ES2864039T3

ES2864039T3 - Expresión de alto nivel de un anticuerpo recombinante en una célula huésped de mamífero

Info

Publication number: ES2864039T3
Application number: ES06753745T
Authority: ES
Inventors: James Rance; Stephan Kalwy; Robert Young; Robert Gay
Original assignee: Lonza Biologics PLC
Current assignee: Lonza Biologics PLC
Priority date: 2005-05-20
Filing date: 2006-05-19
Publication date: 2021-10-13
Anticipated expiration: 2026-05-19
Also published as: CA2606576A1; EP1915394B1; IL187100A0; JP2008539773A; JP4991705B2; KR20080016871A; WO2006122822A2; AU2006249087B2; KR101273829B1; AU2006249087A1; US20090215165A1; HK1120050A1; IL187100A; EP1915394A2; WO2006122822A3

Abstract

Un vector de expresión de mamífero para células huésped de ovario de hámster chino que comprende al menos una primera unidad de transcripción que contiene una primera secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera de un anticuerpo y una segunda unidad de transcripción que contiene una segunda secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada de un anticuerpo, caracterizado por que la composición de codones tanto de la primera como de la segunda secuencia de nucleótidos está adaptada al sesgo de codones de las células huésped de ovario de hámster chino.

Description

DESCRIPCIÓN

Expresión de alto nivel de un anticuerpo recombinante en una célula huésped de mamífero

La presente invención se refiere a una célula huésped de mamífero con una expresión de alto nivel de anticuerpo recombinante en donde la célula huésped contiene un vector de doble gen con secuencias de nucleótidos optimizadas por ingeniería genética que codifican las cadenas de anticuerpos ligera y pesada, al propio vector de doble gen y a un proceso para potenciar la producción de anticuerpos recombinantes en una célula huésped de mamífero.

Los anticuerpos, también llamados inmunoglobulinas, son glicoproteínas, que reconocen específicamente moléculas extrañas llamadas antígenos. Cuando antígenos extraños invaden a seres humanos u otros animales, se desencadena una respuesta inmunológica que implica la producción de anticuerpos por los linfocitos B. Mediante esta respuesta inmunológica, los microorganismos, los virus y las toxinas bacterianas pueden volverse inofensivos. En los vertebrados se conocen cinco clases de inmunoglobulinas con diferentes funciones en el sistema inmunológico: IgG, IgM, IgA, IgD e IgE. Tienen una estructura básica de dos polipéptidos de cadena pesada idénticos y dos polipéptidos de cadena ligera idénticos. Las cadenas pesada y ligera se mantienen juntas mediante puentes disulfuro e interacciones no covalentes. Las propias cadenas comprenden dominios variables y constantes. Los dominios variables de las cadenas pesada y ligera son más variables en la secuencia de aminoácidos que los dominios de la región constante y están ubicados en la parte N-terminal de la molécula de anticuerpo. Los dominios variables de cadena pesada y ligera contienen cada uno tres tramos de secuencia de región determinante hipervariable o complementaria (CDR, por sus siglas en inglés) que juntos forman el sitio único de reconocimiento de antígeno.

Se pueden diseñar varios fragmentos de unión a antígenos funcionales mediante proteólisis de anticuerpos, por ejemplo, mediante digestión con papaína, digestión con pepsina u otros planteamientos enzimáticos, produciendo, por ejemplo, fragmentos Fab, F(ab^')2o Fv. El desarrollo de la tecnología del ADN recombinante condujo al diseño de varios anticuerpos y fragmentos de anticuerpos nuevos. Por ejemplo, las funcionalidades de estas proteínas se han alterado, dando como resultado funciones nuevas y mejoradas. Por tanto, es posible reducir las propiedades inmunológicas no deseadas en aplicaciones médicas. Además, se pueden expresar fragmentos de anticuerpos recombinantes más pequeños que tienen la ventaja sobre los anticuerpos completos en aplicaciones que requieren penetración tisular y rápida eliminación de la sangre.

Las moléculas de anticuerpos diseñados y sus fragmentos se explotan cada vez más como herramientas científicas y clínicas para la terapia y el diagnóstico de enfermedades.

La capacidad única de los anticuerpos para reconocer específicamente y unirse con alta afinidad a prácticamente cualquier tipo de antígeno los hace atractivos como punto de partida para nuevos productos biofarmacéuticos y la investigación científica. Se pueden considerar más aplicaciones fuera de la investigación y la medicina, como las aplicaciones para el consumidor. Algunos ejemplos son el uso de anticuerpos en champús para prevenir la formación de caspa o en pasta de dientes para prevenir caries y para proteger contra el deterioro dental causado por caries, respectivamente. Otras aplicaciones concebibles incluyen, por ejemplo, el uso en biosensores, el tratamiento de aguas residuales, procesos de separación a escala industrial o como abzimas, es decir, el uso de un anticuerpo creado artificialmente como enzima. Un uso completamente diferente de la capacidad de unión de los fragmentos de anticuerpos es el diseño de proteínas de fusión. Por ejemplo, el extremo 3' del gen de la región constante de la cadena pesada se fusiona con el extremo 5' de un gen enzimático. Si el anticuerpo tiene, por ejemplo, especificidad por un antígeno tumoral entonces la fusión puede usarse para administrar una toxina o enzima tóxica a una célula tumoral con el fin de matarla selectivamente. Alternativamente, un quelato (capaz de unirse a un radioisótopo) puede acoplarse químicamente a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo antitumoral recombinante, matando también selectivamente las células tumorales. En la medicina humana, estos planteamientos se denominan a veces “bala mágica”.

Sin embargo, para estos fines se requieren grandes cantidades de anticuerpos. Se encuentran disponibles varios sistemas de expresión, tanto de origen procariótico como eucariótico. La elección del sistema depende de muchos factores, incluida la especie molecular que se expresa y la secuencia precisa del anticuerpo individual. Uno de los sistemas de expresión más utilizados para proteínas recombinantes, incluidos los anticuerpos, es el sistema de expresión de mamífero de células de ovario de hámster chino (CHO, por sus siglas en inglés). Es uno de los pocos tipos de células que permite un cultivo por lotes en suspensión de alta densidad simple y eficiente de células animales. Las células CHO permiten rendimientos de producto muy altos y son comparativamente resistentes al estrés metabólico. Mediante la expresión de proteínas recombinantes en células CHO es posible lograr un patrón de glicosilación que es similar pero no idéntico al obtenido a partir de células humanas.

Recientemente, el rendimiento de anticuerpos recombinantes en células CHO se ha mejorado enormemente mediante la optimización de la composición del medio de cultivo, el diseño del biorreactor y los parámetros del cultivo celular. Por lo tanto, se ha logrado un gran avance para lograr un crecimiento de alta densidad, una alta productividad específica y una viabilidad prolongada de las células cultivadas. Además, la mejora del rendimiento a nivel transcripcional se ha optimizado ampliamente, utilizando los promotores y los elementos potenciadores más fuertes posibles de origen principalmente viral. Además, los estudios comparativos sobre sistemas de vectores y células huésped mostraron que el uso de vectores en tándem, en los que se insertaron unidades de transcripción de genes pesados y ligeros, dio como resultado niveles de producción de anticuerpos mucho más altos en comparación con el uso de una mezcla de cada vector de cadena pesada y vector de cadena ligera.

Sin embargo, a pesar de la tecnología de expresión genética refinada, los niveles aparentes de expresión de anticuerpos aún pueden variar hasta 200 veces. Según Bentley et al., Hybridoma, 17 (1998), 559-567, cada anticuerpo se expresa con una eficacia característica, determinada por una combinación de factores que incluyen el nivel de síntesis de cadenas ligeras y la “compatibilidad” de cadenas ligeras y pesadas. Según Strutzenberger et al., J. Biotechnol., 69 (1999), 215-226, una alta tasa de expresión de la cadena ligera es beneficiosa para aumentar las tasas de secreción del anticuerpo completo. Demostraron que, en un sistema de expresión basado en células CHO, la reducción de la expresión de la cadena ligera conducía a una baja concentración intracelular de cadena ligera y a la acumulación de cadena pesada en el retículo endoplasmático debido a la retención por parte de las chaperonas. Borth et al., J. Biotechnol., 8 (1999), 57-66, analizaron el contenido de ARNm de cadena ligera y pesada intracelular y sus respectivos polipéptidos y las tasas de secreción específicas de tres subclones con tasas de producción específicas baja, media y alta. Para los tres subclones se encontró una correlación entre el contenido intracelular en la cadena ligera y la tasa de secreción, mientras que el contenido intracelular en la cadena pesada fue el mismo para los tres subclones. Los autores concluyen que el ensamblaje en el retículo endoplasmático es uno de los principales factores limitantes de la tasa en la producción de anticuerpos. Smales et al., Biotechnol. Bioeng., 88 (4) (2004), 474-488, describen que en las líneas celulares GS-NSO que producen anticuerpos monoclonales recombinantes, el contenido de cadenas ligeras intracelulares es significativamente mayor que el contenido pesado intracelular. Concluyen que la relación molar intracelular fue de aproximadamente 10:1.

Por tanto, es completamente posible que a lo largo del sistema de producción de anticuerpos una porción considerable de cadenas ligeras y pesadas no se ensamble adecuadamente en inmunoglobulina tetramérica. En primer lugar, existen problemas de ensamblaje de las cadenas de proteínas monoméricas; incluso en presencia de un 70% de cadena ligera de IgG libre, pueden detectarse cantidades considerables de cadena pesada de IgG monomérica. El exceso de cadena ligera también se puede verter en el medio de cultivo celular junto con el anticuerpo monoclonal (mAb, por sus siglas en inglés) funcional y completamente ensamblado. La simple ley química de acción de masas no se aplica en una célula. Los esfuerzos para elevar selectivamente el nivel de expresión de la cadena pesada no han tenido éxito. Gass et al., Trends Immunol. 25 (1) (2004), 17-24, sugieren que en las células plasmáticas, que son células B secretoras de anticuerpos naturales, el mejor título de mAb alcanzable se alcanza en presencia de un exceso de cadena ligera.

Las explicaciones probables también son el ensamblaje ineficaz y/o la degradación selectiva prematura de la cadena pesada seleccionando el proteosoma como diana; es sabido que el control de calidad y la sincronización de las degradaciones implican el marcado con glucosa de los restos de carbohidratos. El ensamblaje de dominios proteicos puede ser impulsado por interacciones de afinidad, la formación de enlaces disulfuro que ponen los dominios en estrecha proximidad y/o la necesidad de enterrar parches hidrófobos expuestos en la superficie de dominios individuales; en la etapa inicial de ensamblaje y plegado, se cree que tales parches están protegidos por proteínas chaperonas. Ahora es bien sabido que la glicoproteína secretora se pliega y ensambla en complejos de orden superior en el compartimento del retículo endoplasmático (RE) interno de la célula poco después de la síntesis de proteínas. El RE es el único compartimento que comprende factores de ensamblaje auxiliares específicos junto con el mecanismo de control de calidad (Ellgaard et al., Quality control in the secretary pathway, Science, 3 de diciembre de 1999; 286:1882-8; Helenius et al., Intracellular functions of N-linked glycans, Science, 23 de marzo de 2001; 291:2364-9). Una vez que ha pasado el punto de ensamblaje con éxito, no tendrá lugar ningún ensamblaje adicional a medida que avanza el paso a través del sistema secretor de la célula. De hecho, algunos tipos de células, como las células CHO, secretan cadenas no ensambladas de ambos tipos, mientras que otras, como las células NSO, retienen cadenas selectivamente no ensambladas del tipo pesado de IgG únicamente y probablemente las dirigen a sistemas degradativos.

