cu orice regiuni sau domenii ale imunoglobulinei umane de tip sălbatic.
Bioechivalenţi
Anticorpii conform invenţiei sunt definiţi prin revendicări. Alţi anticorpi sunt, de asemenea, descrişi aic. Prezenta dezvăluire cuprinde molecule de legare la antigen având secvenţe de aminoacizi care variază de cele ale moleculelor exemplificative descrise aici, dar care păstrează capacitatea de a lega CD3 şi/sau MUC16. Astfel de molecule variante pot cuprinde una sau mai multe adăugiri, deleţii sau substituţii de aminoacizi în comparaţie cu secvenţa părinte, dar prezintă activitate biologică care este în esenţă echivalentă cu cea a moleculelor bispecifice de legare la antigen descrise.
Prezenta dezvăluire include molecule de legare la antigen care sunt bioechivalente cu oricare dintre moleculele exemplificative de legare la antigen prezentate aici. Două proteine de legare a antigenului, sau anticorpi, sunt considerate bioechivalente dacă, de exemplu, sunt echivalente farmaceutice sau alternative farmaceutice a căror rată şi grad de absorbţie nu prezintă o diferenţă semnificativă atunci când sunt administrate la aceeaşi doză molară în condiţii experimentale similare, fie singure. face sau doze multiple. Unele proteine care leagă antigenul vor fi considerate echivalente sau alternative farmaceutice dacă sunt echivalente în gradul lor de absorbţie, dar nu în rata lor de absorbţie şi totuşi pot fi considerate bioechivalente deoarece astfel de diferenţe în rata de absorbţie sunt intenţionate şi se reflectă în etichetarea, nu sunt esenţiale pentru atingerea concentraţiilor efective ale medicamentului în organism, de exemplu, pentru utilizarea cronică şi sunt considerate nesemnificative din punct de vedere medical pentru produsul medicamentos studiat.
De exemplu, două proteine de legare la antigen sunt bioechivalente dacă nu există diferenţe semnificative clinic în ceea ce priveşte siguranţa, puritatea şi potenţa lor.
De exemplu, două proteine care leagă antigenul sunt bioechivalente dacă un pacient poate fi schimbat o dată sau de mai multe ori între produsul de referinţă şi produsul biologic fără o creştere aşteptată a riscului de efecte adverse, inclusiv o modificare semnificativă clinic a imunogenităţii sau diminuarea eficacitate, în comparaţie cu terapia continuată fără o astfel de schimbare.
De exemplu, două proteine de legare la antigen sunt bioechivalente dacă ambele acţionează printr-un mecanism comun sau mecanisme de acţiune pentru starea sau condiţiile de utilizare, în măsura în care astfel de mecanisme sunt cunoscute.
Bioechivalenţa poate fi demonstrată prin metode in vivo şi in vitro. Măsurile de bioechivalenţă includ, de exemplu, (a) un test in vivo la oameni sau alte mamifere, în care concentraţia anticorpului sau a metaboliţilor săi este măsurată în sânge, plasmă, ser sau alt fluid biologic în funcţie de timp; (b) un test in vitro care a fost corelat cu datele de biodisponibilitate umană in vivo şi care previne în mod rezonabil pentru acestea; (c) un test in vivo la oameni sau alte mamifere în care efectul farmacologic acut adecvat al anticorpului (sau al ţintei acestuia) este măsurat în funcţie de timp; şi (d) într-un studiu clinic bine controlat care stabileşte siguranţa, eficacitatea sau biodisponibilitatea sau bioechivalenţa unei proteine care leagă antigenul.
Variantele bioechivalente ale moleculelor bispecifice de legare la antigen prezentate aici pot fi construite, de exemplu, prin efectuarea diferitelor substituţii de resturi sau secvenţe sau eliminând resturile sau secvenţele terminale sau interne care nu sunt necesare pentru activitatea biologică. De exemplu, resturile de cisteină care nu sunt esenţiale pentru activitatea biologică pot fi şterse sau înlocuite cu alţi aminoacizi pentru a preveni formarea de punţi disulfură intramoleculare inutile sau incorecte la renaturare. În alte contexte, proteinele bioechivalente de legare a antigenului pot include variante ale moleculelor bispecifice exemplificative de legare a antigenului prezentate aici, cuprinzând modificări de aminoacizi care modifică caracteristicile de glicozilare ale moleculelor, de exemplu, mutaţii care elimină sau îndepărtează glicozilarea.
Selectivitatea speciilor şi reactivitatea încrucişată a speciilor
Conform anumitor cazuri, sunt descrise molecule de legare la antigen care se leagă la CD3 uman, dar nu la CD3 de la alte specii. De asemenea, sunt furnizate molecule de legare la antigen care se leagă la MUC16 uman. Prezenta descrisă include, de asemenea, molecule de legare la antigen care se leagă la CD3 uman şi la CD3 de la una sau mai multe specii non-umane; şi/sau molecule de legare la antigen care se leagă la MUC16 uman.
Conform anumitor cazuri exemplificative, sunt furnizate molecule de legare la antigen care se leagă la CD3 uman şi/sau M UC16 uman şi se pot lega sau nu, după caz, la unul sau mai multe dintre şoarece, şobolan, cobai, hamster, gerbil, porc, pisică, câine, iepure, capră, oaie, vacă, cal, cămilă, cynomolgus, marmoset, rhesus sau cimpanzeu CD3 şi/sau MUC16. De exemplu, într-un caz exeplificativ particular sunt furnizate molecule bispecifice de legare la antigen care cuprind un prim domeniu de legare la antigen care leagă CD3 uman şi CD3 cynomolgus, şi un al doilea domeniu de legare la antigen care leagă în mod specific MUC16 uman.
Conjugate de medicament-anticorp (ADC)
Anticorpii conform invenţiei sunt definiţi prin revendicări. Alţi anticorpi sunt, de asemenea, descrişi aici conjugaţi anticorp-medicament (ADC) cuprinzând un anticorp anti-MUC16 sau un fragment al acestuia de legare la antigen conjugat la o porţiune terapeutică cum ar fi un agent citotoxic, un medicament chimioterapeutic, imunosupresor sau un radioizotop. În termeni generali, ADC-urile cuprind: A - [L - P]y, în care A este o moleculă de legare la antigen, de ex. un anticorp anti-MUC16 sau un fragment al acestuia (de exemplu, un fragment care cuprinde cel puţin un HCDR3 selectat din oricare dintre secvenţele de aminoacizi HCDR3 enumerate în Tabelul 1), L este un linker, P este sarcina utilă sau fragmentul terapeutic (de exemplu, agent citotoxic), iar y este un număr întreg de la 1 la 30. În diferite cazuri, ADC cuprinde un anticorp anti-MUC16 sau un fragment al acestuia care leagă antigenul care cuprinde CDR-urile unui HCVR şi un LCVR având secvenţele de aminoacizi ale SEQ ID NOs (de exemplu, SEQ ID NOs: 2 şi 10) setului prezentate în Tabelul 1, sau perechi specifice HCVR/LCVR (de exemplu, SEQ ID NO: 2/10). În unele cazuri, anticorpul sau fragmentul anti-MUC16 cuprinde CDR-uri cu secvenţele de aminoacizi ale SEQ ID NOs (de exemplu, SEQ I D NOs: 4-6-8-12-14-16) prezentate în Tabelul 1. În unele cazuri, anticorpul sau fragmentul anti-MUC16 cuprinde un HCVR şi un LCVR având secvenţele de aminoacizi ale SEQ ID NO(de exemplu, SEQ ID NO: 2 şi 10) prezentate în Tabelul 1 sau perechi de secvenţe de aminoacizi specifice (de exemplu, SEQ ID NO: 2/10). În unele cazuri, anticorpul anti-MUC16 este un anticorp sau un fragment de legare la antigen care se leagă la MUC16 uman în unul sau mai multe dintre cele cinci domenii SEA proximale ale membranei ale MUC16 uman care corespund resturilor 13791 -14451 din SEQ ID NO: 1899. În unele cazuri, anticorpul anti-MUC16 este un anticorp sau un fragment de legare la antigen care leagă MUC16 uman în resturile 13810-14451 din SECV I D NR: 1899. În unele cazuri, anticorpul anti-MUC16 este un anticorp sau un fragment de legare la antigen care se leagă la oricare dintre mai multe dintre SEA1, SEA2, SEA3, SEA4, SEA5, SEA6, SEA7, SEA8, SEA9, SEA10, SEA11, SEA12, SEA13, SEA14, SEA15 sau SEA16 al MUC16 uman. Într-un caz, anticorpul sau fragmentul anti-MUC16 se leagă în SEA1 (reziduurile 12074 până la 12229 din SEQ ID NO: 1899). Într-un caz, anticorpul sau fragmentul anti-MUC16 se leagă în SEA2 (reziduurile 12230 până la 12387 din SEQ ID NO: 1899). Într-un caz, anticorpul sau fragmentul anti-MUC16 se leagă în SEA3 (reziduurile 12388 până la 12543 din SEQ ID NO: 1899). Într-un caz, anticorpul sau fragmentul anti-MUC16 se leagă în SEA4 (reziduurile 12544 până la 12698 din SEQ ID NO: 1899). Într-un caz, anticorpul sau fragmentul anti-MUC16 se leagă în SEA5 (reziduurile 12699 până la 12854 din SEQ ID NO: 1899). Într-un caz, anticorpul sau fragmentul anti-MUC16 se leagă în SEA6 (reziduurile 12855 până la 13010 din SEQ ID NO: 1899). Într-un caz, anticorpul sau fragmentul anti-MUC16 se leagă în SEA7 (reziduurile 13011 până la 13166 din SEQ ID NO: 1899). Într-un caz, anticorpul sau fragmentul anti-MUC16 se leagă în SEA8 (reziduurile 13167 până la 13323 din SEQ ID NO: 1899). Într-un caz, anticorpul sau fragmentul anti-MUC16 se leagă în SEA9 (reziduurile 13324 până la 13478 din SEQ ID NO: 1899). Într-un caz, anticorpul sau fragmentul anti-MUC16 se leagă în SEA10 (reziduurile 13479 până la 13634 din SEQ ID NO: 1899). Într-un caz, anticorpul sau fragmentul anti-MUC16 se leagă în SEA11 (reziduurile 13635 până la 13790 din SEQ ID NO: 1899). Într-un caz, anticorpul sau fragmentul anti-MUC16 se leagă în SEA12 (reziduurile 13791 până la 13923 din SEQ ID NO: 1899). Într-un caz, anticorpul sau fragmentul anti-MUC16 se leagă în SEA13 (reziduurile 13924 până la 14074 din SEQ ID NO: 1899). Într-un caz, anticorpul sau fragmentul anti-MUC16 se leagă în SEA14 (reziduurile 14075 până la 14227 din SEQ ID NO: 1899). Într-un caz, anticorpul sau fragmentul anti-MUC16 se leagă în SEA15 (reziduurile 14228 până la 14320 din SEQ ID NO: 1899). Într-un caz, anticorpul sau fragmentul anti-MUC16 se leagă în SEA16 (reziduurile 14321 până la 14464 din SEQ ID NO: 1899). De exemplu, anticorpul izolat sau fragmentul de legare la antigen al acestuia se leagă la MUC16 uman într-un epitop variind de la restul 428 la restul 481 din SEQ ID NO: 1902. În unele cazuri, anticorpul izolat sau fragmentul de legare la antigen interacţionează cu resturile de aminoacizi 428-434, 429-434, 453-467, 459-467, 460-467 şi/sau 474-481 din SEQ ID NO: 1902. În unele cazuri , anticorpul sau fragmentul de legare la antigen interacţionează cu resturile de aminoacizi 428-434, 429-434, 453-467, 459-467, 460-467 şi 474-481 din SEQ ID NO: 1902. În unele cazuri, anticorpul izolat sau Fragmentul de legare la antigen al acestuia leagă MUC16 uman într-un epitop variind de la restul 126 la restul 138 din SEQ ID NO: 1902. În unele cazuri, anticorpul izolat sau fragmentul de legare la antigen interacţionează cu resturile de aminoacizi 126-131, 127-131 şi /sau 132-138 din SEQ ID NO: 1902. În unele cazuri, anticorpul sau fragmentul de legare la antigen interacţionează cu resturile de aminoacizi 126-131, 127-131 şi 132-138 din SEQ ID NO: 1902. Dezvăluirea furnizează suplimentar un anticorp izolat sau un fragment de legare la antigen al acestuia care leagă MUC16 uman într-un epitop variind de la restul 357 la restul 369 din SEQ ID NO: 1902. În unele cazuri, anticorpul izolat sau fragmentul de legare la antigen interacţionează cu resturile de aminoacizi 357-369 , 358-366, 358-369 şi/sau 361-369 din SEQ ID NO: 1902. În unele cazuri, anticorpul sau fragmentul de legare la antigen interacţionează cu resturile de aminoacizi 357-369, 358-366, 358-369 şi 361 -369 din SEQ ID NO: 1902. Într-un caz, dezvăluirea furnizează un anticorp bispecific anti-CD3/anti-MUC16, care cuprinde un braţ de legare anti-MUC16 care cuprinde un lanţ greu care cuprinde secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 1959 şi un lanţ uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 1960 şi un braţ de legare anti-CD3 care cuprinde un lanţ greu care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 1961 şi un lanţ uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 1960. Într-un alt caz, dezvăluirea furnizează un anticorp bispecific anti-CD3/anti-MUC16, care cuprinde un braţ de legare anti-MUC16 care cuprinde un lanţ greu care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 1959 şi un lanţ uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi. a SEQ ID NO: 1960 şi un braţ de legare anti-CD3 care cuprinde un lanţ greu care cuprinde secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 1962 şi un lanţ uşor cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 1960. Cu toate acestea, doar un anticorpul sau fragmentul de legare la antigen al acestuia, aşa cum este definit în revendicări, este în scopul anticorpilor din invenţia revendicată.
Agenţii citotoxici includ orice agent care dăunează creşterii, viabilităţii sau propagării celulelor. Moleculele sau anticorpii care leagă antigenul conform invenţiei livrează aceşti agenţi citotoxici, denumiţi aici „încărcări utile», celulelor ţintă. Exemple de agenţi citotoxici adecvaţi şi agenţi chimioterapeutici pentru formarea ADC-urilor sunt cunoscute în domeniu.
Exemple de agenţi citotoxici adecvaţi şi agenţi chimioterapeutici care pot fi conjugaţi cu anticorpi anti-MUC16 în conformitate cu acest aspect al invenţiei includ, de exemplu, 1-(2cloretil)-1,2-dimetansulfonil hidrazida, 1,8-dihidroxi-biciclo[ 7.3.1]trideca-4,9-dienă-2,6-diină-13-onă, 1-dehidrotestosteron, 5-fluorouracil, 6-mercaptopurină, 6-tioguanină, 9-amino camptotecină, actinomicina D, amanitine, aminopterina, anguidină, antraciclină, antramicină (AMC), auristatine (monometil auristatin E sau monometil auristatin F), bleomicina, busulfan, acid butiric, calicheamicin, camptotecină, carminomicin, carmustină, cemadotine, cisplatină, colchicină, combretastaine, ciclofosfamidă, citarabină, B citocalasin, dactinomicină, daunorubicină, decarbazină, diacetoxipentildoxorubicină, dibromomanitol, dihidroxi antracin dionă, dizorazoli, dolastatin, doxorubicină, duocarmicină, echinomicină, eleuterobine, emetină, epotilone, esperamicină, estramistine, bromidă etidium, etposidiă, floruracile, geldanamicine, gramicidin D, glucocorticoizi, irinotecani, leptomicine, leurozine, lidocaina, lomustina (CCNU), maitansinoide, mecloretamina, melfalan, mercatopurine, metopterine, metotrexat, mitramicină, mitomicina, mitoxantrona, N8-acetil spermidă, podofilotoxine, procaină, propanolol, pteridine, puromicina, rizoxine, streptozotocină, talizomicină, taxol, tenopozidă, tetracaină, tioepa clorambucil, tomaimicină, topotecani, tubulizină, vinblastină, vincristină, vindesină, vinorelbine şi derivaţi ai oricăreia dintre cele de mai sus.
Conform anumitor cazuri, agentul citotoxic care este conjugat cu un anticorp anti-MUC16 este o auristatina, cum ar fi monometil auristatin E (MMAE) sau monometil auristatin F (MMAF), o tubulizină cum ar fi TUB-OH sau TUB-OMOM, o tomaimicină derivat, un derivat de dolastatin sau un maitansinoid cum ar fi DM1 sau DM4. În unele cazuri, agentul citotoxic este un maitansinoid având structura cu Formula (I), incluzând stereoizomerii compuşilor cu Formula (I):
în care A este arilenă sau heteroarilenă.
În unele cazuri, A este un radical divalent de benzen, piridină, naftalenă sau chinolonă, care sunt opţional substituite.
În unele cazuri, A este arilenă.
În unele cazuri A este:
în care:
R1 este, independent la fiecare apariţie, alchil, alchenil, alchi aralchii, halo, heteroaril, heterocicloalchil, hidroxil, ciano, nitro,
sau azido, în care RA este alchil sau heteroalchil;
n este un număr întreg de la 0 la 4;
m este un număr întreg de la 0 la 3;
p este un număr întreg de la 0 la 6; şi
q este un număr întreg de la 0 la 5.
În unele cazuri, compusul cu Formula I este selectat din grupul constând
De exemplu, compusul cu formula (I) este:
În unele cazuri, maitansinoidul cu Formula (I) este conjugat la un anticorp anti-MUC16 sau un fragment al acestuia de legare la antigen prin intermediul unui linker, aşa cum se arată în Formula (IA), mai jos:
în care:
A este arilenă sau heteroarilenă, aşa cum sa discutat mai sus în legătură cu Formula (I);
L este un linker;
BA este un anticorp anti-MUC16 sau un fragment al acestuia de legare la antigen; şi
k este un număr întreg de la 1 la 30.
În diferite variante de realizare, L este:
în care:
SP este un distanţier; s este una sau mai multe legături la anticorpul anti-MUC16 sau fragmentul acestuia;
AA1 este un aminoacid; şi
AA2 este un aminoacid.
În unele cazuri, AA1-AA2 este: valină-citrulină, citrulină-valină, lizină-fenilalanină, fenilalanină-lizină, valină-asparagină, asparagină-valină, treonină-asparagină, asparagină-treonină, serină-asparagină, asparagină-serină, asparagină, asparagină-fenilalanină, leucină-asparagină, asparagină-leucină, izoleucină-asparagină, asparagină-izoleucină, glicină-asparagină, asparagină-glicină, acid glutamic-asparagină, asparagină-acid glutamic, citrulină-asparagină, asparagină-citrulină asparagină sau asparagină-alanină.
În unele cazuri, SP este:
în care: este o legătură la anticorpul anti-MUC16 sau fragmentul acestuia; şi
b este un număr întreg de la 2 la 8.
În alte variante de realizare, L este:
în care: este o legătură la anticorpul anti-MUC16 sau fragment al acestuia; şi b este un număr întreg de la 2 la 8.
De exemplu, compusul cu Formula (IA), incluzând linkerul, care este legat de anticorpul anti-MUC16 sau fragmentul acestuia de legare la antigen este:
în care este o legătură la anticorpul anti-MUC16 sau fragmentul acestuia. În unele cazuri, acest fragment este denumit „Compus 10."
De exemplu, compusul cu Formula (IA), incluzând linkerul, care este legat de anticorpul anti-MUC16 sau fragmentul acestuia de legare la antigen este:
în care este o legătură la anticorpul anti-MUC16 sau fragment al acestuia. În unele cazuri, acest fragment este denumit „Compus 60."
În unele realizări, agentul citotoxic este un maitansinoid având structura cu Formula (II), incluzând stereoizomerii compuşilor cu Formula (II):
în care:
A3a este un aminoacid, o peptidă având 2-20 aminoacizi, un alchil, un alchinil, un alchenil, cicloalchil, un aril, un heteroaril, un heterociclil, -CR5R6-, -O-, -C(=O)-,
-O-C(=O)-, -C(=O)-O-, -O-C(=O)-O-, -C(=O)-(CHx)p1-,-C(=O) )-O-(CHx)p1-,
-(CHx)p1-C(=O)-, -(CHx)p1-C(=O)-O-, -(O-(CH2)p2-)P3-,-((CH2)p2-O-)p3-, -C(=S)-,
-C(=S)-S-, -C(=S)-NH-, -S-C(=S)-, -S-C(=S)-S-, -S-, -SO-, -SO2-,
-NR4-,-N(R4)-C(=O)-N(R8)-, -N(R4)-C(=O)O-, -N(R4)-C(=O)-, - C(=O)-N(R4)-,
-C(=O)-N(R4)-C(=O)-, sau -O-C(=O)-NR4-, în care alchil, alchinil, alchenil, cicloalchil, aril, heteroaril şi heterociclil sunt opţional substituiţi ; şi
p1, p2 şi p3 sunt fiecare independent 0, sau un număr întreg de la 1 la 1OO;
x este 0, 1 sau 2;
R4, R5, R6 şi R8 sunt fiecare independent H, sau un substituit sau nesubstituit: alchil, alchenil, alchinil, aril, heteroaril sau heterociclil; şi
R4a este un substituit sau nesubstituit: alchil, alchenil, alchinil, aril, heteroaril sau heterociclil.
În unele cazuri, compusul cu Formula (I I) este selectat din grupul constând din:
De exemplu, compusul cu Fromula (II) este:
În unele cazuri, maitansinoidul cu Formula (II) este conjugat la un anticorp anti-MUC16 sau un fragment al acestuia de legare la antigen prin intermediul unui linker, aşa cum se arată în Formula (IIA), mai jos:
în care:
BA este un anticorp anti-MUC16 sau un fragment al acestuia de legare la antigen; a este un număr întreg de la 1 la 30;
Z2 este reprezentat prin următoarea formulă structurală: -Z2A-Z2B-Z2C-Z2D, în care Z2A, Z2B, Z2C şi Z2D sunt fiecare în mod independent absent, un aminoacid, o peptidă având 2-20 aminoacizi, un alchil, un alchinil, un alchenil, un cicloalchil, un aril, un heteroaril, un heterociclil, -CR5R6-, -O-, -C(=O)-, -O-C(=O)-, -C(=O)-O-,-O -C(=O)-O-,
-C(=O)-(CHx)p1, -C(=O)-O-(CHx)p1, -(CHx)p1-C(=O)-, -(CHx)p1-C(=O) -O-, -(O-(CH2)p2-)p3-, - ((CH2)p2-O-)p3-, -C(=S)-, -C(=S)-S-, -C (=S)-NH-, -S-C(=S)-, -S-C(=S)-S-, -S-, -SO-, -SO2-, -NR4-, -N(R4)-C (=O)-N(R8)-, -N(R4)-C(=O)O-, -N(R4)-C(=O)-, -C(=O)-N(R4)- , -C(=O)-N(R4)-C(=O)-, -O-C(=O)-N(R4), -O-C(=S)-N(R4)-, - C(=S)-N(R4)-, -N=C=S, -N=C=O,
A este un aminoacid natural sau nenatural sau o peptidă cuprinzând 2-20 aminoacizi; W este -O-, -S-, -CR5R6- sau -NR4-;
X este aril, heteroaril, cicloalchil sau heterociclil, în care aril, heteroaril, cicloalchil şi heterociclil sunt opţional substituiţi;
în care A1, A3 şi R1 sunt fiecare independent un aminoacid, o peptidă având 2-20 aminoacizi, un alchil, un alchinil, un alchenil, un cicloalchil, un aril, un heteroaril, un heterociclil, -CR5R6-, -O -, -C(=O)-, -O-C(=O)-, -C(=O)-O-, -O-C(=O)-O-,
-C(=O)-(CHx)p1, -C(=O)-O-(CHx)p1, -(CHx)p1-C(=O)-, -(CHx)p1-C(=O)-O-,
-(O-(CH2)p2-)p3-, -((CH2)p2-O-)p3-, -C(=S)-, -C(=S)-S-, -S-C(=S) -, -C(=S)-NH-,
-S-C(=S)-S-, -S-, -SO-, -SO2-, -NR4-, -N(R4)-C(=O)-N(R8)-, -N(R4)-C(=O)O-,
-N(R4)-C(=O)-, -C(=O)-N(R4)-, -C(=O)-N(R4)-C(=O)- sau -O-C (=O)-NR4-, în care alchil, alchinil, alchenil, cicloalchil, aril, heteroaril şi heterociclil sunt opţional substituiţi;
R17 este selectat din grupul constând din O, S, NR18 şi CR5R6;
R18 este selectat din grupul constând din H, alchil, alchinil, alchenil, cicloalchil, aril, heteroaril, heterociclil şi acil, în care alchil, alchinil, alchenil, cicloalchil, aril, heteroaril, heterociclil şi acil sunt opţional substituiţi;
R4, R5, R6 şi R8 sunt fiecare independent H, sau un substituit sau nesubstituit: alchil, alchenil, alchinil, aril, heteroaril sau heterociclil;
R4a este un substituit sau nesubstituit: alchil, alchenil, alchinil, aril, heteroaril sau heterociclil;
p1, p2 şi p3 sunt fiecare independent 0, sau un număr întreg de la 1 la 100; şi
x este 0, 1 sau 2.
În unele cazuri ale Formulei (IIA), A este o peptidă selectată din grupul constând din valină-citrulină, citrulină-valină, lizină-fenilalanină, fenilalanină-lizină, valină-asparagină, asparagină-valină, treonină-asparagină, asparagină-treonină , serină-asparagină, asparagină-serină, fenilalanină-asparagină, asparagină-fenilalanină, leucină-asparagină, asparagină-leucină, izoleucină-asparagină, asparagină-izoleucină, glicină-asparagină, asparagină-glicină, acid glutamic-asparagină, asparagină , citrulină-asparagină, asparagină-citrulină, alanină-asparagină şi asparagină-alanină.
De exemplu, compusul cu Formula (IIA) care este legat de anticorpul anti-MUC16 sau fragmentul acestuia de legare la antigen este:
în care este o legătură la anticorpul anti-MUC16 sau fragment al acestuia. În unele cazuri, acest fragment este denumit „Compus 7."
