ES2398076T3 - Anticuerpos de alta afinidad contra el receptor de IL-6 humano - Google Patents

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Abstract

Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente al receptor de interleucina6 humano (hlL-6R) con una Kd de 500 pM o inferior, según se mide por resonancia de plasmón superficial, en el que: (i) las CDR de la cadena pesada comprenden las SEC ID Nº: 5, 7 y 9 como CDR1, CDR2 y CDR3 de cadenapesada respectivamente, y (ii) las CDR de la cadena ligera comprenden las SEC ID Nº: 13, 15 y 17 como CDR1, CDR2 y CDR3 de cadenaligera respectivamente.

Description

Anticuerpos de alta afinidad contra el receptor de IL-6 humano
Declaración de la técnica relacionada
La interleucina 6 (IL-6) es una citocina pleotrópica producida por células inmunes y no inmunes que desempeña un papel crucial en la regulación de la respuesta inmune, reacciones de fase aguda y hematopoyesis. Se une a IL-6R soluble y unido a membrana celular (cadena e) formando un complejo binario, y este complejo es capaz de interaccionar con gp130 unida a membrana celular (cadena 1), induce la formación de un complejo de señalización que comprende dos cada uno de IL-6, IL-6R y gp130.
En los documentos US 5.670.373, 5.795.965, 5.817.790, 6.410.691 y EP 409 607B1 se describen anticuerpos contra hlL-6R. En los documentos US 5.888.510 y 6.723.319 se describen métodos terapéuticos
Breve resumen de la invención
En un primer aspecto, la invención desvela anticuerpos humanos, preferentemente anticuerpos humanos recombinantes, que se unen específicamente al receptor de interleucina 6 humano (hlL-6R). Estos anticuerpos se caracterizan por la unión a hlL-6R con gran afinidad y una cinética de disociación lenta, y por la capacidad para neutralizar la actividad de IL-6. Los anticuerpos pueden ser de longitud completa (por ejemplo, un anticuerpo IgG1 o lgG4) o pueden comprender solamente una porción de unión a antígeno (por ejemplo, un fragmento Fab, F(ab')2 o scFv), y pueden modificarse para afectar a la funcionalidad, por ejemplo, para eliminar funciones efectoras residuales (Reddy et al. (2000) J. Immunol. 164: 1925-1933). En una realización preferida, la invención proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une al receptor de IL-6 humano (SEC ID Nº: 1) con una KD de aproximadamente 500 pM o menos, según se mide por resonancia de plasmón superficial. En una realización más específica, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno tiene una KD de menos de 300 pM, o menos de 200 pM, o incluso menos de 100 pM. En diversas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo bloquea la actividad de hlL-6 con una CI50 de 250 pM o menos, según se mide por bioensayo de luciferasa. En realizaciones más específicas, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo presenta una CI50 de 150 pM o menos.
En aspectos relacionados, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención se une a hlL-6R con una afinidad al menos 2 veces superior a con la que se une a IL-6R de mono. En realizaciones más preferidas, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se une a proteína hlL-6R (SEC ID Nº: 1) con una afinidad que es hasta aproximadamente 3 veces superior respecto a su unión a IL-6R de mono (dominio extracelular de Macaca fascicularis mostrado en la SEC ID Nº: 251).
Por lo tanto, la invención proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente al receptor de interleucina 6 humano (hlL-6R) con una KD de 500 pM o menos, según se mide por resonancia de plasmón superficial, en el que:
(i)
las CDR de la cadena pesada comprenden las SEC ID Nº: 5, 7 y 9 como CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada respectivamente, y
(ii)
las CDR de la cadena ligera comprenden las SEC ID Nº: 13, 15 y 17 como CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera respectivamente
En realizaciones específicas, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende la pareja de HCVR/LCVR de la SEC ID Nº: 3/11.
En un segundo aspecto, la invención proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican un anticuerpo
o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la invención. En una realización, la molécula de ácido nucleico de la invención codifica un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende una HCVR como se ha descrito anteriormente. En realizaciones específicas, la molécula de ácido nucleico que codifica la HCVR es la SEC ID Nº: 2. En un aspecto relacionado, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una LCVR como se ha descrito anteriormente. En realizaciones específicas, la molécula de ácido nucleico que codifica la LCVR es la SEC ID Nº: 10.
La invención desvela anticuerpos anti-hlL-6R o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que tienen un patrón de glicosilación modificado. En algunas aplicaciones, puede ser útil una modificación para eliminar sitios de glicosilación no deseables, o un anticuerpo que carezca de un resto de fucosa en una cadena de oligosacárido, por ejemplo, para aumentar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) (véase Shield et al. (2002) JBC
277: 26733). En otras aplicaciones, puede realizarse una modificación de una galactosilación para modificar la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).
En aspectos adicionales, la invención proporciona vectores de expresión recombinantes que llevan las moléculas de ácido nucleico de la invención, y células hospedadoras en las que se han introducido dichos vectores, así como métodos de generación de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la invención obtenidos por cultivo de las células hospedadoras de la invención. La célula hospedadora puede ser una célula procariota o eucariota, preferentemente la célula hospedadora es una célula de E. coli o una célula de mamífero, tal como una célula CHO.
En un aspecto adicional, la invención presenta una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo humano
o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que se une específicamente a hlL-6R y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En aspectos adicionales, la invención proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo, como se ha definido anteriormente, para su uso en la atenuación o inhibición de una enfermedad o trastorno mediado por IL-6 en un ser humano, en el que la enfermedad o trastorno mediado por IL-6 es artritis, una enfermedad inflamatoria del intestino o lupus eritematoso sistémico. El trastorno se selecciona por tanto de, artritis, incluyendo artritis reumatoide crónica; una enfermedad inflamatoria del intestino, incluyendo enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa; o lupus eritematoso sistémico
En aspectos adicionales, la invención proporciona el uso de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo, como se ha definido anteriormente, en la fabricación de un medicamento para su uso para atenuar o inhibir una enfermedad o trastorno mediado por IL-6 en un ser humano, en el que la enfermedad o trastorno mediado por IL-6 es artritis, una enfermedad inflamatoria del intestino o lupus eritematoso sistémico.
Otros objetos y ventajas serán evidentes a partir de una revisión de la descripción detallada subsiguiente.
Descripción detallada
Antes de describir los presentes métodos, debe entenderse que esta invención no se limita a los métodos y condiciones experimentales particulares descritas, ya que dichos métodos y condiciones pueden variar. También debe entenderse que la terminología usada en la presente memoria es únicamente con el fin de describir realizaciones particulares, y no pretende ser limitante, ya que el alcance de la presente invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.
A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la materia a la que pertenece la invención. Aunque puede usarse cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en la presente memoria en la práctica
o ensayo de la presente invención, los métodos y materiales preferidos se describen a continuación.
La expresión "IL6R humano" (hlL-6R), como se usa en la presente memoria, pretende referirse a un receptor de citocina humano que se une específicamente a interleucina 6 (IL-6). El dominio extracelular de hlL-6R se muestra en la SEC ID Nº: 1.
El término "anticuerpo", como se usa en la presente memoria, pretende referirse a moléculas de inmunoglobulina que comprenden cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (abreviada en la presente memoria como HCVR o VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada comprende tres dominios: CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (abreviada en la presente memoria como LCVR o VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera está compuesta por un dominio (CL1). Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones flanqueantes (FR). Cada VH y VL está compuesta por tres CDR y cuatro FR, dispuestas del extremo amino-terminal al extremo carboxi-terminal en el orden siguiente: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
La expresión "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "porción de anticuerpo" o "fragmento de anticuerpo"), como se usa en la presente memoria, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad para unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo, hlL-6R). Se ha demostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo puede realizarse por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de unión incluidos dentro de la expresión "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL1 y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región de bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al. (1989) Nature 241: 544-546), que consiste en un dominio VH; y (vi) una región determinante de complementariedad aislada (CDR). Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes separados, pueden unirse, usando métodos recombinantes, mediante un enlazador sintético que permita generarlos como una sola cadena contigua en la que las regiones VL y VH se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv); véase, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Dichos anticuerpos de cadena sencilla también pretenden incluirse dentro de la expresión "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo. Se incluyen también otras formas de anticuerpos de cadena sencilla, tales como diacuerpos (véase, por ejemplo, Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA 90: 6444-6448).
Un anticuerpo "neutralizante" o "bloqueante", como se usa en la presente memoria, pretende referirse a un anticuerpo cuya unión a hlL-6R da como resultado la inhibición de la actividad biológica de hlL-6. Esta inhibición de la actividad biológica de hlL-6 puede evaluarse por medición de uno o más indicadores de actividad biológica de hlL6 conocidos en la técnica, tales como la activación celular inducida por hlL-6 y la unión de hlL-6 a hlL-6R (véanse los ejemplos a continuación).
