ES2673518T3

ES2673518T3 - Métodos para modificar las tasas de producción de proteínas

Info

Publication number: ES2673518T3
Application number: ES11151039.2T
Authority: ES
Inventors: Gregory Bannish; Jill Giles-Komar; Michael Rycyzyn
Original assignee: Janssen Biotech Inc
Current assignee: Janssen Biotech Inc
Priority date: 2004-03-31
Filing date: 2005-03-31
Publication date: 2018-06-22
Anticipated expiration: 2025-03-31
Also published as: JP2007537728A; AU2005228444A1; KR20070015183A; US20050221432A1; US7479379B2; CA2561702A1; WO2005094355A2; EP1758929A2; AU2005228444B2; CA2561702C; EP1758929A4; EP2339015B1; DK2339015T3; CN101426812B; EP2339015A1; WO2005094355A3; CN101426812A; KR101145308B1

Abstract

Un método para aumentar la tasa o ritmo de secreción celular de una proteína, que comprende los siguientes pasos: a) modular o regular la actividad de al menos un componente de la ruta de respuesta a proteínas desplegadas (o UPR, por sus siglas en inglés) en una célula; y b) cultivar las células, de manera que el componente de la vía o ruta UPR es una CHOP y de manera que la actividad de la CHOP se modula transfectando establemente la célula con un ácido nucleico que codifica un ARN pequeño de interferencia (ARNip o siRNA, por sus siglas en inglés) que está dirigido a los transcritos (o transcriptos) de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína CHOP, de manera que el ácido nucleico que codifica el siRNA es la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 16.

Description

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Métodos para modificar las tasas de producción de proteínas

Descripción

Campo de la invención

[0001] Está invención está relacionada con unos métodos para modificar la tasa de secreción celular de una proteína.

Antecedentes de la invención

[0002] Normalmente, la producción de proteínas -como anticuerpos- a gran escala se basa en la secreción de proteínas a partir de una línea de producción de células cultivadas. Las proteínas secretadas que se producen mediante células cultivadas pueden recuperarse del medio de cultivo celular circundante y purificarse fácilmente.

[0003] La tasa de secreción celular de proteínas es un parámetro importante que influye en la producción y la purificación de las proteínas secretadas de un biorreactor u otro sistema. En general, pueden obtenerse cosechas o producciones de proteínas más purificadas cuando la tasa de secreción celular es relativamente elevada. A la inversa, si la tasa de secreción celular es demasiado baja, la purificación de proteínas tal vez no sea factible.

[0004] Una de las estrategias para solucionar el problema de las células con una secreción baja ha sido aislar las células subclonadas con una secreción alta de una población de células con una secreción baja. Normalmente, esto requiere de mucho tiempo y de series intensivas de dilución limitante en serie, rastreo y selección de líneas celulares de secreción alta. De manera alternativa, se generan líneas celulares completamente nuevas y que producen la proteína de interés con la esperanza de que estas nuevas líneas celulares sean líneas con una secreción elevada.

[0005] Cada una de las estrategias anteriores para obtener líneas celulares con una secreción alta presenta limitaciones. Por ejemplo, la identificación de líneas celulares con una secreción alta mediante el subclonaje a partir de una población de células con una secreción baja se ve limitada por la relativa escasez de células con una secreción alta en dicha población, así como por las grandes cantidades de tiempo y trabajo que se requieren para identificar cualquier célula con una secreción alta.

[0006] Además, la obtención de nuevas líneas celulares que produzcan el anticuerpo o la proteína de interés se ve limitada por la posibilidad de que las nuevas líneas celulares no tengan una secreción elevada y por el considerable esfuerzo que se requiere para regenerar las células que producen anticuerpos e identificar las células con una secreción alta. En algunos casos, solo pueden obtenerse líneas celulares con una secreción baja debido al plegamiento incorrecto de proteínas dentro del retículo endoplasmático (RE) de las células, lo cual provoca una tasa de secreción menor.

[0007] Por todo ello, existe una necesidad de hallar métodos eficaces para modificar la tasa de secreción celular de una proteína.

Breve descripción de las ilustraciones

[0008]

La Figura 1 (Fig. 1) muestra los niveles de transcripción del gen de la UPR (o los niveles de transcritos génicos de la UPR) en células que secretan mAbs en grandes proporciones.

La Figura 2 muestra los niveles de transcripción del gen de la UpR en células en fase de crecimiento estático. La Figura 3 muestra una comparación de los niveles de transcripción del gen de la UPR en líneas celulares de mieloma parentales.

La Figura 4 muestra los niveles de transcripción del gen de la UPR en líneas celulares con una secreción alta en relación con la línea celular de mieloma parental Sp2/0.

La Figura 5 muestra los niveles de transcripción del gen de la UPR en líneas celulares con una secreción alta en relación con la línea celular de mieloma parental FO.

La Figura 6 muestra los niveles de transcripción del gen de la UPR en líneas celulares con una secreción alta en relación con la línea celular de mieloma parental Ag-653.

La Figura 7 muestra los cambios en las tasas de secreción de anticuerpos como una función de la modificación de los niveles de transcripción del gen de la UPR.

La Figura 8 muestra unas tasas de secreción de anticuerpos más altas en células de mieloma transfectadas establemente con ácido nucleico que codifica siRNAs (o ARNips, en español) específicas de CHOP-10.

Resumen de la invención

[0009] Un aspecto de la invención es un método para aumentar la tasa de secreción celular de una proteína, que incluye los siguientes pasos:

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a) regular la actividad de al menos un componente de la vía de respuesta a proteínas desplegadas (o UPR, por sus siglas en inglés) en una célula; y

b) cultivar las células,

de manera que el componente de la vía o ruta UPR es CHOP y de manera que la actividad de CHOP se modula o regula transfectando establemente la célula con un ácido nucleico que codifica un ARN pequeño de interferencia (ARNip o siRNA, por sus siglas en inglés) que apunta o está dirigido a los transcriptos (o transcritos) de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína CHOP, de manera que el ácido nucleico que codifica el siRNA es la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 16.

