TW201803981A - 用於以使用增強表現基因座爲基礎製造抗體之組成物及方法 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於真核細胞中重組蛋白之位點特異性整合和表現。特言之，本發明係包括藉由應用一增強表現基因座供增進抗體(包括雙特異性抗體)在真核細胞，特別是灰倉鼠(Cricetulus griseus)細胞株中的表現之組成物和方法。
Description
本申請案係主張2016年4月20日申請的美國臨時申請案號62/325,385之優先權，其全文係以引用的方式併入本文中。
本揭示文係關於真核細胞中重組蛋白之位點特異性整合和表現。特言之，本揭示文係關於藉由應用一增強表現基因座供增進抗原結合蛋白，例如雙特異性抗體在真核細胞，特別是灰倉鼠(Cricetulus griseus)細胞株中的表現之組成物和方法。
無論是用於研究或治療用途，細胞表現系統係以提供可靠和有效率的特定蛋白製造來源為目的。由於，例如哺乳動物表現系統之適當後轉譯修飾重組蛋白之能力，哺乳動物細胞中重組的蛋白表現為製造治療性蛋白之較佳方法。
儘管可取得各種表現系統，但有效能的基因轉移之挑戰和用於表現重組蛋白之整合基因的穩定性仍舊存在。對於目標轉殖基因之長期表現，須考量將細胞基因的打斷降至最小以避免細胞株中表現型的改變。
工程化穩定細胞株使其適應多基因表現，例如多特異性抗體中之多抗體鏈，特別具挑戰性。整合基因之表現量可能發生廣泛變異。由於局部基因環境(亦即位置效應)，整合額外的基因可能導致表現上較大變異及不穩定性。用於製造多特異性抗原結合蛋白之表現系統通常需要表現希望配對成特異多聚模式的二或多條不同的免疫球蛋白鏈，且可能通常係偏重有利於同源二聚體產生，而非所欲的異源二聚體或多聚體組合物。因此，在本項技術中對於改良的哺乳動物表現系統有其需求。
在一方面，係提供一細胞其含有一整合在一增強表現基因座內特定位置的外源性核酸序列，其中該外源性核酸序列係編碼雙特異性抗原結合蛋白。
在某些實施例中，此外源性核酸序列係包括一含有編碼第一輕鏈片段(LCF)之核苷酸序列的第一外源性核酸序列，含有一編碼第一重鏈片段(HCF)之核苷酸序列的第二外源性核酸序列，及含有一編碼第二HCF(或稱為HCF*，其中第二HCF與第一HCF為不同的)之核苷酸序列的第三外源性核酸序列，其中該第一和第二HCF與第一LCF係形成雙特異性抗原結合蛋白。在特定的實施例中，第一和第二HCF與第一LCF係含有雙特異性抗原結合蛋白的至少二個可變區和二個CH3恆定區。在某些實施例中，此二個可變區為不同的。在某些實施例中，此二個CH3區為不同的。在某些實施例中，各外源性核酸序列係同時整合於增強表現基因座內的特定位點。
在某些實施例中，編碼第一HCF之核苷酸序列係編碼來自第一恆定區的胺基酸(例如編碼一或多個CH1、CH2、絞鏈或CH3區)，且編碼第二HCF之核苷酸序列係編碼來自第二恆定區的胺基酸。來自第一恆定區的胺基酸與來自第二恆定區的胺基酸可相同或不同。在特定的實施例中，編碼第一HCF的核苷酸序列係編碼第一CH3區，而編碼第二HCF的核苷酸序列係編碼第二CH3區，其中第一和第二CH3區可相同或不同。在某些實施例中，第一和第二CH3區在至少一個胺基酸位置為不同的；例如，二個CH3區中其中之一為人類IgG CH3區，而另一個為修飾的人類IgG CH3區，且二個CH3區具有不同的A蛋白結合特性。在其他的實施例中，編碼第一和第二CH3區的核苷酸序列彼此之差異處在於其中一個核苷酸序列係經密碼子修飾。
在其他特定的實施例中，編碼第一HCF之核苷酸序列係編碼第一重鏈可變(VH)區，而編碼第二HCF之核苷酸序列係編碼第二VH區，其中該第一和第二重鏈可具有相同或不同的VH區。在另外的實施例中，第一和第二VH可連接相同或不同的恆定區。
在某些實施例中，編碼第一LCF之核苷酸序列係編碼第一輕鏈可變(VL)區。
在某些實施例中，此外源性核酸序列係含有一包括編碼第二LCF之核苷酸序列，例如第二輕鏈可變(VL)區的另外外源性核酸。在某些實施例中，此編碼第二VL區的核苷酸序列亦編碼一第二輕鏈恆定區。
基因座之多外源性核酸的相對位置可不同。在某些實施例中，編碼核酸的LCF係位於相對二個HCF-編碼核酸的上游或下游。
在某些實施例中，各HCF或LCF-編碼序列係獨立地連接一轉錄調節序列。在特定的實施例中，第一外源性核酸進一步係包括操作上連接編碼一第一LCF之核苷酸序列的第一啟動子，第二外源性核酸進一步係包括操作上連接編碼一第一HCF之核苷酸序列的第二啟動子，以及第三外源性核酸係包括操作上連接編碼一第二HCF之核苷酸序列的第三起動子，其中該第一、第二和第三啟動子為相同或不同的，及/或該等啟動子與操作上連接第四外源性核酸之第四啟動子為相同或不同的。在某些實施例中，此第一、第二和第三啟動子為相同的。
在某些實施例中，在整合位置的外源性核酸序列進一步係包括重組酶辨識位置，例如，位於相對第一外源性核酸5'的第一重組酶辨識位置(RRS)，及位於相對第二和第三外源性核酸3'的第二重組酶辨識位置(RRS)，其中第一和第二RRS為不同的。在某些實施例中，亦包括一第三RRS且係位於相對第一外源性核酸3'及相對第二和第三外源性核酸之一或二者5'，其中該第三RRS與第一和第二RRS為不同的。
在特定實施例中，此外源性核酸序列可包括一含有篩選標記基因之第四外源性核酸。在特定的實施例中，第四外源性核酸係位於相對第一外源性核酸3'。在特定的實施例中，第四外源性核酸係整合為一斷裂基因(split gene)。在其他的實施例中，第四外源性核酸或篩選標記係位於第三RRS的3'，其為操作上連接第四外源性核酸之第四啟動子的3'。在某些實施例中，此篩選標記係包括已插入、視需要插入至篩選標記基因之內含子中的第三RRS，其中該第三RRS與第一和第二RRS為不同的。
在特定的實施例中，基因座之外源性核酸的順序可為：從
5'至3'，第一外源性核酸(編碼LCF)，第四外源性核酸(編碼篩選標記)，第二外源性核酸(編碼第一HCF)，第三外源性核酸(編碼第二HCF)；且在某些特別的實施例中，第二外源性核酸係含有一編碼修飾的人類IgG CH3區之核苷酸序列，及第三外源性核酸係包括一編碼天然的人類IgG CH3區之核苷酸序列。
在特定的實施例中，基因座之外源性核酸的順序為：從5'至3'，第一外源性核酸(編碼LCF)，第二外源性核酸(編碼第一HCF)，第四外源性核酸(編碼篩選標記)，及第三外源性核酸(編碼第二HCF)，其中第二外源性核酸係包括一編碼天然的人類IgG CH3區之核苷酸序列，而第三外源性核酸係包括一編碼修飾的人類IgG CH3區之核苷酸序列。
在某些實施例中，連接HCF或LCF-編碼序列的啟動子為相同的，且與操作上連接篩選標記的啟動子為不同的。
在某些實施例中，雙特異性抗原結合片段係與T-細胞抗原及與腫瘤細胞抗原特異性結合。亦提供其他適合的雙抗原特異性。
在某些實施例中，增強表現基因座係選自包括至少90%與SEQ ID NO：1相同之核苷酸序列的基因座，或包括至少90%與SEQ ID NO：2相同之核苷酸序列的基因座。
在各種實施例中，此細胞為CHO細胞。
在另外方面，係提供設計用於多外源性核酸之位點特異性整合的載體。
在某些實施例中，本揭示文係提供一組載體，該載體組係包括一第一載體，其從5'至3'係含有：第一RRS，含有編碼第一LCF之核苷酸序列的第一核酸和第三RRS；及一第二載體，其從5'至3'係含有：第三RRS，含有編碼第一VH區之核苷酸序列的第二核酸，第二RRS；其中第一或第二核酸進一步係包括編碼第二HCF之核苷酸序列；且其中第一和第二HCF及第一LCF係形成雙特異性抗原結合蛋白。
在某些實施例中，編碼第二HCF的核苷酸序列係包括在第一核酸中，視需要位於編碼第一LCF之核苷酸序列的下游。在其他的實施例中，編碼第二HCF的核苷酸序列係包括在第二核酸中。
在某些實施例中，編碼第一HCF的核苷酸序列係編碼第一嵌合的恆定區(例如編碼一或多個CH1、絞鏈CH2或CH3區或其片段，或來自任何同功型)，且編碼第二HCF的核苷酸序列係編碼第二嵌合的恆定區。嵌合的恆定區之實例係描述於2014年8月7日公開的PCT國際公開案號WO 2014/121087 A1中，其係以引用的方式併入文中。來自第一恆定區的胺基酸與來自第二嵌合恆定區的胺基酸可相同或不同。在特定的實施例中，編碼第一HCF之核苷酸序列係編碼一第一CH3區，且編碼第二HCF的核苷酸序列係編碼一第二CH3區，其中該第一和第二CH3區可相同或不同。在某些實施例中，第一和第二CH3區在至少一胺基酸位置為不同的；例如，二個CH3區其中之一為人類IgG CH3區，而另一個為修飾的人類IgG CH3區，且二個CH3區具有不同的A蛋白結合特性。在其他的實施例中，編碼第一和第二CH3區的核苷酸序列彼此之差異處係在於其中一個核苷酸序列係經密碼子修飾。
在其他特定的實施例中，編碼第一VH區之核苷酸序列係編碼第一重鏈，且編碼第二VH區之核苷酸序列係編碼第二重鏈，其中第一和第二重鏈可具有相同或不同的恆定區。
在某些實施例中，編碼第一LCF之核苷酸序列係編碼第一輕鏈可變區(VL)。
在某些實施例中，各LCF-或HCF-編碼序列係獨立地連接一轉錄調節序列，例如啟動子。在特定的實施例中，連接第一HCF-編碼序列之啟動子與連接第二HCF-編碼序列之啟動子為相同的。在特定的實施例中，連接LCF和HCF之啟動子皆為相同的。
在某些實施例中，第一載體中的第一核酸進一步係含有篩選標記基因的5'部分，其係位於第一載體之第三RRS的5'；且第二核酸進一步係含有篩選標記基因之其餘3'部分，其係位於第二載體之第三RRS的3'-亦即，篩選標記基因係分開至二個載體。在其他的實施例中，篩選標記和與其操作上連接的啟動子係分開於二個載體間，換言之啟動子和篩選標記係位於不同的載體。在特定的實施例中，操作上連接標記基因的啟動子係位於第一載體中第三RRS的5’，而標記基因係位於第二載體中第三RRS
的3'，且為操作上連接第二核酸之第二啟動子及操作上連接第三核酸之啟動子的5'。在某些實施例中，第一載體中的第三RRS係存在篩選標記基因之內含子的5'部分內；而第二載體中的第三RRS係存在篩選標記基因之內含子的3'部分內。
在特定的實施例中，第一載體從5'至3'係包括第一RRS，第一核酸和第三RRS；而第二載體從5'至3'係包括第三RRS，第二核酸(其中第二核酸係含有編碼第一HCF之核苷酸序列及編碼第二HCF之核苷酸序列)及第二RRS。在其他特定的實施例中，第一載體從5'至3'係包括第一RRS，第一核酸(其中第一核酸係包括編碼第一HCF之核苷酸序列及編碼第二HCF區之核苷酸序列)，及第三RRS；而第二載體從5'至3'係包括第三RRS，第二核酸(其中第二核酸係包括編碼第一HCF區之核苷酸序列)及第二RRS。在任何這些特定實施例中，第一核酸可進一步包括篩選標記基因的5'部分，其係位於第一載體中第三RRS的5'；而第二核酸進一步係包括篩選標記基因的其餘3'部分，其係位於第二載體中第三RRS的3'；且其中視需要第一載體中第三RRS係存在篩選標記基因之內含子的5'部分內，而第二載體的第三RRS係存在篩選標記基因之內含子的3'部分內。
在某些實施例中，載體組可包括一或多個另外的載體；例如含有一或多個RRS及編碼第二LCF之核苷酸序列的載體，或編碼一或多個辨識RRS之重組酶的載體。
在其他的實施例中，本揭示文係經由以同源臂為基礎的同源重組，提供一設計用於進行多外源性核酸之位點特異性整合的載體。在某些實施例中，此載體係含有一編碼雙特異性抗原結合蛋白之外源性核酸序列，其在側邊有一5'同源臂及3'同源臂供整合至細胞的增強表現基因座中。
在另一方面，本揭示文係提供包括一細胞及一或多個載體之組合的系統，且其可用來製造具有將外源性核酸整合於表現增強基因座內之細胞，而該外源性核酸係共同編碼雙特異性抗原結合蛋白。
在特定的實施例中，係提供包括一細胞及一組載體之系統，其中該細胞係含有將一組RRS整合於其基因體的增強表現基因座內，該RRS為彼此互異且在一或多個外源性核酸間留有間隔，例如篩選標記，供
與載體組內的感興趣基因進行重組交換；且其中載體組內的RRS係包括與細胞內的RRS相同之排列。
在某些實施例中，係提供包括一細胞及一組載體之系統，其中該細胞，整合在其基因體之增強表現基因座內，從5'至3'係含有：第一RRS，第一外源性核酸，第二RRS，第二外源性核酸及第三RRS，其中三種RRS為彼此互異；其中該載體組係包括第一載體，其從5'至3'含有第一RRS，含有編碼第一免疫球蛋白鏈或其片段之核苷酸序列的第一核酸及第二RRS；第二載體，其係含有第二RRS，含有編碼第二免疫球蛋白鏈或其片段之核苷酸序列的第二核酸及第三RRS；且其中該第一核酸或第二核酸進一步係包括編碼第三免疫球蛋白鏈或其片段之核苷酸序列。在載體導入細胞後，載體中的第一和第二核酸係經由第一、第二和第三RRS所媒介的重組，整合至增強表現基因座中。
在某些實施例中，細胞中的第一外源性核酸係含有第一篩選標記基因，而細胞中的第二外源性核酸係含有第二篩選標記基因，其中該第一和第二篩選標記基因為不同的。篩選標記係與細胞內整合的外源性核酸交換。
在某些實施例中，第一載體從5'至3'係包括第一RRS，含有編碼第一LCF之核苷酸序列的第一核酸，及第三RRS；而第二載體從5'至3'係含有第三RRS，第二核酸，其中第二核酸係含有編碼第一HCF之核核苷酸序列和編碼第二HCF之核苷酸序列，以及第二RRS。在其他的實施例中，第一載體從5'至3'係含有第一RRS，含有編碼第一LCF之核苷酸序列和編碼第二HCF之核苷酸序列的第一核酸，以及第三RRS；而第二載體從5'至3'係含有第三RRS，含有編碼第一HCF之核苷酸序列的第二核酸，以及第二RRS。
在某些實施例中，第一載體從5'到3'係包括第一RRS，含有編碼第一HCF之核苷酸序列的第一核酸，以及第三RRS；而第二載體從5'至3'係含有第三RRS，第二核酸，其中第二核酸係含有編碼第一LCF之核核苷酸序列和編碼第二HCF之核苷酸序列，以及第二RRS。在其他的實施例中，第一載體從5'至3'係含有第一RRS，含有編碼第一HCF之核苷酸序
