AT500650B1 - Immunogener rekombinanter antikörper - Google Patents

Description

P9tet8»t AT500 650B1 2009-11-15

Beschreibung [0001] Die Erfindung bezieht sich auf einen immunogenen, rekombinanten Antikörper, der für die Immunisierung von Primaten, insbesondere Menschen verwendet wird. Die Erfindung bezieht sich weiters auf einen Impfstoff, der den immunogenen, rekombinanten Antikörper umfasst, sowie auf ein Verfahren zu dessen Herstellung.

[0002] Monoklonale Antikörper (monoclonal antibodies, MAB) sind für die Immuntherapie einer Reihe von verschiedenen Erkrankungen verbreitet verwendet worden, unter anderem für Infektions- und Autoimmunerkrankungen sowie Zustände im Zusammenhang mit Tumoren oder Krebs. Unter Verwendung der Hybridomtechnologie sind MAB, die gegen eine Reihe von Antigenen gerichtet sind, in standardisierter Form hergestellt worden. Eine Vielzahl Tumorassoziierter Antigene (tumor associated antigens, TAA) werden als geeignete Ziele für MAB und ihre Verwendung für die Diagnose von Krebs sowie therapeutische Anwendungen angesehen. TAA sind Strukturen, die hauptsächlich auf der Zellmembran von Tumorzellen exprimiert werden und dadurch eine Unterscheidung zu nichtmalignem Gewebe ermöglichen.

[0003] Ob humane TAA, die von xenogenen MABs entdeckt werden, in der Lage sind, bei Krebspatienten eine Antitumor-Immunantwort auszulösen, und ob solche Antigene tatsächlich mit der Antwort auf autologe Tumore bei Krebspatienten in Verbindung stehen, hängt von der Art des jeweiligen TAA ab und ist noch nicht völlig aufgeklärt. TAAs, die im syngeneischen Wirt entweder natürlich immunogen sind oder immunogen gemacht werden können, können möglicher Weise verwendet werden, um für therapeutische und eventuell prophylaktische Zwecke eine Antitumor-Immunität auszulösen.

[0004] Für die passive Immuntherapie werden MABs einem Patienten systemisch in einer geeigneten Menge verabreicht, um direkt an ein Ziel zu binden. Auf diese Weise bildet sich ein Immunkomplex, und durch eine Reihe von Immunreaktionen wird die Zelle bzw. der Organismus, der mit dem Ziel infiziert ist, getötet. Die therapeutische Wirkung hängt von der Konzentration der MABs im Kreislauf und der biologischen Halbwertszeit ab, die üblicher Weise relativ kurz ist. Daher ist es notwendig, die Verabreichung innerhalb eines geeigneten Zeitrahmens zu wiederholen. Wenn xenogene MABs, wie murine Antikörper, verwendet werden, sind jedoch adverse Reaktionen zu erwarten, die möglicher Weise zu einem anaphylaktisehen Schock führen. Daher werden derartige Immuntherapien nur für einen beschränkten Zeitraum angewendet.

[0005] Aktive Immunisierungspläne aktivieren auf spezifische Weise das Immunsystem der Patienten. Nach der Verabreichung eines Antigens, das einem spezifischen Ziel ähnlich ist, löst die humorale und T-Zellen-spezifische Immunantwort des Patienten Abwehrmechanismen aus, um das Ziel in vivo zu bekämpfen. Für die aktive Immunisierung werden diese Antigene üblicher Weise in einer immunogenen Formulierung präsentiert, um einen Impfstoff zur Verfügung zu stellen. Antigene, die die Ziele imitieren, weisen entweder in der primären oder in der sekundären Sequenz der Ziele oder Fragmente davon Ähnlichkeiten auf. Mimotope oder mimotope Antigene jedoch haben Ähnlichkeiten in der tertiären Struktur des Ziels.

[0006] Beispiele für Mimotope sind anti-idiotype Antikörper oder mimotope Antikörper, die die Struktur eines Antigens nachahmen, das als Ziel für das Immunsystem angesehen wird. Idioty-pe Interaktionen üben einen großen Einfluss auf das Immunsystem aus. Die einzigartigen anti-genen Determinanten in und um die Antigenkombinierende Stelle eines Immunglobulin-(lg-) Moleküls, die einen Antikörper von einem anderen unterscheidbar machen, werden als Idiotope definiert. Alle Idiotope, die auf dem variablen Teil eines Antikörpers vorhanden sind, werden als dessen Idiotyp (Id) bezeichnet. Die molekulare Struktur eines Idiotyps ist sowohl auf den komplementären determinierenden Regionen als auch in den Rahmenregionen der variablen Domäne lokalisiert worden, und im Allgemeinen, jedoch nicht immer, leisten sowohl die schweren als auch die leichten Ketten eines Immunglobulins in einer spezifischen Assoziierung ihren Beitrag dazu.

[0007] Idiotype sind serologisch definierte Einheiten. Die Injektion eines Antikörpers (Ab1) in 1 /29

SiSctTiSh^hK ί>3ϊίίΐΐ3ΓΚΐ AT500 650B1 2009-11-15 einen syngeneisehen, allogenen oder xenogenen Empfänger löst die Produktion von anti-idiotypen Antikörpern (Ab2) aus. In Anbetracht der Wechselwirkungen zwischen Idiotyp und anti-ldiotyp wurde von Niels Jerne (Ann. Immunol. 125C, 373, 1974) eine Regulierung des Immunsystems auf Rezeptorbasis postuliert. Seine Theorie eines Netzwerks betrachtet das Immunsystem als eine Sammlung von Ig-Molekülen und Rezeptoren auf T-Lymphozyten, die alle in der Lage sind, eine antigene Determinante (Epitop) durch ihre kombinierende Stelle (Paratop) zu erkennen, und die alle in der Lage sind, von anderen Antikörpern oder Zelloberflächenrezeptoren des Systems durch die Idiotope, die sie aufweisen, erkannt zu werden.

[0008] Tatsächlich haben zahlreiche Studien gezeigt, dass auf der Oberfläche von sowohl B-und T-Lymphozyten als auch auf sekretierten Antikörpern idiotype und anti-idiotype Rezeptoren vorhanden sind. Herlyn et al. geben eine Übersicht über anti-idiotype Antikörper, die für die Entwicklung von Impfstoffen gegen Krebs verwendet werden (in vivo 5: 615-624 (1991)). Die idiotypen Krebs-Impfstoffe enthalten entweder monoklonale oder polyklonale Ab2, um eine Antitumor-Immunität mit einer Spezifität der ausgewählten TAA auszulösen.

[0009] Wenn die Bindung zwischen Ab1 und Ab2 von dem Antigen, auf das Ab1 gerichtet ist, inhibiert wird, wird angenommen, dass der Idiotyp Stellen-bezogen bindet, da er eine Stelle auf der variablen Domäne des Antikörpers involviert, die an der Erkennung von Antigenen beteiligt ist. Diese Idiotypen, die konformationsgemäß ein antigenes Epitop imitieren, werden als inneres Abbild dieses Epitops bezeichnet. Da sowohl ein Ab2 als auch ein Antigen an das relevante Ab1 binden, können sie eine ähnliche dreidimensionale Konformation gemeinsam haben, die das innere Abbild des jeweiligen Antigens darstellt. Bei anti-idiotypen Antikörpern mit innerem Abbild handelt es sich im Prinzip um Substitute für das Antigen, von welchem sie über das idiotype Netzwerk abgeleitet sind. Daher können diese Surrogat-Antigene in aktiven Immunisierungsprotokollen verwendet werden. Die anti-idiotypen Antikörper bieten Vorteile, wenn das ursprüngliche Antigen nicht ausreichend immunogen ist, um eine signifikante Immunantwort auszulösen. Geeignete anti-idiotype Antikörper mit innerem Abbild, die ein nicht-immunogenes Kohlenhydrat-Antigen nachahmen, sind für bestimmte Impfansätze ganz besonders hilfreich.

[0010] Tumor-assoziierte Antigene sind oftmals ein Teil des „Selbst" und lösen bei Krebspatienten nur eine sehr geringe Immunantwort aus. Im Gegensatz dazu werden anti-idiotype Antikörper mit innerem Abbild, die dreidimensionale Formen exprimieren, die den strukturellen Epito-pen der jeweiligen TAA ähneln, im Tumor-tragenden Wirt als fremde Moleküle erkannt.

[0011] Die Immunantwort, die durch therapeutische oder auch prophylaktische Immunisierung mit geeigneten anti-id MABs hervorgerufen wird, kann daher zu Antitumor-Immunität führen.

[0012] Mimotope Antikörper sind wie anti-idiotype Antikörper. Sie gleichen ebenfalls einer Zielstruktur und können möglicherweise das Immunsystem gegen das Ziel aktivieren. In der EP B1 1 140 168 ist beschrieben, dass mimotope Antikörper gegen menschliche Zellmembran-Antigene bei Krebspatienten Antitumor-Immunität erzeugen. Diese Antikörper richten sich gegen die EpCAM-, NCAM-oder CEA-Antigene; von jedem dieser Ziele ist bekannt, dass es mit Tumoren assoziiert ist.

[0013] Eine therapeutische Immunisierung gegen Krebs mit MABs kann in früheren Stadien der Erkrankung besonders erfolgreich sein: Zum Zeitpunkt der Operation eines Primärtumors haben sich einzelne okkulte Tumorzellen oft bereits in verschiedenen Organe des Patienten ausgebreitet. Es ist bekannt, dass diese Mikrometastasen-Zellen die Ursache für das spätere Wachstum von Metastasen sind, oft Jahre nach der Diagnose und der operativen Entfernung des gesamten klinisch erwiesenen Tumorgewebes. Bisher ist Metastasenkrebs epithelialen Ursprungs in fast allen Fällen unheilbar.

[0014] Daher ist die wirksame Behandlung von „minimal residual cancer" (minimalem Restkrebs), z.B. die Zerstörung okkulter, disseminierter Tumorzellen oder Mikrometastasen-Zellen zur Verhinderung des Wachstums von Metastasen eine dringende medizinische Notwendigkeit. In diesen Stadien der Erkrankung haben herkömmliche chemotherapeutische Ansätze (als Hilfseinstellung) eher nicht sehr viel Erfolg. Durch die Immunisierung mit geeigneten MAB kann 2/29 P9tet8»t AT500 650B1 2009-11-15 jedoch zum Zeitpunkt einer minimalen Resterkrankung (minimal residual disease) eine spezifische Antitumor-Immunität erreicht werden. Mikrometastasen-Zellen können so durch das Immunsystem selektiv eliminiert werden, was zu einer verlängerten Überlebenszeit ohne Rückfälle führt.

[0015] Monoklonale Antikörper mit der Spezifität BR55-2 (geoffenbart z.B. in Wistar EP 285 059 A2, M. Blaszcyk-Thurin et al., J. Biol. Chem. 262 (1987) 372-379, oderZ. Steplewski et al., Hybridoma 9 (1990) 201-210) binden an das Lewis Y6 Antigen, eine auf der Mehrheit menschlicher fester Tumore selektiv exprimierte Kohlenhydratdeterminante. Auf Grund ihrer Eigenschaften können Antikörper BR55-2 für die passive Immuntherapie von Epithelkrebs verwendet werden.

