BR112020012011A2 - moléculas de ligação a antígeno biespecífica isolada e de ligação a antígeno biespecífica ou cadeia de imunoglobulina, composição farmacêutica, recipiente ou dispositivo de injeção, ácido nucleico isolado, vetor isolado, célula hospedeira isolada, métodos para tratar uma doença ou condição, para tratar uma condição de lipodistrofia em um sujeito, para produzir uma molécula de ligação a antígeno biespecífica, e, para administrar uma molécula de ligação a antígeno biespecífica isolada ou composição farmacêutica. - Google Patents

moléculas de ligação a antígeno biespecífica isolada e de ligação a antígeno biespecífica ou cadeia de imunoglobulina, composição farmacêutica, recipiente ou dispositivo de injeção, ácido nucleico isolado, vetor isolado, célula hospedeira isolada, métodos para tratar uma doença ou condição, para tratar uma condição de lipodistrofia em um sujeito, para produzir uma molécula de ligação a antígeno biespecífica, e, para administrar uma molécula de ligação a antígeno biespecífica isolada ou composição farmacêutica. Download PDF

Info

Publication number
BR112020012011A2
BR112020012011A2 BR112020012011-1A BR112020012011A BR112020012011A2 BR 112020012011 A2 BR112020012011 A2 BR 112020012011A2 BR 112020012011 A BR112020012011 A BR 112020012011A BR 112020012011 A2 BR112020012011 A2 BR 112020012011A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
binding
lepr
bispecific antigen
antibodies
bispecific
Prior art date
Application number
BR112020012011-1A
Other languages
English (en)
Inventor
Jesper Gromada
Panayiotis Stevis
Judith ALTAREJOS
Original Assignee
Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Regeneron Pharmaceuticals, Inc. filed Critical Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
Publication of BR112020012011A2 publication Critical patent/BR112020012011A2/pt

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/02—Drugs for disorders of the endocrine system of the hypothalamic hormones, e.g. TRH, GnRH, CRH, GRH, somatostatin
    • A61P5/04—Drugs for disorders of the endocrine system of the hypothalamic hormones, e.g. TRH, GnRH, CRH, GRH, somatostatin for decreasing, blocking or antagonising the activity of the hypothalamic hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2869—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against hormone receptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

A presente invenção refere-se a moléculas de ligação a antígeno, incluindo moléculas de ligação a antígeno biespecíficas que se ligam à GP130 humana e/ou ao receptor de leptina humana (LEPR), e o uso de tais moléculas de ligação a antígeno para o tratamento de condições e distúrbios relacionados à deficiência de leptina ou resistência à leptina. As moléculas de ligação a antígeno biespecíficas da presente invenção podem ser, por exemplo, anticorpos biespecíficos compreendendo um primeiro domínio de ligação a antígeno que se liga especificamente à GP130 humana e um segundo domínio de ligação a antígeno que se liga especificamente ao LEPR humano. As moléculas de ligação a antígeno biespecíficas da presente invenção são úteis em aplicações terapêuticas em que a sinalização induzida por leptina e/ou mediada por LEPR seria benéfica, por exemplo, no tratamento de obesidade, lipodistrofias e outras doenças e distúrbios associados a, ou causados pela deficiência de leptina ou resistência à leptina.