În unele cazuri, agentul citotoxic care este conjugat la un anticorp anti-MUC16 sau un fragment al acestuia este un diastereomer pur sau substanţial pur al DM1:
şi y este un număr întreg de la 1 la 0.
Într-un alt caz, ADC cuprinde o structură „A-[L-P]y» în care A este un anticorp anti-MUC16 sau un fragment al acestuia de legare la antigen, iar [L-P] este:
sau
sau
un amestec al acestora şi
în care y este un număr întreg de la 1 la 30 şi
este o legătură la anticorpul anti-MUC16 sau fragmentul acestuia.
Alţi derivaţi de maitansinoid sunt discutaţi în WO 2O14/145O9O, WO2O16/16O615 şi WO 2O15/O31396.
În unele cazuri, agentul citotoxic care este conjugat la un anticorp anti-MUC16 sau fragment al acestuia este MMAE sau MMAF.
Alţi agenţi citotoxici cunoscuţi în domeniu sunt luaţi în considerare în scopul prezentei invenţii, incluzând, de exemplu, toxine proteice cum ar fi ricina, toxina C. difficile, exotoxina pseudomonas, toxina difterice, toxina botulină, briodina, saporina, toxinele pokeweed (adică, fitolaccatoxină şi fitolaccigenina) şi altele, cum ar fi cele expuse în Sapra şi colab., Pharmacol. & Therapeutics, 2O13, 138:452-469.
Agenţii citotoxici („încărcări utile») pot fi legaţi de o moleculă de legare a antigenului anti-MUC16 sau de un anticorp printr-un linker chimic care leagă covalent compusul de sarcină utilă la molecula de proteină (adică anticorp). Cazuri ale linkerilor specifici sunt discutate mai sus. Mai general, şi aşa cum este utilizat aici, termenul "linker" se referă la orice grupare divalentă sau fragment care leagă, conectează sau leagă un agent de legare (de exemplu, un anticorp sau un fragment al acestuia de legare la antigen) cu un compus de sarcină utilă prezentat aici. În general, agenţi de legare adecvaţi pentru conjugaţii de anticorpi descrişi aici sunt cei care sunt suficient de stabili pentru a exploata timpul de înjumătăţire în circulaţie a anticorpului şi, în acelaşi timp, capabili să-şi elibereze sarcina utilă după internalizarea mediată de antigen a conjugatului. Linkerii pot fi scindabili sau neclivabili. Linkerii clivabili sunt linkeri care sunt scindaţi prin metabolism intracelular după internalizare, de exemplu, scindare prin hidroliză, reducere sau reacţie enzimatică. Linkerii neclivabili sunt linkeri care eliberează o sarcină utilă ataşată prin degradarea lizozomală a anticorpului după internalizare. Linkeri adecvaţi includ, dar fără a se limita la, linkeri labili la acid, linkeri labili la hidroliză, linkeri clivabili enzimatic, linkeri labili de reducere, linkeri auto-imolativi şi linkeri neclivabili. Linkerii adecvaţi îi includ, dar nu se limitează la, pe cei care sunt sau cuprind peptide, glucuronide, succinimid-tioeteri, unităţi de polietilen glicol (PEG), hidrazone, unităţi mal-caproil, unităţi dipeptidice, unităţi valină-citrulină şi para-aminobenzil. (PAB) unităţi. În unele cazuri, linkerul este capabil să se lege la anticorpul sau fragmentul de legare la antigen printr-un rest de lizină sau un rest de cisteină (de exemplu, prin scindarea unei grupări disulfură a anticorpului sau fragmentului, sau printr-un rest de cisteină introdus în anticorp. sau fragment). În unele cazuri, linkerul este capabil să se lege la anticorp sau fragment printr-un rest de glutamină, inclusiv pe cei derivati prin conjugarea mediată de transglutaminază.
Exemple de linkeri care pot fi utilizaţi în contextul prezentei invenţii includ linkeri care cuprind sau constau, de exemplu, din MC (6-maleimidocaproil), MCC (maleimidometil ciclohexan-1-carboxilat), MP (maleimidopropanoil), val-cit (valină). citrulină), val-ala (valină-alanină), ala-phe (alanină-fenilalanină), phe-lys (fenilalanină-lizină), situsul dipeptidic în linker clivabil cu protează, PAB (p-aminobenziloxicarbonil), SPP (N-succinimidil 4-(2-piridiltio) pentanoat), SMCC (N-succinimidil 4-(N-maleimidometil)ciclohexan-1 carboxilat), SIAB (N-succinimidil (4-iodo-acetil)aminobenzoat) şi variante şi combinaţii ale acestora. Exemple suplimentare de linkeri care pot fi utilizaţi în contextul prezentei invenţii sunt dezvăluite, de exemplu, în brevetul US nr. Nr. 7,754,681 şi în Ducry, Bioconjugate Chem., 2010, 21:5-13, şi referinţele citate aici. În unele cazuri, linkerul este sau conţine un distanţier auto-imolativ, cum ar fi cele discutate în Jin, şi colab., Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2012, 20:3465-3469, şi Wu, şi colab., Bioorganic & Medicinal Chemistry , 2016, 24:2697-2706.
Sarcinile utile pot fi legate de anticorpul anti-MUC16 sau fragmentul de legare a antigenului printr-o ataşare la un anumit aminoacid din anticorpul sau molecula de legare a antigenului. Exemple de ataşamente de aminoacizi care pot fi utilizate în contextul acestui aspect al invenţiei includ, de exemplu, lizina (vezi, de exemplu, brevetul US nr. 5,208,020; US 2010/0129314; Hollander şi colab., Bioconjugate Chem., 2008, 19:358-361; WO 2005/089808; Brevetul U.S. Nr. 5,714,586; US 2013/0101546; şi US 2012/0585592), cisteină (a se vedea, de exemplu, US 2007/0258987; WO 2013/055993; WO 2013/055990; WO 2013/053873; WO 2013/053872; WO 2011/ 130598, US 2013/0101546, şi brevetul U.S .7,750,116), selenocisteină (vezi, de exemplu, WO 2OO8/122O39; şi Hofer şi colab., Proc. Natl.
Acad. Sci., USA, 2008, 105:12451-12456), formil glicină (vezi, de exemplu, Carrico şi colab., Nat. Chim. Biol., 2007, 3:321-322; Agarwal şi colab., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 2013, 110:46-51, şi Rabuka şi colab., Nat. Protocols, 2012, 10: 1052-1067), aminoacizi nenaturali (vezi, de exemplu, WO 2013/068874 şi WO 2012/166559) şi aminoacizi acizi (vezi, de exemplu, WO 2O02/05982). Linkerii pot fi, de asemenea, conjugaţi la o proteină care leagă antigenul prin ataşarea la carbohidraţi (vezi, de exemplu, US 2008/0305497 şi Ryan şi colab., Food & Agriculture Immunol., 2001, 13: 127-130) şi linkeri disulfuri (vezi , de exemplu, WO 2013/085925, WO 2010/010324, WO 2011/018611 şi Shaunak şi colab., Nat. Chim. Biol., 2006, 2:312-313).
Raportul medicament-anticorp (DAR) este numărul mediu de medicamente conjugate la anticorpul sau fragmentul de legare la antigen, care are un efect important asupra eficacităţii, potenţei şi farmacocinetica ADC. În diferite cazuri, DAR este de la 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 sau 8 molecule de medicament per anticorp.În unele cazuri, DAR este de la 1 la 4. În anumite cazuri, DAR este de la 2 la 4.În unele cazuri, DAR este de la 2 la 3. În anumite cazuri, DAR este de la 3 la 4. în unele realizări, DAR este de la 1 la 10, de la 1 la 20 sau de la 1 la 30 (adică de la 1 la 30 de molecule de medicament per anticorp sau fragment de legare la antigen al acestuia).
Formulare şi administrare terapeutică
Prezenta dezvăluire furnizează compoziţii farmaceutice care cuprind moleculele de legare la antigen ale prezentei dezvăluiri. Compoziţiile farmaceutice sunt formulate cu purtători adecvaţi, excipienţi şi alţi agenţi care asigură transfer, livrare, toleranţă şi altele asemenea îmbunătăţite. O multitudine de formulări adecvate pot fi găsite în formularul cunoscut de toţi chimiştii farmaceutici: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Aceste formulări includ, de exemplu, pulberi, paste, unguente, jeleuri, ceară, uleiuri, lipide, vezicule care conţin lipide (cationice sau anionice) (cum ar fi LIPOFECTIN™, Life Technologies, Carlsbad, CA), conjugaţi ADN, paste de absorbţie anhidre, emulsii ulei-în-apă şi apă-în-ulei, emulsii carbowax (polietilenglicoli de diferite greutăţi moleculare), geluri semi-solide şi semi-solide. amestecuri solide care conţin carbowax. Vezi, de asemenea, Powell et al. "Compendiu de excipienţi pentru formulări parenterale» PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311.
Doza de moleculă de legare a antigenului administrată unui pacient poate varia în funcţie de vârsta şi mărimea pacientului, boala ţintă, condiţiile, calea de administrare şi altele asemenea. Doza preferată este de obicei calculată în funcţie de greutatea corporală sau suprafaţa corpului. Când o moleculă bispecifică de legare a antigenului este utilizată în scopuri terapeutice la un pacient adult, poate fi avantajos administrarea intravenoasă a moleculei bispecifice de legare a antigenului din prezenta invenţie, în mod normal, la o singură doză de aproximativ O,O1 până la aproximativ 2O mg. /kg greutate corporală, mai preferabil aproximativ O,O2 până la aproximativ 7, aproximativ O,O3 până la aproximativ 5, sau aproximativ O,O5 până la aproximativ 3 mg/kg greutate corporală. În funcţie de severitatea afecţiunii, frecvenţa şi durata tratamentului pot fi ajustate. Dozele şi programele eficiente pentru administrarea unei molecule bispecifice de legare a antigenului pot fi determinate empiric; de exemplu, progresul pacientului poate fi monitorizat prin evaluare periodică, iar doza ajustată în consecinţă. Mai mult, scalarea interspecie a dozelor poate fi realizată utilizând metode binecunoscute în domeniu {de exemplu, Mordenti şi colab., 1991, Pharmaceut. Res. 8: 1351).
Sunt cunoscute diferite sisteme de livrare şi pot fi utilizate pentru a administra compoziţia farmaceutică, de exemplu, încapsularea în lipozomi, microparticule, microcapsule, celule recombinante capabile să exprime virusurile mutante, endocitoza mediată de receptor (vezi, de exemplu, Wu şi colab., 1987, J. Biol. Chim.
262:4429-4432). Metodele de introducere includ, dar nu se limitează la, căile intradermice, intramusculare, intraperitoneale, intravenoase, subcutanate, intranazale, epidurale şi orale. Compoziţia poate fi administrată pe orice cale convenabilă, de exemplu prin perfuzie sau injectare în bolus, prin absorbţie prin căptuşeli epiteliale sau mucocutanate (de exemplu, mucoasa bucală, mucoasa rectală şi intestinală, etc.) şi poate fi administrată împreună cu alţi agenţi biologic activi. Administrarea poate fi sistemică sau locală.
O compoziţie farmaceutică poate fi administrată subcutanat sau intravenos cu un ac standard şi o seringă. În plus, în ceea ce priveşte administrarea subcutanată, un dispozitiv de livrare a stiloului injector (pen) are aplicaţii în eliberarea unei compoziţii farmaceutice conform prezentei invenţii. Un astfel de dispozitiv de livrare a stiloului injector (pen) poate fi reutilizabil sau de unică folosinţă. Un dispozitiv de livrare a stiloului injector (pen) reutilizabil utilizează în general un cartuş înlocuibil care conţine o compoziţie farmaceutică. Odată ce toată compoziţia farmaceutică din cartuş a fost administrat şi cartuşul este gol, cartuşul gol poate fi aruncat cu uşurinţă şi înlocuit cu un cartuş nou care conţine compoziţia farmaceutică. Dispozitivul de livrare a stiloului poate fi apoi reutilizat.Într-un dispozitiv de livrare a stiloului injector (pen) de unică folosinţă, nu există un cartuş înlocuibil. Mai degrabă, dispozitivul de livrare a stiloului injector (pen) de unică folosinţă vine pre-umplut cu compoziţia farmaceutică menţinută într-un rezervor în interiorul dispozitivului. Odată ce rezervorul este golit de compoziţia farmaceutică, întregul dispozitiv este aruncat.
Numeroase dispozitive de eliberare a stiloului injector (pen) şi autoinjector reutilizabile au aplicaţii în administrarea subcutanată a unei compoziţii farmaceutice conform prezentei invenţii. Exemplele includ, dar nu se limitează la, AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, Marea Britanie), stiloul injector (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Elveţia), stiloul stilou HUMALOG MIX 75/25™, Pix HUMALOG™, stilou HUMALIN 7O/3O™ (Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN), NOVOPEN™ I, II şi III (Novo Nordisk, Copenhaga, Danemarca), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhaga, Danemarca), stilou BD™ (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™ şi OPTICLIK™ (sanofi-aventis, Frankfurt, Germania), pentru a numi doar câteva. Exemple de dispozitive de livrare a stiloului injector (pen) de unică folosinţă care au aplicaţii în administrarea subcutanată a unei compoziţii farmaceutice includ, dar nu se limitează la, stiloul injector (sanofi-aventis), FLEXPEN™ (Novo Nordisk) şi KWIKPEN™ (Eli). Lilly), autoinjectorul SURECLICK™ (Amgen, Thousand Oaks, CA), PENLET™ (Haselmeier, Stuttgart, Germania), EPIPEN (Dey, L.P.) şi stiloul HUMIRA™ (Abbott Labs, Abbott Park IL), pentru numiţi doar câteva.
În anumite situaţii, compoziţia farmaceutică poate fi eliberată într-un sistem de eliberare controlată. De exemplu, poate fi utilizată o pompă (vezi Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. ing. 14:201). Într-un alt exemplu, pot fi utilizate materiale polimerice; vezi, Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Florida. Într-un alt exemplu, un sistem cu eliberare controlată poate fi plasat în apropierea ţintei compoziţiei, necesitând astfel doar o fracţiune din doza sistemică (vezi, de exemplu, Goodson, 1984, în Medical Applications of Controlled Release, supra, voi. 2, pp. 115-138). Alte sisteme de eliberare controlată sunt discutate în recenzia lui Langer, 199O, Science 249: 1527-1533.
Preparatele injectabile pot include forme de dozare pentru injecţii intravenoase, subcutanate, intracutanate şi intramusculare, perfuzii prin picurare etc.
Aceste preparate injectabile pot fi preparate prin metode cunoscute public. De exemplu, preparatele injectabile pot fi preparate, de exemplu, prin dizolvarea, suspendarea sau emulsionarea anticorpului sau a sării sale descrise mai sus într-un mediu apos steril sau într-un mediu uleios utilizat în mod convenţional pentru injecţii. Ca mediu apos pentru injecţii, există, de exemplu, soluţie salină fiziologică, o soluţie izotonă care conţine glucoză şi alţi agenţi auxiliari, etc., care pot fi utilizate în combinaţie cu un agent de solubilizare adecvat, cum ar fi un alcool (de exemplu, etanol), un polialcool (de exemplu, propilen glicol, polietilen glicol), un surfactant neionic [de exemplu, polisorbat 80, HCO-50 (aduct polioxietilen (50 mol) de ulei de ricin hidrogenat)] etc. Ca mediu uleios, se folosesc, de exemplu, ulei de susan, ulei de soia, etc., care pot fi utilizate în combinaţie cu un agent de solubilizare cum ar fi benzoat de benzii, alcool benzilic etc. Injecţia astfel preparată este de preferinţă umplută într-o fiolă adecvată.
În mod avantajos, compoziţiile farmaceutice pentru utilizare orală sau parenterală descrise mai sus sunt preparate în forme de dozare într-o doză unitară potrivită pentru a se potrivi unei doze de ingrediente active. Astfel de forme de dozare într-o doză unitară includ, de exemplu, tablete, pastile, capsule, injecţii (fiole), supozitoare etc. Cantitatea de anticorp menţionat mai sus conţinută este în general de aproximativ 5 până la aproximativ 500 mg per formă de dozare într-o doză unitară; în special sub formă de injecţie, este de preferat ca anticorpul menţionat mai sus să fie conţinut în aproximativ 5 până la aproximativ 100 mg şi în aproximativ 10 până la aproximativ 250 mg pentru celelalte forme de dozare.
Utilizări terapeutice ale moleculelor de legare a antigenului
Prezenta dezvăluire include metode care cuprind administrarea unui subiect care are nevoie de aceasta a unei compoziţii terapeutice cuprinzând un anticorp anti-MUC16 sau un fragment al acestuia de legare la antigen, sau o moleculă bispecifică de legare a antigenului care leagă în mod specific CD3 şi MUC16. Compoziţia terapeutică poate cuprinde oricare dintre anticorpii sau moleculele bispecifice de legare a antigenului aşa cum sunt dezvăluite aici şi un purtător sau diluant acceptabil farmaceutic. Aşa cum este utilizată aici, expresia „un subiect care are nevoie de aceasta» înseamnă un animal uman sau non-uman care prezintă unul sau mai multe simptome sau indicii de cancer (de exemplu, un subiect care exprimă o tumoare sau care suferă de oricare dintre tipurile de cancer menţionate mai jos) , sau care altfel ar beneficia de o inhibare sau o reducere a activităţii MUC16 sau o epuizare a celulelor MUC16+ (de exemplu, celulele cancerului ovarian). Cu toate acestea, metodele de tratament terapeutic nu fac parte din metoda revendicată.
Anticorpii şi moleculele bispecifice de legare la antigen ale invenţiei (şi compoziţiile terapeutice care le cuprind) sunt utile, inter alia, pentru tratarea oricărei boli sau tulburări în care stimularea, activarea şi/sau ţintirea unui răspuns imun ar fi benefică. În special, anticorpii anti-MUC16 sau moleculele bispecifice de legare a antigenului anti-CD3/anti-MUC16 din prezenta invenţie pot fi utilizaţi pentru tratamentul, prevenirea şi/sau ameliorarea oricărei boli sau tulburări asociate sau mediate de expresia MUC16. sau activitatea sau proliferarea celulelor MUC16+. Mecanismul de acţiune prin care sunt realizate metodele terapeutice ale invenţiei includ uciderea celulelor care exprimă MUC16 în prezenţa celulelor efectoare, de exemplu, prin CDC, apoptoză, ADCC, fagocitoză sau printr-o combinaţie a două sau mai multe dintre acestea. mecanisme. Celulele care exprimă MUC16 care pot fi inhibate sau distruse utilizând moleculele bispecifice de legare a antigenului din invenţie includ, de exemplu, celule de cancer ovarian.
Moleculele de legare a antigenului din prezenta invenţie pot fi utilizate pentru a trata o boală sau o tulburare asociată cu expresia MUC16 incluzând, de exemplu, un cancer care include cancer ovarian, cancer de sân, cancer pancreatic, cancer pulmonar fără celule mici, colangiocarcinom intrahepatic. tip de formare, adenocarcinom al colului uterin şi adenocarcinom al tractului gastric. Conform anumitor cazuri, anticorpii anti-MUC16 sau anticorpii bispecifici anti-MUC16/anti-CD3 sunt utili pentru tratarea unei paciente afectate de cancer ovarian. Conform altor cazuri înrudite ale invenţiei, sunt furnizate metode care cuprind administrarea unui anticorp anti-MUC16 sau a unei molecule bispecifice de legare a antigenului anti-CD3/anti-MUC16 aşa cum este dezvăluit aici la o pacientă care este afectată de cancer ovarian. Metodele analitice/diagnostic cunoscute în domeniu, cum ar fi scanarea tumorii, etc., pot fi utilizate pentru a stabili dacă o pacientă prezintă o tumoare ovariană.
Prezenta dezvăluire include, de asemenea, metode pentru tratarea cancerului rezidual la un subiect. Aşa cum este utilizat aici, termenul "cancer rezidual" înseamnă existenţa sau persistenţa uneia sau mai multor celule canceroase la un subiect în urma tratamentului cu o terapie anticancer.
Conform anumitor aspecte, prezenta dezvăluie furnizează metode pentru tratarea unei boli sau tulburări asociate cu expresia MUC16 (de exemplu, cancer ovarian) care cuprind administrarea uneia sau mai multor molecule anti-MUC16 sau bispecifice de legare a antigenului descrise în altă parte aici unui subiect după s-a stabilit că subiectul are cancer de prostată. De exemplu, prezenta dezvăluire include metode pentru tratarea cancerului ovarian care cuprind administrarea unui anticorp anti-MUC16 sau a unei molecule bispecifice de legare a antigenului anti-CD3/anti-MUC16 la o pacientă 1 zi, 2 zile, 3 zile, 4 zile, 5 zile , 6 zile, 1 săptămână, 2 săptămâni, 3 săptămâni sau 4 săptămâni, 2 luni, 4 luni, 6 luni, 8 luni, 1 an sau mai mult după ce subiectul a primit terapie hormonală (de exemplu, terapie anti-androgenă).
Terapii şi formulări combinate
Prezenta dezvăluire furnizează metode care cuprind administrarea unei compoziţii farmaceutice cuprinzând oricare dintre anticorpii exemplari şi moleculele bispecifice de legare a antigenului descrise aici în combinaţie cu unul sau mai mulţi agenţi terapeutici suplimentari. Exemple de agenţi terapeutici suplimentari care pot fi combinaţi cu sau administraţi în combinaţie cu o moleculă de legare a antigenului din prezenta invenţie includ, de exemplu, un antagonist EGFR (de exemplu, un anticorp anti-EGFR [de exemplu, cetuximab sau panitumumab] sau inhibitor cu moleculă mică de EGFR [de exemplu, gefitinib sau erlotinib]), un antagonist al unui alt membru al familiei EGFR, cum ar fi Her2/ErbB2, ErbB3 sau ErbB4 (de exemplu, anticorp anti-ErbB2, anti-ErbB3 sau anti-ErbB4 sau inhibitor cu molecule mici de ErbB2, ErbB3 sau activitate ErbB4), un antagonist al EGFRvIII (de exemplu, un anticorp care se leagă în mod specific EGFRvlII), un anagonist cMET (de exemplu, un anticorp anti-cMET), un antagonist IGF1 R (de exemplu, un anticorp anti-IGF1 R), a inhibitor B-raf (de exemplu, vemurafenib, sorafenib, GDC-0879, PLX-4720), un inhibitor PDGFR-α (de exemplu, un anticorp anti-PDGFR-α), un inhibitor PDGFR-β (de exemplu, un anticorp anti-PDGFR-β), un antagonist VEGF (de exemplu, un VEGF-capcană, vezi, de exemplu, US 7,087,41 1 (denumită aici şi „proteină de fuziune care inhibă VEGF»), anticorp anti-VEGF (de exemplu, bevacizumab), un inhibitor de kinază cu moleculă mică al receptorului VEGF (de exemplu, sunitinib, sorafenib sau pazopanib)), un antagonist DLL4 (de exemplu, un anticorp anti-DLL4 dezvăluit în US 2009/0142354, cum ar fi REGN421), un antagonist Ang2 (de ex. Anticorpul Ang2 dezvăluit în US 2011/0027286, cum ar fi H1H685P), un antagonist FOLH1 (PSMA), un antagonist PRLR (de exemplu, un anticorp anti-PRLR), un antagonist STEAP1 sau STEAP2 (de exemplu, un anticorp anti-STEAP1 sau un anticorp anti-STEAP2), un antagonist TMPRSS2 (de exemplu, un anticorp anti-TMPRSS2), un antagonist MSLN (de exemplu, un anticorp anti-MSLN), un antagonist CA9 (de exemplu, un anticorp anti-CA9), un antagonist de uroplakină (de exemplu, un anticorp anti-uroplakină), etc. Alţi agenţi care pot fi administraţi în mod benefic în combinaţie cu moleculele de legare a antigenului includ inhibitori de citokine, inclusiv inhibitori de citokine cu molecule mici şi anticorpi care se leagă la citokine cum ar fi IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18 sau la receptorii lor respectivi. Compoziţiile farmaceutice (de exemplu, compoziţiile farmaceutice care cuprind o moleculă bispecifică de legare la antigen anti-CD3/anti-MUC16 aşa cum este dezvăluită aici) pot fi, de asemenea, administrate ca parte a unui regim terapeutic care cuprinde una sau mai multe combinaţii terapeutice selectate dintre „ICE ": ifosfamidă (de exemplu, Ifex®), carboplatină {de exemplu, Paraplatin®), etoposidă {de exemplu, Etopophos®, Toposar®, VePesid®, VP-16); "DHAP": dexametazonă {de exemplu, Decadron®), citarabină {de exemplu, Cytosar-U®, citozin arabinozidă, ara-C), cisplatină {de exemplu, Platinol®-AQ); şi "ESHAP": etoposidă {de exemplu, Etopophos®, Toposar®, VePesid®, VP-16), metilprednisolon {de exemplu, Medrol®), citarabină în doză mare, cisplatină {de exemplu, Platinol®-AQ).
Prezenta dezvăluire include, de asemenea, combinaţii terapeutice care cuprind oricare dintre moleculele de legare la antigen menţionate aici şi un inhibitor al unuia sau mai multor dintre VEGF, Ang2, DLL4, EGFR, ErbB2, ErbB3, ErbB4, EGFRvllll, cMet, IGF1 R, B-raf, PDGFR-α, PDGFR-β, FOLH1 (PSMA), PRLR, STEAP1, STEAP2, TMPRSS2, MSLN, CA9, uroplakină sau oricare dintre citokinele menţionate mai sus, în care inhibitorul este un aptamer, o moleculă antisens, o ribozimă, un siARN , un peptidocorp, un nanocorp sau un fragment de anticorp {de exemplu, fragment Fab; fragmenF(ab')2; fragment Fd; fragment Fv; scFv; fragment dAb; sau alte molecule modificate, cum ar fi diacorpi, triacorpi, tetracorpi, minicorpi şi unităţi minime de recunoaştere). Moleculele de legare la antigen ale invenţiei pot fi, de asemenea, administrate şi/sau co-formulate în combinaţie cu antivirale, antibiotice, analgezice, corticosteroizi şi/sau NSAID-uri. Moleculele de legare la antigen ale invenţiei pot fi, de asemenea, administrate ca parte a unui regim de tratament care include, de asemenea, tratament cu radiaţii şi/sau chimioterapie convenţională.