Una "CDR" o región determinante de complementariedad es una región de hipervariabilidad intercalada dentro de regiones que están más conservadas, denominadas "regiones flanqueantes" (FR). En realizaciones diferentes del anticuerpo anti-hlL-6R o fragmento de la invención, las FR pueden ser idénticas a las secuencias de línea germinal humanas, o pueden estar modificadas de forma natural o artificial. Un grupo de CDR puede definirse como una secuencia de aminoácidos de consenso.
La expresión "resonancia de plasmón superficial”, como se usa en la presente memoria, se refiere a un fenómeno óptico que permite el análisis de interacciones a tiempo real por detección de alteraciones en las concentraciones de proteína dentro de una matriz biodetectora, por ejemplo usando el sistema BIAcore™ (Pharmacia Biosensor AB).
El término "epítopo" es un determinante antigénico que interacciona con un sitio de unión a antígeno específico en la región variable de una molécula de anticuerpo conocida como parátopo. Un solo antígeno puede tener más de un epítopo. Los epítopos pueden ser conformacionales o lineales. Un epítopo conformacional se produce por aminoácidos espacialmente yuxtapuestos de diferentes segmentos de la cadena polipeptídica lineal. Un epítopo lineal es uno producido por restos aminoacídicos adyacentes en una cadena polipeptídica. En ciertas circunstancias, un epítopo puede incluir restos de sacáridos, grupos fosforilo o grupos sulfonilo en el antígeno.
La expresión "identidad sustancial" o "sustancialmente idéntico", cuando se refiere a un ácido nucleico o fragmento del mismo, indica que, cuando está óptimamente alineado con las inserciones o deleciones de nucleótidos apropiadas con otro ácido nucleico (o su cadena complementaria), existe una identidad de secuencia de nucleótidos en al menos aproximadamente el 95% y, más preferentemente, al menos aproximadamente el 96%, 97%, 98% o 99% de las bases de nucleótidos, según se mide por cualquier algoritmo de identidad de secuencia bien conocido, tal como FASTA, BLAST o Gap, como se analizan a continuación.
Como se aplica a polipéptidos, la expresión "similitud sustancial" o "sustancialmente similar" significa que dos secuencias peptídicas, cuando están óptimamente alineadas, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT usando los pesos de huecos por defecto, comparten una identidad de secuencia de al menos el 95%, aún más preferentemente una identidad de secuencia de al menos el 98% o 99%. Preferentemente, las posiciones de restos que no son idénticas difieren por sustituciones de aminoácidos conservativas. Una "sustitución de aminoácidos conservativa" es una en la que un resto aminoacídico se sustituye por otro resto aminoacídico que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución de aminoácido conservativa no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. En casos en los que dos o más secuencias de aminoácidos difieren entre sí por sustituciones conservativas, el porcentaje de identidad de secuencia o grado de similitud puede ajustarse al alza para corregir por la naturaleza conservativa de la sustitución. Los medios para realizar este ajuste son bien conocidos por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen 1) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadenas laterales de hidroxilo alifáticas: serina y treonina; 3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; 4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptófano; 5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina e histidina; 6) cadenas laterales ácidas: aspartato y glutamato, y 7) las cadenas laterales que contienen azufre son cisteína y metionina. Los grupos de sustitución de aminoácidos conservativos preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alaninavalina, glutamato-aspartato y asparagina-glutamina. Como alternativa, una sustitución conservativa es cualquier cambio que tiene un valor positivo en la matriz de verosimilitud logarítmica PAM250 descrita en Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443 45. Una sustitución "moderadamente conservativa" es cualquier cambio que tiene un valor no negativo en la matriz de verosimilitud logarítmica PAM250.
La similitud de secuencia para polipéptidos, que también se denomina identidad de secuencia, se mide típicamente usando un software de análisis de secuencia. El software de análisis de proteína empareja secuencias similares usando medidas de similitud asignadas a diversas sustituciones, deleciones y otras modificaciones, incluyendo sustituciones de aminoácidos conservativas. Por ejemplo, el software GCG contiene programas tales como Gap y Bestfit que pueden usarse con parámetros por defecto para determinar la homología de secuencia o la identidad de secuencia entre polipéptidos estrechamente relacionados, tales como polipéptidos homólogos de diferentes especies de organismos o entre una proteína de tipo silvestre y una muteína de la misma. Véase, por ejemplo, GCG Versión 6.1. Las secuencias polipeptídicas también pueden compararse usando FASTA, usando los parámetros por defecto o recomendados, un programa en GCG Versión 6.1. FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3) proporciona alineamientos y porcentajes de identidad de secuencia de las regiones del mejor solapamiento entre las secuencias de consulta y de búsqueda (Pearson (2000) anteriormente). Otro algoritmo preferido cuando se compara una secuencia de la invención con una base de datos que contiene un gran número de secuencias de diferentes organismos es el programa informático BLAST, especialmente blastp o tblastn, usando los parámetros por defecto. Véase, por ejemplo, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 410 y Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389 402.
Preparación de anticuerpos humanos
Los métodos para generar anticuerpos humanos incluyen, por ejemplo, Velocimmune™ (Regeneran Pharmaceuticals), tecnología XenoMouse™ (Green et al. (1994) Nature Genetics 7: 13-21; Abgenix), la estrategia de "minilocus" y la presentación en fago (y véanse, por ejemplo, los documentos US 5.545.807, US 6.787.637). La tecnología Velocimmune™ (documento US 6.596.541) incluye un método de generación de un anticuerpo totalmente humano de alta especificidad contra un antígeno seleccionado. Esta tecnología implica la generación de un ratón transgénico que tiene un genoma que comprende regiones variables de cadena pesada y ligera humanas unidas operativamente a loci de la región constante de ratón endógenos, de modo que el ratón produce un anticuerpo que comprende una región variable humana y una región constante de ratón en respuesta a una estimulación antigénica. El ADN que codifica las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo se aísla y se une operativamente a ADN que codifica las regiones constantes de cadena pesada y ligera humanas. El ADN se expresa después en una célula capaz de expresar el anticuerpo totalmente humano. En una realización específica, la célula es una célula CHO.
Los anticuerpos pueden ser terapéuticamente útiles en el bloqueo de una interacción de ligando-receptor o la inhibición de la interacción del componente receptor, más que por destrucción de células a través de la fijación del complemento (citotoxicidad dependiente del complemento) (CDC) y de la participación de la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC). La región constante de un anticuerpo es importante en la capacidad de un anticuerpo para fijar el complemento y mediar la citotoxicidad dependiente de células. Por lo tanto, el isotipo de un anticuerpo puede seleccionarse basándose en si es deseable para el anticuerpo mediar la citotoxicidad.
Las inmunoglobulinas humanas pueden existir en dos formas que están asociadas con la heterogeneidad de la bisagra. En una forma, una molécula de inmunoglobulina comprende una construcción estable de cuatro cadenas de aproximadamente 150-160 kDa en la que los dímeros se mantienen unidos por un enlace disulfuro de cadena pesada intercatenario. En una segunda forma, los dímeros no están unidos por enlaces disulfuro intercatenarios y se forma una molécula de aproximadamente 75-80 kDa compuesta por una cadena pesada y ligera acopladas covalentemente (medio anticuerpo). Estas formas han sido extremadamente difíciles de separar, incluso después de purificación por afinidad. La frecuencia de aparición de la segunda forma en diversos isotipos de IgG intacta es debida a, pero sin limitación, diferencias estructurales asociadas con el isotipo de la región de bisagra del anticuerpo. De hecho, una sola sustitución de aminoácido en la región de bisagra de la bisagra de lgG4 humana puede reducir significativamente la aparición de la segunda forma (Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30: 105) hasta los niveles observados típicamente usando una bisagra de lgG1 humana. La presente invención incluye anticuerpos que tienen una o más mutaciones en la región de bisagra, CH2 o CH3 que pueden ser deseables, por ejemplo, en la producción, para mejorar el rendimiento de la forma de anticuerpo deseada.
Los anticuerpos de la invención se preparan preferentemente con el uso de la tecnología Velocimmune™. Un ratón transgénico en el que las regiones variables de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina endógenas se sustituyen con las regiones variables humanas correspondientes se expone al antígeno de interés, y se recuperan las células linfáticas (tales como células B) de los ratones que expresan anticuerpos. Las células linfáticas pueden fusionarse con una línea celular de mieloma para preparar líneas celulares de hibridoma inmortales, y dichas líneas celulares de hibridoma se exploran y se seleccionan para identificar líneas celulares de hibridoma que produzcan anticuerpos específicos contra el antígeno de interés. El ADN que codifica las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera puede aislarse y unirse a regiones constantes isotípicas deseables de la cadena pesada y la cadena ligera. Dicha proteína de anticuerpo puede producirse en una célula, tal como una célula CHO. Como alternativa, el ADN que codifica los anticuerpos quiméricos específicos de antígeno o los dominios variables de las cadenas ligera y pesada puede aislarse directamente a partir de linfocitos específicos de antígeno.