Description

MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO A ANTÍGENO BIESPECÍFICA ISOLADA E DE LIGAÇÃO A ANTÍGENO BIESPECÍFICA OU CADEIA DE IMUNOGLOBULINA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, RECIPIENTE OU DISPOSITIVO DE INJEÇÃO, ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO, VETOR ISOLADO, CÉLULA HOSPEDEIRA ISOLADA, MÉTODOS PARA TRATAR UMA DOENÇA OU CONDIÇÃO, PARA TRATAR UMA CONDIÇÃO DE LIPODISTROFIA EM UM SUJEITO, PARA PRODUZIR UMA MOLÉCULA DE LIGAÇÃO A ANTÍGENO BIESPECÍFICA, E, PARA ADMINISTRAR UMA MOLÉCULA DE LIGAÇÃO A ANTÍGENO BIESPECÍFICA ISOLADA OU COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção refere-se a moléculas de ligação ao antígeno, incluindo moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas (por exemplo, anticorpos biespecíficos) que se ligam à GP130 humana e/ou a receptor de leptina humano (LEPR) e ao uso de tais moléculas de ligação ao antígeno para o tratamento de condições e distúrbios relacionados a deficiência de leptina ou resistência à leptina.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[002] Uma cópia oficial da listagem de sequências é enviada simultaneamente com o relatório descritivo eletronicamente via EFS-Web como uma listagem de sequências em formato ASCII com um nome de arquivo de “10397WO0O01 SEQ LIST ST25.txt”, uma data de criação de 17 de dezembro de 2018 e um tamanho de cerca de 151 KB. A listagem de sequências contida neste documento em formato ASCII é parte do relatório descritivo e está incorporada neste documento por referência na sua totalidade.
FUNDAMENTOS
[003] A glicoproteína 130 (GP1I30) é um componente de um complexo de receptores que também compreende CNTRF-alfa e LIFR-beta. À sinalização através deste complexo de receptores ativa a sinalização de
JAK/STAT, que, em certos contextos biológicos, resulta em redução do apetite, da ingestão de alimentos e perda de peso.
[004] A leptina é um hormônio polipeptídico predominantemente expresso pelo tecido adiposo e está envolvida na regulação do metabolismo, equilíbrio de energia e ingestão de alimentos. A atividade da leptina é mediada pela interação com, e sinalização através do, receptor de leptina. O receptor de leptina (também conhecido como “LEPR”, “WSX”, “receptor OB”, “OB-R” e “CD295”) é um receptor transmembranar de passagem única da família de receptores de citocina classe I com um grande (818 aminoácidos) domínio extracelular. Deficiência de leptina, resistência à leptina e certas mutações de sinalização de LEPR defeituosa/comprometida estão associadas à obesidade, diabetes tipo 2, dislipidemia, lipodistrofias, esteatose hepática, doenças hepáticas gordurosas não alcoólicas e alcoólicas, resistência à insulina severa, Leprechaunismo/síndrome de Donohue, síndrome de Rabson-Mendenhall e complicações relacionadas. Abordagens terapêuticas para tratar resistência à leptina, deficiência de leptina e hipoleptinemia (por exemplo, lipodistrofia) têm focado principalmente na distribuição de leptina complementar ou análogos de leptina aos indivíduos afetados. Essas abordagens, no entanto, geralmente mostram eficácia limitada, particularmente em indivíduos resistentes à leptina, e são frequentemente associadas a efeitos colaterais adversos. Assim, existe uma necessidade na técnica de abordagens alternativas para tratar a resistência à leptina e outras condições associadas à deficiência de leptina ou hipoleptinemia.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[005] A presente invenção refere-se, em parte, ao conceito de heterodimerização mediada por anticorpo de LEPR e GP130 para ativar ambos Os receptores e, assim, estimular os efeitos anorexegênicos associados à sinalização através desses receptores. Consequentemente, a presente invenção fornece moléculas de ligação ao antígeno (por exemplo, anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno de anticorpos) que se ligam à GP130 humana e/ou ao receptor de leptina humano (LEPR). De acordo com certas modalidades, a presente invenção fornece moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que compreendem um primeiro domínio de ligação ao antígeno (DI) que se liga especificamente à GP130 humana e um segundo domínio de ligação ao antígeno (D2) que se liga especificamente ao receptor de leptina humano (LEPR). A presente invenção inclui moléculas biespecíficas LEPRxGP130 (por exemplo, anticorpos biespecíficos). Em certas modalidades exemplificativas da invenção, o domínio de ligação ao antígeno anti-GP130 (D1) e o domínio de ligação ao antígeno anti-LEPR (D2) compreendem, cada um, regiões variáveis da cadeia pesada (HCVRs) diferentes e distintas pareadas com regiões variáveis da cadeia leve (LCVRs) iguais ou diferentes.
[006] As moléculas de ligação ao antígeno (por exemplo, moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas) da presente invenção são úteis, inter alia, para direcionar células que expressam LEPR e/ou células que expressam GP130, ou ambos. De acordo com certas modalidades, as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da presente invenção são úteis para ligar fisicamente LEPR e GP130 um ao outro na superfície de uma célula, a fim de estimular a sinalização de LEPR. Desta forma, as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da presente invenção podem servir como agonistas de LEPR em uma variedade de aplicações terapêuticas em que a sinalização mediada por leptina e/ou LEPR seria benéfica (por exemplo, no tratamento de obesidade, lipodistrofias e outras doenças e distúrbios associados ou causados por deficiência de leptina ou resistência à leptina).
[007] Outras modalidades ficarão evidentes a partir de uma revisão da descrição detalhada subsequente.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[008] A Figura 1 mostra os efeitos do tratamento de anticorpo biespecífico LEPRxGP130 (quadrados abertos e losangos abertos) em camundongos obesos, alimentados com uma dieta com alto teor de gordura, expressando LEPR humano e GP130 humana, em comparação com o tratamento com anticorpo de controle de isotipo (círculos fechados). Os anticorpos foram administrados por via subcutânea a 30 mg/kg no dia O e no dia 7 (indicado por “Dose” e setas ascendentes), e os efeitos do tratamento com anticorpos no peso corporal (expressos em termos de alteração percentual média no peso corporal desde pré-dose) são plotados ao longo do tempo para cada grupo de tratamento ao longo do tempo. Os quadrados abertos representam camundongos tratados com bs Ab21236 (alternativamente referido como “H4H21236D”). Losangos abertos representam camundongos tratados com bsAb21237 (alternativamente referido como “H4H21237D”). (*) indica controle de isotipo vs. bsAb21236 com P<0,05. (*) indica controle de isotipo vs. bsAb21237 com P<0,05.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[009] Antes de a presente invenção ser descrita, entende-se que esta invenção não está limitada a métodos particulares e às condições experimentais descritas, visto que estes métodos e condições podem variar. Entende-se também que a terminologia usada neste documento tem o propósito de descrever modalidades particulares apenas, e não se destina a ser um fator limitante, uma vez que o escopo da presente invenção estará limitado apenas pelas reivindicações anexas.
[0010] Salvo definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado comumente entendido por uma pessoa versada na técnica à qual esta invenção pertence. Conforme usado neste documento, o termo “cerca de”, quando usado em referência a um valor numérico relatado específico, significa que o valor pode variar a partir do valor relatado em mais de 1%. Por exemplo, conforme usado neste documento, a expressão “cerca de 100” inclui 99 e 101 e todos os valores entres estes (por exemplo, 99,1, 99,2, 99,3, 994, etc.).
[0011] Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes aos descritos neste documento possam ser usados na prática ou no teste da presente invenção, os métodos e materiais preferíveis são agora descritos. Todos as publicações de patentes, pedidos e não patentes mencionados neste relatório descritivo estão incorporados neste documento integralmente por referência. PROTEÍNA GP130
[0012] As expressões “Glicoproteína 130,” “GP130”, “gp130” e similares, conforme usadas neste documento, referem-se à proteína GP130 humana que compreende a sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:185 (ver também UniProtKB QI7RAO). A expressão “GP130” inclui ambas moléculas de GP130 monoméricas e multiméricas. Conforme usado neste documento, a expressão “GP130 humana monomérica” significa uma proteína GP130 ou porção desta que não contém ou possui quaisquer domínios de multimerização e que existe sob condições normais como uma única molécula de GP130 sem uma conexão física direta com outra molécula de GP130. Uma molécula de GP130 monomérica exemplificativa é a molécula referida neste documento como “hGP130.mmbh” que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:191 (ver, por exemplo, Exemplo 3, neste documento). Conforme usado neste documento, a expressão “GP130 humana dimérica” significa um construto que compreende duas moléculas de GP130 conectadas uma à outra através de um ligante, ligação covalente, ligação não covalente ou através de um domínio de multimerização, tal como um domínio Fc de anticorpo. Uma molécula de GP130 dimérica exemplificativa é a molécula referida neste documento como “hGP130.hFc” que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:197 ou “hGP130.mFc” que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:190 (ver, por exemplo, Exemplo 3, neste documento).
[0013] Todas as referências a proteínas, polipeptídeos e fragmentos de proteínas neste documento destinam-se a se referir à versão humana da respectiva proteína, polipeptídeo ou fragmento de proteína, a menos que explicitamente especificado como sendo de uma espécie não humana. Assim, a expressão “GP130” significa GP130 humana, a menos que especificado como sendo de uma espécie não humana, por exemplo, “GP130 de camundongo”, “GP130 de macaco”, etc.
[0014] Conforme usado neste documento, a expressão “GP130 expressa na superfície celular” significa uma ou mais proteínas GP130, ou o seu domínio extracelular, que é/são expressa(s) na superfície de uma célula in vitro ou in vivo, de modo que pelo menos uma porção de uma proteína GP130 é exposta no lado extracelular da membrana celular e é acessível para uma porção de ligação ao antígeno de um anticorpo. Uma “GP130 expressa na superfície celular” pode compreender ou consistir em uma proteína GP130 expressa na superfície de uma célula que normalmente expressa a proteína GP130. Alternativamente, “GP130 expressa na superfície celular” pode compreender ou consistir na proteína GP130 expressa na superfície de uma célula que normalmente não expressa GP130 humana em sua superfície, mas que foi manipulada artificialmente para expressar GP130 em sua superfície. ANTICORPOS ANTI-GP130 E SEUS FRAGMENTOS DE LIGAÇÃO
AO ANTÍGENO
[0015] De acordo com um aspecto da presente invenção, são fornecidos anticorpos anti-GP130 (por exemplo, anticorpos anti-GP130 monoespecíficos). Os anticorpos anti-GP130 exemplificativos de acordo com este aspecto da invenção estão listados nas Tabelas 1 e 2 neste documento. À Tabela 1 estabelece os identificadores de sequências de aminoácidos das regiões variáveis da cadeia pesada (HCVRs), regiões variáveis da cadeia leve (LCVRs), regiões determinantes de complementariedade da cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) e regiões determinantes de complementariedade da cadeia leve (LCDRI, LCDR2 e LCDR3) dos anticorpos anti-GP130 exemplificativos dos quais as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da presente invenção podem ser derivadas. A Tabela 2 estabelece os identificadores de sequência de ácidos nucleicos dos HCVRs, LCVRs, HCDR1, HCDR2 HCDR3, LCDR1I, LCDR2 e LCDR3 dos anticorpos anti-GP130 exemplificativos.
[0016] A presente invenção fornece anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno que se ligam especificamente à GP130, que compreendem uma HCVR que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCVR listadas na Tabela 1 ou uma sequência substancialmente semelhante a esta com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[0017] A presente invenção também fornece anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno que se ligam especificamente à GP130, que compreendem uma LCVR que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre qualquer uma das sequências de aminoácidos de LCVR listadas na Tabela 1, ou uma sequência substancialmente semelhante a esta com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[0018] A presente invenção também fornece anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno que se ligam especificamente à GP130, compreendendo um par de sequências de aminoácidos de HCVR e de LCVR (HCVR/LCVR) compreendendo qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCVR listadas na Tabela 1 pareadas com qualquer uma das sequências de aminoácidos de LCVR listadas na Tabela 1. De acordo com certas modalidades, a presente invenção também fornece anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, que compreendem um par de sequência de aminoácidos de HCVR/LCVR contido dentro de qualquer um dos anticorpos anti-GP130 exemplificativos listados na Tabela 1. Em certas modalidades, o par de sequência de aminoácidos de HCVR/LCVR é estabelecido como SEQ ID NOs: 154/10.
[0019] A presente invenção também fornece anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno que se ligam especificamente à GP130, que compreendem uma cadeia pesada CDRI (HCDRI1) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCDRI listadas na Tabela 1 ou uma sequência substancialmente semelhante a esta com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[0020] A presente invenção também fornece anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno que se ligam especificamente à GP130, que compreendem uma cadeia pesada CDR2 (HCDR2) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCDR2 listadas na Tabela 1 ou uma sequência substancialmente semelhante a esta com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[0021] A presente invenção também fornece anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno que se ligam especificamente à GP130, que compreendem uma cadeia pesada CDR3 (HCDR3) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCDR3 listadas na Tabela 1 ou uma sequência substancialmente semelhante a esta com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[0022] A presente invenção também fornece anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno que se ligam especificamente à GP130, que compreendem uma cadeia leve CDRI (LCDRI) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre qualquer uma das sequências de aminoácidos de LCDRI listadas na Tabela 1 ou uma sequência substancialmente semelhante a esta com pelo menos 90%, pelo menos 95%,
pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[0023] A presente invenção também fornece anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno que se ligam especificamente à GP130, que compreendem uma cadeia leve CDR2 (LCDR2) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre qualquer uma das sequências de aminoácidos de LCDR2 listadas na Tabela 1 ou uma sequência substancialmente semelhante a esta com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[0024] A presente invenção também fornece anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno que se ligam especificamente à GP130, que compreendem uma cadeia leve CDR3 (LCDR3) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre qualquer uma das sequências de aminoácidos de LCDR3 listadas na Tabela 1 ou uma sequência substancialmente semelhante a esta com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[0025] A presente invenção também fornece anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno que se ligam especificamente à GP130, que compreendem um par de sequência de aminoácidos de HCDR3 e LCDR3 (HCDR3/LCDR3) que compreende qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCDR3 listadas na Tabela 1 pareadas com qualquer uma das sequências de aminoácidos de LCDR3 listadas na Tabela 1. De acordo com certas modalidades, a presente invenção fornece anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, que compreendem um par de sequência de aminoácidos de HCDR3/LCDR3 contido dentro de qualquer um dos anticorpos anti-GP130 exemplificativos listados na Tabela 1. Em algumas modalidades, o par de sequência de aminoácidos de HCDR3/LCDR3 é estabelecido como SEQ ID NOs: 160/16.
[0026] A presente invenção também fornece anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno que se ligam especificamente à GP130, que compreendem um conjunto de seis CDRs (ou seja, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) contido em qualquer um dos anticorpos anti-GP130 exemplificativos listados na Tabela 1. Em determinadas modalidades, o conjunto de sequências de aminoácidos de HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1I-LCDR2-LCDR3 é selecionado do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 20-22-24-12-14-16, 28-30-32-12-14-16, 36-38-40-12-14-16, 44-46-48-12-14-16, 52-54-56-12-14-16, 60-62-64-12-14-16, 68-70-72-12-14-16, 76-78-80-12-14-16, 84-86-88-12-14-16, 92-94-96-12-14-16, 100-102-104-12-14-16, 108-110-112-12-14-16, — 116-118-120-12-14-16, — 124-126-128-12-14-16, 132-134-136-12-14-16, 140-142-144-12-14-16, / 148-150-152-12-14-16 e 156-158-160-12-14-16.
[0027] Em uma modalidade relacionada, a presente invenção fornece anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno que se ligam especificamente à GP130, que compreendem um conjunto de seis CDRs (ou seja, HCDRI-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) contido em um par de sequência de aminoácidos de HCVR/LCVR, conforme definido por qualquer um dos anticorpos anti-GP130 exemplificativos listados na Tabela 1. Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno que se ligam especificamente à GP130, que compreendem o conjunto de sequências de aminoácidos de HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 contido em um par de sequência de aminoácidos de HCVR/LCVR de: SEQ ID NOs: 154/10.
[0028] Métodos e técnicas para identificar CDRs nas sequências de aminoácidos de HCVR e LCVR são bem conhecidos na técnica e podem ser usados para identificar CDRs nas sequências de aminoácidos de HCVR e/ou LCVR especificadas divulgadas neste documento. Convenções exemplificativas que podem ser usadas para identificar os limites das CDRs incluem, por exemplo, a definição de Kabat, a definição de Chothia e a definição ABM. Em termos gerais, a definição de Kabat baseia-se na variabilidade da sequência, a definição de Chothia baseia-se na localização das regiões de alça estrutural e a definição ADM é um ajuste entre as abordagens de Kabat e Chothia. Ver, por exemplo, Kabat, “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997); e Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 86:9268-9272 (1989). Bancos de dados públicos também estão disponíveis para identificar sequências de CDR em um anticorpo.
[0029] A presente invenção também fornece moléculas de ácidos nucleicos que codificam anticorpos anti-GP130 ou porções destes. Por exemplo, a presente invenção fornece moléculas de ácidos nucleicos que codificam qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCVR listadas na Tabela 1; em determinadas modalidades, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência polinucleotídica selecionada dentre qualquer uma das sequências de ácidos nucleicos de HCVR listadas na Tabela 2, ou uma sequência substancialmente semelhante a esta com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[0030] A presente invenção fornece moléculas de ácidos nucleicos que codificam qualquer uma das sequências de aminoácidos de LCVR listadas na Tabela 1; em determinadas modalidades, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência polinucleotídica selecionada dentre qualquer uma das sequências de ácidos nucleicos de LCVR listadas na Tabela 2, ou uma sequência substancialmente semelhante a esta com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[0031] A presente invenção fornece moléculas de ácidos nucleicos que codificam qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCDRI1 listadas na Tabela 1; em determinadas modalidades, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência polinucleotídica selecionada dentre qualquer uma das sequências de ácidos nucleicos de HCDRI1 listadas na Tabela 2, ou uma sequência substancialmente semelhante a esta com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[0032] A presente invenção fornece moléculas de ácidos nucleicos que codificam qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCDR)2 listadas na Tabela 1; em determinadas modalidades, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência polinucleotídica selecionada dentre qualquer uma das sequências de ácidos nucleicos de HCDR)2 listadas na Tabela 2, ou uma sequência substancialmente semelhante a esta com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[0033] A presente invenção fornece moléculas de ácidos nucleicos que codificam qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCDR3 listadas na Tabela 1; em determinadas modalidades, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência polinucleotídica selecionada dentre qualquer uma das sequências de ácidos nucleicos de HCDR3 listadas na Tabela 2, ou uma sequência substancialmente semelhante a esta com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[0034] A presente invenção fornece moléculas de ácidos nucleicos que codificam qualquer uma das sequências de aminoácidos de LCDRI1 listadas na Tabela 1; em determinadas modalidades, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência polinucleotídica selecionada dentre qualquer uma das sequências de ácidos nucleicos de LCDRI1 listadas na Tabela 2, ou uma sequência substancialmente semelhante a esta com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[0035] A presente invenção fornece moléculas de ácidos nucleicos que codificam qualquer uma das sequências de aminoácidos de LCDR2 listadas na Tabela 1; em determinadas modalidades, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência polinucleotídica selecionada dentre qualquer uma das sequências de ácidos nucleicos de LCDR2 listadas na Tabela 2, ou uma sequência substancialmente semelhante a esta com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[0036] A presente invenção fornece moléculas de ácidos nucleicos que codificam qualquer uma das sequências de aminoácidos de LCDR3 listadas na Tabela 1; em determinadas modalidades, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência polinucleotídica selecionada dentre qualquer uma das sequências de ácidos nucleicos de LCDR3 listadas na Tabela 2, ou uma sequência substancialmente semelhante a esta com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[0037] A presente invenção também fornece moléculas de ácidos nucleicos que codificam uma HCVR, em que a HCVR compreende um conjunto de três CDRs (ou seja, MKCDR1-HCDR2-HCDR3), em que o conjunto de sequência de aminoácidos de HCDRI-HCDR2-HCDR3 é conforme definido por qualquer um dos anticorpos anti-GP130 exemplificativos listados na Tabela 1.
[0038] A presente invenção também fornece moléculas de ácidos nucleicos que codificam uma LCVR, em que a LCVR compreende um conjunto de três CDRs (ou seja, LCDRI-LCDR2-LCDR3), em que o conjunto de sequência de aminoácidos de LCDR1-LCDR2-LCDR3 é conforme definido por qualquer um dos anticorpos anti-GP130 exemplificativos listados na Tabela 1.
[0039] A presente invenção também fornece moléculas de ácidos nucleicos que codificam uma HCVR e uma LCVR, em que a HCVR compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das sequências de aminoácidos de HC VR listadas na Tabela 1 e em que a LCVR compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das sequências de aminoácidos de LCVR listadas na Tabela 1. Em certas modalidades, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência polinucleotídica selecionada de qualquer uma das sequências de ácido nucleico de HCVR listadas na Tabela 2, ou uma sequência substancialmente semelhante a esta com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência, e uma sequência polinucleotídica selecionada dentre qualquer uma das sequências de ácidos nucleicos de LCVR listadas na Tabela 2, ou uma sequência substancialmente semelhante a esta com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência. Em certas modalidades, de acordo com este aspecto da invenção, a molécula de ácido nucleico codifica uma HCVR e uma LCVR, em que a HCVR e a LCVR são ambas derivadas do mesmo anticorpo anti-GP130 listado na Tabela 1.
[0040] A presente invenção também fornece vetores de expressão recombinantes capazes de expressar um polipeptídeo que compreende uma região variável de cadeia pesada ou leve de um anticorpo anti-GP130. Por exemplo, a presente invenção inclui vetores de expressão recombinantes que compreendem qualquer uma das moléculas de ácidos nucleicos mencionadas acima, ou seja, moléculas de ácidos nucleicos que codificam qualquer uma das sequências de HCVR, LCVR e/ou CDR conforme estabelecido na Tabela 1. Também incluídos dentro do escopo da presente invenção são células hospedeiras em que tais vetores foram introduzidos, bem como métodos de produção de anticorpos ou porções deles por meio da cultura das células hospedeiras em condições que permitem a produção de anticorpos ou fragmentos de anticorpos, e recuperação dos anticorpos e fragmentos de anticorpos assim produzidos.
[0041] A presente invenção inclui anticorpos anti-GP130 com um padrão de glicosilação modificado. Em algumas modalidades, a modificação para remover sítios de glicosilação indesejáveis pode ser útil, ou um anticorpo sem uma fração de fucose presente na cadeia de oligossacarídeo, por exemplo, para aumentar a função de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) (ver Shield et al. (2002) JBC 277:26733). Em outras aplicações, a modificação de galactosilação pode ser feita para modificar a citotoxicidade dependente de complemento (CDC).
Proteína LEPR
[0042] A expressão “receptor de leptina”, “LEPR” e similares, conforme usada neste documento, refere-se ao receptor de leptina humano que compreende a sequência de aminoácidos como estabelecida na SEQ ID NO:186 (ver também UniProtKB/Swiss-Prot nº de Acesso P48357). Nomes alternativos para LEPR usados na literatura científica incluem “receptor OB”, “OB-R” e “CD295”. O LEPR também é referido como “WSX” (ver, por exemplo, Patente US No. 7.524.937). A expressão “LEPR” inclui ambas moléculas de LEPR monoméricas e multiméricas. Conforme usado neste documento, a expressão “LEPR humano monomérico” significa uma proteína LEPR ou porção desta que não contém ou possui quaisquer domínios de multimerização e que existe sob condições normais como uma molécula de LEPR única sem uma conexão física direta com outra molécula de LEPR. Uma molécula de LEPR monomérica exemplificativa é a molécula referida neste documento como “hLEPR.mmbh” que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:187 (ver, por exemplo, Exemplo 10, neste documento). Conforme usado neste documento, a expressão “LEPR humano dimérico” significa um construto que compreende duas moléculas de LEPR conectadas uma à outra através de um ligante, ligação covalente, ligação não covalente ou através de um domínio de multimerização, tal como um domínio Fc de anticorpo. Uma molécula de LEPR dimérica exemplificativa é a molécula referida neste documento como “hLEPR.hFc” que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:189 (ver, por exemplo, Exemplo 10, neste documento).
[0043] Todas as referências a proteínas, polipeptídeos e fragmentos de proteínas neste documento destinam-se a se referir à versão humana da respectiva proteína, polipeptídeo ou fragmento de proteína, a menos que explicitamente especificado como sendo de uma espécie não humana. Assim, a expressão “LEPR” significa LEPR humano, a menos que especificado como sendo de uma espécie não humana, por exemplo, “LEPR de camundongo”, “LEPR de macaco”, etc.
[0044] Como usado neste documento, a expressão “LEPR expresso na superfície celular” significa uma ou mais proteínas de LEPR, ou o seu domínio extracelular, que é/são expressa(s) na superfície de uma célula in vitro ou in vivo, de modo que pelo menos uma porção de uma proteína LEPR é exposta ao lado extracelular da membrana celular e é acessível a uma porção de ligação ao antígeno de um anticorpo. Uma “LEPR expressa na superfície celular” pode compreender ou consistir em uma proteína LEPR expressa na superfície de uma célula que normalmente expressa proteína LEPR. Alternativamente, “LEPR expressa na superfície celular” pode compreender ou consistir na proteína LEPR expressa na superfície de uma célula que normalmente não expressa LEPR humana em sua superfície, mas foi manipulada artificialmente para expressar LEPR em sua superfície.
[0045] Várias isoformas do LEPR são geradas através de splicing alternativo, resultando em uma isoforma b (LEPR-b) longa e várias formas curtas, incluindo isoforma a (LEPR-a) que mostra o padrão de expressão mais alto e mais amplo (Tartaglia LA. The leptin receptor. J Biol Chem 1997; 272: 6093-6096). LEPR-b é a isoforma predominante expressa no cérebro, enquanto LEPR-a é amplamente expresso no fígado. Todas as isoformas compartilham o mesmo domínio extracelular, região transmembrana e um curto estiramento do domínio citoplasmático, contendo a região da Box 1, seguida por uma região variável. A forma longa contém motivos de sequência intracelular necessários para mediar todas as capacidades de sinalização da leptina, enquanto que as formas curtas não possuem essas regiões. O domínio extracelular das formas curtas é idêntico à forma longa apta à sinalização.
MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICAS DE LEPR x GP130
[0046] A presente invenção baseia-se no conceito de estimulação da sinalização de LEPR e GP130 pela ligação de LEPR e GP130 na superfície de uma célula. Em particular, a presente invenção refere-se à premissa de que uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, tal como um anticorpo biespecífico LEPRXGP130 (conforme descrito em detalhes em outra parte neste documento), é capaz de estimular a sinalização dependente de LEPR de STAT3 ao levar GP130 em proximidade relativa do receptor de leptina na superfície das células, mesmo na ausência de leptina. Desta forma, as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da presente invenção podem servir como agonistas de LEPR que podem ser úteis em contextos terapêuticos onde a sinalização de leptina/LEPR induzida é benéfica e/ou desejável.
[0047] Nesse sentido, a presente invenção fornece moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que compreendem um primeiro domínio de ligação ao antígeno (também referido neste documento como “D1”) que se liga à GP130 humana e um segundo domínio de ligação ao antígeno (também referido neste documento como “D2”) que se liga ao LEPR humano. De acordo com a presente invenção, e conforme demonstrado nos exemplos de trabalho neste documento, a ligação simultânea ao LEPR e à GP130 pelas moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção resulta na estimulação da sinalização de LEPR.
[0048] As moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da presente invenção podem ser referidas neste documento como “anticorpos biespecíficos LEPRxGP130” ou outra terminologia relacionada.
[0049] Moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas LEPRXGP130 da presente invenção podem ser construídas usando os domínios de ligação ao antígeno derivados de anticorpos anti-LEPR monoespecíficos (convencionais) e anticorpos anti-GP130. Por exemplo, uma coleção de anticorpos monoclonais, monoespecíficos, anticLEPR e/ou anti-GP1I30 pode ser produzida usando métodos padrão conhecidos na técnica, e seus domínios de ligação ao antígeno podem ser usados para construir moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas LEPRXGP130 (por exemplo, anticorpos biespecíficos) usando técnicas convencionais conhecidas na técnica.
[0050] Anticorpos anti-LEPR exemplificativos que podem ser usados no contexto da presente invenção para produzir moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas LEPRXGP130 incluem qualquer um dos anticorpos anti-LEPR descritos na Publicação de Pedido de Patente US No. 2017/0101477, cuja divulgação é incorporada neste documento em sua totalidade. Anticorpos anti-LEPR que podem ser usados para construir as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas LEPRXGP130 da presente invenção podem ser anticorpos agonistas, ou seja, anticorpos que se ligam ao LEPR humano e ativam a sinalização de LEPR. Em outras modalidades, anticorpos anti-LEPR que podem ser usados para construir moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas LEPRxGP130 podem ser anticorpos potencializadores, ou seja, anticorpos que aumentam a sinalização mediada por leptina através de LEPR. Anticorpos anti-LEPR que são úteis para a construção de moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas LEPRXGP130 podem ser anticorpos que são capazes de se ligar ao LEPR em complexado com leptina. Tais anticorpos incluem aqueles que se ligam ao LEPR e não bloqueiam a interação LEPR:leptina. Alternativamente, anticorpos anti-LEPR que são úteis para a construção de moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas LEPRxXGP130 podem ser anticorpos que competem com leptina para ligação ao LEPR e/ou apenas se ligam ao LEPR na ausência de leptina. Exemplos não limitantes de anticorpos anti-LEPR específicos que podem ser usados para construir moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas LEPRxGP130 incluem os anticorpos anti-LEPR referidos neste documento como “mAb18445” e “mMAb18446”.
[0051] Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica LEPRXxGP130 é derivada de um anticorpo anti-LEPR que potencializa a sinalização mediada por leptina in vitro através da isoforma
LEPR-b.
[0052] Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica LEPRXGP130 é derivada de um anticorpo anti-LEPR que não ativa a sinalização mediada por leptina in vitro através da isoforma LEPR-a.
[0053] Os anticorpos anti-GP130 exemplares que podem ser usados no contexto da presente invenção para produzir moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas LEPRXGP130 incluem qualquer um dos anticorpos anti-GP130 descritos em outra parte neste documento. Anticorpos anti-GP130 que são úteis para a construção de moléculas de ligação ao antígeno Dbiespecíficas LEPRxGP130 incluem anticorpos anti-GP130 com uma ou mais das seguintes propriedades: se liga à GP130 de macaco, não se liga à GP130 de camundongo ou rato, se liga a um epítopo no domínio FNIII de GP130, não inibe a sinalização de GP130 mediada por ligante e/ou não ativa a sinalização de GP130 na ausência de um ligante GP130. Os ligantes de GP130 incluem, por exemplo, oncostatina M humana (OSM), fator inibitório de leucemia humano (LIF) e fator neurotrófico ciliar humano (CNTF). Um exemplo não limitativo de um anticorpo anti-GP130 específico que pode ser usado para construir moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas LEPRXGP130 inclui o anticorpo anti-GP130 referido neste documento como “mAb16683”.
[0054] De acordo com a presente invenção, uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica pode ser um polipeptídeo multifuncional único ou pode ser um complexo multimérico de dois ou mais polipeptídeos que são covalente ou não covalentemente associados um com o outro. Como será evidente pela presente divulgação, qualquer construto de ligação ao antígeno que tenha um domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente ao LEPR humano e um domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente à GP130 humana é considerado uma “molécula de ligação ao antígeno biespecífica”. Qualquer uma das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção ou suas variantes pode ser construída usando técnicas de biologia molecular padrão (por exemplo, tecnologia de DNA recombinante e de expressão de proteína), como será conhecido por uma pessoa versada na técnica.
