BR112021003023A2

BR112021003023A2 - anticorpos anti-fc epsilon-r1 alfa (fcer1a), moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno que ligam fcer1a e cd3, e usos dos mesmos

Info

Publication number: BR112021003023A2
Application number: BR112021003023-9A
Authority: BR
Inventors: Jamie M. Orengo; Andre Limnander; Jee H Kim; Andrew J Murphy
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
Priority date: 2018-08-23
Filing date: 2019-08-22
Publication date: 2021-05-11
Also published as: CN112888482A; WO2020041537A1; MX2021002165A; JP2021533806A; KR20210049863A; CO2021003608A2; AU2019325565A1; PH12021550322A1; CL2021000437A1; SG11202101608XA; US20200062844A1; JP7402223B2; CL2023000442A1; IL280745A; US20230331845A1; US11578127B2; CA3109513A1; EP3840841A1; WO2020041537A8; EA202190601A1

Abstract

A presente invenção fornece anticorpos humanos de comprimento total que se ligam a Fc epsilon-R1 alfa humano (anticorpos monoespecíficos). A presente invenção também fornece anticorpos biespecíficos (bsAbs) que se ligam a ambos Fc epsilon-R1 alfa e CD3 e ativam células T por meio do complexo CD3 na presença de células que expressam Fc epsilon-R1 alfa. As moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno da invenção são úteis para o tratamento de doenças e distúrbios em que uma resposta imune direcionada a Fc epsilon-R1 alfa super-regulada ou induzida é desejada e/ou terapeuticamente benéfica. Por exemplo, os anticorpos biespecíficos da invenção são úteis para o tratamento de alergias, incluindo anafilaxia.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “ANTICORPOS ANTI-FC EPSILON-R1 ALFA (FCER1A),

MOLÉCULAS BIESPECÍFICAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO QUE LIGAM FCER1A E CD3, E USOS DOS MESMOS”

PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido está relacionado e reivindica prioridade do Pedido Provisório U.S. 62/721.921, depositado em 23 de agosto de

2018. Todo o conteúdo do pedido anterior é expressamente incorporado aqui por referência.

REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

[0002] Este pedido incorpora por referência a Listagem de Sequência enviada em formato legível por computador como arquivo 10480WO01_118003-45320_SL.txt, criado em 21 de agosto de 2019 e contendo 67.307 bytes.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0003] A presente invenção refere-se a anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, que são específicos para FcεR1α, e métodos de uso dos mesmos. A presente invenção também se refere a moléculas de ligação aa antígeno biespecíficas que se ligam a FcεR1α e CD3, e métodos de uso das mesmas.

ANTECEDENTES

[0004] FcεR1 é um receptor Fc de alta afinidade para a imunoglobulina E (IgE), e FcεR1 se liga a IgE com uma constante de dissociação de equilíbrio (KD) de cerca de 10-10 M. A reticulação do receptor FcεR1 por IgE ligada ao alérgeno leva à desgranulação celular e subsequente resposta alérgica, e o nível sérico de IgE é positivamente correlacionado com FcεR1.

[0005] O FcεR1 humano é expresso em mastócitos, basófilos, monócitos, macrófagos, mDCs, pDCs, células de Langerhans, eosinófilos e plaquetas. Mastócitos e basófilos são células efetoras inatas que desempenham um papel na alergia e anafilaxia por meio de reticulação mediada por alérgeno do receptor de IgE, FcɛR1α. Outras funções incluem cicatrização de feridas e imunidade da mucosa.

[0006] Existem dois tipos de receptores FcεR1 da superfície da célula multimérica humana, a forma tetramérica e a forma trimérica. O FcεR1 humano tetramérico compreende uma cadeia α, uma cadeia β e um homodímero de cadeias γ (αβγ2), e o FcεR1 humano trimérico compreende uma cadeia α e um homodímero de cadeias γ (αγ2). A cadeia α de FcεR1 liga-se a uma única molécula de anticorpo IgE, enquanto não há papel relatado para as cadeias β e γ na ligação do ligando.

[0007] FcεR1 humano liga-se a IgE humano e murino, e a interleucina-4 (IL-4) aumenta a expressão da cadeia α em humanos. Em contraste, o FcεR1 murino tem apenas a isoforma αβγ2 tetramérica e é expresso em mastócitos e basófilos. IL-4 não aumenta a expressão da cadeia α de FcεR1 murino.

[0008] CD3 é um antígeno homodimérico ou heterodimérico expresso em células T em associação com o complexo receptor de células T (TCR) e é necessário para a ativação de células T. O CD3 funcional é formado pela associação dimérica de duas de quatro cadeias diferentes: épsilon, zeta, delta e gama. Os arranjos diméricos de CD3 incluem gama/épsilon, delta/épsilon e zeta/zeta. Anticorpos contra CD3 mostraram agrupar CD3 em células T, causando assim a ativação de células T de uma maneira semelhante ao engajamento do TCR por moléculas MHC carregadas com peptídeo. Assim, anticorpos anti-CD3 têm sido propostos para fins terapêuticos envolvendo a ativação de células T.

[0009] Moléculas de ligação a antígeno que direcionam FcεR1α, bem como moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que se ligam a FcεR1α e CD3 seriam úteis em configurações terapêuticas em que o direcionamento específico e a morte mediada por células T de células que expressam FcεR1α é desejada.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0010] Em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam a FcεR1α humano. Os anticorpos de acordo com este aspecto são úteis, inter alia, para direcionar células que expressam FcεR1α. A presente invenção também fornece anticorpos biespecíficos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam a FcεR1α humano e CD3 humano. Os anticorpos biespecíficos de acordo com este aspecto são úteis, inter alia, para direcionar células T que expressam CD3 e para estimular a ativação de células T, por exemplo, sob circunstâncias em que a morte de células que expressam FcεR1α mediada por células T é benéfica ou desejável. Por exemplo, os anticorpos biespecíficos podem direcionar a ativação de células T mediada por CD3 para células específicas que expressam FcεR1α, tais como mastócitos ou basófilos.

[0011] Anticorpos anti-FcεR1α exemplificativos da presente invenção estão listados nas Tabelas 1 e 2 aqui. A Tabela 1 apresenta os identificadores de sequência de aminoácidos das regiões variáveis da cadeia pesada (HCVRs) e regiões variáveis da cadeia leve (LCVRs), bem como regiões determinantes de complementaridade da cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), regiões determinantes da complementaridade da cadeia leve (LCDR1 , LCDR2 e LCDR3), cadeia pesada (HC) e cadeia leve (LC) dos anticorpos anti-FcεR1α exemplificativos. A Tabela 2 apresenta os identificadores de sequência das moléculas de ácido nucleico que codificam as HCVRs, LCVRs, HCDR1, HCDR2 HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3, HC e LC dos anticorpos anti-FcεR1α exemplificativos.

[0012] A presente invenção fornece anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, compreendendo um HCVR compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCVR listadas na Tabela 1, ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95 %, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a mesma.

[0013] A presente invenção também fornece anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, compreendendo uma LCVR compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das sequências de aminoácidos de LCVR listadas na Tabela 1, ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a mesma.

[0014] A presente invenção também fornece anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, compreendendo uma HCVR e um par de sequência de aminoácidos de LCVR (HCVR/LCVR) compreendendo qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCVR listadas na Tabela 1 emparelhadas com qualquer uma das sequências de aminoácidos de LCVR listadas na Tabela 1. De acordo com certas modalidades, a presente invenção fornece anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, compreendendo um par de sequência de aminoácidos HCVR/LCVR contido em qualquer um dos anticorpos anti-FcεR1α exemplificativos listados na Tabela 1. Em certas modalidades, o par de sequência de aminoácidos de HCVR/LCVR é das SEQ ID NOs: 2/26, 10/26 ou 18/26 (por exemplo, mAb17110, mAb17111 ou mAb17112).

[0015] A presente invenção também fornece anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, compreendendo uma CDR1 da cadeia pesada (HCDR1) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCDR1 listadas na Tabela 1 ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.

[0016] A presente invenção também fornece anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, compreendendo uma CDR2 de cadeia pesada (HCDR2) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCDR2 listadas na Tabela 1 ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.

[0017] A presente invenção também fornece anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, compreendendo uma CDR3 da cadeia pesada (HCDR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCDR3 listadas na Tabela 1 ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.

[0018] A presente invenção também fornece anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, compreendendo uma CDR1 da cadeia leve (LCDR1) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das sequências de aminoácidos de LCDR1 listadas na Tabela 1 ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.

[0019] A presente invenção também fornece anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, compreendendo uma

CDR2 de cadeia leve (LCDR2) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das sequências de aminoácidos de LCDR2 listadas na Tabela 1 ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.

[0020] A presente invenção também fornece anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, compreendendo uma CDR3 da cadeia leve (LCDR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das sequências de aminoácidos de LCDR3 listadas na Tabela 1 ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.

[0021] A presente invenção também fornece anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, compreendendo uma HCDR3 e um par de sequência de aminoácidos de LCDR3 (HCDR3/LCDR3) compreendendo qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCDR3 listadas na Tabela 1 emparelhadas com qualquer uma das sequências de aminoácidos de LCDR3 listadas na Tabela 1. De acordo com certas modalidades, a presente invenção fornece anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, compreendendo um par de sequência de aminoácidos HCDR3/LCDR3 contido em qualquer um dos anticorpos anti-FcεR1α exemplificativos listados na Tabela 1. Em certas modalidades, o par de sequência de aminoácidos HCDR3/LCDR3 é das SEQ ID NOs: 8/32, 16/32 ou 24/32 (por exemplo, mAb17110, mAb17111, ou mAb17112).

[0022] A presente invenção também fornece anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, compreendendo um conjunto de seis CDRs (isto é, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-

LCDR2-LCDR3) contidas em qualquer um dos anticorpos anti-FcεR1α exemplificativos listados na Tabela 1. Em certas modalidades, o conjunto de sequências de aminoácidos HCDR1-HCDR2-HCDR3- LCDR1-LCDR2-LCDR3 é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 4-6-8-28-30-32, 12-14-16-28 -30-32 ou 20-22-24-28-30-32 (por exemplo, mAb17110, mAb17111, ou mAb17112).

[0023] Em uma modalidade relacionada, a presente invenção fornece anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, compreendendo um conjunto de seis CDRs (isto é, HCDR1-HCDR2- HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) contidas em um par de sequência de aminoácidos HCVR/LCVR como definido por qualquer um dos anticorpos anti-FcεR1α exemplificativos listados na Tabela 1. Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, compreendendo o conjunto de sequências de aminoácidos HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2- LCDR3 contidas dentro de um par de sequência de aminoácidos HCVR/LCVR de SEQ ID NOs: 2/26, 10/26, ou 18/26 (por exemplo, mAb17110, mAb17111, ou mAb17112). Os métodos e técnicas para identificar CDRs nas sequências de aminoácidos de HCVR e LCVR são bem conhecidos na técnica e podem ser utilizados para identificar CDRs dentro das sequências de aminoácidos de HCVR e/ou LCVR especificadas aqui divulgadas. Convenções exemplificativas que podem ser usadas para identificar os limites das CDRs incluem, por exemplo, a definição de Kabat, a definição de Chothia e a definição de AbM. Em termos gerais, a definição de Kabat é baseada na variabilidade de sequência, a definição de Chothia é baseada na localização das regiões de laço estrutural, e a definição de AbM é um compromisso entre as abordagens de Kabat e Chothia. Ver, por exemplo, Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:927-948

(1997); e Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272 (1989). Bancos de dados públicos também estão disponíveis para identificar sequências de CDR dentro de um anticorpo.

[0024] A presente invenção também fornece moléculas de ácido nucleico que codificam anticorpos anti-FcεR1α ou porções dos mesmos. Por exemplo, a presente invenção fornece moléculas de ácido nucleico que codificam qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCVR listadas na Tabela 1; em certas modalidades, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de polinucleotídeo selecionada de qualquer uma das sequências de ácido nucleico de HCVR listadas na Tabela 2, ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99 % de identidade de sequência com a mesma.

[0025] A presente invenção também fornece moléculas de ácido nucleico que codificam qualquer uma das sequências de aminoácidos de LCVR listadas na Tabela 1; em certas modalidades, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de polinucleotídeo selecionada de qualquer uma das sequências de ácido nucleico de LCVR listadas na Tabela 2, ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99 % de identidade de sequência com a mesma.

[0026] A presente invenção também fornece moléculas de ácido nucleico que codificam qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCDR1 listadas na Tabela 1; em certas modalidades, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de polinucleotídeo selecionada de qualquer uma das sequências de ácido nucleico de HCDR1 listadas na Tabela 2, ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99 % de identidade de sequência com a mesma.

[0027] A presente invenção também fornece moléculas de ácido nucleico que codificam qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCDR2 listadas na Tabela 1; em certas modalidades, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de polinucleotídeo selecionada de qualquer uma das sequências de ácido nucleico de HCDR2 listadas na Tabela 2, ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99 % de identidade de sequência com a mesma.

[0028] A presente invenção também fornece moléculas de ácido nucleico que codificam qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCDR3 listadas na Tabela 1; em certas modalidades, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de polinucleotídeo selecionada de qualquer uma das sequências de ácido nucleico de HCDR3 listadas na Tabela 2, ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99 % de identidade de sequência com a mesma.

[0029] A presente invenção também fornece moléculas de ácido nucleico que codificam qualquer uma das sequências de aminoácidos de LCDR1 listadas na Tabela 1; em certas modalidades, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de polinucleotídeo selecionada de qualquer uma das sequências de ácido nucleico de LCDR1 listadas na Tabela 2, ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99 % de identidade de sequência com a mesma.

[0030] A presente invenção também fornece moléculas de ácido nucleico que codificam qualquer uma das sequências de aminoácidos de LCDR2 listadas na Tabela 1; em certas modalidades, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de polinucleotídeo selecionada de qualquer uma das sequências de ácido nucleico de LCDR2 listadas na Tabela 2, ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99 % de identidade de sequência com a mesma.

[0031] A presente invenção também fornece moléculas de ácido nucleico que codificam qualquer uma das sequências de aminoácidos de LCDR3 listadas na Tabela 1; em certas modalidades, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de polinucleotídeo selecionada de qualquer uma das sequências de ácido nucleico de LCDR3 listadas na Tabela 2, ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99 % de identidade de sequência com a mesma.

[0032] A presente invenção também fornece moléculas de ácido nucleico que codificam uma HCVR, em que a HCVR compreende um conjunto de três CDRs (isto é, HCDR1-HCDR2-HCDR3), em que o conjunto de sequência de aminoácidos HCDR1-HCDR2-HCDR3 é conforme definido por qualquer um dos anticorpos anti-FcεR1α exemplificativos listados na Tabela 1.

[0033] A presente invenção também fornece moléculas de ácido nucleico que codificam uma LCVR, em que a LCVR compreende um conjunto de três CDRs (isto é, LCDR1-LCDR2-LCDR3), em que o conjunto de sequência de aminoácidos LCDR1-LCDR2-LCDR3 é conforme definido por qualquer um dos anticorpos anti-FcεR1α exemplificativos listados na Tabela 1.

[0034] A presente invenção também fornece moléculas de ácido nucleico que codificam uma HCVR e uma LCVR, em que a HCVR compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCVR listadas na Tabela 1, e em que a LCVR compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das sequências de aminoácidos de LCVR listadas na Tabela 1. Em certas modalidades, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência polinucleotídica selecionada de qualquer uma das sequências de ácido nucleico de HCVR listadas na Tabela 2, ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência e uma sequência polinucleotídica selecionada de qualquer uma das sequências de ácido nucleico de LCVR listadas na Tabela 2, ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% identidade de sequência com a mesma. Em certas modalidades de acordo com este aspecto da invenção, a molécula de ácido nucleico codifica uma HCVR e LCVR, em que a HCVR e a LCVR são ambas derivadas do mesmo anticorpo anti-FcεR1α listado na Tabela 1.

[0035] A presente invenção também fornece vetores de expressão recombinantes capazes de expressar um polipeptídeo compreendendo uma região variável da cadeia pesada ou leve de um anticorpo anti- FcεR1α. Por exemplo, a presente invenção inclui vetores de expressão recombinantes compreendendo qualquer uma das moléculas de ácido nucleico mencionadas acima, isto é, moléculas de ácido nucleico que codificam qualquer uma das sequências de HCVR, LCVR e/ou CDR conforme estabelecido na Tabela 1. Também incluídos no escopo da presente invenção estão as células hospedeiras nas quais tais vetores foram introduzidos, bem como métodos de produção de anticorpos ou porções dos mesmos por cultura das células hospedeiras em condições que permitem a produção dos anticorpos ou fragmentos de anticorpos,

e recuperação de anticorpos e fragmentos de anticorpos assim produzidos.

[0036] A presente invenção inclui anticorpos anti-FcεR1α tendo um padrão de glicosilação modificado. Em algumas modalidades, a modificação para remover sítios de glicosilação indesejáveis pode ser útil, ou um anticorpo sem uma fração de frutose presente na cadeia de oligossacarídeo, por exemplo, para aumentar a função de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) (ver Shield et al. (2002) JBC 277:26733). Em outras aplicações, a modificação da galactosilação pode ser feita a fim de modificar a citotoxicidade dependente do complemento (CDC).

[0037] Em outro aspecto, a invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo humano recombinante ou fragmento do mesmo que se liga especificamente a FcεR1α e um transportador farmaceuticamente aceitável. Em um aspecto relacionado, a invenção apresenta uma composição que é uma combinação de um anticorpo anti-FcεR1α e um segundo agente terapêutico. Em uma modalidade, o segundo agente terapêutico é qualquer agente que é vantajosamente combinado com um anticorpo anti-FcεR1α. Terapias de combinação adicionais e coformulações envolvendo os anticorpos anti-FcεR1α da presente invenção são divulgadas em outro lugar neste documento.

[0038] Em outro aspecto, a invenção fornece métodos terapêuticos para direcionar/matar células que expressam FcεR1α (por exemplo, mastócitos ou basófilos) usando um anticorpo anti-FcεR1α da invenção, em que os métodos terapêuticos compreendem administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo anti-FcεR1α da invenção a um sujeito em necessidade do mesmo. Em alguns casos, os anticorpos anti-FcεR1α (ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos) podem ser usados para o tratamento de alergia ou podem ser modificados para serem mais citotóxicos por métodos, incluindo, mas não se limitando a, domínios Fc modificados para aumentar ADCC (ver, por exemplo , Shield et al. (2002) JBC 277:26733), radioimunoterapia, conjugados anticorpo-droga ou outros métodos para aumentar a eficiência da morte de células que expressam FcεR1α.

[0039] A presente invenção também inclui o uso de um anticorpo anti-FcεR1α da invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença ou distúrbio (por exemplo, alergia) relacionada ou causada por células que expressam FcεR1α.

[0040] Em ainda outro aspecto, a invenção fornece anticorpos anti- FcεR1α monoespecíficos para aplicações de diagnóstico, tais como, por exemplo, reagentes de imageamento.

[0041] Em ainda outro aspecto, a invenção fornece métodos terapêuticos para estimular a ativação de células T usando um anticorpo anti-CD3 ou porção de ligação ao antígeno de um anticorpo da invenção, em que os métodos terapêuticos compreendem administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo da presente invenção.

[0042] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a FcεR1α humano ou se liga a (Macaca fascicularis) FcεR1α cynomolgus com uma constante de equilíbrio de dissociação de ligação (KD) inferior a cerca de 250 nM, conforme medido em um ensaio de ressonância plasmônica de superfície a 25ºC. Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a FcεR1α humano com uma meia-vida dissociativa (t½) maior que cerca de 0,54 minuto ou se liga a FcεR1α cynomolgus com uma meia-vida dissociativa (t½) maior que cerca de 0,6 minuto como medido em um ensaio de ressonância plasmônica de superfície a 25ºC.

[0043] A invenção fornece ainda um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que compete pela ligação a FcεR1α humano com um anticorpo de referência compreendendo um par de sequência de aminoácidos HCVR/LCVR conforme estabelecido na Tabela 1. Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que compete pela ligação ao FcεR1α humano com um anticorpo de referência compreendendo um par de sequência de aminoácidos HCVR/LCVR selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2/26; 10/26; e 18/26.

[0044] A invenção fornece, além disso, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga ao mesmo epitopo em FcεR1α humano como um anticorpo de referência compreendendo um par de sequência de aminoácidos HCVR/LCVR conforme estabelecido na Tabela 1. Em outro aspecto, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno se liga ao mesmo epitopo no FcεR1α humano como um anticorpo de referência compreendendo um par de sequência de aminoácidos HCVR/LCVR selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2/26; 10/26 e 18/26.

[0045] A invenção fornece ainda um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a FcεR1α humano, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende: as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de uma região variável da cadeia pesada (HCVR) com uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na Tabela 1; e as CDRs de uma região variável da cadeia leve (LCVR) com uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na Tabela 1. Em outro aspecto, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno compreende as CDRs da cadeia pesada e leve de um par de sequência de aminoácidos HCVR/LCVR selecionado do grupo que consiste em: 2/26; 10/26; e 18/26. Em ainda outro aspecto, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno compreende domínios HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2- LCDR3, respectivamente, selecionados do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 4-6-8-28-30- 32; 12-14-16-28-30-32; e 20-22-24-28-30-32

[0046] Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao FcεR1α humano, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: (a) uma região variável da cadeia pesada (HCVR) com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2, 10 e 18; e (b) uma região variável da cadeia leve (LCVR) com uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26. Em um aspecto adicional, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno é um par de sequências de aminoácidos de HCVR/LCVR selecionado do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 2/26; 10/26; e 18/26.

[0047] De acordo com outro aspecto, a presente invenção fornece moléculas de ligação a antígeno biespecíficas (por exemplo, anticorpos) que ligam FcεR1α e CD3. Essas moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas também são referidas aqui como "moléculas biespecíficas anti-FcεR1α/anti-CD3", "moléculas biespecíficas anti-CD3/anti- FcεR1α", "anti-FcεR1α x CD3," "anti-CD3 x FcεR1α ,” ou “FcεR1αxCD3 bsAbs.” A porção anti-FcεR1α da molécula biespecífica anti- FcεR1α/anti-CD3 é útil para direcionar células que expressam FcεR1α (por exemplo, mastócitos ou basófilos), e a porção anti-CD3 da molécula biespecífica é útil para ativar células T. A ligação simultânea de FcεR1α em mastócitos ou basófilos e CD3 em uma célula T facilita a morte dirigida (lise celular) dos mastócitos ou basófilos direcionados pela célula T ativada. As moléculas biespecíficas anti-FcεR1α/anti-CD3 da invenção são, portanto, úteis, inter alia, para o tratamento de doenças e distúrbios relacionados ou causados por células que expressam FcεR1α (por exemplo, alergia).

[0048] As moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas de acordo com este aspecto da presente invenção compreendem um primeiro domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a CD3 humano e um segundo domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a FcεR1α. A presente invenção inclui moléculas biespecíficas anti-FcεR1α/anti-CD3 (por exemplo, anticorpos biespecíficos) em que cada domínio de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada (HCVR) emparelhada com uma região variável da cadeia leve (LCVR). Em certas modalidades exemplificativas da invenção, o domínio de ligação ao antígeno anti- CD3 e o domínio de ligação ao antígeno anti-FcεR1α compreendem, cada um, HCVRs diferentes e distintas emparelhadas com uma LCVR comum. Por exemplo, conforme ilustrado no Exemplo 1 aqui, anticorpos biespecíficos foram construídos compreendendo um primeiro domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a CD3, em que o primeiro domínio de ligação ao antígeno compreende uma HCVR e uma LCVR, cada uma derivada de um anticorpo anti-CD3; e um segundo domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a FcεR1α, em que o segundo domínio de ligação ao antígeno compreende uma HCVR derivada de um anticorpo anti-FcεR1α emparelhado com a mesma LCVR. Em tais modalidades, o primeiro e o segundo domínios de ligação ao antígeno compreendem HCVRs anti-CD3 e anti-FcεR1α distintas, mas compartilham uma LCVR comum. A sequência de aminoácidos desta LCVR é mostrada, por exemplo, na SEQ ID NO: 26, e as sequências de aminoácidos das CDRs correspondentes (isto é, LCDR1-LCDR2-LCDR3) são mostradas nas SEQ ID NOs: 28, 30 e 32, respectivamente. Camundongos geneticamente modificados podem ser usados para produzir moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas totalmente humanas compreendendo duas cadeias pesadas diferentes que se associam a uma cadeia leve idêntica que compreende um domínio variável derivado de um de dois segmentos genéticos de região variável da cadeia leve humana diferentes. Alternativamente, as cadeias pesadas variáveis podem ser emparelhadas com uma cadeia leve comum e expressas de forma recombinante em células hospedeiras. Como tal, os anticorpos da invenção podem compreender cadeias pesadas de imunoglobulina associadas a uma única cadeia leve rearranjada. Em algumas modalidades, a cadeia leve compreende um domínio variável derivado de um segmento genético Vκ1-39 humano ou um segmento genético Vκ3-20. Em outras modalidades, a cadeia leve compreende um domínio variável derivado de um segmento genético Vκ1-39 humano rearranjado com um segmento genético Jκ5 humano ou Jκ1 humano (WO 2017/053856, aqui incorporado por referência).

[0049] A presente invenção fornece moléculas biespecíficas anti- CD3/anti-FcεR1α, em que o primeiro domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a CD3 compreende qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCVR, qualquer uma das sequências de aminoácidos de LCVR, qualquer um dos pares de sequência de aminoácidos de HCVR/LCVR, qualquer uma das sequências de aminoácidos CDR1-CDR2-CDR3 da cadeia pesada ou qualquer uma das sequências de aminoácidos CDR1-CDR2-CDR3 da cadeia leve conforme estabelecido na publicação US 2014/0088295 publicada em 27 de março de 2014 e WO 2018/067331 publicado em 12 de abril de

2018.

[0050] Além disso, a presente invenção fornece moléculas biespecíficas anti-CD3/anti-FcεR1α, em que o primeiro domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a CD3 compreende qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCVR conforme estabelecido na Tabela 3 aqui. O primeiro domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a CD3 também pode compreender qualquer uma das sequências de aminoácidos de LCVR conforme estabelecido nas Tabelas 1 e 3 aqui. A presente invenção também fornece moléculas biespecíficas anti-CD3/anti-FcεR1α, em que o primeiro domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a CD3 compreende qualquer uma das sequências de aminoácidos CDR1- CDR2-CDR3 da cadeia pesada conforme estabelecido na Tabela 3, e/ou qualquer uma das sequências de aminoácidos CDR1-CDR2-CDR3 da cadeia leve conforme estabelecido nas Tabelas 1 e 3 aqui.

[0051] De acordo com certas modalidades, a presente invenção fornece moléculas biespecíficas anti-CD3/anti-FcεR1α, em que o primeiro domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a CD3 compreende uma região variável da cadeia pesada (HCVR) com uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na Tabela 1 aqui ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.

[0052] A presente invenção também fornece moléculas biespecíficas anti-CD3/anti-FcεR1α, em que o primeiro domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a CD3 compreende uma região variável da cadeia leve (LCVR) tendo uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido nas Tabelas 1 e 3 neste documento, ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.

[0053] A presente invenção também fornece moléculas biespecíficas anti-CD3/anti-FcεR1α, em que o primeiro domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a CD3 compreende um par de sequência de aminoácidos HCVR e LCVR (HCVR/LCVR), conforme estabelecido na Tabela 3 neste documento.

[0054] A presente invenção também fornece moléculas biespecíficas anti-CD3/anti-FcεR1α, em que o primeiro domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a CD3 compreende um domínio CDR3 (HCDR3) da cadeia pesada com uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na Tabela 3 neste documento, ou um sequência substancialmente semelhante a esta tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; e um domínio CDR3 da cadeia leve (LCDR3) tendo uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido nas Tabelas 1 e 3 aqui, ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.

[0055] Em certas modalidades, o primeiro domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a CD3 compreende um par de sequências de aminoácidos HCDR3/LCDR3 conforme estabelecido na Tabela 3 neste documento.

[0056] A presente invenção também fornece moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-FcεR1α, em que o primeiro domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a CD3 compreende um domínio CDR1 (HCDR1) de cadeia pesada com um aminoácido conforme estabelecido na Tabela 3 aqui, ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; um domínio CDR2 (HCDR2) de cadeia pesada tendo um aminoácido conforme estabelecido na Tabela 3, ou uma sequência substancialmente semelhante ao mesmo tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; um domínio CDR3 de cadeia pesada (HCDR3) tendo um aminoácido conforme estabelecido na Tabela 3, ou uma sequência substancialmente semelhante ao mesmo tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; um domínio CDR1 (LCDR1) de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido nas Tabelas 1 e 3 aqui, ou uma sequência substancialmente semelhante tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% identidade de sequência; um domínio CDR2 (LCDR2) de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido nas Tabelas 1 e 3 aqui, ou uma sequência substancialmente semelhante desta tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% identidade de sequência e um domínio CDR3 de cadeia leve (LCDR3) tendo uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido nas Tabelas 1 e 3 aqui, ou uma sequência substancialmente semelhante desta tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.