Estudios previos han correlacionado los cambios en la producción de anticuerpos monoclonales recombinantes específicos con la abundancia celular de proteínas del sistema secretor que ocurren como consecuencia de cambios en cualquiera de los entornos celulares (Lambert y Merten, Biotechnol. Bioeng., 54 (2) (1997), 165-180) o del tiempo en cultivo (Downham et al., Biotechnol. Bioeng., 51 (6) (1996), 691-696). Por tanto, la sobreexpresión de chaperonas y foldasas del RE se ha utilizado para modificar la tasa de secreción de anticuerpos recombinantes por las células eucariotas. Por ejemplo, el documento WO 03/057897 enseña un método para expresar una proteína recombinante que comprende la coexpresión de proteínas chaperonas y pequeñas proteínas de choque térmico. Se dice que esas proteínas adicionales promueven el plegado y el ensamblaje con éxito y, por lo tanto, la porción de proteína de producto más activa correctamente plegada.

Sin embargo, la sobreexpresión de chaperonas individuales y foldasa no ha aumentado la producción de anticuerpos monoclonales en células de mamífero. Por ejemplo, se demostró que la sobreexpresión de BIP en células de mamífero redujo la secreción de proteínas con las que se asocia (Dorner y Kaufman, Biologicals, 22 (2) (1994), 103-112) y que la sobreexpresión de PDI en células CHO disminuyó la secreción de una proteína de fusión rica en disulfuro (Davis et al., Biotechnol. Prog., 16 (5) (2000), 736-743). Por tanto, la coexpresión de varios factores auxiliares puede disminuir la tasa de expresión total del producto proteico y requiere una optimización cuidadosa de las tasas de coexpresión individuales de dichos factores auxiliares. Diferentes productos de proteína pueden depender en un grado variable de las funciones de chaperonas individuales, solo parcialmente superpuestas, de las cuales se conocen una multitud hasta la fecha; por ejemplo, GroEL, GroES, DnaK, DnaJ, GrpE, CIpB, IbpA, Ibp. Por lo tanto, parece que no es deseable ni posible coexpresarlos todos a la vez a expensas exclusivas de la tasa de producción de proteínas del producto.

El problema técnico que subyace a la presente invención es evitar las desventajas de la técnica anterior y proporcionar nuevos medios y procesos para mejorar la producción de anticuerpos en una célula huésped de mamífero que permita la producción de alto nivel de anticuerpo IgG completo tetramérico estándar que tiene actividad de receptor Fc y que consta de al menos dos cadenas polipeptídicas diferentes.

La presente invención resuelve este problema técnico al proporcionar un vector de expresión de mamífero para células huésped de ovario de hámster chino que comprende al menos una primera unidad de transcripción que contiene una primera secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera de un anticuerpo y una segunda unidad de transcripción que contiene una segunda secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada de un anticuerpo, caracterizado porque la composición de codones tanto de la primera como de la segunda secuencia de nucleótidos está adaptada al sesgo de codones de las células huésped de ovario de hámster chino.

También se describe en el presente documento un vector de expresión de mamífero que comprende al menos una primera unidad de transcripción que contiene una primera secuencia de nucleótidos sintética que codifica una primera cadena de polipéptidos y una segunda unidad de transcripción que contiene una segunda secuencia de nucleótidos sintética que codifica una segunda cadena de polipéptidos, basándose las secuencias de nucleótidos sintéticas primera y segunda en secuencias de nucleótidos de origen natural, y pudiendo formar las cadenas polipeptídicas primera y segunda una molécula que comprende al menos una o varias copias de cada una de las cadenas polipeptídicas primera y segunda, caracterizado porque la composición de codones tanto de la primera secuencia de nucleótidos como de la segunda está adaptada al sesgo de los codones de los genes de una especie huésped de mamífero dada que es diferente de la especie de mamífero de la que se derivaron originalmente las secuencias de nucleótidos de origen natural.

Por tanto, la presente invención proporciona un vector de expresión de mamífero con secuencias de nucleótidos adaptadas al sesgo de codones de las células CHO, es decir, secuencias de nucleótidos optimizadas por ingeniería genética. Los inventores de la presente invención han probado el vector de doble gen de la invención que comprende genes optimizados por ingeniería genética de las cadenas ligeras y pesadas en el sistema de expresión de células CHO de mamíferos, en el que las secuencias de aminoácidos de las cadenas ligera y pesada no fueron alteradas por la optimización génica. De manera sorprendente e inesperada, se encontró que el uso de un vector en el que se habían optimizado por ingeniería genética los genes de las cadenas pesada y ligera elevaba significativamente el nivel medio de producción de anticuerpos de 37,8 pg/ml a 51,3 pg/ml. Por el contrario, la expresión de una cadena pesada optimizada por ingeniería genética sola en combinación con una cadena ligera no optimizada no fue suficiente para mejorar el nivel de expresión del anticuerpo. Por tanto, mediante el uso del vector de expresión de doble gen de mamífero de la invención que comprende genes optimizados por genes para las cadenas pesada y ligera, es posible lograr un rendimiento total notablemente mayor de anticuerpo secretado en comparación con los vectores de control que contienen un gen optimizado por ingeniería genética y un gen no optimizado o vectores de control en los que los genes de cadena ligera y pesada no están optimizados por ingeniería genética. El nivel notablemente mejorado de producción de anticuerpos obtenido por el vector con genes de cadena pesada y ligera optimizados por ingeniería genética debe atribuirse a los genes de cadena pesada y ligera optimizados por ingeniería genética.

Los resultados adicionales obtenidos por los inventores de la presente invención indican que es ventajoso optimizar todas las secuencias de genes codificantes y no solo ciertas partes de las mismas. Por ejemplo, si solo se optimizaban por ingeniería genética los extremos N de los genes de las cadenas ligera y pesada, la producción total de anticuerpos no aumentaba o solo aumentaba ligeramente.

Los resultados obtenidos por los inventores de la presente invención contrastan marcadamente con las observaciones descritas en la técnica anterior. Por la técnica anterior se sabe que existe una correlación entre el contenido intracelular de la cadena ligera y la tasa de secreción específica del anticuerpo, lo que sugiere que la cadena ligera debe expresarse en exceso en comparación con la cadena pesada para lograr un alto nivel de producción de anticuerpos, y, si no es así, la cadena pesada se acumulará en el retículo endoplasmático debido a la retención de las chaperonas. Por el contrario, los resultados de los inventores sugieren más bien que también en los sistemas de expresión de mamíferos la expresión de la cadena ligera y la expresión de la cadena pesada deben equilibrarse para lograr un alto nivel de producción de anticuerpo secretado. Sin desear entrar en consideraciones teóricas particulares, se cree que para lograr un alto nivel de producción de anticuerpo no es suficiente tener solo una reserva intracelular aumentada de cadenas ligeras. Parece que también es necesaria una gran reserva intracelular de cadenas pesadas.

Además, los resultados de los presentes inventores muestran que no solo el ensamblaje en el retículo endoplasmático es uno de los principales factores limitantes de la tasa en la producción de anticuerpos, sino también la regulación de la transcripción y la regulación de la estabilidad del ARNm. Dado que la optimización génica utilizada por los inventores no alteró las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera, la mayor producción de anticuerpos no puede atribuirse a un ensamblaje alterado de las cadenas o a una degradación asociada al RE alterado de las cadenas polipeptídicas mal plegadas o desplegadas. El aumento de la producción de anticuerpos obtenida por el vector de doble gen en el que tanto los genes de la cadena pesada como de la cadena ligera habían sido optimizados por ingeniería genética sugiere más bien que la eficiencia transcripcional y la estabilidad del ARNm se optimizaron debido a la eliminación de motivos de secuencia que actúan en cis, como cajas TAT internas, sitios chi, secuencias de repetición, sitios de empalme críptico, etc. que conducen a una mayor eficiencia de traducción de los genes respectivos.

Por lo tanto, la presente invención resuelve el problema técnico subyacente al proporcionar un vector de expresión de mamífero para células huésped de ovario de hámster chino que comprende al menos una primera unidad de transcripción que contiene una primera secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera de un anticuerpo y una segunda unidad de transcripción que contiene una segunda secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada de un anticuerpo, caracterizado porque la composición de codones tanto de la primera como de la segunda secuencia de nucleótidos está adaptada al sesgo de codones de las células huésped de ovario de hámster chino.

También se describe en el presente documento un vector de expresión de mamífero que comprende al menos una primera unidad de transcripción que contiene una primera secuencia de nucleótidos sintética que codifica una primera cadena de polipéptidos y una segunda unidad de transcripción que contiene una segunda secuencia de nucleótidos sintética que codifica una segunda cadena de polipéptidos en donde las secuencias de nucleótidos sintéticas primera y segunda se basan en secuencias de nucleótidos de origen natural y en donde las cadenas polipeptídicas primera y segunda pueden formar una molécula que comprende al menos una o varias copias de cada una de las cadenas polipeptídicas primera y segunda, caracterizado porque la composición de codones tanto de la primera como de la segunda secuencia de nucleótidos está modificada de modo que sus ARNm se traduzcan con mayor eficacia.

En el contexto de la presente divulgación, “una molécula que comprende al menos una o múltiples copias de cada una de las cadenas polipeptídicas primera y segunda” es una molécula de múltiples subunidades, en particular una molécula secretora de múltiples subunidades. La molécula puede constar de una o más copias de cada una de dos cadenas polipeptídicas diferentes. La molécula puede comprender más de dos cadenas polipeptídicas diferentes. En una realización preferida, la molécula es un anticuerpo secretor. Como se describe en el presente documento, la molécula puede ser otra proteína que consta de diferentes cadenas o subunidades polipeptídicas. Ejemplos de tales proteínas de múltiples subunidades incluyen, sin limitación, una enzima de múltiples subunidades, una molécula receptora y un canal iónico.

En el contexto de la presente invención, un “vector de expresión de mamífero” es una molécula de ADN, preferiblemente aislada y purificada, que, tras la transfección en una célula huésped de mamífero apropiada, proporciona un alto nivel de expresión de ambas cadenas polipeptídicas dentro de la célula huésped.