列和編碼第二HCF之核苷酸序列的第一核酸，以及第三RRS；而第二載體從5'至3'係含有第三RRS，含有編碼第一LCF之核苷酸序列的第二核酸，以及第二RRS。在任何這些實施例中，第一載體中的第一核酸可進一步包括位於第三RRS之5'的啟動子，而第二載體中的第二核酸進一步係包括操作上連接此啟動子之篩選標記基因，其係位於第三RRS的3'。在其他的實施例中，第一載體中的第一核酸可進一步包括篩選標記基因之5'部分，其係位於第三RRS的5'，而第二載體中的第二核酸進一步係包括篩選標記基因的其餘3'部份，其係位於第三RRS的3'；其中視需要第一載體中第三RRS係存在篩選標記基因之內含子的5'部分內；而第二載體中的第三RRS係存在篩選標記基因之內含子的3'部分內。
在某些實施例中，編碼LCF的核苷酸序列係操作上連接一第一啟動子，編碼第一HCF的核苷酸序列係操作上連接一第二啟動子，而編碼第二HCF的核苷酸序列係操作上連接一第三啟動子，其中該第一、第二和第三啟動子為相同的，且(若存在其中一個載體中)係與操作上連接篩選標記基因的啟動子為不同的。
在某些實施例中，編碼第一HCF之核苷酸序列係編碼第一CH3區，而編碼第二HCF之核苷酸序列係編碼第二CH3區，其中該第一和第二CH3區可相同或不同。在某些實施例中，二個CH3區中其中之一為天然的人類IgG CH3區，而另一個為修飾的人類IgG CH3區。在特定的實施例中，編碼修飾的CH3區之核苷酸序列係在第一載體中(亦即編碼第一LCF之載體)，視需要編碼第一LCF之核苷酸序列的下游。在其他特定的實施例中，編碼修飾的CH3區之核苷酸序列係在第二載體中，且為編碼未修飾CH3區之核苷酸序列的上游。
在另外方面，本揭示文係提供製造雙特異性抗原結合蛋白之方法。
在某些實施例中，此方法係包括提供一文中所述的系統，該系統係含有一具有RRS之細胞及一組含有共同編碼雙特異性抗原結合蛋白之多外源性核酸以及與細胞中RRS相配之RRS的載體；藉由轉染將載體導入細胞內；選擇一轉染的細胞其中載體內的外源性核酸已經由RRS媒介的
重組整合至細胞的增強表現基因座內；在轉化的細胞中表現由核酸所編碼的多肽；及從轉染的細胞得到雙特異性抗原結合蛋白。
在某些實施例中，此方法可包括一細胞，其係含有一整合至表現增強基因座內的編碼雙特異性結合蛋白之外源性核酸序列，從外源性核酸序列表現雙抗原結合蛋白；及從細胞得到雙特異性抗原結合蛋白。
圖1.用於增強表現基因座內整合之例示雙特異性選殖策略。輕鏈(「LC」)載體，例如共同輕鏈，及雙重鏈(「HC」)載體(以「*」表示二條HC為不同的，例如HC*在CH3區含有一修飾及/或為密碼子-修飾)係藉由將感興趣抗體的可變區選殖至適當的載體所製造。LC載體的3' RRS位置及雙HC載體之5' RRS位置為相同的並包括在潮黴素(hygromycin)抗性基因之分裂內含子中，經工程化組合及切除此內含子而得以表現由潮黴素抗性基因所編碼的蛋白供有效的重組選擇。箭頭係代表啟動子。
圖2.用於增強表現基因座內整合之例示雙特異性選殖策略。利用具有一5' RRS(RRS1)之通用輕鏈(參見，例如來自Humanized Universal Light Chain(ULC)VelocImmune®小鼠，如WO 2013022782中所述)，藉由將一側接第三RRS(RRS3)之重鏈(HC*)插入含有通用輕鏈之表現匣的預存在質體中，而得以有效建構新的雙特異性抗體。將第二重鏈(HC)以選殖至帶有RRS2和RRS3位置之第二質體。
圖3.用於增強表現基因座內整合之例示雙特異性選殖策略。首先將三條不同的雙特異性抗體之抗體鏈(AbC1、AbC2和AbC3)選殖至個別的載體中。AbC1和AbC3載體各自具有位於抗體表現匣側邊的RRS位置。從AbC2質體切下用於AbC2之表現匣及然後次選殖至AbC3表現質體，產生從5'至3'含有一RRS3位置，AbC2表現匣，AbC3表現匣和RRS2位置之質體。將此質體與AbC1質體及一重組酶一起導入在表現增強基因座中包含RRS1和RRS2之宿主細胞中。在重組酶-媒介的匣交換後，分離出雙特異性抗體表現細胞株。
圖4.用於增強表現基因座內整合之例示雙特異性選殖策略。首先將三條不同的雙特異性抗體之抗體鏈(AbC1、AbC2和AbC3)選殖至個
別的載體中。AbC1和AbC3載體各自具有位於抗體表現匣側邊的RRS位置。從AbC2質體切下用於AbC2之表現匣及然後次選殖至AbC1表現質體，產生從5'至3'含有一RRS1位置，AbC1表現匣，AbC2表現匣和RRS3位置之質體。將此質體與AbC3質體及一重組酶一起導入在表現增強基因座中包含RRS1和RRS2之宿主細胞中。在重組酶-媒介的匣交換後，分離出雙特異性抗體表現細胞株。
圖5.從整合在一基因體位置之表現匣(EESYR®)表現雙特異性抗體。於EESYR®基因座藉由重組酶媒介的匣交換，產生CHO細胞株RSX4189-1、RSX4187-1、RSX4191-1、RSX4188-1。用於EESYR®基因座之雙特異性Ab的三條不同抗體鏈(AbC1、AbC2和AbC3)之表現匣排列係描繪於左方。藉由HPLC測定4天震盪燒瓶培養之消耗的培養基中的各雙特異性抗體之效價並如右方的條狀圖所示。
術語「抗體」，如文中所用，係包括藉由雙硫鍵相連接的四條多肽鏈(二條重(H)鏈和二條輕(L)鏈)所組成的免疫球蛋白分子。各重鏈係包括一重鏈可變區(文中縮寫為HCVR或VH)及一重鏈恆定區。重鏈恆定區係包括三個區CH1、CH2和CH3。各輕鏈係包括一輕鏈可變區(文中縮寫為LCVR或VL)及一輕鏈恆定區。輕鏈恆定區係包括一個CL區。VH和VL區可進一步細分為高變區，稱為互補決定區(CDR)，其間散佈著較保守性區域，稱為框架區(FR)。各VH和VL係由三個CDR和四個FR所組成，以下列順序由胺基端排列至羧基端：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4(重鏈CDR可縮寫為HCDR1、HCDR2和HCDR3；輕鏈CDR可縮寫為LCDR1、LCDR2和LCDR3)。
「抗原結合蛋白」一詞係包括具有至少一CDR之蛋白且能選擇性辨識一抗原，亦即能以至少微莫耳範圍內的KD與抗原結合。治療性抗原結合蛋白(亦即治療抗體)通常需要奈莫耳(nanomolar)或皮莫耳(picomolar)範圍內之KD。典型地，抗原結合蛋白係包括二或多個CDR，例如2、3、4、5或6個CDR。抗原結合蛋白之實例包括抗體、抗體之抗原結
合片段，例如含有抗體之重鏈和輕鏈可變區的多肽(例如Fab片段、F(ab')2片段)，以及含有抗體之重鏈和輕鏈可變區及含有來自重鏈及/或輕鏈恆定區(例如一或多個恆定區，亦即一或多個CL、CH1、CH2和CH3區)之另外胺基酸的蛋白。
「雙特異性抗原結合蛋白」一詞係包括能選擇性結合二或多個表位-在二個不同的分子上(例如抗原)或在相同分子(例如，在相同的抗原上)，或具有不同特異性之抗原結合蛋白。此等蛋白之抗原結合部份或片段抗原結合(Fab)部份係給予特定抗原特異性，且典型地係由一免疫球蛋白之重鏈可變區和輕鏈可變區所組成。在某些情況下，此重鏈可變區和輕鏈可變區可能並非同源對，換言之，具有不同的結合特異性。
雙特異性抗原結合蛋白之實例為「雙特異性抗體」，其係包括能選擇性結合二或多個表位之抗體。雙特異性抗體一般係包括二條不同的重鏈，其中各重鏈係特異性結合不同的表位-在二個不同的分子上(例如抗原)或在相同的分子上(例如，在相同的抗原上)。若雙特異性抗原結合蛋白能選擇性結合二個不同的表位(一第一表位和一第二表位)，則第一重鏈可變區對第一表位的親和力一般將至少低於第一重鏈可變區對第二表位之親和力1至2，或3至4個數量級，且反之亦然。雙特異性抗原結合蛋白，例如雙特異性抗體可包括辨識相同抗原之不同表位的重鏈可變區。點型的雙特異性抗體係具有二條其各自具有三個重鏈CDR之重鏈，接著(N-端至C-端)一CH1區，絞鏈，一CH2區和一CH3區，以及一不會授予抗原結合特異性但可與各重鏈結合之免疫球蛋白輕鏈，或其可與各重鏈結合且其可結合一或多個與重鏈抗原結合區結合之表位，或其可與重鏈結合且能使一或二條重鏈與一或二個表位結合。在一實施例中，Fc區係包括至少CH2和CH3。Fc區可包括一絞鏈，一CH2區及CH3區。
一具體的雙特異性模式包括第一重鏈(HC)，具有修飾的CH3(HC*)之第二重鏈，及共同輕鏈(LC)(相同輕鏈之二條複製鏈)。另外的實施例包括第一重鏈(HC)，共同LC及HC-ScFv融合多肽(其中第二HC係與ScFv的N-端融合)。另外的實施例包括第一HC，同源LC，HC-ScFv融合多肽(其中第二HC係與ScFv的N-端融合)。另外的實施例包括第一重鏈
(HC)，LC及Fc區。另外的實施例包括第一HC，LC，ScFv-Fc融合多肽(其中Fc係與ScFv的C-端融合)。另外的實施例包括第一HC，共同LC，及Fc-ScFv融合多肽(其中Fc係與ScFv的N-端融合)。另外的實施例包括第一HC，LC及ScFv-HC(其中第二HC係與ScFv的C-端融合)。
在特定的實施例中，重鏈(HC)可為天然的或「野生型」序列而第二重鏈可在Fc區經修飾。在其他的實施例中，重鏈(HC)可為天然的或「野生型」序列而第二重鏈可為密碼子-經修飾。
術語「細胞」係包括任何適用於表現重組核酸序列，且具有能供穩定整合及增強外源性核酸表現之任何細胞。細胞包括哺乳動物細胞，例如非人類動物細胞、人類細胞或細胞融合物，例如雜交瘤或四重雜交瘤。在某些實施例中，此細胞為人類、猴子、人猿、倉鼠、大鼠或小鼠細胞。在某些實施例中，此細胞為選自下列細胞之哺乳動物細胞：CHO(例如CHO K1、DXB-11 CHO、Veggie-CHO)、COS(例如COS-7)、視網膜細胞、Vero、CV1、腎(例如HEK293、293 EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK)、HeLa、HepG2、WI38、MRC 5、Colo205、HB 8065、HL-60、(例如BHK21)、Jurkat、Daudi、A431(表皮的)、CV-1、U937、3T3、L細胞、C127細胞、SP2/0、NS-0、MMT 060562、Sertoli細胞、BRL 3A細胞、HT1080細胞、骨髓瘤細胞、腫瘤細胞及衍生自前述細胞之細胞株。在某些實施例中，此細胞係包括一或多個病毒基因，例如表現病毒基因之視網膜細胞(例如PER.C6TM細胞)。
術語「密碼子經修飾」係指編碼蛋白的核苷酸序列在一或多個核苷酸上經修飾，亦即一或多個密碼子在無改變密碼子所編碼的胺基酸下，產生核苷酸序列之密碼子經修飾版本。核苷酸序列之密碼子修飾可在核酸為基礎的分析中從其密碼子經修飾的版本提供區分核苷酸序列之方便基礎(例如，其中包括，雜交為基礎的分析、PCR)。在某些情況下，核苷酸序列的密碼子係藉由應用本項技術中熟知的密碼子最適化技術加以修飾用以在宿主細胞中提供改良的或最適化的編碼蛋白之表現(Gustafsson,C.,et al.,2004,Trends in Biotechnology,22：346-353；Chung,B.K.-S.,et al.,2013,Journal of Biotechnology,167：326-333；Gustafsson,C.,et al.,2012,Protein Expr Purif,83(1)：37-46)。使用此等技術之序列設計軟體工具亦為本項技術所熟知，其包括但不限於Codon optimizer(Fuglsang A.2003,Protein Expr Purif,31：247-249)、Gene Designer(Villalobos A,et al.,2006,BMC Bioinforma,7：285)及OPTIMIZER(Puigbò P,et al.2007,Nucleic Acids Research,35：W126-W131)等等。
「互補決定區」或術語「CDR」一詞係包括由生物的免疫球蛋白基因之核酸序列所編碼的胺基酸序列，其一般(亦即在野生型動物中)係出現在免疫球蛋白分子(例如抗體或T細胞受體)之輕鏈或重鏈可變區的二個框架區之間。一CDR可由，例如，胚源序列或重排或未重排序列，及例如由未成熟或成熟的B細胞或T細胞所編碼。在某些情況下(例如就CDR3)，CDR可由二或多個序列(例如胚原序列)所編碼，其為非相連的(例如未重排的核酸序列)但在B細胞核酸序列中為相連的，例如因剪接或連接序列之結果(例如V-D-J重組而形成一重鏈CDR3)。
術語「表現增強基因座」係指細胞基因體中的基因座其含有一或多個序列，且當一適合的基因或結構為外源性添加(亦即整合)在序列中或接近序列，或「操作上連接」此一或多個序列時，相較於基因體中的其他區或序列，展現較高量的表現。
術語「增強」當用於描述增強表現時係包括在表現上增強至少約1.5-倍至至少約3-倍超越典型地在隨機將外源性序列整合至基因體中或藉由在一不同的基因座整合所觀察到的，例如相較於相同表現結構之單一複製的一批隨機整合物。應用本發明序列所觀察到的倍數-增強表現係在缺乏本發明序列下與相同基因的表現量做比較，於實質上相同的條件下所測量，例如與在另外的基因座整合至相同物種的基因體相比較。增強重組效能包括增強基因座對重組的能力(例如應用重組酶辨識位置(「RRS」))。增強係指重組的效能優於隨機重組，例如無應用重組酶辨識位置或其類似物，其典型地為0.1%。較佳的增強重組效能為優於隨機的約10-倍，或約1%。除非另有指出，否則所聲請的本發明並不限於特定的重組效能。增強表現基因座典型地係藉由宿主細胞支持高生產率之感興趣蛋白。因此，增強的表現包括每細胞之高產量的感興趣蛋白(增強蛋白的克效價)，而非僅是