[0057] Determinadas moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas exemplificativas não limitativas, anti-CD3/anti-FcεR1α da invenção incluem um primeiro domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a CD3 compreendendo domínios HCDR1-HCDR2- HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3, respectivamente, tendo as sequências de aminoácidos conforme estabelecido na Tabela 3 aqui.

[0058] A presente invenção fornece ainda uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, em que o primeiro domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a CD3 humano compreende regiões determinantes de complementaridade da cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) de uma região variável da cadeia pesada (HCVR) compreendendo uma sequência de aminoácido conforme estabelecido na Tabela 3 e regiões determinantes de complementaridade da cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3) de uma região variável da cadeia leve (LCVR) compreendendo uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido nas Tabelas 1 e 3.

[0059] Em outro aspecto, a invenção fornece uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica em que o primeiro domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a CD3 humano compreende regiões determinantes de complementaridade da cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) de uma região variável da cadeia pesada (HCVR) compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 42; e as regiões determinantes de complementaridade da cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3) de uma região variável da cadeia leve (LCVR) compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26.

[0060] A invenção fornece ainda uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, em que o primeiro domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a CD3 humano compreende HCDR1- HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID Nos: 44-46-48 -28-30-32.

[0061] Em um outro aspecto, a invenção fornece uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, em que o primeiro domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a CD3 humano compreende as CDRs da cadeia pesada e leve de um par de sequência de aminoácidos HCVR/LCVR de SEQ ID NO: 42/26

[0062] Em mais modalidades, as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas exemplificativas anti-CD3/anti-FcεR1α da invenção incluem uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, em que o primeiro domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a CD3 humano compreende uma HCVR compreendendo HCDR1- HCDR2-HCDR3 tendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 44-46-48.

[0063] A presente invenção também fornece moléculas biespecíficas anti-CD3/anti-FcεR1α, em que o segundo domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a FcεR1α compreende uma região variável da cadeia pesada (HCVR) tendo a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2, 10 e 18, ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.

[0064] A presente invenção também fornece moléculas biespecíficas anti-CD3/anti-FcεR1α, em que o segundo domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a FcεR1α compreende uma região variável da cadeia leve (LCVR) com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, ou uma sequência semelhante à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.

[0065] A presente invenção também fornece moléculas biespecíficas anti-CD3/anti-FcεR1α, em que o segundo domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a FcεR1α compreende um par de sequências de aminoácidos de HCVR e LCVR (HCVR/LCVR) selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2/26, 10/26 e 18/26.

[0066] A presente invenção também fornece moléculas biespecíficas anti-CD3/anti-FcεR1α, em que o segundo domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a FcεR1α compreende um domínio CDR3 (HCDR3) da cadeia pesada com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 8, 16 e 24, ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; e um domínio CDR3 da cadeia leve (LCDR3) tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.

[0067] Em certas modalidades, o segundo domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a FcεR1α compreende um par de sequência de aminoácidos HCDR3/LCDR3 selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 8/32, 16/32 e 24/32.

[0068] A presente invenção também fornece moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-FcεR1α, em que o segundo domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a FcεR1α compreende um domínio CDR1 (HCDR1) de cadeia pesada com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 4, 12 e 20, ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; um domínio CDR2 (HCDR2) de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 6, 14 e 22, ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98 % ou pelo menos 99% de identidade de sequência; um domínio CDR3 de cadeia pesada (HCDR3) tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 8, 16 e 24, ou uma sequência substancialmente semelhante desta tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98 % ou pelo menos 99% de identidade de sequência; um domínio CDR1 (LCDR1) de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 28, ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; e um domínio CDR2 (LCDR2) de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; e um domínio CDR3 de cadeia leve (LCDR3) tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 32, ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.

[0069] Certas moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas exemplificativas não limitativas, anti-CD3/anti-FcεR1α da invenção incluem um segundo domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a FcεR1α compreendendo HCDR1-HCDR2-HCDR3- LCDR1-LCDR2-LCDR3, respectivamente, tendo as sequências de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 4- 6-8-28-30-32, 12-14-16-28-30-32 e 20-22-24-28-30-32.

[0070] Em uma modalidade relacionada, a invenção inclui moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-FcεR1α, em que o segundo domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a FcεR1α compreende os domínios CDR da cadeia pesada e leve contidos nas sequências da região variável da cadeia pesada e leve (HCVR/LCVR) selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2/26, 10/26 e 18/26.

[0071] Em outro aspecto, a invenção fornece uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo: (a) um primeiro domínio de ligação ao antígeno que compreende três regiões determinantes de complementaridade da cadeia pesada HCDR1, HCDR2 e HCDR3, respectivamente, compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 44, 46 e 48, e três regiões determinantes de complementaridade da cadeia leve LCDR1, LCDR2 e LCDR3, respectivamente, compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 28, 30 e 32, em que o primeiro domínio de ligação ao antígeno se liga especificamente a CD3 humano; e (b) um segundo domínio de ligação ao antígeno que compreende três regiões determinantes de complementaridade da cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) e três regiões determinantes da complementaridade da cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3); em que HCDR1 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 4, 12 e 20; HCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 6, 14 e 22; HCDR3 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 8, 16 e 24; LCDR1 compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; LCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30; e LCDR3 compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, em que o segundo braço de ligação ao antígeno se liga especificamente a FcεR1α humano.

[0072] Em outro aspecto, a invenção fornece uma molécula de ligação a antígeno biespecífica compreendendo um primeiro domínio de ligação a antígeno que se liga a CD3 humano e um segundo domínio de ligação a antígeno que se liga a FcεR1α humano, em que o segundo domínio de ligação a antígeno é derivado do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de qualquer um dos anticorpos anti-FcεR1α da invenção. Em um aspecto adicional, a invenção fornece uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo um primeiro domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a CD3 humano e um segundo domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a FcεR1α humano.

[0073] A invenção fornece ainda uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que se liga a células humanas que expressam CD3 humano. Em outro aspecto, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica se liga a células humanas que expressam FcεR1α humano e/ou células que expressam FcεR1α cynomolgus.

[0074] Em outro aspecto, a invenção fornece uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que inibe a reação alérgica em um sujeito (por exemplo, camundongos) que expressa FcεR1α humano. A invenção fornece ainda moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que depletam basófilos ou outras células que expressam FcεR1α em um sujeito (por exemplo, camundongos) que expressa FcεR1α humano.

[0075] Em outro aspecto, a invenção fornece uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo um segundo domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a uma célula alvo que expressa FcεR1α humano com uma razão de ligação maior que 200 na presença ou ausência de IgE ou se liga a uma célula alvo expressando FcεR1α cynomolgus com uma razão de ligação superior a 140 na presença ou ausência de IgE, em que tal razão de ligação é medida em um ensaio de ligação n in vitro FACS.

[0076] Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno induz a morte mediada por células T de expressão de FcεR1α com um valor de EC50 inferior a cerca de 20 nM, conforme medido em um ensaio de morte celular mediada por células T in vitro , por exemplo, onde as células que expressam FcεR1α são basófilos.

[0077] Em algumas aplicações, o segundo domínio de ligação ao antígeno liga FcεR1α humano ou cynomolgus com um KD value inferior a cerca de 467 nM, conforme medido em um ensaio de ligação de ressonância plasmônica de superfície in vitro a 25 ºC. Em alguns casos, o segundo domínio de ligação ao antígeno liga cada um de FcεR1α humano e FcεR1α cynomolgus com um valor de KD inferior a cerca de 450 nM, inferior a cerca de 400 nM, inferior a cerca de 350 nM, inferior a cerca de 300 nM, inferior a cerca de 250 nM, inferior a cerca de 200 nM,inferior a cerca de 150 nM, inferior a cerca de 100 nM ou inferior a cerca de 50 nM.

[0078] Em certas modalidades, os anticorpos anti-FcεR1α da invenção, fragmentos de ligação ao antígeno e anticorpos biespecíficos dos mesmos foram feitos substituindo resíduos de aminoácidos de um parental de uma maneira gradual com base nas diferenças entre a sequência da linhagem germinativa e a sequência do anticorpo parental.

[0079] Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica isolada que compete pela ligação a FcεR1α, ou se liga ao mesmo epitopo em FcεR1α como um anticorpo de referência, em que o anticorpo de referência compreende um primeiro domínio de ligação ao antígeno compreendendo um par de sequências HCVR/LCVR compreendendo as sequências de aminoácido da SEQ ID NOs: 42/26, e um segundo domínio de ligação ao antígeno compreendendo um par HCVR/LCVR compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2/26, 10/26 ou 18/26.

[0080] Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica isolada que compete pela ligação a CD3 humano, ou se liga ao mesmo epitopo em CD3 humano como um anticorpo de referência, em que o anticorpo de referência compreende um primeiro domínio de ligação ao antígeno compreendendo um par HCVR/LCVR compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 42/26 e um segundo domínio de ligação ao antígeno compreendendo um par HCVR/LCVR compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2/26, 10/26 ou 18/26.

[0081] Qualquer uma das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas discutidas acima ou aqui pode ser um anticorpo biespecífico. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico compreende uma região constante da cadeia pesada de IgG humana. Em uma modalidade, a região constante da cadeia pesada de IgG humana é o isótipo IgG1. Em uma modalidade, a região constante da cadeia pesada de IgG humana é o isótipo IgG4. Em várias modalidades, o anticorpo biespecífico compreende uma dobradiça quimérica que reduz a ligação do receptor Fcγ em relação a uma dobradiça de tipo selvagem do mesmo isótipo.

[0082] A presente invenção também fornece anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, compreendendo um par de sequências de aminoácidos da cadeia pesada (HC) e da cadeia leve (LC) (HC/LC) compreendendo qualquer uma das sequências de aminoácidos de HC listadas na Tabela 1 emparelhada com qualquer uma das sequências de aminoácidos de LC listadas na Tabela 1. De acordo com certas modalidades, a presente invenção fornece anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, compreendendo um par de sequência de aminoácidos HC/LC contido em qualquer um dos anticorpos anti-FcεR1α exemplificativos listados na Tabela 1. Em certas modalidades, o par de sequências de aminoácidos HC/LC é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 34/40, 36/40 e 38/40.

[0083] A presente invenção também fornece anticorpos biespecíficos, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, compreendendo uma primeira cadeia pesada, uma segunda cadeia pesada e uma cadeia leve comum compreendendo qualquer uma das sequências de aminoácidos HC ou LC listadas na Tabela 7. Em certas modalidades, os anticorpos biespecíficos compreendem um primeiro HC compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56; uma segunda HC compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 50, 52 e 54; e uma cadeia leve comum compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40.

[0084] Em um aspecto, a invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo uma molécula de ligação ao antígeno anti-FcεR1α ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica anti- FcεR1α/anti-CD3 e um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável. A invenção fornece ainda um método para o tratamento de uma doença relacionada ao FcεR1α, alergia ou uma doença relacionada à IgE em um sujeito, o método compreendendo administrar ao sujeito a composição farmacêutica que compreende uma molécula de ligação ao antígeno anti-FcεR1α ou molécula de ligação ao antígeno biespecífico anti-FcεR1α/anti-CD3 e um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, a alergia ou outras doenças relacionadas a IgE são selecionadas do grupo que consiste em asma alérgica, rinite alérgica, febre do feno, anafilaxia, dermatite atópica, urticária crônica, alergia alimentar, alergia perene, alergia a drogas e alergia ao pólen. Em uma modalidade, a alergia é uma alergia grave. Em alguns casos, a alergia leva à anafilaxia. Em certas modalidades, a doença relacionada ao FcεR1α compreende alergia grave, distúrbio de ativação de mastócitos ou mastocitose. Em certas modalidades, o método para o tratamento de alergia compreende administrar ao sujeito da composição farmacêutica que compreende uma molécula de ligação ao antígeno anti-FcεR1α ou molécula de ligação ao antígeno biespecífico anti-FcεR1α/anti-CD3 em uma certa dose, conforme descrito em outro lugar neste documento.

[0085] Em outro aspecto, a presente invenção fornece moléculas de ácido nucleico que codificam qualquer uma das sequências de HCVR, LCVR ou CDR do anti-FcεR1α e moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-FcεR1α divulgadas neste documento, incluindo moléculas de ácido nucleico compreendendo as sequências polinucleotídicas conforme estabelecidas nas Tabelas 2 e 4 neste documento, bem como moléculas de ácido nucleico compreendendo duas ou mais das sequências polinucleotídicas conforme estabelecidas nas Tabelas 2 e 4 em qualquer combinação funcional ou arranjo das mesmas. Os vetores de expressão recombinantes que transportam os ácidos nucleicos da invenção e as células hospedeiras nas quais esses vetores foram introduzidos também são abrangidos pela invenção, assim como os métodos de produção dos anticorpos por cultura das células hospedeiras sob condições que permitem a produção dos anticorpos e recuperação dos anticorpos produzidos.

[0086] A presente invenção fornece moléculas de ácido nucleico que codificam qualquer uma das sequências de aminoácidos da cadeia pesada listadas na Tabela 7. A presente invenção também fornece moléculas de ácido nucleico que codificam qualquer uma das sequências de aminoácidos da cadeia leve listadas na Tabela 7.

[0087] A presente invenção inclui moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-FcεR1α, em que qualquer um dos domínios de ligação ao antígeno acima mencionados que se ligam especificamente a CD3 são combinados, conectados ou de outra forma associados a qualquer um dos domínios de ligação ao antígeno mencionados que ligam especificamente FcεR1α para formar uma molécula de ligação a antígeno biespecífica que liga a CD3 e FcεR1α.

[0088] A presente invenção inclui moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-FcεR1α tendo um padrão de glicosilação modificado. Em algumas aplicações, a modificação para remover sítios de glicosilação indesejáveis pode ser útil, ou um anticorpo sem uma fração de frutose presente na cadeia de oligossacarídeo, por exemplo, para aumentar a função de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) (ver Shield et al. (2002) JBC 277:26733). Em outras aplicações, a modificação da galactosilação pode ser feita a fim de modificar a citotoxicidade dependente do complemento (CDC).

[0089] Em outro aspecto, a invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica anti-CD3/anti-FcεR1α como divulgado neste documento e um transportador farmaceuticamente aceitável. Em um aspecto relacionado, a invenção apresenta uma composição que é uma combinação de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica anti- CD3/anti-FcεR1α e um segundo agente terapêutico. Em uma modalidade, o segundo agente terapêutico é qualquer agente que é vantajosamente combinado com uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica anti-CD3/anti-FcεR1α. Agentes exemplificativos que podem ser vantajosamente combinados com uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica anti-CD3/anti-FcεR1α são discutidos em detalhes em outro lugar neste documento.

[0090] Em ainda outro aspecto, a invenção fornece métodos terapêuticos para direcionar/ablar células que expressam FcεR1α usando uma molécula de ligação ao antígeno biespecífico anti- CD3/anti-FcεR1α da invenção, em que os métodos terapêuticos compreendem administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica que compreende uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica anti-CD3/anti-FcεR1α da invenção a um sujeito em necessidade do mesmo. O anticorpo ou fragmento do mesmo pode ser administrado por via subcutânea, intravenosa, intradérmica, intraperitoneal, oral ou intramuscular. Em certas modalidades, um anticorpo da invenção é administrado em uma dose de cerca de 0,001 mg/kg de peso corporal a cerca de 200 mg/kg de peso corporal do sujeito. Em certas modalidades, um anticorpo da invenção é administrado em uma dose que compreende entre 1 mg a 2500 mg do anticorpo a um sujeito em necessidade do mesmo.

[0091] A presente invenção também inclui o uso de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica anti-CD3/anti-FcεR1α da invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença ou distúrbio relacionado ou causado por células que expressam FcεR1α.

[0092] Outras modalidades ficarão evidentes a partir de uma revisão da descrição detalhada que se segue.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0093] Antes da presente invenção ser descrita, deve-se entender que esta invenção não está limitada a métodos particulares e condições experimentais descritas, uma vez que tais métodos e condições podem variar. Também deve-se entender que a terminologia usada neste documento tem a finalidade de descrever modalidades específicas apenas e não pretende limitar o escopo da presente invenção, o qual será limitado somente pelas reivindicações anexas.

[0094] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos utilizados aqui têm o mesmo significado conforme comumente entendido por um versado na técnica à qual esta invenção pertence. Como utilizado neste documento, o termo "cerca de", quando utilizado em referência a um valor numérico particular recitado, significa que o valor pode variar do valor indicado em não mais que 1%. Por exemplo, como utilizado neste documento, a expressão "cerca de 100" inclui 99 e 101 e todos os valores entre (por exemplo, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, etc.).

[0095] Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos neste documento possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, os métodos e materiais preferidos são agora descritos. Todas as patentes, pedidos de patente e publicações não patenteadas mencionadas neste relatório descritivo são aqui incorporadas por referência na sua totalidade. Definições

[0096] A expressão "CD3", como utilizado neste documento, refere- se a um antígeno que é expresso em células T como parte do receptor de células T multimolecular (TCR) e que consiste em um homodímero ou heterodímero formado a partir da associação de duas de quatro cadeias de receptor: CD3-epsilon, CD3-delta, CD3-zeta e CD3-gama. Todas as referências a proteínas, polipeptídeos e fragmentos de proteína da presente invenção referem-se à versão humana da respectiva proteína, polipeptídeo ou fragmento de proteína, a menos que explicitamente especificadas como sendo de uma espécie não humana. Assim, a expressão "CD3" significa CD3 humano, a menos que especificado como sendo de uma espécie não humana, por exemplo, "CD3 de camundongo", "CD3 de macaco", etc. CD3-epsilon humano compreende a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 59; CD3-delta humano compreende a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 60; CD3-zeta compreende a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 61; e CD3-gama compreende a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 62.

[0097] Como utilizado neste documento, "um anticorpo que se liga a CD3" ou um "anticorpo anti-CD3" inclui anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que reconhecem especificamente uma única subunidade CD3 (por exemplo, epsilon, delta, gama ou zeta), bem como anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno que reconhecem especificamente um complexo dimérico de duas subunidades CD3 (por exemplo, dímeros CD3 gama/épsilon, delta/épsilon e zeta/zeta). Os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno da presente invenção podem ligar CD3 solúvel e/ou CD3 expresso na superfície celular. CD3 solúvel inclui proteínas CD3 naturais, bem como variantes de proteína CD3 recombinante, tais como, por exemplo, construtos CD3 monoméricos e diméricos, que não possuem um domínio transmembranar ou não estão associados a uma membrana celular.

[0098] Como utilizado neste documento, a expressão "CD3 expresso na superfície celular" significa uma ou mais proteína(s) CD3 que é/são expressa(s) na superfície de uma célula in vitro ou in vivo, de modo que pelo menos uma porção de uma proteína CD3 seja exposta ao lado extracelular da membrana celular e é acessível a uma porção de ligação ao antígeno de um anticorpo. "CD3 expresso na superfície celular" inclui proteínas CD3 contidas no contexto de um receptor funcional de células T na membrana de uma célula. A expressão "CD3 expresso na superfície celular" inclui a proteína CD3 expressa como parte de um homodímero ou heterodímero na superfície de uma célula (por exemplo, dímeros CD3 gama/épsilon, delta/épsilon e zeta/zeta). A expressão "CD3 expresso na superfície celular" também inclui uma cadeia CD3 (por exemplo, CD3-epsilon, CD3-delta ou CD3-gama) que é expressa por si mesma, sem outros tipos de cadeia CD3, na superfície de uma célula. Um "CD3 expresso na superfície celular" pode compreender ou consistir em uma proteína CD3 expressa na superfície de uma célula que normalmente expressa a proteína CD3. Alternativamente, "CD3 expresso na superfície celular" pode compreender ou consistir em proteína CD3 expressa na superfície de uma célula que normalmente não expressa CD3 humano em sua superfície, mas foi artificialmente engenheirada para expressar CD3 em sua superfície.

[0099] A expressão “FcεR1α”, como utilizada neste documento, refere-se a uma cadeia α do receptor Fc de alta afinidade (FcεR1) para IgE. FcεR1α é responsável pela ligação de IgE a FcεR1. FcεR1α é expresso em mastócitos, basófilos, monócitos, macrófagos, mDCs, pDCs, células de Langerhans, eosinófilos e plaquetas. A sequência de aminoácidos de FcεR1α humano é apresentada como SEQ ID NO: 63. O termo “FcεR1α” inclui a proteína FcεR1α recombinante ou um fragmento da mesma. O termo também abrange a proteína FcεR1α ou um fragmento da mesma acoplado a, por exemplo, etiqueta de histidina, Fc de camundongo ou humano, ou uma sequência de sinal, como ROR1 (por exemplo, SEQ ID NOs: 57 ou 58).

[00100] Como utilizado neste documento, "um anticorpo que liga FcεR1α" ou um "anticorpo anti-FcεR1α" inclui anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que reconhecem especificamente

FcεR1α.

[00101] Como utilizado neste documento, o termo "doença ou distúrbio associado à expressão de FcεR1α" inclui qualquer doença ou distúrbio em que se espera que a inibição da expressão e/ou atividade (por exemplo, sinalização) de FcεR1α e/ou ablação de células que expressam FcεR1α alivie os sintomas e/ou progressão da doença. Por exemplo, tais doenças e distúrbios incluem, mas não estão limitados a distúrbios de ativação de mastócitos, mastocitose e alergia, incluindo, mas não se limitando a, alergia alimentar, alergia a pólen, alergia a pelos de animais, etc.

[00102] O termo "alergia", como utilizado neste documento, refere-se a uma condição causada pela hipersensibilidade do sistema imunológico a uma substância (alérgeno) no meio ambiente. As alergias incluem, mas não estão limitadas a asma alérgica, febre do feno, dermatite atópica, urticária crônica, alergia alimentar, alergia a pelos de animais e alergia ao pólen. Os sintomas de alergias podem incluir, mas não estão limitados a urticária (por exemplo, urticária), angioedema, rinite, asma, vômitos, espirros, coriza, falta de ar, inflamação dos seios da face, olhos lacrimejantes, respiração ruidosa, broncoespasmo, fluxo expiratório máximo reduzido (PEF), desconforto gastrointestinal, rubor, lábios inchados, língua inchada, pressão arterial reduzida, anafilaxia e disfunção/falência orgânica. Em uma modalidade, a alergia é uma alergia anafilática, que é uma forma grave de alergia que pode causar a morte. Os sintomas de anafilaxia podem incluir, mas não estão limitados a erupções cutâneas, inchaço da língua ou garganta, inchaço das vias aéreas, falta de ar, vômitos, tontura, pressão arterial baixa, etc.

[00103] O termo "alérgeno", como utilizado neste documento, inclui qualquer substância, produto químico, partícula ou composição que seja capaz de estimular uma resposta alérgica em um indivíduo suscetível. Alérgenos podem estar contidos ou derivados de um item alimentar,

como, por exemplo, produtos lácteos (por exemplo, leite de vaca), ovo, aipo, gergelim, trigo, soja, peixe, marisco, açúcares (por exemplo, açúcares presentes na carne, como alfa-galactose), amendoim, outras leguminosas (por exemplo, feijão, ervilha, soja, etc.) e nozes. Alternativamente, um alérgeno pode estar contido ou derivado de um item não alimentar, como, por exemplo, poeira (por exemplo, contendo ácaros), pólen, veneno de inseto (por exemplo, veneno de abelhas, vespas, mosquitos, formigas de fogo, etc. ), mofo, pele de animal, pêlos de animais, lã, látex, metais (por exemplo, níquel), produtos de limpeza doméstica, detergentes, medicamentos, cosméticos (por exemplo, perfumes, etc.), drogas (por exemplo, penicilina, sulfonamidas, salicilato, etc. ), anticorpos monoclonais terapêuticos (por exemplo, cetuximabe), tasneira, grama e bétula. Exemplos de alérgenos de pólen incluem, por exemplo, pólen de árvore, como pólen de bétula, pólen de cedro, pólen de carvalho, pólen de amieiro, pólen de carpa, pólen de aesculus, pólen de salgueiro, pólen de choupo, pólen de plantano, pólen de tília, pólen de olea, pólen de zimbro de Ashe e pólen de Alstonia scholaris.

[00104] O termo "molécula de ligação ao antígeno" inclui anticorpos e fragmentos de anticorpos de ligação ao antígeno, incluindo, por exemplo, anticorpos biespecíficos.

[00105] O termo "anticorpo", como utilizado neste documento, significa qualquer molécula de ligação ao antígeno ou complexo molecular compreendendo pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) que se liga especificamente ou interage com um antígeno particular (por exemplo, FcεR1α ou CD3). O termo "anticorpo" inclui moléculas de imunoglobulina compreendendo quatro cadeias polipeptídicas, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interligadas por ligações dissulfeto, bem como multímeros das mesmas (por exemplo, IgM). Cada cadeia pesada compreende uma região variável da cadeia pesada (aqui abreviada como HCVR ou VH) e uma região constante da cadeia pesada. A região constante da cadeia pesada compreende três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve compreende uma região variável da cadeia leve (abreviada aqui como LCVR ou VL) e uma região constante da cadeia leve. A região constante da cadeia leve compreende um domínio (CL1). As regiões VH e VL podem ser ainda subdivididas em regiões de hipervariabilidade, designadas regiões que determinam complementaridade (CDRs), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões estruturais (FR). Cada VH e VL é composto por três CDRs e quatro FRs, dispostas a partir do terminal amino para o terminal carbóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. Em diferentes modalidades da invenção, as FRs do anticorpo anti-FcεR1α ou anticorpo anti-CD3 (ou porção de ligação ao antígeno dos mesmos) podem ser idênticas às sequências da linhagem germinativa humana ou podem ser modificadas natural ou artificialmente. Uma sequência de consenso de aminoácidos pode ser definida com base em uma análise lado a lado de duas ou mais CDRs.

[00106] O termo "anticorpo", como utilizado neste documento, também inclui fragmentos de ligação ao antígeno de moléculas de anticorpo completas. Os termos "porção de ligação ao antígeno" de um anticorpo, "fragmento de ligação ao antígeno" de um anticorpo e semelhantes, como utilizados neste documento, incluem qualquer polipeptídeo ou glicoproteína de ocorrência natural, obtido enzimaticamente, sintético ou geneticamente modificado que se liga especificamente a um antígeno para formar um complexo. Os fragmentos de ligação ao antígeno de um anticorpo podem ser derivados, por exemplo, de moléculas de anticorpo completas usando quaisquer técnicas padrão adequadas, tais como digestão proteolítica ou técnicas de engenharia genética recombinante envolvendo a manipulação e expressão de DNA codificador de anticorpos variáveis e opcionalmente domínios constantes. Tal DNA é conhecido e/ou está prontamente disponível de, por exemplo, fontes comerciais, bibliotecas de DNA (incluindo, por exemplo, bibliotecas de fago-anticorpo) ou pode ser sintetizado. O DNA pode ser sequenciado e manipulado quimicamente ou utilizando técnicas de biologia molecular, por exemplo, para organizar um ou mais domínios variáveis e/ou constantes em uma configuração adequada ou para introduzir códons, criar resíduos de cisteína, modificar, adicionar ou eliminar aminoácidos etc.

[00107] Exemplos não limitativos de fragmentos de ligação ao antígeno incluem: (i) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab')2; (iii) fragmentos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas Fv de cadeia simples (scFv); (vi) fragmentos de dAb; e (vii) unidades de reconhecimento mínimo que consistem nos resíduos de aminoácidos que mimetizam a região hipervariável de um anticorpo (por exemplo, uma região que determina complementaridade isolada (CDR), tal como um peptídeo CDR3) ou um peptídeo FR3-CDR3-FR4 restrito.Outras moléculas engenheiradas, como anticorpos de domínio específico, anticorpos de domínio único, anticorpos com domínio excluído, anticorpos quiméricos, anticorpos enxertados com CDR, diacorpos, triacorpos, tetracorpos, minicorpos, nanocorpos (por exemplo , nanocorpos monovalentes, nanocorpos bivalentes, etc.), pequenos imunofarmacêuticos modulares (SMIPs) e domínios IgNAR variáveis de tubarão, também estão englobados na expressão "fragmento de ligação ao antígeno", como utilizado neste documento.

[00108] Um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo compreenderá tipicamente pelo menos um domínio variável. O domínio variável pode ser de qualquer tamanho ou composição de aminoácidos e geralmente compreenderá pelo menos uma CDR que é adjacente a ou em estrutura com uma ou mais sequências estruturais. Nos fragmentos de ligação ao antígeno que têm um domínio VH associado a um domínio VL , os domínios VH e VL podem estar situados um em relação ao outro em qualquer arranjo adequado. Por exemplo, a região variável pode ser dimérica e conter dímeros VH-VH, VH-VL ou VL-VL . Alternativamente, o fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo pode conter um domínio VH ou VL .

