TW201823460A

TW201823460A - 生產細胞株增強子

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Publication number: TW201823460A
Application number: TW107107833A
Authority: TW
Inventors: 陳剛; 達雅布洛克夫; 迪普勒德什潘德
Original assignee: 美商再生元醫藥公司
Priority date: 2012-05-29
Filing date: 2013-05-28
Publication date: 2018-07-01
Also published as: IL265867A; AU2018201094A1; ZA201408289B; CA2873131A1; CN110835624A; PL2875047T3; JP2018108094A; EP2875047A1; US20150353634A1; JP2015518728A; EA201492242A1; US9079954B2; IL279922A; US9688751B2; US20150175688A1; US20150299310A1; EP4219546A2; MX2014014630A; AU2019203780A1; MX360359B

Abstract

本發明是有關於發現在生產細胞中異位表現EDEM2以增進可用多重次單位蛋白質的產量。因此，本發明提供含有編碼EDEM2之重組多核苷酸的生產細胞株，諸如標準哺乳動物生物藥劑生產細胞-CHO細胞。亦揭示含有編碼EDEM2之多核苷酸與編碼XBP1之多核苷酸的生產細胞。揭示此等細胞株所生產的抗體效價有所增進，以及此等細胞在培養物中的細胞密度達到增進。

Description

生產細胞株增強子

本發明是有關於針對增進多重次單位蛋白質生產之表現重組型壓力反應植物凝集素的細胞。具體而言，本發明提供含有編碼EDEM2之基因且以高效價(titer)生產抗體的哺乳動物細胞及自其衍生而來的細胞株。

製造治療活性蛋白質需要在分泌之前適當摺疊與加工。適當摺疊尤其與諸如抗體的蛋白質有關，抗體是由在分泌前必須適當組裝的多重次單位所組成。真核細胞必須採用能確保蛋白質適當摺疊並將摺疊錯誤的蛋白質從分泌路徑予以移除的系統。這個系統被稱為是未摺疊蛋白質反應(UPR)路徑，且其係受到摺疊錯誤的蛋白質在內質網(ER)中累積而引起。

UPR的早期事件為活化轉錄因子Xbp1，其復而活化內質網分解-增強α-甘露糖苷酶樣蛋白2(EDEM2)的轉錄，EDEM2係內質網相關分解(ERAD)路徑的一個成員。EDEM2促使摺疊錯誤的蛋白質移除。ERAD路徑包含五個步驟：(1)變形蛋白質的帶位子-媒介辨識、(2)將變形蛋白質靶定至逆轉位機制或涉及EDEM2的E3接合酶、(3)啟動逆轉位；(4)泛素化與進一步逆轉位；以及(5)蛋白酶體靶定與分解。

抗體為多重次單位蛋白質，其包含兩條重鏈及兩條輕鏈，它們必須被適當地摺疊與締合以形成具有功能的異四聚體。任何關於重鏈及輕鏈在效率及精確加工的改良以增進功能性抗體異四聚體的產量或效價是想要的。

申請人出乎意料地發現，在製造蛋白質的細胞株中異位表現EDEM2會增加每個細胞的蛋白質平均產量、增加被分泌至培養基中的蛋白質效價，以及增加生產細胞株的總體細胞密度。

因此，在一個態樣中，本發明提供一種細胞，其含有(a)編碼壓力誘導型甘露糖-結合植物凝集素的重組型多核苷酸，以及(b)編碼多重次單位蛋白質的多核苷酸。在一些具體例中，該壓力誘導型甘露糖-結合植物凝集素為EDEM2蛋白，其非限制性實例提供於表1中，而多重次單位蛋白為抗體。在其他具體例中，該細胞亦含有編碼XBP1之活性剪接形式的多核苷酸，其非限制性實例提供於表2中。在一個具體例中，該細胞為哺乳動物細胞，諸如製造生物藥劑中所用的CHO細胞。

在另一個態樣中，本發明提供一種衍生自先前態樣中所述細胞的細胞株。”衍生自”表示一群同種地源於(clonally descended from)一個單獨細胞且具有一些選定特性(諸如以指定效價生產活性蛋白質的能力，或增殖至特定密度的能力)的細胞。在一些具體例中，衍生自具有編碼壓力誘導型甘露糖-結合植物凝集素之重組型多核苷酸以及編碼多重次單位蛋白質之多核苷酸的細胞的細胞株能夠以每公升培養基至少3克(g/L)、至少5g/L或至少8g/L的效價生產多重次單位蛋白質。在一些具體例中，該細胞株可達到的總體細胞密度(ICD)比衍生自實質上相同的細胞但不帶有編碼壓力誘導型甘露糖-結合植物凝集素之重組型多核苷酸的細胞株所達到之總體細胞密度高出至少30%、高出至少50%、高出至少60%或高出至少90%。

在另一個態樣中，本發明提供一種包含編碼EDEM2蛋白之核酸序列的分離或重組型多核苷酸，其可操作地連結(順式)至組成性並被廣泛地表現的哺乳動物啟動子，諸如泛素C啟動子。在一些具體例中，EDEM2蛋白具有SEQ ID NO：8的胺基酸，或具有與SEQ ID NO：1-7中任一者至少92%一致的胺基酸序列。在一些具體例中，該多核苷酸包含SEQ ID NO：16的核酸序列。在一個特定具體例中，該多核苷酸由SEQ ID NO：14的核酸序列所組成，而在另一個特定具體例中該多核苷酸由SEQ ID NO：15的核酸序列所組成。

在另一個態樣中，本發明提供一種包含編碼XBP1蛋白之核酸序列的分離或重組型多核苷酸，其可操作地連結(以順式)至組成性並被廣泛地表現的哺乳動物啟動子，諸如泛素C啟動子。在一些具體例中，XBP1蛋白具有SEQ ID NO：13的胺基酸，或具有與SEQ ID NO：9-12中任一者至少86%一致的胺基酸序列。在一些具體例中，該多核苷酸包含SEQ ID NO：18的核酸序列。在一個特定具體例中，該多核苷酸由SEQ ID NO：17的核酸序列所組成。

在另一個態樣中，本發明提供一種含有如先前態樣中所述編碼EDEM2之多核苷酸以及編碼多重次單位蛋白質(諸如抗體)之多核苷酸的細胞。在一些具體例中，該細胞亦含有如先前態樣中所述編碼XBP1的多核苷酸。在一個具體例中，該多重次單位蛋白質為抗體，且抗體的重鏈包含SEQ ID NO：43與SEQ ID NO：44的胺基酸序列，而抗體的輕鏈包含SEQ ID NO：45與SEQ ID NO：46的胺基酸序列。在這個以及數個具體例中，多重次單位蛋白質的各個多肽次單位是由個別多核苷酸所編碼。因此，例如編碼抗體的多核苷酸可包括編碼重鏈之多核苷酸以及編碼輕鏈之多核苷酸，因而有兩個次單位。在一些具體例中，該細胞為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。

在一個具體例中，所編碼的多重次單位蛋白質為抗-GDF8抗體，其具有SEQ ID NO：20之重鏈可變區胺基酸序列以及SEQ ID NO：22之輕鏈可變區胺基酸序列。在一個具體例中，該抗-GDF8抗體包含具有SEQ ID NO：19之胺基酸序列的重鏈以及具有SEQ ID NO：21之胺基酸序列的輕鏈。在一個具體例中，編碼抗-GDF8抗體之重鏈的多核苷酸包含SEQ ID NO：23的核酸序列；而編碼抗-GDF8抗體之輕鏈的多核苷酸包含SEQ ID NO：25的核酸序列。在一個具體例中，編碼抗-GDF8抗體之重鏈的多核苷酸由SEQ ID NO：24的核酸序列組成；而編碼抗-GDF8抗體之輕鏈的多核苷酸由SEQ ID NO：25的核酸序列組成。

在另一個具體例中，所編碼的多重次單位蛋白質為抗-ANG2抗體，其具有SEQ ID NO：28之重鏈可變區胺基酸序列以及SEQ ID NO：30之輕鏈可變區胺基酸序列。在一個具體例中，該抗-ANG2抗體包含具有SEQ ID NO：27之胺基酸序列的重鏈以及具有SEQ ID NO：29之胺基酸序列的輕鏈。在一個具體例中，編碼抗-ANG2抗體之重鏈的多核苷酸包含SEQ ID NO：31的核酸序列；而編碼抗-ANG2抗體之輕鏈的多核苷酸包含SEQ ID NO：33的核酸序列。在一個具體例中，編碼抗-ANG2抗體之重鏈的多核苷酸由SEQ ID NO：32的核酸序列組成；而編碼抗-ANG2抗體之輕鏈的多核苷酸由SEQ ID NO：34的核酸序列組成。

在另一個具體例中，所編碼的多重次單位蛋白質為抗-ANGPTL4抗體，其具有SEQ ID NO：36之重鏈可變區胺基酸序列以及SEQ ID NO：38之輕鏈可變區胺基酸序列。在一個具體例中，該抗-ANGPTL4抗體包含具有SEQ ID NO：35之胺基酸序列的重鏈以及具有SEQ ID NO：37之胺基酸序列的輕鏈。在一個具體例中，編碼抗-ANGPTL4抗體之重鏈的多核苷酸包含SEQ ID NO：39的核酸序列；而編碼抗-ANGPTL4抗體之輕鏈的多核苷酸包含SEQ ID NO：41的核酸序列。在一個具體例中，編碼抗-ANGPTL4抗體之重鏈的多核苷酸由SEQ ID NO：40的核酸序列組成；而編碼抗-ANGPTL4抗體之輕鏈的多核苷酸由SEQ ID NO：42的核酸序列組成。