[0055] As moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção podem ser “isoladas”. Uma “molécula de ligação ao antígeno biespecífica isolada”, conforme usado neste documento, significa uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que foi identificada e separada e/ou recuperada de pelo menos um componente de seu ambiente natural. Por exemplo, um anticorpo biespecífico que foi separado ou removido de pelo menos um componente de um organismo ou de um tecido ou célula em que o anticorpo é produzido é um “anticorpo biespecífico isolado” para fins da presente invenção. Uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica isolada também inclui moléculas in situ em uma célula recombinante. Moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas isoladas são moléculas que foram submetidas a pelo menos uma etapa de purificação ou isolamento. De acordo com certas modalidades, uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica isolada pode estar substancialmente livre de outros materiais celulares e/ou produtos químicos.
DOMÍNIOS DE LIGAÇÃO A ANTÍGENO
[0056] As moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da presente invenção compreendem dois domínios de ligação ao antígeno separados (D1 e D2). Conforme usado neste documento, a expressão “domínio de ligação ao antígeno” significa qualquer peptídeo, polipeptídeo, molécula de ácido nucleico, molécula de tipo andaime, molécula de exibição de peptídeo ou construto contendo polipeptídeo que seja capaz de se ligar especificamente a um antígeno de interesse específico (por exemplo, LEPR humano ou GP130 humana). O termo “se liga especificamente” ou similares, conforme usado neste documento em referência a um domínio de ligação ao antígeno, significa que o domínio de ligação ao antígeno é capaz de formar um complexo com um antígeno específico e não se liga a outros antígenos não relacionados sob condições de teste comuns. “Antígenos não relacionados” são proteínas, peptídeos ou polipeptídeos que têm menos de 95% de identidade de aminoácidos entre si.
[0057] Categorias exemplificativas de domínios de ligação ao antígeno que podem ser usadas no contexto da presente invenção incluem anticorpos, porções de anticorpos de ligação ao antígeno, peptídeos que interagem especificamente com um antígeno específico (por exemplo, pepticorpos), moléculas receptoras que interagem especificamente com um antígeno específico, proteínas compreendendo uma porção de ligação a ligante de um receptor que se liga especificamente a um antígeno específico, estruturas em andaime de ligação ao antígeno (por exemplo, DARPins, proteínas de repetição HEAT, proteínas de repetição ARM, proteínas de repetição de tetratricopeptídeo, e outras estruturas em andaime com base em proteínas de repetição de ocorrência natural, etc. [ver, por exemplo, Boersma e Pluckthun, 2011, Curr. Opin. Biotechnol. 22:849-857 e referências citadas ali]), e seus aptâmeros ou porções.
[0058] Métodos para determinar se duas moléculas se ligam especificamente entre si são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, diálise de equilíbrio, ressonância plasmônica de superfície, e similares. O termo “ressonância plasmônica de superfície”, conforme usado neste documento, refere-se a um fenômeno óptico que permite a análise de interações em tempo real pela detecção de alterações em concentrações de proteína em uma matriz de biossensor, por exemplo, usando o sistema BIAcore"M (Biacore Life Sciences division of GE Healthcare, Piscataway, NJ).
[0059] Conforme indicado acima, um “domínio de ligação ao antígeno” (DI e/ou D2) pode compreender ou consistir em um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo. O termo “anticorpo”, conforme usado neste documento, significa qualquer molécula de ligação ao antígeno ou complexo molecular que compreende pelo menos uma região determinante de complementariedade (CDR) que se liga especificamente ou que interage com um antígeno específico (por exemplo, MET humano). O termo “anticorpo” inclui moléculas de imunoglobulina que compreendem quatro cadeias polipeptídicas, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadas por ligações dissulfeto, bem como seus multímeros (por exemplo, IGM). Cada cadeia pesada compreende uma região variável da cadeia pesada (abreviada neste documento como HCVR ou Vym) e uma região constante da cadeia pesada. À região constante de cadeia pesada compreende três domínios, Cul, Cn2 e Cn3. Cada cadeia leve compreende uma região variável da cadeia leve (abreviada neste documento como LCVR ou Vr1) e uma região constante da cadeia leve. A região constante de cadeia leve compreende um domínio (Cr1). As regiões Vu e Vr podem ser ainda subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes de complementariedade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões de framework (FR). Cada Vu e VL é composta por três CDRs e quatro FRs, dispostas a partir do terminal amino para o terminal carbóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Em diferentes modalidades da invenção, as FRs dos anticorpos da invenção (ou sua porção de ligação a antígeno) podem ser idênticas às sequências de linhagem germinativa humana, ou podem ser natural ou artificialmente modificadas. Uma sequência consenso de aminoácidos pode ser definida com base em uma análise lado-a-lado de duas ou mais CDRs.
[0060] Os componentes DI e/ou D2 das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da presente invenção podem compreender ou consistir em fragmentos de ligação ao antígeno de moléculas de anticorpo inteiras. Os termos “porção de ligação a antígeno” de um anticorpo, “fragmento de ligação a antígeno” de um anticorpo, e similares, conforme usado neste documento, incluem qualquer polipeptídeo ou glicoproteína de ocorrência natural, enzimaticamente obtenível, sintética ou geneticamente manipulada que se liga especificamente a um antígeno para formar um complexo. Fragmentos de ligação ao antígeno de um anticorpo podem ser derivados, por exemplo, de moléculas de anticorpo inteiras usando quaisquer técnicas padrão adequadas, tais como digestão proteolítica ou técnicas de manipulação genética recombinante que envolvem a manipulação e expressão de DNA que codifica domínios variáveis e opcionalmente constantes de anticorpo. Tal DNA é conhecido e/ou está facilmente disponível por, por exemplo, fontes comerciais, bibliotecas de DNA (incluindo, por exemplo, bibliotecas de fago-anticorpo) ou pode ser sintetizado. O DNA pode ser sequenciado e manipulado quimicamente ou por usado de técnicas de biologia molecular, por exemplo, para dispor um ou mais domínios variáveis e/ou constantes em uma configuração adequada, ou para introduzir códons, criar resíduos de cisteína, modificar, adicionar ou deletar aminoácidos, etc.
[0061] Exemplos não limitantes de fragmentos de ligação ao antígeno incluem: (1) fragmentos Fab; (1i) fragmentos F(ab')2; (11i) fragmentos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas Fv de cadeia única (scFv); (vi) fragmentos dAb; e (vil) unidades de reconhecimento mínimo consistindo nos resíduos de aminoácido que mimetizam a região hipervariável de um anticorpo (por exemplo, uma região determinante de complementariedade (CDR) isolada, tal como um peptídeo de CDR3) ou um peptídeo de FR3-CDR3-FR4 restrito. Outras moléculas manipuladas, tais como anticorpos específicos de domínio, anticorpos de domínio único, anticorpos de domínio deletado, anticorpos quiméricos, anticorpos enxertados com CDR, diacorpos, triacorpos, tetracorpos, minicorpos, nanocorpos (por exemplo, nanocorpos monovalentes, nanocorpos Dbivalentes, etc.), imunofarmacêuticos modulares pequenos (SMIPs) e domínios variáveis de IZNAR de tubarão, também são abrangidas dentro da expressão “fragmento de ligação ao antígeno”, conforme usada neste documento.
[0062] Um fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo normalmente compreenderá pelo menos um domínio variável. O domínio variável pode ser de qualquer tamanho ou composição de aminoácidos e compreenderá geralmente pelo menos uma CDR que seja adjacente a ou “in frame” com uma ou mais sequências de framework. Nos fragmentos de ligação ao antígeno com um domínio Vu associado a um domínio V,, os domínios Vy e Vr podem ser situados em relação um ao outro em qualquer disposição adequada. Por exemplo, a região variável pode ser dimérica e conter os dímeros Vu-Vn, Vu-VL ou Vr-VL. Alternativamente, o fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo pode conter um domínio monomérico Vu ou Vr.
[0063] Em certas modalidades, um fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo pode conter pelo menos um domínio varável ligado covalentemente a pelo menos um domínio constante. Configurações exemplificativas não limitantes de domínios variáveis e constantes que podem ser encontradas em um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo da presente invenção incluem: (1) Vu-Cul; (1) Vi-Cn2; (1) Vn-Cn3; (iv) Vu-Cul-Cn2; (v) Vu-Cnl-Cn2-Cn3; (vi) Vn-Cn2-Cn3; (vil) Vi-Cr; (vii) VL-Cul; (ix) VI-Cn2; (x) V1I-Cn3; (xi) V1I-Cn1-Cn2; (xi) V1I-Cun1-Cu2-Chn3; (xiii) V1-Cn2-Chn3; e (xiv) VI-Cr. Em qualquer configuração de domínios variáveis e constantes, incluindo qualquer uma das configurações exemplares listadas acima, os domínios variáveis e constantes podem ser ligados diretamente um ao outro ou podem ser ligados por uma região de dobradiça ou de ligante inteira ou parcial. Uma região de dobradiça pode consistir em pelo menos 2 (por exemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 ou mais) aminoácidos que resultam em uma ligação flexível ou semi-flexível entre domínios variáveis e/ou constantes adjacentes em uma única molécula de polipeptídeo. Além disso, um fragmento de ligação ao antígeno pode compreender um homodímero ou heterodímero (ou outro multímero) de qualquer uma das configurações de domínio variável e constante listadas acima em associação não covalente entre si e/ou com um ou mais domínios Vg ou Vi monoméricos (por exemplo, por ligação(Õões) dissulfeto).
[0064] As moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da presente invenção podem compreender ou consistir em anticorpos humanos e/ou anticorpos humanos recombinantes ou fragmentos destes. O termo “anticorpo humano”, conforme usado neste documento, inclui anticorpos que têm regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana. Anticorpos humanos, no entanto, podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados por sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa humanas (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou sítio-específica in vitro ou por mutação somática in vivo), por exemplo, nas CDRs e, especificamente, na CDR3. No entanto, o termo “anticorpo humano”, conforme usado neste documento, não se destina a incluir anticorpos nos quais sequências de CDR derivadas da linhagem germinativa de outras espécies de mamíferos, tais como camundongo, foram enxertadas em sequências de framework humanas.
[0065] As moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da presente invenção podem compreender ou consistir em anticorpos humanos recombinantes ou em seus fragmentos de ligação ao antígeno. O termo “anticorpo humano recombinante”, conforme usado neste documento, destina-se a incluir todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como anticorpos expressos usando um vetor de expressão recombinante transfectado em uma célula hospedeira (descrito mais abaixo), anticorpos isolados de uma biblioteca de anticorpo humano combinatória recombinante (descrito mais abaixo), anticorpos isolados de um animal (por exemplo, camundongo) que seja transgênico para genes de imunoglobulina humana (vide, por exemplo, Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295) ou anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por quaisquer outros meios que envolvam splicing de sequências de gene de imunoglobulina humana em outras sequências de DNA. Esses anticorpos humanos recombinantes têm regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana. Em certas modalidades, no entanto, tais anticorpos humanos recombinantes são submetidos a mutagênese in vitro (ou, quando um animal transgênico para sequências de Ig humana é usado, mutagênese somática in vivo) e, assim, as sequências de aminoácidos das regiões Vu e VL dos anticorpos recombinantes são sequências que, embora derivadas de e relacionadas às sequências Vu e V” de linhagem germinativa humana, podem não existir naturalmente dentro do repertório da linhagem germinativa de anticorpo humano in vivo.
[0066] Métodos para produção de anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica e podem ser usados para construir moléculas de ligação biespecíficas da presente invenção. Formatos biespecíficos exemplificativos que podem ser usados no contexto da presente invenção incluem, sem limitação, por exemplo, formatos com base em scFv ou biespecíficos de diacorpo, fusões de IgG-scFv, (DVD)-Ig de domínio variável duplo, Quadroma, “knobs-into-holes”, cadeia leve comum (por exemplo, cadeia leve comum com “knobs-into-holes”, etc.), CrossMab, CrossFab, (SEED)body, zíper de leucina, Duobody, IZG1/IgG2, Fab (DAF)-IgG de ação dupla, e formatos biespecíficos Mab? (ver, por exemplo, Klein et al. 2012, mAbs 4:6, 1-11, e referências citadas nele, para uma revisão dos formatos descritos anteriormente).
[0067] Os domínios de ligação ao antígeno exemplificativos (D1 e D2) que podem ser incluídos nas moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas LEPRxGP130 da presente invenção incluem domínios de ligação ao antígeno derivados de qualquer um dos anticorpos anti-LEPR e/ou anti-GP130 divulgados neste documento ou de outra forma conhecidos na técnica.
[0068] Por exemplo, a presente invenção inclui moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas LEPRXGP130 compreendendo um domínio de ligação ao antígeno D1 (de ligação à GP130) compreendendo uma HCVR compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada dentre qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCVR listadas na Tabela 1 ou uma sequência substancialmente semelhante a esta com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[0069] A presente invenção também fornece moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas LEPRXGP130 compreendendo um domínio de ligação ao antígeno DI (de ligação à GP130) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada dentre qualquer uma das sequências de aminoácidos de LCVR listadas na Tabela 1 ou uma sequência substancialmente semelhante a esta com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[0070] A presente invenção também fornece moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas LEPRXGP130 compreendendo um domínio de ligação ao antígeno D1 (de ligação à GP130) compreendendo um par de sequências de aminoácidos de HCVR e de LCVR (HCVR/LCVR) compreendendo qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCVR listadas na Tabela 1 pareadas com qualquer uma das sequências de aminoácidos de LCVR listadas na Tabela
1. De acordo com certas modalidades, a presente invenção fornece moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas LEPRXGP130 compreendendo um domínio de ligação ao antígeno D1 (de ligação à GP130) compreendendo um par de sequências de aminoácidos de HCVR/LCVR contido dentro de qualquer um dos anticorpos anti-MET exemplificativos listados na Tabela 1.
[0071] A presente invenção fornece também moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas LEPRXGP130 compreendendo um domínio de ligação ao antígeno D1 (de ligação à GP130) compreendendo uma CDR1 de cadeia pesada (HCDR1) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCDRI1 listadas na Tabela 1 ou uma sequência substancialmente semelhante a esta com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[0072] A presente invenção fornece também moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas LEPRXGP130 compreendendo um domínio de ligação ao antígeno D1 (de ligação à GP130) compreendendo uma CDR2 de cadeia pesada (HCDR2) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCDR?2 listadas na Tabela 1 ou uma sequência substancialmente semelhante a esta com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[0073] A presente invenção fornece também moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas LEPRXGP130 compreendendo um domínio de ligação ao antígeno DI (de ligação à GP130) compreendendo uma CDR3 de cadeia pesada (HCDR3) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCDR3 listadas na Tabela 1 ou uma sequência substancialmente semelhante a esta com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[0074] A presente invenção fornece também moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas LEPRXGP130 compreendendo um domínio de ligação ao antígeno D1 (de ligação à GP130) compreendendo uma CDRI1 de cadeia leve (LCDR1) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre qualquer uma das sequências de aminoácidos de LCDRI1 listadas na Tabela 1 ou uma sequência substancialmente semelhante a esta com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[0075] A presente invenção fornece também moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas LEPRXGP130 compreendendo um domínio de ligação ao antígeno D1 (de ligação à GP130) compreendendo uma CDR2 de cadeia leve (LCDR2) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre qualquer uma das sequências de aminoácidos de LCDR2 listadas na Tabela 1 ou uma sequência substancialmente semelhante a esta com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[0076] A presente invenção fornece também moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas LEPRXGP130 compreendendo um domínio de ligação ao antígeno D1 (de ligação à GP130) compreendendo uma CDR3 de cadeia leve (LCDR3) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre qualquer uma das sequências de aminoácidos de LCDR3 listadas na Tabela 1 ou uma sequência substancialmente semelhante a esta com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[0077] A presente invenção fornece moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas LEPRXxGP130 compreendendo um domínio de ligação ao antígeno D1 (de ligação à GP130) compreendendo um par de sequências de aminoácidos de HCDR3 e de LCDR3 (HCDR3/LCDR3) compreendendo qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCDR3 listadas na Tabela 1 pareadas com qualquer uma das sequências de aminoácidos de LCDR3 listadas na Tabela 1. De acordo com certas modalidades, a presente invenção fornece anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, compreendendo um par de sequências de aminoácidos de HCDR3/LCDR;3 contido dentro de qualquer um dos anticorpos anti-MET exemplificativos listados na Tabela 1.
[0078] A presente invenção também fornece moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas LEPRXGP130 compreendendo um domínio de ligação ao antígeno DI (de ligação à GP130) compreendendo um conjunto de seis CDRs (ou seja, HCDRI-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) contido em qualquer um dos anticorpos anti-MET exemplificativos listados na Tabela
L
[0079] Em uma modalidade relacionada, a presente invenção fornece moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas LEPRXGP130 compreendendo um domínio de ligação ao antígeno D1 (de ligação à GP130) compreendendo um conjunto de seis CDRs (ou seja, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) contido em um par de sequências de aminoácidos de HCVR/LCVR, conforme definido por qualquer um dos anticorpos anti-MET exemplificativos listados na Tabela 1.
[0080] A presente invenção inclui moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas LEPRXxGP130 compreendendo um domínio de ligação ao antígeno D2 (de ligação ao LEPR) compreendendo um domínio variável (HCVR e/ou LCVR) e/ou região determinante de complementariedade (HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e/ou LCDR3), derivados de qualquer um dos anticorpos anti-LEPR descritos neste documento, descritos na Publicação de Pedido de Patente US No 2017/0101477, cuja divulgação é incorporada neste documento em sua totalidade ou de outra forma conhecida na técnica.
[0081] Como exemplos ilustrativos não limitantes, a presente invenção inclui moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas LEPRxGP130 compreendendo um domínio de ligação ao antígeno D1 (de ligação à GP130) e um domínio de ligação ao antígeno D2 (de ligação ao LEPR), em que o domínio de ligação ao antígeno DI compreende um par de sequências de aminoácidos de HCVR/LCVR de SEQ ID NOs: 154/10 ou um conjunto de CDRs de cadeia pesada e leve (HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) compreendendo as SEQ ID NOs: 156-158-160-12-14-16 e em que o domínio de ligação ao antígeno D2 (de ligação ao LEPR) compreende um par de sequências de aminoácidos de HCVR/LCVR das SEQ ID NOs: 170/10 ou 178/10, ou um conjunto de CDRs de cadeia pesada e leve (HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) compreendendo as SEQ ID NOs: 172-174-176-12-14-16 ou
180-182-184-12-14-16"" Um — anticorpo — biespecífico — LEPRxGP130 exemplificativo possuindo essas características de sequência é o anticorpo biespecífico escolhido bsAb21236, que compreende um DI1 derivado de mADb16683 e um D2 derivado de mAb18445. Outro anticorpo biespecífico LEPRxGP130 exemplificativo possuindo essas características de sequência é o anticorpo biespecífico escolhido bs Ab21237, que compreende um D1 derivado de mAb16683 e um D2 derivado de mAb 18446. Outros exemplos específicos de anticorpos biespecíficos da presente invenção são apresentados no Exemplo 9, Tabela 20 neste documento.
COMPONENTES DE MULTIMERIZAÇÃO
[0082] As moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da presente invenção, em certas modalidades, também podem compreender um ou mais componentes de multimerização. Os componentes de multimerização podem funcionar para manter a associação entre os domínios de ligação a antígeno (D1 e D2) Conforme usado neste documento, um “componente de multimerização” é qualquer macromolécula, proteína, polipeptídeo, peptídeo ou aminoácido que tenha a capacidade de se associar a um segundo componente de multimerização de estrutura ou constituição igual ou semelhante. Por exemplo, um componente de multimerização pode ser um polipeptídeo compreendendo um domínio Ch3 de imunoglobulina. Um exemplo não limitante de um componente de multimerização é uma porção Fc de uma imunoglobulina, por exemplo, um domínio Fc de uma IgG selecionada dentre os isotipos IZG1, IgG2, IgG3 e IgG4, bem como qualquer alotipo dentro de cada grupo de isotipo. Em certas modalidades, o componente de multimerização é um fragmento Fc ou uma sequência de aminoácidos de 1 a cerca de 200 aminoácidos de comprimento contendo pelo menos um resíduo de cisteína. Em outras modalidades, o componente de multimerização é um resíduo de cisteína, ou um peptídeo curto contendo cisteína. Outros domínios de multimerização incluem peptídeos ou polipeptídeos que compreendem ou consistem em um zíper de leucina, um motivo hélice-alça, ou um motivo em super-hélice.
[0083] Em certas modalidades, as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da presente invenção compreendem dois domínios de multimerização, M1 e M2, em que D1 está ligado a M1 e D2 está ligado a M2, e em que a associação de M1 com M2 facilita a ligação física de DI e D2 entre si em uma única molécula de ligação ao antígeno biespecífica. Em certas modalidades, M1 e M2 são idênticas entre si. Por exemplo, M1 pode ser um domínio Fc tendo uma sequência de aminoácidos específica, e M2 é um domínio Fc com a mesma sequência de aminoácidos que MI. Alternativamente, M1 e M2 podem diferir entre si em uma ou mais posições de aminoácido. Por exemplo,M1 pode compreender um primeiro domínio Cu3 de imunoglobulina (Ig) e M2 pode compreender um segundo domínio Cn3 de Ig, em que o primeiro e o segundo domínios Cn3 de Ig diferem entre si em pelo menos um aminoácido, e em que pelo menos a diferença de um aminoácido reduz a ligação do construto de direcionamento à Proteína A em comparação a um construto de referência tendo sequências de M1 e M2 idênticas. Em uma modalidade, o domínio Ch3 de Ig de M1 se liga à Proteína A e o domínio Chu3 de Ig de M2 contém uma mutação que reduz ou anula a ligação da Proteína A, tal como uma modificação H95R (pela numeração de éxon do IMGT; H435R pela numeração da UE). O Cn3 de M2 pode compreender ainda uma modificação Y96F (pelo IMGT; Y436F pela UE). Outras modificações que podem ser encontradas dentro do Ch3 de M2 incluem: DI6E, LI8M, N44S, K52N, V57M, e V821I (por IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M, e V4221I por UE) no caso de um domínio Fc de IgG1; N44S, K52N, e V821I (IMGT; N384S, K392N, e V4221I por UE) no caso de um domínio Fc de IgG2; e QISR, N44S, K52N, VS7M, R69K, E79Q, e V821I (por IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q, e V4221I por UE) no caso de um domínio Fc de IgG4.
VARIANTES
[0084] As moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas divulgadas neste documento ou seus domínios de ligação ao antígeno (D1 e/ou D2) podem compreender uma ou mais substituições, inserções e/ou deleções de aminoácido no framework e/ou regiões CDR dos domínios variáveis de cadeia pesada e leve em comparação com as sequências de linhagem germinativa correspondentes a partir das quais as proteínas de ligação ao antígeno ou domínios de ligação ao antígeno foram derivados. Tais mutações podem ser facilmente atribuídas comparando as sequências de aminoácidos divulgadas neste documento a sequências de linhagem germinativa disponíveis em, por exemplo, bancos de dados de sequência de anticorpos públicos. A presente invenção inclui moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas divulgadas neste documento ou seus domínios de ligação ao antígeno (DI e/ou D2), que são derivados de qualquer uma das sequências de aminoácidos divulgadas neste documento, em que um ou mais aminoácidos dentro de uma ou mais regiões de framework e/ou CDR são transformadas no(s) resíduo(s) correspondente(s) da sequência de linhagem germinativa da qual o anticorpo foi derivado ou no(s) resíduo(s) correspondente(s) de outra sequência de linhagem germinativa humana ou em uma substituição conservativa de aminoácidos do(s) resíduo(s) de linhagem germinativa correspondente(s) (tais mudanças na sequência são referidas coletivamente neste documento como “mutações na linhagem germinativa”). Uma pessoa versada na técnica, começando com as sequências de região variável de cadeia pesada e leve divulgadas neste documento, pode facilmente produzir inúmeras moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas ou seus domínios de ligação ao antígeno (D1 e/ou D2), que compreendem uma ou mais mutações na linhagem germinativa individuais ou combinações destas. Em certas modalidades, todos os resíduos de framework e/ou de CDR dentro dos domínios Vu e/ou VL são transformados de volta em resíduos encontrados na sequência de linhagem germinativa original a partir da qual o anticorpo foi derivado. Em outras modalidades, apenas determinados resíduos são transformados de volta na sequência de linhagem germinativa original, por exemplo, apenas os resíduos transformados encontrados dentro dos primeiros 8 aminoácidos de FR1 ou dentro dos últimos 8 aminoácidos de FRA4, ou apenas os resíduos transformados encontrados dentro na CDR1, CDR2 ou CDR3. Em outras modalidades, um ou mais dentre os resíduos de framework e/ou de CDR são transformados no(s) resíduo(s) correspondente(s) de uma sequência de linhagem germinativa diferente (isto é, uma sequência de linhagem germinativa que é diferente da sequência de linhagem germinativa a partir da qual o anticorpo foi originalmente derivado). Além disso, as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas ou seus domínios de ligação ao antígeno (D1 e/ou/ D2) da presente invenção podem conter qualquer combinação de duas ou mais mutações na linhagem germinativa dentro das regiões de framework e/ou regiões CDR, por exemplo, em que certos resíduos individuais são transformados no resíduo correspondente de uma sequência germinativa específica enquanto certos outros resíduos que diferem da sequência de linhagem germinativa original são mantidos ou são transformados no resíduo correspondente de uma sequência de linhagem germinativa diferente. Uma vez obtidas, moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas ou seus domínios de ligação ao antígeno (D1 e/ou D2) que contêm uma ou mais mutações de linhagem germinativa podem ser facilmente testadas para uma ou mais propriedades desejadas, tais como, especificidade de ligação melhorada, maior afinidade de ligação, propriedades biológicas antagonistas ou agonistas (dependendo do caso) melhoradas ou aprimoradas, imunogenicidade reduzida, etc. moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas ou seus domínios de ligação ao antígeno (D1 e/ou D2) obtidos dessa forma geral são englobados na presente invenção.
[0085] A presente invenção inclui também anticorpos anti-LEPR, anticorpos anti-GP130 e moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas compreendendo variantes de qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCVR, LCVR e/ou CDR divulgadas neste documento. As variantes exemplificativas incluídas neste aspecto da invenção incluem variantes de qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCVR, LCVR e/ou CDR divulgadas neste documento possuindo uma ou mais substituições conservativas. Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos anti-LEPR, anticorpos anti-GP130 e moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas LEPRxGP130 com sequências de aminoácidos de HCVR, LCVR e/ou CDR com, por exemplo, 10 ou menos, 8 ou menos, 6 ou menos, 4 ou menos, etc. substituições de aminoácidos conservativas em comparação com qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCVR, LCVR e/ou CDR apresentadas neste documento.
[0086] As variantes exemplificativas incluídas neste aspecto da invenção também incluem variantes com substancial identidade de sequência com qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCVR, LCVR e/ou CDR divulgadas neste documento. Conforme usado neste documento no contexto de sequências de aminoácidos, o termo “identidade substancial” ou “substancialmente idêntico” significa que duas sequências de aminoácidos, quando alinhadas de forma ideal, tais como pelos programas GAP ou BESTFIT usando pesos de lacuna padrão, compartilham pelo menos 95%, 98% ou 99% de identidade de sequência. Em certas modalidades, posições de resíduo que não são idênticas diferem por substituições de aminoácidos conservativas. Uma “substituição de aminoácido conservativa” é uma em que um resíduo de aminoácido é substituído por outro resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral (grupo R) com propriedades químicas semelhantes (por exemplo, carga ou hidrofobicidade). Em geral, uma substituição de aminoácido conservativa não vai mudar substancialmente as propriedades funcionais de uma proteína. Nos casos em que duas ou mais sequências de aminoácidos diferem umas das outras por substituições conservativas, a identidade de sequência percentual ou grau de similaridade pode ser ajustado para cima para corrigir a natureza conservativa da substituição. Os meios para realizar esse ajuste são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Ver, por exemplo, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331, que é incorporado neste documento por referência. Exemplos de grupos de aminoácidos com cadeias laterais com propriedades químicas semelhantes incluem (1) cadeias laterais alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; (2) cadeias laterais alifáticas de hidroxila: serina e treonina; (3) cadeias laterais contendo amida: asparagina e glutamina; (4) cadeias laterais aromáticas: fenilalanina, tirosina e triptofano; (5) cadeias laterais básicas: lisina, arginina e histidina; (6) cadeias laterais acídicas: aspartato e glutamato; e (7) cadeias laterais contendo enxofre são cisteína e metionina. Grupos de substituição de aminoácidos conservativa preferíveis são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato e asparagina-glutamina. Alternativamente, uma substituição conservadora é qualquer mudança tendo um valor positivo na matriz de probabilidade de log PAM250 divulgada em Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-1445, incorporado neste documento por referência. Uma substituição “moderadamente conservadora” é qualquer alteração que tenha um valor não negativo na matriz de probabilidade de log PAM250.
[0087] A identidade de sequência entre duas sequências de aminoácidos diferentes é tipicamente medida usando software de análise de sequência. O software de análise de sequência pareia sequências semelhantes usando medidas de similaridade atribuídas a várias substituições, deleções e outras modificações, incluindo substituições conservativas de aminoácidos. Por exemplo, o software GCG contém programas como Gap e Bestfit que podem ser usados com parâmetros padrão para determinar a homologia de sequência ou identidade de sequência entre polipeptídeos estreitamente relacionados, tais como polipeptídeos homólogos de espécies diferentes de organismos ou entre uma proteína de tipo selvagem e uma muteína desta. Ver,
por exemplo, GCG Versão 6.1. Sequências de polipeptídeos também podem ser comparadas usando FASTA com parâmetros padrão ou recomendados; um programa em GCG Versão 6.1. FASTA (por exemplo, FASTA2 e FASTA3) fornece alinhamentos e identidade de sequência percentual das regiões da melhor sobreposição entre as sequências de pesquisa e busca (Pearson (2000) supra). Outro algoritmo preferível ao se comparar uma sequência da invenção a um banco de dados contendo um grande número de sequências de organismos diferentes é o programa de computador BLAST, especialmente BLASTP ou TBLASTN, usando parâmetros padrão. Ver, por exemplo, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 e Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402, cada um sendo incorporado neste documento por referência. Moléculas de Ligação ao Antígeno Biespecíficas LEPRxGP130 Compreendendo Variantes Fc
[0088] De acordo com certas modalidades da presente invenção, são fornecidas proteínas de ligação ao antígeno biespecíficas LEPRxGP130 compreendendo um domínio Fc compreendendo uma ou mais mutações que aprimoram ou enfraquecem a ligação do anticorpo ao receptor FcRn, por exemplo, em pH ácido em comparação com pH neutro. Por exemplo, a presente invenção inclui proteínas de ligação ao antígeno biespecíficas LEPRXGP130 compreendendo uma mutação na região Ch2 ou Ch3 do domínio Fc, em que a(s) mutação(ões) aumenta(m) a afinidade do domínio Fc para FcRn em um ambiente ácido (por exemplo, em um endossoma onde o pH varia de cerca de 5,5 a cerca de 6,0). Essas mutações podem resultar em um aumento na meia-vida sérica do anticorpo quando administradas a um animal. Exemplos não limitantes de tais modificações Fc incluem, por exemplo, uma modificação na posição 250 (por exemplo, E ou Q); 250 e 428 (por exemplo, L ou F); 252 (por exemplo, L/Y/F/W ou T), 254 (por exemplo, S ou T) e 256 (por exemplo, S/R/Q/E/D ou T); ou uma modificação na posição 428 e/ou 433 (por exemplo, H/L/R/S/P/Q ou K) e/ou 434 (por exemplo, H/F ou Y); ou uma modificação na posição 250 e/ou 428; ou uma modificação na posição 307 ou 308 (por exemplo, 308F, V308F) e 434. Em uma modalidade, a modificação compreende uma modificação em 428L (por exemplo, M428L) e 434S (por exemplo, N434S); uma modificação em 428L, 2591 (por exemplo, V2591) e 308F (por exemplo, V308F); uma modificação em 433K (por exemplo, H433K) e 434 (por exemplo, 434Y); uma modificação em 252, 254, e 256 (por exemplo, 252Y, 254T e 256E); uma modificação em 250Q e 428L (por exemplo, T250Q e M428L); e uma modificação em 307 e/ou 308 (por exemplo, 308F ou 308P).
[0089] Por exemplo, a presente invenção inclui proteínas de ligação ao antígeno biespecíficas LEPRXxGP130 compreendendo um domínio Fc compreendendo um ou mais pares ou grupos de mutações selecionados do grupo que consiste em: 250Q e 248L (por exemplo, T250Q e M248L); 252Y, 254T e 256E (por exemplo, M252Y, S254T e T256E); 428L e 434S (por exemplo, M428L e N434S); e 433K e 434F (por exemplo.H433K e N434F). Todas as combinações possíveis das mutações de domínio Fc precedentes e outras mutações dentro dos domínios variáveis de anticorpo divulgados neste documento são contempladas dentro do escopo da presente invenção. Características Biológicas das Moléculas de Ligação ao Antígeno LEPRxGP130 da Invenção