[0016] Die Tumor-assoziierte Lewis Y Oligosaccharid-Determinante, die auch während bestimmter Stadien der embryonalen Entwicklung exprimiert wird, ist an sich fast nicht immuno-gen. Monoklonale anti-idiotype Antikörper (Ab2) gegen BR55-2 (Ab1) mit inneren Abbildungseigenschaften durch Nachahmen der strukturellen Epitope des Lewis Y Antigens sind jedoch für die Induzierung einer schützenden Antitumor-Immunität nützlich, insbesondere in den früheren Stadien der Erkrankung (EP B1 0 644 947 A1).

[0017] In der EP 0 644 947 A1 ist beschrieben, dass monoklonale anti-idiotype Antikörper (Ab2) gegen BR55-2 (Ab1) mit inneren Abbildungseigenschaften zum Hervorrufen von Immunität gegen sowohl freie HIV als auch HlV-infizierte Zellen verwendet werden.

[0018] Neben ihrer Expression auf Krebs epithelialen Ursprungs ist das Lewis Y-Kohlenhydratantigen auch an der Pathogenese der Infektion mit humanem Immunschwächevirus (HIV) beteiligt. Erworbenes Immunschwächesyndrom (AIDS) wird als eine distinkte Erkrankung erkannt, wobei herausgefunden wurde, dass ihre Ätiologie mit einer Infektion eines lymphotrophen Retrovirus (HIV) zusammenhängt. Die Erkrankung ist durch eine Störung im Zusammenhang mit einer gestörten Zell-mediierten Immunität und absoluten Lymphopenie, insbesondere reduzierte Helfer-T-Lymphozyten (CD4) gekennzeichnet. AIDS kann ein Vorsyndrom vorangehen, das sich üblicher Weise durch einen Komplex von bestimmten klinischen Merkmalen und Helfer-T-Lymphopenie manifestiert. Das Vorsyndrom wird als AIDS-bezogener Komplex (AIDS related complex, ARC) bezeichnet.

[0019] HIV gehört zu einer Gruppe von Viren, die in den letzten Jahrzehnten intensiv untersucht worden sind. Wenn ein Retrovirus in eine menschliche oder tierische Zelle eindringt, wird die RNA zu DNA und wird in die Wirtszelle eingeschleust, die dann getäuscht und dazu gebracht wird, die Gene des Virus als ihre eigenen zu behandeln. HIV kann in diesen Zellen jahrelang latent bleiben; dort ist es sicher vor den Attacken durch das Immunsystem des Körpers und wird jedes Mal blind kopiert, wenn sich die Wirtszelle teilt. Nur wenn durch eine Aktivierung der infizierten Zellen eine rasche Virusreplikation ausgelöst wird, töten die produzierten Viruspartikel diese Zellen und ergießen sich in den Blutkreislauf.

[0020] HlV-infizierte Zellen exprimieren in vitro und in vivo auf ihrer Oberfläche ein verändertes Glykosylierungsmuster, nämlich die Lewis Y Kohlenhydratdeterminante. Dieses Antigen kommt normaler Weise nur während bestimmter Entwicklungsstadien des Fötus vor und steht auch in Zusammenhang mit einer Reihe von Malignitäten. Die Expression von HlV-infizierten Zellen kann ihren veränderten Differenzierungsstatus widerspiegeln, der durch die Transformation durch das Retrovirus ausgelöst worden ist. Das Lewis Y Oligosaccharid stellt eine spezifische Antwort des Wirts dar, die sowohl auf HlV-infizierten Zellen als auch auf freien HlV-Partikeln exprimiert wird.

[0021] EpCAM (Epithelial Cell Adhesion Molecule, Epithelzellen-Adhäsionsmolekül) wird auf fast allen Tumoren epithelialen Ursprungs exprimiert, kommt jedoch auch auf einer großen Anzahl von normalem Epithelgewebe oder Epithelzellen vor. Es ist als selbstklebendes Molekül charakterisiert worden und wird als pan-epitheliales Adhäsions-Antigen klassifiziert (J. Cell Biol. 125: 437 (1994)). Als ein auf der Membran verankertes Glykoprotein spielt es in Krebsgeweben bei der Adhäsion zwischen den Zellen eine sehr starke Rolle. 3/29 [0022] Von menschlichem Epithel-Antigen EpCAM abgeleitete Peptide werden für die Behandlung oder Prophylaxe von mit EpCAM assoziierten Krebsarten, für die Induzierung einer zytotoxischen T-Lymphozytenantwort, die gegen EpCAM-positive Tumorzellen wirkt, und für diagnostische Zwecke vorgeschlagen (WO A1 97/15597 A1).

[0023] In der US 6 444 207 B1 ist eine Immuntherapie für Tumore mit einem monoklonalen Antikörper gegen das 17-1A Antigen, das eine Determinante des EpCAM-Moleküls ist, beschrieben. Für die passive Immuntherapie von Gastrointestinalkrebs werden multiple Dosen von etwa 400 mg oder mehr verabreicht.

[0024] In der EP 1140 168 B1 ist eine immunogene Formulierung von HE2 beschrieben, einem EpCAM-spezifischen, murinen lgG2a-Antikörper. Immunisierungsstudien haben das Auslösen einer starken, Antigenspezifischen Immunantwort nachgewiesen, die mit EpCAM kreuzreagiert und komplementäre Faktoren aktiviert, um die Lyse von Tumorzellen auszulösen. Studien an Rhesusaffen und klinische Daten wiesen auf eine hohe Immunogenität des HE2-Immunisierungs-Antigens hin.

[0025] Die Expression rekombinanter Proteine in höheren eukaryotischen Zellen stellt in der modernen Biologie ein essentielles Werkzeug dar. Die Verfeinerung von Genexpressionsvektoren von Säugetieren ermöglichte den Fortschritt auf diversen wissenschaftlichen Gebieten (Makrides, Protein Expression and Purification 17: 183-202 (1999)). Auf Grund der erhöhten Nachfrage nach menschlichen Antikörpern zur Verwendung in der Therapie von Menschen sind Studien über eine geeignete Zelllinie für die Produktion solcher komplexen Moleküle mit hoher Ausbeute durchgeführt worden. Menschliche oder Mensch-Maus-Hetero-Hybridome haben oft gewisse Grenzen, wie niedrige Wachstumsraten und hohe Serumanforderungen. Dies hat zur alternativen Verwendung rekombinanter Zellen zur Herstellung rekombinanter Antikörper geführt, mit den Vorteilen der Auswahl der Zelllinien für die Transfektion, Kontrolle des Antikörper-Isotyps, Kontrolle der Expression unter Verwendung starker Promotoren etc. (Strutzenberger et al., J. Biotechnology 69 (2-3): 215-26 (1999)). Das Standardmodell der Proteintranslation gilt für die weitaus größte Anzahl von eukaryotischen mRNAs und beinhaltet den Eintritt der Ribosome an der 5'-Kappenstruktur, gefolgt vom Scannen der mRNA in Richtung von 5' nach 3' bis zum Erreichen des Initiierungskodons. Auf dem Gebiet der IgG-Expression wird das Biomolekül von 4 richtig gefalteten Untereinheiten zusammengesetzt. Die Menge und die Lokalisierung dieser verschiedenen Untereinheiten beeinflussen in starkem Maße das Falten durch die Selbstorganisation des Expressionsproduktes und daher seine biologische Aktivität.

[0026] In der US 6 331 415 B1 sind Verfahren zur Herstellung rekombinanter Immunglobuline, Vektoren und transformierter Wirtszellen beschrieben. Es werden ein oder mehrere Vektoren verwendet, um sowohl schwere als auch leichte Ketten eines Antikörpers oder Fragmente davon in einer einzelnen Zelle herzustellen. Die geoffenbarten Wirte sind Bakterienzellen oder Hefe.

[0027] Auf Grund unterschiedlicher Mengen der Gene, die die Immunglobulin-Untereinheiten kodieren, die in das Wirtsgenom integriert sind, kann es zu falsch gefalteten und biologisch inaktiven Expressionsprodukten kommen. Es ist erforderlich, dass zwei verschiedene Gene transkribiert und vier Polypeptidketten in ausgewogener Weise zusammengesetzt werden. Daher sind für die Produktion von Antikörpern oligocistrone Expressionssysteme beschrieben (WO 98/11241 A1). Die oligocistronen Expressionsvektoren stehen unter der Kontrolle einer starken Promotor/Verstärker-Einheit, eines Selektions-Markergens und mindestens zwei IRES-(Internal Ribosomal Entry Site) Elementen.

[0028] Bi-cistrone Expressionsvektoren können für eine ausgewogene Expression der Polypeptidketten geeignet sein. IRES-Elemente werden üblicher Weise vom Encephalomyocarditis-Virus, Maul- und Klauenseuche-Virus oder Poliovirus abgeleitet. Ribosome sind in der Lage, an den IRES-Stellen in ein mRNA-Molekül einzudringen und die Translation mehrerer offener Leserahmen auf dem selben mRNA-Strang zu initiieren. Der größte Vorteil dieser Konstrukte ist die Möglichkeit, unterschiedliche Gene unter der Kontrolle eines einzigen Promotors zu expri-mieren, unabhängig von ihren Integrationsstellen in das Wirtsgenom. Selektionsmarker inte-

JssitTiichsKhss päiwtamt AT500 650B1 2009-11-15 grieren sich unabhängig von den gewünschten Genen, die exprimiert werden sollen, in das Wirtsgenom.

[0029] Um mögliche Probleme bei der wiederholten Verwendung von Maus-Antikörpern zur Behandlung von Menschen zu überwinden, können durch das Kombinieren der variablen Domänen eines gewählten elterlichen murinen MAB mit menschlichen konstanten Regionen Chimäre Maus/Mensch-MABs erzeugt werden. Um die Eigenschaften von MABs zur Verwendung in der passiven Immuntherapie noch weiter zu verbessern, werden mit rekombinanter DNA-Technologie „völlig humanisierte" Antikörper konstruiert. Minimale Teile eines elterlichen Maus-Antikörpers, die die CDRs (Complementarity Determining Regions) enthalten, werden mit Rahmen menschlicher variabler Regionen und menschlicher konstanter Regionen kombiniert. Für die Zusammenstellung und den Aufbau dieser „völlig humanisierten" MABs werden Sequenzhomologie und Molekülmodellieren verwendet, um eine Kombination von menschlichen und murinen Sequenzelementen auszuwählen, die die Immunogenität weiter reduzieren, während sie die Bindeeigenschaften behalten.

[0030] Schneider et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 2509-13 (1988)) beschreiben gentechnisch veränderte Immunglobuline, die Strukturmerkmale aufweisen, die die segmenteile Flexibilität eines Immunglobulins kontrollieren. Die untersuchten Proteine waren Hybride eines relativ rigiden Isotyps (Maus lgG1) und eines relativ flexiblen (Maus lgG2a).

[0031] Die WO 00/41722 A1 offenbart die Verwendung eines Antikörpers, der gegen ein tumorspezifisches zelluläres Membranantigen gerichtet ist. Bei diesem Antikörper handelt es sich um einen monoklonalen lgG2a/kappa Antikörper, der an ein EpCAM-Epitop bindet.

