KR101145308B1 - 단백질 생산 속도를 변경하는 방법 - Google Patents

Abstract

항체와 같은 단백질의 세포성 분비 속도를 변경하는 방법 및 본 방법에 의해 생산된 변경된 세포가 개시되었다. 방법과 변경된 세포는 치료, 진단 및 연구 목적을 위한 높은 레벨의 단백질을 생산하는데 유용하다.

세포성 분비 속도, 항체

Description

단백질 생산 속도를 변경하는 방법 {METHODS FOR ALTERING PROTEIN PRODUCTION RATES}

본 발명은 단백질의 세포 분비 속도를 변경하는 방법에 관한 것이다.

항체와 같은 단백질의 대규모 생산은 전형적으로 배양된 생산 세포주로부터의 단백질의 분비에 의존한다. 배양된 세포에 의해 분비된 단백질은 즉각적으로 회수될 수 있고, 주변 세포 배양 배지로부터 정제될 수 있다.

단백질의 세포 분비 속도는 생반응기 또는 기타 시스템으로부터 분비된 단백질의 정제 및 생산에 영향을 미치는 중요한 변수이다. 일반적으로, 정제된 단백질의 더 큰 수율은 세포 분비 속도가 상대적으로 높을 때 얻어질 수 있다. 반대로, 세포 분비 속도가 너무 낮으면, 단백질 정제는 가능하지 않을 수도 있다.

낮은 분비 세포의 문제를 피하는 한가지 접근법은 부차클로닝된 높은 분비 세포를 낮은 분비 세포의 모집단으로부터 분리하는 것이다. 전형적으로, 이것은 수 시간이 필요하고, 연속 희석을 제한하고, 높은 분비 세포주를 스크리닝하고 선택한다는 노동 집약적인 순환을 필요로 한다.

택일적으로, 중요한 단백질을 생산하는 완전히 새로운 세포주는 새로운 세포주가 높은 분비 세포주일 것이라는 기대에서 생성된다.

높은 분비 세포주를 생성하는데 이전의 방법은 각각 제한적이다. 예를 들면, 높은 분비 세포주를 낮은 분비 세포의 모집단으로부터 부차클로닝함으로써 규명하는 것은 모집단내 높은 분비 세포의 상대적인 희소성뿐만 아니라 임의의 높은 분비 세포를 규명하는데 필요한 막대한 양의 시간과 노동력에 의해 제한된다.

더구나, 중요한 항체 또는 단백질을 생산하는 새로운 세포주의 생성은 새로운 세포주가 높은 분비가 아닐 가능성 및 항체 생성 세포를 재-생성하고, 높은 분비 세포를 확인하는데 필요한 실질적인 양의 노력에 의해 제한된다. 일부 예에서, 감소된 분비 속도를 야기하는 세포의 소포체내에 미스폴딩된(misfolding) 단백질 때문에 낮은 분비 세포주만 얻어질 수 있다.

따라서, 단백질의 세포 분비 속도를 바꾸는 효과적인 방법에 대한 필요성이 존재한다.

본 발명의 한 측면은, 세포중의 적어도 하나의 UPR 경로 성분의 활성을 조정하고, 그 세포를 배양하는 단계를 포함하는 단백질의 세포 분비 속도를 변경하는 방법이다.

본 발명의 다른 측면은, 세포중 적어도 하나의 UPR(unfolded protein response) 경로 성분의 활성을 조정하고, 그 세포를 배양하는 단계를 포함하는 단백질의 세포 분비 속도를 변경하는 것에 의해 생성된 세포 분비 속도가 변경된 플라즈마 세포이다.

본 발명의 다른 측면은, 세포중 적어도 하나의 UPR 경로 성분의 활성을 조정하고, 그 세포를 배양함으로써 생성된 세포 분비 속도가 변경된 플라즈마 세포를 포함하는 유전자도입 동물이다.

본 발명의 다른 측면은, SEQ ID NO: 15 또는 SEQ ID NO: 16에 나타낸 서열을 갖는 분리된 핵산이다.

본원에서 언급된 모든 출판물은, 특허 및 특허 출원을 포함하지만 제한하지는 않으며, 완전히 설명된 것처럼 참고문헌에 의해 본원에 포함되어 있다.

본원에서 사용된 용어 "항체"는 넓은 의미로 뜻해지고, 면역글로불린 또는 다클론 항체, 쥐, 인간, 인간화 및 키메라 단클론 항체를 포함하는 단클론 항체 및 항체 조각 또는 변형체를 포함한 항체 분자를 포함한다. 항체는 플라즈마 세포에 구조 발현되고 분비되는 분비된 단백질이다. 항체는 표준 방법, 예를 들면 하이브리도마(hybridoma) 생성에 의해 또는, 항체 중쇄 및/또는 경쇄 유전자의 무한증식된 B 세포, 예를 들면 골수종 세포 또는 CHO(Chinese hamster ovary) 세포, 식물 세포 및 곤충 세포와 같은 다른 세포 유형으로 형질전환에 의해 무한증식된 플라즈마 세포를 이용하여 생성될 수 있다.

항체 조각 또는 변이체는 유사체(mimetibodies), Fab 조각, F(ab')₂ 조각, Fc 조각, 중쇄 조각, 경쇄 조각, 및 적어도 하나의 항체 펩티드 사슬의 일부를 함유한 분자를 포함한다. 이러한 일부는 항체 가변부, 힌지(hinge), 불변부위 펩티드 사슬에 해당할 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "유사체"는 일반식(I)을 갖는 단백질을 의미한다:

(V1(n)-Pep(n)-Flex(n)-V2(n)-pHinge(n)-CH2(n)-CH3(n))(m)

(I)

상기식에서,

V1은 면역글로불린 가변부의 N-종단의 적어도 하나의 부분이고,

Pep는 항원결정인자에 결합하는 적어도 하나의 생활성 펩티드이고,

Flex는 유사체가 교대방향 및 결합특성을 갖도록 하는 구조적 유연성을 제공하는 폴리펩티드이고,

V2는 면역글로불린 가변부의 C-종단의 적어도 하나의 부분이고,

pHinge는 면역글로불린 가변부의 적어도 일부이고,

CH2는 면역글로불린 CH2 불변부의 적어도 일부이고,

CH3은 면역글로불린 CH3 불변부의 적어도 일부이며,

여기에서 n 및 m은 1-10 사이의 정수일 수 있다. 유사체는 다른 유형의 면역 글로불린 분자, 예를 들면 구조내에 존재하는 중쇄 불변 영역 아미노산 서열에 따른 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgD 및 IgE의 특성 및 기능을 모방할 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "단클론 항체" (mAb)는 충분히 균일한 항체로 부터 얻어진 항체 (또는 항체 조각)을 의미한다. 단클론 항체는 매우 특이하고, 전형적으로 단일 항원결정기에 대해 향해있다. 조정기 "단클론"은 항체의 충분히 균일한 특성을 나타내고, 어떤 특별한 방법에 의해 항체의 생산을 요구하지 않는다. 예를 들면, 쥐 mAb는 Kohler et al., Nature 256:495(1975)의 하이브리도마법에 의해 만들어질 수 있다. 수용체 항체(전형적으로 인간과 같은 다른 포유류종)로부터 유래된 경쇄 및 중쇄 불변부와 관련한 공여 항체(전형적으로 쥐)로부터 유래된 경쇄 및 중쇄 가변부를 함유한 키메라 mAb는 미국특허 제 4,816, 567호에 개시된 방법에 의해 제조할 수 있다. 비-인간 공여 면역글로불린(전형적으로 쥐)으로부터 유래된 CDR 및 하나 또는 그 이상의 인간 면역 글로불린으로부터 유래된 분자의 면역글로불린-유래 부분의 잔기, 결합 친화도를 보존하기 위해 변경된 구조 지지 잔기를 임의로 갖는 인간화된 mAb는 Queen et al., Proc. Natl Acad Sci(USA), 86: 10029-10032, (1989) 및 Hodgson et al., Bio/Technology, 9: 421, (1991)에 의해 개시된 기술에 의해 수득할 수 있다.

어떤 비-인간 서열도 없는 완전한 인간 mAb는 인간 면역글로불린은 형질전환 쥐로부터 예를 들면 Lonberg et al., Nature 368: 856-859, (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14: 845-851, (1996)' 및 Mendez et al., Nature Genetics 15: 146-156, (1997)에서 참고된 기술로 제조될 수 있다. 인간 mAb는 Knappik et al., J. Mol. Biol. 296: 57-86, (2000) 및 Krebs et al., J. Immunol. Meth. 254: 67-84, (2001)에서 참고된 기술에 의해 파지 디스플레이 라이브러리(phage display libraries)로부터 또한 제조되고 최적화될 수 있다.