El vector de expresión de mamífero según la presente invención comprende al menos dos unidades de transcripción separadas. Un vector de expresión con dos unidades de transcripción separadas también se denomina vector de doble gen. En el doble gen reivindicado, la primera secuencia de nucleótidos sintética o el primer gen de la primera unidad de transcripción codifica la cadena ligera de un anticuerpo y la segunda secuencia de nucleótidos sintética de la segunda unidad de transcripción codifica la cadena pesada de un anticuerpo. Otro ejemplo descrito en el presente documento es un vector de doble gen en el que las dos secuencias de nucleótidos sintéticas codifican dos subunidades diferentes de una proteína, tal como una enzima.

Sin embargo, también es posible que el vector de expresión de la invención comprenda más de dos unidades de transcripción separadas —por ejemplo, tres, cuatro o incluso más unidades de transcripción separadas— , cada una de las cuales comprende una secuencia de nucleótidos sintética diferente que codifica una cadena polipeptídica diferente. En el presente documento se describe un vector con cuatro unidades de transcripción separadas, cada una de las cuales contiene una secuencia de nucleótidos sintética diferente que codifica una subunidad de una enzima que consta de cuatro subunidades diferentes.

En el contexto de la presente invención, el término “optimización génica” significa una técnica mediante la cual se introducen múltiples alteraciones en una secuencia de nucleótidos natural, tal como un gen de interés, que da como resultado la generación de una nueva secuencia de nucleótidos sintética. En el contexto de la presente invención, “secuencia de nucleótidos sintética” significa, por lo tanto, una secuencia de nucleótidos que se deriva por optimización génica a partir de una secuencia de nucleótidos natural. La secuencia de nucleótidos natural puede ser una secuencia genómica o un ADNc obtenido a partir de una secuencia genómica y que carece de secuencias intrónicas.

El objetivo de la optimización génica es aumentar la eficiencia de traducción del gen y garantizar su expresión óptima en un organismo diana o en un tejido o una célula de este organismo diana, por lo que el organismo diana es diferente del organismo del cual se derivó originalmente la secuencia de nucleótidos. En función de la diferente abundancia de diferentes ARN de transferencia degenerados en diferentes especies, cada organismo tiene su elección preferida de uso de codones. Las proteínas que presentan en un organismo o especie dados el nivel más alto de expresión tienen un alto sesgo de codones (es decir, el grado en que tienden a utilizarse en un gen los mismos codones para aminoácidos).

Por tanto, la optimización génica incluye la sustitución de al menos un codón existente de la secuencia de nucleótidos natural con un codón sinónimo preferiblemente utilizado en el organismo diana. El codón sinónimo corresponde a un iso-ARNt que, en comparación con el iso-ARNt correspondiente al codón reemplazado, se encuentra en mayor abundancia en la célula u organismo diana.

En la presente invención, la composición de codones de las secuencias de nucleótidos primera y segunda está adaptada al sesgo de codones de genes de células huésped CHO.

Como se describe en el presente documento, la composición de codones de las secuencias de nucleótidos primera y segunda está adaptada al sesgo de codones de los genes de Homo sapiens.

La expresión génica eucariota es un mecanismo complejo que puede regularse en los niveles transcripcional, postranscripcional, traduccional y postraduccional. Los experimentos con levaduras han demostrado que el 80% del proteoma se expresa durante el crecimiento exponencial y que el 85% de los ribosomas están involucrados en la traducción, lo que sugiere que los ARNm tienen que competir por los ribosomas. Los estudios de los presentes inventores sobre líneas celulares NSO que producen un anticuerpo quimérico han revelado además que el ARNm recombinante representa aproximadamente el 20% del ARNm total. Esto sugiere que la demanda de ribosomas excede los recursos celulares y, por lo tanto, la escasez de ribosomas puede impedir el mantenimiento y el crecimiento celulares.

La regulación de la estabilidad del ARNm es un componente importante de la regulación de la expresión génica. Las características estructurales de los ARNm individuales pueden influir en el proceso de traducción. En eucariotas superiores se ha demostrado que, por ejemplo, la longitud de la secuencia delantera, la presencia de una estructura secundaria cadena arriba o cadena abajo del codón de iniciación y la longitud del terminal poli (A) pueden afectar la eficacia de la traducción del ARNm. Las estructuras secundarias estables dentro de una secuencia delantera pueden impedir el escaneo de la subunidad ribosómica 40S en su búsqueda del codón de iniciación y, por lo tanto, inhibir la traducción. Se sabe que existen secuencias de consenso que actúan en cis y motivos de secuencia que están implicados en la determinación de la estabilidad del ARNm. Las interacciones cooperativas de elementos en ácidos nucleicos también están involucradas en la restricción de la expresión de genes celulares en los niveles postranscripcionales. Dichas secuencias inhibidoras (INS, por sus siglas en inglés) son activas dentro de los ARNm. Además, varios ARNm virales y celulares han desarrollado elementos reguladores —es decir, elementos del sitio de entrada del ribosoma interno (IRES, por sus siglas en inglés)— dentro de la secuencia delantera que funcionan a través de mecanismos independientes del casquete para promover la unión de la subunidad ribosómica 40S internamente a un ARNm.

La optimización génica también incluye alteraciones que mejoran la eficiencia transcripcional de una secuencia de nucleótidos sintética y confieren al ARNm una estabilidad mejorada y/o aumentan la eficiencia de traducción del ARNm.

Por tanto, la optimización génica incluye alteraciones en el contenido de GC o la distribución de GC en una o ambas secuencias de nucleótidos sintéticas en comparación con las secuencias de nucleótidos naturales. Por tanto, la divulgación se refiere a un vector de expresión de mamífero en el que las dos secuencias de nucleótidos sintéticas tienen un contenido de GC y/o una distribución de GC que son diferentes de las correspondientes secuencias de nucleótidos de origen natural. Un contenido de GC “diferente” significa que la secuencia de nucleótidos sintética puede tener un contenido de GC mayor o menor que la secuencia de nucleótidos de origen natural dependiendo de la célula huésped de mamífero diana. En particular, en una o ambas secuencias de nucleótidos sintéticas, el contenido de GC de la 5'UTR se reduce en comparación con las correspondientes secuencias de nucleótidos de origen natural. Además, en una o en ambas secuencias de nucleótidos sintéticas, el contenido de GC de la 3'UTR aumenta en comparación con las correspondientes secuencias de nucleótidos de origen natural.

En otro aspecto, una o ambas de las dos secuencias de nucleótidos sintéticas tienen un contenido de AT y/o una distribución de AT que es diferente de la de las correspondientes secuencias de nucleótidos de origen natural. En particular, en una o ambas secuencias de nucleótidos sintéticas, el contenido de AT de la 3'UTR está reducido en comparación con las correspondientes secuencias de nucleótidos de origen natural.

En otro aspecto más, en una o ambas secuencias de nucleótidos sintéticas, la longitud de la 3'UTR y/o la 5'UTR está alterada en comparación con las correspondientes secuencias de nucleótidos de origen natural. En particular, la longitud de la 3'UTR está incrementada. En particular, la longitud de la 5'UTR se ajusta a aproximadamente 60 pb.

En otra realización preferida, una o ambas de las dos secuencias de nucleótidos sintéticas contienen menos motivos de secuencia que actúan en cis que las correspondientes secuencias de nucleótidos de origen natural. “Menos motivos de secuencia que actúan en cis” significa que la secuencia de nucleótidos de origen natural tiene al menos un motivo de secuencia que actúa en cis más en comparación con la secuencia de nucleótidos sintética. Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos sintética tiene menos del 95%, menos del 90%, menos del 80%, menos del 70%, menos del 60%, menos del 50%, menos del 40%, menos del 30%, menos del 20% o incluso menos del 10% de todos los motivos de secuencia que actúan en cis presentes en la secuencia de nucleótidos de origen natural. Lo que más se prefiere es que la secuencia de nucleótidos sintética no tenga ningún motivo de secuencia que actúe en cis. Se prefiere que la optimización génica incluya en particular alteraciones de motivos de secuencia que actúan en cis que están presentes en 5'UTR y 3'UTR.

“Motivos de secuencia que actúan en cis” o “elementos de secuencia que actúan en cis” incluyen, entre otros, cajas TATA internas, sitios chi, sitios de entrada ribosómica como sitios IRES, tramos de secuencia ricos en AT o ricos en elementos de secuencias de GC, ARE, INS o CRS, secuencias de repetición que pueden afectar a la estabilidad del ARN, sitios donadores y aceptores de empalme críptico, etc. Por lo tanto, las dos secuencias de nucleótidos sintéticas contienen preferiblemente menos cajas TATA internas, sitios chi y/o sitios de entrada ribosómica que la secuencia de nucleótidos de origen natural. Las dos secuencias de nucleótidos sintéticas también pueden contener menos elementos de secuencia de ARE, INS y/o CRS que la secuencia de nucleótidos de origen natural. Además, las dos secuencias de nucleótidos sintéticas pueden contener secuencias menos repetidas en comparación con la secuencia de nucleótidos de origen natural, de modo que su ARN formará menos estructuras secundarias que las secuencias de nucleótidos de origen natural. Además, las dos secuencias de nucleótidos sintéticas pueden contener sitios donadores y aceptores de empalme menos crípticos que la secuencia de nucleótidos de origen natural.

En una realización de la presente invención, la optimización génica incluye solo alteraciones de un tipo particular de motivos de secuencia que actúan en cis, tales como alteración y/o eliminación de elementos ARE presentes en la secuencia de nucleótidos de origen natural. En otra realización, la optimización génica incluye la alteración y/o la eliminación de dos o más tipos de motivos de secuencia que actúan en cis presentes en la secuencia de nucleótidos de origen natural; por ejemplo, eliminación de cajas TATA y elementos de secuencia ARE y sitios donadores y aceptores de empalme críptico. En otra realización más, la optimización génica incluye la alteración y/o la eliminación de todos los tipos imaginables de motivos de secuencia que actúan en cis. La optimización génica de las secuencias de nucleótidos sintéticas primera y segunda puede incluir la alteración y/o la eliminación de diferentes motivos de secuencia que actúan en cis.

La optimización génica incluye alteraciones que eliminan sitios de iniciación alternativos como uCDS y uAUG. Por tanto, la presente divulgación también se refiere a vectores de expresión de mamíferos en los que una o ambas de las dos secuencias de nucleótidos sintéticas contienen menos sitios de iniciación alternativos que las correspondientes secuencias de nucleótidos de origen natural.

En una realización de la presente invención, la secuencia de nucleótidos completa que codifica una cadena de anticuerpo está optimizada por ingeniería genética. En una realización adicional, solo ciertas regiones de la secuencia de nucleótidos están optimizadas por ingeniería genética. Un ejemplo de esto es la optimización génica del extremo N de la secuencia de nucleótidos. Según la invención, por supuesto, es posible que las secuencias primera y segunda de nucleótidos sintéticas sean el resultado de diferentes optimizaciones génicas. Por ejemplo, es posible que en una de las dos secuencias de nucleótidos sintéticas la secuencia completa esté optimizada por ingeniería genética mientras que en la otra secuencia sintética solo una parte de la secuencia esté optimizada por ingeniería genética. Sin embargo, también es posible que en las secuencias de nucleótidos sintéticas se alteren diferentes características. Por ejemplo, en una de las secuencias de nucleótidos sintéticas solo se alteró el contenido de GC, mientras que en la otra secuencia de nucleótidos sintéticas solo se eliminaron ciertos elementos que actúan en cis.