[0090] A presente invenção inclui moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas LEPRXGP130 que se ligam ao LEPR humano com alta afinidade. Por exemplo, a presente invenção inclui moléculas de ligação ao antígeno LEPRxGP130 que se ligam ao LEPR humano monomérico (por exemplo, hLEPR.mmbh) com uma Kp de menos de cerca de 110 nM, conforme medido pela ressonância plasmônica de superfície a 25ºC, por exemplo, usando um formato de ensaio conforme definido no Exemplo 10 neste documento ou um ensaio substancialmente semelhante. De acordo com certas modalidades, moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas LEPRXxGP130 são fornecidas que se ligam ao LEPR humano monomérico (por exemplo, hnLEPR.mmbh) com uma meia-vida dissociativa (12) superior a cerca de 3 minutos, conforme medido pela ressonância plasmônica de superfície a 25ºC, por exemplo, usando um formato de ensaio conforme definido no Exemplo 10 neste documento ou um ensaio substancialmente semelhante.
[0091] A presente invenção inclui moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas LEPRXGP130 que se ligam à GP130 humana com alta afinidade. Por exemplo, a presente invenção inclui moléculas de ligação ao antígeno LEPRxGP130 que se ligam à GP130 monomérica humana (por exemplo, hGP130.mmbh) com uma Kp de menos de cerca de 150 nM conforme medido pela ressonância plasmônica de superfície a 25ºC, por exemplo, usando um formato de ensaio conforme definido no Exemplo 10 neste documento ou um ensaio substancialmente semelhante. De acordo com certas modalidades, são fornecidas moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas LEPRXxGP130 que se ligam à GP130 monomérica humana (por exemplo, hGP130.mmbh) com uma meia-vida dissociativa (t12) superior a cerca de 2,5 minutos conforme medido pela ressonância plasmônica de superfície a 25ºC, por exemplo, usando um formato de ensaio conforme definido no Exemplo 10 neste documento ou um ensaio substancialmente semelhante.
[0092] A presente invenção inclui moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas LEPRXGP130 que são capazes de se ligar a células que expressam LEPR humano. Em alguns aspectos, as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas LEPRXGP130 são capazes de se ligar a células que expressam LEPR humano, isoforma b. Em determinadas modalidades, proteínas de ligação ao antígeno biespecíficas LEPRXxGP130 são fornecidas que se ligam a células que expressam LEPR humano na presença e/ou ausência de leptina. A presente invenção inclui moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas LEPRXGP130 que são capazes de se ligar a células que expressam GP130 humana. A ligação celular por uma molécula de ligação ao
40 /102 antígeno biespecífica da presente invenção pode ser avaliada por separação celular ativada por fluorescência (FACS) em células que expressam LEPR e/ou GP130, por exemplo, usando um formato de ensaio conforme definido no Exemplo 11 neste documento ou um ensaio substancialmente semelhante.
[0093] A presente invenção inclui moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas LEPRXGP130 que ativam a sinalização celular mediada por GP130. Em determinadas modalidades, a presente invenção inclui moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas LEPRXxGP130 que ativam a sinalização celular mediada por GP130 com uma potência que é pelo menos 20% do grau de ativação observado pelo tratamento com um ligante de GP130. Por exemplo, a presente invenção inclui moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas LEPRxGP130 que ativam a sinalização celular mediada por GP130 com uma potência que é pelo menos 20% ou 25% do grau de ativação observado pelo tratamento com oncostatina M humana (OSM) sob a mesma condição de ensaio experimental ou uma condição de ensaio experimental similar. À ativação da sinalização celular mediada por GP130 por uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica da presente invenção pode ser avaliada por um ensaio de sinalização celular in vitro, por exemplo, usando um formato de ensaio conforme definido no Exemplo 12 neste documento ou um ensaio substancialmente semelhante.
[0094] A presente invenção inclui moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas LEPRXGP130 que especificamente, ou preferencialmente, ativam a sinalização através da isoforma 'b' (forma longa) de LEPR e não ativam substancialmente a sinalização através da isoforma 'a' (forma curta) de LEPR. De acordo com certas modalidades, moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas LEPRxGP130 são fornecidas que especificamente, ou preferencialmente, potencializam a sinalização de leptina através da isoforma 'b' (forma longa) de LEPR e não potencializam substancialmente a sinalização de leptina através da isoforma 'a' (forma curta) de LEPR. A ativação ou potencialização da sinalização através da isoforma 'b' de LEPR e/ou da isoforma 'a' de LEPR pode ser avaliada por um ensaio in vitro usando uma linhagem de células repórter que expressa especificamente a isoforma 'b' de LEPR ou a isoforma 'a' de LEPR, por exemplo, usando um formato de ensaio conforme definido no Exemplo 14 neste documento ou um ensaio substancialmente semelhante.
[0095] A presente invenção inclui moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas LEPRXGP130 que causam uma redução no peso corporal quando administradas a um animal. Por exemplo, a presente invenção inclui moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas LEPRXGP130 que causam uma redução de 1% a 4% no peso corporal em animais de 2 a 14 dias após a administração da molécula de ligação ao antígeno biespecífica em uma dose terapeuticamente eficaz ao animal. A indução da perda de peso pelas moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção pode ser avaliada usando um sistema modelo geneticamente manipulado, por exemplo, usando um modelo in vivo tal como estabelecido no Exemplo 13 neste documento ou um modelo substancialmente semelhante.
[0096] As moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da presente invenção podem possuir uma ou mais das características biológicas acima mencionadas ou qualquer combinação destas. A lista anterior de características biológicas das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção não se destina a ser exaustiva. Outras características biológicas das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da presente invenção serão evidentes a uma pessoa versada comumente na técnica a partir de uma revisão da presente divulgação incluindo os Exemplos de trabalho neste documento. Mapeamento de Epítopo, Domínios de Ligação e Tecnologias Relacionadas
[0097] O epítopo ao qual os anticorpos e domínios de ligação ao antígeno da presente invenção se ligam pode consistir em uma única sequência contígua de 3 ou mais (por exemplo, 3, 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17, 18, 19, 20 ou mais) aminoácidos de uma proteína LEPR ou GP130. Alternativamente, o epítopo relevante pode consistir em uma pluralidade de aminoácidos não contíguos (ou sequências de aminoácidos) da proteína alvo.
[0098] Várias técnicas conhecidas pelas pessoas comumente versadas na técnica podem ser usadas para determinar o epítopo em LEPR e/ou GP130 com os quais os anticorpos e domínios de ligação ao antígeno da presente invenção interagem. Técnicas exemplificativas que podem ser usadas para determinar um epítopo ou domínio de ligação de um anticorpo específico ou domínio de ligação ao antígeno incluem, por exemplo, mutagênese sítio-dirigida (por exemplo, mutagênese de varredura de alanina, mutagênese de varredura de arginina, etc.), análise de blots de peptídeo (Reineke, 2004, Methods Mol Biol 248:443-463), proteção de protease e análise de clivagem de peptídeo. Além disso, métodos como excisão de epítopo, extração de epítopo e modificação química de antígenos podem ser empregados (Tomer, 2000, Protein Science 9:487-496). Outro método que pode ser usado para identificar os aminoácidos dentro de um polipeptídeo com o qual um anticorpo interage é troca de hidrogênio/deutério detectada por espectrometria de massa. Em termos gerais, o método de troca de hidrogênio/deutério envolve a marcação com deutério da proteína de interesse, seguida pela ligação do anticorpo à proteína marcada com deutério. Em seguida, o complexo de proteína/anticorpo é transferido para água para permitir que a troca de hidrogênio-deutério ocorra em todos os resíduos, exceto pelos resíduos protegidos pelo anticorpo (que permanecem marcados com deutério). Após a dissociação do anticorpo, a proteína alvo é submetida à clivagem de protease e análise de espectrometria de massa, revelando assim os resíduos marcados com deutério que correspondem aos aminoácidos específicos com os quais o anticorpo interage. Ver, por exemplo, Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; Engen e Smith (2001) Anal. Chem. 73:256A-265A. A análise da estrutura cristalina por raio-X também pode ser usada para identificar os aminoácidos dentro de um polipeptídeo com o qual um anticorpo interage.
[0099] A presente invenção inclui moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas LEPRXGP130 compreendendo um domínio DI (de ligação à GP130) que se liga ao mesmo epítopo que qualquer um dos anticorpos anti-GP130 exemplificativos específicos ou domínios de ligação ao antígeno descritos neste documento (por exemplo anticorpos compreendendo qualquer uma das sequências de aminoácidos conforme estabelecidos na Tabela 1 neste documento). A presente invenção inclui moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas LEPRXGP130 compreendendo um domínio D2 (de ligação ao LEPR) que se liga ao mesmo epítopo que qualquer um dos anticorpos anti-LEPR exemplificativos específicos ou domínios de ligação ao antígeno descritos neste documento (por exemplo, anticorpos compreendendo qualquer uma das sequências de aminoácidos conforme estabelecidos na Tabela 18 neste documento). Da mesma forma, a presente invenção também inclui moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas LEPRXGP130 compreendendo um domínio DI (de ligação à GP130) que compete pela ligação à GP130 com qualquer um dos anticorpos anti-GP130 exemplificativos específicos descritos neste documento (por exemplo, anticorpos compreendendo qualquer uma das sequências de aminoácidos conforme estabelecidos na Tabela 1 neste documento). Além disso, a presente invenção também inclui moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas LEPRXGP130 compreendendo um domínio D?2 (de ligação ao LEPR) que compete pela ligação ao LEPR com qualquer um dos anticorpos anti-LEPR exemplificativos específicos descritos neste documento (por exemplo anticorpos compreendendo qualquer uma das sequências de aminoácidos conforme estabelecidos na Tabela 18 neste documento).
[00100] Pode-se determinar facilmente se um anticorpo ou domínio de ligação ao antígeno se liga ao mesmo epítopo que, ou compete pela ligação
44 / 102 com, um anticorpo anti-GP130 ou anti-LEPR de referência usando métodos de rotina conhecidos na técnica e exemplificados neste documento.
Por exemplo, para determinar se um anticorpo de teste se liga ao mesmo epítopo como um anticorpo anti-GP130 ou anti-LEPR de referência da invenção, o anticorpo de referência é deixado se ligar a uma molécula alvo (isto é, GP130 ou proteína LEPR, conforme o caso). Em seguida, a capacidade de um anticorpo de teste de se ligar à molécula alvo é avaliada.
Se o anticorpo de teste for capaz de se ligar à molécula alvo após a ligação de saturação com o anticorpo de referência, pode-se concluir que o anticorpo de teste se liga a um epítopo diferente do anticorpo de referência.
Por outro lado, se o anticorpo de teste não for capaz de se ligar à molécula alvo após a ligação de saturação com o anticorpo de referência, então o anticorpo de teste pode se ligar ao mesmo epítopo que o epítopo ligado pelo anticorpo de referência da invenção.
Experimentação de rotina adicional (por exemplo, mutação de peptídeo e análises de ligação) podem então ser realizadas para confirmar se a falta de ligação observada do anticorpo de teste é, de fato, devido à ligação ao mesmo epítopo que o anticorpo de referência ou se o bloqueio estérico (ou outro fenômeno) é responsável pela falta de ligação observada.
Experimentos deste tipo podem ser realizados usando ELISA, RIA, Biacore, citometria de fluxo ou qualquer outro ensaio de ligação a anticorpo quantitativo ou qualitativo disponível na técnica.
De acordo com certas modalidades da presente invenção, dois anticorpos se ligam ao mesmo epítopo (ou ao epítopo sobreposto) se, por exemplo, um excesso de 1, 5, 10, 20 ou 100 vezes de um anticorpo inibe a ligação do outro em pelo menos 50%, mas preferencialmente 75%, 90% ou mesmo 99%, conforme medido em um ensaio de ligação competitiva (ver, por exemplo, Junghans et al., Cancer Res. 1990:50:1495-1502). Alternativamente, dois anticorpos são considerados como se ligando ao mesmo epítopo se essencialmente todas as mutações de aminoácidos no antígeno que reduzem ou eliminam a ligação de um anticorpo reduzem ou eliminam a ligação do outro.
45 /102 Dois anticorpos são considerados como tendo “epítopos sobrepostos” se apenas um subconjunto das mutações de aminoácido que reduzem ou eliminam a ligação de um anticorpo reduzem ou eliminam a ligação do outro.
[00101] Para determinar se um anticorpo compete pela ligação (ou compete de forma cruzada pela ligação) com um anticorpo anti-GP130 ou anti-LEPR de referência, a metodologia de ligação descrita acima é realizada em duas orientações: Em uma primeira orientação, o anticorpo de referência é deixado se ligar à molécula alvo sob condições de saturação seguido pela avaliação da ligação do anticorpo de teste à molécula alvo. Em uma segunda orientação, o anticorpo de teste é deixado se ligar a uma molécula alvo sob condições de saturação seguido pela avaliação de ligação do anticorpo de referência à molécula alvo. Se, em ambas as orientações, apenas o primeiro anticorpo (de saturação) for capaz de se ligar à molécula alvo, então conclui-se que o anticorpo de teste e o anticorpo de referência competem pela ligação à molécula alvo. Como será apreciado por uma pessoa comumente versada na técnica, um anticorpo que compete pela ligação com um anticorpo de referência pode não se ligar necessariamente ao mesmo epítopo que o anticorpo de referência, mas pode bloquear estericamente a ligação do anticorpo de referência ao se ligar a um epítopo sobreposto ou adjacente.
[00102] Os domínios de ligação ao antígeno (D1 e/ou D2) das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da presente invenção podem ser descritos em termos dos domínios de GP130 ou LEPR com os quais o domínio de ligação ao antígeno interage. Proteínas de GP130 e LEPR compreendem vários domínios referidos como D1, D2, D3 e FNIII. Nesse sentido, os domínios de ligação ao antígeno D1 e D2 das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da presente invenção podem se ligar a um domínio de LEPR ou GP130 selecionado do grupo consistindo em DI, D2, D3 ou FNIII. De acordo com certas modalidades exemplificativas, moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas LEPRXxGP130 são fornecidas em que o domínio de ligação ao
46 / 102 antígeno D1 (anti-GP130) se liga ao domínio FNIII de GP130, e o domínio de ligação ao antígeno D2 (anti-LEPR) se liga ao domínio FNIII de LEPR. Outras combinações de domínio de ligação são contempladas dentro do escopo da presente invenção. Preparação de Anticorpos Humanos
[00103] Os anticorpos anti-GP130, anticorpos antiLEPR e LEPRxGP130 biespecíficos da presente invenção podem ser anticorpos totalmente humanos. Métodos para gerar anticorpos monoclonais, incluindo anticorpos monoclonais totalmente humanos, são conhecidos na técnica. Qualquer método conhecido pode ser usado no contexto da presente invenção para produzir anticorpos humanos que se ligam especificamente à GP130 humana e/ou LEPR humano.
[00104] Usando a tecnologia VELOCIMMUNETY, por exemplo, ou qualquer outro método semelhante conhecido para gerar anticorpos monoclonais totalmente humanos, anticorpos quiméricos de alta afinidade para GP130 humana e/ou LEPR humano são inicialmente isolados tendo uma região variável humana e uma região constante de camundongo. Assim como na seção experimental abaixo, os anticorpos são caracterizados e selecionados por características desejáveis, incluindo afinidade, atividade de bloqueio de ligante, seletividade, epítopo etc. Se necessário, as regiões constantes de camundongo são substituídas por uma região constante humana desejada, por exemplo IgG1 ou IgG4 de tipo selvagem ou modificada, para gerar anticorpos anti-GP130 e/ou anti-LEPR totalmente humanos. Enquanto a região constante selecionada pode variar de acordo com o uso específico, as características de afinidade alta de ligação ao antígeno e especificidade alvo residem na região variável. Em certos casos, anticorpos anti-GP130 e/ou anti-LEPR totalmente humanos são isolados diretamente de células B positivas para antígeno. Bioequivalentes
[00105] A presente invenção inclui anticorpos anti-GP130, anticorpos
47 /102 anti-LEPR e anticorpos biespecíficos LEPRXxGP130 tendo sequências de aminoácidos que variam daquelas dos anticorpos descritos, mas que retêm a capacidade de se ligar ao(s) antígeno(s) alvo(s) relevante(s) (GP130 e/ou LEPR) e exercer uma ou mais funções biológicas dos anticorpos precursores dos quais tais variantes são derivadas. Tais anticorpos variantes e fragmentos de anticorpos compreendem uma ou mais adições, deleções ou substituições de aminoácidos quando comparados com a sequência principal, mas exibem atividade biológica que é essencialmente equivalente à dos anticorpos descritos. Da mesma forma, a presente invenção inclui sequências de DNA que codificam anti-GP130, anticorpos anti-LEPR e anticorpos biespecíficos LEPRxGP130 da presente invenção, em que tais sequências de DNA compreendem uma ou mais adições, deleções ou substituições de nucleotídeos em comparação com a sequência precursora divulgada, mas que codificam anticorpos anti-GP130, anticorpos anti-LEPR e anticorpos biespecíficos LEPRxGP130 que são essencialmente bioequivalentes aos anticorpos exemplares divulgados neste documento. Exemplos de tais sequências de aminoácidos e sequências de DNA variantes são discutidos em outro lugar neste documento.
[00106] Duas proteínas de ligação ao antígeno, ou anticorpos, são consideradas bioequivalentes se, por exemplo, são equivalentes farmacêuticos ou alternativas farmacêuticas cuja taxa e extensão de absorção não mostram uma diferença significativa quando administradas na mesma dose molar sob condições experimentais semelhantes, sejam doses únicas ou múltiplas doses. Alguns anticorpos serão considerados equivalentes ou alternativas farmacêuticas se forem equivalentes na extensão de sua absorção, mas não em sua taxa de absorção e, ainda assim, podem ser considerados bioequivalentes porque tais diferenças na taxa de absorção são intencionais e são refletidas na marcação, não são essenciais para a obtenção de concentrações eficazes do fármaco corporal em, por exemplo, uso crônico e são consideradas
48 /102 clinicamente insignificantes para o produto medicamentoso específico estudado.
[00107] Em uma modalidade, duas proteínas de ligação ao antígeno são bioequivalentes se não houver diferenças clinicamente significativas na sua segurança, pureza e potência.
[00108] Em uma modalidade, duas proteínas de ligação ao antígeno são bioequivalentes se um paciente puder trocar uma ou mais vezes o produto de referência pelo produto biológico sem um aumento esperado no risco de efeitos adversos, incluindo uma mudança clinicamente significativa na imunogenicidade ou eficácia diminuída em comparação com a terapia contínua sem tal troca.
[00109] Em uma modalidade, duas proteínas de ligação ao antígeno são bioequivalentes se ambas atuarem por um mecanismo comum ou mecanismos de ação para a condição ou condições de uso, na medida em que tais mecanismos são conhecidos.
[00110] Bioequivalência pode ser demonstrada por métodos in vivo e in vitro. As medidas de bioequivalência incluem, por exemplo, (a) um teste in vivo em seres humanos ou outros mamíferos, em que a concentração do anticorpo ou seus metabólitos é medida no sangue, plasma, soro ou outro fluido biológico em função do tempo; (b) um teste in vitro que foi correlacionado e é razoavelmente preditivo de dados de biodisponibilidade in vivo de humanos; (c) um teste in vivo em seres humanos ou outros mamíferos em que o efeito farmacológico agudo apropriado do anticorpo (ou seu alvo) é medido em função do tempo; e (d) em um ensaio clínico bem controlado que estabelece segurança, eficácia ou biodisponibilidade ou bioequivalência de um anticorpo. Seletividade de Espécies e Reatividade Cruzada de Espécies
[00111] A presente invenção, de acordo com certas modalidades, fornece anticorpos anti-GP130, anticorpos antiLEPR e anticorpos biespecíficos LEPRXxGP130 (e outras moléculas de ligação ao antígeno que
49 /102 compreendem domínios de ligação ao antígeno anti-GP130 e/ou anti-LEPR) que se ligam à GP130 humana e ao LEPR humano, mas não às proteínas correspondentes de outras espécies. À presente invenção inclui também anticorpos anti-GP130, anticorpos anti-LEPR e anticorpos biespecíficos LEPRxXxGP130 (e moléculas de ligação ao antígeno que compreendem domínios de ligação ao antígeno anti-GP130 e/ou anti-LEPR) que se ligam à GP130 humana e ao LEPR humano e à GP130 e ao LEPR de uma ou mais espécies não humanas. Por exemplo, a presente invenção inclui moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que compreendem um primeiro e um segundo domínios de ligação ao antígeno, em que o primeiro domínio de ligação ao antígeno se liga à GP130 de humano e macaco (por exemplo, Macaca Jfascicularis), mas não se liga à GP130 de roedores (rato e/ou camundongo). À presente invenção inclui moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que compreendem um primeiro e um segundo domínios de ligação ao antígeno, em que o segundo domínio de ligação ao antígeno se liga ao LEPR de humano e macaco (por exemplo, Macaca fascicularis), mas não se liga ao LEPR de roedores (rato e/ou camundongo).
[00112] A presente invenção fornece ainda anticorpos anti-GP130, anticorpos anti-LEPR e anticorpos biespecíficos LEPRXxGP130 (e outras moléculas de ligação ao antígeno que compreendem domínios de ligação ao antígeno anti-GP130 e/ou anti-LEPR) que se ligam à GP130 humana e/ou ao LEPR humano e podem se ligar ou não, conforme o caso, a um ou mais dentre camundongo, rato, porquinho-da-índia, hamster, gerbil, porco, gato, cão, coelho, cabra, ovelha, vaca, cavalo, camelo, cynomolgus, marmoset, rhesus ou chimpanzé das proteínas de GP130 e/ou LEPR correspondentes. Administração e Formulação Terapêuticas
[00113] A invenção fornece composições farmacêuticas que compreendem anticorpos anti-GP130, anticorpos anti-LEPR e anticorpos biespecíficos LEPRxGP130 (e outras moléculas de ligação ao antígeno que compreendem domínios de ligação ao antígeno anti-GP130 e/ou anti-LEPR) da presente invenção. As composições farmacêuticas da invenção podem ser formuladas com carreadores, excipientes e outros agentes adequados que forneçam melhor transferência, distribuição, tolerância e semelhantes. Usos Terapêuticos dos Anticorpos
[00114] A presente invenção inclui métodos que compreendem a administração a um sujeito em necessidade desta (por exemplo, um mamífero, tal como um humano), uma composição terapêutica que compreende uma molécula de ligação ao antígeno LEPRXGP130 biespecífica (por exemplo, uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica LEPRXGP130 que compreende qualquer um dos componentes DI e D2 conforme estabelecido na Tabela 20 neste documento). A composição terapêutica pode compreender qualquer uma das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas LEPRXxGP130 divulgadas neste documento e um carreador ou diluente farmaceuticamente aceitável.
[00115] As moléculas de ligação ao antígeno Dbiespecíficas LEPRxGP130 da invenção são úteis, inter alia, para o tratamento, prevenção e/ou melhoria de qualquer doença ou distúrbio associado ou mediado por deficiência de leptina, resistência à leptina, hipoleptinemia ou, de outra forma, tratável pela estimulação ou ativação de sinalização de LEPR ou mimetização da atividade natural da leptina in vitro ou in vivo. Por exemplo, as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da presente invenção são úteis para tratar condições de lipodistrofia. As condições de lipodistrofia exemplificativas que são tratáveis pelas moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da presente invenção incluem, por exemplo, lipodistrofia generalizada congênita, lipodistrofia generalizada adquirida, lipodistrofia parcial familiar, lipodistrofia parcial adquirida, lipodistrofia abdominal centrífuga, lipoatrofia anular, lipodistrofia localizada e lipodistrofia associada ao HIV.
[00116] As moléculas de ligação ao antígeno Dbiespecíficas LEPRxGP130 da presente invenção também são úteis para o tratamento ou prevenção de uma ou mais doenças ou distúrbios selecionados do grupo que consiste em obesidade, síndrome metabólica, anseio alimentar induzido por dieta, amenorreia hipotólica funcional, diabetes tipo 1, diabetes tipo 2, resistência a insulina, resistência a insulina severa incluindo resistência a insulina severa devido a mutação no receptor de insulina, resistência a insulina severa não causada por mutação no receptor de insulina, resistência severa a insulina causada por uma mutação em vias de sinalização a jusante ou induzida por outras causas, doenças hepáticas gordurosas alcoólicas e não alcoólicas, doença de Alzheimer, deficiência de leptina, resistência a leptina, lipodistrofias, = Leprechaunismo/síndrome de Donohue, síndrome de Rabson-Mendenhall.
[00117] No contexto dos métodos de tratamento descritos neste documento, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica LEPRXxGP130 pode ser administrada como uma monoterapia (isto é, como o único agente terapêutico) ou em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais (exemplos dos quais são descritos em outra parte neste documento). Terapias e Formulações de Combinação
[00118] A presente invenção inclui composições e formulações terapêuticas compreendendo qualquer uma das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficaa LEPRxGP130 descritas neste documento em combinação com um ou mais componentes terapeuticamente ativos adicionais e métodos de tratamento compreendendo administrar tais combinações a sujeitos em necessidade destas.
[00119] As moléculas de ligação ao antígeno Dbiespecíficas LEPRxGP130 da presente invenção podem ser co-formuladas com e/ou administradas em combinação com um ou mais componentes terapeuticamente ativos adicionais, tais como, por exemplo, produtos farmacêuticos prescritos para o tratamento de obesidade, hipercolesterolemia, hiperlipidemia, diabetes tipo 2, diabetes tipo 1, controle de apetite, infertilidade, etc. Exemplos de tais componentes adicionais terapeuticamente ativos incluem, por exemplo, leptina humana recombinante (por exemplo, metreleptina [MY ALEPT]), inibidores de PCSK9 (por exemplo, anticorpos anti-PCSK9 [alirocumab, evolocumab, bococizumab, lodelcizumab, ralpancizumab, etc.]), estatinas (atorvastatina, rosuvastatina, cerivastatina,y pitavastatinay fluvastatinay sinvastatina, lovastatina, pravastatina, etc.), ezetimib, insulina, variantes de insulina, secretagogos de insulinay metformina, sulfonilureias, inibidores do cotransportador de glicose 2 (SGLT2) (por exemplo, dapaglifozina, canaglifozina, empagliflozina, etc.), agonistas/análogos de GLP-1 (por exemplo, extendina-4, exenatida, liraglutida, lixisenatida, albiglutida, dulaglutida, etc.), inibidores de glucagon (GCG) (por exemplo, anticorpos anti-GCG), inibidores do receptor de glucagon (GCGR) (por exemplo, anticorpos anti-GCGR, antagonistas de GCGR de molécula pequena, oligonucleotídeos antisense específicos para GCGR, aptâmeros anti-GCGR [por exemplo, Spiegelmers], etc.), inibidores de proteína tipo angiopoietina (ANGPTL) (por exemplo, anticorpos antiCANGPTL3, anticorpos anti-ANGPTLA, anticorpos anticCANGPTL8, etc.), Fentermina, Orlistate, Topiramato, Bupropiona, Topiramato/Fentermina, Bupropiona/Naltrexona, Bupropiona/Zonisamida, Pramlintida/Metrelepina, Lorcaserina, Cetilistate, Tesprecipitina, Velneperit, etc.
[00120] O(s) Componente(s) terapeuticamente ativo(s) adicional(is), por exemplo, qualquer um dos agentes listados acima ou seus derivados, podem ser administrados imediatamente antes, simultâneos com, ou pouco após a administração de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica LEPRxGP130 da presente invenção; (para fins da presente divulgação, tais regimes de administração são consideradas a administração de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica LEPRXxGP130 “em combinação com” um componente terapeuticamente ativo adicional). A presente invenção inclui composições farmacêuticas em que uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica LEPRXGP130 da presente invenção é co-formulada com um ou mais componentes terapeuticamente ativos adicionais, conforme descrito em outra parte neste documento.
Regimes de Administração
[00121] De acordo com certas modalidades da presente invenção, doses múltiplas de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica LEPRXGP130 (ou uma composição farmacêutica que compreende uma combinação de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica LEPRXxGP130 e qualquer um dos agentes terapeuticamente ativos adicionais mencionados neste documento) podem ser administradas a um sujeito durante um curso de tempo definido. Os métodos de acordo com este aspecto da invenção compreendem administrar sequencialmente a um sujeito múltiplas doses de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica LEPRXxGP130 da invenção. Conforme usado neste documento, “administrar sequencialmente” significa que cada dose da molécula de ligação ao antígeno biespecífica LEPRXGP130 é administrada ao sujeito em um momento diferente, por exemplo, em dias diferentes separados por um intervalo predeterminado (por exemplo, horas, dias, semanas ou meses). A presente invenção inclui métodos que compreendem administrar sequencialmente ao paciente uma dose inicial única de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica LEPRXGP130, seguida por uma ou mais doses secundárias da molécula de ligação ao antígeno biespecífica LEPRXGP130 e, opcionalmente, seguidas por uma ou mais doses terciárias da molécula de ligação ao antígeno biespecífica LEPRXGP130.
[00122] Os termos “dose inicial”, “doses secundárias” e “doses terciárias” referem-se à sequência temporal de administração da molécula de ligação ao antígeno biespecífica LEPRXGP130 da invenção. Assim, a “dose inicial” é a dose que é administrada no início do regime de tratamento (também referida como a “dose de avaliação inicial”, “dose de carregamento”, “dose inicial” e semelhantes); as “doses secundárias” são as doses que são administradas após a dose inicial; e as “doses terciárias” são as doses que são administradas após as doses secundárias. As doses iniciais, secundárias e terciárias podem todas conter a mesma quantidade de molécula de ligação ao antígeno biespecífica LEPRXGP130, mas geralmente podem diferir entre si em termos de frequência de administração. Em determinadas modalidades, no entanto, as quantidades de molécula de ligação ao antígeno biespecífica LEPRxXGP130 contidas nas doses inicial, secundária e/ou terciária variam entre si (por exemplo, ajustadas para cima ou para baixo conforme apropriado) durante o curso do tratamento. Em determinadas modalidades, duas ou mais (por exemplo, 2, 3, 4 ou 5) doses são administradas no início do regime de tratamento como “doses de carregamento” seguidas por doses subsequentes que são administradas com menos frequência (por exemplo, “doses de manutenção”).
DISPOSITIVOS
[00123] A presente invenção também fornece um recipiente (por exemplo, um frasco ou coluna de cromatografia) ou dispositivo de injeção (por exemplo., seringa, seringa pré-preenchida ou autoinjetor) compreendendo uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica (por exemplo, formulação farmacêutica desta) estabelecida neste documento. O recipiente ou dispositivo de injeção pode ser empacotado em um kit.
[00124] Um dispositivo de injeção é um dispositivo que introduz uma substância no corpo de um sujeito (por exemplo, um humano) através de uma via parenteral, por exemplo, intraocular, intravítrea, intramuscular, subcutânea ou intravenosa. Por exemplo, um dispositivo de injeção pode ser uma seringa (por exemplo, pré-preenchida com a formulação farmacêutica, tal como um autoinjetor) que, por exemplo, inclui um cilindro ou tubo para reter o fluido a ser injetado (por exemplo, compreendendo o anticorpo ou fragmento ou uma formulação farmacêutica deste), uma agulha para perfurar a pele, os vasos sanguíneos ou outro tecido para injeção do fluido; e um êmbolo para empurrar o fluido para fora do cilindro e através do orifício da agulha e para dentro do corpo do sujeito.
[00125] A presente invenção inclui métodos para administrar uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica da presente invenção compreendendo a introdução por exemplo, injeção, da molécula no corpo do sujeito, por exemplo, com um dispositivo de injeção.
MÉTODOS DE EXPRESSÃO
[00126] A presente invenção inclui métodos recombinantes para produzir uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica da presente invenção ou uma cadeia de imunoglobulina desta, compreendendo (1) introduzir, em uma célula hospedeira, um ou mais polinucleotídeos que codificam cadeias de imunoglobulina leves e/ou pesadas de tal molécula de ligação ao antígeno biespecífica, por exemplo, em que o polinucleotídeo está em um vetor; e/ou se integra ao cromossomo da célula hospedeira e/ou está operacionalmente ligado a um promotor; (ii) cultivar a célula hospedeira (por exemplo, célula de mamífero, fungo, ovário de hamster chinês (CHO), Pichia ou Pichia pastoris) sob condições favoráveis à expressão do polinucleotídeo e, (111) opcionalmente, isolar a molécula de ligação ao antígeno biespecífica ou a cadeia de imunoglobulina da célula hospedeira e/ou do meio no qual a célula hospedeira é cultivada. O produto de tal método também faz parte da presente invenção, juntamente com uma composição farmacêutica deste.
[00127] Em uma modalidade da invenção, um método para produzir uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica inclui um método de purificação da molécula, por exemplo, por cromatografia de coluna, precipitação e/ou filtração. O produto de tal método também faz parte da presente invenção, juntamente com uma composição farmacêutica deste.
[00128] Células hospedeiras compreendendo uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica da presente invenção e/ou um polinucleotídeo que codifica cadeias de imunoglobulina de tal molécula (por exemplo, em um vetor) também fazem parte da presente invenção. As células hospedeiras incluem, por exemplo, células de mamíferos, tais como células de ovário de hamster chinês (CHO) e células fúngicas, tais como células de Pichia (por exemplo, P. pastoris).
EXEMPLOS
[00129] Os exemplos a seguir são apresentados a fim de fornecer às pessoas versadas na técnica uma divulgação e descrição completas de como produzir e usar os métodos e composições da invenção, e não se destinam a limitar o escopo do que os inventores consideram como sua invenção. Esforços têm sido feitos para garantir a precisão em relação a números usados (por exemplo, quantidades, temperatura, etc.), mas alguns erros e desvios experimentais devem ser considerados. Salvo se indicado de outra forma, partes são partes em peso, peso molecular é o peso molecular médio, temperatura é em graus centígrados e a pressão é ou está próxima à atmosférica. Exemplo 1. Geração de Anticorpos Anti-GP130
[00130] Anticorpos anti-GP130 foram obtidos pela imunização de um camundongo geneticamente manipulado compreendendo DNA que codifica regiões variáveis de cadeia leve pesada e kappa humanas com um imunógeno compreendendo domínio extracelular de GP130 humano recombinante. Os camundongos utilizados para imunizações expressam uma “cadeia leve universal”. Ou seja, os anticorpos produzidos neste camundongo têm regiões variáveis de cadeia pesada diferentes, mas domínios variáveis de cadeia leve essencialmente idênticos.
[00131] A resposta imune do anticorpo foi monitorada por um imunoensaio específico de GP130. Quando uma resposta imune desejada foi obtida, esplenócitos foram coletados e fundidos com células de mieloma de camundongo para preservar sua viabilidade e formar linhagens celulares de hibridoma. As linhagens celulares de hibridoma foram triadas e selecionadas para identificar linhagens celulares que produzem anticorpos específicos de GP130. Com o uso desta técnica, vários anticorpos quiméricos anti-GP130 (isto é, anticorpos que possuem domínios variáveis humanos e domínios constantes de camundongo) foram obtidos. Além disso, vários anticorpos anti-GP130 totalmente humanos foram isolados diretamente de células B positivas para antígeno sem fusão com células de mieloma, conforme descrito no documento US 2007/0280945A1.