培養中高細胞複製數所達到的高效價。特異性生產力Qp(pg/細胞/天，亦即pcd)係視為持續生產力之測量值。所希望的為具有Qp大於5 pcd，或大於10 pcd，或大於15 pcd，或大於20 pcd，或大於25 pcd，或甚至大於30 pcd之重組宿主細胞。帶有感興趣基因插入至一增強表現基因座內的宿主細胞，或「hotspot」係具有高單位生產率(specific productivity)。
當「外源性添加基因」、「外源性添加核酸」或簡單地「外源性核酸」係用於有關感興趣基因座時，此詞語係指任何並非出現在自然界所發現的基因座內之感性基因座內的DNA序列或基因。例如，CHO基因座內的「外源性核酸」(例如，包括SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2序列之基因座)，可為並非自然界中特定CHO基因座中所發現之倉鼠基因(亦即，來自倉鼠基因體之另外基因座的倉鼠基因)、來自任何其他物種(例如人類基因)、嵌合基因(例如人類/小鼠)或並非在自然界中所發現存在CHO感興趣基因座內之任何其他基因。
「重鏈」或「免疫球蛋白重鏈」一詞係包括來自任何生物之免疫球蛋白重鏈恆定區序列，除非另有說明係包括一重鏈可變區。重鏈可變區係包括三個重鏈CDR和四個FR區，除非另有說明。典型的重鏈，在可變區之後，係具有(從N-端至C-端)：CH1區、絞鏈、CH2區及CH3區。術語「重鏈之片段」或「重鏈片段」(文中亦稱為"HCF")，係包括至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100個或更多個重鏈胺基酸之胜肽，並可包括一或多個CDR，一或多個CDR與一或多個FR組合，一或多個CH1，絞鏈，CH2或CH3，可變區，恆定區，恆定區之片段(例如CH1、CH2、CH3)或其組合。HCF之實例包括VH，及全長或部分的Fc區。「編碼HCF之核苷酸序列」一詞係包括編碼由HCF所組成的多肽之核苷酸序列以及編碼含有HCF之多肽的核苷酸序列，例如除了特定的HCF之外可含有另外的胺基酸之多肽的核苷酸序列。例如，編碼HCF之核苷酸序列係包括編碼由VH所組成，由VH連接一CH3所組成，由全長重鏈所組成之多肽的核苷酸序列等等。
「同源序列」在核酸序列的內容中係指與參照核酸序列實質上同源之序列。在某些實施例中，在一恰當的殘基延伸上若至少50%、55%、
60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的其對應核苷酸為相同的，則二個序列係視為實質上同源。在某些實施例中，此恰當的殘基延伸為完全的(亦即全長)序列。
「輕鏈」一詞係包括來自任何生物之免疫球蛋白輕鏈恆定區序列，除非另有說明係包括人類κ和λ輕鏈。輕鏈可變(VL)區典型地係包括三個輕鏈CDR和四個框架(FR)區，除非另有說明。一般而言，全長的輕鏈，從胺基端至羧基端，係包括一包含FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4之VL區，及一輕鏈恆定區。可用於本發明之輕鏈包括該等，例如不會選擇性結合與雙特異性抗體選擇性結合之第一或第二表位。適合的輕鏈亦包括該等可結合或促成一或二個與抗體之抗原結合區鍵結的表位結合者。術語「輕鏈之片段」或「輕鏈片段」(或「LCF」)係包括至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100個或更多個輕鏈胺基酸之胜肽，並可包括一或多個CDR，一或多個CDR與一或多個FR組合，可變區，恆定區，恆定區之片段或其組合。LCF之實例包括VL和全長或部分的輕鏈恆定區(「CL」)。「編碼LCF之核苷酸序列」一詞係包括編碼由LCF所組成的多肽之核苷酸序列以及編碼含有LCF之多肽的核苷酸序列，例如除了特定的LCF之外可含有另外的胺基酸之多肽的核苷酸序列。例如，編碼LCF之核苷酸序列係包括編碼由VL所組成，或由全長輕鏈所組成之多肽的核苷酸序列等等。
「操作上連接」一詞係指以所希望的連接分子功能之方式連接核酸或蛋白。當其為功能上彼此相關時，則DNA區為操作上連接。例如，若一啟動子能參與序列的轉錄，則此啟動子係操作上連接一編碼序列；若其放置位置係容許轉譯，則核糖體結合位置係操作上連接一編碼序列。一般而言，操作上連接可包括，但不一定需要接觸。在例如分泌前導序列的情況下，接觸和適當的放置在閱讀框為典型的特色。感興趣基因座之增強表現序列係操作上連接一感興趣基因(GOI)，其中其係與GOI功能上相關，例如其存在造成了GOI增強的表現。
「相同性百分比」，當描述一感興趣基因座時，例如SEQ ID
NO：1或SEQ ID NO：2，或其片段，係指包括同源序列，順著相連的同源性之區域展現所述相同性，但在比較的序列中出現無同源性之缺位、刪除或插入並不納入計算相同性百分比之考量。
如文中所用，例如SEQ ID NO：1或其片段與一物種同源性之間的「相同性百分比」測定，不應包括其中物種同源性不具有同源序列供對齊比較之序列比較(亦即SEQ ID NO：1或其片段在該點有一插入，或物種同源性具有缺位或刪除，視情況而定)。因此，「相同性百分比」不包括缺位、刪除和插入之罰分。
「辨識位置」或「辨識序列」為一藉由核酸酶或其他酵素所辨識之特定DNA序列結合及導向DNA骨架之特定位點裂解。核酸內切酶裂解DNA分子內的DNA。辨識位置在本項技術中亦指辨識目標位置。
「重組酶辨識位置」(或「RRS」)為由重組酶，例如Cre重組酶(Cre)或內翻轉酶(flp)所辨識的特定DNA序列。當一或多個其目標辨識序列係策略性放置在生物體之基因體內時，位點特異性重組酶可進行DNA重排，包括刪除、反轉及易位。在一實例中，Cre係特異性媒介在其DNA目標辨識位置loxP的重組事件，該辨識位置係由二個被8-bp間隙子隔開的13-bp倒置重複所組成。可使用一個以上的重組酶辨識位置，例如，用以幫助重組媒介的DNA交換。亦可使用重組酶辨識位置之變體或突變物，例如lox位置(Araki,N.et al,2002,Nucleic Acids Research,30：19,e103)。
「重組酶媒介的匣交換」或「RMCE」係指用於以一供體匣精確置換基因體匣之方法。用以進行此方法典型所提供的分子組成物係包括1)在5’和3’兩側有對特定重組酶具特異性之辨識目標位置的基因體目標匣，2)側面有配合變識目標位置之供體匣，及3)位點特異性重組酶。重組酶蛋白已為本項技術所熟知(Turan,S.and Bode J.,2011,FASEB J.,25,pp.4088-4107)且在無得失核苷酸下能準確裂解特定辨識目標位置內的DNA(DNA之序列)。一般的重組酶/位置重組酶包括(但不限於)Cre/lox和Flp/frt。市售套組亦提供含有R4-attP位置之載體及編碼用於RMCE之phiC31整合酶的載體(亦參見，例如美國公開申請案第US20130004946號)。
「位點置特異性整合」或「靶向插入」係指用於針對插入或
整合基因或核酸序列至基因體的特定位置之基因靶向方法，亦即，將DNA導向相連的多肽鏈中二個核苷酸之間的特定位置。位點特異性整合或靶向插入亦可就包括多表現單元或卡匣，其各自具有其自我調節元素(例如啟動子、增強子及/或轉錄終止序列)之特定核酸來進行。「插入」和「整合」可交換使用。請了解，依照所用的基因編輯技術，插入一基因或核酸序列(例如包括一表現匣之核酸序列)可能產生(或可經工程化)取代或刪除一或多個核酸。
「穩定整合」係指整合於宿主細胞之基因體中的外源性核酸在細胞培養中保持整合一段延長的時間，例如至少7天，至少10天，至少15天，至少20天，至少25天，至少30天，至少35天，至少40天，至少45天，至少50天，至少55天，至少60天或更長。請了解，製造雙特異性抗原結合蛋白供大規模的生產和純化為一具挑戰的任務。穩定性和無性繁殖性為任何生物分子之再現性所必須，特別是治療上所使用的。由本揭示文之方法所製造的表現雙特異性抗體之選殖株係提供一產生治療性生物分子之一致及可再現的方法。
本揭示文係藉由在宿主細胞中應用一增強表現基因座，提供用於宿主細胞，特別是中倉鼠(Cricetulus griseus)細胞株中增進多肽表現之組成物和方法。更特言之，本揭示文係提供設計用於將共同編碼雙特異性抗原結合蛋白之多外源性核酸整合至一宿主細胞例如CHO細胞中的增強表現基因座內特定位置之組成物和方法。特言之，本揭示文係提供含有整合在一增強表現基因座內於特定位置的多外源性核酸之細胞，其中該多外源性核酸係共同編碼雙特異性抗原結合蛋白。本揭示文進一步係提供設計用於多外源性核酸之位點特異性整合至一增強表現基因座之核酸載體。本揭示文另外係提供一系統，該系統包括一含有二或多個重組酶辨識位置(RRS)之宿主細胞以及一組含有相配的RRS和多外源性核酸之載體，用於來自載體的多外源性核酸之位點特異性整合至一增強表現基因座中。另外，本揭示文係提供使用文中所述的細胞、載體及系統來製造雙特異性抗原結合蛋白之方法。
在一方面，本揭示文係提供含有整合於增強表現基因座內在特定位置的多外源性核酸之細胞，其中該外源性核酸序列係編碼雙特異性抗原結合蛋白。
文中所提供的細胞能產生具有高效價及/或高單位生產率(pg/細胞/天)之雙特異性抗原結合蛋白(例如雙特異性抗體)。在某些實施例中，一細胞係產生至少5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L、25mg/L、30mg/L、35mg/L、40mg/L、45mg/L、50mg/L或更大效價之雙特異性抗原結合蛋白。在某些實施例中，一細胞係產生至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、50%或更高之雙特異性抗原結合蛋白效價與總抗原結合蛋白比率的雙特異性抗原結合蛋白。在某些實施例中，以每天每個細胞所產生的總抗原結合蛋白(以pg表示)為基準所測，一細胞係產生具有至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15皮克/細胞/天(pcd)或更高單位生產率的雙特異性抗原結合蛋白。
在某些實施例中，雙特異性抗原結合蛋白係含有二段具有不同抗原特異性之HC片段(「HCF」)及二段LCF。在其中使用二個VL區之情況下，其可為相同或不同的。在特定的實施例中，二個VL區為相同的，例如共同輕鏈。
在某些實施例中，各二段HCF係包括來自重鏈恆定區的胺基酸，例如CH1、CH2或CH3。在特定的實施例中，各二段HCF係包括CH3區。在一特別的實施例中，各二段HCF係包括一恆定區，亦即全長的恆定區。
在某些實施例中，各二段HCF係包括一VH，且這二個VH可為相同或不同的。
在某些實施例中，此雙特異性抗原結合蛋白係包括二條重鏈(亦即二條全長重鏈)。
在某些實施例中，各二段LCF係包括一VL。在特定的實施例中，各LCF係由一操作上連接一胺基酸序列的VL區所組成，而該胺基酸序列係包括來自輕鏈恆定區的胺基酸。在特定的實施例中，各VL區係操
作上連接一CL區，亦即，此雙特異性抗原結合蛋白係包括一輕鏈(亦即全長輕鏈)。
在某些實施例中，整合在增強表現基因座內的外源性核酸序列係包括一含有編碼第一LCF之核苷酸序列的第一外源性核酸，一含有編碼第一HCF之核苷酸序列的第二外源性核酸，以及含有編碼第二HCF之核苷酸序列的第三外源性核酸。
在某些實施例中，編碼第一LCF之核苷酸序列可編碼一輕鏈可變(VL)區序列。在特定的實施例中，編碼第一VL區的核苷酸序列係編碼第一輕鏈
在某些實施例中，編碼第一HCF之核苷酸序列係編碼來自第一重鏈恆定區的胺基酸，例如一或多個CH1、絞鏈、CH2或CH3)，而編碼第二HCF的核苷酸序列係編碼來自第二重鏈恆定區的胺基酸。來自第一重鏈恆定區的胺基酸與來自第二重鏈恆定區的胺基酸可相同或不同。例如，編碼第一HCF的核苷酸序列係編碼第一CH3區，而編碼第二HCF之核苷酸序列係編碼第二CH3區，其中第一和第二CH3區可為相同的，或在有一或多個胺基酸位置為不同的，如下文雙特異性抗原結合蛋白中所述。
在某些實施例中，編碼第一HCF之核苷酸序列係編碼第一VH，而編碼第二HCF之核苷酸序列係編碼第二VH。
在某些實施例中，編碼第一HCF之核苷酸序列係編碼一第一重鏈，而編碼第二HCF之核苷酸序列係編碼一第二重鏈。第一和第二重鏈可具有相同的恆定區，或在一或多個胺基酸為不同的。具有不同重鏈恆定區(例如不同的CH3區)之各種雙特異性抗原結合蛋白的實例係進一步描述於下文。與編碼的胺基酸序列無關，編碼來自二個重鏈恆定區之胺基酸的核苷酸序列可不相同，其中二個編碼核苷酸序列其中之一可為密碼子經修飾，其係提供以核酸為基礎的偵測分析區別二個核苷酸序列之方便基準。
在某些實施例中，各HCF-或LCF-編碼核苷酸序列係獨立地及操作上連接含有一啟動子之轉錄調節序列。就「獨立地」，其係指各編碼序列係操作上連接一個別的轉錄調節序列，例如啟動子，使得編碼序列的
轉錄係處於個別的調整和控制下。在某些實施例中，引導二條含HCF多肽轉錄之啟動子為相同的。在某些實施例中，引導二條含HCF多肽轉錄之啟動子，以及引導含LCF多肽轉錄之啟動子皆為相同的，例如CMV啟動子。在某些實施例中，各HCF-或LCF-編碼核苷酸序列係獨立地及操作上連接一誘發或抑制啟動子。誘發或抑制啟動子使得生產製造僅在生產階段(給料分批培養)而非在生長階段期間(種子培養)發生。各基因產物之良好的生產控制(表現)可藉由不同的啟動子來達成。
在一此實例中，將細胞先工程化用以表現四環黴素抑制蛋白(TetR)並將各HCF-和LCF-編碼核苷酸序列置於啟動子之轉錄控制下，其活性係由TetR所調節。將二個縱排的TetR操縱子(TetO)置於CMV啟動子的正下游處。在某些實施例中，各HCF-及/或LCF-編碼核苷酸序列係獨立地及操作上連接至少一TetR操縱子(TetO)或Arc操縱子(ArcO)之啟動子上游。在其他的實施例中，各HCF-及/或LCF-編碼核苷酸序列係獨立地及操作上連接CMV/TetO或CMV/ArcO雜交啟動子。另外適合的啟動子係描述於下。