Componentele active terapeutic suplimentare pot fi administrate chiar înainte de, concomitent cu sau la scurt timp după administrarea unei molecule de legare a antigenului din prezenta invenţie; (în scopul prezentei dezvăluiri, astfel de regimuri de administrare sunt considerate administrarea unei molecule de legare la antigen „în combinaţie cu» o componentă suplimentară activă terapeutic).
Prezenta dezvăluire include compoziţii farmaceutice în care o moleculă de legare a antigenului a prezentei invenţii este co-formulată cu una sau mai multe dintre componentele suplimentare activ(e) terapeutic aşa cum este descris în altă parte aici.
Regimuri de administrare
Conform anumitor cazuri, doze multiple de o moleculă de legare a antigenului (de exemplu, un anticorp anti-MUC16 sau o moleculă bispecifică de legare a antigenului care leagă în mod specific MUC16 şi CD3) pot fi administrate unui subiect pe o perioadă de timp definită. Metodele conform acestui aspect al invenţiei cuprind administrarea secvenţială la un subiect de doze multiple dintr-o moleculă de legare a antigenului conform invenţiei. Aşa cum este folosit aici, "administrare secvenţială" înseamnă că fiecare doză dintr-o moleculă de legare a antigenului este administrată subiectului la un moment diferit de timp, de exemplu, în zile diferite separate printr-un interval predeterminat {de exemplu, ore, zile, săptămâni sau luni). Prezenta dezvăluire include metode care cuprind administrarea secvenţială la pacient a unei singure doze iniţiale dintr-o moleculă de legare a antigenului, urmată de una sau mai multe doze secundare ale moleculei de legare a antigenului şi, opţional, urmată de una sau mai multe doze terţiare de antigen. moleculă de legare.
Termenii "doză iniţială", "doze secundare" şi "doze terţiare" se referă la secvenţa temporală de administrare a moleculei de legare a antigenului conform invenţiei. Astfel, "doza iniţială" este doza care este administrată la începutul regimului de tratament (denumită şi "doză de bază"); "dozele secundare" sunt dozele care sunt administrate după doza iniţială; iar "dozele terţiare" sunt dozele care sunt administrate după dozele secundare. Dozele iniţiale, secundare şi terţiare pot conţine toate aceeaşi cantitate de moleculă de legare a antigenului, dar în general pot diferi una de cealaltă în ceea ce priveşte frecvenţa administrării. În anumite cazuri, totuşi, cantitatea de moleculă de legare a antigenului conţinută în dozele iniţiale, secundare şi/sau terţiare variază una de la alta (de exemplu, ajustată în sus sau în jos după caz) în timpul tratamentului. În anumite cazri, două sau mai multe (de exemplu, 2, 3, 4 sau 5) doze sunt administrate la începutul regimului de tratament ca „doze de încărcare» urmate de doze ulterioare care sunt administrate mai puţin frecvent (de exemplu, „ doze de întreţinere»).
Într-un caz exemplificativ, fiecare doză secundară şi/sau terţiară este administrată de la 1 la 26 (de exemplu, 1, 1 1⁄2, 2, 21⁄2, 3, 31⁄2, 4, 41⁄2, 5, 51⁄2, 6, 61⁄2, 7, 71⁄2, 8, 81⁄2, 9, 91⁄2, 10, 101⁄2, 11 , 1 1 1⁄2, 12, 121⁄2, 13, 131⁄2, 14, 141⁄2, 15, 151⁄2, 16, 16, 1⁄2, 17, 171⁄2, 171⁄2, 181⁄2 19, 191⁄2, 20, 201⁄2, 21, 21 1⁄2, 22, 221⁄2, 23, 231⁄2, 24, 241⁄2, 25, 251⁄2, 26, 261⁄2 sau mai mult) săptămâni după doza imediat anterioară. Expresia "doza imediat anterioară", aşa cum este utilizată aici, înseamnă, într-o secvenţă de administrări multiple, doza de moleculă de legare a antigenului care este administrată unui pacient înainte de administrarea dozei următoare în secvenţa fără intervenţie. doze.
Metodele conform acestui aspect pot cuprinde administrarea unui pacient a oricărui număr de doze secundare şi/sau terţiare ale unei molecule de legare la antigen (de exemplu, un anticorp anti-MUC16 sau o moleculă bispecifică de legare a antigenului care leagă în mod specific MUC16 şi CD3). De exemplu, în anumite variante de realizare, pacientului i se administrează doar o singură doză secundară.
în alte variante de realizare, două sau mai multe (de exemplu, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 sau mai multe) doze secundare sunt administrate pacientului. De asemenea, în anumite cazuri, pacientului i se administrează doar o singură doză terţiară. În alte cazuri, două sau mai multe (de exemplu, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 sau mai multe) doze terţiare sunt administrate pacientului.
În cazurile care implică doze secundare multiple, fiecare doză secundară poate fi administrată la aceeaşi frecvenţă ca şi celelalte doze secundare. De exemplu, fiecare doză secundară poate fi administrată pacientului la 1 până la 2 săptămâni după doza imediat anterioară. În mod similar, în exemplele de realizare care implică mai multe doze terţiare, fiecare doză terţiară poate fi administrată la aceeaşi frecvenţă ca şi celelalte doze terţiare. De exemplu, fiecare doză terţiară poate fi administrată pacientului la 2 până la 4 săptămâni după doza imediat anterioară. Alternativ, frecvenţa la care dozele secundare şi/sau terţiare sunt administrate unui pacient poate varia pe parcursul regimului de tratament. Frecvenţa de administrare poate fi, de asemenea, ajustată în timpul tratamentului de către un medic, în funcţie de nevoile pacientului în parte după examenul clinic.
Utilizări pentru diagnosticare ale anticorpilor
Anticorpii anti-MUC16 pot fi, de asemenea, utilizaţi pentru a detecta şi/sau măsura celulele MUC16 sau care exprimă MUC16 într-o probă, de exemplu, o probă biologică în scopuri de diagnosticare. De exemplu, un anticorp anti-MUC16, sau fragment al acestuia, poate fi utilizat pentru a diagnostica o afecţiune sau o boală caracterizată prin exprimare aberantă (de exemplu, supraexpresie, subexpresie, lipsă de expresie etc.) a MUC16. Testele de diagnostic exemplificative pentru MUC16 pot cuprinde, de exemplu, punerea în contact a unei probe, obţinută de la un pacient, cu un anticorp anti-MUC16, în care anticorpul anti-MUC16 este marcat cu o moleculă marcatoare sau reporter detectabilă. Alternativ, un anticorp anti-MUC16 nemarcat poate fi utilizat în aplicaţii de diagnostic în combinaţie cu un anticorp secundar care este el însuşi marcat detectabil. Marcatorul detectabil sau molecula raportor poate fi un radioizotop, cum ar fi 3H, 4C, 32P, 35S sau 25l; un fragment fluorescent sau chemiluminiscent, cum ar fi izotiocianat de fluoresceină sau rodamină; sau o enzimă cum ar fi fosfatază alcalină, beta-galactozidază, peroxidază de hrean sau luciferază. O altă utilizare exemplificativă de diagnosticare a anticorpilor anti-MUC16 include anticorpi marcaţi cu 89Zr, cum ar fi marcaţi cu 89Zr-desferioxamină, în scopul identificării neinvazive şi urmăririi celulelor tumorale la un subiect (de exemplu, imagistica cu tomografie cu emisie de pozitroni (PET)). (A se vedea, de exemplu, Tavare, R. et al. Cancer Res. 2O16 1 ian;76(1):73-82; şi Azad, BB. et al. Oncotarget. 2O16 Mar 15;7(1 1):12344-58). Testele exemplificative specifice care pot fi utilizate pentru a detecta sau măsura MUC16 într-o probă includ testul imunosorbent legat de enzime (ELISA), radioimunotestul (RIA) şi sortarea celulelor activate de fluorescenţă (FACS).
Probele care pot fi utilizate în testele de diagnosticare MUC16 includ orice probă de ţesut sau fluid obţinută de la un pacient care conţine cantităţi detectabile de proteină MUC16, sau fragmente ale acesteia, în condiţii normale sau patologice. În general, nivelurile de MUC16 dintr-o probă specială obţinută de la un pacient sănătos (de exemplu, un pacient care nu suferă de o boală sau afecţiune asociată cu niveluri sau activitate anormală de MUC16) vor fi măsurate pentru a stabili iniţial un nivel de referinţă sau standard al MUC16. Acest nivel de bază al MUC16 poate fi apoi comparat cu nivelurile de MUC16 măsurate în probe obţinute de la indivizi suspectaţi de a avea o boală legată de MUC16 (de exemplu, o tumoare care conţine celule care exprimă MUC16) sau o afecţiune. Exemple de probe de ţesut sau fluid includ, dar nu se limitează la acestea, plasmă, ser, ascită, ovar, uter, col uterin, ficat, vezică urinară, pancreas, stomac, intestin subţire sau gros, vezică biliară, sân, plămân, rinichi, salivare şi glandele lacrimale sau orice malignitate epitelioidă a acestora. Exemple suplimentare de probe de ţesut sau fluid includ, dar nu se limitează la carcinomul seros papilar al colului uterin, adenocarcinomul endometrului, adenocarcinomul cu celule clare al vezicii urinare, carcinomul veziculelor seminale, carcinomul gastric, adenocarcinomul colorectal şi mezoteliomul epitelioid. Se prevede că orice probă de fluid sau de ţesut care conţine cantităţi detectabile de proteină MUC16, sau fragmente ale acesteia, poate fi supusă metodelor de detectare descrise aici. Metodele descrise pot fi utilizate pentru a monitoriza dezvoltarea şi progresia bolilor maligne sau pentru a distinge între condiţii normale şi boli. Ca atare, metodele descrise pot fi utilizate pentru a detecta sau monitoriza cancerele, cum ar fi cancerul ovarian, cancerul vezicii urinare, cancerul mamar, cancerul pancreatic, cancerul pulmonar fără celule mici, tipul colangiocarcinomului intrahepatic care formează masa, adenocarcinomul colului uterin, şi adenocarcinom al tractului gastric.
EXEMPLE
Următoarele exemple sunt prezentate astfel încât să ofere celor cu calificare obişnuită în domeniu o dezvăluire şi o descriere completă a modului de realizare şi utilizare a metodelor şi compoziţiilor invenţiei şi nu au scopul de a limita domeniul de aplicare a ceea ce consideră inventatorii ca invenţia lor. S-au făcut eforturi pentru a asigura acurateţea cu privire la numerele utilizate (de exemplu, cantităţi, temperatură etc.), dar ar trebui luate în considerare unele erori şi abateri experimentale. Dacă nu se indică altfel, părţile sunt părţi în greutate, greutatea moleculară este greutatea moleculară medie, temperatura este în grade Centigrade şi presiunea este la sau aproape de atmosferă.
Exemplul 1: Generarea de anticorpi anti-MUC16
Anticorpii anti-MUC16 au fost obţinuţi prin imunizarea unui şoarece modificat genetic cu un antigen MUC16 uman sau prin imunizarea unui şoarece modificat cuprinzând ADN care codifică regiuni variabile ale lanţului greu de imunoglobulină umană şi lanţ uşor kappa cu un antigen MUC16 uman.
Şoarecii modificaţi genetic au fost imunizaţi cu hMUC16.nub (un format trunchiat care cuprinde ultimele cinci domenii SEA ale Mucin-16 (SEQ ID: 1902)) sau imunizaţi cu o linie celulară care exprimă hMUC16, cum ar fi celulele OVCAR-3.
SEQ ID No: 1902 conţine resturile 13810-14451 ale SEQ ID NO: 1899, precum şi etichete C-terminale. După imunizare, splenocitele au fost recoltate de la fiecare şoarece şi fie (1) fuzionate cu celule de mielom de şoarece pentru a-şi păstra viabilitatea şi forma celule de hibridom şi analizate pentru specificitatea MUC16, fie (2) celule B sortate (aşa cum este descris în US 2007/0280945A1) folosind un fragment uman MUC16 ca reactiv de sortare care se leagă şi identifică anticorpii reactivi (celule B pozitive pentru antigen).
Anticorpii himerici la MUC16 au fost iniţial izolaţi având o regiune variabilă umană şi o regiune constantă de şoarece. Anticorpii au fost caracterizaţi şi selectaţi pentru caracteristici dezirabile, inclusiv afinitatea, selectivitatea etc. Dacă este necesar, regiunile constante de şoarece au fost înlocuite cu o regiune constantă umană dorită, de exemplu regiunea constantă lgG1 sau lgG4 de tip sălbatic sau modificată, pentru a genera un anticorp anti-MUC16 complet uman. În timp ce regiunea constantă selectată poate varia în funcţie de utilizarea specifică, caracteristicile de legare a antigenului cu afinitate mare şi specificitate ţintă rezidă în regiunea variabilă. Denumirile anticorpilor, cum ar fi H1H8755P şi H1M7129N, denotă anticorpi complet umani „H1H» sau anticorpi himeric uman variabil/regiune constantă de şoarece „H1M». Anticorpii identificaţi prin metoda hibridomului sunt indicaţi cu numere ID anticorpi care se termină cu „N» sau „N2. „Anticorpii identificaţi prin metoda de sortare a celulelor B sunt indicaţi cu numere de identificare a anticorpilor care se termină cu „P» sau „P2».
Anumite proprietăţi biologice ale anticorpilor exemplificativi anti-MUC16 generaţi în conformitate cu metodele din acest Exemplu sunt descrise în detaliu în Exemplele prezentate mai jos.
Secvenţele de aminoacizi şi acizi nucleici din regiunea variabilă a lanţului greu şi uşor ale anticorpilor anti-MUC16
Tabelul 1 prezintă identificatorii secvenţei de aminoacizi ai regiunilor variabile ale lanţului greu şi uşor şi CDR-urile anticorpilor anti-MUC16 selectaţi. Identificatorii de secvenţă de acid nucleic corespunzători sunt prezentaţi în Tabelul 2.
Tabelul 1: Identificatori de secvenţă de aminoacizi
SEQ ID NOs: Denumire anticorp HCVR HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCVR LCDR1 LCDR2 LCDR3 H1H8755P 2 4 6 8 10 12 14 16 H1H8767P 18 20 22 24 26 28 30 32 H1H8770P 34 36 38 40 42 44 46 48 H1H8783P 50 52 54 56 58 60 62 64 H1H8790P 66 68 70 72 74 76 78 80 H1H8794P 82 84 86 88 90 92 94 96 H1H8794P2 82 84 86 88 858 860 862 864 H1H8799P 98 100 102 104 106 108 110 112 H1H8799P2 98 100 102 104 170 172 174 176 H1H8804P 114 116 118 120 122 124 126 128 H1H8808P 130 132 134 136 138 140 142 144 H1H8810P 146 148 150 152 154 156 158 160 H1H8813P 162 164 166 168 170 172 174 176 H1M7129N 178 180 182 184 186 188 190 192 H1M7137N 194 196 198 200 394 396 398 400 H1M9519N 202 204 206 208 210 212 214 216 H1M9521N 218 220 222 224 226 228 230 232 H1M9528N 234 236 238 240 242 244 246 248 H2M7128N 250 252 254 256 1936 1938 1940 1942 H1M7130N 1944 1946 1948 1950 1952 1954 1956 1958 H2M7131N 258 260 262 264 266 268 270 272 H2M7133N 274 276 278 280 1936 1938 1940 1942 H2M7134N 282 284 286 288 290 292 294 296 H2M7135N 298 300 302 304 306 308 310 312 H2M7138N 314 316 318 320 322 324 326 328 H2M9538N 330 332 334 336 338 340 342 344 H3M9524N 346 348 350 352 354 356 358 360 H3M9525N 362 364 366 368 370 372 374 376 H3M9529N 378 380 382 384 386 388 390 392
Tabelul 2: Identificatori de secvenţă de acid nucleic
SEQ ID NOs: Denumire anticorp HCVR HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCVR LCDR1 LCDR2 LCDR3 H1H8755P 1 3 5 7 9 11 13 15 H1H8767P 17 19 21 23 25 27 29 31 H1H8770P 33 35 37 39 41 43 45 47 H1H8783P 49 51 53 55 57 59 61 63 H1H8790P 65 67 69 71 73 75 77 79 H1H8794P 81 83 85 87 89 91 93 95 H1H8794P2 81 83 85 87 857 859 861 863 H1H8799P 97 99 101 103 105 107 109 111 H1H8799P2 97 99 101 103 169 171 173 175 H1H8804P 113 115 117 119 121 123 125 127 H1H8808P 129 131 133 135 137 139 141 143 H1H8810P 145 147 149 151 153 155 157 159 H1H8813P 161 163 165 167 169 171 173 175 H1M7129N 177 179 181 183 185 187 189 191 H1M7137N 193 195 197 199 393 395 397 399 H1M9519N 201 203 205 207 209 211 213 215 H1M9521N 217 219 221 223 225 227 229 231 H1M9528N 233 235 237 239 241 243 245 247 H2M7128N 249 251 253 255 1935 1937 1939 1941 H1M7130N 1943 1945 1947 1949 1951 1953 1955 1957 H2M7131N 257 259 261 263 265 267 269 271 H2M7133N 273 275 277 279 1935 1937 1939 1941 H2M7134N 281 283 285 287 289 291 293 295 H2M7135N 297 299 301 303 305 307 309 311 H2M7138N 313 315 317 319 321 323 325 327 H2M9538N 329 331 333 335 337 339 341 343 H3M9524N 345 347 349 351 353 355 357 359 H3M9525N 361 363 365 367 369 371 373 375 H3M9529N 377 379 381 383 385 387 389 391
Exemplul 2: Anticorpii anti-MUC16 se leagă în mod specific la hMUC16 exprimat endogen pe linia celulară OVCAR-3
Capacitatea anticorpilor anti-MUC16 de a se lega în mod specific de MUC16 care exprimă endogen pe linia celulară de carcinom ovarian uman (OVCAR-3) a fost evaluată printr-un test de detecţie bazat pe electrochimiluminiscenţă (Meso Scale Discovery (MSD), Rockville, MD). Pe scurt, OVCAR-3 şi o linie celulară de adenocarcinom ovarian martor, SK-OV-3, care nu are o expresie detectabilă a hMUC16, au fost clătite în 1xPBS suplimentat cu Ca2+/Mg2+ (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) urmată de incubare în tampon de disociere celulară fără enzime (Millipore, Billerica, MA) timp de 10 minute la 37°C. Celulele detaşate au fost apoi spălate o dată în 1xPBS suplimentat cu Ca2+/Mg2+ şi numărate (Cellometer Auto T4 cell counter, Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA). Aproximativ 1,0x104 celule au fost placate în plăci cu electrozi de carbon cu 96 de godeuri (MSD) MULTI-ARRAY şi incubate timp de 1 oră la 37°C. Siturile de legare nespecifice au fost apoi blocate cu 2% BSA (g/v) în PBS timp de 1 oră la temperatura camerei. Apoi, la celulele legate de placă au fost adăugate diluţii în serie de anticorpi anti-MUC16 sau de control (0,85pM -50nM) şi martori tampon fără anticorpi au fost adăugaţi la celulele legate de placă şi incubate timp de 1 oră la temperatura camerei (RT). Plăcile au fost apoi spălate pentru a îndepărta anticorpii nelegaţi utilizând un dispozitiv de spălat plăci AquaMax2OOO (MDS Analytical Technologies, Sunnyvale, CA). Anticorpii legaţi de plăci au fost detectaţi cu un anticorp anti-lanţ uşor kappa uman conjugat cu SULFO-TAG™ (Regeneron) sau cu un anticorp IgG anti-şoarece conjugat cu SULFO-TAG™ (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) timp de 1 oră la RT. După spălare, plăcile au fost dezvoltate cu Read Buffer (MSD) conform protocolului producătorului şi semnalele luminiscente au fost înregistrate cu un instrument SECTOR Imager 6000 (MSD).
Intensitatea luminiscenţei, măsurată în unităţi de lumină relativă (RLU), pentru cele două linii celulare a fost înregistrată pentru a indica intensitatea de legare a fiecărui anticorp. Raportul semnalului detectat cu legarea anticorpului anti-MUC16 de 1,9 nM sau 16,7 nM la OVCAR-3 vs. SK-OV-3 a fost raportat ca o indicaţie a specificităţii şi potenţei de legare (Tabelul 3).
Tabelul 3: Raporturile de legare celulară ale anticorpilor anti-Mud 6 care exprimă endogen hMUC16 OVCAR-3 faţă de liniile celulare SK-OV-3 hMUC16-negative
Raport: anti-MUC16 Legare OVCAR-3/SK-OV-3 ID Anticorp [Ab]: 1.9nM [Ab]: 16.7nM Anticorpi Anti-Muc16 Hibridom (H1M, H2M, H3M) H2M7128N 59 31 H1M7129N 68 19 H2M7131N 86 37 H2M7133N 69 33 H2M7134N 68 29 H2M7135N 30 5 H1M7137N 77 29 H2M7138N 82 50 H3M7132N 89 38 H1M9519N 109 78 H1M9521N 132 107 H3M9524N 81 57 H3M9525N 137 51 H1M9528N 153 120 H3M9529N 143 99 H2M9538N 89 26 Anticorpi umani Fc anti-MUC16 (H1H) H1H8755P 13 5 H1H8767P 4 NS H1H8770P 9 3 H1H8783P 11 4 H1H8790P 8 3 H1H8794P 8 3 H1H8794P2 5 NS H1H8799P 10 4 H1H8799P2 10 4 H1H8804P 8 3 H1H8808P 4 NS H1H8810P 8 3 H1H8813P 11 5 H1H9519N 41 30 H1H9521N 30 28 H1H9524N 20 48 H1H9525N 4 21 H1H9528N 41 18 H1H9529N 109 74 H1H9538N 12 13 Controale mIgG1 Anticorp de control al izo-tipului NS NS mIgG2a Anticorp de control al izo-tipului NS NS hIgG1 Anticorp de control al izotipului NS NS NS=nespecific - raport la 1,9 nM sau 16,7 nM <2,5 ori. Izotipuri: H1H: hlgG1; H1M: mlgG1; H2M: mlgG2; H3M: mlgG3 Notă: variaţia raporturilor de intensitate de legare între acelaşi anticorp exprimat cu un Fc de şoarece şi Fc uman se datorează utilizării diferiţilor reactivi de detectare secundară SULFO-TAG.
După cum arată rezultatele din Tabelul 3, majoritatea anticorpilor anti-MUC16 din această invenţie s-au legat în mod specific la OVCAR-3 atât la concentraţii de anticorpi mari (16,7 nM) cât şi scăzute (1,9 nM). Anticorpii de control izotip mlgG1, mlgG2a şi hlgG1 nu au arătat nicio legare specifică nici la OVCAR-3, nici la linia celulară SK-OV-3. În plus, există dovezi că metoda este sensibilă, deoarece câţiva anticorpi care nu au prezentat legare la proteina MUC16 umană monomerică solubilă într-un test de legare a rezonanţei plasmonilor de suprafaţă (vezi Exemplul 4 de mai jos) au prezentat legare specifică la MUC16 uman endogen exprimat pe celulele OVCAR-3 în acest test de legare pe bază de celule.
Exemplul 3: Generarea de anticorpi bispecifici care leagă celule specifice ovariene (MUC16) şi CD3
Prezenta dezvăluire furnizează molecule bispecifice de legare la antigen care leagă CD3 şi MUC16; astfel de molecule bispecifice de legare a antigenului sunt denumite aici, de asemenea, „molecule bispecifice anti-MUC16/anti-CD3 sau anti-MUC16xCD3. „Porţiunea anti-MUC16 a moleculei bispecifice anti-MUC16/anti-CD3 este utilă pentru ţintirea celulelor tumorale care exprimă MUC16 (cunoscută şi ca CA-125), iar porţiunea anti-CD3 a moleculei bispecifice este utilă pentru activarea T. -celule. Legarea simultană a MUC16 pe o celulă tumorală şi CD3 pe o celulă T facilitează uciderea direcţionată (liza celulară) a celulei tumorale vizate de către celula T activată.
Anticorpii bispecifici cuprinzând un domeniu de legare specific anti-MUC16 şi un domeniu de legare specific anti-CD3 au fost construiţi folosind metodologii standard, în care domeniul de legare a antigenului anti-MUC16 şi domeniul de legare a antigenului anti-CD3 cuprind fiecare HCVR-uri diferite, distincte, asociate cu un LCVR comun. În anticorpii bispecifici exemplificaţi, moleculele au fost construite utilizând un lanţ greu de la un anticorp anti-CD3, un lanţ greu de la un anticorp anti-MUC16 şi un lanţ uşor comun de la anticorpul anti-MUC16. În alte cazuri, anticorpii bispecifici pot fi construiţi utilizând un lanţ greu de la un anticorp anti-CD3, un lanţ greu de la un anticorp anti-MUC16 şi un lanţ uşor de la un anticorp anti-CD3 sau un lanţ uşor de anticorp cunoscut a fi promiscuu sau se potriveşte eficient cu o varietate de braţe grele de lanţ.
Anticorpii bispecifici descrişi în următoarele exemple constau din braţe de legare anti-CD3 având afinităţi de legare diferite la proteina hCD3ε/δ heterodimerică umană solubilă (aşa cum este descris în Exemplul 15 de aici); şi MUC16 uman (vezi Exemplele 1-2 de mai sus). Anticorpii bispecifici exemplificaţi au fost fabricaţi având un domeniu Fc lgG1 (BSMUC16/CD3-001, -002, -003 şi -004) sau un domeniu Fc lgG4 modificat (himeric) (BSMUC16/CD3-OO5) aşa cum este stabilit în cererea de brevet SUA Publicaţia nr. US20140243504A1, publicată la 28 august 2014.
Un rezumat al părţilor componente ale domeniilor de legare la antigen ale diferiţilor anticorpi bispecifici anti-MUC16xCD3 construiţi este prezentat în Tabelul 4.
Tabelul 4: Rezumatul părţilor componente ale anticorpilor bispecifici anti-MUC16xCD3 selectaţi
Identificatorul anticorpului bispecific Anti-MUC16 Anti-CD3 Regiunea variabilă a lanţului uşor comun Domeniul de legare la antigen Domeniul de legare la antigen Regiunea variabila a lanîului greu Regiunea variabila a lanţului greu BSMUC16/CD3-001 H1H8767P (SEQ ID NO:18) CD3-VH-G (SEQ ID NO: 1730) H1H8767P (SEQ ID NO: 26) BSMUC16/CD3-002 H1H8767P (SEQ ID NO:18) CD3-VH-G5 (SEQ ID NO:1762) H1H8767P (SEQ ID NO: 26) BSMUC16/CD3-003 H1H8767P (SEQ ID NO:18) CD3-VH-G9 (SEQ ID NO:1778) H1H8767P (SEQ ID NO: 26) BSMUC16/CD3-004 H1H8767P (SEQ ID NO:18) CD3-VH-G10 (SEQ ID NO:1786) H1H8767P (SEQ ID NO: 26) BSMUC16/CD3-005 H1H8767P (SEQ ID NO:18) CD3-VH-G20 (SEQ ID NO:1866) H1H8767P (SEQ ID NO: 26)
Lanţurile uşoare enumerate în Tabelul 4 au fost comune atât braţelor de ţintire CD3 cât şi MUC16 ale anticorpilor bispecifici. Tabelele 1 şi 2 prezintă identificatorii de secvenţă de aminoacizi şi, respectiv, de acid nucleic pentru diferitele regiuni variabile ale lanţului greu şi CDR-urile corespunzătoare ale braţelor anti-MUC16 ale anticorpilor bispecifici din acest Exemplu. Tabelele 22 şi 23 prezintă identificatorii de secvenţă de aminoacizi şi, respectiv, de acid nucleic, pentru diferitele regiuni variabile ale lanţului greu şi CDR-urile corespunzătoare ale braţelor anti-CD3 ale anticorpilor bispecifici din acest Exemplu.
Exemplul 4: Afinităţile de legare şi constantele cinetice derivate de rezonanţa plasmonului de suprafaţă ale anticorpilor monoclonali umani anti-MUC16 monospecifici şi anti-MUC16xCD3 bispecifici
Afinităţile de legare şi constantele cinetice ale anticorpilor umani anti-MUC16 au fost determinate prin rezonanţă plasmonică de suprafaţă în timp real (SPR; Biacore 4000 sau Biacore T-200, GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA) la 25°C. Anticorpii anti-MUC16 testaţi în acest exemplu au fost lianţi monospecifici bivalenţi la MUC16 (exprimaţi cu o regiune constantă hlgG1 (H1 H), mlgG1 (H1 M), mlgG2 (H2M) sau mlgG3 (H3M) sau anticorpi bispecifici cuprinşi dintr-un anti- -Domeniu de legare MUC16 şi un domeniu de legare anti-CD3. Anticorpii au fost capturaţi pe o suprafaţă a senzorului CM4 sau CM5 Biacore (GE Healthcare Life Sciences) derivatizată prin cuplarea amină cu un anticorp monoclonal anti-uman Fc (GE, # BR-1008-39) sau un anticorp monoclonal anti-şoarece Fc de capră (GE). , # BR-1008-38). Diverse concentraţii de MUC16 uman monomeric solubil, într-un format trunchiat, cuprinzând ultimele cinci domenii SEA ale Mucin-16 (hMUC16.mmh, sau MUC16 „nub», SEQ ID: 1902) au fost injectate pe suprafaţa captată de anticorp anti-MUC16 la un debit de 50uL/minut (Biacore T-200) sau 30uL/minut (Biacore 4000).
Asocierea anticorp-reactiv a fost monitorizată timp de 4 minute şi disocierea a fost monitorizată timp de 6-10 minute. Toate studiile de legare au fost efectuate în tampon HBS-ET (0,01 M HEPES pH 7,4, 0,15 M NaCI, 0,05% v/v Surfactant P20).
Constantele vitezei de asociere cinetică (ka) şi disociere (kd) au fost determinate prin ajustarea senzorgramelor în timp real la un model de legare 1: 1 utilizând software-ul de ajustare a curbei Scrubber 2.0c. Constantele de echilibru de disociere de legare (D) şi timpii de înjumătăţire disociativ (tЅ) au fost calculate din constantele vitezei cinetice ca:
Parametrii cinetici de legare pentru anticorpii monospecifici anti-MUC16 la un fragment monomer al proteinei umane MUC16 sunt prezentaţi mai jos în tabelele 5A şi 5B. Parametrii cinetici de legare pentru anticorpii bispecifici anti-MUC16/anti-CD3 la proteina monomerică MUC16 umană sunt prezentaţi mai jos în Tabelul 6.
Tabelul 5A: Afinităţile de legare Biacore ale anticorpilor Anti-MUC16 Hibridoma (H1M, H2M şi H3M) la fragmentul hMUC16 la 25 °C
ID Anticorp ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) t 1/2 (min) H2M7128N 1.89E+05 6.40E-04 3.39E-09 18 H1M7129N 5.31E+04 1.04E-04 1.97E-09 111 H2M7131N 6.47E+04 1.62E-04 2.51E-09 71 H3M7132N 2.57E+04 1.96E-04 7.62E-09 59 H2M7133N 1.67E+05 3.77E-04 2.26E-09 31 H2M7134N 6.55E+04 1.62E-04 2.47E-09 71 H2M7135N 5.10E+04 2.18E-04 4.27E-09 53 H1M7137N 5.30E+04 9.09E-05 1.72E-09 127 H2M7138N 7.41E+04 9.25E-05 1.25E-09 125 H1M9519N NB NB NB NB H1M9521N NB NB NB NB H3M9524N NB NB NB NB H3M9525N NB NB NB NB H1M9528N NB NB NB NB H3M9529N NB NB NB NB NB: Nicio legătură
Tabelul 5B: Afinităţile de legare Biacore ale anticorpilor anti-MUC16 Fc uman (H1H) la fragmentul hMUC16 la 25°C
ID Anticorp ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) t1/2 (min) H1H8755P 5.22E+05 1.49E-04 2.86E-10 77 H1H8767P 1.17E+05 4.18E-04 3.58E-09 28 H1H8770P 2.47E+05 3.08E-04 1.25E-09 38
(continuare)
ID Anticorp ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) t1/2 (min) H1H8783P 1.74E+05 1.07E-04 6.14E-10 108 H1H8790P 1.01E+05 7.61E-04 7.53E-09 15 H1H8794P 3.62E+05 2.79E-04 7.71E-10 41 H1H8799P 7.90E+04 3.66E-04 4.63E-09 32 H1H8799P2 7.58E+04 3.73E-04 4.92E-09 31 H1H8804P 4.94E+04 6.07E-04 1.23E-08 19 H1H8808P 4.12E+03 2.16E-04 5.24E-08 54 H1H8810P 5.77E+04 3.16E-04 5.48E-09 37 H1H8813P 5.32E+04 2.32E-04 4.35E-09 50
Tabelul 6: Afinităţi de legare biacore ale anticorpilor bispecifici anti-MUC16/ anti-CD3 la fragmentul hMUC16 la 25°C
Identificatorul anticorpului bispecific ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) t 1/2 (min) BSMUC16/CD3-001 9.48E+04 5.86E-04 6.18E-09 20 BSMUC16/CD3-005 9.41E+04 5.64E-04 6.00E-09 21
După cum arată rezultatele, majoritatea anticorpilor anti-MUC16 ai acestei invenţii s-au legat la proteina MUC16 umană solubilă, unii prezentând afinitate subnanomolară.Câţiva anticorpi (H1M9519N, H1M9521N, H3M9524N, H3M9525N, H1M9528N, H3M9529N) nu au afişat nicio legare la formatul trunchiat care cuprind ultimele cinci domenii SEA prin rezonanţa plasmonului de suprafaţă, totuşi, leagă de MUC16AR specifică endogenului uman. 3 celule într-un test de legare pe bază de celule. Anticorpii bispecifici anti-MUC16xCD3 ai acestei dezvăluiri s-au legat de asemenea la proteina MUC16 umană trunchiată solubilă care prezintă afinitate nanomolară în acest test.
Exemplul 5: Proprietăţi suplimentare de legare, activare a celulelor T şi citotoxicitate ale anticorpilor bispecifici exemplificaţi
În acest exemplu, a fost determinată capacitatea anticorpilor bispecifici MUC16xCD3 de a se lega la liniile de celule umane care exprimă CD3 (celule T umane), în comparaţie cu legarea la liniile de celule specifice ţintei (specifice MUC16), prin FACS. În plus, capacitatea acestor anticorpi bispecifici de a se activa la linii celulare specifice ţintei (specifice MUC16) a fost de asemenea comparată într-un test similar.
Titrarea de legare a anticorpilor bispecifici exemplificaţi măsuraţi prin analiza FACS
A. Pe scurt, analiza citometrică în flux (adică sortarea celulelor activate prin fluorescenţă sau FACS) a fost utilizată pentru a determina legarea anticorpilor bispecifici la celulele Jurkat sau la celulele care exprimă MUC16 uman, urmată de detectarea cu ficoeritrină (PE) sau marcată cu APC. anticorpi anti-IgG uman. Pe scurt, 2x 105 celule/godeu au fost incubate timp de 30 de minute la 4°C cu o diluţie în serie variind de la 1,33E-07M la 8,03E-12M din fiecare anticorp de testat sau control izotip (anticorp de acelaşi izotip care leagă un antigen diferit fără încrucişare). -reactivitate la MUC16 sau CD3). După incubare, celulele au fost spălate de două ori cu PBS rece conţinând 1% FBS filtrat şi a fost adăugat la celule un anticorp secundar anti-uman conjugat cu PE sau conjugat cu APC şi incubat timp de încă 30 de minute. Godeurile care nu conţin anticorp sau numai secundar au fost, de asemenea, utilizate ca martori. După incubare, celulele au fost spălate, resuspendate în 200 μL PBS rece care conţine 1% FBS filtrat şi analizate prin citometrie în flux pe un BD FACS Canto II. Vezi Tabelul 7A.
B. În experimente separate cu condiţii analoge celor descrise mai sus, analiza citometrică în flux (sau FACS) a fost utilizată pentru a determina legarea anticorpilor bispecifici selectaţi la celulele Jurkat, PEO-1, OVCAR3-Luc şi celulele T cynomolgus. Pentru analiza de titrare, diluarea în serie a anticorpilor bispecifici MUC16xCD3 selectaţi, un prim anticorp de control izotip (un anticorp uman himeric lgG4 care leagă un antigen uman irelevant, fără reactivitate încrucişată cu CD3 uman sau cynomolgus) şi un al doilea anticorp de control izotip (un om). anticorp himeric lgG4 care leagă un antigen uman irelevant fără reactivitate încrucişată la MUC16 uman), variind de la 66,6 nM la 0,001 nM. Vezi Tabelul 7B şi Fig. 11A-11 C.
Pentru analiza FACS, celulele au fost încadrate în funcţie de înălţimea de împrăştiere înainte faţă de zona de împrăştiere înainte pentru selecţia evenimentelor individuale, urmată de împrăştiere laterală şi directă. EC5O pentru titrarea legării celulelor a fost determinat folosind software-ul PRISM™ (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA). Valorile au fost calculate utilizând analiza de regresie neliniară cu 4 parametri. (Liu, J., şi colab. 2005, Biotechnol Letters 27: 1821-1827). Valoarea EC5O reprezintă concentraţia anticorpului testat unde se observă 50% din legarea sa maximă.
Tabelul 7A: Legarea FACS pe liniile celulare specifice CD3 şi MUC16
Identificatorul anticorpului bispecific Braţul de legare Anti-CD3 FACS titrarea de legare EC50 [M] Jurkat OVCAR3 (MUC16+) BSMUC16/CD3-001 CD3-VH-G 3.21E-09 1.20E-09 BSMUC16/CD3-002 CD3-VH-G5 Very weak 2.69E-09
Tabelul 7B: Legarea FACS pe liniile celulare specifice CD3 şi MUC16
Identificatorul anticorpului bispecific Braţul de leagre Anti-CD3 FACS titrarea de legare EC50 [M] PEO-1 (MUC16+) OVCAR3- Luc (MUC16+) Jurkat Celule T Cinomolgus BSMUC16/CD3-001 CD3-VH-G 3.02E-09 1.32E-09 6.44E-09 1.56E-08 BSMUC16/CD3-002 CD3-VH-G5 3.13E-09 Not tested 3.01E-07 No Binding BSMUC16/CD3-005 CD3-VH-G20 2.63E-09 1.47E-09 6.26E-08 1.17E-06
Aşa cum se arată în tabelele 7A şi 7B, braţele de legare CD3 ale fiecărui anticorp bispecific MUC16 au prezentat o gamă de legare celulară la celulele T care exprimă CD3 uman şi de maimuţă (de exemplu, de la EC50 3,2 nM până la legare foarte slabă). Anticorpul bispecific BSMUC16/CD3-001 a arătat o măsurare ridicată a legării la celulele care exprimă CD3 (adică <7nM), în timp ce anticorpul bispecific BSMUC16/CD3-002 a arătat o legare slabă spre deloc la celulele care exprimă CD3 umane şi de maimuţă. Legarea nemăsurabilă sau nicio legare măsurabilă, în testul FACS sau testul echivalent se referă la o interacţiune de legare între anticorp şi antigenul său ţintă care depăşeşte limita de detectare a testului (de exemplu, la sau peste 1 μΜ). Anticorpii bispecifici testaţi au prezentat o legare celulară similară pe liniile celulare care exprimă MUC16, confirmând faptul că împerecherea bispecifică cu braţele CD3 individuale care prezintă interacţiuni mari sau slabe (sau deloc măsurabile) cu CD3 nu a afectat sau diminuat legarea specifică ţintei tumorii (legarea specifică MUC16). a fost mai mică sau egală cu 3 nM (legare ridicată) în aceste exemple. Primul anticorp de control nu s-a legat de celulele CD3+, iar cel de-al doilea anticorp de control nu s-a legat de celulele MUC16+.
Vezi, de asemenea, Fig. 11A-11 C.
Anticorpii care prezintă legare slabă până la deloc detectabilă la CD3 uman sunt încă consideraţi avantajoşi pentru împerecherea bispecifică determinată de aviditate şi au fost testaţi suplimentar pentru citotoxicitate în teste in vitro (vezi mai jos) şi in vivo (Exemplul 8).
Activarea celulelor T şi citotoxicitatea specifică tumorii prezentate de anticorpi bispecifici măsuraţi in vitro
A. Uciderea specifică a celulelor ţintă tumorale care exprimă MUC16 în prezenţa anticorpilor bispecifici pe bază de CD3 a fost monitorizată prin citometrie în flux. După cum s-a raportat anterior, anticorpii bispecifici au prezentat abilităţi diferenţiale de legare la proteina CD3 şi la liniile celulare care exprimă CD3 (adică legare foarte slabă sau puternică). Aceşti anticorpi bispecifici au fost testaţi pentru capacitatea de a induce celulele T umane naive să redirecţioneze uciderea către celulele care exprimă ţintă. Pe scurt, liniile celulare care exprimă MUC16 (OVCAR3) au fost etichetate cu 1 μΜ de colorant de urmărire fluorescent Violet Cell Tracker. După marcare, celulele au fost placate peste noapte la 37°C. Separat, PBMC-urile umane au fost placate în mediu RPMI suplimentat la 1x106 celule/mL şi incubate peste noapte la 37°C pentru a se îmbogăţi limfocite prin epuizarea macrofagelor aderente, a celulelor dendritice şi a unor monocite. A doua zi, celulele ţintă au fost co-incubate cu PBMC nestimulate epuizate de celule aderente (raportul 4:1 celula ţintă/efector) şi o diluţie în serie de anticorpi bispecifici relevanţi sau control izotip (interval de concentraţie: 66,7 nM până la 0,25 pM) timp de 48 ore la 37°C. Celulele au fost îndepărtate din plăci de cultură celulară folosind un tampon de disociere celulară fără enzime şi analizate prin FACS. A se vedea rezultatele reprezentate în Tabelul 8A.
B. În studii analoge, liniile celulare care exprimă MUC16 (PEO-1 sau OVCAR3-Luc) au fost marcate, placate şi incubate peste noapte, aşa cum s-a descris. Au fost co-incubate diluţii în serie de anticorpi bispecifici MUC16xCD3 sau de control izotip. A se vedea rezultatele prezentate în tabelele 8B şi 8C şi în figurile 12A-12B.
Pentru analiza FACS, celulele au fost colorate cu un urmăritor de celule roşii îndepărtate mort/vii (Invitrogen). S-au adăugat 5x105 perle de numărare în fiecare godeu imediat înainte de analiza FACS. Au fost colectate 1x104 margele pentru fiecare probă. Pentru evaluarea specificităţii uciderii, celulele au fost încadrate pe populaţii vii marcate cu violet. Procentul din populaţia vie a fost înregistrat şi utilizat pentru calcularea supravieţuirii normalizate.
Activarea celulelor T a fost evaluată prin incubarea celulelor cu anticorpi conjugaţi direct la CD2, CD69 şi/sau CD25 şi prin raportarea procentului de celule T activate timpuriu (CD69+) şi/sau celule T activate târziu (CD25+) din totalul celulelor T ( CD2+).
După cum arată rezultatele din tabelele 8A-8C, epuizarea celulelor care exprimă MUC16 a fost observată cu bispecifici anti-MUC16xCD3. Toţi anticorpii bispecifici testaţi au activat şi direcţionat celulele T umane pentru a epuiza celulele ţintă cu EC50 în intervalul picomolar. În plus, liza (epuizarea) celulei ţintă observată a fost asociată cu o reglare în sus a CD69 (sau CD25) pe celulele T CD2+, de asemenea, cu EC50 picomolare (pM).
Important, rezultatele acestui exemplu demonstrează, de asemenea, că un anticorp bispecific construit cu un braţ de legare CD3 care a afişat o legare slabă până la deloc măsurabilă la proteina CD3 sau la celulele care exprimă CD3 (de ex.
CD3-VH-G5) şi-au păstrat încă capacitatea de a activa celulele T şi au prezentat o citotoxicitate puternică a celulelor care exprimă antigenul tumoral.
Tabelul 8A: Citotoxicitatea şi proprietăţile de activare a celulelor T ale anticorpilor bispecifici MUC16xCD3 selectaţi
Identificatorul anticorpului bispecific Braţul de legare Anti-CD3 OVCAR3 epuizarea celuleor EC50 [M] Activarea celulelor T (CD69 suprareglementare) EC50 [M] BSMUC16/CD3-001 CD3-VH-G 2.24E-11 5.88E-12 BSMUC16/CD3-002 CD3-VH-G5 3.06E-11 1.01E-11
Tabelul 8B: Citotoxicitatea şi proprietăţile de activare a celulelor T ale Anticorpilor bispecifici MUC16xCD3 selectaţi
Identificatorul anticorpului bispecific PEO-1 epuizarea celulelor EC50 [M] Activarea celulelor T (CD69 suprareglementare) EC50 [M] Activarea celulelor T (CD25 suprareglementare) EC50 [M] BSMUC16/CD3-001 2.56E-11 8.34E-12 3.90E-11 BSMUC16/CD3-002 6.75E-11 1.34E-11 8.89E-11 BSMUC16/CD3-005 7.74E-11 1.72E-11 1.06E-10
Tabelul 8C: Citotoxicitatea şi proprietăţile de activare a celulelor T ale Anticorpilor bispecifici MUC16xCD3 selectaţi
Identificatorul anticorpului bispecific OVCAR3-Luc epuizarea celulelor EC50 [M] Activarea celulelor T (CD69 suprareglemen-tare) EC50 [M] Activarea celulelor T (CD25 suprareglemen-tare) EC50 [M] BSMUC16/CD3-001 1.54E-11 2.98E-12 3.06E-11 BSMUC16/CD3-005 5.16E-11 1.54E-11 1.17E-10
Exemplul 6: Cartografierea epitopului bazată pe schimbul de hidrogen/deuteriu (H/D) a anticorpilor Anti-Muc 16 H4sH8767P, H1H8794P2 şi H1H8799P2 care se leagă la o porţiune a domeniului C-termen al hMUC16
Au fost efectuate experimente pentru a determina resturile de aminoacizi MUC16 din cele cinci domenii SEA C-terminale (SEQ ID No: 19O2, denumită în continuare hMUC16.nub), cu care interacţionează anticorpii anti-MUC16 H4sH8767P, H1H8794P2 şi H1 H8799P2. În acest scop, a fost utilizată maparea epitopului de schimb hidrogen/deuteriu (H/D) cu spectrometrie de masă (HDX-MS).
O descriere generală a metodei de schimb H/D este prezentată în Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; şi Engen şi Smith (2001) Anal. Chim. 73:256A-265A.
Experimentele HDX-MS au fost efectuate pe o platformă integrată Waters HDX/MS, constând dintr-un sistem Leaptec HDX PAL pentru etichetarea deuteriului, un Waters Acquity M-Class (Manager de solvent auxiliar) pentru digestia şi încărcarea probei, un Waters Acquity M-Class (µBinary solvent manager) pentru gradientul coloanei analitice şi un spectrometru de masă Synapt G2-Si pentru măsurarea masei peptidei peptice.
Soluţia de marcare a fost preparată în tampon PBS 10 mM în D2O la pD 7,0.
Pentru marcarea cu deuteriu, s-au incubat 3,8 μL de hMUC16.nub (12 ρmοΙ/μL) sau hMUC16.nub preamestecat cu anticorpul anti-MUC16 H4sH8767P, H1H8794P2 sau H1H8799P2 în raport molar 2:1 a fost incubat cu 56,2µL. Soluţie de marcare D2O pentru diferite momente de timp (de exemplu: control nedeuterat = 0 sec; etichetare cu deuteriu: 1 min şi 20 min). Deuterarea a fost stinsă prin transferul a 50 μL la 50 μL tampon de stingere pre-răcit (0,2 M TCEP, 6 M clorură de guanidină în 100 mM tampon fosfat, pH 2,5) şi proba amestecată a fost incubată la 1,0 °C timp de două minute. Proba stinsă a fost apoi injectată într-un Waters HDX Manager pentru digestia online pepsină/protează XIII. Peptidele digerate au fost prinse pe o precoloană VanGuard ACQUITY UPLC BEH C18 1,7-μm, 2,1x5 mm la 0°C şi eluate într-o coloană analitică ACQUITY UPLC BEH C18 (1,7-μm, 1,0x50 mm) timp de 9 minute. separare în gradient de 5%-40% B (faza mobilă A: 0,1 % acid formic în apă, faza mobilă B: 0,1 % acid formic în acetonitril). Spectrometrul de masă a folosit o tensiune conică de 37 V, un timp de scanare de O,5 s şi un interval de masă/încărcare de 50-1700 Th.
Pentru identificarea resturilor de peptide ale hMUC16.nub cu care interacţionează H4sH8767P, H1H8794P2 şi H1H8799P2, datele LC-MSE din proba neuterata au fost procesate şi căutate într-o bază de date care includea secvenţe pentru hMUC16.nub, pepsină aleatorie şi o secvenţă aleatorie. folosind software-ul Waters ProteinLynx Global Server (PLGS). Peptidele identificate au fost importate în software-ul DynamX şi filtrate după două criterii: 1) produse minime per aminoacid: 0,25 şi 2) pragul fişierului de replicare: 2. Software-ul DynamX a determinat apoi automat absorbţia de deuteriu a fiecărei peptide, pe baza timpului de retenţie şi a preciziei înalte a masei (<10 ppm) în mai multe momente de timp cu 3 replici de fiecare dată.
Folosind coloana online pepsină/protează XIII cuplată cu achiziţia MSEdata, au fost identificate un total de 1O9 peptide de la hMUC16.nub în absenţa sau prezenţa H4sH8767P, reprezentând 64% acoperire a secvenţei. Şase peptide au redus semnificativ absorbţia de deuteră (valori delta centroid > 0,5 daltoni de la cel puţin un punct de timp cu valori p < 0,05) atunci când s-au legat la H4sH8767P şi sunt ilustrate în Tabelul 9A. Masa peptidei înregistrată corespunde valorii medii a centroidului MH+ masă din trei replici. Aceste peptide, corespunzând aminoacizilor 428-434, 453-467 şi 474-481 ai hMuc16.nub, au avut viteze mai lente de deuterare atunci când s-au legat la H4sH8767P. Aceste reziduuri identificate corespund, de asemenea, reziduurilor 14237-14243, 14262-14276 şi 14283-1429O ale hMUC16 aşa cum sunt definite de intrarea Uniprot Q8WXI7 (MUC16_HUMAN), SEQ ID NO: 1899.
Tabelul 9A. hMUC16.nub Peptide cu rate de deuterare modificate la legarea H4sH8767P
Reziduuri de SEQ ID NO: 1902 1min Deuterare 20 min Deuterare Secveţa de Amino Acid hMUC16. nub hMUC16.nub + 4sH8767P Δ hMUC16 . nub hMUC16.nub + H4sH8767P Δ 428-434 LYKGSQL 809,97 ± 0,03 809,07±0,06 -0,26 811,05 ± 0,16 810,17±0,01 -0,88 429-434 YKGSQL 697,10 ± 0,00 696,74±0,00 -0,35 698,13 ± 0,02 697,60±0,03 -0,52 453-467 VTVKALFSS NLDPSL 1595,35 ± 0,08 1593,97±0,2 -1,38 1596,01 ± 0,08 1595,33±0,03 -0,68 459-467 FSSNLDPSL 983,19 ± 0,01 981,57±0,08 -1,62 983,51 ±0,03 982,76±0,07 -0.75 460,467 SSNLDPSL 835,44 ± 0,01 834,01±0,00 -1,43 835,89 ± 0,01 835,12±0,15 -0,74 474-481 DKTLNASF 899,76 ± 0,00 899,25±0,06 -0,51 900,63 ± 0,00 900,10±0,03 -0,54
Folosind coloana online pepsină/protează XIII cuplată cu achiziţia MSEdata, au fost identificate un total de 109 peptide de la hMUC16.nub în absenţa sau prezenţa H1H8794P2, reprezentând o acoperire de secvenţă de 64%. Trei peptide au redus semnificativ absorbţia de deuteră (valori delta centroid > 0,5 daltoni de la cel puţin un punct de timp cu valori p < 0,05) când s-au legat la H1 H8794P2 şi sunt ilustrate în Tabelul 9B. Masa peptidei înregistrată corespunde valorii medii a centroidului MH+ masă din trei replici. Aceste peptide, corespunzând aminoacizilor 126-131, 127-131 şi 132-138 ai hMuc16.nub, au avut rate mai lente de deuteration atunci când s-au legat la H1H8794P2. Aceste reziduuri identificate corespund, de asemenea, reziduurilor 13935-13940, 13936-13940 şi 13941-13947 ale hMUC16 aşa cum sunt definite de intrarea Uniprot Q8WXI7 (MUC16_HUMAN), SEQ ID NO: 1899.
Tabelul 9B. hMUC16.nub Peptide cu rate de deuteration modificate la legarea H1H8794P2
1min Deuterare 20 min Deuterare Reziduuri de SEQ ID NO: 1902 Secvenţa Amino Acid hMUC16. nub hMUC16.nub + H1H8794P2 Δ hMUC16 . nub hMUC16.nub + H1H8794P2 Δ 126-131 LRYMAD 771,41±0, 01 770,60±0,04 -0,81 771,91 ±0,04 770,76±0,02 -1,15 127-131 RYMAD 658,03±0, 02 657,32±0,01 -0,71 657,89 ±0,01 657,27±0,01 -0,6 132-138 MGQPGSL 692,55±0, 02 691,42±0,15 -1,13 692,61 ±0,01 691,58±0,02 -1,03
Folosind coloana online pepsină/protează XIII cuplată cu achiziţia de date MSE, au fost identificate un total de 109 peptide de la hMUC16.nub în absenţa sau prezenţa H1H8799P2, reprezentând o acoperire a secvenţei de 64%. Patru peptide au redus semnificativ absorbţia de deuteră (valori delta centroid > 0,5 daltoni de la cel puţin un moment de timp cu valori p < 0,05) când s-au legat la H1H8799P2 şi sunt ilustrate în Tabelul 9C. Masa peptidei înregistrată corespunde valorii medii a centroidului MH+masă din trei replici. Aceste peptide, corespunzând aminoacizilor 357-369, 358-366, 358-369 şi 361-369 ai hMuc16.nub, au avut viteze mai lente de deuteration atunci când s-au legat la H1H8799P2. Aceste reziduuri identificate corespund, de asemenea, reziduurilor 14165-14178, 14166-14176, 14166-14178 şi 1417O-14178 ale hMUC16 aşa cum sunt definite de intrarea Uniprot Q8WXI7 (MUC16_HUMAN), SEQ899 ID NO.
Tabelul 9C. hMUC16.nub Peptide cu rate de deuteration modificate la legarea H1H8799P2
Rezuduuri SEQ ID NO: 1902 1min Deuterare 20 min Deuterare Secvenţa Amino Acid hMUC16. nub hMUC16.nub + H1H8799P2 Δ hMUC16 . nub hMUC16.nu + H1H8799P2 Δ 357-369 LSQLTHGVT QLGF 1404,15±0, 03 1403,41±0,0 9 -0,74 1406,1 4±0,15 1404,26±0,02 -2,11 358-366 SQLTHGVT QL 972,37±0, 10 972,04±0,10 -0,33 973,94 ±0,03 972,56±0,00 -1,38 358-369 SQLTHGVT QLGF 1291,23±0, 02 1290,20±0,0 0 -1,03 1291,3 4±0,02 1291,05±0,06 -227 361-369 THGVTQLGF 1404,15±0, 03 1403,42±0,0 5 -0,73 1406,1 4±0,14 1404,03±0,02 -2,11
Exemplul 7: Evaluarea farmacocinetică a anticorpilor bispecifici anti-MUC16 x CD3
Evaluarea farmacocineticii anticorpilor bispecifici anti-MUC16 x CD3 BSMUC16/CD3-OO1 şi BSMUC16/CD3-OO5 şi un control izotip au fost efectuate la şoareci MUC16 x CD3 umanizaţi (şoareci homozigoţi pentru expresia MUC16 şi CD3 umană, MUC16hu/hu x CD3hu/hu) şoareci umanizaţi CD3 (şoareci homozigoţi pentru exprimarea CD3 umană, CD3hu/hu) şi şoareci de tip sălbatic (WT) adaptaţi la tulpină (75% C57BL, 25%129Sv). Cohortele au conţinut 4-5 şoareci per anticorp testat şi per tulpină de şoarece. Toţi şoarecii au primit un singur intraperitoneal (i.p.) Doza de O,4 mg/kg. Au fost recoltate probe de sânge la 3 şi 6 ore, 1, 3, 7, 14 şi 28 de zile după administrare. Sângele a fost procesat în ser şi congelat la -8O °C până a fost analizat.
Concentraţiile de anticorpi circulanţi au fost determinate prin analiza totală a anticorpilor IgG umani utilizând GyroLab xPlore™ (Gyros, Uppsala, Suedia). Pe scurt, un anticorp policlonal anti-IgG uman de capră biotinilat (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) a fost capturat pe perle acoperite cu streptavidină pe un Gyrolab Bioaffy 200 CD (Gyros) pentru a captura IgG umană prezentă în ser. După capturarea coloanei de afinitate, anticorpul IgG uman legat în probe a fost detectat cu IgG anti-uman de capră marcat Alexa-647 (Jackson ImmunoResearch). Semnalul fluorescent pe coloană permis pentru detectarea IgG legată şi unităţile de răspuns (RU) au fost citite de instrument. Concentraţiile probelor au fost determinate prin interpolare dintr-o curbă standard care a fost potrivită utilizând o potrivire a curbei logistice cu 5 parametri folosind software-ul de evaluare Gyrolab.
Parametrii PK au fost determinaţi prin analiză non-compartimentală (NCA) utilizând software-ul Phoenix® WinNonlin® Versiunea 6.3 (Certara, L.P., Princeton, NJ) şi un model de dozare extravasculară. Folosind valorile medii ale concentraţiei respective pentru fiecare anticorp, toţi parametrii PK, inclusiv concentraţia maximă observată în ser (Cmax), timpul de înjumătăţire estimat observat (t1/2) şi aria sub curba concentraţiei în funcţie de timp până la ultima concentraţie măsurabilă (AUClast). ) au fost determinate folosind o regulă trapezoidală liniară cu interpolare liniară şi ponderare uniformă
În urma i.p. administrarea de anticorpi la şoarecii WT, profilurile concentraţiei totale de IgG în timp ale BSMUC16/CD3-001, BSMUC16/CD3-005 şi controlul izotipului au fost toate similare, caracterizate mai întâi printr-o scurtă distribuţie a medicamentului urmată de o singură fază de eliminare a medicamentului pe parcursul întregii perioade. restul studiului. Concentraţiile serice maxime (Cmax) şi expunerea calculată la medicament (AUClast) ale celor trei anticorpi au fost comparabile (în interval de 1,3 ori unul faţă de celălalt).
În urma i.p. administrarea de anticorpi în CD3hu/hu şoarece, BSMUC16/CD3-001, BSMUC16/CD3-005 şi controlul izotipului au avut concentraţii Cmax comparabile (4,6, 3,6 şi, respectiv, 4,1 μg/mL). BSMUC16/CD3-005 şi controlul izotipului au prezentat curbe similare de eliminare a medicamentelor, în timp ce BSMUC16/CD3-001 au prezentat o eliminare mai abruptă a medicamentului decât ambele, sugerând că legarea CD3 umană a ţintei conduce clearance-ul. Concentraţia terminală de anticorpi pentru BSMUC16/CD3-OO1 a fost de 0,03 μg/mL, ceea ce este de aproximativ 28 de ori mai mică decât concentraţiile terminale de anticorpi determinate pentru controlul izotipului (0,85 g/mL) şi de 22 de ori mai puţin decât BSMUC16/CD3-005 (0,66 g/mL) concentraţii serice.
La şoarecii dublu umanizaţi MUC16hu/hu x CD3hu/hu, anticorpii de control bispecifici şi izotip Muc16xCD3 au avut concentraţii Cmax comparabile (Cmax range: 4,5-6,9 μg/mL). Ambii anticorpi bispecifici au prezentat o eliminare mai abruptă a medicamentului decât controlul izotipului sugerând un efect mediat de ţintă. Concentraţiile terminale de anticorpi pentru BSMUC16/CD3-001 şi BSMUC16/CD3-005 au fost de aproximativ 29 de ori, respectiv de 2,9 ori mai mici decât concentraţiile terminale de anticorpi determinate pentru controlul izotip (0,86 μg/mL).
Un rezumat al datelor pentru anticorpii bispecifici anti-MUC16 x CD3 totali şi concentraţiile de anticorpi de control izotip sunt rezumate în Tabelul 10.Parametrii medii PK sunt descrişi în Tabelele 11A şi 11B. Concentraţiile medii totale de anticorpi în funcţie de timp sunt prezentate în figurile 1, 2 şi 3. În concluzie, anticorpii bispecifici MUC16xCD3 au prezentat curbe similare de eliminare Cmax şi medicamente la şoarecii WT, dar BSMUC16/CD3-001 a afişat rate de eliminare mai abrupte decât BSMUC16/CD3-005 şi controlul izotipului la şoarecii CD3 unic umanizat şi MUC16/CD3 şoareci dublu umanizaţi. Deoarece anticorpii bispecifici administraţi în acest studiu PK sunt alcătuiţi din acelaşi braţ de legare anti-MUC16, rezultatele sugerează că puterea de legare a grupului de ţintire CD3 poate juca un rol în nivelurile de expunere la medicamente (AUClast) şi ratele de eliminare a medicamentului. . Nici BSMUC16/CD3-OO1 sau BSMUC16/CD3-OO5 nu leagă şoarecele MUC16 sau CD3 de şoarece.
Tabelul 10: Concentraţiile medii de IgG totale în ser după o singură injecţie intraperitoneală de O,4 mg/kg de BSMUC16/CD3-001, BSMUC16/CD3-005 şi anticorpi de control izotip la şoareci WT, şoareci CD3 umanizaţi şi şoareci MUC16 x CD3 umanizaţi
Anticorp Timp (d) Concentraţia totală a mAb in serul de şoarece WT CD3hu/hu MUC16hu/hu x CD3hu/hu Medie (µg/mL) +/- SD Medie (µg/mL) +/- SD Medie (µg/mL) +/-SD BSMUC16/CD3-001 0.13 5.39 0.34 4.30 0.29 6.77 1.52 0.25 5.80 0.36 4.26 1.07 6.63 1.06 1.00 4.13 0.43 2.87 0.71 4.89 0.53 3.00 3.19 0.53 1.44 0.27 2.50 0.22 7.00 2.61 0.73 0.72 0.13 1.20 0.22 14.00 1.44 0.69 0.18 0.05 0.28 0.08 21.00 0.93 NO 0.07 0.02 0.06 0.05 28.00 0.60 NO 0.04 0.01 0.03 0.02 BSMUC16/CD3-005 0.13 4.23 0.62 3.35 1.15 4.35 0.24 0.25 4.53 0.55 3.40 0.96 4.45 0.49 1.00 3.47 0.32 2.72 0.42 3.00 0.61 3.00 2.51 0.13 1.95 0.37 1.98 0.41 7.00 2.02 0.24 2.31 0.67 1.58 0.36 14.00 1.19 0.17 1.01 0.23 0.78 0.26 21.00 1.19 0.29 1.19 0.11 0.66 0.29 28.00 0.71 0.20 0.66 0.28 0.30 0.22 Control Izotip 0.13 5.07 1.16 5.43 1.30 6.56 0.70 0.25 5.91 1.10 5.67 1.91 6.48 0.90 1.00 2.64 0.24 2.98 1.14 2.82 0.30 3.00 2.05 0.06 2.29 0.83 1.57 0.37 7.00 1.80 0.25 2.14 0.85 1.96 0.37 14.00 1.22 0.28 1.48 0.66 1.34 0.37 21.00 1.20 0.58 1.43 0.72 1.24 0.44 28.00 0.73 0.24 0.85 0.29 0.86 0.41 Timp: (h, când este menţionat)= timpul în ore după injecţia cu doză unică; D= Ziua de studiu; SD = Abatere standard; NU = Nedeterminat din cauza excluderii şoarecilor cu titruri anti-medicament pentru eliminarea medicamentelor
Tabelul 11A: Rezumatul parametrilor farmacocinetici: CD3 hu/hu şoareci umanizaţi
Parametru Unităţi Şoareci WT Şoareci CD3hu/hu Control Izotip BSMUC16/CD3-001 BSMUC16/CD3-005 Control Izotip BSMUC16/C D3-001 BSMUC16/ CD3-005 Cmax µg/m L 5 ± 3 6 ± 0,4 5 ± 0,5 4,1 ± 3 4,6 ± 0,8 3,5 ± 1 T1/2 d 11 ± 4 7 ± 3 12 ± 2 14 ± 0,5 3,9 ± 0,6 11 ± 5 AUClast d•µg/ mL 35 ± 18 40 ± 11 45 ± 5 49 ± 20 16 ± 3 36 ± 13 Cmax= Concentraţie maximă; AUG = Aria sub curba concentraţie-timp; AUClast, = AUG calculată de la momentul zero până la momentul ultimei concentraţii pozitive; T1/2= Timpul de înjumătăţire estimat observat
Tabelul 11 B: Rezumatul parametrilor farmacocinetici: MUC16hu/hu x CD3hu/hu şoareci dublu umanizaţi
Parametru Unităţi Şoareci WT Şoareci MUC16hu/hu x CD3hu/hu Control Izotip BSMUC16 /CD3-001 BSMUC16 /CD3-005 Control Izotip BSMUC16 /CD3-001 BSMUC16 /CD3-005 Cmax mg/mL 5 ±3 6 ± 0.4 5 ± 0.5 6.7 ± 0.7 6.9 ± 1 4.5 ± 4 T1/2 d 11 ± 4 7 ± 3 12 ± 2 12.9 ± 4 3.3 ± 0.8 8.2 ± 4 AUClast d•mg/mL 35 ± 18 40 ± 11 45 ± 5 46 ± 10 27 ± 3 34 ± 11 Cmax= Concentraţie maximă; AUG = Aria sub curba concentraţie-timp; AUClast= AUG calculată de la momentul zero până la momentul ultimei concentraţii pozitive; T1/2= Timpul de înjumătăţire estimat observat
Exemplul 8: Anticorpii bispecifici anti-MUC16/anti-CD3 prezintă o eficacitate anti-tumorală puternică in vivo
Pentru a determina eficacitatea in vivo a anticorpilor bispecifici anti-MUC16/anti-CD3 exemplari identificaţi ca având legare slabă sau inexistentă la CD3 uman şi cynomolgus, au fost efectuate studii pe şoareci imunocompromiţi purtători de xenogrefe de cancer de prostată uman. Eficacitatea anticorpilor bispecifici selectaţi a fost testată atât în modelele de dozare pentru tratament imediat, cât şi în cazul tratamentului terapeutic.
Eficacitatea anticorpilor bispecifici anti-MUC16/anti-CD3 în modelele de xenogrefă tumorală umană
Pentru a evalua eficacitatea in vivo a bispecificilor anti-MUC16/anti-CD3 în studiile de xenogrefă tumorală umană, şoarecii NOD scid gamma (NSG) (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine) au fost preimplantaţi cu celule mononucleare din sângele periferic uman (PBMC). ReachBio LLC, Seattle, WA) şi apoi au primit celule de ascită din linia de celule de cancer ovarian uman OVCAR-3 (American Type Tissue Culture, Manassas, VA) transdus cu luciferază (OVCAR-3/Luc). Celulele OVCAR-3 exprimă endogen MUC-16.
Pe scurt, şoarecii NSG au fost injectaţi intraperitoneal (i.p.) cu 5,0 x 106 PBMC umane. 8d mai târziu, 1,5 x 106 celule de ascită din linia celulară OVCAR-3/Luc, trecute anterior in vivo, au fost administrate i.p. la şoarecii NSG grefaţi cu PBMC. În grupul de tratament imediat, şoarecii au fost trataţi i.p. în ziua implantării celulelor OVCAR-3/Luc cu anticorpi bispecifici MUC16/CD3 BSMUC16/CD3-001 sau BSMUC16/CD3-005 sau un control izotip, la o doză de 10μg/şoarece (N=5 şoareci/grup de tratament). În modelul de doză terapeutică, şoarecii au fost trataţi i.p. 7d după implantarea tumorii cu anticorpi bispecifici MUC16/CD3 sau de control descrişi mai sus, la o doză de 10μg/şoarece (N=5/grup de tratament).
În toate studiile, creşterea tumorii a fost monitorizată prin imagistica bioluminiscentă (BLI). Şoarecii au fost injectaţi i.p. cu substratul de luciferază D-luciferină suspendată în PBS (150 mg/kg) şi fotografiată sub anestezie cu izofluran după 10 min. BLI a fost efectuat folosind sistemul Xenogen I VIS (Perkin Elmer, Hopkinton, MA) iar semnalele BLI au fost extrase folosind software-ul Living Image (Xenogen/Perkin Elmer). Regiunile de interes au fost desenate în jurul fiecărei mase celulare şi intensităţile fotonului au fost înregistrate ca fotoni (p)/sec(s)/cm2/steradian(sr). Pentru grupul cu tratament imediat, datele sunt prezentate ca niveluri BLI 26d după implantarea tumorii (Tabelul 12A). Pentru grupul de tratament terapeutic, datele sunt prezentate ca modificarea ori a BLI între ziua 6 (1 zi înainte de tratament) şi la punctul final al studiului (26 d după implantarea tumorii; Tabelul 12B).
După cum arată rezultatele, atât BSMUC16/CD3-001 cât şi BSMUC16/CD3-005 au arătat o eficacitate similară în suprimarea creşterii tumorii în comparaţie cu controlul izotipului când BLI a fost măsurat în ziua 26 în modelul de dozare imediată.
Ambii anticorpi bispecifici anti-MUC16/anti-CD3 au suprimat, de asemenea, creşterea tumorilor stabilite atunci când au fost administraţi 7d după implantarea tumorii, în comparaţie cu martor.În rezumat, anticorpii bispecifici anti-MUC16/anti-CD3 ai acestei invenţii prezintă o eficacitate anti-tumorală puternică în mai multe modele.
Tabelul 12A: Eficacitatea anticorpilor bispecifici anti-MUC16/anti-CD3 în modelul de xenogrefă imun-compromis: dozare imediată
Model Tumoră/ Tulpină şoarece/ Doză Identificator al anticorpului bispecific N Avg Radianţă medie bioluminiscentă (fotoni/sec/cm2/ steradian) Ziua 26 (mean ± SD) OVCAR-3/Luc/ NSG/ 10µg/ şoarece BSMUC16/CD3-001 5 1,4 x 103 ± 3.5 x 102 BSMUC16/CD3-005 5 1,5 x 103 ± 9.7 x 102 Control Izotip 5 2,0x107 ± 1.0x106
Tabelul 12B: Eficacitatea anticorpilor bispecifici anti-Mud 6/anti-CD3 în modelul de xenogrefă imun-compromisă: tratament terapeutic
Model Tumoră/ Tulpină şoarece/ Doză Identificator al anticorpului bispecific N Schimbarea Avg de pliere a luminii bioluminiscente [p/s/cm2/sr] la Ziua 26 relativ la Ziua 6 (mean 6 SD) OVCAR-3/Luc / NSG/ 10µg / şoarece BSMUC16/CD3-001 5 2.0 ± 5.0 BSMUC16/CD3-005 5 0.01 ± 0.02 Control Izotip 5 21.0 ± 8.0
În experimente suplimentare, eficacitatea in vivo a unui anticorp bispecific anti-MUC16/anti-CD3 a fost evaluată în modele de tumori xenogenice şi singeneice. Pentru primul model xenogenic, şoarecii NSG au fost injectaţi intraperitoneal (IP) cu celule OVCAR-3/Luc trecute anterior in vivo (Ziua O) la unsprezece zile după grefarea cu PBMC umane. Şoarecii au fost trataţi IP cu 0,01, 0,1 sau 0,5 mg/kg BSMUC16/CD3-001 sau li s-au administrat 0,5 mg/kg de control fără legare sau de control de legare CD3 în zilele 6, 10, 13, 16 şi 21. Sarcina tumorală a fost evaluată de BLI în zilele 6, 14 şi 20 după implantarea tumorii. Tratamentul cu 0,1 sau 0,5 mg/kg de BSMUC16/CD3-001 a dus la o eficacitate anti-tumorală semnificativă, determinată de măsurătorile BLI în ziua 20, aşa cum se arată în tabelele 13A-C şi în figurile 4-6. Pentru cel de-al doilea model xenogenic, şoarecii NSG au fost injectaţi cu celule OVCAR-3/Luc trecute anterior in vivo (Ziua 0) la treisprezece zile după grefare cu PBMC umane şi un al doilea lot de PBMC a fost transferat în Ziua 4. Şoarecii au fost trataţi intravenos (IV) cu 0,1, 0,5, 1 sau 5 mg/kg BSMUC16/CD3-005 sau li s-au administrat 5 mg/kg de control fără legare sau de control de legare CD3 în zilele 5, 8, 12, 15, 19 şi 22. Povara tumorală a fost evaluată de BLI în zilele 4, 11, 18 şi 25. Tratamentul cu 0,5, 1 sau 5 mg/kg BSMUC16/CD3-005 a dus la o eficacitate anti-tumorală semnificativă, aşa cum se arată prin măsurătorile BLI şi modificările pliilor (Tabelele 13D-F şi Figurile 7-9). Pentru a examina eficacitatea într-un model imun-competent, gena CD3 murină a fost înlocuită cu CD3 uman şi o porţiune a genei MUC16 de şoarece a fost înlocuită cu secvenţa umană. Înlocuirile au dus la un şoarece ale cărui celule T exprimă CD3 uman şi care exprimă o moleculă MUC16 himerică care conţine o porţiune de MUC16 uman la care se leagă anticorpul bispecific BSMUC16/CD3-001. Pentru modelul tumoral singeneic, au fost utilizate linii celulare ID8-VEGF concepute pentru a exprima porţiunea de MUC16 uman. Şoarecii au fost implantaţi cu celule ID8-VEGF/huMUC16 subcutanat şi tratat cu 100 μg de BSMUC16/CD3-001 fie în ziua implantării, fie la zece zile după implantare când s-au stabilit tumorile. Tratamentul cu 100 BSMUC16/CD3-001 a dus la o eficacitate antitumorală semnificativă, aşa cum se arată în Tabelul 13G şi Figura 10.
Implantarea şi măsurarea tumorilor xenogrefe: Celulele de ascită din linia celulară OVCAR-3/Luc, trecute anterior in vivo, au fost administrate IP la şoarecii NSG grefaţi anterior cu PBMC umane. BLI a fost măsurat ca citire pentru creşterea tumorii la câteva zile după implantarea OVCAR-3/Luc şi de mai multe ori în timpul studiului. După măsurarea iniţială a BLI pentru cohortare, şoarecii au fost împărţiţi în grupuri de 4-6 animale fiecare şi au administrat anticorpi bispecifici sau de control MUC16xCD3 de două ori pe săptămână pe parcursul studiului.
Calculul creşterii şi inhibării tumorii xenogrefei: Imagistica cu bioluminiscenţă a fost utilizată pentru a măsura sarcina tumorii. Şoarecilor li s-a injectat IP cu 150 mg/kg (după cum s-a determinat prin greutăţile corporale la începutul experimentului) de substrat de luciferază D-luciferină suspendată în PBS. La zece minute după dozare, imagistica BLI a şoarecilor a fost efectuată sub anestezie cu izofluran folosind Sistem Xenogen IVIS. Achiziţia imaginii a fost efectuată cu câmpul vizual la D, înălţimea subiectului de 1,5 cm şi nivel mediu de colectare pentru un timp de expunere de 0,5 minute. Semnalele BLI au fost extrase folosind software-ul Living Image. Regiunile de interes au fost desenate în jurul fiecărei mase tumorale şi intensităţile fotonului au fost înregistrate ca p/s/cm2/sr. Analiza statistică a fost efectuată folosind software-ul GraphPad Prism (Versiunea 6). Semnificaţia statistică pentru rezultatele BLI a fost determinată utilizând un test t Mann-Whitney neparametric nepereche. Modificările de ori au fost calculate prin formula: (Ziua 20-Ziua 6)/Ziua 6 pentru studiul 1 şi (Ziua 25-Ziua 4)/Ziua 4 pentru studiul 2.
Implantarea şi măsurarea tumorilor singeneice: Şoarecii care exprimă CD3 uman şi o himeră umană-murină a MUC16 în loci de şoarece corespunzătoare au fost implantaţi cu celule 1Oe6 ID8-VEGF/huMUC16 subcutanat (SC). Şoarecilor li s-a administrat BSMUC16/CD3-001 sau un control IP de legare la CD3, de două ori pe săptămână pe parcursul studiului. Tratamentul a început în ziua 0 sau în ziua 10 după implantare. Creşterea tumorii a fost măsurată cu şublere de două ori pe săptămână. Şoarecii au fost sacrificaţi la 47 de zile după implantarea tumorii.
Calculul creşterii şi inhibării tumorii singenice: Pentru a determina volumul tumorii prin şubler extern, s-au determinat cel mai mare diametru longitudinal (lungime) şi cel mai mare diametru transversal (lăţime). Volumul tumorii pe baza măsurătorilor calibrului a fost calculat prin formula: Volumul = (lungime x lăţime2)/2.
Semnificaţia statistică a fost determinată utilizând un test t Mann-Whitney neparametric nepereche.
Eficacitatea antitumorală a anticorpului bispecific BSMUC16/CD3-OO1 în modelele de tumori xenogenice şi singeneice in vivo este prezentată în Tabelele 13A-D de mai jos.
Tabelul 13A: Studiul 1 al modelului OVCAR-3. Nivelul bioluminiscenţei în ziua 6 după implantarea tumorii
Anticorp (mg/kg) Radianţa medie [p/s/cm22/sr] 6 zile după-implantare (median ± SEM) controlul ne-legării (0,5) 8.15e+05 ± 7.88e+04 CD3-controlul legării (0,5) 6.39e+05 ± 8.67e+04 BSMUC16/CD3-001 (0,5) 7.64e+05 ± 1.19e+05 BSMUC16/CD3-001 (0,1) 6.31e+05 ± 1.10e+05 BSMUC16/CD3-001 (0,01) 8.77e+05 ± 7.91e+04
Tabelul 13B: Studiul 1 al modelului OVCAR-3. Nivelul de biolumescenţă în ziua 20 după implantarea tumorii
Anticorp (mg/kg) Radianţa medie [p/s/cm22/sr] 20 zile după implantare (median ± SEM) controlul ne-legării (0,5) 8,63e+06 ± 1,45e+06 CD3-controlul legării (0,5) 9,94e+06 ± 1,08e+06 BSMUC16/CD3-001 (0,5) 9,37e+02 ± 9,62e+02 BSMUC16/CD3-001 (0,1) 2,36e+04 ± 1,28e+06 BSMUC16/CD3-001 (0,01) 6,51e+06 ± 1,60e+06
Tabelul 13C: Studiul 1 al modelului OVCAR-3. Modificarea plierii BLI între Ziua 6 şi Ziua 20 după implantarea tumorii
Anticorp (mg/kg) Modificarea plierii în Radianţa medie [p/s/cm22/sr] de la ziua 6 la ziua 20 după implantare (median ± SD) controlul ne-legării (0,5) 9.5 ±1.9 CD3-controlul legării (0,5) 15.6 ± 6.7 BSMUC16/CD3-001 (0.5) -1.00 ± 0.00 BSMUC16/CD3-001 (0.1) 1.2 ± 4.7 BSMUC16/CD3-001 (0.01) 5.6 ± 4.2
Tabelul 13D: Studiul 2 al modelului OVCAR-3. Nivelul de biolumescenţă în ziua 4 după implantarea tumorii
Anticorp (mg/kg) Radianţa medie [p/s/cm22/sr] 4 zile după implantare (median ± SEM) controlul ne-legării (5) 1.54e+05 ± 9.93e+03 CD3-controlul legării (5) 1.34e+05 ± 1.55e+04 BSMUC16/CD3-005 (5) 1.54e+05 ± 1.03e+04 BSMUC16/CD3-005 (1) 1.38e+05 ± 4.65e+03 BSMUC16/CD3-005 (0.5) 1.31e+05 ± 4.03e+03 BSMUC16/CD3-005 (0.1) 1.53e+05 ± 1.93e+04
Tabelul 13E: Studiul 2 al modelului OVCAR-3. Nivelul de biolumescenţă în ziua 25 după implantarea tumorii
Anticorp (mg/kg) Radianţa medie [p/s/cm22/sr] 25 zile după implantare (median ± SEM) controlul ne-legării (5) 7.20e+06 ± 8.91e+05 CD3-controlul legării (5) 6.15e+06 ± 7.26e+05 BSMUC16/CD3-005 (5) 1.52e+03 ± 4.86e+05 BSMUC16/CD3-005 (1) 6.99e+03 ± 6.23e+03 BSMUC16/CD3-005 (0.5) 2.23e+03 ± 2.35e+05 BSMUC16/CD3-005 (0.1) 7.63e+06 ± 1.83e+06
Tabelul 13F: Studiul 2 al modelului OVCAR-3. Schimbarea plierii în BLI între Ziua 4 şi Ziua 25 după implatarea tumorii
Anticorp (mg/kg) Modificarea plierii în Radianţa medie [p/s/cm22/sr] de la ziua 4 la ziua 25 după implantare (median ± SD) controlul ne-legării (5) 46.8 ± 20.6 CD3-controlul legării (5) 55.0 ± 14.7 BSMUC16/CD3-005 (5) 2.5 ± 8.5 BSMUC16/CD3-005 (1) -0.9 ± 0.1 BSMUC16/CD3-005 (0.5) 0.7 ± 3.6 BSMUC16/CD3-005 (0.1) 45.4 ± 35.7
Tabelul 13G: modelul ID8-VEGF/huMUC16. Dimensiunea tumorii (mm3)
în ziua 47
Începutul tratamentului Anticorp (mg) Dimensiunea tumării (mm3) la ziua 47 (mean SEM) Ziua 0 CD3-controlul legării (100) 827.5 ± 223.5 Ziua 0 BSMUC16/CD3-001 (100) 51.2 ± 51.2 Ziua 10 BSMUC16/CD3-001 (100) 273.8 ± 92.36
Exemplul de referinţă 1: Prepararea şi caracterizarea conjugatului
Toţi anticorpii monoclonali au fost exprimaţi în celule CHO şi purificaţi prin proteina A. Un control izotip a fost, de asemenea, preparat într-un mod similar. Anticorpul de control izotip care nu se leagă a fost derivat dintr-un antigen imunologic care nu are nicio legătură cu oncologia.
Anticorpul (10 mg/ml) în HEPES 50 mM, NaCI 150 mM, pH 7,5, a fost tratat cu ditiotreitol 1 mM la 37 °C timp de 30 min. După filtrarea pe gel (G-25, pH 4,5 acetat de sodiu), unul dintre derivaţii de sarcină utilă maleimido linker Compusul 7 sau Compusul 10 (vezi Tabelul 14) (1,2 echivalenţi/grup SH) în DMSO (10 mg/ml) a fost adăugat la anticorpul redus şi amestecul ajustat la pH 7,0 cu 1 M HEPES (pH 7,4). Compusul 7 şi Compusul 10 şi metodele de producere a compuşilor sunt descrise în Publicaţia PCT Nr. WO2014/145090, publicată la 18 septembrie 2014 şi, respectiv, în Publicaţia PCT Nr. WO2016/160615, publicată la 6 octombrie 2016, fiecare dintre care este încorporat în întregime aici prin referire.După 1 oră, reacţia a fost stinsă cu N-etil maleimidă în exces. Conjugatele au fost purificate prin cromatografie de excludere dimensională şi filtrate steril. Concentraţiile de proteine şi încărcături utile de linker au fost determinate prin analiză spectrală UV. HPLC de excludere a mărimii a stabilit că toţi conjugaţii utilizaţi au fost >95% monomelici.
Randamentele sunt raportate în Tabelul 14 pe baza determinărilor de proteine. Toţi anticorpii conjugaţi au fost analizaţi prin UV pentru valorile de încărcare a sarcinii utile de linker conform Hamblett şi colab., Cancer Res 2004 107063. Rezultatele sunt rezumate în Tabelul 14.
Un conjugat care cuprinde Compusul 60 poate fi preparat folosind o metodă similară. Compusul 60 şi metodele de producere a compusului sunt descrise în Publicaţia PCT nr. WO2016/160615 (Exemplul 20), publicat pe 6 octombrie 2016, care este încorporat în întregime aici ca referinţă. Compusul 60 este Maytansin-N-metil-L-alanină-(3-metoxi-4-amino)benzamido-Cit-Val-Cap-Mal.
Tabelul 14: Rezumatul sarcinii utile (medicament chimiotoxic) şi parametrii
Compus ε 252 nm (cm-1 M-1) ε 280 nm (cm-1 M-1) 7 [Maitansin-3-N-metil-L-(S)-alanină-propanamidil-3-N-metil- N-[4-(amino-citrullină-valină-hexanamidă-6-maleimidi/)benzil] carbamat] 50600 8100 10 [Maitansin-N-metil-L-alanină-4-aminobenzamidă-citrullină-valină- caprolil-6-maleimidil] 45990 20600 Anticorp ε 252 nm (cm-1 M-1) ε 280 nm (cm-1 M-1) H1H9519N 83995 235280 H1H9521N 85564 232050 Control Izotip 75113 218360 Conjugat de Anticorp Sarcina:Anticorp (UV) Randament % H1H9519N-7 3.5 40 H1H9521N-7 3.6 40 H1H9521N-10 3.0 40 Control Izotip -7 3.0 60 Control Izotip -10 3.4 60
Exemplul de referinţă 2: Conjugaţii de medicament cu anticorpi anti-MUC16 sunt inhibitori potenţi ai creşterii tumorii în modelele de xenogrefă in vivo pentru cancerul de prostată MUC16-pozitiv
Pentru a determina eficacitatea in vivo a anticorpilor anti-MUC16 conjugaţi la Compusul 7 şi Compusul 10, au fost efectuate studii pe şoareci imunocompromiţi purtători de xenogrefe de cancer ovarian MUC16 pozitive.
Pentru aceste studii, şoarecii SCID femele (Taconic, Hudson NY) au fost implantaţi cu celule OVCAR3 [NIH:OVCAR-3 (OVCAR3, ATCC HTB-161)] transfectate cu luciferază (OVCAR3/luc) care exprimă endogen MUC16. Pentru tumorile intraperitoneale (IP), şoarecii au fost randomizaţi în grupuri de tratament şi dozaţi fie cu anticorpi conjugaţi cu medicament anti-MUC16 (vezi Exemplul de referinţă 1), cu un anticorp conjugat care nu se leagă, fie cu vehicul după detectarea semnalului luminescent al tumorii. Pentru xenogrefele subcutanate (SC), odată ce tumorile au atins un volum mediu de 2OO mm3 (-Ziua 16), şoarecii au fost randomizaţi în grupuri de tratament şi dozaţi fie cu anticorpi conjugaţi cu medicament anti-MUC16, fie cu un anticorp conjugat nelegator, fie cu vehicul. În aceste studii in vivo, anticorpii au fost dozaţi şi tumorile au fost apoi monitorizate până când s-a dezvoltat ascită sau s-a atins o dimensiune medie a tumorii de aproximativ 1200 mm3 în cohorta dozată numai cu vehicul. În acest moment a fost calculată inhibarea creşterii tumorii.
Într-un studiu iniţial intraperitoneal (IP), anticorpii anti-MUC16 exemplari conjugaţi cu Compusul 7 au fost examinaţi pentru eficacitatea în reducerea semnalului luminiscent OVCAR3/luc. Şoarecii au primit patru doze o dată pe săptămână de anti-MUC16 şi ADC-uri de control la 85 μg/kg de echivalent medicament pe baza raporturilor medicament ADC:anticorp. După cum este rezumat în Tabelul 15A, H1H9519N-Compusul 7 şi H1H9521N-Compusul 7 au inhibat puternic creşterea tumorii ascitice. Aceste ADC anti-MUC16 au redus eficient dimensiunea tumorii, cu o reducere de 1OO% a luminiscenţei tumorii în raport cu controlul vehiculului. Controlul ADC nu a mediat nicio inhibare a creşterii tumorii subcutanate OVCAR/luc.
Un studiu suplimentar care evaluează eficacitatea ADC-urilor anti-MUC16 împotriva tumorii OVCAR3/luc subcutanate (SC) este rezumat în Tabelul 15B. Şoarecii au primit patru doze o dată pe săptămână de anti-MUC16 şi ADC-uri de control la 85 μg/kg de echivalent medicament pe baza raporturilor ADC medicament:anticorp. Când au fost conjugate cu Compusul 7, ADC-urile MUC16 H1H9519N- Compusul 7 şi H1H9521N- Compusul 7 au produs din nou un efect anti-tumoral semnificativ; de data aceasta împotriva tumorilor subcutanate OVCAR3/luc. În consecinţă, aceste ADC au mediat o inhibare de 1OO% şi, respectiv, 109% a creşterii tumorii. Controlul ADC nu a mediat nicio inhibare a creşterii tumorii subcutanate OVCAR/luc.
Într-un al treilea studiu, eficacitatea anticorpului anti-MUC16 H1H9521 N conjugat cu medicamentul linker Compusul 10 a fost evaluată în modelul de tumoră IP OVCAR3/luc. Şoarecii au primit doze unice de anti-MUC16 şi ADC-uri de control la 85 μg/kg, 170 μg/kg şi 340 μg/kg de echivalent medicament pe baza raporturilor medicament ADC:anticorp. După cum este rezumat în Tabelul 15C, H1H9519N-10 a inhibat puternic creşterea tumorii ascitice. Dozele de H1H9519N-Compusul 10 au dus la o inhibare de 99-100 % a luminiscenţei tumorii în raport cu vehiculul de control. S-a observat o anumită inhibare cu Control ADC utilizând Compusul 10, deşi aceasta a fost mai moderată decât cea observată după anti-MUC16 H1H9519N-Compusul 10.
Tabelul 15A: Inhibarea creşterii tumorii OVCAR3/luc IP în ziua 49 la şoarecii SCID trataţi cu anticorpi anti-MUC16 conjugaţi la compusul 7
Grup de tratament Stralucirea medie a tumorii finale (media ± SEM) Inhibarea medie a creşterii tumorii (%) Vehicul 16469750 ± 10679335 0 Control- Compound 7 85 µg/kg 16813750 ± 4026065 -2 H1H9519N- Compound 7 85 µg/kg 111254 ± 187288 100 H1H9521N- Compound 7 85 µg/kg 110413 ± 161353 100
Tabelul 15B: Inhibarea creşterii tumorii OVCAR3/luc SC în ziua 37 la şoarecii SCID trataţi cu anticorpi anti-MUC16 conjugaţi la compusul 7
Grup de tratament Stralucirea medie a tumorii finale (media ± SEM) Inhibarea medie a creşterii tumorii (%) Vehicul 1210 ± 426 0 Control- Compound 7 85 µg/kg 1737 ± 391 -51 H1H9519N- Compound 7 85 µg/kg 187 ± 269 100 H1H9521N- Compound 7 85 µg/kg 89 ± 97 109
Tabelul 15C: Inhibarea creşterii tumorii OVCAR3/luc IP în ziua 49 la şoarecii SCID trataţi cu anticorpi anti-MUC16 conjugaţi la compusul 10
Grup de tratament Stralucirea medie a tumorii finale (media ± SEM) Inhibarea medie a creşterii tumorii (%) Vehicul 29211000 ± 23504780 0 Control- Compound 10 85 µg/kg 17332625 ± 14346694 41 Control- Compound 10 170 µg/kg 32075000 ± 15623403 -10 Control- Compound 10 340 mg/kg 22882350 ± 18771913 22 H1H9521N-Compound 10 85 µg/kg 574285 ± 306844 99 H1H9521N-Compound 10 170 µg/kg 236037 ± 226948 100 H1H9521N- Compound 10 340 µg/kg 26472 ± 25079 101
Exemplul : Generarea de anticorpi anti-CD3
Anticorpii anti-CD3 au fost obţinuţi prin imunizarea unui şoarece modificat cuprinzând ADN care codifică regiuni variabile ale lanţului greu de imunoglobuline umane şi ale lanţului uşor kappa cu celule care exprimă CD3 sau cu ADN care codifică CD3. Răspunsul imun al anticorpilor a fost monitorizat printr-un imunotest specific CD3. Când s-a obţinut un răspuns imun dorit, splenocitele au fost recoltate şi fuzionate cu celule de mielom de şoarece pentru a-şi păstra viabilitatea şi a forma linii celulare de hibridom. Liniile celulare de hibridom au fost verificate şi selectate pentru a identifica liniile celulare care produc anticorpi specifici CD3. Folosind această tehnică au fost obţinuţi mai mulţi anticorpi himeric anti-CD3 (adică anticorpi care posedă domenii variabile umane şi domenii constante de şoarece). În plus, câţiva anticorpi anti-CD3 complet umani au fost izolaţi direct din celulele B pozitive pentru antigen fără fuziune cu celulele de mielom, aşa cum este descris în US 2007/0280945A1.
Anumite proprietăţi biologice ale anticorpilor anti-CD3 exemplificativi generaţi în conformitate cu metodele din acest exemplu sunt descrise în detaliu în exemplele de aici.
Exemplul 10: Secvenţe de aminoacizi şi acizi nucleici din regiunea variabilă a lanţului greu şi uşor
Tabelul 16 prezintă identificatorii secvenţei de aminoacizi ai regiunilor variabile ale lanţului greu şi uşor şi CDR-urile anticorpilor anti-CD3 selectaţi ai dezvăluirii. Identificatorii de secvenţă de acid nucleic corespunzători sunt prezentaţi în Tabelul 17. Metodele de producere a anticorpilor anti-CD3 dezvăluiţi aici pot fi găsite de asemenea în publicaţia SUA 20O14/0088295.
Tabelul 16: Identificatori de secvenţă de aminoacizi
SEQ ID NOs: Denumire anticorp HCVR HCDR1 HCDR3 LCVR LCDR11 LCDR2 LCDR3 H1H2712N 402 404 406 408 410 412 414 416 H1M2692N 418 420 422 424 426 428 430 432 H1M3542N 434 436 438 440 442 444 446 448 H1M3544N 450 452 454 456 458 460 462 464 H1M3549N 466 468 470 472 474 476 478 480 H1M3613N 482 484 486 488 490 492 494 496 H2M2689N 498 500 502 504 506 508 510 512 H2M2690N 514 516 518 520 522 524 526 528 H2M2691N 530 532 534 536 538 540 542 544 H2M2704N 546 548 550 552 554 556 558 560 H2M2705N 562 564 566 568 570 572 574 576 H2M2706N 578 580 582 584 586 588 590 592 H2M2707N 594 596 598 600 602 604 606 608 H2M2708N 610 612 614 616 618 620 622 624 H2M2709N 626 628 630 632 634 636 638 640 H2M2710N 642 644 646 648 650 652 654 656 H2M2711N 658 660 662 664 666 668 670 672 H2M2774N 674 676 678 680 682 684 686 688 H2M2775N 690 692 694 696 698 700 702 704 H2M2776N 706 708 710 712 714 716 718 720 H2M2777N 722 724 726 728 730 732 734 736 H2M2778N 738 740 742 744 746 748 750 752 H2M2779N 754 756 758 760 762 764 766 768 H2M2789N 770 772 774 776 778 780 782 784 H2M2862N 786 788 790 792 794 796 798 800 H2M2885N 802 804 806 808 810 812 814 816 H2M2886N 818 820 822 824 826 828 830 832 H2M3540N 834 836 838 840 842 844 846 848 H2M3541N 850 852 854 856 858 860 862 864 H2M3543N 866 868 870 872 874 876 878 880 H2M3547N 882 884 886 888 890 892 894 896 H2M3548N 898 900 902 904 906 908 910 912 H2M3563N 914 916 918 920 922 924 926 928 SEQ ID NOs: Denumire anticorp HCVR HCDR1 HCDR3 LCVR LCDR11 LCDR2 LCDR3 H1H5751P 930 932 934 936 938 940 942 944 H1H5752P 946 948 950 952 954 956 958 960 H1H5753B 962 964 966 968 970 972 974 976 H1H5754B 978 980 982 984 986 988 990 992 H1H5755B 994 996 998 1000 1002 1004 1006 1008 H1H5756B 1010 1012 1014 1016 1018 1020 1022 1024 H1H5757B 1026 1028 1030 1032 1034 1036 1038 1040 H1H5758B 1042 1044 1046 1048 1050 1052 1054 1056 H1H5761P 1058 1060 1062 1064 1066 1068 1070 1072 H1H5763P 1074 1076 1078 1080 1082 1084 1086 1088 H1H5764P 1090 1092 1094 1096 1098 1100 1102 1104 H1H5769P 1106 1108 1110 1112 1114 1116 1118 1120 H1H5771P 1122 1124 1126 1128 1130 1132 1134 1136 H1H5772P 1138 1140 1142 1144 1146 1148 1150 1152 H1H5777P 1154 1156 1158 1160 1162 1164 1166 1168 H1H5778P 1170 1172 1174 1176 1178 1180 1182 1184 H1H5780P 1186 1188 1190 1192 1194 1196 1198 1200 H1H 5781P 1202 1204 1206 1208 1210 1212 1214 1216 H1H5782P 1218 1220 1222 1224 1226 1228 1230 1232 H1H5785B 1234 1236 1238 1240 1242 1244 1246 1248 H1H5786B 1250 1252 1254 1256 1258 1260 1262 1264 H1H5788P 1266 1268 1270 1272 1274 1276 1278 1280 H1H5790B 1282 1284 1286 1288 1290 1292 1294 1296 H1H5791B 1298 1300 1302 1304 1306 1308 1310 1312 H1H5792B 1314 1316 1318 1320 1322 1324 1326 1328 H1H5793B 1330 1332 1334 1336 1338 1340 1342 1344 H1H5795B 1346 1348 1350 1352 1354 1356 1358 1360 H1H5796B 1362 1364 1366 1368 1370 1372 1374 1376 H1H5797B 1378 1380 1382 1384 1386 1388 1390 1392 H1H5798B 1394 1396 1398 1400 1402 1404 1406 1408 H1H5799P 1410 1412 1414 1416 1418 1420 1422 1424 H1H5801B 1426 1428 1430 1432 1434 1436 1438 1440 H1H7194B 1442 1444 1446 1448 1634 1636 1638 1640 H1H7195B 1450 1452 1454 1456 1634 1636 1638 1640 H1H7196B 1458 1460 1462 1464 1634 1636 1638 1640 H1H7198B 1466 1468 1470 1472 1634 1636 1638 1640 H1H7203B 1474 1476 1478 1480 1634 1636 1638 1640 H1H7204B 1482 1484 1486 1488 1634 1636 1638 1640 H1H7208B 1490 1492 1494 1496 1634 1636 1638 1640
SEQ ID NOs: Denumie anticorp HCVR HCDR1 HCDR3 LCVR LCDR11 LCDR2 LCDR3 H1H7211B 1498 1500 1502 1504 1634 1636 1638 1640 H1H7221B 1506 1508 1510 1512 1634 1636 1638 1640 H1H7223B 1514 1516 1518 1520 1634 1636 1638 1640 H1H7226B 1522 1524 1526 1528 1634 1636 1638 1640 H1H7232B 1530 1532 1534 1536 1634 1636 1638 1640 H1H7233B 1538 1540 1542 1544 1634 1636 1638 1640 H1H7241B 1546 1548 1550 1552 1634 1636 1638 1640 H1H7242B 1554 1556 1558 1560 1634 1636 1638 1640 H1H7250B 1562 1564 1566 1568 1634 1636 1638 1640 H1H7251B 1570 1572 1574 1576 1634 1636 1638 1640 H1H7254B 1578 1580 1582 1584 1634 1636 1638 1640 H1H7258B 1586 1588 1590 1592 1634 1636 1638 1640 H1H7269B 1594 1596 1598 1600 1634 1636 1638 1640 H1H7279B 1602 1604 1606 1608 1634 1636 1638 1640 H1xH7221G 1610 1612 1614 1616 1634 1636 1638 1640 H1xH7221G3 1618 1620 1622 1624 1634 1636 1638 1640 H1xH7221G5 1626 1628 1630 1632 1634 1636 1638 1640
Tabelul 17: Identificatori de secvenţă de acid nucleic
SEQ ID NOs: Denumire anticorp HCVR HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCVR LCDR1 LCDR2 LCDR3 H1H2712N 401 403 405 407 409 411 413 415 H1M2692N 417 419 421 423 425 427 429 431 H1M3542N 433 435 437 439 441 443 445 447 H1M3544N 449 451 453 455 457 459 461 463 H1M3549N 465 467 469 471 473 475 477 479 H1M3613N 481 483 485 487 489 491 493 495 H2M2689N 497 499 501 503 505 507 509 511 H2M2690N 513 515 517 519 521 523 525 527 H2M2691N 529 531 533 535 537 539 541 543 H2M2704N 545 547 549 551 553 555 557 559 H2M2705N 561 563 565 567 569 571 573 575 H2M2706N 577 579 581 583 585 587 589 591 H2M2707N 593 595 597 599 601 603 605 607 H2M2708N 609 611 613 615 617 619 621 623 H2M2709N 625 627 629 631 633 635 637 639
SEQ ID NOs: Denumire anticorp HCVR HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCVR LCDR1 LCDR2 LCDR3 H2M2710N 641 643 645 647 649 651 653 655 H2M2711N 657 659 661 663 665 667 669 671 H2M2774N 673 675 677 679 681 683 685 687 H2M2775N 689 691 693 695 697 699 701 703 H2M2776N 705 707 709 711 713 715 717 719 H2M2777N 721 723 725 727 729 731 733 735 H2M2778N 737 739 741 743 745 747 749 751 H2M2779N 753 755 757 759 761 763 765 767 H2M2789N 769 771 773 775 777 779 781 783 H2M2862N 785 787 789 791 793 795 797 799 H2M2885N 801 803 805 807 809 811 813 815 H2M2886N 817 819 821 823 825 827 829 831 H2M3540N 833 835 837 839 841 843 845 847 H2M3541N 849 851 853 855 857 859 861 863 H2M3543N 865 867 869 871 873 875 877 879 H2M3547N 881 883 885 887 889 891 893 895 H2M3548N 897 899 901 903 905 907 909 911 H2M3563N 913 915 917 919 921 923 925 927 H1H5751P 929 931 933 935 937 939 941 943 H1H5752P 945 947 949 951 953 955 957 959 H1H5753B 961 963 965 967 969 971 973 975 H1H5754B 977 979 981 983 985 987 989 991 H1H5755B 993 995 997 999 1001 1003 1005 1007 H1H5756B 1009 1011 1013 1015 1017 1019 1021 1023 H1H5757B 1025 1027 1029 1031 1033 1035 1037 1039 H1H5758B 1041 1043 1045 1047 1049 1051 1053 1055 H1H5761P 1057 1059 1061 1063 1065 1067 1069 1071 H1H5763P 1073 1075 1077 1079 1081 1083 1085 1087 H1H5764P 1089 1091 1093 1095 1097 1099 1101 1103 H1H5769P 1105 1107 1109 1111 1113 1115 1117 1119 H1H5771P 1121 1123 1125 1127 1129 1131 1133 1135 H1H5772P 1137 1139 1141 1143 1145 1147 1149 1151 H1H5777P 1153 1155 1157 1159 1161 1163 1165 1167 H1H5778P 1169 1171 1173 1175 1177 1179 1181 1183 H1H5780P 1185 1187 1189 1191 1193 1195 1197 1199 H1H5781P 1201 1203 1205 1207 1209 1211 1213 1215 H1H5782P 1217 1219 1221 1223 1225 1227 1229 1231
SEQ ID NOs: Denumire anticorp HCVR HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCVR LCDR1 LCDR2 LCDR3 H1H5785B 1233 1235 1237 1239 1241 1243 1245 1247 H1H5786B 1249 1251 1253 1255 1257 1259 1261 1263 H1H5788P 1265 1267 1269 1271 1273 1275 1277 1279 H1H5790B 1281 1283 1285 1287 1289 1291 1293 1295 H1H5791B 1297 1299 1301 1303 1305 1307 1309 1311 H1H5792B 1313 1315 1317 1319 1321 1323 1325 1327 H1H5793B 1329 1331 1333 1335 1337 1339 1341 1343 H1H5795B 1345 1347 1349 1351 1353 1355 1357 1359 H1H5796B 1361 1363 1365 1367 1369 1371 1373 1375 H1H5797B 1377 1379 1381 1383 1385 1387 1389 1391 H1H5798B 1393 1395 1397 1399 1401 1403 1405 1407 H1H5799P 1409 1411 1413 1415 1417 1419 1421 1423 H1H5801B 1425 1427 1429 1431 1433 1435 1437 1439 H1H7194B 1441 1443 1445 1447 1633 1635 1637 1639 H1H7195B 1449 1451 1453 1455 1633 1635 1637 1639 H1H7196B 1457 1459 1461 1463 1633 1635 1637 1639 H1H7198B 1465 1467 1469 1471 1633 1635 1637 1639 H1H7203B 1473 1475 1477 1479 1633 1635 1637 1639 H1H7204B 1481 1483 1485 1487 1633 1635 1637 1639 H1H7208B 1489 1491 1493 1495 1633 1635 1637 1639 H1H7211B 1497 1499 1501 1503 1633 1635 1637 1639 H1H7221B 1505 1507 1509 1511 1633 1635 1637 1639 H1H7223B 1513 1515 1517 1519 1633 1635 1637 1639 H1H7226B 1521 1523 1525 1527 1633 1635 1637 1639 H1H7232B 1529 1531 1533 1535 1633 1635 1637 1639 H1H7233B 1537 1539 1541 1543 1633 1635 1637 1639 H1H7241B 1545 1547 1549 1551 1633 1635 1637 1639 H1H7242B 1553 1555 1557 1559 1633 1635 1637 1639 H1H7250B 1561 1563 1565 1567 1633 1635 1637 1639 H1H7251B 1569 1571 1573 1575 1633 1635 1637 1639 H1H7254B 1577 1579 1581 1583 1633 1635 1637 1639 H1H7258B 1585 1587 1589 1591 1633 1635 1637 1639 H1H7269B 1593 1595 1597 1599 1633 1635 1637 1639 H1H7279B 1601 1603 1605 1607 1633 1635 1637 1639 H1xH7221G 1609 1611 1613 1615 1633 1635 1637 1639 H1xH7221G3 1617 1619 1621 1623 1633 1635 1637 1639 H1xH7221G5 1625 1627 1629 1631 1633 1635 1637 1639
La anticorpi se face referire în mod obişnuit aici conform următoarei nomenclaturi: prefixul Fc (de ex. „H1H», „M1M», „H2M» etc.), urmat de un identificator numeric (de exemplu, „2712», „2692» etc., după cum se arată în Tabelul 1), urmat de un „P», „ N» sau sufixul „B». Astfel, conform acestei nomenclaturi, un anticorp poate fi denumit aici, de exemplu, "H1H2712N", "H1M2692N", "H2M2689N" etc.