En una realización particularmente preferida de la invención, la optimización génica no da como resultado secuencias de aminoácidos alteradas; es decir, las cadenas de anticuerpos primera y segunda codificadas por las secuencias de nucleótidos sintéticas tienen las mismas secuencias de aminoácidos que las correspondientes cadenas de anticuerpos codificadas por las secuencias de nucleótidos de origen natural.

Sin embargo, según la invención, por supuesto, es posible que la optimización génica conduzca a una secuencia de aminoácidos alterada de una o ambas cadenas de anticuerpos codificadas por las secuencias de nucleótidos sintéticas; es decir, la primera cadena de anticuerpo codificada por la primera secuencia de nucleótidos sintética o la segunda cadena de anticuerpo codificada por la segunda secuencia de nucleótidos sintética o ambas tienen secuencias de aminoácidos diferentes de las correspondientes cadenas de anticuerpos codificadas por las secuencias de nucleótidos de origen natural. Un ejemplo preferido se refiere a cadenas de anticuerpos que tienen menos sitios de glicosilación o sitios de glicosilación modificados en comparación con las correspondientes cadenas de anticuerpos codificadas por las secuencias de nucleótidos de origen natural.

La invención se refiere a un vector de expresión de mamífero, en el que la primera secuencia de nucleótidos sintética codifica la cadena ligera de un anticuerpo y la segunda secuencia de nucleótidos sintética codifica la cadena pesada de un anticuerpo. Preferiblemente, tras la expresión, las cadenas polipeptídicas primera y segunda pueden formar un anticuerpo o inmunoglobulina. En otra realización preferida, las secuencias primera y/o segunda de nucleótidos sintéticas se fusionan con el gen de una proteína efectora. En este caso, tras la expresión, las cadenas polipeptídicas primera y segunda pueden formar una proteína de fusión, acoplándose una proteína efectora a un anticuerpo o inmunoglobulina.

Una inmunoglobulina según la presente invención puede tener actividad de receptor de Fc o actividad de activación del complemento o ambas. Aunque la activación del complemento está claramente definida en la técnica en relación con la inducción de la cascada del complemento (por vías posiblemente diferentes), la actividad del receptor Fc en el contexto de la presente invención debe entenderse como la activación de los receptores Fc celulares que desencadenan una respuesta celular; por ejemplo, en el caso de IgG o IgA de origen natural, actividades fagocíticas o citotóxicas o, por ejemplo, en el caso de la liberación de gránulos de mastocitos tras la activación de receptores celulares por inmunoglobulina de clase IgE natural. De manera similar, entre los anticuerpos naturales, los anticuerpos de clase IgM e IgG pueden desencadenar la activación del complemento. Ni que decir tiene que cualquiera de dichas actividades efectoras puede variar entre las subclases de anticuerpos de origen natural y sus alotipos conocidos y, por consiguiente, puede variar entre los anticuerpos de la presente invención. Sin embargo, en el contexto de la presente invención, es posible que la actividad del receptor Fc o los dominios efectores de activación del complemento se modifiquen por ingeniería genética en cualquier estructura de inmunoglobulina dada mediante intercambio de dominios, transfiriendo o añadiendo eficazmente las respectivas propiedades efectoras en dicha inmunoglobulina resultante.

La inmunoglobulina puede ser un tipo de inmunoglobulina de origen natural, además de su unión específica para un antígeno dado, o puede ser un tipo de inmunoglobulina artificial modificado por ingeniería genética. Esto incluye anticuerpos quiméricos de especie o anticuerpos injertados con CDR, anticuerpos creados por mezcla de genes o ingeniería dirigida al sitio, anticuerpos modificados químicamente con PEG o restos quelantes de radioisótopos o proteínas de fusión que unen un resto de inmunoglobulina que tiene dicha actividad mencionada anteriormente con cualquier otro resto proteico, tal como otro dominio enzimáticamente activo. La medida en que una determinada inmunoglobulina confiere cada actividad puede variar. Ambos tipos de función efectora están causados por las regiones de porción constante de la cadena pesada de inmunoglobulina; por ejemplo, las diferentes subclases de IgG humana varían en su eficacia relativa para activar y amplificar las etapas de la cascada del complemento. En general, las IgG1 e IgG3 humanas fijan el complemento de forma más eficaz, la IgG2 es menos eficaz y la IgG4 no activa el complemento. Los formatos de ensayo para probar cualquiera de las actividades antes mencionadas son bien conocidos por los inmunólogos y otras personas; los protocolos adecuados pueden encontrarse, por ejemplo, en manuales de laboratorio de inmunoquímica estándar, como Harlow et al., Antibodies—a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1988. En la inmunoglobulina de origen natural, por ejemplo, las cadenas ligeras tienen un único dominio de región constante y las cadenas pesadas tienen varios dominios de región constante. Todas las subclases humanas IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 median las funciones efectoras citotóxicas a través de porciones de cadena constante (ADCC: citotoxicidad dirigida por anticuerpos, por sus siglas en inglés), producidas por la interacción del anticuerpo con células asesinas/linfocitos T citotóxicos; esto es bastante notable, porque a menudo se ha dicho que la IgG4 no media en tales efectos. Sin embargo, se ha encontrado que, sistemáticamente, la IgG4 humana es intrínsecamente capaz de mediar la ADCC, mientras que su extensión es fuertemente modulada/dependiente de la fuente de células efectoras usadas en los ensayos, tales como la liberación de 51Cr, debido a un polimorfismo natural distinto en al menos los seres humanos. Esto ha sido demostrado por Greenwood J, Clark M, Waldmann H.: Structural motifs involved in human IgG antibody effector functions Eur J Immunol 1993; 5:1098-1104.

Las clases IgG e IgA de anticuerpos o inmunoglobulinas de origen natural tienen naturalmente tres dominios de región constante, denominados CH1, CH2 y CH3, y las clases IgM e IgE tienen cuatro dominios de región constante. En cambio, por ejemplo, el documento WO02/056910 diseña anticuerpos artificiales para terapia humana que están desprovistos del dominio CH1; dichos anticuerpos también están abarcados por la noción de inmunoglobulina según la presente invención.

Preferiblemente, la molécula de inmunoglobulina o Ig comprende al menos un dominio bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3 o variantes funcionales de los mismos. Esos dominios forman la parte esencial de Fc, por ejemplo, en la IgG natural. Las descripciones y definiciones detalladas de estos elementos estructurales de una inmunoglobulina se definen en Amzel et al., Three-dimensional structure of immunoglobulins, Ann. Rev. Biochem. 48, 961-997 (1979); Davies et al., Structural basis of antibody function, Ann. Rev. Immunol. 1, 87-117 (1983); Hunkapiller et al., Diversity of immunoglobulin gene superfamily, Adv. Immunol. 44, 1 -63 (1989). Dichos dominios pueden ser dominios de origen natural, versiones quiméricas creadas artificialmente de tales dominios o conjuntos quiméricos de tales dominios o versiones diseñadas por ingeniería; por ejemplo, por mutagénesis dirigida al sitio. En el pasado, a menudo se usaban anticuerpos quiméricos humanos de ratón injertados con CDR quiméricas; asimismo, los sitios de glicosilación potenciales en las porciones de dominio variable o CH1/CL se eliminaban a menudo mediante mutagénesis dirigida al sitio. Por supuesto, el grado de ingeniería de cualquier parte de la inmunoglobulina según la presente invención a menudo puede estar limitado por la necesidad de evitar la creación de motivos extensos, fuertemente inmunogénicos en el anticuerpo diseñado, aparte de la variabilidad natural inherente a las regiones determinantes de complementariedad. Aparte de esto, para el resto de unión al antígeno aguas arriba de la porción de bisagra que se denomina convencionalmente porción Fv (que comprende los dominios V^hy V^l) de, por ejemplo, un anticuerpo de tipo IgG, el único requisito según la presente invención es que dicha porción esté formada por dos cadenas polipeptídicas distintas (cuando se secretan) y tenga alguna propiedad de unión al antígeno. Es posible que una inmunoglobulina según la presente invención tenga una valencia de unión a antígeno aumentada lograda por dominios variables multiplicados dispuestos en forma de “perla en un hilo” en el formato Fv de unión a antígeno.

En una realización particularmente preferida de la invención, la primera secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera de un anticuerpo comprende la secuencia representada en SEQ ID No. 3 y la segunda secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada de un anticuerpo comprende la secuencia representada en SEQ ID No. 1. La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera codificada por la SEQ ID No. 3 se representa en la SEQ ID No. 4. La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada codificada por la SEQ ID No. 1 se representa en la SEQ ID No. 2.

Además de las secuencias de nucleótidos que codifican las cadenas ligera y pesada, el vector de expresión de mamíferos comprende secuencias de ADN reguladoras que son necesarias para una transcripción eficaz de los ARNm de la secuencia codificante y una traducción eficaz de los ARNm en la línea de células huésped. Cuando las secuencias reguladoras están unidas operativamente a la secuencia de nucleótidos, mediarán en el inicio de la transcripción de esta secuencia de nucleótidos y promoverán la síntesis de proteínas eficaz a partir del ARNm correspondiente dentro del entorno de una célula de mamífero. En una realización preferida de la presente invención, en cada una de las dos unidades de transcripción, las secuencias de nucleótidos que codifican las cadenas ligera y pesada están bajo el control de las mismas unidades reguladoras.

Preferiblemente, los vectores de expresión de mamíferos de la presente invención contienen además al menos un marcador expresable que se puede seleccionar en células animales. Por tanto, en una realización preferida, el presente vector de expresión de mamífero comprende una tercera unidad de transcripción que codifica un marcador que se puede seleccionar. Puede usarse cualquier marcador de selección comúnmente empleado, tal como timidina quinasa (tk), dihidrofolato reductasa (DHFR) o glutamina sintetasa (GS). En una realización preferida, se emplea un marcador de selección GS expresable (Bebbington et al., 1992, High-level expression of a recombinant antibody from myeloma cells using a glutamine synthetase gene as an amplifiable selectable marker, Bio/Technology 10:169-175; Cockett et al., 1990, High level expression of tissue inhibitor of metalloproteinases in Chinese Hamster Ovary (CHO) cells using Glutamine synthetase gene amplification, Bio/Technology 8:662-667). El sistema GS es uno de los dos únicos sistemas que son de particular importancia para la producción de proteínas terapéuticas. En comparación con el sistema de dihidrofolato reductasa (DHFR), el sistema GS ofrece una gran ventaja de tiempo durante el desarrollo porque a menudo se pueden crear líneas celulares altamente productivas a partir del transfectante inicial, evitando así la necesidad de múltiples rondas de selección en presencia de concentraciones crecientes de agente selectivo para lograr la amplificación de genes (Brown et al., 1992, Process development for the production of recombinant antibodies using the glutamine synthetase (GS) system, Cytotechnology 9:231-236).

