CZ286547B6 - Monoklonální protilátky a jejich použití - Google Patents
Monoklonální protilátky a jejich použití Download PDFInfo
- Publication number
- CZ286547B6 CZ286547B6 CZ19942851A CZ285194A CZ286547B6 CZ 286547 B6 CZ286547 B6 CZ 286547B6 CZ 19942851 A CZ19942851 A CZ 19942851A CZ 285194 A CZ285194 A CZ 285194A CZ 286547 B6 CZ286547 B6 CZ 286547B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- antibody
- antibodies
- mouse
- cells
- binding
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 16
- 230000003302 anti-idiotype Effects 0.000 title abstract description 4
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 title abstract 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 12
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 153
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims abstract description 127
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims abstract description 126
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims abstract description 109
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 38
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims abstract description 19
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 15
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 12
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims abstract description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 6
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims abstract description 4
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 4
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 claims abstract description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 110
- 241001529936 Murinae Species 0.000 claims description 25
- 206010041067 Small cell lung cancer Diseases 0.000 claims description 14
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 claims description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 10
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 8
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 claims description 6
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000010807 negative regulation of binding Effects 0.000 claims description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 3
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 abstract description 26
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract description 14
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 abstract description 9
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 abstract description 6
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 abstract description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 abstract 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 131
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 73
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 49
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 44
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 44
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 35
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 33
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 33
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 33
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 29
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 29
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 25
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 24
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 20
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 17
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 16
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 15
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 15
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 14
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 14
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 13
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 12
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 12
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 12
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 11
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 11
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 11
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 11
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 11
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 10
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 10
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 10
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 10
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 10
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 10
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 10
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 10
- 230000004044 response Effects 0.000 description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 8
- 239000011651 chromium Substances 0.000 description 8
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 8
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000005809 anti-tumor immunity Effects 0.000 description 7
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 7
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 7
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 7
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 7
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 7
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 7
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 7
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 6
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 6
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 6
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 6
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 6
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 6
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 5
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 5
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- MXKCYTKUIDTFLY-ZNNSSXPHSA-N alpha-L-Fucp-(1->2)-beta-D-Galp-(1->4)-[alpha-L-Fucp-(1->3)]-beta-D-GlcpNAc-(1->3)-D-Galp Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](NC(C)=O)[C@H](O[C@H]3[C@H]([C@@H](CO)OC(O)[C@@H]3O)O)O[C@@H]2CO)O[C@H]2[C@H]([C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O2)O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MXKCYTKUIDTFLY-ZNNSSXPHSA-N 0.000 description 5
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 5
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 5
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 5
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 4
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 4
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 4
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 4
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 4
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 4
- JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCSSC1=CC=CC=N1 JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethoxybenzenecarbothioamide Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(N)=S WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GHCVXTFBVDVFGE-UHFFFAOYSA-N 4-amino-6-chloro-1,3,5-triazin-2-ol Chemical compound NC1=NC(O)=NC(Cl)=N1 GHCVXTFBVDVFGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010061968 Gastric neoplasm Diseases 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 3
- 208000007521 HIV Seropositivity Diseases 0.000 description 3
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 3
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 3
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 3
- 230000005889 cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 3
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 229940031098 ethanolamine Drugs 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 3