[00132] Certas propriedades biológicas dos anticorpos anti-GP130 exemplificativos gerados de acordo com os métodos deste Exemplo e de anticorpos biespecíficos criados a partir destes são descritas em detalhes nos Exemplos apresentados abaixo. Exemplo 2. Sequências de Ácidos Nucleicos e de Aminoácidos de Região Variável de Cadeia Leve e Pesada de anticorpos anti-GP130.
[00133] A Tabela | apresenta os identificadores de sequência de aminoácidos das regiões variáveis de cadeia pesada e leve e CDRs de anticorpos anti-LEPR selecionados da invenção. (Conforme observado acima, todos os anticorpos gerados no Exemplo 1 possuem a mesma região variável de cadeia leve e as mesmas sequências de CDR de cadeia leve também). Os identificadores de sequência de ácidos nucleicos correspondentes são apresentados na Tabela 2. Tabela 1: Identificadores de Sequência de Aminoácidos de Anticorpos Anti-GP130 Lo SEQ ID NOs: Denominação do Anticorpo | HCVR | HCDRI | HCDR2 | HCDR3 || LCVR | LCDRI | LCDR2 | LCDR3 MAbI16614 20 2 MAbI6618 28 30 16 MAb16622 16 MAb16623 E 46 16 MAb16636 52 54 16 MAbI6637 60 62 16 | Matisse | 66 | 6 7O 16 | MAb16659 76 78 | so | 10 | 1x2 [1 | MAb16662 84 86 | 8 W1o| 1 | 11 | 6 MAbI6664 | 90 | 92 24 | o | 1o | nr [1 | MAbI666S | 98 | 100 102 | 104 || 10 | 12 [| 1 | 6 MAbI6666 | 106 | 108 10 | 12 [10 | 12 [| | 6 MAb16669 116 18 | 120 || 10 | 12 [| mw | 6 MAbI6673 12 126 | 128 | 10 | 1x2 | 14 | 16 | MAbI6676 [1 ve | 1na [| 16 |
Tabela 1: Identificadores de Sequência de Aminoácidos de Anticorpos Anti-GP130 SEQ ID NOs: MAb16680 140 142 [io 1 | [16 | MADb16682 148 150 [1 | 1 | | 16 | MAbIG6683 [| 154 [| 156 | 158 [| 160 [10 | 2 | nu | 16 | Tabela 2: Identificadores de Sequência de Ácidos Nucleicos de Anticorpos Anti-GP130 Lo SEQ ID NOs: Denominação do| Anticorpo | HCVR | HCDRI | HCDR2 | HCDR3 || LCVR | LCDRI | LCDR2 | LCDR3 MAbI6614 1 19 21 23 MADbI16618 25 27 29 31 " 13 15 MAb16622 33 35 37 39 MAb16623 41 B 45 Ex MAb16636 49 51 53 ss | o | an jo3 | 15 | MAb16637 57 59 61 63 No po 3 Ss MAbI16656 65 67 69 1a fo o 3 Ss | MAb16659 TB 75 TI 719 No pn [3 Ss | MADb16662 81 83 85 86 Wo [| n 13 15 MADb16664 89 91 93 5 | o | un 3 15 MAb16665 E 99 101 103 | 9 | n 3 15 MAb16666 105 107 109 111 nn 3 15 MADb16669 113 115 17 119 7 3 15 MAb16673 121 123 125 127 nu 3 15 MADbI16676 129 131 133 135 nu 3 15 MAb16680 137 139 141 143 15 MAb16682 Us 147 149 151 MADb16683
[00134] Os anticorpos da presente invenção podem ser de qualquer isotipo. Por exemplo, os anticorpos anti-GP130 da invenção podem compreender domínio variável e sequências de CDR conforme estabelecido nas Tabelas 1 e 2 e um domínio Fc humano de isotipo IgG4, IgG], etc. Para certas aplicações ou experimentos, o domínio Fc pode ser um domínio Fc de camundongo. Como será apreciado por uma pessoa comumente versada na técnica, um anticorpo com um isotipo Fc específico pode ser convertido em um anticorpo com um isotipo Fc diferente (por exemplo, um anticorpo com um Fc de IZgG4 de camundongo pode ser convertido em um anticorpo com uma IgG1 humana, etc.), mas em qualquer caso, os domínios variáveis (incluindo CDRs) — que são indicados pelos identificadores numéricos mostrados nas Tabelas 1 e 2 — permanecerão os mesmos, e as propriedades de ligação deverão ser idênticas ou substancialmente semelhantes, independentemente da natureza do domínio Fc. Exemplo 3. Cinética de ligação Biacore de anticorpos monoclonais anti-GP130 que se ligam a diferentes reagentes de GP130 medida a 25ºC e 37ºC.
[00135] As constantes de dissociação (Kp) de equilíbrio para diferentes reagentes de GP130 que se ligam a anticorpos monoclonais anti-GP130 purificados foram determinadas usando um biossensor Biacore 4000 com base em ressonância plasmônica de superfície em tempo real. Todos os estudos de ligação foram realizados em 10OmM HEPES, 150mM NaCl, 3mM EDTA e 0,05% v/v de Surfactante Tween-20, tampão de corrida de pH 7,4 (HBS-ET) a 25ºC e 37ºC. A superfície do sensor Biacore foi derivada primeiro pelo acoplamento da amina com um anticorpo monoclonal de camundongo anti-Fc humano (GE *BR-1008-39) para capturar anticorpos monoclonais anti-GP130. Estudos de ligação foram realizados nos seguintes reagentes de GP130 monoméricos e diméricos: domínio extracelular de GP130 de humano expresso com uma tag de C-terminal myc-myc-hexahistidina (hGP130-mmH; SEQ ID NO:191), domínio extracelular de GP130 de Macaca fascicularis expresso com uma tag de C-terminal myc-myc-hexahistidina (mfGP130-mmH; SEQ ID NO: 194), domínio extracelular de GP130 de humano expresso com uma tag de IgG2a Fc de camundongo de C-terminal (hGP130-hFc; SEQ ID NO:197), domínio extracelular de GP130 de camundongo expresso com uma tag de C-terminal myc-myc-hexahistidina (mMGP130-mmH; SEQ ID NO:196) e domínio extracelular de GP130 de rato expresso com uma tag de C-terminal myc-myc-hexahistidina (rGP130-mmH; SEQ ID NO:195). Os reagentes marcados com “mmH” são monoméricos, enquanto que os reagentes marcados com “mFc” são diméricos. Assim, por exemplo, “hGP130-mmH” também é referida como “GP130 humana monomérica” e “hGP130-mFc” também é referida como “GP130 humana dimérica”.
[00136] Diferentes concentrações de hPG130-mmH, mfGP130-mmH, hGP130-mFc (100nM — 3,7nM,; diluição em série de 3 vezes) ou 100mM de mGP130-mmH e rGP130-mmH foram primeiro preparadas em tampão de corrida HBS-ET e foram injetadas sobre a superfície do anticorpo monoclonal anti-GP130 capturado com anti-Fc humano por 4 minutos a uma vazão de 30uL/minuto, enquanto a dissociação do reagente de GP130 ligado ao anticorpo monoclonal foi monitorada por 10 minutos em tampão de corrida HBS-ET. A taxa de associação (Kk,) e a taxa de dissociação (ka) foram determinadas pelo ajuste dos sensorgramas de ligação em tempo real a um modelo de ligação de 1:1 com limitação de transporte de massa usando o software de ajuste de curva Scrubber 2.0c. A constante de equilíbrio de dissociação (Kp) e meia-vida dissociativa (t/2) foram calculadas a partir das taxas cinéticas como: kd In(2) KoM=KA, e vóominm=60*Kkd
[00137] Os parâmetros da cinética de ligação para ligação de hGP130-MMH, —mfGP1I30-MMH, hGP1I30.mFc, mGPI30-MMH ou rGP130-MMH a diferentes anticorpos monoclonais anti-GP130 da invenção a 25ºC e 37ºC são mostrados nas Tabelas 3 a 12. Tabela 3: Parâmetros cinéticos de ligação para ligação de hGP130-MMH a anticorpos monoclonais de GP130 a 25ºC. Nível de — 100nM Ag) 1, mAb Capturado captura de Ligada ams o o ao) mAB(RU) | (RU) Ô MADbI16614 143 + 0,67 18 5,52E+04 1,01E-02 1,83E-07 11 MADbI16618 182 + 0,52 52 3,54E+05 4,25E-02 1,20E-07 0,3 MADb16622 197 + 0,95 36 1,20E+05 2,43E-02 2,03E-07 0,5 MADb16623 243 + 1,48 TI 1,80E+05 3,77E-03 2,10E-08 3 MADb16636 195 + 0,45 2,70E+04 9,93E-04 3,68E-08 12 MADb16637 3061/71 | 91 | 7/11E+04 1,10E-03 1,55E-08 10 MADbI16641 154 + 0,93 3,56E+05 8,87E-04 2,49E-09 3 MADb16646 167 + 0,45 5,88E+04 7,713E-04 1,31E-08 15 MADbI16656 189 + 0,44 3,59E+04 8,25E-04 2,30E-08 14 MADbI16659 212 +0,39 6,93E+05 4,59E-04 6,63E-10 25 MADb16662 215 0,67 2,35E+05 2,90E-02 1,23E-07 0,4 MADb16664 217 0,69 6,98E+05 1,64E-03 2,35E-09 7 MADb16665 294 + 1,48 1,15E+05 4,73E-02 4,11E-07 0,2 MADb16666 317 +2,83 3,17E+05 4,56E-03 1,44E-08 3 MADb16669 152 +0,5 1,14E+04 4,03E-04 3,54E-08 29 MADb16673 158 + 0,32 2,15E+05 1,41E-02 6,55E-08 0,8 MADbI16676 176 + 0,33 2,87E+05 6,31E-04 2,19E-09 18 MADb16680 270 +0,91 1,47E+05 4,75E-04 3,24E-09 24 MADb16682 186 + 0,55 1,21E+05 1,64E-02 1,36E-07 0,7 MADb16683 238 2,72 6,97E+04 3,25E-03 4,67E-08 4 MADb16684 204 + 1,09 5,32E+04 6,22E-03 1,17E-07
Tabela 3: Parâmetros cinéticos de ligação para ligação de hGP130-MMH a anticorpos monoclonais de GP130 a 25ºC. Nível de —/100nM Ag mAB(RU) | (RU) À de IgG4 NB indica que nenhuma ligação foi observada sob as condições experimentais atuais. Tabela 4: Parâmetros cinéticos de ligação para ligação de hGP130-MMH a anticorpos monoclonais de GP130 a 37ºC. 100nM Nível de Ag ka kd KD EA mAb Capturado | capturade | 7; x, : ' : Ligada (Ms) As) M) (min) mAB(RU) | (RU) | MAbIG6I4 | 176+298 | 10 | 247E05 | 3000E-02 | 121E07 | 04 | | MAbI668O | 291+159 | 58 | 948E+O4 | 206E-03 | 217E-08 | 6 | | MAbI669S | 192+156 | 87 | 494E+05 | 627E-03 | 127E08 | 18 | Controle de isotipo NB indica que nenhuma ligação foi observada sob as condições experimentais atuais.
[00138] A 25ºC, os anticorpos monoclonais anti-GP130 se ligaram a hGP130-MMH com valores de Kp que variam de 663pM a 411nM, conforme mostrado na Tabela 3. A 37ºC, os anticorpos monoclonais anti-GP130 se ligaram a hGP130-MMH com valores de Kp que variam de 1,84nM a 225nM, conforme mostrado na Tabela 4.
Tabela 5: Parâmetros cinéticos de ligação para ligação de mEGP130-MMH a anticorpos monoclonais de GP130 a 25ºC.
Nível de — [100nM Ag mAB (RU) (RU) - | MaAbI66I4 | 142065 | 16 | 744604 | 104E02 | 139807 | 11 | | MabI6641 | 153355 | 109 | 344605 | 860E-04 | 250E-09 | 13 | | Mabisso3 | 159x033 | 6 | NB | nb | Nn—ç |ng| Controle de isotipo NB indica que nenhuma ligação foi observada sob as condições experimentais atuais.
IC indica que a ligação observada foi inclusiva e foi incapaz de ajustar os dados de ligação em tempo real sob as condições experimentais presentes.
Tabela 6: Parâmetros cinéticos de ligação para ligação de mEGP130-MMH a anticorpos monoclonais de GP130 a 37ºC.
Nívelde — 100nM Ag) mAB (RU) (RU) MAbI6614 MAbI6618 MAbI16622 MAb16623 MAbI16636 MAbI16637 MAbI16641 MAbI16646 MADI6656 MADI6659 MAbI6662 MAbI6664 MAbI6665 —| 330+088 | 14 | 492605 | 101E0 | 205E07 | 01 | MAb16666 MAb16669 MAbI6673 MAbI6676
Tabela 6: Parâmetros cinéticos de ligação para ligação de mfGP130-MMH a anticorpos monoclonais de GP130 a 37ºC. Nível de — 100nM Agi . mAB(RU) | (RU) MAbI16682 MAbI16683 MAbI16684 MADbI6687 MAbI16692 MAbI16693 MADbI16695 MADbI16702 26 NB indica que nenhuma ligação foi observada sob as condições experimentais atuais.
[00139] 23 dos 26 anticorpos monoclonais anti-GP130 da invenção se ligaram a mfGP130-MMH. A 25ºC, anticorpos monoclonais anti-GP130 se ligaram a mfGP130-MMH com valores de Kp que variam de 812pM a 233nM, conforme mostrado na Tabela 5. A 37ºC, anticorpos monoclonais anti-GP130 se ligaram a mfGP130-MMH com valores de Kp que variam de 2,34nM a 239nM, conforme mostrado na Tabela 6. Tabela 7: Parâmetros cinéticos de ligação de hGP130-mFc ligando-se a anticorpos monoclonais GP130 a 25ºC. Nível de —f100nM Ag ka " KD ns mAb Capturado | capturade | Ligada (Ms) as o) (min) mAB(RU) | (RU)
64 /102 Tabela 7: Parâmetros cinéticos de ligação de hGP130-mFc ligando-se a anticorpos monoclonais GP130 a 25ºC. Nível de — [100nM Ag mAB(RU) | (RU) Controle de isotipo NB indica que nenhuma ligação foi observada sob as condições experimentais atuais Tabela 8: Parâmetros cinéticos de ligação de hGP130-mFc ligando-se a anticorpos monoclonais GP130 a 37ºC. 100nM Nível de A: ka kd KD [A mAB (RU) (RU) MAb16683 260 + 1,27 11 1,96E+05 1,14E-03 5,80E-09 MAbI16684 217 +0,75 103 2,02E+05 9,96E-04 4,94E-09 MAb16687 183 +1,22 193 5,89E+05 | 1,00E-05* | 1,70E-11 MAbI16692 195 + 0,86 196 1,30E+06 3,29E-04 2,52E-10 MAb16693 178 + 1,04 140 4,35E+05 1,25E-03 288E-09 | 9 | MAb16695 189 + 0,93 183 1,32E+06 7,63E-04 5,80E-10 MADbI16702 214 +0,89 139 1,29E+06 7,35E-04 5,70E-10 Controle de isotipo NB indica que nenhuma ligação foi observada sob as condições experimentais atuais. *significa que não foi observada dissociação de hGP130-mFc do anticorpo monoclonal GP130 capturado e o valor de ka foi fixado manualmente a 1,00E-05 durante a análise.
[00140] A 25ºC, os anticorpos monoclonais anti-GP130 se ligaram a hGP130-mFc com valores de Kp que variam de 36,6pM a 8,21nM, conforme mostrado na Tabela 7. A 37ºC, os anticorpos monoclonais anti-GP130 se ligaram a hGP130-mFc com valores de Kp que variam de 17pM a 9,56nM, conforme mostrado na Tabela 8. Tabela 9: Parâmetros cinéticos de ligação de MGP130-MMH ligando-se a anticorpos monoclonais GP130 a 25ºC.
Nível de —[100nM Ag ka kd KD " mAb Capturado | capturade | Ligada (Ms) ars) MD (min) mAB (RU) (RU) - MAb16614 142 1 NB NB NB NB MAbI16618 181 1 NB NB NB NB MAb16622 195 1 NB NB NB NB MAb16623 240 o NB NB NB NB MAb16636 194 o NB NB NB NB MADb16637 304 1 NB NB NB NB MAb1664] 152 -1 NB NB NB NB MAbI16692 179 -1 NB NB NB NB MAb16693 158 -1 NB NB NB NB MAbI16695 183 o NB NB NB NB MAbI16702 206 o NB NB NB NB ars e os Tx] NB indica que nenhuma ligação foi observada sob as condições experimentais atuais.
Tabela 10: Parâmetros cinéticos de ligação de MGP130-MMH ligando-se a anticorpos monoclonais GP130 a 37ºC.
Nível de — 100nM Ag) ' mAB (RU) (RU) S | Mabis6id | 16 | o | NB8 | N8 |] NB | NB| | Mabis6ig | 209 | o | Ng | N8 |] NB | NB| | MatIG6S | 330 | 12 [| NE | NE | NE |N| | MatIG66 | 36 | o | NB | NB | NE |N| | MatIG6O | 16 | 1 | NE | NE | NE |N|
66 / 102 Tabela 10: Parâmetros cinéticos de ligação de mGP130-MMH ligando-se a anticorpos monoclonais GP130 a 37ºC. Nível de —/100nM Ag mAB (RU) (RU) À | MabIGOS | 18 | 12 [| N8 | NB | NE |N| | Maior | 21 | o | NB | NE | NE |N| ft so a a os a Ta IgG4 NB indica que nenhuma ligação foi observada sob as condições experimentais atuais
[00141] Nenhum dos anticorpos monoclonais anti-GP130 da invenção se ligou a MGP130-MMH a 25ºC ou a 37ºC, conforme mostrado nas Tabelas 9 e 10. Tabela 11: Parâmetros cinéticos de ligação de rGP130-MMH ligando-se a anticorpos monoclonais GP130 a 25ºC. Nível de — 100nM Ag, mAB (RU) (RU) o | MabIGGI4 | 142012 | O |] NB | NB | NB |NB| | MaAbIG6IS | 180x054 | 6 | NB | NB | NB |NB| | Mabi666s | 2152095 | oO [| ne | ne | NB |NB| | Mabi666s | 291x016 | 0 [| ne | ne | NE |NB| | Mabi6666 | 316211 | 1 [| Ne | Ne | NE |NB| | Mabis6sz | 18:02 | 0 [| ne | ne | N8 |NB| tr ae o e dx] de IzgG4 NB indica que nenhuma ligação foi observada sob as condições experimentais atuais. Tabela 12: Parâmetros cinéticos de ligação de rGP130-MMH ligando-se a anticorpos monoclonais GP130 a 37ºC. Nível de — [100nM Ag mAB (RU) (RU) L Mapissig |[207x091 | 2 [ NB | nb | nº |N6|
67 /102 Tabela 12: Parâmetros cinéticos de ligação de rGP130-MMH ligando-se a anticorpos monoclonais GP130 a 37ºC. Nívelde —[100nM Ag ' ; mAb Capturado captura de Ligada ams do . ( é ) mAB(RU) | (RU) À mm MAbI6622 27x051 | 1 | NE | ne | Nnõ8 |nsB| MAbI6623 270 0,14 MADI6636 219 0,61 MAbI6637 337+183 | 0 | ne | nB | ne |NB| MAbI6641 172086 | 1 | ne | ne | Nn8 | nB| MAb16646 199 + 0,44 1,77E+05 7,12E-02 4,03E-07 | 0,16 | MADI6656 207x008 | 0 | NE | ne | ne |nsB| MAbI6659 22x021 | 1 | NE | ne | ne |nB| MAb16662 235x057 | 1 | NE | ne | ne |nB| MADI6664 243 + 0,44 MAbI6665 328 + 1,24 MAbI16666 311+248 | 1 | Nn& | NE | NE |NB| MAbI16669 166 +0,15 MAbI6673 172+0,18 MAbI6676 186 + 0,58 MAbI16680 282 20,79 MADbI16682 203054 | 1 | NE | ne | nõ& | ns| MADbI6683 2562027 | 0 | NB | ne | nõ8 |ns| MAbI6684 212 +1,24 MAbI6687 179 +0,18 MAb16692 191 + 0,49 2,39E+05 2,27E-01 9,50E-07 MAb16693 14066 | 1 | NB | ne | NE |NB| MAbI16695 184+036 | 0 | NB | ne | NE |NB| MADbI6702 210x0146 | 1 | NE | Nn | Nnõ& | nB| Controle de Isotipo NB indica que nenhuma ligação foi observada sob as condições experimentais atuais.
[00142] Conforme mostrado nas Tabelas 11 e 12, 2 dos 26 anticorpos monoclonais anti-GP130 da invenção se ligaram a rGP130-MMH. A 25ºC, os anticorpos monoclonais anti-GP130 se ligaram a rGP130-MMH com valores de Kp que variam de 344nM a 460nM, conforme mostrado na Tabela 11. À 37ºC, os anticorpos monoclonais anti-GP130 se ligaram a rGP130-MMH com valores de Kp que variam de 403nM a 950 conforme mostrado na Tabela 12. Exemplo 4: Ligação da célula de anticorpo anti-GP130 por análise FACS
[00143] A fim de avaliar a ligação celular por anticorpos anti-GP130 da invenção, duas linhagens celulares foram geradas. Uma linhagem celular de células HEK293 foi gerada superexpressando de forma estável a gp130 humana de comprimento total (FL) (aminoácidos 1-918 de acesso % P40189 com leucina na posição 2 alterada para valina, uma variante natural) juntamente com um repórter de luciferase (Stat3-luciferase, Stat3-luc, SA Bioscience,
tHCLS-6028L). As células foram triadas duas vezes usando citometria de fluxo para alta expressão de gpl30. É conhecido doravante como HEK293/Stat3-luc/gp130-2X Sort. Células IMR-32 (Neuroblastoma humano, ATCCO), também foram avaliadas quanto à ligação celular, pois essas células expressam gp130 de forma endógena e foram usadas para bioensaios. As células usadas para ligação foram geradas para expressar de forma estável um repórter da luciferase (Stat3-luciferase, Stat3-luc, SA Bioscience, HCLS-6028L) e são referidas doravante como células IMR-32/STAT3-Luc.
[00144] Para a análise de FACS, 10nM dos anticorpos foram usados para corar 0,5 x 106 células/poço de cada tipo de célula a 4ºC em PBS (sem cálcio e magnésio) contento 2% FBS por 30 minutos. Células IMR-32/STAT3-luc foram incubadas com 1 mg/mL de IgG de camundongo por 30 minutos a 4ºC para bloquear receptores Fc antes de adicionar os anticorpos. Para testar se a ligação de anticorpo anti-gp130 é específica para gp130 nas células IMR-32, anticorpos foram adicionados às células IMR-32/Stat3-luc com ou sem ser pré-ligado a 1000nM de proteína recombinante do ecto-domínio de gpl130 humana fundido a uma tag myc-myc-his (hgp130.mmbh) durante 30 minutos a 25ºC. Após incubação com anticorpos primários, as células foram coradas com 8ug/mL de anticorpo secundário conjugado Alexa Fluor&-647 (Jackson ImmunOresearch Laboratories Inc., anti-chumano * 109-607-003) por 30 minutos. As células foram fixadas usando BD CytoFixTM (Becton Dickinson, tt 554655) e analisadas em um Citômetro de Fluxo IQue& (Intellicyt&). Controles de anticorpos não corados e secundários apenas também, foram testados para todas as linhagens celulares. Os resultados foram analisados usando o software ForeCyt& (IntelliCyt&) para determinar os meios geométricos de fluorescência para células viáveis.
[00145] Conforme mostrado na Tabela 13, vinte e seis anticorpos anti-gp130 da invenção testados a 10nM demonstraram ligação com células
69 /102 HEK293/Stat3-luc/gp130-2X Sort com razões de ligação variando de 29 a 159 vezes.
Os anticorpos anti-gp130 demonstraram ligação às células parentais HEK293 com razões de ligação de 4 a 45 vezes.
As razões de ligação às células IMR-32/Stat3-luc variaram de 5 a 23 vezes sem hgp130.mmh e de 4 a 9 vezes com hGP130.mmh.
As amostras de anticorpos isotipos controles e anticorpos secundários sozinhos demonstraram razões de ligação variando de 1 a 3 vezes para linhagens celulares HEK293 e 1 a 8 vezes para células IMR-32/Stat3-luc.
Tabela 13 Ligação de anticorpos anti-gp130 10nM às células HEK293/Stat3-luc/gp130-2X Sort e TMR-32/Stat3-luc.
MFI - Normalizado para Controle Não Corado Anticorpo 293/Stat3-luc/GP130 TMR-32/Stat3-luc 293 Parental 2X sort [Sem hGP130.mmh| 1uM em "mm nGP130.mmh MADbI6614 MABbI6618 MADb16622 MAbI6636 MADbI6637 MAbI6G6aD ar MabI6646 ea DR MAbI6656 20 MAbI6659 14 MAbI6662 7 MAb16664 8 MAbI6665 4 MAb16666 45 MAb16669 9 MAbI6673 15 MAbI6676 as gg MAbI16680 MAbI66B2 O gg MAbI16683 MAbI16684 MAbI16687 MAbI6692 aaa MAb16693 MAbI6G6os Bo | ao o | a MAbI670O2 as Pa 6 Controle de isotipo de Não corados | Exemplo 5: Competição cruzada de Octet entre diferentes anticorpos monoclonais anti-GP130.
[00146] A competição de ligação entre um painel de anticorpos monoclonais anti-GP130 foi determinada usando um ensaio de interferometria bicamada sem marcador em tempo real na plataforma de biossensor Octet HTX (Pall ForteBio Corp.). Todo o experimento foi realizado a 25ºC em 10mM HEPES, 150 mM NaCl, 3mM EDTA, 0,05% v/v de Surfactante Tween-20 e 1 mg/mL BSA, tampão pH 7,4 (HBS-EBT) com a placa agitando na velocidade de 1000 rpm. Para avaliar se 2 anticorpos competem entre si para ligação com seus respectivos epítopos na GP130 humana recombinante (hGP130-mmH; expresso com uma tag myc-myc-hexahistidina C-terminal SEQ ID:188), cerca de 0,4-0,5nm de hGP1I30-mmH foi primeiro capturado em pontas de biossensor Octet revestido com anticorpo anti-Penta-His (Fortebio Inc, 4 18-5122) pela submersão das pontas de biossensor por 4 minutos em poços contendo 40-50 ug/mL de solução de hGP130-MMH. As pontas de biossensor capturadas por antígeno foram então saturadas com o primeiro anticorpo monoclonal anti-GP130 (mAb-1) mergulhando em poços contendo 50ug/mL de solução de mAb-1 por 4 minutos. As pontas de biossensor foram então mergulhadas em poços contendo solução de 50ug/mL do segundo anticorpo monoclonal anti-GP130 (mAb-2) por 3 minutos. As pontas de biossensor foram lavadas em tampão HBS-ETB entre cada etapa do experimento. À resposta de ligação em tempo real foi monitorada durante todo o curso do experimento e a resposta de ligação ao final de cada etapa foi registrada. À resposta da ligação mAb-2 a hGP130-MMH pré-complexada com mAb-1 foi comparada e o comportamento competitivo/não competitivo de diferentes anticorpos monoclonais anti-GP130 foi determinado conforme mostrado na Tabela 14.
Tabela 14: Competição cruzada entre anticorpos monoclonais anti-GP130
Tabela 14: Competição cruzada entre anticorpos monoclonais anti-GP130 LL xMwss7 — MAbI6676 MADI6695 MADbI6664 MADIG622
MADIGOST MADI6665 MADI66ST MADIG6S6 MAbI6618 MAb16636
Tabela 14: Competição cruzada entre anticorpos monoclonais anti-GP130 mAb-2 que compete com mAb-l RN MAbI6692 MADbI16618 MADb16673 MAb16636 MAb16692 MADbI6614 MADb16682 MADbI16618 MADb16673 MADb16692 MADb16636 MABbI6614 MAbI6682 MADbI16636 MAb16614 MAbI16692 MAbI16682 MADb16636 MAb16682 MAb16692 MAbI6614 MADbI6684 MADbI16702 MAb16623 MADIG6OS MADb16669 MADb16623 MADbI16702 MAb16684 MAbI16693 MAbI16669 MADb16623 MAbI16702 MADbI6684 MADb16693 MAb16669 MADb16623 MADb16684 MADb16693 MAbI6TOZ MAb16669 MADb16623 MADb16684 MADb16669 MALIGTO? MADb16693 MADb16646 MADb16680 MAb16680 MAb16646 MABbI6683 Exemplo 6: Anticorpos monoclonais ligando-se a proteínas do domínio GP130 em sobrenadante Luminex-GP130 delta DI-mmH e GP130 delta D1-3-mmH CHO.
[00147] Para identificar a região de ligação da GP130 humana com a qual os anticorpos anti-GP130 da invenção interagem, utilizou-se uma análise baseada em citometria de fluxo Luminex FLEXMAP (FM3DD, LuminexCorp) para caracterizar a interação de domínios de proteína GP130 humana recombinante. Para o ensaio, aproximadamente 3 milhões de microesferas Microplex R carboxiladas (Luminex, Catt LCI000A), foram lavadas, vortexadas e sonicadas em 0,1 M NaPO;, pH 6,2 (tampão de ativação) e então centrifugadas para remover o sobrenadante. As microesferas foram ressuspensas em 120 uL de tampão de ativação e os grupos carboxilato (-COOH) foram ativados por adição de 15 ul de 50 mg/ml de N-hidroxisuccinimida (NHS, Thermo Scientific, Cattt 24500) seguido pela adição de 15 uL de 50 mg/mL de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil |carbodiimida (EDC, ThermoScientific, Cattt 22980) a 25ºC. Após 10 minutos, o pH da reação foi reduzido para 5,0 com a adição de 600 uL de 50 mM MES, pH 5 (tampão de acoplamento), e as microesferas foram vortexadas e centrifugadas para remover o sobrenadante. Os grânulos ativados foram imediatamente misturados com 500 uL de 20 ug/mL de anticorpos anti-myc monoclonais com IgG de camundongo, em tampão de acoplamento e incubados por duas horas a 25ºC. A reação de acoplamento foi interrompida pela adição de 50 uL de IM TRIS-HCI, pH 8,0 e as microesferas foram rapidamente vortexadas, centrifugadas e lavadas quatro vezes com 1 mL de solução salina tamponada com fosfato 1X da Dulbecco (DPBS, pH 7,2, ThermoScientific Catit 14190136), para remover proteínas desacopladas e outros componentes de reação.
[00148] As proteínas GP130 expressadas transitoriamente, incluindo GP130 delta DI humana expresso com uma tag myc-myc hexahistidina C-terminal (GP130 delta DI-MMH, SEQ ID NO:192) e GP130 delta DI-D3 humana expressadas com uma tag myc-myc hexahistidina C-terminal (GP130 delta C1-D3-MMH humana, SEQ ID NO: 193), foram suspensas em meio CHO-S-SFM II sem soro (Thermo Fisher, Cat tt 31033020) e foram então clarificadas por centrifugação. O domínio extracelular de comprimento total de GP130 purificado expresso com uma tag myc-myc hexahistidina C-terminal (GP130-MMH humana, SEQ ID NO:191) foi preparado a 10 ug/mL em PBS.
Alíquotas de microesferas com anticorpos monoclonais anti-myc imobilizados, preparadas conforme descrito acima, foram adicionadas individualmente a 1 mL de cada um desses sobrenadantes proteicos e a 500 uL de proteína GP130 purificada. As microesferas foram misturadas suavemente, incubadas por duas horas a 25ºC, lavadas duas vezes com 1 mL de DBPS, centrifugadas para remover o sobrenadante e, finalmente, ressuspensas em 1 mL de tampão DPBS. Quarenta e oito uL de microesferas acopladas a IZG anti-myc de reações individuais com GP130 humana de comprimento total e com cada uma das proteínas de domínio GP130 humana foram retiradas e misturadas em 3,6 mL de PBS + 20 mg/mL BSA+0,05% azida sódica (tampão de bloqueio).
[00149] Deste agrupamento misto, 75 uL de microesferas foram plaqueadas por poço em uma placa de filtro de 96 poços (Millipore, Cat. No: MSBVN1250) e misturadas com 25 uL de anticorpos monoclonais anti-GP130 humana individuais (0,5 ou 5 ug/mL), incubadas por duas horas a 25ºC e então lavadas duas vezes com 200 uL de DPBS com 0,05% Tween 20 (tampão de lavagem). Para detectar e quantificar as quantidades de níveis de anticorpo anti-GP130 ligados a microesferas individuais, 100 uL de 2,5 ug/mL de F(ab')2 de cabra conjugada à R-Ficoeritrina anti-kappa humana (Southern Biotech, Catit 2063-09) em tampão de bloqueio, foi adicionado e incubado por 30 minutos a 25ºC. Após 30 minutos, as amostras foram lavadas duas vezes com 200 uL de tampão de lavagem e ressuspensas em 150 uL do tampão de lavagem. A Intensidade de Fluorescência Mediana (MFI) das microesferas foi medida em um Analisador Luminex.
Tabela 15: Sinal de MFI Luminex de anticorpos anti-GP130 que se ligam ao domínio extracelular de comprimento total capturado da tag myc de GP130 humana, GP130 delta DI humana isolada e domínios delta D1-D3.
GPI30 GPI30 GP130 Domínio Domínio gi gi ; Domínio Domínio(s) de Anticorpo extracelular extracelular ; > Delta DI Delta DI-D3 extracelular de interação (comprimento total
Tabela 15: Sinal de MFI Luminex de anticorpos anti-GP130 que se ligam ao domínio extracelular de comprimento total capturado da tag myc de GP130 humana, GP130 delta DI humana isolada e domínios delta D1-D3. GPI30 GPI30 GP130 Domínio Domínio o gs ; Domínio Domínio(s) de Anticorpo extracelular extracelular ; > Delta DI Delta DI-D3 extracelular de interação ea e ' (comprimento total
[00150] Os resultados da análise baseada em Luminex são tabelados na Tabela 15. As intensidades de sinal de MFI Luminex indicam que os vinte e seis anticorpos anti-GP130 da invenção se ligaram ao domínio extracelular de comprimento total da GP130 humana.
[00151] Anticorpos anti-GP130 mAb16637, mAb16641, mAb16656, MAb16659, mAb16664, mAb16665, mAb16676, mAb16687 e MAbI6695 perderam a ligação a ambas as proteínas de deleção, sugerindo epítopos de ligação dentro do domínio D1 da GP130 humana.
[00152] Anticorpos anti-GP130 mAb16614, mAb16618, mAb16622, mAb16636, mAb16662, mAb16666, mAb16673, mAb16682, mAb16692 perderam ligação à GP130 delta D1-D3, mantendo a ligação à GP130 delta DI, indicando que o epítopo de ligação está dentro dos domínios D2-D3 da GP130 humana.
[00153] Anticorpos anti-GP130 mAb16623, mAb16646, mAb16669, mMAb16680, mAb16683, mAb16684, mAb16693, mAb16702 ligado à GP130 delta DI e GP130 delta D1-D3, indicando que seu domínio de ligação está dentro de FNIII da GP130 humana. Exemplo 7: Ensaio baseado em células funcionais com células IMR-32/Stat3-luc, sem ligantes ou com Oncostatina M, hLIF ou hCNTF.
[00154] A fim de avaliar a ativação ou inibição transcricional de anticorpos anti-GP130, as células IMR-32 (Neuroblastoma ATCC humano) foram geradas para expressar estavelmente um repórter da luciferase (STAT3-Luc; SABiosciences, tt CLS-6028L). A linhagem celular resultante é referida doravante como IMR-32/STAT3-Luc (ver Exemplo 4 neste documento).
[00155] Para o bioensaio, células IMR-32/STAT3-Luc foram plaqueadas em 15,000 células/poço em uma placa de 96 poços em tampão de ensaio (0,1% FBS em Optimem com pen/estrep) e incubadas durante a noite a 37ºC em 5% CO;. Os anticorpos anti-gp130 do dia seguinte ou um isotipo controle foram diluídos serialmente de 100nM a 24,4pM no tampão de ensaio (mais uma amostra contendo tampão sozinho sem molécula de teste), adicionados às células e incubados a 25ºC por 30 minutos. Após 30 minutos, 100pM de Oncostatina M humana (hOSM, R&D Sistema 293-OM), 20pM de Fator Inibitório de Leucemia Humana (hLIF, R&D Sistemas 7734-LF), 20pM de Fator Neurotrófico Ciliar Humano (hCNTF, R&D Sistemas 257-NT), ou tampão de ensaio foram adicionados à célula. nOSM, hLIF e hCNTF foram serialmente diluídos de 10nM a 0,17pM em tampão de ensaio (mais uma amostra contendo tampão sozinho sem molécula de teste) e adicionados a células não tratadas com anticorpos. Após 5 horas a 37ºC em 5% CO;, a atividade de luciferase foi medida com reagente OneGlo"M (Promega, E6031) e leitor de placa com vários marcadores Victor!M X (Perkin Elmer). Os resultados foram analisados usando regressão não linear (logística de 4 parâmetros) com software Prism 5 (GraphPad) para obter os valores ECs,º e ClIso. A ativação de anticorpos foi calculada com a faixa máxima de RLU alcançada pelo anticorpo sobre a faixa máxima de RLU alcançada pelo hoOSM. A porcentagem de inibição foi calculada com os valores de RLU usando a seguinte equação: RLIPEZNS e — RU6nibição % de Inibição = 100 x Bo EA— re Ducaygr vund
[00156] Nesta equação, “RLUAvaliação Inicial” é o valor de luminescência das células tratadas com uma quantidade constante de ligante (hOSM, hLIF ou hCNTF) sem anticorpos. “RLUInibição” é o valor de luminescência com 100nM de um anticorpo específico com uma concentração específica de ligante, e “RLUFundo” é o valor de luminescência de células sem quaisquer ligantes ou anticorpos.
[00157] Conforme mostrado na Tabela 16, vinte e seis anticorpos anti-gp130 humana da invenção foram testados quanto sua capacidade de ativar ou inibir a ativação de células IMR-32/Stat3-luc. Conforme mostrado na Tabela 19, na ausência de qualquer ligantes adicionados, nenhum dos anticorpos da invenção testados mostrou qualquer ativação de células IMR-32/Stat3-luc. Um dos 26 anticorpos da invenção, mAb16692, mostrou inibição completa de todos os três ligantes testados com valores ICso de 48pM, 140pM e 230pM para hOSM, hLIF e hCNTF, respectivamente. Dez anticorpos adicionais da invenção testados mostraram alguma inibição de pelo menos um dos ligantes com a % de inibição variando de 17% a 95%, com valores ICso para os anticorpos inibidores variando de >100nM a 88pM. Quinze anticorpos da invenção não mostraram inibição de nenhum dos ligantes testados. Um anticorpo de controle de isotipo não demonstrou qualquer ativação ou inibição mensurável de células IMR-32/Stat3-luc. Os ligantes ativaram células IMR-32/STAT3-luc com valores ECso de S4pM para hOSM, 23pM para hLIF e 4pM para hCNTF.
Tabela 16 Ativação e inibição de anticorpos anti-gp130 na ausência ou presença de ligantes GP130 em células IMR-32/Stat3-luc.
OSM (100pM) LIF (20pM) CNTF (20pM) Sem - P Pp Pº ligante mAb PID % de % de % de eso IM] eso IM] 1650 IM] fas, los DM) os Sem io Sem is Sem Sem mMADbIG614 |Sem Inibição| Am, [sem Inibição| pipicão Sem Inibição| pro | ativação mADIGGIS | >5,08-08 > LOBO ú > LOBO Ativação ais Sem ais Sem ais Sem Sem ia Sem ia Sem 7 Sem mMAbI16623 Sem Inibição Inibição ISem Inibição Inibição | ? 1,0E-07 22 Ativação mALIGSA6 | > 1,08-08 > 1OROS > LOBOS tivação S ia Sem S is Sem S is Sem Sem mAbI6637 |Sem Inftição| p Sem, |sem Inibição| pipicão (Sem Inibição| pão | Ativação is Sem ais Sem Sem mAbI66A! seem | a fem Infbição| pígoso fem TInibição mMAbI6646 | > 1,0E-07 > 1,0E-07 26 > 1,0E-07 30 Sem Ativação . Sem is Sem is Sem Sem mMAbI6656 |Sem Inibição| pipa, [Sem Inibição) pisos, iSemInibição| pipa, | Ativação S ia Sem S is Sem S is Sem Sem mMAbI6659 [Sem Inibição| pipicão Sem Inibição| piso |SemInibição| pipiso | Ativação S ia Sem S ia Sem S e” Sem Sem ia Sem ia Sem ia Sem Sem mMAbIG664 |Sem Inibição| pis, [Sem inibição) 1 SI fsem Inibição| pipicão | Ativação . Sem is Sem is Sem Sem mMAbIG665 |Sem Inibição| pipa, SSemInibição) pisos, iSemInibição| pipa, | Ativação S is Sem S is Sem s Sem e ia Sem S is Sem S e” Sem Sem mAbIGSTS | >5,0B-08 2,06-09 > 1087 ávaçã Ativação ii oã Sem ii oã Sem ” Sem Sem mMAbI16676 Sem Inibição Inibição Sem Inibição)| Inibição Sem Inibição| Inibição | Ativação mAbI66SO 1860? 24E-OO | so | 26E10 Ativação S e” Sem S e” Sem Sem io Sem ” Sem ” Sem Sem MAbIG683 |Sem Inibição| pipa, [Sem Inibição| pn, iSemInibição| minis, | Ativação A, io Sem io Sem io Sem Sem mAb16684 |Sem Inibição| Inibição Sem Inibição Inibição Sem Inibição| Inibição | Ativação e” Sem e” Sem e” Sem Sem mAb16687 |Sem Inibição| Inibição Sem Inibição Inibição Sem Inibição| Inibição | Ativação mMAbI6692 | 4,8E-11 1,4E-10 101 2,3E-10 100 Sem Ativação Sem Sem Sem Sem o z > > mMAbI6693 |Sem Inibição| ipa, [Sem Inibição| pn, iSemInibição| mina, | Ativação ; Sem : Sem : Sem Sem o > > > mMAb16695 |Sem Inibição| Inibição Sem Inibição| Inibição Sem Inibição| Inibição | Ativação mAb de a) Sem 11) Sem 4.2) Sem | Sem Exemplo 8: ELISA de bloqueio de anticorpos purificados GP130
[00158] GP130 (glicoproteína 130) é uma proteína transmembrana do receptor de citocina tipo I que forma um complexo ternário de alta afinidade com o fator neurotrófico ciliar do ligante (CNTF) quando está associado com a CNTFRa (subunidade alfa do receptor do fator neurotrófico ciliar). À capacidade de anticorpos anti-gp130 em bloquear a ligação de proteína GP130 ao complexo CNTFR o/CNTF ligado a placa foi medida usando um ELISA sanduíche de competição. Neste ensaio, várias concentrações de anticorpo anti-gp130 foram pré-misturadas com uma quantidade constante de proteína GP130 dimérica e a redução da ligação de gp130 devido à presença do anticorpo no complexo CNTFRo/CNTF de placa imobilizada foi monitorada.
[00159] A proteína gpl30 dimérica usada nos experimentos foi composta por uma porção do domínio extracelular de gp130 humana (aminoácidos E23-E619 do número de acesso NP 002175.2) expresso com a porção Fc da proteína IZG2a de camundongo no terminal C (hGP130-mFc; SEQ 1ID:190, mw 94,210 daltons). A proteína CNTFRa A foi comprada da R&D Systems (aminoácidos Q23-P346 de acesso 6992, mw 36,000 daltons). A proteína CNTF foi comprada da R&D Systems (aminoácidos A2- M200 de acesso tt6441.1, mw 22,800 daltons). Controle de isotipo de anticorpo, anti-Fel d 1 e anticorpo IZG4 ” humano foram incluídos como controles para detecção de fundo de IgG.
[00160] O experimento foi realizado usando o procedimento a seguir. CNTFRo humana foi revestida a uma concentração de 2 mg/mL em HBSS em uma placa de microtitulação de 96 poços durante a noite a 4ºC. Sítios de ligação não específicos foram subsequentemente bloqueados usando uma solução a 1% (p/v) de BSA em HBSS. CNTF humana a uma concentração de 1 ug/ml em HBSS foi adicionada à CNTFRa ligada à placa por 1 hora em temperatura ambiente. Em placas de diluição separadas, uma quantidade constante de 2,5nNM de proteína GP130-mFc humana foi titulada com anticorpos que variam de 3,4“pM a 200nM em diluição serial e sem anticorpo presente. Essas soluções foram incubadas por 1 hora à temperatura ambiente (RT) e posteriormente transferidas para as placas de microtitulação com complexo CNTFRo/CNTF sem lavagem. As placas foram incubadas por 2 horas em RT, lavadas com tampão PBST e hGP130-mFc ligada à placa foi detectada com um anticorpo policlonal anti-mFc conjugado com peroxidase de raiz forte (HRP) (Jackson ImmunOresearch Inc). As amostras foram desenvolvidas com uma solução TMB (BD Biosciences, substrato A e B misturados em razão de 1:1, conforme as instruções do fabricante) para produzir uma reação colorimétrica e então neutralizadas com IM ácido sulfúrico antes de medir a absorbância a 450nm em um leitor de placas Victor X5.