Cuando se utilizan en particular para la expresión transitoria/episomal únicamente, los vectores de expresión de la invención pueden comprender además un origen de duplicación como el origen del virus de Epstein-Barr (VEB) o el virus SV40 para la duplicación autónoma o el mantenimiento episomal en células huésped eucariotas, pero pueden estar desprovistos de un marcador que se puede seleccionar. Los vectores de expresión de la invención pueden ser, por ejemplo, sin limitación, fragmentos de ADN lineales, fragmentos de ADN que abarcan secuencias de direccionamiento nuclear o pueden optimizarse especialmente para la interacción con reactivos de transfección, virus animales o plásmidos adecuados que pueden transportarse y producirse en bacterias.

La presente invención también resuelve el problema técnico subyacente proporcionando una célula huésped CHO que contiene el vector de expresión de mamífero de la presente invención.

Otras células huésped descritas en el presente documento incluyen cualquier línea celular huésped de vertebrados que, a diferencia de las líneas celulares primarias, se pueda propagar de manera estable en cultivo celular. Posibles líneas celulares son por ejemplo, células COS, células NSO, células BHK, células Sf-9, células 293 o 293-EBNA, células HBK-11 (ATCC-CRL12569; véase también el documento US6.136.599), células Per-C6 (Crucell B.V., Países Bajos; WO97/00326, véase también el documento EP-1161548) o células HT1080. Por ejemplo, las células HT1080 se pueden solicitar como ATCC No. CCL-121 en la Colección Estadounidense de Cultivos Tipo, de Manassas, Virginia, EE. UU. Se ha descubierto que las células HT1080 permiten una glicosilación mejorada del producto cuando se usan en combinación con el sistema marcador de selección de glutamina sintetasa (documento WO 03/064630).

Según la invención, la célula huésped de mamífero es una célula o línea celular de ovario de hámster chino (CHO) (Puck et al., 1958, J. Exp. Med. 108:945-955), en particular células CHO-K1 (ATCC CCL-61), CHO pro3-, CHO DG44, CHO P12, la línea celular dhfr-CHO DUK-BII (Chassin et al., PNAS 77, 1980, 4216-4220), DUXB11 (Simonsen et al., PNAS 80, 1983, 2495-2499) o células CHO adaptadas para el crecimiento en cultivo en suspensión sin suero (es decir, excluyendo el cultivo transmitido por microvehículos).

En el presente documento se describen células huésped que son células linfoides, tales como células linfoides de mamíferos, que abarcan, por ejemplo, líneas de células de hibridoma, mieloma y trioma. Algunos ejemplos son, por ejemplo, células de hibridoma no secretoras como SP2/0 y de mieloma no secretoras, por ejemplo, como la línea celular NSO ECACC n° 85110503 (Colección Europea de Cultivos Celulares, Centre for Applied microbiology, Salisbury, Wiltshire SP40JG, Reino Unido) de ratón o YB2/3.0 Ag20 (descrita en GB2070313) de rata. Las células de mieloma, como las células NSO, son realmente tipos de células linfoides B, es decir, líneas celulares de plasmocitoma, aunque se tratan habitualmente en la técnica como “mielomas” (Barnes et al., Cytotechnology 32:109-123, 2000).

Otros ejemplos de células huésped de mamíferos incluyen fibroblastos humanos MRC5, células de melanoma humano 983M, células de riñón canino MDCK, fibroblastos de pulmón de rata cultivados con RF aislados de ratas Sprague-Dawley, células de melanoma murino B16BL6, células de mastocitoma murino P815 y células de adenocarcinoma mamario murino MT1A2.

Para introducir el vector de expresión en una célula huésped de mamífero según la presente invención, puede emplearse cualquier técnica de transfección —como las bien conocidas en la técnica; por ejemplo, electoporación, coprecipitación con fosfato cálcico, transfección de DEAE-dextrano, lipofección— si es apropiado para un tipo de célula huésped dado. Cabe señalar que la célula huésped de mamífero transfectada con el vector de la presente invención debe interpretarse como una línea celular transfectada de forma transitoria o estable. Por tanto, según la presente invención, el presente vector de expresión de mamífero se puede mantener episomalmente o se puede integrar de forma estable en el genoma de la célula huésped de mamífero.

Una transfección transitoria se caracteriza por no aplicar ninguna presión de selección para un marcador de selección portado por un vector. Un grupo o lote de células que se origina a partir de una transfección transitoria es una población de células agrupadas que comprende células que han captado y expresan el ADN extraño y células que no lo han captado. En experimentos de expresión transitoria que normalmente duran de 20 a 50 horas después de la transfección, los vectores transfectados se mantienen como elementos episomales y aún no están integrados en el genoma. Es decir, el ADN transfectado, por lo general, no se integra en el genoma de la célula huésped. Las células huésped tienden a perder el ADN transfectado y a crecer más que las células transfectadas en la población tras el cultivo del conjunto de células transfectadas transitoriamente. Por lo tanto, la expresión es más fuerte en el periodo inmediatamente posterior a la transfección y disminuye con el tiempo. Preferiblemente, un transfectante transitorio según la presente invención se entiende como una célula que se mantiene en cultivo celular en ausencia de presión de selección hasta un tiempo de 90 horas después de la transfección.

En una realización preferida de la invención, la célula huésped CHO se transfecta de forma estable con el vector de expresión de mamífero de la invención. Transfección estable significa que el ADN extraño recién introducido, como el ADN del vector, se está incorporando al ADN genómico, generalmente mediante eventos de recombinación aleatorios no homólogos. El número de copias de ADN del vector y, concomitantemente, la cantidad del producto génico pueden aumentarse seleccionando líneas celulares en las que las secuencias del vector se han amplificado después de la integración en el ADN de la célula huésped. Por lo tanto, es posible que dicha integración estable dé lugar, tras la exposición a una presión de selección adicional para la amplificación de genes, a dobles cromosomas minúsculos en las células CHO. Además, en el caso de una secuencia de vector, una transfección estable puede dar lugar a la pérdida de partes de la secuencia de vector que no están directamente relacionadas con la expresión del producto génico recombinante, como, por ejemplo, las regiones de control del número de copias bacterianas se vuelven superfluas tras la integración genómica. Por tanto, una célula huésped transfectada ha integrado en el genoma al menos una parte o diferentes partes del vector de expresión.

La presente invención resuelve el problema técnico subyacente también al proporcionar un proceso para mejorar el nivel de producción de un anticuerpo secretado, que comprende una cadena ligera y una cadena pesada, que comprende las etapas de

a) transfectar una célula huésped CHO con un vector de expresión según la presente invención que codifica la cadena ligera y la cadena pesada,

b) cultivar la célula huésped en condiciones apropiadas para permitir la propagación de la célula y la expresión y el ensamblaje de las dos cadenas dentro de la célula para formar una molécula, y la secreción de la molécula formada y

c) recolectar el anticuerpo formado.

El proceso para aumentar el nivel de producción de un anticuerpo secretado se basa en el uso del vector de la invención de expresión de doble gen de mamífero que comprende dos genes diferentes optimizados por ingeniería genética que codifican las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo, que tras, la expresión, forman la molécula deseada. Mediante el uso del vector de la invención es posible lograr un rendimiento total notablemente mayor de anticuerpo secretado que con los vectores de control que contienen solo un gen optimizado por ingeniería genética o vectores de control en los que ninguno de los dos genes está optimizado por ingeniería genética. Por tanto, el proceso de la invención da como resultado ventajosamente un nivel considerablemente mejorado de producción del anticuerpo secretado.

Preferiblemente, en el proceso de la invención, ambas cadenas de anticuerpos diferentes se expresan en una proporción de casi 1:1. Esto es particularmente ventajoso si la molécula deseada es un anticuerpo que consta de múltiples copias de una cadena pesada y de una ligera. Sin embargo, también es posible ajustar la expresión de las dos cadenas de anticuerpos a otra proporción. Esto se puede lograr aplicando diferentes estrategias de optimización génica a las dos secuencias de nucleótidos sintéticas diferentes que codifican las cadenas de anticuerpos o uniendo operativamente las dos secuencias de nucleótidos sintéticas con un promotor diferente.

Como se describe en el presente documento, el proceso se puede usar para aumentar el rendimiento de cualquier molécula secretada que conste de al menos dos cadenas polipeptídicas diferentes. Los ejemplos de tales proteínas de múltiples subunidades incluyen, sin limitación, una enzima que comprende varias subunidades diferentes, una molécula receptora y un canal iónico.

Los medios y los métodos de cultivo adecuados para líneas celulares de mamíferos son bien conocidos en la técnica, como se describe, por ejemplo, en el documento US 5.633.162. Ejemplos de medios de cultivo celular estándar para matraces de laboratorio o cultivo celular de baja densidad y que se adaptan a las necesidades de tipos de células particulares incluyen, sin limitación, el medio 1640 del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (Morre, G., The Journal of the American Medical Association, 199, pp. 519s, 1967), el medio L-15 (Leibovitz, A. et al., Amer. J. of Hygiene, 78, 1, pp. 173ss, 1963), el medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), el medio esencial mínimo de Eagle (MEM), el medio F12 de Ham (Ham, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sc.53, pp. 288ss, 1965) o DMEM modificado de Iscoves que carece de albúmina, transferrina y lecitina (Iscoves et al., J. Exp. med. 1, pp. 923ss, 1978). Por ejemplo, los medios F10 o F12 de Ham se diseñaron especialmente para el cultivo de células CHO. En el documento EP-481 791 se describen otros medios especialmente adaptados al cultivo de células CHO. Es sabido que tales medios de cultivo se pueden complementar con suero fetal bovino (FBS, por sus siglas en inglés; también llamado suero fetal de ternera FCS), proporcionando este último una fuente natural de una plétora de hormonas y factores de crecimiento. El cultivo celular de células de mamíferos es en la actualidad una operación rutinaria bien descrita en libros de texto y manuales científicos; se cubre en detalle, por ejemplo, en R. lan Fresney, Culture of Animal cells, a manual, 4a edición, Wiley-Liss, Nueva York, 2000.