[0032] In der WO 01/21796 A2 wird die Herstellung von lgG2a-Fusionsproteinen, die mit einem neuen Oberflächenrezeptor (ICOS) oder costimulatorischen Molekülen (GL50) verknüpft sind, beschrieben. Dabei dient das lgG2a-ICOS-Fusionsprotein zum Nachweis von GL50 z.B. in einem ELISA-Test.

[0033] In der WO 97/40140 A1 wird die Herstellung eines monoklonalen Antikörpers (ein lgG2a-lsotyp) beschrieben. Dieser Antikörper imitiert funktionell die Struktur des Gangliosids GD2.

[0034] In der US 5 977 315 A wird die Herstellung eines anti-idiotypischen Antikörpers, der gegen das CEA-Antigen gerichet ist, beschrieben.

[0035] Steinitz et al. (J Immunol 141 (1988): 3516-3522) offenbaren humane monoklonale anti-idiotypische Antikörper, die murine Antikörper gerichtet gegen Kolon-Karcinomzellen zu binden vermögen, und den monoklonalen Antikörper mAb17-1A.

[0036] Fagerberg et al. (Cancer Immunol Immunther 42 (1996): 81-87) offenbaren einen murinen und einen chimeren monoklonaren Antikörper, der in der Lage ist, das Tumor-assoziierte Antigen GA733-2 zu binden. Derartige Antikörper können für die Immunisierung von Patienten, die an kolorektalem Karzinom leiden, verwendet werden.

[0037] Das Ziel der Erfindung bestand darin, Präparate von monoklonalen Antikörpern mit verbesserten immunogenen Eigenschaften zur Verwendung zur Immunisierung von Patienten, insbesondere Krebspatienten, zur Verfügung zu stellen.

[0038] Erfindungsgemäß wird ein immunogener rekombinanter Antikörper zur Verfügung gestellt, der für die aktive Immunisierung von Primaten ausgelegt ist. Der Antikörper umfasst zumindest einen Teil einer murinen Aminosäuresequenz vom lgG2a-Subtyp und eine Säugetier-Glykosylierung. Der erfindungsgemäße Antikörper wird durch rekombinante Nukleinsäuretechnologie erhalten, insbesondere rekombinante DNA-Technologie, um den immunogenen Antikörper in standardisierter Form herzustellen.

[0039] Immunisierungsstudien haben überraschender Weise gezeigt, dass der murine lgG2a-Teil für den Aufbau eines immunogenen Antikörpers von kritischer Bedeutung ist, insbesondere im Vergleich zu lgG1-Antikörpern. Im Folgenden wird der immunogene Antikörper, der zumindest einen Teil der erfindungsgemäßen lgG2a-Aminosäuresequenz umfasst, als „lgG2a immu- 5/29

ί>3ϊίίΐΐ3ΓΚΐ AT500 650 B1 2009-11-15 nogener Antikörper" bezeichnet. Der Ausdruck „immunogen" definiert jegliche Struktur, die in einem spezifischen Wirtssystem zu einer Immunantwort führt. Zum Beispiel sind ein muriner Antikörper oder Fragmente davon bei Menschen höchst immunogen, insbesondere in Kombination mit Hilfsstoffen. Ein erfindungsgemäßer immunogener Antikörper kann auf Grund seiner Spezifität oder auf Grund seiner Struktur Immunogenität haben. Der immunogene Antikörper kann vorzugsweise auch dann Immunogenität induzieren, wenn er denaturiert oder mit bestimmten Strukturen oder Trägern konjugiert ist.

[0040] Die von den erfindungsgemäßen lgG2a immunogenen Antikörpern induzierte humorale Immunantwort ist in Bezug auf die Quantität der spezifischen, von den Patienten induzierten Antikörper und die Spezifität gegen ausgewählte Ziele und Epitope signifikant verbessert. Überraschender Weise stellte sich heraus, dass die verbesserte Immunantwort vom Glykosylierungsmuster des Antikörpers abhängig ist. Eine nicht glykosylierte oder deglykosylierte Variante des erfindungsgemäßen lgG2a immunogenen Antikörpers kann ebenfalls eine Immunantwort auslösen.

[0041] Es hat sich herausgestellt, dass insbesondere CHO (Chinese Hamster Ovary) oder menschliche Glykosylierung einen immunogenen Antikörper liefert, der besser sein kann als die nicht glykosylierte Variante. Glykosylierungsmuster von Nagetieren oder von Primaten, darunter von Menschen oder Schimpansen, werden bevorzugt. Vorzugsweise sind die Nagetiere keine Mäuse.

[0042] Der Antikörper kann eine murine Aminosäuresequenz oder irgendeine andere Säugetier-Aminosäuresequenz haben, die mit dem murinen lgG2a-Teil kombiniert ist. Bevorzugte Säugetier-Sequenzen sind menschliche oder humanisierte oder Mensch/Maus-chimäre oder murine Sequenzen. Zu den bevorzugten Antikörpern gehören daher murine, Chimäre oder humanisierte sowie „völlig humanisierte" Antikörper.

[0043] Der erfindungsgemäße lgG2a immunogene Antikörper ist vorzugsweise ein anti-idiotyper Antikörper (Ab2) oder ein mimotoper Ab 1-Antikörper. Entweder wird der funktionelle Antikörper zur Verfügung gestellt oder Fragmente, Varianten und Derivate davon. Ein funktioneller Antikörper besteht aus zwei Arten von Polypeptidketten, die in weitere Untereinheiten geteilt werden können, die beiden großen, schweren Ketten und die beiden leichten Ketten. Die Polypeptide sind über Disulfidbrücken und nicht-kovalente Bindungen miteinander verbunden. Die leichten Ketten sind entweder lambda- oder kappa-Ketten. Vorzugsweise weist der funktioneile Antikörper eine natürliche Spezifität auf und kann das Komplementsystem aktivieren. Noch mehr bevorzugt hat er eine neutralisierende Wirkung. Der erfindungsgemäße mimotope Antikörper imitiert vorzugsweise ein Antigen oder ein Ziel, das vom Idiotyp des Antikörpers selbst erkannt wird. Der idiotype Antikörper (Ab1) ist vorzugsweise gegen ein Tumorassoziiertes Antigen, TAA, gerichtet. Der bevorzugte erfindungsgemäße Ab2-Antikörper ist gegen den Idiotyp eines für ein TAA spezifischen Antikörpers gerichtet.

[0044] Erfindungsgemäße lgG2a immunogene Antikörper können die spezifischen Epitope aufweisen, die entweder in der ursprünglichen Säugetier-Aminosäuresequenz vorhanden sind oder durch Veränderung des Antikörpers eingeführt wurden, einschließlich Rekombinations-, Konjugations- und Derivatisierungstechniken.

[0045] Im Prinzip kann ein Molekülmodellieren durchgeführt werden, um den erfindungsgemäßen Antikörper umzuformen. Die möglichen Variationen sind vielfältig und reichen von der Veränderung nur einer oder einiger weniger Aminosäuren bis zum völligen Umbau der konstanten Region, um ein Beispiel zu nennen. Veränderungen in der konstanten Region werden im Allgemeinen durchgeführt, um die zellulären Prozesscharakteristika zu verbessern, wie Komplementfixierung, Interaktion mit Membranen und andere Effektorfunktionen. Veränderungen in der variablen Region werden durchgeführt, um die Antigen-Bindungscharakteristika zu verbessern. Diese Veränderungen können durch standardmäßige Rekombinationstechniken und auch durch oligo-gerichtete Mutagenesetechniken erfolgen (Dalbadie-McFarland et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 79: 6.409 (1982), WO 91/17177 A1 Berstein et al., J. Mol. Biol. 112: 535-542 (1977)). 6/29

(S5Mriii£lii${hö pstetaist AT500 650 B1 2009-11-15 [0046] Die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen lgG2a Antikörpers kann mit der ursprünglichen Säugetier-Aminosäuresequenz ident sein, sie kann jedoch auch Aminosäurevariationen enthalten, die zu einem lgG2a Antikörper mit immunogenen Eigenschaften führen, die mit jenen des lgG2a Antikörpers, der die ursprüngliche Säugetier-Aminosäuresequenz enthält, vergleichbar, vorzugsweise identisch ist.

[0047] Zum Beispiel können die Aminosäure-Variationen eine Variation einer oder mehrerer Aminosäuren sein, vorzugsweise nicht mehr als 10 Aminosäuren, noch mehr bevorzugt nicht mehr als 5 Aminosäuren, am meisten bevorzugt 1 Aminosäure im Vergleich zur Sequenz eines lgG2a Antikörpers, wie er von Sun et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 84: 214-8 (1987))) bekannt ist oder gemäß Fig. 6 oder 7.

[0048] Vorzugsweise liegt die Aminosäurevariation innerhalb der kappa-Kette des Antikörpers, vorzugsweise etwa 10 Aminosäuren nach dem Ende der 3. Komplementdeterminierungsregion (complement determining region, CDR). Die Aminosäurevariation kann jegliche Aminosäure sein, vorzugsweise das Ersetzen eines Lysins durch ein Arginin.

[0049] Der Ausdruck „Epitop" definiert jegliche Region eines Moleküls, die von einem spezifischen Antikörper erkannt werden kann oder die die Bildung dieser spezifischen Antikörper auslöst. Epitope können entweder konforme oder lineare Epitope sein.

[0050] Bevorzugte Epitope, die vom lgG2a immunogenen Antikörper präsentiert werden, werden von Antigenen abgeleitet, die für Epitheltumore spezifisch sind und vorzugsweise häufig bei Brustkrebs, Gastrointestinal-, Colorektal-, Prostata-, Pankreas-, Eierstock- und Lungenkrebs exprimiert werden, wobei es sich entweder um Kleinzell-Lungenkrebs (small cell lung cancer, SCLC) oder nicht-Kleinzell-Lungenkrebs (non small cell lung cancer, NSCLC) handelt. Die bevorzugten Epitope induzieren insbesondere eine humorale Immunantwort und die Bildung spezifischer Antikörper in vivo. Die erfindungsgemäßen Antikörper induzieren vorzugsweise auch eine T-Zellen-spezifische Antwort. Diese kann vorzugsweise durch Koppelung von Kohlenhydratresten an den erfindungsgemäßen Antikörper ausgelöst werden, wie Lewis Antigene, z.B. Lewis x-, Lewis b- und Lewis y-Strukturen, auch sialylierte Lewis x-Strukturen, GloboH-Strukturen, KH1, Tn-Antigen, TF-Antigen und alpha-1 -3-Galactosyl-Epitop.

[0051] Zu den bevorzugten Epitopen gehören Protein-Epitope, die auf malignen Zellen fester Tumore exprimiert werden, z.B. TAG-72, MUC1, Folatbindungsprotein A-33, CA125, HER-2/neu, EGF-Rezeptoren, PSA, MART etc. Weiters können Peptide von T-Zellen-Epitopen oder Mimotope solcher T-Zellen-Epitope vom erfindungsgemäßen Antikörper präsentiert werden. Geeignete Epitope werden üblicher Weise in mindestens 20% der Fälle einer bestimmten Erkrankung oder Krebs, vorzugsweise in mindestens 30 %, mehr bevorzugt in mindestens 40 %, am meisten bevorzugt in mindestens 50 % der Fälle exprimiert.