[00161] A análise de dados foi realizada usando um modelo de resposta à dose sigmoide dentro do software Prism!M (GraphPad). O valor ICsº calculado, definido como a concentração de anticorpo necessária para reduzir 50% da ligação GP130 ao complexo CNTFRo/CNTF, foi usado como um indicador de bloqueio de potência. O bloqueio percentual na concentração máxima testada foi calculado como um indicador da capacidade dos anticorpos de bloquear a ligação de GP1I130 a CNTFRo/CNTF na placa, conforme determinado a partir da curva de dose. A razão da redução no sinal observado na presença da concentração mais alta testada de 200nM anticorpo, em relação à diferença entre o sinal com 2,5nM GP130 sem anticorpo (0% de bloqueio) e o sinal de fundo do anticorpo secundário conjugado com HRP sozinho (100% de bloqueio), foi subtraída do bloqueio de 100%.
[00162] Os resultados do ELISA de bloqueio são mostrados na Tabela 17 com porcentagens de bloqueio na presença de 200nM anticorpo relatado para todos os anticorpos. Os valores ICs,o são relatados apenas para anticorpos que bloqueiam >30% da ligação GP130 à CNTFRo/CNTF.
Dezenove dos vinte e seis anticorpos a-GP130 bloqueiam <30% da ligação de proteína GP130 a CNTFRo/CNTF.
Números negativos indicam um aumento da ligação GP130 detectada na presença de anticorpo.
Sete anticorpos bloquearam a ligação da proteína GP130 a CNTFRo/CNTF >30% e os valores ICs,º variaram de abaixo do limite inferior de quantificação para o ensaio de 1,25nM a 6,5nM, com quatro deles bloqueando 90% ou mais do sinal na concentração mais alta de anticorpo testada.
O anticorpo controle de bloqueio irrelevante mostrou bloqueio de 4,5% em concentrações de até 200nM.
Tabela 17: ELISA de Bloqueio de Anticorpos Purificados GP130 Identificador de nºdoLote — [Bloqueio Máximo| Potência de Bloqueio de Anticorpo de Anticorpo de Anticorpo à | 2,5nM hGP130-mFc ligando-se ao 200nM (%) complexo CNTFR/CNTF ligado à placa (M) | mABIG6GIA —| MAbISGIZLI | ais |O mabi6a2 — | MABIGSZLI | BI [o | mAbIG623 —| MAbIG6A3ZTLI | 49d | mAPBIG637 —| MAbIG637TLI | 3886 [| | maAbIG64I —| MAbISGAILI | ago | | maAbI6646 — | MAbIGGA6LI | sa | | maAbI66S6 — | MAbIG6S6LI | aa | | mabi668ão — | MAbIG6BOLI | aos | mabi6682 — | MAbIG6B2LI |U 339 | mabi6683 —| MAbIG6B3ZLI | aaa | mabi6684 — | MAbIGGBATa | aa | mabi6687z —| MAbIG6B7ZEI |U go | mabi6693 —| MAbIG6I3ZLI |U Ago | mabi669s — | MAbIG69STI | aa | maAbI67OZ —| MAbI67O2TLI | 2a | Pa LP | hIgG4 Neste Exemplo, o bloqueio de 100% é igual ao valor de OD450nm de anticorpo secundário conjugado com HRP sem GP130. 0% de bloqueio é o valor de OD450nm com 2,5nM hGP130-mFc sem anticorpo.
A % de Bloqueio Máximo Negativo indica um aumento da ligação à GP130 detectada na presença de anticorpo.
-Os valores ICso não são quantitativos para anticorpos que bloqueiam <30% na concentração mais alta testada. *Indica valor ICso abaixo do limite inferior de quantificação de 1,25E-09M para o ensaio. Exemplo 9: Triagem biespecífica com abordagem focada em LEPR x GP130.
[00163] Este Exemplo descreve a geração de anticorpos biespecíficos que se ligam ao LEPR e GP130 para a promoção da sinalização de STAT3. Tais anticorpos são referidos neste documento como “anticorpos biespecíficos LEPR x GP130”, ou “LEPR x GP130 baAbs”, “anticorpos biespecíficos anti-LEPR x anti-GP130”, ou similares. Neste Exemplo, vários braços de ligação a anti-GP130 foram pareados com quatro braços de ligação a anti-LEPR diferentes. Os anticorpos anti-LEPR usados para construir os anticorpos biespecíficos deste Exemplo são anticorpos agonistas referidos como mAb16679, mAb18445, mAb18446 e mAb 18449 (ver Pedido de Patente US Publ. nº 2017/0101477, cuja divulgação é incorporada por referência neste documento em sua totalidade). As sequências de aminoácidos e ácidos nucleicos dos domínios variáveis e CDRs dos anticorpos anti-LEPR usados neste Exemplo estão resumidas nas Tabelas 18 e 19, respectivamente. Tabela 18: Identificadores de Sequência de Aminoácidos anti-LEPR Lo o SEQBNOS = Denominação do| Anticorpo — | HCVR | HCDR1 | HCDR2 | HCDR3 || LCVR | LCDR1 | LCDR2 | LCDR3 LL mabi6szo [2 ag o a a 6 [10 [12 | 4 [16 | [10 [12 | 14 [16 | Lmabisaas | 178 | 180 [| 18 [ 18 [510 | 1x | a | 16 ) Tabela 19: Identificadores de Sequência de Ácido Nucleico anti-LEPR Lo SEQ ID NOs: Denominação do| Anticorpo | HCVR | HCDR1 | HCDR2 | HCDR3 || LCVR | LCDRI | LCDR2 | LCDR3 | o | nu [13 | 15 | mAb18449 | o ]u [13 [55
[00164] Dezoito anticorpos biespecíficos foram gerados através do pareamento de braços de ligação a anti-LEPR de mAb16679 com braços de ligação de 18 anticorpos anti-GP130 diferentes. Seis anticorpos biespecíficos adicionais foram criados pelo pareamento de braços de ligação de anticorpos anti-LEPR mAbI18449, mAbI8445 e mAbI18446 com braços de ligação anti-GP130. Métodos padrões foram usados para produzir os anticorpos biespecíficos descritos neste documento.
Todos os anticorpos biespecíficos LEPR x GP130 mostrados neste exemplo compreendem a mesma cadeia leve (“comum”) (compreendendo a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve [LCVR] da SEQ ID NO: 10 e sequências de aminoácidos CDR de cadeia leve [LCDR1, LCDR2 e LCDR3] da SEQ ID NOs: 12, 14 e 16). Os componentes dos anticorpos biespecíficos deste Exemplo estão resumidos na Tabela 20. Tabela 20: Sumário de Componentes de Anticorpos Biespecíficos LEPR x GP130. J | SEQ ID NOs: (Sequências de Aminoácidos) Domínio do Braço de Ligação ao o” anão à Anticorpo LEPR (DI) Domínio do Braço de Ligação à GP130 (D2) biespecífico | DI- DI- DI- D2- HCVR |HCDRI1 HCDR2 DI-HCDR3|[D2-HCVR| HCDR1 [D2-HCDR2 D2-HCDR3 o mMAb16679 mAb 16614 bsapIDISOD [LET | » a mAb 16679 mAb 16618 psabioiaoD a O A 32 mAb 16679 mAb 16622 DSADIOIAID ão 9 mAb 16679 mAb 16623 [psAbIOIA2D H 46 8 mAb 16679 mAb 16636 a a E mAb 16679 mAb 16637 a a a O O 9 mAb 16679 mAb 16656 bsapiorasD aa NC TP | mAb 16679 mAb 16659 psAbIDIA6D 6, 78 E mAb16679 mAb16662 sabio a O A 88 mAb16679 mAb16664 | PSADI9IASD 2 94 96 9 mAb16679 mMAb16665 [psAbIoIAD | 8 Ti | 102 104 mAb16679 mAb16666 psabioi so a O A 17 mAb16679 mAb16669 sabio so a uu O A o mAb16679 mAb16673 bsaporlsan o Ta Ds E
Tabela 20: Sumário de Componentes de Anticorpos Biespecíficos LEPR x GP130. SEQ ID NOs: (Sequências de Aminoácidos) Domínio do Braço de Ligação a " ss... Anticarpo ominio LEPR (DD 1Bação 2º || Domínio do Braço de Ligação à GP130 (D2) biespecífico | D1- DI- DI- D2- HCVR|HCDR1 HCDR2 D1-HCDR3|[D2-HCVR| HCDR1 [D2-HCDR2)D2-HCDR3 mAbI6679 mAbI6676 esapiansoo 32] 136 mMAbI6679 mMAbI6680 psanae mo | 142 Tm | mAbI16679 mAb16682 psapaiso 188 | 150 152 | bsAb19156D | Q “2 So LL 8 1547 56 isa 160 | psAbI9757D Fe o e TE o E mAbI18449 mMAbI16666 psapTãeo 164 | 166 12 mADbI8445 mAb16683 psapaaãoo RA 160 mAbI18446 mAbI6683 psAPaIDDO 180 | 182 160 mAbI18445 mMAbI6683 psAmaTEo mm 160 mAbI18446 mMAbI6683 psApaT6ROD Exemplo 10: Cinética de ligação Biacore de anticorpos biespecíficos anti-LEPR x anti-GP130 que se ligam a diferentes reagentes GP130 medidos a 25ºC e 37ºC.
[00165] Constantes de dissociação de equilíbrio (valores Kp) para ligação de LEPR e GP130 a anticorpos biespecíficos anti-LEPR/GP130 purificados foram determinadas usando um biossensor de ressonância plasmônica de superfície em tempo real usando um instrumento Biacore 4000. Todos os estudos de ligação foram realizados em 10mM HEPES, 150mM NaCl, 3mM EDTA e 0,05% v/v de Surfactante Tween-20, pH 7,4 (HBS-ET) tampão de corrida a 25ºC e 37ºC. A superfície do sensor Biacore foi derivada primeiro pelo acoplamento da amina com um anticorpo monoclonal de camundongo anti-Fc humano (GE tBR-1008-39) para capturar anticorpos biespecíficos anti-LEPR/GP130. Estudos de ligação foram realizados nos seguintes reagentes: domínio extracelular de LEPR humano expresso com uma tag myc-myc hexahistidina C-terminal (hnhLEPR-MMH; SEQ ID NO:187),
domínio extracelular de LEPR de macaca fascicularis expresso com uma tag myc-myc-hexahistidina C-terminal (nfLEPR-MMH; SEQ ID NO: 188), domínio extracelular GP130 humano expresso com uma tag myc-myc hexahistidina C-terminal (hGP130-MMH; SEQ ID NO:191), e domínio extracelular GPI30 de macaca fascicularis expresso com uma tag myc-myc-hexahistidina C-terminal (mfGP130-MMH; SEQ ID NO:194). Diferentes concentrações de reagentes LEPR ou GP130 foram primeiro preparadas em tampão de corrida HBS-ET (100nM -— 3,7nM,; diluição em série de 3 vezes) e injetadas sobre uma superfície do anticorpo biespecífico anti-LEPR/GP130 capturado com anti-Fc humano por 4 minutos a uma vazão de 30uL/minuto, enquanto a dissociação de anticorpo biespecífico ligado ao reagente LEPR ou GP130 foi monitorada por 10 minutos em tampão de corrida HBS-ET. As constantes de taxa de associação (K,) e dissociação (kg) cinéticas foram determinadas pelo ajuste de sensorgramas de ligação em tempo real a um modelo de ligação de 1:1 com limitação de transporte de massa usando o software de ajuste de curva Scrubber 2.0c. As constantes de equilíbrio de dissociação de ligação (Kp) e meia-vida dissociativa (t42) foram calculadas a partir das taxas cinéticas como: kd n2) Ko (M)=k1, e tt (min)=60*kd,
[00166] Parâmetros de cinética de ligação para ligação de hLEPR-MMH, mfíLEPR-MMH, hGPI30-MMH ou mIGPI30-MMH a diferentes anticorpos biespecíficos anti-LEPR/GP130 da invenção a 25ºC e 37ºC são mostrados nas Tabelas 21 a 28. Tabela 21 Parâmetros cinéticos de ligação de hLEPR-MMH ligando-se a anticorpos biespecíficos anti-LEPR/GP130 a 25ºC Nível d 100nM Anticorpo captura de NhLEPR-M ka ka Ko» P biespecífico MH Ligado (UMs) (Us) [60] (min) mAB(RU) | go) 7,36E-09 | 64 5,91E-09 | 77
Tabela 21 Parâmetros cinéticos de ligação de hLEPR-MMH ligando-se a anticorpos biespecíficos anti-LEPR/GP130 a 25ºC Nível de | 2O09M Anticorpo captura de hLEPR-M ka ka K»r tá biespecífico mAB (RU) P Ps (Ms) (1s) MM) (min) 731E-09 | 64 648E-09 | 73 6,62E-09 | 70
8.16E-09 | 64 7,95E-09 | 64 6,36E-09 | 76 7,85E-09 | N LO6E-07 | 31 *NB indica que nenhuma ligação foi observada sob as condições experimentais atuais. Tabela 22 Parâmetros cinéticos de ligação de hLEPR-MMH ligando-se a anticorpos biespecíficos anti-LEPR/GP130 a 37ºC. Nível de | 100nM Anticorpo captura de hLEPR-M ka ka Kr [52] biespecífico MH Ligado) (1/Ms) (1/s) (M) (min) mAB (RU) (RU)
Tabela 22 Parâmetros cinéticos de ligação de nLEPR-MMH ligando-se a anticorpos biespecíficos anti-LEPR/GP130 a 37ºC. Nível de | 100nM Anticorpo captura de hLEPR-M ka ka K» va biespecífico MH Ligado) (1I/Ms) (1/s) (M) (min) mAB (RU) (RU) Isotipo *NB indica que nenhuma ligação foi observada sob as condições experimentais atuais.
[00167] A 25ºC, anticorpos biespecíficos anti-LEPR/GP130 se ligaram a hLEPR-MMH com valores de Kp variando de 5,91nNM a 106nM, conforme mostrado na Tabela 21. A 37ºC, anticorpos monoclonais anti-LEPR da invenção se ligaram a nLEPR-MMH com valores de Kp que variam de 16,2nM a 726nM, conforme mostrado na Tabela 22. Tabela 23 Parâmetros cinéticos de ligação de mILEPR-MMH ligando-se a anticorpos biespecíficos anti-LEPR/GP130 em 25ºC. 100nM Anticorpo Nível de =| miLEPR- ka ka Kr [2 biespecífico captura de | MMH (UMs) As) WD) (min) mAB (RU) Ligado (RU) 2,86E-09 | 93 2,74E-09 | 92 | bsabioisaD | 45543 | 194 | 411604 | 124E04 | 302E09 | 93 2,75E-09 | 94 2,96E-09 | 92 87 1C 10 [ bsaba1237D | 190+06 [ 16 | 308Ex04 | 116603 | 378E08 | 10 |
88 /102 Tabela 23 Parâmetros cinéticos de ligação de mILEPR-MMH ligando-se a anticorpos biespecíficos anti-LEPR/GP130 em 25ºC. 100nM Anticorpo Nível de — | mfLEPR- ka ka Kr vs biespecífico captura de | MMH (UMs) As) MW) (min) mAB(RU) | Ligado (RU) *NB indica que nenhuma ligação foi observada sob as condições experimentais atuais, *IC indica que o sinal de ligação observado foi menor que três vezes acima da ligação não específica observada para a superfície do anticorpo de controle do isotipo e/ou os dados não podem ser usados para medir os parâmetros cinéticos de ligação. Tabela 24: Parâmetros cinéticos de ligação mILEPR-MMH ligando-se a anticorpos biespecíficos anti-LEPR/GP130 a 37ºC. 100nM Anticorpo Nível de — | mfLEPR- ka ka K» A biespecífico captura de | MMH (UMs) as) M) (min) mAB(RU) | Ligado (RU) *NB indica que nenhuma ligação foi observada sob as condições experimentais atuais. *IC indica que o sinal de ligação observado foi menor que três vezes acima da ligação não específica observada para a superfície do anticorpo de controle do isotipo e/ou os dados não podem ser usados para medir os parâmetros cinéticos de ligação.
[00168] A 25ºC, 21 dos 22 anticorpos biespecíficos anti-LEPR/GP130 da invenção se ligaram a mfLEPR-MMH com valores de Kp que variam de 2,63nNM a 583nNM, conforme mostrado na Tabela 23. A 37ºC, 20 dos 22 anticorpos biespecíficos anti-LEPR/GP1I30 da invenção se ligaram a mILEPR-MMH com valores de Kp que variam de 5,05nM a 284nM, conforme mostrado na Tabela 24. Tabela 25: Parâmetros cinéticos de ligação de hGP130-MMH ligando-se a anticorpos biespecíficos anti-LEPR/GP130 a 25ºC. : Nível de 100nM Anticorpo captura de hGP130-M ka ka Kr [52] biespecífico MH Ligado! (UMs) (1s) (M) (min) mAB (RU) (RU) | bsabio1i390D | 168+03 | 6 [| 1 [e | eo || 4 18 19 1 | bsabioiasD | 18606 | 6 [| o Page ae ec
0.5 4 *NB indica que nenhuma ligação foi observada sob as condições experimentais atuais. *IC indica que o sinal de ligação observado foi menor que três vezes acima da ligação não específica observada para a superfície do anticorpo de controle do isotipo e/ou os dados não podem ser usados para medir os parâmetros cinéticos de ligação. Tabela 26: Parâmetros cinéticos de ligação de hGP130-MMH ligando-se a anticorpos biespecíficos anti-LEPR/GP130 a 37ºC. Nível de 100nM Anticorpo captura de hGP130-M ka ka K»r va biespecífico MH Ligado)| (UMs) (Us) MM) (min) mAB (RU) (RU) | psabioisoD | 230+05 | 19 | 829605 | 120601 | 144607 | 01 |
Tabela 26: Parâmetros cinéticos de ligação de hGP130-MMH ligando-se a anticorpos biespecíficos anti-LEPR/GP130 a 37ºC. Nível de 100nM Anticorpo hGP130-M ka ka Kr vs biespecífico captura de ur Ligado) (UMs) /s) MW) (min) mAB (RU) (RU) *NB indica que nenhuma ligação foi observada sob as condições experimentais atuais. *IC indica que o sinal de ligação observado foi menor que três vezes acima da ligação não específica observada para a superfície do anticorpo de controle do isotipo e/ou os dados não podem ser usados para medir os parâmetros cinéticos de ligação.
[00169] A 25ºC, 17 dos 22 anticorpos biespecíficos anti-LEPR/GP130 da invenção se ligaram a hGP130-MMH com valores de Kp que variam de 448hM a 219nM, conforme mostrado na Tabela 25. A 37ºC, 17 dos 22 anticorpos biespecíficos anti-LEPR/GP130 se ligaram a hGP130-MMH com Kp valores variando de 901pM a 358hM, conforme mostrado na Tabela 26. Tabela 27 Parâmetros cinéticos de ligação de mfGP130-MMH ligando-se a anticorpos biespecíficos anti-LEPR/GP130 a 25ºC. 100nM Anticorpo Nível de — | mfGP130- ka ka Kr [2 biespecífico — | fapturade | MMH | qu, Vs) MD) (min) mAB (RU) Ligado (RU) | psabioi3aD | 168+x03 | 6 [| 1 | 1 | 16 |1 | | psabioissD | 186x06 | 6 | 1 | 1 | 16 |1 |
Tabela 27 Parâmetros cinéticos de ligação de mIGP130-MMH ligando-se a anticorpos biespecíficos anti-LEPR/GP130 a 25ºC. 100nM Anticorpo Nível de — | mfGP130- ka ka Kr A biespecífico captura de | MMH (UMs) Us) MM) (min) mAB (RU) Ligado (RU) | psari97S7D | 17505 | 15 | 108e%oS | 2046E-02 | 188E-07 | 06 | *NB indica que nenhuma ligação foi observada sob as condições experimentais atuais. *IC indica que o sinal de ligação observado foi menor que três vezes acima da ligação não específica observada para a superfície do anticorpo de controle do isotipo e/ou os dados não podem ser usados para medir os parâmetros cinéticos de ligação.
Tabela 28 Parâmetros cinéticos de ligação de mIGP130-MMH ligando-se a anticorpos biespecíficos anti-LEPR/GP130 a 37ºC. 100nM Anticorpo Nível de — | mfGP130- ka ka K» DA biespecífico captura de | MMH (Ms) as) M) (min) mAB (RU) Ligado (RU) | psabi9ioD | 22905 | 14 | 797605 | 146601 | 183E07 | 01 | | psari9i4D | 23013 | 41 | 168E0S | 183E03 | 109608 | 6 | | psari9i4oD | 21:08 | 8 | 1 |] 1 | 1 [51 | psabi9IS3D | 23+03 | 32 | 284605 | 123E03 | 433609 | 9 | | psarai236D | 285221 | 18 | 698E04 | 125E-02 | 179607 | 09 | *NB indica que nenhuma ligação foi observada sob as condições experimentais atuais. *IC indica que o sinal de ligação observado foi menor que três vezes acima da ligação não específica observada para a superfície do anticorpo de controle do isotipo e/ou os dados não podem ser usados para medir os parâmetros cinéticos de ligação.
[00170] A 25ºC, 17 de 22 anticorpos biespecíficos LEPR x GP130 da invenção se ligaram a mfGP130-MMH com valores Kp variando de 513pnM a 188hM, conforme mostrado na Tabela 27. A 37ºC, 16 de 22 anticorpos biespecíficos LEPR x GP130 da invenção se ligaram a mfGP130-MMH com valores de Kp variando de 959pM a 450nM, conforme mostrado na Tabela 28. Exemplo 11: Ligação Celular de Anticorpo Biespecífico LEPR x GP130 Medida pela Análise FACS
[00171] A fim de avaliar a ligação celular por anticorpos biespecíficos LEPRxGP130, linhagens celulares estáveis HEK293 foram geradas. Uma linhagem celular foi gerada para superexpressar GP130 humana de comprimento total de forma estável (aminoácidos 1-918 de acesso tHP40189 com leucina na posição 2 alterada para valina, uma variante natural) juntamente com um repórter de luciferase (Stat3-luciferase, Stat3-luc, SA Bioscience, HCLS-6028L) e foi triada duas vezes usando citometria de fluxo para alta expressão de GP130. Esta linhagem celular é referida doravante como “HEK293/Stat3-luc/gp130-2X Sort.” Outra linhagem celular usada neste Exemplo, conhecida doravante como “HEK293/hLEPR-GPI”, expressa de forma estável o domínio extracelular de LEPR humana (aminoácidos 22-839 do número de acesso P48357, Isoforma B) com uma tag myc-myc N-terminal e sequência de peptídeo C-terminal da carboxipeptidase M humana que orienta a adição de GPI (Glicosilfosfatidilinositol), de modo que a proteína pode ser ancorada com GPI à membrana.
[00172] Para a análise de FACS, 0,5 x 106 células/poço de células parentais HEK293, células HEK293/Stat3-luc/gp130-2X Sort e células HEK293/hLEPR-GPI, foram incubadas com 200nM de anticorpos convencionais contra GP130 ou LEPR ou com anticorpos biespecíficos LEPRxGP130, juntamente com anticorpos de controle de isotipo a 4ºC em PBS (sem cálcio e magnésio) contendo 2% FBS.
[00173] Para testar se a ligação do anticorpo anti-LEPR ou a ligação do anticorpo biespecífico LEPRXGP130 às células foi afetada pela presença de Leptina, 1luM Leptina humana (R&D Systems, t398-LP) foi incubada com as células por 30 minutos, seguida pela adição de anticorpos anti-LEPR ou anticorpo de controle do isotipo. Após incubação com anticorpos primários, as células foram coradas com 8 mg/mL de anticorpo secundário conjugado com Alexa —“Fluor&-647 (Jackson ImmunOresearch Laboratories Inc. t109-607-003) por 30 minutos. As células foram fixadas usando BD CytoFixTM (Becton Dickinson, tt554655) e analisadas em um Citômetro de Fluxo IQue& (Intellicyt). Controles de anticorpos não corados e secundários apenas também, foram testados para todas as linhagens celulares. Os resultados foram analisados usando os softwares ForeCyt& (IntelLicyt) e FlowJo versão para determinar os meios geométricos de fluorescência para células viáveis.
[00174] Conforme mostrado na Tabela 29, dois anticorpos biespecíficos LEPRxGP130 da invenção testados a 200nM demonstraram ligação à células HEK293/gp130 2X Sort com razões de ligação de 132 e 169 vezes e ligação às células HEK293/hLEPR-GPI com razões de ligação de 4423 e 6320 vezes sem Leptina e 3596 e 5932 vezes na presença de 1 uM Leptina. O braço de ligação à GP130 dos anticorpos biespecíficos da invenção produzido como um anticorpo convencional (mAb16683) demonstrou ligação à células HEK293/gp130 2X Sort com uma razão de ligação de 235 vezes e ligação à células HEK293/hLEPR-GPI com uma razão de ligação de 21 vezes. Os braços de ligação de LEPR dos biespecíficos (mAb 18445 e mAb 18446) produzido como um anticorpo convencional demonstrou ligação à células HEK293/hLEPR-GPI com razões de ligação de 4711 e 7023 vezes sem Leptina e 4246 e 6390 vezes na presença de 1 uM Leptina. Os anticorpos convencionais e biespecíficos anti-GP130 e anti-LEPR demonstraram ligação às células parentais HEK293 com razões de ligação variando de 3 a 24 vezes. As amostras de anticorpos de controle do isotipo e de anticorpos secundários apenas também não demonstraram ligação significativa a nenhuma das linhagens celulares testadas
94 /102 com ou sem Leptina, com razões de ligação variando de 1 a 3 vezes. Tabela 29: Ligação de Anticorpo à Células Avaliadas por FACS Razão de Ligação: Amostra Normalizada a Não Corada de Cada Linhagem Celular (FLA4-A) Células Células Anticorpo e [ea gptã02 HEK293/hLEPR- HEK293/hLEPR-G| IGPI (Sem Leptina)| PI (IuM Leptina) bsAb21236 | (LEPR x GPLIO) | 13 132 | 4423 | 3596 bsAb21237 mADbI6683 (mABb anti-GP130) 17 235 21 Não testado mAB18445 x (mAb anti-LEPR, E 42 mAB18446 (mAb anti-LEPR) 6 Não testado 7023 6390 | anticorpo de controle do | 27 7 3 3 1s80tipo Anticorpo secundário apenas| 1 | Sem anticorpo a A] Nãotestado | Exemplo 12: Ensaios baseados em células funcionais.
[00175] Os receptores de citocina GP130 (aminoácidos 1-918 do número de acesso P40189) e LEPR (aminoácidos 1-1165 do número de acesso P48357) têm uma tirosina quinase não covalentemente associada, JAK2, ligada à região proximal da membrana de seus domínios citoplasmáticos. O tratamento com o ligante cognato ou anticorpo agonista culminam na ativação de JAK2, que por sua vez fosforila resíduos de tirosina chave na região citoplasmática do receptor. Os resíduos de tirosina fosforilados servem como sítios de encaixe para complexos de sinalização que, após a fosforilação, levam à estimulação das vias de sinalização, tais como STAT3 e ERK. Para LEPR, o resíduo de tirosina Y1141 media a sinalização de STAT3 e a mutação deste resíduo em fenilalanina (Y1141F) elimina a sinalização de STAT3 (Carpenter et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:6061-6066).
[00176] Um bioensaio foi desenvolvido para detectar a ativação transcricional de STAT3 através da promoção de GP130 e heterodimerização de LEPR após o tratamento com LEPR x GP130 bsAbs. Em particular, uma linhagem de células repórter que expressa estavelmente o LEPR humano mutante (Y1141F) e o GP130 humano tipo selvagem, juntamente com um repórter de luciferase sensível a STAT3 (STAT3-Luc; Qiagen CLS-6028L) foi gerada. A linhagem celular estável resultante, referida como HEK293.STAT3.Luc.GP130.hLEPR (Y1141F), foi isolada e mantida em meio DME suplementado com 10% FBS, lug/mL Puromicina, 250ug/mL de Higromicina B, 500ug/mL de G418 e Penicilina/Estreptomicina/L-Glutamina. Dois anticorpos biespecíficos LEPRxGP130 foram identificados neste bioensaio, bs Ab21236 e bsAb21237, que promoveram atividade de STAT3 na presença de leptina.
[00177] Para o bioensaio, células HEK293.STAT3.Luc.GP130.hLEPR (Y1141F) foram plaqueadas em uma densidade de 20,000 células/poço e, então, no dia seguinte o meio foi substituído por 80uL de Opti-MEM suplementado com 1% BSA e 0,1% FBS (Tampão de Ensaio). Posteriormente, 10uL de concentração fixa de 10nM de Leptina humana (hLeptin, R&D Systems, f4398-LP-O01IM) foi adicionado aos poços. Imediatamente após o tratamento de hLeptin, os anticorpos biespecíficos foram diluídos em série de meio log (12 pontos) para concentrações finais variando de S00NM a SPpM em Tampão de Ensaio e foram então adicionados às células. O controle do isotipo e OSM humana (hOSM; R&D Systems, t295-OM/CF) foram diluídos em meio log (11 pontos) a concentrações finais variando de 100nNM a IDM em Tampão de Ensaio e foram então adicionados às células. As placas foram então colocadas na incubadora durante a noite a 37ºC em 5% CO;. O reagente One-Glo (Promega, tE6051) foi então adicionado às amostras e a atividade da luciferase foi medida no Leitor de Placa Multimarcador Envision (Perkin Elmer) no modo Luminescente. Os valores de unidades de luz relativa (RLU) foram obtidos e os resultados foram analisados usando regressão não linear como o software GraphPad Prism (GraphPad). O valor de RLU máximo obtido a partir da resposta à dose de hoSM foi definido como 100% de ativação no ensaio baseado em células HEK293.STAT3.Luc.GP130.hLepR (Y1141F).
[00178] A capacidade de anticorpos biespecíficos LEPRXxGP130 de
96 / 102 ativar através da sinalização celular mediada por GP130 foi avaliada no ensaio baseado em células HEK293.STAT3.Luc.gp130.hLepR (Y1141F) e os valores ECs5,o resultante e a porcentagem de ativação são mostrados na Tabela 30. À responsividade da linhagem celular foi confirmada usando uma resposta de dose de hOSM, que demonstrou ativação no ensaio com um valor ECs, de 592pPM. Ambos os anticorpos biespecíficos LEPRxGP130 testados, bsAb21236 e bsAb21237, demonstraram ativação neste ensaio com valores ECso de 211INM e 246nM, respectivamente. Ambos os anticorpos biespecíficos têm aproximadamente 20% da ativação máxima observada com hOSM. Tabela 30 Ativação da linhagem celular HEK293.STAT3.Luc.GP130.hLEPR (YI1141F) por Anticorpos Biespecíficos LEPRXGP130
TES hOsM 5,919E-10 100%
[00179] Para confirmar que a ativação por anticorpos biespecíficos LEPRxGP130 no ensaio baseado em células HEK293.STAT3.Luc.GP130.hLEPR (YI1141F) foi devida à ativação através de LEPR e GP130, um bioensaio de competição foi realizado usando proteínas LEPR e GPI30 solúveis para bloquear a ativação pelos anticorpos biespecíficos. O bioensaio de competição utilizou uma concentração fixa em excesso, 500nM, do domínio extracelular de LEPR humana com uma tag hFc C-terminal (hLEPR-hFc; 189) e o domínio extracelular de LEPR humana com uma tag myc-myc hexahistidina C-terminal (nLEPR-MMH; SEQ ID NO: 187) o domínio extracelular de GP130 humana com uma tag hFc C-terminal (hGP130-hFc; SEQ ID NO:197) e o domínio extracelular de CNTFR humano com uma tag myc-myc-hexahistidina C-terminal (nCNTFR-MMH; SEQ ID NO:198).
[00180] Para o ensaio, células HEK293.STAT3.Luc.GP130.hLEPR
(Y1141F) foram plaqueadas na densidade de 20,000 células/poço e, então, no dia seguinte o meio foi substituído por 70uL de Opti-MEM suplementado com 1% BSA e 0,1% FBS (Tampão de Ensaio). 10uL de concentração fixa de 10OnM de Leptina humana (hLeptin; R&D Systems, t398-LP-01M) foi adicionado aos poços. Imediatamente após o tratamento de hLeptin, 1OnM dos anticorpos biespecíficos no Tampão de Ensaio foram então adicionados às células. Imediatamente após, uma quantidade excedente, 500nM, das proteínas solúveis hLEPR-hFc, hLEPR-MMH, hGP130-hFc e hfcCNRLT-MMH foram adicionadas aos poços indicados apropriados. As placas foram então colocadas na incubadora durante a noite a 37ºC em 5% CO2. O reagente One-Glo (Promega, tfE6051) foi então adicionado às amostras e a atividade da luciferase foi medida no Leitor de Placa Multimarcador Envision (Perkin Elmer) no modo Luminescente. Os valores de unidades de luz relativa (RLU) foram obtidos e os resultados foram analisados usando o software GraphPad Prism (GraphPad).
[00181] O resultado do ensaio de competição demonstrou que hLEPR-MMH e hGP130-hFc e hLEPR-hFc solúvel foram capazes de bloquear a atividade de anticorpo biespecífico enquanto hcNRLT.mmh solúvel não bloqueou a atividade dos anticorpos biespecíficos. A atividade dos anticorpos biespecíficos sozinhos é definida como 100%, enquanto que a atividade do controle de isotipo representa 0% de atividade.
[00182] A Tabela 31 abaixo mostra a ativação de células HEK293.STAT3.Luc.GP130.hLEPR por anticorpos biespecíficos na presença de LEPR, GP130 e CNTFR humano solúvel. A Tabela 32 mostra a produção de RLU na presença de hLEPR-MMH, hLEPR-hFc, hGP130-hFc ou hCNTFR-MMH. Tabela 31 Ativação de células HEK293.STAT3.Luc.GP130.hLEPR (Y1141F) por anticorpos biespecíficos LEPR x GP130 na presença de LEPR, GP130 e CNTFR humanos solúveis Anticorpo biespecífico RLU na IRLU na presença| RLU na RLU na Tampão de presença de | de hLEPR-hFc | presençade | presença de Ensaio NLEPR-MMH | [500 nM] NGP130-hFc JhCNTFR-MMH [500 nM] [500 nM] [500 nM]
98 /102 bsAb21237 | 11280 | 11800 | 10480 | 9480 | 14320 39920 | 43400 | 44920 | 38080 e o ejes| Isotipo Tabela 32 Ativação de células HEK293.STAT3.Luc.GP130.hLEPR (Y1141F) por anticorpos biespecíficos LEPR x GP130 na presença de LEPR, GP130 e CNTFR humanos solúveis Anticorpo RLU na RLU na RLUna |RLU na presença Tampão de biespecífico | presençade | presençade | presença de de Ensaio NLEPR-MMH | hLEPR-hFc | hGP130-hFc |hCNTFR-MMH [500 nM] [500 nM] [500 nM] [500 nM] Controle de 0% Isotipo Exemplo 13: Eficácia in vivo de anticorpos biespecíficos LEPR x GP130 bsAb21236 e bsAb21237 em camundongos obesos induzidos por dieta.
[00183] Os efeitos de dois anticorpos biespecíficos LEPR x GP130 da invenção, bsAb21236 e bsAb21237, no peso corporal foram determinados em um modelo in vivo usando uma dieta com alto teor de gordura oferecida a camundongos LEPRHu/Hu;IL6STHu/Hu, que expressam um receptor de leptina composto pela sequência de domínio extracelular de LEPR humana no lugar da sequência de domínio extracelular de LEPR murina e uma proteína GP130 composta pela sequência de domínio extracelular de ILSST humano no lugar da sequência de domínio extracelular de IL6ST murino.
[00184] No dia O, vinte e três camundongos machos LEPRHu/Hu;IL6STHu/Hu que foram alimentados com uma dieta com alto teor de gordura por 12 semanas foram randomizados em três grupos de 7 a 8 camundongos com base no peso corporal. No dia O e 7, cada grupo recebeu através de injeção subcutânea uma dose de anticorpo de controle de isotipo a 30 mg/kg, bsAb21236 a 30 mg/kg ou bsAb21237 a 30 mg/kg. O anticorpo de controle de isotipo usado não se liga a nenhuma proteína de camundongo conhecida. O peso corporal de cada camundongo foi medido diariamente pela duração do estudo. A alteração percentual no peso corporal do dia O foi calculada para cada animal em cada momento medido. A Figura | resume a alteração percentual média no peso corporal para animais em cada grupo de tratamento. Todos os resultados são expressos como média + SEM.
99 /102
[00185] Conforme — mostrado — na Figura 1, camundongos LEPRHu/Hu;IL6STHu/Hu tratados com bsAb21236 a 30 mg/kg exibiram reduções significativas na alteração percentual de peso corporal começando em três dias após o tratamento com anticorpo e em outros momentos subsequentes medidos em comparação com camundongos injetados com anticorpo de controle de isotipo. Camundongos LEPRHu/Hu;IL6STHu/Hu tratados com bsAb21237 a 30 mg/kg exibiram uma redução significativa na alteração percentual de peso corporal começando em cinco dias após o tratamento com anticorpo e em outros momentos subsequentes medidos em comparação com camundongos injetados com anticorpo de controle de isotipo.
Exemplo 14: Ativação transcricional de STAT3 através da promoção de heterodimerização de GP130 e LEPR (forma curta) após tratamento com LEPR x GP130 bsAbs
[00186] GP130 serve um co-receptor para múltiplas citocinas e é expresso amplamente em tecidos humanos (Taga T., Kishimoto T. gpl30 e a família de citocinas da interleucina-6. Annu. Rev. Immunol, 1997; 15:797-819). As isoformas do LEPR são geradas através de splicing alternativo, resultando em uma isoforma longa b (LEPR-b) e várias formas curtas, incluindo isoforma a (LEPR-a) que mostra o padrão de expressão mais alto e mais amplo (Tartaglia LA. The leptin receptor. J] Biol Chem 1997; 272: 6093-6096). Todas as isoformas compartilham o mesmo domínio extracelular, região transmembrana e um curto estiramento do domínio citoplasmático, contendo a região da Box 1, seguida por uma região variável. A forma longa contém motivos de sequência intracelular necessários para mediar todas as capacidades de sinalização da leptina, enquanto que as formas curtas não possuem essas regiões. Uma vez que o domínio extracelular das formas curtas é idêntico à forma longa apta à sinalização, os anticorpos biespecíficos podem se ligar às formas curtas e gerar complexos com GP130. O tecido alvo pretendido primário para agonistas de LEPR em geral (incluindo moléculas de ligação a antígeno biespecíficas LEPRXGP130) é o cérebro onde LEPR na isoforma b é predominantemente expresso. Dada a ampla expressão de GP130 e isoforma a de LEPR, no entanto, existiu o potencial para ativação de STAT3 indesejada em tecidos tais como o fígado.
[00187] A fim de avaliar os resultados de sinalização resultantes da complexação da isoforma curta de LEPR a e GP130, um bioensaio foi desenvolvido para detectar a ativação transcricional de STAT3 por meio da promoção da heterodimerização de GP130 e LEPR (forma curta) após tratamento com LEPR x GP130 bsAbs. Em particular, uma linhagem de células repórter que expressa de forma estável a forma curta dominante de LEPR (NP 001003679.1), a ser referida como hLEPR(a), e GP130 humana tipo selvagem, juntamente com um repórter de luciferase sensível a STAT3 (STAT3-Luc; Qiagen CLS-6028L) foi gerada. A linhagem celular estável resultante, referida como HEK293.STAT3.Luc.GP130.hLEPR(a), foi isolada e mantida em meio DME suplementado com 10% de FBS, lug/mL Puromicina, 250ug/mL de Higromicina B, 500ug/nL de G418 e Penicilina/Estreptomicina/L-Glutamina.
[00188] Para o bioensaio, células HEK293.STAT3.Luc.GP130.hLEPR (a) foram plaqueadas em uma densidade de 20,000 células/poço e, então, no dia seguinte o meio foi substituído por 80uL de Opti-MEM suplementado com 1% BSA e 0,1% FBS (Tampão de Ensaio). Posteriormente, 10uL de concentração fixa de 10nM de Leptina humana (hLeptin; R&D Systems, t%398-LP-01M) foi adicionado aos poços. Imediatamente após o tratamento de hLeptin, os anticorpos biespecíficos foram diluídos em série de meio log (12 pontos) para concentrações finais variando de 500nM a 5pM em Tampão de Ensaio e foram então adicionados às células. Como controles, a leptina humana e OSM (hOSM; R&D Systems, t:295-OM/CF) foram diluídos em meio log (11 pontos) a concentrações finais variando de 100nM a 1pM no Tampão de Ensaio e foram então adicionados às células. As placas foram então colocadas na incubadora durante a noite a 37ºC em 5% CO;,. O reagente One-Glo (Promega, tE6051) foi então adicionado às amostras e a atividade da luciferase foi medida no Leitor de Placa Multimarcador Envision (Perkin Elmer) no modo Luminescente. Os valores de unidades de luz relativa (RLU) foram obtidos e os resultados foram analisados usando regressão não linear com o software GraphPad Prism (GraphPad). O valor de RLU máximo obtido a partir da resposta à dose de hOSM foi definido como 100% de ativação no ensaio com base em células HEK293.STAT3.Luc.GP130.hLEPR (a).
[00189] A capacidade de anticorpos biespecíficos LEPR x GP130 de ativar através da sinalização celular mediada por GP130 foi avaliada no ensaio com base em célula HEK293.STAT3.Luc.gp130.hLEPR (a) e as respostas resultantes são mostradas na Tabela 33. A responsividade da linhagem celular foi confirmada usando uma resposta de dose de hoSM, que demonstrou ativação no ensaio com um valor ECso de 121pM e sua resposta máxima foi escolhida como 100% de ativação. Ambos os anticorpos biespecíficos LEPR x GP130 testados, bs Ab21236 e bsAb21237, falharam em ativar a sinalização de STAT3 com LEPR(a). Semelhante à leptina, as proteínas de ligação a antígeno biespecíficas da presente invenção geram sinalização de STAT3 produtiva apenas em tipos celulares contendo a forma longa de LEPR.
Tabela 33: Ativação de linhagem celular HEK293.STAT3.Luc.GP130.hLEPR (a) por Anticorpos Biespecíficos LEPR x GP130 Porcentagem de ativação Molécula testada ECso (M) máxima em comparação com hosM (bsAb21236 + 1OnM leptina| Semativação | ———Semativição = =
[00190] Em resumo, os dados mostram que os anticorpos biespecíficos
LEPRxXGP130 fornecidos neste documento não ativam a sinalização através da “forma curta” do receptor de leptina (isoforma a de LEPR), mas ativam a sinalização através da “longa forma” do receptor de leptina (isoforma b de LEPR). A relevância desta constatação é que sugere que estes anticorpos biespecíficos exercem sua atividade principalmente no cérebro, onde a isoforma 'b' é predominantemente expressa, mas não em outros tecidos, tais como o fígado, onde a forma “a” é amplamente expressa. Dado que estes anticorpos biespecíficos podem ser usados para tratar a obesidade através da ativação de sinalização de LEPR no cérebro, este trabalho confirma que os anticorpos biespecíficos fornecidos neste documento são eficazes no direcionamento da sinalização de leptina para onde é necessária (no cérebro) enquanto se evita uma sinalização indesejada em outros lugares no corpo (tal como o fígado, por exemplo, em adenoma hepatocelular inflamatório (ver Rebouissou et al., Nature Letters, 457(8): 200-205, 2009)).
[00191] A presente invenção não deve ser limitada no escopo pelas modalidades específicas descritas neste documento. De fato, várias modificações da invenção além daquelas descritas neste documento tornar-se-ão evidentes aos versados na técnica a partir da descrição anterior e das figuras anexas. Essas modificações destinam-se a estar dentro do escopo das reivindicações anexas.