基因座內多外源性核酸序列的相對位置可為多樣的。不希望受限於任何理論，咸信重要地係達到二條含HCF多肽之平衡(亦即相當的)表現量。在某些實施例中，LCF編碼核酸係位於相對二個HCF-編碼核酸的上游。在其中三個用於引導含LCF多肽及二條含HCF多肽表現之啟動子為相同的情況下，適合的排列從5'至3'可包括編碼LCF的核苷酸序列，操作上連接一核苷酸序列之另外不同的啟動子(例如篩選標記基因)，以及編碼第二HCF之核苷酸序列。其他適合的排列從5'至3'係包括編碼LCF的核苷酸序列，操作上連接一核苷酸序列之另外不同的啟動子(例如篩選標記基因)，編碼第一HCF的核苷酸序列，以及編碼第二HCF的核苷酸序列。當編碼HCF之核苷酸序列係編碼一恆定區序列時，位於上游的核苷酸序列可編碼一修飾版本的恆定區序列(例如經修飾的CH3)，或位於上游的核苷酸序列可編碼一修飾版本的恆定區序列而另一個序列係編碼未經修飾版本的恆定區序列。
在某些實施例中，此細胞進一步係含有一或多個RRS，其亦整合於基因座內。在某些實施例中，此細胞係包括彼此互異及在外源性
核酸序列側邊的第一和第二RRS，其中該外源性核酸序列依次係含有一第一LCF-編碼核酸，一第一HCF-編碼核酸以及一第二HCF-編碼核酸。在特定的實施例中，LCF編碼核酸係位於相對二個HCF-編碼核酸的上游，且此細胞係包括一第三RRS，其係位於相對第一LCF-編碼核酸之3'，及相對於一或二個HCF-編碼外源性核酸之5'，其中該第三RRS與第一和第二RRS為不同的。第三RRS可經工程化而包括在一基因的內含中，其可置於任何二個HCF-或LCF-編碼序列之間。
適用於本揭示所述的細胞、載體和系統中選殖和製造之雙特異性抗原結合蛋白，例如雙特異性抗體並不限於任何特定形式之雙特異性抗原結合蛋白。
在各種實施例中，此雙特異性抗原結合蛋白係包括二條多肽，其各自含有一抗原結合部份(例如VH區)及CH3區，其中二條多肽的抗原結合部份係具有不同的抗原特異性，且其中二個CH3區，就有關彼此在其中一個CH3區於至少一個胺基酸位置係經修飾而在二條多肽間產生有差別的A蛋白結合特性而言，為異源二聚性。參見，例如美國專利8,586,713中所述的雙特異性抗體。在此方式中，可應用差別性A蛋白分離流程從同源二聚物中容易地分離此異源二聚性雙特異性抗原結合蛋白。
在某些實施例中，此雙特異性抗原結合蛋白係包括二條重鏈，其具有不同抗原特異性及在至少一個CH3區的胺基酸位置為不同的而得到二條重鏈間具差別的A蛋白結合特性。
在某些實施例中，二條多肽係含有人類IgG之CH3區，二條多肽中的其中之一係含有選自IgG1、IgG2和IgG4之人類IgG CH3區，而二條多肽中的另一條係含有選自IgG1、IgG2和IgG4之經修飾的人類IgG CH3區，其中此修飾係降低或消除經修飾的CH3區與A蛋白的結合。在特定的實施例中，二條多肽中的其中一條係含有人類IgG1 CH3區，而二條多肽中的另一條係含有經修飾的人類IgG1 CH3區，其中該修飾係由下列組成之群中選出：IMGT外顯子編號系統之(i)95R及(ii)95R和96F。在其他特定的實施例中，經修飾的CH3區係包括1至5個由下列組成之群中選出之
另外的修飾：IMGT外顯子編號系統之16E、18M、44S、52N、57M和82I。
在其他各種實施例中，二條多肽係含有小鼠IgG CH3區，其中二條多肽中的其中一條係含有未修飾小鼠IgG CH3區，而二條多肽中的另一條係含有經修飾的小鼠IgG CH3區，其中此修飾係降低或消除經修飾的CH3區與A蛋白的結合。在各種實施例中，小鼠IgG CH3區係經修飾而在由下列組成之群中選出的特定位置包括特定的胺基酸(EU編號)：252T、254T，及256T；252T、254T、256T，及258K；247P、252T、254T、256T，及258K；435R和436F；252T、254T、256T、435R及436F；252T、254T、256T、258K、435R和436F；24tP、252T、254T、256T、258K、435R和436F；及435R。在特定的實施例中，係製造一群由下列組成之群中選出的特別修飾群：M252T、S254T、S256T；M252T、S254T、S256T、I258K；I247P、M252T、S254T、S256T、I258K；H435R、H436F；M252T、S254T、S256T、H435R、H436F；M252T、S254T、S256T、I258K、H435R、H436F；I247P、M252T、S254T、S256T、I258K、H435R、H436F；及H435R。
在各種實施例中，雙特異性抗原結合蛋白為小鼠與大鼠單株抗體或抗原結合蛋白之雜交，例如小鼠IgG2a和大鼠IgG2b之雜交。根據這些實施例，雙特異性抗體係由包括各自一重鏈/輕鏈對經由其Fc部分結合之二種抗體的異源二聚物所組成。所欲的異源二聚物可容易地從二種親代抗體同源二聚物和雙特異性異源二聚物之混合物中純化，因為雙特異性抗體和A蛋白的結合性質與親代抗體為不同的：大鼠IgG2b不會與A蛋白結合，而小鼠IgG2a則會。因此，在比小鼠IgG2a同源二聚物更高的pH時，小鼠-大鼠異源二聚物會與A蛋白結合而溶離物則不會，且此項促成了雙特異性異源二聚物之選擇性純化。
在其他各種實施例中，雙特異性抗原結合蛋白為在本項技術中稱作結節入孔(「knobs-into-holes」)之形式(參見，例如美國專利第7,183,076號)。在這些實施例中，二種抗體的Fc部份係經工程化而產生一突出的結節(「knob」)，而另一個為互補的孔(「hole」)。當於相同的細胞中製造時，藉由工程化之結節與工程化之孔的結合，重鏈據稱係優先形成異源二聚物而非同源二聚物。
在另外的實施例中，第一重鏈和第二重鏈係在CH3區包括一或多個胺基酸修飾使二條重鏈間能相互作用。CH3-CH介面的胺基殘基可以帶電的胺基酸取代，以提供靜電上不利的同源二聚體形成(參見，例如PCT公開案號WO2009089004；及歐洲公開案號EP1870459)。
在其他的實施例中，第一重鏈係包括一同型IgA CH3區而第二重鏈係包括IgG CH3區(或反之亦然)，以促進異源二聚物優先形成(參見，例如PCT公開案號WO2007110205.)。
在其他的實施例中，各種形式可藉由工程化方法與免疫球蛋白鏈合併，而促進異源二聚物形成，例如Fab-臂交換(PCT公開案號WO2008119353；PCT公開案號WO2011131746)、捲曲螺旋區相互作用(PCT公開案號WO2011034605)或白胺酸拉鏈胜肽(leucine zipper peptide)(Kostelny,et al.J.Immunol.1992,148(5)：1547-1553)。
可用於產生雙特異性抗原結合蛋白之免疫球蛋白重鏈可變區可使用任何本項技術已知的方法來產生。例如，第一重鏈係包括由一核酸所編碼的可變區，而該核酸係衍生自經第一抗原免疫化之第一動物成熟B細胞的基因體，且該第一重鏈係特異性辨識此第一抗原；及第二重鏈係包括由一核酸所編碼的可變區，而該核酸係衍生自經第二抗原免疫化之第二動物成熟B細胞的基因體，且該第二重鏈係特異性辨識此第二抗原。免疫球蛋白重鏈可變區序列亦可藉由本項技術中已知的其他方法來獲得，例如藉由噬菌體展示。在其他的實例中，編碼重鏈可變區的核酸係包括該等已描述或另外在本項技術可取得的抗體。在某些實施例中，二條重鏈編碼序列的其中一條密碼子係經修飾，以便提供以核酸為基準的分析區分二條編碼序列之方便基準。
包括辨識二個不同表位(或二種不同抗原)之二條重鏈的雙特異性抗體，當其可與相同輕鏈(亦即具有相同可變區和恆定區的輕鏈)配對時，則更容易分離。用於產生可與二條不同特異性之重鏈配對，而不會干擾或不會實質上干擾重鏈可變區對其目標抗原之選擇性及/或親和力的輕鏈之各種方法已為本項技術所知，如，例如美國專利8,586,713及文中所揭示的技術所述。
雙特異性抗原結合蛋白可具有各種的雙抗原特異性及相關有用的應用。
在某些實例中，包括對腫瘤抗原和T-細胞抗原具結合特異性之雙特異性抗原結合蛋白可使其以一細胞上的抗原，例如CD20為標靶，以及以T細胞上的抗原，例如T細胞受體如CD3為標靶。就此，雙特異性抗原結合蛋白係以病患的感興趣細胞(例如淋巴病患的B細胞，經由CD20結合)以及病患的T細胞二者為標靶。雙特異性抗原結合蛋白，在各種實施例中，係經設計得以在結合T細胞受體，例如與CD3結合後活化T細胞，因而將T細胞活化與特定選擇的腫瘤細胞結合。
在其中一部分係與CD3結合而另一部份係與目標抗原結合之雙特異性抗原結合蛋白的情況下，目標抗原可為腫瘤相關抗原。特定的腫瘤相關抗原之非限定實例包括，例如AFP、ALK、BAGE蛋白、BIRC5(survivin)、BIRC7、β-catenin、brc-abl、BRCA1、BCMA、BORIS、CA9、碳酸酐酶IX、caspase-8、CALR、CCR5、CD19、CD20(MS4A1)、CD22、CD30、CD40、CDK4、CEA、CLEC-12、CTLA4、cyclin-B1、CYP1B1、EGFR、EGFRvIII、ErbB2/Her2、ErbB3、ErbB4、ETV6-AML、EpCAM、EphA2、Fra-1、FOLR1、GAGE蛋白(例如GAGE-1、-2)、GD2、GD3、GloboH、glypican-3、GM3、gp100、Her2、HLA/B-raf、HLA/k-ras、HLA/MAGE-A3、hTERT、LMP2、MAGE蛋白(例如MAGE-1、-2、-3、-4、-6和-12)、MART-1、間皮素(mesothelin)、ML-IAP、Muc1、Muc2、Muc3、Muc4、Muc5、Muc16(CA-125)、MUM1、NA17、NY-BR1、NY-BR62、NY-BR85、NY-ESO1、OX40、p15、p53、PAP、PAX3、PAX5、PCTA-1、PLAC1、PRLR、PRAME、PSMA(FOLH1)、RAGE蛋白、Ras、RGS5、Rho、SART-1、SART-3、Steap-1、Steap-2、TAG-72、TGF-β、TMPRSS2、Thompson-nouvelle抗原(Tn)、TRP-1、TRP-2、酪胺酸酶及uroplakin-3。
在某些實施例中，此雙特異性抗原結合蛋白係由下列組成之群中選出：抗-CD3 x抗-CD20雙特異性抗體(如描述於美國專利申請案公開案號US2014/0088295A1和US20150266966A1，係以引用的方式併入文中)，抗-CD3 x抗-Mucin 16雙特異性抗體(例如抗-CD3 x抗-Muc16雙特異性抗
體)及抗-CD3 x抗-前列腺特異性膜抗原雙特異性抗體(例如抗-CD3 x抗-PSMA雙特異性抗體)。在其他的實施例中，此雙特異性抗原結合蛋白係包括一結合CD3之部分。例示的抗-CD3抗體部份係描述於美國專利申請案公開案號US2014/0088295A1和US20150266966A1中，及2017年3月30日公開的國際公開案號WO 2017/053856，其全部係以引用的方式併入文中)。又在其他的實施例中，此雙特異性抗原結合蛋白係包括一結合CD3之部份及一結合BCMA、CD19、CD20、CD28、CLEC-12、Her2、HLA2蛋白、MAGE蛋白、Muc16、PSMA或Steap-2之部份。
在其中一部份係與T細胞受體如CD3結合而另一部份係與目標抗原結合之雙特異性抗原結合蛋白的情況下，目標抗原可為感染性疾病-相關抗原。感染性疾病-相關抗原之非限定實例包括，例如表現在病毒顆粒表面上，或優先表現在經病毒感染的細胞上之抗原，其中該病毒係由下列組成之群中選出：HIV、肝炎(A、B或C)、皰疹病毒(例如HSV-1、HSV-2、CMV、HAV-6、VZV、埃-巴病毒(Epstein Barr virus))、腺病毒、流感病毒、黃病毒、伊科病毒、鼻病毒、柯薩奇病毒疹、冠狀病毒、呼吸道融合瘤病毒、腮腺炎病毒、輪狀病毒、麻疹病毒、德國麻疹病毒、微小病毒、牛痘病毒、HTLV、登革熱病毒、乳突病毒、軟疣病毒、小兒麻痺病毒、狂犬病病毒、JC病毒及蟲媒病毒性腦炎病毒。另外，目標抗原可為表現在細菌表面，或優先表現在經細菌感染的細胞上之抗原，其中該細菌係由下列組成之群中選出：衣原體(chlamydia)、立克次體(rickettsia)、分枝桿菌(mycobacteria)、葡萄球菌(staphylococci)、鏈球菌(streptococci)、肺炎雙球菌(pneumonococci)、腦膜炎球菌(meningococci)、淋病球菌(gonococci)、克雷伯氏菌(klebsiella)、變形桿菌(proteus)、沙雷氏菌(serratia)、假單胞菌(pseudomonas)、退伍軍人菌(legionella)、白喉菌(diphtheria)、沙門氏菌(salmonella)、桿菌(bacilli)、霍亂菌(cholera)、破傷風菌(tetanus)、肉毒桿菌(botulism)、炭疽病菌(anthrax)、瘟疫菌(plague)、鉤端螺旋體(leptospira)及萊姆病菌(Lyme disease bacteria)。在特定的實施例中，目標抗原為表現在真菌表面，或優先表現在經真菌感染的細胞上之抗原，其中該真菌係由下列組成之群中選出：念珠菌(Candida)(白色念珠菌(albicans)、克柔念珠菌(krusei)、