[00109] Em certas modalidades, um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo pode conter pelo menos um domínio variável covalentemente ligado a pelo menos um domínio constante. Configurações exemplificativas não limitativas de domínios variáveis e constantes que podem ser encontrados dentro de um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo da presente invenção incluem: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2-CH3; (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (x) VL-CH3; (xi) VL- CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; e (xiv) VL-CL. Em qualquer configuração de domínios variáveis e constantes, incluindo qualquer uma das configurações exemplificativas listadas acima, os domínios variáveis e constantes podem ser diretamente ligados um ao outro ou podem ser ligados por uma dobradiça total ou parcial ou região de ligante. Uma região de dobradiça pode consistir em pelo menos 2 (por exemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 ou mais) aminoácidos que resultam em uma ligação flexível ou semiflexível entre domínios variáveis e/ou constantes adjacentes em uma única molécula de polipeptídeo. Além disso, um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo da presente invenção pode compreender um homodímero ou heterodímero (ou outro multímero) de qualquer uma das configurações de domínio variável e constante listadas acima em associação não covalente uma com a outra e/ou com um ou mais domínios monoméricos VH ou VL (por exemplo, por ligação(ões) dissulfeto.

[00110] Tal como acontece com as moléculas de anticorpo completo,

os fragmentos de ligação ao antígeno podem ser monoespecíficos ou multiespecíficos (por exemplo, biespecíficos). Um fragmento de ligação ao antígeno multiespecífico de um anticorpo compreenderá tipicamente pelo menos dois domínios variáveis diferentes, em que cada domínio variável é capaz de se ligar especificamente a um antígeno separado ou a um epitopo diferente no mesmo antígeno. Qualquer formato de anticorpo multiespecífico, incluindo os formatos de anticorpo biespecífico exemplificativos divulgados neste documento, pode ser adaptado para uso no contexto de um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo da presente invenção usando técnicas de rotina disponíveis na técnica.

[00111] Os anticorpos da presente invenção podem funcionar através da citotoxicidade dependente do complemento (CDC) ou citotoxicidade mediada por células dependente do anticorpo (ADCC). "Citotoxicidade dependente de complemento" (CDC) refere-se à lise de células que expressam antígeno por um anticorpo da invenção na presença de complemento. "Citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos" (ADCC) refere-se a uma reação mediada por células em que células citotóxicas não específicas que expressam receptores Fc (FcRs) (por exemplo, células Assassinas Naturais (NK), neutrófilos e macrófagos) reconhecem o anticorpo ligado em uma célula-alvo e, assim, levam à lise da célula alvo. CDC e ADCC podem ser medidos usando ensaios que são bem conhecidos e disponíveis na técnica. (Ver, por exemplo, Patentes U.S. 5.500.362 e 5.821.337, e Clynes et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:652-656). A região constante de um anticorpo é importante na capacidade de um anticorpo de fixar complemento e mediar a citotoxicidade dependente de células. Assim, o isótipo de um anticorpo pode ser selecionado com base em se é desejável que o anticorpo medie a citotoxicidade.

[00112] Em certas modalidades da invenção, os anticorpos monoespecíficos anti-FcεR1α ou anticorpos biespecíficos anti- FcεR1α/anti-CD3 da invenção são anticorpos humanos. O termo "anticorpo humano", como utilizado neste documento, pretende incluir anticorpos possuindo regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina da linhagem germinativa humana. Os anticorpos humanos da invenção podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados por sequências de imunoglobulina da linhagem germinativa humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou específica do sítio in vitro ou por mutação somátic in vivo), por exemplo, nas CDRs e em particular na CDR3. No entanto, o termo "anticorpo humano", como utilizados neste documento, não pretende incluir anticorpos nos quais as sequências de CDR derivadas da linhagem germinal de outra espécie de mamífero, tal como um camundongo, foram enxertadas em sequências de estrutura humanas.

[00113] Os anticorpos da invenção podem, em algumas modalidades, ser anticorpos humanos recombinantes. O termo "anticorpo humano recombinante", como utilizado neste documento, pretende incluir todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como anticorpos expressos utilizando um vetor de expressão recombinante transfectado em uma célula hospedeira (descrito mais a seguir), anticorpos isolados de uma biblioteca de anticorpos humanos combinatória recombinante (descrita mais adiante), anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico para genes de imunoglobulina humana (ver, por exemplo, Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295) ou anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por qualquer outro meio que envolva processamento de sequências de genes de imunoglobulina humana para outras sequências de DNA. Tais anticorpos humanos recombinantes têm regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina da linhagem germinativa humana. Em certas modalidades, no entanto, tais anticorpos humanos recombinantes são sujeitos a mutagênese in vitro (ou, quando é utilizado um animal transgênico para sequências de Ig humanas, mutagênese somática in vivo ) e assim as sequências de aminoácidos das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são sequências que, enquanto derivadas e relacionadas com sequências VH e VL de linhagem germinativa humana podem não existir naturalmente no repertório de linhagem germinal de anticorpo humano in vivo.

[00114] Os anticorpos humanos podem existir em duas formas que estão associadas à heterogeneidade da dobradiça. Em uma forma, uma molécula de imunoglobulina compreende um construto de quatro cadeias estável de aproximadamente 150 a 160 kDa, na qual os dímeros são mantidos juntos por uma ligação dissulfeto de cadeia pesada inter-cadeias. Em uma segunda forma, os dímeros não estão ligados através de ligações dissulfeto inter-cadeias e forma-se uma molécula de cerca de 75 a 80 kDa composta por uma cadeia leve e pesada acoplada covalentemente (meio anticorpo). Essas formas são extremamente difíceis de separar, mesmo após a purificação por afinidade.

[00115] A frequência de aparecimento da segunda forma em vários isótipos de IgG intactos deve-se a, mas não se limita a, diferenças estruturais associadas ao isótipo da região de dobradiça do anticorpo. Uma única substituição de aminoácido na região de dobradiça da dobradiça da IgG4 humana pode reduzir significativamente a aparência da segunda forma (Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30:105) a níveis tipicamente observados utilizando uma dobradiça de IgG1 humana. A presente invenção engloba anticorpos que têm uma ou mais mutações na região de dobradiça CH2 ou CH3 que podem ser desejáveis, por exemplo, na produção, para melhorar o rendimento da forma de anticorpo desejada.

[00116] Os anticorpos da invenção podem ser anticorpos isolados. Um "anticorpo isolado", como utilizado neste documento, significa um anticorpo que foi identificado e separado e/ou recuperado de pelo menos um componente do seu ambiente natural. Por exemplo, um anticorpo que foi separado ou removido de pelo menos um componente de um organismo, ou de um tecido ou célula em que o anticorpo existe naturalmente ou é naturalmente produzido, é um "anticorpo isolado" para os fins da presente invenção. Um anticorpo isolado também inclui um anticorpo in situ dentro de uma célula recombinante. Anticorpos isolados são anticorpos que foram submetidos a pelo menos uma etapa de purificação ou isolamento. De acordo com certas modalidades, um anticorpo isolado pode estar substancialmente isento de outro material celular e/ou produtos químicos.

[00117] A presente invenção também inclui anticorpos de um braço que se ligam a FcεR1α. Como utilizado neste documento, um "anticorpo de um braço" significa uma molécula de ligação ao antígeno compreendendo uma cadeia pesada de anticorpo simples e uma cadeia leve de anticorpo simples. Os anticorpos de um braço da presente invenção podem compreender qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCVR/LCVR ou CDR conforme estabelecido na Tabela 1.

[00118] Os anticorpos anti-FcεR1α ou anti-FcεR1α/anti-CD3 aqui divulgados podem compreender uma ou mais substituições de aminoácidos, inserções e/ou deleções nas regiões de estrutura e/ou CDR dos domínios variáveis da cadeia pesada e leve em comparação com as sequências correspondentes da linhagem germinativa das quais os anticorpos foram derivados. Tais mutações podem ser prontamente determinadas comparando as sequências de aminoácidos aqui divulgadas com as sequências da linhagem germinal disponíveis, por exemplo, nas bases de dados de sequências de anticorpos públicas.

A presente invenção inclui anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, que são derivados de qualquer uma das sequências de aminoácidos divulgadas neste documento, em que um ou mais aminoácidos dentro de uma ou mais regiões estruturais e/ou CDR são mutadas para o(s) resíduo(s) correspondente(s) da sequência da linhagem germinativa a partir da qual o anticorpo foi derivado, ou ao(s) resíduo(s) correspondente(s) de outra sequência da linhagem germinativa humana, ou a uma substituição conservativa de aminoácidos do(s) resíduo(s) da linhagem germinativa correspondente (tais alterações de sequência são referidas aqui coletivamente como "mutações da linhagem germinativa"). Um versado na técnica, começando com as sequências da região variável da cadeia pesada e leve aqui descritas, pode facilmente produzir inúmeros anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno que compreendem uma ou mais mutações da linhagem germinativa individuais ou combinações dos mesmos.

Em certas modalidades, todos os resíduos de estrutura e/ou CDR dentro dos domínios VH e/ou VL são mutados de volta para os resíduos encontrados na sequência da linhagem germinativa original da qual o anticorpo foi derivado.

Em outras modalidades, apenas certos resíduos são mutados de volta para a sequência da linhagem germinativa original, por exemplo, apenas os resíduos mutados encontrados nos primeiros 8 aminoácidos do FR1 ou nos últimos 8 aminoácidos do FR4, ou apenas os resíduos mutados encontrados na CDR1, CDR2 ou CDR3. Em outras modalidades, um ou mais da estrutura e/ou resíduo(s) de CDR são mutados para o(s) resíduo(s) correspondente(s) de uma sequência de linhagem germinativa diferente (isto é, uma sequência de linhagem germinativa que é diferente da sequência de linhagem germinativa da qual o anticorpo foi originalmente derivado). Além disso, os anticorpos da presente invenção podem conter qualquer combinação de duas ou mais mutações da linhagem germinativa dentro da estrutura e/ou regiões CDR, por exemplo, em que certos resíduos individuais são mutados para o resíduo correspondente de uma determinada sequência da linhagem germinativa, enquanto certos outros resíduos que diferem da sequência da linhagem germinativa original são mantidos ou são mutados para o resíduo correspondente de uma sequência diferente da linhagem germinativa. Uma vez obtidos, os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno que contêm uma ou mais mutações da linhagem germinativa podem ser facilmente testados para uma ou mais propriedades desejadas, tais como especificidade de ligação melhorada, maior afinidade de ligação, propriedades biológicas antagonísticas ou agonísticas intensificadas ou aumentadas (conforme o caso pode ser), imunogenicidade reduzida, etc. Os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno obtidos desta maneira geral estão incluídos na presente invenção.

[00119] A presente invenção também inclui anticorpos anti-FcεR1α ou anti-FcεR1α/anti-CD3 compreendendo variantes de qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCVR, LCVR e/ou CDR divulgadas neste documento tendo uma ou mais substituições conservativas. Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos anti-FcεR1α ou anti- FcεR1α/anti-CD3 com sequências de aminoácidos de HCVR, LCVR e/ou CDR com, por exemplo, 10 ou menos, 8 ou menos, 6 ou menos, 4 ou menos , etc. substituições conservativas de aminoácidos em relação a qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCVR, LCVR e/ou CDR estabelecidas nas Tabelas 1 e 3 aqui.

[00120] O termo "epitopo" refere-se a um determinante antigênico que interage com um sítio de ligação de antígeno específico na região variável de uma molécula de anticorpo conhecida como parátopo. Um antígeno simples pode ter mais de um epitopo. Assim, diferentes anticorpos podem se ligar a diferentes áreas de um antígeno e podem ter diferentes efeitos biológicos. Os epitopos podem ser conformacionais ou lineares. Um epitopo conformacional é produzido por aminoidos espacialmente justapostos de diferentes segmentos da cadeia polipeptídica linear. Um epitopo linear é aquele produzido por resíduos de aminoácidos adjacentes em uma cadeia polipeptídica. Em certas circunstâncias, um epitopo pode incluir frações de sacarídeos, grupos fosforil ou grupos sulfonil no antígeno.

[00121] O termo "identidade substancial" ou "substancialmente idêntico", quando se refere a um ácido nucleico ou fragmento deste indica que, quando idealmente alinhado com inserções ou deleções de nucleotídeos apropriados com outro ácido nucleico (ou a sua cadeia complementar), existe uma identidade de sequência nucleotídica em pelo menos cerca de 95% e mais preferivelmente pelo menos cerca de 96%, 97%, 98% ou 99% das bases de nucleotídeos, conforme medido por qualquer algoritmo bem conhecido de identidade de sequência, tal como FASTA, BLAST ou Gap, como discutido a seguir. Uma molécula de ácido nucleico com identidade substancial para uma molécula de ácido nucleico de referência pode, em certos casos, codificar um polipeptídeo que tem a mesma ou substancialmente semelhante sequência de aminoácidos que o polipeptídeo codificado pela molécula de ácido nucleico de referência.

[00122] Conforme aplicado aos polipeptídeos, o termo "similaridade substancial" ou "substancialmente semelhante" significa que duas sequências de peptídeos, quando alinhadas de forma otimizada, como pelos programas GAP ou BESTFIT usando pesos de lacuna padrão, compartilham pelo menos 95% de identidade de sequência, ainda mais preferencialmente pelo menos 98% ou 99% de identidade de sequência. Preferivelmente, as posições de resíduos que não são idênticos diferem por substituições de aminoácidos conservativas. Uma "substituição conservativa de aminoácido" é aquela em que um resíduo de aminoácido é substituído por outro resíduo de aminoácido possuindo uma cadeia lateral (grupo R) com propriedades químicas semelhantes (por exemplo, carga ou hidrofobicidade). Em geral, uma substituição conservativa de aminoácidos não altera substancialmente as propriedades funcionais de uma proteína. Nos casos em que duas ou mais sequências de aminoácidos diferem umas das outras por substituições conservativas, a porcentagem de identidade de sequência ou grau de semelhança pode ser ajustada para cima para corrigir a natureza conservativa da substituição. Os meios para realizar este ajuste são bem conhecidos pelos versados na técnica. Ver, por exemplo, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-331, aqui incorporado por referência. Exemplos de grupos de aminoácidos que possuem cadeias laterais com propriedades químicas semelhantes incluem (1) cadeias laterais alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; (2) cadeias laterais de hidroxil alifático: serina e treonina; (3) cadeias laterais contendo amida: asparagina e glutamina; (4) cadeias laterais aromáticas: fenilalanina, tirosina e triptofano; (5) cadeias laterais básicas: lisina, arginina e histidina; (6) cadeias laterais acídicas: aspartato e glutamato, e (7) cadeias laterais contendo enxofre são cisteína e metionina. Os grupos de substituição conservativa de aminoácidos preferidos são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina- tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato e asparagina-glutamina. Alternativamente, uma substituição conservativa é qualquer alteração que tenha um valor positivo na matriz de verossimilhança logarítmica de PAM250 divulgada em Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-1445, aqui incorporado por referência. Uma substituição "moderadamente conservativa" é qualquer alteração que tenha um valor não negativo na matriz de verossimilhança logarítmica de PAM250.

[00123] A similaridade de sequência para polipeptídeos, que também é referida como identidade de sequência, é tipicamente medida usando software de análise de sequência. O software de análise de proteínas combina sequências semelhantes usando medidas de semelhanças atribuídas a várias substituições, deleções e outras modificações, incluindo substituições conservativas de aminoácidos. Por exemplo, o software GCG contém programas como Gap e Bestfit que podem ser usados com parâmetros padrão para determinar a homologia de sequência ou identidade de sequência entre polipeptídeos intimamente relacionados, como polipeptídeos homólogos de diferentes espécies de organismos ou entre uma proteína de tipo selvagem e uma muteína da mesma. Ver, por exemplo, GCG Versão 6.1. As sequências polipeptídicas também podem ser comparadas usando FASTA usando parâmetros padrão ou recomendados, um programa no GCG Versão

6.1. FASTA (por exemplo, FASTA2 e FASTA3) fornece alinhamentos e identidade de sequência percentual das regiões da melhor sobreposição entre as sequências de consulta e pesquisa (Pearson (2000) supra). Outro algoritmo preferido quando se compara uma sequência da invenção com uma base de dados contendo um grande número de sequências de organismos diferentes é o programa de computador BLAST, especialmente BLASTP ou TBLASTN, utilizando parâmetros por defeito. Ver, por exemplo, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 and Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389- 402, cada aqui incorporado por referência. Mutações da linhagem germinativa

[00124] Os anticorpos anti-FcεR1α e/ou anti-CD3 aqui divulgados compreendem uma ou mais substituições de aminoácidos, inserções e/ou deleções nas regiões de estrutura e/ou CDR dos domínios variáveis da cadeia pesada em comparação com as sequências correspondentes da linhagem germinativa das quais os anticorpos foram derivados.

[00125] A presente invenção também inclui anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, que são derivados de qualquer uma das sequências de aminoácidos divulgadas neste documento, em que um ou mais aminoácidos dentro de uma ou mais regiões estruturais e/ou CDR são mutadas para o(s) resíduo(s) correspondente(s) da sequência da linhagem germinativa a partir da qual o anticorpo foi derivado, ou ao(s) resíduo(s) correspondente(s) de outra sequência da linhagem germinativa humana, ou a uma substituição conservativa de aminoácidos do(s) resíduo(s) da linhagem germinativa correspondente (tais alterações de sequência são referidas aqui coletivamente como "mutações da linhagem germinativa"), e possuindo propriedades de ligação desejadas a um antígeno FcεR1α ou CD3, por exemplo, ligação fraca ou nenhuma ligação detectável de anticorpos anti-CD3 a CD3. Vários desses anticorpos exemplificativos que reconhecem FcεR1α são descritos na Tabela 1. Vários desses anticorpos exemplificativos que reconhecem CD3 são descritos na Tabela 3.

[00126] Além disso, os anticorpos da presente invenção podem conter qualquer combinação de duas ou mais mutações da linhagem germinativa dentro da estrutura e/ou regiões CDR, por exemplo, em que certos resíduos individuais são mutados para o resíduo correspondente de uma determinada sequência da linhagem germinativa, enquanto certos outros resíduos que diferem da sequência da linhagem germinativa original são mantidos ou são mutados para o resíduo correspondente de uma sequência diferente da linhagem germinativa. Uma vez obtidos, os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno que contêm uma ou mais mutações da linhagem germinativa podem ser testados para uma ou mais propriedades desejadas, tais como especificidade de ligação melhorada, afinidade de ligação fraca ou reduzida, propriedades farmacocinéticas melhoradas ou intensificadas, imunogenicidade reduzida, etc. Os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno obtidos desta maneira geral, dada a orientação da presente divulgação, estão incluídos na presente invenção.

[00127] A presente invenção também inclui anticorpos anti-FcεR1α compreendendo variantes de qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCVR, LCVR e/ou CDR divulgadas neste documento tendo uma ou mais substituições conservativas. Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos anti-CD3 com sequências de aminoácidos de HCVR, LCVR e/ou CDR com, por exemplo, 10 ou menos, 8 ou menos, 6 ou menos, 4 ou menos , etc. substituições conservativas de aminoácidos em relação a qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCVR, LCVR e/ou CDR estabelecidas na Tabela 1 aqui. Os anticorpos e moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da presente invenção compreendem uma ou mais substituições de aminoácidos, inserções e/ou deleções na estrutura e/ou regiões CDR dos domínios variáveis da cadeia pesada e leve em comparação com as sequências de linhagem germinativa correspondentes dos quais os domínios de ligação ao antígeno individuais foram derivados, enquanto mantém ou melhora a ligação desejada a FcεR1α ou CD3, por exemplo, ligação fraca ou nenhuma ligação detectável de anticorpos anti-CD3 ao antígeno CD3. Uma "substituição conservativa de aminoácido" é aquela em que um resíduo de aminoácido é substituído por outro resíduo de aminoácido possuindo uma cadeia lateral (grupo R) com propriedades químicas semelhantes (por exemplo, carga ou hidrofobicidade). Em geral, uma substituição conservativa de aminoácidos não alterará substancialmente as propriedades funcionais de uma proteína, isto é , a substituição de aminoácidos mantém ou melhora a afinidade de ligação desejada no caso de moléculas de ligação anti-FcεR1α e/ou anti-CD3, por exemplo, ligação fraca a nenhuma ligação detectável ou anticorpos anti-CD3 ao antígeno CD3. Exemplos de grupos de aminoácidos que possuem cadeias laterais com propriedades químicas semelhantes incluem (1) cadeias laterais alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; (2) cadeias laterais de hidroxil alifático: serina e treonina; (3) cadeias laterais contendo amida: asparagina e glutamina; (4) cadeias laterais aromáticas: fenilalanina, tirosina e triptofano; (5) cadeias laterais básicas: lisina, arginina e histidina; (6) cadeias laterais acídicas: aspartato e glutamato, e (7) cadeias laterais contendo enxofre são cisteína e metionina. Os grupos de substituição conservativa de aminoácidos preferidos são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina- tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato e asparagina-glutamina. Alternativamente, uma substituição conservativa é qualquer alteração que tenha um valor positivo na matriz de verossimilhança logarítmica de PAM250 divulgada em Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-1445. Uma substituição "moderadamente conservativa" é qualquer alteração que tenha um valor não negativo na matriz de verossimilhança logarítmica de PAM250.

[00128] A presente invenção também inclui moléculas de ligação ao antígeno compreendendo um domínio de ligação ao antígeno com uma sequência de aminoácidos de HCVR e/ou CDR que é substancialmente idêntica a qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCVR e/ou CDR divulgadas neste documento, enquanto mantém ou melhora a propriedade desejada para o antígeno FcεR1α e/ou CD3. O termo "identidade substancial" ou "substancialmente idêntica", quando se refere a uma sequência de aminoácidos, significa que duas sequências de aminoácidos, quando alinhadas de forma otimizada, como pelos programas GAP ou BESTFIT usando pesos de lacuna padrão, compartilham pelo menos 95% de identidade de sequência, ainda mais preferencialmente pelo menos 98% ou 99% de identidade de sequência. Preferivelmente, as posições de resíduos que não são idênticos diferem por substituições de aminoácidos conservativas. Nos casos em que duas ou mais sequências de aminoácidos diferem umas das outras por substituições conservativas, a porcentagem de identidade de sequência ou grau de semelhança pode ser ajustada para cima para corrigir a natureza conservativa da substituição. Os meios para realizar este ajuste são bem conhecidos pelos versados na técnica. Ver, por exemplo, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331.

[00129] A similaridade de sequência para polipeptídeos, que também é referida como identidade de sequência, é tipicamente medida usando software de análise de sequência. O software de análise de proteínas combina sequências semelhantes usando medidas de semelhanças atribuídas a várias substituições, deleções e outras modificações, incluindo substituições conservativas de aminoácidos. Por exemplo, o software GCG contém programas como Gap e Bestfit que podem ser usados com parâmetros padrão para determinar a homologia de sequência ou identidade de sequência entre polipeptídeos intimamente relacionados, como polipeptídeos homólogos de diferentes espécies de organismos ou entre uma proteína de tipo selvagem e uma muteína da mesma. Ver, por exemplo, GCG Versão 6.1. As sequências polipeptídicas também podem ser comparadas usando FASTA usando parâmetros padrão ou recomendados, um programa no GCG Versão

6.1. FASTA (por exemplo, FASTA2 e FASTA3) fornece alinhamentos e identidade de sequência percentual das regiões da melhor sobreposição entre as sequências de consulta e pesquisa (Pearson (2000) supra). Outro algoritmo preferido quando se compara uma sequência da invenção com uma base de dados contendo um grande número de sequências de organismos diferentes é o programa de computador BLAST, especialmente BLASTP ou TBLASTN, utilizando parâmetros por defeito. Ver, por exemplo, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 and Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-

402.

[00130] Uma vez obtidos, os domínios de ligação ao antígeno que contêm uma ou mais mutações da linhagem germinativa são testados quanto à diminuição da afinidade de ligação utilizando um ou mais ensaios in vitro . Embora os anticorpos que reconhecem um determinado antígeno sejam tipicamente rastreados para seu propósito por meio de testes de alta (ou seja , forte) afinidade de ligação ao antígeno, os anticorpos da presente invenção exibem ligação fraca ou nenhuma ligação detectável. Moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas compreendendo um ou mais domínios de ligação a antígeno obtidos desta maneira geral também estão incluídas na presente invenção e são consideradas vantajosas como terapias de alergia dirigidas por avidez.

[00131] Benefícios inesperados, por exemplo, propriedades farmacocinéticas melhoradas e baixa toxicidade para o paciente podem ser realizados a partir dos métodos aqui descritos. Propriedades de ligação dos anticorpos

[00132] Como utilizado neste documento, o termo "ligação" no contexto da ligação de um anticorpo, imunoglobulina, fragmento de ligação de anticorpo ou proteína contendo Fc a, por exemplo, um antígeno predeterminado, tal como uma proteína de superfície celular ou fragmento da mesma, normalmente se refere a uma interação ou associação entre um mínimo de duas entidades ou estruturas moleculares, como uma interação anticorpo-antígeno.

[00133] Por exemplo, a afinidade de ligação tipicamente corresponde a um valor KD de cerca de 10-6 M ou menos, tal como cerca de 10-7 M ou menos, tal como cerca de 10-8 M ou menos, tal como cerca de 10-9 M ou menos quando determinado por, por exemplo, tecnologia de ressonância plasmônica de superfície (SPR) em um instrumento BIAcore 3000 usando o antígeno como o ligando e o anticorpo, Ig, fragmento de ligação ao anticorpo ou proteína contendo Fc como analito

(ou antiligando). Estratégias de ligação baseadas em células, tais como ensaios de ligação de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS), também são rotineiramente usadas, e os dados de FACS se correlacionam bem com outros métodos, como ligação de competição de radioligando e SPR (Benedict, CA, J. Immunol Methods. 1997, 201(2):223-31; Geuijen, CA, et al. J Immunol Methods. 2005, 302(1-2):68-77).

[00134] Por conseguinte, o anticorpo ou proteína de ligação ao antígeno da invenção se liga ao antígeno predeterminado ou molécula de superfície celular (receptor) com uma afinidade correspondente a um valor KD que é pelo menos dez vezes menor do que sua afinidade para ligação a um antígeno (por exemplo, BSA, caseína). De acordo com a presente invenção, a afinidade de um anticorpo correspondente a um valor KD que é igual ou inferior a dez vezes menor do que um antígeno não específico pode ser considerada ligação não detectável, no entanto, tal anticorpo pode ser emparelhado com um segundo braço de ligação ao antígeno para a produção de um anticorpo biespecífico da invenção.

[00135] O termo "KD" (M) refere-se à constante de equilíbrio de dissociação de uma interação anticorpo-antígeno particular, ou a constante de equilíbrio de dissociação de um anticorpo ou fragmento de ligação de anticorpo a um antígeno. Há uma relação inversa entre KD e afinidade de ligação, portanto, quanto menor o valor de KD , maior, ou seja , mais forte, a afinidade. Assim, os termos "afinidade mais alta" ou "afinidade mais forte" referem-se a uma capacidade maior de formar uma interação e, portanto, um valor de KD menor e, inversamente, os termos "afinidade mais baixa" ou "afinidade mais fraca" se relacionam a uma capacidade menor de formar uma interação e, portanto, um valor de KD maior. Em algumas circunstâncias, uma maior afinidade de ligação (ou KD) de uma molécula particular (por exemplo , anticorpo) para sua molécula parceira interativa (por exemplo , antígeno X) em comparação com a afinidade de ligação da molécula (por exemplo , anticorpo) para outra molécula parceira interativa (por exemplo , antígeno Y) pode ser expresso como uma razão de afinidade de ligação determinada dividindo o maior valor de KD (menor ou mais fraca afinidade) pelo menor KD (maior ou mais forte afinidade), por exemplo expresso como 5 vezes ou 10 vezes maior afinidade de ligação, conforme o caso.

[00136] O termo "kd" (s -1 ou 1/s) refere-se à constante da taxa de dissociação de uma interação anticorpo-antígeno particular, ou a constante da taxa de dissociação de um anticorpo ou fragmento de ligação ao anticorpo. Esse valor também é referido como o valor de koff.

[00137] O termo "ka" (M-1 x s-1 ou 1/M) refere-se à constante da taxa de associação de uma interação anticorpo-antígeno particular, ou a constante da taxa de associação de um anticorpo ou fragmento de ligação ao anticorpo.

[00138] O termo "KA" (M-1 ou 1/M) refere-se à constante de equilíbrio de associação de uma interação anticorpo-antígeno particular, ou a constante de equilíbrio de associação de um anticorpo ou fragmento de ligação a anticorpo. A constante de equilíbrio da associação é obtida dividindo o ka pelo kd.