En una realización preferida de la presente invención, el medio de cultivo celular usado carece de suero fetal de ternera (FCS o FBS), que entonces se denomina “exento de suero”. Las células en medio sin suero generalmente requieren insulina y transferrina en un medio sin suero para un crecimiento óptimo. La transferrina puede estar sustituida al menos parcialmente por agentes quelantes no peptídicos o sideróforos tales como la tropolona, como se describe en el documento WO 94/02592, o por niveles aumentados de una fuente de hierro orgánico favorablemente junto con antioxidantes tales como la vitamina C. La mayoría de las líneas celulares requieren uno o más factores de crecimiento sintéticos (que comprenden polipéptidos recombinantes), que incluyen, por ejemplo, factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factores de crecimiento de tipo insulina I y II (IGFI, IGFII), etc. Otras clases de factores que pueden ser necesarios incluyen: prostaglandinas, proteínas de transporte y unión (por ejemplo, ceruloplasmina, lipoproteínas de alta y baja densidad, albúmina de suero bovino (BSA), hormonas, incluidas las hormonas esteroides y ácidos grasos. La prueba del factor polipeptídico se realiza de forma óptima de manera escalonada probando nuevos factores polipeptídicos en presencia de aquellos que se ha descubierto que son estimulantes del crecimiento. Estos factores de crecimiento son sintéticos o recombinantes. Existen varios planteamientos metodológicos bien conocidos en el cultivo de células animales, y a continuación se describe un ejemplo. La etapa inicial es obtener condiciones en las que las células sobrevivan y/o crezcan lentamente durante 3 6 días después de la transferencia del medio de cultivo suplementado con suero. En la mayoría de los tipos de células, esto es al menos en parte una función de la densidad del inóculo. Una vez que se encuentre el suplemento óptimo de hormona/factor de crecimiento/polipéptido, disminuirá la densidad del inóculo requerida para la supervivencia.

En otra realización preferida, el medio de cultivo celular está libre de proteínas; es decir, está libre tanto de suero fetal como de suplementos de factor de crecimiento proteico individual u otra proteína, tal como transferrina recombinante.

En otra realización, el proceso de la presente invención incluye un crecimiento de alta densidad de las células huésped; por ejemplo, en un biorreactor industrial de alimentación por lotes. A continuación, se puede aplicar el procesamiento corriente abajo convencional. En consecuencia, debe emplearse un medio de cultivo de crecimiento de alta densidad. Dichos medios de crecimiento de alta densidad generalmente se pueden complementar con nutrientes como todos los aminoácidos, fuentes de energía como glucosa en el intervalo indicado anteriormente, sales inorgánicas, vitaminas, oligoelementos (definidos como compuestos inorgánicos generalmente presentes en concentraciones finales en el intervalo micromolar), tampones, los cuatro nucleósidos o sus correspondientes nucleótidos, antioxidantes como el glutatión (reducido), vitamina C y otros componentes como importantes lípidos de membrana, por ejemplo, colesterol o fosfatidilcolina, o precursores de lípidos, por ejemplo, colina o inositol. Un medio de alta densidad estará enriquecido en la mayoría o en todos estos compuestos y, a excepción de las sales inorgánicas a partir de las cuales se regula la osmolaridad del medio esencialmente isotónico, los comprenderá en cantidades mayores (reforzadas) que los medios estándar anteriormente mencionados, como se puede inferir en GB2251 249 en comparación con RPMI 1640. Preferiblemente, un medio de cultivo de alta densidad según la presente invención está reforzado porque todos los aminoácidos, excepto el triptófano, superan los 75 mg/l de medio de cultivo. Preferiblemente, junto con el requerimiento general de aminoácidos, la glutamina y/o la asparagina están en exceso de 1 g/l, más preferiblemente de 2 g/l de medio de cultivo de alta densidad. En el contexto de la presente invención, el cultivo de células de alta densidad se define como una población de células animales que tienen temporalmente una densidad de células viables de al menos 105 células/ml o más, preferiblemente de al menos 106 células/ml o más, y cuya población ha crecido continuamente a partir de una sola célula o inóculo de menor densidad de células viables en un medio de cultivo celular en un volumen de cultivo constante o en aumento.

En una realización preferida adicional, el proceso de la presente invención incluye un cultivo de alimentación por lotes. Un cultivo de alimentación por lotes es un sistema de cultivo en el que se suministra al menos glutamina, opcionalmente con uno o varios otros aminoácidos, preferiblemente glicina, al cultivo celular como se describe en el documento GB2251249 para mantener su concentración en el medio, además de controlar la concentración de glucosa mediante alimentación separada. Más preferiblemente, la alimentación de glutamina y opcionalmente uno o varios otros aminoácidos se combina con la alimentación de una o más fuentes de energía como glucosa al cultivo celular como se describe en el documento EP-229809-A. La alimentación suele iniciarse a las 25-60 horas después del inicio del cultivo; por ejemplo, es útil comenzar a alimentar cuando las células han alcanzado una densidad de aproximadamente 106 células/ml. Es bien sabido en la técnica que en las células animales cultivadas, la “glutaminólisis” (McKeehan et al., 1984, Glutaminolysis in animal cells, en: Carbohydrate Metabolism in Cultured Cells, ed. M.J. Morgan, Plenum Press, Nueva York, pp. 11 -150) puede convertirse en una fuente importante de energía durante la fase de crecimiento. La alimentación total de glutamina y/o asparagina (para la sustitución de glutamina por asparagina, véase Kurano, N. et al., 1990, J. Biotechnology 15, 113-128) está normalmente en el intervalo de 0,5 a 10 g por l de volumen de cultivo, preferiblemente de 1 a 2 g por l de volumen de cultivo; otros aminoácidos que pueden estar presentes en la alimentación son de 10 a 300 mg de alimentación total por litro de cultivo; en particular, se suele administrar glicina, lisina, arginina, valina, isoleucina y leucina en cantidades al menos 150 a 200 mg superiores a las de los otros aminoácidos. La alimentación se puede añadir como inyección o como alimentación bombeada continuamente; preferiblemente, la alimentación se bombea casi continuamente al biorreactor. Ni que decir tiene que el pH se controla cuidadosamente durante el cultivo de alimentación por lotes en un biorreactor a un pH óptimo aproximadamente fisiológico para una línea celular dada mediante la adición de base o tampón. Cuando se usa glucosa como fuente de energía, la cantidad total de glucosa es normalmente de 1 a 10, preferiblemente de 3 a 6 gramos por litro de cultivo. Aparte de la inclusión de aminoácidos, la alimentación preferiblemente comprende una baja cantidad de colina en el intervalo de 5 a 20 mg por litro de cultivo. Más preferiblemente, dicha alimentación de colina se combina con la suplementación de etanolamina esencialmente como se describe en el documento US 6.048.728, en particular en combinación con la alimentación con glutamina. Ni que decir tiene que con el uso del sistema de marcadores GS, se requerirán cantidades menores de glutamina que con un sistema de expresión sin GS, ya que la acumulación excesiva de glutamina además de la producida endógenamente daría lugar a la producción de amoniaco y la toxicidad concomitante. Para GS, la glutamina en el medio o alimento se sustituye principalmente por sus equivalentes y/o precursores, es decir, asparagina y/o glutamato.

En la técnica se conocen bien los métodos para recolectar —es decir, aislar y/o purificar— una proteína dada de una célula, un cultivo celular o el medio en el que se cultivaron las células. Las proteínas se pueden aislar y/o purificar a partir de material biológico; por ejemplo, mediante precipitación fraccionada con sales o disolventes orgánicos, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía en gel, HPLC, cromatografía de afinidad, etc.

Las figuras muestran:

Figura 1 Mapa del vector pcB72.3 que comprende la secuencia genómica de la cadena pesada

Figura 2 Mapa del ADNc del vector pcB72.3 HC que comprende el ADNc de la cadena pesada

Figura 3 Mapas del vector pcB72.3 Geneart HC, que comprende un gen optimizado por ingeniería genética que codifica la cadena pesada bajo el control del promotor hCMV-MIE, y del vector pcB72.3 Geneart HC/LC que comprende un gen optimizado por ingeniería genética que codifica la cadena pesada y un gen optimizado por ingeniería genética que codifica la cadena ligera, estando cada uno de los genes bajo el control del promotor hCMV-MIE.

Figura 4 Niveles relativos de expresión de anticuerpos en células CHO-K1 SV transfectadas. Comparación entre el vector pcB72.3 que comprende ADN genómico que codifica la cadena pesada y el ADNc del vector pcB72.3 HC que comprende ADNc que codifica la cadena pesada.

Figura 5 Niveles relativos de expresión de anticuerpos en células CHO-K1 SV transfectadas. Comparación entre el ADNc del vector pcB72.3 HC que comprende el ADNc que codifica la cadena pesada, el vector pcB72.3 HC que comprende un gen optimizado por ingeniería genética que codifica la cadena pesada y el vector pcB72.3 HC/LC que comprende un gen optimizado por ingeniería genética que codifica la cadena pesada y un gen optimizado por ingeniería genética que codifica la cadena ligera.

Figura 6 La Figura muestra el efecto de las regiones constantes optimizadas por ingeniería genética sobre la producción de anticuerpos en células CHO-K1 SV transfectadas. El vector pConG1GA contiene las secuencias del gen IgGI con regiones constantes optimizadas y regiones variables no optimizadas. El vector pConG2GA contiene las secuencias del gen IgG2 con regiones constantes optimizadas y regiones variables no optimizadas. El vector pConG4GA contiene las secuencias del gen IgG4 con regiones constantes optimizadas y regiones variables no optimizadas. El vector GlcDNA contiene secuencias de genes de IgG1 no optimizadas, el vector G2cDNA contiene secuencias de genes de IgG2 no optimizadas y el vector pcB72.3 HCcDNA contiene secuencias de IgG4 no optimizadas. Se utilizó como control el vector pcB72.3 GAHC/LC, un vector con regiones constantes optimizadas por ingeniería genética y regiones variables optimizadas por ingeniería genética. Los datos para pcB72.3 (7) y pConG4GA (8) se obtuvieron de un experimento separado, explicando las diferencias en los valores de control observados entre pcB72.3 (1) y pcB72.3 (7).

El listado de secuencias muestra:

La SEQ ID No.1 muestra la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la cadena pesada de cB72.3 optimizada.

La SEQ ID No. 2 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de cB72.3 optimizada codificada por la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID No. 1.

La SEQ ID No. 3 muestra la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la cadena ligera cB72.3 optimizada.

La SEQ ID No. 4 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera cB72.3 optimizada codificada por la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID No. 3.

Se entiende que las explicaciones y referencias hechas a una realización preferida dada en la presente memoria descriptiva de la invención se refieren igualmente a todas las realizaciones preferidas adicionales de la presente invención.

La presente invención se explica con más detalle mediante los siguientes ejemplos.

Ejemplos

Materiales y métodos

Células utilizadas

Línea celular CHO CHOK1SV: es una variante de la línea celular CHO-K1 y se ha adaptado al crecimiento en suspensión y medio libre de proteínas.

Propagación de células CHOK1SV:

Las células CHOK1SV se propagaron de forma rutinaria en matraces agitadores de suspensión en medio CD-CHO (Invitrogen) complementado con L-glutamina 6 mM. La concentración de semillas fue de 2 x 105 células/ml, y las células se dividen cada 4 días. Los matraces se gasearon con 5 CO²al 5% y se incubaron a 36,5°C (entre 35,5°C y 37,0°C) con agitación orbital a 140 rpm.