光滑念珠菌(glabrata)、熱帶念珠菌(tropicalis)等)、新型隱球菌(Crytococcus neoformans)、麴菌(Aspergillus)(煙麴黴菌(fumigatus)、黑麴菌(niger)等)、毛黴目(毛黴屬(mucor)、犁頭黴屬(absidia)、根黴屬(rhizopus)等)、申克氏孢子絲菌(Sporothrix schenkii)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、巴西副孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)及組織胞漿菌(Histoplasma capsulatum)。在特定的實施例中，目標抗原可為表現在寄生蟲表面，或優先表現在經寄生蟲感染的細胞上之抗原，其中該寄生蟲係由下列組成之群中選出：痢疾阿米巴原蟲(Entamoeba histolytica)、結腸小袋絛蟲(Balantidium coli)、福氏耐格裡變形蟲(Naegleriafowleri)、棘阿米巴原蟲(Acanthamoeba sp.)、梨型鞭毛蟲(Giardia lambia)、隱孢子蟲(Cryptosporidium sp.)、陰道毛滴蟲(Pneumocystis carinii)、間日瘧原蟲(Plasmodium vivax)、果氏巴貝蟲(Babesia microti)、布氏錐蟲(Trypanosoma brucei)、枯西氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)、杜氏利什曼原蟲(Leishmania donovani)、弓漿蟲(Toxoplasma gondii)、巴西鼠鉤蟲(Nippostrongylus brasiliensis)、狐絛蟲(Taenia crassiceps)及馬來血絲蟲(Brugia malayi)。特異性病原-相關抗原之非限定實例包括，例如HIV gp120、HIV CD4、B型肝炎糖蛋白L、B型肝炎糖蛋白M、B型肝炎糖蛋白S、C型肝炎E1、C型肝炎E2、肝細胞特異性蛋白、單純皰疹病毒gB、巨細胞病毒gB及HTLV套膜蛋白。
亦可製造包括二個各自針對相同細胞表面上的結合夥伴(亦即各自針對不同目標)之結合部份的雙特異性結合蛋白。此項設計特別適合以表現相同細胞表面上的雙標靶之特定細胞或細胞類型為標靶。雖然目標可能個別出現在其他細胞上，但這些結合蛋白的結合部份係經選擇而使得各結合部份以相當低的親和力與其標靶結合(例如低微莫耳濃度，或高奈莫耳濃度-例如超過100奈莫耳濃度KD，例如500、600、700、800奈莫耳濃度)。以此種方法，僅在相同細胞上二個標靶為接近的情況下，延長標靶結合為有利的。
可製造包括二個結合相同標靶之結合部份(各自在相同標靶的不同表位上)的雙特異性結合蛋白。此項設計特別適用於讓成功阻斷標靶
與結合蛋白之可能性達到最大。跨膜通道或細胞表面受體之多胞外環區可為該相同雙特異性結合分子之標靶。
可製造包括二個群集及活化負免疫訊號傳遞之調節因子而造成免疫抑制之結合部份的雙特異性結合蛋白。當標靶係位於相同細胞時，可能達到抑制順式(cis)；當標靶係位於不同細胞時，可能達到抑制反式(cis)。以具有抗-IgGRIIb結合部份及抗-FelD1結合部份之雙特異性結合蛋白可達到抑制順式，如此IgGRIIb僅在FelD1存在時群集以便下調對之FelD1免疫反應。以具有抗-BTLA結合部份及特異性結合一組織特異性感興趣抗原之結合部份的雙特異性結合蛋白可達到抑制反式，如此群集的抑制性BTLA分子僅在所選的目標組織中發生，其可能解決自體免疫疾病。
可製造活化多組份受體之雙特異性結合蛋白。在此項設計中二種針對二種受體結合組份之結合部份係與此受體交聯，並活化來自此受體的訊號傳遞。此項可，例如使用帶有結合IFNAR1之結合部份及結合IFNAR2之結合部份的雙特異性結合蛋白，結合交聯此受體來進行。此雙特異性結合蛋白可提供干擾素治療的替代選擇。
可製造傳送穿過半滲透屏障，例如血液-腦屏障之結合部份的雙特異性結合蛋白。在此項設計中，一結合部份係與可通過特定選擇性屏障的標靶結合；另一結合部份係以具有治療活性之分子為目標，其中具有治療活性之目標分子一般不能穿過此屏障。此類的雙特異性結合蛋白可用於將治療劑帶到治療可能無法到達的組織。一些實例包括以pIGR受體為標靶運送治療劑至腸道或肺，或以運鐵蛋白受體為標靶運送治療劑穿過血液-腦屏障。
可製造運送結合部份至特定細胞或細胞類型之雙特異性結合蛋白。在此項設計中，一結合部份係以容易內化至細胞內的細胞表面蛋白(例如受體)為標靶。另一結合部份係以胞內蛋白為標靶，其中胞內蛋白之結合產生了治療效用。
與吞噬細胞性免疫細胞之表面受體和感染病原(例如酵母菌或細菌)之表面分子結合的雙特異性結合蛋白，將感染病原帶到吞噬細胞免疫細胞附近以促進病原之吞噬作用。此一設計的實例可為以CD64或CD89
分子以及病原為標靶的雙特異性抗體。
具有一抗體可變區作為一結合部份及一非-Ig部份作為第二結合部份的雙特異性結合蛋白。此抗體可變區可達到命中目標，而該非-Ig部份為一效應子或連接Fc之毒素。在此方法中，配體(例如效應子或毒素)係遞送至與抗體可變區結合的標靶。
具有二個各自與Ig區(例如含有CH2和CH3區之Ig序列)結合部份的雙特異性結合蛋白在Fc情況下可帶到彼此鄰近處。此項設計的實例包括陷阱(trap)，例如同源-或異源二聚物陷阱分子。
適合用於本發明之增強表現基因座包括例如，包括一具有與美國專利8,389,239中所述的SEQ ID NO：1實質同源之核苷酸序列的基因座(文中亦稱為「EESYR®基因座」)，包括一具有與美國申請案序號14/919,300中所述的SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3實質同源之核苷酸序列的基因座(文中亦稱為YARS®基因座」)，及其他增強表現基因座及本項技術中所登載的序列(例如US 20150167020A1和美國專利6,800,457)。
在某些實施例中，用於本發明之增強表現基因座係選自包括一具有與SEQ ID NO：1實質同源之核苷酸序列的基因座，或包括一具有與SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3實質同源之核苷酸序列的基因座。這些基因座含有特定的序列，其相較於基因體內的其他序列，不僅提供整合在可操作連接此序列(亦即在此序列內或及接近此序列內)之基因的增強表現，亦展現更佳的重組效能及增進整合穩定性。
已從CHO細胞辨識出SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3。已發現其他的哺乳動物物種(例如人類或小鼠)對此辨識出的增強表現區具有局限的同源性；然而可在灰倉鼠(Cricetulus griseus)或其他同源物種之衍生自其他組織類型的細胞株中發現同源序列，並且可藉由本項技術中熟知的技術加以分離。例如，可藉由交叉物種雜交或以PCR為基礎的技術辨識其他同源序列。此外，藉由本項技術中熟知的定點或隨機突變技術可改變SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3中所列的核苷酸序列。然後可將所產生的變體進行增強表現活性之檢測。藉由例行的實驗可
將與具有增強表現活性SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3有至少約90%核酸相同性之DNA分離，其預期係具有增強表現活性。
整合位置，一或多個外源性核酸之插入位置或核苷酸位置，可在任何增強表現序列(例如SEQ ID NO：1,SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3)內或鄰接的任何位置。感興趣基因座內或與其鄰接的特異性染色體位置是否支持穩定整合及有效率的轉錄此整合的外源性基因，可根據本項技術中熟知的標準程序來測定，例如，如美國專利8,389,239和美國申請案序號14,919,300所述。
文中所考量的整合位置係位於增強表現序列內，或極接近此序列內，例如就有關染色體DNA上之增強表現序列的位置而言，係低於約1kb，500鹼基對(bp)、250bp、100bp、50bp、25bp、10bp或低於5bp上游(5’)或下游(3’)。又在一些其他實施例中，就有關染色體DNA上之增強表現序列的位置而言，所應用的整合位置係位於約1000、2500、5000或更高鹼基對上游(5’)或下游(3’)。
請了解在本項技術中大的基因體區，例如骨架/基質連接區，係用於有效複製及轉錄染色體DNA。骨架/基質連接區(S/MAR)亦稱為骨架-連接區(MAR)，為其中連接核基質之真核細胞基因體DNA區。無受限於任一理論，S/MAR典型地係繪出非-編碼區，隔開一特定轉錄區(例如染色質區)及其鄰接區，且亦為此機制及/或得以轉錄之因子結合提供平檯，例如用於DNA酶或聚合酶之辨識位置。某些S/MAR經定性出長度為約14-20kb(Klar,et al.2005,Gene 364：79-89)。因此，在增強表現基因座之基因整合(例如在接近或SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3內)預期係賦予增強的表現。在某些實施例中，包括一整合在增強表現基因座內特定位置的外源性核酸序列的宿主細胞，其中該核酸係編碼雙特異性抗原結合蛋白，係具有高單位生產率。在其他的實施例中，此雙特異性抗原結合蛋白-編碼宿主細胞係具有至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或30皮克/細胞/天(pcd)之單位生產率。
在某些實施例中，整合位置係在包括SEQ ID NO：1核苷酸序列的基因座內。在特定的實施例中，整合位置係在SEQ ID NO：1核苷酸
序列內或極接近SEQ ID NO：1核苷酸序列內。在特別的實施例中，整合位置係在由編號10-13,515；20-12,020；1,020-11,020；2,020-10,020；3,020-9,020；4,020-8,020；5,020-7,020；6,020-6,920；6,120-6,820；6,220-6,720；6,320-6,620；6,420-6,520；6,460-6,500；6,470-6,490；及6,475-6,485之核苷酸跨越位置選出的SEQ ID NO：1內的位置。在其他的實施例中，整合位置係在由SEQ ID NO：1之5,000-7,400、5,000-6,500、6,400-7,400核苷酸；及SEQ ID NO：1之6,400-6,500核苷酸組成之群中選出的序列內。在一特定的實施例中，整合位置係在SEQ ID NO：1之6471至6473核苷酸序的「作用(act)」三聯體之前，之後或之內。
在某些實施例中，整合位置係在包括SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3核苷酸序列的基因座內。在特定的實施例中，整合位置係在SEQ ID NO：2之核苷酸序列內或極接近SEQ ID NO：2核苷酸序列內。在特定的實施例中，整合位置係在SEQ ID NO：3之核苷酸序列內或極接近SEQ ID NO：3核苷酸序列內。在某些實施例中，整合位置係在SEQ ID NO：3之核苷酸1990-1991、1991-1992、1992-1993、1993-1994、1995-1996、1996-1997、1997-1998、1999-2000、2001-2002、2002-2003、2003-2004、2004-2005、2005-2006、2006-2007、2007-2008、2008-2009、2009-2010、2010-2011、2011-2012、2012-2013、2013-2014、2014-2015、2015-2016、2016-2017、2017-2018、2018-2019、2019-2020、2020-2021或2021-2022內。在特定的實施例中，整合係在SEQ ID NO：3之2001-2022核苷酸上或之內。在某些實施例中，外源性核係插入在SEQ ID NO：3之2001-2002核苷酸或2021-2022核苷酸上或之內，以及由於插入而刪除SEQ ID NO：3之2002-2021核苷酸。
以位點特異性方式將多外源性核酸整合至增強表現基因座內，亦即如文中所述之增強表現基因座內的一特定位置，可以數種方式來達成，包括，例如藉由如本項技術中所述之同源性重組及重組酶媒介的匣交換(參見，例如美國專利8,389,239及文中所揭示的技術)。
在某些實施例中，係提供在增強表現基因座內含有至少二個，
亦即二或多個不同重組酶辨識序列(RRS)，方便供整合含有多外源性核酸或感興趣基因之核酸的細胞。此等細胞可用各種方法藉由導入含有二或多個RRS之外源性核酸至一所欲的基因座內來獲得，包括同源性重組，如下文中所述及本項技術，例如美國專利8,389,239及文中所述的技術。
在特定的實施例中，係提供在增強表現基因座內含有二個以上的不同重組酶辨識序列(RRS)，方便供整合多外源性核酸的細胞。在特別的實施例中，係提供在增強表現基因座內含有三個不同重組酶辨識序列(RRS)的細胞，其可媒介二種個別外源性核酸之整合，其中基因體之5' RRS和中間的RRS係與在第一核酸側邊的5' RRS及3' RRS相配以供整合，及基因體中間的RRS和3' RRS係與在第二外源性核酸側邊的5' RRS和3' RRS相配以供整合。
適合的RRS可選自包括LoxP、Lox511、Lox5171、Lox2272、Lox2372、Loxm2、Lox-FAS、Lox71、Lox66及其突變體之群，其中位點特異性重組酶為Cre重組酶或其衍生物係用於進行重組酶-媒介的匣交換(RMCE)。在其他的實例中，適合的RRS可選自包括FRT、F3、F5、FRT突變體-10、FRT突變體+10及其突變體之群，且在此狀況下，係使用位點特異性重組酶Flp重組酶或其衍生物來進行RMCE。又在另外的實例中，RRS可選自包括attB、attP及其突變體之群，且在此狀況下其中係使用位點特異性重組酶phiC31整合酶或其衍生物來進行RMCE。
在其他的實施例中，係藉由同源性重組技術修飾天然細胞用以將含有多外源性核酸之核酸序列整合至增強表現基因座內的特定位置。