在另一個具體例中，本發明提供一種藉由將先前態樣的細胞培養於培養基中製造多重次單位蛋白質的方法，其中該多重次單位蛋白質係於細胞中合成且接而被分泌至培養基中。在一些具體例中，該多重次單位蛋白質為抗體，諸如，例如抗-GDF8、抗-ANG2、抗-ANGPTL4，或具有SEQ ID NO：43與44之重鏈序列，以及具有SEQ ID NO：45與46之輕鏈序列的抗體。在一些具體例中，該多重次單位蛋白質達到至少3g/L、至少5g/L、至少6g/L或至少8g/L的效價。在一些具體例中，細胞在培養基中增殖並建立約5 x 10⁷細胞-天/mL、約1 x 10⁸細胞-天/mL，或約1.5 x 10⁸細胞-天/mL的總體細胞密度。

在另一個態樣中，本發明提供一種多重次單位蛋白質，其是依據先前態樣中所述方法製造。在一個具體例中，所製造的蛋白質為抗體。在一些具體例中，該抗體由一含有SEQ ID NO：43與SEQ ID NO：44之胺基酸序列的重鏈，以及一含有SEQ ID NO：45與SEQ ID NO：46之胺基酸序列的輕鏈組成。在一個特定具體例中，所製造的多重次單位蛋白質為抗-GDF8抗體，其具有SEQ ID NO：20之重鏈可變區胺基酸序列以及SEQ ID NO：22之輕鏈可變區胺基酸序列。在另一個特定具體例中，所製造的多重次單位蛋白質為抗-ANG2抗體，其具有SEQ ID NO：28之重鏈可變區胺基酸序列以及SEQ ID NO：30之輕鏈可變區胺基酸序列。在又另一個特定具體例中，所製造的多重次單位蛋白質為抗-ANGPTL4抗體，其具有SEQ ID NO：36之重鏈可變區胺基酸序列以及SEQ ID NO：38之輕鏈可變區胺基酸序列。

在說明本發明之前，要理解本發明不限於所述特定方法以及實驗條件，因為這些方法以及條件可能會改變。亦要理解本文中所用術語僅供說明特定具體例之用，而不是限制性的，因為本發明的範疇將僅會受到隨附申請專利範圍所限制。

除非另有定義，否則所有本文使用的技術以及科學術語具有與本發明所屬技藝中具有通常技藝者普遍理解的相同意思。如本文所用，術語”約”，當使用在有關特定引用的數值或數值範圍時，表示該數值可自所引用的數值起改變不超過1%。舉例而言，如本文所用，詞句”約100”包括99與101以及其間的所有數值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

儘管任何類似或等同於本文所述的方法以及材料可應用於實施或測試本發明，現將說明較佳的方法以及材料。所有本文提及的公開文獻以其整體併入本文中做為參考資料。

如本文所用，術語”重組型多核苷酸”可與”分離的多核苷酸”交替使用，表示諸如藉由遺傳工程操作產生的單股或雙股核醣核酸或去氧核醣核酸的核酸聚合物。重組型多核苷酸可以是存在於活體外或在細胞內作為游離基因組的環狀質體或線狀建構物。重組型多核苷酸可以是併入較大的多核苷酸分子或大分子結構的建構物，諸如線狀或環狀基因組。較大的多核苷酸分子或大分子結構的建構物可以在細胞內或在細胞的細胞核內。因此，重組型多核苷酸可以併入細胞的基因組中。

如本文所用，術語”壓力誘導型甘露糖-結合植物凝集素”意指甘露糖-結合蛋白，其表示結合或能夠結合甘露糖、甘露糖衍生物(諸如甘露糖-6-磷酸)或在其糖萼(glycocalyx)中表現甘露糖或甘露糖衍生物的醣蛋白的蛋白質；且其活性在壓力期間向上調節的蛋白質。細胞壓力包括尤其是飢餓、DNA損傷、缺氧、毒害、剪切壓力及其他機械壓力、腫瘤壓力，以及摺疊錯誤的蛋白質在內質網中累積。例示性壓力誘導型甘露糖-結合植物凝集素包括EDEM蛋白EDEM1、EDEM2及EDEM3、Yos 9、OS9與 XTP3-B(參見Vembar and Brodsky,Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.9(12)：944-957,2008，及其中引用的參考資料)。

如本文所用，術語”EDEM2”代表內質網分解-增強α-甘露糖苷酶樣蛋白2的任何同源物、同系物或經保守性取代的變體。EDEM2蛋白在技藝中普遍熟知為涉及內質網-相關分解(ERAD)，受到Xbp-1向上調節且促使摺疊錯誤的醣蛋白從鈣連結蛋白(calnexin)循環中移出。(參見Mast et al.,Glycobiology 15(4)；421-436,2004；Olivari and Molinari,FEBS Lett.581；3658-3664,2007；Olivari et al.,J.Biol.Chem.280(4)：2424-2428,2005；及Vembar and Brodsky 2008，其等併入本文作為參考資料)。例示性EDEM2序列顯示於表1中，其與序列表交叉引用。

如本文所用，術語”Xbp1”亦已知為XBP1或X-盒結合蛋白1，表示Xbp1的任何同源物、同系物或經保守性取代的變體。Xbp1是UPR的一種轉錄因子以及功能要素。ER壓力活化(1)轉錄因子ATF6，其復而向上調節Xbp1 mRNA的轉錄，以及(2)ER膜蛋白IRE1，其媒介前驅物Xbp1 mRNA剪接以產生活性Xbp1。如上所提，活化的Xbp1復而向上調節EDEM2 的活性。(參見Yoshida et al.,Cell Structure and Function 31(2)：117-125,2006；and Olivari,2005)。例示性Xbp1胺基酸序列顯示於表2中，其與序列表交叉引用。

如本文所用，術語”抗體”通常欲意指包含4個多肽鏈，藉由雙硫鍵交互連結的2個重(H)鏈以及2個輕(L)鏈的免疫球蛋白分子，以及其集合體(例如IgM)；但是，僅由重鏈組成的免疫球蛋白分子(亦即缺少輕鏈)也涵括在術語”抗體”的定義中。各個重鏈含有1個重鏈可變區(此處縮寫為HCVR或VH)以及1個重鏈恆定區。重鏈恆定區含有三個結構域，CH1、CH2以及CH3。各個輕鏈含有1個輕鏈可變區(此處縮寫為LCVR或VL)以及1個輕鏈恆定區。輕鏈恆定區含有一個結構域(CL1)。VH與VL區可進一步分成具有超變異性的區(命名為互補決定區(CDR))，散佈有較為保守的區域(命名為骨架區(FR))。各個VH與VL由三個CDR以及四個FR所構成，按下列順序從胺基端往羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。”分離的抗體”或”純化的抗體”可以是實質上不含其他細胞材料或化學品。

術語”特異結合”或類似者表示與抗原在生理條件下形成相對穩定複合物的抗體或其抗原-結合片段。特異結合的特徵在於解離常數為至少約1x10^-6M或更高。用於測定兩個分子是否特異結合的方法為本技藝中已知，且包括例如平衡透析、表面電漿共振及類似方法。但是，特異結合人類GDF8(舉例而言)的分離抗體可能對其他抗原(諸如其他物種的GDF8分子(同源物))具有交叉反應性。

不同抗體可用做為帶有編碼壓力誘導型甘露糖-結合植物凝集素之多核苷酸的細胞分泌之多重次單位蛋白質的實例。那些實例包括抗-GDF8、抗-ANG2以及抗-ANGPTL4抗體。此等及類似抗體分別描述於美國專利申請案第20110293630號、第20110027286號及第20110159015號中，該等申請案併入本文作為參考資料。

如本文所用，術語”細胞”意指能夠複製DNA、轉錄RNA、轉譯多肽且分泌蛋白質的原核或真核細胞。細胞包括商業生產生物產品中所用的動物細胞，諸如昆蟲細胞(例如施耐德細胞、Sf9細胞、Sf21細胞、Tn-368細胞、BTI-TN-5B1-4細胞；參見Jarvis,Methods Enzymol.463：191-222,2009；與Potter et al.,Int.Rev.Immunol.10(2-3)：103-112,1993)以及哺乳動物細胞(例如，CHO或CHO-K1細胞、COS或COS-7細胞、HEK293細胞、PC12細胞、HeLa細胞、融合瘤細胞；Trill et al.,Curr.Opin.Biotechnol.6(5)：553-560,1995；Kipriyanov and Little,Mo.Biotechnol.12(2)：173-201,1999)。在一個具體例中，細胞為含有所述UPR路徑多核苷酸的CHO-K1細胞。有關於CHO-K1細胞的說明，亦參見Kao et al.,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 60：1275-1281,1968。

如本文所用，術語”啟動子”表示通常呈順式並位在蛋白質編碼序列上游，且其促使蛋白質編碼序列轉錄的基因序列。啟動子可以被調節(發育、組織特異性或誘導性(化學品、溫度))或為組成性活化的。在某些具體例中，編碼蛋白質的多核苷酸可操作地連結至組成性啟動子。”可操作地連結”表示編碼蛋白質的多核苷酸位在啟動子的三端(下游)且為順式，並受啟動子控制。在某些具體例中，啟動子為組成性哺乳動物啟動子，諸如泛素C啟動子(參見Schorpp et al.,Nucl.Acids Res.24(9)：1787-1788,1996)；Byun et al.,Biochem.Biophys.Res.Comm.332(2)：518-523,2005)或CMV-IE啟動子(參見Addison et al.,J.Gen.Virol.78(7)：1653-1661,1997；Hunninghake et al.,J.Virol.63(7)：3026-3033,1989)，或hCMV-IE啟動子(人類巨大細胞病毒立即早期基因啟動子)(參見Stinski & Roehr,J.Virol.55(2)：431-441,1985；Hunninghake et al.,J.Virol.63(7)：3026-3033,1989)。

如本文所用，片語”總體細胞密度”或”ICD”表示在一段時間內被當作積分之培養基中的細胞密度，表示為細胞-天/mL。在一些具體例中，細胞在培養物中約第12天測量ICD。