본원에서 사용된 "세포 분비 속도"는 세포가 일정 단백질을 분비할 때의 속도를 의미한다. 이러한 속도는 시간 변화당 배양 배지중 존재하는 단백질 양의 변화에 따라 기재될 수 있고, 세포 수로 정규화되어 단위 "pg/cell/day"로 표시될 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "단기 간섭 RNA"는 목적 유전자 전사의 분리를 중재하는 핵산 서열을 의미한다. siRNA(short interfering RNA)는 이중가닥화 되었거나, 또는 단기 머리핀형일 것이다. 이중가닥화된 siRNA는 두개의 개별적인, 역평행인, 소결된 RNA 가닥 또는 RNA 및 DNA 모두를 함유한 소결된 핵산 가닥(예를 들면, 5'-TTTTUUUU-3' 소결되어 5'-TTTTUUUU-3'으로 또는 5'-TTTT-3' 소결되어 5'-UUUU-3'으로)을 포함할 것이다. 단기 머리핀형 siRNA는 단일 RNA 가닥 또는 단일 RNA를 포함할 것이다: DNA 하이브리드(hybrid) 가닥은 줄기-루프 구조, 또는 siRNA와 같이 효과적인 다른 2차 구조를 형성할 수 있다. 해당 분야의 숙련된 기술자는 siRNA가 다른 변형, 예를 들면 뉴클레오시드 유사체, 백본(backbone) 변형, 및 변형된 siRNA 핵산이 목적 유전자 전사의 분리를 매개할 수 있도록 여전히 허용하는 기타 변형을 포함한다.

본원에서 사용된 용어 "작은 분자"는 분자량이 24,000g/mol 이하인 화합물을 의미하고, 이것은 아미노산 잔기 또는 핵산 잔기만을 오로지 포함하지는 않는다.

본원에서 사용된 용어 "전사적 조절 서열"은 유전자의 전사에 따라 증가하거나 감소하는 유전자 또는 핵산 서열의 전사에 필요한 핵산 서열을 의미한다.

본원 및 청구항에서 사용된 "UPR 경로 성분"은 UPR 경로를 통해 신호를 중재하거나 UPR을 활성화하는 펩티드 사슬 또는 핵산 서열, 예를 들면 전사적 조절 서열이다.

본 발명은 세포에 의해 단백질의 세포성 분비 속도를 변경하는데 유용한 방법을 제공한다. 본 발명의 방법의 예시적 사용은 항체와 같이 치료, 진단, 연구 목적으로 유용한 단백질에 대한 분비 속도의 증진이다.

세포주 중 낮은 단백질 분비 속도는 UPR을 통한 분비 공정을 늦추거나 멈추는 세포 ER중 잘못 폴딩된 단백질의 축적에 의해 야기될 수 있다. ER 막중 스트레스-감지 단백질은 폴딩되지 않은 과량의 단백질을 감지할 수 있고, UPR을 유발시킨다. 이어서, 복잡한 신호 전달 연쇄반응을 통하여 차페론(chaperone) 단백질 Bip 및 전사 인자 XBP-1 및 CHOP는 업레귤레이트화(upregulated) 된다.

차페론 단백질은 폴딩되지 않은 단백질에 결합하고 올바른 폴딩을 돕는다. 전사 인자 CHOP는 일반적으로 세포 성장, 분화, 생존에 음성적인 조절인자로 간주된다. CHOP의 업레귤레이션(upregulation)이 세포 주기 정지를 유발하고, 게다가 UPR 도입의 책임을 가진 불리한 조건에 대항하는 세포 시간을 주는 것으로 관찰되었다.

전사 인자 XBP-1은 플라즈마 세포, 많은 양의 면역글로불린을 분비하는 분화된 B 림프구를 생성하는데 필요하다. 플라즈마 세포는 일부 UPR 유전자의 업레귤레이션이 면역글로불린 합성에 앞서 일어나는 변경된 UPR을 나타낸다. 이것은 XBP-1, Bip, Grp94 및 p50ATF6 알파를 포함하고, 이들의 업레귤레이션은 플라즈마 세포 분화 및 적절한 항체 생성에 필요하다(Gass, J.N., et al., J. Biol. Chem. 227, 49047-49054(2002). 반대로, CHOP는 이러한 전이중 업레귤레이트화되지 않고, UPR의 뚜렷한 형태를 제시한다. 이들 분자의 업레귤레이션은 세포성 단백질 분비 속도의 증가 또는 세포자멸을 일으키는 유익하거나 해로운 효과를 가질 수 있다. 참고: Kaufman, R.J., Genes Dev. 13, 1211-1233 (1999) and Cudna, R.E., et al., Biotechnol. Bioeng. 81, 56-65(2003).

본 발명의 방법에서, 단백질의 세포 분비 속도는 세포중 적어도 하나의 UPR 경로 성분의 활성을 조정하고 세포를 배양하여 변경된다. 본 발명의 방법은 항체와 같은 단백질의 세포성 분비 속도를 증가시키거나 감소시키는 것에 대하여 제공한다.

본 발명의 구체예에서, 단백질의 세포성 분비 속도는 UPR 경로 성분을 코딩한 핵산으로 세포를 안정하게 핵산전달감염시키는 것에 의해 증가된다. UPR 경로 성분은 폴리펩티드 또는 핵산 서열, 예를 들면 UPR 경로를 통해 신호를 중재하거나 UPR을 활성화하는 전사적 조절 서열일 수 있다. UPR 경로 성분은 BiP, XBP 및 CHOP 및 유사한 활성을 가진 변형을 포함한다. UPR 경로 성분의 다른 예는, IRE1, PERK, ATF4, ATF6, eIF2alpha, GRP78, GRP94, 칼레티쿨린(calreticulin), 차페론, 및 유사한 활성을 갖는 변형을 포함한다(참고: 예를 들면, Cudna and Dickson, Biotechnol. Bioeng., 81, 56-65(2002)). 전사적 조절 서열의 예는 다른 UPR 유전자의 프로모터에서 규명된 UPRE(cis-acting UPR element) 및 ERSE가 있다. 해당 분야의 숙련된 기술자는 다른 UPR 경로 성분 및 전사적 조절 서열을 인식할 것이다. UPR 경로 성분은 SEQ ID NO: 2(쥐 BiP), SEQ ID NO: 4(쥐 XBP-1, 스플라이스화된(spliced) 형태), SEQ ID NO: 6(쥐 XBP-1, 스플라이스화되지 않은 형태), SEQ ID NO: 8(쥐 CHOP-10), SEQ ID NO: 10(인간 BiP), SEQ ID NO: 12(인간 XBP-1) 또는 SEQ ID NO: 14(인간CHOP-10)에서 나타낸 것과 같이 아미노산 서열을 가질 수 있다. UPR 경로 성분 핵산은 SEQ ID NO: 1(쥐 BiP mRNA), SEQ ID NO: 3(쥐 XBP-1, 스플라이스화된 형태 mRNA), SEQ ID NO: 5(쥐 XBP-1, 스플라이스화되지 않은 형태, mRNA), SEQ ID NO: 7(쥐 CHOP-10 mRNA), SEQ ID NO: 9(인간 BiP mRNA), SEQ ID NO: 11(인간 XBP-1 mRNA), SEQ ID NO: 13(인간 CHOP-10 mRNA)에서 나타낸 것과 같은 서열을 가질 수 있다.

모분자와 유사한 활성을 가진 이들 서열의 변이체는 본 발명의 방법에서 또한 유용할 것이다. 예를 들면, 적어도 모분자와 80%의 일치함을 가진 변이 분자는 유사한 활성을 가지는 것으로 기대된다. 두 단백질 서열간의 백분율 일치는 필터링을 끄고, 모든 다른 기본적인 셋팅은 변경하지 않은 BLASTP 알고리즘을 사용하여 결정할 수 있다. 폴리펩티드의 다른 아이소형, 폴리펩티드의 우세한 네가티브 버전(version), 또는 폴리펩티드의 공유적으로 수정된 형태는 모분자의 변이체의 일부 예이다.

본 발명의 다른 구체예에서, 단백질의 세포 분비 속도는 UPR 경로 성분의 발현을 감소시킴으로써 감소될 수 있다. BiP 또는 CHOP와 같은 UPR 경로 성분의 유전자 발현은 siRNA 분자 또는 안티센스 분자를 가진 세포에 의해 감소될 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 단백질의 세포 분비 속도는 작은 분자의 투여를 통한 UPR 경로 성분의 조정에 의해 증가될 수 있다. 대표적인 작은 분자는, UPR 도입제인 타파시가르긴이다(Litton, J., J. Biol. Chem. 26, 17067-17071(1991). 이러한 작은 분자의 다른 예는, 투니카마이신(tunicamycin) 및 지질다당질(lipopolysaccharide)을 포함한다.

본 발명의 다른 구체예에서, 단백질의 세포 분비 속도는 세포를 정지 성장 단계에 놓아 증가된다. 세포는 영양소 유용성을 제한하거나, 세포성 폐기물이 축적되도록 허용하거나 세포 배양 배지의 pH를 변경함으로써 정지 성장 단계에 놓여질 수 있다. 해당 분야의 숙련된 기술자는 정지 성장 단계에서 세포를 놓아두는 것에 대한 다른 방법을 인식할 것이다.

본 발명의 방법에서, 대표적인 세포는 플라즈마 세포, 즉, 항체를 분비하는 분화된 B-세포이다. 플라즈마 세포는 쥐, 인간 또는 기타 동물 원으로부터 분리될 수 있다.