就同源重組，係將同源多核苷酸分子(亦即同源臂)列出並交換一段其序列。若一轉殖基因側邊為同源基因體序列，則在此交換期間可導入此轉殖基因。在一實例中，重組酶辨識位置可於整合位置經由同源性重組導入宿主細胞基因體中。在其他的實例中，係將含有多外源性核酸之核酸序列，例如共同編碼雙特異性抗原結合蛋白之多核酸，其中核酸的側邊有與目標基因座中的序列同源之序列(「同源臂」)，插入宿主基因體中。
真核細胞之同源性重組可藉由在整合位置導入一染色體DNA斷裂來促進。此項可藉由將特定核酸酶瞄準整合的特定位置來進行。
在目標基因座辨識DNA序列的DNA-結合蛋白已為本項技術所知。基因靶向載體亦可用於促進同源性重組。
用以進行同源性重組之基因靶向載體結構及核酸酶選擇係在本發明所屬之熟習技術者的技術內。在某些實例中，具有一模組結構及含有個別的鋅指區之鋅指核酸酶(ZFN)，係辨識目標序列中一特別的3-核苷酸序列(例如鎖定的整合位置)。某些實施例可利用ZFN與以多目標序列為標靶之個別鋅指區的組合。亦可應用類轉錄活化因子(TAL)效應子核酸酶(TALEN)進行位點特異性基因體編輯。典型地係利用TAL效應子蛋白DNA-結合區與限制核酸酶之非特異性裂解區之組合，例如FokI。在某些實施例中，係利用包括TAL效應子蛋白DNA-結合區及限制核酸酶裂解區之融合蛋白來辨識及裂解本發明基因座內之目標序列的DNA(Boch J et al.,2009 Science 326：1509-1512)。RNA-引導的核酸內切酶(RGEN)為可編程基因體工程化工具，其係由細菌適應性免疫機制所開發出。在此系統中-群集的規律間隔短回文重複序列(CRISPR)/CRISPR-相關的(Cas)免疫反應-當與二個RNA複合時(其中一個係引導目標選擇)，Cas9蛋白形成一序列特異性核酸內切酶。RGEN係由組份(Cas9和tracrRNA)及一目標特異性CRISPR RNA(crRNA)所組成。DNA目標裂解之效能及裂解位置的所在處二者係以前間隔序列鄰近膜體的位置為基準而變，另外需要目標辨識(Chen,H.et al,J.Biol.Chem.於2014年3月14日線上公開，為Manuscript M113.539726)。特異性靶向基因座之獨特序列(例如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3)可藉由將許多的這些序列與CHO基因體對齊來鑑別，其可以16-17鹼基對配對來揭露可能的脫靶位置。
在某些實施例中，係將帶有一感興趣核酸(例如含有一或多個RRS之核酸視需要側邊有一或多個篩選標記基因，或含有共同編碼雙特異性抗原結合蛋白之多外源性核酸的核酸)，兩側為5'和3'同源臂之靶向載體，導入帶有一或多個另外的載體或mRNA之細胞中。在一實施例中，一或多個另外的載體或mRNA係含有一編碼位點特異性核酸酶，其包括(但不限於)鋅指核酸酶(ZFN)、ZFN二聚物、類轉錄活物因子效應子核酸酶(TALEN)、TAL效應子區融合蛋白以及RNA-引導的DNA核酸內切酶之核
苷酸序列。在特定的實施例中，此一或多個載體或mRNA係包括一含有嚮導RNA、tracrRNA和編碼Cas酵素之核苷酸序列的第一載體，以及包括一供體(外源性)核苷酸序列之第二載體。此供體序列係含有編碼感興趣基因之核苷酸序列或辨識序列，或包括任一希望用於靶向插入之此等外源性元件的基因匣。當使用mRNA時，藉由熟習技術者已知的常見轉染方法可將mRNA轉染至細胞且可編碼一酵素，例如易位酶或核酸內切酶。雖然導入細胞中的RNA可能為過渡性的且無法整合至基因體中，但此mRNA可攜帶對整合發生所必須或有利的外源性核酸。在某些情況下，當僅需短期表現來達到所欲的核酸整合時，mRNA係經選擇以便於消除任何附件多核苷酸之持續副作用的風險。
文中係提供用於將外源性核酸經由位點特異性整合導入增強表現基因座內之核酸載體。適合的載體包括經設計含有側接RRS供經由RMCE整合之外源性核酸序列的載體，以及經設計含有側接同源臂供經由同源性重組整合之外源性感興趣核酸序列的載體。
在各種實施例中，係提供用以經由RMCE進行位點特異性整合之載體。在某些實施例中，載體係設計用來進行多核酸同時整合至一目標基因座內。與連續整合相反，同時整合容許有效及快速分離產生雙特異性抗原結合蛋白之所欲的選殖株。
在某些實施例中，係提供及包括二或多個載體之一組載體，各載體係含有至少二個在一或多個核酸側邊的RRS，其中此組載體中的核酸係共同編碼雙特異性抗原結合蛋白。
在一實施例中，一組載體從5'至3'係包括第一載體，其係包含：第一RRS，包括一編碼第一LCF之核苷酸序列的第一核酸，及第三RRS的；第二載體，其從5'至3'係包括：第三RRS，包括一編碼第一HCF之核苷酸序列的第二核酸，第二RRS；其中第一或第二核酸序列進一步係包括一編碼第二HCF之核苷酸序列；及其中第一和第二HCF，以及第一LCF係編碼雙特異性抗原結合蛋白之區(例如可變區)。在某些實施例中，編碼第二HCF的核苷酸序列係包括在第一載體上的第一核酸內(亦即，第一LCF
和第二HCF在一載體上)，視需要置於編碼第一LCF之核苷酸序列的下游；及在在其他的實施例中，編碼第二HCF之核苷酸序列係包括在第二載體上的第二核酸內(第一HCF和第二HCF在一載體上)。
編碼HCF的核苷酸序列可編碼胺基酸，例如來自恆定區的胺基酸或結構域，或編碼整個恆定區。在特定的實施例中，編碼HCF或LCF之核苷酸序列可編碼一或多個恆定區，例如CL、CH1、絞鏈、CH2、CH3或其組合。在特定的實施例中，編碼HCF的核苷酸序列可編碼一CH3區。例如編碼第一HCF的核苷酸序列可編碼一第一CH3區，而編碼第二HCF的核苷酸序列可編碼一第二CH3區。第一和第二CH3區可為相同的，或有至少一個胺基酸為不同的。就文中所述的雙特異性抗原結合蛋白，CH3區或恆定區中的差異可採任何模式，例如造成不同A蛋白結合特性之差異、靜電轉向或為「knob-and-hole」模式。與任何胺基酸序列差異無關，二條HCF-編碼核苷酸序列之差異亦可在於二條核苷酸序列的其中一條為密碼子經修飾的。
在某些實施例中，各HCF-編碼核苷酸序列為獨立地及操作上連接一轉錄調節序列，包括，例如一啟動子。在某些實施例中，引導二條含HCF多肽轉錄的啟動子為相同的。在某些實施例中，引導二條含HCF多肽轉錄的啟動子，以及引導含LCF多肽轉錄的啟動子皆為相同的(例如CMV啟動子)。在某些實施例中，各HCF-或LCF編碼核苷酸序列的為獨立地且操作上連接一誘發或抑制啟動子。誘發或抑制啟動子讓生產製造得以發生，例如僅在生產階段(給料分批培養)而非在生長階段期間(種子培養)。誘發或抑制啟動子亦能使一或多個感興趣基因有差異化表現。在某些實施例中，各HCF-及/或LCF-編碼核苷酸序列為獨立地及操作上連接至少一TetR操縱子(TetO)或Arc操縱子(ArcO)之啟動子上游。又在其他實施例中，各HCF-及/或LCF-編碼核苷酸序列為獨立地及操作上連接一CMV/TetO或CMV/ArcO雜交啟動子。雜交啟動子(亦稱為調節融合蛋白)之實例可參見2003年12月11日公開的國際公開案號WO03101189A1(其係以引用的方式併入文中)。
在某些實施例中，第一載體中的第一核酸可進一步包括篩選
標記基因之5'部分，其係位於第一載體之第三RRS的5'，而第二核酸進一步係包括篩選標記基因的其餘3'部份，其係位於第二載體之第三RRS的3'。在這些實施例中，第一、第二和第三RRS係媒介第一和第二核酸之位點特異性整合，其造成了供方便篩選之適當及同時整合的選殖株中篩選標記基因的5'部份和3'部份連結。在特定的實施例中，第一載體中的第三RRS係設計置於篩選標記基因之內含子的5'部份內；而第二載體中的第三RRS係設計置於篩選標記基因之內含子的3'部份內。又在其他實施例中，第一載體中的第三RRS係設計置於啟動子和與其操作上連接的篩選標記基因之間(但其在其他載體中為分開的)；第一載體中的第三RRS係設計在啟動子之3'；而第二載體中的第三RRS係設計在篩選標記基因之5'。
文中所述的載體組可包括二個以上的載體。例如，除了上述的二個載體之外，載體組可包括一第三載體，該第三載體係包含至少二個在編碼LCF核苷酸序列側邊的RRS。此載體組亦可包括一編碼一或多個辨識RRS之重組酶的載體。
在其他的實施例中，係提供經由同源性重組進行位點特異性整合之載體。在某些實例中，整合於一宿主基因體內的多核苷酸序列可為DNA序列，例如RRS或側邊有一或多個篩選標記基因之多RRS，用於產生具有一或多個RRS的細胞，其中該RRS係整合於一所欲的基因體中供後續編碼雙特異性抗原結合蛋白之核酸進行整合。在其他的實例中，整合於宿主基因體中的多核苷酸序列係包括共同編碼雙特異性抗原結合蛋白之多核酸。例如，該多核苷酸序列係包括編碼雙特異性抗體之二條不同重鏈及共同輕鏈的核酸。在某些實施例中，共同編碼雙特異性抗原結合蛋白之多核酸各自係獨立地(亦即個別地)操作上連接調節序列(例如啟動子、增強子、轉錄終止序列或其組合)-亦即，各多核酸之調節序列(例如啟動子)為個別的，其可為相同或不同的(亦即含有相同或不同的核苷酸序列)。在多核酸中的一核酸係包括多個編碼序列的情況下，編碼用於多肽N-端部份之各編碼序列或各核苷酸序列為獨立地且操作上連接其各自的調節序列(例如啟動子)。
選擇與增強表現基因座內的序列同源的序列係完全在技術者的技術內，且係包括此選擇的序列作為靶向載體中之同源臂。在某些實
施例中，此載體或結構係包括一第一同源臂和第二同源臂，其中組合的第一和第二同源臂係包括一取代基因座內之內生性序列的靶向序列。在其他的實施例中，第一和第二同源臂係包括整合或插入基因座之內生性序列中的靶向序列。在某些實施例中，同源臂係含有與存在SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3中的核苷酸序列同源之核苷酸序列。在特定的實施例中，此載體係含有一5'同源臂，其具有相當於SEQ ID NO：3之1001-2001核苷酸之核苷酸序列，以及一3'同源臂，其具有相當於SEQ ID NO：3之2022-3033核苷酸之核苷酸。同源臂，例如第一同源臂(亦稱為5’同源臂)及第二同源臂(亦稱為3’同源臂)與基因座內的靶向序列為同源的。同源臂從5’至3’可在基因座內擴展一包括至少1kb，或至少約2kb，或至少約3kb，或至少約4kb，或至少5kb，或至少約10kb之區或靶向序列。在其他的實施例中，選擇用於第一和第二同源臂之靶向序列的核苷酸總數包括至少1kb，或至少約2kb，或至少約3kb，或至少約4kb，或至少5kb，或至少約10kb。在某些情況下，5’同源臂和3’同源臂(與靶向序列同源)之間的距離包括至少5bp、10bp、20bp、30bp、40bp、50bp、60bp、70bp、80bp、90bp、100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp，或至少1kb，或至少約2kb，或至少約3kb，或至少約4kb，或至少5kb，或至少約10kb。在選擇SEQ ID NO：3之1001-2001和2022-3022核苷酸作為5'和3'同源臂之情況下，二同源臂間的距離可為20個核苷酸(相當於SEQ ID NO：3之2002-2021核苷酸)；且此等同源臂可媒介外源性核酸整合至一包括SEQ ID NO：3之基因座內，例如SEQ ID NO：3之1990-2021或2002-2021核苷酸，並同時刪除SEQ ID NO：3之2002-2021核苷酸。
用於導入外源性核酸供位點特異性整合至一增強表現基因座內的文中所揭示載體，可包括另外的基因和序列，其係用於引導外源性感興趣核酸和編碼多肽之表現，及用於選擇和鑑別已成功整合外源性感興趣核酸之細胞。此等另外的序列包括，例如，轉錄和轉譯調節序列、篩選標記基因等等，同時描述於下文。
文中所揭示用於以位點特異性方式將外源性核酸整合至一
增強表現基因座內的載體，及由位點特異性整合所得到的細胞，可包括用於引導外源性感興趣核酸及編碼多肽表現之調節序列。調節序列包括轉錄啟動子、增強子、編碼適合mRNA核糖體結合位置之序列，以及控制終止轉錄和轉譯之序列。轉錄和轉譯控制序列可經由病毒來源提供。例如，常用的啟動子和增強子係衍生自病毒，例如多瘤病毒、腺病毒2、猴病毒40(SV40)、小鼠或人類聚細胞病毒(CMV)、CMV迅早(immediate early)(CMV-IE)或CMV主要IE(CMV-MIE)啟動子，以及RSV、SV40晚期啟動子、SL3-3、MMTV、泛素(Ubi)、泛素C(UbC)和HIV LTR啟動子。可利用病毒基因體啟動子、控制及/或訊號序列來驅動表現，所提供的此等控制序列與所選的宿主細胞為相容的。依照在其中表現感興趣蛋白之細胞類型，亦可使用非病毒細胞啟動子(例如，β-球蛋白及EF-1α啟動子)。衍生自SV40病毒基因體之DNA序列，例如SV40來源，早期和晚期啟動子、增強子、剪接和多腺苷化位置可用來提供可用於表現外源性DNA序列之其他基因元件。早期和晚期啟動子為特別有用的，因為二者可容易地從病毒SV40獲得，為亦包括SV40病毒複製來源之片段(Fiers et al.,Nature 273：113,1978)。亦可使用較小或較大的SV40片段。典型地，係包括大約250bp序列從位於SV40複製來源Hind III位置延伸至BglI位置。可使用誘發啟動子(例如，由化學性化合物、共因子、調節蛋白所誘發)且對於讓抗原結合蛋白僅在生產階段(給料分批培養)而非在生長階段期間(種子培養)產生特別有用。誘發或抑制啟動子之實例包括醇去氫酶I基因啟動子、四環黴素反應啟動子系統、醣皮質類固醇受體啟動子、雌激素受體啟動子、蛻皮素受體啟動子、金屬硫蛋白為基礎的啟動子及T7-聚合酶為基礎的啟動子。適用於經由雙順反子載體表現多重轉錄之序列先前已有描述(Kim S.K.and Wold B.J.,Cell 42：129,1985)且可用於本發明。適用於多順反子之蛋白表現的策略包括使用2A胜肽(Szymczak et al.,Expert Opin Biol Ther 5：627-638(2005))及使用內部的核醣體進入位，二者已為本項技術所熟知。其他類型的表現載體亦可使用，例如該等描述於美國專利第4,634,665號(Axel et al.)及美國專利第4,656,134號(Ringold et al.)。