En un aspecto, el ratón transgénico comprende hasta 18 genes de cadena pesada variable humana funcionales y 12 genes de cadena ligera kappa variable humana funcionales. En otro aspecto, el ratón transgénico comprende hasta 39 genes de cadena pesada variable humana y 30 genes de cadena ligera kappa variable humana. En otro aspecto más, el ratón transgénico comprende hasta 80 genes de cadena pesada variable humana y 40 genes de cadena ligera kappa variable humana.
En general, los anticuerpos de la presente invención poseen afinidades muy elevadas, poseyendo típicamente valores de KD de aproximadamente 10-9 a aproximadamente 10-12 M, cuando se miden por su unión a antígeno inmovilizado en una fase sólida o en fase de solución.
Inicialmente, se aíslan anticuerpos quiméricos de alta afinidad que tienen una región variable humana y una región constante de ratón. Como se describe a continuación, los anticuerpos se caracterizan y se seleccionan por sus características deseables, incluyendo la afinidad de unión a hlL-6R, la capacidad para bloquear hlL-6 y/o la selectividad por la proteína humana. Las regiones constantes de ratón se sustituyen con una región constante humana deseada para generar el anticuerpo totalmente humano de la invención, por ejemplo lgG4 o lgG1 de tipo silvestre o modificada (por ejemplo, SEC ID Nº: 242, 243, 244). Aunque la región constante seleccionada puede variar de acuerdo con un uso específico, las características de unión a antígeno de alta afinidad y de especificidad de diana residen en la región variable.
Mapeo de epítopos y tecnologías relacionadas
Para explorar la búsqueda de anticuerpos que se unen a un epítopo particular, puede realizarse un ensayo rutinario de bloqueo cruzado tal como el descrito en Antibodies: A Laboratory Manual 1988 Cold Spring Harbor Laboratory, Harlow y Lane, eds. Otros métodos incluyen mutantes de barrido mediante alanina, transferencias de péptidos (Reineke (2004) Methods Mol Biol 248: 443-63) o análisis de escisión de péptidos como se describen en los ejemplos a continuación. Además, pueden emplearse métodos tales como la escisión de epítopos, la extracción de epítopos y la modificación química de antígenos (Tomer (2000) Protein Science: 9: 487-496).
La generación de perfiles asistida por modificaciones (MAP), también conocida como generación de perfiles de anticuerpos basada en la estructura del antígeno (ASAP), es un método que clasifica grandes cantidades de anticuerpos monoclonales (mAb) dirigidos contra el mismo antígeno de acuerdo con las similitudes del perfil de unión de cada anticuerpo con superficies de antígenos modificadas química o enzimáticamente (Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 2004/0101920). Cada categoría puede reflejar un epítopo único diferente de forma distintiva de, o parcialmente solapante con un epítopo representado por otra categoría. Esta tecnología permite el filtrado rápido de anticuerpos genéticamente idénticos, de modo que la caracterización puede centrarse en anticuerpos genéticamente distintos. Cuando se aplica a la exploración de hibridomas, la MAP puede facilitar la identificación de clones de hibridoma poco frecuentes con características deseadas. La MAP puede usarse para separar los anticuerpos de hlL-6R de la invención en grupos de anticuerpos que se unen a diferentes epítopos.
Los agentes útiles para alterar la estructura del antígeno inmovilizado son enzimas, tales como, por ejemplo, enzimas proteolíticas y agentes químicos. La proteína antigénica puede inmovilizarse en superficies de microplacas biodetectoras o perlas de poliestireno. Estas últimas pueden procesarse, por ejemplo, con un ensayo tal como un ensayo de detección múltiple Luminex™ (Luminex Corp., TX). Debido a la capacidad de Luminex™ para manejar un análisis múltiple con hasta 100 tipos diferentes de perlas, el Luminex™ proporciona superficies antigénicas casi ilimitadas con diversas modificaciones, dando como resultado una resolución mejorada en la generación de perfiles de epítopos de anticuerpos sobre un ensayo de biodetector.
Administración terapéutica y formulaciones
La administración de entidades terapéuticas de acuerdo con la invención se administrará con vehículos, excipientes y otros agentes adecuados que se incorporan en formulaciones para proporcionar una transferencia, administración, tolerancia y similares mejoradas. Pueden encontrarse una multitud de formulaciones apropiadas en la lista de especialidades farmacéuticas conocida por todos los químicos farmacéuticos: Remington's Pharmaceutical Sciences (15ª ed, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1975), particularmente el Capítulo 87 por Blaug, Seymour, en el mismo. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, pomadas, gelatinas, ceras, lípidos oleosos, lípidos (catiónicos o aniónicos) que contienen vesículas (tales como Lipofectin™), conjugados de ADN, pastas de absorción anhidras, emulsiones de aceite en agua y de agua en aceite, emulsiones de carbowax (polietilenglicoles de diversos pesos moleculares), geles semisólidos y mezclas semisólidas que contienen carbowax. Cualquiera de las mezclas anteriores puede ser apropiada en tratamientos y terapias de acuerdo con la presente invención, con tal de que el ingrediente activo en la formulación no se inactive por la formulación y la formulación sea fisiológicamente compatible y tolerable con la vía de administración. Véase también Powell et al. PDA (1998) J Pharm SciTechnol.
52: 238-311 y las citas en el mismo para información adicional relacionada con excipientes y vehículos bien conocidos por los químicos farmacéuticos.
Ejemplos
Los ejemplos siguientes se presentan para proporcionar a los expertos en la materia una divulgación y descripción completas de cómo preparar y usar los métodos y composiciones de la invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran su invención. Se han realizado esfuerzos para asegurar la precisión con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.), pero deberían suponerse algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique otra cosa, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio, la temperatura es en grados centígrados, y la presión es la atmósferica o próxima a esta.
Ejemplo 1. Generación de anticuerpos humanos contra el receptor de IL-6 humano.
La inmunización de roedores puede realizarse por cualquier método conocido en la técnica (véase, por ejemplo, Harlow y Lane (1988) anteriormente; Malik y Lillehoj, Antibody techniques: Academic Press, 1994, CA). En una realización preferida, el antígeno hlL-6R se administra directamente a ratones que comprenden loci de ADN que codifican tanto la región variable de cadena pesada como la región variable de cadena ligera kappa de Ig humana (Velocimmune™, Regeneron Pharmaceuticals, Inc.; documento US 6.596.541), con un adyuvante para estimular la respuesta inmune. Dicho adyuvante incluye adyuvante completo e incompleto de Freund, sistema adyuvante MPL+TDM (Sigma) o RIBI (dipéptidos de muramilo) (véase O'Hagan, Vaccine Adjuvant, por Human Press, 2000, NJ). Dicho adyuvante puede prevenir la dispersión rápida del polipéptido por secuestro del antígeno en un depósito de administración prolongada local, y puede contener factores que puedan estimular la respuesta inmune del hospedador. En una realización, el hlL-6R se administra indirectamente como un plásmido de ADN que contiene el gen de hlL-6R y que expresa hlL-6R usando la maquinaria de expresión de proteína celular del hospedador para producir polipéptido antigénico in vivo. En ambas estrategias, el programa de inmunización requiere varias administraciones separadas unas cuantas semanas. La respuesta inmune de anticuerpo se controla mediante un inmunoensayo específico de antígeno convencional. Cuando los animales alcanzaron su respuesta inmune máxima, se recogieron las células B que expresaban anticuerpo y se fusionaron con células de mieloma de ratón para preservar su viabilidad, formando células de hibridoma. Para seleccionar anticuerpos monoclonales funcionalmente deseables, se exploraron los medios acondicionados de las células de hibridoma o células transfectadas para determinar su especificidad, afinidad de unión a antígeno y potencia en el bloqueo de la unión de hlL-6 a hlL-6R (descrito a continuación).