전형적으로, 플라즈마 세포는 표준 기술, 예를 들면 Epstein-Barr 바이러스로의 바이러스 감염과 같은 표준 기술, 또는 기타 방법, 예를 들면 방사성, 또는 화학적 돌연변이 유발에 의해 무한증식되었다. 무한증식된 플라즈마 세포는 암성일수 있고, 미네랄 오일 또는 다른 성분을 동물의 복막안에 주입함으로써 얻을 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 무한증식된 융합 협동체(partner)는 해당 분야에 "골수종 세포"로 알려진 것이다. 골수종은 일반적으로 비장 세포와, 다발골수종, 골수암으로 고통받는 유기체로부터 얻어진 무한증식된 융합 협동체의 융합으로부터 형성된다. 유기체는 조류, 어류, 파충류, 포유류 및 기타 동물계일 수 있다. 골수종 세포주의 예는 쥐로부터 얻어진 SP2/0(American Type Culture Collection(ATCC), Manasas, VA, CRL-1581), NSO(European Collection of Cell Cultures(ECACC), Salisbury, Wiltshire, UK, ECACC No. 85110503), FO(ATCC CRL-1646), 및 Ag653 (ATCC CRL-1580) 세포주를 포함한다. 인간으로부터 얻어진 골수종 세포주의 예로 U266 세포주(ATTC CRL-TIB-196)가 있다. 해당 분야의 숙련된 기술자는 다른 골수종 세포주를 인식할 것이다.

본 발명의 한 구현예에서, 골수종 세포는 DNA 분자로 안정하게 형질전환된다. 안정하게 형질전환된 골수종 세포는 해당 분야의 숙련된 기술자에게 잘 알려진 형질전환, 스크리닝 및 선택의 방법에 의해 생성될 것이다. 세포를 안정하게 형질전환는데 사용되는 DNA 서열은 골수종 세포의 DNA속으로 또는 부위-특이 방식으로 임의로 통합될 것이다. 이러한 DNA 서열은 UPR 경로 성분을 코딩할 것이다. 추가적으로, 안정하게 형질전환된 핵산 서열은 삽입적으로 비활성이거나 UPR 성분, 예를 들면 UPR 유전자 또는 전사적 조절 서열을 제거할 것이다.

본 발명의 다른 구체예에서, 단백질의 세포 분비 속도를 세포를 UPR 경로 성분을 코딩한 핵산 서열의 전사를 목적으로 하는 RNA를 코딩한 핵산 서열과 안정적으로 형질전환시킴으로써 증가시킨다. 이러한 siRNA는 CHOP 단백질을 코딩한 핵산 서열의 전사를 목적으로 한다. 대표적인 CHOP 단백질은 SEQ ID NO: 8 또는 SEQ ID NO: 14에 나타낸 아미노산 서열을 가진 것이다. 쥐 CHOP-10을 코딩한 핵산 서열의 전사를 목적으로 하는 siRNA를 코딩한 핵산 서열로의 안정적인 형질전환은 본 발명의 방법에서 유용하다. 대표적인 쥐 CHOP-10 유전자 전사에 특이한 siRNA는 SEQ ID NO: 15 또는 SEQ ID NO: 16에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 해당 분야의 숙련된 기술자는 UPR 유전자 전사를 목적으로 하는 siRNA를 코딩한 다른 핵산을 인식할 것이다.

본 발명의 방법에서 유용한 다른 세포는 CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포, 곤충 세포 및 식물 세포를 포함한다.

본 발명의 다른 구체예에서, 비-유전자도입 동물에 관련하여 상승된 레벨에서 구성적으로 또는 유도적으로 UPR 단백질을 발현하는 유전자도입 동물이 생산될 수 있다.

유전자도입 동물의 생산에 관한 기술은 해당분야에 알려져 있다.

본 발명의 방법에서, 세포는 배양된다.

세포는 현탁액중 또는 점착성 배지로 배양될 수 있다. 세포는 다양한 용기, 예를 들면, 생반응기, 세포백(cell bag), 배양 접시, 플라스크 및 해당 분야의 숙련된 기술자에게 잘 알려진 기타 용기에서 배양될 것이다. 세포는 화학적으로 한정된 배지 제제(formulation)를 포함하는 임의의 적절한 배지에서 배양될 수 있다. 기온 및 대기 구성과 같은 세포 배양에 적절한 환경 조건은, 해당 분야의 숙련된 기술자에게 또한 잘 알려져 있다. 세포의 배양 방법 또한 해당 분야의 숙련된 기술자에게 잘 알려져 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 생성되는 세포 분비 속도로 변화된 플라즈마 세포를 제공한다. siRNA를 코딩한 안정하게 형질전환된 핵산으로 UPR 경로 성분의 활성을 조정함으로써 플라즈마 세포가 생성될 수 있다. siRNA는 CHOP 단백질과 같은 UPR 경로 성분을 코딩한 핵산 서열의 전사를 목적으로 할 수 있다. 제공된 플라즈마 세포는, 예를 들어, C2-8 또는 C2-18 세포와 같이 SP2/0 유래된 세포일 수 있다. 이러한 플라즈마 세포는 항체 또는 정제되어야 하는 다른 폴리펩티드를 분비할 수 있다.

본 발명은 이제 뒤이은 특이하고, 비제한적인 실시예에 관하여 기재할 것이다.

도 1은 높은 속도에서 mAb를 분비하는 세포중의 UPR 유전자 전사 레벨을 나타낸다.

도 2는 정지 성장 단계 세포 중의 UPR 유전자 전사 레벨을 나타낸다.

도 3은 모 골수종 세포주 중 UPR 유전자 전사 레벨의 비교를 나타낸다.

도 4는 SP2/0 모 골수종 세포주에 관한 높은 분비 세포주 중의 UPR 유전자 전사 레벨을 나타낸다.

도 5는 FO 모 골수종 세포주에 관한 높은 분비 세포주 중의 UPR 유전자 전사 레벨을 나타낸다.

도 6은 Ag-653 모 골수종 세포주에 관한 높은 분비 세포주 중의 UPR 유전자 전사 레벨을 나타낸다.

도 7은 UPR 유전자 전사 레벨의 변동의 함수에 따른 항체 분비 속도 중의 변화를 나타낸다.

도 8은 CHOP-10 특이 siRNA를 코딩한 핵산으로 안정적으로 형질전환된 골수 종 세포 중 증가된 항체 분비 속도를 나타낸다.

실시예 1

고분비 세포주중 UPR 유전자 전사 레벨

mAbs를 높은 속도로 분비하는 세포주를 동일한 mAb를 낮은 속도에서 분비하는 세포주와 UPR 유전자 전사의 레벨에 대하여 분석하였다. 조사된 세포주는 높은 분비 세포주 C505B, C505C 및 C505D를 포함하였다. 조사된 낮은 분비 세포주는 C505A 세포주 및 SP2/0, C505A, B, C 및 D의 모 골수종 세포주였다. 이들 세포주 전부는 αv-인테그린에 대하여 특이한 인간 IgG1 mAb의 중쇄 및 경쇄를 DNA 코딩으로 형질전환시켰다. C505B, C505C 및C505D 세포주를 순차적 부차클로닝, 검색 및 mAb 분비의 높은 속도에 대한 선택에 의해 규명하였다.

항체 분비 속도는 24시간 동안 세포 배양 배지에 분비된 mAb의 양을 측정하고, 생육 가능한 세포의 수를 세어 "pg/viable cell/day"의 단위를 가진 세포 분비 속도를 생성시켰다. C505a 세포주는 5-10μg/mL/7days의 농도에 해당하는 5-7pg/viable cell/day의 낮은 속도에서 항체를 분비하였다. C505B 세포주는 약 15pg/viable cell/day의 속도에서 항체를 생산하고, C505C는 약 13pg/viable cell/day의 속도에서 생산하고, 또한 C505D는 15pg/viable cell/day의 속도에서 생산하였다.

모든 mAb 분비 세포주 및 부모 골수종 세포주를 5% CO₂의 분위기에서 5% FBS, 2mM 글루타민, 및 2mM 피루베이트를 함유하는 IMDM 배지중 37℃ 현탁액에서 배양하였다. 0.5mg/L 미코페놀산, 2.5mg/L 하이포크산틴(hypoxanthine) 및 50mg/L 크산틴(xanthine)을 포함한 1X MHX 선택 배지 역시 배지중에 존재하였다.

정량 PCT(Q-PCR)을 통해 높고 낮은 발현(expressing) 세포주간의 UPR 유전자 전사에서의 차이를 평가하였다. 세포를 지수적 성장 단계에서 성장시키고, 전체 RNA를 5×10⁶의 세포에서 RNEasy^TM 시스템(Qiagen Inc., Valencia, CA)을 이용하여 분리시켰다. Q-PCR을 표준 2단계 반응으로 수행하였다. cDNA 합성 단계를 Superscript^TM II 역전사(Invitrogen Inc., Carlsbad, CA) 및 임의의 육합체 시발물질을 사용하여 제작자에 의해 특화된 반응 조건을 사용하여 수행하였다. Tagman^TM Q-PCR(Applied Biosystems, Foster City, CA)를 그 후 ABI PRISM^TM 7000HT 또는 7900HT 기구(Applied Biosystems, Foster City, CA)로 제작자에 의해 특화한 대로 수행하였다. RNA의 5,000pg가 각 Q-PCR 반응에서 사용되었다. Q-PCR에 사용된 BiP, CHOP, 및 XBP 특이 시발물질 및 프루브(probe) 조합을 Primer Express^TM software(Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용하여 설계하였다. cDNA 레벨을 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제(GAPDH) 살림 유전자에 대한 전사 레벨에 대하여 규격화하고, 그 후, 적절한 모 세포주에 대한 cDNA/GAPDH 전사 수치에 대하여 규격화하였다. ABI PRISM 7000HT 또는 7900HT 기구 및 관련 소프트 웨어를 사용하여 PCR의 초기 지수적 단계중 자료 수집 및 전사 정량화를 수행하였다.