Transfección transitoria:

Las transfecciones transitorias se realizaron utilizando células de crecimiento en suspensión. Las células se contaron y distribuyeron en pocillos de una placa de 24 pocillos a razón de 2,5 x 105 células viables por pocillo en un medio a base de DMEM complementado con suero al 10% y L-glutamina 6 mM, y se incubaron durante la noche a 36,5°C. Al día siguiente, el medio acondicionado se reemplazó con 1 ml de medio fresco (como antes) y las células se incubaron durante 3 horas a 37°C.

Para cada transfección, se resuspendieron 5 pg de cada uno de los SGV (HC y LC-SGV mezclados) o 5 pg de los DGV en 100 pl de medio de transfección (OptiMEM, Invitrogen). Para los controles positivos, las células también se transfectaron con el vector pcB72.3, que codifica genes de cadena pesada y cadena ligera para una IgG4/anticuerpo kappa que sirve como modelo de anticuerpo. También se incluyó un control negativo (solo agua).

Para cada transfección, se diluyeron 5 pl de reactivo Lipofectamina-2000 (Invitrogen) en 100 pl de medio de transfección, se mezclaron y se dejaron reposar durante 5 minutos a temperatura ambiente. El ADN y el reactivo de lipofectamina diluido se combinaron, se mezclaron y se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 20 minutos. Esta mezcla de 200 pl se añadió luego a un pocillo de la placa de 24 pocillos que contenía las células, y las células se incubaron durante 4 o 10 días a 37°C. El sobrenadante del cultivo se recogió y se aclaró mediante centrifugación antes del ensayo para determinar la presencia de anticuerpo mediante ELISA de ensamblaje.

Transfecciones estables:

Las células utilizadas para las transfecciones se cultivaron en cultivo en suspensión celular, como se ha detallado anteriormente. Las células de cultivos en crecimiento se centrifugaron y lavaron una vez en medio sin suero antes de volver a suspenderlas a una concentración de 1,43 x 107 células/ml. Se añadieron un volumen de 0,7 ml de la suspensión celular y 40 pg de ADN plasmídico a una cubeta de electroporación. A continuación, se colocó la cubeta en el aparato de electroporación y se administró un único impulso de 250 V y 400 pF. Después de la transfección, las células se distribuyeron en placas de 96 pocillos a razón de aproximadamente 2500 células huésped/pocillo (5 x 104/ml), utilizando el medio a base de DMEM no selectivo complementado con dFCS al 10%. Las placas se incubaron a 36,5°C (entre 35,5°C y 37,0°C) en una atmósfera de CO²al 10% en aire.

El día después de la transfección, se añadió medio a base de DMEM complementado con dFCS al 10%/L-metionina sulfoximina 66 pM a cada pocillo (150 pl/pocillo) para dar una concentración final de L-metionina sulfoximina de 50 pM. Las placas se controlaron para determinar cuándo murieron las células no transfectadas y cuándo aparecieron los focos de células transfectadas. Los focos de células transfectadas se hicieron evidentes aproximadamente de tres a cuatro semanas después de la transfección. Todas las líneas celulares examinadas y que más habían progresado procedían de pocillos que contenían solo una colonia.

Evaluación de la productividad de líneas celulares en cultivo estático

Las placas de transfección de 96 pocillos se incubaron durante aproximadamente tres semanas para permitir la formación de colonias. Las colonias resultantes se examinaron microscópicamente para verificar que las colonias eran de un tamaño adecuado para el ensayo (cubriendo más del 60% del fondo del pocillo), y que solo estaba presente una colonia en cada pocillo.

Las colonias adecuadas se transfirieron a pocillos de placas de 24 pocillos que contenían 1 ml de medio de crecimiento selectivo (medio a base de DMEM/dFCS al 10%/L-metionina sulfoximina 25 pM). Estos cultivos se incubaron durante 14 días a 36,5°C (entre 35,5°C y 37,0°C) en una atmósfera de CO²al 10% en aire. Se recogió el sobrenadante de cada pocillo y se analizó la concentración de anticuerpo presente mediante el método de HPLC de proteína A.

ELISA de ensamblaje:

La concentración de anticuerpos de las muestras se determinó usando un ELISA de fase doble que mide la IgG humana ensamblada. Esto implicó la captura de muestras y el estándar en una placa de 96 pocillos recubierta con un anticuerpo anti-Fc humano. El anticuerpo unido se revela con una cadena ligera antihumana unida a la peroxidasa de rábano picante y al sustrato cromogénico TMB. El desarrollo de color fue proporcional a la concentración de anticuerpo presente en la muestra en comparación con el estándar.

HPLC de proteína A:

El método de cromatografía de afinidad de proteína A para la medición de IgG se realizó en un HPLC Agilent 1100. El producto de IgG se une selectivamente a una columna de inmunodetección de proteína A de Poros. El material no unido se lava de la columna y el anticuerpo unido restante se libera disminuyendo el pH del disolvente. La elución se controló por absorbancia a 280 nm y el producto se cuantificó (usando el soporte lógico Chemstation) frente a un estándar de anticuerpo genérico y se realizó una corrección para las diferencias en los coeficientes de extinción.

Constructo vectorial

a) ADNc de la cadena pesada

La versión de ADNc de HC de pcB72.3 se generó transfectando transitoriamente el vector de expresión pcB72.3 (representado en la Figura 1) en células CHOK1SV usando Lipofecatmina-2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Al día siguiente, se extrajo el ARN total de las células transfectadas usado como plantilla en la síntesis de ADNc. La secuencia de HC de cB72.3 se amplificó a partir del ADNc usando cebadores específicos. Como esta secuencia se deriva del ARNm, carece de secuencias intrónicas. A continuación, esta secuencia se clonó en el vector pEE6.4 y se combinó con el vector pConK VL para generar el vector de ADNc de pcB72.3 HC (representado en la Figura 2).

b) Genes optimizados por ingeniería genética

La optimización génica se ejecutó en secuencias de ADNc que codifican HC y LC de cB72.3. La optimización se ejecutó en la secuencia para eliminar todas las posibles secuencias que actúan negativamente y para optimizar el uso de codones. Luego, las secuencias óptimas se sintetizaron utilizando un planteamiento de ensamblaje de genes. Después del ensamblaje, las secuencias codificantes de HC y LC representadas en las SEQ ID Nos. 1 y 3, respectivamente, se clonaron en el vector pEE6.4 (para HC) y el vector pEE12.4 (para LC) mediante los sitios Hind III y EcoR I. Luego se generó un DGV combinando los casetes de expresión de HC y LC mediante clonación a través de los sitios de enzimas de restricción Not I y Pvu I. Esto generó los vectores pcB72.3 Geneart HC y pcB72.3 Geneart HC/LC representados en la Figura 3.

c) Preparación de ADN para transfección

Para los vectores de ADNc y Geneart, se generó una preparación volumétrica de ADN usando un equipo Qiagen Maxiprep. Para todas las transfecciones, el ADN del vector se linealizó mediante digestión con Pvu I. Se examinó el plásmido digerido pasando una muestra en un gel de agarosa para confirmar la linealización completa. El ADN se purificó mediante extracción con fenol:cloroformo y se dividió en alícuotas en lotes de 40 gg. El ADN dentro de cada alícuota se precipitó mediante la adición de 0,1 volúmenes de acetato de sodio 3 M, pH 5,2 y dos volúmenes de etanol al 100% enfriado con hielo y se almacenó a -20 ± 5°C hasta que se requirió.

Cultivos de transfección, selección y sobrecrecimiento

Se transfectaron células CHOK1SV con los constructos vectoriales usando un método de electroporación estándar. Las células se cultivaron en placas de 96 pocillos. Al día siguiente, se añadió medio selectivo a 50 gM.

Las placas se analizaron en busca de colonias en desarrollo a las 4 semanas después de la transfección. Para cada grupo de transfección, se transfirieron aproximadamente 100 colonias de tamaño apropiado a placas de 24 pocillos en medio que contenía MSX 25 gM. Se permitió que las células crecieran en exceso durante 2 semanas, después de lo cual se recogió el medio de cultivo celular de cada pocillo y se evaluó mediante HPLC de proteína A para determinar el nivel de anticuerpo cB72.3 presente.

Resultados y conclusiones

Secuencia de la cadena pesada genómica en contraposición con la del ADNc

El efecto de eliminar los intrones de la secuencia que codifica la HC de pcB72.3 se evaluó en transfecciones estables. Se permitió que 104 colonias de cada conjunto de transfectantes crecieran en exceso en placas de 24 pocillos, y se determinaron las concentraciones de anticuerpo resultantes de cada línea celular. Los resultados se resumen en la Figura 4 y en la Tabla 1. A partir de los datos, es evidente que la presencia de intrones en la secuencia que codifica pcB72.3 HC no tiene ningún efecto sobre el nivel de anticuerpo generado. Se ha demostrado que el intrón dentro de la secuencia promotora es necesario para la máxima expresión génica, por lo que es probable que este intrón por sí solo contribuya a la expresión génica eficaz.

Hay dos posibles mecanismos mediante los cuales se logra esto. O el propio promotor es más eficaz cuando el intrón está presente, o el ARNm generado después del empalme del intrón derivado del promotor es más estable. Es evidente a partir de estos datos que el empalme adicional de intrones tales como los presentes en la secuencia que codifica la HC no da como resultado un aumento de la expresión génica.

Tabla 1: Análisis estadístico de datos de comparación genómica con respecto al ADNc

Análisis de secuencias de genes optimizadas por ingeniería genética

El efecto de la optimización de la secuencia de ADN se evaluó en transfecciones estables. Se permitió que 104 colonias de cada conjunto de transfectantes crecieran en exceso en placas de 24 pocillos, y se determinaron las concentraciones de anticuerpo resultantes de cada línea celular. En este caso, los datos se compararon con la versión de ADNc del control, ya que las secuencias optimizadas por ingeniería genética estaban en formato de ADNc en lugar del formato genómico estándar. Los resultados se resumen en la Figura 5 y en la Tabla 2.

La optimización génica demostró que la optimización de ambas cadenas dio un aumento en la concentración media de anticuerpos del 35% (p = 0,006). Sin embargo, la optimización de la HC sola no dio como resultado un aumento significativo en la expresión de anticuerpos. Estos datos sugieren que también se necesita la optimización de la LC para una mayor expresión de anticuerpos. La razón de esto podría ser que la secuencia de LC era subóptima y la optimización llevó el nivel de LC expresado a alinearse con el nivel de la HC. Por ejemplo, los motivos de inestabilidad de ARN se eliminaron de la secuencia de la LC que no estaban presentes en la secuencia de la HC.