[00139] O termo “EC50” ou “EC50” refere-se à metade da concentração efetiva máxima, que inclui a concentração de um anticorpo que induz uma resposta a meio caminho entre a linha de base e o máximo após um tempo de exposição especificado. O EC50 representa essencialmente a concentração de um anticorpo onde 50% do seu efeito máximo é observado. Em certas modalidades, o valor de EC50 é igual à concentração de um anticorpo da invenção que dá metade da ligação máxima a células que expressam CD3 ou antígeno relacionado à alergia, conforme determinado por por exemplo, um ensaio de ligação FACS. Assim, a ligação reduzida ou mais fraca é observada com um EC50, aumentado, ou metade do valor máximo da concentração efetiva.

[00140] Em uma modalidade, a ligação diminuída pode ser definida como uma concentração de EC50 aumentada que permite a ligação à metade da quantidade máxima de células alvo.

[00141] Em outra modalidade, o valor de EC50 representa a concentração de um anticorpo da invenção que provoca a metade do esgotamento máximo de células alvo pela atividade citotóxica de células T. Assim, a atividade citotóxica aumentada (por exemplo , morte de basófilos mediada por células T) é observada com um EC50diminuído, ou metade do valor da concentração efetiva máxima. Moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas

[00142] Os anticorpos da presente invenção podem ser monoespecíficos, bi-específicos ou multiespecíficos. Os anticorpos multiespecíficos podem ser específicos para diferentes epitopos de um polipeptídeo alvo ou podem conter domínios de ligação ao antígeno específicos para mais de um polipeptídeo alvo. Ver, por exemplo, Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244. Os anticorpos monoespecíficos anti-FcεR1α ou anticorpos biespecíficos anti-FcεR1α/anti-CD3 da presente invenção podem ser ligados ou coexpressos com outra molécula funcional, por exemplo, outro peptídeo ou proteína. Por exemplo, um anticorpo ou fragmento do mesmo pode ser funcionalmente ligado (por exemplo, por acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou de outra forma) a uma ou mais outras entidades moleculares, como outro anticorpo ou fragmento de anticorpo para produzir um bi-específico ou um anticorpo multiespecífico com uma segunda especificidade de ligação ou adicional.

[00143] O uso da expressão "anticorpo anti-CD3" ou "anticorpo anti- FcεR1α" neste documento se destina a incluir anticorpos anti-CD3 ou anti-FcεR1α monoespecíficos, bem como anticorpos biespecíficos compreendendo um braço de ligação a CD3 e um braço de ligação a FcεR1α. Assim, a presente invenção inclui anticorpos biespecíficos em que um braço de uma imunoglobulina se liga a CD3 humano e o outro braço da imunoglobulina é específico para FcεR1α humano. O braço de ligação a CD3 pode compreender qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCVR/LCVR ou CDR conforme estabelecido na Tabela 3 aqui.

[00144] Em certas modalidades, o braço de ligação a CD3 se liga a CD3 humano e induz a ativação de células T humanas. Em certas modalidades, o braço de ligação a CD3 se liga fracamente a CD3 humano e induz a ativação de células T humanas. Em outras modalidades, o braço de ligação a CD3 se liga fracamente a CD3 humano e induz a ablação de mastócitos e/ou basófilos no contexto de um anticorpo biespecífico ou multiespecífico. Em outras modalidades, o braço de ligação a CD3 se liga ou está fracamente associado a CD3 humano, mas a interação de ligação não é detectável por ensaios in vitro conhecidos na técnica. O braço de ligação a FcεR1α pode compreender qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCVR/LCVR ou CDR conforme estabelecido na Tabela 1 aqui.

[00145] De acordo com certas modalidades exemplificativos, a presente invenção inclui moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que se ligam especificamente a CD3 e FcεR1α. Tais moléculas podem ser referidas aqui como, por exemplo, moléculas biespecíficas "anti- CD3/anti-FcεR1α," ou "anti-CD3xFcεR1α," ou "anti-FcεR1α/anti-CD3", ou "anti-FcεR1αxCD3," ou "CD3xFcεR1α" ou moléculas biespecíficas "FcεR1αxCD3" ou outra terminologia semelhante (por exemplo, anti- FcεR1α x anti-CD3).

[00146] O termo "FcεR1α", como utilizado neste documento, refere- se à proteína FcεR1α humana, a menos que seja especificada como sendo de uma espécie não humana (por exemplo, "FcεR1α de camundongo", "FcεR1α de macaco", etc.). A proteína FcεR1α humana tem a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 63.

[00147] As moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas acima mencionadas que se ligam especificamente a CD3 e FcεR1α podem compreender uma molécula de ligação ao antígeno anti-CD3 que se liga a CD3 com uma afinidade de ligação fraca, como exibir um KD maior do que cerca de 40 nM, conforme medido por um ensaio de ligação por afinidade in vitro .

[00148] Como utilizado neste documento, a expressão "molécula de ligação ao antígeno" significa uma proteína, polipeptídeo ou complexo molecular compreendendo ou consistindo em pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) que sozinha, ou em combinação com uma ou mais CDRs adicionais e/ou regiões estruturais (FRs), liga-se especificamente a um antígeno particular. Em certas modalidades, uma molécula de ligação ao antígeno é um anticorpo ou um fragmento de um anticorpo, uma vez que esses termos são definidos em outro lugar neste documento.

[00149] Como utilizado neste documento, a expressão "molécula biespecífica de ligação ao antígeno" significa uma proteína, polipeptídeo ou complexo molecular compreendendo pelo menos um primeiro domínio de ligação ao antígeno e um segundo domínio de ligação ao antígeno. Cada domínio de ligação ao antígeno dentro da molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende pelo menos uma CDR que sozinha, ou em combinação com uma ou mais CDRs e/ou FRs adicionais, se liga especificamente a um antígeno particular. No contexto da presente invenção, o primeiro domínio de ligação ao antígeno se liga especificamente a um primeiro antígeno (por exemplo, CD3), e o segundo domínio de ligação ao antígeno se liga especificamente a um segundo antígeno distinto (por exemplo, FcεR1α).

[00150] Em certas modalidades exemplificativas da presente invenção, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é um anticorpo biespecífico. Cada domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo biespecífico compreende um domínio variável da cadeia pesada (HCVR) e um domínio variável da cadeia leve (LCVR). No contexto de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo um primeiro e um segundo domínio de ligação ao antígeno (por exemplo, um anticorpo biespecífico), as CDRs do primeiro domínio de ligação ao antígeno podem ser designadas com o prefixo "A1" e as CDRs do segundo domínio de ligação ao antígeno podem ser designadas com o prefixo "A2". Assim, as CDRs do primeiro domínio de ligação ao antígeno podem ser referidas aqui como A1-HCDR1, A1-HCDR2 e A1- HCDR3; e as CDRs do segundo domínio de ligação ao antígeno podem ser referidas aqui como A2-HCDR1, A2-HCDR2 e A2-HCDR3.

[00151] O primeiro domínio de ligação ao antígeno e o segundo domínio de ligação ao antígeno podem ser direta ou indiretamente conectados um ao outro para formar uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica da presente invenção. Alternativamente, o primeiro domínio de ligação ao antígeno e o segundo domínio de ligação ao antígeno podem, cada um, ser conectados a um domínio de multimerização separado. A associação de um domínio de multimerização com outro domínio de multimerização facilita a associação entre os dois domínios de ligação ao antígeno, formando assim uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica. Como utilizado neste documento, um "domínio de multimerização" é qualquer macromolécula, proteína, polipeptídeo, peptídeo ou aminoácido que tem a capacidade de se associar a um segundo domínio de multimerização da mesma estrutura ou constituição ou semelhante. Por exemplo, um domínio de multimerização pode ser um polipeptídeo compreendendo um domínio CH3 de imunoglobulina. Um exemplo não limitativo de um componente de multimerização é uma porção Fc de uma imunoglobulina (compreendendo um domínio CH2-CH3), por exemplo, um domínio Fc de uma IgG selecionada dos isótipos IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, bem como qualquer alótipo dentro de cada grupo de isótipos.

[00152] As moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da presente invenção compreenderão tipicamente dois domínios de multimerização, por exemplo, dois domínios Fc que são cada um individualmente parte de uma cadeia pesada de anticorpo separada. O primeiro e o segundo domínios de multimerização podem ser do mesmo isótipo IgG, como, por exemplo, IgG1/IgG1, IgG2/IgG2 e IgG4/IgG4. Alternativamente, o primeiro e o segundo domínios de multimerização podem ser de diferentes isótipos de IgG, tais como, por exemplo, IgG1/IgG2, IgG1/IgG4, IgG2/IgG4, etc.

[00153] Em certas modalidades, o domínio de multimerização é um fragmento Fc ou uma sequência de aminoácidos de 1 a cerca de 200 aminoácidos de comprimento contendo pelo menos um resíduo de cisteína. Em outras modalidades, o domínio de multimerização é um resíduo de cisteína ou um peptídeo curto contendo cisteína. Outros domínios de multimerização incluem peptídeos ou polipeptídeos compreendendo ou consistindo em um zíper de leucina, um motivo de hélice-alça ou um motivo de espiral enrolada.

[00154] Qualquer formato ou tecnologia de anticorpo biespecífico pode ser usado para fazer as moléculas de ligação a antígeno biespecíficas da presente invenção. Por exemplo, um anticorpo ou fragmento do mesmo tendo uma primeira especificidade de ligação ao antígeno pode ser funcionalmente ligado (por exemplo, por acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou de outra forma) a uma ou mais outras entidades moleculares, como outro anticorpo ou fragmento de anticorpo tendo um segunda especificidade de ligação ao antígeno para produzir uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica. Formatos biespecíficos específicos que podem ser utilizados no contexto da presente invenção incluem, sem limitação, por exemplo, formatos biespecíficos baseados em scFv ou em diacorpos, fusões de IgG-scFv, (DVD)-Ig de domínio variável duplo, Quadroma, manípulos nos orifícios, cadeia leve comum (por exemplo, cadeia leve comum com protuberâncias-em-buracos, etc.), corpo CrossMab, CrossFab (SEED), zíper de leucina, Duobody, IgG1/IgG2, Fab de ação dupla (DAF) -IgG e Mab2 formatos biespecíficos (ver, por exemplo, Klein et al. 2012, mAbs 4: 6, 1-11 e referências citadas nele, para uma revisão dos formatos anteriores).

[00155] No contexto de moléculas de ligação a antígeno biespecíficas da presente invenção, os domínios de multimerização, por exemplo, domínios Fc, podem compreender uma ou mais alterações de aminoácidos (por exemplo, inserções, deleções ou substituições) em comparação com o tipo selvagem, versão de ocorrência natural do domínio Fc. Por exemplo, a invenção inclui moléculas de ligação a antígeno biespecíficas compreendendo uma ou mais modificações no domínio Fc que resulta em um domínio Fc modificado com uma interação de ligação modificada (por exemplo, aumentada ou diminuída) entre Fc e FcRn. Em uma modalidade, a molécula de ligação ao antígeno biespecífico compreende uma modificação em uma região CH2 ou uma CH3, em que a modificação aumenta a afinidade do domínio Fc para FcRn em um ambiente acídico (por exemplo, em um endossoma onde o pH varia de cerca de 5,5 a cerca de 6,0). Exemplos não limitativos de tais modificações Fc incluem, por exemplo, uma modificação na posição 250 (por exemplo, E ou Q); 250 e 428 (por exemplo, L ou F); 252 (por exemplo, L/Y/F/W ou T), 254 (por exemplo, S ou T) e 256 (por exemplo, S/R/Q/E/D ou T); ou uma modificação na posição 428 e/ou 433 (por exemplo, L/R/S/P/Q ou K) e/ou 434 (por exemplo, H/F ou Y); ou uma modificação na posição 250 e/ou 428; ou uma modificação na posição 307 ou 308 (por exemplo, F ou P) e 434. Em uma modalidade, a modificação compreende uma modificação 428L (por exemplo, M428L) e 434S (por exemplo, N434S); uma modificação 428L, 259I (por exemplo, V259I) e 308F (por exemplo, V308F); uma modificação 433K (por exemplo, H433K) e uma 434 (por exemplo, 434Y); uma modificação 252, 254 e 256 (por exemplo, 252Y, 254T e 256E); uma modificação 250Q e 428L (por exemplo, T250Q e M428L); e uma modificação 307 e/ou 308 (por exemplo, 308F ou 308P).

[00156] A presente invenção também inclui moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas compreendendo um primeiro domínio CH3 de imunoglobulina e um segundo domínio CH3 de Ig, em que o primeiro e segundo domínios CH3 de Ig diferem um do outro por pelo menos um aminoácido e em que pelo menos uma diferença de aminoácido reduz a ligação do anticorpo biespecífico à Proteína A em comparação com um anticorpo biespecífico sem a diferença de aminoácido. Em uma modalidade, o primeiro domínio Ig CH3 de Ig se liga à Proteína A e o segundo domínio Ig CH3 contém uma mutação que reduz ou elimina a ligação da Proteína A, tal como uma modificação de H95R (pela numeração de éxon IMGT; H435R por numeração EU). O segundo CH3 pode ainda compreender uma modificação Y96F (por IMGT; Y436F por EU). Ver, por exemplo, Patente U.S. 8.586.713. Modificações adicionais que podem ser encontradas no segundo CH3 incluem: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M e V82I (por IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M e V422I por EU) no caso de anticorpos IgG1; N44S, K52N e V82I (IMGT; N384S, K392N e V422I por EU) no caso de anticorpos IgG2; e Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q e V82I (por IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q e V422I por EU) no caso de anticorpos IgG4.

[00157] Em certas modalidades, o domínio Fc pode ser quimérico,

combinando sequências Fc derivadas de mais de um isótipo de imunoglobulina. Por exemplo, um domínio Fc quimérico pode compreender parte ou a totalidade de uma sequência CH2 derivada de uma região CH2 de IgG1 humana, IgG2 humana ou IgG4 humana, e parte ou a totalidade de uma sequência CH3 derivada de uma IgG1 humana, IgG2 humana ou IgG4 humana. Um domínio Fc quimérico também pode conter uma região de dobradiça quimérica. Por exemplo, uma dobradiça quimérica pode compreender uma sequência de "dobradiça superior", derivada de uma região de dobradiça de IgG1 humana, IgG2 humana ou IgG4 humana, combinada com uma sequência de "dobradiça inferior", derivada de uma região de dobradiça de IgG1 humana, IgG2 humana ou IgG4 humana. Um exemplo particular de um domínio Fc quimérico que pode ser incluído em qualquer uma das moléculas de ligação ao antígeno aqui estabelecidas compreende, do terminal N ao C: [IgG4 CH1] - [IgG4 dobradiça superior] - [IgG2 dobradiça inferior] - [IgG4 CH2] - [IgG4 CH3]. Outro exemplo de um domínio Fc quimérico que pode ser incluído em qualquer uma das moléculas de ligação ao antígeno aqui estabelecidas compreende, do terminal N ao C: [IgG1 CH1] - [IgG1 dobradiça superior] - [IgG2 dobradiça inferior] - [IgG4 CH2] - [IgG1 CH3]. Estes e outros exemplos de domínios Fc quiméricos que podem ser incluídos em qualquer uma das moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção são descritos na Publicação US 2014/0243504, publicada em 28 de agosto de 2014, que é incorporada neste documento em sua totalidade. Os domínios Fc quiméricos com estes arranjos estruturais gerais, e variantes, podem ter a ligação ao receptor Fc alterada, que por sua vez afeta a função efetora de Fc.

[00158] Em certas modalidades, a invenção fornece uma cadeia pesada de anticorpo em que a região da região constante da cadeia pesada (CH) compreende uma sequência de aminoácidos de pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% idêntica a qualquer uma das SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 ou SEQ ID NO: 56. Em algumas modalidades, a região da região constante da cadeia pesada (CH) compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 e SEQ ID NO: 56. Variantes de Sequência

[00159] Os anticorpos e moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da presente invenção podem compreender uma ou mais substituições de aminoácidos, inserções e/ou deleções na estrutura e/ou regiões CDR dos domínios variáveis da cadeia pesada e leve em comparação com as sequências de linhagem germinativa correspondentes dos quais os domínios de ligação ao antígeno individuais foram derivados. Tais mutações podem ser prontamente determinadas comparando as sequências de aminoácidos aqui divulgadas com as sequências da linhagem germinal disponíveis, por exemplo, nas bases de dados de sequências de anticorpos públicas. As moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção podem compreender domínios de ligação ao antígeno que são derivados de qualquer uma das sequências de aminoácidos exemplificativas divulgadas neste documento, em que um ou mais aminoácidos dentro de uma ou mais regiões estruturais e/ou CDR são mutadas para o(s) resíduo(s) correspondente(s) da sequência da linhagem germinativa a partir da qual o anticorpo foi derivado, ou ao(s) resíduo(s) correspondente(s) de outra sequência da linhagem germinativa humana, ou a uma substituição conservativa de aminoácidos do(s) resíduo(s) da linhagem germinativa correspondente (tais alterações de sequência são referidas aqui coletivamente como "mutações da linhagem germinativa"). Um versado na técnica, começando com as sequências da região variável da cadeia pesada e leve aqui descritas,

pode facilmente produzir inúmeros anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno que compreendem uma ou mais mutações da linhagem germinativa individuais ou combinações dos mesmos.

Em certas modalidades, todos os resíduos de estrutura e/ou CDR dentro dos domínios VH e/ou VL são mutados de volta para os resíduos encontrados na sequência da linhagem germinativa original da qual o domínio de ligação ao antígeno foi originalmente derivado.

Em outras modalidades, apenas certos resíduos são mutados de volta para a sequência da linhagem germinativa original, por exemplo, apenas os resíduos mutados encontrados nos primeiros 8 aminoácidos do FR1 ou nos últimos 8 aminoácidos do FR4, ou apenas os resíduos mutados encontrados na CDR1, CDR2 ou CDR3. Em outras modalidades, um ou mais da estrutura e/ou resíduo(s) de CDR são mutados para o(s) resíduo(s) correspondente(s) de uma sequência de linhagem germinativa diferente (isto é, uma sequência de linhagem germinativa que é diferente da sequência de linhagem germinativa da qual o domínio de ligação ao antígeno foi originalmente derivado). Além disso, os domínios de ligação ao antígeno podem conter qualquer combinação de duas ou mais mutações da linhagem germinativa dentro da estrutura e/ou regiões CDR, por exemplo, em que certos resíduos individuais são mutados para o resíduo correspondente de uma determinada sequência da linhagem germinativa, enquanto certos outros resíduos que diferem da sequência da linhagem germinativa original são mantidos ou são mutados para o resíduo correspondente de uma sequência diferente da linhagem germinativa.

Uma vez obtidos, domínios de ligação ao antígeno que contêm uma ou mais mutações da linhagem germinativa podem ser facilmente testados para uma ou mais propriedades desejadas, tais como especificidade de ligação melhorada, maior afinidade de ligação, propriedades biológicas antagonísticas ou agonísticas intensificadas ou aumentadas (conforme o caso pode ser),

imunogenicidade reduzida, etc. Moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas compreendendo um ou mais domínios de ligação a antígeno obtidos desta maneira geral estão incluídas na presente invenção.

[00160] A presente invenção também inclui moléculas de ligação ao antígeno em que um ou ambos os domínios de ligação ao antígeno compreendem variantes de qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCVR, LCVR e/ou CDR divulgadas neste documento tendo uma ou mais substituições conservativas. Por exemplo, a presente invenção inclui moléculas de ligação ao antígeno compreendendo um domínio de ligação ao antígeno com sequências de aminoácidos de HCVR, LCVR e/ou CDR com, por exemplo, 10 ou menos, 8 ou menos, 6 ou menos, 4 ou menos, etc. Substituições conservativas de aminoácidos em relação a qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCVR, LCVR e/ou CDR aqui divulgadas. Uma "substituição conservativa de aminoácido" é aquela em que um resíduo de aminoácido é substituído por outro resíduo de aminoácido possuindo uma cadeia lateral (grupo R) com propriedades químicas semelhantes (por exemplo, carga ou hidrofobicidade). Em geral, uma substituição conservativa de aminoácidos não altera substancialmente as propriedades funcionais de uma proteína. Exemplos de grupos de aminoácidos que possuem cadeias laterais com propriedades químicas semelhantes incluem (1) cadeias laterais alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; (2) cadeias laterais de hidroxil alifático: serina e treonina; (3) cadeias laterais contendo amida: asparagina e glutamina; (4) cadeias laterais aromáticas: fenilalanina, tirosina e triptofano; (5) cadeias laterais básicas: lisina, arginina e histidina; (6) cadeias laterais acídicas: aspartato e glutamato, e (7) cadeias laterais contendo enxofre são cisteína e metionina. Os grupos de substituição conservativa de aminoácidos preferidos são: valina-leucina-isoleucina,

fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato e asparagina-glutamina. Alternativamente, uma substituição conservativa é qualquer alteração que tenha um valor positivo na matriz de verossimilhança logarítmica de PAM250 divulgada em Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-1445, aqui incorporado por referência. Uma substituição "moderadamente conservativa" é qualquer alteração que tenha um valor não negativo na matriz de verossimilhança logarítmica de PAM250.

[00161] A presente invenção também inclui moléculas de ligação ao antígeno compreendendo um domínio de ligação ao antígeno com uma sequência de aminoácidos de HCVR, LCVR e/ou CDR que é substancialmente idêntica a qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCVR, LCVR e/ou CDR divulgadas neste documento. O termo "identidade substancial" ou "substancialmente idêntica", quando se refere a uma sequência de aminoácidos, significa que duas sequências de aminoácidos, quando alinhadas de forma otimizada, como pelos programas GAP ou BESTFIT usando pesos de lacuna padrão, compartilham pelo menos 95% de identidade de sequência, ainda mais preferencialmente pelo menos 98% ou 99% de identidade de sequência. Preferivelmente, as posições de resíduos que não são idênticos diferem por substituições de aminoácidos conservativas. Nos casos em que duas ou mais sequências de aminoácidos diferem umas das outras por substituições conservativas, a porcentagem de identidade de sequência ou grau de semelhança pode ser ajustada para cima para corrigir a natureza conservativa da substituição. Os meios para realizar este ajuste são bem conhecidos pelos versados na técnica. Ver, por exemplo, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-331, aqui incorporado por referência.

[00162] A similaridade de sequência para polipeptídeos, que também é referida como identidade de sequência, é tipicamente medida usando software de análise de sequência. O software de análise de proteínas combina sequências semelhantes usando medidas de semelhanças atribuídas a várias substituições, deleções e outras modificações, incluindo substituições conservativas de aminoácidos. Por exemplo, o software GCG contém programas como Gap e Bestfit que podem ser usados com parâmetros padrão para determinar a homologia de sequência ou identidade de sequência entre polipeptídeos intimamente relacionados, como polipeptídeos homólogos de diferentes espécies de organismos ou entre uma proteína de tipo selvagem e uma muteína da mesma. Ver, por exemplo, GCG Versão 6.1. As sequências polipeptídicas também podem ser comparadas usando FASTA usando parâmetros padrão ou recomendados, um programa no GCG Versão

6.1. FASTA (por exemplo, FASTA2 e FASTA3) fornece alinhamentos e identidade de sequência percentual das regiões da melhor sobreposição entre as sequências de consulta e pesquisa (Pearson (2000) supra). Outro algoritmo preferido quando se compara uma sequência da invenção com uma base de dados contendo um grande número de sequências de organismos diferentes é o programa de computador BLAST, especialmente BLASTP ou TBLASTN, utilizando parâmetros por defeito. Ver, por exemplo, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 and Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389- 402, cada aqui incorporado por referência. Ligação Dependente de pH

[00163] A presente invenção inclui anticorpos anti-FcεR1α e moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-FcεR1α, com características de ligação dependentes do pH. Por exemplo, um anticorpo anti-FcεR1α da presente invenção pode exibir ligação reduzida a FcεR1α em pH acídico em comparação com pH neutro. Alternativamente, os anticorpos anti-FcεR1α da invenção podem exibir ligação intensificada a FcεR1α em pH acídico em comparação com pH neutro. A expressão "pH acídico" inclui valores de pH inferiores a cerca de 6,2, por exemplo, cerca de 6,0, 5,95, 5,9, 5,85, 5,8, 5,75, 5,7, 5,65, 5,6, 5,55, 5,5, 5,45, 5,4, 5,35, 5,3, 5,25 , 5,2, 5,15, 5,1, 5,05, 5,0 ou menos. Como utilizado neste documento, a expressão "pH neutro" significa um pH de cerca de 7,0 a cerca de 7,4. A expressão "pH neutro" inclui valores de pH de cerca de 7,0, 7,05, 7,1, 7,15, 7,2, 7,25, 7,3, 7,35 e 7,4.

[00164] Em certos casos, "ligação reduzida ... em pH acídico em comparação com pH neutro" é expressa em termos de uma razão do valor KD da ligação do anticorpo ao seu antígeno em pH acídico para o valor KD da ligação do anticorpo ao seu antígeno em pH neutro (ou vice- versa). Por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode ser considerado como exibindo "ligação reduzida a FcεR1α em pH acídico em comparação com pH neutro" para os fins da presente invenção se o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo exibir uma razão de KD acídica/ neutra de cerca de 3,0 ou superior. Em certas modalidades exemplificativas, a razão KD acídica/neutra para um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção pode ser cerca de 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 10,5, 11,0, 11,5, 12,0, 12,5, 13,0, 13,5, 14,0, 14,5, 15,0, 20,0, 25,0, 30,0, 40,0, 50,0, 60,0, 70,0, 100,0 ou superior.

[00165] Anticorpos com características de ligação dependentes do pH podem ser obtidos, por exemplo, por rastreio de uma população de anticorpos para ligação reduzida (ou intensificada) a um antígeno particular em pH ácido em comparação com o pH neutro. Adicionalmente, modificações do domínio de ligação ao antígeno ao nível de aminoácidos podem originar anticorpos com características dependentes do pH. Por exemplo, substituindo um ou mais aminoácidos de um domínio de ligação ao antígeno (por exemplo, dentro de uma

CDR) com um resíduo de histidina, pode ser obtido um anticorpo com ligação ao antígeno reduzida em pH acídico relativamente a pH neutro. Anticorpos Compreendendo Variantes Fc

[00166] De acordo com certas modalidades da presente invenção, anticorpos anti-FcεR1α e moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-FcεR1α são fornecidos compreendendo um domínio Fc compreendendo uma ou mais mutações que aumentam ou diminuem a ligação do anticorpo ao receptor FcRn, por exemplo, em pH acídico em comparação com pH neutro. Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos que compreendem uma mutação na região CH2 ou CH3 do domínio Fc, em que a(s) mutação(ões) aumenta a afinidade do domínio Fc para FcRn em um ambiente acídico (por exemplo, em um endossoma onde o pH varia de cerca de 5,5 a cerca de 6,0). Tais mutações podem resultar num aumento da meia vida no soro do anticorpo quando administrado a um animal. Exemplos não limitativos de tais modificações Fc incluem, por exemplo, uma modificação na posição 250 (por exemplo, E ou Q); 250 e 428 (por exemplo, L ou F); 252 (por exemplo, L/Y/F/W ou T), 254 (por exemplo, S ou T) e 256 (por exemplo, S/R/Q/E/D ou T); ou uma modificação na posição 428 e/ou 433 (por exemplo, H/L/R/S/P/Q ou K) e/ou 434 (por exemplo, H/F ou Y); ou uma modificação na posição 250 e/ou 428; ou uma modificação na posição 307 e/ou 308 (por exemplo, F ou P) e 434. Em uma modalidade, a modificação compreende uma modificação 428L (por exemplo, M428L) e 434S (por exemplo, N434S); uma modificação 428L, 259I (por exemplo, V259I) e 308F (por exemplo, V308F); uma modificação 433K (por exemplo, H433K) e uma 434 (por exemplo, 434Y); uma modificação 252, 254 e 256 (por exemplo, 252Y, 254T e 256E); uma modificação 250Q e 428L (por exemplo, T250Q e M428L); uma modificação 307 e/ou uma modificação 308 (por exemplo, 308F ou 308P).