Claims (31)

REIVINDICAÇÕES
1. Molécula de ligação a antígeno biespecífica isolada, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) um primeiro domínio de ligação a antígeno (D1) que se liga à GP130 humana; e (b) um segundo domínio de ligação a antígeno (D2) que se liga ao receptor da leptina humana (LEPR).
2. Molécula de ligação a antígeno biespecífica isolada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que DI e/ou D2 compreendem um domínio variável de imunoglobulina.
3. Molécula de ligação a antígeno biespecífica isolada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que DI e/ou D2 compreendem uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina (HCVR) e uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina (LCVR).
4. Molécula de ligação a antígeno biespecífica isolada de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um componente de multimerização que conecta D] com D2.
5. Molécula de ligação a antígeno biespecífica isolada de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o componente de multimerização compreende uma porção Fc de uma imunoglobulina.
6. Molécula de ligação a antígeno biespecífica isolada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que D1 é derivado de um anticorpo anti-GP130 que exibe uma ou mais propriedades selecionadas do grupo constituído por: (1) se liga à GP130 monomérica humana a 25ºC com um Kp de menos de cerca de 50 nM, conforme medido pela ressonância plasmônica de superfície; (1) se liga à GPI30 de macaco, mas não se liga substancialmente à GP130 de rato ou de camundongo, conforme determinado pela ressonância plasmônica de superfície; (111) não inibe a sinalização mediada por ligante GP130 em um ensaio de sinalização GP130 baseado em células; e (iv) não ativa a sinalização GP130 na ausência de um ligante GP130.
7. Molécula de ligação a antígeno biespecífica isolada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que D2 é derivado de um anticorpo anti-LEPR que exibe uma ou mais propriedades selecionadas do grupo constituído por: (1) se liga ao LEPR monomérico humano a 25ºC com um Kp de menos de cerca de 110 nM, conforme medido pela ressonância plasmônica de superfície; e (11) potencializa a sinalização mediada por leptina in vitro.
8. Molécula de ligação a antígeno biespecífica isolada de acordo com qualquer uma das reivindicações | a 7, caracterizada pelo fato de que a molécula de ligação a antígeno biespecífica exibe uma ou mais propriedades selecionadas do grupo constituído por: (1) se liga ao LEPR monomérico humano a 25ºC com um Kp de menos de cerca de 110 nM conforme medido pela ressonância plasmônica de superfície; (11) se liga ao LEPR monomérico humano a 25ºC com um ty, de mais de cerca de 3 minutos, conforme medido pela ressonância plasmônica de superfície; (ii) se liga à GP130 monomérica humana a 25ºC com um Kp de menos de cerca de 150 nM conforme medido pela ressonância plasmônica de superfície; (iv) se liga à GP130 monomérica humana a 25ºC com um ty, de mais de cerca de 2,5 minutos, conforme medido pela ressonância plasmônica de superfície; (v) se liga ao LEPR de macaco; (vi) se liga à GP130 de macaco; (vii) se liga à células que expressam LEPR humana na presença ou ausência de leptina conforme medido pela FACS; (viii) ativa GP130 em um ensaio baseado em células com uma potência que é pelo menos 20% ou maior do que a ativação mediada pela oncostatina M humana sob as mesmas condições de ensaio experimentais ou em condições de ensaio experimentais semelhantes; e (ix) causa uma redução no peso corporal quando administrado em uma dose terapeuticamente eficaz a um animal.
9. Molécula de ligação a antígeno biespecífica isolada de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizada pelo fato de que DI compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (DI -HCDR1, DI-HCDR2 e DI-HCDR3) de uma região variável de cadeia pesada (DI-HCVR) compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 154 e três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (DI-LCDRI1, DI-LCDR2 e DI-LCDR3) de uma região variável de cadeia leve (DI-LCVR) compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:
10.
10. Molécula de ligação a antígeno biespecífica isolada de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que DI-HCDRI1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 156; DI-HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 158; DI-HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 160; DI-LCDRI1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12; DI-LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14; e DI-LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16.
11. Molécula de ligação a antígeno biespecífica isolada de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que DI-HCVR compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 154; e DI-LCVR compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:10.
12. Molécula de ligação a antígeno biespecífica isolada de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 11, caracterizada pelo fato de que D2 compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (D2-HCDR1, D2-HCDR2 e D2-HCDR3) de uma região variável de cadeia pesada (D2-HCVR) compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada do grupo constituído por SEQ ID NOs: 2, 162, 170 e 178; e três regiões determinantes de complementariedade de cadeia leve (D2-LCDRI, D2-LCDR2 e D2-LCDR3) de uma região variável de cadeia leve (D2-LCVR) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10.
13. Molécula de ligação a antígeno biespecífica isolada de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que D2-HCVR compreende sequências de aminoácidos de D2-HCDR1, D2-HCDR2, D2-HCDR3 selecionadas do grupo constituído por SEQ ID NOs: 4, 6, 38, respectivamente; SEQ ID NOs: 164,166, 168, respectivamente; SEQ ID NOs: 172, 174, 176, respectivamente; e SEQ ID NOs: 180, 182, 184, respectivamente; e em que D2-LCVR compreende sequências de aminoácidos de D2-LCDR1, D2-LCDR2, D2-LCDR3 das SEQ ID NOs: 12, 14, 16, respectivamente.
14. Molécula de ligação a antígeno biespecífica isolada de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que D2-HCVR compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo constituído por SEQ ID NOs: 2, 162, 170 e 178; e DI-LCVR compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10.
15. Molécula de ligação a antígeno biespecífica isolada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que D2 é derivado de um anticorpo anti-LEPR que potencializa a sinalização mediada por leptina in vitro através do isoforma LEPR-b.
16. Molécula de ligação a antígeno biespecífica isolada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que D2 é derivado de um anticorpo anti-LEPR que não ativa a sinalização mediada por leptina in vitro através do isoforma LEPR-a.
17. Molécula de ligação a antígeno biespecífica isolada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a molécula de ligação a antígeno biespecífica ativa a sinalização através da isoforma b de LEPR e não ativa substancialmente a sinalização mediada por leptina através do isoforma a de LEPR.
18. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende a molécula de ligação a antígeno biespecífica isolada de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 17, e um carreador ou diluente farmaceuticamente aceitável.
19. Recipiente ou dispositivo de injeção, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ligação a antígeno biespecífica isolada ou composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 18.
20. Ácido nucleico isolado, caracterizado pelo fato de que codifica as cadeias de imunoglobulina da molécula de ligação a antígeno biespecífica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-17.
21. Vetor isolado, caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucleico de acordo com a reivindicação 20.
22. Célula hospedeira isolada, caracterizada pelo fato de que compreende a molécula de ligação a antígeno biespecífica, ácido nucleico ou vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-21.
23. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que é uma célula de ovário de hamster chinês.
24. Método para tratar uma doença ou condição, em um sujeito,
associada a, ou causada pela deficiência de leptina ou resistência à leptina, o método, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 18 a um sujeito em necessidade desta.
25. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a doença ou condição associada a, ou causada pela deficiência ou resistência à leptina é selecionada do grupo consistindo em lipodistrofias, obesidade, síndrome metabólica, desejo alimentar induzido por dieta, amenorreia hipotalâmica funcional, diabetes tipo 1, diabetes tipo 2, resistência à insulina, resistência à insulina severa devido à mutação no receptor de insulina, doença de Alzheimer, deficiência de leptina, resistência à leptina, síndrome de Leprechaunismo/Donohue e síndrome de Rabson-Mendenhall.
26. Método para tratar uma condição de lipodistrofia em um sujeito, o método, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 18 a um sujeito em necessidade desta, em que a condição de lipodistrofia é selecionada do grupo consistindo em lipodistrofia generalizada congênita, lipodistrofia generalizada adquirida, lipodistrofia parcial familiar, lipodistrofia parcial adquirida, lipodistrofia abdominal centrífuga, lipoatrofia anular, lipodistrofia localizada e lipodistrofia associada ao HIV.
27. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 24 a 26, caracterizado pelo fato de que compreende ainda administrar um segundo agente terapêutico ao sujeito, em que o segundo agente terapêutico é selecionado do grupo consistindo em uma leptina humana recombinante, um inibidor de PCSKO9, uma estatina, ezetimibe, insulina, uma variante de insulina, um secretagogo de insulina, metformina, uma sulfonilureia, um inibidor de cotransportador de glicose sódica 2 (SGLT2), um agonista/análogo de GLP-1, um inibidor de glucagon (GCG), um inibidor de receptor de glucagon (GCGR), um inibidor de proteína similar a angiopoietina (ANGPTL), Fentermina,
TI Orlistat, Topiramato, Bupropiona, Topiramato/Fentermina, Bupopiona/Naltrexona, Bupropiona/Zonisamida, —Pramlintida/Metrelepina, Lorcaserina, Cetilistat, Tesofensina e Velneperite.
28. Método para produzir uma molécula de ligação a antígeno biespecífica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-17, ou uma cadeia de imunoglobulina desta, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) introduzir um ou mais polinucleotídeos que codificam uma cadeia de imunoglobulina da referida proteína de ligação a antígeno em uma célula hospedeira; (b) cultivar a célula hospedeira sob condições favoráveis à expressão do polinucleotídeo; e (c) opcionalmente, isolar a proteína de ligação a antígeno ou cadeia de imunoglobulina a partir da célula hospedeira e/ou meio em que a célula hospedeira é cultivada.
29. Molécula de ligação a antígeno biespecífica ou cadeia de imunoglobulina, caracterizada pelo fato de que é um produto do método de acordo com a reivindicação 28.
30. Método para administrar uma molécula de ligação a antígeno biespecífica isolada ou composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-17, 18 ou 29, a um sujeito, caracterizado pelo fato de que compreende a injeção de referida molécula ou composição no corpo do sujeito.
31. Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que a referida molécula ou composição é injetada por via intravenosa, por via intramuscular ou subcutânea.
% de Alteração no Peso Corporal -O- Controle de isotipo; 30 mg/kg SC (N=7) “O H4H21236D; 30 mg/kg SC (N=8) O H4H121237D; 30 mg/kg SC (N=8) 4 tt = Fo————— 2 * o ' o 3 É DOM TO sacode ema e & ss NV
HH H O 2 e A CP O & E 2 E T+ dd 14 i: ido Sit: < o o". o SS 4 *
E 2 2 4 6 4 8 10 12 14 Dose Dose Tempo (dias) FIGURA 1
BR112020012011-1A 2017-12-18 2018-12-17 moléculas de ligação a antígeno biespecífica isolada e de ligação a antígeno biespecífica ou cadeia de imunoglobulina, composição farmacêutica, recipiente ou dispositivo de injeção, ácido nucleico isolado, vetor isolado, célula hospedeira isolada, métodos para tratar uma doença ou condição, para tratar uma condição de lipodistrofia em um sujeito, para produzir uma molécula de ligação a antígeno biespecífica, e, para administrar uma molécula de ligação a antígeno biespecífica isolada ou composição farmacêutica. BR112020012011A2 (pt)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762607137P 2017-12-18 2017-12-18
US62/607137 2017-12-18
US201862635406P 2018-02-26 2018-02-26
US62/635406 2018-02-26
PCT/US2018/066075 WO2019126071A1 (en) 2017-12-18 2018-12-17 Bispecific antigen binding molecules that bind leptin receptor and/or gp130, and methods of use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BR112020012011A2 true BR112020012011A2 (pt) 2020-11-24