文中所揭示用於以位點特異性方式將外源性核酸整合至一增強表現基因座內的載體，及從位點特異性整合所得到的細胞，可包括一或多個篩選標記基因。
在某些實施例中，篩選標記基因係賦予藥物抗性，例如該等描述於Kaufman,R.J.(1988)Meth.Enzymology 185：537之表I中，及包括DHFR-MTX抗性、P-糖蛋白和多重藥物抗性(MDR)-各種親脂性細胞毒性劑(例如，阿黴素(adriamycin)、秋水仙素(colchicine)、長春新鹼(vincristine))及腺核苷去胺酶(ADA)-Xyl-A或腺核苷及2'-去氧柯福黴素(2'-deoxycoformycin)。其他優勢的篩選標記包括微生物衍生的抗生素阻抗基因，例如新黴素(neomycin)、卡那黴素(kanamycin)或潮黴素(hygromycin)抗性。數種適合的選擇系統係針對哺乳動物宿主(Sambrook前文，pgs 16.9-16.15)。應用二種優勢篩選標記之共轉染法亦有描述(Okayama and Berg,Mol.Cell Biol 5：1136,1985)。
在其他的實施例中，篩選標記基因係編碼一多肽，其係提供或能產生一可偵測訊號供辨識有或無成功插入及/或置換基因匣，視情況而定。適合的實例包括螢光標記或蛋白，催化一產生可偵測訊號之化學反應的酵素等等。螢光標記的實例已為本項技術所熟知，包括(但不限於)圓盤珊瑚(Discosoma coral)(DsRed)、綠螢光蛋白(GFP)、強化的綠螢光蛋白(eGFP)、氰基螢光蛋白(CFP)、強化的氰基螢光蛋白(eCFP)、黃螢光蛋白(YFP)、強化的黃螢光蛋白(eYFP)及遠紅外線螢光蛋白(例如mKate、mKate2、mPlum、mRaspberry或E2-crimson。亦參見，例如Nagai,T.,et al.2002 Nature Biotechnology 20：87-90；Heim,R.et al.23 February 1995 Nature 373：663-664；及Strack,R.L.et al.2009 Biochemistry 48：8279-81。
在另一方面，本揭示文係提供一系統，該系統係包括一細胞與一或多個載體之組合，且可用於製造具有整合在一增強表現基因座內、共同編碼雙專一性抗原結合蛋白之外源性核酸的細胞。此系統，例如可以套組的形式來提供。
在某些實施例中，此一系統係經設計而能容許有效率的載體
建構及經由RMCE將多外源性核酸同時整合至增強表現基因座內的特定位置。同時整合使快速分離所欲的選殖株為可能的，且使用一增強表現基因座對於製造穩定的細胞株亦為重要的。
在某些實施例中，係提供一系統，其包括任一設計用來經由RMCE整合多外源性核酸之上述載體組，及含有在一特定位置整合於增強表現基因座內並與載體組中的RRS相配之RRS的細胞。例如，系統係包括一細胞及一組載體，其中該細胞，整合在其基因體之增強表現基因座內，從5'至3'係含有：第一RRS，第一外源性核酸，第二RRS，第二外源性核酸及第三RRS，其中三個RRS為彼此互異的；其中該載體組從5'至3'係包括第一RRS，包括編碼第一LCF(例如第一VL)之核苷酸序列的第一核酸，及第二RRS；第二載體係包括第二RRS，包括編碼第一HCF(例如第一VH)之核苷酸序列的第二核酸，及第三RRS；且其中第一核酸或第二核酸進一步係包括編碼第二HCF(例如第二VH)之核苷酸序列。在載體導入細胞後，載體中的第一和第二核酸係經由第一、第二和第三RRS所媒介的重組整合至增強表現基因座內。為了幫助篩選具有從載體適當整合至基因座內之核酸的轉染子，系統中細胞內的第一外源性核酸可包括一第一篩選標記基因，而細胞內的第二外源性核酸可包括一第二篩選標記基因，其中第一和第二標記基因為彼此互異的，且與載體所提供的任何篩選標記基因亦為不同的；且在特定的實施例中，第一和第二篩選標記基因係編碼螢光蛋白(其可提供負選擇)，而載體上的第一和第二核酸係提供一另外的分裂模式之篩選標記基因，用來提供正選擇。雖然以所希望的重組分離選殖株之效能可能有限(約1%)，但單獨的負選擇可提供快速的選殖株分離。負選擇結合正選擇(一種新的螢光，或對藥物或抗生素的阻抗性)可顯著改善分離正選殖株之效能(達到約80%)。
此等系統可包括另外的組份、試劑或資訊，例如藉由轉染將系統中的載體導入系統的細胞內之方法。非限定轉染法包括化學為基礎的轉染法包括使用微脂體；奈粒子；磷酸鈣(Graham et al.(1973)Virology 52(2)：456-67,Bacchetti et al.(1977)Proc Natl Acad Sci USA 74(4)：1590-4 and,Kriegler,M(1991)Transfer and Expression：A Laboratory Manual.New York：
W.H.Freeman and Company.pp.96-97)；樹枝狀聚合物；或陽離子聚合物，例如DEAE-葡聚醣或聚乙烯亞胺。非化學性方法包括電穿孔；超音波穿孔；及光學轉染。以粒子為基礎的轉染包括使用基因槍、磁力輔助轉染(Bertram,J.(2006)Current Pharmaceutical Biotechnology 7,277-28)。轉染亦可使用病毒法。mRNA遞送包括使用TransMessengerTM和TransIT®之方法(Bire et al.BMC Biotechnology 2013,13：75)。一種將異源性DNA導入細胞中常用的方法為磷酸鈣沉澱，例如，如Wigler等人所述(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：3567,1980)。使用哺乳動物細胞之聚乙烯引發的細菌原生質融合(Schaffner et al.,(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：2163)為另一種導入異源性DNA之有用方法。亦可使用電穿孔將DNA直接導入至宿主細胞的細胞質中，例如Potter等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：7161,1988)或Shigekawa等人(BioTechniques 6：742,1988)所述。其他可用於將異源性DNA導入哺乳動物細胞中的試劑已有描述，例如LipofectinTM試劑及LipofectamineTM試劑(Gibco BRL,Gaithersburg,Md.)。這二種市售的試劑係用於形成脂質-核酸複合物(或微脂體)，當應用於培養細胞時，其係幫助核酸吸收至細胞中。
本揭示文亦提供製造雙特異性抗原結合蛋白之方法。利用本發明方法，可製造高效價及/或高單位生產率(pg/細胞/天)之雙特異性抗原結合蛋白(例如，雙特異性抗體)。在某些實施例中，所製造的雙特異性抗原結合蛋白為至少5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L、25mg/L、30mg/L、35mg/L、40mg/L、45mg/L、50mg/L或更高之效價。在某些實施例中，雙特異性抗原結合蛋白，係以至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、50%或更高之雙特異性抗原結合蛋白效價對總雙特異性抗原結合蛋白效價之比率所製造。在某些實施例中，以每個細胞每天所製造的總抗原結合蛋白為基準，雙特異性抗原結合蛋白係以5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15皮克/細胞/天或更高的單位生產率所製造。
在一實施例中，此方法係利用一文中所揭示的系統並藉由轉染將系統中的載體導入系統的細胞內。可篩選及鑑定其中外源性核酸已經
由RMCE適當地整合至細胞的目標增強表現基因座中之轉染細胞。可從整合的核酸表現二種含HCF的多肽和至少一含LCF的多肽，並可從鑑定出的轉染細胞得到含有全部三種多肽的雙特異性抗原結合蛋白，及使用已知的方法純化。
在某些實施例中，一方法係包括(i)提供一包括一細胞和一組載體之系統，其中該細胞，整合在其基因體的基因座內，從5'至3'係含有：第一RRS，第一外源性核酸，第二RRS，第二外源性核酸及第三RRS，其中三個RRS係彼此互異；其中該組載體從5'至3'係包括第一RRS，包括編碼第一LCF的核苷酸序列(例如第一VL)之第一核酸，及第二RRS；第二載體係包括第二RRS，包括編碼第一HCF的核苷酸序列(例如第一VH)之第二核酸，及第三RRS；其中第一核酸或第二核酸進一步係包括一括編碼第二HCF的核苷酸序列(例如第二VH)；(ii)將載體同時導入細胞；及(iii)篩選其中載體內的第一和第二核酸已經由第一、第二和第三RRS所媒介的重組同時整合至增強表現基因座內之轉化細胞。
在一此方法之特定實施例中，為了幫助篩選具有從載體適當整合至基因座內之核酸的轉化體，系統中細胞內的第一外源性核酸可包括一第一篩選標記基因，而細胞內的第二外源性核酸可包括一第二篩選標記基因，其中第一和第二篩選標記基因為彼此互異的；且載體上的第一和第二核酸係共同編碼一分裂模式的另外篩選標記，其中編碼此另外篩選標記基因之完整序列係在同時整合後提供。可就轉化體進行篩選用以針對抗第一和第二篩選標記作選擇(負選擇)及就另外的篩選標記作篩選(正選擇)。
在另外的實施例中，此方法係簡單地利用一細胞，該細胞係具有整合在細胞之增強表現基因座內於特定位置的外源性核酸，其中該外源性核酸序列係編碼雙特異性抗原結合蛋白，並從細胞表現此雙特異性抗原結合蛋白。選殖的表現匣在特定整合位置為連續的。
本發明進一步係藉由下列實例來說明，其不應視為在任何方面之限制。所有引述的參考文獻之內容(包括如本申請書整體所引述之參考文獻、已頒予的專利及已公開的專利申請案)係僅此以引用的方式明確併入。
雙特異性抗體之重鏈和輕鏈組份可從雜交瘤細胞、B細胞、漿細胞或本項技術已知的重組抗體基因庫，使用本項技術已知的方法選殖。例如，可藉由5'端RACE PCR或PCR使用抗前導肽之引子、框架1序列、框架4序列或恆定區序列，從雜交瘤或B細胞選殖抗體。另一種選擇，抗體-表現細胞中的抗體基因或mRNA可藉由次世代定序及隨後經由生物訊息鑑定來加以定序。藉由合成的DNA技術將抗體蛋白定序及選殖對應的抗體基因亦為可行的。重組抗體庫，例如酵母菌或噬菌體庫亦為抗體基因之來源。
CHO表現細胞株RSX4189-1、RSX4187-1、RSX4191-1和RSX4188-1各自係產生由三條不同多肽所組成的雙特異性抗體：AbC1、AbC2和AbC3(圖5)。就建構RSX4189-1之質體，係將AbC1質體藉由以Mfe I消化加以線性化，其為AbC1基因之3’。將藉由Mfe I消化從AbC2質體切下的AbC2表現匣接合於線性化AbC1質體的Mfe I位置。將接合產物轉化為DH10B大腸桿菌(E.coli)。轉化及於含安比西林(Ampicillin)LB培養基中生長後，將個別的大腸桿菌菌落就蘊藏含有AbC1和AbC2基因之所欲質體進行分析。藉由Sanger定序確認AbC3質體和AbC1-AbC2雙重表現質體之maxi-prep DNA序列。使用lipofectamine將這二種載體與Cre表現載體pRG858一起轉染至在EESYR®基因座含有RRS1和RRS3位置之EESYR®宿主細胞。以抗生素選擇轉染的細胞歷時12天，及隨後將重組的細胞集中為RSX4189-1。
就產生建構RSX4187-1之質體，係將側接Mlu I和Nhe I位置之AbC3表現匣選殖至AbC2質體中的Mlu I和Spe I位置，AbC2基因之3’。將組合的AbC2-AbC3質體、AbC1質體及Cre質體pRG858使用lipofectamine共轉染至EESYR®宿主細胞。將經歷RMCE的細胞集中為RSX4187-1。
就產生建構RSX4191-1之質體，係將AbC3表現匣選殖至AbC1質體的Mfe I位置，AbC1基因的3’。將組合的AbC1-AbC3質體、
AbC2質體和Cre質體pRG858使用lipofectamine共轉染至EESYR®宿主細胞。將經歷RMCE的細胞集中為RSX4191-1。
就產生建構RSX4188-1之質體，係將AbC2表現匣選殖至AbC3質體的Mlu I和Spe I位置，AbC3基因的3’。將組合的AbC3-AbC2質體、AbC1質體和Cre質體pRG858使用lipofectamine共轉染至EESYR®宿主細胞。將經歷RMCE的細胞集中為RSX4188-1。
將雙特異性抗體表現細胞株RSX4189-1、RSX4187-1、RSX4191-1和RSX4188-1置於懸浮液中以無血清培養基培養。就測定其雙特異性抗體表現量，係於Guava流式細胞儀上計算培養的細胞數，並啟動每毫升含有2百萬個細胞的新鮮震盪器燒瓶培養。4天後，離心移除細胞後收集所耗費的培養基。使用對該雙特異性抗體具特異性之A蛋白HPLC分析測定雙特異性抗體效價。由RSX4189-1、RSX4187-1、RSX4191-1和RSX4188-1所表現的雙特異性抗體蛋白之效價分別為37.8mg/L、40.5mg/L、48.3mg/L和21.8mg/L。由這些細胞株所表現的所有抗體蛋白之總效價(包括雙特異性抗體蛋白及非特異性抗體蛋白)，以及雙特異性抗體蛋白效價與總抗體蛋白效價之比率係如下表所示。
SEQ ID NO：1
13515個鹼基
DNA
灰倉鼠(Cricetulus griseus)
SEQ ID NO：2
14931個鹼基
DNA
灰倉鼠
misc_feature(2176)..(2239)
n為a,c,g,t或核苷酸缺漏
SEQ ID NO：3
4001個鹼基
DNA
灰倉鼠
<110> Regeneron Pharmaceuticals,Inc.