如本文所用，術語”培養(物)”表示(1)含有細胞、培養基與被分泌的多重次單位蛋白質的組成物，以及(2)在培養基中培育細胞的動作，不論細胞是否活躍地分裂。細胞可培養在小如25mL燒瓶或更小，或大如10,000公升或更大商用生物反應器的容器中。”培養基”意指培養介質，其尤其包含容許細胞生長、增殖或維持的養分、脂質、胺基酸、核酸、緩衝劑及微量元素，以及細胞所生產的多重次單位蛋白質。細胞培養基包括無血清以及無水解物的限定培養基，以及補充有血清(例如胎牛血清(FBS)或蛋白質水解物)的培養基。商業上可取得培養基的非限制性實例包括RPMI培養基1640、杜貝可改良伊格爾培養基(DMEM)、DMEM/F12混合物、F10營養混合物、漢氏F12營養混合物，以及最低需求培養基(MEM)。

如本文所用，片語”保守性置換變體”當應用於多肽時，表示具有一或多個保守性胺基酸置換之胺基酸序列的多肽。”保守性胺基酸置換”是一種胺基酸殘基置換成另一種帶有類似化學性質(例如電荷或疏水性)之側鏈(R基團)的胺基酸殘基。一般來說，保守性胺基酸置換大體上不會改變蛋白質的官能性質。在兩個或更多個胺基酸序列因為保守性置換而彼此有所不同的情況下，相似性百分比或程度可以向上調整以校正置換的保守性質。用來做這個調整的方法對於習於該技藝者來說是熟知的。參見，例如Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24：307-331，併入本文做為參考資料。帶有具類似化學性質的側鏈之胺基酸的群組實例包括1)脂肪族側鏈：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸與異白胺酸；2)脂肪族-羥基側鏈：絲胺酸與蘇胺酸；3)含醯胺的側鏈：天門冬醯胺酸與麩醯胺酸；4)芳族側鏈：苯丙胺酸、酪胺酸與色胺酸；5)鹼性側鏈：離胺酸、精胺酸與組胺酸；6)酸性側鏈：天門冬胺酸與麩胺酸；以及7)含硫側鏈：半胱胺酸與甲硫胺酸。較佳的保守性胺基酸置換群組為：纈胺酸-白胺酸-異白胺酸、苯丙胺酸-酪胺酸、離胺酸-精胺酸、丙胺酸-纈胺酸、天門冬胺酸-麩胺酸，以及天門冬醯胺酸-麩醯胺酸。或者，保守性置換可以是任何在Gonnet et al.(1992)Science 256：1443-1445中揭示的PAM250對數-相似矩陣中具有正值的變化。”中度保守”置換是任何在PAM250對數-相似矩陣中具有非負值的改變。

具體例-細胞

在一個態樣中，本發明提供一種可用於生產具有治療或研究用途之蛋白質的細胞。在一些具體例中，該蛋白質是由多重次單位組成，該等次單位必須適當地摺疊並組裝以產生足夠數量的活性蛋白質。抗體為具有治療或研究用途之多重次單位蛋白質的實例。在一些具體例中，該細胞帶有重組型基因建構物(亦即多核苷酸)，該建構物編碼多重次單位蛋白質之個別次單位的一或多者。在其他具體例中，編碼個別多肽次單位的基因建構物為天然存在的，諸如，例如編碼B細胞之抗體次單位的核酸序列。

為促使多重次單位蛋白質的適當組裝與分泌，該細胞含有編碼壓力誘導型甘露糖-結合植物凝集素的重組型多核苷酸，其在一些具體例中為ERAD的組分。在一些具體例中，該壓力誘導型甘露糖-結合植物凝集素為內質網分解-增強α甘露糖苷酶樣蛋白2(EDEM2)。預期任何編碼EDEM2或經保守性置換的變體可在本發明中成功地使用。表1列出脊椎動物EDEM2蛋白的一些實例。那些蛋白質序列的多重成對比較是使用Thompson et al.,Nucl.Acids Rev.22(22)：4673-80,1994(亦參見Yuan et al.,Bioinformatics 15(10)：862-3,1999)的Clustal W程式來進行，其顯示各個揭示EDEM2多核苷酸序列與各個其他EDEM2序列為至少69%一致。揭示之哺乳動物EDEM2序列的Clustal W比較顯示，各個序列與其他者為至少92%一致。因此，在一些具體例中，細胞含有編碼具有與哺乳動物EDEM2任一者至少92%一致之序列的EDEM2多肽的多核苷酸。一致EDEM2胺基酸序列是藉由將小鼠、大鼠、倉鼠、黑猩猩及人類EDEM2予以排列而建立。一致序列如SEQ ID NO：8中所示。因此，在一些具體例中，該細胞含有編碼具有SEQ ID NO：8之胺基酸序列之EDEM2多肽的多核苷酸。

在不同具體例中，該細胞含有編碼EDEM2多肽的重組型多核苷酸，該EDEM2多肽具有與小鼠EDEM2(mEDEM2)胺基酸序列至少92%一致之胺基酸序列；且在一個特定具體例中，該多肽為mEDEM2或其經保守性置換的變體。

在一些具體例中，該多重次單位蛋白質為抗體，且該細胞含有編碼包含胺基酸序列SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45，及SEQ ID NO：46之一或多個多肽的多核苷酸。SEQ ID NO：43及44各者分別代表特定抗體重鏈之大約N端及C端部分的一致序列。因此，在一個具體例中編碼蛋白質次單位之多核苷酸編碼含有SEQ ID NO：43及SEQ ID NO：44的多肽。SEQ ID NO：45及46各者分別代表特定抗體輕鏈之大約N端及C端部分的一致序列。因此，在一個具體例中編碼蛋白質次單位之多核苷酸編碼含有SEQ ID NO：45及SEQ ID NO：46的多肽。在一些具體例中，除了編碼EDEM2蛋白質之重組型多核苷酸以外，該細胞含有至少兩個多核苷酸，其各自編碼多重次單位蛋白質的特定次單位。舉例而言，且如下面所例示，該細胞含有編碼抗體重鏈之多核苷酸及抗體輕鏈之另一多核苷酸，該抗體重鏈包含SEQ ID NO：43及SEQ ID NO：44之胺基酸序列，該抗體輕鏈包含SEQ ID NO：45及SEQ ID NO：46之胺基酸序列。

在一些具體例中，除了如上所述含有壓力反應多核苷酸及一或多個編碼多肽次單位的多核苷酸以外，該細胞亦含有編碼在EDEM2上游操作之未摺疊蛋白質反應轉錄因子之多核苷酸。該上游轉錄因子在一些情況下為XBP1的剪接形式。預期任何所編碼的XBP1可以在本發明中成功地使用。表2列出脊椎動物XBP1剪接形式多肽的一些實例。那些多肽序列的多重成對比較是使用Clustal W(Thompson 1994；Yuan 1999)來實施，其顯示各個揭示經剪接之XBP1多核苷酸序列與各個其他XBP1序列為至少48%一致。揭示之哺乳動物XBP1序列的Clustal W比較顯示，各個序列與其他者為至少86%一致。因此，在一些具體例中，該細胞含有編碼具有與哺乳動物經剪接XBP1任一者至少86%一致之序列的XBP1多肽剪接形式的多核苷酸。一致XBP1胺基酸序列是藉由將小鼠、倉鼠及人類XBP1胺基酸序列予以排列而建立。一致序列如SEQ ID NO：13中所示。因此，在一些具體例中，該細胞含有編碼具有SEQ ID NO：13之胺基酸序列之XBP1多肽的多核苷酸。

在不同具體例中，該細胞含有編碼XBP1多肽的多核苷酸，該XBP1多肽具有與小鼠XBP1(mXBP1)胺基酸序列(SEQ ID NO：9)至少86%一致之胺基酸序列；且在一個特定具體例中，該多肽為mXBP1或其經保守性置換的變體。

本發明預期任何細胞可使用來帶有編碼植物凝集素之多肽，以供生產經適當摺疊且具活性的多重次單位蛋白質。此等細胞包括已知的蛋白質生產細胞，諸如細菌大腸桿菌及類似的原核細胞、酵母菌畢赤巴斯德酵母及其他酵母菌與非畢赤酵母菌、植物細胞培植體(諸如菸草者)、昆蟲細胞(諸如施耐德2細胞、Sf9與Sf21，及粉紋夜蝶衍生的Hi5細胞)，以及經常用於生物生產的哺乳動物細胞(諸如CHO、CHO-K1、COS、HeLa、HEK293、Jurkat，及PC12細胞)。在一些具體例中，該細胞為CHO-K1或經修飾的CHO-K1細胞，諸如在美國專利第7,435,553號、第7,514,545號及第7,771,997號，以及美國公開專利申請案第US 2010-0304436 A1中所教示者，其各自以其整體併入本文做為參考資料。

在一些特定具體例中，本發明在生物體外提供CHO-K1細胞，其含有(1)編碼mEDEM2的多核苷酸，含有SEQ ID NO：16之核苷酸序列、(2)編碼XBP1的多核苷酸，含有SEQ ID NO：18之核苷酸序列、(3)編碼抗體重鏈之多核苷酸，含有編碼包含SEQ ID NO：43與44之胺基酸序列的多肽的核苷酸序列，以及(4)編碼抗體輕鏈之多核苷酸，含有編碼包含SEQ ID NO：45與46之胺基酸序列的多肽的核苷酸序列。

在一個特定具體例中，本發明在生物體外提供CHO-K1細胞，其含有(1)編碼mEDEM2的多核苷酸，含有SEQ ID NO：16之核苷酸序列、(2)編碼XBP1的多核苷酸，含有SEQ ID NO：18之核苷酸序列、(3)編碼抗體重鏈之多核苷酸，含有SEQ ID NO：23之核苷酸序列，以及(4)編碼抗體輕鏈之多核苷酸，含有SEQ ID NO：25之核苷酸序列。

在另一個特定具體例中，本發明在生物體外提供CHO-K1細胞，其含有(1)編碼mEDEM2的多核苷酸，含有SEQ ID NO：16之核苷酸序列、(2)編碼XBP1的多核苷酸，含有SEQ ID NO：18之核苷酸序列、(3)編碼抗體重鏈之多核苷酸，含有SEQ ID NO：31之核苷酸序列，以及(4)編碼抗體輕鏈之多核苷酸，含有SEQ ID NO：33之核苷酸序列。

在又另一個特定具體例中，本發明在生物體外提供CHO-K1細胞，其含有(1)編碼mEDEM2的多核苷酸，含有SEQ ID NO：16之核苷酸序列、(2)編碼XBP1的多核苷酸，含有SEQ ID NO：18之核苷酸序列、(3)編碼抗體重鏈之多核苷酸，含有SEQ ID NO：39之核苷酸序列，以及(4) 編碼抗體輕鏈之多核苷酸，含有SEQ ID NO：41之核苷酸序列。

細胞株

在另一個態樣中，本發明提供一種細胞株，其包含複數由上述細胞的同種擴增而來的細胞。細胞株的至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或約100%組成細胞含有編碼壓力誘導型甘露糖-結合植物凝集素的重組型多核苷酸，其在一些具體例中為ERAD的組分。在一些具體例中，該壓力誘導型甘露糖-結合植物凝集素為內質網分解-增強α-甘露糖苷酶樣蛋白2(EDEM2)。預期任何編碼EDEM2或經保守性置換的變體可在本發明中成功地使用。如先前段落中所論，表1列出脊椎動物EDEM2蛋白的一些實例。在一些具體例中，該組成細胞含有編碼具有與任一哺乳動物EDEM2至少92%一致之序列的EDEM2多肽的多核苷酸。在一些具體例中，該組成細胞含有編碼具有SEQ ID NO：8之哺乳動物一致胺基酸序列之EDEM2多肽的多核苷酸。在一些具體例中，該組成細胞含有SEQ ID NO：1之重組型多核苷酸或其經保守性置換的變體。

在一些具體例中，由該細胞株所生產的多重次單位蛋白質為抗體，且該細胞株的組成細胞含有編碼包含胺基酸序列SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44(其分別代表特定抗體重鏈之N端與C端部分的一致序列)，與SEQ ID NO：45及SEQ ID NO：46(其分別代表特定抗體輕鏈之N端與C端部分的一致序列)之一或多個多肽的多核苷酸。在一些具體例中，除了編碼EDEM2蛋白之重組型多核苷酸以外，該細胞株的組成細胞含有至少兩個多核苷酸，其個別編碼多重次單位蛋白質的特定次單位。舉例而言，組成細胞含有編碼抗體重鏈之多核苷酸及編碼抗體輕鏈之另一多核苷酸，該抗體重鏈包含SEQ ID NO：43及SEQ ID NO：44之胺基酸序列，該抗體輕鏈包含SEQ ID NO：45及SEQ ID NO：46之胺基酸序列。

在一些具體例中，除了如上所述含有壓力反應多核苷酸及一或多個編碼多肽次單位的多核苷酸以外，該組成細胞亦含有編碼在EDEM2上游操作之未摺疊蛋白質反應轉錄因子之多核苷酸，諸如XBP1的剪接形式。預期任一編碼XBP1可成功使用在本發明中。如先前段落中所論，表2列出脊椎動物XBP1剪接形式多肽的一些實例。那些序列的Clustal W分析顯示，各個揭示經剪接之XBP1多核苷酸序列與各個其他XBP1序列為至少48%一致；而哺乳動物XBP1序列的比較顯示，各個序列與其他者為至少86%一致。因此，在一些具體例中，該細胞株之組成細胞含有編碼具有與哺乳動物經剪接XBP1任一者至少86%一致之序列的XBP1多肽剪接形式的多核苷酸。在一些具體例中，該組成細胞含有編碼具有SEQ ID NO：13之一致胺基酸序列之XBP1多肽的多核苷酸。

在不同具體例中，該細胞含有編碼XBP1多肽的多核苷酸，該XBP1多肽具有與小鼠XBP1(mXBP1)胺基酸序列(SEQ ID NO：9)至少86%一致之胺基酸序列；且在一個特定具體例中，該多肽為SEQ ID NO：9的mXBP1或其經保守性置換的變體。

本發明預期該細胞株包含其親代選自已知蛋白質生產細胞之組成細胞，已知蛋白質生產細胞為諸如細菌大腸桿菌及類似的原核細胞、酵母菌畢赤巴斯德酵母及其他酵母菌與非畢赤酵母菌、植物細胞培植體(諸如菸草者)、昆蟲細胞(諸如施耐德2細胞、Sf9與Sf21，及粉紋夜蝶衍生的Hi5細胞)，以及經常用於生物生產的哺乳動物細胞(諸如CHO、CHO-K1、COS、HeLa、HEK293、Jurkat，及PC12細胞)。在一些具體例中，該細胞為CHO-K1或經修飾的CHO-K1細胞，諸如在美國專利第7,435,553號、第7,514,545號及第7,771,997號，以及美國公開專利申請案第US 2010-0304436 A1中所教示者。

在一些具體例中，培養基中所培養的細胞株能夠生產多重次單位蛋白質並將經適當組裝的多重次單位蛋白質分泌至培養基中，以產生至少3g/L、至少5g/L或至少8g/L的效價。

此外，該細胞株之組成細胞能夠在培養物中增殖至達到總體細胞密度比不含有編碼壓力誘導型甘露糖-結合植物凝集素之重組型多核苷酸的細胞株之總體細胞密度高出約30%。在一些情況下，該細胞株能夠達到總體細胞密度比不含有編碼壓力誘導型甘露糖-結合植物凝集素之重組型多核苷酸的細胞株之總體細胞密度高出至少約50%、高出至少60%，或高出至少90%。在一些具體例中，在培養物中約12天後評估該細胞株的總體細胞密度。

在一些特定具體例中，本發明提供一種包含同種衍生之組成細胞的細胞株，其中該組成細胞為CHO-K1細胞，其含有(1)編碼mEDEM2的多核苷酸，含有SEQ ID NO：16之核苷酸序列、(2)編碼XBP1的多核苷酸，含有SEQ ID NO：18之核苷酸序列、(3)編碼抗體重鏈之多核苷酸，含有編碼包含SEQ ID NO：43與44之胺基酸序列的多肽的核苷酸序列，以及(4)編碼抗體輕鏈之多核苷酸，含有編碼包含SEQ ID NO：45與46之胺基酸序列的多肽的核苷酸序列。

在一個特定具體例中，本發明提供一種包含同種衍生之組成細胞的細胞株，其中該組成細胞為CHO-K1細胞，其含有(1)編碼mEDEM2的多核苷酸，含有SEQ ID NO：16之核苷酸序列、(2)編碼XBP1的多核苷酸，含有SEQ ID NO：18之核苷酸序列、(3)編碼抗體重鏈之多核苷酸，含有SEQ ID NO：23之核苷酸序列，以及(4)編碼抗體輕鏈之多核苷酸，含有SEQ ID NO：25之核苷酸序列。

在另一特定具體例中，本發明提供一種包含同種衍生之組成細胞的細胞株，其中該組成細胞為CHO-K1細胞，其含有(1)編碼mEDEM2的多核苷酸，含有SEQ ID NO：16之核苷酸序列、(2)編碼XBP1的多核苷酸，含有SEQ ID NO：18之核苷酸序列、(3)編碼抗體重鏈之多核苷酸，含有SEQ ID NO：31之核苷酸序列，以及(4)編碼抗體輕鏈之多核苷酸，含有SEQ ID NO：33之核苷酸序列。

在又另一特定具體例中，本發明提供一種包含同種衍生之組成細胞的細胞株，其中該組成細胞為CHO-K1細胞，其含有(1)編碼mEDEM2的多核苷酸，含有SEQ ID NO：16之核苷酸序列、(2)編碼XBP1的多核苷酸，含有SEQ ID NO：18之核苷酸序列、(3)編碼抗體重鏈之多核苷酸，含有SEQ ID NO：39之核苷酸序列，以及(4)編碼抗體輕鏈之多核苷酸，含有SEQ ID NO：41之核苷酸序列。

EDEM2多核苷酸

在另一個態樣中，本發明提供一種編碼EDEM2蛋白的多核苷酸。編碼EDEM2的多核苷酸為重組型且可在活體外(如在試管中)，或在活體外轉譯系統中，或在活體內(諸如細胞，其可為生物體外，如細胞培養物)，或活體內(如生物體內)製造、儲存、使用或表現。在一些具體例中，編碼EDEM2的多核苷酸是在某個基因內，表示其受到某個啟動子所控制並位在該啟動子下游，且在聚腺苷酸化位點上游。編碼EDEM2的多核苷酸或基因是在質體或其他環狀或線狀載體內。編碼EDEM2的多核苷酸或基因可以在環狀或線狀DNA建構物內，其可以在細胞內作為游離基因組，或併入細胞基因組。

如上所述，編碼EDEM2的多核苷酸編碼表1之任一同源物、同系物或經保守性置換的EDEM2多肽，或具有與SEQ ID NO：1至5與8中任一者至少92%一致之胺基酸序列的EDEM2多肽，包括SEQ ID NO：8之哺乳動物一致序列。

在一些情況下，重組型或分離之編碼EDEM2的多核苷酸可操作地連結至哺乳動物啟動子。該啟動子可以是任一種啟動子，但在一些情況下其為哺乳動物啟動子，諸如例如泛素C啟動子。

在一個特定具體例中，編碼EDEM2的多核苷酸實質上從5’至3’是由啟動子(諸如泛素C啟動子)、接而為視情況選用的內含子(諸如β球蛋白內含子)、繼而EDEM2編碼序列、接著聚腺苷酸化序列(諸如SV40pA序列)組成。這樣一種EDEM2編碼多核苷酸之亦為特定具體例的特定實例是由SEQ ID NO：16說明。那個序列的保守性變體亦預期為本發明的具體例。

在一些情況下，編碼EDEM2之重組型多核苷酸為質體的一部分，其可為線狀、環狀、游離基、併入、靜止DNA建構物或用於遞送EDEM2基因或表現EDEM2蛋白的載體。在一個特定具體例中，該質體含有(1)EDEM2基因，其受泛素C啟動子控制且末端為SV40聚腺苷酸化訊號，以及(2)可篩選標記，諸如在啟動子(SV40啟動子)控制下編碼賦予對博萊黴素之抗性的多肽的多核苷酸或編碼賦予對新黴素抗性之多肽的多核苷酸，並且末端為聚腺苷酸化序列，諸如PGK pA序列。在一個特定具體例中，該質體包含在5’至3’方向上呈環狀形式的泛素C啟動子、β球蛋白內含子、EDEM2編碼序列、SV40 pA序列、SV40啟動子、新黴素抗性編碼序列及PGK pA序列。這個具體例的一個特定實例是以具有SEQ ID NO：14之序列的質體為例。在另一個特定具體例中，該質體包含在5’至3’方向上呈環狀形式的泛素C啟動子、β球蛋白內含子、EDEM2編碼序列、SV40 pA序列、SV40啟動子、博萊黴素抗性編碼序列及PGK pA序列。這個具體例的一個特定實例是以具有SEQ ID NO：15之序列的質體為例。

XBP1多核苷酸

在另一個態樣中，本發明提供一種編碼XBP1蛋白的多核苷酸。編碼XBP1的多核苷酸為重組型且可活體外(如在測試管中)，或在活體外轉譯系統中，或在活體內(諸如細胞，其可為生物體外，如細胞培養物)，或活體內(如生物體內)製造、儲存、使用或表現。在一些具體例中，編碼XBP1的多核苷酸是在某個基因內，表示其受到某個啟動子所控制並位在該啟動子下游，且在聚腺苷酸化位點上游。編碼XBP1的多核苷酸是在質體或其他環狀或線狀載體內。編碼XBP1的多核苷酸或基因可以在環狀或線狀DNA建構物內，其可以在細胞內作為游離基因組，或併入細胞基因組。

如上所述，編碼XBP1的多核苷酸編碼表2之任一同源物、同系物或經保守性置換的XBP1多肽，或具有與SEQ ID NO：9、10與11中任一者至少86%一致之胺基酸序列的XBP1多肽，包括SEQ ID NO：13之哺乳動物一致序列。

在一些情況下，重組型或分離之編碼XBP1的多核苷酸可操作地連結至哺乳動物啟動子。該啟動子可以是任一種啟動子，但在一些情況下其為哺乳動物啟動子，諸如例如泛素C啟動子。

在一個特定具體例中，編碼XBP1的多核苷酸實質上從5’至3’是由啟動子(諸如泛素C啟動子)、接而為視情況選用的內含子(諸如β球蛋白內含子)、繼而XBP1編碼序列、接著聚腺苷酸化序列(諸如SV40 pA序列)組成。SEQ ID NO：18說明編碼XBP1之多核苷酸的一個實例。那個例示性序列的保守性變體亦預期為本發明的具體例。

在一些情況下，編碼XBP1之重組型多核苷酸為質體的一部分，其可為線狀、環狀、游離基、併入、靜止DNA建構物或用於遞送XBP1基因或表現經剪接且具活性XBP1蛋白的載體。在一個特定具體例中，該質體含有(1)XBP1基因，其受泛素C啟動子控制且末端為SV40聚腺苷酸化訊號，以及(2)可篩選標記，諸如在啟動子(諸如SV40啟動子)控制下編碼賦予對博萊黴素之抗性的多肽的多核苷酸或賦予對新黴素抗性之多肽的多核苷酸，並且末端為聚腺苷酸化序列，諸如PGK pA序列。在一個特定具體例中，該質體包含在5’至3’方向上呈環狀形式的泛素C啟動子、β球蛋白內含子、XBP1編碼序列、SV40 pA序列、SV40啟動子、博萊黴素抗性編碼序列及PGK pA序列。這個具體例的一個特定實例是以具有SEQ ID NO：17之序列的環狀質體為例。

編碼抗體重鏈與輕鏈的多核苷酸

在另一個態樣中，本發明提供一種編碼抗體重鏈多肽(HC)的多核苷酸。編碼HC的多核苷酸為重組型且可活體外(如在測試管中)，或在活體外轉譯系統中，或在活體內(諸如細胞，其可為生物體外，如細胞培養物)，或活體內(如生物體內)製造、儲存、使用或表現。在一些具體例中，編碼HC的多核苷酸是在某個基因內，表示其受到某個啟動子所控制並位在該啟動子下游，且在聚腺苷酸化位點上游。編碼HC的多核苷酸或基因是在質體或其他環狀或線狀載體內。編碼HC的多核苷酸或基因可以在環狀或線狀DNA建構物內，其可以在細胞內作為游離基因組，或併入細胞基因組。

在一些情況下，重組型或分離之編碼HC的多核苷酸可操作地連結至哺乳動物啟動子。該啟動子可以是任一種啟動子，但在一些情況下其為哺乳動物啟動子，諸如例如泛素C啟動子或hCMV-IE啟動子。

在一個特定具體例中，編碼HC的多核苷酸為基因，其實質上從5’至3’包含啟動子(例如hCMV-IE啟動子)、接而為視情況選用的內含子(諸如β球蛋白內含子)、繼而重鏈編碼序列(諸如，例如編碼SEQ ID NO：43與44、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：35之胺基酸的序列)、接著聚腺苷酸化序列(例如SV40 pA序列)。HC基因的特定實例是由SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：39說明。那些序列任一者的保守性變體亦預期為本發明的具體例。

在一些情況下，編碼HC之重組型多核苷酸為質體的一部分，其可為線狀、環狀、游離基、併入、靜止DNA建構物或用於遞送重鏈基因或表現重鏈次單位的載體。在一個特定具體例中，該質體含有(1)HC基因，其受hCMV-IE啟動子控制且末端為SV40聚腺苷酸化訊號，以及(2)可篩選標記，諸如在啟動子(SV40啟動子)控制下編碼賦予對潮黴素之抗性的多肽的多核苷酸，並且末端為聚腺苷酸化序列，諸如PGK pA序列。在一個特定具體例中，該質體包含在5’至3’方向上呈環狀形式的hCMV-IE啟動子、β球蛋白內含子、抗體重鏈編碼序列(其編碼具有SEQ ID NO：43與44、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：35之胺基酸的HC)、SV40 pA序列、SV40啟動子、潮黴素抗性編碼序列及PGK pA序列。含有HC基因的這樣一個質體的具體實例與特定具體例是以SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：40來說明。此等序列任一者的保守性變體亦預期為本發明的具體例。

在另一個態樣中，本發明提供一種編碼抗體輕鏈多肽(LC)的多核苷酸。編碼LC的多核苷酸為重組型且可活體外(如在測試管中)，或在活體外轉譯系統中，或在活體內(諸如細胞，其可為生物體外，如細胞培養物)，或活體內(如生物體內)製造、儲存、使用或表現。在一些具體例中，編碼LC的多核苷酸是在某個基因內，表示其受到某個啟動子所控制並位在該啟動子下游，且在聚腺苷酸化位點上游。編碼LC的多核苷酸或基因是在質體或其他環狀或線狀載體內。編碼LC的多核苷酸或基因可以在環狀或線狀DNA建構物內，其可以在細胞內作為游離基因組，或併入細胞基因組。

在一些情況下，重組型或分離之編碼LC的多核苷酸可操作地連結至哺乳動物啟動子。該啟動子可以是任一種啟動子，但在一些情況下其為哺乳動物啟動子，諸如例如泛素C啟動子或hCMC-IE啟動子。

在一個特定具體例中，編碼LC的多核苷酸為基因，實質上從5’至3’包含啟動子(例如hCMV-IE啟動子)、接而為視情況選用的內含子(諸如β球蛋白內含子)、繼而輕鏈編碼序列(諸如，例如編碼SEQ ID NO：45與46、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：37之胺基酸序列的序列)、接著聚腺苷酸化序列(諸如SV40 pA序列)。這樣一個LC基因的具體實例與特定具體例是由SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：41說明。那些序列任一者的保守性變體亦預期為本發明的具體例。

在一些情況下，編碼LC之重組型多核苷酸為質體的一部分，其可為線狀、環狀、游離基、併入、靜止DNA建構物或用於遞送輕鏈基因或表現輕鏈次單位的載體。在一個特定具體例中，該質體含有(1)LC基因，其受hCMV-IE啟動子控制且末端為SV40聚腺苷酸化訊號，以及(2)可篩選標記，諸如在啟動子(諸如SV40啟動子)控制下編碼賦予對潮黴素之抗性的多肽的多核苷酸，並且末端為聚腺苷酸化序列，諸如PGK pA序列。在一個特定具體例中，該質體包含在5’至3’方向上呈環狀形式的hCMV-IE啟動子、β球蛋白內含子、抗體輕鏈編碼序列(其編碼具有SEQ ID NO：45與46、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：37之胺基酸的LC)、SV40 pA序列、SV40啟動子、潮黴素抗性編碼序列及PGK pA序列。含有LC基因的這樣一個質體的具體實例與特定具體例是以SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：34或SEQ ID NO：42來說明。此等序列任一者的保守性變體亦預期為本發明的具體例。

製造多重次單位蛋白質的方法

在另一個態樣中，本發明提供一種藉由培養細胞，或細胞株的組成細胞來製造多重次單位蛋白質的方法，該細胞或細胞株之組成細胞能夠在培養基中生產並分泌相對大量的經適當組裝多重次單位蛋白，其中該多重次單位組份以相對高的效價被分泌至培養基中。本製造方法中所使用的細胞為先前態樣中所述的細胞，其含有本文所述編碼ERAD植物凝集素的多核苷酸。

為了生產可供使用的重組型蛋白質，培養細胞，且具體而言是哺乳動物細胞的方法為技藝中已知的(例如，參見De Jesus & Wurm,Eur.J. Pharm.Biopharm.78：184-188,2011及其中所引用的參考資料)。簡言之，含有所述多核苷酸的細胞培養在培養基中，該培養基可含有血清或水解物，或可為化學限定且針對蛋白質生產經最佳化處理。培養物可為進料批次培養物或呈恆態的連續培養物。可以實驗平台大小的燒瓶(~25mL)、生產規模擴大生物反應器(1-5L)，或工業規模生物反應器(5,000-25,000L)培養細胞。生產運行數週至一個月，期間多重次單位蛋白質被分泌至培養基中。

主體細胞生產與分泌經適當組裝多重次單位蛋白質的能力增強。在一些具體例中，多重次單位蛋白質(例如抗體)以94ρg/細胞/天、至少37ρg/細胞/天，或至少39ρg/細胞/天的速率被分泌至培養基中。在一些具體例中，該多重次單位蛋白質在培養約第12天後達到至少至少3g/L、至少5g/L、至少6g/L，或至少8g/L的效價。

另外，主體細胞增殖並達到相對高的細胞密度，進一步最佳化產率的能力增強。在一些具體例中，細胞或細胞株後代系列(seed train)在培養時達到至少5 x 10⁷細胞-天/mL、至少1 x 10⁸細胞-天/mL或至少1.5 x 10⁸細胞-天/mL的總體細胞密度。

視情況，分泌的多重次單位蛋白質接而從其所分泌的培養基中被純化。蛋白質純化法為技藝中熟知的(參見例如Kelley,mAbs 1(5)：443-452)。在一些具體例中，蛋白質是藉由離心將細胞從液體培養基上清液移除而收取，接著為各種層析步驟與過濾步驟以移除尤其是病毒與其他汙染物或摻雜物。在一些具體例中，層析步驟包括離子交換步驟，諸如陽離子-交換或陰離子-交換。亦可採用不同親和力層析介質，諸如蛋白質A層析供純化抗體。

視情況，製造方法可包括產生細胞的先行步驟。因此，在一些具體例中，製造多重次單位蛋白質的方法包含利用編碼壓力誘導型甘露糖-結合植物凝集素的載體轉染細胞，接而為篩選其穩定整合株(integrant)的步驟。載體的非限制性實例包括彼等含有編碼具有下列之EDEM2的多核苷酸的基因建構物：SEQ ID NO：1-8任一者的胺基酸序列、與SEQ ID NO：1-8任一者至少92%一致的胺基酸序列，或SEQ ID NO：1-8的任一經保守性置換變體。可用載體亦包括，例如，帶有SEQ ID NO：16之基因的質體、SEQ ID NO：15的質體，以及SEQ ID NO：14的質體。吾人應記住質體序列(例如SEQ ID NO：14、15、17、24、26、32、34、40及42)為在序列表中以線性方式描述的環狀序列。因此，在彼等情況下，所記序列的最3端核苷酸可以被視為所記序列最5端核苷酸的緊接5端。在SEQ ID NO：14之質體的實例中，轉形株是透過對新黴素的抗性來進行篩選；就SEQ ID NO：15而言，是透過博萊黴素抗性來進行篩選。

關於建構多核苷酸及包含多核苷酸之載體的詳細方法描述於美國專利第7,435,553號及第7,771,997號(其併入本文做為參考資料)以及在例如Zwarthoff et al.,J.Gen.Virol.66(4)：685-91,1985；Mory et al.,DNA.5(3)：181-93,1986；與Pichler et al.,Biotechnol.Bioeng.108(2)：386-94,2011中。

位在起始細胞中的編碼壓力誘導型甘露糖-結合植物凝集素的載體可已含有編碼調控多重次單位蛋白質之次單位表現的建構物或基因要素，或使用XBP1的那些具體例為XBP1。或者，編碼壓力誘導型甘露糖-結合植物凝集素的載體可以先放入細胞中，接著為其他建構物。

方法所製造的多重次單位蛋白質

在另一個態樣中，本發明提供一種多重次單位蛋白質，其為依據本文揭示的方法所製造。若包括一或多個促使多重次單位蛋白質(諸如抗體)的適當摺疊、組裝與轉譯後修飾的要素，則習於技藝者合理預期這樣的一個蛋白質具有獨特的結構與功能特性。舉例而言，由所揭示方法製造的抗體合理咸信具有特定醣基化型態與相對比例較高的非聚集異四聚體。

實例

提出下列實例俾以將如何製造與使用本發明方法和組成物之完整揭示內容以及說明提供給技藝中具有通常技術者，且不欲限制發明人就其發明所視為的範疇。已盡力確保所用數字(例如數量、溫度等)的正確性，但可能產生某些實驗誤差與偏差。除非另有指明，否則份為莫耳份，分子量為平均分子量，百分比濃度(%)表示以克計的溶質質量除以以毫升計的溶液體積乘上100%(例如，10%物質X表示0.1克物質X/mL溶液)，溫度為攝氏度，而壓力為大氣壓或近乎大氣壓。

實例1：細胞株

利用兩個編碼人類抗體重鏈與輕鏈的質體轉染CHO-K1衍生的細胞株。兩個質體含有hph基因，賦予對潮黴素B的抗性(Asselbergs and Pronk,1992,Mol.Biol.Rep.,17(1)：61-70)。使用LIPOFECTAMIN試劑(Invitrogen cat.#18324020)轉染細胞。簡言之，轉染前一天將350萬個細胞放置於10cm平盤的完全F12(Invitrogen cat.#11765，含有10%胎牛血清(FBS)(Invitrogen cat.#10100)中。轉染當天，洗滌細胞一次並將培養基置換為OPTIMEM(來自Invitrogen cat.# 31985)。在OPTIMEM培養基中製備DNA/Lipofectamin複合物接著添加至細胞中。6小時後再次將培養基更換為具有10% FBS的完全F12。使用潮黴素B篩選劑在400μg/ml下篩選穩定併入的質體。使用FASTAR技術分離表現純系抗體的細胞株(描述於美國專利第6,919,183號中，其併入本文做為參考資料)。

表現抗體的細胞株接著以編碼EDEM2的質體再次轉染。EDEM2質體分別含有新黴素磷酸轉移酶(質體建構物命名為”p3”)或sh ble(質體”p7”)基因以賦予對G418或博萊黴素的抗性。使用相同的轉染方法。取決於可篩選標記，使用G418或博萊黴素分別在400μg/ml或250μg/ml下篩選細胞。接著使用FASTR技術分離純系細胞株。

實例2：

在規模縮小的12天進料批次方法中使用震盪燒瓶評估抗體生產。在這個方法中，以0.8百萬細胞/mL生產培養基(具有高胺基酸的限定培養基)的密度將細胞植入震盪燒瓶。維持培養物約12天，且補充三次進料以及葡萄糖。在整個批次過程中監控活細胞密度以及抗體效價。

為測定mEDEM2對於蛋白質生產增強的影響，比較含有mEDEM2與XBP1之CHO細胞株的蛋白質生產以及含有mXBP1但沒有mEDEM2的對照細胞之生產。相對於不表現mEDEM2的彼等細胞株，蛋白質效價在彼等表現mEDEM2的細胞株中較高。

實例3：總體細胞天數

總體細胞天數(“ICD”)是用來描述在進料批次過程中培養物生長情形的片語。在12天生產分析的過程中，吾人在第0、3、5、7、10及12天監控活細胞密度。接著將此數據相對時間來作圖。ICD為活細胞密度的積分，計算為細胞密度曲線下的面積。經EDEM2轉染的細胞株在12天進料批次過程中具有較高的ICD(參見表5)。

實例4：抗-GDF8抗體生產

檢驗異位表現EDEM2、XBP1或兩者對於生產具有SEQ ID NO：19之重鏈序列以及SEQ ID NO：21之輕鏈序列的抗-GDF8抗體的影響。針對效價與總體細胞密度檢驗個別細胞株並置入"區塊(bin)”或數值範圍內。異位表現EDEM2明顯增加表現抗體之細胞株的數目，在5-6g/L效價範圍內。XBP1與EDEM2的組合顯示對高效價細胞株的增加超出加成效用。在分泌抗體的細胞中，表現EDEM2也明顯地增加達到高ICD之細胞株數目(參見表6)。

<110> 再生元醫藥公司REGENERON PHARMACEUTICALS,INC.

<120> 生產細胞株增強子PRODUCTION CELL LINE ENHANCERS

<130>

<150> US 61/652,549

<151> 2012-05-29

<160> 46

<170> PatentIn第3.5版

<210> 1

<211> 577

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 1

<210> 2

<211> 576

<212> PRT

<213> 挪威大鼠

<400> 2

<210> 3

<211> 578

<212> PRT

<213> 灰倉鼠

<400> 3

<210> 4

<211> 578

<212> PRT

<213> 智人

<400> 4

<210> 5

<211> 578

<212> PRT

<213> 黑猩猩

<400> 5

<210> 6

<211> 513

<212> PRT

<213> 紅毛猩猩

<400> 6

<210> 7

<211> 572

<212> PRT

<213> 斑馬魚

<400> 7

<210> 8

<211> 577

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 一致序列

<220>

<221> 混合特徵

<222> (12)..(12)

<223> V或L

<220>

<221> 混合特徵

<222> (14)..(14)

<223> V或A

<220>

<221> 混合特徵

<222> (15)..(15)

<223> L或F

<220>

<221> 混合特徵

<222> (26)..(26)

<223> D或E

<220>

<221> 混合特徵

<222> (28)..(28)

<223> T或S

<220>

<221> 混合特徵

<222> (57)..(57)

<223> Y或F

<220>

<221> 混合特徵

<222> (91)..(91)

<223> T或V

<220>

<221> 混合特徵

<222> (104)..(104)

<223> N或S

<220>

<221> 混合特徵

<222> (220)..(220)

<223> V或L

<220>

<221> 混合特徵

<222> (285)..(285)

<223> K或R

<220>

<221> 混合特徵

<222> (292)..(292)

<223> H或R

<220>

<221> 混合特徵

<222> (356)..(356)

<223> P或A

<220>

<221> 混合特徵

<222> (442)..(442)

<223> H或D

<220>

<221> 混合特徵

<222> (444)..(444)

<223> N或T

<220>

<221> 混合特徵

<222> (456)..(456)