[0052] Gemäß der Erfindung gibt es bevorzugte Kohlenhydratepitope, die von Tumorassoziierten, aberranten Kohlenhydratstrukturen, wie Lewis Antigenen, abgeleitet werden, z.B. Lewis x-, Lewis b- und Lewis y-Strukturen, auch sialylierte Lewis x-Strukturen, GloboH-Strukturen, KH1, Tn-Antigen, TF-Antigen und alpha-1-3-Galactosyl-Epitope.

[0053] Die bevorzugten TAA-Ziele oder Epitope sind ausgewählt aus der Gruppe von Determinanten, abgeleitet von der Gruppe von Antigenen bestehend aus Peptiden oder Proteinen, wie EpCAM, NCAM, CEA und T-Zellen-Peptiden, Kohlenhydraten, wie aberrante Glykosylierungsmuster, Lewis Y, Sialyl-Tn, Globo H und Glykolipide, wie GD2, GD3 und GM2. Erfindungsgemäße mimotope Antikörper werden am meisten bevorzugt, wenn sie ein Epitop eines solchen TAA imitieren und gleichzeitig gegen ein anderes oder das gleiche TAA gerichtet sind, zum Beispiel ein mimotoper Antikörper, der gegen ein zelluläres Adhäsionsmolekül gerichtet ist, wie EpCAM, NCAM oder CEA.

[0054] Zusätzlich kann der erfindungsgemäße Antikörper ein Mimotop oder mimotope(s) Antigenie) oder antigene Struktur(en) enthalten, die eine Immunantwort auslösen, die für Epithelzel-len-spezifische Adhäsionsmoleküle spezifisch ist. Vorzugsweise löst der erfindungsgemäße lgG2a immunogene Antikörper die Entwicklung von EpCAM- spezifischen Antikörpern aus. 7/29 päteöäst AT500 650B1 2009-11-15

Vorzugsweise kann der erfindungsgemäße Antikörper eine EpCAM-spezifische Gelenk-Region enthalten.

[0055] Es ist gefunden worden, dass die Aminosäuresequenz der lgG2a Gelenk-Region im Vergleich zu der Ep-CAM-Aminosäuresequenz Strukturen der Homologie aufweist. Die verwendete Nummerierung der Aminosäuresequenz ist identisch mit der Nummerierung, wie sie von Strnad J. et al., Cancer Res., 49 (1989), 314-317, veröffentlicht wurde. Diese Homologien könnten die Spezifität des erfindungsgemäßen Antikörpers für Ep-CAM beeinflussen. Zum Beispiel weisen die Aminosäuren 36 bis 42, die Aminosäuren 117 bis 131, die Aminosäuren 124 bis 134 und die Aminosäuren 144 bis 160 eine signifikante Homologie zwischen 29 % und 57 % zu Regionen innerhalb der Gelenk-Region von lgG2a Antikörpern auf.

[0056] Weitere bevorzugte Antigene oder Ziele werden von Antigenen von Infektionserregern abgeleitet, wie viralen, bakteriellen, fungalen, übertragbaren spongiformen Enzephalitis- (TSA) Erregern oder parasitischen Erregern. Zu den bevorzugten Antigenen oder Zielen zählen Determinanten von Glykosylierungsmustern des Virus und infizierter Zellen, wie Lewis Y Glykosylierung von infizierten HlV-Zellen.

[0057] Es gibt im Stand der Technik bekannte Verfahren zur Definition geeigneter Antigene, Determinanten und verwandter Epitope, die notwendig sind, um die Peptide, Polypeptide oder Proteine, verwandte Nukleinsäuren, Lipoproteine, Glykolipide, Kohlenhydrate oder Lipide zu erzeugen, die von TAA oder Infektionserregern abgeleitet werden. Ohne unnötige Experimente wird daher der lgG2a immunogene Antikörper durch Auswahl des geeigneten Ab1 mimotopen oder Ab2 Antikörpers zusammengestellt und erzeugt, gegebenenfalls unter Modifizierung seiner Aminosäuresequenz und Expression desselben in einer geeigneten rekombinanten Wirtszelle.

[0058] Der erfindungsgemäße lgG2a immunogene Antikörper kann spezifisch aufgebaut sein, um Charakteristika von Komposit- oder Hybrid-Antikörpern aufzuweisen, um zumindest 2 Typen oder Subtypen von Immunglobulinen zu kombinieren. Der bevorzugte bi-isotype Antikörper wird zum Beispiel von einem lgG1 oder lgG3 Antikörper ausgewählt, der die Aminosäuresequenz vom lgG2a-Subtyp enthält. Die Aminosäuresequenz vom lgG2a-Subtyp wird entweder in die Sequenz des elterlichen Antikörpers eingeführt oder ist ein Ersatz für ähnliche Teile des elterlichen Antikörpers. Die bevorzugte Lokalisation der lgG2a Sequenz liegt in der konstanten Region des Antikörpers, am meisten bevorzugt in mindestens einer der Regionen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Regionen CL, CH1, Gelenk, CH2 und CH3. Am meisten bevorzugt ist ein Antikörper, bei welchem die lgG2a Region innerhalb der Gelenk-Region liegt.

[0059] Der beste Modus des lgG2a immunogenen Antikörpers bezieht sich auf einen anti-idiotypen Antikörper gegen monoklonale Antikörper, produziert von ATCC HB 9324 oder ATCC HB 9347, hybridisiert mit zumindest einem Teil einer murinen Aminosäuresequenz eines lgG2a Antikörpers. Der lgG2a immunogene Antikörper ist vorzugsweise ein Konstrukt einer anti-idiotypen Lewis Y imitierenden hypervariablen Region und der hochgradig immunogenen murinen lgG2a konstanten Regionen zur Bildung eines funktionellen Antikörpers.

[0060] Die Erfindung umfasst weiters Impfstoffe für Immunisierungszwecke, die den lgG2a immunogenen Antikörper in einer pharmazeutischen Formulierung umfassen. Die pharmazeutische Formulierung enthält vorzugsweise Hilfsmittel oder Adjuvantien, um die Qualität eines Injektionspräparats in Bezug auf Sicherheit, Verträglichkeit und Immunogenität zu verbessern. Die Zusammenstellung des Impfstoffs ist abhängig von den behandelten Primaten, darunter insbesondere Menschen oder Schimpansen.

[0061] Die erfindungsgemäßen Impfstoffe können geeigneter Weise für die Prophylaxe und Therapie von mit Krebs in Zusammenhang stehenden Erkrankungen verwendet werden, z.B. Metastasenerkrankungen bei Krebspatienten. Der erfindungsgemäße Impfstoff moduliert spezifisch Antigen präsentierende Zellen in vivo oder ex vivo, wodurch er eine Immunantwort auf das Epitop auslöst, auf das vom lgG2a immunogenen Antikörper abgezielt wird.

[0062] Ein erfindungsgemäßer Impfstoff enthält typischer Weise den lgG2a immunogenen Antikörper in geringen Konzentrationen. Die immunogene Menge liegt oft im Bereich von 0,01 8/29

SiSctTiSh^hK ί>3ϊίίΐΐ3ΓΚΐ AT500 650B1 2009-11-15 pg bis 10 mg. Je nach der Art des Antikörpers kann die Immunogenität durch xenogene Sequenzen oder Derivatisierung des Antikörpers verändert werden. Außerdem erhöht die Verwendung von Adjuvantien die Immunogenität des lgG2a Antikörpers noch weiter. Die immuno-gene Dosis eines Antikörpers, der geeigneter Weise mit einem Adjuvans formuliert ist, liegt daher vorzugsweise zwischen 0,01 pg und 750 pg, am meisten bevorzugt zwischen 100 pg und 500 pg. Ein Impfstoff, der für die Injektion eines Depots ausgelegt ist, enthält jedoch wesentlich größere Mengen des lgG2a immunogenen Antikörpers, z.B. mindestens 1 mg bis zu 10 mg. Das Immunogen wird so abgegeben, um das Immunsystem über einen längeren Zeitraum hinweg zu stimulieren.

[0063] Üblicher Weise wird der erfindungsgemäße Impfstoff als gebrauchsfertiges Präparat in einer Einwegspritze zur Verfügung gestellt, die ein Volumen von 0,01 bis 1 ml, vorzugsweise 0,1 bis 0,75 ml enthält. Die derart zur Verfügung gestellte Impfstofflösung oder -Suspension ist hoch konzentriert. Die Erfindung bezieht sich weiters auf ein Kit zum Impfen von Patienten, das den Impfstoff und geeignete Verabreichungsmittel enthält, wie eine Spritze, Injektionswerkzeuge, Pistolen etc.

[0064] Der Impfstoff ist spezifisch formuliert, um ein pharmazeutisches Präparat zu erzeugen, das für die subkutane, intramuskuläre, intradermale oder transdermale Verabreichung geeignet ist. Ein weiterer möglicher Weg ist die mukosale Verabreichung, entweder durch nasale oder perorale Impfung. Wenn Feststoffe verwendet werden, um die pharmazeutische Formulierung herzustellen, wird der lgG2a immunogene Antikörper entweder als Adsorbat oder in Suspension mit den Feststoffen verabreicht. Bestimmte Ausführungsformen enthalten wässerige Medien für die Suspendierung der Formulierung oder für Lösungen des lgG2a immunogenen Antikörpers, um einen flüssigen Impfstoff zur Verfügung zu stellen.

[0065] Üblicher Weise ist der Impfstoff bei Kühltemperatur lagerungsstabil. Es können jedoch Konservierungsmittel, wie Thimerosal oder andere Mittel mit verbesserter Verträglichkeit verwendet werden, um seine Lagerungsstabilität zu verbessern, um längere Lagerungszeiten auch bei höheren Temperaturen bis zur Zimmertemperatur zu ermöglichen. Der erfindungsgemäße Impfstoff kann auch in gefrorener oder lyophilisierter Form zur Verfügung gestellt werden, die bei Bedarf aufgetaut bzw. rekonstituiert wird.

[0066] Bevorzugte pharmazeutische Formulierungen enthalten pharmazeutisch annehmbare Träger, wie Puffer, Salze, Proteine oder Konservierungsmittel.

[0067] Beispiele für Adjuvantien, die die Effizienz des erfindungsgemäßen Impfstoffs verbessern, sind Aluminiumhydroxid (Alumgel) oder Aluminiumphosphat, wie Wachstumsfaktoren, Lymphokine, Cytokine, wie IL-2, IL-12, GM-CSF, gamma-lnterferon, oder Komplement-Faktoren, z.B. C3d, liposomale Präparate und Formulierungen zusätzlicher Antigene, die starke Immunogene sind, wie Tetanustoxoid, bakterielle Toxine, wie Pseudomonas Exotoxine und Derivate von Lipid A.