<120> 用於以使用增強表現基因座為基礎製造抗體之組成物及方法
<130> 32354PCT(TO047WO01)
<150> 62/325,385
<151> 2016-04-20
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 13515
<212> DNA
<213> 灰倉鼠(Cricetulus griseus)
<400> 1
<210> 2
<211> 14931
<212> DNA
<213> 灰倉鼠
<220>
<221> misc_feature
<222> (2716)..(2239)
<223> n為a,c,g,t或核甘酸缺漏
<400> 2
<210> 3
<211> 4001
<212> DNA
<213> 灰倉鼠
<400> 3
Claims (57)
- 一種細胞，其係包括一整合在一增強表現基因座內特定位置的外源性核酸序列，其中該外源性核酸序列係編碼雙特異性抗原結合蛋白。
- 如請求項1之細胞，其中該外源性核酸序列係包括一包含編碼第一LCF之核苷酸序列的第一外源性核酸，包含編碼第一HCF之核苷酸序列的第二外源性核酸，及包含編碼第二HCF之核苷酸序列的第三外源性核酸。
- 如請求項2之細胞，其中編碼第一HCF之核苷酸序列係編碼第一CH2和第一CH3區，而編碼第二HCF之核苷酸序列係編碼第二CH2和第二CH3區。
- 如請求項3之細胞，其中該第一和第二CH3區至少在一個胺基酸位置為不同的。
- 如請求項3之細胞，其中該第一和第二CH3區為人類IgG之CH3區，且二個CH3區其中之一在至少一個胺基酸位置係經修飾，而產生不同於未修飾CH3區之A蛋白結合特性。
- 如請求項3之細胞，其中該編碼第一和第二CH區之核苷酸序列彼此的差異係在於其中一核苷酸序列係經密碼子修飾。
- 如請求項2之細胞，其中該編碼第一HCF之核苷酸序列係編碼第一VH，而編碼第二HCF之核苷酸序列係編碼第二VH。
- 如請求項2之細胞，其中該編碼第一LCF之核苷酸序列係編碼第一VL。
- 如請求項1之細胞，其中該外源性核酸序列進一步係包括一包含編碼第二LCF之核苷酸序列的另外外源性核酸。
- 如請求項9之細胞，其中該編碼第二LCF之核苷酸序列係編碼第二VL。
- 如請求項2之細胞，其中該第一外源性核酸進一步係包括一操作上連接編碼第一LCF之核苷酸序列的第一啟動子，第二外源性核酸進一步係包括操作上連接編碼第一HCF之核苷酸序列的第二啟動子，以及第三外源性核酸係包括操作上連接編碼第二HCF之核苷酸序列的第三啟動子，其中該第一、第二和第三啟動子為相同或不同的。
- 如請求項2之細胞，其中該第一外源性核酸係位於相對第二和第三外源性核酸的上游。
- 如請求項12之細胞，進一步係包括第一重組酶辨識位置(RRS)，其係位於相對該第一外源性核酸的5'，及一第二重組酶辨識位置(RRS)，其係位於相對第二和第三外源性核酸的3'，其中該第一和第二RRS為不同的。
- 如請求項12之細胞，進一步係包括第三RRS，其係位於相對該第一外源性核酸的3'，及相對該第二和第三外源性核酸之一或二者的5'，其中該第三RRS與第一和第二RRS為不同的。
- 如請求項13之細胞，進一步係包括一包含篩選標記基因之第四外源性核酸。
- 如請求項15之細胞，其中該第四外源性核酸進一步係包括第三RRS且係位於相對第一外源性核酸的3'。
- 如請求項2之細胞，其中該第二外源性核酸係位於相對該第一和第三外源性核酸的上游。
- 如請求項16之細胞，其中基因座之外源性核酸的順序為：從5'至3'，第一外源性核酸，第四外源性核酸，第二外源性核酸及第三外源性核酸，其中該第二外源性核酸係包括一編碼修飾的人類IgG CH3區之核苷酸序列，而該第三外源性核酸係包括一編碼天然的人類IgG CH3區之核苷酸序列。
- 如請求項16之細胞，其中基因座之外源性核酸的順序為：從5'至3'，第一外源性核酸，第二外源性核酸，第四外源性核酸及第三外源性核酸，其中該第二外源性核酸係包括編碼天然人類IgG CH3區之核苷酸序列，而第三外源性核酸係包括編碼修飾的人類IgG CH3區之核苷酸序列。
- 如請求項18或19之細胞，其中該第一、第二和第三啟動子為相同的且與操作上連接篩選標記基因之啟動子不同。
- 如請求項1之細胞，其中該雙特異性抗原結合蛋白係與T-細胞抗原及腫瘤細胞抗原特異性結合。
- 如請求項1之細胞，其中該增強表現基因座係由下列組成之群中選出：包括至少90%與SEQ ID NO：1相同之核苷酸序列的基因座及包括至少90%與SEQ ID NO：2相同之核苷酸序列的基因座。
- 如任何前述請求項之細胞，其中該細胞為CHO細胞。
- 一組載體，係包括第一載體，其從5'至3'係包括：第一RRS，包括編碼第一LCF之核苷酸序列的第一核酸，及第三RRS；第二載體，其從5'至3'係包括：該第三RRS，包括編碼第一HCF之核苷酸序列的第二核酸，及第二RRS；其中該第一或第二核酸進一步係包括編碼第二HCF之核苷酸序列；及其中該第一和第二HCF，以及第一LCF係編碼雙特異性抗原結合蛋白。
- 如請求項24之載體組，其中該編碼第二HCF之核苷酸序列係包括在第一核酸中。
- 如請求項25之載體組，其中該編碼第二HCF的核苷酸序列係位於編碼第一LCF之核苷酸序列的上游或下游。
- 如請求項24之載體組，其中該編碼第二HCF的核苷酸序列係包括在第二核酸中。
- 如請求項24之載體組，其中該編碼第一HCF的核苷酸序列係編碼第一CH3區，而該編碼第二HCF的核苷酸序列係編碼第二CH3區。
- 如請求項28之載體組，其中該第一和第二CH3區在至少一個胺基酸位置為不同的。
- 如請求項28之載體組，其中該第一和第二CH3區為人類IgG CH3區，及二個CH3區其中之一係在至少一個胺基酸位置經修飾，產生不同於未修飾CH3區的A蛋白結合特性。
- 如請求項28之載體組，其中該編碼第一和第二HC區的核苷酸序列彼此之差異係在於其中一核苷酸序列經密碼子修飾。
- 如請求項24之載體組，其中該編碼第一HCF的核苷酸序列係編碼第一VH，而編碼第二HCF的核苷酸序列係編碼第二重鏈VH。
- 如請求項24之載體組，其中該編碼第一LCF的核苷酸序列係編碼第一VL。
- 如請求項24之載體組，其中該編碼第一輕鏈LCF的核苷酸序列係操作上連接第一啟動子，該編碼第一HCF的核苷酸序列係操作上連接第二啟動子，及該編碼第二HCF的核苷酸序列係操作上連接第三啟動子。
- 如請求項34之載體組，其中該第一、第二和第三啟動子為相同或不同 的。
- 如請求項24之載體組，其中該第一核酸進一步係包括位於第一載體之第三RRS之5'的第二啟動子；及該第二核酸進一步係包括位於第二載體之第三RRS之3'的篩選標記基因。
- 如請求項24之載體組，其中該第一核酸進一步係包括第二啟動子，其係在第一載體中位於篩選標記基因之5'部分的5'；而在第二載體中篩選標記之3'部分係存在篩選標記基因之5'部分的同源臂3'。
- 如請求項24之載體組，其中該第一載體從5'至3'係包括第一RRS，第一核酸和第三RRS；及該第二載體從5'至3'係包括第三RRS，第二核酸其中該第二核酸係包括編碼第一重鏈或其片段之核苷酸序列以及編碼第二重鏈或其片段之核苷酸序列。
- 如請求項24之載體組，其中該第一載體從5'至3'係包括第一RRS，第一核酸其中該第一核酸係包括編碼第一LCF的核苷酸序列和編碼第二HCF的核苷酸序列，以及第三RRS；及該第二載體從5'至3'係包括第三RRS，第二核酸其中該第二核酸係包括編碼第一HCF之核苷酸序列。
- 如請求項38或39之載體組，其中該第一核酸進一步係包括篩選標記基因之5'部分，其係位於第一載體中第三RRS的5'；及第二核酸進一步係包括篩選標記基因之其餘的3'部分，其係位於第二載體中第三RRS的3'；且其中視需要第一載體中的第三RRS係存在篩選標記基因之內含子的5'部分內，而第二載體中的第三RRS係存在篩選標記基因之內含子的3'部分內。
- 如請求項24之載體組，進一步係包括一包含一或多個RRS及編碼第二LCF之核苷酸序列的第三載體。
- 如請求項24之載體組，進一步係包括編碼一或多個辨識RRS之重組酶的第三載體。
- 一種載體，其係包括編碼雙特異性抗原結合蛋白之外源性核酸序列，而該外源性核酸序列係側接5'同源臂及3'同源臂供整合至細胞的增強表現 基因座內。
- 一種包括細胞及一組載體之系統，其中該細胞，整合於其基因體之增強表現基因座內，從5'至3'係包括，第一RRS，第一外源性核酸，第三RRS，第二外源性核酸及第二RRS，其中此三個RRS係彼此互異；其中該組載體係包括第一載體，其從5'至3'係包括：第一RRS，包括編碼第一LCF之核苷酸序列的第一核酸，及第三RRS；第二載體，其係包括：第三RRS，包括編碼第一HCF之核苷酸序列的第二核酸，及第二RRS；及其中該第一核酸或第二核酸進一步係包括編碼第二HCF之核苷酸序列；及其中在載體導入細胞後，載體中的第一和第二核酸係經由第一、第二和第三RRS所媒介的重組，整合至增強表現基因座內。
- 如請求項44之系統，其中該第一外源性核酸係包括第一篩選標記基因，而該第二外源性核酸係包括第二篩選標記基因，其中該第一和第二篩選標記基因為不同的。
- 如請求項44之系統，其中該第一載體從5'至3'係包括：第一RRS，包括第一LCF之第一核酸，以及第三RRS；及該第二載體從5'至3'係包括：第三RRS，第二核酸，其中該第二核酸係包括編碼第一HCF之核苷酸序列和編碼第二HCF之核苷酸序列二者，以及第二RRS。
- 如請求項44之系統，其中該第一載體從5'至3'係包括：第一RRS，包括編碼第一LCF之核苷酸序列和編碼第二HCF之核苷酸序列的第一核酸，以及第三RRS，及該第二載體從5'至3'係包括：第三RRS，包括編碼第一HCF之核苷酸序列的第二核酸，以及第二RRS。
- 如請求項46或47之系統，其中該第一載體中的第一核酸進一步係包括篩選標記基因的5'部分，其係位於第三RRS之5'；及該第二載體中的第 二核酸進一步係包括該篩選標記基因的其餘3'部分，其係位於第三RRS之3'。
- 如請求項48之系統，其中第一載體中的第三RRS係存在於篩選標記基因之內含子的5'部分內；而第二載體中的第三RRS係存在於篩選標記基因之內含子的3'部分內。
- 如請求項48之系統，其中該編碼LCF的核苷酸序列係操作上連接第一啟動子，該編碼第一HCF的核苷酸序列係操作上連接第二啟動子，而該編碼第二HCF的核苷酸序列係操作上連接第三啟動子，其中該第一、第二和第三啟動子為相同或不同的，及/或該等啟動子與操作上連接篩選標記基因的啟動子為相同或不同。
- 如請求項44之系統，其中該編碼第一HCF的核苷酸序列係編碼第一CH3區，而該編碼第二HCF的核苷酸序列係編碼第二CH3區。
- 如請求項51之系統，其中該第一和第二CH3區之一為人類IgG CH3區，而另一個為包含至少一個經修飾胺基酸位置之修飾的人類IgG CH3區。
- 如請求項52之系統，其中該編碼修飾的HC3區之核苷酸序列係在第一載體中。
- 如請求項52之系統，其中該編碼修飾的HC3區之核苷酸序列係在第二載體中以及在編碼未修飾的HC3區之核苷酸序列的上游。
- 一種方法，其係包括：(i)提供一根據請求項44-54中任一項之系統；(ii)藉由轉染將載體同時導入細胞；及(iii)選擇一轉染細胞，其中載體內的第一和第二核酸已經由第一、第二和第三RRS媒介的重組，整合至細胞的增強表現基因座內。
- 如請求項55之方法，進一步係包括：(i)在所選的轉染細胞中表現第一LCF、第一HCF及第二HCF；及(ii)從所選的轉染細胞得到包括第一LCF、第一HCF和第二HCF之雙特異性抗原結合蛋白。
- 一種製造雙特異性抗原結合蛋白之方法，其係包括(i)提供根據請求項1-23中任一項之細胞； (ii)從外源性核酸序列表現雙特異性抗原結合蛋白；及(iii)從該細胞得到雙特異性抗原結合蛋白。
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