Ejemplo 2. Anticuerpos anti-hlL6R generados por aislamiento directo de esplenocitos
El ADN que codifica dominios VH y VL puede aislarse directamente a partir de una sola célula B positiva para antígeno. En resumen, el ratón transgénico inmunizado con hlL-6Ra se sacrificó y sus esplenocitos se recogieron. Los eritrocitos se eliminaron por lisis, seguido de sedimentación de los esplenocitos recogidos. Los esplenocitos resuspendidos se incubaron primero con un cóctel de IgG humana, FITC-anti-mFc y biotina-IL6Ra durante 1 hora. Las células teñidas se lavaron dos veces con PBS, después se tiñeron con un cóctel de IgG humana y de rata, APCanti-mlgM y SA-PE durante una hora. Las células teñidas se lavaron una vez con PBS y se analizaron por citometría de flujo en un MoFlo (Cytomation). Cada célula B positiva para IgG, negativa para IgM y positiva para antígeno se separó y se sembró en placas en un pocillo separado en una placa de 96 pocillos. Se realizó una RT-PCR de genes de anticuerpo a partir de estas células B de acuerdo con un método descrito por Wang et al. (2000) (J Immunol Methods 244: 217-225). En resumen, se sintetizaron los ADNc para cada célula B individual mediante RT-PCR. Cada producto de RT resultante se dividió después y se transfirió a dos pocillos correspondientes en dos placas de 96 pocillos. Un conjunto de los productos de RT resultantes se amplificó primero por PCR usando un cebador degenerado 5' específico para la secuencia líder de la región variable de la cadena pesada de IgG humana y un cebador 3' específico para la región constante de la cadena pesada de ratón, para formar un amplicón. El amplicón se amplificó después de nuevo por PCR usando un conjunto de cebador degenerado 5' específico para la región flanqueante 1 de la secuencia de la región variable de la cadena pesada de IgG humana y un cebador 3' anidado específico para la región constante de la cadena pesada de ratón. El otro conjunto de los productos de RT resultantes se amplificó primero por PCR usando un cebador degenerado 5' específico para la secuencia líder de la región variable de la cadena ligera kappa humana y un cebador 3' específico para la región constante de la cadena ligera kappa de ratón para formar un amplicón. El amplicón se amplificó después de nuevo por PCR usando un conjunto de cebador degenerado 5' específico para la región flanqueante 1 de la secuencia de la región variable de la cadena ligera kappa humana y un cebador 3' anidado específico para la región constante da la cadena ligera kappa de ratón. Los productos de PCR de cadena pesada y cadena ligera se clonaron en vectores de anticuerpo linealizados con Sap l que contenían la región constante de cadena pesada de IgG1 y la región constante de cadena ligera kappa, respectivamente. El plásmido de cadena pesada tiene un sitio lox2272 y un sitio lox511 flanqueando los casetes de expresión de cadena pesada. Además, inmediatamente cadena abajo del lox2272 en el plásmido de cadena pesada existe un gen de resistencia a higromicina que carece de un promotor y de un ATG iniciador. El gen de resistencia a higromicina también está unido transcripcionalmente a un gen de eGFP cadena abajo mediante una secuencia de IRES. El plásmido de cadena ligera tiene un sitio loxP y un sitio lox2272 flanqueando el casete de expresión de la cadena ligera. Además, el plásmido de cadena ligera tiene un promotor de SV40 inmediatamente antes de un ATG en el sitio lox2272, de modo que tras la integración en una célula hospedadora apropiada el promotor de SV40 proximal a lox2272 y el ATG iniciador del plásmido de cadena ligera se ponen adyacentes al gen de resistencia a higromicina en el plásmido de cadena pesada en la fase de lectura apropiada, para permitir la transcripción y traducción de los genes de resistencia a higromicina y eGFP. Los plásmidos recombinantes purificados que tenían una secuencia de región variable de cadena pesada y los plásmidos que tenían una secuencia de región variable de cadena ligera de la misma célula B se combinaron y transfectaron después junto con un plásmido que expresa la recombinasa Cre, en una línea celular hospedadora CHO modificada. La línea celular hospedadora CHO modificada contiene, de 5' a 3', un sitio loxP, un eCFP, un sitio lox2272, DsRed y un sitio lox511 en un locus transcripcionalmente activo. Por consiguiente, la célula CHO hospedadora puede aislarse por citometría de flujo como una célula positiva para azul, positiva para rojo y negativa para verde. Cuando los plásmidos recombinantes que expresan genes de cadena pesada y de cadena ligera se transfectan juntos con un plásmido que expresa la recombinasa Cre, la recombinación específica de sitio mediada por la recombinasa Cre da como resultado la integración de los plásmidos de anticuerpo en el locus cromosómico que contiene los sitios lox y el reemplazo de los genes de eCFP y DsRed. Después, los recombinantes pueden aislarse como células negativas para azul, negativas para rojo y positivas para verde por citometría de flujo. Por consiguiente, las células CHO
5 transfectadas con plásmidos recombinantes que tenían una secuencia de región variable de cadena pesada y plásmidos que tenían una secuencia de región variable de cadena ligera de la misma célula B se separaron por citometría de flujo, y los recombinantes apropiados que muestran el fenotipo negativo para azul, negativo para rojo y positivo para verde se aislaron, y se establecieron líneas celulares CHO que expresaban anticuerpo recombinante a partir de los clones aislados.
Ejemplo 3. Determinación de la afinidad de unión a antígeno
La KD de la unión de antígeno a los anticuerpos seleccionados descritos anteriormente se determinó por la cinética superficial en un ensayo de resonancia de plasmón superficial de biodetector a tiempo real (BIAcore™). Más
15 específicamente, la afinidad de los anticuerpos por IL-6R humano se midió usando un BIAcore® 2000 o BIAcore® 3000. El anticuerpo se capturó en una superficie con anti-IgG de ratón y se expuso a diversas concentraciones de proteína hlL-6R recombinante en forma monomérica o dimérica. Se realizó un análisis cinético usando el software BIAevaluation™ para obtener las constantes de velocidad de asociación y disociación.
20 Las afinidades de unión de los anticuerpos a hlL-6R también se midieron para medios acondicionados de hibridoma
o proteínas purificadas mediante inmunoensayo de competición basado en placa. Las proteínas de anticuerpo se purificaron usando cromatografía de afinidad de Proteína G a partir de medio de acondicionamiento de células de hibridoma que tenía agotada la IgG bovina (lnvitrogen). Para el ELISA de competición, en resumen, se premezclaron cantidades constantes de anticuerpo a diferentes niveles con diluciones seriadas de proteína antigénica, hlL-6R-hFc, 25 que variaban de 0 a 10 !g/ml, y se incubaron durante dos horas a temperatura ambiente para alcanzar un equilibrio de pseudo-unión entre el anticuerpo y el antígeno. Estas soluciones se transfirieron después a placas de 96 pocillos previamente recubiertas con hlL-6R-hFc para permitir que el anticuerpo libre en las mezclas se uniera al hlL-6R-hFc recubierto sobre la placa. Las placas se recubrieron típicamente con de 1 a 2 !g/ml de proteína hlL-6R-hFc en solución de PBS durante una noche a 4ºC, seguido de bloqueo inespecífico con BSA. Después de eliminar por 30 lavado el exceso de anticuerpo en solución, los anticuerpos unidos a la placa se detectaron con un reactivo de anticuerpo policlonal de cabra anti-IgG o IgA de ratón conjugado con HRP y se revelaron usando sustratos colorimétricos o quimioluminiscentes. La dependencia de las señales de las concentraciones de antígeno en solución se analizaron con un análisis de ajuste de 4 parámetros usando el software Prism" (Graph Pad) y se describió como CI50. También se llevó a cabo un inmunoensayo de competición usando un instrumento Kinexa™ en
35 fase de solución estable (Sapidyne Inc.).
Los resultados se muestran en la Tabla 1 (control: anticuerpo monoclonal humanizado contra IL-6R humano (Patente de Estados Unidos Nº 5.817.790 SEC ID Nº: 69 y 71). Anticuerpo (secuencias de aminoácidos de HCVR y LCVR): VQ8A9-6 (3, 11); VQ8F11-21 (19, 27); VV7G4-1 (35, 43); VV7G4-10 (51, 59), VV6C10-1 (67, 75); VV6C10-3
40 (83, 91); VV6C10-4 (99, 107); W6F12-11 (115, 123); VV9A6-11 (131, 139); W6A9-5 (147, 155), VV3D8-4 (163, 171); VV1G4-7 (179, 187); 248982-13-1-E5 (195, 203); 248982-13-2-A9 (211, 219). La KD de monómero y dímero se determinó por BIAcore™; la KD en solución por Kinexa™; la CI50 por ensayos de ELISA (n.d. = no determinada).
Tabla 1. Afinidad de unión a antígeno
Anticuerpo
Kd Monómero (nM) Kd Dímero(nM) Kd Monómero en solución (nM) ELISA CI50 Dímero(nM)
VQ8A9-6
0,222 0,101 0,120 0,004
VQ8F11-21
0,067 0,023 0,009 0,008
VV3D8-4
2,410 0,172 1,910 0,013
VV6A9-5
0,097 0,146 0,032 0,005
VV1G4-7
0,225 0,070 0,197 0,041
VV6C10-1
0,267 0,032 2,050 0,010
VV6F12-11
n.d. n.d n.d 0,033
VV7G4.10
n.d. n.d. n.d. 1,980
VV9A6-11
n.d. n.d. n.d. 0,347
VV6C10-3
n.d. n.d. n.d. 0,009
248982-13-1-E5
0,987 0,785 n.d. 0,360
248982-13-2-A9
2,870 n.d. n.d. 0,054
Anticuerpo
Kd Monómero (nM) Kd Dímero(nM) Kd Monómero en solución (nM) ELISA CI50 Dímero(nM)
Control
1,790 n.d. 1,960 n.d.
Ejemplo 4. Neutralización de la actividad de hlL-6
Las actividades de bloqueo de hlL-6 de los anticuerpos anti-hlL-6R de la invención se exploraron mediante
5 inmunoensayos de bloqueo de hlL-6, bioensayos de crecimiento celular dependiente de hlL-6 in vitro y resonancia de plasmón superficial (BIAcore™). El inmunoensayo se usó para explorar la capacidad del anticuerpo ensayado para bloquear la unión de hlL-6 a hlL-6R, y el bioensayo in vitro se usó para determinar la potencia de los anticuerpos en la neutralización de la transducción de señales celulares mediada por hlL-6R.