[00167] Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos anti- FcεR1α e moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas anti-CD3/anti- FcεR1α, compreendendo um domínio Fc compreendendo um ou mais pares ou grupos de mutações selecionadas do grupo que consiste em: 250Q e 248L (por exemplo, T250Q e M248L); 252Y, 254T e 256E (por exemplo, M252Y, S254T e T256E); 428L e 434S (por exemplo, M428L e N434S); e 433K e 434F (por exemplo, H433K e N434F). Todas as combinações possíveis das mutações do domínio Fc anteriores e outras mutações dentro dos domínios variáveis do anticorpo aqui divulgados estão contempladas no âmbito da presente invenção. Características biológicas dos anticorpos e moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas

[00168] De acordo com certas modalidades, a presente invenção inclui anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno de anticorpos que ligam FcεR1α humano (por exemplo, a 25ºC) com um KD de menos de cerca de 303 nM ou ligam FcεR1α cynomolgus (por exemplo, a 25ºC) com um KD de menos que cerca de 467 nM, conforme medido pela ressonância plasmônica de superfície, por exemplo, usando um formato de ensaio conforme definido no Exemplo 3 neste documento. Em certas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno da presente invenção ligam FcεR1α humano ou cynomolgus com um KD de menos que cerca de 400 nM, menos que cerca de 500 nM, menos que cerca de 450 nM, menos que cerca de 400 nM, menos que cerca de 350 nM, menos que cerca de 300 nM, menos que cerca de 250 nM, menos que cerca de 200 nM, menos que cerca de 150 nM, ou menos que cerca de 100 nM, conforme medido pela ressonância plasmônica de superfície, por exemplo, usando um formato de ensaio conforme definido no Exemplo 3 aqui (por exemplo, captura de mAb ou formato de captura de antígeno), ou um ensaio substancialmente semelhante. A presente invenção inclui moléculas de ligação a antígeno biespecíficas

(por exemplo, anticorpos biespecíficos que se ligam a FcεR1α humano ou cynomolguscom um KD inferior a cerca de 467 nM, conforme medido por ressonância plasmônicas de superfície, por exemplo, usando um formato de ensaio conforme definido no Exemplo 3 neste documento (por exemplo, captura de mAb ou formato de captura de antígeno), ou um ensaio substancialmente semelhante.

[00169] A presente invenção também inclui anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam a FcεR1α humano com uma meia-vida dissociativa (t½) maior que cerca de 0,2 minuto ou maior que cerca de 0,5 minuto ou ligam FcεR1α cynomolgus com uma meia-vida dissociativa (t½) superior a cerca de 0,3 minutos ou superior a cerca de 0,6 minutos, conforme medido por ressonância plasmônica de superfície a 25ºC, por exemplo, usando um formato de ensaio conforme definido no Exemplo 3 neste documento, ou um ensaio substancialmente semelhante. A presente invenção inclui moléculas de ligação a antígeno biespecíficas (por exemplo, anticorpos biespecíficos) que se ligam a FcεR1α humano ou cynomolgus com um KD superior a cerca de 0,54 minuto ou superior a cerca de 1,1 minutos, conforme medido pela ressonância plasmônica de superfície a 25ºC, por exemplo, usando um formato de ensaio conforme definido no Exemplo 3 aqui, ou um ensaio substancialmente semelhante.

[00170] A presente invenção também inclui anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam especificamente a linhagens de células humanas que expressam FcεR1α humano ou cynomolgus (por exemplo, células HEK293 engenheiradas para expressar FcεR1α humano ou cynomolgus), conforme determinado por um ensaio de detecção baseado em citometria de fluxo como estabelecido no Exemplo 4 ou um ensaio substancialmente semelhante.

[00171] A presente invenção também inclui moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-FcεR1α que exibem uma ou mais características selecionadas do grupo que consiste em: (a) ligação a FcεR1α expresso na superfície celular na ausência ou presença de IgE (ver, por exemplo, Exemplo 4); (b) ativação da sinalização de CD3 humano na presença de células que expressam FcεR1α (ver, por exemplo, Exemplo 5); (c) indução da apoptose mediada por células T de células que expressam FcεR1α in vitro (ver, por exemplo, Exemplo 6); (d) indução da morte de basófilos mediada por células T em uma população de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) in vitro (ver, por exemplo, Exemplo 6); (e) bloqueio da desgranulação de mastócitos induzida por alérgeno (por exemplo, anafilaxia) em camundongos que expressam FcεR1α humano (ver, por exemplo, Exemplo 7); e (f) depleção de basófilos esplênicos em camundongos que expressam FcεR1α humano (ver, por exemplo, Exemplo 7).

[00172] A presente invenção inclui anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam a CD3 humano com alta afinidade. A presente invenção também inclui anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno que se ligam a CD3 humano com afinidade média ou baixa, dependendo do contexto terapêutico e das propriedades de direcionamento específicas que são desejadas. A presente invenção também inclui anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam a CD3 humano com afinidade mensurável. Por exemplo, no contexto de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífico, em que um braço se liga a CD3 e outro braço se liga a um antígeno alvo (por exemplo, FcεR1α), pode ser desejável que o braço de ligação ao antígeno alvo se ligue ao antígeno alvo com alta afinidade enquanto o braço anti-CD3 se ligue ao CD3 com afinidade apenas moderada ou baixa ou nenhuma afinidade. Desta forma, o direcionamento preferencial da molécula de ligação ao antígeno a células que expressam o antígeno alvo pode ser alcançado, evitando a ligação de CD3 geral/não direcionada e os consequentes efeitos colaterais adversos associados a ela.

[00173] A presente invenção inclui moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas (por exemplo, anticorpos biespecíficos) que são capazes de se ligar simultaneamente a CD3 humano e a FcεR1α humano. O braço de ligação que interage com células que expressam CD3 pode ter ligação fraca ou nenhuma ligação detectável, conforme medido em um ensaio de ligação in vitro adequado. A extensão em que uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica se liga a células que expressam CD3 e/ou FcεR1α pode ser avaliada por classificação de células ativadas por fluorescência (FACS), conforme ilustrado no Exemplo 4 aqui.

[00174] Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos, fragmentos de ligação ao antígeno e anticorpos biespecíficos dos mesmos que se ligam especificamente a linhagens de células T humanas que expressam CD3, mas não expressam FcεR1α, células T de primatas (por exemplo, células mononucleares de sangue periférico de cynomolgus [PBMCs]) e/ou células que expressam FcεR1α.

[00175] A presente invenção inclui anticorpos, fragmentos de ligação ao antígeno e anticorpos biespecíficos dos mesmos que se ligam a CD3 humano com afinidade fracaisto é, baixa) ou mesmo nenhuma afinidade detectável.

[00176] A presente invenção inclui anticorpos, fragmentos de ligação ao antígeno e anticorpos biespecíficos dos mesmos que se ligam a CD3 de macaco (cynomolgus) com fracaisto é, baixa) ou mesmo nenhuma afinidade detectável.

[00177] A presente invenção inclui anticorpos, fragmentos de ligação ao antígeno e anticorpos biespecíficos dos mesmos que se ligam a CD3 humano e induzem a ativação de células T.

[00178] A presente invenção inclui moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-FcεR1α que são capazes de inibir a resposta alérgica e/ou depletar células que expressam FcεR1α em um sujeito (ver, por exemplo, Exemplo 7, em um ensaios de anafilaxia cutânea passiva (PCA) ou um ensaio baseado em citometria de fluxo, ou ensaios substancialmente semelhantes). Por exemplo, de acordo com certas modalidades, as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-FcεR1α são fornecidas, em que uma única administração de 25 mg/kg da molécula de ligação ao antígeno biespecífica a um sujeito causa uma redução no número de células que expressam FcεR1α no sujeito (por exemplo, o número de basófilos esplênicos é significativamente reduzido). Mapeamento de Epitopo e Tecnologias Relacionadas

[00179] O epitopo em CD3 e/ou FcεR1α ao qual as moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção se ligam pode consistir em uma única sequência contígua de 3 ou mais (por exemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais) aminoácidos de uma proteína CD3 ou FcεR1α. Alternativamente, o epitopo pode consistir em uma pluralidade de aminoácidos não contíguos (ou sequências de aminoácidos) de CD3 ou FcεR1α. Os anticorpos da invenção podem interagir com aminoácidos contidos em uma única cadeia CD3 (por exemplo, CD3-epsilon, CD3-delta ou CD3-gama), ou podem interagir com aminoácidos em duas ou mais cadeias CD3 diferentes. O termo "epitopo", como utilizado neste documento, refere- se a um determinante antigênico que interage com um sítio de ligação de antígeno específico na região variável de uma molécula de anticorpo conhecida como parátopo. Um antígeno simples pode ter mais de um epitopo. Assim, diferentes anticorpos podem se ligar a diferentes áreas de um antígeno e podem ter diferentes efeitos biológicos. Os epitopos podem ser conformacionais ou lineares. Um epitopo conformacional é produzido por aminoidos espacialmente justapostos de diferentes segmentos da cadeia polipeptídica linear. Um epitopo linear é aquele produzido por resíduos de aminoácidos adjacentes em uma cadeia polipeptídica. Em certas circunstâncias, um epitopo pode incluir frações de sacarídeos, grupos fosforil ou grupos sulfonil no antígeno.

[00180] Várias técnicas conhecidas pelos versados na técnica podem ser usadas para determinar se um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo "interage com um ou mais aminoácidos" dentro de um polipeptídeo ou proteína. Técnicas exemplificativas incluem, por exemplo, ensaio de bloqueio cruzado de rotina, tal como o descrito Antibodies, Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY), alanine scanning mutational analysis, peptide blots analysis (Reineke, 2004, Methods Mol Biol 248:443-463), e análise de clivagem de peptídeo. Adicionalmente, podem ser empregados métodos, tais como excisão de epitopos, extração de epitopos e modificação química de antígenos (Tomer, 2000, Protein Science 9:487- 496). Outro método que pode ser usado para identificar os aminoácidos dentro de um polipeptídeo com o qual um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo interage é a troca de hidrogênio/deutério detectada por espectrometria de massa. Em termos gerais, o método de troca hidrogênio/deutério envolve a marcação da proteína de interesse pelo deutério, seguida da ligação do anticorpo à proteína marcada com deutério. Em seguida, o complexo proteína/anticorpo é transferido para água para permitir que a troca de hidrogênio-deutério ocorra em todos os resíduos, exceto para os resíduos protegidos pelo anticorpo (que permanecem marcados com deutério). Após a dissociação do anticorpo, a proteína alvo é submetida à clivagem por protease e análise de espectrometria de massa, revelando assim os resíduos marcados com deutério que correspondem aos aminoácidos específicos com os quais o anticorpo interage. Ver, por exemplo, Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; Engen and Smith (2001) Anal. Chem. 73:256A-265A. A cristalografia de raios-X do complexo antígeno/anticorpo também pode ser usada para fins de mapeamento de epitopos.

[00181] A presente invenção inclui ainda anticorpos anti-FcεR1α que se ligam ao mesmo epitopo que qualquer um dos anticorpos exemplificativos específicos aqui descritos (por exemplo , anticorpos compreendendo qualquer uma das sequências de aminoácidos conforme estabelecido na Tabela 1 aqui). Da mesma forma, a presente invenção também inclui anticorpos anti-FcεR1α que competem pela ligação a FcεR1α com qualquer um dos anticorpos exemplificativos específicos aqui descritos (por exemplo , anticorpos compreendendo qualquer uma das sequências de aminoácidos conforme estabelecido na Tabela 1 aqui).

[00182] A presente invenção também inclui moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas compreendendo um primeiro domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a CD3 humano e/ou CD3 cynomolgus com afinidade de ligação baixa ou detectável e um segundo domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a FcεR1α humano ou cynomolgus, em que o primeiro domínio de ligação ao antígeno se liga ao mesmo epitopo em CD3 que qualquer um dos domínios de ligação ao antígeno específicos de CD3 exemplificativos específicos aqui descritos e/ou em que o segundo domínio de ligação ao antígeno se liga ao mesmo epitopo em FcεR1α como qualquer um dos domínios de ligação ao antígeno específicos de FcεR1α exemplificativos aqui descritos.

[00183] Da mesma forma, a presente invenção também inclui moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas compreendendo um primeiro domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a CD3 humano e um segundo domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a FcεR1α humano, em que o primeiro domínio de ligação ao antígeno compete pela ligação a CD3 com qualquer um dos domínios de ligação ao antígeno específicos de CD3 exemplificativos específicos aqui descritos, e/ou em que o segundo domínio de ligação ao antígeno compete pela ligação a FcεR1α com qualquer um dos domínios de ligação ao antígeno específicos de FcεR1α exemplificativos específicos aqui descritos.

[00184] Pode-se facilmente determinar se uma determinada molécula de ligação ao antígeno (por exemplo, anticorpo) ou domínio de ligação ao antígeno do mesmo se liga ao mesmo epitopo ou compete pela ligação com uma molécula de ligação ao antígeno de referência da presente invenção usando métodos de rotina conhecidos na técnica. Por exemplo, para determinar se um anticorpo de teste se liga ao mesmo epitopo em FcεR1α (ou CD3) como uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica de referência da presente invenção, a molécula biespecífica de referência é primeiro permitida a se ligar a uma proteína FcεR1α (ou proteína CD3). Em seguida, é avaliada a capacidade de um anticorpo de teste de se ligar à molécula FcεR1α (ou CD3). Se o anticorpo de teste for capaz de se ligar a FcεR1α (ou CD3) após a ligação de saturação com a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de referência, pode-se concluir que o anticorpo de teste se liga a um epitopo diferente de FcεR1α (ou CD3) do que a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de referência. Por outro lado, se o anticorpo de teste não for capaz de se ligar à molécula FcεR1α (ou CD3) após a ligação de saturação com a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de referência, então o anticorpo de teste pode se ligar ao mesmo epitopo de FcεR1α (ou CD3) como o epitopo ligado pela molécula de ligação ao antígeno biespecífica de referência da invenção. Experiências de rotina adicional (por exemplo, mutação de peptídeo e análises de ligação) podem então ser realizadas para confirmar se a falta observada de ligação do anticorpo de teste é de fato devido à ligação ao mesmo epitopo que a molécula de ligação ao antígeno biespecífico de referência ou se o bloqueio estérico (ou outro fenômeno) é responsável pela falta de ligação observada. Experiências deste tipo podem ser realizadas usando ELISA, RIA, Biacore, citometria de fluxo ou qualquer outro ensaio quantitativo ou qualitativo de ligação ao anticorpo disponível na técnica. De acordo com certas modalidades da presente invenção, duas proteínas de ligação ao antígeno ligam-se ao mesmo (ou sobreposição) epitopo se, por exemplo, um excesso de 1-, 5-, 10, 20 ou 100 vezes de uma proteína de ligação ao antígeno inibe a ligação da outra em pelo menos 50%, mas de preferência 75%, 90% ou mesmo 99%, conforme medido em um ensaio de ligação competitiva (ver, por exemplo, Junghans et al., Cancer Res. 1990:50:1495-1502). Alternativamente, duas proteínas de ligação ao antígeno são consideradas como ligando-se ao mesmo epitopo se essencialmente todas as mutações de aminoácidos no antígeno que reduzem ou eliminam a ligação de uma proteína de ligação ao antígeno reduzem ou eliminam a ligação da outra. Duas proteínas de ligação ao antígeno são consideradas como tendo "epitopos sobrepostos" se apenas um subconjunto das mutações de aminoácidos que reduzem ou eliminam a ligação de uma proteína de ligação ao antígeno reduzem ou eliminam a ligação da outra.

[00185] Para determinar se um anticorpo ou domínio de ligação ao antígeno do mesmo compete pela ligação com uma molécula de ligação ao antígeno de referência, a metodologia de ligação acima descrita é realizada em duas orientações: Em uma primeira orientação, a molécula de ligação ao antígeno de referência pode se ligar a uma proteína FcεR1α (ou proteína CD3) sob condições de saturação seguida pela avaliação da ligação do anticorpo de teste à molécula FcεR1α (ou CD3). Em uma segunda orientação, o anticorpo de teste pode se ligar a uma molécula FcεR1α (ou CD3) sob condições de saturação, seguido pela avaliação da ligação da molécula de ligação ao antígeno de referência à molécula FcεR1α (ou CD3). Se, em ambas as orientações, apenas a primeira (saturação) molécula de ligação ao antígeno for capaz de se ligar à molécula FcεR1α (ou CD3), então conclui-se que o anticorpo de teste e a molécula de ligação ao antígeno de referência competem pela ligação a FcεR1α ( ou CD3). Como será apreciado por um versado na técnica, um anticorpo que compete pela ligação com uma molécula de ligação ao antígeno de referência pode não necessariamente se ligar ao mesmo epitopo que o anticorpo de referência, mas pode bloquear estericamente a ligação do anticorpo de referência por ligar um epitopo sobreposto ou adjacente. Preparação de domínios de ligação ao antígeno e construção de moléculas biespecíficas

[00186] Os domínios de ligação ao antígeno específicos para antígenos particulares podem ser preparados por qualquer tecnologia de geração de anticorpos conhecida na técnica. Uma vez obtidos, dois domínios de ligação ao antígeno diferentes, específicos para dois antígenos diferentes (por exemplo, CD3 e FcεR1α), podem ser apropriadamente arranjados um em relação ao outro para produzir uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica da presente invenção usando métodos de rotina. (Uma discussão de formatos de anticorpos biespecíficos exemplificativos que podem ser usados para construir as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da presente invenção é fornecida em outro lugar neste documento). Em certas modalidades, um ou mais dos componentes individuais (por exemplo, cadeias pesadas e leves) das moléculas de ligação ao antígeno multiespecíficas da invenção são derivados de anticorpos quiméricos, humanizados ou totalmente humanos. Os métodos para produzir tais anticorpos são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, uma ou mais das cadeias pesadas e/ou leves das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da presente invenção podem ser preparadas usando a tecnologia

VELOCIMMUNE™. Usando a tecnologia VELOCIMMUNE™ (ou qualquer outra tecnologia de geração de anticorpo humano), anticorpos quiméricos de alta afinidade para um antígeno particular (por exemplo, CD3 ou FcεR1α) são inicialmente isolados tendo uma região variável humana e uma região constante de camundongo. Os anticorpos são caracterizados e selecionados pelas características desejáveis, incluindo afinidade, seletividade, epitopo, etc. As regiões constantes de camundongo são substituídas por uma região constante humana desejada para gerar cadeias pesadas e/ou leves totalmente humanas que podem ser incorporadas nas moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da presente invenção.

[00187] Animais geneticamente modificados podem ser usados para fazer moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas humanas. Por exemplo, um camundongo geneticamente modificado pode ser usado que é incapaz de reorganizar e expressar uma sequência variável de cadeia leve de imunoglobulina de camundongo endógena, em que o camundongo expressa apenas um ou dois domínios variáveis de cadeia leve humana codificados por sequências de imunoglobulina humana operacionalmente ligadas ao gene constante kappa de camundongo no locus kappa de camundongo endógeno. Tais camundongos geneticamente modificados podem ser usados para produzir moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas totalmente humanas compreendendo duas cadeias pesadas diferentes que se associam a uma cadeia leve idêntica que compreende um domínio variável derivado de um de dois segmentos genéticos de região variável da cadeia leve humana diferentes. (Ver, por exemplo, US 2011/0195454). Totalmente humano refere-se a um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno ou domínio de imunoglobulina do mesmo, compreendendo uma sequência de aminoácidos codificada por um DNA derivado de uma sequência humana ao longo de todo o comprimento de cada polipeptídeo do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno ou domínio de imunoglobulina do mesmo. Em alguns casos, a sequência totalmente humana é derivada de uma proteína endógena a um humano. Em outros casos, a proteína ou sequência de proteína totalmente humana compreende uma sequência quimérica em que cada sequência de componente é derivada de sequência humana. Embora não sejam limitados por nenhuma teoria, proteínas quiméricas ou sequências quiméricas são geralmente concebidas para minimizar a criação de epitopos imunogênicos nas junções de sequências componentes, por exemplo , em comparação com quaisquer regiões ou domínios de imunoglobulina humana de tipo selvagem. Bioequivalentes

[00188] A presente invenção abrange moléculas de ligação ao antígeno possuindo sequências de aminoácidos que variam daquelas das moléculas exemplificativas aqui divulgadas, mas que retêm a capacidade de se ligar a CD3 e/ou FcεR1α. Essas moléculas variantes podem compreender uma ou mais adições, deleções ou substituições de aminoácidos quando comparadas com a sequência parental, mas exibem atividade biológica que é essencialmente equivalente à das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas descritas.

[00189] A presente invenção inclui moléculas de ligação ao antígeno que são bioequivalentes a qualquer uma das moléculas de ligação ao antígeno exemplificativas aqui estabelecidas. Duas proteínas de ligação ao antígeno, ou anticorpos, são consideradas bioequivalentes se, por exemplo, forem equivalentes farmacêuticos ou alternativas farmacêuticas cuja taxa e extensão de absorção não mostram uma diferença significativa quando administradas na mesma dose molar sob condições experimentais semelhantes, seja dose única ou doses múltiplas. Algumas proteínas de ligação ao antígeno serão consideradas equivalentes ou alternativas farmacêuticas se forem equivalentes na extensão de sua absorção, mas não em sua taxa de absorção e, ainda assim, podem ser consideradas bioequivalentes porque tais diferenças na taxa de absorção são intencionais e se refletem na marcação, não são essenciais para a obtenção de concentrações corporais eficazes de drogas, por exemplo, uso crônico, e são considerados clinicamente insignificantes para a droga específica estudada.

[00190] Em uma modalidade, duas proteínas de ligação ao antígeno são bioequivalentes se não houver diferenças clinicamente significativas em sua segurança, pureza e potência.

[00191] Em uma modalidade, duas proteínas de ligao ao antigio são bioequivalentes se um paciente puder ser comutado uma ou mais vezes entre o produto de referência e o produto biológico sem um aumento esperado no risco de efeitos adversos, incluindo uma alteração clinicamente significativa na imunogenicidade ou eficácia diminuída, em comparação com a continuação da terapêutica sem essa mudança.

[00192] Em uma modalidade, duas proteínas de ligação ao antígeno são bioequivalentes se ambas atuam por um mecanismo ou mecanismos de ação comuns para a condição ou condições de uso, na medida em que tais mecanismos sejam conhecidos.

[00193] A bioequivalência pode ser demonstrada por métodos in vivo e in vitro. As medidas de bioequivalência incluem, por exemplo, (a) um teste in vivo em humanos ou outros mamíferos, no qual a concentração do anticorpo ou de seus metabólitos é medida no sangue, plasma, soro ou outro fluido biológico em função do tempo; (b) um teste in vitro que foi correlacionado e é razoavelmente preditivo de dados de biodisponibilidade humana in vivo; (c) um teste in vivo em humanos ou outros mamíferos em que o efeito farmacológico agudo apropriado do anticorpo (ou seu alvo) é medido em função do tempo; e (d) em um ensaio clínico bem controlado que estabelece segurança, eficácia ou biodisponibilidade ou bioequivalência de uma proteína de ligação ao antígeno.

[00194] Variantes bioequivalentes das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas exemplificativas aqui estabelecidas podem ser construídas, por exemplo, fazendo várias substituições de resíduos ou sequências ou deletando resíduos ou sequências terminais ou internos não necessários para a atividade biológica. Por exemplo, resíduos de cisteína não essenciais para a atividade biológica podem ser deletados ou substituídos por outros aminoácidos para prevenir a formação de pontes dissulfeto intramoleculares desnecessárias ou incorretas após renaturação. Em outros contextos, proteínas de ligação ao antígeno bioequivalentes podem incluir variantes das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas exemplificativas aqui apresentadas, compreendendo alterações de aminoácidos que modificam as características de glicosilação das moléculas, por exemplo, mutações que eliminam ou removem a glicosilação. Seletividade de espécies e reatividade cruzada de espécies

[00195] De acordo com certas modalidades da invenção, são fornecidas moléculas de ligação ao antígeno que se ligam a CD3 humano. Também são fornecidas moléculas de ligação ao antígeno que se ligam a FcεR1α humano. A presente invenção também inclui moléculas de ligação ao antígeno que se ligam a CD3 humano a CD3 de uma ou mais espécies não humanas; e/ou moléculas de ligação ao antígeno que se ligam a FcεR1α humano ou e a FcεR1α de uma ou mais espécies não humanas, por exemplo, cynomolgus.

[00196] De acordo com certas modalidades exemplificativas da invenção, são fornecidas moléculas de ligação ao antígeno que se ligam a CD3 humano e/ou FcεR1α humano e podem se ligar ou não, conforme o caso, a um ou mais de CD3 e/ou FcεR1α de camundongo, rato, porquinho-da-índia, hamster, gerbil, porco, gato, cão, coelho, cabra,

ovelha, vaca, cavalo, camelo, cynomolgus, sagui, rhesus, cynomolgus ou chimpanzé. Por exemplo, em uma modalidade exemplificativa particular da presente invenção, moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas são fornecidas compreendendo um primeiro domínio de ligação ao antígeno que se liga a CD3 humano e um segundo domínio de ligação ao antígeno que se liga a FcεR1α humano ou cynomolgus. Formulação Terapêutica e Administração

[00197] A presente invenção fornece composições farmacêuticas compreendendo as moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção. As composições farmacêuticas da invenção são formuladas com transportadores, excipientes e outros agentes adequados que proporcionam uma melhor transferência, distribuição, tolerância e semelhantes. Inúmeras formulações apropriadas podem ser encontradas no formulário conhecido por todos os químicos farmacêuticos: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Estas formulações incluem, por exemplo, pós, pastas, pomadas, geleias, ceras, óleos, lipídeos, lipídeos (catiônicos ou aniônicos) contendo vesículas (como LIPOFECTIN™, Life Technologies, Carlsbad, CA), conjugados de DNA, pastas de absorção anidras, emulsões óleo em água e água em óleo, emulsões carbowax (polietilenoglicóis de vários pesos moleculares), géis semissólidos e misturas semissólidas contendo carbowax. Ver também Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311.

[00198] A dose da molécula de ligação ao antígeno administrada a um paciente pode variar dependendo da idade e do tamanho do paciente, doença alvo, condições, via de administração e semelhantes. A dose preferida é tipicamente calculada de acordo com o peso corporal ou área de superfície corporal. Quando uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica da presente invenção é usada para fins terapêuticos em um paciente adulto, pode ser vantajoso administrar por via intravenosa a molécula de ligação ao antígeno biespecífica da presente invenção normalmente em uma dose única de cerca de 0,01 a cerca de 50 mg/kg de peso corporal, mais preferencialmente cerca de 0,1 a cerca de 25, cerca de 1 a cerca de 25, ou cerca de 5 a cerca de 25 mg/kg de peso corporal. Dependendo da gravidade da condição, a frequência e a duração do tratamento podem ser ajustadas. As dosagens e horários eficazes para a administração de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica podem ser determinados empiricamente; por exemplo, o progresso do paciente pode ser monitorado por avaliação periódica e a dose ajustada em conformidade. Além disso, o escalonamento interespécies de dosagens pode ser realizado usando métodos bem conhecidos na técnica (por exemplo, Mordenti et al., 1991, Pharmaceut. Res. 8:1351).

[00199] Vários sistemas de distribuição são conhecidos e podem ser usados para administrar a composição farmacêutica da invenção, por exemplo, encapsulação em lipossomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capazes de expressar os vírus mutantes, endocitose mediada por receptor (ver, por exemplo, Wu et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Os métodos de introdução incluem, mas não se limitam a, vias intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, intranasal, epidural e oral. A composição pode ser administrada por qualquer via conveniente, por exemplo, por infusão ou injeção em bolus, por absorção através de revestimentos epiteliais ou mucocutâneos (por exemplo, mucosa oral, mucosa retal e intestinal, etc.) e pode ser administrada juntamente com outros agentes biologicamente ativos. A administração pode ser sistêmica ou local.

[00200] Uma composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada por via subcutânea ou intravenosa com uma agulha e seringa padrão. Além disso, no que diz respeito à distribuição subcutânea, um dispositivo de distribuição de caneta tem prontamente aplicações na distribuição de uma composição farmacêutica da presente invenção. Tal dispositivo de distribuição de caneta pode ser reutilizável ou descartável.Um dispositivo de distribuição de caneta reutilizável geralmente utiliza um cartucho substituível que contém uma composição farmacêutica. Uma vez que toda a composição farmacêutica dentro do cartucho foi administrada e o cartucho está vazio, o cartucho vazio pode ser prontamente descartado e substituído por um novo cartucho que contém a composição farmacêutica. O dispositivo de distribuição de caneta pode então ser reutilizado. Em um dispositivo de distribuição de caneta descartável, não há cartucho substituível. Em vez disso, o dispositivo de distribuição de caneta descartável vem pré-preenchido com a composição farmacêutica mantida em um reservatório dentro do dispositivo. Uma vez que o reservatório é esvaziado da composição farmacêutica, todo o dispositivo é descartado.