Tabla 2: Análisis estadístico de datos de optimizaciones de genes

Efecto de las regiones constantes optimizadas por ingeniería genética en la producción de anticuerpos

Se generaron vectores que contienen los genes de las cadenas pesada y ligera para IgG1, IgG2 e IgG4, respectivamente, en los que las regiones constantes de los genes de las cadenas pesada y ligera se optimizaron por ingeniería genética, mientras que las regiones variables de ambos genes no se optimizaron. Así, se generaron el vector pConG1GA que contiene las secuencias del gen IgG1 con regiones constantes optimizadas y regiones variables no optimizadas, el vector pConG2GA que contiene las secuencias del gen IgG2 con regiones constantes optimizadas y regiones variables no optimizadas y el vector pConG4GA que contiene las secuencias del gen IgG4 con regiones constantes optimizadas y regiones variables no optimizadas.

Los vectores obtenidos se probaron de la forma estándar para la producción de anticuerpos y se compararon con vectores de ADNc no optimizados, en particular el vector G1cADN que contiene genes pesados y ligeros de IgG1 no optimizados, el vector G2cDNA que contiene genes pesados y ligeros de IgG2 no optimizados y el vector pcB72.3 HCcDNA que contiene secuencias de IgG4 no optimizadas. Además, se incluyó como control en el primer experimento el vector pcB72.3 GAHC/LC totalmente optimizado, un vector con regiones constantes optimizadas por ingeniería genética y regiones variables optimizadas por ingeniería genética. Los resultados se resumen en la Figura 6. Una comparación entre los vectores pConG1GA y G1cDNA muestra que la región constante optimizada de IgG1 proporciona una expresión aumentada. Además, una comparación directa entre los vectores pConG2GA y G2cDNA muestra que la región constante optimizada de IgG2 proporciona una expresión aumentada. Por el contrario, la optimización de IgG4 no da una expresión aumentada, como se muestra por una comparación entre los vectores pConG4GA y pcB72.3 HCcDNA. Por tanto, los resultados muestran que el uso de regiones constantes optimizadas por ingeniería genética da como resultado una expresión media de anticuerpos aumentada.

Cabe señalar que los datos de IgG4 se obtuvieron de un experimento separado, lo que explica las diferencias en los valores de control observados entre los dos conjuntos de transfecciones.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Lonza Biologics plc.

<120> Expresión de alto nivel de anticuerpo recombinante en una célula huésped de mamífero

<130> LBP1009PCT00

<160>4

<170> PatentIn versión 3.3

<210> 1

<211> 1500

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 1

taaaacgacg gccagtgagc gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tgggtaccaa 60 gcttgccgcc accatggagt ggagctgggt gttcctgttc ttcctgagcg tgaccaccgg 120 cgtgcacagc caggtgcagc tgcagcagag cgacgccgag ctggtgaagc ctggcgccag 180 cgtgaagatc agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc gatcacgcca tccactgggc 240 caagcagaag cccgagcagg gcctggagtg gatcggctac atcagccccg gcaacgacga 300 catcaagtac aacgagaagt tcaagggcaa ggccaccctg accgccgaca agagcagcag 360 caccgcctac atgcagctga acagcctgac cagcgaggac agcgccgtgt acttctgcaa ^{J ‘¡¿.yj} gcggagctac tacggccact ggggccaggg caccaccctg acagtgagca gcgccagcac 480 caagggccca agcgtgttcc ccctggcccc ctgcagcaga agcaccagcg agagcacagc 540 cgccctgggc tgcctggtga aggactactt ccccgagccc gtgaccgtgt cctggaacag 600 cggagccctg acaagcggag tgcacacctt ccccgccgtg ctgcagagca gcggcctgta 660 ctccctgagc agcgtggtga ccgtgcccag cagcagcctg ggcaccaaga cctacacctg 720 caacgtggac cacaagccca gcaacaccaa agtggacaag cgcgtggaga gcaagtacgg 780 ccctccctgc cccagctgcc ctgcccccga gttcctgggc ggacccagcg tgtttctgtt 840 cccccccaag cccaaggata ccctgatgat cagccggacc cctgaagtga cctgcgtggt 900 ggtggatgtg agccaggagg accccgaagt gcagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga 960 agtgcacaac gccaagacca agcccagaga ggagcagttc aacagcacct accgcgtggt 1020 gtctgtgctg accgtgctgc accaggattg gctgaacggc aaggagtaca agtgcaaagt 1080 gagcaacaag ggcctgccta gcagcatcga gaaaaccatc agcaaggcca agggccagcc 1140 aagagagccc caggtgtaca ccctgccccc ctcccaggag gagatgacca agaaccaggt 1200 gtccctgacc tgtctggtga agggcttcta ccccagcgac atcgccgtgg agtgggagag 1260 caacggccag cccgagaaca actacaagac caccccccct gtgctggaca gcgatggcag 1320 cttcttcctg tacagccggc tgaccgtgga taagagcaga tggcaggagg gcaacgtgtt 1380 cagctgcagc gtgatgcacg aggccctgca caatcactac acccagaaga gcctgagcct 1440 gtccctgggc aagtgagaat tccgagctcc agcttttgtt ccctttagtg agggttaatt 1500

<210>2

<211 > 460

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Met Glu Trp Ser Trp val Phe Leu Phe Phe Leu Ser val Thr Thr Gly 1 5 10 15

val Hi s ser Gln val Gln Leu Gln Gln Ser Asp Ala Glu Leu val Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser val Lys lie Ser cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr ASD His Ala lie Hi S Trp Ala Lys Gln Lys Pro Glu Gln Gly Leu 50 55 60

Glu Trp lie Gly Tyr lie Ser Pro Gly Asn Asp Asp lie Lys Tyr Asn 65 70 75 80 Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu ASP Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Phe cys Lys Arg Ser Tyr Tyr Gly Hi s Trp Gly Gln Gly Thr Thr

115 120 125

Leu Thr val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser val Phe Pro Leu 130 135 140

Ala Pro cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys 145 150 155 160 Leu val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro val Thr val Ser Trp Asn Ser

165 170 175

Gly Ala Leu Thr Ser Gly val His Thr Phe Pro Ala val Leu Gln Ser

180 185 190

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr val Pro Ser Ser Ser

195 200 205

Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr cys Asn val Asp His Lys Pro Ser Asn 210 215 220

Thr Lys val ASp Lys Arg val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro cys Pro 225 230 235 240 Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

245 250 255

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie ser Arg Thr pro Glu val

260 265 270

Thr Cys val val Val Asp val Ser Gln Glu Asp Pro Glu val Gln Phe

275 280 285

Asn Trp Tyr val Asp Gly val Glu val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 290 295 300

Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg val val Ser val Leu Thr

305 310 315 320

val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys cys Lys val

325 330 335

Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser lie Glu Lys Thr lie ser Lys Ala

340 345 350

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln

355 360 365

Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln val Ser Leu Thr Cys Leu val Lys Gly 370 375 380

Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

385 390 395 400

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

405 410 415

Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu

420 425 430

Gly Asn val Phe Ser Cys Ser val Met His Glu Ala Leu His Asn His

435 440 445

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

450 455 460

<210>3

<211> 800

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400>3

taaaacgacg gccagtgagc gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tgggtaccaa 60 gcttgccgcc accatgagcg tgcccaccca ggtgctgggc ctgctgctgc tgtggctgac 120 cgatgccaga tgcgacatcc agatgaccca gagccccgcc agcctgagcg tgtctgtggg 180 cgagaccgtg accatcacct gcagagccag cgagaacatc tacagcaacc tggcctggta 240 tcagcagaag cagggcaaga gcccccagct gctggtgtac gccgccacca acctggccga 300 cggcgtgccc agcagattca gcggcagcgg ctccggcacc cagtacagcc tgaagatcaa 360 cagcctgcag agcgaggatt tcggcagcta ctactgccag cacttctggg gcacccccta 420 cacctttggc ggcggaacca ggctggagat caagcggacc gtggccgccc ccagcgtgtt 480 catcttcccc cccagcgatg agcagctgaa gagcggcacc gccagcgtgg tgtgtctgct 540 gaacaacttc taccctcgag aggccaaagt gcagtggaaa gtggacaacg ccctgcagtc 600 cggcaacagc caggagagcg tgaccgagca ggacagcaag gactccacct acagcctgag 660 cagcaccctg accctgagca aggccgacta cgagaagcac aaagtgtacg cctgcgaagt 720 gacccaccag ggcctgtcca gccccgtgac caagagcttc aaccggggcg agtgctgaga 780 attccgagct ccagcttttg 800

<210>4

<211 > 234

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400>4

Met Ser val Pro Thr Gln val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr

1 5 10 15

Asp Ala Arg Cys Asp lie Gln Met Thr Gln ser Pro Ala Ser Leu Ser

20 25 30

val ser val Gly Glu Thr val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn

35 40 45

^T l ⁱ i e ^{_ -}i^ry ^-__f s e ^_r^_______M ^_i l i l c u ^*M ¹í ^„a i i p ^{. T}l y ^.i ^{, -}«ain ^/v -j ^"i ^Ii ^-i ⁱi_ys ^/u^{“ T}i u ^{M r}v-j ^~\ i ^wy i ⁱ_ ^»y ^{/ i}i ^-o c i ⁿn ^Mu ^A

50 55 60

Gln Leu Leu val Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly val Pro Ser

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys lie Asn

85 90 95

145 150 155 160

Pro Arg Glu Ala Lys val Gln Trp Lys val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

165 170 175

Gly Asn Ser Gln Glu Ser val Thr Glu Gln Asp ser Lys Asp ser Thr

180 185 190

Tyr ser Leu Ser ser Thr Leu Thr Leu ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

195 200 205

His Lys val Tyr Ala Cys Glu val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220

val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un vector de expresión de mamífero para células huésped de ovario de hámster chino que comprende al menos una primera unidad de transcripción que contiene una primera secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera de un anticuerpo y una segunda unidad de transcripción que contiene una segunda secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada de un anticuerpo, caracterizado por que la composición de codones tanto de la primera como de la segunda secuencia de nucleótidos está adaptada al sesgo de codones de las células huésped de ovario de hámster chino.

2. Un vector de expresión de mamífero según la reivindicación 1, en donde las cadenas ligeras y pesadas codificadas por las secuencias de nucleótidos primera y segunda tienen sitios de glicosilación modificados.

3. Un vector de expresión de mamífero según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la cadena ligera y la cadena pesada pueden formar un anticuerpo.

4. Un vector de expresión de mamífero según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el vector comprende una tercera unidad de transcripción que codifica un marcador que se puede seleccionar.

5. Un vector de expresión de mamífero según la reivindicación 4, en donde el marcador que se puede seleccionar es un marcador de glutamina sintetasa (GS).

6. Una célula huésped de ovario de hámster chino que contiene un vector de expresión de mamífero según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Proceso para mejorar el nivel de producción de un anticuerpo secretado que comprende una cadena ligera y una cadena pesada que comprende las etapas de

a) transfectar una célula huésped de ovario de hámster chino con un vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que codifica la cadena ligera y la cadena pesada,

b) cultivar la célula huésped en condiciones apropiadas para permitir la propagación de la célula y la expresión y el ensamblaje de las dos cadenas dentro de la célula para formar una molécula, y la secreción de la molécula formada, y c) recolectar el anticuerpo formado.