10 Para el inmunoensayo, se recubrió proteína recombinante hlL-6 sobre una placa de 96 pocillos en tampón PBS durante una noche a 4ºC. Esta placa se usó para capturar el hlL-6R-hFc libre de soluciones de muestra de anticuerpo, y la cantidad de hlL-6R-hFc capturado se cuantificó de acuerdo con la curva patrón. Las soluciones de muestra estaban compuestas por una cantidad constante de proteína recombinante hlL-6R-hFc (100 pM) y cantidades variables de anticuerpo, en medio acondicionado de hibridoma bruto o como proteína de anticuerpo
15 purificada, que varían de 0 a aproximadamente 50 nM en diluciones seriadas. Las mezclas de antígeno-anticuerpo se incubaron a temperatura ambiente durante �2 horas para permitir que la unión de antígeno-anticuerpo alcance el equilibrio. Las soluciones de muestra equilibradas se transfirieron después a las placas recubiertas con hlL-6 para la medición del hlL-6R-hFc libre. Después de 1 hora de unión, la placa se lavó y el hlL-6R-hFc unido se detectó usando anticuerpos policlonales de cabra anti-hFc conjugados con HRP (Jackson Immuno Research), y se reveló usando
20 sustrato de TMB (BD Pharmigen). Las CI50 se determinaron como la cantidad de anticuerpo necesaria para reducir el 50% del IL-6R-hFc detectable contra ligando hlL-6 unido a placa. Los resultados se muestran en la primera columna de la Tabla 2.
Además, la capacidad del anticuerpo de ensayo para bloquear la unión de hlL-6 al receptor hlL-6R se determinó
25 usando resonancia de plasmón superficial. Las moléculas de antígeno hlL-6R-hFc purificadas se capturaron mediante anticuerpos policlonales de cabra anti-IgG humana inmovilizados en la superficie de CM-5 a través de acoplamiento con amina a una densidad de 250 UR. La solución de hlL-6 (0,25 ml, 50 nM) se inyectó sobre la superficie de receptor y se registró la hlL-6 unida (primera inyección de IL-6). Después, la hlL-6 unida se eliminó con una estimulación de MgCI2 3 M, seguida de tampón de acondicionamiento. El anticuerpo anti-hlL6R en medio
30 acondicionado de hibridoma se inyectó sobre la superficie de receptor capturado, seguido de una segunda inyección de hlL-6. El porcentaje de reducción en la unión de hIL-6 resultante a partir de complejo de anticuerpo y receptor preformado se usó como una puntuación para definir los bloqueantes de hlL-6 de los no bloqueantes (segunda columna, Tabla 2).
35 Tabla 2. Neutralización de la unión de hlL-6
Anticuerpo
CI50 Inhibición de la unión de hlL6R/hlL6 (nM) Inhibición de la unión de hlL6/hlL6R (%) CI50 Inhibición de la proliferación celular de XG-1 (nM) CI50 actividad luciferasa de HepG2/Stat3 (nM)
VQ8A9-6
0,39 68 0,40 0,097
VQ8F11-21
0,12 98 0,62 0,135
VV3D8-4
0,61 93 >100 n.d.
VV6A9-5
0,35 100 1,10 0,188
VV1G4-7
1,10 34 1,80 0,578
VV6C10-1
4,60 61 >6,90 n.d.
VV6F12-11
2,20 n.d. n.d. n.d.
VV7G4-10
13,00 n.d. n.d. n.d.
VV9A6-11
0,50 n.d. n.d. n.d.
VV6C10-3
0,06 n.d. n.d. n.d.
Control
2,20 91 1,50 0,854
La capacidad de los anticuerpos de hlL-6R para bloquear la actividad de hlL-6 in vitro se midió en la línea de mieloma dependiente de hlL-6 XG-1. Células XG-1 mantenidas en medio que contenía hlL-6 se lavaron dos veces con medio sin hlL-6 y se cultivaron durante �24 horas en medio sin hlL-6 para reducir la hlL-6 residual. Las células 40 privadas de suero se centrifugaron después y se resuspendieron en el medio a 4 x 105 células por ml, y se
sembraron en placas 20.000 células por pocillo en una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos. Las proteínas de anticuerpo purificadas se diluyeron en serie en medio y se añadieron a las células sembradas en placas a concentraciones que variaban de 0 a 50 nM. Posteriormente, se añadió hlL-6 recombinante a los pocillos a una concentración final de 8 pM. Se dejó que las células crecieran durante 72 horas a 37ºC en una incubadora
5 humidificada de CO2 al 5%. Al final del periodo de crecimiento, se midieron las células vivas usando el kit CCK-8 (Dojindo, Japón). Las CI50 se determinaron como se ha descrito anteriormente, y se describen en la tercera columna de la Tabla 2.
La capacidad de los anticuerpos de hlL-6R para bloquear la actividad de hlL-6 también se midió in vitro en la línea
10 celular de hepatoma humano sensible a hlL-6, HepG2. Las células HepG2 se transfectaron con un plásmido indicador que contenía un elemento de respuesta STAT3 (transductor de señales y activador de la transcripción 3) unido a un gen de luciferasa. Las células transfectadas se trataron con tripsina, se centrifugaron y se resuspendieron en el medio a aproximadamente 2,5 x 105 células por ml y se sembraron en placas a 20.000 células por pocillo en una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos. Las proteínas de anticuerpo purificadas se diluyeron en serie en medio
15 y se añadieron a las células sembradas en placas a concentraciones que variaban de 0 a 100 nM. Posteriormente, se añadió hlL-6 recombinante a los pocillos a una concentración final de 50 pM. La respuesta se midió después de incubar las células durante 6 horas a 37ºC en una incubadora humidificada de CO2 al 5%. La actividad de luciferasa se midió con el sistema de ensayo de luciferasa Steady-Glo™ (Promega). Las CI50 se determinaron como se ha descrito anteriormente, y se describen en la cuarta columna de la Tabla 2.
Ejemplo 5. Diversidad de epítopos de unión
Se realizó un inmunoensayo de competición de unión a anticuerpo usando como control anticuerpo humanizado contra IL-6R humano. En resumen, se recubrió una placa inmunoabsorbente de 96 pocillos con 20 ng por pocillo de 25 proteína recombinante hlL-6R durante una noche a 4ºC. Después de bloquear la unión inespecífica con BSA, los sitios de unión de hlL-6R en una mitad de la placa se saturaron con unión del anticuerpo de control por adición de 500 ng del control por pocillo, y a la otra mitad de la placa se añadió tampón de unión solamente. Después de una unión de tres horas a temperatura ambiente, se adicionaron los anticuerpos purificados a una concentración final de 50 ng/ml con y sin el anticuerpo de control preexistente en el pocillo. Después de una hora de unión adicional, el 30 anticuerpo libre se eliminó por lavado y el anticuerpo unido a la placa se detectó con anticuerpo policlonal de cabra anti-IgG o IgA de ratón conjugado con HRP y la placa se reveló usando sustratos cromáticos de HRP, y se registró la absorbancia a 450 nm. Las deducciones en porcentaje de la unión de los anticuerpos anti-hlL6R por la presencia del anticuerpo de control se enumeran en la Tabla 3 a continuación. Se realizó un experimento similar usando la tecnología de resonancia de plasmón superficial (Tabla 3). Ambos métodos generaban resultados coherentes. Los
35 anticuerpos VQ8F11, VV3D8, VV6A9, VV6C10-1 se unían a epítopos que solapaban con el anticuerpo de control; mientras que los anticuerpos VQ8A9, VV1G4, VV6F12, VV7G4, VV9A6 y VV6C10-3 parecían unirse a epítopos distintos ya que la unión a antígeno no se bloqueaba por el anticuerpo de control. La competición parcial puede ser el resultado del impedimento estérico del primer anticuerpo unido, aun cuando los epítopos puedan no ser solapantes.
Tabla 3. Competición de la unión a antígeno con anticuerpo de control
Anticuerpo
BIAcore™ (% reducción) Inmunoensayo (% reducción)
VQ8A9-6
26 3
VQ8F11-21
96 79
VV3D8-4
97 84
VV6A9-5
96 84
VV1G4-7
12 3
VV6C10-1
90 80
VV6F12-11
n.d. 3
VV7G4-10
n.d. 26
VV9A6-11
n.d. 18
VV6C10-3
n.d. 1
Ejemplo 6. Propiedad de unión cruzada entre especies
45 Se ensayaron cuatro anticuerpos para determinar la reactividad cruzada con proteína recombinante IL-6R de mono usando la tecnología de BIAcore™. En resumen, se usó una microplaca biodetectora sobre la que se inmovilizó anticuerpo policlonal de cabra anti-Fc de ratón para presentar anticuerpos monoclonales anti-hlL-6R a una densidad de aproximadamente 75 UR. Se inyectó proteína IL-6R humana recombinante o monomérica de mono (Macaca fascicularis, dominio extracelular; SEC ID Nº: 251), a un intervalo de concentraciones entre 1,25-40 nM, sobre la superficie de anticuerpo. La unión del receptor al anticuerpo y la disociación del complejo unido se controlaron a tiempo real. Se obtuvo tanto la constante de velocidad de asociación (ka) como la constante de velocidad de disociación (kd) y se calculó la KD (Tabla 4).