[0068] Zusätzlich können Verfahren zur Fierstellung von Antikörperkonjugaten oder denaturierten Impfstoffkomponenten verwendet werden, um die Immunogenität des lgG2a immunogenen Antikörpers zu erhöhen. Mischungen des lgG2a immunogenen Antikörpers und weiterer Impfstoff-Antigene, insbesondere verschiedener anti-idiotypen Antikörper, können für eine gleichzeitige Impfung dienen.

[0069] Der lgG2a immunogene Antikörper wird durch gentechnische Veränderung als rekombi-nantes Molekül hergestellt. Geeignete Wirtszellen sind CFIO- (Chinese Flamster Ovary) -Zellen, BFIK- (Baby Flamster Kidney) -Zellen, FIEK- (Fluman Embryonic Kidney) -Zellen oder ähnliche. Auf jeden Fall erhält der translatierte Antikörper so das Glykosylierungsmuster der Wirtszelle, was für die Immunogenität des Antikörpers von kritischer Bedeutung ist. Wenn eine Wirtszelle ausgewählt wird, die keine Glykosylierung erzeugt (wie Bakterienzellen, wie E. coli), kann der Antikörper mit chemischen oder enzymatischen Mitteln glykosyliert werden. Das Glykosylierungsmuster kann durch übliche Techniken verändert werden.

[0070] Spezifische Wirtszellen können an Fland ihrer Fähigkeit ausgewählt werden, ein glykosy- 9/29

fete»!« AT500 650 B1 2009-11-15 liertes Expressionsprodukt zu erzeugen. Wirtszellen könnten auch derart modifiziert werden, dass sie jene Enzyme produzieren, die für eine spezifische Glykosylierung notwendig sind (Glycoconj. J. (1999), 16: 81).

[0071] Wirtszellen, die den erfindungsgemäßen Antikörper exprimieren, werden vorzugsweise ohne Verwendung von Serum oder Serumkomponenten kultiviert. Übliche Kultivierungsmedien können bovines Serum enthalten, wodurch bovine Immunglobuline in das geerntete Medium eingeführt werden. Diese bovinen Immunglobuline oder IgG können schwer vom Expressionsprodukt zu trennen sein, das der erfindungsgemäße lgG2a immunogene Antikörper ist. Daher wird das Expressionsprodukt vorzugsweise durch Kultivierung der Wirtszellen in einem serumfreien Medium erhalten, d.h. ohne Verwendung von bovinem Serum, um einen Antikörper ohne bovine IgG zu erzeugen, wie mit HPLC-Verfahren gemessen wird.

[0072] Der lgG2a immunogene Antikörper kann eine native Struktur eines funktionell intakten Antikörpers haben. Es kann jedoch von Vorteil sein, ein Antikörperderivat herzustellen, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe von Antikörperfragmenten, -Konjugaten oder -Homologen. Bevorzugte Derivate enthalten zumindest Teile des Fab-Fragments, am meisten bevorzugt zusammen mit zumindest Teilen des F (ab')2-Fragments und/oder Teilen der Gelenk-Region und/oder Teilen der Fc-Region eines lambda- oder kappa-Antikörpers. Diese Fragmente können mit aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden, z.B. Spaltung eines monoklonalen Antikörpers mit proteolytischen Enzymen, wie Papain oder Pepsin, oder durch rekombinante Verfahren. Diese Fab- und F (ab)2-Fragmente können auch mit Hilfe einer Phage Display Genbibliothek hergestellt werden (Winter et al., 1994, Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455). Der erfindungsgemäße lgG2a immunogene Antikörper ist üblicher Weise vom Typ IgG, IgM oder IgA.

[0073] Weiters kann ein Einzelketten-Antikörperderivat als erfindungsgemäßer lgG2a immuno-gener Antikörper verwendet werden.

[0074] Das bevorzugte Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Antikörpers macht sich ein multicistrones Antikörper-Expressionskonstrukt zunutze, das in einem CHO-, BHK- oder Primaten-Expressionssystem verwendet wird. Das erfindungsgemäße Konstrukt enthält mindestens eine Nukleotidsequenz, die eine kappa leichte Kette kodiert, und mindestens eine Nukleotidsequenz, die eine gamma schwere Kette kodiert, wobei mindestens eine der Nukleotidsequenzen, die eine kappa leichte Kette oder eine gamma schwere Kette kodieren, eine Nukleotidsequenz umfasst, die zumindest einen Teil einer murinen Aminosäuresequenz vom lgG2a-Subtyp kodiert, und mindestens 2 IRES-Elemente. So werden die Polypeptidketten des Antikörpers auf ausgewogene Weise exprimiert.

[0075] Die Nukleotidsequenz, die zumindest einen Teil der murinen Aminosäuresequenz vom lgG2a-Subtyp kodiert, ist vorzugsweise mit Techniken der Insertion oder Substitution in die Nukleotidsequenz eingebunden, die die kappa leichte Kette oder die gamma schwere Kette kodiert, um ein Antikörper-Expressionskonstrukt zu erhalten. Die Nukleotidsequenz, die die kappa-Kette kodiert, und eine Nukleotidsequenz, die die gamma-Kette kodiert, sind vorzugsweise mittels einer IRES-Sequenz miteinander verbunden.

[0076] E in erfindungsgemäßer Vektor umfasst einen Promotor, ein Antikörper-Expressionskonstrukt, wie oben beschrieben, und eine Transkriptionsterminationssequenz. Der Vektor enthält vorzugsweise eine der IRES-Sequenzen in abgeschwächter Form. Durch eine eingefügte Sequenz kann die IRES-Sequenz abgeschwächt werden, um das Eindringen der Ribosome und die Expression eines operativ damit verbundenen quantitativen Selektionsmarkers nach unten zu regulieren. Auf diese Weise können jene Wirtszellen, die den Selektionsmarker und das Expressionsprodukt auf höchstem Niveau produzieren, einfach ausgewählt werden. Die IRES-Sequenz ist vorzugsweise durch Einfügung der Sequenz abgeschwächt, um sie vor und/oder hinter der IRES-Sequenz zu lokalisieren. Die Einfügungssequenz kann ein Herpin kodieren.

[0077] Zu den bevorzugten Selektionsmarkern gehört das DHFR- (Dihydro-folatreduktase-)- 10/29 ξΚίιΤίΐίΐίίΐΐΚ P9tot8!»t ΑΤ500 650 Β1 2009-11-15

Gen, das eine essentielle Komponente für das Wachstum transfizierter DHFR-defizienter CHO-Zellen in Anwesenheit von MTX (Methotrexat) ist. Alternativ dazu können auch andere Selekti-ons- und Amplifikationsmarker verwendet werden, wie Hygromycin-B-phosphotransferase, Thymidinkinase etc. Bei Verwendung einer IRES-Sequenz integriert sich ein Selektionsmarker genau an der gleichen Stelle wie das fremde Gen, und die Selektion findet an der gleichen mRNA statt, die sowohl Antikörperketten als auch den Selektionsmarker kodiert. Durch Abschwächen dieser zweiten IRES-Sequenz wird die Translationseffizienz des Selektionsmarkers stark reduziert. Die Verwendung eines DHFR-defizienten CHO-Stamms ermöglicht die Selektion und Genkopienummeramplifikation unter Verwendung niedriger selektiver Konzentrationen von MTX im Bereich von 1 bis 10 pMol/1.

[0078] Ein bicistroner pIRES Expressionsvektor ist im Handel erhältlich (Clontech Laboratories Inc., Palo Alto, USA). Dieses Konstrukt kann modifiziert werden, um die schweren und leichten Antikörperketten mit fast den gleichen hohen Expressionsniveaus zu produzieren.

[0079] Das bevorzugte Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers gemäß der Erfindung umfasst die folgenden Schritte: [0080] - Transformieren einer CHO-Wirtszellen mit einem multicistronen Antikörper-Expres sionskonstrukt, enthaltend mindestens eine Nukleotidsequenz, die eine kappa leichte Kette kodiert, und eine Nukleotidsequenz, die eine gamma schwere Kette kodiert, wobei zumindest eine der Nukleotidsequenzen eine Nukleotidsequenz umfasst, die zumindest einen Teil einer murinen Aminosäuresequenz vom lgG2a-Subtyp kodiert, und mindestens zwei IRES-Elemente, und [0081] - Expression dieser Nukleotidsequenzen unter der Kontrolle einer Einzelsignalse quenz, um einen intakten Antikörper herzustellen.

[0082] Es hat sich erwiesen, dass bei Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens die kappa leichte Kette und die gamma schweren Ketten in etwa äquimolarer Menge exprimiert werden. Es hat sich gezeigt, dass die erhaltene Antikörperkonzentration mindestens 1 pg/ml, vorzugsweise 5 bis 50 pg/ml beträgt.

[0083] Fig. 1: Darstellung des originalen pIRES Expressionsvektors

[0084] Fig. 2: Darstellung der Kloningkassette von tri-cistroner HE-2 Expression und DHFR

Selektionskonstrukt [0085] Fig. 3: Sequenz der Kloningkassette von tri-cistroner HE-2 Expression und DHFR Selektionskonstrukt, eingeführte Restriktionsstellen fett und kursiv; KOZAK-Sequenzen unterstrichen.

[0086] Fig. 4 [0087] Fig. 5 [0088] Fig. 6 [0089] Fig. 7

Darstellung eines lgG2a Le-Y Antikörpers Molekularbiologisches lgG2a Le-y Antikörperkonstrukt Aminosäuresequenz von HE-2 gamma Aminosäuresequenz von HE-2 kappa [0090] Die folgenden Beispiele beschreiben die Erfindung mehr im Detail, sie schränken jedoch den Umfang der Erfindung nicht ein.

[0091] I. Herstellung von rekombinantem, murinem lgG2a HE-2 Antikörper (rHE-2) [0092] Beispiel 1: Molekularbiologische Konstrukte [0093] Der bicistrone pIRES Expressionsvektor (Fig. 1), erworben von Clontech Laboratories Inc., Palo Alto, USA, ermöglicht es, 2 Gene auf hohem Niveau zu exprimieren, und ermöglicht auch die Translation von 2 aufeinanderfolgenden offenen Leserahmen von der selben Messen-ger-RNA. Um positive Transformanten unter Verwendung eines Reporterproteins auszuwählen, ist die innere Ribosomeneintrittsstelle (IRES) bei diesem Expressionsvektor verkürzt worden, um niedrigere Expressionsraten dieses zweiten Leserahmens zu ermöglichen. Daher musste 11/29

(KMriiidiisfhö jjaiwtssi AT500 650 B1 2009-11-15 die ursprüngliche IRES-Sequenz wieder hergestellt werden, um unsere Zwecke der Expression von schweren und leichten Antikörperketten auf fast dem gleichen Expressionsniveau zu erfüllen. Die abgeschwächte IRES-Sequenz wird für die Expression unseres Selektionsmarkers verwendet.

[0094] DNA-Manipulationen erfolgten mit standardmäßigen Verfahren. Unter Verwendung der PCR-Technologie und des Advantage-HF PCR Kit (Clontech Laboratories Inc., Palo Alto, USA) wurden die schwere und die leichte Kette des HE-2 Antikörpers unter Verwendung von Primern amplifiziert, die die jeweiligen Spaltstellen für Restriktionsendonukleasen einführen, die für die Einführung des Gens in die Expressionsvektoren notwendig sind, ein Mal und zwei Mal die Kozak-Sequenzen oberhalb der offenen Leserahmen. Die autologen Signalsequenzen wurden verwendet, um nascente Polypeptidketten auf den Sekretionsweg zu lenken. Die Primer wurden von MWG-Biotech AG, Deutschland, gekauft. Fig. 2 zeigt die Kloningkassette, die für die bi-cistrone Expression von HE-2 verwendet wurde. Es wurde eine zweistufige Kloningstrategie angewendet: Eine kappa-Kette einschließlich ihrer autologen Signalsequenz wurde als Xho I, Mlu I Fragment amplifiziert und unter Verwendung des Rapid Ligation Kit (Roche, Deutschland) gemäß den Instruktionen des Herstellers in den Expressionsvektor eingebunden. Das Konstrukt wurde in den chemisch kompetenten E. coli Bakterienstamm DHöalpha (Gibco BRL) transfiziert und unter Verwendung des Ampicillin-Selektionsmarkers amplifiziert. In einem zweiten Schritt wurden die rekonstruierte IRES-Sequenz und gamma-Kette, auch einschließlich ihrer autologen Signalsequenz, als Mlu I, Nco I bzw. Nco I, Sal I Fragmente amplifiziert und in einer einstufigen Ligationsreaktion in den modifizierten Expressionsvektor eingebunden, der bereits die HE-2 kappa-Kette enthielt. Dieses Konstrukt wurde unter Verwendung des Bakterienstamms DHöalpha (Gibco BRL) amplifiziert. 25 Konstrukte aus verschiedenen PCR-Proben wurden unter Verwendung der Restriktionsendonukleasen EcoR I und BamH I verdaut. Konstrukte, die den richtigen Verdauungsplan aufwiesen, wurden bidirektional sequenziert. In dieses Expressionskonstrukt wurde die unten beschriebene Selektionskassette eingeführt. Der Selektionsmarker DHFR wurde als PCR Xba I / Not I Fragment vom pSV2-dhfr Plasmid (ATCC # 37146) amplifiziert. PCR-Primer führten diese Restriktionsstellen ein. Die abgeschwächte IRES at. Sequenz wurde mittels PCR von pSV-IRES (Clontech # 6028-1) als Sal I / Xba I Fragment amplifiziert. In einer einstufigen Ligationsreaktion wurden IRES at. und DHFR in das bereits beschriebene Expressionskonstrukt eingebunden, nach dem Verdau mit den entsprechenden Restriktionsendonukleasen und einem weiteren Dephosphorylierungsschritt. Nach einer Trans-fektion in den Bakterienstamm DH5alpha (Gibco BRL) wurden positive Transformanten mittels PCR gescreent. Das richtige Einführen von Selektions- und Expressionskassetten wurde mittels Minipräparation und weiterem Verdauungsplan, in Fig. 2 dargestellt, nachgewiesen. Die Konstrukte wurden bidirektional sequenziert und bei weiteren Transfektionen in eukaryotischen Zellen verwendet.

[0095] Beispiel 2: Transfektion [0096] Der charakterisierte eukaryotische Stamm, CHO (ATCC-CRL 9096), wurde mit dem Expressionsvektor, der wie oben beschrieben hergestellt wurde, transfiziert. Der DHFR Selektionsmarker wurde verwendet, um stabile Zelllinien zu etablieren, die rHE-2 exprimieren. In einer Kulturplatte mit 6 Näpfchen wurde die Zelllinie in Dichten von 105 Zellen geimpft in 2 ml komplettem Iscove's modifiziertem Dulbecco's Medium mit 4 mM L-Glutamin, eingestellt auf einen Gehalt von 1,5 g/l Natriumbicarbonat und supplementiert mit 0,1 mM Hypoxanthin und 0,016 mM Thymidin, 90 %; fötales bovines Serum, 10 % (Gibco, BRL). Die Zellen wurden bis zu 50 % Konfluenz gezüchtet. Die Zellen wurden gemäß den Angaben des Herstellers in Abwesenheit von Serum mit 2 pg DNA unter Verwendung von Lipofectin® Reagens (Gibco BRL) transfiziert. Die Transfektion wurde durch die Zugabe von komplettem Medium nach 6 bzw. 24 Stunden beendet.

[0097] Beispiel 3: Selektion positiver Transformanten und Kultivierung [0098] Komplettes Medium wurde 24 bzw. 48 Stunden nach der Transfektion durch selektives Medium ersetzt. FCS in komplettem Medium wurde durch dialysiertes FCS (Gibco BRL, Ur- 12/29

AT500 650 B1 2009-11-15 sprung: Südamerika) ersetzt. 10 Tage nach der Selektion erschienen positive Transformanten als rasch wachsende multizelluläre Konglomerate. Die Konzentration von rHE-2 wurde in Überständen durch einen spezifischen Sandwich-ELISA analysiert, der sowohl die variable als auch die konstante Domäne des Antikörpers erkannte. Zellen, die eine hohe Produktivität aufwiesen, wurden 1:10 gesplittet und in 75 cm2 Zellkulturkolben zur Aufbewahrung in flüssigem Stickstoff expandiert. Parallel dazu wurden diese Produzenten einem steigenden Selektionsdruck ausgesetzt, indem dem Kulturmedium Methotrexat zugesetzt wurde und die Zellen in eine Zellkulturplatte mit 6 Näpfchen geimpft wurde. Das Verfahren wurde etwa 2 Wochen später wiederholt, als die Zellen eine stabile Wachstumskinetik erreichten. Ausgehend von einer Konzentration von 0,005 μΜ wurde die MTX-Konzentration bei jeder Selektionsrunde verdoppelt, bis schließlich eine Konzentration von 1280 μΜ MTX erreicht wurde, und parallel dazu in Gewebekulturplatten mit 96 Näpfchen subkultiviert. Die Überstände wurden wöchentlich mit einem spezifischen Sandwich-ELISA analysiert, der sowohl die variable als auch die konstante Domäne des Antikörpers erkannte. Stabile Kulturen, die die höchste Produktivität aufwiesen, wurden in 75 cm2 Zellkulturkolben transferiert und schrittweise schließlich in 860 cm2 rollende Gewebekulturkolben in nicht-selektivem Medium expandiert. Die Überstände wurden geerntet, zentrifugiert, analysiert und einerweiteren Reinigung unterzogen.

[0099] Beispiel 4: [00100] Produktion von rHE-2 unter serumfreien Bedingungen. Rekombinantes rHE-2 wurde im Laborrahmen mit einer veränderten CHO-Zelllinie hergestellt, wobei proteinfreies Medium Excell 325PF (JRH Biosciences) in Rollerflaschen verwendet wurde. Die Überstände wurden affinitätsgereinigt, wobei der anti-idiotype Antikörper IGN111 verwendet wurde, immobilisiert auf Sepharose und charakterisiert mittels SDS-PAGE, SEC-HPLC, ELISA und IEF.

[00101] Beispiel 5: Analyse von Expressionsprodukten [00102] Überstände wurden mittels spezifischem ELISA analysiert, der sowohl die variable als auch die konstante Domäne des exprimierten Antikörpers erkannte. Der polyklonale anti-idiotype Antikörper IGN111 wurde mit 10 ug/ml auf Maxisorp® (NUNC) Sorptionsplatten beschichtet. Er wurde in Ziege durch Immunisierung mit HE-2 Fab Fragmenten gezogen und mittels Affinität unter Verwendung eines zweistufigen chromatographischen Set-ups extrahiert. Antikörper gegen murine konstante Regionen wurden in einem ersten Schritt auf eine polyklonale Maus-lgG-Säule adsorbiert, und anti-idiotype Antikörper wurden in einem zweiten Schritt mittels Affinität unter Verwendung einer HE-2-Agarosesäule gefangen. Das Endprodukt, die polyklonale IGN111 Antikörperpräparation erkennt daher die variable Domäne von HE-2. Verbleibende aktive Gruppen wurden durch Inkubation mit 1 % Magermilch blockiert, und Überstände wurden aufgebracht. Die exprimierten Antikörper wurden an Hand ihrer konstanten Domäne unter Verwendung eines Hase-anti-Maus-lgG2a-HRP Konjugats (Biozym) nachgewiesen. Die Quantifizierung erfolgte durch Vergleich mit einem ebenfalls beladenen und charakterisierten HE-2 Standard-Hybridom-Antikörper.

[00103] Die Bestimmung der Größe der exprimierten Proteine erfolgte mittels SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese unter Verwendung von 4 - 14 % Acrylamidgradient-Gels in einer Novex® (Gibco BRL) Elektrophoresekammer. Die Proteine wurden Silber gefärbt. Um die exprimierten Antikörper immunologisch nachzuweisen, wurden Western Blots auf Nitrozellulosemembranen (0,2 pm) durchgeführt. Proteine, die sich auf SDS-Polyacrylamidgels abschie-den, wurden unter Verwendung einer Novex® (Gibco BRL) Blotting-Kammer elektrotransferiert. Die Membranen wurden 2 Mal gewaschen, bevor die Blockierungslösung (TBS + 3 % Magermilchpulver BBL) und die Antikörperlösung (10 pg/ml polyklonaler Ziegen IGN-111 Antikörper, Maus monoklonaler anti-Maus IgG Antikörper (Zymed) oder Hase anti-Maus IgG gamma-Kette (Zymed) in TBS + 1 % Magermilchpulver) zugesetzt wurden. Schließlich erfolgte die Entwicklung unter Verwendung eines Hase anti-Ziege-HRP, Hase anti-Maus IgG-HRP oder Maus anti-Hase IgG-HRP konjugierten Antikörpers (BIO-RAD), verdünnt zu 1:1000 in TBS + 1 % Magermilchpulver und einem HRP Farbentwicklungsreagens (BIO-RAD) gemäß den Angaben des Herstellers. 13/29 ΑΤ500 650 Β1 2009-11-15 [00104] Isoelektrische Fokussiergels wurden verwendet, um die gereinigten Expressionsprodukte mit dem charakterisierten murinen HE-2 Standard-Hybridom-Antikörper zu vergleichen. Proben wurden auf lEF-Gels geladen, pH 3-7 (Invitrogen), und die Auftrennung erfolgte gemäß den Angaben des Herstellers. Die Proteine wurden durch Silberfärbung oder durch immunologische Verfahren mittels Western Blot sichtbar gemacht. Zu diesem Zweck wurden die Proteine in einen Tris-gepufferten SDS/Harnstoff/Jodactamid-Puffer geladen und auf Nitrozellulosemembranen transferiert, wobei das gleiche Verfahren verwendet wurde, wie es für Western Blots beschrieben ist. Der Nachweis erfolgte unter Verwendung des polyklonalen Ziegen-IGN111 anti-idiotypen Antikörpers. Die Interaktion der Expressionsprodukte mit ihrem Ziel-Antigen, EpCAM, wurde durch Inkubieren der gereinigten Überstände mit Nitrozellulosemembranen durchgeführt, auf welche rEpCAM elektrotransferiert wurde. Die Färbung der interagierenden Antikörper erfolgte analog zu Western Blots unter Verwendung von anti-Maus lgG2a-HRP konjugiertem Antikörper (Zymed).