Prefixele H1H, H1M şi H2M de pe denumirile anticorpilor utilizate aici indică izotipul particular al regiunii Fc a anticorpului. De exemplu, un anticorp „H1H» are un Fc lgG1 uman, un anticorp „H1M» are un Fc lgG1 de şoarece şi un anticorp „H2M» are un Fc lgG2 de şoarece (toate regiunile variabile sunt complet umane, aşa cum este indicat de prima „H» în denumirea anticorpului). După cum va fi apreciat de o persoană cu calificare obişnuită în domeniu, un anticorp având un anumit izotip Fc poate fi convertit într-un anticorp cu un izotip Fc diferit (de exemplu, un anticorp cu un Fc lgG1 de şoarece poate fi convertit într-un anticorp cu un lgG4 uman etc.), dar în orice caz, domeniile variabile (inclusiv CDR-urile) - care sunt indicate de identificatorii numerici prezentaţi în Tabelul 1 - vor rămâne aceleaşi, iar proprietăţile de legare sunt de aşteptat să fie identice sau substanţial similare indiferent de natura domeniului Fc.
Tabelele 18 şi 19 prezintă identificatorii secvenţei de aminoacizi pentru regiunile variabile ale lanţului greu (Tabelul 18) şi regiunile variabile ale lanţului uşor (Tabelul 19) şi CDR-urile corespunzătoare acestora, ale HCVR şi LCVR-uri suplimentare anti-CD3 utile în anti-MUC16 x anti. - anticorpi bispecifici CD3 ai dezvăluirii.
Tabelul 18 (Secvenţe de aminoacizi din regiunea variabilă a lanţului greu)
SEQ ID NOs Identificator al lanţului greu HCVR HCDR1 HCDR2 HCDR3 CD3-VH-AA 1642 1644 1646 1648 CD3-VH-B 1658 1660 1662 1664 CD3-VH-C 1674 1676 1678 1680 CD3-VH-D 1690 1692 1694 1696 CD3-VH-E 1706 1708 1710 1712 CD3-VH-F# 1721 1722 1723 1724
Tabelul 19 (Secvenţe de aminoacizi din regiunea variabilă a lanţului uşor)
SEQ ID NOs Identificator al lanţului uşor LCVR LCDR1 LCDR2 LCDR3 CD3-VL-AA 1650 1652 1654 1656 CD3-VL-B 1666 1668 1670 1672 CD3-VL-C 1682 1684 1686 1688 CD3-VL-D 1698 1700 1702 1704 CD3-VL-E 1714 1716 1718 1720 CD3-VL-F# 1725 1726 1727 1728
Regiunile variabile ale lanţului greu şi uşor ale CD3-VH-F şi CD3-VL-F au fost derivate din anticorpul anti-CD3 desemnat „L2K» aşa cum este prezentat în WO2004/106380.
În plus, Tabelele 20 şi 21 stabilesc identificatorii de secvenţă pentru secvenţele de nucleotide care codifică regiunile variabile ale lanţului greu (Tabelul 2O) şi regiunile variabile ale lanţului uşor (Tabelul 21) şi CDR-urile corespunzătoare ale HCVR-urilor şi LCVR-urilor suplimentare anti-CD3 utile. în anticorpii bispecifici anti-MUC16 x anti-CD3 ai dezvăluirii.
Tabelul 20 (Secvenţe de nucleotide care codifică secvenţe de regiune variabilă a lanţului greu)
SEQ ID NOs Identificator al lanţului greu HCVR HCDR1 HCDR2 HCDR3 CD3-VH-AA 1641 1643 1645 1647 CD3-VH-B 1657 1659 1661 1663 CD3-VH-C 1673 1675 1677 1679 CD3-VH-D 1689 1691 1693 1695 CD3-VH-E 1705 1707 1709 1711
Tabelul 21 (Secvenţe de nucleotide care codifică secvenţele de regiune variabilă a lanţului uşor)
SEQ ID NOs Identificator al lanţului uşor LCVR LCDR1 LCDR2 LCDR3 CD3-VL-AA 1649 1651 1653 1655 CD3-VL-B 1665 1667 1669 1671 CD3-VL-C 1681 1683 1685 1687 CD3-VL-D 1697 1699 1701 1703 CD3-VL-E 1713 1715 1717 1719
Construcţii de control utilizate în următoarele exemple
Diverse constructe de control (anticorpi anti-CD3) au fost incluse în cele ce urmează experimente în scopuri comparative: "OKT-3", un anticorp monoclonal de şoarece împotriva antigenelor de suprafaţă a celulelor T umane, disponibil de la American Type Culture Collection (ATCC) sub catalogul nr. CRL-8001; şi "SP34", un anticorp monoclonal de şoarece disponibil comercial, obţinut, de exemplu, de la Biolegend, San Diego, CA (Cat. Nr. 3O2914) sau BD Pharmagen, Cat. 55052, reactiv împotriva lanţului epsilon al complexului T3 de pe celulele limfocitelor T umane.
Exemplul 13: Generarea de anticorpi suplimentari anti-CD3
Următoarele proceduri au avut ca scop identificarea anticorpilor care au recunoscut în mod specific CD3 (co-receptor de celule T) ca antigen.
Un grup de anticorpi anti-CD3 a fost obţinut de la un şoarece modificat genetic. Pe scurt, şoarecii au fost imunizaţi cu un antigen CD3 şi au generat celule B care au cuprins o diversitate de rearanjamente VH umane pentru a exprima un repertoriu divers de anticorpi specifici antigenului de înaltă afinitate. Anticorpii descrişi în Tabelele 22-25 au aceeaşi secvenţă de lanţ uşor de VK1-39JK5 (LCVR prezentat în SEQ ID NO: 1890).
Anticorpii generaţi au fost testaţi pentru legarea la antigenul CD3 uman şi al maimuţei cynomolgus într-un test de legare in vitro şi, de ex. un anticorp CD3: CD3-VH-P desemnat (HCVR prezentat în SEQ ID NO: 1882) a fost identificat, printre alţii, care s-a găsit că se leagă atât la CD3 uman, cât şi la cynomolgus având o legare EC50 între 1 şi 40 nM (sau titrarea de legare a celulelor), aşa cum s-a determinat într-o titrare FACS a celulelor Jurkat şi, respectiv, a celulelor T cynomolgus. A se vedea, de asemenea, de exemplu, experimentele de legare FACS prezentate în Exemplul 13 şi în PCT/US2016/O44732 depus la 29 iulie 2016.
Resturile de aminoacizi ale liniei germinale ale CD3-VH-P au fost identificate ulterior (rearanjarea V-D-J pentru CD3-VH-P este IGHV3-9*01, IGHJ6*02, IGHD5-12*01) şi un anticorp denumit „CD3-VH-G " a fost conceput pentru a conţine doar cadre germinale. Alţi derivaţi de anticorpi au fost modificaţi prin tehnici de clonare moleculară bine-cunoscute pentru a înlocui reziduurile de aminoacizi într-o manieră treptată, pe baza diferenţelor dintre secvenţa liniei germinale şi secvenţa CD3-VH-P.
Fiecărui derivat de anticorp i se dă o desemnare a numărului „CD3-VH-G». Vezi Tabelul 18.
În timp ce CD3-VH-G şi alţi anticorpi modificaţi şi-au păstrat legarea aşa cum s-a observat în testele FACS, câţiva anticorpi anti-CD3 s-au legat la CD3 uman sau cynomolgus in vitro cu legare slabă până la deloc măsurabilă, cum ar fi EC5O 4O nM. Afinităţile de legare, cinetica de legare şi alte proprietăţi biologice pentru a elucida toxicitatea şi profilurile farmacocinetice (pK) au fost investigate ulterior pentru anticorpi bispecifici care cuprind anticorpii anti-CD3 exemplificaţi generaţi în conformitate cu metodele din acest exemplu, sunt descrise în detaliu în exemplele de aici.
Exemplul 12: Regiunile variabile ale lanţului greu şi uşor (secvenţele de aminoacizi şi acizi nucleici ale CDR-urilor)
Tabelul 22 prezintă identificatorii secvenţei de aminoacizi ai regiunilor variabile ale lanţului greu şi CDR-urile anticorpilor anti-CD3 selectaţi ai dezvăluirii. Identificatorii de secvenţă de acid nucleic corespunzători sunt prezentaţi în Tabelul 23.
Secvenţele de aminoacizi şi acid nucleic au fost determinate pentru fiecare secvenţă de lanţ greu de anticorp. Fiecărui lanţ greu de anticorp derivat din secvenţa liniei germinale (SEQ ID NO: 1910) i s-a atribuit o desemnare a numărului „G» pentru o nomenclatură consistentă. Tabelul 22 prezintă identificatorii secvenţei de aminoacizi ai regiunilor variabile ale lanţului greu şi CDR-urile anticorpilor anti-CD3 modificaţi conform invenţiei. Identificatorii de secvenţă de acid nucleic corespunzători sunt prezentaţi în Tabelul 23. Identificatorii secvenţei de aminoacizi şi acid nucleic ai regiunii variabile ale lanţului uşor şi CDR-urile sunt de asemenea identificaţi mai jos în Tabelele 24 şi, respectiv, 25.
Tabelul 22: Identificatori de secvenţă de aminoacizi cu lanţ greu
Desemnarea anticorpului CD3-VH SEQ ID NOs: HCVR CDR1 CDR2 CDR3 CD3-VH-G 1730 1732 1734 1736 CD3-VH-G2 1738 1740 1742 1744 CD3-VH-G3 1746 1748 1750 1752 CD3-VH-G4 1754 1756 1758 1760 Desemnarea anticorpului CD3-VH SEQ ID NOs: HCVR CDR1 CDR2 CDR3 CD3-VH-G5 1762 1764 1766 1768 CD3-VH-G8 1770 1772 1774 1776 CD3-VH-G9 1778 1780 1782 1784 CD3-VH-G10 1786 1788 1790 1792 CD3-VH-G11 1794 1796 1798 1800 CD3-VH-G12 1802 1804 1806 1808 CD3-VH-G13 1810 1812 1814 1816 CD3-VH-G14 1818 1820 1822 1824 CD3-VH-G15 1826 1828 1830 1832 CD3-VH-G16 1834 1836 1838 1840 CD3-VH-G17 1842 1844 1846 1848 CD3-VH-G18 1850 1852 1854 1856 CD3-VH-G19 1858 1860 1862 1864 CD3-VH-G20 1866 1868 1870 1872 CD3-VH-G21 1874 1876 1878 1880 CD3-VH-P 1882 1884 1886 1888
Tabelul 23: Identificatori de secvenţă de acid nucleic cu lanţ greu
Desemnarea anticorpului CD3-VH SEQ ID NOs: HCVR CDR1 CDR2 CDR3 CD3-VH-G 1729 1731 1733 1735 CD3-VH-G2 1737 1739 1741 1743 CD3-VH-G3 1745 1747 1749 1751 CD3-VH-G4 1753 1755 1757 1759 CD3-VH-G5 1761 1763 1765 1767 CD3-VH-G8 1769 1771 1773 1775 CD3-VH-G9 1777 1779 1781 1783 CD3-VH-G10 1785 1787 1789 1791 CD3-VH-G11 1793 1795 1797 1799 CD3-VH-G12 1801 1803 1805 1807 CD3-VH-G13 1809 1811 1813 1815 CD3-VH-G14 1817 1819 1821 1823 CD3-VH-G15 1825 1827 1829 1831 CD3-VH-G16 1833 1835 1837 1839 CD3-VH-G17 1841 1843 1845 1847 CD3-VH-G18 1849 1851 1853 1855 CD3-VH-G19 1857 1859 1861 1863 Desemnarea anticorpului CD3-VH SEQ ID NOs: HCVR CDR1 CDR2 CDR3 CD3-VH-G21 1873 1875 1877 1879 CD3-VH-P 1881 1883 1885 1887
Tabelul 24: Identificatori de secvenţă de aminoacizi a lanţului uşor
Desemnarea anticorpului SEQ ID NOs: LCVR CDR1 CDR2 CDR3 VK1-39JK5 1890 1892 1894 1896
Tabelul 25: Identificatori de secvenţă de acid nucleic al lanţului uşor
Desemnarea antcorpului SEQ ID NOs: LCVR CDR1 CDR2 CDR3 VK1-39JK5 1889 1891 1893 1895
Anticorpul de control 1 desemnat "CD3-L2K" a fost construit pe baza unui anticorp anti-CD3 cunoscut (adică, anticorpul anti-CD3 "L2K" aşa cum este prezentat în WO2004/106380).
Anticorpul de control al izotipului, la care se face referire în exemplele de aici, este un anticorp cu izotip (lgG4 modificat) care interacţionează cu un antigen irelevant, de exemplu Antigenul FelD1.
Exemplul 15: Studii in vitro şi in vivo asupra anticorpilor monoclonali umani anti-CD3
Studiile in vivo şi in vitro asupra anticorpilor monoclonali umani anti-CD3 au fost realizate aşa cum este descris în publicaţia SUA 2014/0088295 publicată pe 27 martie 2014 şi PCT/US2016/044732 depusă pe 29 iulie 2016, care sunt încorporate aici ca referinţă.
Unii anticorpi monoclonali umani anti-CD3 ai prezentei invenţii leagă proteina CD3 heterodimerică solubilă, fie în formate de captare a anticorpilor, fie în formate de captare a antigenului, cu afinitate ridicată. Proteina CD3 heterodimerică solubilă (hCD3-epsilon/hCD3-delta; SEQ ID NO: 1900/1901) a fost preparată fie cu o etichetă Fc umană (hFcΔAdp/hFc; SEQ ID NO: 1931/1932), fie cu o etichetă Fc de şoarece (mFcΔAdp/). mFc; SEQ ID NO: 1933/1934). Proteina CD3 heterodimerică a fost purificată folosind metoda descrisă în Davis şi colab. (US2010/0331527).
Unii anticorpi monoclonali umani anti-CD3 ai invenţiei au legat celulele T umane şi au indus proliferarea celulelor T. Unii anticorpi monoclonali umani anti-CD3 ai invenţiei au legat celulele T de maimuţă CD2+CD4+ şi au indus proliferarea acestora. Unii anticorpi monoclonali umani anti-CD3 au susţinut uciderea mediată de celule T redirecţionate prin interacţiunea Fc/FcR într-un test de ucidere a U937 pe bază de calceină. Uciderea observată, care se crede că depinde de Fc-ul anticorpului angajarea cu receptorul Fc pe celulele U937 care duce la gruparea CD3 pe celulele T adiacente, a fost oprită prin adăugarea de IgG umană nespecifică (datele nu sunt prezentate). O gamă largă de anticorpi bispecifici construiţi cu variante de braţ anti-CD3 descrise aici (în special braţele anti-CD3 bazate pe lanţul greu CD3-VH-P derivat din IGHV3-9*01, IGHJ6*02, IGHD5-12*01) activează celulele PBMC umane şi PBMC de maimuţă şi prezintă activitate citotoxică pe liniile celulare care exprimă antigenul tumoral.
Exemplul de referinţă 3: Screening-ul şi identificarea anticorpilor monoclonali anti-MUC16 adecvaţi pentru imunohistochimie (IHC) pe probe încorporate în parafină fixată cu formalină (FFPE).
Au fost identificate linii de celule tumorale umane cu niveluri cunoscute de exprimare a MUC16, fixate în formalină tamponată neutră 1O% şi încorporate în parafină. Aceste linii au fost folosite pentru a verifica diverşi anticorpi anti-MUC16 pentru a identifica candidaţii pentru studiile IHC.
Liniile celulare au inclus următoarele linii celulare negative MUC16:
HT29 (Colon) şi PC3/ATCC parental (Prostată); Linii de celule pancreatice cu niveluri scăzute până la deloc de MUC16: Capanl (adenocarcinom pancreatic), HPAC (adenocarcinom pancreatic).
Liniile celulare care exprimă MUC16 endogen includ: OVCAR3 (ovarian) şi PEO-1 (carcinom ovarian seros).
Liniile celulare transfectate au fost concepute după cum urmează: celulele PC3/ATCC (linia parentală de cancer de prostată) au fost transfectate pentru a genera linii celulare PC3/MUC16 „scurte» şi PC3/MUC16 „înalte». Ambele construcţii includ domeniul C-terminal al MUC16 din aminoacizii 13.810-14.507 (din SEQ ID NO: 1899), iar acesta include o parte din domeniul SEA12, SEA13, SEA14, SEA15, SEA16, regiunea C-terminală non-SEA , regiunea transmembranară şi domeniul citoplasmatic. În plus, celulele PC3/MUC înalte au aminoacizi N-terminali suplimentari 12783-13467 (din SEQ ID NO: 1899) care includ SEA5 (parţial) până la SEA9 şi un linker scurt între domeniul SEA9 şi începutul scurtului MUC16 construi.
Acest lucru permite diferenţierea între anticorpii anti-MUC16 care se leagă în regiunea repetă şi cei care se leagă la porţiunea „nub» a MUC16 adiacentă membranei după clivaj enzimatic şi eliberare a regiunilor repetate (analog cu porţiunea CA125 a MUC16).
Toată colorarea a fost efectuată pe autostainer Ventana Discovery XT utilizând protocoale standard. Peletele celulare au fost deparafinate, recuperarea epitopului indusă de căldură a fost optimizată, biotina endogenă a fost blocată şi a fost efectuată blocarea proteinelor. Anticorpii au fost aplicaţi manual la o concentraţie iniţială de 10μg/ml şi au fost, de asemenea, titraţi pentru a asigura specificitatea semnalului. S-a făcut comparaţie cu un anticorp anti-MUC16 disponibil comercial (OC-125), care este specific pentru regiunile repetate ale CA-125 (Roche, Ventana Catalog # 760-2610) şi un control negativ (absenţa anticorpului primar). Detectarea a fost cu Donkey anti-şoarece-Biotin urmată de Streptavidin-Peroxidază de hrean. Conversia substratului, Di-amino Benzidine (DAB) a fost observată ca colorare maro.
Probele au fost contracolorate cu hematoxilină pentru a vizualiza nucleele. Rezultatele experimentelor de colorare sunt prezentate în Tabelul 26 de mai jos.
Tabelul 26: Legarea anticorpilor anti-MUC16 la celulele MUC16 negative şi la celulele care exprimă MUC16 sau porţiunile proximale ale membranei MUC16
Linia celulară: HT29 Capan1 HPAC OVCAR3 PEO-1 PC3/ATCC parental PC3/MUC16 Short PC3/MUC16 High H1M7130N - - - +++ ++ - +++ +++ H2aM7128N - - + +++ ++ - +++ +++ H2aM7131N - - - +++ ++ - +++ +++ H2aM7133N - - - +++ ++ - - - H2aM7138N - - + +++ ++ - +++ +++ H1M9519N - NT NT +++ +++ NT - +++ H3M9525N - NT NT - - NT - - OC-125 - - + +++ ++ - - +++ Neg. Control - - - - - - - - NT - netestat
Patru dintre anticorpii testaţi (H1M7130N, H2aM7128N, H2aM7131N şi H2aM7138N) au prezentat legare pozitivă la celulele care exprimă porţiunea „nub» a MUC16 fără regiuni repetate (PC3/MUC16 scurt). Aceşti anticorpi sunt identificaţi ca „legători nub.„ Unul dintre anticorpii testaţi (H1M9519N) a arătat legare pozitivă la celulele care exprimă regiunile repetate ale MUC16 (PC3/MUC16 ridicat), dar legare negativă la celule care exprimă doar porţiunea „nub» a MUC16 (PC3/MUC16 scurt). Acest anticorp este identificat ca un "legător repetat", similar cu anticorpul OC-125 disponibil comercial. Este de aşteptat ca anticorpii testaţi să leagă ţesuturi sau celule de origine diferită având proteinele exprimate şi/sau fragmentele de proteine aşa cum este descris aici.

Claims (14)

1. Un anticorp bispecific sau un fragment de legare la antigen al acestuia care cuprinde un prim domeniu de legare la antigen care leagă în mod specific CD3 uman şi un al doilea domeniu de legare la antigen care leagă în mod specific MUC16 uman, în care al doilea domeniul de legare a antigenului cuprinde domeniile HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3, respectiv, cuprinzând secvenţele de aminoacizi ale SEQ ID NO: 20-22-24-28-30-32.
2. Anticorpul bispecific sau fragment de legare la antigen conform revendicării 1, care cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 18 şi o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 26.
3. Anticorpul bispecific sau fragment de legare la antigen conform revendicării 1 sau 2, în care primul domeniu de legare a antigenului care leagă în mod specific CD3 uman cuprinde domenii HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3, cuprinzând secvenţe de aminoacizi selectate dintre grupul constând din SEQ ID NO: 1732-1734-1736-28-30-32, 1764-1766-1768-28-30-32, 1780-1782-1784-28-30-32, 1788-1792-- 28-30-32 şi 1868-1870-1872-28-30-32.
4. Anticorpul bispecific sau fragment de legare la antigen conform revendicării 3, în care primul domeniu de legare la antigen care leagă CD3 uman cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu (HCVR) care cuprinde o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SEQ ID NO: 1730 , 1762, 1778, 1786 şi 1866, şi o regiune variabilă a lanţului uşor (LCVR) care cuprinde secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 26.
5. Anticorpul bispecific sau fragment de legare la antigen conform revendicării 3, în care primul domeniu de legare a antigenului cuprinde domenii HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3, respectiv secvenţele de aminoacizi ale SEQ ID NO: 1732-1734 -1736-28-30-32 şi al doilea domeniu de legare la antigen cuprinde domeniile HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3, respectiv secvenţele de aminoacizi ale SEQ ID NO: 20-22-24-28-30 -32.
6. Anticorpul bispecific sau fragment de legare la antigen conform revendicării 3, în care primul domeniu de legare a antigenului cuprinde domenii HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3, respectiv secvenţele de aminoacizi ale SEQ ID NO: 1868-1870 -1872-28-30-32 şi al doilea domeniu de legare a antigenului cuprinde domeniile HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3, respectiv secvenţele de aminoacizi ale SEQ ID NO: 20-22-24-28-30 -32.
7. Anticorpul bispecific conform revendicării 5, în care primul domeniu de legare la antigen cuprinde un HCVR care cuprinde secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 1730 şi un LCVR cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 26 şi în care al doilea antigen -domeniul de legare cuprinde un HCVR care cuprinde secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 18 şi un LCVR cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 26.
8. Anticorpul bispecific conform revendicării 6, în care primul domeniu de legare a antigenului cuprinde un HCVR care cuprinde secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 1866 şi un LCVR cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 26 şi în care al doilea antigen -domeniul de legare cuprinde un HCVR care cuprinde secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 18 şi un LCVR cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 26.