Tabla 4. Comparación de la afinidad de unión a IL-6R humano y de mono
Anticuerpo
Antígeno ka (M-1S-1) kd (S-1) Kd (nM)
Control
IL6R humano 1,74E+05 1,67E-04 0,963
IL6R de mono
1,44E+05 1,68E-04 1,170
VQ8F11-21
IL6R humano 8,51 E+05 4,38E-05 0,051
IL6R de mono
3,39E+05 4,86E-05 0,143
VV1G4-7
IL6R humano 2,57E+05 6,18E-05 0,240
IL6R de mono
no unión
VV6A9-5
IL6R humano 5,18E+05 8,41 E-05 0,162
IL6R de mono
5,00E+05 7,70E-05 0,154
VQ8A9-6
IL6R humano 7,32E+05 2,76E-04 0,377
IL6R de mono
7,31E+05 4,16E-04 0,569
Entre los cuatro anticuerpos ensayados, VQ8F11, VV6A9 y VQ8A9 reaccionaban fuertemente con el receptor de
10 mono con valores de KD que diferían en hasta de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 3 veces de la unión a receptor humano, respectivamente. VV1G4, que no se bloqueaba por el anticuerpo de control (Tabla 3), no mostraba unión al receptor de mono a pesar de la fuerte unión al receptor humano con una KD de 241 pM.
Ejemplo 7. Efecto de la región constante sobre la afinidad de unión
15 La afinidad de unión a hlL-6R monomérico de cuatro anticuerpos que tenían IgG de ratón, lgG1 humana o lgG4 humana (de tipo silvestre y modificados) se determinó usando BIAcore™ como se ha descrito anteriormente, excepto por que se usó una superficie de anticuerpo policlonal de cabra anti-Fc humana para capturar anticuerpos hlgG. Se inyectó hlL-6R monomérico a concentraciones de 12,5, 6,25, 3,12 y 1,56 nM. La capacidad de los anticuerpos para
20 neutralizar la transducción de señales de HepG2/STAT3 dependiente de hlL-6 también se determinó en un ensayo de luciferasa (CI50). Las CI50 para diferentes isotipos de IgG eran similares, sugiriendo la ausencia de efecto del isotipo sobre la afinidad del anticuerpo por el antígeno.
Tabla 5. Comparación de isotipos de IgG
Anticuerpo
IgG ka (M-1S-1) kd (S-1) Kd (nM) CI50 (nM)
VQ8F11-21
hlgG1 6,22E+05 4,54E-05 0,073 0,150
hlgG4
7,17E+05 5,22E-05 0,073 0,228
mlgG2a
7,86E+05 5,27E-05 0,067 0,135
modhlgG4
8,81E+05 4,705-05 0,053 0,249
VQ8A9-6
hlgG1 1,09E+06 2,60E-04 0,238 0,130
hlgG4
1,17E+06 2,35E-04 0,201 0,185
mlgG1
9,95E+05 2,21 E-04 0,222 0,097
VV6A9-5
hlgG1 7,12E+05 8,87E-05 0,125 0,204
hlgG4
5,67E+05 7,64E-05 0,135 0,343
mlgG2a
7,72E+05 7,52E-05 0,097 0,188
VQ1G4-21
hlgG1 3,34E+05 7,92E-05 0,237 0,767
hlgG4
2,73E+05 9,18E-05 0,336 0,528
mlgG2a
3,41E+05 7,66E-05 0,225 0,578
Aspectos de la divulgación
Lo que se indica a continuación son aspectos de la divulgación:
(1)
Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente al receptor de interleucina 6 humano (hlL-6R) con una KD de aproximadamente 500 pM o menor, y 300 pM o menor, según se mide por resonancia de plasmón superficial,.
(2)
Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con (1) que se une al hlL-6R con una afinidad al menos 2 veces mayor con respecto a su unión al IL-6R de mono.
(3)
Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con (1) o (2), que comprende un dominio de región determinante de complementariedad 3 (CDR3) de cadena pesada y un dominio CDR3 de cadena ligera, en el que
el dominio CDR3 de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula X1 - X2- X3 - X4 - X5 - X6 - X7 -X8 - X9 - X10 - X11 - X12 - X13 - X14 - X15 - X16 - X17- X18- X19 (SEC ID Nº: 247) en la que X1 = Ala, X2 = Lys, X3 = Gly, X4 = Arg, X5 = Asp, X6 = Ser o Ala, X7 = Phe, X8 = Asp; X9 = Ile, X10 = Pro o ausente, X11 = Phe o ausente, X12 = Val o ausente, X13 = Tyr o ausente, X14 = Tyr o ausente, X15 = Tyr o ausente, X16 = Gly o ausente, X17 = Met o ausente, X18 = Asp o ausente y X19 = Val o ausente; y el dominio CDR3 de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula X1 - X2 - X3 - X4 - X5 - X6 - X7 - X5- X9 (SEC ID Nº: 250) en la que X1 = Gln, X2 = Gln o His, X3 = Ala, X4 = Asn o Tyr, X5 = Ser, X6 = Phe, X7 = Pro, X8 = Pro y X9 = Thr.
(4)
Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con (3), que adicionalmente comprende un dominio CDR1 de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula X1 - X2 - X3
-
X4- X5 - X6 - X7 - X8(SEC ID Nº: 245) en la que X1 = Gly o Arg, X2 = Phe, X3 = Thr, X4 = Phe, X5 = Asp, X6 = Asp, X7 = Tyr y X8 = Ala; un dominio CDR2 de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula X1 - X2 - X3 - X4 - X5 - X6 - X7 - X8(SEC ID Nº: 246) en la que X1 = Ile o Val, X2 = Ser, X3 = Trp, X4 = Asn, X5 = Ser, X6 = Gly, X7 = Ser y X8 = Ile; un dominio CDR1 de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula X1 - X2 - X3 -X4 - X5 - X6 - X7 - X8(SEC ID Nº: 248), en la que X1 = Gln, X2 = Gly, X3 = Ile, X4 = Ser, X5 = Ser y X6 = Trp; y un dominio CDR2 de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula X1 -X2 -X3 (SEC ID Nº: 249), en la que X1 = Gly o Ala, X2 = Ala yX3 = Ser.
(5)
Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con (1) o (2), que comprende:
un dominio CDR3 de cadena pesada seleccionado del grupo que consiste en las SEC ID Nº: 25, 153, 9, 185, 41, 57, 73, 89, 105, 121, 137, 169, 201 y 217; y un dominio CDR3 de cadena ligera seleccionado del grupo que consiste en las SEC ID Nº: 33, 161, 17, 193, 49, 65, 81, 97, 113, 129, 145, 177, 209 y 225.
(6)
Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con (5), que adicionalmente comprende:
un dominio CDR1 de cadena pesada seleccionado del grupo que consiste en las SEC ID Nº: 21, 149, 5,181, 37, 53, 69, 85, 101, 117, 133, 165, 197 y 213; un dominio CDR2 de cadena pesada seleccionado del grupo que consiste en las SEC ID Nº: 23, 151, 7,183, 39, 55, 71, 87, 103, 119, 135, 167, 199 y 215; un dominio CDR1 de cadena ligera seleccionado del grupo que consiste en las SEC ID Nº: 29, 157, 13, 189, 45, 61, 77, 93, 109, 125, 141, 173, 205 y 221; y un dominio CDR2 de cadena ligera seleccionado del grupo que consiste en las SEC ID Nº: 31, 159, 15, 191, 47, 63, 79, 95, 111, 127, 143, 175, 207 y 223.
(7)
Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con (5) o (6), en el que las CDR de cadena pesada y las CDR de cadena ligera comprenden las SEC ID Nº: 21, 23, 25 y las SEC ID Nº: 29, 31, 33; las SEC ID Nº: 149, 151, 153 y las SEC ID Nº: 157, 159, 161; las SEC ID Nº: 5, 7, 9 y las SEC ID Nº: 13, 15, 17; y las SEC ID Nº: 181, 183, 185 y las SEC ID Nº: 189, 191, 193, respectivamente.
(8)
Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con (1) o (2), que comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID Nº: 19, 47, 3, 179, 227, 231, 35, 51, 67, 83, 99, 115, 131, 239, 241,163, 235, 195 y 211; y una región variable de cadena ligera (LCVR) seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID Nº: 27, 155, 11, 187, 229, 233, 43, 59, 75, 91, 107, 123, 139, 171, 237, 203 y 219.
(9)
Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con (8), que comprende los de pares HCVR/LCVR seleccionados del grupo que consiste en las SEC ID Nº: 19/27; 147/155; 3/11; 179/187; 227/229; 231/233; 35/43; 51/59; 67/75; 83/91; 99/107; 115/123; 131/139; 239/155; 241/155; 163/171; 235/237; 195/203 y 211/219.