결과는 도 1에 나타내었고, BiP 및 XBP-1 UPR 유전자 전사 레벨은 낮은 분비 세포보다 높은 분비 세포에서 약 3-4배 가량 높다는 것을 나타내었다. CHOP 레벨에서의 차이는 덜 표명되었다.

실시예 2

정지 성장 단계 세포에서의 UPR 유전자 전사 레벨 및 항체 분비 속도

정지 성장 단계중 세포를 지수적 성장 단계중의 세포와 UPR 유전자 전사 레벨 및 mAb 분비 속도에 대하여 분석하였다. C168J 세포주는 SP2/0 모 골수종 세포주로부터 유발된 이입세포이고, IgG1 mAb를 25-30pg/cell/day의 속도로 분비하였다. C505A는 상기 실시예 1에 기재된 바와 같다.

C505A, C168J 및 SP2/0 세포주의 IgG1 mAb 분비 속도를 T-75 또는 T-150 플라스크중 5×10⁶ 세포를 시딩(seeding)하고 실시예 1에 기재되었듯이 배양하여 평가하였다. 3일 후, 세포는 지수적 성장 단계였고, 6일에 세포는 정지 성장 단계였다. 전체 세포수 및 생육가능 세포수를 두 성장 단계 모두의 세포에 대하여 결정하였다. 두 성장 단계 모두의 세포에서의 배양 배지를 인간 IgG에 대하여 표준 효소 면역 측정법에 의해(enzyme linked immunosorbent assay)(ELISA) 분석하였다. BiP, CHOP, 및 XBP-1 특이 Q-PCR을 지수적 및 정지 성장 단계 세포에 대해 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행하였다.

표 1에 나타낸 표 1은 C505A 및 C168j 세포주가 IgG1 mAb 분비 속도가 증가되었다는 것을 보여준다(표 1).

표 1: 분비된 IgG1의 속도(pg/cell/day)

세포주	지수적 단계	정지 단계
C505A	3.90	5.40
C168j	10.40	13.90
SP2/0	0	0

더욱이, 도 2에 나타낸 결과는 정지 단계 성장중 C505A, C168j 및 SP2/0의 UPR 유전자 전사 레벨이 지수적 단계 성장에 비해 증가되었다는 것을 보여준다.

실시예 3

부모 골수종 세포주중 UPR 유전자 전사 레벨

더 높은 분비 세포주가 UPR 유전자의 더 높은 레벨을 함유하였는지를 결정하기 위해 SP2/0, NSO, FO 및 Ag653 모 골수종 세포주중 UPR 유전자 전사 레벨을 조사하였다. SP2/0, NSO, FO 및 Ag653 세포를 지수적 성장 단계에서 성장시키고, 전체 RNA를 5×10⁶ 세포로부터 상기 실시예 1에 기재되었듯이 분리하였다. Q-PCR 및 분석을 또한 실시예 1에 기재되었듯이 수행하였다. 도 3에 나타낸 결과는 조사된 모든 세포에서 유사한 BiP 및CHOP 전사 레벨을 나타내었다. 그러나, XBP-1 전사 레벨은 FO 및NSO 세포에서 조사된 다른 세포 유형에 비해 상승하였다.

실시예 4

높은 분비 세포주 및 모 골수종 세포주중의 UPR 유전자 전사 레벨

높은 속도로 mAbs를 분비하는 세포주를 UPR 유전자 전사 레벨에 대하여 이들의 모 세포주에 비교 분석하였다. 도 4-6에 나타낸 세포주를 지수적 성장 단계에서 성장시키고, 전체 RNA를 5×10⁶ 세포로부터 상기 실시예 1에 기재되었듯이 분리하였다. Q-PCR 및 분석을 또한 실시예 1에 기재되었듯이 수행하였다.

도 4-6에 나타낸 결과는 높은 속도에서 mAbs를 분비하는 세포주가 SP2/0, FO 및 Ag653 모 골수종 세포주에 비해 더 높은 UPR 유전자 전사 레벨을 갖는다는 것을 보여주었다. 이러한 결과는 증가된 UPR 유전자 발현이 증가된 항체 분비 속도와 결합되어 모 골수종 세포주의 정체성과 상관없이 높은 분비 세포를 생성하는 것을 제시하였다.

실시예 5

UPR 도입 후 UPR 단백질 발현

낮은 분비 세포에 비해 높은 분비 세포중 UPR 단백질 발현 및 모 골수종 세포주를 UPR 도입 후 약리제 타프시가르긴(thapsigargin)으로 분석하였다. 타프시가르긴은 SERCA(sarcoplasmic endoplasmic reticulum Ca2+ ATPase) 펌프를 막는 ATPase 억제제이고, ER 루멘(lumen)중 칼슘 고갈로 이끈다.

세포를 100nM의 타프시가르긴으로 처리하였고, XBP-1 및 CHOP-특이 웨스턴 블롯트(Western blot)를 준비하였다. 세포를 한정된 시점에서 RIPA (radioimmunoprecipitation) 용해 완충액(1X PBS, 1% N-P40, 0.5% 소듐 데옥시콜레이트, 0.1% 소듐 도데실설페이트, 1 mM PMSF, 및 Roche의 프로테아제 억제제(Catalog No. 1836153))중에서 용해하였고, 맑아진 용해질중 단백질 농도를 표준 BCA(bicinchoninic acid) 단백질 분석(Sigma Catalog. No. B9643)을 사용하여 정량화하였다. 웨스턴 블롯트를 위해, 20μg의 각 용해질을 표준 SDS-PAGE 젤상에서 수행하고, PVDF(polyvinylidene fluoride) 막으로 옮기고, XBP-1 또는 CHOP에 특이한 항체(Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA)로 프루브하였다.

결과(제시되지 않았음)는 높은 분비 세포중 UPR 단백질이 낮은 분비 세포 및 모 골수종 세포주에 비해 높은 레벨로 발현된다는 것을 나타내었다. XBP-1-특이 웨스턴 블롯트는 XBP-1 단백질 발현이 타프시가르긴 처리된 높은 분비 C168j 세포에서 강하게 유발된다는 것을 나타내었다. 이러한 XBP-1 발현의 유발은 UPR의 약리적 도입 7시간 후 가장 뚜렷하고, 가장 이르게는 후-처리 2시간에 가시적이었다. CHOP-특이 웨스턴 블롯트는 CHOP 단백질 발현이 타프시가르긴 처리된 높은 분비 C168j 세포에서 강하게 유발된다는 것을 나타내었다. CHOP은 2시간에서 가장 먼저 나타나며, 최대 4-7시간으로 발현되고, 22시간에서는 많이 감소하였다,

실시예 6

증가한 UPR 단백질 발현 레벨

세포를 이들 UPR 단백질의 세포 발현 매개체를 상승시키기 위해 순간적으로 BiP 및 XBP-1 발현 매개체로 형질전환시켰다. HEK293T/17(ATCC CRL-11268) 세포를 37℃의 5% CO₂ 대기중에서 부착 배양으로 성장시키고 5% FBS, 2 mM 글루타민 및 2mM 피루베이트를 함유한 IMDM(Iscove's Modified Dubelcco's Minimal Essential Media) 배지에서 배양하였다. XBP-1 아이소형 1(isoform)(NCBI Accession AF027963), XBP-1 아이소형 2(NCBI Accession AF443192), 또는 BiP를 코딩한 cDNA는 표준법을 사용하여 순간적인 형질전환 실험에 유용한 매개체로 부차클로닝되었다. 매개체는 CMV 촉진제의 조절하에 zsGreen1 단백질을 발현하였고, CMV 촉진제 조절하에서 추가적인 코딩 지역의 도입을 위한 다수의 클로닝 부위를 가졌다. 카나마이신 저항 유전자를 박테리아 선택에 사용하였다. HEK293T/17 세포를 그 후, 왼편 비형질전환시키거나, 빈 매개체 단독, XBP-1 아이소형 1 발현 매개체, XBP-1 아이소형 2 발현 매개체 또는 BiP 발현 매개체로 순간적인 형질전환을 시켰다. 형질전환을 LipofectamineTM 2000 시약(Invitrogen Inc., Carlsbad, CA)으로 제조자에 의해 지시되는 대로 수행하였다. 형질전환 48시간 후 세포를 RIPA 용해 완충제로 용해하였고, 맑아진 용해질의 동등한 세포 해당량을 SDS-PAGE 젤상에 올렸다. 그 후, 웨스턴 블롯트를 제조하였고, 상기 실시예 5에 기재되었듯이 프루브하였다. 블롯트를 그 후, 벗겨내고, 악틴-특이 항체로 리프루브하여 각 레인(lane)에 올려진 동등한 단백질을 확인하였다.