9. Anticorpul bispecific conform revendicării 7, care cuprinde un prim braţ de legare care cuprinde un lanţ greu care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 1961 şi un lanţ uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 1960 şi un al doilea braţ de legare cuprinzând un lanţ greu care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 1959 şi un lanţ uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 1960.
10. Anticorpul bispecific conform revendicării 8, care cuprinde un prim braţ de legare cuprinzând un lanţ greu care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 1962 şi un lanţ uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 1960 şi un al doilea braţ de legare cuprinzând un lanţ greu care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 1959 şi un lanţ uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 1960.
11. O compoziţie farmaceutică cuprinzând anticorpul bispecific sau fragmentul de legare la antigen conform oricăreia dintre revendicările 1-10 şi un purtător sau diluant acceptabil farmaceutic.
12. Anticorpul bispecific sau fragmentul de legare la antigen conform oricăreia dintre revendicările 1-10, sau compoziţia farmaceutică conform revendicării 11, pentru utilizare într-o metodă de tratare a unui cancer care exprimă MUC16.
13. Anticorpul bispecific sau fragmentul de legare la antigen, sau compoziţia farmaceutică, pentru utilizare conform revendicării 12, în care cancerul este selectat din grupul constând din cancer ovarian, cancer de sân, cancer pancreatic, cancer pulmonar fără celule mici, colangiocarcinom intrahepatic. tip de formare de masă, adenocarcinom al colului uterin şi adenocarcinom al tractului gastric.
14. Anticorpul bispecific sau fragmentul de legare la antigen, sau compoziţia farmaceutică, pentru utilizare conform revendicării 12, în care cancerul este cancer ovarian.
MDE20190826T 2016-09-23 2017-09-22 Anticorpi bispecifici anti-MUC16-CD3 și conjugate anticorp anti-MUC16-medicament MD3515487T2 (ro)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662399249P 2016-09-23 2016-09-23
US201762558711P 2017-09-14 2017-09-14
PCT/US2017/053113 WO2018067331A1 (en) 2016-09-23 2017-09-22 Bi specific anti-muc16-cd3 antibodies and nti-muc16 drug conjugates

Publications (1)

Publication Number Publication Date
MD3515487T2 true MD3515487T2 (ro) 2023-11-30

Family

ID=60083442

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MDE20190826T MD3515487T2 (ro) 2016-09-23 2017-09-22 Anticorpi bispecifici anti-MUC16-CD3 și conjugate anticorp anti-MUC16-medicament

Country Status (28)

Country Link
US (4) US10941208B2 (ro)
EP (3) EP3515946B1 (ro)
JP (2) JP7066690B2 (ro)
KR (2) KR102531251B1 (ro)
CN (2) CN110214026B (ro)
AU (2) AU2017339711B2 (ro)
BR (2) BR112019005697A2 (ro)
CA (2) CA3037536C (ro)
CL (4) CL2019000712A1 (ro)
CO (1) CO2019003967A2 (ro)
DK (2) DK3515487T5 (ro)
ES (2) ES2952735T3 (ro)
FI (1) FI3515487T3 (ro)
HR (2) HRP20221202T1 (ro)
HU (2) HUE063020T2 (ro)
IL (2) IL265369B2 (ro)
LT (2) LT3515487T (ro)
MD (1) MD3515487T2 (ro)
MX (2) MX2019003322A (ro)
MY (2) MY194596A (ro)
PH (2) PH12019500550A1 (ro)
PL (2) PL3515487T3 (ro)
PT (2) PT3515487T (ro)
RS (2) RS63660B1 (ro)
SI (2) SI3515487T1 (ro)
SM (2) SMT202300308T1 (ro)
WO (2) WO2018067331A1 (ro)
ZA (2) ZA201901557B (ro)

Families Citing this family (64)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI635098B (zh) 2013-02-01 2018-09-11 再生元醫藥公司 含嵌合恆定區之抗體
US10556952B2 (en) 2015-03-30 2020-02-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Heavy chain constant regions with reduced binding to Fc gamma receptors
TWI796283B (zh) 2015-07-31 2023-03-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｍｓｌｎ及ｃｄ３抗體構築體
TWI744242B (zh) 2015-07-31 2021-11-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Egfrviii及cd3抗體構築體
TWI829617B (zh) 2015-07-31 2024-01-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｆｌｔ３及ｃｄ３抗體構築體
EA039859B1 (ru) 2015-07-31 2022-03-21 Эмджен Рисерч (Мюник) Гмбх Биспецифические конструкты антител, связывающие egfrviii и cd3
TWI784917B (zh) 2015-09-23 2022-11-21 美商再生元醫藥公司 最優化抗ｃｄ３雙特異性抗體及其用途
US11583593B2 (en) 2016-01-14 2023-02-21 Synthis Therapeutics, Inc. Antibody-ALK5 inhibitor conjugates and their uses
TN2018000266A1 (en) 2016-02-03 2020-01-16 Amgen Res Munich Gmbh Psma and cd3 bispecific t cell engaging antibody constructs.
HRP20221202T1 (hr) 2016-09-23 2022-12-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-muc16 (mucin 16) antitijela
FI3548515T3 (fi) 2016-12-01 2026-03-04 Regeneron Pharma Radioleimattuja anti-PD-L1-vasta-aineita immuno-PET-kuvantamiseen
AU2018219909B2 (en) * 2017-02-10 2025-02-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Radiolabeled anti-LAG3 antibodies for immuno-PET imaging
RU2747095C2 (ru) * 2018-05-11 2021-04-26 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский научный центр рентгенорадиологии" Министерства здравоохранения российской федерации (ФГБУ "РНЦРР" Минздрава России) Мономолекулярный химерный т-клеточный рецептор к раковому антигену са125
CN108659131B (zh) * 2018-05-28 2021-09-14 长春力太生物技术有限公司 一种抗ceacam-5的单域抗体及其应用
CA3104098A1 (en) 2018-06-21 2019-12-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Bispecific anti-psma x anti-cd28 antibodies and uses thereof
TWI890661B (zh) * 2018-06-21 2025-07-21 美商再生元醫藥公司 用雙特異性抗CD3xMUC16抗體及抗PD-1抗體治療癌症的方法
TWI838389B (zh) * 2018-07-19 2024-04-11 美商再生元醫藥公司 雙特異性抗-BCMAｘ抗-CD3抗體及其用途
EA202190315A1 (ru) 2018-07-19 2021-04-16 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Химерные антигенные рецепторы со специфичностью к bcma и их применение
KR20210049863A (ko) 2018-08-23 2021-05-06 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 항-Fc 엡실론-R1 알파 (FCERIA) 항체, FCERIA 및 CD3에 결합하는 이중특이적 항원-결합 분자 및 이들의 용도
IL280875B2 (en) 2018-08-31 2024-12-01 Regeneron Pharma Dosing strategy that mitigates cytokine release syndrome for cd3/c20 bispecific antibodies
EP3874276B1 (en) 2018-10-31 2023-09-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method and system of identifying and quantifying a protein
EP4640698A3 (en) * 2018-11-16 2026-02-25 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Antibodies to mucin-16 and methods of use thereof
US11249089B2 (en) 2018-12-12 2022-02-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. System and method of analysis of a protein using liquid chromatography-mass spectrometry
KR20210104758A (ko) 2018-12-19 2021-08-25 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 이중특이적 항-muc16 x 항-cd28 항체 및 이의 용도
KR20210104836A (ko) 2018-12-19 2021-08-25 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 이중 특이적 항-cd28 x 항-cd22 항체 및 그의 용도
EP3941941A1 (en) 2019-03-22 2022-01-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Egfr x cd28 multispecific antibodies
JP7675016B2 (ja) * 2019-05-08 2025-05-12 メモリアル スローン ケタリング キャンサー センター ムチン－１６に対するヒト化抗体およびそれを使用する方法
WO2020256721A1 (en) * 2019-06-19 2020-12-24 Synthis, Llc Antib0dy-alk5 inhibitor conjugates and their uses
WO2020257604A1 (en) 2019-06-21 2020-12-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Use of bispecific antigen-binding molecules that bind muc16 and cd3 in combination with 4-1bb co-stimulation
CN114401988A (zh) * 2019-07-09 2022-04-26 国家生物技术研究所公司 具有降低的免疫原性的抗体
TWI890689B (zh) * 2019-08-15 2025-07-21 美商再生元醫藥公司 用於細胞靶向之多特異性抗原結合分子及其用途
WO2021032174A1 (zh) * 2019-08-21 2021-02-25 和铂医药(上海)有限责任公司 一种抗cd47抗原结合蛋白及其应用
PE20220708A1 (es) * 2019-09-06 2022-05-04 Symphogen As Anticuerpos anti-cd73
US11814428B2 (en) * 2019-09-19 2023-11-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-PTCRA antibody-drug conjugates and uses thereof
MX2022006714A (es) * 2019-12-06 2022-08-08 Regeneron Pharma Métodos de tratamiento del mieloma múltiple con anticuerpos anti-bcma x anti-cd3 bisespecíficos.
EP3931303A1 (en) 2019-12-06 2022-01-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-vegf protein compositions and methods for producing the same
KR20210095781A (ko) 2020-01-24 2021-08-03 주식회사 에이프릴바이오 항원결합 단편 및 생리활성 이펙터 모이어티로 구성된 융합 컨스트럭트를 포함하는 다중결합항체 및 이를 포함하는 약학조성물
WO2021226444A2 (en) 2020-05-08 2021-11-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Vegf traps and mini-traps and methods for treating ocular disorders and cancer
WO2022140344A1 (en) * 2020-12-22 2022-06-30 Amgen Inc. Diffusion gradient assay for anti-cd3-containing molecules
SI4284512T1 (sl) 2021-01-28 2025-06-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Sestavki in postopki za zdravljenje sindroma sproščanja citokinov
TW202304507A (zh) 2021-04-02 2023-02-01 美商再生元醫藥公司 含有抗ｍｕｃ１６ｘ抗ｃｄ３雙特異性抗體之穩定調配物
AR126161A1 (es) 2021-06-17 2023-09-27 Boehringer Lngelheim Int Gmbh Moléculas de fijación triespecíficas novedosas
IL312813A (en) 2021-11-24 2024-07-01 Regeneron Pharma Methods for treating cancer using bispecific antibodies against CD3 and MUC16 and antibodies against CTLA-4
KR20240130137A (ko) 2022-01-07 2024-08-28 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 이중특이적 항-MUC16 x 항-CD3 항체 단독으로 또는 항-PD-1 항체와의 조합으로 재발성 난소암을 치료하는 방법
EP4464722A4 (en) * 2022-01-10 2026-03-04 Nanjing Leads Biolabs Co Ltd ANTIBODIES AND THEIR USE
US20250082756A1 (en) * 2022-01-10 2025-03-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Muc16 chimeric antigen receptors
JP2025509567A (ja) 2022-03-17 2025-04-11 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 再発性類上皮肉腫を、二重特異性抗ＭＵＣ１６ｘ 抗ＣＤ３抗体単独で、または抗ＰＤ－１抗体と組み合わせて治療する方法
US20230357446A1 (en) 2022-04-11 2023-11-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for universal tumor cell killing
JP2025529310A (ja) * 2022-09-06 2025-09-04 ティージェイ バイオファーマ （シャンハイ） カンパニー， リミテッド 多特異性構築物およびその使用
WO2024123698A1 (en) 2022-12-08 2024-06-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods to characterizing a fragment crystallizable domain of a bispecific antibody
IL322545A (en) 2023-02-17 2025-10-01 Regeneron Pharma Induced NK cells responding to bispecific CD3/TAA antibodies
IL323074A (en) 2023-03-13 2025-10-01 Regeneron Pharma Methods for treating cancer with anti-CD22 x anti-CD28 bispecific molecules
AU2024305352A1 (en) 2023-06-12 2025-12-04 Amgen Inc. Lymphotoxin beta receptor agonist binding proteins
TW202519547A (zh) 2023-07-10 2025-05-16 美商再生元醫藥公司 雙特異性PD-L1x4-1BB抗體及其使用方法
WO2025014913A1 (en) 2023-07-10 2025-01-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Bispecific pd-l1xcd28 antibodies and methods of use thereof
WO2025036848A1 (en) 2023-08-11 2025-02-20 Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd. Anti-muc16 antibodies and uses thereof
CN117024596B (zh) * 2023-08-18 2024-02-27 镜像绮点(上海)细胞技术有限公司 肿瘤原代细胞特异性标记与活体成像
WO2025080540A1 (en) 2023-10-09 2025-04-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating cancer with a combination of a taaxcd3 bispecific antibody and a targeted immunocytokine
CN119978126A (zh) * 2023-11-10 2025-05-13 深圳市菲鹏生物治疗股份有限公司 抗muc16抗体、靶向muc16的嵌合抗原受体及其应用
WO2025104253A1 (en) * 2023-11-17 2025-05-22 Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd. Anti-muc16 antibodies and uses thereof
TW202539732A (zh) 2023-11-29 2025-10-16 美商再生元醫藥公司 以雙特異性抗muc16×抗cd28抗體與抗pd-1抗體之組合或與雙特異性抗muc16×抗cd3抗體之組合治療復發性卵巢癌及子宮內膜癌之方法
TW202542187A (zh) 2023-12-12 2025-11-01 美商再生元醫藥公司 以雙特異性抗muc16x抗cd3抗體單獨或與抗pd-1抗體組合治療子宮內膜癌之方法
WO2026015612A1 (en) 2024-07-10 2026-01-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating smarcb1-deficient cancers
WO2026050255A2 (en) 2024-08-27 2026-03-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-slc3a2-apis antigen-binding proteins and methods of use thereof

Family Cites Families (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
EP0940468A1 (en) 1991-06-14 1999-09-08 Genentech, Inc. Humanized antibody variable domain
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US7087411B2 (en) 1999-06-08 2006-08-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Fusion protein capable of binding VEGF
US20070258987A1 (en) 2000-11-28 2007-11-08 Seattle Genetics, Inc. Recombinant Anti-Cd30 Antibodies and Uses Thereof
JP5232350B2 (ja) 2001-04-17 2013-07-10 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ アーカンソー Ｃａ１２５遺伝子のリピート配列並びに診断および治療的介入のためのその使用
DE50105971D1 (de) 2001-12-04 2005-05-25 Brahms Ag Verfahren zur Diagnose von Sepsis unter Bestimmung von CA 125
MXPA05003884A (es) 2002-10-16 2005-10-05 Euro Celtique Sa Anticuerpos que enlazan polipeptidos ca 125/0772p a celulas asociadas y metodos de uso de los mismos.
CA2523716C (en) 2003-05-31 2014-11-25 Micromet Ag Human anti-human cd3 binding molecules
EP1718667B1 (en) 2004-02-23 2013-01-09 Genentech, Inc. Heterocyclic self-immolative linkers and conjugates
TW200539855A (en) 2004-03-15 2005-12-16 Wyeth Corp Calicheamicin conjugates
US7750116B1 (en) 2006-02-18 2010-07-06 Seattle Genetics, Inc. Antibody drug conjugate metabolites
RS52176B (sr) 2006-06-02 2012-08-31 Regeneron Pharmaceuticals Inc. Antitela visokog afiniteta prema humanom il-6 receptoru
NO347649B1 (no) 2006-12-14 2024-02-12 Regeneron Pharma Humant antistoff eller antistoff fragment som spesifikt binder human deltaliknende ligand 4 (hDII4), nukleinsyremolekyl som koder for slike og vektor og vert-vektorsystemer, samt fremgangsmåte for fremstilling, sammensetning og anvendelse.
WO2008122039A2 (en) 2007-04-02 2008-10-09 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Selenocysteine mediated hybrid antibody molecules
AR066476A1 (es) * 2007-05-08 2009-08-19 Genentech Inc Anticuerpos anti-muc16 disenados con cisteina y conjugaods de anticuerpos y farmacos
JP2010528285A (ja) 2007-05-23 2010-08-19 ベンタナ・メデイカル・システムズ・インコーポレーテツド 免疫組織化学およびｉｎｓｉｔｕハイブリダーゼーションのためのポリマー担体
US8187801B2 (en) 2008-04-24 2012-05-29 Wisconsin Alumni Research Foundation Methods and kits to detect and monitor ovarian cancer and preeclampsia
CN102083461B (zh) 2008-04-30 2014-09-17 伊缪诺金公司 有效的偶联物和亲水性连接体
ES2536882T3 (es) 2008-07-21 2015-05-29 Polytherics Limited Nuevos reactivos y procedimiento de conjugación de moléculas biológicas
KR101747103B1 (ko) 2009-06-26 2017-06-14 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 천연 면역글로불린 포맷을 가지는 용이하게 분리된 이중특이성 항체
JO3182B1 (ar) 2009-07-29 2018-03-08 Regeneron Pharma مضادات حيوية بشرية عالية الالفة مع تولد الاوعية البشرية - 2
EP2464654B1 (en) 2009-08-10 2014-10-08 UCL Business PLC Thiol protecting group
US10143186B2 (en) 2010-02-08 2018-12-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Common light chain mouse
CA2793753C (en) 2010-03-26 2018-06-05 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Antibodies to muc16 and methods of use thereof
WO2011130598A1 (en) 2010-04-15 2011-10-20 Spirogen Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
WO2012005982A2 (en) 2010-07-06 2012-01-12 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Reporter for rna polymerase ii termination
CN103338751A (zh) * 2010-11-26 2013-10-02 约翰内斯堡威特沃特斯兰德大学 一种药物组合物
EP2714685B1 (en) 2011-05-27 2016-10-19 Ambrx, Inc. Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acid linked dolastatin derivatives
US8815226B2 (en) 2011-06-10 2014-08-26 Mersana Therapeutics, Inc. Protein-polymer-drug conjugates
US9526798B2 (en) 2011-10-14 2016-12-27 Seattle Genetics, Inc. Pyrrolobenzodiazepines and targeted conjugates
EP2751076B1 (en) 2011-10-14 2018-04-25 MedImmune Limited Synthesis method and intermediates useful in the preparation of pyrrolobenzodiazepines
BR112014008888A2 (pt) 2011-10-14 2017-04-18 Seattle Genetics Inc pirrolobenzodiazepinas
MX358757B (es) 2011-10-14 2018-09-03 Seattle Genetics Inc Pirrolobenzodiazepinas y conjugados dirigidos.
WO2013068874A1 (en) 2011-11-11 2013-05-16 Pfizer Inc. Antibody-drug conjugates
MX2014006739A (es) 2011-12-05 2015-06-05 Igenica Biotherapeutics Inc Conjugados de anticuerpo-farmaco y compuestos relacionados, composiciones , y metodos.
JOP20200236A1 (ar) * 2012-09-21 2017-06-16 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد cd3 وجزيئات ربط الأنتيجين ثنائية التحديد التي تربط cd3 وcd20 واستخداماتها
TWI635098B (zh) 2013-02-01 2018-09-11 再生元醫藥公司 含嵌合恆定區之抗體
AU2014233385C1 (en) 2013-03-15 2019-09-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Biologically active molecules, conjugates thereof, and therapeutic uses
KR102252925B1 (ko) 2013-08-26 2021-05-18 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 마크롤라이드 디아스테레오머를 포함하는 약제학적 조성물, 이의 합성 방법 및 치료학적 용도
KR102225489B1 (ko) * 2013-12-17 2021-03-10 제넨테크, 인크. 항-cd3 항체 및 이의 사용 방법
TWI701042B (zh) * 2014-03-19 2020-08-11 美商再生元醫藥公司 用於腫瘤治療之方法及抗體組成物
EA201790719A1 (ru) * 2014-09-26 2017-07-31 Макродженикс, Инк. Биспецифические моновалентные диатела, которые способны связывать cd19 и cd3, а также их применения
EP4190817A1 (en) * 2015-03-17 2023-06-07 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Anti-muc16 antibodies and uses thereof
KR20240142591A (ko) 2015-03-27 2024-09-30 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 메이탄시노이드 유도체, 이의 컨주게이트, 및 사용 방법
TWI784917B (zh) * 2015-09-23 2022-11-21 美商再生元醫藥公司 最優化抗ｃｄ３雙特異性抗體及其用途
HRP20221202T1 (hr) 2016-09-23 2022-12-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-muc16 (mucin 16) antitijela
WO2020257604A1 (en) * 2019-06-21 2020-12-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Use of bispecific antigen-binding molecules that bind muc16 and cd3 in combination with 4-1bb co-stimulation
TW202304507A (zh) * 2021-04-02 2023-02-01 美商再生元醫藥公司 含有抗ｍｕｃ１６ｘ抗ｃｄ３雙特異性抗體之穩定調配物
IL312813A (en) * 2021-11-24 2024-07-01 Regeneron Pharma Methods for treating cancer using bispecific antibodies against CD3 and MUC16 and antibodies against CTLA-4
KR20240130137A (ko) * 2022-01-07 2024-08-28 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 이중특이적 항-MUC16 x 항-CD3 항체 단독으로 또는 항-PD-1 항체와의 조합으로 재발성 난소암을 치료하는 방법

Also Published As

Publication number Publication date
IL265309A (en) 2019-05-30
US20200317810A1 (en) 2020-10-08
PH12019500550A1 (en) 2019-05-27
CA3037536A1 (en) 2018-03-29
DK3515487T5 (da) 2024-09-02
HRP20231281T1 (hr) 2024-02-02
DK3515487T3 (da) 2023-08-28
ZA201901591B (en) 2024-05-30
KR102418667B1 (ko) 2022-07-12
MX2019003322A (es) 2019-08-05
SMT202200359T1 (it) 2022-11-18
CN110036032A (zh) 2019-07-19
KR102531251B1 (ko) 2023-05-15
EP4273172A3 (en) 2024-02-28
DK3515946T3 (en) 2022-08-01
RS64691B1 (sr) 2023-11-30
EP3515946A1 (en) 2019-07-31
EP3515946B1 (en) 2022-07-06
US10738130B2 (en) 2020-08-11
BR112019005697A2 (pt) 2019-07-16
EP4273172A2 (en) 2023-11-08
IL265369A (en) 2019-05-30
MY200230A (en) 2023-12-15
PT3515487T (pt) 2023-08-24
CN110036032B (zh) 2023-09-05
CL2019000726A1 (es) 2019-05-31
CN110214026B (zh) 2023-12-05
NZ751903A (en) 2025-09-26
CA3037738A1 (en) 2018-04-12
AU2017339711B2 (en) 2024-06-06
EP3515487A1 (en) 2019-07-31
KR20190073377A (ko) 2019-06-26
US20230272111A1 (en) 2023-08-31
SMT202300308T1 (it) 2023-11-13
US20180118848A1 (en) 2018-05-03
PL3515946T3 (pl) 2022-11-07
RS63660B1 (sr) 2022-11-30
CN110214026A (zh) 2019-09-06
US12570764B2 (en) 2026-03-10
AU2017339711A1 (en) 2019-04-11
AU2017331363A1 (en) 2019-04-11
US20180112001A1 (en) 2018-04-26
AU2017331363B2 (en) 2024-06-13
HUE063020T2 (hu) 2023-12-28
MY194596A (en) 2022-12-06
LT3515487T (lt) 2023-08-25
WO2018058003A1 (en) 2018-03-29
ES2952735T3 (es) 2023-11-03
IL265309B1 (en) 2023-12-01
JP2019536740A (ja) 2019-12-19
PL3515487T3 (pl) 2024-01-15
MX2019003326A (es) 2019-09-10
WO2018067331A9 (en) 2018-06-07
IL265309B2 (en) 2024-04-01
NZ751907A (en) 2025-09-26
CL2021002645A1 (es) 2022-04-29
LT3515946T (lt) 2022-08-10
KR20190067808A (ko) 2019-06-17
PH12019500604A1 (en) 2019-06-03
CO2019003967A2 (es) 2019-05-10
US11485793B2 (en) 2022-11-01
US10941208B2 (en) 2021-03-09
ZA201901557B (en) 2024-08-28
FI3515487T3 (fi) 2023-08-15
ES2925563T3 (es) 2022-10-18
IL265369B1 (en) 2023-11-01
SI3515946T1 (sl) 2022-09-30
HUE059761T2 (hu) 2022-12-28
JP7066690B2 (ja) 2022-05-13
EP3515487B1 (en) 2023-07-19
IL265369B2 (en) 2024-03-01
SI3515487T1 (sl) 2023-09-29
CA3037536C (en) 2026-02-17
CL2019000712A1 (es) 2019-05-31
PT3515946T (pt) 2022-08-04
CL2023002690A1 (es) 2024-02-02
DK3515946T5 (da) 2024-09-02
HRP20221202T1 (hr) 2022-12-09
JP7066691B2 (ja) 2022-05-13
JP2019533807A (ja) 2019-11-21
BR112019005670A2 (pt) 2019-06-04
WO2018067331A1 (en) 2018-04-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12570764B2 (en) Anti-MUC16 antibodies, antibody-drug conjugates, and bispecific antigen-binding molecules that bind MUC16 and CD3, and uses thereof
JP7695420B2 (ja) 抗ｓｔｅａｐ２抗体、抗体－薬物複合体、およびｓｔｅａｐ２とｃｄ３を結合する二重特異性抗原結合分子、ならびにそれらの使用
HK40102994A (en) Bi specific anti-muc16-cd3 antibodies and anti-muc16 drug conjugates
EA045730B1 (ru) Анти-muc16 (mucin16) антитела
HK40011846B (en) Bi specific anti-muc16-cd3 antibodies and anti-muc16 drug conjugates
HK40011846A (en) Bi specific anti-muc16-cd3 antibodies and anti-muc16 drug conjugates
HK40011845B (en) Anti-muc16 (mucin 16) antibodies
HK40011845A (en) Anti-muc16 (mucin 16) antibodies
EA039842B1 (ru) Биспецифичные анти-muc16-cd3 антитела и конъюгаты анти-muc16-лекарственное средство
EA044194B1 (ru) Анти-steap2 антитела, конъюгаты антитело-лекарственное средство и биспецифические антигенсвязывающие молекулы, которые связывают steap2 и cd3, и их применение