(10)
Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de (1) a (9).
(11)
Un vector que comprende la secuencia de nucleótidos de acuerdo con (10).
(12)
Un sistema vector - hospedador para la producción de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que se une específicamente al receptor de IL-6 humano que comprende un vector de acuerdo con (11), en una célula huésped adecuada.
(13)
Un sistema vector - hospedador de acuerdo con (12), en el que la célula hospedadora es una célula procariota o eucariota seleccionada de una célula de E. coli o una célula CHO.
(14)
Un método para producir un anticuerpo anti-IL-6R o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende cultivar células de un sistema vector - hospedador de acuerdo con (12) o (13) en condiciones que permitan la producción del anticuerpo o fragmento del mismo y recuperar el anticuerpo o fragmento así producido.
(15)
El uso de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de (1) to (9) en la preparación de un medicamento para su uso para atenuar o inhibir una enfermedad o un trastorno mediado por IL-6 en un ser humano.
(16)
Un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de
(1)
a (9) para su uso en la atenuación o inhibición de una enfermedad o trastorno mediado por IL-6 en un ser humano.
(17)
Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de (1) a (9) y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
(18)
Un método para atenuar o inhibir una enfermedad o un trastorno mediado por IL-6 en un paciente humano, comprendiendo el método administrar a un paciente humano una cantidad eficaz de un anticuerpo
o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de (1) a (9).
(19)
Un método de acuerdo con (18), en el que la enfermedad o trastorno mediado por IL-6 es artritis, tal como artritis reumatoide crónica; una enfermedad inflamatoria del intestino, tal como enfermedad de Crohn
o colitis ulcerosa; o lupus eritematoso sistémico.
Listado de secuencias
<110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
<120> Anticuerpos de alta afinidad contra el receptor de IL-6 humano
<130> 6010A-WO
<140> A asignar
<141>
<150> 60/810.664
<151>
<150> 60/843.232
<151>
<160> 251
<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
<210> 1
<211> 358
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<400> 1
<210> 2 10 <211> 379
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Sintético
<400> 2
<210> 3
<211> 126
<212> PRT 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
10 <400> 3
<210> 4 15 <211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 20 <223> Sintético
<400> 4 ggattcatct ttgatgatta tgcc 24
25 <210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
30 <220>
<223> Sintético
<400> 5
<210> 6
<211> 24
<212> ADN 40 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético <400> 6 attagttgga atagtggtag cata 24
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 7
15
<210> 8 <211> 57 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Sintético
25
<400> 8 gcaaaagatg gaggcagcag ctggttaccg ttcgtctact actacggtat ggacgtc 57
<210> 9 <211> 19 <212> PRT <213> Secuencia artificial
<220> <223> Sintético
35
<400> 9
<210> 10
<211> 325
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 11
<210> 11
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
10
<210> 12 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Sintético
15
<400> 12 cagagtatta gcagcaac 18
20
<210> 13 <211> 6 <212> PRT <213> Secuencia artificial
25
<220> <223> Sintético <400> 13
30
<210> 14 <211> 9 <212> ADN <213> Secuencia artificial
35
<220> <223> Sintético
40 45
<400> 14 ggtgcatcc 9 <210> 15 <211> 3 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Sintético
50
<400> 15
5
<210> 16 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial
10
<220> <223> Sintético <400> 16 cagcagtata gtagctggcc tccgtacact 30
15
<210> 17 <211> 10 <212> PRT <213> Secuencia artificial
20
<220> <223> Sintético
<400> 17
25
<210> 18
<211> 349
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
30
<220>
<223> Sintético
<400> 18
35
<210> 19
<211> 116 40 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético 45
<400> 19
<210> 20 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Sintético
<400> 20 agatttacct ttgatgatta tgcc
24
<210> 21 <211> 8 <212> PRT <213> Secuencia artificial
<220> <223> Sintético
<400> 21
<210> 22 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Sintético
<400> 22 attagttgga atagtggtag aata
24
<210> 23 <211> 8 <212> PRT <213> Secuencia artificial
<220> <223> Sintético
<400> 23
5
<210> 24 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Sintético
10
<400> 24 gcaaaaggcc gagattcttt tgatatc 27
15
<210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia artificial
<220> <223> Sintético
20
<400> 25
<210> 26 25 <211> 322
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 30 <223> Sintético
<400> 26
35
<210> 27
<211> 107
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
40
<220>
<223> Sintético
<400> 27
45
<210> 28
<211> 18
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 28 cagggtatta gcagctgg 18
<210> 29
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 29
<210> 30
<211> 9
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 30 ggtgcatcc 9
<210> 31
<211> 3
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 31
<210> 32
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 32 caacaggcta acagtttccc gtacact 27
<210> 33
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 33
<210> 34
<211> 370
<212> ADN 10 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
15 <400> 34
<210> 35 20 <211> 123
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 25 <223> Sintético
<400> 35
30
<210> 36 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial
35
<220> <223> Sintético
40
<400> 36 24 ggttacactt ttacccatta tggt 24
<210> 37
<211> 8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 37
<210> 38
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 38 24 atcagcgctt acaatgatga caca 24
<210> 39
<211> 8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 39
<210> 40
<211> 48
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 40 gcgagagaag cgcagctcgt cctctactac tactacggta tggacgtc 48
<210> 41
<211> 16
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 41
<210> 42
<211> 322
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 42
10 <210> 43
<211> 107
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
15 <220>
<223> Sintético
<400> 43
20 25
<210> 44 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Sintético
30
<400> 44 cagagtgtta gcagcttc 18
35
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<220> <223> Sintético
40
<400> 45
<210> 46 45 <211> 9
<212> ADN
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<223> Sintético
5 <400> 46 gatgcatcc 9
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<211> 3
<212> PRT
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<220>
<223> Sintético 15
<400> 47
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25
<220>
<223> Sintético
<400> 48
cagcagcgta acaattggcc gtacatt
27
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35
<220>
<223> Sintético
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<220>
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10
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20 25
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30
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<223> Sintético
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10
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<223> Sintético 50
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<220>
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<223> Sintético
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<220>
<223> Sintético
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<223> Sintético
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<220>
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<223> Sintético
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<220>
<223> Sintético
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20
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<220>
<223> Sintético
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<223> Sintético
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<220>
<223> Sintético
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5
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15
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20
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35
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<212> PRT
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<220>
<223> Sintético
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<223> Sintético
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<212> PRT
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<220>
<223> Sintético
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<211> 24
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<220>
<223> Sintético
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<220>
<223> Sintético
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5
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10
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15
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<220> <223> Sintético
20
<400> 121
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético 30
<400> 122
35 <210> 123
<211> 107
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
40 <220>
<223> Sintético
<400> 123
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<220>
<223> Sintético
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<212> PRT
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<220>
<223> Sintético
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<220>
<223> Sintético
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<220>
<223> Sintético
<400> 127
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<213> Secuencia artificial
5
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<400> 129
20
<210> 130
<211> 370
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25
<220>
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30
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<220>
<223> Sintético 40
<400> 131
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<212> ADN
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<220>
<223> Sintético
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<220>
<223> Sintético
<400> 133
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<211> 24
<212> ADN
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<220>
<223> Sintético
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 135
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<220>
<223> Sintético
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 137
<210> 138
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<220>
<223> Sintético 15
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<211> 107
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25 <220>
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<400> 139
35
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<220> <223> Sintético
40
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45
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<220>
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<220>
<223> Sintético
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<220>
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<210> 145
<211> 9
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 145
<210> 146
<211> 349
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<220>
<223> Sintético
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<220>
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<400> 147
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30 35
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<220>
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<220>
<223> Sintético
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<212> ADN
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<220>
<223> Sintético
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<210> 153
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 153
<210> 154
<211> 322
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 154
<210> 155
<211> 107
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
5
<220>
<223> Sintético
<400> 155
10
15
<210> 156 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia artificial
20
<220> <223> Sintético <400> 156 cagggtatta gcagctgg 18
25