[00105] Beispiel 6: Affinitätsreinigung [00106] Es wurde ein Pharmacia (Amersham Pharmacia Biotech) ÄKTA-System verwendet. 1000 ml geklärter Kulturüberstand, der Antikörper enthielt, wurde unter Verwendung eines Pro-Varion 30 kDa cut-off (Millipore) Konzentrators konzentriert, dann mit PBS verdünnt und auf eine 20 ml IGN111 Sepharose-Affinitäts-Gel XK26/20 Säule (Amersham Pharmacia Biotech) geladen. Kontaminierende Proteine wurden in einem Waschschritt mit PBS + 200 mM NaCI verworfen. Gebundene Antikörper wurden mit 100 mM Glycin eluiert, pH 2,9, und unter Verwendung von 0,5 M NaHC03 sofort neutralisiert. Der Ausfluss wurde bei λ 215 und λ 280 nm online beobachtet und einer folgenden HPLC-Analyse unterworfen, wofür eine ZORBAX G-250 (Agilent Technologies) Säule verwendet wurde.

[00107] 2000 ml geerntete Überstände, die von Rollerflaschenkulturen stammten, wurden zentrifugiert, konzentriert, in PBS verdünnt und mittels Affinitatschromatographie unter Verwendung der IGN111 Sepharose-Säule bis zur Homogenität gereinigt. Nach dem Eluieren, der Neutralisation und der Dialyse gegen PBS wurde das Endprodukt mit SEC-HPLC gemessen. Ein von Hybridom abgeleiteter muriner Standard des gleichen Immunglobulins wurde mit rHE-2 verglichen und eluiert, beide als scharfe einzelne Peaks zur gleichen Zeit, was mit der erwarteten Retentionszeit von IgG korrelierte. Mit Hilfe dieser Reinigungsstrategie im Laborrahmen wurde eine Reinheit von > 92 % erzielt.

[00108] Die weitere Charakterisierung des Expressionsproduktes erfolgte durch reduzierende und nicht reduzierende Silber gefärbte SDS-PAGE und Western Blotting. Die Expressionsprodukte wurden durch den spezifischen, anti-idiotypen Antikörper Ziege-anti-HE-2, IGN111 nachgewiesen und mit einem anti-Ziege-HRP konjugierten Antikörper sichtbar gemacht. Nicht reduzierte Proben zeigten Bande im erwarteten Bereich eines intakten IgG Moleküls entsprechend 160 kDa. Dieses Ergebnis korreliert genau mit dem murinen Standard HE-2 Hybridom-Antikörper. Bei reduzierten Proben sind Bande im Bereich von 25 und 50 kDa sichtbar, auch interagierend mit dem anti-idiotypen Ziege-anti-HE-2 Antikörper IGN111. Diese Bande entsprechen den IgG leichten bzw. schweren Ketten.

[00109] Die Interaktion mit dem Zielantigen von HE-2, EpCAM, wurde analysiert, indem Nitrozellulosemembranen, auf denen rEpCAM elektro-geblottet worden war, mit gereinigten Expressionsprodukten inkubiert wurden. Es wurde ein weiterer Subtyp-spezifischer Nachweis interagierender Antikörper erbracht. Der murine HE-2 Standard-Hybridom-Antikörper erkennt das monomere rEpCAM von 25 kDa und auch eine Serie von rEpCAM Aggregaten, die di-, tri- und polymeren Formen entsprechen. Genau die gleiche Bandenverteilung findet sich bei allen gereinigten Expressionsprodukten.

[00110] Gereinigte Expressionsprodukte und der murine HE-2 Standard-Hybridom-Antikörper wurden weiter analysiert. Alle Antikörper weisen ein inhomogenes, mehrbändiges isoelektrisches Fokussierungsmuster auf, identisch im pH, jedoch unterschiedlich in der quantitativen Verteilung, das aus 3 wesentlichen Protein-Isoformen und 2 Subformen besteht, die über einen pH-Bereich von 8,2 bis 7,2 verteilt sind. Von CHO abgeleitete Isoformen sind in Richtung höhe- 14/29 AT500 650 B1 2009-11-15 rer pH-Werte verschoben, der murine HE-2 Standard weist die identischen Isoformen auf, die quantitative Verteilung tendiert jedoch zu sauren Formen. Wir waren in der Lage, rekombi-nanten Maus lgG2a Antikörper HE-2 in CHO-Zellen zu exprimieren. Die stabile genomische Integration erfolgte 14 Tage nach der Transfektion. Das Expressionskonstrukt ermöglichte eine rasche und bequeme Transfektion unter Verwendung eines einzelnen Plasmids. Durch die Verwendung eines Selektionssystem auf der Basis eines Wirtsstammes, dem ein essentielles Stoffwechselenzym fehlte, eines Plasmids, das das korrespondierende Gen trug, und eines potenten Antagonisten dieses Enzyms konnte die Anzahl der Genkopien durch ständig steigenden Selektionsdruck erhöht werden. Durch die Verwendung einer abgeschwächten IRES-Sequenz in der Expressionskassette dieses selektierbaren Markers konnten sehr geringe Mengen des Antagonisten MTX für die Selektionsstrategie verwendet werden. Mit Werten von etwa 10 pg/24 h.ml, die mindestens 5 Wochen lang in Produktionskulturen gehalten werden konnten, wurde eine moderate Expression erreicht. Gereinigte Expressionsprodukte unterschieden sich in der Größe und in spezifischen immunologischen Assays nicht vom murinen HE-2 Standard. Dennoch kann es zu Unterschieden in post-translatorischen Modifikationen gekommen sein. Daher wiesen rekombinante Antikörper ein Wirts- oder Medium-spezifisches isoelektrisches Fokussierungsmuster auf. Die biologische Äquivalenz des Expressionsproduktes wurde in Immunisierungsstudien weiter analysiert.

[00111] Beispiel 7: Immunisierungsstudien A. 17-1A Referenzgruppe [00112] Der murine lgG2a Antikörper 17-1A (17-1A), hergestellt mittels Hybridomtechnologie, wurde von Glaxo als eine 10 mg/ml PBS-Lösung unter dem Namen Panorex® erworben. Dieser Antikörper wurde als ein muriner Standard HE-2 Hybridom-Antikörper verwendet. B. rHE-2 [00113] Rekombinantes HE-2 wurde wie oben beschrieben hergestellt.

C. Deglykosylierte 17-1A

[00114] 20 mg 17-1A wurden unter nicht denaturierenden Bedingungen unter Verwendung von PNGase-F (New England Biolabs, #P0704S) deglykosyliert. Die Vollständigkeit der Deglykosy-lierung wurde mittels Western Blot-Analyse und Inkubation mit ConA-Peroxidase (Sabio #180705L1205-2) überprüft. Puffertausch und Reinigung erfolgten mittels SEC Superdex 200 Chromatographie unter Verwendung von 1 mM NaH2P04, 0,86 % NaCI, pH 6,0. D. UPC10 [00115] UPC10, ein lgG2a Antikörper mit völlig verschiedener Spezifität, wurde von Sigma (#M9144-1) erworben.

FORMULIERUNG DER IMPFSTOFFE

[00116] Die Impfstoffe wurden in 1% A1 (OH) 3-Suspensionen formuliert, die 500 pg Antikör-per/Dosis enthielten. Die Antikörperlösungen wurden mit dem LAL-Endpunkt-Verfahren auf ihren Endotoxingehalt getestet. 10 und 100 pl Überstand der Lösung wurden gemäß den Angaben des Herstellers analysiert und mit einem Endotoxin-Standard von 0,15 bis 1,2 EU/ml verglichen. Antikörperlösungen wurden gegen den Formulierungspuffer 1 mM NaH2P04, 0,89 % NaCI, pH 6,0 unter Verwendung einer Slide-A-Lyzer Dialysekassette 3500 MWCO, 3 - 15 ml (PIERCE, #0066110) dialysiert. Die Konzentration und die Integrität des Proteins wurden mit SEC-HPLC (Zorbax-GF250, Agilent) überprüft.

IMMUNISIERUNGSSTRATEGIE

[00117] 4 Rhesusaffen (Macacca mulatta) pro Gruppe mit einem Körpergewicht zwischen 4 und 6 kg und ohne Vorbehandlung wurden am Tag 1, 15, 29 und 57 mit 500 μΙ/Tier s.c. geimpft. 15/29 §ίϊί)Τίΐίι;5£!1ί5 P9tot8!»t ΑΤ500 650 Β1 2009-11-15

Am Tag 11, 5 und 1 (Pre-Serum), Tag 14, Tag 29, Tag 57 und Tag 71 wurden Serumproben genommen. Die Blutproben für die Serumpräparation wurden in Röhrchen mit Gerinnungsaktivator gesammelt; das Zentrifugieren erfolgte bei 1500 g 30 min lang (gemäß den Anwendungshinweisen). Die Serumproben wurden in Röhrchen transferiert und bei -80°C gelagert.

17-1A-ELISA

[00118] Pre-Seren und Immun-Seren wurden mit einem ELISA Testsystem analysiert, wobei der Immunisierungsauslöser zum Testen der induzierten Immunantwort verwendet wurde. 17-1A wurde als Beschichtungsantikörper verwendet, aufgetragen zu 10 pg/ml auf Maxisorp® (NUNC) Sorptionsplatten, verdünnt in Beschichtungspuffer (PAA, Lot: T05121-436). Die verbleibenden aktiven Gruppen wurden durch Inkubation mit 3 % FCS (Gibco BRL, Hitzeinaktiviert, #06Q6116K) in PBS blockiert, bevor die Seren in 6 x 1:10 Verdünnungen in PBS, supplementiert mit 2 % FCS, aufgetragen wurden. Induzierte Antikörper wurden an Hand ihrer konstanten Domänen unter Verwendung eines Hase-anti-human-IgG, A, M-HRP Konjugats (Zymed) erkannt. Die Färbung erfolgte durch übliche Verfahren. Die Extinktion bei 492 nm wurde unter Verwendung von 620 nm als Referenz gemessen. Die Quantifizierung erfolgte durch Vergleich mit einem Standard-Immunserum, das eine standardisierte Menge Antikörper enthielt, die einem Titer von 9000 entsprach.

AFFINITÄTSREINIGUNG

[00119] Es wurde ein ÄKTA System (Amersham Pharmacia Biotech) verwendet. 1 ml Serum wurde 1 : 10 mit laufendem Puffer PBS, supplementiert mit 200 mM NaCI, verdünnt und auf eine 1,0 ml 17-1A oder rEpCAM Sepharose Affinitätsgel XK10/2 Säule (Amersham Pharmacia Biotech) geladen, um die induzierte allgemeine Immunantwort bzw. die Zielantigen-spezifische zu reinigen. Kontaminierende Proteine wurden in einem Waschschritt mit PBS + 200 mM NaCI verworfen. Gebundene Antikörper wurden mit 100 mM Glycin, pH 2,9, eluiert und sofort mit 0,5 M NaHCOs neutralisiert. Der Ausfluss wurde bei λ 215 und λ 280 nm online beobachtet. Die Eluierungsfraktionen wurden einer folgenden HPLC-Analyse unterworfen, um das Verhältnis IgG/lgM, die Reinheit und die Konzentration zu bestimmen.