[0010] Otro aspecto de la invención es una célula plasmática con una tasa de secreción celular modificada, tal y como se especifica en la reivindicación 8, que se obtiene regulando la actividad de CHOP en la célula mediante el método explicado previamente.

[0011] La divulgación también proporciona un animal transgénico que contiene una célula plasmática con una tasa de secreción celular modificada que se obtiene regulando la actividad del -al menos un- componente de la ruta UPR en una célula y cultivando las células.

[0012] También se desvela un ácido nucleico aislado que tiene la secuencia que se muestra en SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 16.

Descripción detallada de la invención

[0013] Tal y como aparece en el presente texto, el término 'anticuerpos' se usa en un sentido amplio y comprende las moléculas de anticuerpos o inmunoglobulina, que comprenden los anticuerpos policlonales, los anticuerpos monoclonales -incluyendo los anticuerpos monoclonales murinos, humanos, humanizados y quiméricos- y los fragmentos o variantes de anticuerpos. Los anticuerpos son proteínas secretadas que las células plasmáticas expresan y secretan de forma constitutiva. Los anticuerpos también pueden producirse usando células plasmáticas inmortalizadas mediante métodos estándares como la generación de hibridomas o mediante la transfección de genes con cadenas pesadas y/o ligeras de anticuerpos en una célula B (o linfocito B) inmortalizada, como una célula de mieloma u otros tipos de células como células de ovario de hámster chino (o células CHO, por sus siglas en inglés), células vegetales o células de insectos.

[0014] Los fragmentos o variantes de anticuerpos incluyen mimeticuerpos, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, fragmentos Fc, fragmentos de cadena pesada, fragmentos de cadena ligera y moléculas que contienen una porción de al menos una cadena peptídica de anticuerpos. Estas porciones pueden corresponder a las cadenas peptídicas de la región variable, la región bisagra o la región constante del anticuerpo.

[0015] Tal y como se utiliza en el presente texto, el término 'mimeticuerpo' ('mimetibody', en inglés) hace referencia a una proteína que tiene la fórmula genérica (I):

(V1(n)-Pep(n)-Flex(n)-V2(n)-pHinge(n)-CH2(n)-CH3(n))(m) (I)

donde V1 es al menos una parte o porción de un extremo N-terminal de una región variable de una inmunoglobulina, Pep es al menos un péptido bioactivo que se une a un epítopo, Flex es un polipéptido que proporciona flexibilidad estructural permitiendo que el mimetocuerpo tenga orientaciones alternativas y propiedades de enlace, V2 es al menos una porción de un extremo C-terminal de una región variable de una inmunoglobulina, pHinge (o pBisagra) es al menos una porción de una región bisagra de una inmunoglobulina, CH2 es al menos una porción de una región constante CH2 de una inmunoglobulina y CH3 es al menos una porción de una región constante CH3 de una inmunoglobulina, de manera que n y m pueden ser un número entero entre 1 y 10. Un mimetocuerpo puede imitar las propiedades y funciones de diferentes tipos de moléculas de inmunoglobulina como IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgD y IgE dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de la cadena pesada presente en la construcción o molécula.

[0016] Tal y como se utiliza en el presente texto, el término 'anticuerpo monoclonal' (mAb, por sus siglas en inglés) hace referencia a un anticuerpo (o fragmento de anticuerpo) que se obtiene de una población de anticuerpos básicamente homogéneos. Los anticuerpos monoclonales son muy específicos y, normalmente, se dirigen contra un único determinante antigénico. El término 'monoclonal' señala el carácter básicamente homogéneo del anticuerpo y el hecho de que no sea necesario producir el anticuerpo mediante un método particular. Por ejemplo, los mAbs murinos pueden obtenerse mediante el método de hibridomas de Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975). Los mAbs quiméricos que contienen una región variable de la cadena pesada y la cadena ligera, que se obtiene a partir de un anticuerpo donante (normalmente murina), juto con regiones constantes de la cadena pesada y la cadena ligera, que se obtienen a partir de un anticuerpo receptor o anticuerpo aceptor (normalmente, otra especie mamífera como la especie humana), pueden prepararse siguiendo el método que se desvela en la Patente de EE. UU. n° 4,816,567. Los mAbs humanizados que tienen CDRs provenientes de una inmunoglobulina donante no humana (normalmente murina), de manera que las restantes partes provenientes de la inmunoglobulina se obtienen de una o más inmunoglobulinas humanas y de manera que, opcionalmente, tienen residuos de apoyo del marco para preservar la

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afinidad de enlace (o afinidad de unión), pueden obtenerse mediante las técnicas que se desvelan en Queen et al., Proc. Natl Acad Sci (USA), 86:10029-10032, (1989) y Hodgson et al., Bio/Technology, 9: 421, (1991).

[0017] Los mAbs completamente humanos que carecen de cualquier secuencia no humana pueden prepararse a partir de ratones trasngénicos con inmunoglobulina humana mediante técnicas que se explican, por ejemplo, en Lonberg et al., Nature, 368: 856-859, (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14: 845-851, (1996)' y Mendez et al., Nature Genetics, 15: 146-156, (1997). Los mAbs humanos también pueden prepararse y optimizarse utilizando las bibliotecas de expresión de fagos mediante las técnicas que se explican, por ejemplo, en Knappik et al., J. Mol. Biol., 296: 57-86, (2000) y Krebs et al., J. Immunol. Meth., 254: 67-84, (2001).

[0018] Tal y como se utiliza en el presente texto, la 'tasa o índice de secreción celular' hace referencia a la tasa -o ritmo- a la que una célula segrega o secreta una proteína determinada. Esta tasa puede describirse como el cambio en la cantidad de proteína(s) presente en el medio de cultivo respecto al cambio o transcurso del tiempo, o puede normalizarse usando el número de células y expresarse mediante las unidades 'pg/célula/día'.