<210> 157 <211> 6 <212> PRT <213> Secuencia artificial
30
<220> <223> Sintético
<400> 157
35 40
<210> 158 <211> 9 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Sintético
45
<400> 158 gctgcatcc 9
50
<210> 159 <211> 3 <212> PRT <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 159
<210> 160 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial
15
<220> <223> Sintético <400> 160 caacatgctt acagtttccc gtacact 27
<210> 161 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia artificial
25
<220> <223> Sintético
<400> 161
<210> 162
<211> 349
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 162
<210> 163
<211> 116
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 163
5
<210> 164 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial
10
<220> <223> Sintético <400> 164 ggattcacct ttgatgatta tgcc 24
15
<210> 165 <211> 8 <212> PRT <213> Secuencia artificial
20
<220> <223> Sintético
<400> 165
25 30
<210> 166 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Sintético
35
<400> 166 attagttgga acagtggtag aata 24
40
<210> 167 <211> 8 <212> PRT <213> Secuencia artificial
<220> <223> Sintético
45
<400> 167
5
<210> 168 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial
10
<220> <223> Sintético <400> 168 gcaaaaggcc gggatgcttt tgatatc 27
15
<210> 169 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia artificial
20
<220> <223> Sintético
<400> 169
25
<210> 170
<211> 322
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
30
<220>
<223> Sintético
<400> 170
35
<210> 171
<211> 107 40 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético 45
<400> 171
<210> 172
<211> 18
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 172 cagggtatta gcagctgg 18
<210> 173
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 173
<210> 174
<211> 9
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 174 gctgcatcc 9
<210> 175
<211> 3
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 175
<210> 176
<211> 27
<212> ADN <213> Secuencia artificial
5
<220> <223> Sintético
<400> 176 caacaggcta acagtttccc gtacact
27
10
<210> 177 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia artificial
15
<220> <223> Sintético
<400> 177
<210> 178
<211> 361
<212> ADN 25 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
30 <400> 178
<210> 179 35 <211> 120
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 40 <223> Sintético
<400> 179
<210> 180
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 180 ggatacacct tcacctctta tgat 24
<210> 181
<211> 8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 181
<210> 182
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 182 atgaacccaa acagtggtaa caca 24
<210> 183
<211> 8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 183 <210> 187
5
<210> 184 <211> 39 <212> ADN <213> Secuencia artificial
10
<220> <223> Sintético <400> 184 gcgcgagact acagtagcca ctactacggt ttggacgtc 39
15
<210> 185 <211> 13 <212> PRT <213> Secuencia artificial
20
<220> <223> Sintético
<400> 185
25
<210> 186
<211> 322
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
30
<220>
<223> Sintético
<400> 186
35
<211> 107 40 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético 45
<400> 187
<210> 188
<211> 18
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 188 caggacatta gcaattat 18
<210> 189
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 189
<210> 190
<211> 9
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 190 gttgcatcc 9
<210> 191
<211> 3
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 191
<210>
192
<210>
194
<211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial
5
<220> <223> Sintético
10 15
<400> 192 caacagttta atagttaccc gctcactttc <210> 193 <211> 10 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Sintético 30
20
<400> 193
<211> 378 25 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético 30
<400> 194
35 <210> 195
<211> 126
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
40 <220>
<223> Sintético
<400> 195
<210> 196
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 196 ggattcacct ttgatgatta tgcc 24
<210> 197
<211> 8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 197
<210> 198
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 198 attagttgga atagtggggc cata 24
<210> 199
<211> 8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 199
5
<210> 200 <211> 57 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Sintético
10
<400> 200 acaaaagaag aagtgggagc tacggtggat tatttctact tctacggtat ggacgtc 57
15
<210> 201 <211> 19 <212> PRT <213> Secuencia artificial
<220> <223> sintético
20
<400> 201
<210> 202 25 <211> 318
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 30 <223> Sintético
<400> 202
35
<210> 203
<211> 106
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
40
<220>
<223> Sintético
<400> 203
45
<210> 204
<211> 18
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 204 cagagtgtta gcaactac 18
<210> 205
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 205
<210> 206
<211> 9
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 206 gatgcatcc 9
<210> 207
<211> 3
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 207
<210> 208
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 208 cagcagcgta gcaactggcc tacg 24
<210> 209
<211> 8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 209
<210> 210
<211> 348
<212> ADN 10 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
15 <400> 210
<210> 211 20 <211> 116
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 25 <223> Sintético
<400> 211 <220>
30
<210> 212 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial
35
<220> <223> Sintético
40 45
<400> 212 ggattcacct ttgatgatta tgccc <210> 213 <211> 8 <212> PRT <213> Secuencia artificial 24
<223> Sintético
<400> 213
<210> 214
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 214 attagttgga atagtggtag ggta 24
<210> 215
<211> 8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 215
<210> 216
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 216 acaaaaggcc gggatgcttt tgatatc 27
<210> 217
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 217
<210> 21
<211> 321
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 218
<210> 219
<211> 107 5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético 10
<400> 219
15
<210> 220 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia artificial
20
<220> <223> Sintético
25 30
<400> 220 cagggtatta gcagctgg <210> 221 <211> 6 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Sintético 18
35
<400> 221
40
<210> 222 <211> 9 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 222
gctgcatcc 9 5
<210> 223
<211> 3
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 223 15
<210> 224
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
25
<400> 224
caacaggcta acagtttccc gtacact
27
<210> 225
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
35
<223> Sintético
<400> 225
<210> 226
<211> 378
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 226
<210> 227
<211> 126
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 227
<210> 228
<211> 324 10 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético 15
<400> 228
20 <210> 229
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
25 <220>
<223> Sintético
<400> 229
<210> 230
<211> 348 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 230
10
<210> 231
<211> 116
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
15
<220>
<223> Sintético
<400> 231
20
<210> 232
<211> 321 25 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético 30
<400> 232
35 <210> 233
<211> 107
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
40 <220>
<223> Sintético
<400> 233
5 <210> 234
<211> 360
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
10 <220>
<223> Sintético
<400> 234
<210> 235
<211> 120
<212> PRT 20 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
25 <400> 235
<210> 236
<211> 321
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 236
<210> 237
<211> 107 10 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético 15
<400> 237
<210> 238 20 <211> 349
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 25 <223> Sintético
<400> 238
30
<210> 239
<211> 116
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
35
<220>
<223> Sintético
<400> 239
40
<210> 240
<211> 348 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético 10
<400> 240
15 <210> 241
<211> 116
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
20 <220>
<223> Sintético
<400> 241
<210> 242
<211> 330
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<210> 243
<211> 327
<212> PRT 10 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
15 <400> 243
<210> 244
<211> 327 5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético 10
<400> 244
5
<210> 245 <211> 6 <212> PRT <213> Secuencia artificial
10 15
<220> <223> Sintético <220> <221> VARIANTE <222> (1)...(6) <223> Xaa = Cualquier aminoácido <400> 245
20
<210> 246 <211> 3 <212> PRT <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)...(3)
<223> Xaa = Cualquier aminoácido
<400> 246
<210> 247
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)...(10)
<223> Xaa = Cualquier aminoácido
<400> 247
<210> 248
<211> 8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)...(8)
<223> Xaa = Cualquier aminoácido
<400> 248
<210> 249
<211> 8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)...(8)
<223> Xaa = Cualquier aminoácido
<400> 249
5
<210> 250 <211> 19 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Sintético
10
<220> <221> VARIANTE <222> (1)...(19) <223> Xaa = Cualquier aminoácido
15
<400> 250
<210> 251
<211> 311
<212> PRT
<213> Macaca fascicularis
<400> 251

Claims (14)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente al receptor de interleucina 6 humano (hlL-6R) con una Kd de 500 pM o inferior, según se mide por resonancia de plasmón superficial, en el que:
    (i)
    las CDR de la cadena pesada comprenden las SEC ID Nº: 5, 7 y 9 como CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada respectivamente, y
    (ii)
    las CDR de la cadena ligera comprenden las SEC ID Nº: 13, 15 y 17 como CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera respectivamente
  2. 2.
    Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende la pareja de HCVR/LCVR de la SEC ID Nº: 3/11.
  3. 3.
    Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que se une específicamente al hlL-6R con una KD de 300 pM o inferior, según se mide por resonancia de plasmón superficial.
  4. 4.
    Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con la reivindicación 1, 2 o 3, que se une al hlL-6R con una afinidad al menos 1,5 veces superior respecto a la unión al IL-6R de mono.
  5. 5.
    El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el fragmento de unión a antígeno se selecciona de Fab, F(ab')2 y scFv.
  6. 6.
    Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
  7. 7.
    Un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 6.
  8. 8.
    Una célula hospedadora aislada que comprende un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 7.
  9. 9.
    La célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la célula hospedadora es una célula procariota o eucariota seleccionada de una de E. coli o una célula CHO.
  10. 10.
    Un método para producir un anticuerpo anti-IL-6R o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende cultivar la célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 8 o 9 en condiciones que permitan la producción del anticuerpo o fragmento del mismo y la recuperación del anticuerpo o fragmento así producido.
  11. 11.
    El uso de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en la fabricación de un medicamento para su uso para atenuar o inhibir una enfermedad o trastorno mediado por IL-6 en un ser humano, en el que la enfermedad o trastorno mediado por IL-6 es artritis, una enfermedad inflamatoria del intestino o lupus eritematoso sistémico.
  12. 12.
    Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para su uso en la atenuación o inhibición de una enfermedad o trastorno mediado por IL-6 en un ser humano, en el que la enfermedad o trastorno mediado por IL-6 es artritis, una enfermedad inflamatoria del intestino o lupus eritematoso sistémico.
  13. 13.
    Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
  14. 14.
    El uso de acuerdo con la reivindicación 11 o un anticuerpo o fragmento de acuerdo con la reivindicación 12, en el que dicha artritis es artritis reumatoide crónica, o dicha enfermedad inflamatoria del intestino es la enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa.
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