ERGEBNISSE

[00120] In Anbetracht aller Impfungen wurden keine Nebenwirkungen beobachtet.

[00121] Bei dieser Immunisierungsstudie löste die Impfung mit verschiedenen lgG2a Formulierungen in allen Fällen eine starke IgG-Typ Immunisierungsantigen-spezifische Immunantwort aus. Außer bei der deglykosylierten 17-1A Formulierung, die eine geringere Immunantwort hervorrief, war die Immunogenität aller anderen Formulierungen fast gleich. Die Immuntiter stiegen von Werten unterhalb der Nachweisgrenze auf bis zu 300 pg/ml Serum, was einem induzierten IgG-Verhältnis von fast 1% entspricht. Die Immunogenität aller angewendeten gly-kosylierten lgG2a Antikörper war fast im gleichen Bereich, unabhängig von ihrer Spezifität.

[00122] Auch unabhängig von der Immunisierungsgruppe reagierten alle mit lgG2a geimpften Tiere mit einer Immunantwort vom IgG-Typ, wobei EpCAM entsprechend einer Menge von 30 -40% des Immunisierungsantigen-spezifischen Titers erkannt wurde. Die Impfung mit lgG2a Antikörpern führte daher zu einer Kreuzreaktivität der Immunseren mit EpCAM. Die Deglykosy-lierung des Immunisierungsantigens verminderte beide induzierten IgG-Werte signifikant, sowohl jene, die gegen das Immunisierungsantigen gerichtet waren, als auch jene gegen EpCAM.

[00123] Die Deglykosylierung verändert die immunogenen Eigenschaften des Antikörpers erheblich. Sowohl die Immunglobulin-Titer gegen das Immunisierungsantigen als auch das Zielantigen waren reduziert. Ein Vergleich zwischen dem originalen Hybridom-abgeleiteten Immunisierungsantigen 17-1A und dem rekombinant exprimierten rHE-2 von CHO-Zellen erbrachte keinerlei immunologische Unterschiede. Beide Formulierungen zeigten eine identische Kinetik im Aufbau der Immunisierungsantigen- und Zielantigen-spezifischen Immunantwort. Erhöhte IgG- und IgM-Titer waren ähnlich. 16/29

Claims (32)

1. {B&rfiitfcsihiS AT500 650 B1 2009-11-15 [00124] Beispiel 8: Expression eines hybriden immunogenen Antikörpers [00125] Der rekombinante lgG2a Le-Y Antikörper ist ein lgG2a Hybrid-Antikörper, der für die Impfung von Primaten vorgesehen ist. Er vereint eine hypervariable Region, die ein anti-idiotypes Lewis-Y (Le-Y) imitiert, und die hochgradig immunogenen konstanten Regionen Maus lgG2a. Eine Darstellung des lgG2a Le-Y Antikörpers ist in Fig. 4 zu sehen. [00126] Die Immuntherapie mit rekombinantem lgG2a Le-Y Antikörper verstärkt die Immunoge-nität des elterlichen Antikörpers IGN301, der von einer Hybridomzelle erzeugt wird. Sie löst eine starke Immunantwort vom Typ IgG aus, gerichtet gegen Le-Y und/oder EpCAM, überexprimiert und präsentiert auf Epithel-Krebszellen. Diese Immunantwort führt zur Lyse der Tumorzellen durch Komplementaktivierung oder Zellmediation, was die Bildung von Metastasen verhindert. [00127] Molekularbiologische Konstrukte des rekombinanten lgG2a Le-Y Antikörpers wurden in den oben beschriebenen polycistronen Expressionsvektor inkorporiert, wie in Fig. 1 und 2 zu sehen ist. [00128] Der rekombinante lgG2a Le-Y Antikörper wurde vorübergehend in HEK293-Zellen exprimiert, mit Calciumphosphat-Copräzipitation in einem MicroSpin-System in Gegenwart von FCS. Nach der Reinigung mit einer anti-Le-Y Affinitätssäule und der Qualifizierung des Expressionsproduktes wurde der rekombinante lgG2a Le-Y Antikörper auf A1(OH)3 formuliert und in einer Immunisierungsstudie an Rhesusaffen unter Verwendung von 4 Dosen zu 500 pg als Impfung verabreicht. [00129] Es konnte eine hohe Immunogenität im Vergleich zum elterlichen Impfstoff IGN301 beobachtet werden. Die induzierte Immunantwort vom Typ IgG wurde mittels ELISA analysiert und wies eine Immunisierungsantigen-, Le-Y- und EpCAM-Spezifität auf. Patentansprüche 1. Immunogener rekombinanter Antikörper, zusammengestellt für die aktive Immunisierung von Primaten, dadurch gekennzeichnet, dass er zumindest einen Teil einer murinen Aminosäuresequenz vom lgG2a-Subtyp und eine Säugetier-Glykosylierung umfasst, wobei die Säugetier-Glykosylierung eine Hamster- oder Primaten-Glykosylierung ist.
2. 2. Antikörper gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Mimotop enthält, das eine Immunantwort auslöst, die für Epithelzellen-Adhäsionsmoleküle spezifisch ist.
3. 3. Antikörper gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper ein Säugetier-Antikörper ist.
4. 4. Antikörper gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass er eine murine Aminosäuresequenz aufweist.
5. 5. Antikörper gemäß den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Ep-CAM-Mimotop enthält.
6. 6. Antikörper gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Ep-CAM-Mimotop von zumindest Teilen der Gelenk-Region gebildet wird.
7. 7. Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen funktionellen Antikörper handelt.
8. 8. Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen Chimären, insbesondere humanisierten, Antikörper handelt.
9. 9. Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen anti-idiotypen Antikörper handelt.
10. 10. Antikörper gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass er gegen den Idiotyp eines Antikörpers gerichtet ist, der für ein Tumor-assoziiertes Antigen spezifisch ist.
11. 11. Antikörper gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen ausgewählt 17/29 ist aus der Gruppe bestehend aus Peptiden oder Proteinen, wie EpCAM, NCAM, CEA und T-Zellpeptiden, Kohlenhydraten, wie Lewis Y, Sialyl-Tn, Globo H und Glykolipiden, wie GD2, GD3 und GM2.
12. 12. Antikörper gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass er gegen ein zelluläres Adhäsionsmolekül, wie EpCAM, NCAM oder CEA, gerichtet ist.
13. 13. Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen bi-isotypischen Antikörper handelt.
14. 14. Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper ein IgG 1 -Antikörper ist, der in der konstanten Region die Aminosäuresequenz vom lgG2a-Subtyp enthält.
15. 15. Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuresequenz vom lgG2a-Subtyp in mindestens einer der Regionen, ausgewählt aus den Regionen CH1, Gelenk, CH2 und CH3, enthalten ist.
16. 16. Antikörper gemäß einem der Ansprüche 8 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen anti-idiotypen Antikörper gegen monoklonale Antikörper handelt, produziert von ATCC HB 9324 oder ATCC HB 9347, hybridisiert mit zumindest einem Teil einer murinen Aminosäuresequenz eines lgG2a-Antikörpers.
17. 17. Impfstoff, dadurch gekennzeichnet, dass er einen Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16 in einer pharmazeutischen Formulierung umfasst.
18. 18. Impfstoff gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die pharmazeutische Formulierung ein Adjuvans enthält.
19. 19. Multicistrones Antikörper-Expressionskonstrukt zur Herstellung eines Antikörpers gemäß Anspruch 1 in einem CHO-Expressionssystem, dadurch gekennzeichnet, dass es zumindest eine Nukleotidsequenz, die eine kappa leichte Kette kodiert, und eine Nukleotidsequenz, die eine gamma schwere Kette kodiert, enthält, wobei mindestens eine der Nukleotidsequenzen, die eine kappa leichte Kette oder eine gamma schwere Kette kodieren, eine Nukleotidsequenz umfasst, die zumindest einen Teil einer murinen Aminosäuresequenz vom lgG2a-Subtyp kodiert, und mindestens zwei IRES-Elemente.
20. 20. Antikörper-Expressionskonstrukt gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz, die zumindest einen Teil der murinen Aminosäuresequenz vom lgG2a-Subtyp kodiert, entweder durch Insertions- oder Substitutionstechniken in die Nukleotidsequenz eingebunden ist, die die kappa leichte Kette oder die gamma schwere Kette kodiert.
21. 21. Vektor, dadurch gekennzeichnet, dass er einen Promotor, ein Antikörper-Expressionskonstrukt gemäß Anspruch 19 oder 20 und eine Transkriptionsterminationssequenz umfasst.
22. 22. Vektor gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass eine der IRES-Sequenzen durch eine eingefügte Sequenz abgeschwächt ist, die das Eindringen der Ribosome nach unten reguliert.
23. 23. Vektor gemäß Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die eingefügte Sequenz vor und/oder nach der IRES-Sequenz lokalisiert ist und ein Hairpin kodiert.
24. 24. CHO-Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, dass sie mit einem Vektor gemäß einem der Ansprüche 21 bis 23 transformiert ist.
25. 25. Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es - das Transformieren einer CHO-Wirtszelle mit einem multicistronen Antikörper-Expressionskonstrukt, enthaltend mindestens eine Nukleotidsequenz, die eine kappa leichte Kette kodiert, und eine Nukleotidsequenz, die eine gamma schwere Kette kodiert, wobei mindestens eine der Nukleotidsequenzen eine Nukleotidsequenz umfasst, die zumindest »3!Wt3!iSt AT500 650B1 2009-11-15 einen Teil einer murinen Aminosäuresequenz vom lgG2a-Subtyp kodiert, und mindestens zwei IRES-Elemente, und - die Expression dieser Nukleotidsequenzen unter der Kontrolle eines einzigen Promotors, um einen intakten Antikörper herzustellen, umfasst.
26. 26. Verfahren gemäß Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass eines der IRES-Elemente eine abgeschwächte IRES-Sequenz ist, welche abgeschwächte IRES-Sequenz die Expression eines quantitativen Selektionsmarkers, der operativ damit verbunden ist, nach unten reguliert.
27. 27. Verfahren gemäß Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Selektionsmarkersequenz ein Gen ist, das Dihydrofolatreduktase kodiert.
28. 28. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 25 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenzen durch Kultivieren transfizierter CHO-Zellen mit Dihydrofolatreduktase-Mangel vorzugsweise in Anwesenheit einer selektiven Methotrexatkonzentration im Bereich von 1 bis 10 pMol/l exprimiert werden.
29. 29. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 25 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz, die die kappa-Kette kodiert, und eine Nukleotidsequenz, die die gam-ma-Kette kodiert, durch eine IRES-Sequenz miteinander verbunden sind.
30. 30. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 25 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass die kappa leichte Kette und die gamma schwere Kette in etwa äquimolarer Menge hergestellt werden.
31. 31. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 25 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass eine Antikörperkonzentration von mindestens 1 pg/ml, vorzugsweise 5-50 pg/ml hergestellt wird.
32. 32. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 25 bis 31, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirtszelle in einem serumfreien Medium kultiviert wird. Hierzu 10 Blatt Zeichnungen 19/29