[00201] Numerosos dispositivos de distribuição de caneta e autoinjetor reutilizáveis têm aplicações na distribuição subcutânea de uma composição farmacêutica da presente invenção. Examples include, but are not limited to AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK), DISETRONIC™ pen (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Switzerland), HUMALOG MIX 75/25™ pen, HUMALOG™ pen, HUMALIN 70/30™ pen (Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN), NOVOPEN™ I, II and III (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), BD™ pen (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™, and OPTICLIK™ (sanofi-aventis, Frankfurt, Germany), to name only a few. Exemplos de dispositivos de distribuição de caneta descartáveis com aplicações na distribuição subcutânea de uma composição farmacêutica da presente invenção incluem, mas não estão limitados à caneta SOLOSTAR™ (sanofi-aventis), o FLEXPEN™ (Novo Nordisk) e o KWIKPEN™ (Eli Lilly), o Autoinjetor SURECLICKTM (Amgen, Thousand Oaks, CA), o PENLETTM (Haselmeier, Stuttgart, Germany), o EPIPEN (Dey, L.P.), e o HUMIRATM Pen (Abbott Labs, Abbott Park IL), para citar apenas alguns.

[00202] Em certas situações, a composição farmacêutica pode ser distribuída em um sistema de liberação controlada. Em uma modalidade, uma bomba pode ser usada (ver Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201). Em outra modalidade, materiais poliméricos podem ser usados; ver, Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Florida. Em ainda outra modalidade, um sistema de liberação controlada pode ser colocado na proximidade do alvo da composição, exigindo assim apenas uma fração da dose sistêmica (ver, por exemplo, Goodson, 1984, em Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138). Outros sistemas de liberação controlada são discutidos na revisão por Langer, 1990, Science 249:1527-1533.

[00203] As preparações injetáveis podem incluir formas de dosagem para injeções intravenosas, subcutâneas, intracutâneas e intramusculares, infusões gota a gota, etc. Estas preparações injetáveis podem ser preparadas por métodos publicamente conhecidos. Por exemplo, as preparações injetáveis podem ser preparadas, por exemplo, por dissolução, suspensão ou emulsificação do anticorpo ou seu sal descrito acima em um meio aquoso estéril ou um meio oleoso convencionalmente usado para injeções. Como meio aquoso para injeções, existem, por exemplo, soro fisiológico, uma solução isotônica contendo glicose e outros agentes auxiliares, etc., que podem ser usados em combinação com um agente solubilizante apropriado, como um álcool (por exemplo, etanol), um poliálcool (por exemplo, propileno glicol, polietileno glicol), um tensoativo não iônico [por exemplo, polissorbato 80, HCO-50 (aduto de polioxietileno (50 mol) de óleo de rícino hidrogenado)], etc. Como meio oleoso, são empregados, por exemplo, óleo de gergelim, óleo de soja, etc., que podem ser usados em combinação com um agente solubilizante, tal como benzoato de benzil, álcool benzílico, etc. A injeção assim preparada é preferivelmente preenchida em uma ampola apropriada.

[00204] Vantajosamente, as composições farmacêuticas para utilização oral ou parenteral descritas anteriormente são preparadas em formas de dosagem em uma dose unitária adequada para se ajustar a uma dose dos ingredientes ativos. Essas formas de dosagem em uma dose unitária incluem, por exemplo, comprimidos, pílulas, cápsulas, injeções (ampolas), supositórios, etc. A quantidade do anticorpo supracitado contido é geralmente cerca de 5 a cerca de 500 mg por forma de dosagem em uma dose unitária; especialmente na forma de injeção, é preferido que o anticorpo acima mencionado esteja contido em cerca de 5 a cerca de 100 mg e em cerca de 10 a cerca de 250 mg para as outras formas de dosagem. Usos terapêuticos das moléculas de ligação ao antígeno

[00205] A presente invenção inclui métodos que compreendem administrar a um sujeito em necessidade do mesmo uma composição terapêutica compreendendo um anticorpo anti-FcεR1α ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ou uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que se liga especificamente a CD3 e FcεR1α. A composição terapêutica pode compreender qualquer um dos anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas conforme divulgado neste documento e um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável. Como utilizado neste documento, a expressão "um sujeito em necessidade do mesmo" significa um animal humano ou não humano que exibe um ou mais sintomas ou indícios de uma doença ou distúrbio relacionado a FcεR1α, como distúrbio de ativação de mastócitos, mastocitose ou uma alergia (por exemplo, um sujeito que sofre de qualquer tipo de alergia ou que exibe qualquer resposta alérgica), ou que de outra forma se beneficiaria de uma inibição ou redução na atividade de FcεR1α ou uma depleção de células FcεR1α+ (por exemplo, anafilaxia).

[00206] Os anticorpos e moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção (e composições terapêuticas compreendendo os mesmos) são úteis, inter alia, para o tratamento de qualquer doença ou distúrbio em que a estimulação, ativação e/ou direcionamento de uma resposta imune seria benéfica. Em particular, os anticorpos anti- FcεR1α ou as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas anti- CD3/anti-FcεR1α da presente invenção podem ser usadas para o tratamento, prevenção e/ou melhoria de qualquer doença ou distúrbio associado ou mediado pela expressão de FcεR1α ou atividade ou proliferação de células FcεR1α+. O mecanismo de ação pelo qual os métodos terapêuticos da invenção são alcançados incluem a morte das células que expressam FcεR1α na presença de células efetoras, por exemplo, por CDC, apoptose, ADCC, fagocitose ou por uma combinação de dois ou mais destes mecanismos. As células que expressam FcεR1α que podem ser inibidas ou mortas usando as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção incluem, por exemplo, mastócitos e/ou basófilos.

[00207] As moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção podem ser usadas para tratar uma doença ou distúrbio associado à expressão de IgE ou FcεR1α incluindo, por exemplo, distúrbio de ativação de mastócitos (como síndrome de ativação de mastócitos), mastocitose ou alergias incluindo asma alérgica, feno febre, anafilaxia, dermatite atópica, urticária crônica, alergia alimentar e alergia ao pólen. As alergias podem ser causadas pela exposição a um ou mais alérgenos, conforme listado em outra parte deste documento. De acordo com certas modalidades da presente invenção, os anticorpos anti- FcεR1α ou anticorpos biespecíficos anti-FcεR1α/anti-CD3 são úteis para o tratamento de um paciente que sofre de alergia grave, incluindo anafilaxia. De acordo com outras modalidades relacionadas da invenção, métodos são fornecidos compreendendo administrar um anticorpo anti-FcεR1α ou uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica anti-CD3/anti-FcεR1α, conforme divulgado neste documento a um paciente que sofre de anafilaxia. Métodos analíticos/diagnósticos conhecidos na técnica, tais como teste de reação alérgica, etc., podem ser usados para determinar se um paciente sofre de anafilaxia.

[00208] De acordo com certos aspectos, a presente invenção fornece métodos para o tratamento de uma doença ou distúrbio associado à expressão de FcεR1α (por exemplo, anafilaxia), compreendendo administrar um ou mais dos anti-FcεR1α ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas descritas em outro lugar neste documento a um sujeito após o sujeito foi determinado como tendo alergia. Por exemplo, a presente invenção inclui métodos para o tratamento de alergia compreendendo administrar um anticorpo anti-FcεR1α ou uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica anti-CD3/anti-FcεR1α a um paciente 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas ou 4 semanas, 2 meses, 4 meses, 6 meses, 8 meses, 1 ano ou mais após o sujeito ter recebido outra terapia (por exemplo, terapia anti-histamínica). Terapias de combinação e formulações

[00209] A presente invenção fornece métodos que compreendem administrar uma composição farmacêutica compreendendo qualquer um dos anticorpos exemplificativos e moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas aqui descritas em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais. Agentes terapêuticos adicionais exemplificativos que podem ser combinados ou administrados em combinação com uma molécula de ligação ao antígeno da presente invenção incluem, por exemplo, um antagonista de IgE (por exemplo, um anticorpo anti-IgE, como omalizumabe) ou inibidor de molécula pequena de IgE (por exemplo, darpins, como darpin E2_76), um inibidor de IL-25, um inibidor de IL-4, um inibidor do receptor de IL-4 (por exemplo, um anticorpo anti-IL-4R, como dupilumabe), um inibidor de IL- 33 (por exemplo, um anticorpo anti-IL-33), um agente de ablação de células plasmáticas (por exemplo, um anticorpo biespecífico BCMA x CD3) e um inibidor de TSLP. Em certas modalidades, o agente de ablação de células plasmáticas é selecionado do grupo que consiste em um agente de direcionamento de antígeno de maturação de células B (BCMA), um inibidor de proteassoma, um inibidor de histona desacetilase, um inibidor de fator de ativação de células B (BAFF) e um inibidor do ligando indutor da proliferação A (APRIL; CD256). Em uma modalidade, o agente de direcionamento BCMA é selecionado do grupo que consiste em um anticorpo biespecífico anti-BCMA/anti-CD3, um receptor de antígeno quimérico contra BCMA e um anticorpo anti-BCMA conjugado a uma droga citotóxica.

[00210] Outros agentes que podem ser administrados de forma benéfica em combinação com as moléculas de ligação ao antígeno da invenção incluem medicamentos de tratamento de alergia, incluindo anti-histamínicos, agentes anti-inflamatórios, corticoides, epinefrina, um dilatador brônquico, um descongestionante, antagonistas de leucotrieno ou inibidor de mastócitos (por exemplo, cromoglicato de sódio).

[00211] A presente invenção também inclui combinações terapêuticas compreendendo qualquer uma das moléculas de ligação ao antígeno aqui mencionadas e um inibidor de IgE ou FcεR1α, em que o inibidor é um aptâmero, uma molécula antissentido, uma ribozima, um siRNA, um pepticorpo, um nanocorpo ou um fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmento Fab; fragmento F(ab')2 ; fragmento Fd; fragmento Fv; scFv; fragmento dAb; ou outras moléculas modificadas, como diacorpos, triacorpos, tetracorpos, minicorpos e unidades de reconhecimento mínimo). As moléculas de ligação ao antígeno da invenção também podem ser administradas e/ou coformuladas em combinação com antivirais, antibióticos, analgésicos, corticosteroides e/ou NSAIDs.

[00212] O(s) componente(s) terapeuticamente ativo(s) adicionais podem ser administrados imediatamente antes, simultaneamente ou logo após a administração de uma molécula de ligação ao antígeno da presente invenção; (para os fins da presente divulgação, tais regimes de administração são considerados a administração de uma molécula de ligação ao antígeno "em combinação com" um componente terapeuticamente ativo adicional).

[00213] A presente invenção inclui composições farmacêuticas nas quais uma molécula de ligação ao antígeno da presente invenção é coformulada com um ou mais dos componentes terapeuticamente ativos adicionais conforme descrito em outro lugar neste documento. Regimes de administração

[00214] De acordo com certas modalidades da presente invenção, doses múltiplas de uma molécula de ligação ao antígeno (por exemplo, um anticorpo anti-FcεR1α ou uma molécula de ligação ao antígeno biespecífico que liga especificamente FcεR1α e CD3) podem ser administradas a um sujeito ao longo de um curso de tempo definido. Os métodos de acordo com este aspecto da invenção compreendem a administração sequencial a um sujeito em necessidade de doses múltiplas de uma molécula de ligação ao antígeno da invenção. Como utilizado neste documento, "administração sequencial" significa que cada dose de uma molécula de ligação ao antígeno é administrada ao sujeito em um ponto diferente no tempo, por exemplo, em dias diferentes separados por um intervalo predeterminado (por exemplo, horas, dias, semanas ou meses). A presente invenção inclui métodos que compreendem a administração sequencial ao paciente de uma única dose inicial de uma molécula de ligação ao antígeno, seguida por uma ou mais doses secundárias da molécula de ligação ao antígeno e, opcionalmente, seguida por uma ou mais doses terciárias da molécula de ligação ao antígeno.

[00215] Os termos "dose inicial", "doses secundárias" e "doses terciárias" referem-se à sequência temporal de administração da molécula de ligação ao antígeno da invenção. Assim, a "dose inicial" é a dose que é administrada no início do regime de tratamento (também referida como a "dose de linha de base"); as "doses secundárias" são as doses administradas após a dose inicial; e as "doses terciárias" são as doses administradas após as doses secundárias. As doses inicial, secundária e terciária podem conter a mesma quantidade da molécula de ligação ao antígeno, mas geralmente podem diferir umas das outras em termos de frequência de administração. Em certas modalidades, no entanto, a quantidade de uma molécula de ligação ao antígeno contida nas doses inicial, secundária e/ou terciária varia uma da outra (por exemplo, ajustada para cima ou para baixo conforme apropriado) durante o curso do tratamento. Em certas modalidades, duas ou mais (por exemplo, 2, 3, 4 ou 5) doses são administradas no início do regime de tratamento como "doses de carga" seguidas por doses subsequentes que são administradas em uma base menos frequente (por exemplo, "doses de manutenção").

[00216] Em uma modalidade exemplificativa da presente invenção, cada dose secundária e/ou terciária é administrada 1 a 26 (por exemplo, 1, 1½, 2, 2½, 3, 3½, 4, 4½, 5, 5½, 6, 6½, 7, 7½, 8, 8½, 9, 9½, 10, 10½, 11, 11½, 12, 12½, 13, 13½, 14, 14½, 15, 15½, 16, 16½, 17, 17½, 18,

18½, 19, 19½, 20, 20½, 21, 21½, 22, 22½, 23, 23½, 24, 24½, 25, 25½, 26, 26½ ou mais) semanas após a dose imediatamente anterior. A frase "a dose imediatamente anterior", como utilizado neste documento, significa, em uma sequência de administrações múltiplas, a dose da molécula de ligação ao antígeno que é administrada a um paciente antes da administração da dose seguinte na sequência sem doses de intervenção.

[00217] Os métodos de acordo com este aspecto da invenção podem compreender administrar a um paciente qualquer número de doses secundárias e/ou terciárias de uma molécula de ligação ao antígeno (por exemplo, um anticorpo anti-FcεR1α ou uma molécula de ligação ao antígeno biespecífico que liga especificamente FcεR1α e CD3). Por exemplo, em certas modalidades, apenas uma única dose secundária é administrada ao paciente. Em outras modalidades, duas ou mais doses secundárias (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou mais) são administradas ao paciente. Do mesmo modo, em certas modalidades, apenas uma única dose terciária é administrada ao paciente. Em outras modalidades, duas ou mais doses (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou mais) terciárias são administradas ao paciente.

[00218] Em modalidades que envolvem múltiplas doses secundárias, cada dose secundária pode ser administrada na mesma frequência que as outras doses secundárias. Por exemplo, cada dose secundária pode ser administrada ao paciente 1 a 2 semanas após a dose imediatamente anterior. Do mesmo modo, em modalidades que envolvem múltiplas doses terciárias, cada dose terciária pode ser administrada na mesma frequência que as outras doses terciárias. Por exemplo, cada dose terciária pode ser administrada ao paciente 2 a 4 semanas após a dose imediatamente anterior. Alternativamente, a frequência com que as doses secundárias e/ou terciárias são administradas a um paciente pode variar ao longo do regime de tratamento. A frequência de administração também pode ser ajustada durante o curso do tratamento por um médico, dependendo das necessidades do paciente individual após o exame clínico.

[00219] Em uma modalidade, a molécula de ligação ao antígeno (por exemplo, um anticorpo anti-FcεR1α ou uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que se liga especificamente a FcεR1α e CD3) é administrada a um sujeito como uma dose baseada no peso. Uma "dose baseada no peso" (por exemplo, uma dose em mg/kg) é uma dose do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou da molécula de ligação ao antígeno biespecífica que mudará dependendo do peso do sujeito.

[00220] Em outra modalidade, um anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica é administrado a um sujeito como uma dose fixa. Uma "dose fixa" (por exemplo, uma dose em mg) significa que uma dose do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou a molécula biespecífica de ligação ao antígeno é usada para todos os sujeitos, independentemente de quaisquer fatores específicos relacionados ao sujeito, tais como peso. Em uma modalidade particular, uma dose fixa de um anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção é baseada em um peso ou idade predeterminados.

[00221] Em geral, uma dose adequada da molécula de ligação ao antígeno da invenção pode estar na faixa de cerca de 0,001 a cerca de 200,0 miligramas por quilograma de peso corporal do receptor, geralmente na faixa de cerca de 1 a 50 mg por quilograma de peso corporal. Por exemplo, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou a molécula de ligação ao antígeno biespecífica podem ser administrados em cerca de 0,1 mg/kg, cerca de 0,5 mg/kg, cerca de 1 mg/kg, cerca de 1,5 mg/kg, cerca de 2 mg/kg, cerca de 3 mg/kg, cerca de 5 mg/kg, cerca de 10 mg/kg, cerca de 15 mg/kg, cerca de 20 mg/kg, cerca de 25 mg/kg, cerca de 30 mg/kg, cerca de 40 mg/kg , cerca de 50 mg/kg por dose única. Valores e faixas intermediárias aos valores citados também se destinam a fazer parte desta invenção.

[00222] Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno da invenção é administrada como uma dose fixa de cerca de 1 mg a cerca de 2500 mg. Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno da invenção é administrada como uma dose fixa de cerca de 1 mg, 2 mg, 3 mg, 5 mg, 10 mg, 15 mg, 20 mg, 25 mg, cerca de 30 mg, cerca de 50 mg , cerca de 75 mg, cerca de 100 mg, cerca de 125 mg, cerca de 150 mg, cerca de 175 mg, 200 mg, cerca de 225 mg, cerca de 250 mg, cerca de 275 mg, cerca de 300 mg, cerca de 325 mg, cerca de 350 mg, cerca de 375 mg, cerca de 400 mg, cerca de 425 mg, cerca de 450 mg, cerca de 475 mg, cerca de 500 mg, cerca de 525 mg, cerca de 550 mg, cerca de 575 mg, cerca de 600 mg, cerca de 625 mg, cerca de 650 mg, cerca de 675 mg, cerca de 700 mg, cerca de 725 mg, cerca de 750 mg, cerca de 775 mg, cerca de 800 mg, cerca de 825 mg, cerca de 850 mg, cerca de 875 mg, cerca de 900 mg, cerca de 925 mg, cerca de 950 mg, cerca de 975 mg, cerca de 1000 mg, cerca de 1500 mg, cerca de 2000 mg ou cerca de 2500 mg. Valores e faixas intermediárias aos valores citados também se destinam a fazer parte desta invenção. Usos Diagnósticos dos Anticorpos

[00223] Os anticorpos anti-FcεR1α da presente invenção também podem ser usados para detectar e/ou medir células que expressam FcεR1α ou FcεR1α em uma amostra, por exemplo, para fins de diagnóstico. Por exemplo, um anticorpo anti-FcεR1α, ou fragmento do mesmo, pode ser usado para diagnosticar uma condição ou doença caracterizada por expressão aberrante (por exemplo, superexpressão, subexpressão, falta de expressão, etc.) de FcεR1α. Ensaios de diagnóstico exemplificativos para FcεR1α podem compreender, por exemplo, contatar uma amostra, obtida de um paciente, com um anticorpo anti-FcεR1α da invenção, em que o anticorpo anti-FcεR1α é marcado com um marcador detectável ou molécula repórter. Alternativamente, um anticorpo anti-FcεR1α não marcado pode ser usado em aplicações de diagnóstico em combinação com um anticorpo secundário que é ele próprio marcado de forma detectável. O marcador detectável ou molécula repórter pode ser um radioisótopo, como 3H, 14C, 32 35 125 P, S, ou I; uma porção fluorescente ou quimioluminescente, tal como isotiocianato de fluoresceína ou rodamina; ou uma enzima como fosfatase alcalina, beta-galactosidase, peroxidase de rábano ou luciferase. Outro exemplo de uso de diagnóstico dos anticorpos anti- 89 FcεR1α da invenção inclui marcado com Zr, tal como marcado com 89 Zr-desferrioxamina, anticorpo para o propósito de identificação não invasiva e rastreamento de mastócitos, basófilos ou outras células que expressam FcεR1α em um sujeito (por exemplo , imageamento de tomografia por emissão de pósitrons (PET)). (Ver, por exemplo, Tavare, R. et al. Cancer Res. 2016 Jan 1;76(1):73-82; e Azad, BB. et al. Oncotarget. 2016 Mar 15;7(11):12344-58.) Ensaios exemplificativos específicos que podem ser usados para detectar ou medir FcεR1α em uma amostra incluem ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA) e classificação de células ativadas por fluorescência (FACS).

[00224] As amostras que podem ser utilizadas em ensaios de diagnóstico de FcεR1α de acordo com a presente invenção incluem qualquer tecido ou amostra de fluido obtida de um paciente que contém quantidades detectáveis de proteína FcεR1α, ou fragmentos da mesma, em condições normais ou patológicas. Geralmente, os níveis de FcεR1α em uma amostra particular obtida de um paciente saudável (por exemplo, um paciente não afetado por uma doença ou condição associada a níveis ou atividade anormais de FcεR1α) serão medidos para estabelecer inicialmente um nível de linha de base ou padrão de FcεR1α. Este nível de linha de base de FcεR1α pode então ser comparado com os níveis de FcεR1α medidos em amostras obtidas de indivíduos com suspeita de ter uma doença relacionada a FcεR1α (por exemplo, um sujeito com alergia) ou condição.

EXEMPLOS

[00225] Os seguintes exemplos são apresentados de modo a prover aos versados na técnica uma divulgação e descrição completas de como preparar e utilizar os métodos e composições da invenção e não se destinam a limitar o âmbito do que os inventores consideram como sua invenção. Têm sido feitos esforços para assegurar a precisão em relação aos números utilizados (por exemplo, quantidades, temperatura, etc), mas alguns erros experimentais e desvios devem ser considerados. A menos que indicado de outra forma, as partes são partes em peso, peso molecular é o peso molecular médio, temperatura é em graus centígrados e pressão é atmosférica ou próxima à atmosférica. Exemplo 1: Geração de anticorpos Geração de anticorpos anti-FcεR1α

[00226] Os anticorpos anti-FcεR1α foram obtidos por imunização de um camundongo geneticamente modificado com um antígeno FcεR1α humano (por exemplo, hFcεR1α, SEQ ID NO: 63) ou por imunização de um camundongo engenheirado compreendendo DNA que codifica regiões variáveis de cadeia pesada e leve kappa de imunoglobulina humana com um antígeno FcεR1α humano.

[00227] Após a imunização, os esplenócitos foram colhidos de cada camundongo e (1) fundidos com células de mieloma de camundongo para preservar sua viabilidade e formar células de hibridoma e rastreados para especificidade FcεR1α, ou (2) células B classificadas

(conforme descrito em US 2007/0280945A1) usando um fragmento FcεR1α humano como o reagente de classificação que se liga e identifica anticorpos reativos (células B antígeno-positivas).

[00228] Os anticorpos quiméricos para FcεR1α foram inicialmente isolados com uma região variável humana e uma região constante de camundongo. Os anticorpos foram caracterizados e selecionados pelas características desejáveis, incluindo afinidade, seletividade, etc. Se necessário, as regiões constantes de camundongo foram substituídas por uma região constante humana desejada, por exemplo, região constante de IgG4 ou IgG1 de tipo selvagem ou modificada, para gerar um anticorpo anti-FcεR1α totalmente humano. Embora a região constante selecionada possa variar de acordo com o uso específico, as características de ligação de antígeno de alta afinidade e especificidade de alvo residem na região variável.

[00229] Certas propriedades biológicas dos anticorpos anti-FcεR1α exemplificativos gerados de acordo com os métodos deste Exemplo são descritos em detalhes nos Exemplos apresentados abaixo. Geração de anticorpos anti-CD3

[00230] Os anticorpos anti-CD3 foram gerados conforme descrito em WO 2017/053856, que é aqui incorporado por referência. Um anticorpo anti-CD3 exemplificativo foi selecionado para a produção de anticorpos biespecíficos anti-CD3/anti-FcεR1α de acordo com a presente invenção. Outros anticorpos anti-CD3 para uso na preparação de anticorpos biespecíficos de acordo com a presente invenção podem ser encontrados em, por exemplo, WO 2014/047231.

[00231] Certas propriedades biológicas dos anticorpos anti-CD3 exemplificativos gerados de acordo com os métodos deste Exemplo são descritos em detalhes nos Exemplos aqui. Geração de anticorpos biespecíficos que ligam FcεR1α e CD3

[00232] A presente invenção fornece moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que se ligam CD3 e FcεR1α; tais moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas também são referidas aqui como "moléculas biespecíficas anti-FcεR1α/anti-CD3 ou anti-FcεR1αxCD3". A porção anti-FcεR1α da molécula biespecífica anti-FcεR1α/anti-CD3 é útil para direcionar células que expressam FcεR1α ou basófilos), e a porção anti-CD3 da molécula biespecífica é útil para ativar células T. A ligação simultânea de FcεR1α em uma célula e CD3 em uma célula T facilita a morte dirigida (lise celular) da célula alvo que expressa FcεR1α pela célula T ativada.

[00233] Anticorpos biespecíficos compreendendo um domínio de ligação específico anti-FcεR1α e um domínio de ligação específico anti- CD3 foram construídos usando metodologias padrão, em que o domínio de ligação ao antígeno anti-FcεR1α e o domínio de ligação ao antígeno anti-CD3 compreendem cada um HCVRs diferentes e distintos pareados com um LCVR comum. Em anticorpos biespecíficos exemplificados, as moléculas foram construídas utilizando uma cadeia pesada de um anticorpo anti-CD3, uma cadeia pesada de um anticorpo anti-FcεR1α e uma cadeia leve comum do anticorpo anti-CD3 WO 2017/053856). Em outros casos, os anticorpos biespecíficos podem ser construídos utilizando uma cadeia pesada de um anticorpo anti-CD3, uma cadeia pesada de um anticorpo anti-FcεR1α e uma cadeia leve de um anticorpo anti-CD3 ou uma cadeia leve de uma cadeia leve de anticorpo anti-FcεR1α ou qualquer outra cadeia leve conhecida por ser promíscua ou emparelhar efetivamente com uma variedade de braços de cadeia pesada. Os anticorpos anti-FcεR1α e os anticorpos anti-CD3, a partir dos quais quaisquer componentes dos anticorpos biespecíficos são derivados, são algumas vezes referidos como anticorpos parentais.

[00234] Os anticorpos biespecíficos descritos nos exemplos seguintes compreendem braços de ligação anti-CD3; e braço de ligação anti-FcεR1α. Anticorpos biespecíficos exemplificados foram fabricados com um domínio IgG4 Fc (bsAb24919D, bsAb24920D e bsAb24921D).

[00235] Um resumo das partes componentes dos domínios de ligação ao antígeno dos vários anticorpos biespecíficos anti- FcεR1αxCD3 construídos é apresentado na Tabela 5. Exemplo 2: Sequências de aminoácidos e ácidos nucleicos de região variável de cadeia pesada e leve

[00236] A Tabela 1 apresenta os identificadores de sequência de aminoácidos das regiões variáveis da cadeia pesada e leve (HCVR e LCVR), CDRs e cadeias pesadas e cadeias leves (HC e LC) de anticorpos anti-FcεR1α selecionados da invenção. Os identificadores de sequência de ácido nucleico correspondentes são apresentados na Tabela 2. Tabela 1: Identificadores de sequência de aminoácidos SEQ ID NOs: Designação de anticorpos HCVR HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCVR LCDR1 LCDR2 LCDR3 HC LC mAb17110 2 4 6 8 26 28 30 32 34 40 mAb17111 10 12 14 16 26 28 30 32 36 40 mAb17112 18 20 22 24 26 28 30 32 38 40 Tabela 2: Identificadores de sequência de ácido nucleico SEQ ID NOs: Designação de anticorpos HCVR HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCVR LCDR1 LCDR2 LCDR3 HC LC mAb17110 1 3 5 7 25 27 29 31 33 39 mAb17111 9 11 13 15 25 27 29 31 35 39 mAb17112 17 19 21 23 25 27 29 31 37 39

[00237] A Tabela 3 apresenta os identificadores de sequência de aminoácidos das regiões variáveis da cadeia pesada e leve (HCVR e LCVR), CDRs e cadeia pesada e cadeia leve (HC e LC) de um anticorpo anti-CD3 exemplificativo da invenção. Os identificadores de sequência de ácido nucleico correspondentes são apresentados na Tabela 4.