[0019] Tal y como se utiliza en el presente texto, el término 'ARN pequeño de interferencia' hace referencia a una secuencia de ácido nucleico que regula la escisión o descomposición ('cleavage', en inglés) del transcrito -o transcripción- de un gen diana. Los ARNs pequeños de interferencia (ARNips o siRNAs, por sus siglas en inglés) pueden ser bicatenarios o de horquillado corto. Los siRNAs bicatenarios o de doble cadena pueden estar compuestos de dos cadenas de ARN individuales, antiparalelas e hibridadas, o cadenas de ácido nucleico hibridado, que contienen tanto ARN como ADN (por ejemplo, 5'-TTTTUUUU-3' hibridado o fijado con 5'-TTTTUUUU-3' o 5'- TTTT-3' hibridado con 5'-UUUU-3'). Los siRNAs del tipo de horquillado corto pueden estar compuestos de una sola cadena de ARN o una sola cadena híbrida de ARN:ADN que puede formar una estructura en tallo-bucle u otra estructura secundaria eficaz. Las personas versadas en la materia comprenderán que los siRNAs pueden comprender otras modificaciones como análogos de nucleósidos, modificaciones en el esqueleto o estructura central y otras modificaciones que permiten que el ácido nucleico siRNA modificado regule la escisión del transcrito de un gen diana.

[0020] Tal y como se utiliza en el presente texto, el término 'molecula pequeña' hace referencia a un compuesto con una masa molecular de menos de 24,000 g/mol que no está compuesto solamente de residuos de aminoácidos o residuos de ácido nucleico.

[0021] Tal y como se utiliza en el presente texto, el término 'secuencia de control transcripcional' hace referencia a una secuencia de ácido nucleico que es necesaria para la transcripción de un gen o una secuencia de ácido nucleico que aumenta o disminuye la transcripción de un gen.

[0022] Tal y como se utiliza en el presente texto y en las reivindicaciones, el término 'componente de la ruta UPR' hace referencia a cadenas peptídicas o secuencias de ácido nucleico, como las secuencias de control transcripcionales, que regulan la transmisión o comunicación a lo largo de la ruta UPR o activan la UPR.

[0023] La presente divulgación proporciona métodos que son útiles para modificar la tasa de secreción celular de una proteína por parte de una célula. Un uso ejemplar de los métodos de la divulgación es el aumento de las tasas de secreción en el caso de las proteínas que son útiles por motivos diagnósticos, terapéuticos o de investigación, como los anticuerpos.

[0024] Las tasas bajas de secreción de proteínas en líneas celulares pueden estar provocadas por la acumulación de proteínas mal plegadas en el RE de la célula, lo cual ralentiza o detiene el proceso de secreción mediante la UPR. Las proteínas sensibles al estrés que están presentes en la membrana del RE detectan un exceso de proteínas mal plegadas y desencadenan la UPR. Posteriormente, mediante una compleja cascada de transducción de señales, la proteína chaperona Bip y los factores de transcripción XBP-1 y CHOP se regulan al alza.

[0025] Las proteínas chaperonas se unen a las proteínas desplegadas y ayudan a que se produzca un plegamiento correcto. Generalmente, el factor de transcripción CHOP se considera un regulador negativo del crecimiento, la diferenciación y la supervivencia celulares. Se ha observado que la regulación al alza de CHOP provoca la parada del ciclo celular, lo cual da a la célula el tiempo necesario para hacer frente a las condiciones desfavorables que provocan la inducción de la UPR.

[0026] El factor de transcripción XBP-1 es necesario para producir células plasmáticas, los linfocitos B diferenciados que secretan grandes cantidades de inmunoglobulinas. Las células plasmáticas expresan una UPR modificada en la que se da una regulación al alza de algunos genes de la UPR antes de la síntesis de inmunoglobulina. Estos incluyen XBP-1, Bip, Grp94 y p50ATF6 alfa y su regulación al alza es necesaria para la diferenciación de las células plasmáticas y la secreción adecuada de anticuerpos (Gass, J.N., et al., J. Biol. Chem., 227, 49047-49054 (2002). Por el contrario, CHOP no se regula al alza durante esta transición, lo cual indica un tipo distinto de UPR. La regulación al alza de estas moléculas puede tener un efecto beneficioso o perjudicial, de manera que puede provocar un aumento en la tasa de secreción celular de proteínas o una apoptosis. Ver Kaufman, R.J., Genes Dev. 13, 12111233 (1999) y Cudna, R.E., et al., Biotechnol. Bioeng., 81, 56-65 (2003).

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[0027] En un método de la presente divulgación, la tasa de secreción celular de una proteína se modifica modulando o regulando la actividad de al menos un componente de la ruta UPR en una célula y cultivando la célula. El método de la divulgación ayuda a aumentar o disminuir la tasa de secreción celular de una proteína, como un anticuerpo.

[0028] En una realización de la divulgación, la tasa de secreción celular de una proteína se aumenta transfectando establemente la célula con un ácido nucleico que codifica un componente de la ruta UPR. Los componentes de la ruta UPR pueden ser polipéptidos o secuencias de ácido nucleico, como una secuencia de control transcripcional, que regulan la transmisión o comunicación a lo largo de la ruta UPR o activan la UPR. Los ejemplos de componentes de la ruta UPR incluyen BiP, XBP y CHOP y variantes que tienen una actividad similar. Otros ejemplos de componentes de la ruta UpR incluyen IRE1, PERK, ATF4, ATF6, eIF2alfa, GRP78, GRP94, calreticulina, chaperonas y otras variantes que tienen una actividad similar (ver, por ejemplo, Cudna y Dickson, Biotechnol. Bioeng., 81, 56-65 (2002)). Un ejemplo de una secuencia de control transcripcional es el elemento de la UPR que actúa en cis (UPRE) y ERSE, que se han identificado en los promotores de diferentes genes de la UPR. Aquellas personas con unos conocimientos y habilidades estándares en esta materia podrán reconocer otros componentes de la ruta UPR y otras secuencias de control transcripcionales. El componente de la ruta UPR puede tener una secuencia de aminoácidos como las que se muestran en SEQ ID NO: 2 (BiP murino), SEQ ID NO: 4 ( XBP-1 murino, forma empalmada), SEQ ID NO: 6 (XBP-1 murino, forma sin empalmar), SEQ ID nO: 8 (CHOP-10 murino), SEQ ID NO: 10 (BiP humano), SEQ ID NO: 12 (XBP-1 humano) o SEQ ID NO: 14 (CHOP-10 humano). El ácido nucleico del componente de la ruta UPR puede tener una secuencia como las que se muestran en SEQ ID NO: 1 (ARNm de BiP murino), SEQ ID NO: 3 (XBP-1 murino, ARNm en su forma empalmada), SEQ ID NO: 5 (XBP-1 murino, forma sin empalmar, ARNm), SEQ ID NO: 7 (ARNm de CHOP-10 murino), SEQ ID NO: 9 (ARNm de BiP humano), SEQ ID NO: 11 (ARNm de XBP-1 humano), SEQ ID NO: 13 (ARNm de CHOP-10 humano).

[0029] Las variantes de estas secuencias que tengan una actividad similar a la molécula parental también son útiles en los métodos de la divulgación. Por ejemplo, las moléculas variantes que tienen al menos un 80% de igualdad o identidad con la molécula parental deberían tener una actividad similar. El porcentaje de igualdad o identidad entre dos secuencias de proteínas puede determinarse usando el algoritmo BLASTP con el filtrado apagado y todos los demás ajustes por defecto inalterados. Las diferentes isoformas de un polipéptido, las versiones dominantes negativas de un polipéptido o las formas modificadas covalentemente de un polipéptido son algunos ejemplos de variantes de una molécula parental.

[0030] La expresión génica de un componente de la ruta UPR, como BiP o CHOP, puede disminuirse mediante una célula con moléculas de ARN pequeño de interferencia (siRNA) o moléculas antisentido.

[0031] De acuerdo con la presente divulgación, la tasa de secreción celular de una proteína puede aumentarse modulando el componente de la ruta UPR mediante la administración de una molécula pequeña. Una molécula ejemplar es la tapsigargina, un agente de inducción de la UPR (Litton, J., J. Biol. Chem., 26, 17067-17071 (1991)). Otros ejemplos de estas moléculas pequeñas incluyen la tunicamicina y los lipopolisacáridos.

[0032] Además, la tasa de secreción celular de una proteína puede aumentarse poniendo las células en una fase de crecimiento estático. Las células pueden ponerse en una fase de crecimiento estático limitando la disponibilidad de nutrientes, permitiendo que se acumulen los desechos celulares y modificando el pH del medio de cultivo celular. Aquellas personas versadas en la materia también conocerán otros métodos para poner las células en una fase de crecimiento estático.

[0033] En los métodos de la invención, las células ejemplares son células plasmáticas, es decir, células B diferenciadas que secretan anticuerpos. Las células plasmáticas pueden aislarse de fuentes murinas o humanas u otras fuentes animales. Normalmente, las células plasmáticas se han inmortalizado mediante técnicas estándares como la infección vírica, por ejemplo con virus de Epstein-Barr, u otros métodos como la mutagénesis radiológica o química. Las células plasmáticas inmortalizadas también pueden ser cancerosas y pueden obtenerse inyectando aceite mineral u otro compuesto en la cavidad peritoneal de un animal.

[0034] En una realización de la invención, los acompañantes de fusión inmortalizados son lo que en este campo se conoce como 'células de mieloma'. Normalmente, los mielomas se forman de la fusión de células esplénicas con un acompañante de fusión inmortalizado que se ha obtenido de un organismo que padece mieloma múltiple, un cáncer de la médula ósea. El organismo puede ser un pájaro, pez, reptil, mamífero u otro animal (Animalia). Los ejemplos de líneas celulares de mieloma incluyen las líneas celulares SP2/0 ('American Type Culture Collection' (ATCc), Manassas, Virginia, Estados Unidos, CRL-1581), NSO ('European Collection of Cell Cultures' -Colección europea de cultivos celulares-, (ECACC), Salisbury, Wiltshire, Reino Unido, ECACC N° 85110503), FO (ATCC CRL-1646), y Ag653 (ATCC CRL-1580), obtenidas a partir de ratones. Un ejemplo de línea celular de mieloma obtenida de humanos es la línea celular U266 (ATTC CRL-TIB-196). Aquellas personas versadas en la materia conocerán otras líneas celulares de mieloma.

[0035] En una realización de la invención, las células de mieloma se transfectan establemente con una molécula de ADN. Las células de mieloma transfectadas establemente pueden obtenerse mediante métodos de transfección, cribado y selección que resultan muy conocidos para aquellas personas con unas habilidades y conocimientos

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estándares en este campo. Las secuencias de ADN que se usan para transfectar establemente las células pueden integrarse aleatoriamente en el ADN de una célula de mieloma o pueden integrarse en un sitio específico. Estas secuencias de ADN pueden codificar componentes de la ruta UPR. Además, las secuencias de ácido nucleico transfectadas establemente pueden desactivar o eliminar insercionalmente un componente de la UPR, como un gen de la UPR o una secuencia de control transcripcional.

[0036] De acuerdo con la invención, la tasa de secreción celular de una proteína se aumenta transfectando establemente la célula con una secuencia de ácido nucleico que codifica un siRNA que apunta o está dirigido a los transcriptos (o transcritos) de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína CHOP. Las proteínas CHOP ejemplares son aquellas que tienen las secuencias de aminoácidos que se muestran en SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO:14. La transfeccion estable con una secuencia de ácido nucleico que codifica un siRNA que apunta o está dirigido a los transcriptos de secuencias de ácido nucleico que codifican una CHOP-10 murina es útil para los métodos de la invención. El siRNA ejemplar específico para transcriptos génicos de CHOP-10 murina, tal y como se usa en los métodos de la invención, comprende las secuencias de nucleótidos que se muestran en SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 16. Aquellas personas versadas en la materia conocerán otros ácidos nucleicos que codifican siRNAs que apuntan a transcritos de genes de la UPR.

[0037] Otras células que son útiles para los métodos de la invención incluyen la células de ovario de hámster chino (o células CHO), las células de insectos y las células vegetales.

[0038] De acuerdo con la presente divulgación, pueden obtenerse animales transgénicos que expresan proteínas de la UPR de forma inductiva o constitutiva a niveles elevados con respecto a animales no transgénicos. Las técnicas para obtener animales transgénicos son bien conocidas en este campo.

[0039] En los métodos de la invención, se cultivan las células. Las células pueden cultivarse en suspensión o en cultivos adherentes. Las células pueden cultivarse en diversos recipientes, incluyendo -por ejemplo- biorreactores, bolsas de células, placas de cultivo, frascos u otros recipientes que resultan muy conocidos para aquellas personas con conocimientos y habilidades estándares en este campo. Las células pueden cultivarse en cualquier medio adecuado, incluyendo las formulaciones de medios químicamente definidos. Las condiciones ambientales que son adecuadas para el cultivo celular, como la temperatura y la composición atmosférica, también resultan muy conocidas para las personas versadas en la materia. Los métodos para el cultivo de células también resultan muy conocidos para las personas versadas en la materia.

[0040] La presente invención también proporciona células plasmáticas con tasas modificadas de secreción celular que se obtienen gracias a los métodos de la invención. Las células plasmáticas se obtienen modulando la actividad de CHOP en la célula con un ácido nucleico transfectado establemente que codifica un ARN pequeño de interferencia que apunta o está dirigido a transcritos de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína CHOP, de manera que el ácido nucleico que codifica el siRNA es la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO:16. La célula plasmática que se proporciona puede ser, por ejemplo, una célula derivada de SP2/0, como una célula C2-8 o C2-18. Estas células plasmáticas pueden secretar un anticuerpo u otro polipéptido que se vayan a purificar.

[0041] La presente invención se describe a continuación mediante los siguientes Ejemplos específicos y no limitativos.

Ejemplo 1

Niveles de transcritos génicos de la UPR en líneas celulares con una secreción alta

[0042] Se analizaron líneas celulares que secretaban mAbs en grandes cantidades para estudiar los niveles de transcritos génicos de la UPR en comparación con las líneas celulares que secretaban mAbs idénticos en cantidades pequeñas. Las líneas celulares examinadas incluían las líneas con una secreción elevada C505B, C505C y C505D. Las líneas celulares con una secreción baja que se analizaron fueron la línea C505A y SP2/0, la línea celular de mieloma parental de C505A, B, C y D. Todas estas líneas se transfectaron con ADN que codifica las cadenas pesadas y ligeras de un mAb de IgG1 humana que específico para av-integrina. Las líneas celulares C505B, C505C y C505D se identificaron mediante subclonaje secuencial, cribado y selección de las tasas elevadas de secreción de mAb.

[0043] Las tasas de secreción de anticuerpos se determinaron midiendo la cantidad de mAb secretada en un periodo de 24 h en el medio de cultivo celular y contando el número de células viables para obtener una tasa de secreción celular en unidades de 'pg/células viables/día'. La línea C505a segrega o secreta anticuerpos en tasas bajas de 5-7 pg/célula viable/día, equivalentes a una concentración de alrededor de 5-10 pg/mL/7 días. La línea C505B produce anticuerpos a un ritmo de alrededor de 15 pg/célula viable/día, C505C produce a un ritmo de alrededor de 13 pg/célula viable/día y C505D produce a un ritmo de alrededor de 15 pg/célula viable/día.

[0044] Todas las líneas celulares que secretan mAb y la línea celular de mieloma parental se cultivaron en

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suspensión a 37° C en un medio IMDM que contenía un 5% de FBS, 2 mM de glutamina y 2mM de piruvato en una atmósfera de un 5% de CO2. Un medio seleccionado de 1X MHX que contenía 0,5 mg/L de ácido micofenólico, 2,5 mg/L de hipoxantina y 50 mg/L de xantina también estaba presente en el medio.

[0045] Las diferencias en los niveles de transcritos génicos de la UPR entre las líneas celulares con una expresión alta y las líneas celulares con una expresión baja se analizaron mediante una PCR cuantitativa (Q-PCR, por sus siglas en inglés). Las células se cultivaron en la fase de crecimiento exponencial y el ARN total se aisló de 5x106 células usando el sistema RNEasy™ (Qiagen Inc., Valencia, California, Estados Unidos). Se realizó una Q-PCR usando una reacción estándar de dos pasos. El paso de síntesis de ADNc se realizó usando 'Superscript™ II reverse transcriptase' (Transcriptasa inversa SuperScript™) (Invitrogen Inc., Carlsbad, California, Estados Unidos) y usando cebadores -o 'primers'- hexámeros aleatorios siguiendo las condiciones reactivas especificadas por el fabricante. Después, se realizó una Q-PCR Taqman™ (Applied Biosystems, Foster City, California, Estados Unidos) usando las herramientas ABI PRISM™ 7000Ht o 7900HT (Applied Biosystems, Foster City, California, Estados Unidos) según las especificaciones del fabricante. Se usaron 5000 pg de ARN en cada reacción de Q-PCR. Los cebadores específicos para BiP, CHOP y XBP y las combinaciones de sonda utilizadas para la Q-PCR se diseñaron usando el software Primer Express™ (Applied Biosystems, Foster City, California, Estados Unidos). Los niveles de ADNc se regularon o normalizaron respecto a los niveles de transcripción del gen constitutivo (o gen 'housekeeping') de Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) y, posteriormente, se normalizaron al valor de transcripción de ADNc/GAPDH para la línea celular parental apropiada. La recogida de datos y la cuantificación de transcripción en la fase exponencial temprana de la pCr se realizaron utilizando las herramientas ABI PRISM™ 7000HT o 7900HT y el software correspondiente.

[0046] Los resultados se muestran en la Figura 1 y demuestran que los niveles de transcritos génicos de la UPR de BiP y XBP-1 fueron alrededor de 3-4 veces más elevados en las líneas celulares con una secreción alta que en las células con una secreción baja. Las diferencias en los niveles de CHOP fueron menos acusadas.

Ejemplo 2

Niveles de transcritos génicos de la UPR y tasas de secreción de anticuerpos en células en fase de crecimiento estático

[0047] Se analizaron las células en fase de crecimiento estático para estudiar los niveles de transcritos génicos de la UPR y las tasas de secreción de mAb en relación con la fase de crecimiento exponencial. La línea celular C168J es un transfectoma proveniente de la línea celular de mieloma parental SP2/0 y secreta mAb de IgG1 a un ritmo de 2530 pg/célula/día. El caso de C505A es el que se ha descrito previamente en el Ejemplo 1.

[0048] Las tasas de secreción de mAb de IgG1 de las líneas celulares C505A, C168J y SP2/0 se analizaron sembrando 5x106 células en matraces de T-75 o T-150 y cultivándolas como se describe en el Ejemplo 1. Después de 3 días, las células se encontraban en la fase de crecimiento exponencial y, después de 6 días, las células estaban en la fase de crecimiento estático. El número total de células y el número de células viables se determinó para las células en ambas fases de crecimiento. Los medios de cultivo de las células en ambas fases de crecimiento se examinaron para analizar la IgG humana mediante un ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) estándar. Se realizó una Q-PCR específica para BiP, CHOP y XBP-1 con las células en fase de crecimiento estático y exponencial como se ha descrito previamente en el Ejemplo 1.

[0049] Los resultados que se muestran en la Tabla 1 demuestran que las líneas C505A y C168j aumentaron las tasas de secreción de mAb de IgG1 (Tabla 1).

Tabla 1: Tasa de IgG1 secretada (pg/célula/día)

Línea celular: Fase exponencial Fase estática

C505A: 3,90 5,40

C168j: 10,40 13,90

SP2/0: 0 0

Asimismo, los resultados que se muestran en la Figura 2 demuestran unos mayores niveles de transcritos génicos de la UPR en C505A, C168j y Sp2/0 en la fase de crecimiento estático en relación con la fase de crecimiento exponencial.

Ejemplo 3

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Niveles de transcritos génicos de la UPR en líneas celulares de mieloma parentales

[0050] Se examinaron los niveles de transcritos génicos de la UPR en las líneas celulares de mieloma parentales SP2/0, NSO, FO y Ag653 para determinar si las líneas celulares con una secreción más alta contenían unos niveles más altos de genes de la UPR. Se cultivaron células de SP2/0, NSO, FO y Ag653 en la fase de crecimiento exponencial y el ARN total se aisló de 5x106 células como se ha descrito previamente en el Ejemplo 1. También se realizaron análisis y Q-PCR como se ha descrito en el Ejemplo 1. Los resultados que se muestran en la Figura 3 muestran unos niveles comparables de transcripción de BiP y CHOP en todas las células examinadas. Sin embargo, los niveles de transcripción de XBP-1 eran elevados en las células de FO y NSO en relación con los demás tipos de células examinados.

Ejemplo 4

Niveles de transcritos génicos de la UPR en líneas celulares con una secreción alta y líneas celulares de mieloma parentales

[0051] Se analizaron las líneas celulares que secretan mAbs en tasas elevadas para estudiar los niveles de transcritos génicos de la UPR en comparación con sus líneas celulares parentales. Las líneas celulares que se indican en las Figuras 4-6 se cultivaron para la fase de crecimiento exponencial y el ARN total se aisló de 5x106 células como se ha descrito previamente en el Ejemplo 1. También se realizaron análisis y Q-PCR como se ha descrito en el Ejemplo 1.

[0052] Los resultados que se muestran en las Figuras 4-6 demuestran que las líneas celulares que secretan mAbs en tasas más elevadas tienen unos niveles más elevados de transcritos génicos de la UPR en relación con sus líneas parentales de células de mieloma SP2/0, FO y Ag653. Estos resultados sugieren que el aumento en la expresión génica de la UPR está relacionado con el aumento en las tasas de secreción de anticuerpos independientemente de la identidad de la línea celular de mieloma parental que se haya utilizado para producir las células con una secreción alta.

Ejemplo 5

Expresión de proteínas de la UPR tras la inducción de la UPR

[0053] La expresión de proteínas de la UPR en células con una secreción alta en comparación con células con una secreción baja y líneas celulares de mieloma parentales se analizó tras la inducción de la UPR por medio del agente farmacológico tpsigargina. La tapsigargina es un inhibidor de la ATPasa que bloquea el bombeo de ATPasa de Ca2+ del retículo sarco/endoplásmico (SERCA) y provoca la disminución de calcio en el canal del RE.

[0054] Las células se trataron con 100 nM de tapsigargina y se prepararon 'Western blots' específicos para XBP-1 y ChoP. Se provocó la lisis de las células en momentos específicos en un buffer o tampón de lisis de radioinmunoprecipitación (RIPA) (1X PBS, 1% de N-P40, 0,5% de desoxicolato de sodio, 0,1% de dodecilsulfato de sodio, 1 mM de PMSF e inhibidores de proteasa de Roche (Catalog N° 1836153)) y las concentraciones de proteínas en los lisados clarificados se cuantificaron usando un ensayo proteico estándar con ácido bicinconínico (BCA, pos sus siglas en inglés)(Sigma Catalog. N° B9643). Para los Western blots, se usaron 20 |jg de cada lisado con un gel SDS-PAGE estándar, se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF, pos sus siglas en inglés) y se examinaron con anticuerpos específicos para XBP-1 o CHOP (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, California, Estados Unidos).

[0055] Los resultados (no se muestran) indicaron que las proteínas de UPR en células con una secreción alta se expresan en niveles elevados en comparación con las células con una secreción baja y las líneas celulares de mieloma parentales. El Western blot específico para XBP-1 indicó que la expresión de la proteína XBP-1 se induce ampliamente en las células C168j con una secreción alta y tratadas con tapsigargina. Esta inducción de la expresión de XBP-1 es más marcada 7 horas después de la inducción farmacológica de la UPR, y es visible tan solo 2 horas después del tratamiento. El Western blot específico para CHOP indicó que la expresión de la proteína CHOP se induce ampliamente en las células C168j con una secreción alta y tratadas con tapsigargina. La CHOP aparece primero tras 2 horas, alcanza su grado máximo de expresión a las 4-7 horas y disminuye en gran medida tras 22 horas.

Ejemplo 6

Niveles crecientes en la expresión de proteínas de la UPR

[0056] Las células se transfectaron temporalmente con vectores de expresión de BiP y XBP-1 con el objetivo de aumentar los niveles de expresión celular de estas proteínas de la UPR. Se cultivaron células HEK293T/17 (ATCC CRL-11268) en cultivos adherentes a 37° C en una atmósfera con un 5% de CO2 y se cultivaron en un medio IMDM ('Iscove's Modified Dulbecco's Minimal Essential Medium') que contenía un 5% de FBS, 2mM de glutamina y 2 mM

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de piruvato. Utilizando métodos estándares, los ADNcs que codifican la isoterma 1 de XBP-1 (Registro NCBI AF027963), la isoterma 2 de XBP-1 (Registro NCBI AF443192) o BiP se subclonaron en un vector útil para experimentos de transfección temporal. El vector expresa la proteína zsGreen1 bajo el control de un promotor CMV y tiene un sitio de clonado múltiple para introducir una región de codificación adicional bajo el control de un promotor CMV. Se usó un gen resistente a la kanamicina para la selección bacteriana. Después, las células HEK293T/17 se dejaron sin transfectar o se transfectaron temporalmente sólo con el vector vacío, con el vector de expresión de la isoterma 1 de XBP-1, con el vector de expresión de la isoforma 2 de XBP-1 o con el vector de expresión de BiP. Las transfecciones se realizaron usando el reactivo Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen Inc., Carlsbad, California, Estados Unidos) y siguiendo las indicaciones del fabricante. 48 horas después de la transfección, se provocó la lisis de las células en un tampón de lisis RIPA y se colocaron los mismos equivalentes celulares de lisados clarificados en los geles SDS-PAGE. Después se prepararon los Western blots y se examinaron como se ha descrito previamente en el Ejemplo 5. Los 'blots' o transferencias se dividieron en tiras y se volvieron a analizar con un anticuerpo específico para la actina para confirmar que había la misma carga de proteínas en cada una.

[0057] Los resultados (no se muestran) demostraron que los niveles de expresión de la isoforma 1 de XBP-1 (calle o carril denominado 'XBP-1') y la isoforma 2 de XBP-1 (carril denominado 'X54') aumentaron en las células que se transfectaron temporalmente con vectores de expresión que codificaban estas isoformas de XBP-1. Asimismo, los datos (no se muestran) indicaron que los niveles de expresión de BiP aumentaron en las células que se transfectaron temporalmente con vectores de expresión que codificaban la BiP, y no se detectó ninguna expresión de BiP en las células que se dejaron sin transfectar o que se transfectaron sólo con el vector vacío.

Ejemplo 7

Efectos de los niveles de transcritos génicos de la UPR sobre las tasas de secreción de anticuerpos

[0058] Se analizó el efecto de los niveles de transcritos génicos de la UPR sobre las tasas de secreción de anticuerpos. Se diseñaron moléculas de siRNA de cadena doble que apuntaban o estaban dirigidas a transcritos génicos de BiP, CHOP y XBP-1 usando el 'siRNA Target Finder Tool' (
www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html) de Ambion alojado en Internet y se sintetizaron usando el 'Silencer™ siRNA Construction Kit' (Ambion Inc., Woodward, Texas, Estados Unidos, n° de Catálogo 11620). Se diseñaron dos siRNAs para cada transcrito diana. 3x106 células C168J cultivadas en condiciones estándares se transfectaron mediante electroporación con 3 |jg de cada siRNA de cadena doble, tal y como se indica en la Figura 10. Las células electroporadas se suspendieron en 2 ml de medio IMDM tal y como se ha descrito previamente en el Ejemplo 1 y después se cultivaron en placas T-12. Las concentraciones de células viables se determinaron 8 días después. Las concentraciones de mAb de IgG1 también se determinaron 8 días después utilizando técnicas estándares de nefelometría.

[0059] Los resultados de la Figura 7 muestran que las tasas de secreción de anticuerpos pueden regularse o modularse modificando los niveles de transcritos génicos de la UPR en las tasas de secreción de anticuerpos. La transfección de células C168J -con una secreción alta- con ARNs pequeños de interferencia (siRNAs) que pueden prevenir la expresión de las isoformas BiP, CHOP y XBP-1 de los genes de la UPR a partir de transcritos de ARN redujo las tasas de secreción de IgG1 por parte de las células C168J.

Ejemplo 8

Aumentar las tasas de secreción de anticuerpos aumentando los niveles de expresión y transcripción génica de la UPR

[0060] La sobreexpresión de proteínas de la UPR puede aumentar las tasas de secreción de proteínas como mAbs por parte de las células. Las líneas celulares que secretan proteínas, como las líneas celulares que secretan mAbs, se transfectan con construcciones de vectores de expresión que codifican BiP, CHOP, XBP-1 y otras proteínas asociadas con la UPR para conseguir la sobreexpresión de estas proteínas. Las células se transfectan con estas construcciones de vectores de expresión tanto de forma individual como de forma combinada. Las tasas de secreción de proteínas apropiadas, como las tasas de secreción de anticuerpos, se determinan 2, 4 y 6 días después de la transfección utilizando técnicas estándares. Las tasas de secreción de proteínas en células transfectadas se comparan con las tasas de secreción de células de control no transfectadas. Se espera que las tasas de secreción de proteínas sean más elevadas en las células que sobreexpresan una o más proteínas de la UPR. En caso de que la sobreexpresión constitutiva de BiP o XBP-1 acabe provocando la apoptosis de estas células, estos genes pueden colocarse 'aguas abajo' de un promotor inducible y activarse sólo cuando sea necesario.

Ejemplo 9

Aumentar las tasas de secreción de anticuerpos en células de mieloma transfectadas establemente con una CHOP-10 que codifica siRNA

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[0061] La transfección estable de células de mieloma C465A con construcciones de ADN que producían siRNAs específicos para CHOP-10 aumentó las tasas de secreción (Figura 8). Se diseñaron dos moléculas diferentes de siRNA dirigidas a transcritos génicos de CHOP-10 usando el 'siRNA Target Finder Tool' (
www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html) de Ambion alojado en Internet. Las moléculas se siRNA que se diseñaron eran de horquillado corto. Los ácidos nucleicos que codificaban estos siRNAs (SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16) se sintetizaron y clonaron en los sitios BamHI y HindIII del vector pSILENCER4.1-neo (Ambion Inc., Woodward, Texas, Estados Unidos) utilizando métodos estándares. La clonación de la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO: 15 en el pSILENCER4.1-neo produjo pCHOP1, mientras que la clonación de las secuencias que se muestran en SEQ ID NO: 16 en este vector produjo pCHOP2. Después, los ADNs plasmídicos de pCHOP1, pCHOP2 y pSILENCER4.1-neo se transfectaron de forma separada en células de mieloma C465A mediante electroporación. Después, las células de mieloma transfectadas establemente que contenían estos vectores se seleccionaron en un medio de SFM8 que contenía un 10% de FBS y 300 pg/ml de G418 por cultivo a 37° C en una atmósfera con un 5% de CO2. Este medio de selección también contenia un medio de selección de 1X MHX que contenía 0,5 mg/L de ácido micofenólico, 2,5 mg/L de hipoxantina y 50 mg/L de xantina para mantener una expresión estable de anticuerpos por parte de las células C465A.

[0062] Cada línea celular que se muestra en la Figura 8 se cultivó en suspensión durante seis días en un medio de SFM8 que contenía un 10% de FBS, 1X MHX y 300 pg/ml de G418. La densidad de las células viables y los títulos - o concentraciones- de los anticuerpos se determinaron a diario durante este periodo de seis días. La densidad de las células viables se analizó mediante ensayos estándares de exclusión de tinte y el título de los anticuerpos en el medio de cultivo se analizó mediante técnicas estándares de nefelometría. La línea de celulas de mieloma C465A se deriva de la línea de células mieloma SP2/0 y expresa de forma estable un mAb murino específico para TNF-alfa humano del isotipo IgG1 kappa. La línea de celulas de mieloma C2-8 es una línea celular derivada de C465A transfectada establemente con pCHOP1. La línea de celulas de mieloma C2-18 es una línea celular derivada de C465A transfectada establemente con pCHOP2. Las líneas celulares V11 y V12 son líneas celulares derivadas de C465A transfectadas establemente con pSILENCER4.1-neo solo; las dos líneas se obtuvieron de forma independiente.

[0063] Los datos obtenidos indicaron que los siRNAs específicos de CHOP-10 codificados por pCHOP1 y pCHOP2 aumentaron la productividad específica de anticuerpos en comparación con las líneas celulares de control C465A, V11 y V12 (Figura 8).

[0064] Una vez que la presente invención se ha descrito por completo, para aquellas personas con unas habilidades y conocimientos estándares en este campo resultará evidente que pueden realizarse muchos cambios y modificaciones sin apartarse por ello del alcance de las reivindicaciones anexas.

<110> Centocor Ortho Biotech Inc.

<120> Métodos para modificar las tasas de producción de proteínas

<130> P056080EP

<140>

<141>

<150> EP 05742266.9 <151> 2005-03-31

<150> PCT/US2005/010605 <151> 2005-03-31

<150> 60/558,239 <151> 2004-03-31

<160> 16

<170> PatentIn versión 3.3

<210> 1 <211> 1965 <212> ADN <213> Mus musculus

<400> 1

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Reivindicaciones

1. Un método para aumentar la tasa o ritmo de secreción celular de una proteína, que comprende los siguientes pasos:

a) modular o regular la actividad de al menos un componente de la ruta de respuesta a proteínas desplegadas (o UPR, por sus siglas en inglés) en una célula; y

b) cultivar las células,

de manera que el componente de la vía o ruta UPR es una CHOP y de manera que la actividad de la CHOP se modula transfectando establemente la célula con un ácido nucleico que codifica un ARN pequeño de interferencia (ARNip o siRNA, por sus siglas en inglés) que está dirigido a los transcritos (o transcriptos) de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína CHOP, de manera que el ácido nucleico que codifica el siRNA es la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 15 o SEQ ID nO: 16.
2. El método de la reivindicación 1, de manera que la célula es una célula de mieloma.
3. El método de la reivindicación 2, de manera que la célula de mieloma es Sp2/0, NSO, FO o Ag653.
4. El método de la reivindicación 2, de manera que la célula de mieloma es un subclón de Sp2/0, NSO, FO o Ag653.
5. El método de la reivindicación 1, de manera que la célula es una célula de ovario de hámster chino (o célula

CHO).
6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, de manera que la proteína es un anticuerpo.
7. El método de la reivindicación 1, de manera que la proteína CHOP tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 8.
8. Una célula plasmática que se obtiene modulando o regulando la actividad de la CHOP en la célula mediante un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, de manera que la célula plasmática está transfectada establemente con un ácido nucleico que codifica un ARN pequeño de interferencia (siRNA) que está dirigido a los transcritos de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína CHOP, de manera que el ácido nucleico que codifica el siRNA es la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 16.
9. La célula plasmática de la reivindicación 8, que es una célula derivada de SP2/0.
10. La célula plasmática de la reivindicación 9, que

a) secreta un anticuerpo; y/o

b) es una célula C2-8 o c2-18.

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