<223> S,T，或A

<220>

<221> 混合特徵

<222> (458)..(458)

<223> M或I

<220>

<221> 混合特徵

<222> (461)..(461)

<223> H或Y

<220>

<221> 混合特徵

<222> (489)..(489)

<223> R或Q

<220>

<221> 混合特徵

<222> (502)..(502)

<223> I或M

<220>

<221> 混合特徵

<222> (503)..(503)

<223> K或R

<220>

<221> 混合特徵

<222> (505)..(505)

<223> F或L

<220>

<221> 混合特徵

<222> (506)..(506)

<223> Y或H

<220>

<221> 混合特徵

<222> (509)..(509)

<223> K或R

<220>

<221> 混合特徵

<222> (510)..(510)

<223> Q或R

<220>

<221> 混合特徵

<222> (513)..(513)

<223> P或S

<220>

<221> 混合特徵

<222> (514)..(516)

<223> KRA,RA，或KF

<220>

<221> 混合特徵

<222> (518)..(518)

<223> R或K

<220>

<221> 混合特徵

<222> (519)..(519)

<223> K或N

<220>

<221> 混合特徵

<222> (522)..(522)

<223> R或S

<220>

<221> 混合特徵

<222> (529)..(529)

<223> Q或P

<220>

<221> 混合特徵

<222> (530)..(530)

<223> S或A

<220>

<221> 混合特徵

<222> (531)..(531)

<223> G或R

<220>

<221> 混合特徵

<222> (533)..(533)

<223> A或G

<220>

<221> 混合特徵

<222> (534)..(534)

<223> T或S

<220>

<221> 混合特徵

<222> (535)..(535)

<223> L或P

<220>

<221> 混合特徵

<222> (536)..(536)

<223> S或F

<220>

<221> 混合特徵

<222> (537)..(537)

<223> S或A

<220>

<221> 混合特徵

<222> (539)..(540)

<223> AN,EN,GKQD，或ENHD

<220>

<221> 混合特徵

<222> (542)..(542)

<223> P或A

<220>

<221> 混合特徵

<222> (545)..(545)

<223> K或R

<220>

<221> 混合特徵

<222> (546)..(546)

<223> Q或K

<220>

<221> 混合特徵

<222> (549)..(549)

<223> Q,R，或K

<220>

<221> 混合特徵

<222> (551)..(551)

<223> R或K

<220>

<221> 混合特徵

<222> (552)..(552)

<223> T,A，或V

<400> 8

<210> 9

<211> 371

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 9

<210> 10

<211> 369

<212> PRT

<213> 灰倉鼠

<400> 10

<210> 11

<211> 376

<212> PRT

<213> 智人

<400> 11

<210> 12

<211> 383

<212> PRT

<213> 斑馬魚

<400> 12

<210> 13

<211> 371

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 一致序列

<220>

<221> 混合特徵

<222> (7)..(7)

<223> A或S

<220>

<221> 混合特徵

<222> (9)..(9)

<223> S或N

<220>

<221> 混合特徵

<222> (10)..(10)

<223> A或P

<220>

<221> 混合特徵

<222> (12)..(12)

<223> T或D

<220>

<221> 混合特徵

<222> (13)..(13)

<223> A或G

<220>

<221> 混合特徵

<222> (14)..(14)

<223> A或T

<220>

<221> 混合特徵

<222> (26)..(26)

<223> S或A

<220>

<221> 混合特徵

<222> (27)..(27)

<223> Xaa可為任何天然胺基酸

<220>

<221> 混合特徵

<222> (29)..(29)

<223> R或Q

<220>

<221> 混合特徵

<222> (37)..(37)

<223> G或A

<220>

<221> 混合特徵

<222> (38)..(38)

<223> Xaa可為任何天然胺基酸

<220>

<221> 混合特徵

<222> (40)..(40)

<223> A或G

<220>

<221> 混合特徵

<222> (46)..(46)

<223> S或N，或ASG

<220>

<221> 混合特徵

<222> (48)..(48)

<223> T,A，或L

<220>

<221> 混合特徵

<222> (103)..(103)

<223> H或Q

<220>

<221> 混合特徵

<222> (106)..(106)

<223> Q或L

<220>

<221> 混合特徵

<222> (121)..(121)

<223> V或I

<220>

<221> 混合特徵

<222> (128)..(128)

<223> T或Q

<220>

<221> 混合特徵

<222> (134)..(134)

<223> T,V，或A

<220>

<221> 混合特徵

<222> (136)..(136)

<223> D,T，或V

<220>

<221> 混合特徵

<222> (137)..(137)

<223> P,T，或A

<220>

<221> 混合特徵

<222> (138)..(138)

<223> D或E

<220>

<221> 混合特徵

<222> (140)..(140)

<223> V,A，或無

<220>

<221> 混合特徵

<222> (141)..(141)

<223> P或無

<220>

<221> 混合特徵

<222> (143)..(143)

<223> V,T，或A

<220>

<221> 混合特徵

<222> (145)..(145)

<223> A或S

<220>

<221> 混合特徵

<222> (148)..(148)

<223> S或N

<220>

<221> 混合特徵

<222> (149)..(149)

<223> G或E

<220>

<221> 混合特徵

<222> (152)..(152)

<223> L或P

<220>

<221> 混合特徵

<222> (169)..(169)

<223> S或P

<220>

<221> 混合特徵

<222> (178)..(178)

<223> D或G

<220>

<221> 混合特徵

<222> (179)..(179)

<223> T或G

<220>

<221> 混合特徵

<222> (180)..(180)

<223> V或I

<220>

<221> 混合特徵

<222> (181)..(181)

<223> A或D

<220>

<221> 混合特徵

<222> (196)..(196)

<223> K或N

<220>

<221> 混合特徵

<222> (210)..(210)

<223> S或P

<220>

<221> 混合特徵

<222> (212)..(212)

<223> S或N

<220>

<221> 混合特徵

<222> (222)..(222)

<223> E或無

<220>

<221> 混合特徵

<222> (254)..(254)

<223> V或I

<220>

<221> 混合特徵

<222> (271)..(271)

<223> T或A

<220>

<221> 混合特徵

<222> (284)..(284)

<223> S或P

<220>

<221> 混合特徵

<222> (287)..(287)

<223> E或N

<220>

<221> 混合特徵

<222> (298)..(298)

<223> K或E

<220>

<221> 混合特徵

<222> (301)..(301)

<223> L,V，或無

<220>

<221> 混合特徵

<222> (303)..(303)

<223> D或E

<220>

<221> 混合特徵

<222> (305)..(305)

<223> F或L

<220>

<221> 混合特徵

<222> (306)..(306)

<223> I或V

<220>

<221> 混合特徵

<222> (309)..(309)

<223> L或P

<220>

<221> 混合特徵

<222> (321)..(321)

<223> L或P

<220>

<221> 混合特徵

<222> (322)..(322)

<223> R或K

<220>

<221> 混合特徵

<222> (324)..(324)

<223> P或S

<220>

<221> 混合特徵

<222> (331)..(331)

<223> H或Y

<220>

<221> 混合特徵

<222> (337)..(337)

<223> E或G

<220>

<221> 混合特徵

<222> (340)..(340)

<223> P或L

<220>

<221> 混合特徵

<222> (349)..(349)

<223> P或L

<220>

<221> 混合特徵

<222> (352)..(352)

<223> T,I，或V

<220>

<221> 混合特徵

<222> (353)..(353)

<223> D或N

<400> 13

<210> 14

<211> 7686

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成質體

<400> 14

<210> 15

<211> 7257

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成質體

<400> 15

<210> 16

<211> 3892

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成建構物

<400> 16

<210> 17

<211> 6629

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成質體

<400> 17

<210> 18

<211> 3264

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成建構物

<400> 18

<210> 19

<211> 447

<212> PRT

<213> 智人

<400> 19

<210> 20

<211> 110

<212> PRT

<213> 智人

<400> 20

<210> 21

<211> 214

<212> PRT

<213> 智人

<400> 21

<210> 22

<211> 100

<212> PRT

<213> 智人

<400> 22

<210> 23

<211> 2971

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成建構物

<400> 23

<210> 24

<211> 7013

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成質體

<400> 24

<210> 25

<211> 2272

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成建構物

<400> 25

<210> 26

<211> 6335

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成質體

<400> 26

<210> 27

<211> 452

<212> PRT

<213> 智人

<400> 27

<210> 28

<211> 112

<212> PRT

<213> 智人

<400> 28

<210> 29

<211> 214

<212> PRT

<213> 智人

<400> 29

<210> 30

<211> 107

<212> PRT

<213> 智人

<400> 30

<210> 31

<211> 2986

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成建構物

<400> 31

<210> 32

<211> 7028

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成質體

<400> 32

<210> 33

<211> 2272

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成建構物

<400> 33

<210> 34

<211> 6335

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成質體

<400> 34

<210> 35

<211> 449

<212> PRT

<213> 智人

<400> 35

<210> 36

<211> 103

<212> PRT

<213> 智人

<400> 36

<210> 37

<211> 214

<212> PRT

<213> 智人

<400> 37

<210> 38

<211> 107

<212> PRT

<213> 智人

<400> 38

<210> 39

<211> 2977

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成建構物

<400> 39

<210> 40

<211> 7019

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成質體

<400> 40

<210> 41

<211> 2272

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成建構物

<400> 41

<210> 42

<211> 6335

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成質體

<400> 42

<210> 43

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 一致序列

<220>

<221> 混合特徵

<222> (1)..(1)

<223> Xaa可為任何天然胺基酸

<220>

<221> 混合特徵

<222> (11)..(11)

<223> Xaa可為任何天然胺基酸

<220>

<221> 混合特徵

<222> (28)..(28)

<223> Xaa可為任何天然胺基酸

<220>

<221> 混合特徵

<222> (30)..(30)

<223> Xaa可為任何天然胺基酸

<220>

<221> 混合特徵

<222> (34)..(35)

<223> Xaa可為任何天然胺基酸

<220>

<221> 混合特徵

<222> (93)..(93)

<223> Xaa可為任何天然胺基酸

<220>

<221> 混合特徵

<222> (93)..(93)

<223> Xaa可為任何天然胺基酸

<220>

<221> 混合特徵

<222> (96)..(96)

<223> Xaa可為任何天然胺基酸

<220>

<221> 混合特徵

<222> (100)..(100)

<223> Xaa可為任何天然胺基酸

<220>

<221> 混合特徵

<222> (111)..(111)

<223> Xaa可為任何天然胺基酸

<220>

<221> 混合特徵

<222> (114)..(114)

<223> Xaa可為任何天然胺基酸

<400> 43

<210> 44

<211> 225

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 一致序列

<220>

<221> 混合特徵

<222> (13)..(13)

<223> Xaa可為任何天然胺基酸

<220>

<221> 混合特徵

<222> (47)..(47)

<223> Xaa可為任何天然胺基酸

<220>

<221> 混合特徵

<222> (53)..(53)

<223> Xaa可為任何天然胺基酸

<220>

<221> 混合特徵

<222> (75)..(75)

<223> Xaa可為任何天然胺基酸

<220>

<221> 混合特徵

<222> (106)..(106)

<223> Xaa可為任何天然胺基酸

<220>

<221> 混合特徵

<222> (109)..(110)

<223> Xaa可為任何天然胺基酸

<220>

<221> 混合特徵

<222> (134)..(135)

<223> Xaa可為任何天然胺基酸

<220>

<221> 混合特徵

<222> (137)..(137)

<223> Xaa可為任何天然胺基酸

<220>

<221> 混合特徵

<222> (188)..(188)

<223> Xaa可為任何天然胺基酸

<220>

<221> 混合特徵

<222> (198)..(198)

<223> Xaa可為任何天然胺基酸

<220>

<221> 混合特徵

<222> (224)..(224)

<223> Xaa可為任何天然胺基酸

<400> 44

<210> 45

<211> 60

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 一致序列

<220>

<221> 混合特徵

<222> (13)..(14)

<223> Xaa可為任何天然胺基酸

<220>

<221> 混合特徵

<222> (16)..(16)

<223> Xaa可為任何天然胺基酸

<220>

<221> 混合特徵

<222> (21)..(22)

<223> Xaa可為任何天然胺基酸

<220>

<221> 混合特徵

<222> (24)..(27)

<223> Xaa可為任何天然胺基酸

<220>

<221> 混合特徵

<222> (31)..(31)

<223> Xaa可為任何天然胺基酸

<220>

<221> 混合特徵

<222> (34)..(34)

<223> Xaa可為任何天然胺基酸

<220>

<221> 混合特徵

<222> (48)..(48)

<223> Xaa可為任何天然胺基酸

<220>

<221> 混合特徵

<222> (50)..(50)

<223> Xaa可為任何天然胺基酸

<220>

<221> 混合特徵

<222> (54)..(54)

<223> Xaa可為任何天然胺基酸

<220>

<221> 混合特徵

<222> (56)..(56)

<223> Xaa可為任何天然胺基酸

<400> 45

<210> 46

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 一致序列

<220>

<221> 混合特徵

<222> (4)..(4)

<223> Xaa可為任何天然胺基酸

<400> 46

Claims

一種分離多核苷酸，其包含編碼下列之核苷酸序列：一內質網分解-增強α-甘露糖苷酶樣蛋白2(EDEM2)多肽，其中該EDEM2包含與SEQ ID NO：1至少92%一致的胺基酸序列；一啟動子；及一多重次單位蛋白質.
如請求項1之分離多核苷酸，其中該啟動子係選自由泛素C、CMV-IE及SV40所組成之群組。
如請求項1或2之分離多核苷酸，其中該EDEM2多肽包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列。
如請求項1至3中任一項之分離多核苷酸，其中該EDEM2多肽實質上由SEQ ID NO：8之胺基酸序列所組成。
如請求項1至4中任一項之分離多核苷酸，其中該EDEM2多肽包含選自由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6所組成群組之胺基酸序列。
如請求項1至3及5中任一項之分離多核苷酸，其中該EDEM2多肽實質上由SEQ ID NO：1之胺基酸序列所組成。
如請求項1至6中任一項之分離多核苷酸，其中該編碼多重次單位蛋白質之核苷酸序列編碼至少一抗體重鏈或至少一抗體輕鏈。
如請求項7之分離多核苷酸，其中該核苷酸序列編碼包含SEQ ID NO：43及SEQ ID NO：44之胺基酸序列的抗體重鏈。
如請求項7或8之分離多核苷酸，其中該編碼多重次單位蛋白質之核苷酸序列進一步編碼包含SEQ ID NO：45及SEQ ID NO：46之胺基酸序列的抗體輕鏈。
如請求項7、8或9之分離多核苷酸，其中該編碼多重次單位蛋白質之核苷酸序列編碼包含SEQ ID NO：43及SEQ ID NO：44之胺基酸序列的抗體重鏈與包含SEQ ID NO：45及SEQ ID NO：46之胺基酸序列的抗體輕鏈。
如請求項7之分離多核苷酸，其中該編碼多重次單位蛋白質之核苷酸序列編碼抗-GDF8抗體重鏈，可操作地連結至哺乳動物泛素C啟動子或人類CMV-IE啟動子。
如請求項11之分離多核苷酸，其中該抗-GDF8抗體重鏈包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列。
如請求項11之分離多核苷酸，其中該抗-GDF8抗體重鏈包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列。
如請求項11之分離多核苷酸，其中該編碼多重次單位蛋白質之核苷酸序列編碼抗-GDF8抗體重鏈，包含SEQ ID NO：23。
如請求項11之分離多核苷酸，其中該編碼多重次單位蛋白質之核苷酸序列編碼抗-GDF8抗體重鏈，包含SEQ ID NO：24。
如請求項7至15中任一項之分離多核苷酸，其中該核苷酸序列編碼抗-GDF8抗體輕鏈，可操作地連結至哺乳動物泛素C啟動子或人類CMV-IE啟動子。
如請求項16之分離多核苷酸，其中該編碼多重次單位蛋白質之核苷酸序列編碼包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的抗-GDF8抗體輕鏈。
如請求項16之分離多核苷酸，其中該編碼多重次單位蛋白質之核苷酸序列編碼包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列的抗-GDF8抗體輕鏈。
如請求項16之分離多核苷酸，其中該編碼多重次單位蛋白質之核苷酸序列編碼包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列的抗-GDF8抗體輕鏈。
如請求項16之分離多核苷酸，其中該編碼多重次單位蛋白質之核苷酸序列編碼包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列的抗-GDF8抗體輕鏈。
如請求項7、8、9或10之分離多核苷酸，其中該編碼多重次單位蛋白質之核苷酸序列編碼抗-ANG2抗體重鏈，可操作地連結至哺乳動物泛素C啟動子或人類CMV-IE啟動子。
如請求項21之分離多核苷酸，其中該抗-ANG2抗體重鏈包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列。
如請求項21之分離多核苷酸，其中該抗-ANG2抗體重鏈包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列。
如請求項21之分離多核苷酸，其中該編碼多重次單位蛋白質之核苷酸序列包含SEQ ID NO：31之核苷酸序列。
如請求項21之分離多核苷酸，其中該編碼多重次單位蛋白質之核苷酸序列包含SEQ ID NO：32之核苷酸序列。
如請求項21至25中任一項之分離多核苷酸，其中該編碼多重次單位蛋白質之核苷酸序列編碼抗-ANG2抗體輕鏈，可操作地連結至哺乳動物之啟動子。
如請求項26之分離多核苷酸，其中該抗-ANG2抗體輕鏈包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列。
如請求項26之分離多核苷酸，其中該抗-ANG2抗體輕鏈包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列。
如請求項26之分離多核苷酸，其中該編碼多重次單位蛋白質之核苷酸序列包含SEQ ID NO：33之核苷酸序列。
如請求項26之分離多核苷酸，其中該編碼多重次單位蛋白質之核苷酸序列包含SEQ ID NO：34之核苷酸序列。
如請求項7至10中任一項之分離多核苷酸，其編碼多重次單位蛋白質之核苷酸序列編碼抗-AngPtl4抗體重鏈，可操作地連結至哺乳動物泛素 C啟動子或人類CMV-IE啟動子。
如請求項31之分離多核苷酸，其中該抗-AngPtl4抗體重鏈包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列。
如請求項31之分離多核苷酸，其中該抗-AngPtl4抗體重鏈包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列。
如請求項31之分離多核苷酸，其中該編碼多重次單位蛋白質之核苷酸序列包含SEQ ID NO：39之核苷酸序列。
如請求項31之分離多核苷酸，其中該編碼多重次單位蛋白質之核苷酸序列包含SEQ ID NO：40之核苷酸序列。
如請求項31之分離多核苷酸，其中該核苷酸序列編碼抗-AngPtl4抗體輕鏈，可操作地連結至哺乳動物泛素C啟動子或人類CMV-IE啟動子。
如請求項36之分離多核苷酸，其中該抗-AngPtl4抗體輕鏈包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列。
如請求項36之分離多核苷酸，其中該抗-AngPtl4抗體輕鏈包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列。
如請求項36之分離多核苷酸，其中該編碼多重次單位蛋白質之核苷酸序列包含SEQ ID NO：41之核苷酸序列。
如請求項36之分離多核苷酸，其中該編碼多重次單位蛋白質之核苷酸序列包含SEQ ID NO：42之核苷酸序列。
如請求項1至40中任一項之分離多核苷酸，其進一步包含編碼X-盒結合蛋白1(XBP1)之剪接形式的核苷酸序列。
如請求項41之分離多核苷酸，其中該XBP1包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列。
如請求項41之分離多核苷酸，其中該XBP1包含與SEQ ID NO：9至少86%一致的胺基酸序列。
如請求項41至43中任一項之分離多肽，其中該編碼XBP1之剪接形式的核苷酸序列包含SEQ ID NO：17或18之核苷酸序列。