결과(제시되지 않았음)는 XBP-1 아이소형 1("XBP-1"로 표시된 레인) 및 XBP-1 아이소형 2("X54"로 표시된 레인) 발현 레벨이 이들 XBP-1 아이소형을 코딩한 발현 매개체로 순간적으로 형질전환된 세포중에서 상승되었음을 나타내었다. 더구나, 자료(제시되지 않았음)는 BiP 발현 레벨을 BiP를 코딩한 발현 매개체로 순간적으로 형질전환된 세포중에서 및 왼편 비형질전환시키거나, 빈 매개체 단독으로 형질전환시킨 세포중에서 상승되었음을 나타내었고, BiP 발현은 감지되지 않았다.

실시예 7

항체 분비 속도에 대한 UPR 유전자 전사 레벨의 효과

항체 분비 속도에 대한 UPR 유전자 전사 레벨의 효과가 분석되었다. BiP, CHOP 및 XBP-1 유전자 전사에 대해 표적화된 두가닥 siRNA 분자를 Ambion's internet based siRNA Target Finder Tool (www. ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)을 사용하여 설계하였고, Silencer^TM siRNA Construction Kit(Ambion Inc., Woodward, TX, Catalog No. 11620)을 이용하여 합성하였다. 각 표적화된 전사에 대하여 두 siRNA를 설계하였다. 표준 조건에서 배양한 3×10⁶ C168J 세포를 도 10에 나타낸 것과 같이 3μg의 각각의 이들 두가닥 siRNA를 전기 천공을 통해 형질전환시켰다. 전기 천공된 세포를 실시예 1에 기재된 것과 같이 2ml의 IMDM 배지에 현탁시키고, 그 후, T-12 판에서 배양시켰다. IgG1 mAb 농도를 또한 표준 비탁법 기술을 사용하여 8일 후 결정하였다.

도 7의 결과는 항체 분비 속도가 항체 분비 속도상의 UPR 유전자 전사를 변경함으로써 조절될 수 있음을 보여준다. 높은 분비 C168J 세포를 UPR 유전자 BiP, CHOP 및 XBP-1 아이소형의 발현을 RNA 전사로부터 막을 수 있는 siRNA(short 간섭 RNA)로 형질전환시키는 것은 C168J 세포 IgG1 분비 속도를 감소시켰다.

실시예 8

증가하는 UPR 유전자 전사 및 발현 레벨에 의한 항체 분비 속도의 증가

UPR 단백질의 과-발현은 mAbs와 같은 단백질의 분비 속도를 세포에 의해 증가시킬 수 있다. mAb 분비 세포주와 같은 단백질 분비 세포주를 BiP, CHOP, XBP-1 및 다른 UPR 연합 단백질을 코딩하는 발현 매개체 구성물로 형질전환시켰다. 세포는 독립적으로 또는 조합으로 구성되는 이들 발현 매개체로 형질전환시켰다. 항체 분비 속도와 같은 적절한 단백질 분비 속도를 표준 기법을 사용하여 형질전환 후, 4 및 6일 후 결정하였다. 형질전환된 세포중의 단백질 분비 속도는 비형질전환된 대조 세포의 분비 속도에 비교된다. 단백질 분비 속도는 하나 또는 그 이상의 UPR 단백질을 과발현하는 세포에서 더 높은 것으로 기대되었다. BiP 또는 XBP-1의 구성성 과발현이 마침내 이들 세포중에서 세포자멸을 유발하는 경우, 이들 유전자는 유발가능한 촉진제의 아랫쪽에 위치될 수 있고, 필요할 때만 활성화될 수 있다.

실시예 9

siRNA 를 코딩한 CHOP -10으로 안정적으로 형질전환된 골수종 세포중의 증가된 항체 분비 속도

CHOP-10 특이 siRNA를 생산하는 DNA 구성물로 C456A 골수종 세포를 안정적으로 감염시키는 것은 항체 분비 속도를 증가시켰다(도 8). CHOP-10 유전자 전사에 표적화된 두개의 다른 siRNA 분자를 Ambion's internet based siRNA Target Finder Tool(www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)을 사용하여 설계하였다. 설계된 siRNA 분자는 짧은 머리핀형이었다. 이들 siRNA를 코딩한 핵산(SEQ ID NO: 15 및 SEQ ID NO: 16)을 합성하고 pSILENCER4.1-neo vector (Ambion Inc., Woodward, TX)의 BamHI 및 HindIII 부위로 복제하였다. SEQ ID No: 15중 보여진 뉴클레오티드 서열의 pSILENCER4.1-neo으로의 복제는 pCHOP2를 생산하였고, 반면, SEQ ID No: 16중 보여진 서열의 이 매개체로의 복제는 pCHOP2를 생산하였다. pCHOP1, pCHOP2 및 pSILENCER4.1-neo 플라스미드 DNA를 그 후, 각각 개별적으로 C465A 골수종 세포로 전기 천공에 의해 형질전환시켰다. 이들 매개체를 함유한 안정적으로 형질전환된 골수종 세포는 그 후, 10% FBS 및 300μg/ml G418을 함유한 SFM8 배지에서 37℃의 5% CO₂ 대기중 배양에 의해 선택되었다. 이 선택 배지는 0.5mg/L 미코페놀산, 2.5mg/L 하이포크산틴 및 50mg/L 크산틴을 함유한 1X MHX 선택 배지를 또한 포함하여 C465A 세포에 의한 안정적인 항체 발현을 유지시켰다.

도 8에 나타낸 각 세포주를 6일간, 10% FBS, 1X MHX 및 300μg/ml G418을 함유한 SFM8 배지에서 성장시켰다. 생육가능한 세포 밀도 및 항체가를 이 6일의 기간동안 매일 결정하였다. 생육가능한 세포 밀도를 표준 색소 배제 분석에 의해 분석하고 배양 배지중의 항체가를 표준 비탁법에 의해 분석하였다. C465A 골수종 세포주는 SP2/0 골수종 세포주로부터 유래하였고, 인간 TNF-알파에 특이적인 생쥐 mAb의 IgG1 카파 아이소형을 안정적으로 발현시켰다.C2-8 골수종 세포주는 C465A에서 유래된 세포주이고, pCHOP1으로 안정적으로 형질전환되었다. C2-18 골수종 세포주는 C465A에서 유래된 세포주이고, pCHOP2로 안정적으로 형질전환되었다. V11 및 V12 세포주는 C465A에서 유래된 세포주이고, pSILENCER4.1-neo 단독으로 안정적으로 형질전환되었다; 두 세포주는 모두 독립적으로 생성되었다.

얻어진 자료는 pCHOP1 및 pCHOP2에 의해 코딩된 CHOP-10 특이 siRNA가 대조군 C465A, V11 및 V12 세포주에 비해 항체 특이 생산성을 증가시켰다는 것을 나타내었다(도 8).

이제 완전히 기재된 본 발명은, 첨부된 청구항의 정신 및 범위로부터 멀어짐 없이, 거기에 많은 변화와 변이가 만들어질 수 있는 해당 기술분야의 보통 기술의 하나가 될 것이 명백하다.

SEQUENCE LISTING <110> Centocor, Inc. <120> Methods for Altering Protein Production Rates <130> CEN5049 PCT <140> PCT/US2005/010605 <141> 2005-03-31 <150> 60/558,239 <151> 2004-03-31 <160> 16 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1965 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 1 atgatgaagt tcactgtggt ggcggcggcg ttgctgctgc tgggcgcggt gcgggccgag 60 gaggaggaca agaaggagga tgtgggcacg gtggtcggca tcgacttggg gaccacctat 120 tcctgcgtcg gtgtgttcaa gaacggccgc gtggagatca tagccaacga tcagggcaac 180 cgcatcacgc cgtcgtatgt ggccttcact cctgaagggg agcgtctgat tggcgatgcg 240 gccaagaacc aactcacgtc caaccccgag aacacggtct tcgatgccaa gcgcctcatc 300 ggacgcactt ggaatgaccc ttcggtgcag caggacatca agttcttgcc attcaaggtg 360 gttgaaaaga aaactaaacc gtacattcaa gttgatattg gaggtgggca aaccaagaca 420 tttgccccag aagaaatttc tgccatggtt ctcactaaaa tgaaggagac tgctgaggcg 480 tatttgggaa agaaggttac ccatgcagtt gttactgtac cagcttactt caatgatgcc 540 cagcgacaag caaccaaaga tgctggcact attgctggac tgaatgtcat gaggatcatc 600 aatgagccta cagcagctgc 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Met Asp 165 170 175 Ser Asp Thr Val Ala Ser Ser Asp Ser Glu Ser Asp Ile Leu Leu Gly 180 185 190 Ile Leu Asp Lys Leu Asp Pro Val Met Phe Phe Lys Cys Pro Ser Pro 195 200 205 Glu Ser Ala Ser Leu Glu Glu Leu Pro Glu Val Tyr Pro Glu Gly Pro 210 215 220 Ser Ser Leu Pro Ala Ser Leu Ser Leu Ser Val Gly Thr Ser Ser Ala 225 230 235 240 Lys Leu Glu Ala Ile Asn Glu Leu Ile Arg Phe Asp His Val Tyr Thr 245 250 255 Lys Pro Leu Val Leu Glu Ile Pro Ser Glu Thr Glu Ser Gln Thr Asn 260 265 270 Val Val Val Lys Ile Glu Glu Ala Pro Leu Ser Ser Ser Glu Glu Asp 275 280 285 His Pro Glu Phe Ile Val Ser Val Lys Lys Glu Pro Leu Glu Asp Asp 290 295 300 Phe Ile Pro Glu Leu Gly Ile Ser Asn Leu Leu Ser Ser Ser His Cys 305 310 315 320 Leu Arg Pro Pro Ser Cys Leu Leu Asp Ala His Ser Asp Cys Gly Tyr 325 330 335 Glu Gly Ser Pro Ser Pro Phe Ser Asp Met Ser Ser Pro Leu Gly Thr 340 345 350 Asp His Ser Trp Glu Asp Thr Phe Ala Asn Glu Leu Phe Pro Gln Leu 355 360 365 Ile Ser Val 370 <210> 5 <211> 801 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 5 atggtggtgg tggcagcggc gccgagcgcg gccacggcgg cccccaaagt gctactctta 60 tctggccagc ccgcctccgg cggccgggcg ctgccgctca tggtacccgg tccgcgggca 120 gcagggtcgg aggcgagcgg gacaccgcag gctcgcaagc ggcagcggct cacgcacctg 180 agcccggagg agaaagcgct gcggaggaaa ctgaaaaaca gagtagcagc gcagactgct 240 cgagatagaa agaaagcccg gatgagcgag ctggagcagc aagtggtgga tttggaagaa 300 gagaaccaca aactccagct agaaaatcag cttttacggg agaaaactca cggccttgtg 360 gttgagaacc aggagttaag aacacgcttg ggaatggaca cgctggatcc tgacgaggtt 420 ccagaggtgg aggccaaggg gagtggagta aggctggtgg ccgggtctgc tgagtccgca 480 gcactcagac tatgtgcacc tctgcagcag gtgcaggccc agttgtcacc tccccagaac 540 atcttcccat ggactctgac actgttgcct cttcagattc tgagtctgat atccttttgg 600 gcattctgga caagttggac cctgtcatgt ttttcaaatg tccttcccca gagtctgcta 660 gtctggagga actcccagag gtctacccag aaggacctag ttccttacca gcctcccttt 720 ctctgtcagt ggggacctca tcagccaagc tggaagccat taatgaactc attcgttttg 780 accatgtata caccaagcct c 801 <210> 6 <211> 267 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Met Val Val Val Ala Ala Ala Pro Ser Ala Ala Thr Ala Ala Pro Lys 1 5 10 15 Val Leu Leu Leu Ser Gly Gln Pro Ala Ser Gly Gly Arg Ala Leu Pro 20 25 30 Leu Met Val Pro Gly Pro Arg Ala Ala Gly Ser Glu Ala Ser Gly Thr 35 40 45 Pro Gln Ala Arg Lys Arg Gln Arg Leu Thr His Leu Ser Pro Glu Glu 50 55 60 Lys Ala Leu Arg Arg Lys Leu Lys Asn Arg Val Ala Ala Gln Thr Ala 65 70 75 80 Arg Asp Arg Lys Lys Ala Arg Met Ser Glu Leu Glu Gln Gln Val Val 85 90 95 Asp Leu Glu Glu Glu Asn His Lys Leu Gln Leu Glu Asn Gln Leu Leu 100 105 110 Arg Glu Lys Thr His Gly Leu Val Val Glu Asn Gln Glu Leu Arg Thr 115 120 125 Arg Leu Gly Met Asp Thr Leu Asp Pro Asp Glu Val Pro Glu Val Glu 130 135 140 Ala Lys Gly Ser Gly Val Arg Leu Val Ala Gly Ser Ala Glu Ser Ala 145 150 155 160 Ala Leu Arg Leu Cys Ala Pro Leu Gln Gln Val Gln Ala Gln Leu Ser 165 170 175 Pro Pro Gln Asn Ile Phe Pro Trp Thr Leu Thr Leu Leu Pro Leu Gln 180 185 190 Ile Leu Ser Leu Ile Ser Phe Trp Ala Phe Trp Thr Ser Trp Thr Leu 195 200 205 Ser Cys Phe Ser Asn Val Leu Pro Gln Ser Leu Leu Val Trp Arg Asn 210 215 220 Ser Gln Arg Ser Thr Gln Lys Asp Leu Val Pro Tyr Gln Pro Pro Phe 225 230 235 240 Leu Cys Gln Trp Gly Pro His Gln Pro Ser Trp Lys Pro Leu Met Asn 245 250 255 Ser Phe Val Leu Thr Met Tyr Thr Pro Ser Leu 260 265 <210> 7 <211> 504 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 7 atggcagctg agtccctgcc tttcaccttg gagacggtgt ccagctggga gctggaagcc 60 tggtatgagg atctgcagga ggtcctgtcc tcagatgaaa atgggggcac ctatatctca 120 tccccaggaa acgaagagga agaatcaaaa accttcacta ctcttgaccc tgcgtcccta 180 gcttggctga cagaggagcc agggccaaca gaggtcacac gcacatccca aagccctcgc 240 tctccagatt ccagtcagag ttctatggcc caggaggaag aggaggaaga gcaaggaaga 300 actaggaaac ggaaacagag tggtcagtgc ccagcccggc ctgggaagca acgcatgaag 360 gagaaggagc aggagaacga gcggaaagtg gcacagctag ctgaagagaa cgagcggctc 420 aagcaggaaa tcgagcgcct gaccagggag gtggagacca cacggcgggc tctgatcgac 480 cgcatggtca gcctgcacca agca 504 <210> 8 <211> 168 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Met Ala Ala Glu Ser Leu Pro Phe Thr Leu Glu Thr Val Ser Ser Trp 1 5 10 15 Glu Leu Glu Ala Trp Tyr Glu Asp Leu Gln Glu Val Leu Ser Ser Asp 20 25 30 Glu Asn Gly Gly Thr Tyr Ile Ser Ser Pro Gly Asn Glu Glu Glu Glu 35 40 45 Ser Lys Thr Phe Thr Thr Leu Asp Pro Ala Ser Leu Ala Trp Leu Thr 50 55 60 Glu Glu Pro Gly Pro Thr Glu Val Thr Arg Thr Ser Gln Ser Pro Arg 65 70 75 80 Ser Pro Asp Ser Ser Gln Ser Ser Met Ala Gln Glu Glu Glu Glu Glu 85 90 95 Glu Gln Gly Arg Thr Arg Lys Arg Lys Gln Ser Gly Gln Cys Pro Ala 100 105 110 Arg Pro Gly Lys Gln Arg Met Lys Glu Lys Glu Gln Glu Asn Glu Arg 115 120 125 Lys Val Ala Gln Leu Ala Glu Glu Asn Glu Arg Leu Lys Gln Glu Ile 130 135 140 Glu Arg Leu Thr Arg Glu Val Glu Thr Thr Arg Arg Ala Leu Ile Asp 145 150 155 160 Arg Met Val Ser Leu His Gln Ala 165 <210> 9 <211> 1962 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 atgaagctct ccctggtggc cgcgatgctg ctgctgctca gcgcggcgcg ggccgaggag 60 gaggacaaga aggaggacgt gggcacggtg gtcggcatcg acctggggac cacctactcc 120 tgcgtcggcg tgttcaagaa cggccgcgtg gagatcatcg ccaacgatca gggcaaccgc 180 atcacgccgt cctatgtcgc cttcactcct gaaggggaac gtctgattgg cgatgccgcc 240 aagaaccagc tcacctccaa ccccgagaac acggtctttg acgccaagcg gctcatcggc 300 cgcacgtgga atgacccgtc tgtgcagcag gacatcaagt tcttgccgtt caaggtggtt 360 gaaaagaaaa ctaaaccata cattcaagtt gatattggag gtgggcaaac aaagacattt 420 gctcctgaag aaatttctgc catggttctc actaaaatga aagaaaccgc tgaggcttat 480 ttgggaaaga aggttaccca tgcagttgtt actgtaccag cctattttaa tgatgcccaa 540 cgccaagcaa ccaaagacgc tggaactatt gctggcctaa atgttatgag gatcatcaac 600 gagcctacgg cagctgctat tgcttatggc ctggataaga gggaggggga gaagaacatc 660 ctggtgtttg acctgggtgg cggaaccttc gatgtgtctc ttctcaccat tgacaatggt 720 gtcttcgaag ttgtggccac taatggagat actcatctgg gtggagaaga ctttgaccag 780 cgtgtcatgg aacacttcat caaactgtac aaaaagaaga cgggcaaaga tgtcaggaaa 840 gacaatagag ctgtgcagaa actccggcgc gaggtagaaa aggccaaacg ggccctgtct 900 tctcagcatc aagcaagaat tgaaattgag tccttctatg aaggagaaga cttttctgag 960 accctgactc gggccaaatt tgaagagctc aacatggatc tgttccggtc tactatgaag 1020 cccgtccaga aagtgttgga agattctgat ttgaagaagt ctgatattga tgaaattgtt 1080 cttgttggtg gctcgactcg aattccaaag attcagcaac tggttaaaga gttcttcaat 1140 ggcaaggaac catcccgtgg cataaaccca gatgaagctg tagcgtatgg tgctgctgtc 1200 caggctggtg tgctctctgg tgatcaagat acaggtgacc tggtactgct tgatgtatgt 1260 ccccttacac ttggtattga aactgtggga ggtgtcatga ccaaactgat tccaaggaac 1320 acagtggtgc ctaccaagaa gtctcagatc ttttctacag cttctgataa tcaaccaact 1380 gttacaatca aggtctatga aggtgaaaga cccctgacaa aagacaatca tcttctgggt 1440 acatttgatc tgactggaat tcctcctgct cctcgtgggg tcccacagat tgaagtcacc 1500 tttgagatag atgtgaatgg tattcttcga gtgacagctg aagacaaggg tacagggaac 1560 aaaaataaga tcacaatcac caatgaccag aatcgcctga cacctgaaga aatcgaaagg 1620 atggttaatg atgctgagaa gtttgctgag gaagacaaaa agctcaagga gcgcattgat 1680 actagaaatg agttggaaag ctatgcctat tctctaaaga atcagattgg agataaagaa 1740 aagctgggag gtaaactttc ctctgaagat aaggagacca tggaaaaagc tgtagaagaa 1800 aagattgaat ggctggaaag ccaccaagat gctgacattg aagacttcaa agctaagaag 1860 aaggaactgg aagaaattgt tcaaccaatt atcagcaaac tctatggaag tgcaggccct 1920 cccccaactg gtgaagagga tacagcagaa aaagatgagt tg 1962 <210> 10 <211> 654 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Lys Leu Ser Leu Val Ala Ala Met Leu Leu Leu Leu Ser Ala Ala 1 5 10 15 Arg Ala Glu Glu Glu Asp Lys Lys Glu Asp Val Gly Thr Val Val Gly 20 25 30 Ile Asp Leu Gly Thr Thr Tyr Ser Cys Val Gly Val Phe Lys Asn Gly 35 40 45 Arg Val Glu Ile Ile Ala Asn Asp Gln Gly Asn Arg Ile Thr Pro Ser 50 55 60 Tyr Val Ala Phe Thr Pro Glu Gly Glu Arg Leu Ile Gly Asp Ala Ala 65 70 75 80 Lys Asn Gln Leu Thr Ser Asn Pro Glu Asn Thr Val Phe Asp Ala Lys 85 90 95 Arg Leu Ile Gly Arg Thr Trp Asn Asp Pro Ser Val Gln Gln Asp Ile 100 105 110 Lys Phe Leu Pro Phe Lys Val Val Glu Lys Lys Thr Lys Pro Tyr Ile 115 120 125 Gln Val Asp Ile Gly Gly Gly Gln Thr Lys Thr Phe Ala Pro Glu Glu 130 135 140 Ile Ser Ala Met Val Leu Thr Lys Met Lys Glu Thr Ala Glu Ala Tyr 145 150 155 160 Leu Gly Lys Lys Val Thr His Ala Val Val Thr Val Pro Ala Tyr Phe 165 170 175 Asn Asp Ala Gln Arg Gln Ala Thr Lys Asp Ala Gly Thr Ile Ala Gly 180 185 190 Leu Asn Val Met Arg Ile Ile Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Ile Ala 195 200 205 Tyr Gly Leu Asp Lys Arg Glu Gly Glu Lys Asn Ile Leu Val Phe Asp 210 215 220 Leu Gly Gly Gly Thr Phe Asp Val Ser Leu Leu Thr Ile Asp Asn Gly 225 230 235 240 Val Phe Glu Val Val Ala Thr Asn Gly Asp Thr His Leu Gly Gly Glu 245 250 255 Asp Phe Asp Gln Arg Val Met Glu His Phe Ile Lys Leu Tyr Lys Lys 260 265 270 Lys Thr Gly Lys Asp Val Arg Lys Asp Asn Arg Ala Val Gln Lys Leu 275 280 285 Arg Arg Glu Val Glu Lys Ala Lys Arg Ala Leu Ser Ser Gln His Gln 290 295 300 Ala Arg Ile Glu Ile Glu Ser Phe Tyr Glu Gly Glu Asp Phe Ser Glu 305 310 315 320 Thr Leu Thr Arg Ala Lys Phe Glu Glu Leu Asn Met Asp Leu Phe Arg 325 330 335 Ser Thr Met Lys Pro Val Gln Lys Val Leu Glu Asp Ser Asp Leu Lys 340 345 350 Lys Ser Asp Ile Asp Glu Ile Val Leu Val Gly Gly Ser Thr Arg Ile 355 360 365 Pro Lys Ile Gln Gln Leu Val Lys Glu Phe Phe Asn Gly Lys Glu Pro 370 375 380 Ser Arg Gly Ile Asn Pro Asp Glu Ala Val Ala Tyr Gly Ala Ala Val 385 390 395 400 Gln Ala Gly Val Leu Ser Gly Asp Gln Asp Thr Gly Asp Leu Val Leu 405 410 415 Leu Asp Val Cys Pro Leu Thr Leu Gly Ile Glu Thr Val Gly Gly Val 420 425 430 Met Thr Lys Leu Ile Pro Arg Asn Thr Val Val Pro Thr Lys Lys Ser 435 440 445 Gln Ile Phe Ser Thr Ala Ser Asp Asn Gln Pro Thr Val Thr Ile Lys 450 455 460 Val Tyr Glu Gly Glu Arg Pro Leu Thr Lys Asp Asn His Leu Leu Gly 465 470 475 480 Thr Phe Asp Leu Thr Gly Ile Pro Pro Ala Pro Arg Gly Val Pro Gln 485 490 495 Ile Glu Val Thr Phe Glu Ile Asp Val Asn Gly Ile Leu Arg Val Thr 500 505 510 Ala Glu Asp Lys Gly Thr Gly Asn Lys Asn Lys Ile Thr Ile Thr Asn 515 520 525 Asp Gln Asn Arg Leu Thr Pro Glu Glu Ile Glu Arg Met Val Asn Asp 530 535 540 Ala Glu Lys Phe Ala Glu Glu Asp Lys Lys Leu Lys Glu Arg Ile Asp 545 550 555 560 Thr Arg Asn Glu Leu Glu Ser Tyr Ala Tyr Ser Leu Lys Asn Gln Ile 565 570 575 Gly Asp Lys Glu Lys Leu Gly Gly Lys Leu Ser Ser Glu Asp Lys Glu 580 585 590 Thr Met Glu Lys Ala Val Glu Glu Lys Ile Glu Trp Leu Glu Ser His 595 600 605 Gln Asp Ala Asp Ile Glu Asp Phe Lys Ala Lys Lys Lys Glu Leu Glu 610 615 620 Glu Ile Val Gln Pro Ile Ile Ser Lys Leu Tyr Gly Ser Ala Gly Pro 625 630 635 640 Pro Pro Thr Gly Glu Glu Asp Thr Ala Glu Lys Asp Glu Leu 645 650 <210> 11 <211> 783 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 atggtggtgg tggcagccgc gccgaacccg gccgacggga cccctaaagt tctgcttctg 60 tcggggcagc ccgcctccgc cgccggagcc ccggccggcc aggccctgcc gctcatggtg 120 ccagcccaga gaggggccag cccggaggca gcgagcgggg ggctgcccca ggcgcgcaag 180 cgacagcgcc tcacgcacct gagccccgag gagaaggcgc tgaggaggaa actgaaaaac 240 agagtagcag ctcagactgc cagagatcga aagaaggctc gaatgagtga gctggaacag 300 caagtggtag atttagaaga agagaaccaa aaacttttgc tagaaaatca gcttttacga 360 gagaaaactc atggccttgt agttgagaac caggagttaa gacagcgctt ggggatggat 420 gccctggttg ctgaagagga ggcggaagcc aaggggaatg aagtgaggcc agtggccggg 480 tctgctgagt ccgcagcact cagactacgt gcacctctgc agcaggtgca ggcccagttg 540 tcacccctcc agaacatctc cccatggatt ctggcggtat tgactcttca gattcagagt 600 ctgatatcct gttgggcatt ctggacaact tggacccagt catgttcttc aaatgccctt 660 ccccagagcc tgccagcctg gaggagctcc cagaggtcta cccagaagga cccagttcct 720 taccagcctc cctttctctg tcagtgggga cgtcatcagc caagctggaa gccattaatg 780 aac 783 <210> 12 <211> 261 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Met Val Val Val Ala Ala Ala Pro Asn Pro Ala Asp Gly Thr Pro Lys 1 5 10 15 Val Leu Leu Leu Ser Gly Gln Pro Ala Ser Ala Ala Gly Ala Pro Ala 20 25 30 Gly Gln Ala Leu Pro Leu Met Val Pro Ala Gln Arg Gly Ala Ser Pro 35 40 45 Glu Ala Ala Ser Gly Gly Leu Pro Gln Ala Arg Lys Arg Gln Arg Leu 50 55 60 Thr His Leu Ser Pro Glu Glu Lys Ala Leu Arg Arg Lys Leu Lys Asn 65 70 75 80 Arg Val Ala Ala Gln Thr Ala Arg Asp Arg Lys Lys Ala Arg Met Ser 85 90 95 Glu Leu Glu Gln Gln Val Val Asp Leu Glu Glu Glu Asn Gln Lys Leu 100 105 110 Leu Leu Glu Asn Gln Leu Leu Arg Glu Lys Thr His Gly Leu Val Val 115 120 125 Glu Asn Gln Glu Leu Arg Gln Arg Leu Gly Met Asp Ala Leu Val Ala 130 135 140 Glu Glu Glu Ala Glu Ala Lys Gly Asn Glu Val Arg Pro Val Ala Gly 145 150 155 160 Ser Ala Glu Ser Ala Ala Leu Arg Leu Arg Ala Pro Leu Gln Gln Val 165 170 175 Gln Ala Gln Leu Ser Pro Leu Gln Asn Ile Ser Pro Trp Ile Leu Ala 180 185 190 Val Leu Thr Leu Gln Ile Gln Ser Leu Ile Ser Cys Trp Ala Phe Trp 195 200 205 Thr Thr Trp Thr Gln Ser Cys Ser Ser Asn Ala Leu Pro Gln Ser Leu 210 215 220 Pro Ala Trp Arg Ser Ser Gln Arg Ser Thr Gln Lys Asp Pro Val Pro 225 230 235 240 Tyr Gln Pro Pro Phe Leu Cys Gln Trp Gly Arg His Gln Pro Ser Trp 245 250 255 Lys Pro Leu Met Asn 260 <210> 13 <211> 1386 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 atggcctcaa acgattatac ccaacaagca acccaaagct atggggccta ccccacccag 60 cccgggcagg gctattccca gcagagcagt cagccctacg gacagcagag ttacagtggt 120 tatagccagt ccacggacac ttcaggctat ggccagagca gctattcttc ttatggccag 180 agccagaaca caggctatgg aactcagtca actccccagg gatatggctc gactggcggc 240 tatggcagta gccagagctc ccaatcgtct tacgggcagc agtcctccta ccctggctat 300 ggccagcagc cagctcccag cagcacctcg ggaagttacg gtagcagttc tcagagcagc 360 agctatgggc agccccagag tgggagctac agccagcagc ctagctatgg tggacagcag 420 caaagctatg gacagcagca aagctataat ccccctcagg gctatggaca gcagaaccag 480 tacaacagca gcagtggtgg tggaggtgga ggtggaggtg gaggtaacta tggccaagat 540 caatcctcca tgagtagtgg tggtggcagt ggtggcggtt atggcaatca agaccagagt 600 ggtggaggtg gcagcggtgg ctatggacag caggaccgtg gaggccgcgg caggggtggc 660 agtggtggcg gcggcggcgg cggcggtggt ggttacaacc gcagcagtgg tggctatgaa 720 cccagaggtc gtggaggtgg ccgtggaggc agaggtggca tgggcggaag tgaccgtggt 780 ggcttcaata aatttggtgt gttcaagaag gaagtgtatc ttcatacatc accacacctg 840 aaagcagatg tgcttttcca gactgatcca actgcagaga tggcagctga gtcattgcct 900 ttctccttcg ggacactgtc cagctgggag ctggaagcct ggtatgagga cctgcaagag 960 gtcctgtctt cagatgaaaa tgggggtacc tatgtttcac ctcctggaaa tgaagaggaa 1020 gaatcaaaaa tcttcaccac tcttgaccct gcttctctgg cttggctgac tgaggaggag 1080 ccagaaccag cagaggtcac aagcacctcc cagagccctc actctccaga ttccagtcag 1140 agctccctgg ctcaggagga agaggaggaa gaccaaggga gaaccaggaa acggaaacag 1200 agtggtcatt ccccagcccg ggctggaaag cagcgcatga aggagaaaga acaggagaat 1260 gaaaggaaag tggcacagct agctgaagag aatgaacggc tcaagcagga aatcgagcgc 1320 ctgaccaggg aagtagaggc gactcgccga gctctgattg accgaatggt gaatctgcac 1380 caagca 1386 <210> 14 <211> 462 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Met Ala Ser Asn Asp Tyr Thr Gln Gln Ala Thr Gln Ser Tyr Gly Ala 1 5 10 15 Tyr Pro Thr Gln Pro Gly Gln Gly Tyr Ser Gln Gln Ser Ser Gln Pro 20 25 30 Tyr Gly Gln Gln Ser Tyr Ser Gly Tyr Ser Gln Ser Thr Asp Thr Ser 35 40 45 Gly Tyr Gly Gln Ser Ser Tyr Ser Ser Tyr Gly Gln Ser Gln Asn Thr 50 55 60 Gly Tyr Gly Thr Gln Ser Thr Pro Gln Gly Tyr Gly Ser Thr Gly Gly 65 70 75 80 Tyr Gly Ser Ser Gln Ser Ser Gln Ser Ser Tyr Gly Gln Gln Ser Ser 85 90 95 Tyr Pro Gly Tyr Gly Gln Gln Pro Ala Pro Ser Ser Thr Ser Gly Ser 100 105 110 Tyr Gly Ser Ser Ser Gln Ser Ser Ser Tyr Gly Gln Pro Gln Ser Gly 115 120 125 Ser Tyr Ser Gln Gln Pro Ser Tyr Gly Gly Gln Gln Gln Ser Tyr Gly 130 135 140 Gln Gln Gln Ser Tyr Asn Pro Pro Gln Gly Tyr Gly Gln Gln Asn Gln 145 150 155 160 Tyr Asn Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Asn 165 170 175 Tyr Gly Gln Asp Gln Ser Ser Met Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly 180 185 190 Gly Tyr Gly Asn Gln Asp Gln Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Tyr 195 200 205 Gly Gln Gln Asp Arg Gly Gly Arg Gly Arg Gly Gly Ser Gly Gly Gly 210 215 220 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Asn Arg Ser Ser Gly Gly Tyr Glu 225 230 235 240 Pro Arg Gly Arg Gly Gly Gly Arg Gly Gly Arg Gly Gly Met Gly Gly 245 250 255 Ser Asp Arg Gly Gly Phe Asn Lys Phe Gly Val Phe Lys Lys Glu Val 260 265 270 Tyr Leu His Thr Ser Pro His Leu Lys Ala Asp Val Leu Phe Gln Thr 275 280 285 Asp Pro Thr Ala Glu Met Ala Ala Glu Ser Leu Pro Phe Ser Phe Gly 290 295 300 Thr Leu Ser Ser Trp Glu Leu Glu Ala Trp Tyr Glu Asp Leu Gln Glu 305 310 315 320 Val Leu Ser Ser Asp Glu Asn Gly Gly Thr Tyr Val Ser Pro Pro Gly 325 330 335 Asn Glu Glu Glu Glu Ser Lys Ile Phe Thr Thr Leu Asp Pro Ala Ser 340 345 350 Leu Ala Trp Leu Thr Glu Glu Glu Pro Glu Pro Ala Glu Val Thr Ser 355 360 365 Thr Ser Gln Ser Pro His Ser Pro Asp Ser Ser Gln Ser Ser Leu Ala 370 375 380 Gln Glu Glu Glu Glu Glu Asp Gln Gly Arg Thr Arg Lys Arg Lys Gln 385 390 395 400 Ser Gly His Ser Pro Ala Arg Ala Gly Lys Gln Arg Met Lys Glu Lys 405 410 415 Glu Gln Glu Asn Glu Arg Lys Val Ala Gln Leu Ala Glu Glu Asn Glu 420 425 430 Arg Leu Lys Gln Glu Ile Glu Arg Leu Thr Arg Glu Val Glu Ala Thr 435 440 445 Arg Arg Ala Leu Ile Asp Arg Met Val Asn Leu His Gln Ala 450 455 460 <210> 15 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Nucleic acid sequence encoding a short interfering RNA of the short hairpin type which targets CHOP transcripts. <400> 15 acgaagagga agaatcaaat tcaagagatt tgattcttcc tcttcgttt 49 <210> 16 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Nucleic acid sequence encoding a short interfering RNA of the short hairpin type which targets CHOP transcripts. <400> 16 gaactaggaa acggaaacat tcaagagatg tttccgtttc ctagttctt 49

Claims (28)

1. a) CHOP 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 전사체를 표적으로 하는 siRNA(short interfering RNA)를 코딩하는, 서열번호 15 또는 서열번호 16의 핵산 서열을 가진 핵산으로 세포를 안정적으로 형질전환시킴으로써 상기 세포 내 폴딩되지 않은 단백질 반응(UPR, unfolded protein response) 경로 성분의 활성을 감소시키는 단계; 및

   b) 상기 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 단백질의 세포 분비 속도를 증가시키는 방법.
2. 제1항에 있어서, CHOP 단백질이 서열번호 8에 나타낸 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 세포가 골수종 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제3항에 있어서, 골수종 세포가 SP2/0 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제3항에 있어서, 골수종 세포가 F0 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제1항에 있어서, 세포가 중국 햄스터 난소(CHO) 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
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