Tabela 3: Identificadores de sequência de aminoácidos SEQ ID NOs: Designação de anticorpos HCVR HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCVR LCDR1 LCDR2 LCDR3 HC LC mAb7221G20 42 44 46 48 26 28 30 32 56 40 Tabela 4: Identificadores de sequência de ácido nucleico SEQ ID NOs: Designação de anticorpos HCVR HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCVR LCDR1 LCDR2 LCDR3 HC LC mAb7221G20 41 43 45 47 25 27 29 31 55 39

[00238] Um resumo das partes componentes dos vários anticorpos biespecíficos anti-FcεR1αxCD3 construídos é apresentado na Tabela 5. As Tabelas 6, 7 e 8 listam a HCVR, LCVR, CDRs e identificadores de cadeia pesada e sequência leve dos anticorpos biespecíficos. Tabela 5: Resumo das partes componentes de anticorpos biespecíficos anti-FcεR1α16xCD3 Anti-FcεR1α Anti-CD3 Identificador Domínio de ligação ao Domínio de ligação ao Região variável da de anticorpo antígeno antígeno cadeia leve comum: biespecífico Região variável da cadeia Região variável da cadeia pesada: pesada: bsAb24919D mAb17110 mAb7221G20 mAb7221G20 mAb7221G20 bsAb24920D mAb17111 mAb7221G20 mAb17112 mAb7221G20 bsAb24921D mAb7221G20 Tabela 6: Sequências de aminoácidos de regiões variáveis e CDRs de anticorpos biespecíficos Identifica Domínio de ligação ao Domínio de ligação ao Região variável de cadeia dor de antígeno anti-FcεR1α antígeno anti-CD3 leve comum SEQ ID NOs anticorpo SEQ ID NOs. SEQ ID NOs. biespecífi HC HCD HCD HCD HC HCD HCD HCD LCV LCD LCD LCD co VR R1 R2 R3 VR R1 R2 R3 R R1 R2 R3 bsAb249 2 4 6 8 42 44 46 48 26 28 30 32 19D bsAb249 10 12 14 16 42 44 46 48 26 28 30 32 20D bsAb249 18 20 22 24 42 44 46 48 26 28 30 32 21D

Tabela 7: identificadores de sequência de aminoácidos de cadeia pesada e de cadeia leve de anticorpos biespecíficos Identificador de anticorpo Anti-FcεR1α Anti-CD3 Cadeia leve comum biespecífico Cadeia pesada Cadeia pesada bsAb24919D SEQ ID NO: 50 SEQ ID NO: 56 SEQ ID NO: 40 bsAb24920D SEQ ID NO: 52 SEQ ID NO: 56 SEQ ID NO: 40 bsAb24921D SEQ ID NO:54 SEQ ID NO: 56 SEQ ID NO: 40 Tabela 8: identificadores de sequência de ácido nucleico de cadeia pesada e de cadeia leve de anticorpos biespecíficos Identificador de anticorpo Anti-FcεR1α Anti-CD3 Cadeia leve comum biespecífico Cadeia pesada Cadeia pesada bsAb24919D SEQ ID NO: 49 SEQ ID NO: 55 SEQ ID NO: 39 bsAb24920D SEQ ID NO: 51 SEQ ID NO: 55 SEQ ID NO: 39 bsAb24921D SEQ ID NO: 53 SEQ ID NO: 55 SEQ ID NO: 39 Exemplo 3: Afinidades de ligação derivadas de ressonância plasmônica de superfície e constantes cinéticas de anticorpos monoclonais humanos anti-FcεR1α monoespecíficos e anti- FcεR1α16xCD3 biespecíficos

[00239] Constantes de dissociação de equilíbrio (KD) para a ligação do ectodomínio FcεR1α humano oucynomolgus a anticorpos monoclonais anti-FcεR1α purificados (mAbs) e anticorpos biespecíficos CD3 x FcεR1α (bsAbs) foram determinados usando um biossensor de ressonância plasmônica de superfície em tempo real (SPR-Biacore), Biacore 8k. Todos os estudos de ligação foram realizados em tampão HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM e tensoativo Tween-20 0,05% v/v, pH 7,4 (HBS-ET) a 25°C e 37°C.

[00240] A superfície do sensor Biacore CM4 foi primeiro derivatizada por acoplamento de amina com um anticorpo monoclonal de camundongo anti-Fc humano para capturar aproximadamente 500-900 RUs de anticorpos monoclonais anti-FcεR1α ou anticorpos monoclonais biespecíficos anti-CD3 x FcεR1α. 1 RU (unidade de resposta) representa 1 pg de proteína por mm2, conforme definido pelo fabricante. O ectodomínio de reagentes FcεR1α humanos cynomolgus foram expressos com uma etiqueta C-term myc-myc-6xHis-hFcεR1α.MMH (SEQ ID NO: 57) e mfFcεR1α.MMH (SEQ ID NO: 58). Diferentes concentrações de reagentes FcεR1α foram preparadas em tampão de execução HBS-ET (600nM - 7,4nM; diluído em série por 3 vezes) e injetadas sobre anticorpos monoclonais anti-FcεR1α capturados anti-Fc humano ou anticorpos monoclonais biespecíficos anti-CD3 x FcεR1α por 1 minuto a uma taxa de fluxo de 30 µL/minuto. A dissociação dos reagentes FcεR1α ligados foi monitorada por 4 minutos em tampão de execução HBS-ET. As constantes de taxa de associação (ka) e dissociação (kd) foram determinadas ajustando os sensorgramas de ligação em tempo real a um modelo de ligação 1:1 com limitação de transporte de massa usando o software de avaliação Biacore 8k. As constantes de equilíbrio de dissociação de ligação (KD) e as meias-vidas dissociativas (t½) foram calculadas a partir das constantes de taxa cinética como: ( ) KD (M) = , e t½ (min) = ∗

[00241] Os parâmetros de cinética de ligação para a ligação de hFcεR1α.MMH e mfFcεR1α.MMH a diferentes anticorpos monoclonais anti-FcεR1α exemplificativos ou anticorpos monoclonais biespecíficos anti-CD3 x FcεR1α da invenção a 25°C e 37°C são mostrados na Tabela 9 até a Tabela 12. Tabela 9: Parâmetros de cinética de ligação de ligação de hFcεR1α.MMH a anticorpos monoclonais anti-FcεR1α ou anticorpos monoclonais biespecíficos anti-CD3 X FcεR1α a 25°C. Nível de Limite de 600nM ka kd KD t½ mAb Capturado captura de hFcεR1α.MMH (1/Ms) (1/s) (M) (min) mAb (RU) (RU) mAb17110 609 ± 1,2 130 7,19E + 04 9,13E 1,27E-07 1,3 mAb17111 567 ± 0,8 91 7,84E + 04 -03 1,65E 2,11E-07 0,7 mAb17112 630 ± 0,9 123 8,80E + 04 -02 1,84E 2,09E-07 0,63 bsAb24919D 610 ± 0,7 72 6,82E + 04 -02 1,04E 1,52E-07 1,1 bsAb24920D 573 ± 1 46 6,59E+04 -02 2,00E 3,03E-07 0,6 -02

Nível de Limite de 600nM ka kd KD t½ mAb Capturado captura de hFcεR1α.MMH (1/Ms) (1/s) (M) (min) mAb (RU) (RU) bsAb24921D 607 ± 0,6 69 7,74E + 04 2,12E 2,74E-07 0,54 Controle de isótipo -02 545 ± 1,7 -5 NB * NB * NB * NB * mAb

NB* indica que nenhuma ligação foi observada nas atuais condições experimentais.

Tabela 10: Parâmetros de cinética de ligação de ligação de hFcεR1α.MMH a anticorpos monoclonais anti-FcεR1α ou anticorpos monoclonais biespecíficos anti-CD3 X FcεR1α a 37°C.

Nível de Limite de 600nM ka kd KD t½ mAb Capturado captura de hFcεR1α.MMH (1/Ms) (1/s) (M) (min) mAb (RU) (RU) mAb17110 745 ± 1,5 93 8,88E + 04 3,94E- 4,44E-07 0,29 mAb17111 745 ± 2,2 52 8,21E + 04 02 4,83E- 5,88E-07 0,24 mAb17112 681 ± 0,6 87 1,13E + 05 02 5,85E- 5,17E-07 0,20 bsAb24919D 764 ± 1,5 43 7,35E + 04 02 5,88E- 8.01E-07 0,20 bsAb24920D 743 ± 3,5 19 6,39E + 04 02 9,91E- 1,55E+06 0,12 bsAb24921D 670 ± 0,6 40 9,56E + 04 02 9,34E- 9,77E-07 0,12 Controle de isótipo 02 688 ± 3,5 -2 NB * NB * NB * NB * mAb

Tabela 11: Parâmetros de cinética de ligação de ligação de mfFcεR1α.MMH a anticorpos monoclonais anti-FcεR1α ou anticorpos monoclonais biespecíficos anti-CD3 X FcεR1α a 25°C.

Limite de Nível de 600nM ka kd KD t½ mAb Capturado captura de mfFceR1a.MMH (1/Ms) (1/s) (M) (min) mAb (RU) (RU) mAb17110 596 ± 0,8 79 6,13E + 04 1,36E 2,21E-07 0,8 mAb17111 620 ± 0,5 60 5,55E + 04 -02 1,37E 2,47E-07 0,8 mAb17112 594 ± 1,3 110 7,13E + 04 -02 1,39E 1,95E-07 0,8 -02

Limite de Nível de 600nM ka kd KD t½ mAb Capturado captura de mfFceR1a.MMH (1/Ms) (1/s) (M) (min) mAb (RU) (RU) bsAb24919D 597 ± 0,8 40 3,96E + 04 1,44E 3,63E-07 0,8 bsAb24920D 625 ± 0,8 26 4,17E +04 -02 1,95E 4,67E-07 0,6 bsAb24921D 563 ± 0,8 60 6,29E + 04 -02 1,61E 2,56E-07 0,7 Controle de isótipo +02 610 ± 1,6 -9 NB * NB * NB * NB * mAb NB* indica que nenhuma ligação foi observada nas atuais condições experimentais. Tabela 12: Parâmetros de cinética de ligação de ligação de mfFcεR1α.MMH a anticorpos monoclonais anti-FcεR1α ou anticorpos monoclonais biespecíficos anti-CD3 X FcεR1α a 37°C. Nível de Limite de 600nM ka kd KD t½ mAb Capturado captura de mfFceR1a.MMH (1/Ms) (1/s) (M) (min) mAb (RU) (RU) mAb17110 719 ± 3,5 53 5,94E + 04 2,54E- 4,28E-07 0,45 mAb17111 720 ± 3,4 38 5,17E + 04 02 2,64E- 5,10E-07 0,44 mAb17112 769 ± 0,7 81 9,94E + 04 02 3,28E- 3,30E-07 0,35 bsAb24919D 685 ± 1,7 20 3,86E + 04 02 3,99E- 1,03E-06 0,29 bsAb24920D 660 ± 2,7 10 1,33E + 04 02 4,45E- 3,35E-06 0,26 bsAb24921D 749 ± 1,2 37 8,56E + 04 02 4,45E- 5,20E-07 0,26 Controle de isótipo 02 775 ± 2,8 -9 NB * NB * NB * NB * mAb NB* indica que nenhuma ligação foi observada nas atuais condições experimentais.

[00242] A 25°C, anticorpos monoclonais anti-FcεR1α exemplificativos ou anticorpos monoclonais biespecíficos anti-CD3 x FcεR1α da invenção ligados a hFcεR1α.MMH com valores KD variando de 127 nM a 303 nM, como mostrado na Tabela 9. A 37°C, anticorpos monoclonais anti-FcεR1α exemplificativos ou anticorpos monoclonais biespecíficos anti-CD3 x FcεR1α da invenção ligados a hFcεR1α.MMH com valores KD variando de 444 nM a 1,55 uM, como mostrado na

Tabela 10.

[00243] A 25°C, anticorpos monoclonais anti-FcεR1α exemplificativos ou anticorpos monoclonais biespecíficos anti-CD3 x FcεR1α da invenção ligados a mfFcεR1α.MMH com valores KD variando de 195nM a 467nM, como mostrado na Tabela 11. A 37°C, anticorpos monoclonais anti-FcεR1α exemplificativos ou anticorpos monoclonais biespecíficos anti-CD3 x FcεR1α da invenção ligados mfFcεR1α.MMH com valores KD variando de 330 nM a 3,35 uM, como mostrado na Tabela 12. Exemplo 4: Anticorpos biespecíficos Anti-FcR1 x CD3 se ligam especificamente a FcεR1α expresso em células Jurkat e HEK293

[00244] A fim de avaliar a ligação a antígenos expressos em células por anticorpos monoclonais anti-FcεR1α e anticorpos bi-específicos anti-FcR1 x CD3, o experimento de citometria de fluxo foi realizado com células Jurkat/NFAT-Luc and HEK293/hFcR1 /hFcR1/hFcR1. As células Jurkat/NFAT-Luc são células Jurkat projetadas para expressar de forma estável um repórter de luciferase sob o controle de transcrição do elemento de resposta do fator nuclear de células T ativadas (NFAT). As células HEK293/hFcR1 /hFcR1/hFcR1 são células HEK293 projetadas para expressar de forma estável FcR1, FcR1 e FcR1. Para testar a ligação a Fc R1 de macaco (cynomolgus, mf) (aminoácidos 4-260 de acessão # XP_005541370.1 com alanina na posição 81 alterada para triptofano), mfFcR1 foi expresso de forma estável em HEK293 juntamente com FcR1 e FcR1. A linhagem celular resultante, doravante referida como HEK293/mf FcR1 /hFcR1/hFcR1 foi isolada e mantida em meio DMEM suplementado com 10% de FBS, 1X NEAA, 1X Penicilina/Estreptomicina/L-Glutamina, 1g/mL Puromicina, 100g/mL de Higromicina B e 500g/ ml de sulfato G418. As informações dos reagentes são as seguintes: meio DMEM, Irvine Scientific, Cat # CRL-

1573; Soro fetal bovino (FBS), Seradigm, Cat #1500-500; 100 X Penicilina/Estreptomicina/L-Glutamina (Pen/Strep/Glut), Invitrogen, Cat #10378-016; 100X aminoácidos não essenciais (NEAA), Irvine Scientific, Cat# 9034; Antibiótico seletivo Geneticin™ (Sulfato G418), Invitrogen, Cat# 11811-098; Higromicina B, Calbiochem, Cat #400049; Puromicina, Sigma, Cat #P-8833.

[00245] Para análise de citometria de fluxo, células HEK293, HEK293/hFcR1 /hFcR1/hFcR1 e HEK293/mf FcR1 /hFcR1/hFcR1 foram coletadas após dissociação usando tampão de dissociação sem enzima (Millipore Cat # S-004), e as células foram pré-incubadas com ou sem 70 nM de IgE humana, por 30 minutos em gelo em tampão FACS (PBS, sem Ca++ e Mg++, (Irvine Scientific, Cat # 9240) contendo 2% de FBS). Células Jurkat/NFAT-luc também foram coletadas. Os anticorpos na concentração de 70 nM foram então adicionados a 1 x106 células/poço de cada tipo de célula a 4°C durante 30 minutos. Após incubação com anticorpos primários, as células foram coradas com 1,3g/ml de anticorpo secundário anti-IgG-humano conjugado com aloficocianina (APC) (Jackson ImmunoResearch, Cat # 109-136-170) durante 30 minutos em gelo. As células foram fixadas usando BD CytoFixTM (Becton Dickinson, Cat. #554655) e analisadas em Accuri ™ C6 (BD) ou citômetro de fluxo CytoFLEX (Beckman Coulter). Os controles de anticorpos não corados e secundários isolados também foram testados para todas as linhagens celulares e uma amostra foi avaliada quanto à viabilidade usando o corante de viabilidade Far Red Fluo (Thermo Fisher, Cat #L10120) de acordo com o protocolo do fabricante. Os resultados foram analisados usando o software FlowJo (versão 10.0.8, FlowJo) para determinar as médias geométricas de fluorescência para células viáveis e a razão de ligação foi calculada com a intensidade média de fluorescência (MFI) da condição experimental normalizada pela MFI das células respectivas não coradas. Os resultados foram resumidos nas Tabelas 13 e 14. Tabela 13: Ligação de 70 nM de anticorpos anti-FcεR1α e anticorpos Anti-FcR1 x CD3 a células HEK293/hFcR1 /hFcR1/hFcR1 e Jurkat/NFAT-luc. Razão de ligação (MFI de tratado/MFI de não corado) HEK293/hFcR1 Jurkat/NFAT- HEK293 /hFcR1/hFcR1 luc ID de anticorpos Especificidade Sem IgE Sem IgE 70nM IgE Sem IgE bsAb24919D FcR1 x hCD3 2 269 277 48 bsAb24920D FcR1 x hCD3 4 248 201 48 bsAb24921D FcR1 x hCD3 11 253 295 94 mAb17110 FcR1 2 171 396 1 mAb17111 FcR1 1 136 369 1 mAb17112 FcR1 8 158 367 1 Controle furtivo de Proteína irrelevante 1 1 1 2 IgG4 humana Controle de IgG4 Proteína irrelevante 1 1 1 1 Humana Tabela 14: Ligação de 70 nM de anticorpos anti-FcεR1α e anticorpo Anti-FcR1 x CD3 a células HEK293/mf FcR1 /hFcR1/hFcR1 Razão de ligação (MFI de tratado/MFI de não corado) HEK293 HEK293/mfFcR1 /hFcR1/hFcR1 Parental ID de anticorpos Especificidade Sem IgE Sem IgE 70nM IgE bsAb24919D FcR1 x hCD3 1 166 236 bsAb24920D FcR1 x hCD3 2 142 169 bsAb24921D FcR1 x hCD3 2 169 284 mAb17110 FcR1 1 101 256 mAb17111 FcR1 1 102 190 mAb17112 FcR1 1 134 279 Controle furtivo de Proteína irrelevante 1 1 1 IgG4 humana Controle de IgG4 Proteína irrelevante 1 1 1 Humana

[00246] Como mostrado na Tabela 13, os anticorpos bispecíficos anti-FcR1 x CD3 exemplificativos bsAb24919D, bsAb24920D e bsAb24921D, mostraram ligação a FcR1 humano expresso em células HEK293/hFcR1 /hFcR1/hFcR1 sem e com 70 nM de IgE humana com razões de ligação de 201-295 e para e CD3 humano expresso em células Jurkat com razões de ligação de 48-94. Os anticorpos biespecíficos exemplificativos da invenção mostraram ligação mínima a HEK293 sem receptores FcR1 com razões de ligação de 2 - 11. Os anticorpos anti-FcR1 mostraram ligação a células HEK293/hFcR1 /hFcR1/hFcR1 sem e com 70 nM de IgE humana com razões de ligação de 136 - 396 e a células HEK293 ou Jurkat com razões de ligação 1 - 8. Os anticorpos de controle de isótipo não mostraram ligação a qualquer uma das células e os controles secundários apenas mostraram razões de ligação de 1.

[00247] Como mostrado na Tabela 14, os anticorpos anti-FcR1 x CD3 biespecíficos exemplificativos bsAb24919D, bsAb24920D, e bsAb24921D, mostraram ligação a FcR1 de macaco (cynomolgus) expresso em células HEK293/mfFcR1 /hFcR1/hFcR1 sem e com 70 nM de IgE humana de 142-284. Os anticorpos biespecíficos exemplificativos da invenção mostraram ligação mínima a células HEK293 sem receptores FcR1 com razões de ligação de 1 - 2. Anticorpos anti-FcR1 exemplificativos da invenção mostraram ligação a células HEK293/mfFcR1 /hFcR1/hFcR1 sem e com 70 nM de IgE humana com razões de ligação de 101-279, mas não a HEK293. Os anticorpos de controle de isótipo não mostraram ligação a qualquer uma das células e os controles secundários apenas mostraram razões de ligação de 1. Exemplo 5: Ativação de Sinalização de CD3 Humano por Anticorpos Biespecíficos Anti-FcεR1α x CD3

[00248] A fim de avaliar a ativação da sinalização de CD3 humano por anticorpos biespecíficos anti-FcR1 x CD3 na presença de células que expressam FcR1 , foi realizado um bioensaio com células Jurkat/NFAT-luc e HEK293/hFcR1 /hFcR1/hFcR1 . Linhagens celulares estáveis foram desenvolvidas. A linhagem de células Jurkat, uma linhagem de células linfocíticas T humanas, foi utilizada para demonstrar a sinalização do receptor de células T mediada por CD3 (Abraham and Weiss, Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signaling paradigm. Nat Rev Immunol. 2004 Apr;4(4):301-8). As células Jurkat foram engenheiradas para expressar de forma estável um repórter de luciferase sob o controle de transcrição do elemento de resposta do fator nuclear de células T ativadas (NFAT). A linhagem celular resultante, doravante referida como Jurkat/NFAT-Luc, foi isolada e mantida em meio RPMI1640 (Irvine Scientific, Cat. #9160) suplementado com 10% de FBS, 1X Penicilina/Estreptomicina/L- Glutamina e 1g/mL de Puromicina. Além disso, as células HEK293 foram transfectadas para expressar estavelmente FcR1 humano (aminoácidos 1-257 de Uniprot #P12319-1), FcR1 (aminoácidos 1- 244 de Uniprot #Q01362-1) e FcR1 (aminoácidos 1-86 de Uniprot #P30273-1). A linhagem celular resultante, doravante referida como HEK293/hFcR1 /hFcR1/hFcR1 foi isolada e mantida em meio DMEM (Irvine Science, Cat. #9033) suplementado com 10% de FBS, 1X NEAA, 1X Penicilina/Estreptomicina/L-Glutamina, 1g/mL de Puromicina, 100g/mL de Higromicina B e 500g/ml de sulfato G418.

[00249] Um bioensaio foi realizado para medir a sinalização de CD3 por anticorpos anti-FcR1 x CD3 biespecificos exemplificativos da invenção. Para o bioensaio, as células HEK293 or HEK293/hFcR1 /hFcR1/hFcR1 foram semeadas a 10.000 células por poço em uma placa de 96 poços em tampão de ensaio com ou sem 10 nM de IgE humana em tampão de ensaio (FBS a 10% em RPMI1640 (Irvine Scientific, Cat #9160) com caneta/strep/glut) por 30 minutos a 37°C em 5% de CO2. Após a incubação, as células Jurkat/NFAT-luc foram semeadas em 50.000 juntamente com anticorpos anti-FcR1 x CD3 biespecíficos exemplificativos da invenção, anti-FcR1 exemplificativo da invenção ou anticorpos de controle de isótipo em concentrações que variam de 100 nM a 2pM mais uma amostra contendo tampão sozinho (sem anticorpo). Após 5,5 horas a 37°C em 5% de CO2, a atividade da luciferase foi medida com reagente OneGlo™ (Promega, # E6031) e leitor de placa multilabel Victor™ X (Perkin Elmer). Os resultados foram analisados por meio de regressão não linear (logística de 4 parâmetros) com o software Prism™6 (GraphPad) para obter os valores de EC50 . A ativação dobrada foi calculada com a RLU (unidades de luz relativas) média na concentração mais alta de anticorpo normalizado pela RLU média sem anticorpo. Os resultados foram resumidos na Tabela 15. Tabela 15: Ativação de CD3 humano por anticorpos Anti-FcR1 x CD3 Jurkat/NFAT-luc Jurkat/NFAT-luc Células HEK293/hFcR1 Células HEK293 /hFcR1/hFcR1 Sem IgE 10nM IgE Sem IgE 10nM IgE EC50 Ativação EC50 Ativação ID de anticorpo Especificidade EC50 [M] EC50 [M] [M] de dobra [M] de dobra FcR1 x Sem Sem bsAb24919D 3,4E-10 32 1,5E-09 32 hCD3 ativação ativação FcR1 x Sem Sem bsAb24920D 6,8E-10 23 4,9E-09 25 hCD3 ativação ativação FcR1 x Sem Sem bsAb24921D 2,3E-10 24 1,1E-09 27 hCD3 ativação ativação Sem Sem Sem Sem mAb17110 FcR1 1 1 ativação ativação ativação ativação Sem Sem Sem Sem mAb17111 FcR1 1 1 ativação ativação ativação ativação Sem Sem Sem Sem mAb17112 FcR1 1 1 ativação ativação ativação ativação Controle furtivo de Proteína Sem Sem Sem Sem 1 1 IgG4 humana irrelevante ativação ativação ativação ativação Controle de IgG4 Proteína Sem Sem Sem Sem 1 1 Humana irrelevante ativação ativação ativação ativação

[00250] Como mostrado na Tabela 15, anticorpos anti-FcR1 x CD3 biespecíficos exemplificativos da invenção, bsAb24919D, bsAb24920D, e bsAb24921D, mostrou ativação da sinalização de CD3 em células

Jurkat/NFAT-luc com valores EC50 que variam de 230pM a 680pM na presença de células HEK293/hFcR1 /hFcR1/hFcR1 sem IgE humana e 1,1 nM a 4,9 nM com 10 nM de IgE humana. A ativação mais alta foi alcançada por bsAb24919D com ativação de 32 sem e com 10 nM de IgE. Os anticorpos biespecíficos exemplificativos da invenção mostraram ativação mínima na presença de HEK293 sem receptores FcR1 com ativação de dobra variando de 1 a 3. Os anticorpos anti- FcR1 e de controle de isótipo não mostraram ativação com ativação de 1 vez em qualquer uma das condições testadas. Exemplo 6: Efeito de anticorpos biespecíficos Anti-FcεR1α x Anti- CD3 em ensaios de morte in vitro

[00251] Para determinar a eficácia dos anticorpos biespecíficos anti- FcεR1α x anti-CD3 exemplificativos da invenção (bsAb24919D, bsAb24920D and bsAb24921D) na indução da morte mediada por células T de células que expressam FcεR1α in vitro, foram usados dois experimentos separados. Em um experimento, células HEK293/hFcR1 /hFcR1/hFcR1 engenheiradas foram usadas como alvos, enquanto no segundo experimento basófilos humanos primários dentro de uma população de células mononucleares de sangue periférico total (PBMC) foram usados como alvos. Em ambos os casos, protocolos semelhantes foram usados para ativar as células T antes do ensaio de morte: as células T CD8+ foram primeiro isoladas de leucopacks humanos (NY Blood Center) usando um kit de coquetel de enriquecimento de células T CD8+humanas RossetteSepTM (STEMCELL Technologies, Cat. #15063) e colocadas em cultura com Dynabeads® revestido com CD3/CD28 (Invitrogen, Cat. #11132D) para induzir a ativação das células T. Nos dias 2-3 de cultura, os grânulos foram removidos usando separação magnética e as células T foram colocadas em cultura. Em um exemplo (para uso com células alvo HEK293/hFcR1 /hFcR1/hFcR1 ), as células T foram mantidas em cultura por 5 dias, momento em que IL-2 foi adicionado a 300U/ml para promover a viabilidade e o crescimento, e as células T foram usadas 2 dias após a adição de IL-2. No segundo exemplo (para uso com células alvo de PBMC), as células foram mantidas em cultura por um dia após a remoção dos grânulos e então usadas para o ensaio de morte. Em ambos os casos, as células T ativadas foram marcadas com éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE, Thermo Fischer Scientific, Cat.# C34554) antes de configurar o ensaio de morte para permitir a exclusão das células durante a análise dos resultados.

[00252] Para determinar a eficácia de anticorpos biespecíficos anti- FcεR1α x anti-CD3 exemplificativos da invenção na indução de morte mediada por células T de células alvo HEK293/hFcR1 /hFcR1/hFcR1 , um ensaio de morte que usa a detecção de dois mediadores da cascata apoptótica como leitura (caspase 3 clivada e PARP clivada) foi usado. Para configurar o ensaio de morte, as células T ativadas foram misturadas com as células alvo em uma razão de 10 células alvo por célula T e, em seguida, plaqueadas em uma placa de 96 poços. Diluições de cinco vezes em série de anticorpos variando na concentração final de 100nM a 10,24fM foram adicionadas aos poços, e as células foram incubadas durante a noite a 37 ºC para permitir que a morte mediada por células T ocorresse. Os anticorpos incluem anticorpos biespecíficos anti-FcεR1α/CD3 exemplificativos da invenção e anticorpo de controle de isótipo. Após a incubação, as células foram colhidas e ressuspensas em BD cytofix pré-aquecido (Cat. #554655) por 10 minutos a 37 ºC. As células foram então lavadas duas vezes em tampão MACS (Miltenyi, Cat. #130-091-221) e tornadas permeáveis por ressuspensão em metanol gelado e incubação a -20 ºC por pelo menos 30 minutos ou durante a noite. Após a permeabilização, o tampão MACS foi adicionado às células por 10 minutos para permitir a re-hidratação celular, seguido por 2 lavagens com tampão MACS. As células foram então incubadas com anticorpo bloqueador de Fc (Ebioscience, Cat. #14-9161-73), seguido por coloração com um coquetel de anticorpos contendo anti-caspase 3 clivada conjugados com Alexa-647 (Cell Signaling Technology, Cat. #9602S) e anticorpos anti-PARP clivados conjugados com PE (BD Biosciences, Cat. #552933). A clivagem da caspase 3 e PARP são etapas obrigatórias na ativação da cascata apoptótica que é iniciada após a distribuição de grânulos líticos citotóxicos das células T CD8+ para os alvos. Assim, a detecção específica dessas proteínas clivadas serve como uma leitura da morte. Após a coloração, as células foram lavadas, ressuspensas em tampão MACS e adquiridas usando um instrumento LSRFortessa (BD Biosciences). As células mortas foram identificadas como CFSE-, e as células apoptóticas nesta população foram identificadas como caspase 3+ clivada e PARP +clivada. A análise dos dados foi realizada utilizando o software Graphpad Prism. Os pontos de dados obtidos foram transformados usando uma equação X = Log (X), e os dados transformados foram submetidos a uma análise de regressão linear e ajustados em uma curva de resposta à dose sigmoidal. EC80 (oitenta por cento (80%) da concentração eficaz máxima, que inclui a concentração de um anticorpo que induz uma resposta de oitenta por cento (80%) entre a linha de base e o máximo após um tempo de exposição especificado) e as principais respostas foram derivadas desta análise.