Family

ID=65003567

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112020012011-1A BR112020012011A2 (pt) 2017-12-18 2018-12-17 moléculas de ligação a antígeno biespecífica isolada e de ligação a antígeno biespecífica ou cadeia de imunoglobulina, composição farmacêutica, recipiente ou dispositivo de injeção, ácido nucleico isolado, vetor isolado, célula hospedeira isolada, métodos para tratar uma doença ou condição, para tratar uma condição de lipodistrofia em um sujeito, para produzir uma molécula de ligação a antígeno biespecífica, e, para administrar uma molécula de ligação a antígeno biespecífica isolada ou composição farmacêutica.

Country Status (13)

Country Link
US (2) US11834500B2 (pt)
EP (1) EP3728315A1 (pt)
JP (1) JP2021509021A (pt)
KR (1) KR20200100089A (pt)
CN (1) CN111542540A (pt)
AU (1) AU2018390811A1 (pt)
BR (1) BR112020012011A2 (pt)
CA (1) CA3084385A1 (pt)
IL (1) IL275243A (pt)
MA (1) MA51289A (pt)
MX (1) MX2020006508A (pt)
SG (1) SG11202005146VA (pt)
WO (1) WO2019126071A1 (pt)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI824372B (zh) 2015-10-12 2023-12-01 美商再生元醫藥公司 活化瘦素受體的抗原結合蛋白
CA3084385A1 (en) 2017-12-18 2019-06-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Bispecific antigen binding molecules that bind leptin receptor and/or gp130, and methods of use thereof
AU2019249273A1 (en) 2018-04-06 2020-10-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of treatment using a leptin receptor agonist antibody
WO2021000251A1 (en) * 2019-07-02 2021-01-07 Shanghaitech University Antibody to leptin receptor
MX2023001491A (es) 2020-08-05 2023-03-08 Synthekine Inc Moleculas de union a gp130 y metodos de uso.
CN112190691B (zh) * 2020-09-23 2022-02-18 南方医科大学 Lifr蛋白作为非酒精性脂肪肝生物标记物及治疗靶点的应用
CN113110048B (zh) * 2021-04-13 2022-06-17 中国空气动力研究与发展中心设备设计与测试技术研究所 采用hosm观测器的非线性系统输出反馈自适应控制系统和方法
WO2024028773A1 (en) * 2022-08-03 2024-02-08 Pfizer Inc. Anti- il27r antibodies and methods of use thereof

Family Cites Families (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2898040B2 (ja) * 1990-01-26 1999-05-31 忠三 岸本 ｇｐ１３０蛋白質に対する抗体
US6451523B1 (en) 1994-09-14 2002-09-17 Interneuron Pharmaceuticals, Inc. Detection of a leptin receptor variant and methods for regulating obesity
US5912123A (en) 1994-09-14 1999-06-15 Progenitor, Inc. Detection of the leptin receptor in reproductive organs and methods for regulating reproductive biology
US5643748A (en) 1994-09-14 1997-07-01 Progenitor, Inc. HU-B1.219, a novel human hematopoietin receptor
US5856098A (en) 1994-09-14 1999-01-05 Progenitor, Inc. Detection of a leptin receptor variant
FR2733250B1 (fr) * 1995-04-21 1997-07-04 Diaclone Anticorps monoclonaux anti-gp130, et leurs utilisations
US6977240B1 (en) 1995-11-27 2005-12-20 Millenium Pharmaceuticals, Inc. Methods of using the OB receptor antibodies to treat bodyweight disorders
US6482927B1 (en) 1995-11-27 2002-11-19 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Chimeric proteins comprising the extracellular domain of murine Ob receptor
US20050019325A1 (en) 1996-01-08 2005-01-27 Carter Paul J. WSX receptor agonist antibodies
US20020193571A1 (en) 1996-01-08 2002-12-19 Paul J. Carter Wsx receptor agonist antibodies
AU2476301A (en) 1996-01-16 2001-05-24 Rockefeller University, The DB the receptor for leptin nucleic acids encoding the receptor, and uses thereof
AU1833197A (en) 1996-01-18 1997-08-11 Progenitor, Inc. Detection of a leptin receptor variant and methods for regulating obesity
ATE320479T1 (de) 1996-01-23 2006-04-15 Indevus Pharmaceuticals Inc Process zur verwendung des obese-gens und seines genprodukts zur stimulierung der entwicklung von haemotopoietischen zellen
US7067472B1 (en) 1996-06-04 2006-06-27 The Scripps Research Institute Diagnostic and therapeutic methods related to regulating energy mobilization with OB protein and OB antibodies
IT1288388B1 (it) * 1996-11-19 1998-09-22 Angeletti P Ist Richerche Bio Uso di sostanze che attivano il recettore del cntf ( fattore neurotrofico ciliare) per la preparazione di farmaci per la terapia
IL120733A0 (en) 1997-04-29 1997-08-14 Yeda Res & Dev Leptin as an inhibitor of cell proliferation
US6696411B1 (en) 1998-04-22 2004-02-24 Cornell Research Foundation, Inc. Canine erythropoietin gene and recombinant protein
US20040253242A1 (en) 2000-12-05 2004-12-16 Bowdish Katherine S. Rationally designed antibodies
FR2852397B1 (fr) 2003-03-10 2005-04-29 Utilisation des genes leprotl 1 et ob-rgrp pour le criblage de composes actifs sur la prise ou la perte de poids ou le diabete d'un sujet humain ou animal.
DE10353593A1 (de) 2003-11-17 2005-06-23 Klinikum der Universität München Großhadern-Innenstadt Leptinantagonist und Verfahren zur quantitativen Messung von Leptin
US7863240B2 (en) 2004-10-08 2011-01-04 Enzo Therapeutics, Inc. Methods and uses of leptin in hepatocellular carcinoma
US8969291B2 (en) 2004-10-08 2015-03-03 Enzo Therapeutics, Inc. Methods for decreasing leptin levels or activity for treating inflammation
EP1812038A1 (en) 2004-11-18 2007-08-01 VIB vzw Fibronectin iii domain as leptin receptor antagonists
CA2606102C (en) 2005-04-26 2014-09-30 Medimmune, Inc. Modulation of antibody effector function by hinge domain engineering
PE20071101A1 (es) 2005-08-31 2007-12-21 Amgen Inc Polipeptidos y anticuerpos
ES2398076T3 (es) 2006-06-02 2013-03-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anticuerpos de alta afinidad contra el receptor de IL-6 humano
US8652466B2 (en) 2006-12-08 2014-02-18 Macrogenics, Inc. Methods for the treatment of disease using immunoglobulins having Fc regions with altered affinities for FcγRactivating and FcγRinhibiting
GB0715216D0 (en) 2007-08-03 2007-09-12 Asterion Ltd Leptin
WO2010054010A1 (en) 2008-11-07 2010-05-14 Fabrus Llc Anti-dll4 antibodies and uses thereof
TWI452136B (zh) 2010-11-17 2014-09-11 中外製藥股份有限公司 A multiple specific antigen-binding molecule that replaces the function of Factor VIII in blood coagulation
WO2012107416A2 (en) 2011-02-10 2012-08-16 Roche Glycart Ag Improved immunotherapy
US8790651B2 (en) 2011-07-21 2014-07-29 Zoetis Llc Interleukin-31 monoclonal antibody
US20140013456A1 (en) 2012-03-16 2014-01-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Histidine Engineered Light Chain Antibodies and Genetically Modified Non-Human Animals for Generating the Same
HRP20230623T1 (hr) 2012-09-12 2023-09-29 Genzyme Corporation Polipeptidi koji sadrže fc domenu s promijenjenom glikozilacijom i smanjenom efektorskom funkcijom
TWI682941B (zh) 2013-02-01 2020-01-21 美商再生元醫藥公司 含嵌合恆定區之抗體
US20170051062A1 (en) 2014-02-18 2017-02-23 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Methods and Pharmaceutical Compositions for the Treatment of Diseases Mediated by the NRP-1/OBR Complex Signaling Pathway
AU2015343048A1 (en) * 2014-11-06 2017-05-18 Children's Research Institute, Children's National Medical Center Immunotherapeutics for cancer and autoimmune diseases
TWI824372B (zh) * 2015-10-12 2023-12-01 美商再生元醫藥公司 活化瘦素受體的抗原結合蛋白
JP7042816B2 (ja) 2016-11-08 2022-03-28 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド レプチン受容体をアンタゴナイズする抗原結合性タンパク質
CA3084385A1 (en) 2017-12-18 2019-06-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Bispecific antigen binding molecules that bind leptin receptor and/or gp130, and methods of use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
US20190185562A1 (en) 2019-06-20
US20240158497A1 (en) 2024-05-16
KR20200100089A (ko) 2020-08-25
MA51289A (fr) 2021-03-24
MX2020006508A (es) 2020-09-17
AU2018390811A1 (en) 2020-07-02
IL275243A (en) 2020-07-30
WO2019126071A1 (en) 2019-06-27
CN111542540A (zh) 2020-08-14
US11834500B2 (en) 2023-12-05
EP3728315A1 (en) 2020-10-28
CA3084385A1 (en) 2019-06-27
JP2021509021A (ja) 2021-03-18
SG11202005146VA (en) 2020-06-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI728990B (zh) 抗ｐｓｍａ抗體，結合ｐｓｍａ與ｃｄ３之雙特異性抗原結合分子，及其用途
JP7436603B2 (ja) レプチン受容体を活性化させる抗原結合タンパク質
BR112020012011A2 (pt) moléculas de ligação a antígeno biespecífica isolada e de ligação a antígeno biespecífica ou cadeia de imunoglobulina, composição farmacêutica, recipiente ou dispositivo de injeção, ácido nucleico isolado, vetor isolado, célula hospedeira isolada, métodos para tratar uma doença ou condição, para tratar uma condição de lipodistrofia em um sujeito, para produzir uma molécula de ligação a antígeno biespecífica, e, para administrar uma molécula de ligação a antígeno biespecífica isolada ou composição farmacêutica.
JP6367233B2 (ja) 抗ｐｄｇｆｒ−ベータ抗体及びそれらの使用
JP6581085B2 (ja) 抗アクチビンａ抗体及びその使用
AU2014240392A1 (en) Human antibodies to Nav1.7
KR20160131026A (ko) 항-egfrviii 항체 및 그것의 용도
MX2014011898A (es) Anticuerpos anti-hla-b*27 y usos de estos.
TW201701903A (zh) 抗人類ｇｄｆ８之抗體
KR20150084007A (ko) 항-프로키네티신 수용체 (ｐｒｏｋｒ) 항체 및 이의 용도
US11578127B2 (en) Anti-Fc epsilon-R1 alpha (FcεR1α) antibodies, bispecific antigen-binding molecules that bind FcεR1α and CD3, and uses thereof
EA041859B1 (ru) Антигенсвязывающие белки, которые активируют лептиновый рецептор
BR112015020470B1 (pt) Anticorpo monoclonal humano isolado anti-il-33 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, seus usos, molécula de ácido nucleico isolada, vetor de expressão, e composição farmacêutica

Legal Events

Date Code Title Description
B350 Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette]