CN110214026B - 双特异性抗muc16-cd3抗体和抗muc16药物结合物 - Google Patents

双特异性抗muc16-cd3抗体和抗muc16药物结合物 Download PDF

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Abstract

本公开提供了抗粘蛋白16抗体：结合到MUC16和CD3并且在表达MUC16的肿瘤存在下通过CD3复合物活化T细胞的双特异性抗体(bsAb)；结合到人类和MUC16的人类IgG抗体(单特异性抗体)；活体内抑制肿瘤生长的抗MUC16抗体药物结合物。所述抗体适用于治疗各种癌症，包括卵巢癌。

Description

双特异性抗MUC16-CD3抗体和抗MUC16药物结合物
参考序列表
本申请以引用的方式并入序列表，其以计算机可读形式、以文件10295WO01-Sequence.txt提交，于2017年9月22日创建并含有893,983个字节。
技术领域
本发明涉及抗体及其抗原结合片段，其对粘蛋白16(MUC16)具有特异性，以及其使用方法。本发明还涉及结合MUC16和CD3的双特异性抗原结合分子，和其使用方法。本发明还涉及抗体-药物结合物，其包含抗MUC16抗体或其片段和治疗剂(例如细胞毒性剂)。
背景技术
粘蛋白16(MUC16)，也称为癌抗原125、癌瘤抗原125、碳水化合物抗原125或CA-125，是单一跨膜结构域高度糖基化整合膜糖蛋白，其在卵巢癌中大量表达。MUC16由三个主要结构域组成：细胞外N端结构域；散布有海胆精子，肠激酶和集聚蛋白(SEA)结构域的大串联重复结构域；以及包含一段跨膜区域和短胞质尾区的羧基端结构域。蛋白质裂解可以引起MUC16的大部分细胞外部分脱落到血流中。MUC16在癌症(包括卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、肝内胆管癌-肿块形成类型、子宫颈腺癌和胃肠道腺癌)以及包括发炎性肠病、肝硬化、心力衰竭、腹膜感染和腹部手术的疾病和病症中过度表达(Haridas,D.等人,2014,FASEB J.,28:4183-4199)。证实癌细胞上的表达可以保护肿瘤细胞免受免疫系统的影响。(Felder,M.等人,2014,《分子癌症(Molecular Cancer)》,13:129)。已经研究了使用针对MUC16的抗体治疗卵巢癌的方法。奥戈伏单抗(Oregovomab)和阿戈伏单抗(abgovomab)是具有有限成功率的抗MUC16抗体。(Felder,见上文,Das,S.和Batra,S.K.2015,《癌症研究(Cancer Res.)》75:4660-4674)。
CD3是在与T细胞受体复合物(TCR)相关的T细胞上表达的同型二聚体或异二聚体抗原并且是T细胞活化所需的。功能性CD3由以下四种不同链中的两种的二聚体结合形成：ε、ζ、δ和γ。CD3二聚体排列包括γ/ε、δ/ε和ζ/ζ。已证实针对CD3的抗体在T细胞上聚集CD3，从而以类似于由肽负荷的MHC分子参与TCR的方式引起T细胞活化。因此，已提出抗CD3抗体用于涉及T细胞活化的治疗目的。此外，已提出能够结合CD3和靶抗原的双特异性抗体用于治疗用途，包括靶向针对表达靶抗原的组织和细胞的T细胞免疫应答。
靶向MUC16的抗原结合分子，包括抗体-药物结合物，以及结合MUC16和CD3的双特异性抗原结合分子将适用于其中需要特异性靶向和T细胞介导的杀伤表达MUC16的细胞的治疗情形。
发明内容
在第一方面中，本发明提供抗体和其抗原结合片段，其结合于人类MUC16。根据本发明的这一方面的抗体尤其适用于靶向表达MUC16的细胞。本发明还提供结合人类MUC16和人类CD3的双特异性抗体和其抗原结合片段。根据本发明的这一方面的双特异性抗体尤其适用于靶向表达CD3的T细胞，并用于刺激T细胞活化，例如在T细胞介导的表达MUC16的细胞的杀伤是有益或所需的情况下。例如，双特异性抗体可以引导针对特异性MUC16表达细胞(例如卵巢肿瘤细胞)的CD3介导的T细胞活化。
本发明的例示性抗MUC16抗体列举于本文中的表1和2中。表1阐述例示性抗MUC16抗体的重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)的氨基酸序列标识符，以及重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)。表2阐述编码例示性抗MUC16抗体的HCVR、LCVR、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的核酸分子的序列标识符。
本发明提供抗体或其抗原结合片段，其包含HCVR，所述HCVR包含选自表1中列举的HCVR氨基酸序列中的任一个的氨基酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的大体上类似序列。
本发明还提供抗体或其抗原结合片段，其包含LCVR，所述LCVR包含选自表1中列举的LCVR氨基酸序列中的任一个的氨基酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的大体上类似序列。
本发明还提供抗体或其抗原结合片段，其包含HCVR和LCVR氨基酸序列对(HCVR/LCVR)，所述氨基酸序列对包含表1中列举的HCVR氨基酸序列中的任一个和与其配对的表1中列举的LCVR氨基酸序列中的任一个。根据某些实施例，本发明提供抗体或其抗原结合片段，其包含表1中列举的例示性抗MUC16抗体中的任一个内所含的HCVR/LCVR氨基酸序列对。在某些实施例中，HCVR/LCVR氨基酸序列对具有SEQ ID NO:18/26(例如H1H8767P)。
本发明还提供抗体或其抗原结合片段，其包含重链CDR1(HCDR1)，所述重链CDR1包含选自表1中列举的HCDR1氨基酸序列中的任一个的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的大体上类似序列。
本发明还提供抗体或其抗原结合片段，其包含重链CDR2(HCDR2)，所述重链CDR2包含选自表1中列举的HCDR2氨基酸序列中的任一个的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的大体上类似序列。
本发明还提供抗体或其抗原结合片段，其包含重链CDR3(HCDR3)，所述重链CDR3包含选自表1中列举的HCDR3氨基酸序列中的任一个的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的大体上类似序列。
本发明还提供抗体或其抗原结合片段，其包含轻链CDR1(LCDR1)，所述轻链CDR1包含选自表1中列举的LCDR1氨基酸序列中的任一个的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的大体上类似序列。
本发明还提供抗体或其抗原结合片段，其包含轻链CDR2(LCDR2)，所述轻链CDR2包含选自表1中列举的LCDR2氨基酸序列中的任一个的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的大体上类似序列。
本发明还提供抗体或其抗原结合片段，其包含轻链CDR3(LCDR3)，所述轻链CDR3包含选自表1中列举的LCDR3氨基酸序列中的任一个的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的大体上类似序列。
本发明还提供抗体或其抗原结合片段，其包含HCDR3和LCDR3氨基酸序列对(HCDR3/LCDR3)，所述氨基酸序列对包含表1中列举的HCDR3氨基酸序列中的任一个和与其配对的表1中列举的LCDR3氨基酸序列中的任一个。根据某些实施例，本发明提供抗体或其抗原结合片段，其包含表1中列举的例示性抗MUC16抗体中的任一个内所含的HCDR3/LCDR3氨基酸序列对。在某些实施例中，HCDR3/LCDR3氨基酸序列对具有SEQ ID NO:24/32(例如H1H8767P)。
本发明还提供抗体或其抗原结合片段，其包含表1中列举的例示性抗MUC16抗体中的任一个中所含的六个CDR的集合(即，HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)。在某些实施例中，HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列集合是选自由以下组成的组：SEQ ID NO:20-22-24-28-30-32(例如H1H8767P)。
在相关实施例中，本发明提供抗体或其抗原结合片段，其包含如由表1中列举的例示性抗MUC16抗体中的任一个定义的HCVR/LCVR氨基酸序列对内所含的六个CDR的集合(即，HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)。举例来说，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:18/26(例如H1H8767P)的HCVR/LCVR氨基酸序列对内所含的HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列集合。用于鉴别HCVR及LCVR氨基酸序列内的CDR的方法和技术是所属领域中众所周知的并且可以用于鉴别本文中所公开的指定HCVR和/或LCVR氨基酸序列内的CDR。可以用于鉴别CDR的边界的例示性公约包括例如Kabat定义、Chothia定义和AbM定义。一般来说，Kabat定义是基于序列可变性，Chothia定义是基于结构环区域的位置，并且AbM定义是Kabat与Chothia方法之间的折中方案。参见例如Kabat,“《免疫相关蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)》,”国立卫生研究院(National Institutes of Health),Bethesda,Md.(1991)；Al-Lazikani等人,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》273:927-948(1997)；以及Martin等人,《美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》86:9268-9272(1989)。公共资料库也可以用于鉴别抗体内的CDR序列。
本发明还提供编码抗MUC16抗体或其部分的核酸分子。举例来说，本发明提供编码表1中列举的HCVR氨基酸序列中的任一个的核酸分子；在某些实施例中，核酸分子包含选自表2中列举的HCVR核酸序列中的任一个的聚核苷酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的大体上类似序列。
本发明还提供编码表1中列举的LCVR氨基酸序列中的任一个的核酸分子；在某些实施例中，核酸分子包含选自表2中列举的LCVR核酸序列中的任一个的聚核苷酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的大体上类似序列。
本发明还提供编码表1中列举的HCDR1氨基酸序列中的任一个的核酸分子；在某些实施例中，核酸分子包含选自表2中列举的HCDR1核酸序列中的任一个的聚核苷酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的大体上类似序列。
本发明还提供编码表1中列举的HCDR2氨基酸序列中的任一个的核酸分子；在某些实施例中，核酸分子包含选自表2中列举的HCDR2核酸序列中的任一个的聚核苷酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的大体上类似序列。
本发明还提供编码表1中列举的HCDR3氨基酸序列中的任一个的核酸分子；在某些实施例中，核酸分子包含选自表2中列举的HCDR3核酸序列中的任一个的聚核苷酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的大体上类似序列。
本发明还提供编码表1中列举的LCDR1氨基酸序列中的任一个的核酸分子；在某些实施例中，核酸分子包含选自表2中列举的LCDR1核酸序列中的任一个的聚核苷酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的大体上类似序列。
本发明还提供编码表1中列举的LCDR2氨基酸序列中的任一个的核酸分子；在某些实施例中，核酸分子包含选自表2中列举的LCDR2核酸序列中的任一个的聚核苷酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的大体上类似序列。
本发明还提供编码表1中列举的LCDR3氨基酸序列中的任一个的核酸分子；在某些实施例中，核酸分子包含选自表2中列举的LCDR3核酸序列中的任一个的聚核苷酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的大体上类似序列。
本发明还提供编码HCVR的核酸分子，其中HCVR包含三个CDR的集合(即，HCDR1-HCDR2-HCDR3)，其中HCDR1-HCDR2-HCDR3氨基酸序列集合如由表1中列举的例示性抗MUC16抗体中的任一个所定义。
本发明还提供编码LCVR的核酸分子，其中LCVR包含三个CDR的集合(即，LCDR1-LCDR2-LCDR3)，其中LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列集合如由表1中列举的例示性抗MUC16抗体中的任一个所定义。
本发明还提供编码HCVR和LCVR的核酸分子，其中HCVR包含表1中列举的HCVR氨基酸序列中的任一个的氨基酸序列，且其中LCVR包含表1中列举的LCVR氨基酸序列中的任一个的氨基酸序列。在某些实施例中，核酸分子包含选自表2中列举的HCVR核酸序列中的任一个的聚核苷酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的大体上类似序列，和选自表2中列举的LCVR核酸序列中的任一个的聚核苷酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的大体上类似序列。在根据本发明的这一方面的某些实施例中，核酸分子编码HCVR和LCVR，其中HCVR和LCVR都衍生自表1中列举的同一个抗MUC16抗体。
本发明还提供能够表达多肽的重组型表达载体，所述多肽包含抗MUC16抗体的重链或轻链可变区。举例来说，本发明包括重组型表达载体，其包含上文提及的核酸分子中的任一个，即编码如表1中所阐述的HCVR、LCVR和/或CDR序列中的任一个的核酸分子。在本发明的范围内还包括用于引入这类载体的宿主细胞，以及通过在允许产生抗体或抗体片段的条件下培养宿主细胞并且回收由此产生的抗体和抗体片段来产生抗体或其部分的方法。
本发明包括具有经修饰的糖基化模式的抗MUC16抗体。在一些实施例中，用于移除不合需要的糖基化位点的修饰可能适用，或在寡糖链上不存在海藻糖部分的抗体，例如用于增加抗体依赖性细胞的细胞毒性(antibody dependent cellular cytotoxicity，ADCC)功能(参见Shield等人(2002)《生物化学杂志(JBC)》277:26733)。在其它应用中，可以进行半乳糖基化修饰以便修饰补体依赖性细胞毒性(complement dependent cytotoxicity，CDC)。
在另一态样中，本发明提供一种医药组合物，其包含特异性结合MUC16的重组型人类抗体或其片段和医药学上可接受的载体。在一个相关方面中，本发明的特征在于一种组合物，其是抗MUC16抗体与第二治疗剂的组合。在一个实施例中，第二治疗剂是任何宜与抗MUC16抗体组合的药剂。涉及本发明的抗MUC16抗体的其它组合疗法和共同配制物公开于本文中的其它地方。
在另一方面中，本发明提供使用本发明的抗MUC16抗体靶向/杀伤表达MUC16的肿瘤细胞的治疗方法，其中所述治疗方法包含向有需要的个体给予治疗有效量的包含本发明的抗MUC16抗体的医药组合物。在一些情况下，抗MUC16抗体(或其抗原结合片段)可以用于治疗癌症(例如卵巢癌)，或可以通过以下方法经修饰以具有更高的细胞毒性，包括(但不限于)用于提高ADCC的经修饰的Fc域(参见例如Shield等人(2002)《生物化学杂志》277:26733)、放射免疫疗法、抗体-药物结合物或其它用于提高肿瘤切除效率的方法。
本发明还包括本发明的抗MUC16抗体的用途，其是用于制造用以治疗与表达MUC16的细胞相关或由其引起的疾病或病症的药剂。在一个方面中，本发明涉及一种化合物，包含如本文中所公开的抗MUC16抗体或抗原结合片段或MUC16xCD3双特异性抗体，其是用于药品。在一个方面中，本发明涉及一种化合物，其包含如本文中所公开的抗体-药物结合物(ADC)，其是用于药品。
在另一个方面中，本发明提供单特异性抗MUC16抗体，其是用于诊断应用，如例如成像剂。
在另一个方面中，本发明提供治疗方法，其使用抗CD3抗体或本发明的抗体的抗原结合部分刺激T细胞活化，其中所述治疗方法包含给予治疗有效量的包含抗体的医药组合物。
在另一个方面中，本发明提供经分离的抗体或其抗原结合片段，其以小于约53nM的结合解离平衡常数(KD)结合人类粘蛋白16(MUC16)，如在25℃下在表面电浆子共振分析法中测量。在另一个方面中，本发明提供经分离的抗体或其抗原结合片段，其以大于约15分钟的解离半衰期(t1/2)结合人类MUC16，如在25℃下在表面电浆子共振分析法中测量。
本发明还提供抗体或抗原结合片段，其与包含如表1中所阐述的HCVR/LCVR氨基酸序列对的参考抗体竞争结合于人类MUC16。在另一个方面中，本发明提供抗体或抗原结合片段，其与包含选自由以下组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对的参考抗体竞争结合于人类MUC16：SEQ ID NO:2/10；18/26；34/42；50/58；66/74；82/90；98/106；114/122；130/138；146/154；162/170；178/186；194/394；202/210；218/226；234/242；250/1936；258/266；274/1936；282/290；298/306；314/322；330/338；346/354；362/370；和378/386。
本发明还提供抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与包含如表1中所阐述的HCVR/LCVR氨基酸序列对的参考抗体结合于人类MUC16上的同一个表位。在另一个方面中，抗体或抗原结合片段与包含选自由以下组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对的参考抗体结合于人类MUC16上的同一个表位：SEQ ID NO:2/10；18/26；34/42；50/58；66/74；82/90；98/106；114/122；130/138；146/154；162/170；178/186；194/394；202/210；218/226；234/242；250/1936；258/266；274/1936；282/290；298/306；314/322；330/338；346/354；362/370；和378/386。
本发明还提供结合人类MUC16的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含：具有如表1中所阐述的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)的互补决定区(CDR)；和具有如表1中所阐述的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)的CDR。在另一个方面中，经分离的抗体或抗原结合片段包含选自由以下组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对的重链和轻链CDR：2/10；18/26；34/42；50/58；66/74；82/90；98/106；114/122；130/138；146/154；162/170；178/186；194/394；202/210；218/226；234/242；250/1936；258/266；274/1936；282/290；298/306；314/322；330/338；346/354；362/370；和378/386。在另一个方面中，经分离的抗体或抗原结合片段分别包含选自由以下组成的组的HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3域：SEQ ID NO:4-6-8-12-14-16；20-22-24-28-30-32；36-38-40-44-46-48；52-54-56-60-62-64；68-70-72-76-78-80；84-86-88-92-94-96；100-102-104-108-110-112；116-118-120-124-126-128；132-134-136-140-142-144；148-150-152-156-158-160；164-166-168-172-174-176；180-182-184-188-190-192；196-198-200-396-398-400；204-206-208-212-214-216；220-222-224-228-230-232；236-238-240-244-246-248；252-254-256-1938-1940-1942；260-262-264-268-270-272；276-278-280-1938-1940-1942；284-286-288-292-294-296；300-302-304-308-310-312；316-318-320-324-326-328；332-334-336-340-342-344；348-350-352-356-358-360；364-366-368-372-374-376；和380-382-384-388-390-392。
在另一个方面中，本发明提供经分离的抗体或其抗原结合片段，其结合人类MUC16，其中所述抗体或抗原结合片段包含：(a)具有选自由以下组成的组的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)：SEQ ID NO:2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、202、218、234、250、258、274、282、298、314、330、346、362和378；和具有选自由以下组成的组的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)：SEQ ID NO:10；26；42；58；74；90；106；122；138；154；170；186；210；226；242；266；290；306；322；338；354；370；386；1936和394。在另一个方面中，根据技术方案10所述的经分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含选自由以下组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对：SEQ ID NO:2/10；18/26；34/42；50/58；66/74；82/90；98/106；114/122；130/138；146/154；162/170；178/186；194/394；202/210；218/226；234/242；250/1936；258/266；274/1936；282/290；298/306；314/322；330/338；346/354；362/370；和378/386。
本发明还提供经分离的抗体或其抗原结合片段，其结合SEQ ID NO:1902的残基428到残基481范围内的表位内的人类MUC16。在一些情况下，经分离的抗体或抗原结合片段与SEQ ID NO:1902的氨基酸残基428-434、429-434、453-467、459-467、460-467和/或474-481相互作用。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段与SEQ ID NO:1902的氨基酸残基428-434、429-434、453-467、459-467、460-467和474-481相互作用。本发明还提供经分离的抗体或其抗原结合片段，其结合SEQ ID NO:1902的残基126到残基138范围内的表位内的人类MUC16。在一些情况下，经分离的抗体或抗原结合片段与SEQ ID NO:1902的氨基酸残基126-131、127-131和/或132-138相互作用。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段与SEQ ID NO:1902的氨基酸残基126-131、127-131和132-138相互作用。本发明还提供经分离的抗体或其抗原结合片段，其结合SEQ ID NO:1902的残基357到残基369范围内的表位内的人类MUC16。在一些情况下，经分离的抗体或抗原结合片段与SEQ ID NO:1902的氨基酸残基357-369、358-366、358-369和/或361-369相互作用。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段与SEQ IDNO:1902的氨基酸残基357-369、358-366、358-369和361-369相互作用。本发明还提供经分离的抗体或其抗原结合片段，其结合人类MUC16(SEQ ID NO:1899)的五个近膜SEA域中的一个或多个内的人类MUC16。五个近膜SEA域对应于SEQ ID NO:1899的残基13791-14451。在一些情况下，抗体或抗原结合片段以小于约60nM的KD结合，如在25℃下，在表面电浆子共振分析法中测量。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段在SEQ ID NO:1899的残基14237到14290内结合。在一个实施例中，抗体或抗原结合片段包含HCVR/LCVR对的CDR，所述HCVR/LCVR对包含SEQ ID NO:18/26的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段在SEQID NO:1899的残基13935到13947内结合。在一个实施例中，抗体或抗原结合片段包含HCVR/LCVR对的CDR，所述HCVR/LCVR对包含SEQ ID NO:82/858的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段在SEQ ID NO:1899的残基14165到14178内结合。在一个实施例中，抗体或抗原结合片段包含HCVR/LCVR对的CDR，所述HCVR/LCVR对包含SEQ ID NO:98/170的氨基酸序列。
在一个方面中，本发明提供抗体或其抗原结合片段，其结合于MUC16的一个或多个SEA域。在各种实施例中，抗MUC16抗体或抗原结合片段结合于以下中的任一个或多个：SEA1、SEA2、SEA3、SEA4、SEA5、SEA6、SEA7、SEA8、SEA9、SEA10、SEA11、SEA12、SEA13、SEA14、SEA15或SEA16。在一个实施例中，抗MUC16抗体或片段在SEA1(SEQ ID NO:1899的残基12074到12229)内结合。在一个实施例中，抗MUC16抗体或片段在SEA2(SEQ ID NO:1899的残基12230到12387)内结合。在一个实施例中，抗MUC16抗体或片段在SEA3(SEQ ID NO:1899的残基12388到12543)内结合。在一个实施例中，抗MUC16抗体或片段在SEA4(SEQ ID NO:1899的残基12544到12698)内结合。在一个实施例中，抗MUC16抗体或片段在SEA5(SEQ ID NO:1899的残基12699到12854)内结合。在一个实施例中，抗MUC16抗体或片段在SEA6(SEQ ID NO:1899的残基12855到13010)内结合。在一个实施例中，抗MUC16抗体或片段在SEA7(SEQ IDNO:1899的残基13011到13166)内结合。在一个实施例中，抗MUC16抗体或片段在SEA8(SEQID NO:1899的残基13167到13323)内结合。在一个实施例中，抗MUC16抗体或片段在SEA9(SEQ ID NO:1899的残基13324到13478)内结合。在一个实施例中，抗MUC16抗体或片段在SEA10(SEQ ID NO:1899的残基13479到13634)内结合。在一个实施例中，抗MUC16抗体或片段在SEA11(SEQ ID NO:1899的残基13635到13790)内结合。在一个实施例中，抗MUC16抗体或片段在SEA12(SEQ ID NO:1899的残基13791到13923)内结合。在一个实施例中，抗MUC16抗体或片段在SEA13(SEQ ID NO:1899的残基13924到14074)内结合。在一个实施例中，抗MUC16抗体或片段在SEA14(SEQ ID NO:1899的残基14075到14227)内结合。在一个实施例中，抗MUC16抗体或片段在SEA15SEQ ID NO:1899的残基14228到14320)内结合。在一个实施例中，抗MUC16抗体或片段在SEA16(SEQ ID NO:1899的残基14321到14464)内结合。
根据另一个方面，本发明提供抗体-药物结合物，其包含抗MUC16抗体或其抗原结合片段和治疗剂(例如细胞毒性剂)。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段和细胞毒性剂通过如本文所论述的连接子共价连接。在各种实施例中，抗MUC16抗体或抗原结合片段可以是本文中所描述的抗MUC16抗体或片段中的任一种。
在一些实施例中，细胞毒性剂选自奥瑞他汀(auristatin)、类美登素(maytansinoid)、妥布赖森(tubulysin)、富山霉素(tomaymycin)衍生物或海兔毒素(dolastatin)衍生物。在一些情况下，细胞毒性剂是选自MMAE或MMAF的奥瑞他汀，或选自DM1或DM4的类美登素。在一些实施例中，细胞毒性剂是具有如本文所论述的式(I)或式(II)的结构的类美登素。
在一些实施例中，细胞毒性剂是具有以下结构的类美登素：
在一些实施例中，细胞毒性剂是具有以下结构的类美登素：
在一些实施例中，抗体-药物结合物包含抗MUC16抗体或其片段，和
其中是连接到抗MUC16抗体或其片段的键。.
在一些实施例中，抗体-药物结合物包含抗MUC16抗体或其片段，和
其中是连接到抗MUC16抗体或其片段的键。
在一些实施例中，抗体-药物结合物包含抗MUC16抗体或其片段，和
其中是连接到抗MUC16抗体或其片段的键。
在一些实施例中，键通过半胱氨酸残基的硫成分与抗体或其片段接触。
在一些实施例中，抗体-药物结合物包含抗MUC16抗体或其片段，和
其混合物，
其中是连接到抗MUC16抗体或其片段的键。
在一些实施例中，键通过赖氨酸残基的氮成分与抗体或其片段接触。
在上文或本文中论述的抗体-药物结合物的各种实施例中的任一个中，抗体-药物结合物可以包含每个抗MUC16抗体或其片段1到4个细胞毒素剂。
根据另一方面，本发明提供结合MUC16和CD3的双特异性抗原结合分子(例如抗体)。这类双特异性抗原结合分子在本文中也称为“抗MUC16/抗CD3双特异性分子”、“抗CD3/抗MUC16双特异性分子”或“MUC16xCD3bsAbs”。抗MUC16/抗CD3双特异性分子的抗MUC16部分适用于靶向表达MUC16(例如卵巢瘤)的细胞(例如肿瘤细胞)，并且双特异性分子的抗CD3部分适用于活化T细胞。肿瘤细胞上的MUC16和T细胞上的CD3的同时结合有助于通过经活化的T细胞定向杀伤(细胞溶解)目标肿瘤细胞。因此，本发明的抗MUC16/抗CD3双特异性分子尤其适用于治疗与表达MUC16的肿瘤相关或由其引起的疾病和病症(例如卵巢癌)。
根据本发明的这一态样的双特异性抗原结合分子包含特异性结合人类CD3的第一抗原结合域和特异性结合MUC16的第二抗原结合域。本发明包括抗MUC16/抗CD3双特异性分子(例如双特异性抗体)，其中每个抗原结合域包含与轻链可变区(LCVR)配对的重链可变区(HCVR)。在本发明的某些例示性实施例中，抗CD3抗原结合域和抗MUC16抗原结合域各自包含不同的与共同LCVR配对的相异的HCVR。举例来说，如本文中的实例3中所说明，构筑双特异性抗体，其包含特异性结合CD3的第一抗原结合域，其中第一抗原结合域包含衍生自抗CD3抗体的HCVR，其与衍生自抗MUC16抗体的LCVR(例如与抗MUC16抗原结合域中所包括相同的LCVR)配对；和特异性结合MUC16的第二抗原结合域，其中第二抗原结合域包含衍生自抗MUC16抗体的HCVR/LCVR。换句话说，在本文所公开的例示性分子中，来自抗CD3抗体的HCVR与来自抗MUC16抗体的LCVR的配对产生特异性结合CD3(但不结合MUC16)的抗原结合域。在这类实施例中，第一和第二抗原结合结构域包含不同的抗CD3和抗MUC16HCVR，但共有共同的抗MUC16LCVR。在其它实施例中，双特异性抗原结合分子包含不同的抗CD3和抗MUC16HCVR，但共有共同的LCVR。这一LCVR的氨基酸序列展示于例如SEQ ID NO:1890中，并且相应CDR(即，LCDR1-LCDR2-LCDR3)的氨基酸序列分别展示于SEQ ID NO:1892、1894和1896中。经基因修饰的小鼠可以用于产生完全人类双特异性抗原结合分子，其包含与一致轻链相关的两个不同重链，所述轻链包含衍生自两个不同的人类轻链可变区基因区段中的一个的可变域。或者，可变重链可与一个共同轻链配对并且在宿主细胞中以重组方式表达。因此，本发明的抗体可以包含与单一重排轻链相关的免疫球蛋白重链。在一些实施例中，轻链包含衍生自人类Vκ1-39基因区段或Vκ3-20基因区段的可变域。在其它实施例中，轻链包含衍生自与人类Jκ5或人类Jκ1基因区段重排的人类Vκ1-39基因区段的可变域。
本发明提供抗CD3/抗MUC16双特异性分子，其中第一抗原结合域特异性结合包含以下的CD3：如2014年3月27日公开的美国公开案2014/0088295和2016年7月29日提交的PCT/US2016/044732中所阐述的HCVR氨基酸序列中的任一个、LCVR氨基酸序列中的任一个、HCVR/LCVR氨基酸序列对中的任一个、重链CDR1-CDR2-CDR3氨基酸序列中的任一个或轻链CDR1-CDR2-CDR3氨基酸序列中的任一个。
此外，本发明提供抗CD3/抗MUC16双特异性分子，其中特异性结合CD3的第一抗原结合域包含如本文中的表16、18和22中所阐述的HCVR氨基酸序列中的任一个。特异性结合CD3的第一抗原结合域还可以包含如本文中的表1、16、19和23中所阐述的LCVR氨基酸序列中的任一个。根据某些实施例，特异性结合CD3的第一抗原结合域包含如本文中的表16、18、19、22和23中所阐述的HCVR/LCVR氨基酸序列对中的任一个。本发明还提供抗CD3/抗MUC16双特异性分子，其中特异性结合CD3的第一抗原结合域包含如本文中的表16、18和22中所阐述的重链CDR1-CDR2-CDR3氨基酸序列中的任一个，和/或如本文中的表1、16、19和23中所阐述的轻链CDR1-CDR2-CDR3氨基酸序列中的任一个。
根据某些实施例，本发明提供抗CD3/抗MUC16双特异性分子，其中特异性结合CD3的第一抗原结合域包含重链可变区(HCVR)，其具有如本文中的表16、18和22中所阐述的氨基酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似序列。
本发明还提供抗CD3/抗MUC16双特异性分子，其中特异性结合CD3的第一抗原结合域包含轻链可变区(LCVR)，其具有如本文中的表1、6、19和23中所阐述的氨基酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似序列。
本发明还提供抗CD3/抗MUC16双特异性分子，其中特异性结合CD3的第一抗原结合域包含如本文中的表16、18、19、22和23中所阐述HCVR和LCVR(HCVR/LCVR)氨基酸序列对。
本发明还提供抗CD3/抗MUC16双特异性分子，其中特异性结合CD3的第一抗原结合域包含重链CDR3(HCDR3)结构域，其具有如本文中的表16、18和22中所阐述的氨基酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似序列；和轻链CDR3(LCDR3)结构域，其具有如本文中的表1、16、19和23中所阐述的氨基酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似序列。
在某些实施例中，特异性结合CD3的第一抗原结合域包含如本文中的表16、18、19、22和23中所阐述的HCDR3/LCDR3氨基酸序列对。
本发明还提供抗CD3/抗MUC16双特异性抗原结合分子，其中特异性结合CD3的第一抗原结合域包含重链CDR1(HCDR1)结构域，其具有如本文中的表16、18和22中所阐述的氨基酸或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似序列；重链CDR2(HCDR2)结构域，其具有如表16、18和22中所阐述的氨基酸或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似序列；重链CDR3(HCDR3)结构域，其具有如表16、18和22中所阐述的氨基酸或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似序列；轻链CDR1(LCDR1)结构域，其具有如本文中的表1、16、19和23中所阐述的氨基酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似序列；轻链CDR2(LCDR2)结构域，其具有如本文中的表1、16、19和23中所阐述的氨基酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似序列，和轻链CDR3(LCDR3)结构域，其具有如本文中的表1、16、19和23中所阐述的氨基酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似序列。
本发明的某些非限制性、例示性抗CD3/抗MUC16双特异性抗原结合分子包括特异性结合CD3的第一抗原结合域，其分别包含HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3域，具有如本文中的表16、18、19、22和23中所阐述的氨基酸序列。
本发明还提供双特异性抗原结合分子，其中特异性结合人类CD3的第一抗原结合域包含来自重链可变区(HCVR)的重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和来自轻链可变区(LCVR)的轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，所述重链可变区包含如表16、表18或表22中所阐述的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如表1、表16、表19或表23中所阐述的氨基酸序列。
在另一个方面中，本发明提供双特异性抗原结合分子，其中特异性结合人类CD3的第一抗原结合域包含来自重链可变区(HCVR)的重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和来自轻链可变区(LCVR)的轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，所述重链可变区选自由SEQ ID NO:1730、1762、1778、1786和1866组成的组，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
本发明还提供双特异性抗原结合分子，其中特异性结合人类CD3的第一抗原结合域包含三个重链互补决定区(A1-HCDR1、A1-HCDR2和A1-HCDR3)和三个轻链互补决定区(A1-LCDR1、A1-LCDR2和A1-LCDR3)，其中A1-HCDR1包含选自由SEQ ID NO:1732、1764、1780、1788和1868组成的组的氨基酸序列；A1-HCDR2包含选自由SEQ ID NO:1734、1766、1782、1790和1870组成的组的氨基酸序列；A1-HCDR3包含选自由SEQ ID NO:1736、1768、1784、1792和1872组成的组的氨基酸序列；A1-LCDR1包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；A1-LCDR2包含SEQID NO:30的氨基酸序列；并且A1-LCDR3包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。
在另一个方面中，本发明提供双特异性抗原结合分子，其中特异性结合人类CD3的第一抗原结合域包含选自由以下组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对的重链和轻链CDR：SEQ ID NO:1730/26、1762/26、1778/26、1786/26和1866/26。
在另一个方面中，本发明提供双特异性抗原结合分子，其中特异性结合人类CD3的第一抗原结合域包含三个重链互补决定区(A1-HCDR1、A1-HCDR2和A1-HCDR3)和三个轻链互补决定区(A1-LCDR1、A1-LCDR2和A1-LCDR3)，并且其中特异性结合人类MUC16的第二抗原结合域包含三个重链互补决定区(A2-HCDR1、A2-HCDR2和A2-HCDR3)和三个轻链互补决定区(A2-LCDR1、A2-LCDR2和A2-LCDR3)；其中A1-HCDR1包含选自由SEQ ID NO:1732、1764、1780、1788和1868组成的组的氨基酸序列；A1-HCDR2包含选自由SEQ ID NO:1734、1766、1782、1790和1870组成的组的氨基酸序列；A1-HCDR3包含选自由SEQ ID NO:1736、1768、1784、1792和1872组成的组的氨基酸序列；A1-LCDR1包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；A1-LCDR2包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；并且A1-LCDR3包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；并且其中A2-HCDR1包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；A2-HCDR2包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；A2-HCDR3包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；A2-LCDR1包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；A2-LCDR2包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；并且A2-LCDR3包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。
本发明的某些非限制性、例示性抗CD3/抗MUC16双特异性抗原结合分子包括特异性结合CD3的第一抗原结合域，其包含重链，所述重链包含具有选自FR1(SEQ ID NO:1903)、FR2(SEQ ID NO:1904)、FR3(SEQ ID NO:1905)和FR4(SEQ ID NO:1906)的氨基酸序列的可变域构架区。
在更多的实施例中，本发明的例示性抗CD3/抗MUC16双特异性抗原结合分子包括双特异性抗原结合分子，其中特异性结合人类CD3的第一抗原结合域包含HCVR，所述HCVR包含具有SEQ ID NO:1907-1908-1909的氨基酸序列的HCDR1-HCDR2-HCDR3。
本发明还提供抗CD3/抗MUC16双特异性分子，其中特异性结合MUC16的第二抗原结合域包含重链可变区(HCVR)，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似序列：SEQ ID NO:2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、202、218、234、250、258、274、282、298、314、330、346、362和378。
本发明还提供抗CD3/抗MUC16双特异性分子，其中特异性结合MUC16的第二抗原结合域包含轻链可变区(LCVR)，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似序列：SEQ ID NO:10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、210、226、242、266、290、306、322、338、354、370、386、1936和394。
本发明还提供抗CD3/抗MUC16双特异性分子，其中特异性结合MUC16的第二抗原结合域包含选自由SEQ ID NO:18/26组成的组的HCVR和LCVR(HCVR/LCVR)氨基酸序列对。
本发明还提供抗CD3/抗MUC16双特异性分子，其中特异性结合MUC16的第二抗原结合域包含重链CDR3(HCDR3)，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似序列：SEQ ID NO:8、24、40、56、72、88、104、120、136、152、168、184、200、208、224、240、256、264、280、288、304、320、336、352、368和384；和轻链CDR3(LCDR3)，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似序列：SEQ ID NO:16、32、48、64、80、96、112、128、144、160、176、192、216、232、248、272、296、312、328、344、360、376、392、400和1942。
在某些实施例中，特异性结合MUC16的第二抗原结合域包含选自由SEQ ID NO:24/32组成的组的HCDR3/LCDR3氨基酸序列对。
本发明还提供抗CD3/抗MUC16双特异性抗原结合分子，其中特异性结合MUC16的第二抗原结合域包含重链CDR1(HCDR1)结构域，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似序列：SEQ IDNO:4、20、36、52、68、84、100、116、132、148、164、180、196、204、220、236、252、260、276、284、300、316、332、348、364和380；重链CDR2(HCDR2)结构域，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似序列：SEQ ID NO:6、22、38、54、70、86、102、118、134、150、166、182、198、206、222、238、254、262、278、286、302、318、334、350、366和382；重链CDR3(HCDR3)结构域，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似序列：SEQ ID NO:8、24、40、56、72、88、104、120、136、152、168、184、200、208、224、240、256、264、280、304、320、336、352、368和384；轻链CDR1(LCDR1)结构域，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似序列：SEQ ID NO:12、28、44、60、76、92、108、124、140、156、172、188、396、212、228、244、396、268、396、292、308、324、340、356、372、1938和388；和轻链CDR2(LCDR2)结构域，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似序列：SEQ ID NO:14、30、46、62、78、94、110、126、142、158、174、190、398、214、230、246、398、270、398、294、310、326、342、358、374、1940和390；和轻链CDR3(LCDR3)结构域，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上类似序列：SEQ IDNO:16、32、48、64、80、96、112、128、144、160、176、192、400、216、232、248、400、272、400、296、312、328、344、360、376、1942和392。
本发明的某些非限制性、例示性抗CD3/抗MUC16双特异性抗原结合分子包括特异性结合MUC16的第二抗原结合域，其分别包含HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3域，具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:20-22-24-28-30-32。
在相关实施例中，本发明包括抗CD3/抗MUC16双特异性抗原结合分子，其中特异性结合MUC16的第二抗原结合域包含选自由SEQ ID NO:18/26组成的组的重链和轻链可变区(HCVR/LCVR)序列内所含的重链和轻链CDR域。
在一个实施例中，本发明提供抗CD3/抗MUC16双特异性抗体，其包含抗MUC16结合臂和抗CD3结合臂，所述抗MUC16结合臂包含有包含SEQ ID NO:1959的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:1960的氨基酸序列的轻链，所述抗CD3结合臂包含有包含SEQ ID NO:1961的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:1960的氨基酸序列的轻链。在另一实施例中，本发明提供抗CD3/抗MUC16双特异性抗体，其包含抗MUC16结合臂和抗CD3结合臂，所述抗MUC16结合臂包含有包含SEQ ID NO:1959的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:1960的氨基酸序列的轻链，所述抗CD3结合臂包含有包含SEQ ID NO:1962的氨基酸序列的重链和包含SEQID NO:1960的氨基酸序列的轻链。
在另一个方面中，本发明提供双特异性抗原结合分子，其包含结合人类CD3的第一抗原结合域和结合人类MUC16的第二抗原结合域，其中第二抗原结合域是衍生自本发明的抗MUC16抗体中的任一个的抗体或抗原结合片段。在另一个方面中，本发明提供双特异性抗原结合分子，其包含特异性结合人类CD3的第一抗原结合域和特异性结合人类MUC16的第二抗原结合域。
本发明还提供双特异性抗原结合分子，其结合表达人类CD3的人类细胞和表达食蟹猕猴CD3的食蟹猕猴细胞。在另一个方面中，双特异性抗原结合分子结合表达人类MUC16的人类细胞。
在另一个方面中，本发明提供双特异性抗原结合分子，其抑制具有人类卵巢癌异种移植物的免疫功能不全小鼠中的肿瘤生长。本发明还提供双特异性抗原结合分子，其抑制具有人类卵巢癌异种移植物的免疫功能不全小鼠中已建立肿瘤的肿瘤生长。
在另一个方面中，本发明提供双特异性抗原结合分子，其包含i)第一抗原结合域，其以大于约4nM的EC50值特异性结合效应细胞，和ii)第二抗原结合域，其以小于3nM的EC50值特异性结合目标人类卵巢肿瘤细胞，其中这类EC50结合值是在活体外FACS结合分析法中测量。
在一个实施例中，双特异性抗原结合分子可以包括第二抗原结合域，其以小于约2nM的EC50值特异性结合目标卵巢肿瘤细胞。在一些情况下，第一抗原结合域以大于约40nM、大于约100nM、大于约200nM、大于约300nM、大于约400nM、大于约500nM或大于约1μM的EC50值特异性结合人类CD3和食蟹猕猴CD3中的每一个。在一些情况下，第一抗原结合域以微弱或不可测量的结合或结合亲和力特异性结合人类CD3和食蟹猕猴CD3中的每一个。
在一些实施例中，抗原结合分子以小于约31pM的EC50值诱导T细胞介导的肿瘤细胞杀伤，如在活体外T细胞介导的肿瘤细胞杀伤分析法中测量，例如其中肿瘤细胞是OVCAR3细胞。
在一些应用中，第一抗原结合域以大于约11nM的KD值结合人类CD3，如在活体外表面电浆子共振结合分析法中测量。在一些实例中，第一抗原结合域以大于约15nM、大于约30nM、大于约60nM、大于约120nM、大于约300nM或大于约500nM的KD值结合人类CD3和食蟹猕猴CD3中的每一个，如在活体外表面电浆子共振结合分析法中测量。
在某些实施例中，本发明的抗CD3抗体、其抗原结合片段和双特异性抗体是通过基于生殖系序列与亲本抗体序列之间的差异，以逐步方式置换亲本的氨基酸残基而制得。
在一些实施例中，本发明提供双特异性抗原结合分子，其中第二抗原结合域与参考抗原结合蛋白质竞争结合于人类MUC16，所述参考抗原结合蛋白质包含三个重链互补决定区(A2-HCDR1、A2-HCDR2和A2-HCDR3)和三个轻链互补决定区(A2-LCDR1、A2-LCDR2和A2-LCDR3)，其中A2-HCDR1包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；A2-HCDR2包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；A2-HCDR3包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；A2-LCDR1包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；A2-LCDR2包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；并且A2-LCDR3包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。在一些实施例中，本发明提供双特异性抗原结合分子，其中第二抗原结合域与参考抗原结合蛋白质竞争结合于人类MUC16，所述参考抗原结合蛋白质包含有包含SEQ IDNO:18的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)和包含氨基酸序列SEQ ID NO:26的轻链可变区(LCVR)。
在一些实施例中，本发明提供双特异性抗原结合分子，其中第一抗原结合域与参考抗原结合蛋白质竞争结合于人类CD3，所述参考抗原结合蛋白质包含三个重链互补决定区(A1-HCDR1、A1-HCDR2和A1-HCDR3)和三个轻链互补决定区(A1-LCDR1、A1-LCDR2和A1-LCDR3)，A1-HCDR1包含选自由SEQ ID NO:1732、1764、1780、1788和1868组成的组的氨基酸序列；A1-HCDR2包含选自由SEQ ID NO:1734、1766、1782、1790和1870组成的组的氨基酸序列；A1-HCDR3包含选自由SEQ ID NO:1736、1768、1784、1792和1872组成的组的氨基酸序列；A1-LCDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO:28；A1-LCDR2包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；并且A1-LCDR3包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。在一些实施例中，本发明提供双特异性抗原结合分子，其中第一抗原结合域与参考抗原结合蛋白质竞争结合于人类CD3，所述参考抗原结合蛋白质包含有包含选自由SEQ ID NO:1730、1762、1778、1786和1866组成的组的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)和包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)。
在一些实施例中，本发明提供双特异性抗原结合分子，其中第一抗原结合域与参考抗原结合蛋白质竞争结合于人类CD3，所述参考抗原结合蛋白质包含有包含选自由SEQID NO:1730、1762、1778、1786和1866组成的组的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)，和包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)；并且其中第二抗原结合域与参考抗原结合蛋白质竞争结合于人类MUC16，所述参考抗原结合蛋白质包含有包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)，和包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)。
在一个方面中，本发明提供医药组合物，其包含抗MUC16抗原结合分子或抗MUC16/抗CD3双特异性抗原结合分子和医药学上可接受的载体或稀释剂。本发明还提供一种用于治疗个体中的癌症的方法，所述方法包含向个体给予医药组合物，其包含抗MUC16抗原结合分子或抗MUC16/抗CD3双特异性抗原结合分子和医药学上可接受的载体或稀释剂。在一些实施例中，癌症选自由包括以下的癌症组成的组：卵巢癌、乳癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、肝内胆管癌-肿块形成型、子宫颈腺癌和胃肠道腺癌。在一些情况下，癌症是卵巢癌。
在另一个方面中，本发明提供编码本文所公开的抗CD3/抗MUC16双特异性抗原结合分子的HCVR、LCVR或CDR序列中的任一个的核酸分子，包括包含如本文中的表2、17、20、21、23和25中所阐述的聚核苷酸序列的核酸分子，以及以任何功能性组合或排列形式包含如表2、17、20、21、23和25中所阐述的聚核苷酸序列中的两个或更多个的核酸分子。本发明还涵盖具有本发明的核酸的重组型表达载体和已经引入这类载体的宿主细胞，以及通过在允许产生抗体的条件下培养宿主细胞来产生抗体和回收所产生的抗体的方法。
本发明包括抗CD3/抗MUC16双特异性抗原结合分子，其中前述特异性结合CD3的抗原结合域中的任一个与前述特异性结合MUC16的抗原结合域中的任一个组合、连接或以其它方式相关，以形成结合CD3和MUC16的双特异性抗原结合分子。
本发明包括具有经修饰的糖基化模式的抗CD3/抗MUC16双特异性抗原结合分子。在一些实施例中，用于移除不合需要的糖基化位点的修饰可能适用，或在寡糖链上不存在海藻糖部分的抗体，例如用于增加抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)功能(参见Shield等人(2002)《生物化学杂志》277:26733)。在其它应用中，可以进行半乳糖基化修饰以便修饰补体依赖性细胞毒性(CDC)。
在另一个方面中，本发明提供医药组合物，其包含如本文中所公开的抗CD3/抗MUC16双特异性抗原结合分子和医药学上可接受的载体。在相关方面中，本发明提供一种组合物，其是抗CD3/抗MUC16双特异性抗原结合分子与第二治疗剂的组合。在一个实施例中，第二治疗剂是任何宜与抗CD3/抗MUC16双特异性抗原结合分子组合的药剂。宜与抗CD3/抗MUC16双特异性抗原结合分子组合的例示性药剂在本文中的其它地方详细论述。
在另一个方面中，本发明提供使用本发明的抗CD3/抗MUC16双特异性抗原结合分子靶向/杀伤表达MUC16的肿瘤细胞的治疗方法，其中所述治疗方法包含向有需要的个体给予治疗有效量的医药组合物，其包含本发明的抗CD3/抗MUC16双特异性抗原结合分子。
本发明还包括本发明的抗CD3/抗MUC16双特异性抗原结合分子的用途，其用于制造用以治疗与表达MUC16的细胞相关或由其引起的疾病或病症的药剂。
在另一个方面中，本发明提供用于检测生物样品中的MUC16的方法，其包含：从个体获得生物样品，和通过使生物样品与抗MUC16抗体或其抗原结合片段接触并且检测MUC16与抗MUC16抗体或抗原结合片段之间的结合来检测生物样品中是否存在MUC16。在一些情况下，生物样品是选自以下的组织或体液样品：血浆、血清、腹水、卵巢、子宫、子宫颈、肝、膀胱、胰腺、胃、小肠或大肠、胆囊、乳房、肺、肾脏、唾液和泪液腺体，或其任何上皮状恶性肿瘤。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段结合对应于SEQ ID NO:1899的残基13791-14451的人类MUC16的五个近膜海洋域中的一个或多个内的人类MUC16。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段结合SEQ ID NO:1899的残基13810-14451内的人类MUC16。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段结合于人类MUC16的SEA1、SEA2、SEA3、SEA4、SEA5、SEA6、SEA7、SEA8、SEA9、SEA10、SEA11、SEA12、SEA13、SEA14、SEA15或SEA16中的任一个或多个。
在另一个方面中，本发明提供用于检测患者中的MUC16的方法，其包含：从患者获得组织样品；和通过使组织样品与抗MUC16抗体接触并且检测MUC16与抗MUC16抗体之间的结合来检测组织样品中是否存在MUC16。在一些情况下，所述方法进一步包含在检测到组织样品中存在MUC16时，诊断患者患有癌症。在一个实施例中，组织样品是卵巢组织。在一些情况下，抗MUC16抗体对SEQ ID NO:1899的残基12783-13467内的表位具有特异性。在一个实施例中，抗MUC16抗体包含有包含SEQ ID NO:202/210的氨基酸序列的HCVR/LCVR对的CDR。在一些情况下，抗MUC16抗体对SEQ ID NO:1899的残基13810-14451内的表位具有特异性。在一个实施例中，，抗MUC16抗体包含选自由以下组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列的CDR：SEQ ID NO:250/1936、258/266、314/322和1944/1952。
在另一个方面中，本发明提供用于检测患者中的MUC16的方法，其包含：从患者获得血浆样品；和通过使血浆样品与抗MUC16抗体接触并且检测MUC16与抗MUC16抗体之间的结合来检测血浆样品中是否存在MUC16，所述MUC16抗体包含有包含SEQ ID NO:202/210的氨基酸序列的HCVR/LCVR对的CDR。在一些情况下，所述方法进一步包含在检测到血浆样品中存在MUC16时，诊断患者患有癌症。在一些实施例中，所述方法进一步包含向所诊断的患者给予有效量的抗CD3xMUC16双特异性抗体。在一些实施例中，所述方法进一步包含向所诊断的患者给予有效量的ADC，其包含抗MUC16抗体或其抗原结合片段和细胞毒性剂。
在另一个方面中，本发明提供结合MUC16的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含选自由以下组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对的CDR：SEQID NO:202/210、250/1936、258/266、314/322、82/858、98/170和1944/1952。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段分别包含选自由以下组成的组的HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3域：SEQ ID NO:204-206-208-212-214-216；252-254-256-1938-1940-1942；260-262-264-268-270-272；316-318-320-324-326-328；84-86-88-1892-1894-1896；100-102-104-172-174-176；和1946-1948-1950-1954-1956-1958。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含选自由以下组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对：202/210、250/1936、258/266、314/322、82/858、98/170和1944/1952。
其它实施例将由随后详细说明中的综述变得显而易见。
附图说明
图1、2和3说明野生型小鼠(图1)、人类化CD3小鼠(图2)或人类化MUC16x CD3小鼠(图3)中抗MUC16x CD3双特异性抗体的药物动力学概况。
图4展示OVCAR-3模型研究1的结果(在第6天的平均辐射率[p/s/cm2/sr])。所有组具有类似的肿瘤负荷，如在开始给药之前通过BLI评估。所展示的资料是肿瘤负荷，如在肿瘤植入后第6天通过BLI评估。使用不成对非参数曼-惠特尼t测试(Mann-Whitney t-tests)来测定统计显著性。各组之间的肿瘤负荷不存在显著差异。
图5展示OVCAR-3模型研究1的结果(在第20天的平均辐射率[p/s/cm22/sr])。BSMUC16/CD3-001在0.1和0.5mg/kg下显著降低肿瘤负荷。将人类OVCAR-3/Luc细胞植入用人类T细胞进行移植的NSG小鼠中。在肿瘤植入后第6天开始处理。小鼠在第6、10、13、16和21天用腹膜内给予的0.01、0.1或0.5mg/kg的BSMUC16/CD3-001处理或用CD3结合对照物或非结合对照物(0.5mg/kg，腹膜内)处理。所展示的资料是肿瘤负荷，如在肿瘤植入后第20天通过BLI评估。使用不成对非参数曼-惠特尼t测试来测定统计显著性。比较用BSMUC16/CD3-001进行的处理与非结合对照物(对于0.5mg/kg，**p<0.01，对于0.1mg/kg，#p<0.05，BSMUC16/CD3-001)。
图6展示OVCAR-3模型研究1的结果(D6与D20之间BLI明显肿瘤的倍数变化)。BSMUC16/CD3-001在0.01、0.1和0.5mg/kg下显著降低肿瘤负荷的倍数变化。将人类OVCAR-3/Luc细胞植入用人类T细胞进行移植的NSG小鼠中。小鼠在第6、10、13、16和21天用腹膜内给予的0.01、0.1或0.5mg/kg的BSMUC16/CD3-001处理或用CD3结合对照物或非结合对照物(0.5mg/kg，腹膜内)处理。所展示的资料是第一次测量(在开始处理之前采集)和在第20天研究结束时的肿瘤负荷的倍数变化。使用不成对非参数曼-惠特尼t测试测定统计显著性。比较用BSMUC16/CD3-001进行的处理与非结合对照物(对于0.5mg/kg，**p<0.01，对于0.1mg/kg，#p<0.05，对于0.01mg/kg，$p<0.05，BSMUC16/CD3-001)。
图7展示OVCAR-3模型研究2的结果(在第4天的平均辐射率[p/s/cm2/sr])。所有组具有类似的肿瘤负荷，如在开始给药之前通过BLI评估。所展示的资料是肿瘤负荷，如在肿瘤植入后第4天通过BLI评估。使用不成对非参数曼-惠特尼t测试来测定统计显著性。在第4天，各组之间不存在肿瘤负荷的显著差异。
图8展示OVCAR-3模型研究2的结果(在第25天的平均辐射率[p/s/cm22/sr])。BSMUC16/CD3-005在0.5、1和5mg/kg下显著降低肿瘤负荷。将人类OVCAR-3/Luc细胞植入用人类T细胞进行移植的NSG小鼠中。在肿瘤植入后第5天开始处理。小鼠在第5、8、12、15、19和22天用静脉内给予的0.1、0.5、1或5mg/kg的REGN4019处理或给予CD3结合对照物或非结合对照物(5mg/kg，静脉内)。所展示的资料是肿瘤负荷，如在肿瘤植入后第25天通过BLI评估。使用不成对非参数曼-惠特尼t测试来测定统计显著性。比较用BSMUC16/CD3-005进行的处理与非结合对照物(对于5mg/kg，**p<0.01，对于1mg/kg，##p<0.01，对于0.5mg/kg，$$p<0.01，BSMUC16/CD3-005)。
图9展示OVCAR-3模型研究2的结果(D4与D25之间BLI明显肿瘤的倍数变化)。BSMUC16/CD3-005在0.5、1和5mg/kg下显著降低肿瘤生长。将人类OVCAR-3/Luc细胞植入用人类T细胞进行移植的NSG小鼠中。小鼠在第5、8、12、15、19和22天用静脉内给予的0.1、0.5、1或5mg/kg的REGN4019处理或用CD3结合对照物或非结合对照物(5mg/kg，静脉内)处理。所展示的资料是第一次测量(在开始处理前一天采集)和第25天研究结束时的肿瘤负荷的倍数变化。使用不成对非参数曼-惠特尼t测试来测定统计显著性。比较用BSMUC16/CD3-005进行的处理与非结合对照物(对于5mg/kg，**p<0.01，对于1mg/kg，##p<0.01，对于0.5mg/kg，$$p<0.01，REGN4019)。
图10展示ID8-VEGF/huMUC16模型的结果。在移植后第47天的肿瘤尺寸，当在移植当天或肿瘤植入后第10天开始处理时，BSMUC16/CD3-001显著降低同基因型模型中的肿瘤生长。将表达一部分人类MUC16的鼠类卵巢肿瘤品系植入表达人类CD3而非小鼠CD3和嵌合MUC16分子的小鼠中。在移植当天或移植后第10天向小鼠给予BSMUC16/CD3-001(100μg，腹膜内)或在移植当天给予CD3结合对照物(100μg，腹膜内)。对于立即处理组，在第0、4、7、10、13、17、20或24天处理小鼠，并且对于在D10开始给药的组，在第10、13、17、20和24天处理。所展示的资料是在移植后第47天的肿瘤体积。使用不成对非参数曼-惠特尼t测试来测定统计显著性。比较用BSMUC16/CD3-001进行的处理与CD3结合对照物(对于在D0开始，**p<0.01，对于在D10开始，*p<0.05)。
图11A-11C说明针对PEO-1、OVCAR3-Luc、Jurkat细胞和食蟹猕猴T细胞的选择性双特异性抗体的结合的流动式细胞测量分析(或FACS)的结果。通过测试每种抗体的一系列连续稀释物来进行滴定分析：MUC16xCD3双特异性抗体BSMUC16/CD3-001、BSMUC16/CD3-002或BSMUC16/CD3-003，或第一或第二同型对照抗体(与CD3或MUC16不具有交叉反应性)。
图12A和12B描绘在人类PBMC存在下，在抗MUC16x抗CD3处理之后，48小时细胞毒性分析法中PEO-1(图12A)或OVCAR3-Luc(图12B)细胞杀伤的实例。
具体实施方式
在描述本发明之前，应理解，本发明不限于所描述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变化。还应该理解，本文中所用的术语是仅出于描述具体实施例的目的而并不意图造成限制，因为本发明的范围将仅由所附权利要求书限制。
除非另外规定，否则本文中所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的一般技术人员通常所理解相同的含义。如本文中所使用，当关于具体叙述数值使用时，术语“约”意指值可以与叙述值相差不超过1％。举例来说，如本文中所使用，表述“约100”包括99和101以及两者之间的所有值(例如99.1、99.2、99.3、99.4等)。
现在描述优选的方法和材料，但与本文中所描述类似或等效的任何方法和材料都可以用于本发明的实践或测试中。本说明书中提及的所有专利案、申请案和非专利公开案都以全文引用的方式并入本文中。
定义
如本文中所使用，表述“CD3”是指作为多分子T细胞受体(TCR)的一部分的在T细胞上表达的抗原，并且其由均二聚体或杂二聚体组成，所述均二聚体或杂二聚体由以下四种受体链中的两种的结合形成：CD3-ε、CD3-δ、CD3-ζ和CD3-γ。人类CD3-ε包含如SEQ ID NO:1897中所阐述的氨基酸序列；人类CD3-δ包含如SEQ ID NO:1898中所阐述的氨基酸序列。除非明确指定为来自非人类物种，否则本文中对蛋白质、多肽和蛋白质片段的所有参考都意图指各别蛋白质、多肽或蛋白质片段的人类版本。因此，除非指定为来自非人类物种，例如“小鼠CD3”、“猴CD3”等，否则表述“CD3”意指人类CD3。
如本文中所使用，“结合CD3的抗体”或“抗CD3抗体”包括特异性识别单一CD3子单元(例如ε、δ、γ或ζ)的抗体和其抗原结合片段，以及特异性识别两个CD3子单元的二聚复合物(例如γ/ε、δ/ε和ζ/ζCD3二聚体)的抗体和其抗原结合片段。本发明的抗体和抗原结合片段可以结合可溶性CD3和/或细胞表面表达的CD3。可溶性CD3包括天然CD3蛋白质以及重组型CD3蛋白质变异体，如单体和二聚CD3构筑体，其不含跨膜域或在其它方面与细胞膜无关。
如本文中所使用，表述“细胞表面表达的CD3”意指在活体外或活体内细胞表面上表达的一种或多种CD3蛋白质，使得至少一部分CD3蛋白质暴露于细胞膜的细胞外侧并且可由抗体的抗原结合部分接触。“细胞表面表达的CD3”包括在细胞的细胞膜中的功能性T细胞受体情形中所含的CD3蛋白质。表述“细胞表面表达的CD3”包括在细胞表面上作为均二聚体或杂二聚体(例如γ/ε、δ/ε和ζ/ζCD3二聚体)的一部分表达的CD3蛋白质。表述“细胞表面表达的CD3”还包括在细胞表面上由自身表达(无其它CD3链类型)的CD3链(例如CD3-ε、CD3-δ或CD3-γ)。“细胞表面表达的CD3”可以包含在通常表达CD3蛋白质的细胞表面上表达的CD3蛋白质或由其组成。或者，“细胞表面表达的CD3”可以包含在满足以下条件的细胞的表面上表达的CD3蛋白质或由其组成：其通常不在其表面上表达人类CD3，但已经人工改造以在其表面上表达CD3。
如本文中所使用，表述“MUC16”是指粘蛋白16。MUC16是在卵巢癌中大量表达的单跨膜域高度糖基化整合膜糖蛋白。人类MUC16的氨基酸序列阐述于SEQ ID NO:1899中。
如本文中所使用，“结合MUC16的抗体”或“抗MUC16抗体”包括特异性识别MUC16的抗体和其抗原结合片段。
术语“抗原结合分子”包括抗体和抗体的抗原结合片段，包括例如双特异性抗体。
如本文中所使用，术语“抗体”意指任何包含至少一个特异性结合于具体抗原(例如MUC16或CD3)或与其相互作用的互补决定区(CDR)的抗原结合分子或分子复合物。术语“抗体”包括免疫球蛋白分子以及其多聚体(例如IgM)，所述免疫球蛋白分子包含四个多肽链，即通过二硫键互连的两个重(H)链和两个轻(L)链。各重链包含重链可变区(本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域，即CH1、CH2和CH3。各轻链包含轻链可变区(本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域(CL1)。VH和VL区可以进一步再分成高变区，称为互补决定区(CDR)，穿插有称为构架区(FR)的保守性更高的区域。各VH及VL是由从氨基端到羧基端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本发明的不同实施例中，抗MUC16抗体或抗CD3抗体(或其抗原结合部分)的FR可以与人类生殖系序列一致，或可以是天然的或经人工修饰。氨基酸共同序列可以基于两个或更多个CDR的并列分析来定义。
如本文中所使用，术语“抗体”也包括完整抗体分子的抗原结合片段。如本文中所使用，术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等包括特异性结合抗原以形成复合物的任何天然存在、可以酶方式获得、合成或经遗传工程改造的多肽或糖蛋白。抗体的抗原结合片段可以使用任何适合的标准技术从例如完整抗体分子获得，所述技术如蛋白水解消化或重组基因工程改造技术，其涉及编码抗体可变域和任选地恒定域的DNA的操作和表达。这类DNA是已知的和/或易于购自例如商业来源、DNA文库(包括例如噬菌体-抗体文库)，或可以合成的。DNA可以化学方式或通过使用分子生物学技术定序和操作，例如将一个或多个可变域和/或恒定域配置成适合的组态，或引入密码子，产生半胱氨酸残基，修饰、添加或删除氨基酸等。
抗原结合片段的非限制性实例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)最小识别单元，其由模拟抗体的高变区(例如，经分离的互补决定区(CDR)，如CDR3肽)或限制性FR3-CDR3-FR4肽的氨基酸残基组成。其它经工程改造的分子，如结构域特异性抗体、单域抗体、结构域缺失抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、微型抗体、纳米抗体(例如单价纳米抗体、二价纳米抗体等)、小模块免疫药物(small modular immunopharmaceutical；SMIP)和鲨鱼可变IgNAR结构域也涵盖于如本文中所使用的表述「抗原结合片段」内。
抗体的抗原结合片段将通常包含至少一个可变域。可变域可以具有任何尺寸或氨基酸组成并且通常将包含与一个或多个构架序列相邻或同框的至少一个CDR。在具有与VL域相关联的VH域的抗原结合片段中，VH和VL域可以任何适合的配置相对于彼此定位。举例来说，可变区可以是二聚体并且含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚体。或者，抗体的抗原结合片段可以含有单体VH或VL域。
在某些实施例中，抗体的抗原结合片段可以含有至少一个共价连接到至少一个恒定域的可变域。可发现于本发明的抗体的抗原结合片段内的可变域和恒定域的非限制性、例示性组态包括：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3；(iv)VH-CH1-CH2；(v)VH-CH1-CH2-CH3；(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii)VL-CH1；(ix)VL-CH2；(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3；和(xiv)VL-CL。在可变域和恒定域的任何组态，包括上文所列的例示性组态中的任一个中，可变域和恒定域可以直接彼此连接或可以通过完全或部分铰链区或连接区连接。铰链区可以由至少2个(例如5、10、15、20、40、60个或更多个)氨基酸组成，所述氨基酸在单一多肽分子中的相邻可变域和/或恒定域之间产生柔性或半柔性连接。此外，本发明的抗体的抗原结合片段可以包含上文所列的可变域和恒定域组态中的任一个的均二聚体或杂二聚体(或其它多聚体)，所述可变域和恒定域组态彼此和/或与一个或多个单体VH或VL域非共价结合(例如通过双硫键)。
与完整抗体分子相同，抗原结合片段可以是单特异性或多特异性的(例如双特异性的)。抗体的多特异性抗原结合片段将通常包含至少两个不同的可变域，其中各可变域能够特异性结合于独立抗原或相同抗原上的不同表位。可以使用所属领域中可用的常规技术使任何多特异性抗体格式(包括本文所公开的例示性双特异性抗体格式)在本发明的抗体的抗原结合片段情况下适用。
本发明的抗体可以通过补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)发挥作用。“补体依赖性细胞毒性”(CDC)是指在补体存在下，抗原表达细胞由本发明的抗体溶解。“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”(ADCC)是指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如自然杀手(NK)细胞、嗜中性白血球和巨噬细胞)识别目标细胞上的结合的抗体并且由此引起目标细胞的溶解。可以使用所属领域中众所周知和可用的分析法测量CDC和ADCC(参见例如美国专利案第5,500,362号和第5,821,337号，以及Clynes等人,(1998)《国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)》(USA)95:652-656)。抗体的恒定区在抗体固定补体和介导细胞依赖性细胞毒性的能力方面是重要的。因此，可以基于是否需要抗体介导细胞毒性来选择抗体的同型。
在本发明的某些实施例中，本发明的抗MUC16单特异性抗体或抗MUC16/抗CD3双特异性抗体是人类抗体。如本文中所使用，术语「人类抗体」意图包括具有衍生自人类生殖系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人类抗体可以包括不由人类生殖系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过活体外随机或定点突变诱发或通过活体内体细胞突变引入的突变)，例如在CDR并且具体地说，CDR3中。然而，如本文中所使用，术语「人类抗体」不意图包括衍生自另一种哺乳动物物种(如小鼠)的生殖系的CDR序列已移植于人类构架序列上的抗体。
在一些实施例中，本发明的抗体可以是重组型人类抗体。如本文中所使用，术语“重组型人类抗体”意图包括所有通过重组手段制备、表达、产生或分离的人类抗体，如使用转染到宿主细胞中的重组型表达载体表达的抗体(下文中进一步描述)；从重组型、组合性人类抗体文库分离的抗体(下文中进一步描述)；从人类免疫球蛋白基因的转殖基因动物(例如小鼠)分离的抗体(参见例如Taylor等人,(1992)《核酸研究(Nucl.Acids Res.)》20:6287-6295)或通过任何其它涉及将人类免疫球蛋白基因序列拼接到其它DNA序列的方式制备、表达、产生或分离的抗体。这类重组型人类抗体具有衍生自人类生殖系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施例中，这类重组型人类抗体可以经历活体外突变诱发(或当使用人类Ig序列的转殖基因动物时，活体内体细胞突变诱发)，并且因此重组型抗体的VH和VL区的氨基酸序列是虽然衍生自人类生殖系VH及VL序列且与其相关，但活体内可不天然存在于人类抗体生殖系谱系内的序列。
人类抗体可以与铰链异质性相关的两种形式存在。在一种形式中，免疫球蛋白分子包含约150-160kDa的稳定四链构筑体，其中二聚体通过链间重链二硫键固持在一起。在第二形式中，二聚体不通过链间二硫键连接并且形成由共价偶合的轻链和重链构成的约75-80kDa的分子(半抗体)。这些形式极难分离，甚至在亲和纯化之后也是如此。
第二形式在各种完整IgG同型中的出现频率是归因于(但不限于)与抗体的铰链区同型相关的结构差异。人类lgG4铰链的铰链区中的单一氨基酸取代可以使第二形式的出现显著减少(Angal等人(1993)《分子免疫学(Molecular Immunology)》30:105)到通常使用人类lgG1铰链观察到的水准。本发明涵盖在铰链、CH2或CH3区中具有一个或多个突变的抗体，所述一个或多个突变在例如产量方面可能是合乎需要的，以改善所需抗体形式的产率。
本发明的抗体可以是经分离的抗体。如本文中所使用，「经分离的抗体」意指经鉴别且从其天然环境的至少一种组分分离和/或回收的抗体。举例来说，在本发明中，从生物体的至少一种组分或从其中抗体天然存在或天然产生的组织或细胞分离或去除的抗体是「经分离的抗体」。经分离的抗体还包括重组型细胞内的原位抗体。经分离的抗体是已经历至少一个纯化或分离步骤的抗体。根据某些实施例，经分离的抗体可以基本上不含其它细胞物质及/或化学物质。
本发明还包括结合MUC16的单臂抗体。如本文中所使用，「单臂抗体」意指包含单一抗体重链及单一抗体轻链的抗原结合分子。本发明的单臂抗体可以包含如表1中所阐述的HCVR/LCVR或CDR氨基酸序列中的任一个。
与衍生抗体的对应生殖系序列相比，本文所公开的抗MUC16或抗MUC16/抗CD3抗体可以在重链和轻链可变域的构架区和/或CDR区中包含一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失。这类突变可以容易地通过比较本文所公开的氨基酸序列与可从例如公共抗体序列资料库获得的生殖系序列来确定。本发明包括抗体和其抗原结合片段，其衍生自本文所公开的氨基酸序列中的任一个，其中一个或多个构架区和/或CDR区内的一个或多个氨基酸突变成衍生抗体的生殖系序列的相应残基，或突变成另一人类生殖系序列的相应残基，或突变成相应生殖系残基的保守性氨基酸取代(这类序列变化在本文中统称为“生殖系突变”)。以本文所公开的重链和轻链可变区序列为起始物质，所属领域中的普通技术人员可以容易地产生许多包含一个或多个个别生殖系突变或其组合的抗体和抗原结合片段。在某些实施例中，VH和/或VL域内的所有构架和/或CDR残基全部突变回在衍生抗体的初始生殖系序列中发现的残基。在其它实施例中，仅某些残基突变回初始生殖系序列，例如仅在FR1的前8个氨基酸内或在FR4的最后8个氨基酸内发现的突变型残基，或仅在CDR1、CDR2或CDR3内发现的突变型残基。在其它实施例中，构架和/或CDR残基中的一个或多个突变成不同生殖系序列(即，不同于最初衍生抗体的生殖系序列的生殖系序列)的相应残基。此外，本发明的抗体可以在构架区和/或CDR区内含有两个或更多个生殖系突变的任何组合，例如其中某些个别残基突变成具体生殖系序列的相应残基，而不同于初始生殖系序列的某些其它残基保持不变或突变成不同生殖系序列的相应残基。在获得之后，可以容易地测试含有一个或多个生殖系突变的抗体和抗原结合片段的一种或多种所需性质，如改善的结合特异性、增加的结合(例如通过细胞结合滴定或FACS结合测量)或结合亲和力(例如KD)、改良的或增强的拮抗性或促效生物特性(视具体情况)、降低的免疫原性等。本发明涵盖以这种常用方式获得的抗体和抗原结合片段。
本发明还包括抗MUC16或抗MUC16/抗CD3抗体，其包含本文所公开的HCVR、LCVR及/或CDR氨基酸序列中的任一个的具有一个或多个保守性取代的变异体。举例来说，本发明包括抗MUC16或抗MUC16/抗CD3抗体，其具有HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列，所述HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列与本文中的表1中所阐述或如本文中的表16、18、19、22和23中所描述的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列中的任一个相比具有例如10个或更少个、8个或更少个、6个或更少个、4个或更少个等保守性氨基酸取代。
术语“表位”是指与称为互补位的抗体分子的可变区中的特异性抗原结合位点相互作用的抗原决定子。单一抗原可以具有超过一个表位。因此，不同抗体可以结合于抗原上的不同区域并且可以具有不同生物作用。表位可以是构形或线性的。构形表位是由来自线性多肽链的不同区段的空间并置氨基酸产生。线性表位是由多肽链中的相邻氨基酸残基产生的表位。在某些情况下，表位可以包括抗原上的糖类、磷酰基或磺酰基。
当参考核酸或其片段时，术语“基本上一致性”或“基本上一致”指示当与另一核酸(或其互补股)在适合的核苷酸插入或缺失下进行最佳比对时，在至少约95％，并且更优选至少约96％、97％、98％或99％的核苷酸碱基中存在核苷酸序列一致性，如通过任何众所周知的序列一致性算法，如FASTA、BLAST或Gap测量，如下文中所论述。与参考核酸分子具有基本上一致性的核酸分子在某些情况下可以编码具有与由参考核酸分子所编码的多肽相同或基本上相似的氨基酸序列的多肽。
如应用于多肽，术语「基本上相似性」或「基本上相似」意指两个肽序列在如通过程序GAP或BESTFIT，使用默认空位权重最佳比对时，具有至少95％序列一致性，甚至更优选至少98％或99％序列一致性。不一致残基位置的差异优选是保守性氨基酸取代。“保守性氨基酸取代”是其中一个氨基酸残基经另一个含有具有类似化学特性(例如电荷或疏水性)的侧链(R基团)的氨基酸残基取代的取代。通常，保守性氨基酸取代不会显著改变蛋白质的功能特性。在其中两个或更多个氨基酸序列彼此间差异是保守性取代的情况下，可以上调序列一致性或相似度百分比以根据保守性取代性质进行校正。用于进行这种调节的手段是所属领域的技术人员众所周知的。参见例如Pearson(1994)《分子生物学方法(MethodsMol.Biol.)》24:307-331，其以引用的方式并入本文中。含有具有类似化学特性的侧链的氨基酸组的实例包括(1)脂族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、白氨酸和异白氨酸；(2)脂族羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；(3)含有酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸，和(7)含硫侧链是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守性氨基酸取代组是：缬氨酸-白氨酸-异白氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。或者，保守性置换是在以引用的方式并入本文中的Gonnet等人(1992)《科学(Science)》256:1443-1445中所公开的PAM250对数似然性矩阵中具有正值的任何变化。“适度保守”置换是在PAM250对数似然矩阵中具有非负值的任何变化。
通常使用序列分析软件测量多肽的序列相似性，其也称为序列一致性。蛋白质分析软件使用分配于各种取代、缺失和其它修饰，包括保守性氨基酸取代的相似性量度来匹配相似序列。举例来说，GCG软件含有如Gap和Bestfit等程序，其可以在默认参数下使用于测定密切相关的多肽，如来自生物体的不同物种的同源多肽之间，或野生型蛋白与其突变蛋白之间的序列同源性或序列一致性。参见例如GCG，6.1版。多肽序列也可以使用FASTA(6.1版GCG中的程序)，使用默认或推荐参数进行比较。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供查询序列与搜寻序列之间的最佳重叠区域的比对和序列一致性百分比(Pearson(2000),见上文)。当比较本发明的序列与含有许多来自不同生物体的序列的资料库时，另一优选的算法是电脑程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN，使用默认参数。参见例如Altschul等人(1990)《分子生物学杂志》215:403-410和Altschul等人(1997)《核酸研究》25:3389-402，其各自以引用的方式并入本文中。
生殖系突变
与衍生抗体的相应生殖系序列相比，本文所公开的抗CD3抗体在重链可变域的构架区和/或CDR区中包含一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失。
本发明还包括抗体和其抗原结合片段，其衍生自本文所公开的氨基酸序列中的任一个，其中一个或多个构架区和/或CDR区内的一个或多个氨基酸突变成衍生抗体的生殖系序列的相应残基，或突变成另一人类生殖系序列的相应残基，或突变成相应生殖系残基的保守性氨基酸取代(这类序列变化在本文中统称为“生殖系突变”)，并且与CD3抗原具有弱或不可检测的结合。若干识别CD3的这类例示性抗体描述于本文中的表16、18、19、22和23中。
此外，本发明的抗体可以在构架区和/或CDR区内含有两个或更多个生殖系突变的任何组合，例如其中某些个别残基突变成具体生殖系序列的相应残基，而不同于初始生殖系序列的某些其它残基保持不变或突变成不同生殖系序列的相应残基。在获得之后，可以测试含有一个或多个生殖系突变的抗体和抗原结合片段的一种或多种所需特性，如改良的结合特异性、弱或降低的结合或结合亲和力、改良的或增强的药物动力学特性、降低的免疫原性等。本发明涵盖根据本发明的指导，以这种常用方式获得的抗体和抗原结合片段。
本发明还包括抗CD3抗体，其包含本文所公开的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列中的任一个的具有一个或多个保守性取代的变异体。举例来说，本发明包括具有HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列的抗CD3抗体，所述HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列与与本文中的表16、18、19、22和23中所阐述的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列中的任一个相比具有例如10个或更少个、8个或更少个、6个或更少个、4个或更少个等保守性氨基酸取代。与衍生个别抗原结合域的相应生殖系序列相比，本发明的抗体和双特异性抗原结合分子在重链和轻链可变域的构架区和/或CDR区中包含一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失，同时保持或改善所需的与CD3抗原的弱到不可检测的结合。“保守性氨基酸取代”是其中一个氨基酸残基经另一个含有具有类似化学特性(例如电荷或疏水性)的侧链(R基团)的氨基酸残基取代的取代。一般来说，保守性氨基酸取代将不会显著改变蛋白质的功能特性，即在抗CD3结合分子的情况下，氨基酸取代保持或改善所需的弱到不可检测的结合或结合亲和力。含有具有类似化学特性的侧链的氨基酸组的实例包括(1)脂族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、白氨酸和异白氨酸；(2)脂族羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；(3)含有酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸，和(7)含硫侧链是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守性氨基酸取代组是：缬氨酸-白氨酸-异白氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。或者，保守置换是在公开于Gonnet等人(1992)《科学》256:1443-1445中的PAM250对数似然性矩阵中具有正值的任何变化。“适度保守”置换是在PAM250对数似然矩阵中具有非负值的任何变化。
本发明还包括抗原结合分子，其包含具有与本文所公开的HCVR和/或CDR氨基酸序列中的任一个基本上一致的HCVR和/或CDR氨基酸序列的抗原结合域，同时保持或改善所需的对CD3抗原的弱亲和力。当参考氨基酸序列时，术语“基本上一致性”或“基本上一致”意指两个氨基酸序列在最佳比对(如使用默认空位权重通过程序GAP或BESTFIT)时，共有至少95％序列一致性，甚至更优选至少98％或99％序列一致性。不一致残基位置的差异优选是保守性氨基酸取代。在其中两个或更多个氨基酸序列彼此间差异是保守性取代的情况下，可以上调序列一致性或相似度百分比以根据保守性取代性质进行校正。用于进行这种调节的手段是所属领域的技术人员众所周知的。参见例如Pearson(1994)《分子生物学方法》24:307-331。
通常使用序列分析软件来测量多肽的序列相似性，其也称为序列一致性。蛋白质分析软件使用分配于各种取代、缺失和其它修饰，包括保守性氨基酸取代的相似性量度来匹配相似序列。举例来说，GCG软件含有如Gap和Bestfit等程序，其可以在默认参数下使用于测定密切相关的多肽，如来自生物体的不同物种的同源多肽之间，或野生型蛋白与其突变蛋白之间的序列同源性或序列一致性。参见例如GCG，6.1版。多肽序列也可以使用FASTA(6.1版GCG中的程序)，使用默认或推荐参数进行比较。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供查询序列与搜寻序列之间的最佳重叠区域的比对和序列一致性百分比(Pearson(2000),见上文)。当比较本发明的序列与含有许多来自不同生物体的序列的资料库时，另一优选的算法是电脑程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN，使用默认参数。参见例如Altschul等人(1990)《分子生物学杂志》215:403-410和Altschul等人(1997)《核酸研究》25:3389-402。
在获得之后，利用一种或多种活体外分析，针对降低的结合或结合亲和力来测试含有一种或多种生殖系突变的抗原结合域。尽管识别具体抗原的抗体通常是通过测试对所述抗原的高(即，强)结合或结合亲和力，针对其目的进行筛分，但本发明的抗体呈现弱结合或不可检测的结合。本发明也涵盖以这种常用方式获得的包含一个或多个抗原结合域的双特异性抗原结合分子并且认为可以有利地作为亲合力驱动肿瘤疗法。
可以由本文中所描述的方法实现意外优点，例如改善的药物动力学特性和对患者的低毒性。
抗体的结合特性
如本文中所使用，在抗体、免疫球蛋白、抗体结合片段或含有Fc的蛋白质与任一例如预定抗原(如细胞表面蛋白质或其片段)的结合的情形下，术语“结合”通常是指至少两个实体或分子结构之间的相互相用或关联，如抗体-抗原相互作用。
举例来说，当使用抗原作为配位体且抗体、Ig、抗体结合片段或含有Fc的蛋白质作为分析物(或抗配位体)，通过例如表面电浆子共振(surface plasmon resonance；SPR)技术在BIAcore 3000仪器中测定时，结合亲和力通常对应于约10-7M或更小，如约10-8M或更小，如约10-9M或更小的KD值。通常也使用基于细胞的结合策略，如荧光活化细胞分选(FACS)结合分析法，并且FACS资料与其它方法(如放射性配位体竞争结合和SPR)良好相关(Benedict,CA,《免疫学方法杂志(J Immunol Methods.)》1997,201(2):223-31；Geuijen,CA等人,《免疫学方法杂志》2005,302(1-2):68-77)。
因此，本发明的抗体或抗原结合蛋白质结合于预定抗原或细胞表面分子(受体)，所述预定抗原或细胞表面分子具有对应于比其结合于非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白)的亲和力低至少十倍的KD值的亲和力。根据本发明，对应于等于或小于比非特异性抗原低十倍的KD值的抗体亲和力可以视为不可检测的结合，但是这类抗体可以与第二抗原结合臂配对以产生本发明的双特异性抗体。
术语“KD”(M)是指具体抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，或与抗原结合的抗体或抗体结合片段的解离平衡常数。KD与结合亲和力之间存在相反关系，因此KD值越小，亲和力越高，即越强。因此，术语“较高的亲和力”或“较强的亲和力”涉及较高的形成相互作用且因此较小的KD值的能力，且相反地，术语“较低的亲和力”或“较弱的亲和力”涉及较低的形成相互作用且因此较大的KD值的能力。在某些情况下，具体分子(例如抗体)与其相互作用搭配物分子(例如抗原X)的较高结合亲和力(或KD)(与所述分子(例如抗体)与另一种相互作用搭配物分子(例如抗原Y)的结合亲和力相比)可以表示成结合率，其是通过将较大的KD值(较低或较弱亲和力)除以较小的KD(较高或较强的亲和力)来测定，例如视具体情况表示成5倍或10倍更大的结合亲和力。
术语“kd”(sec-1或1/s)是指具体抗体-抗原相互作用的解离速率常数，或抗体或抗体结合片段的解离速率常数。所述值也称为koff值。
术语“ka”(M-1×sec-1或1/M)是指具体抗体-抗原相互作用的结合速率常数，或抗体或抗体结合片段的结合速率常数。
术语“KA”(M-1或1/M)是指具体抗体-抗原相互作用的结合平衡常数，或抗体或抗体结合片段的结合平衡常数。结合平衡常数是通过将ka除以kd获得。
术语“EC50”或“EC50”是指半最大有效浓度，其包括在指定暴露时间之后诱导基线与最大值之间的半途响应的抗体浓度。EC50本质上代表其中观察到其最大作用的50％的抗体浓度。在某些实施例中，EC50值等于产生与表达CD3的细胞或肿瘤相关抗原的半最大结合的本发明的抗体的浓度，如通过例如FACS结合分析法测定。因此，在增加的EC50或半最大有效浓度值下观察到降低或较弱的结合。
在一个实施例中，降低的结合可以定义为能够实现与半最大量的目标细胞结合的增加的EC50抗体浓度。
在另一实施例中，EC50值表示通过T细胞毒性活性引发目标细胞的半最大消耗的本发明的抗体的浓度。因此，在降低的EC50或半最大有效浓度值下观察到增加的细胞毒性活性(例如T细胞介导的肿瘤细胞杀伤)。
双特异性抗原结合分子
本发明的抗体可以是单特异性、双特异性或多特异性。多特异性抗体可以对一种目标多肽的不同表位具有特异性或可以含有对超过一种目标多肽具有特异性的抗原结合域。参见例如Tutt等人,1991,《免疫学杂志(J.Immunol.)》147:60-69；Kufer等人,2004,《生物技术趋势(Trends Biotechnol.)》22:238-244。本发明的抗MUC16单特异性抗体或抗MUC16/抗CD3双特异性抗体可以与另一种功能性分子(例如另一种肽或蛋白质)连接或共表达。举例来说，抗体或其片段可以功能上连接(例如通过化学偶合、基因融合、非共价结合或以其它方式)到一个或多个其它分子实体，如另一抗体或抗体片段，以产生具有第二或其它结合特异性的双特异性或多特异性抗体。
本文中使用表述“抗CD3抗体”或“抗MUC16抗体”意图包括单特异性抗CD3或抗MUC16抗体，以及包含CD3结合臂和MUC16结合臂的双特异性抗体。因此，本发明包括双特异性抗体，其中免疫球蛋白的一个臂结合人类CD3，并且免疫球蛋白的另一个臂对人类MUC16具有特异性。CD3结合臂可以包含如本文中的表1、16、18、19、22和23中所阐述的HCVR/LCVR或CDR氨基酸序列中的任一个。
在某些实施例中，CD3结合臂结合于人类CD3并且诱导人类T细胞活化。在某些实施例中，CD3结合臂弱结合于人类CD3并且诱导人类T细胞活化。在其它实施例中，在双特异性或多特异性抗体的情形下，CD3结合臂弱结合于人类CD3并且诱导肿瘤相关抗原表达细胞杀伤。在其它实施例中，CD3结合臂与人类和食蟹猕猴(猴)CD3弱结合或相关，并且所述结合相互相用不可由所属领域中已知的活体外分析法检测。MUC16结合臂可以包含如本文中的表1中所阐述的HCVR/LCVR或CDR氨基酸序列中的任一个。
根据某些例示性实施例，本发明包括特异性结合CD3和MUC16的双特异性抗原结合分子。这类分子在本文中可以称为例如“抗CD3/抗MUC16”，或“抗CD3xMUC16”或“CD3xMUC16”双特异性分子，或其它类似术语(例如抗MUC16/抗CD3)。本发明提供双特异性抗原结合分子，其由结合MUC16的第一抗原结合臂和结合CD3的第二抗原结合臂构筑。在一些实施例中，抗CD3臂包含衍生自IGHV3-9*01、IGHJ6*02、IGHD5-12*01的重链。在其它实施例中，双特异性抗原结合分子在肿瘤抗原表达细胞系上活化人类PBMC细胞和/或诱导细胞毒性活性。
如本文中所使用，除非指定来自非人类物种(例如“小鼠MUC16”、“猴MUC16”等)，否则术语“MUC16”是指人类MUC16蛋白质。人类MUC16蛋白质具有SEQ ID NO:1899中展示的氨基酸序列。
前述特异性结合CD3和MUC16的双特异性抗原结合分子可以包含抗CD3抗原结合分子，其以弱结合亲和力结合于CD3，如呈现大于约40nM的KD，如通过活体外亲和力结合分析法测量。前述双特异性抗原结合分子可以包含抗CD3抗原结合分子，其结合于CD3且呈现大于约100nM的EC50，如通过FACS滴定分析法测量。前述双特异性抗原结合分子可以包含抗CD3抗原结合分子，其呈现不可测量或不可观察的与CD3的结合，如通过活体外亲和力结合分析法或FACS滴定分析法测量，但保持在肿瘤抗原表达细胞系上活化人类PBMC细胞和/或诱导细胞毒性活性的能力。
如本文中所使用，表述“抗原结合分子”意指包含至少一个互补决定区(CDR)或由其组成的蛋白质、多肽或分子复合物，所述互补决定区单独或与一个或多个其它CDR及/或构架区(FR)组合特异性结合于具体抗原。在某些实施例中，抗原结合分子是抗体或抗体片段，如这些术语在本文中其它地方定义。
如本文中所使用，表述“双特异性抗原结合分子”意指至少包含第一抗原结合域和第二抗原结合域的蛋白质、多肽或分子复合物。双特异性抗原结合分子内的各抗原结合域包含至少一个CDR，其单独或与一个或多个其它CDR和/或FR组合特异性结合于具体抗原。在本发明的情形下，第一抗原结合域特异性结合第一抗原(例如CD3)，并且第二抗原结合域特异性结合第二、不同抗原(例如MUC16)。
在本发明的某些例示性实施例中，双特异性抗原结合分子是双特异性抗体。双特异性抗体的各抗原结合域包含重链可变域(HCVR)和轻链可变域(LCVR)。在包含第一和第二抗原结合域的双特异性抗原结合分子(例如双特异性抗体)的情形下，第一抗原结合域的CDR可由前缀“A1”指定且第二抗原结合域的CDR可由前缀“A2”指定。因此，第一抗原结合域的CDR在本文中可称为A1-HCDR1、A1-HCDR2和A1-HCDR3；并且第二抗原结合域的CDR在本文中可称为A2-HCDR1、A2-HCDR2和A2-HCDR3。
第一抗原结合域和第二抗原结合域可以直接地或间接地彼此连接以形成本发明的双特异性抗原结合分子。或者，第一抗原结合域和第二抗原结合域可以各自连接到单独的多聚化结构域。一个多聚化结构域与另一多聚化结构域的结合促进两个抗原结合域之间的结合，从而形成双特异性抗原结合分子。如本文中所使用，“多聚化结构域”是能够与相同或相似结构或构成的第二多聚化结构域结合的任何大分子、蛋白质、多肽、肽或氨基酸。举例来说，多聚化结构域可以是包含免疫球蛋白CH3结构域的多肽。多聚化组分的非限制性实例是免疫球蛋白的Fc部分(包含CH2-CH3结构域)，例如选自同型IgG1、IgG2、IgG3和IgG4以及各同型群组内的任何同种异型的IgG的Fc域。
本发明的双特异性抗原结合分子将通常包含两个多聚化结构域，例如两个Fc域，其各自个别地是单独的抗体重链的一部件。第一和第二多聚化结构域可以具有相同IgG同型，如IgG1/IgG1、IgG2/IgG2、IgG4/IgG4。或者，第一和第二多聚化结构域可以具有不同IgG同型，如IgG1/IgG2、IgG1/IgG4、IgG2/IgG4等。
在某些实施例中，多聚化结构域是含有至少一个半胱氨酸残基的1到约200个氨基酸长的Fc片段或氨基酸序列。在其它实施例中，多聚化结构域是半胱氨酸残基，或含有半胱氨酸的短肽。其它多聚化结构域包含肽或多肽，所述肽或多肽包含白氨酸拉链、螺旋环圈基元或卷曲螺旋基元或由其组成。
任何双特异性抗体格式或技术都可以用于制备本发明的双特异性抗原结合分子。举例来说，具有第一抗原结合特异性的抗体或其片段可以功能上连接(例如通过化学偶合、基因融合、非共价结合或以其它方式)到一个或多个其它分子实体，如具有第二抗原结合特异性的另一抗体或抗体片段，以产生双特异性抗原结合分子。可以用于本发明的情形下的特定例示性双特异性格式包括(但不限于)例如基于scFv或双功能抗体双特异性格式、IgG-scFv融合物、双重可变域(DVD)-Ig、四源杂交瘤(Quadroma)、臼包杵、常见轻链(例如具有臼包杵的常见轻链等)、CrossMab、CrossFab、(SEED)体、白氨酸拉链、Duobody、IgG1/IgG2、双重作用Fab(DAF)-IgG和Mab2双特异性格式(关于前述格式的综述，参见例如Klein等人2012,mAbs 4:6,1-11和其中所引用的参考文献)。
在本发明的双特异性抗原结合分子的情形下，与Fc域的野生型、天然存在的版本相比，多聚化结构域(例如Fc域)可以包含一种或多种氨基酸变化(例如插入、缺失或取代)。举例来说，本发明包括双特异性抗原结合分子，其在Fc域中包含一种或多种修饰，产生具有Fc与FcRn之间的经修饰的结合相互相用(例如增强或减弱)的经修饰的Fc域。在一个实施例中，双特异性抗原结合分子包含CH2或CH3区域中的修饰，其中所述修饰增加酸性环境中(例如核内体中，其中pH值在约5.5到约6.0范围内)Fc域对FcRn的亲和力。这类Fc修饰的非限制性实例包括例如位置250(例如E或Q)；250和428(例如L或F)；252(例如L/Y/F/W或T)、254(例如S或T)和256(例如S/R/Q/E/D或T)处的修饰；或位置428和/或433(例如H/L/R/S/P/Q或K)和/或434(例如H/F或Y)处的修饰；或位置250和/或428处的修饰；或位置307或308(例如308F、V308F)和434处的修饰。在一个实施例中，修饰包含428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修饰；428L、259I(例如V259I)和308F(例如V308F)修饰；433K(例如H433K)和434(例如434Y)修饰；252、254和256(例如252Y、254T和256E)修饰；250Q和428L修饰(例如T250Q和M428L)；以及307和/或308修饰(例如308F或308P)。
本发明还包括双特异性抗原结合分子，其包含第一CH3结构域和第二Ig CH3结构域，其中第一和第二Ig CH3结构域彼此相差至少一个氨基酸，且其中与不具有氨基酸差异的双特异性抗体相比，至少一个氨基酸差异降低双特异性抗体与蛋白质A的结合。在一个实施例中，第一Ig CH3结构域结合蛋白质A并且第二Ig CH3结构域含有减少或消除蛋白质A结合的突变，如H95R修饰(由IMGT外显子编号；H435R，由EU编号)。第二CH3可以进一步包含Y96F修饰(由IMGT；Y436F，由EU)。参见例如美国专利案第8,586,713号。可发现于第二CH3内的其它修饰包括：在IgG1抗体的情况下，D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(由IMGT；D356E、L358M、N384S、K392N、V397M和V422I，由EU)；在IgG2抗体的情况下，N44S、K52N和V82I(IMGT；N384S、K392N和V422I，由EU)；并且在IgG4抗体的情况下，Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(由IMGT；Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I，由EU)。
在某些实施例中，Fc域可以是衍生自超过一种免疫球蛋白同型的嵌合、组合Fc序列。举例来说，嵌合Fc域可以包含一部件或所有衍生自人类IgG1、人类IgG2或人类IgG4CH2区的CH2序列，和一部分或所有衍生自人类IgG1、人类IgG2或人类IgG4的CH3序列。嵌合Fc域还可以含有嵌合铰链区。举例来说，嵌合铰链可以包含衍生自人类IgG1、人类IgG2或人类IgG4铰链区的“上铰链”序列，与衍生自人类IgG1、人类IgG2或人类IgG4铰链区的“下铰链”序列组合。可包括于本文所阐述的抗原结合分子中的任一个中的嵌合Fc域的具体实例从N端到C端包含：[IgG4CH1]-[IgG4上铰链]-[IgG2下铰链]-[IgG4CH2]-[IgG4CH3]。可包括于本文所阐述的抗原结合分子中的任一个中的嵌合Fc域的另一实例从N端到C端包含：[IgG1CH1]-[IgG1上铰链]-[IgG2下铰链]-[IgG4CH2]-[IgG1CH3]。可包括于本发明的抗原结合分子中的任一个中的嵌合Fc域的这些和其它实例描述于2014年8月28日出版的美国公开案2014/0243504中，所述公开案以全文引用的方式并入。具有这些通用结构布置的嵌合Fc域和其变异体可以具有变化的Fc受体结合，其又影响Fc效应功能。
在某些实施例中，本发明提供抗体重链，其中重链恒定区(CH)区域包含与SEQ IDNO:1911、SEQ ID NO:1912、SEQ ID NO:1913、SEQ ID NO:1914、SEQ ID NO:1915、SEQ IDNO:1916、SEQ ID NO:1917、SEQ ID NO:1918、SEQ ID NO:1919或SEQ ID NO:1920中的任一个至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％一致的氨基酸序列。在一些实施例中，重链恒定区(CH)区域包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1911、SEQ IDNO:1912、SEQ ID NO:1913、SEQ ID NO:1914、SEQ ID NO:1915、SEQ ID NO:1916、SEQ IDNO:1917、SEQ ID NO:1918、SEQ ID NO:1919和SEQ ID NO:1920。
在其它实施例中，本发明提供抗体重链，其中Fc域包含与SEQ ID NO:1921、SEQ IDNO:1922、SEQ ID NO:1923、SEQ ID NO:1924、SEQ ID NO:1925、SEQ ID NO:1926、SEQ IDNO:1927、SEQ ID NO:1928、SEQ ID NO:1929或SEQ ID NO:1930中的任一个至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％一致的氨基酸序列。在一些实施例中，Fc域包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1921、SEQ ID NO:1922、SEQ ID NO:1923、SEQ IDNO:1924、SEQ ID NO:1925、SEQ ID NO:1926、SEQ ID NO:1927、SEQ ID NO:1928、SEQ IDNO:1929和SEQ ID NO:1930。
序列变异体
与衍生个别抗原结合域的相应生殖系序列相比，本发明的抗体和双特异性抗原结合分子可以在重链和轻链可变域的构架区和/或CDR区中包含一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失。这类突变可以容易地通过比较本文所公开的氨基酸序列与可从例如公共抗体序列资料库获得的生殖系序列来确定。本发明的抗原结合分子可以包含衍生自本文所公开的例示性氨基酸序列中的任一个的抗原结合域，其中一个或多个构架区和/或CDR区内的一个或多个胺基酸突变成衍生抗体的生殖系序列的相应残基，或突变成另一人类生殖系序列的相应残基，或突变成相应生殖系残基的保守性氨基酸取代(这类序列变化在本文中统称为“生殖系突变”)。以本文所公开的重链和轻链可变区序列为起始物质，所属领域中的普通技术人员可以容易地产生许多包含一个或多个个别生殖系突变或其组合的抗体和抗原结合片段。在某些实施例中，VH和/或VL域内的所有构架和/或CDR残基突变回在最初衍生抗原结合域的初始生殖系序列中发现的残基。在其它实施例中，仅某些残基突变回初始生殖系序列，例如仅在FR1的前8个氨基酸内或在FR4的最后8个氨基酸内发现的突变型残基，或仅在CDR1、CDR2或CDR3内发现的突变型残基。在其它实施例中，构架和/或CDR残基中的一个或多个突变成不同生殖系序列(即，与最初衍生抗原结合域的生殖系序列不同的生殖系序列)的相应残基。此外，抗原结合域可以在构架区和/或CDR区内含有两个或更多个生殖系突变的任何组合，例如其中某些个别残基突变成具体生殖系序列的相应残基，而不同于初始生殖系序列的某些其它残基保持不变或突变成不同生殖系序列的相应残基。在获得之后，可以容易地测试含有一个或多个生殖系突变的抗原结合域的一种或多种所需性质，如改善的结合特异性、增加的结合或结合亲和力、改善或增强的拮抗性或促效生物特性(视具体情况)、降低的免疫原性等。本发明涵盖以这种常用方式获得的包含一个或多个抗原结合域的双特异性抗原结合分子。
本发明还包括抗原结合分子，其中一个或两个抗原结合域包含本文所公开的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列中的任一个的具有一个或多个保守性取代的变异体。举例来说，本发明包括抗原结合分子，其包含具有HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列的抗原结合域，所述HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列与本文所公开的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列中的任一个相比具有例如10个或更少个、8个或更少个、6个或更少个、4个或更少个等保守性氨基酸取代。“保守性氨基酸取代”是其中一个氨基酸残基经另一个含有具有类似化学特性(例如电荷或疏水性)的侧链(R基团)的氨基酸残基取代的取代。通常，保守性氨基酸取代不会显著改变蛋白质的功能特性。含有具有类似化学特性的侧链的氨基酸组的实例包括(1)脂族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、白氨酸和异白氨酸；(2)脂族羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；(3)含有酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸，和(7)含硫侧链是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守性氨基酸取代组是：缬氨酸-白氨酸-异白氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。或者，保守性置换是在以引用的方式并入本文中的Gonnet等人(1992)《科学》256:1443-1445中所公开的PAM250对数似然性矩阵中具有正值的任何变化。“适度保守”置换是在PAM250对数似然矩阵中具有非负值的任何变化。
本发明还包括抗原结合分子，其包含具有与本文所公开的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列中的任一个基本上一致的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列的抗原结合域。当参考氨基酸序列时，术语“基本上一致性”或“基本上一致”意指两个氨基酸序列在最佳比对(如使用默认空位权重通过程序GAP或BESTFIT)时，共有至少95％序列一致性，甚至更优选至少98％或99％序列一致性。不一致残基位置的差异优选是保守性氨基酸取代。在其中两个或更多个氨基酸序列彼此间差异是保守性取代的情况下，可以上调序列一致性或相似度百分比以根据保守性取代性质进行校正。用于进行这种调节的手段是所属领域的技术人员众所周知的。参见例如Pearson(1994)《分子生物学方法》24:307-331，其以引用的方式并入本文中。
通常使用序列分析软件来测量多肽的序列相似性，其也称为序列一致性。蛋白质分析软件使用分配于各种取代、缺失和其它修饰，包括保守性氨基酸取代的相似性量度来匹配相似序列。举例来说，GCG软件含有如Gap和Bestfit等程序，其可以在默认参数下使用于测定密切相关的多肽，如来自生物体的不同物种的同源多肽之间，或野生型蛋白与其突变蛋白之间的序列同源性或序列一致性。参见例如GCG，6.1版。多肽序列也可以使用FASTA(6.1版GCG中的程序)，使用默认或推荐参数进行比较。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供查询序列与搜寻序列之间的最佳重叠区域的比对和序列一致性百分比(Pearson(2000),见上文)。当比较本发明的序列与含有许多来自不同生物体的序列的资料库时，另一优选的算法是电脑程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN，使用默认参数。参见例如Altschul等人(1990)《分子生物学杂志》215:403-410和Altschul等人(1997)《核酸研究》25:3389-402，其各自以引用的方式并入本文中。
pH值依赖性结合
本发明包括抗MUC16抗体和抗CD3/抗MUC16双特异性抗原结合分子，其具有pH值依赖性结合特征。举例来说，与中性pH值相比，本发明的抗MUC16抗体在酸性pH值下可以呈现降低的与MUC16的结合。或者，与中性pH值相比，本发明的抗MUC16抗体在酸性pH值下可以呈现增强的与MUC16的结合。表述“酸性pH值”包括小于约6.2的pH值，例如约6.0、5.95、5.9、5.85、5.8、5.75、5.7、5.65、5.6、5.55、5.5、5.45、5.4、5.35、5.3、5.25、5.2、5.15、5.1、5.05、5.0或更低。如本文中所使用，表述「中性pH值」意指约7.0到约7.4的pH值。表述「中性pH值」包括约7.0、7.05、7.1、7.15、7.2、7.25、7.3、7.35和7.4的pH值。
在某些情况下，「与中性pH值相比，在酸性pH值下降低的结合」是就在酸性pH值下抗体与其抗原结合的KD值与在中性pH值下抗体与其抗原结合的KD值的比来表述(或反过来)。举例来说，出于本发明的目的，如果抗体或其抗原结合片段呈现约3.0或更大的酸性/中性KD比，那么抗体或其抗原结合片段可以视为呈现「与中性pH值相比，在酸性pH值下降低的与MUC16的结合」。在某些例示性实施例中，本发明的抗体或抗原结合片段的酸性/中性KD比可以是约3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、20.0、25.0、30.0、40.0、50.0、60.0、70.0、100.0或更高。
可以例如通过针对与中性pH值相比，在酸性pH值下降低(或增强)的与具体抗原的结合来筛选抗体群体，以获得具有pH值依赖性结合特征的抗体。此外，在氨基酸水准下抗原结合域的修饰可以产生具有pH值依赖性特征的抗体。举例来说，通过用组氨酸残基取代抗原结合域(例如CDR内)的一个或多个氨基酸，可以获得与中性pH值相比，在酸性pH值下具有降低的抗原结合的抗体。
包含Fc变异体的抗体
根据本发明的某些实施例，提供抗MUC16抗体和抗CD3/抗MUC16双特异性抗原结合分子，其包含Fc域，所述Fc域包含一个或多个增强或减少抗体与FcRn受体的结合的突变，例如与中性pH值相比，在酸性pH值下。举例来说，本发明包括在Fc域的CH2或CH3区域中包含突变的抗体，其中所述突变在酸性环境中(例如在核内体中，其中pH值在约5.5到约6.0范围内)增加Fc域对FcRn的亲和力。此类突变可以引起当向动物给予时，抗体的血清半衰期增加。这类Fc修饰的非限制性实例包括例如位置250(例如E或Q)；250和428(例如L或F)；252(例如L/Y/F/W或T)、254(例如S或T)和256(例如S/R/Q/E/D或T)处的修饰；或位置428和/或433(例如H/L/R/S/P/Q或K)和/或434(例如H/F或Y)处的修饰；或位置250和/或428处的修饰；或位置307或308(例如308F、V308F)和434处的修饰。在一个实施例中，修饰包含428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修饰；428L、259I(例如V259I)和308F(例如V308F)修饰；433K(例如H433K)和434(例如434Y)修饰；252、254和256(例如252Y、254T和256E)修饰；250Q和428L修饰(例如T250Q和M428L)；以及307和/或308修饰(例如308F或308P)。
举例来说，本发明包括抗MUC16抗体和抗CD3/抗MUC16双特异性抗原结合分子，其包含Fc域，所述Fc域包含选自由以下组成的组的一个或多个突变对或突变组：250Q和248L(例如T250Q和M248L)；252Y、254T和256E(例如M252Y、S254T和T256E)；428L和434S(例如M428L和N434S)；和433K和434F(例如H433K和N434F)。前述Fc域突变和本文所公开的抗体可变域内的其它突变的所有可能的组合涵盖于本发明的范围内。
抗体和双特异性抗原结合分子的生物特征
本发明包括以高亲和力(例如次纳摩尔KD值)结合人类MUC16的抗体和其抗原结合片段。
根据某些实施例，本发明包括抗体和抗体的抗原结合片段，其以小于约60nM的KD结合人类MUC16(例如在25℃下)，如通过表面等离子子共振所测量，例如使用如本文中实例4中所定义的分析法格式。在某些实施例中，本发明的抗体或抗原结合片段以小于约60nM、小于约40nM、小于约20nM、小于约10nM、小于约8nM、小于约7nM、小于约6nM、小于约5nM、小于约4nM、小于约3nM、小于约2nM,、小于约1nM、小于约800pM、小于约700pM、小于约500pM、小于约400pM或小于约300pM的KD结合MUC16，如通过表面等离子共振所测量，例如使用如本文中实例4所定义的分析法格式(例如mAb捕捉或抗原捕捉格式)，或基本上类似的分析法。本发明包括双特异性抗原结合分子，例如以小于约7nM的KD结合MUC16的双特异性抗体，如通过表面等离子共振所测量，例如使用如本文中实例4所定义的分析法格式(例如mAb捕捉或抗原捕捉格式)，或基本上类似的分析法。。
本发明还包括抗体和其抗原结合片段，其以大于约10分钟或大于约125分钟的解离半衰期(t1/2)结合MUC16，如在25℃下通过表面等离子共振所测量，例如使用如本文中实例4中所定义的分析法格式，或基本上类似的分析法。在某些实施例中，本发明的抗体或抗原结合片段以大于约10分钟、大于约20分钟、大于约30分钟、大于约40分钟、大于约50分钟、大于约60分钟、大于约70分钟、大于约80分钟、大于约90分钟、大于约100分钟、大于约110分钟或大于约120分钟的t1/2结合MUC16，如在25℃下通过表面等离子共振所测量，例如使用如本文中实例4中所定义的分析法格式(例如mAb捕捉或抗原捕捉格式)，或基本上类似的分析法。本发明包括双特异性抗原结合分子，例如以大于约10分钟或大于约20分钟的结合MUC16的双特异性抗体，如在25℃下通过表面等离子共振所测量，例如使用如本文中实例4中所定义的分析法格式，或基本上类似的分析法。
本发明还包括抗体和其抗原结合片段，其特异性结合于表达内源性MUC16的人类细胞系(例如OVCAR-3)，如通过基于电化学发光的侦测分析法(如实例2中所阐述)或基本上类似的分析法所测定。
本发明还包括抗CD3/抗MUC16双特异性抗原结合分子，其呈现选自由以下组成的组的一种或多种特征：(a)抑制具有人类卵巢癌异种移植物的免疫功能不全小鼠中的肿瘤生长；和(b)抑制具有人类卵巢癌异种移植物的免疫功能不全小鼠中已建立肿瘤的肿瘤生长(参见例如实例8)。
本发明包括以高亲和力结合人类CD3的抗体和其抗原结合片段。本发明还包括抗体和其抗原结合片段，取决于治疗情形和所需的具体靶向特性，其以中等或低亲和力结合人类CD3。在一些情况下，低亲和力包括以大于300nM、大于500nM或大于1μM的KD或EC50(例如在表面等离子共振分析法中测量)结合CD3的抗体。本发明还包括以不可测量的亲和力结合人类CD3的抗体和其抗原结合片段。举例来说，在双特异性抗原结合分子的情形下，其中一个臂结合CD3并且另一个臂结合目标抗原(例如MUC16)，可能需要目标抗原结合臂以高亲和力结合目标抗原，同时抗CD3臂仅以中等或低亲和力或无亲和力结合CD3。以这种方式，可以实现抗原结合分子优先靶向表达目标抗原的细胞，同时避免一般/未靶向的CD3结合和随之而来的与其相关的不良副作用。
本发明包括双特异性抗原结合分子(例如双特异性抗体)，其能够同时结合于人类CD3和人类MUC16。与表达CD3的细胞相互作用的结合臂可以具有弱到不可检测的结合，如在适合的活体外结合分析法中测量。可以通过荧光活化细胞分选(FACS)来评估双特异性抗原结合分子与表达CD3和/或MUC16的细胞的结合程度，如本文中实例5中所说明。
举例来说，本发明包括抗体、其抗原结合片段和双特异性抗体，其特异性结合表达CD3但不表达MUC16的人类T细胞系(例如Jurkat)、灵长类动物T细胞(例如食蟹猕猴外周血液单核细胞[PBMC])和/或表达MUC16的细胞。
本发明包括抗体、其抗原结合片段和双特异性抗体，其以弱(即，低)或甚至不可检测的结合或结合亲和力来结合人类CD3。
本发明包括抗体、其抗原结合片段和双特异性抗体，其以弱(即，低)或甚至不可检测的结合或结合亲和力来结合猴(即，食蟹猕猴)CD3。
本发明包括抗体、其抗原结合片段和双特异性抗体，其结合人类CD3并且诱导T细胞活化。
本发明包括抗CD3/抗MUC16双特异性抗原结合分子，其能够消耗个体中表达肿瘤抗原的细胞(参见例如实例8，在生物发光成像分析法或基本上类似的分析法中)。举例来说，根据某些实施例，提供抗CD3/抗MUC16双特异性抗原结合分子，其中向个体单次给予10μg双特异性抗原结合分子可以引起个体中表达MUC16的细胞数目减少(例如遏制或抑制个体中的肿瘤生长)。除非另有指示，否则生物发光辐射率是指[p/s/cm22/sr]。
本发明还包括抗MUC16抗体药物结合物，其抑制活体内MUC16阳性卵巢癌异种移植模型中的肿瘤生长(参见例如实例10，在生物发光成像分析法或基本上类似的分析法中)。在某些实施例中，提供具有化合物7的抗MUC16抗体药物结合物，其中以85μg/kg的剂量给予的四次每周一次给药可以抑制活体内腹膜内OVCAR3/luc肿瘤生长。在某些实施例中，提供具有化合物7的抗MUC16抗体药物结合物，其中以85μg/kg的剂量给予的四次每周一次给药可以抑制活体内皮下OVCAR3/luc肿瘤生长。在某些实施例中，提供具有化合物10的抗MUC16抗体药物结合物，其中以85μg/kg、170μg/kg或340μg/kg的剂量进行的单次给药可以抑制活体内腹膜内OVCAR3/luc肿瘤生长。除非另有指示，否则生物发光辐射率是指[p/s/cm22/sr]。
本发明还包括抗CD3/抗MUC16双特异性抗原结合分子，其在人类化MUC16x CD3小鼠(用于人类MUC16和CD3表现的小鼠同型接合子，MUC16hu/huxCD3hu/hu)、CD3人类化小鼠(用于人类CD3表现的小鼠同型接合子，CD3hu/hu)和品系匹配(75％C57BL、25％129Sv)野生型(WT)小鼠中呈现药物动力学概况，如实例7中所描述以及图1、2和3中所展示。
表位定位和相关技术
本发明的抗原结合分子结合的CD3和/或MUC16上的表位可以由具有CD3或MUC16蛋白质的3个或更多个(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个)氨基酸的单一连续序列组成。或者，表位可以由CD3或MUC16的多个非连续氨基酸(或氨基酸序列)组成。本发明的抗体可以与单一CD3链(例如CD3-ε、CD3-δ或CD3-γ)内所含的氨基酸相互作用，或可以与两个或更多个不同CD3链上的氨基酸相互作用。如本文中所使用，术语“表位”是指与称为互补位的抗体分子的可变区中的特异性抗原结合位点相互作用的抗原决定子。单一抗原可以具有超过一个表位。因此，不同抗体可以结合于抗原上的不同区域并且可以具有不同生物作用。表位可以是构形或线性的。构形表位是由来自线性多肽链的不同区段的空间并置氨基酸产生。线性表位是由多肽链中的相邻氨基酸残基产生的表位。在某些情形中，表位可以包括抗原上的糖类、磷酰基或磺酰基。
所属领域的一般技术人员已知的各种技术可以用于测定抗体的抗原结合域是否“与多肽或蛋白质内的一个或多个氨基酸与相互作用”。例示性技术包括例如惯例交叉阻断分析法，如描述Antibodies,Harlow及Lane(Cold Spring Harbor Press,Cold SpringHarb.,NY)的分析法；丙氨酸扫描突变分析；肽印迹分析(Reineke,2004,《分子生物学方法》248:443-463)和肽裂解分析。此外，可以使用如表位切除、表位提取和抗原化学修饰等方法(Tomer 2000《蛋白质科学(Protein Science)》9:487-496)。另一种可以用于鉴别与抗体的抗原结合域相互作用的多肽内的氨基酸的方法是通过质谱检测的氢/氘交换。一般来说，氢/氘交换方法涉及氘标记相关蛋白质，接着使抗体与氘标记的蛋白质结合。接着，将蛋白质/抗体复合物转移到水中以允许氢-氘交换在除了经抗体保护的残基(其保持经氘标记)以外的所有残基处发生。在抗体解离之后，对目标蛋白质进行蛋白酶裂解和质谱分析，由此展现对应于与抗体相互作用的特定氨基酸的氘标记的残基。参见例如Ehring(1999)《分析型生物化学(Analytical Biochemistry)》267(2):252-259；Engen和Smith(2001)《分析化学(Anal.Chem.)》73:256A-265A。抗原/抗体复合物的X射线结晶也可以用于表位定位目的。
本发明还包括抗MUC16抗体，其与本文中所描述的特定例示性抗体(例如包含如本文中的表1中所阐述的氨基酸序列中的任一个的抗体)中的任一种结合于相同表位。类似地，本发明还包括抗MUC16抗体，其与本文中所描述的特定例示性抗体中的任一种(例如包含如本文中的表1中所阐述的氨基酸序列中的任一个的抗体)竞争结合于MUC16。
本发明还包括双特异性抗原结合分子，其包含以低或不可检测的结合或结合亲和力特异性结合人类CD3和/或食蟹猕猴CD3的第一抗原结合域，和特异性结合人类MUC16的第二抗原结合域，其中第一抗原结合域与本文中所描述的特定例示性CD3特异性抗原结合域中的任一个结合于CD3上的相同表位，和/或其中第二抗原结合域与本文中所描述的特定例示性MUC16特异性抗原结合域中的任一个结合于MUC16上的相同表位。
类似地，本发明还包括双特异性抗原结合分子，其包含特异性结合人类CD3的第一抗原结合域，和特异性结合人类MUC16的第二抗原结合域，其中第一抗原结合域与本文中所描述的特定例示性CD3特异性抗原结合域中的任一个竞争结合于CD3，和/或其中第二抗原结合域与本文中所描述的特定例示性MUC16特异性抗原结合域中的任一个竞争结合于MUC16。
可以使用所属领域中已知的常规方法容易地测定具体抗原结合分子(例如抗体)或其抗原结合域是否与本发明的参考抗原结合分子结合于相同表位或竞争结合。举例来说，为了测定测试抗体是否与本发明的参考双特异性抗原结合分子结合于MUC16(或CD3)上的相同表位，首先使参考双特异性分子结合于MUC16蛋白质(或CD3蛋白质)。接着，评估测试抗体结合于MUC16(或CD3)分子的能力。如果测试抗体在与参考双特异性抗原结合分子饱和结合后能够结合于MUC16(或CD3)，那么可以得出测试抗体与参考双特异性抗原结合分子结合于MUC16(或CD3)的不同表位的结论。另一方面，如果测试抗体在与参考双特异性抗原结合分子饱和结合后不能结合于MUC16(或CD3)分子，那么测试抗体可能结合于MUC16(或CD3)的与本发明的参考双特异性抗原结合分子所结合的表位相同的表位。接着，可以进行其它常规实验(例如肽突变和结合分析)以确认所观察到的测试抗体的结合不足是否实际上是由与参考双特异性抗原结合分子结合于相同表位引起，或空间阻断(或另一种现象)是否引起所观察到的结合不足。这类实验可以使用ELISA、RIA、Biacore、流动式细胞测量术或所属领域中可用的任何其它定量或定性抗体结合分析法来进行。根据本发明的某些实施例，如果例如1、5、10、20或100倍过量的一种抗原结合蛋白质抑制另一种抗原结合蛋白质的结合达至少50％，但优选75％、90％或甚至99％，如在竞争性结合分析法(参见例如Junghans等人,《癌症研究(Cancer Res.)》1990:50:1495-1502)中测量，那么两种抗原结合蛋白质结合于相同(或重叠)表位。或者，如果抗原中基本上所有的减少或消除一种抗原结合蛋白质的结合的氨基酸突变减少或消除另一种抗原结合蛋白质的结合，那么认为两种抗原结合蛋白质结合于相同表位。如果仅减少或消除一种抗原结合蛋白质的结合的氨基酸突变的子集减少或消除另一种抗原结合蛋白质的结合，那么认为两种抗原结合蛋白质具有“重叠表位”。
为了测定抗体或其抗原结合域是否与参考抗原结合分子竞争结合，沿两个方向进行上述结合方法：在第一方向中，使参考抗原结合分子在饱和条件下结合于MUC16蛋白质(或CD3蛋白质)，接着评估测试抗体与MUC16(或CD3)分子的结合。在第二定向中，使测试抗体在饱和条件下结合于MUC16(或CD3)分子，接着评估参考抗原结合分子与MUC16(或CD3)分子的结合。如果在两个方向中，仅第一(饱和)抗原结合分子能够结合于MUC16(或CD3)分子，那么得出测试抗体和参考抗原结合分子竞争结合于MUC16(或CD3)的结论。如所属领域的普通技术人员应理解，与参考抗原结合分子竞争结合的抗体可能未必与参考抗体结合于同一表位，但可以通过结合重叠或相邻表位而在空间上阻断参考抗体的结合。
制备抗原结合域和构筑双特异性分子
对具体抗原具有特异性的抗原结合域可以通过所属领域中已知的任何抗体产生技术制备。在获得之后，对两个不同抗原(例如CD3和MUC16)具有特异性的两个不同抗原结合域可以使用常规方法适当地相对于彼此排列，以产生本发明的双特异性抗原结合分子(本文中的其它地方提供可以用于构筑本发明的双特异性抗原结合分子的例示性双特异性抗体格式的论述)。在某些实施例中，本发明的多特异性抗原结合分子的个别组分(例如重链和轻链)中的一个或多个是衍生自嵌合、人类化或完全人类抗体。用于制备这类抗体的方法是所属领域中众所周知的。举例来说，可以使用VELOCIMMUNETM技术制备本发明的双特异性抗原结合分子的重链和/或轻链中的一个或多个。使用VELOCIMMUNETM技术(或任何其它人类抗体产生技术)，初始分离针对具体抗原(例如CD3或MUC16)的具有人类可变区和小鼠恒定区的高亲和力嵌合抗体。关于所需特征表征和选择抗体，包括亲和力、选择性、表位等。用所需人类恒定区置换小鼠恒定区以产生可以并入本发明的双特异性抗原结合分子中的完全人类重链和/或轻链。
经基因工程改造的动物可以用于制备人类双特异性抗原结合分子。举例来说，可以使用不能重排及表达内源性小鼠免疫球蛋白轻链可变序列的经基因修饰的小鼠，其中小鼠仅表达由可操作地连接到位于内源性小鼠κ基因座处的小鼠κ恒定基因的人类免疫球蛋白序列编码的一个或两个人类轻链可变域。这类经基因修饰的小鼠可以用于产生完全人类双特异性抗原结合分子，其包含与一致轻链相关的两个不同重链，所述轻链包含衍生自两个不同人类轻链可变区基因区段中的一个的可变域(参见例如US 2011/0195454)。完全人类是指包含跨越抗体或其抗原结合片段或免疫球蛋白结构域的各多肽的整个长度的由衍生自人类序列的DNA编码的氨基酸序列的抗体或其抗原结合片段或免疫球蛋白结构域。在一些实例中，完全人类序列衍生自对人类呈内源性的蛋白质。在其它实例中，完全人类蛋白质或蛋白质序列包含其中各组分序列衍生自人类序列的嵌合序列。尽管不受任何一种理论限制，但例如相比于任何野生型人类免疫球蛋白区域或结构域，嵌合蛋白质或嵌合序列通常经设计以将组分序列的接合点中的免疫原性表位的产生减到最少。
生物等效
本发明涵盖抗原结合分子，其具有在本文所公开的例示性分子的氨基酸序列范围内变化但保留结合CD3和/或MUC16能力的氨基酸序列。当与母序列比较时，这类变异型分子可以包含氨基酸的一个或多个添加、缺失或取代，但呈现与所描述的双特异性抗原结合分子的生物活性基本上等效的生物活性。
本发明包括抗原结合分子，其与本文中所阐述的例示性抗原结合分子中的任一个生物等效。举例来说，如果两个抗原结合蛋白质或抗体满足以下条件，那么视为生物等效：当在类似实验条件下以单次剂量或多剂量方式，以相同摩尔剂量给予时，其是吸收速率和吸收程度不展示显著差异的医药学等效物或医药学替代物。如果一些抗原结合蛋白质在吸收程度上但不在吸收速率上等效，则将其视为等效物或医药学替代物，且又可将其视为生物等效的，因为吸收速率中的这类差异是故意的且反映在标记中，对于在例如慢性使用方面达到有效主体药物浓度不是必要的，且对于所研究的具体药品来说被视为医学上无关紧要的。
在一个实施例中，如果两个抗原结合蛋白的安全性、纯度和效能方面不存在临床显著差异，则其是生物等效的。
在一个实施例中，如果患者能够在参考产品与生物产品之间转换一次或多次，且相比于无这类转换之持续疗法，不存在副作用(包括免疫原性的临床显著变化或有效性减弱)风险的预期增加，那么两个抗原结合蛋白是生物等效的。
在一个实施例中，如果两个抗原结合蛋白都通过一种或多种共同的作用机制在一种或多种使用条件下起作用，达到这类机制所已知的程度，那么其是生物等效的。
生物等效性可以通过活体内和活体外方法证明。生物等效性测量包括例如(a)人类或其它哺乳动物中的活体内测试，其中测量血液、血浆、血清或其它物流体中随时间而变的抗体或其代谢物的浓度；(b)与人类活体内生物可用性资料相关且合理地预测人类活体内生物可用性资料的活体外测试；(c)人类或其它哺乳动物中的活体内测试，其中测量随时间而变的抗体(或其目标)的适当急性药理学作用；以及(d)建立抗体的安全性、功效或生物可用性或生物等效性的良好控制的临床试验。
本文中所阐述的例示性双特异性抗原结合分子的生物等效变异体可以通过例如进行残基或序列的各种取代或删除对于生物活性来说非必需的末端或内部残基或序列来构筑。举例来说，可以删除对于生物活性来说非必需的半胱氨酸残基或用其它氨基酸置换，以防止在复性后形成不必要或不恰当的分子内二硫桥键。在其它情形中，生物等效抗原结合蛋白质可以包括本文中所阐述的例示性双特异性抗原结合分子的变异体，其包含修饰分子的糖基化特征的氨基酸变化，例如消除或去除糖基化的突变。
物种选择性和物种交叉反应性
根据本发明的某些实施例，提供抗原结合分子，其结合于人类CD3，但不结合于来自其它物种的CD3。还提供结合于人类MUC16的抗原结合分子。本发明还包括结合于人类CD3和来自一种或多种非人类物种的CD3的抗原结合分子；和/或结合于人类MUC16的抗原结合分子。
根据本发明的某些例示性实施例，提供抗原结合分子，其结合于人类CD3和/或人类MUC16并且可以视具体情况结合或不结合以下中的一个或多个：小鼠、大鼠、天竺鼠、仓鼠、沙鼠、猪、猫、狗、兔、山羊、绵羊、母牛、马、骆驼、食蟹猕猴、狨猴、恒河猴或黑猩猩CD3和/或MUC16。举例来说，在本发明的具体例示性实施例中，提供双特异性抗原结合分子，其包含结合人类CD3和食蟹猕猴CD3的第一抗原结合域，和特异性结合人类MUC16的第二抗原结合域。
抗体-药物结合物(ADC)
本发明提供抗体-药物结合物(ADC)，其包含与治疗部分(如细胞毒性剂、化学治疗药物、免疫抑制剂或放射性同位素)结合的抗MUC16抗体或其抗原结合片段。一般来说，ADC包含：A-[L-P]y，其中A是抗原结合分子，例如抗MUC16抗体，或其片段(例如包含至少一个选自表1中列举的HCDR3氨基酸序列中的任一个的HCDR3的片段)，L是连接子，P是有效负荷或治疗部分(例如细胞毒性剂)，并且y是整数1到30。在各种实施例中，ADC包含抗MUC16抗体或其抗原结合片段，其包含具有表1中所阐述的SEQ ID NO(例如SEQ ID NO:2和10)的氨基酸序列的HCVR和LCVR或特定HCVR/LCVR对(例如SEQ ID NO:2/10)的CDR。在一些情况下，抗MUC16抗体或片段包含具有表1中所阐述的SEQ ID NO(例如SEQ ID NO:4-6-8-12-14-16)的氨基酸序列的CDR。在一些情况下，抗MUC16抗体或片段包含具有表1中所阐述的SEQ ID NO(例如SEQ ID NO:2和10)或特定氨基酸序列对(例如SEQ ID NO:2/10)的氨基酸序列的HCVR和LCVR。在一些情况下，抗MUC16抗体是结合对应于SEQ ID NO:1899的残基13791-14451的人类MUC16的五个近膜海洋域中的一个或多个内的人类MUC16的抗体或抗原结合片段。在一些情况下，抗MUC16抗体是结合SEQ ID NO:1899的残基13810-14451内的人类MUC16的抗体或抗原结合片段。在一些情况下，抗MUC16抗体是结合于人类MUC16的SEA1、SEA2、SEA3、SEA4、SEA5、SEA6、SEA7、SEA8、SEA9、SEA10、SEA11、SEA12、SEA13、SEA14、SEA15或SEA16中的任一个或多个的抗体或抗原结合片段。
细胞毒性剂包括任何对细胞的生长、存活或增殖不利的试剂。本发明的抗原结合分子或抗体向目标细胞递送这些细胞毒性剂，本文中称为“有效负荷”。适用于形成ADC的细胞毒性剂和化学治疗剂的实例是所属领域中已知的。
可与根据本发明的这一方面的抗MUC16抗体结合的适合的细胞毒性剂和化学治疗剂的实例包括例如1-(2-氯乙基)-1,2-二甲烷磺酰基酰肼、1,8-二羟基-双环[7.3.1]十三碳-4,9-二烯-2,6-二炔-13-酮、1-去氢睪固酮、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、9-氨基喜树碱、放线菌素D(actinomycin D)、瓢菌素、氨基喋呤、蛇形菌素(anguidine)、蒽环霉素(anthracycline)、安曲霉素(anthramycin；AMC)、奥瑞他汀(auristatins)(单甲基奥瑞他汀E或单甲基奥瑞他汀F)、博莱霉素(bleomycin)、白消安(busulfan)、丁酸、卡奇霉素(calicheamicins)、喜树碱、洋红霉素(carminomycin)、卡莫司汀(carmustine)、西马多丁(cemadotin)、顺铂(cisplatin)、秋水仙碱(colchicin)、风车子抑素(combretastatins)、环磷酰胺、阿糖胞苷(cytarabine)、细胞迟缓素B(cytochalasin B)、放线菌素D、道诺霉素(daunorubicin)、达卡巴嗪(decarbazine)、二乙酰氧基戊基阿霉素(diacetoxypentyldoxorubicin)、二溴甘露醇、二羟基炭疽菌素二酮、迪索拉唑(disorazole)、海兔毒素(dolastatin)、小红莓(doxorubicin)、倍癌霉素(duocarmycin)、棘霉素(echinomycin)、艾榴塞洛素(eleutherobins)、吐根素(emetine)、埃博霉素(epothilones)、埃斯培拉霉素(esperamicin)、雌氮芥(estramustines)、溴化乙锭、依托泊苷(etoposide)、氟尿嘧啶(fluorouracils)、格尔德霉素(geldanamycins)、短桿菌素D(gramicidin D)、糖皮质激素、依立替康(irinotecans)、轻子霉素(leptomycins)、长春罗新(leurosines)、利多卡因(lidocaine)、洛莫司汀(lomustine；CCNU)、类美登素(maytansinoids)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、美法仑(melphalan)、巯基嘌呤、甲氨喋呤(methopterins)、甲胺喋呤(methotrexate)、光神霉素(mithramycin)、丝裂霉素(mitomycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、N8-乙酰基亚精胺、足叶草毒素(podophyllotoxins)、普鲁卡因(procaine)、普萘洛尔(propranolol)、喋啶(pteridines)、嘌呤霉素(puromycin)、根霉素(rhizoxins)、链佐霉素(streptozotocin)、他利霉素(tallysomycins)、紫杉醇(taxol)、特诺波赛(tenoposide)、四卡因(tetracaine)、噻替派苯丁酸氮芥(thioepa chlorambucil)、托马霉素(tomaymycins)、托泊替康(topotecans)、妥布赖森(tubulysin)、长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)、长春瑞滨(vinorelbines)和前述中的任一个的衍生物。
根据某些实施例，与抗MUC16抗体结合的细胞毒性剂是奥瑞他汀，如单甲基奥瑞他汀E(MMAE)或单甲基奥瑞他汀F(MMAF)；妥布赖森，如TUB-OH或TUB-OMOM；富山霉素(tomaymycin)衍生物；海兔毒素衍生物；或类美登素，如DM1或DM4。在一些实施例中，细胞毒性剂是具有式(I)的结构的类美登素，包括式(I)化合物的立体异构体：
其中A是亚芳基或亚杂芳基。
在一些实施例中，A是苯、吡啶、萘或喹啉酮的二价基团，其是任选地经取代的。
在一些实施例中，A是亚芳基。
在一些实施例中，A是：
其中：
R1在每次出现时独立地是烷基、烯基、炔基、芳基、烷芳基、芳烷基、卤基、杂芳基、杂环烷基、羟基、氰基、硝基或叠氮基，
其中RA是烷基或杂烷基；
n是整数0到4；
m是整数0到3；
p是整数0到6；和
q是整数0到5。
在一些实施例中，式I化合物是选自由以下组成的组：
/>
/>
/>
在一个实施例中，式(I)化合物是：
在一些实施例中，式(I)的类美登素通过连接子与抗MUC16抗体或其抗原结合片段结合，如以下式(IA)中所示：
其中：
A是亚芳基或亚杂芳基，如上文关于式(I)所论述；
L是连接子；
BA是抗MUC16抗体或其抗原结合片段；和
k是整数1到30。
在各种实施例中，L是：
其中：
SP是间隔基；
是连接到抗MUC16抗体或其片段的一个或多个键；
AA1是氨基酸；和
AA2是氨基酸。
在一些实施例中，AA1-AA2是：缬氨酸-瓜氨酸、瓜氨酸-缬氨酸、赖氨酸-苯丙氨酸、苯丙氨酸-赖氨酸、缬氨酸-天冬酰胺、天冬酰胺-缬氨酸、苏氨酸-天冬酰胺、天冬酰胺-苏氨酸、丝氨酸-天冬酰胺、天冬酰胺-丝氨酸、苯丙氨酸-天冬酰胺、天冬酰胺-苯丙氨酸、白氨酸-天冬酰胺、天冬酰胺-白氨酸、异白氨酸-天冬酰胺、天冬酰胺-异白氨酸、甘氨酸-天冬酰胺、天冬酰胺-甘氨酸、谷氨酸-天冬酰胺、天冬酰胺-谷氨酸、瓜氨酸-天冬酰胺、天冬酰胺-瓜氨酸、丙氨酸-天冬酰胺或天冬酰胺-丙氨酸。
在一些实施例中，SP是：
其中：
是连接到抗MUC16抗体或其片段的键；和
b是整数2到8。
在其它实施例中，L是：
其中：
是连接到抗MUC16抗体或其片段的键；和
b是整数2到8。
在一个实施例中，结合于抗MUC16抗体或其抗原结合片段的式(IA)化合物(包括连接子)是：
其中是连接到抗MUC16抗体或其片段的键。在一些实例中，这一部分称为“化合物10”。
在一个实施例中，结合于抗MUC16抗体或其抗原结合片段的式(IA)化合物(包括连接子)是：
其中是连接到抗MUC16抗体或其片段的键。在一些实例中，这一部分称为“化合物60”。
在一些实施例中，细胞毒性剂是具有式(II)的结构的类美登素，包括式(II)化合物的立体异构体：
其中：
A3a是氨基酸、具有2-20个氨基酸的肽、烷基、炔基、烯基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环基、-CR5R6-、-O-、-C(＝O)-、
-O-C(＝O)-、-C(＝O)-O-、-O-C(＝O)-O-、-C(＝O)-(CHx)p1-、-C(＝O)-O-(CHx)p1-、
-(CHx)p1-C(＝O)-、-(CHx)p1-C(＝O)-O-、-(O-(CH2)p2-)p3-、-((CH2)p2-O-)p3-、-C(＝S)-、
-C(＝S)-S-、-C(＝S)-NH-、-S-C(＝S)-、-S-C(＝S)-S-、-S-、-SO-、-SO2-、-NR4-、-N(R4)-C(＝O)-N(R8)-、-N(R4)-C(＝O)O-、-N(R4)-C(＝O)-、-C(＝O)-N(R4)-、-C(＝O)-N(R4)-C(＝O)-或-O-C(＝O)-NR4-，其中烷基、炔基、烯基、环烷基、芳基、杂芳基和杂环基任选地经取代；和
p1、p2和p3各自独立地是0，或整数1到100；
x是0、1或2；
R4、R5、R6和R8各自独立地是H，或经取代或未经取代的：烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基或杂环基；和
R4a是经取代或未经取代的：烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基或杂环基。
在一些实施例中，式(II)化合物是选自由以下组成的组：
在一个实施例中，式(II)化合物是：
在一些实施例中，式(II)的类美登素通过连接子与抗MUC16抗体或其抗原结合片段结合，如以下式(IIA)中所示：
其中：
BA是抗MUC16抗体或其抗原结合片段；
a是整数1到30；
Z2由以下结构式表示：-Z2A-Z2B-Z2C-Z2D，其中Z2A、Z2B、Z2C和Z2D各自独立地是不存在、氨基酸、具有2-20个氨基酸的肽、烷基、炔基、烯基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环基、-CR5R6-、-O-、-C(＝O)-、-O-C(＝O)-、-C(＝O)-O-、-O-C(＝O)-O-、-C(＝O)-(CHx)p1、-C(＝O)-O-(CHx)p1、-(CHx)p1-C(＝O)-、-(CHx)p1-C(＝O)-O-、-(O-(CH2)p2-)p3-、-((CH2)p2-O-)p3-、-C(＝S)-、-C(＝S)-S-、-C(＝S)-NH-、-S-C(＝S)-、-S-C(＝S)-S-、-S-、-SO-、-SO2-、-NR4-、-N(R4)-C(＝O)-N(R8)-、-N(R4)-C(＝O)O-、-N(R4)-C(＝O)-、-C(＝O)-N(R4)-、-C(＝O)-N(R4)-C(＝O)-、-O-C(＝O)-N(R4)、-O-C(＝S)-N(R4)-、-C(＝S)-N(R4)-、-N＝C＝S、-N＝C＝O、
A是天然或非天然氨基酸，或包含2-20个氨基酸的肽；
W是-O-、-S-、-CR5R6-或-NR4-；
X是芳基、杂芳基、环烷基或杂环基，其中芳基、杂芳基、环烷基和杂环基任选地经取代；
其中A1、A3和R1各自独立地是氨基酸、具有2-20个氨基酸的肽、烷基、炔基、烯基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环基、-CR5R6-、-O-、-C(＝O)-、-O-C(＝O)-、-C(＝O)-O-、-O-C(＝O)-O-、-C(＝O)-(CHx)p1-、-C(＝O)-O-(CHx)p1-、-(CHx)p1-C(＝O)-、-(CHx)p1-C(＝O)-O-、-(O-(CH2)p2-)p3-、-((CH2)p2-O-)p3-、-C(＝S)-、-C(＝S)-S-、-S-C(＝S)-、-C(＝S)-NH-、-S-C(＝S)-S-、-S-、-SO-、-SO2-、-NR4-、-N(R4)-C(＝O)-N(R8)-、-N(R4)-C(＝O)O-、-N(R4)-C(＝O)-、-C(＝O)-N(R4)-、-C(＝O)-N(R4)-C(＝O)-或-O-C(＝O)-NR4-，其中烷基、炔基、烯基、环烷基、芳基、杂芳基和杂环基任选地经取代；
R17选自由以下组成的组：O、S、NR18和CR5R6；
R18选自由以下组成的组：H、烷基、炔基、烯基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环基和酰基，其中烷基、炔基、烯基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环基和酰基任选地经取代；
R4、R5、R6和R8各自独立地是H，或经取代或未经取代的：烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基或杂环基；
R4a是经取代或未经取代的：烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基或杂环基；
p1、p2和p3各自独立地是0，或整数1到100；和
x是0、1或2。
在式(IIA)的一些实施例中，A是选自由以下组成的组的肽：缬氨酸-瓜氨酸、瓜氨酸-缬氨酸、赖氨酸-苯丙氨酸、苯丙氨酸-赖氨酸、缬氨酸-天冬酰胺、天冬酰胺-缬氨酸、苏氨酸-天冬酰胺、天冬酰胺-苏氨酸、丝氨酸-天冬酰胺、天冬酰胺-丝氨酸、苯丙氨酸-天冬酰胺、天冬酰胺-苯丙氨酸、白氨酸-天冬酰胺、天冬酰胺-白氨酸、异白氨酸-天冬酰胺、天冬酰胺-异白氨酸、甘氨酸-天冬酰胺、天冬酰胺-甘氨酸、谷氨酸-天冬酰胺、天冬酰胺-谷氨酸、瓜氨酸-天冬酰胺、天冬酰胺-瓜氨酸、丙氨酸-天冬酰胺和天冬酰胺-丙氨酸。
在一个实施例中，结合于抗MUC16抗体或其抗原结合片段的式(IIA)化合物是：
其中是连接到抗MUC16抗体或其片段的键。在一些实例中，这一部分称为“化合物7”。
在一些实施例中，与抗MUC16抗体或其片段结合的细胞毒性剂是DM1的纯或基本上纯的非对映异构体：
并且y是整数1到0。
在另一实施例中，ADC包含“A-[L-P]y”结构，其中A是抗MUC16抗体或其抗原结合片段，并且[L-P]是：
其混合物，和
其中y是整数1到30，和
是连接到抗MUC16抗体或其片段的键。
其它类美登素衍生物论述于WO 2014/145090、WO 2016/160615和WO 2015/031396中，其各自以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，与抗MUC16抗体或其片段结合的细胞毒性剂是MMAE或MMAF。
本发明的范围内涵盖所属领域中已知的其它细胞毒性剂，包括例如蛋白质毒素，如蓖麻毒素(ricin)、艰难梭菌(C.difficile)毒素、假单胞菌外毒素、白喉毒素(diphtheria toxin)、肉毒杆菌毒素(botulinum toxin)、榄香胶素(bryodin)、皂草素(saporin)、商陆毒素(pokeweed toxins)(即，植物毒素(phytolaccatoxin)和植物素霉素(phytolaccigenin))，和其它细胞毒性剂，如Sapra等人,《药理学和治疗剂(Pharmacol.&Therapeutics)》,2013,138:452-469中所阐述的细胞毒性剂。
细胞毒性剂(“有效负荷”)可以通过化学连接子连接到本发明的抗MUC16抗原结合分子或抗体，所述化学连接子使有效负荷化合物共价结合于蛋白质分子(即，抗体)。特定连接子的例示性实施例论述于上文中。更一般地并且如本文所使用，术语“连接子”是指任何使结合剂(例如抗体或其抗原结合片段)与本文中所阐述的有效负荷化合物链接、连接或键结的二价基团或部分。通常，适用于本文中所描述的抗体结合物的结合剂连接子是满足以下条件的连接子：其在抗体的循环半衰期内足够稳定并且同时，能够在结合物的抗原介导的内化之后释放其有效负荷。连接子可以是可裂解或不可裂解的。可裂解连接子是在内化之后由细胞内代谢裂解的连接子，例如通过水解、还原或酶促反应裂解。不可裂解连接子是在内化之后通过抗体的溶酶体降解来释放所连接的有效负荷的连接子。适合的连接子包括(但不限于)酸不稳定连接子、水解不稳定连接子、酶可裂解连接子、还原不稳定连接子、自我分解型连接子和不可裂解连接子。适合的连接子还包括(但不限于)作为或包含肽、葡萄糖苷酸、丁二酰亚胺-硫醚、聚乙二醇(PEG)单元、腙、马来酰亚胺基单元、二肽单元、缬氨酸-瓜氨酸单元和对氨基苯甲基(PAB)单元的连接子。在一些情况下，连接子能够通过赖氨酸残基或半胱氨酸残基(例如通过抗体或片段的二硫基的裂解，或通过工程改造到抗体或片段中的半胱氨酸残基)键结到抗体或抗原结合片段。在一些情况下，连接子能够通过谷氨酰胺残基(包括通过谷氨酰胺转氨酶介导的结合衍生的残基)键结到抗体或片段。
可以在本发明的情形下使用的例示性连接子包括例如包含以下或由其组成的连接子：MC(6-顺丁烯二酰亚胺基己酰基)、MCC(环己烷-1-甲酸顺丁烯二酰亚胺基甲酯)、MP(顺丁烯二酰亚胺基丙酰基)、val-cit(缬氨酸-瓜氨酸)、val-ala(缬氨酸-丙氨酸)、ala-phe(丙氨酸-苯丙氨酸)、phe-lys(苯丙氨酸-赖氨酸)、蛋白酶可裂解连接子中的二肽位点、PAB(对氨基苯甲氧基羰基)、SPP(4-(2-吡啶基硫基)戊酸N-丁二酰亚胺酯)、SMCC(4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1甲酸N-丁二酰亚胺酯)、SIAB((4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸N-丁二酰亚胺酯)以及其变异体和组合。可以在本发明的情形下使用的连接子的其它实例公开于例如美国专利案第7,754,681号和Ducry,《化学生物结合物(Bioconjugate Chem.)》2010,21:5-13和其中引用的参考文献中，其内容以全文引用的方式并入本文中。在一些情况下，连接子是或含有自我分解型间隔基，如Jin等人,《生物有机和药物化学(Bioorganic&Medicinal Chemistry)》2012,20:3465-3469和Wu等人,《生物有机和药物化学(Bioorganic&Medicinal Chemistry)》2016,24:2697-2706中论述的连接子。
有效负荷可以通过抗体或抗原结合分子内具体氨基酸处的连接来连接到抗MUC16抗体或抗原结合片段。可以用于本发明的这一方面的情形中的例示性氨基酸连接包括例如赖氨酸(参见例如美国专利案第5,208,020号；US 2010/0129314；Hollander等人,《化学生物结合物》,2008,19:358-361；WO 2005/089808；美国专利案第5,714,586号；US 2013/0101546；和US 2012/0585592)、半胱氨酸(参见例如US 2007/0258987；WO 2013/055993；WO2013/055990；WO 2013/053873；WO 2013/053872；WO 2011/130598；US 2013/0101546；和美国专利案第7,750,116号)、硒半胱氨酸(参见例如WO 2008/122039；和Hofer等人,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA)》,2008,105:12451-12456)、甲酰基甘氨酸(参见例如Carrico等人,《自然化学生物学(Nat.Chem.Biol.)》,2007,3:321-322；Agarwal等人,《美国国家科学院院刊》,2013,110:46-51，和Rabuka等人,《自然科学报告(Nat.Protocols)》,2012,10:1052-1067)、非天然氨基酸(参见例如WO 2013/068874和WO2012/166559)，以及酸性氨基酸(参见例如WO 2012/05982)。连接子也可以通过连接到碳水化合物(参见例如US 2008/0305497和Ryan等人,《食品和农业免疫学(Food&AgricultureImmunol.)》,2001,13:127-130)和二硫键连接子(参见例如WO 2013/085925、WO 2010/010324、WO 2011/018611和Shaunak等人,《自然化学生物学》,2006,2:312-313)结合于抗原结合蛋白质。
药物:抗体比(DAR)是与抗体或抗原结合片段结合的药物的平均数目，其在ADC的功效、效能和药物动力学方面具有重要作用。在各种实施例中DAR是每个抗体1、2、3、4、5、6、7、或8个药物分子。在一些实施例中，DAR是1到4。在某些实施例中，DAR是2到4。在一些情况下，DAR是2到3。在某些情况下，DAR是3到4。在一些实施例中，DAR是1到10、1到20或1到30(即，每个抗体或其抗原结合片段1到30个药物分子)。
治疗性配制物和给药
本发明提供医药组合物，其包含本发明的抗原结合分子。本发明的医药组合物是由适合的载体、赋形剂和提供改善的转移、递送、耐受性等的其它药剂配制。许多适合的配制物可以发现于所有医药化学家已知的处方集：Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,Pa中。这些配制物包括例如粉末、浆料、软膏、冻胶、蜡、油、脂质、含有脂质(阳离子型或阴离子型)的微脂粒(如LIPOFECTINTTM,LifeTechnologies,Carlsbad,CA)、DNA结合物、无水吸收浆料、水包油及油包水乳液、乳液聚乙二醇(各种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和含有聚乙二醇的半固体混合物。另参见Powell等人《用于非经肠配制物的赋形剂的概要(Compendium of excipients forparenteral formulations)》PDA(1998)《医药科学技术杂志(J Pharm Sci Technol)》52:238-311。
向患者给予的抗原结合分子的剂量可以视患者的年龄和体征、目标疾病、病状、给药途径等而变化。优选剂量通常根据体重或体表面积计算。当本发明的双特异性抗原结合分子用于成年患者中的治疗目的时，宜静脉内给予本发明的双特异性抗原结合分子，通常以每千克体重约0.01到约20mg，更优选每千克体重约0.02到约7、约0.03到约5或约0.05到约3mg的单次剂量。视病状的严重程度而定，可以调节治疗的频率和持续时间。用于给予双特异性抗原结合分子的有效剂量和时程可以凭经验确定；举例来说，患者进展可以通过周期性评估来监测，且相应地调节剂量。此外，可以使用所属领域中众所周知的方法进行剂量的物种间缩放(例如Mordenti等人,1991,《药剂学研究(Pharmaceut.Res.)》8:1351)。
已知各种递送系统并且可以用于给予本发明的医药组合物，例如脂质体中的囊封、微粒、微胶囊、能够表达突变型病毒的重组型细胞、受体介导的内饮作用(参见例如Wu等人,1987,《生物化学杂志》262:4429-4432)。引入方法包括(但不限于)皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和经口途径。组合物可以通过任何便利的途径给予，例如通过输注或快速注射、通过经由上皮或粘膜皮肤内层(例如口腔粘膜、直肠粘膜和肠粘膜等)吸收并且可以与其它生物学活性剂一起给予。可以全身或局部给药。
本发明的医药组合物可以用标准针头和注射器皮下或静脉内递送。此外，关于皮下递送，笔式递送装置易于在递送本发明的医药组合物时应用。这类笔式递送装置可以是可再用的或抛弃式的。可再用的笔式递送装置通常利用含有医药组合物的可替换套筒。在已给予套筒内的所有医药组合物并且套筒是空的后，可以容易地丢弃空套筒且用含有医药组合物的新套筒替换。随后可再使用笔式递送装置。在抛弃式笔式递送装置中，不存在可替换套筒。实际上，抛弃式笔式递送装置预填充有保存于装置内的储集器中的医药组合物。一旦清空储集器的医药组合物，即丢弃整个装置。
许多可再用笔式和自助注射器递送装置应用于本发明的医药组合物的皮下递送。仅举几例，实例包括(但不限于)AUTOPENTM(Owen Mumford,Inc.,Woodstock,UK)、DISETRONICTM笔(Disetronic Medical Systems,Bergdorf,Switzerland)、HUMALOG MIX75/25TM笔、HUMALOGTM笔、HUMALIN 70/30TM笔(Eli Lilly and Co.,Indianapolis,IN)、NOVOPENTM I、II和III(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、NOVOPEN JUNIORTM(NovoNordisk,Copenhagen,Denmark)、BDTM笔(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)、OPTIPENTM、OPTIPEN PROTM、OPTIPEN STARLETTM和OPTICLIKTM(sanofi-aventis,Frankfurt,Germany)。仅举几例，应用于皮下递送本发明的医药组合物的抛弃式笔式递送装置的实例包括(但不限于)SOLOSTARTM笔(sanofi-aventis)、FLEXPENTM(Novo Nordisk)和KWIKPENTM(Eli Lilly)、SURECLICKTM自动注射器(Amgen,Thousand Oaks,CA)、PENLETTM(Haselmeier,Stuttgart,Germany)、EPIPEN(Dey,L.P.)和HUMIRATM笔(Abbott Labs,Abbott Park IL)。
在某些情形中，医药组合物可以在控制释放系统中递送。在一个实施例中，可以使用泵(参见Langer,见上文；Sefton,1987,《生物医学工程中的CRC评论(CRCCrit.Ref.Biomed.Eng.)》14:201)。在另一实施例中，可以使用聚合材料；参见《控制释放的医学应用(Medical Applications of Controlled Release)》,Langer及Wise(编),1974,CRC Pres.,Boca Raton,Florida。在另一实施例中，可以将控制释放系统接近组合物之目标置放，因此仅需要全身剂量的一部分(参见例如Goodson,1984,《控制释放的医学应用》,见上文,第2卷,第115-138页)。其他控制释放系统论述于Langer,1990,《科学》249:1527-1533之综述中。
可注射制剂可以包括用于静脉内、皮下、皮内和肌肉内注射、滴液输液等的剂型。这些可注射制剂可以由公开已知的方法制备。举例来说，可注射制剂可以例如通过使上文所描述的抗体或其盐溶解、悬浮或乳化于常规用于注射的无菌水性介质或油性介质中来制备。作为用于注射的水性介质，例如生理盐水、含有葡萄糖和其它辅助剂的等渗溶液等，其可以与适合的增溶剂(如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非离子型表面活性剂[例如聚山梨醇酯80、HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加合物)]等)组合使用。作为油性介质，可以使用例如芝麻油、大豆油等，其可以与增溶剂(如苯甲酸苯甲酯、苯甲醇等)组合使用。由此制备的注射物优选填充于适合的安瓿中。
上文所描述的用于经口或非经肠使用的医药组合物宜制备成适于拟合活性成分剂量的单位剂量的剂型。这类呈单位剂量形式的剂型包括例如片剂、丸剂、胶囊、注射剂(安瓿)、栓剂等。所含有的前述抗体的量通常是每单位剂量的剂型约5到约500mg；尤其在注射液形式中，前述抗体优选含在约5到约100mg和约10到约250mg另一剂型中。
抗原结合分子的治疗性用途
本发明包括一种方法，其包含向有需要的个体给予治疗性组合物，所述治疗性组合物包含抗MUC16抗体或其抗原结合片段或特异性结合CD3和MUC16的双特异性抗原结合分子。治疗性组合物可以包含如本文中所公开的抗体或双特异性抗原结合分子中的任一个和医药学上可接受的载体或稀释剂。如本文中所使用，表述“有需要的个体”意指呈现癌症的一种或多种症状或病征(例如表达肿瘤或患有下文中提及的癌症中的任一种的个体)或将以其它方式受益于MUC16活性的抑制或降低或MUC16+细胞(例如卵巢癌细胞)的消耗的人类或非人类动物。
本发明的抗体和双特异性抗原结合分子(和包含其的治疗性组合物)尤其适用于治疗其中免疫反应的刺激、活化和/或靶向将有利的任何疾病或病症。具体地说，本发明的抗MUC16抗体或抗CD3/抗MUC16双特异性抗原结合分子可以用于治疗、预防和/或改善任何与MUC16表达或活性或MUC16+细胞增殖相关或由其介导的疾病或病症。本发明的治疗方法实现的作用机制包括在效应细胞存在下杀伤表达MUC16的细胞，例如通过CDC、细胞凋亡、ADCC、噬菌作用或通过这些机制中的两种或更多种的组合。可以使用本发明的双特异性抗原结合分子抑制或杀伤的表达MUC16的细胞包括例如卵巢癌细胞。
本发明的抗原结合分子可以用于治疗与MUC16表达相关的疾病或病症，包括例如癌症，包括卵巢癌、乳癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、肝内胆管癌-肿块形成型、子宫颈腺癌和胃肠道腺癌。根据本发明的某些实施例，抗MUC16抗体或抗MUC16/抗CD3双特异性抗体适用于治疗罹患卵巢癌的患者。根据本发明的其它相关实施例，提供一种方法，其包含向罹患卵巢癌的患者给予如本文中所公开的抗MUC16抗体或抗CD3/抗MUC16双特异性抗原结合分子。所属领域中已知的分析/诊断方法(如肿瘤扫描等)可以用于确定患者是否具有卵巢肿瘤。
本发明还包括用于治疗个体中的残余癌症的方法。如本文中所使用，术语“残余癌症”意指在用抗癌疗法治疗后，个体中存在或存留一种或多种癌细胞。
根据某些方面，本发明提供用于治疗与MUC16表达相关的疾病或病症(例如卵巢癌)的方法，其包含在测定个体患有前列腺癌之后，向个体给予本文中其它地方描述的抗MUC16或双特异性抗原结合分子中的一种或多种。举例来说，本发明包括用于治疗卵巢癌的方法，其包含在个体已接受激素疗法(例如抗雄激素疗法)之后1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周或4周、2个月、4个月、6个月、8个月、1年或更长时间向患者给予抗MUC16抗体或抗CD3/抗MUC16双特异性抗原结合分子。
组合疗法和配制物
本发明提供一种方法，其包含给予医药组合物，所述医药组合物包含本文中所描述的例示性抗体和双特异性抗原结合分子中的任一种与一种或多种其它治疗剂的组合。可与本发明的抗原结合分子组合或组合给予的例示性其它治疗剂包括例如EGFR拮抗剂(例如抗EGFR抗体[例如西妥昔单抗(cetuximab)或帕尼单抗(panitumumab)]或EGFR小分子抑制剂[例如吉非替尼(gefitinib)或埃罗替尼(erlotinib)])、另一种EGFR家族成员(如Her2/ErbB2、ErbB3或ErbB4)拮抗剂(例如抗ErbB2、抗ErbB3或抗ErbB4抗体或ErbB2、ErbB3或ErbB4活性小分子抑制剂)、EGFRvIII拮抗剂(例如特异性结合EGFRvIII的抗体)、cMET拮抗剂(例如抗cMET抗体)、IGF1R拮抗剂(例如抗IGF1R抗体)、B-raf抑制剂(例如维罗非尼(vemurafenib)、索拉非尼(sorafenib)、GDC-0879、PLX-4720)、PDGFR-α抑制剂(例如抗PDGFR-α抗体)、PDGFR-β抑制剂(例如抗PDGFR-β抗体)、VEGF拮抗剂(例如VEGF-Trap，参见例如US 7,087,411(在本文中也称为“VEGF抑制融合蛋白质”)、抗VEGF抗体(例如贝伐珠单抗(bevacizumab))、VEGF受体小分子激酶抑制剂(例如舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)或帕唑帕尼(pazopanib))、DLL4拮抗剂(例如US 2009/0142354中公开的抗DLL4抗体，如REGN421)、Ang2拮抗剂(例如US 2011/0027286中公开的抗Ang2抗体，如H1H685P)、FOLH1(PSMA)拮抗剂、PRLR拮抗剂(例如抗PRLR抗体)、STEAP1或STEAP2拮抗剂(例如抗STEAP1抗体或抗STEAP2抗体)、TMPRSS2拮抗剂(例如抗TMPRSS2抗体)、MSLN拮抗剂(例如抗MSLN抗体)、CA9拮抗剂(例如抗CA9抗体)、尿溶蛋白拮抗剂(例如抗尿溶蛋白抗体)等。可有利地与本发明的抗原结合分子组合给予的其它药剂包括细胞介素抑制剂，包括小分子细胞介素抑制剂和结合于细胞介素(如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18)或其各别受体的抗体。本发明的医药组合物(例如包含如本文中所公开的抗CD3/抗MUC16双特异性抗原结合分子的医药组合物)也可以作为治疗方案的一部分给予，所述治疗方案包含一种或多种选自以下的治疗组合：“ICE”：异环磷酰胺(例如)、卡铂(carboplatin)(例如/>)、依托泊苷(etoposide)(例如 VP-16)；“DHAP”：地塞米松(dexamethasone)(例如/>)、阿糖胞苷(cytarabine)(例如Cytosar-/>胞嘧啶阿拉伯糖苷、ara-C)、顺铂(例如/>-AQ)；和“ESHAP”：依托泊苷(例如/> VP-16)、甲基泼尼龙(methylprednisolone)(例如/>)、高剂量阿糖胞苷、顺铂(例如/>-AQ)。
本发明还包括治疗组合，其包含本文中提及的抗原结合分子中的任一种和以下中的一个或多个的抑制剂：VEGF、Ang2、DLL4、EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4、EGFRvIII、cMet、IGF1R、B-raf、PDGFR-α、PDGFR-β、FOLH1(PSMA)、PRLR、STEAP1、STEAP2、TMPRSS2、MSLN、CA9、尿溶蛋白或前述细胞介素中的任一种，其中抑制剂是适体、反义分子、核糖核酸酶、siRNA、肽体、纳米抗体或抗体片段(例如Fab片段；F(ab')2片段；Fd片段；Fv片段；scFv；dAb片段；或其它经工程改造的分子，如双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、微型抗体和最小识别单位)。本发明的抗原结合分子还可以与抗病毒剂、抗生素、镇痛剂、皮质类固醇和/或NSAID组合给予和/或共同配制。本发明的抗原结合分子也可以作为治疗方案的一部分给予，所述治疗方案还包括辐射治疗和/或常规化学疗法。
所述其它治疗活性组分可以在即将给予本发明的抗原结合分子之前、与本发明的抗原结合分子的给药同时或在给予本发明的抗原结合分子之后不久给予(在本发明中，这类给药方案视为给予“抗原结合分子与其它治疗活性组分的组合”)。
本发明包括医药组合物，其中本发明的抗原结合分子与如本文中其它地方所描述的其它治疗活性组分中的一种或多种共同配制。
给药方案
根据本发明的某些实施例，可以在既定时程内向个体给予多个剂量的抗原结合分子(例如抗MUC16抗体或特异性结合MUC16和CD3的双特异性抗原结合分子)。根据本发明的这一方面的方法包含向个体依序给予多个剂量的本发明的抗原结合分子。如本文中所使用，“依序给予”意指在不同时间点向个体给予各剂量的抗原结合分子，例如在由预定间隔(例如小时、天、周或月)隔开的不同天。本发明包括一种方法，其包含向患者依序给予单一初始剂量的抗原结合分子，接着给予一个或多个第二剂量的抗原结合分子和(任选地)接着给予一个或多个第三剂量的抗原结合分子。
术语「初始剂量」、「第二剂量」和「第三剂量」是指本发明的抗原结合分子的给药的时间顺序。因此，“初始剂量”是在治疗方案开始时给予的剂量(也称为“基线剂量”)；“第二剂量”是在初始剂量之后给予的剂量；并且“第三剂量”是在第二剂量之后给予的剂量。初始、第二和第三剂量都可以含有相同量的抗原结合分子，但通常可以在给药频率方面彼此不同。然而，在某些实施例中，初始、第二和/或第三剂量中所含的抗原结合分子之量在治疗过程期间彼此不同(例如视需要上调或下调)。在某些实施例中，在治疗方案开始时给予两个或更多个(例如2、3、4或5个)剂量作为“起始剂量”，接着以较低频繁给予后续剂量(例如“维持剂量”)。
在本发明的一个例示性实施例中，在前一剂量之后1到26(例如1、11/2、2、21/2、3、31/2、4、41/2、5、51/2、6、61/2、7、71/2、8、81/2、9、91/2、10、101/2、11、111/2、12、121/2、13、131/2、14、141/2、15、151/2、16、161/2、17、171/2、18、181/2、19、191/2、20、201/2、21、211/2、22、221/2、23、231/2、24、241/2、25、251/2、26、261/2或更多)周给予各第二和/或第三剂量。如本文中所使用，短语「前一剂量」意指在多次给药的顺序中，在给予所述顺序中的下一个剂量之前向患者给予的抗原结合分子的剂量，其中不存在中间剂量。
根据本发明的这一方面的方法可以包含向患者给予任何数目的第二和/或第三剂量的抗原结合分子(例如抗MUC16抗体或特异性结合MUC16和CD3的双特异性抗原结合分子)。举例来说，在某些实施例中，仅向患者给予单一第二剂量。在其它实施例中，向患者给予两个或更多个(例如2、3、4、5、6、7、8个或更多个)第二剂量。类似地，在某些实施例中，仅向患者给于单一第三剂量。在其它实施例中，向患者给予两个或更多个(例如2、3、4、5、6、7、8个或更多个)第三剂量。
在涉及多个第二剂量的实施例中，各第二剂量可以与其它第二剂量相同的频率给予。举例来说，可以在前一剂量之后1到2周向患者给于各第二剂量。类似地，在涉及多个第三剂量的实施例中，各第三剂量可以与其它第三剂量相同的频率给予。举例来说，可以在前一剂量之后2到4周向患者给于各第三剂量。或者，向患者给予第二和/或第三剂量的频率可以在治疗方案期间变化。也可以在治疗过程期间在临床检查之后由医师根据个别患者的需要来调节给药频率。
抗体的诊断用途
本发明的抗MUC16抗体也可以用于检测和/或测量样品(例如用于诊断目的的生物样品)中的MUC16或表达MUC16的细胞。举例来说，抗MUC16抗体或其片段可以用于诊断由MUC16的异常表达(例如过度表达、低表达、表达不足等)表征的病状或疾病。用于MUC16的例示性诊断分析法可以包含例如使从患者获得的样品与本发明的抗MUC16抗体接触，其中抗MUC16抗体用可检测标记或报导分子标记。或者，未标记的抗MUC16抗体可以与自身以可检测的方式标记的二级抗体组合用于诊断应用中。可检测标记或报导分子可以是放射性同位素，如3H、14C、32P、35S或125I；荧光或化学发光部分，如异硫氰酸萤光素或若丹明(rhodamine)；或酶，如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化酶或荧光素酶。本发明的抗MUC16抗体的另一种例示性诊断用途包括用于个体中肿瘤细胞的非侵袭性鉴别和追踪目的的89Zr标记(如89Zr-去铁胺标记)的抗体(例如正电子发射断层摄影术(PET)成像)(参见例如Tavare,R.等人《癌症研究(Cancer Res.)》2016年1月1日；76(1):73-82；和Azad,BB.等人Oncotarget.2016年5月15日；7(11):12344-58)。可以用于检测或测量样品中的MUC16的特定例示性分析法包括酶联结免疫吸附分析法(ELISA)、放射免疫分析法(RIA)和荧光活化细胞分选(FACS)。
可以用于本发明的MUC16诊断分析法中的样品包括可以在正常或病理学条件下从患者获得的含有可检测量的MUC16蛋白质或其片段的任何组织或体液样品。通常，将测量从健康患者(例如未患有与MUC16含量或活性异常相关的疾病或病状的患者)获得的具体样品中MUC16的含量以最初建立MUC16的基线或标准含量。接着，可以比较这一MUC16基线含量与从怀疑患有MUC16相关疾病(例如含有表达MUC16的细胞的肿瘤)或病状的个体获得的样品中测量的MUC16含量。
组织或体液样品的实例包括(但不限于)血浆、血清、腹水、卵巢、子宫、子宫颈、肝、膀胱、胰腺、胃、小肠或大肠、胆囊、乳房、肺、肾脏、唾液和泪腺或其任何上皮状恶性疾病。组织或体液样品的其它实例包括(但不限于)子宫颈浆液性乳头状癌瘤、子宫内膜腺癌、膀胱透明细胞腺癌、精囊癌、胃癌、结直肠腺癌和上皮状间皮瘤。设想可以对任何含有可检测量的MUC16蛋白质或其片段的体液或组织样品进行本文中所描述的检测方法。所描述的方法可以用于监测恶性疾病的发展和进程，或区分正常和疾病条件。因此，所描述的方法可以用于检测或监测癌症，如卵巢癌、膀胱癌、乳癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、肝内胆管癌-肿块形成型、子宫颈腺癌和胃肠道腺癌。
实例
提出以下实例以便为所属领域的一般技术人员提供如何制得和使用本发明的方法和组合物的完整公开内容和描述，并且不意图限制本发明人视作其发明的范围。已努力确保关于所用数量(例如量、温度等)的精确度，但应考虑存在一些实验性误差和偏差。除非另外指明，否则份数是重量份，分子量是平均分子量，温度是以摄氏度计，并且压力是大气压或接近大气压。
实例1：产生抗MUC16抗体
通过以下方式获得抗MUC16抗体：用人类MUC16抗原使经基因修饰的小鼠免疫或通过用人类MUC16抗原使包含编码人类免疫球蛋白重链和κ轻链可变区的DNA的经工程改造的小鼠免疫。
经基因修饰的小鼠用hMUC16.nub(涵盖Mucin-16(SEQ ID:1902)的最后五个SEA域的截短格式)免疫或用表达hMUC16的细胞系(如OVCAR-3细胞)免疫。SEQ ID NO:1902含有SEQ ID NO:1899的残基13810-14451，以及C端标签。在免疫接种之后，从各小鼠收集脾细胞，并且(1)与小鼠骨髓瘤细胞融合以保持其活力并形成融合瘤细胞，并且针对MUC16特异性进行筛选，或(2)B细胞分选(如US 2007/0280945A1中所描述)，使用人类MUC16片段作为结合和鉴别反应性抗体(抗原阳性B细胞)的分选剂。
初始分离针对MUC16的具有人类可变区和小鼠恒定区的嵌合抗体。针对所需特征(包括亲和力、选择性等)表征和选择抗体。如果需要，用所需人类恒定区(例如野生型或经修饰的IgG1或IgG4恒定区)置换小鼠恒定区，以产生完全人类抗MUC16抗体。虽然所选恒定区可以根据特定用途而改变，但高亲和力抗原结合和目标特异性特征存在于可变区中。抗体名称标示，如H1H8755P和H1M7129N，表示完全人类抗体“H1H”或嵌合人类可变区/小鼠恒定区抗体“H1M”。通过融合瘤方法鉴别的抗体由以“N”或“N2”结尾的抗体ID编号表示。通过B细胞分选方法鉴别的抗体由以“P”或“P2”结尾的抗体ID编号表示。
根据这一实例的方法产生的例示性抗MUC16抗体的某些生物特性详细描述于下文阐述的实例中。
抗MUC16抗体的重链和轻链可变区氨基酸和核酸序列
表1阐述所选择的本发明的抗MUC16抗体的重链和轻链可变区以及CDR的氨基酸序列标识符。相应核酸序列标识符阐述于表2中。
表1：氨基酸序列标识符
表2：核酸序列标识符
实例2：特异性结合于在OVCAR-3细胞系上内源性表达的hMUC16的抗MUC16抗体
通过基于电化学发光的检测分析法(Meso Scale Discovery(MSD),Rockville,MD)评估抗MUC16抗体特异性结合于在人类卵巢癌细胞系(OVCAR-3)上内源性表达的MUC16的能力。
简单来说，在补充有Ca2+/Mg2+的1xPBS(Irvine Scientific,Santa Ana,CA)中冲洗OVCAR-3和对照性卵巢腺癌细胞系SK-OV-3(其不具有可检测的hMUC16表达)，接着在不含酶的细胞解离缓冲液(Millipore,Billerica,MA)中，在37℃下培育10分钟。接着，在补充有Ca2+/Mg2+的1xPBS中洗涤经剥离的细胞一次并且计数(Cellometer Auto T4细胞计数器，Nexcelom Bioscience,Lawrence,MA)。将约1.0×104个细胞涂布于MULTI-ARRAY 96孔碳电极盘(MSD)中并且在37℃下培育1小时。接着，在室温下用含2％BSA(w/v)的PBS经1小时阻断非特异性结合位点。接着，将抗MUC16或对照抗体的连续稀释物(0.85pM-50nM)和不含抗体的缓冲液对照物添加到盘结合的细胞中并且在室温(RT)下培育1小时。接着，使用AquaMax2000盘洗涤器(MDS Analytical Technologies,Sunnyvale,CA)洗涤盘以去除未结合的抗体。在室温下，用SULFO-TAGTM结合的抗人类κ轻链抗体(Regeneron)或SULFO-TAGTM结合的抗小鼠IgG抗体(Jackson Immunoresearch,West Grove,PA)经1小时检测盘结合的抗体。在洗涤之后，盘用读取缓冲液(MSD)根据制造商方案显影并且用SECTOR Imager 6000(MSD)仪器记录发光信号。
记录两个细胞系的发光强度(以相对光单位(RLU)测量)以指示各抗体的结合强度。报导用结合于OVCAR-3的1.9nM或16.7nM抗MUC16抗体检测的信号与用结合于SK-OV-3的所述抗体检测的信号的比率作为特异性和结合效能的指示(表3)。
表3：针对内源性表达hMUC16OVCAR-3与针对hMUC16阴性SK-OV-3细胞系的抗Muc16抗体的细胞结合比
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NS＝在1.9nM或16.7nM下的非特异性比率<2.5倍
同型：H1H：hIgG1；H1M：mIgG1；H2M：mIgG2；H3M：mIgG3
注释：由小鼠Fc与人类Fc表达的相同抗体之间的结合强度比的变化是由使用不同的SULFO-TAG二级检测剂引起。
如表3中的结果证实，大部分本发明的抗MUC16抗体在高(16.7nM)和低(1.9nM)抗体浓度下都特异性结合于OVCAR-3。mIgG1、mIgG2a和hIgG1同型对照抗体未展示与OVCAR-3或SK-OV-3细胞系的特异性结合。此外，存在所述方法具有敏感性的证据，因为在表面等离子共振结合分析法(参见下文中的实例4)中未呈现与可溶性单体人类MUC16蛋白质结合的若干抗体在这一基于细胞的结合分析法中显示与表达于OVCAR-3细胞上的内源性人类MUC16的特异性结合。
实例3：产生结合卵巢细胞特异性(MUC16)和CD3的双特异性抗体
本发明提供结合CD3和MUC16的双特异性抗原结合分子；这类双特异性抗原结合分子在本文中也称为“抗MUC16/抗CD3或抗MUC16xCD3双特异性分子”。抗MUC16/抗CD3双特异性分子的抗MUC16部分适用于靶向表达MUC16(也称为CA-125)的肿瘤细胞，并且双特异性分子的抗CD3部分适用于活化T细胞。肿瘤细胞上的MUC16和T细胞上的CD3的同时结合有助于通过经活化的T细胞定向杀伤(细胞溶解)目标肿瘤细胞。
使用标准方法构筑包含抗MUC16特异性结合域和抗CD3特异性结合域的双特异性抗体，其中抗MUC16抗原结合域和抗CD3抗原结合域各自包含与共同LCVR配对的不同、相异的HCVR。在例示性双特异性抗体中，利用来自抗CD3抗体的重链、来自抗MUC16抗体的重链和来自抗MUC16抗体的共同轻链构筑分子。在其它实例中，可以利用以下构筑双特异性抗体：来自抗CD3抗体的重链、来自抗MUC16抗体的重链和来自抗CD3抗体的轻链，或已知与多种重链臂有效混杂或配对的抗体轻链。
以下实例中描述的双特异性抗体由以下组成：对人类可溶性杂二聚hCD3ε/δ蛋白质具有不同结合亲和力的抗CD3结合臂(如本文中的实例15中所描述)；和人类MUC16(参见以上实例1-2)。制造具有IgG1Fc域(BSMUC16/CD3-001、-002、-003和-004)或经修饰的(嵌合)IgG4Fc域(BSMUC16/CD3-005)的例示性双特异性抗体，如2014年8月28日公开的美国专利申请公开案第US20140243504A1号中所阐述。
所构筑的各种抗MUC16xCD3双特异性抗体的抗原结合域的组分部分的概述阐述于表4中。
表4：所选择的抗MUC16xCD3双特异性抗体的组分部分的概述
表4中列举的轻链是双特异性抗体的CD3和MUC16靶向臂共有的。表1和2分别阐述本实例的双特异性抗体的抗MUC16臂的各种重链可变区和其相应CDR的氨基酸和核酸序列标识符。表22和23分别阐述本实例的双特异性抗体的抗CD3臂的各种重链可变区和其相应CDR的氨基酸和核酸序列标识符。
实例4：人类单克隆抗MUC16单特异性和抗MUC16xCD3双特异性抗体的表面等离子共振衍生的结合亲和力和动力学常数
通过实时表面等离子共振(SPR；Biacore 4000或Biacore T-200，GE HealthcareLife Sciences,Pittsburgh,PA)在25℃下测定人类抗MUC16抗体的结合亲和力和动力学常数。在本实例中测试的抗MUC16抗体是针对MUC16的二价单特异性结合物(由hIgG1(H1H)、mIgG1(H1M)、mIgG2(H2M)或mIgG3(H3M)恒定区表达)或包含抗MUC16结合域和抗CD3结合域的双特异性抗体。将抗体捕捉到通过与单克隆抗人类Fc抗体(GE，#BR-1008-39)或单克隆山羊抗小鼠Fc抗体(Ge，#BR-1008-38)的胺偶合衍生的CM4或CM5 Biacore感测器表面(GeHealthcare Life Sciences)上。在50微升/分钟(Biacore T-200)或30微升/分钟(Biacore4000)的流动速率下，将各种浓度的涵盖Mucin-16(hMUC16.mmh，或MUC16“nub”，SEQ ID:1902)的最后五个SEA域的呈截短格式的可溶性单体人类MUC16注射到抗MUC16抗体捕捉表面上。监测抗体-试剂关联性4分钟并且监测解离6-10分钟。在HBS-ET缓冲液(0.01M HEPESpH 7.4、0.15M NaCl、0.05％v/v Surfactant P20)中进行所有结合研究。
通过使用Scrubber 2.0c曲线拟合软件拟合实时感测器图谱与1:1结合模型来测定动力学关联(ka)及解离(kd)速率常数。结合解离平衡常数(KD)和解离半衰期(t1/2)由动力学速率常数计算如下：
并且/>
单特异性抗MUC16抗体对单体人类MUC16蛋白质片段的结合动力学参数展示于以下表5A和5B中。抗MUC16/抗CD3双特异性抗体对单体人类MUC16蛋白质的结合动力学参数展示于以下表6中。
表5A：在25℃下，融合瘤抗MUC16抗体(H1M、H2M和H3M)对hMUC16片段的Biacore结合亲和力
抗体ID ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M) t1/2(min)
H2M7128N 1.89E+05 6.40E-04 3.39E-09 18
H1M7129N 5.31E+04 1.04E-04 1.97E-09 111
H2M7131N 6.47E+04 1.62E-04 2.51E-09 71
H3M7132N 2.57E+04 1.96E-04 7.62E-09 59
H2M7133N 1.67E+05 3.77E-04 2.26E-09 31
H2M7134N 6.55E+04 1.62E-04 2.47E-09 71
H2M7135N 5.10E+04 2.18E-04 4.27E-09 53
H1M7137N 5.30E+04 9.09E-05 1.72E-09 127
H2M7138N 7.41E+04 9.25E-05 1.25E-09 125
H1M9519N NB NB NB NB
H1M9521N NB NB NB NB
H3M9524N NB NB NB NB
H3M9525N NB NB NB NB
H1M9528N NB NB NB NB
H3M9529N NB NB NB NB
NB：无结合
表5B：在25℃下，人类Fc抗MUC16抗体(H1H)对hMUC16片段的Biacore结合亲和力
抗体ID ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M) t1/2(min)
H1H8755P 5.22E+05 1.49E-04 2.86E-10 77
H1H8767P 1.17E+05 4.18E-04 3.58E-09 28
H1H8770P 2.47E+05 3.08E-04 1.25E-09 38
H1H8783P 1.74E+05 1.07E-04 6.14E-10 108
H1H8790P 1.01E+05 7.61E-04 7.53E-09 15
H1H8794P 3.62E+05 2.79E-04 7.71E-10 41
H1H8799P 7.90E+04 3.66E-04 4.63E-09 32
H1H8799P2 7.58E+04 3.73E-04 4.92E-09 31
H1H8804P 4.94E+04 6.07E-04 1.23E-08 19
H1H8808P 4.12E+03 2.16E-04 5.24E-08 54
H1H8810P 5.77E+04 3.16E-04 5.48E-09 37
H1H8813P 5.32E+04 2.32E-04 4.35E-09 50
表6：在25℃下，抗MUC16/抗CD3双特异性抗体对hMUC16片段的Biacore结合亲和力
如结果所示，大部分本发明的抗MUC16抗体结合于可溶性人类MUC16蛋白质，一些呈现次纳摩尔亲和力。通过表面等离子共振，若干抗体(H1M9519N、H1M9521N、H3M9524N、H3M9525N、H1M9528N、H3M9529N)未显示与涵盖最后五个SEA域的截短格式的结合，但是，在基于细胞的结合分析法中显示与表达于OVCAR-3细胞上的内源性人类MUC16的特异性结合。在这一分析法中，本发明的抗MUC16xCD3双特异性抗体也结合于呈现纳摩尔亲和力的可溶性截短型人类MUC16蛋白质。
实例5：例示性双特异性抗体的其它结合、T细胞活化和细胞毒性特性
在本实例中，与结合于目标特异性(MUC16特异性)细胞系相比，通过FACS测定MUC16xCD3双特异性抗体结合于表达人类CD3(人类T细胞)细胞系的能力。此外，也在类似分析法中比较这些双特异性抗体活化目标特异性(MUC16特异性)细胞系的能力。
例示双特异性抗体的结合滴定，如通过FACS分析测量
A.简单来说，利用流动式细胞测量分析(即，荧光活化细胞分选或FACS)测定双特异性抗体与Jurkat细胞或表达人类MUC16的细胞的结合，接着用藻红素(PE)标记或APC标记的抗人类IgG抗体进行检测。简单来说，用各测试抗体或同型对照物(具有结合不同抗原的相同同型的抗体，其与MUC16或CD3不具有交叉反应性)的1.33E-07M到8.03E-12M范围内的连续稀释物，在4℃下以2×105个细胞/孔培育30分钟。在培育之后，细胞用含有1％经过滤的FBS的冷PBS洗涤两次，并且将PE结合或APC结合的抗人类二级抗体添加到细胞中且再培育30分钟。也使用不含抗体或仅含二级抗体的孔作为对照物。在培育之后，洗涤细胞，再悬浮于200μL含有1％经过滤的FBS的冷PBS中并且用BD FACS Canto II通过流式细胞测量术进行分析。参见表7A。
B.在具有与上文所描述类似的条件的单独实验中，利用流动式细胞测量分析(或FACS)测定所选双特异性抗体与Jurkat细胞、PEO-1、OVCAR3-Luc和食蟹猕猴T细胞的结合。对于滴定分析，所选择的MUC16xCD3双特异性抗体、第一同型对照抗体(人类嵌合IgG4抗体，其结合无关的人类抗原，不与人类或食蟹猕猴CD3具有交叉反应性)和第二同型对照抗体(人类嵌合IgG4抗体，其结合无关的人类抗原，不与人类MUC16具有交叉反应性)的连续稀释物，在66.6nM到0.001nM范围内。参见表7B和图11A-11C。
对于FACS分析，通过单一事件选择的正向散射高度比正向散射面积，接着侧面和正向散射来闸控细胞。使用PRISMTM软件(GraphPad Software,Inc.,La Jolla,CA)测定细胞结合滴定的EC50。使用4-参数非线性回归分析计算值(Liu,J.等人,2005,《生物技术快报(Biotechnol Letters)》27:1821-1827)。EC50值表示在观察到测试抗体的50％最大结合时测试抗体的浓度。
表7A：CD3和MUC16特异性细胞系上的FACS结合
表7B：CD3和MUC16特异性细胞系上的FACS结合
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如表7A和7B中所示，各MUC16双特异性抗体的CD3结合臂显示与人类和猴CD3表达T细胞的一系列细胞结合(例如从3.2nM EC50到极弱结合)。BSMUC16/CD3-001双特异性抗体展示与CD3表达细胞的高结合测量值(即，<7nM)，而BSMUC16/CD3-002双特异性抗体展示与人类和猴CD3表达细胞的弱到无结合。在FACS分析法或等效分析法中不可测量的结合或无可测量的结合是指抗体与其目标抗原之间的结合相互作用超出分析法的侦测极限(例如等于或高于1μM)。所测试的双特异性抗体在表达MUC16的细胞系上显示类似的细胞结合，证实呈现与CD3的高或弱(或不可测量的)相互作用的与个别CD3臂的双特异性配对不会影响或减少这些实例中的肿瘤目标特异性结合(MUC16特异性结合小于或等于3nM(高结合))。第一对照抗体不结合于CD3+细胞，并且第二对照抗体不结合于MUC16+细胞。也参见图11A-11C。
呈现弱到不可检测的与人类CD3的结合的抗体仍视为有利于亲合力驱使的双特异性配对，并且在活体外(参见下文)和活体内分析法中进一步测试细胞毒性(实例8)。
如活体外测量的由双特异性抗体呈现的T细胞活化和肿瘤特异性细胞毒性
A.通过流式细胞测量术监测在基于CD3的双特异性抗体存在下，表达MUC16的肿瘤目标细胞的特异性杀伤。如先前所报导，双特异性抗体对CD3蛋白质和表达CD3的细胞系显示不同的结合能力(即，极弱或强的结合)。测试这些相同的双特异性抗体诱导原生人类T细胞重新导向针对目标表达细胞的杀伤的能力。
简单来说，用1μM荧光追踪染料Violet Cell Tracker标记表达MUC16(OVCAR3)的细胞系。在标记之后，在37℃下涂布细胞过夜。单独地，在补充型RPMI培养基中，以1×106个细胞/毫升涂布人类PBMC并且在37℃下培育过夜，以通过消耗粘着性巨噬细胞、树突状细胞和一些单核细胞来富集淋巴细胞。第二天，目标细胞与粘着性细胞耗尽的非刺激性PBMC(效应子/目标细胞4:1比率)和相关双特异性抗体或同型对照物的连续稀释物(浓度范围：66.7nM到0.25pM)一起在37℃下培育48小时。使用不含酶的细胞解离缓冲液从细胞培养盘移出细胞，并且通过FACS进行分析。参见表8A中呈现的结果。
B.在类似研究中，如所描述标记、涂布和培育表达MUC16(PEO-1或OVCAR3-Luc)的细胞系过夜。共同培育MUC16xCD3双特异性抗体或同型对照物的连续稀释物。参见表8B和8C以及图12A-12B中描绘的结果。
关于FACS分析，细胞用死/活的远红血球追踪器(Invitrogen)染色。在即将进行FACS分析之前，将5×105个计数珠粒添加到各孔中。对于各样品，收集1×104个珠粒。对于杀伤特异性的评估，用活的Violet标记的群体闸控细胞。记录活群体的百分比并且用于计算标准化存活率。
通过培育细胞与针对CD2、CD69和/或CD25的直接结合抗体和通过报导全部T细胞(CD2+)中的较早活化(CD69+)T细胞和/或较晚活化(CD25+)T细胞的百分比来评估T细胞活化。
如表8A-8C中结果的所展示，在抗MUC16xCD3双特异性下观察到表达MUC16的细胞的消耗。所有所测试的双特异性抗体活化和引导人类T细胞消耗目标细胞，其中EC50在皮摩尔范围内。此外，所观察到的目标细胞溶解(消耗)与CD2+T细胞上CD69(或CD25)的上调相关，也具有皮摩尔(pM)级EC50。
重要的是，这一实例的结果还证明所构筑的具有CD3结合臂的双特异性抗体(其显示与CD3蛋白质或表达CD3的细胞(即，CD3-VH-G5)的弱到不可测量的结合)仍保持活化T细胞的能力并且呈现肿瘤抗原表达细胞的强细胞毒性。
表8A：所选择的MUC16xCD3双特异性抗体的细胞毒性和T细胞活化特性
表8B：所选择的MUC16xCD3双特异性抗体的细胞毒性和T细胞活化特性
表8C：所选择的MUC16xCD3双特异性抗体的细胞毒性和T细胞活化特性
实例6：结合于hMUC16的C端结构域的一部分的抗Muc16抗体H4sH8767P、H1H8794P2和H1H8799P2的基于氢/氘(H/D)交换的表位定位
进行实验以测定与抗MUC16抗体H4sH8767P、H1H8794P2和H1H8799P2相互作用的C端五个SEA域(SEQ ID NO:1902，下文中称为hMUC16.nub)内的MUC16氨基酸残基。为此目的，利用通过质谱进行的氢/氘(H/D)交换表位定位(HDX-MS)。H/D交换方法的一般说明阐述于Ehring(1999)《分析型生物化学(Analytical Biochemistry)》267(2):252-259；和Engen和Smith(2001)《分析化学(Anal.Chem.)》73:256A-265A中。
用整合式Waters HDX/MS平台进行HDX-MS实验，所述平台由以下组成：用于氘标记的Leaptec HDX PAL系统、用于样品消化和负荷的Waters Acquity M-Class(Auxiliary溶剂管理器)、用于分析型柱梯度的Waters Acquity M-Class(μBinary溶剂管理器)和用于胃蛋白酶肽质量测量的Synapt G2-Si质谱仪。
在pD 7.0下，在D2O中，在10mM PBS缓冲液中制备标记溶液。对于氘标记，以2:1摩尔比与抗MUC16抗体H4sH8767P、H1H8794P2或H1H8799P2预混合的3.8μL hMUC16.nub(12pmol/μL)或hMUC16.nub与56.2μL一起培育。各种时间点的D2O标记溶液(例如：非氘化对照物＝0秒；氘标记：1分钟和20分钟)。通过将50μL样品转移到50μL预先冷却的淬灭缓冲液(含0.2M TCEP、6M氯化胍的100mM磷酸盐缓冲液，pH 2.5)中来淬灭氘化，并且在1.0℃下培育混合样品两分钟。接着，将经淬灭的样品注射到Waters HDX Manager中以用于在线胃蛋白酶/蛋白酶XIII消化。在0℃下，将经消化的肽捕捉到ACQUITY UPLC BEH C18 1.7-μm，2.1×5mm VanGuard预柱上，并且针对5％-40％B的9分钟梯度分离(移动相A：含0.1％甲酸的水，移动相B：含0.1％甲酸的乙腈)溶离到分析型柱ACQUITY UPLC BEH C18(1.7-μm，1.0×50mm)。质谱仪使用37V锥电压、0.5秒扫描时间和50-1700Th质量/电荷范围。
对于与H4sH8767P、H1H8794P2和H1H8799P2相互作用的hMUC16.nub的肽残基的鉴别，使用Waters ProteinLynx Global Server(PLGS)软件，针对包括hMUC16.nub、胃蛋白酶和随机序列的序列的资料库处理和搜索来自非氘化样品的LC-MSE资料。将经鉴别的肽导入DynamX软件并且通过两个准则过滤：1)每个氨基酸的最小产物：0.25和2)复制档案临限值：2。接着，DynamX软件跨越多个时间点基于滞留时间和高质量精确性(<10ppm)自动测定各肽的氘吸收，其中在各时间处3个复本。
使用与MSE资料获取偶合的在线胃蛋白酶/蛋白酶XIII柱，在不存在或存在H4sH8767P的情况下鉴别总共109种来自hMUC16.nub的肽，表示64％序列覆盖率。当结合于H4sH8767P时，六种肽具有显著降低的氘化吸收(矩心δ值>0.5道尔顿，来自至少一个时间点，其中p值<0.05)并且说明于表9A中。所记录的肽质量对应于来自三个复本的矩心MH+质量的平均值。这些肽，对应于hMuc16.nub的氨基酸428-434、453-467和474-481，在结合于H4sH8767P时具有较慢的氘化速率。这些所鉴别的残基也对应于如由Uniprot条目Q8WXI7(MUC16_HUMAN)，SEQ ID NO:1899所定义的hMUC16的残基14237-14243、14262-14276和14283-14290。
表9A.在结合H4sH8767P时具有变化的氘化速率的hMUC16.nub肽
使用与MSE资料获取偶合的在线胃蛋白酶/蛋白酶XIII柱，在不存在或存在H1H8794P2的情况下鉴别总共109种来自hMUC16.nub的肽，表示64％序列覆盖率。在结合于H1H8794P2时，三种肽具有显著降低的氘化吸收(矩心δ值>0.5，来自至少一个时间点，其中p值＜0.05)并且说明于表9B中。所记录的肽质量对应于来自三个复本的矩心MH+质量的平均值。这些肽，对应于hMuc16.nub的氨基酸126-131、127-131和132-138，在结合于H1H8794P2时具有较慢的氘化速率。这些所鉴别的残基也对应于如由Uniprot条目Q8WXI7(MUC16_HUMAN)，SEQ ID NO:1899所定义的hMUC16的残基13935-13940、13936-13940和13941-13947。
表9B.在结合H1H8794P2时具有变化的氘化速率的hMUC16.nub肽
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使用与MSE资料获取偶合的在线胃蛋白酶/蛋白酶XIII柱，在不存在或存在H1H8799P2的情况下鉴别总共109种来自hMUC16.nub的肽，表示64％序列覆盖率。当结合于H1H8799P2时，四种肽具有显著降低氘化吸收(矩心δ值>0.5道尔顿，来自至少一个时间点，其中p值＜0.05)并且说明于表9C中。所记录的肽质量对应于来自三个复本的矩心MH+质量的平均值。这些肽，对应于hMuc16.nub的氨基酸357-369、358-366、358-369和361-369，在结合于H1H8799P2时具有较慢的氘化速率。这些所鉴别的残基也对应于如由Uniprot条目Q8WXI7(MUC16_HUMAN)，SEQ ID NO:1899所定义的hMUC16的残基14165-14178、14166-14176、14166-14178和14170-14178。
表9C.在结合H1H8799P2时具有变化的氘化速率的hMUC16.nub肽
实例7：抗MUC16x CD3双特异性抗体的药物动力学评估
在人类化MUC16xCD3小鼠(用于人类MUC16和CD3表达的小鼠同型接合子，MUC16hu/ huxCD3hu/hu)、CD3人类化小鼠(用于人类CD3表达的小鼠同型接合子，CD3hu/hu)和菌株匹配(75％C57BL、25％129Sv)野生型(WT)小鼠中进行抗MUC16xCD3双特异性抗体BSMUC16/CD3-001和BSMUC16/CD3-005以及同型对照物的药物动力学评估。群组含有每种测试抗体和每种小鼠品系4-5只小鼠。所有小鼠接受单次腹膜内(i.p.)0.4mg/kg剂量。在给药后3和6小时、1、3、7、14和28天收集血液样品。将血液处理成血清并且在-80℃下冷冻直到分析。
使用GyroLab xPloreTM(Gyros,Uppsala,Sweden)，通过完全人类IgG抗体分析来测定循环抗体浓度。简单来说，用Gyrolab Bioaffy 200CD(Gyros)将生物素化山羊抗人类IgG多克隆抗体(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA)捕捉到经抗生蛋白链菌素涂布的珠粒上，以捕捉血清中的人类IgG。在亲和柱捕捉之后，用Alexa-647标记的山羊抗人类IgG(Jackson ImmunoResearch)检测样品中结合的人类IgG抗体。柱上的荧光信号使得能够检测结合的IgG并且通过仪器读取反应单位(RU)。使用Gyrolab Evaluator软件，通过来自使用5-参数对数曲线拟合来拟合的标准曲线的内插法测定样品浓度。
使用6.3版软体(Certara,L.P.,Princeton,NJ)和血管外给药模型，通过非分室分析(NCA)来测定PK参数。使用各抗体的各别平均浓度值，使用线性梯形法则以及线性内插法和均匀加权测定所有PK参数，包括所观察到的血清中的最大浓度(Cmax)、所观察到的所评估的半衰期(t1/2)和直到最后可测量浓度的浓度与时间曲线下面积(AUClast)。
在野生型小鼠中腹膜内给予抗体之后，BSMUC16/CD3-001、BSMUC16/CD3-005和同型对照物的总IgG浓度-时间概况都是类似的，首先通过简单药物分布，接着遍及研究的其余部分的单一药物清除阶段表征。三种抗体的最大血清浓度(Cmax)和所计算的药物暴露(AUClast)是类似的(在彼此的1.3倍内)。
在CD3hu/hu小鼠中腹膜内给予抗体之后，BSMUC16/CD3-001、BSMUC16/CD3-005和同型对照物具有类似的Cmax浓度(分别是4.6、3.6和4.1μg/mL)。BSMUC16/CD3-005和同型对照物呈现类似药物清除曲线，而BSMUC16/CD3-001与前两种相比呈现更陡的药物清除，表明人类CD3目标结合有助于清除。BSMUC16/CD3-001的最终抗体浓度是0.03μg/mL，其比同型对照物(0.85μg/mL)的所测定的最终抗体浓度小约28倍并且比BSMUC16/CD3-005(0.66μg/mL)血清浓度小22倍。
在MUC16hu/huxCD3hu/hu双重人类化小鼠中，Muc16xCD3双特异性和同型对照抗体具有类似的Cmax浓度(Cmax范围：4.5-6.9μg/mL)。两种双特异性抗体都呈现比同型对照物更陡的药物清除，表明目标介导的作用。BSMUC16/CD3-001和BSMUC16/CD3-005的最终抗体浓度分别比同型对照物的所测定的最终抗体浓度(0.86μg/mL)低约29倍和2.9倍。
表10中概述总抗MUC16xCD3双特异性抗体和同型对照抗体浓度的资料概述。平均PK参数描述于表11A和11B中。平均总抗体浓度与时间的关系展示于图1、2和3中。总之，MUC16xCD3双特异性抗体在野生型小鼠中呈现类似的Cmax和药物清除曲线，但BSMUC16/CD3-001在CD3单一人类化小鼠和MUC16/CD3双重人类化小鼠中显示比BSMUC16/CD3-005和同型对照物更陡的清除率。由于在这一PK研究中给予的双特异性抗体包含相同的抗MUC16结合臂，因此结果表明CD3靶向臂的结合强度可能在药物暴露水平(AUClast)和药物清除速率中起作用。BSMUC16/CD3-001或BSMUC16/CD3-005都不结合小鼠MUC16或小鼠CD3。
表10：在野生型小鼠、人类化CD3小鼠和人类化MUC16xCD3小鼠中，在单次0.4mg/kg腹膜内注射BSMUC16/CD3-001、BSMUC16/CD3-005和同型对照抗体之后，血清中总IgG的平均浓度
时间：(小时，在注明时)＝单次剂量注射后的小时数；D＝研究天数；SD＝标准差；ND＝由于用药物清除抗药物滴度排除小鼠而未测定
表11A：药物动力学参数概述：CD3hu/hu人类化小鼠
Cmax＝峰值浓度；AUC＝浓度-时间曲线下面积；AUClast＝从时间零到最后一次正浓度时间计算的AUC；T1/2＝观察到的所评估的半衰期
表11B：药物动力学参数概述：MUC16hu/huxCD3hu/hu双重人类化小鼠
Cmax＝峰值浓度；AUC＝浓度-时间曲线下面积；AUClast＝从时间零到最后一次正浓度时间计算的AUC；T1/2＝观察到的所评估的半衰期
实例8：抗MUC16/抗CD3双特异性抗体显示活体内强效抗肿瘤功效
为了测定鉴别为与人类和食蟹猕猴CD3具有弱或不可检测的结合的例示性抗MUC16/抗CD3双特异性抗体的活体内功效，在具有人类前列腺癌异种移植物的免疫功能不全小鼠中进行研究。在立即处理和治疗性治疗给药模型中测试所选择的双特异性抗体的功效。
人类肿瘤异种移植模型中抗MUC16/抗CD3双特异性抗体的功效
为了在人类肿瘤异种移植物研究中评估抗MUC16/抗CD3双特异性的活体内功效，预先将人类外周血液单核细胞(PBMC；ReachBio LLC.,Seattle,WA)移植到NOD scidγ(NSG)小鼠(Jackson Laboratories,Bar Harbor,Maine)中，并且接着提供来自经荧光素酶(OVCAR-3/Luc)转导的人类卵巢癌细胞系OVCAR-3(American Type Tissue Culture,Manassas,VA)的腹水细胞。OVCAR-3细胞内源性表达MUC-16。
简单来说，向NSG小鼠腹膜内(i.p.)注射5.0×106个人类PBMC。在8天后，向移植有PBMC的NSG小鼠腹膜内给予预先活体内传代的来自OVCAR-3/Luc细胞系的1.5×106个腹水细胞。在立即处理组中，在OVCAR-3/Luc细胞移植当天用MUC16/CD3双特异性抗体BSMUC16/CD3-001或BSMUC16/CD3-005或同型对照物以10微克/小鼠的剂量腹膜内处理小鼠(N＝5只小鼠/处理组)。在治疗剂量模型中，在肿瘤移植后7天，用上文所描述的MUC16/CD3双特异性或对照抗体以10微克/小鼠的剂量腹膜内处理小鼠(N＝5只/处理组)。
在所有研究中，通过生物发光成像(BLI)监测肿瘤生长。向小鼠腹膜内注射悬浮于PBS中的荧光素酶受质D-荧光素(150mg/kg)并且在10分钟之后，在异氟醚麻醉下成像。使用Xenogen IVIS系统(Perkin Elmer,Hopkinton,MA)进行BLI并且使用Living Image软件(Xenogen/Perkin Elmer)提取BLI信号。描绘各细胞质周围的相关区域并且以光子(p)/秒(s)/cm2/立体角(sr)形式记录光子强度。对于立即处理组，资料展示为肿瘤植入后26天的BLI含量(表12A)。对于治疗性处理组，资料展示为第6天(处理前1天)与研究终点(肿瘤植入后26天；表12B)之间的BLI的倍数变化。
如结果展示，在立即给药模型中，当在第26天测量BLI时，与同型对照物相比，BSMUC16/CD3-001和BSMUC16/CD3-005在抑制肿瘤生长方面都展示类似的功效。与对照物相比，当在肿瘤植入后7天给予时，抗MUC16/抗CD3双特异性抗体也都抑制已建立肿瘤的生长。总之，本发明的双特异性抗MUC16/抗CD3抗体在若干模型中显示强抗肿瘤功效。
表12A：免疫功能不全异种移植模型中抗MUC16/抗CD3双特异性抗体的功效：立即给药
表12B：免疫功能不全异种移植模型中抗Muc16/抗CD3双特异性抗体的功效：治疗性处理
在其它实验中，在异种和同种肿瘤模型中评估抗MUC16/抗CD3双特异性抗体的活体内功效。对于第一异种模型，在移植人类PBMC之后第十一天，向NSG小鼠腹膜内(IP)注射预先活体内传代的OVCAR-3/Luc细胞(第0天)。在第6、10、13、16和21天，小鼠用0.01、0.1或0.5mg/kg的BSMUC16/CD3-001腹膜内处理，或给予0.5mg/kg的非结合对照物或CD3结合对照物。在肿瘤植入后第6、14和20天，通过BLI评估肿瘤负荷。用0.1或0.5mg/kg的BSMUC16/CD3-001处理可以引起显著抗肿瘤功效，如在第20天通过BLI测量所测定，如表13A-C和图4-6中所示。对于第二异种模型，在移植人类PBMC之后第十三天，向NSG小鼠注射预先活体内传代的OVCAR-3/Luc细胞(第0天)，并且在第4天转移第二批PBMC。在第5、8、12、15、19和22天，小鼠用0.1、0.5、1或5mg/kg的BSMUC16/CD3-005静脉内(IV)处理，或给予5mg/kg的非结合对照物或CD3结合对照物。在第4、11、18和25天，通过BLI评估肿瘤负荷。用0.5、1或5mg/kg的BSMUC16/CD3-005处理可以引起显著抗肿瘤功效，如由BLI测量和倍数变化所示(表13D-F和图7-9)。为了检验在免疫胜任模型中的功效，用人类CD3置换鼠类CD3基因并且用人类序列置换一部分小鼠MUC16基因。所述置换产生满足以下条件的小鼠：其T细胞表达人类CD3，并且表达含有与BSMUC16/CD3-001双特异性抗体结合的一部分人类MUC16的嵌合MUC16分子。对于同种肿瘤模型，使用经工程改造以表达人类MUC16的所述部分的ID8-VEGF细胞系。将ID8-VEGF/huMUC16细胞皮下移植到小鼠中并且在移植当天或在移植之后第十天，在形成肿瘤时用100μg BSMUC16/CD3-001处理。用100μg BSMUC16/CD3-001处理可以引起显著抗肿瘤功效，如表13G和图10中所示。
异种移植肿瘤的移植和测量：向预先移植有人类PBMC的NSG小鼠腹膜内给予预先活体内传代的来自OVCAR-3/Luc细胞系的腹水细胞。在OVCAR-3/Luc移植之后若干天和在研究期间多次测量BLI作为肿瘤生长的读取值。在用于分组的初始BLI测量之后，将小鼠分成每组4-6只动物并且在整个研究期间每周给予MUC16xCD3双特异性或对照抗体两次。
计算异种移植肿瘤生长和抑制：使用生物发光成像来测量肿瘤负荷。向小鼠腹膜内注射悬浮于PBS中的150mg/kg(如在实验开始时通过体重测定)的荧光素酶受质D-荧光素。在给药之后十分钟，使用Xenogen IVIS系统在异氟醚麻醉下进行小鼠的BLI成像。在D视野、1.5cm个体高度和0.5分钟暴露时间的中等分组水平下进行影像获取。使用LivingImage软件提取BLI信号。描绘各肿瘤块周围的相关区域并且以p/s/cm2/sr形式记录光子强度。使用GraphPad Prism软件(第6版)进行统计分析。使用不成对非参数Mann-Whitney t测试来测定BLI结果的统计显著性。通过下式计算倍数变化：(第20天-第6天)/第6天(对于研究1)和(第25天-第4天)/第4天(对于研究2)。
同种肿瘤的移植和测量：用10e6ID8-VEGF/huMUC16细胞对表达人类CD3和相应小鼠基因座中的MUC16的人类-鼠类嵌合体的小鼠进行皮下(SC)移植。向小鼠腹膜内给予BSMUC16/CD3-001或CD3结合对照物，在整个研究期间每周两次。处理在移植后第0天或第10天开始。用测径规每周测量肿瘤生长两次。在肿瘤移植之后第47天处死小鼠。
计算同种肿瘤生长和抑制：为了通过外部测径规测定肿瘤体积，测定最大纵向直径(长度)和最大横向直径(宽度)。由下式计算基于测径规测量的肿瘤体积：体积＝(长度×宽度2)/2。使用不成对非参数Mann-Whitney t测试来测定统计显著性。
异种和同种活体内肿瘤模型中BSMUC16/CD3-001双特异性抗体的抗肿瘤功效展示于以下表13A-D中。
表13A：OVCAR-3模型研究1。肿瘤移植后第6天的生物发光水平
抗体(mg/kg) 移植后第6天的平均辐射[p/s/cm22/sr](中值±SEM)
非结合对照物(0.5) 8.15e+05±7.88e+04
CD3结合对照物(0.5) 6.39e+05±8.67e+04
BSMUC16/CD3-001(0.5) 7.64e+05±1.19e+05
BSMUC16/CD3-001(0.1) 6.31e+05±1.10e+05
BSMUC16/CD3-001(0.01) 8.77e+05±7.91e+04
表13B：OVCAR-3模型研究1。肿瘤移植后第20天的生物发光水平
抗体(mg/kg) 移植后第20天的平均辐射[p/s/cm22/sr](中值±SEM)
非结合对照物(0.5) 8.63e+06±1.45e+06
CD3结合对照物(0.5) 9.94e+06±1.08e+06
BSMUC16/CD3-001(0.5) 9.37e+02±9.62e+02
BSMUC16/CD3-001(0.1) 2.36e+04±1.28e+06
BSMUC16/CD3-001(0.01) 6.51e+06±1.60e+06
表13C：OVCAR-3模型研究1。肿瘤移植后第6天与第20天之间的BLI的倍数变化
表13D：OVCAR-3模型研究2。肿瘤移植后第4天的生物发光水平
抗体(mg/kg) 移植后第4天的平均辐射[p/s/cm22/sr](中值±SEM)
非结合对照物(5) 1.54e+05±9.93e+03
CD3结合对照物(5) 1.34e+05±1.55e+04
BSMUC16/CD3-005(5) 1.54e+05±1.03e+04
BSMUC16/CD3-005(1) 1.38e+05±4.65e+03
BSMUC16/CD3-005(0.5) 1.31e+05±4.03e+03
BSMUC16/CD3-005(0.1) 1.53e+05±1.93e+04
表13E：OVCAR-3模型研究2。肿瘤移植后第25天的生物发光水平
抗体(mg/kg) 移植后第25天的平均辐射[p/s/cm22/sr](中值±SEM)
非结合对照物(5) 7.20e+06±8.91e+05
CD3结合对照物(5) 6.15e+06±7.26e+05
BSMUC16/CD3-005(5) 1.52e+03±4.86e+05
BSMUC16/CD3-005(1) 6.99e+03±6.23e+03
BSMUC16/CD3-005(0.5) 2.23e+03±2.35e+05
BSMUC16/CD3-005(0.1) 7.63e+06±1.83e+06
表13F：OVCAR-3模型研究2。肿瘤移植后第4天与第25天之间的BLI的倍数变化
表13G：ID8-VEGF/huMUC16模型。第47天的肿瘤尺寸(mm3)
处理开始 抗体(μg) 第47天的肿瘤尺寸(mm3)(平均值±SEM)
第0天 CD3结合对照物(100) 827.5±223.5
第0天 BSMUC16/CD3-001(100) 51.2±51.2
第10天 BSMUC16/CD3-001(100) 273.8±92.36
实例9：结合物制备和表征
所有单克隆抗体在CHO细胞中表达并且通过蛋白质A纯化。也以类似方式制备同型对照。非结合同型对照抗体是衍生自与肿瘤学无关的免疫抗原。
在37℃下，用1mM二硫苏糖醇处理于50mM HEPES、150mM NaCl，pH 7.5中的抗体(10mg/ml)30分钟。在凝胶过滤(G-25，pH 4.5，乙酸钠)之后，将含顺丁烯二酰亚胺基连接子有效负荷衍生物化合物7或化合物10(参见表14)(1.2当量/SH基团)中的一个的DMSO(10mg/ml)添加到经还原的抗体中并且用1M HEPES(pH 7.4)将混合物调节到pH 7.0。化合物7和化合物10以及制备化合物的方法分别描述于2014年9月18日公开的PCT公开案第WO2014/145090号和2016年10月6日公开的PCT公开案第WO2016/160615号中，其各自以全文引用的方式并入本文中。在1小时之后，用过量的N-乙基顺丁烯二酰亚胺淬灭反应物。结合物通过尺寸排阻色谱法纯化并且无菌过滤。通过UV光谱分析来测定蛋白质和连接子有效负荷浓度。尺寸排阻HPLC确认所使用的所有结合物是>95％单体。基于蛋白质测定，产率报导于表14中。根据Hamblett等人,《癌症研究》2004 10 7063，通过UV分析所有结合抗体的连接子有效负荷的负荷值。结果概述于表14中。
可以使用类似方法制备包含化合物60的结合物。化合物60和制备化合物的方法描述于2016年10月6日公开的PCT公开案第WO2016/160615(实例20)号中，其以全文引用的方式并入本文中。化合物60是美登素-N-甲基-L-丙氨酸-(3-甲氧基-4-氨基)苯甲酰胺基-Cit-Val-Cap-Mal。
表14：有效负荷(化学毒性药物)和抗体-药物结合物参数的概述
实例10：抗MUC16抗体药物结合物是活体内MUC16阳性前列腺癌异种移植模型中肿瘤生长的强效抑制剂
为了测定与化合物7和化合物10结合的抗MUC16抗体的活体内功效，在具有MUC16阳性卵巢癌异种移植物的免疫功能不全小鼠中进行研究。
对于这些研究，将经荧光素酶(OVCAR3/luc)转染的内源性表达MUC16的OVCAR3[NIH:OVCAR-3(OVCAR3，ATCC HTB-161)]细胞移植到雌性SCID小鼠(Taconic,Hudson NY)中。对于腹膜内(IP)肿瘤，将小鼠随机分入处理组，并且根据肿瘤发光信号的检测来给予抗MUC16药物结合抗体(参见实例9)、非结合型结合抗体或媒剂。对于皮下(SC)异种移植，在肿瘤达到200mm3的平均体积(约第16天)之后，将小鼠随机分入处理组并且给予抗MUC16药物结合抗体、非结合型结合抗体或媒剂。在这些活体内研究中，给予抗体并且接着监测肿瘤直到在仅给予媒剂的群组中产生腹水或达到约1200mm3的平均肿瘤尺寸。此时，计算肿瘤生长抑制。
在初始腹膜内(IP)研究中，检验与化合物7结合的例示性抗MUC16抗体降低OVCAR3/luc发光信号的功效。基于ADC药物:抗体比率，小鼠以85μg/kg的药物当量每周接受四次抗MUC16和对照性ADC给药。如表15A中概述，H1H9519N-化合物7和H1H9521N-化合物7有效抑制腹水肿瘤生长。这些抗MUC16ADC有效减小肿瘤尺寸，与媒剂对照物相比，肿瘤发光降低100％。对照性ADC不介导OVCAR/luc腹水肿瘤细胞生长的任何抑制。
评估抗MUC16ADC针对皮下(SC)OVCAR3/luc肿瘤的功效的另一研究概述于表15B中。基于ADC药物:抗体比率，小鼠以85μg/kg的药物当量每周接受四次抗MUC16和对照性ADC给药。当与化合物7结合时，MUC16 ADC H1H9519N-化合物7和H1H9521N-化合物7又产生显著抗肿瘤作用；这次针对皮下OVCAR3/luc肿瘤。因此，这些ADC分别介导肿瘤生长的100％和109％抑制。对照性ADC不介导OVCAR/luc皮下肿瘤生长的任何抑制。
在第三研究中，在IP OVCAR3/luc肿瘤模型中评估与连接子药物化合物10结合的抗MUC16抗体H1H9521N的功效。基于ADC药物:抗体比率，小鼠以85μg/kg、170μg/kg和340μg/kg的药物当量接受单次剂量的抗MUC16和对照性ADC。如表15C中所概述，H1H9519N-10有效抑制腹水肿瘤生长。与媒剂对照物相比，所述剂量的H1H9519N-化合物10引起肿瘤发光的99-100％抑制。使用化合物10，在对照性ADC情况下观察到一些抑制，但这比在抗MUC16H1H9519N-化合物10情况下观察到的更温和。
表15A：在用与化合物7结合的抗MUC16抗体处理的SCID小鼠中，在第49天时OVCAR3/luc IP肿瘤生长的抑制
处理组 最终肿瘤平均辐射(平均值±SEM) 平均肿瘤生长抑制(％)
媒剂 16469750±10679335 0
对照性化合物7 85μg/kg 16813750±4026065 -2
H1H9519N-化合物7 85μg/kg 111254±187288 100
H1H9521N-化合物7 85μg/kg 110413±161353 100
表15B：在用与化合物7结合的抗MUC16抗体处理的SCID小鼠中，在第37天时OVCAR3/luc SC肿瘤生长的抑制
处理组 最终肿瘤体积(平均值±SEM) 平均肿瘤生长抑制(％)
媒剂 1210±426 0
对照性化合物7 85μg/kg 1737±391 -51
H1H9519N-化合物7 85μg/kg 187±269 100
H1H9521N-化合物7 85μg/kg 89±97 109
表15C：在用与化合物10结合的抗MUC16抗体处理的SCID小鼠中，在第49天时OVCAR3/luc IP肿瘤生长的抑制
处理组 最终肿瘤辐射(平均值±SEM) 平均肿瘤生长抑制(％)
媒剂 29211000±23504780 0
对照性化合物10 85μg/kg 17332625±14346694 41
对照性化合物10 170μg/kg 32075000±15623403 -10
对照性化合物10 340μg/kg 22882350±18771913 22
H1H9521N-化合物10 85μg/kg 574285±306844 99
H1H9521N-化合物10 170μg/kg 236037±226948 100
H1H9521N-化合物10 340μg/kg 26472±25079 101
实例11：产生抗CD3抗体
通过用表达CD3的细胞或编码CD3的DNA使包含编码人类免疫球蛋白重链和κ轻链可变区的经工程改造的小鼠免疫来获得抗CD3抗体。通过CD3特异性免疫分析法来监测抗体免疫反应。当获得所需免疫反应时，收集脾细胞并且使其与小鼠骨髓瘤细胞融合以保留其活力且形成融合瘤细胞系。对融合瘤细胞系进行筛选及选择以鉴别产生CD3特异性抗体的细胞系。使用这种技术，获得若干抗CD3嵌合抗体(即，具有人类可变域和小鼠恒定域的抗体)。此外，从不与骨髓瘤细胞融合的抗原阳性B细胞直接分离若干完全人类抗CD3抗体，如US 2007/0280945A1中所描述。
根据这一实例的方法产生的例示性抗CD3抗体的某些生物特性详细描述于本文中的实例中。
实例12：重链和轻链可变区氨基酸和核酸序列
表16阐述所选择的本发明的抗CD3抗体的重链和轻链可变区以及CDR的氨基酸序列标识符。相应核酸序列标识符阐述于表17中。制备本文所公开的抗CD3抗体的方法也可以见于美国公开案2014/0088295中。
表16：氨基酸序列标识符
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表17：核酸序列标识符
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本文中通常根据以下命名法提及抗体：Fc前缀(例如“H1H”、“H1M”、“H2M”等)，后跟数字标识符(例如“2712”、“2692”等，如表1中所示)，后跟“P”、“N”或“B”后缀。因此，根据这一命名法，抗体在本文中可称为例如“H1H2712N”、“H1M2692N”、“H2M2689N”等。本文中使用的抗体名称上的H1H、H1M和H2M前缀指示抗体的具体Fc区同型。举例来说，“H1H”抗体具有人类IgG1Fc，“H1M”抗体具有小鼠IgG1Fc，并且“H2M”抗体具有小鼠IgG2Fc(所有可变区是完全人类的，如由抗体名称中的第一个‘H’所表示)。如所属领域的普通技术人员将了解，可以将具有具体Fc同型的抗体转化成具有不同Fc同型的抗体(例如可以将具有小鼠IgG1Fc的抗体转化成具有人类IgG4的抗体等)，但在任何情况下，可变域(包括CDR)，其由表1中展示的数字标识符指示，将保持相同，并且预期结合特性将一致或基本上类似而与Fc域的性质无关。
表18和19阐述其它适用于本发明的抗MUC16x抗CD3双特异性抗体中的抗CD3HCVR和LCVR的重链可变区(表18)和轻链可变区(表19)以及其相应CDR的氨基酸序列标识符。
表18(重链可变区氨基酸序列)
表19(轻链可变区氨基酸序列)
CD3-VH-F和CD3-VL-F的重链和轻链可变区是衍生自称为“L2K”的抗CD3抗体，如WO2004/106380中所阐述。
此外，表20和21阐述核苷酸序列的序列识别符，所述核苷酸序列编码其它适用于本发明的抗MUC16x抗CD3双特异性抗体中的抗CD3HCVR和LCVR的重链可变区(表20)和轻链可变区(表21)以及其相应CDR。
表20(编码重链可变区序列的核苷酸序列)
表21(编码轻链可变区序列的核苷酸序列)
用于以下实例中的对照性构筑体
出于比较目的，以下实验中包括各种对照性构筑体(抗CD3抗体)：“OKT-3”，针对人类T细胞表面抗原的小鼠单克隆抗体，其可以从美国菌种保藏中心(American TypeCulture Collection；ATCC)以目录号CRL-8001获得；和“SP34”，一种可商购的小鼠单克隆抗体，其从例如Biolegend,San Diego,CA(目录号302914)或BD Pharmagen(目录号55052)获得，具有针对人类T淋巴球细胞上T3复合物的ε链的反应性。
实例13：产生其它抗CD3抗体
以下程序旨在鉴别特异性识别CD3(T细胞共受体)作为抗原的抗体。
一组抗CD3抗体是衍生自经基因修饰的小鼠。简单来说，小鼠用CD3抗原免疫并且产生B细胞，其包含多种人类VH重排以表达高亲和力抗原特异性抗体的不同基因谱。表22-25中描述的抗体具有VK1-39JK5的相同轻链序列(SEQ ID NO:1890中所阐述的LCVR)。
在活体外结合分析法中测试所产生的抗体与人类和食蟹猕猴CD3抗原的结合，并且例如尤其鉴别一种CD3抗体：称为CD3-VH-P(SEQ ID NO:1882中所阐述的HCVR)，发现其结合于具有1与40nM结合(或细胞结合滴定)之间的EC50的人类和食蟹猕猴CD3，如分别在Jurkat细胞和食蟹猕猴T细胞的FACS滴定中测定。也参见例如实例15和2016年7月29日提交的PCT/US2016/044732中概述的FACS结合实验。
接着鉴别CD3-VH-P的生殖系氨基酸残基(CD3-VH-P的V-D-J重排是IGHV3-9*01、IGHJ6*02、IGHD5-12*01)并且称为“CD3-VH-G”的抗体经工程改造以仅含有生殖系构架。通过众所周知的分子选殖技术工程改造其它抗体衍生物以基于生殖系序列与CD3-VH-P序列之间的差异，以逐步方式置换氨基酸残基。为各抗体衍生物指定“CD3-VH-G”数字名称。参见表18。
尽管CD3-VH-G和某些其它经工程改造的抗体保持其结合，如在FACS分析法中所见，但若干抗CD3抗体以弱到不可测量的结合(如40nM EC50)活体外结合于人类或食蟹猕猴CD3。接着研究包含根据本实例的方法产生的例示性抗CD3抗体的双特异性抗体的结合亲和力、结合动力学和其它用于阐明毒性和药物动力学(pK)概况的生物特性，其详细描述于本文中的实例中。
实例14：重链和轻链可变区(CDR的氨基酸和核酸序列)
表22阐述所选择的本发明的抗CD3抗体的重链可变区和CDR的氨基酸序列标识符。相应核酸序列标识符阐述于表23中。
测定各抗体重链序列的氨基酸和核酸序列。对于一致命名法，为衍生自生殖系序列(SEQ ID NO:1910)的各抗体重链指定“G”数字名称。表22阐述本发明的经工程改造的抗CD3抗体的重链可变区和CDR的氨基酸序列标识符。相应核酸序列标识符阐述于表23中。以下表24和25中也分别鉴别轻链可变区和CDR的氨基酸和核酸序列标识符。
表22：重链氨基酸序列标识符
表23：重链核酸序列标识符
表24：轻链氨基酸序列标识符
表25：轻链核酸序列标识符
基于已知的抗CD3抗体(即，如WO2004/106380中所阐述的抗CD3抗体“L2K”)构筑称为“CD3-L2K”的对照抗体1。
本文中的实例中提及的同型对照抗体是与无关抗原(即FelD1抗原)相互作用的同型匹配(经修饰的IgG4)抗体。
实例15：人类单克隆抗CD3抗体的活体外和活体内研究
如2014年3月27日公开的美国公开案2014/0088295和2016年7月29日提交的PCT/US2016/044732中所描述进行人类单克隆抗CD3抗体的活体内和活体外研究，其以引用的方式并入本文中。
本发明的一些人类单克隆抗CD3抗体以高亲和力，以抗体捕捉或抗原捕捉格式结合可溶性杂二聚CD3蛋白质。用人类Fc标签(hFcΔAdp/hFc；SEQ ID NO:1931/1932)或小鼠Fc标签(mFcΔAdp/mFc；SEQ ID NO:1933/1934)制备可溶性杂二聚CD3蛋白质(hCD3-ε/hCD3-δ；SEQ ID NO:1900/1901)。杂二聚CD3蛋白质使用Davis等人(US2010/0331527)中描述的方法纯化。
本发明的一些人类单克隆抗CD3抗体结合人类T细胞并且诱导T细胞增殖。本发明的一些人类单克隆抗CD3抗体结合CD2+CD4+猴T细胞并且诱导其增殖。在基于钙黄绿素的U937杀伤分析法中，一些人类单克隆抗CD3抗体通过Fc/FcR相互相用支持重新引导的T细胞介导的杀伤。通过添加非特异性人类IgG(资料未展示)来遏制所观察到的杀伤，相信所述杀伤是取决于抗体与引起相邻T细胞上CD3的聚集的U937细胞上的Fc受体的Fc接合。用本文中所描述的抗CD3臂变异体(具体地说，基于衍生自IGHV3-9*01、IGHJ6*02、IGHD5-12*01的CD3-VH-P重链的抗CD3臂)构筑的广泛范围的双特异性抗体活化人类PBMC细胞和猴PBMC，并且对表达肿瘤抗原的细胞系显示细胞毒性活性。
实例16：适用于福尔马林(Formalin)固定的石蜡嵌入(FFPE)样品上的免疫组织化学(IHC)的抗MUC16单克隆抗体的筛选和鉴别。
鉴别具有已知的MUC16表达量的人类肿瘤细胞系，固定在10％中性缓冲福尔马林中并且包埋于石蜡中。这些细胞系用于筛选各种抗MUC16抗体以鉴别用于IHC研究的候选物。
细胞系包括以下MUC16阴性细胞系：
HT29(结肠)和PC3/ATCC亲本(前列腺)；具有低MUC16含量或不具有MUC16的胰腺细胞系：Capan1(胰腺癌)、HPAC(胰腺癌)。
内源性MUC16表达细胞系包括：OVCAR3(卵巢)和PEO-1(浆液性卵巢癌)。
经转染的细胞系如下经工程改造：PC3/ATCC(亲本前列腺癌品系)细胞经转染以产生PC3/MUC16“短”和PC3/MUC16“高”细胞系。两种构筑体都包括来自(SEQ ID NO:1899的)氨基酸13、810-14、507的MUC16的C端结构域，并且这包括一部分SEA12结构域、SEA13、SEA14、SEA15、SEA16、C端非SEA区域、跨膜区和细胞质域。此外，PC3/MUC高细胞具有(SEQ ID NO:1899的)其它N端氨基酸12783-13467，其包括SEA5(部分)到SEA9和SEA9结构域与MUC16短构筑体的起始处之间的短连接子。这实现在重复区域中结合的抗MUC16抗体与在重复区域(类似于MUC16的CA125部分)的酶促裂解和释放之后结合于与细胞膜相邻的MUC16的“nub”部分的抗体之间的分化。
使用标准方案，用Ventana Discovery XT自动染色仪进行所有染色。将细胞集结粒脱蜡，最佳化热诱导的表位检索，阻断内源性生物素并且进行蛋白质阻断。以10μg/ml的初始浓度人工施用抗体并且也以滴定方式降低以确保信号的特异性。针对可商购的抗MUC16抗体(OC-125，其对CA-125(Roche,Ventana目录号760-2610)具有特异性)和阴性对照物(不存在初级抗体)进行比较。相继用驴抗小鼠-生物素和抗生蛋白链菌素-辣根过氧化酶进行检测。观察到呈棕色染色形式的受质二-氨基联苯胺(DAB)的转化。用苏木精对样品进行对比染色以观察细胞核。染色实验的结果呈现于以下表26中。
表26：抗MUC16抗体与MUC16阴性细胞以及表达MUC16的细胞或MUC16的近膜部分的结合
NT-未测试
四种测试抗体(H1M7130N、H2aM7128N、H2aM7131N和H2aM7138N)展示与表达不具有重复区域(PC3/MUC16短)的MUC16的“nub”部分的细胞的阳性结合。这些抗体鉴别为“nub结合子”。一种测试抗体(H1M9519N)展示与表达MUC16的重复区域(PC3/MUC16高)的细胞的阳性结合，但展示与仅表达MUC16的“nub”部分(PC3/MUC16短)的细胞的阴性结合。这种抗体鉴别为“重复结合子”，与可商购的OC-125抗体类似。预期测试抗体结合具有如本文中所描述的表达蛋白质和/或蛋白质片段的不同来源的组织或细胞。
本发明的范围不受本文中所描述的具体实施例限制。实际上，根据前述说明，除本文中所描述的修改以外，本发明的各种修改对所属领域的技术人员来说也会变得显而易见。这类修改意图属于所附权利要求书的范围内。

Claims (18)

1.一种双特异性抗体或其抗原结合片段，其包含特异性结合人类CD3的第一抗原结合域和特异性结合人类MUC16的第二抗原结合域，其中所述第二抗原结合域包含分别由氨基酸序列SEQ ID NO:20-22-24-28-30-32组成的HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3域。
2.根据权利要求1所述的双特异性抗体或抗原结合片段，其包含由氨基酸序列SEQ IDNO:18组成的重链可变区和由氨基酸序列SEQ ID NO:26组成的轻链可变区。
3.据权利要求1或2所述的双特异性抗体或抗原结合片段，其中特异性结合人类CD3的第一抗原结合域包含分别由氨基酸序列组成的HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3，所述氨基酸序列选自由SEQ ID NO:1732-1734-1736-28-30-32、1764-1766-1768-28-30-32、1780-1782-1784-28-30-32、1788-1790-1792-28-30-32和1868-1870-1872-28-30-32组成的组。
4.根据权利要求3所述的双特异性抗体或抗原结合片段，其中结合人类CD3的第一抗原结合域包含重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)，所述重链可变区由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列选自由SEQ ID NO:1730、1762、1778、1786和1866组成的组，且所述轻链可变区(LCVR)由氨基酸序列SEQ ID NO:26组成。
5.根据权利要求3所述的双特异性抗体或抗原结合片段，其中第一抗原结合域包含HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3域，其分别由氨基酸序列SEQ ID NO:1732-1734-1736-28-30-32组成，且第二抗原结合域包含HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3域，其分别由氨基酸序列SEQ ID NO:20-22-24-28-30-32组成。
6.根据权利要求3所述的双特异性抗体或抗原结合片段，其中第一抗原结合域包含HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3域，其分别由氨基酸序列SEQ ID NO:1868-1870-1872-28-30-32组成，且第二抗原结合域包含HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3域，其分别由氨基酸序列SEQ ID NO:20-22-24-28-30-32组成。
7.根据权利要求5所述的双特异性抗体或抗原结合片段，其中第一抗原结合域包含由氨基酸序列SEQ ID NO:1730组成的HCVR和由氨基酸序列SEQ ID NO:26组成的LCVR，且其中第二抗原结合域包含由氨基酸序列SEQ ID NO:18组成的HCVR和由氨基酸序列SEQ ID NO:26组成的LCVR。
8.根据权利要求6所述的双特异性抗体或抗原结合片段，其中第一抗原结合域包含由氨基酸序列SEQ ID NO:1866组成的HCVR和由氨基酸序列SEQ ID NO:26组成的LCVR，且其中第二抗原结合域包含由氨基酸序列SEQ ID NO:18组成的HCVR和由氨基酸序列SEQ ID NO:26组成的LCVR。
9.根据权利要求7所述的双特异性抗体，其包含第一结合臂和第二结合臂，所述第一结合臂包含由氨基酸序列SEQ ID NO:1961组成的重链和由氨基酸序列SEQ ID NO:1960组成的轻链，并且所述第二结合臂包含由氨基酸序列SEQ ID NO:1959组成的重链和由氨基酸序列SEQ ID NO:1960组成的轻链。
10.根据权利要求8所述的双特异性抗体，其包含第一结合臂和第二结合臂，所述第一结合臂包含由氨基酸序列SEQ ID NO:1962组成的重链和由氨基酸序列SEQ ID NO:1960组成的轻链，并且所述第二结合臂包含由氨基酸序列SEQ ID NO:1959组成的重链和由氨基酸序列SEQ ID NO:1960组成的轻链。
11.一种医药组合物，其包含根据权利要求1至10中任一项所述的双特异性抗体或抗原结合片段和医药学上可接受的载体或稀释剂。
12.根据权利要求1至10中任一项所述的双特异性抗体或抗原结合片段或根据权利要求11所述的医药组合物在制备治疗卵巢癌的药物中的用途。
13.一种核酸分子，其包含编码权利要求1-10中任一项所述的双特异性抗体或抗原结合片段的核苷酸序列；第一组核酸分子，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列分别编码权利要求1-8中任一项所述的双特异性抗体或抗原结合片段的第一抗原结合域的重链可变区(HCVR)、第二抗原结合域的HCVR，和第一和第二抗原结合域的轻链可变区；或第二组核酸分子，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列分别编码权利要求9或10的双特异性抗体的第一结合臂的重链、第二结合臂的重链，以及第一和第二结合臂的轻链。
14.包含权利要求13的核酸分子的一种表达载体，或分别包含权利要求13所述的第一组或第二组核酸分子的一组表达载体。
15.宿主细胞，其包含权利要求1-10中任一项所述的双特异性抗体或抗原结合片段、权利要求13所述的核酸分子或核酸分子组、或权利要求14的表达载体或表达载体组。
16.一种生产权利要求1-10中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段的方法，包括在允许生产所述双特异性抗体或抗原结合片段的条件下培养权利要求15的宿主细胞，并回收由此生产的双特性抗体或抗原结合片段。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述宿主细胞是中国仓鼠卵巢细胞。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其进一步包括将所述双特异性抗体或抗原结合片段配制为具有合适载体的医药组合物。
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