[00253] Para determinar a eficácia dos anticorpos biespecíficos anti- FcεR1α x anti-CD3 exemplificativos da invenção na indução da morte mediada por células T de basófilos primários dentro de uma população de células mononucleares de sangue periférico (PBMC), um ensaio baseado na quantificação dessas células relativas para o resto da população de PBMC foi utilizado. PBMCs frescas foram obtidos a partir de sangue de doador por purificação Ficoll (GE Healthcare, Cat. # 17- 1440-03) e foram misturadas com células T ativadas e diluições de anticorpos em um formato semelhante ao descrito acima para as células alvo HEK293/hFcR1 /hFcR1/hFcR1 engenheiradas. Após incubação durante a noite, as células foram colhidas, incubadas com um marcador de células vivas/mortas (Invitrogen Cat. #L34962), seguido de incubação com um anticorpo bloqueador de Fc e coloração com uma mistura de anticorpos contendo anticorpos anti-HLA-DR conjugado com APC (BD Biosciences, Cat. #559866) e anti-CD123 conjugado com BUV 395 (BD Biosciences, Cat. . #564195). As células foram então lavadas duas vezes com tampão MACS e fixadas em uma solução contendo BD Cytofix diluído 1:4 em PBS por 15 minutos. As células foram ressuspensas em tampão MACS e adquiridas em um instrumento LSRFortessa. As células mortas foram excluídas da análise usando o marcador de células vivas/mortas, assim como as células T ativadas exógenas que haviam sido previamente marcadas com CFSE. Os basófilos na população de PBMC viva restante foram identificados como CD123+HLA-DR-.

[00254] A análise dos dados foi realizada utilizando o software Graphpad Prism. Os pontos de dados obtidos foram transformados usando uma equação X = Log (X), e os dados transformados foram submetidos a uma análise de regressão linear e ajustados em uma curva de resposta à dose sigmoidal. EC50s foram derivados desta análise. A redução percentual máxima de basófilos foi calculada usando a seguinte fórmula: 100 - (100 x por cento de basófilos na amostra com a maior dose de anticorpo)/(porcentagem média de basófilos em todas as amostras de controle de isótipo).

[00255] A Tabela 16 resume os aumentos dependentes da dose em caspase 3 clivada e células alvo duplamente positivas HEK293/hFcR1 /hFcR1/hFcR1 PARP clivadas na presença de cada exemplo de anticorpos biespecíficos da invenção (bsAb24919D, bsAb24920D e bsAb24921D), com EC80s de 3,456 x 10-11 M, 1,264 x 10-

M, e 6,128 x 10-11 M, respectivamente. Como este ensaio é baseado na captura dos estágios iniciais de apoptose, o ensaio é interrompido antes que as células sejam totalmente mortas, e a porcentagem máxima de células com coloração positiva para os marcadores apoptóticos foi 56,04, 56,48 e 55,83 para células incubadas com bsAb24919D, bsAb24920D e bsAb24921D, respectivamente. Notavelmente, nenhum aumento na porcentagem de células alvo positivas para ambos os marcadores apoptóticos foi observado quando as células T foram incubadas junto com as células alvo na ausência de anticorpo em relação às células alvo incubadas sozinhas. Em outras palavras, a indução de apoptose não é observada quando as células T foram incubadas junto com as células alvo na presença de anticorpo de controle de isótipo apenas. Tabela 16: EC80 e porcentagem máxima de células apoptóticas a partir de curvas de morte de resposta à dose de células alvo HEK293/hFcR1 /hFcR1/hFcR1 após incubação com células T e anticorpos biespecíficos FcεR1α x CD3 bsAb24919D bsAb24920D bsAb24921D EC80 3,456e-11 1,264e-10 6,128e-11 Porcentagem máxima de células 56,04 56,48 55,83 apoptóticas

[00256] A Tabela 17 resume as diminuições dependentes da dose em basófilos dentro da população alvo de PBMC total na presença de anticorpos biespecíficos exemplificativos da invenção (bsAb24919D, bsAb24920D e bsAb24921D), com EC50s de 3,748 x 10-9 M, 2,003 x 10- 8 M, e 4,003 x 10-9 M, respectivamente. Os basófilos diminuíram 90,57%, 80,1% e 90,92% com a dose mais alta de bsAb24919D, bsAb24920D e bsAb24921D, respectivamente em relação à porcentagem média de basófilos dentro das PBMCs em todas as amostras tratadas com isótipo. Tabela 17: EC50 e diminuição percentual máxima de basófilos a partir de curvas de resposta à dose de basófilos em células alvo de PBMC após incubação com células T e anticorpos biespecíficos FcεR1α x CD3 bsAb24919D bsAb24920D bsAb24921D EC50 3,748e-9 2,003e-8 4,003e-9 Redução máxima percentual de basófilos 90,57% 80,1% 90,92% Exemplo 7: Eficácia in vivo de anticorpos biespecíficos anti- FcεR1α x CD3

[00257] Foi estudado o efeito dos anticorpos biespecíficos anti- FcεR1α x anti-CD3 no modelo de anafilaxia cutânea passiva (PCA) in vivo e na depleção de basófilos esplênicos.

[00258] Para determinar a eficácia dos anticorpos biespecíficos anti- FcεR1α x CD3 da invenção para bloquear a desgranulação de mastócitos induzida por alérgeno, foi usado o modelo de anafilaxia cutânea passiva (PCA) in vivo . O modelo PCA avalia a hipersensibilidade tipo 1 e mede a permeabilidade vascular induzida pela ativação de mastócitos local no tecido da orelha (Gilfillan, A. M. & Tkaczyk, C. Integrated signaling pathways for mast-cell activation. Nat. Rev. Immunol. 6, 218–230 (2006)). Este modelo envolve a injeção intradérmica de um soro específico do alérgeno de pacientes alérgicos em uma área local na pele de camundongos que expressam o receptor de IgE de alta afinidade humano, FcεR1α, seguida por injeção intravenosa de um alérgeno junto com um corante. A reação alérgica causa dilatação capilar e aumento da permeabilidade vascular no local de sensibilização, resultando em acúmulo preferencial de corante neste local. O corante pode ser extraído do tecido e quantificado espectrofotometricamente.

[00259] Para os ensaios de PCA, grupos de camundongos humanizados para FcεR1α e CD3 (n≥5 por experimento) foram primeiro injetados subcutaneamente com um anticorpo de controle de isótipo ou um dos três anticorpos biespecíficos FcεR1α x CD3 exemplificativos da invenção em uma dose de 25mg/kg. Cinco dias após a administração do anticorpo, os camundongos foram injetados no ouvido com soro de um indivíduo alérgico a gato (título de IgE 585, diluído 1:5 em PBS). No dia seguinte, os camundongos foram administrados por via intravenosa (100μL por camundongo) com uma solução de 1 μg/mL Fel D1 (Indoor biotech LTN-FD1-1) dissolvido em 1X PBS contendo 0,5% (p/v) de corante azul de Evan (Sigma Aldrich, # E2129). Uma hora após a administração do antígeno, os camundongos foram sacrificados e as orelhas e baços foram excisados e coletados.

[00260] As orelhas foram colocadas em 1 mL de formamida e subsequentemente incubadas por 3 dias a 50°C para extrair o corante azul de Evan. O tecido da orelha foi então removido da formamida, manchado para remover o excesso de líquido e pesado. Alíquotas de duzentos microlitros de cada extrato de formamida foram transferidas para placas de 96 poços em duplicado. A absorbância dos sobrenadantes resultantes foi medida a 620 nm. A densidade óptica medida foi convertida na concentração do corante azul de Evan usando uma curva padrão e é representada como nanograma do corante azul de Evan por miligrama de tecido da orelha. A Tabela 18 mostra os valores médios ± desvio padrão para cada grupo.

[00261] Para avaliar a frequência dos basófilos, foi utilizado um ensaio baseado em citometria de fluxo. As suspensões de células únicas foram preparadas a partir dos baços coletados após a lise dos glóbulos vermelhos (Sigma, Cat #R7757). As células foram então coradas com um marcador de células vivas/mortas, seguido pela coloração de anticorpos com as misturas de anticorpos contendo BUV 395 anti-B220 conjugado (BD, Cat #563793), FITC anti-CD4 conjugado (BD, Cat #553031), FITC anti-CD8 conjugado (BD, Cat #557667) e CD49b conjugado com PECy7 (EBIOSCIENCE, Cat #25-5971-82).

Após a coloração, as células foram lavadas duas vezes com tampão MACS (Miltenyi Biotech Cat# 130-091-221), fixadas com BD Cytofix (Cat #554655) diluído 1:4 em PBS por 15 minutos, então ressuspensas em tampão MACS e armazenadas em 4 graus. No dia da aquisição, as células foram lavadas duas vezes em BD Perm/tampão de lavagem (Cat #554723) e coradas para FcεR1α intracelular com o anti-FcεR1α conjugado eFluor450 (EBIOSCIENCE, Cat #48-5899-42). As células foram então adquiridas em um instrumento LSRFortessa e analisadas usando o software FlowJo. Os basófilos foram identificados como B220- CD4- CD8- CD49+ FcεR1α+. A redução percentual de basófilos em camundongos administrados com anticorpos individuais foi calculada com a seguinte fórmula: 100- (porcentagem de basófilos esplênicos/porcentagem média de basófilos esplênicos no grupo de isótipo), onde a porcentagem de basófilos esplênicos é calculada em relação ao total de células vivas no baço. Os resultados estão mostrados na Tabela 19.

[00262] O extravasamento do corante azul de Evan foi observado nas orelhas de camundongos que não receberam o anticorpo ou naqueles administrados com um anticorpo de controle de isótipo, com uma quantificação média do corante de 84,06 e 82,05 ng/mg, respectivamente (ng/mg refere-se ao nanograma do corante azul de Evan por miligrama de tecido). A Tabela 18 demonstra a eficácia dos anticorpos biespecíficos anti-FcεR1α x CD3 exemplificativos da invenção (bsAb24919D e bsAb24921D) no modelo de PCA, conforme indicado por uma redução significativa de extravasamento de corante nos grupos tratados com esses anticorpos em comparação com o controle de isótipo. Uma tendência não estatisticamente significativa para o extravasamento de corante reduzido foi observada no grupo tratado com bsAb24920D em comparação com o controle de isótipo. Como mostrado, bsAb24919D e bsAb24921D bloqueiam a desgranulação de mastócitos no modelo cutâneo passivo in vivo contra a sensibilização e desafio subsequente com Fel D1 em comparação com o controle de isótipo demonstrando uma redução significativa no extravasamento de corante de 74,64 ng/mg e 75,26 ng/mg, respectivamente, enquanto uma redução mais modesta de 48,56 ng/mg foi observada com bsAb24920D. A significância estatística foi determinada da seguinte forma: A normalidade de todos os grupos foi primeiro testada com o teste de normalidade de Shapiro-Wilk. Como os dados em todos os grupos estavam normalmente distribuídos, uma análise ANOVA de uma via foi aplicada, com um teste de Brown- Forsythe para determinar as diferenças nos desvios padrão entre os grupos. Foram observados desvios-padrão significativamente diferentes; assim, um teste não paramétrico de Kruskal-Wallis foi executado em vez do teste de comparação múltipla de Dunn para determinar a significância estatística entre os grupos.

[00263] Os baços de camundongos aos quais não foi administrado anticorpo continham uma média de 0,91% de basófilos em relação ao total de células vivas, enquanto os de camundongos administrados com anticorpo de controle de isótipo continham uma média de 0,71% de basófilos. A Tabela 19 demonstra a eficácia dos anticorpos biespecíficos FcεR1α x CD3 exemplificativos da invenção (bsAb24919D, bsAb24920D e bsAb24921D) na depleção de basófilos esplênicos nos mesmos camundongos do experimento PCA descrito acima. Como mostrado, os camundongos tratados com qualquer um dos três anticorpos mostraram uma redução nos basófilos esplênicos. Embora esta redução tenha sido significativa para todos os três anticorpos em comparação com os camundongos que não receberam o anticorpo, a redução foi estatisticamente significativa apenas para os camundongos tratados com bsAb24919D quando comparado ao grupo administrado com um anticorpo de controle de isótipo. Os camundongos tratados com bsAb24919D, bsAb24920D e bsAb24921D mostraram 96, 93 e 92 por cento de redução nos basófilos em relação ao grupo de isótipo, respectivamente.

A significância estatística foi determinada da seguinte forma: um teste de normalidade de Shapiro-Wilk foi executado pela primeira vez, e todos os grupos de dados que encontramos estavam normalmente distribuídos; assim, uma análise ANOVA de uma via foi aplicada, e um teste de Brown-Forsythe foi usado para testar as diferenças nos desvios-padrão entre os grupos.

Foram observados desvios-padrão significativamente diferentes; neste teste, então um teste não paramétrico de Kruskal-Wallis foi executado em vez do teste de comparação múltipla de Dunn para determinar a significância estatística entre os grupos.

Tabela 18: Efeito de anticorpos biespecíficos anti-FcεR1α x CD3 no modelo in vivo de anafilaxia cutânea passiva (PCA) Diferença média em comparação com o controle Tratamento ng Evans Blue/mg tissue ±SD de isótipo bsAb24919D (n=7) 7,41 ± 1,1 -74,64 bsAb24920D (n = 7) 33,49 ± 16,54 -48,56 (ns) bsAb24921D (n = 7) 6,79 ± 2,77 -75,26(**)

25mg/kg total antibody concentration used for all groups administered antibody *P≤.05, ***P≤.001, ***P≤.0001 n = número de camundongos por grupo Tabela 19: Efeito de anticorpos biespecíficos anti-FcεR1α x CD3 na depleção de basófilos esplênicos Basófilos esplênicos Redução percentual média em relação à média de Tratamento (porcentagem de células vivas) basófilos no grupo de controle de isótipo bsAb24919D (n=7) 0,003 ± 0,0017 95,89 (**) bsAb24920D (n = 7) 0,005 ± 0,0018 92,96 (ns) bsAb24921D (n = 7) 0,003 ± 0,0026 92,43 (ns)

25mg/kg total antibody concentration used for all groups administered antibody *P≤.05, ***P≤.001, ***P≤.0001 n = número de camundongos por grupo

[00264] Para os ensaios de PCA e de depleção de basófilos, a ablação de células que expressam FcεR1α foi alcançada usando anticorpos biespecíficos anti-FcεR1α x CD3 exemplificativos da invenção em dosagem mais baixa. bsAb24919D e bsAb24921D mostraram inibição estatisticamente significativa da resposta PCA e perda significativa de basófilos em experimentos repetidos com doses mais baixas de 1 mg/kg, 5 mg/kg e 10 mg/kg (dados não mostrados). A eficácia é semelhante em doses entre 5 mg/kg e 25 mg/kg para bsAb24919D e bsAb24921D em ambos os ensaios de PCA e de depleção de basófilos (dados não mostrados).

[00265] A presente invenção não deve ser limitada no seu âmbito pelas modalidades específicas aqui descritas. De fato, várias modificações da invenção, além daquelas descritas neste documento, vão se tornar evidente para aqueles versados na técnica da descrição acima. Tais modificações pretendem ser abrangidas pelo escopo das reivindicações anexas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo caracterizado pelo fato de que se liga a FcεR1α humano ou se liga a FcεR1α cynomolgus com um valor de constante de equilíbrio de dissociação de ligação (KD) inferior a cerca de 470 nM, conforme medido em um ensaio de ressonância plasmônica de superfície a 25ºC.

2. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo caracterizado pelo fato de que se liga a FcεR1α humano com uma meia-vida dissociativa (t½) maior que cerca de 0,54 minuto ou se liga a FcεR1α cynomolgus com uma meia-vida dissociativa (t½) maior que cerca de 0,6 minuto como medido em um ensaio de ressonância plasmônica de superfície a 25ºC.

3. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compete pela ligação a FcεR1α humano com um anticorpo de referência compreendendo um par de sequência de aminoácidos HCVR/LCVR conforme estabelecido na Tabela 1.

4. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de referência compreende um par de sequências de aminoácidos HCVR/LCVR selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2/26; 10/26; e 18/26.

5. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga ao mesmo epitopo em FcεR1α humano como um anticorpo de referência compreendendo um par de sequência de aminoácidos HCVR/LCVR conforme estabelecido na Tabela 1.

6. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga ao mesmo epitopo em FcεR1α humano como um anticorpo de referência compreendendo um par de sequência de aminoácidos HCVR/LCVR selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2/26; 10/26 e 18/26.

7. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a FcεR1α humano, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende: (a) as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de uma região variável da cadeia pesada (HCVR) com uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na Tabela 1; e (b) as CDRs de uma região variável da cadeia leve (LCVR) com uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na Tabela 1.

8. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende as CDRs da cadeia pesada e leve de um par de sequência de aminoácidos HCVR/LCVR selecionado do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 2/26, 10/26; e 18/26.

9. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende domínios HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3, respectivamente, selecionados do grupo que consiste em: SEQ ID NOs:.4-6-8-28-30-32; 12-14-16-28-30-32; e 20-22-24-28-30-32.

10. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a FcεR1α humano, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende: (a) uma região variável da cadeia pesada (HCVR) com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2, 10 e 18; e (b) uma região variável da cadeia leve (LCVR) com uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NOs: 26.

11. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende um par de sequência de aminoácidos HCVR/LCVR selecionado do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 2/26, 10/26; e 18/26.

12. Molécula biespecífica de ligação ao antígeno, caracterizada pelo fato de que compreende um primeiro domínio de ligação ao antígeno que se liga a CD3 humano e um segundo domínio de ligação ao antígeno que se liga a FcεR1α humano, em que o segundo domínio de ligação ao antígeno é derivado do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11.

13. Molécula biespecífica de ligação ao antígeno, caracterizada pelo fato de que compreende um primeiro domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a CD3 humano e um segundo domínio de ligação a antígeno que se liga a FcεR1α humano e/ou cynomolgus.

14. Molécula biespecífica de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizada pelo fato de que a molécula de ligação ao antígeno se liga a ambos CD3 humano e FcεR1α humano e induz a morte de células mediada por células T de células que expressam FcεR1α com um valor EC50 inferior a cerca de 20 nM.

15. Molécula biespecífica de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizada pelo fato de que a molécula de ligação ao antígeno inibe a reação alérgica em um sujeito que expressa FcεR1α humano.

16. Molécula biespecífica de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 15, caracterizada pelo fato de que a molécula de ligação ao antígeno ativa a sinalização de CD3 com um valor de EC50 inferior a cerca de 4,9 nM.

17. Molécula biespecífica de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 16, caracterizada pelo fato de que o segundo domínio de ligação ao antígeno se liga especificamente a FcεR1α humano ou se liga a FcεR1α cynomolgus com um valor KD inferior a cerca de 470 nM, conforme medido em um ensaio de ligação de ressonância plasmônica de superfície in vitro a 25 ºC.

18. Molécula biespecífica de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 17, caracterizada pelo fato de que o segundo domínio de ligação ao antígeno se liga a FcεR1α humano com um valor KD inferior a cerca de 300 nM, inferior a cerca de 200 nM, inferior a cerca de 150 nM, ou inferior a cerca de 100 nM, conforme medido em um ensaio de ligação de ressonância plasmônica de superfície in vitro a 25 ºC.

19. Molécula biespecífica de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18, caracterizada pelo fato de que o segundo domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a FcεR1α humano compreende as regiões determinantes de complementaridade da cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) de uma região variável da cadeia pesada (HCVR) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2, 10 e 18; e as regiões determinantes de complementaridade da cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3) de uma região variável da cadeia leve (LCVR) compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26.

20. Molécula biespecífica de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 19, caracterizada pelo fato de que o segundo domínio de ligação ao antígeno que se liga a FcεR1α humano compreende três regiões determinantes de complementaridade da cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) e três regiões determinantes de complementaridade da cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 4, 12 e 20; HCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 6, 14 e 22; HCDR3 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 8, 16 e 24; LCDR1 compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28; LCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 30; e LCDR3 compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NOs: 32.

21. Molécula biespecífica de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que o segundo domínio de ligação ao antígeno compreende domínios HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 selecionados do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 4-6-8-28- 30-32, 12-14-16-28-30- 32 e 20-22-24-28-30-32.

22. Molécula biespecífica de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 21, caracterizada pelo fato de que o segundo domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a FcεR1α humano compreende os CDRs da cadeia pesada e leve de um par HCVR/LCVR compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 2/26; 10/26; e 18/26.

23. Molécula biespecífica de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 22, caracterizada pelo fato de que o primeiro domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a CD3 humano compreende regiões determinantes de complementaridade da cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) de uma região variável da cadeia pesada (HCVR) compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 42; e as regiões determinantes de complementaridade da cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3) de uma região variável da cadeia leve (LCVR) compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26.

24. Molécula biespecífica de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 23, caracterizada pelo fato de que o primeiro domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a CD3 humano compreende três regiões determinantes de complementaridade da cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) e três regiões determinantes de complementaridade da cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 44; HCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 46; HCDR3 compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48; LCDR1 compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28; LCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 30; e LCDR3 compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 32.

25. Molécula biespecífica de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 24, caracterizada pelo fato de que o primeiro domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a CD3 humano compreende as CDRs de cadeia pesada e leve de um par de sequência de aminoácidos HCVR/LCVR da SEQ ID NO: 42/26.

26. Molécula biespecífica de ligação ao antígeno isolada, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) um primeiro domínio de ligação ao antígeno que compreende os domínios HCDR1, HCDR2 e HCDR3, respectivamente, compreendendo as sequências de aminoácidos da SEQ ID NOs: 44, 46 e 48 e domínios LCDR1, LCDR2 e LCDR3, respectivamente, compreendendo as sequências de aminoácidos da SEQ ID NOs: 28, 30 e 32; e (b) um segundo domínio de ligação ao antígeno compreendendo os domínios HCDR1, HCDR2 e HCDR3, respectivamente, compreendendo as sequências de aminoácidos da SEQ ID NOs: 4, 6 e 8, e domínios LCDR1, LCDR2 e LCDR3, respectivamente, compreendendo as sequências de aminoácidos da SEQ ID NOs: 28, 30 e 32.

27. Molécula biespecífica de ligação ao antígeno isolada, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) um primeiro domínio de ligação ao antígeno que compreende domínios HCDR1, HCDR2 e HCDR3, respectivamente, compreendendo as sequências de aminoácidos da SEQ ID NOs: 44, 46 e 48 e domínios LCDR1, LCDR2 e LCDR3, respectivamente, compreendendo as sequências de aminoácidos da SEQ ID NOs: 28, 30 e 32, em que o primeiro domínio de ligação ao antígeno se liga a CD3 humano; e (b) um segundo domínio de ligação ao antígeno que compreende os domínios HCDR1, HCDR2 e HCDR3, respectivamente, compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 12, 14 e 16 e os domínios LCDR1, LCDR2 e LCDR3, respectivamente, compreendendo as sequências de aminoácido da SEQ ID NOs: 28, 30 e 32, em que o segundo domínio de ligação ao antígeno se liga a FcεR1α humano.

28. Molécula biespecífica de ligação ao antígeno isolada, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) um primeiro domínio de ligação ao antígeno que compreende os domínios HCDR1, HCDR2 e HCDR3, respectivamente, compreendendo as sequências de aminoácidos da SEQ ID NOs: 44, 46 e 48 e domínios LCDR1, LCDR2 e LCDR3, respectivamente, compreendendo as sequências de aminoácidos da SEQ ID NOs: 28, 30 e 32, em que o primeiro domínio de ligação ao antígeno se liga a CD3 humano e (b) um segundo domínio de ligação ao antígeno que compreende os domínios HCDR1, HCDR2 e HCDR3, respectivamente, compreendendo as sequências de aminoácidos da SEQ ID NOs: 20, 22 e 24, e domínios LCDR1, LCDR2 e LCDR3, respectivamente, compreendendo as sequências de aminoácidos da SEQ ID NOs: 28, 30 e 32, em que o segundo domínio de ligação ao antígeno se liga a FcεR1α humano.

29. Molécula biespecífica de ligação ao antígeno isolada, caracterizada pelo fato de que compete pela ligação a FcεR1α, ou se liga ao mesmo epitopo em FcεR1α como um anticorpo de referência, em que o anticorpo de referência compreende um primeiro domínio de ligação ao antígeno compreendendo um par de sequências HCVR/LCVR compreendendo as sequências de aminoácido da SEQ ID NOs: 42/26, e um segundo domínio de ligação ao antígeno compreendendo um par de sequências HCVR/LCVR compreendendo as sequências de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2/26, 10/26 e 18/26.

30. Molécula biespecífica de ligação ao antígeno isolada, caracterizada pelo fato de que compete pela ligação a CD3 humano, ou se liga ao mesmo epitopo no CD3 humano como um anticorpo de referência, em que o anticorpo de referência compreende um primeiro domínio de ligação ao antígeno compreendendo um par de sequências HCVR/LCVR compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 42/26 e um segundo domínio de ligação ao antígeno compreendendo um par de sequências HCVR/LCVR compreendendo as sequências de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 2/26, 10/26 e 18/26.

31. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, ou molécula biespecífica de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 30, caracterizados pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou a molécula biespecífica de ligação ao antígeno se liga a FcεR1α expresso na superfície celular na presença de imunoglobulina E (IgE).

32. Molécula biespecífica de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 31, caracterizada pelo fato de que é um anticorpo biespecífico.

33. Molécula biespecífica de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 32, caracterizada pelo fato de que o anticorpo biespecífico compreende uma região constante da cadeia pesada de IgG humana.

34. Molécula biespecífica de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que a região constante da cadeia pesada de IgG humana é o isótipo IgG4.

35. Molécula biespecífica de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que a região constante da cadeia pesada de IgG humana é o isótipo IgG1.

36. Molécula biespecífica de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 32 a 34, caracterizada pelo fato de que o anticorpo biespecífico compreende uma primeira cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 56, uma segunda cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 50, e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 40.

37. Molécula biespecífica de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 32 a 34, caracterizada pelo fato de que o anticorpo biespecífico compreende uma primeira cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 56, uma segunda cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 52, e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 40.

38. Molécula biespecífica de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 32 a 34, caracterizada pelo fato de que o anticorpo biespecífico compreende uma primeira cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 56, uma segunda cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 54, e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 40.

39. Molécula de ácido nucleico caracterizada pelo fato de que codifica o anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, ou molécula de ligação ao antígeno biespecífica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 38.

40. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 39.

41. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende o vetor como definido na reivindicação 40.

42. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, ou a molécula biespecífica de ligação ao antígeno, como definida em qualquer uma das reivindicações 12 a 38, e um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável.

43. Método para produzir um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ou uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar uma célula hospedeira que expressa o anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, ou a molécula biespecífica de ligação ao antígeno como definida em qualquer uma das reivindicações 12 a 38, sob condições que permitem a produção do anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ou molécula biespecífica de ligação ao antígeno.

44. Método para tratamento de uma doença ou distúrbio associado à expressão e/ou sinalização de FcεR1α em um sujeito, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao sujeito a composição farmacêutica como definida na reivindicação 42.

45. Método, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que a doença ou distúrbio associado à expressão e/ou sinalização de FcεR1α é uma alergia, um distúrbio de ativação de mastócitos ou mastocitose.

46. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que a alergia é selecionada do grupo que consiste em asma alérgica, febre do feno, dermatite atópica, urticária crônica, alergia alimentar e alergia ao pólen.

47. Método, de acordo com a reivindicação 45 ou 46, caracterizado pelo fato de que a alergia é uma alergia anafilática.

48. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 47, caracterizado pelo fato de que compreende ainda administrar ao sujeito um segundo agente terapêutico.

49. Método, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que o segundo agente terapêutico é selecionado do grupo que consiste em um antagonista de IgE, uma anti- histamina, um agente anti-inflamatório, um corticosteroide, um antagonista de leucotrieno, um inibidor de mastócitos, um dilatador brônquico, um descongestionante, epinefrina, um inibidor de IL-4, um inibidor do receptor de IL-4, um antagonista de IL-33, um antagonista de IL-25, um agente de ablação de células plasmáticas e um antagonista de TSLP.

50 Uso da composição farmacêutica, como definida na reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que é no tratamento de uma doença ou distúrbio associado à expressão e/ou sinalização de FcεR1α.

51. Uso, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que a doença ou distúrbio é uma alergia, um distúrbio de ativação de mastócitos ou mastocitose.