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- 229960002385 streptomycin sulfate Drugs 0.000 description 3
- 125000000954 2-hydroxyethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 2
- -1 3-dimethylaminopropyl Chemical group 0.000 description 2
- 206010001513 AIDS related complex Diseases 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004366 CD4-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- VYZAMTAEIAYCRO-BJUDXGSMSA-N Chromium-51 Chemical compound [51Cr] VYZAMTAEIAYCRO-BJUDXGSMSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 241000542855 Megathura crenulata Species 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 208000007660 Residual Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 101800000385 Transmembrane protein Proteins 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 2
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 2
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 2
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000012482 interaction analysis Methods 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 208000037841 lung tumor Diseases 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 238000004513 sizing Methods 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- PMUNIMVZCACZBB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyethylazanium;chloride Chemical compound Cl.NCCO PMUNIMVZCACZBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001474374 Blennius Species 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010041397 CD4 Antigens Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000700112 Chinchilla Species 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 206010025327 Lymphopenia Diseases 0.000 description 1
- 101710141347 Major envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 1
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 102000007365 Sialoglycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010032838 Sialoglycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006023 anti-tumor response Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- RIIWUGSYXOBDMC-UHFFFAOYSA-N benzene-1,2-diamine;hydron;dichloride Chemical compound Cl.Cl.NC1=CC=CC=C1N RIIWUGSYXOBDMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 238000009566 cancer vaccine Methods 0.000 description 1
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000000973 chemotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009827 complement-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 238000005094 computer simulation Methods 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229960001484 edetic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940073579 ethanolamine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 230000008175 fetal development Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 239000012997 ficoll-paque Substances 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 231100001023 lymphopenia Toxicity 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 229940043504 normal human immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000010915 one-step procedure Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000012910 preclinical development Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000001566 pro-viral effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 229940021993 prophylactic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- FFISLTWEISOMFC-UHFFFAOYSA-N pyridin-2-yl propanedithioate Chemical compound CCC(=S)SC1=CC=CC=N1 FFISLTWEISOMFC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- QTENRWWVYAAPBI-YCRXJPFRSA-N streptomycin sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@H]1O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@H]1O QTENRWWVYAAPBI-YCRXJPFRSA-N 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 229940021747 therapeutic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000000954 titration curve Methods 0.000 description 1
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 210000000605 viral structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
- G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3023—Lung
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3053—Skin, nerves, brain
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
- C07K16/4208—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig
- C07K16/4241—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig
- C07K16/4258—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig against anti-receptor Ig
- C07K16/4266—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig against anti-receptor Ig against anti-tumor receptor Ig
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56966—Animal cells
- G01N33/56972—White blood cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
- G01N33/56988—HIV or HTLV
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57423—Specifically defined cancers of lung
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Virology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Zoology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
Abstract
Popisují se myší monoklonální anti-idiotypové protilátky s vlastnostmi vnitřního obrazu (Ab2) proti monoklonálním protilátkám BR55-2 (Ab1), a farmaceutické prostředky k preventivní nebo/a terapeutické imunizaci proti infekcím virem HIV, proti rakovině epitheliálního původu a proti rakovině malých plicních buněk, které je obsahují, a jejich použití ke stanovením a imuno-purifikacím in vitro. Způsob přípravy těchto protilátek spočívá v tom, že se myši imunizují konjugátem BR55-2/myší IgG3-F(ab').sub.2.n.-KLH, myší slezinné buňky se nechají sfusovat s buňkami myší myelomové linie SP 2/0, vyberou se vzniklé hybridomové buňky, které produkují IgG s inhibiční kapacitou, jíž se míní inhibice vazby protilátky BR55-2/myší IgG2a na buněčnou linii SKBR5, vyšší než 95 %, načež se po přečištění izolují anti-idiotypové protilátky.ŕ
Description
Myší monoklonální anti-idiotypové protilátky, způsob jejich přípravy, farmaceutické kompozice, které je obsahují, a jejich použití
Oblast techniky
Vynález popisuje myší monoklonální protilátky s vlastnostmi vnitřního obrazu (Ab2), proti monoklonálním protilátkám BR55-2 (Abl), způsob jejich produkce a jejich použití k preventivní a/nebo terapeutické imunizaci proti infekcím virem HTV a proti rakovině epiteliálního původu a proti rakovině malých plicních buněk.
Současný stav techniky
Jeden z přístupů k manipulování imunitním systémem je založen na idiotypových interakcích. Jako idiotopy se označují unikátní antigenní determinanty buď přímo v, či v blízkosti vazebného místa pro antigen v molekule imunoglobulinu (Ig). Tyto determinanty také odlišují jednu protilátku od druhé. Souhrn všech idiotypů přítomných ve variabilní části dané protilátky se nazývá idiotyp (id). Molekulární struktura idiotypů byla lokalizována jak v komplementaritu určujících oblastech, tak v oblastech úseku základní struktury variabilní domény. Všeobecně, ale ne vždy, přispívá ke specifickým asociacím jak těžkého, tak lehkého řetězce.
Idiotypy jsou serologicky definované entity, protože injekce protilátky (často zmíněná jako Abl) do syngenního, allogenního nebo xenogenního příjemce indukuje tvorbu anti-idiotypových protilátek (často zmiňovány jako Ab2). Na předpokladu, že existují interakce idiotyp/antiidiotyp, byly postulovány zákonitosti fyziologické a na receptorech založené regulace imunitního systému (vizNiels Jeme, Ann. Immunol. 125C, 373, 1974). Jeho teorie sítě nahlíží na imunitní systém jako na soustavu molekul Ig a receptorů T-lymfocytů, které jsou svým vazebným místem (paratopem) schopny rozpoznat antigenní determinantu (epitop), a které mohou být zároveň rozeznávány jinými protilátkami nebo buněčnými povrchovými receptory tohoto systému díky idiotopům, které samy vykazují. Mnohé studie vskutku dokazují, že idiotypové a anti-idiotypové receptory jsou přítomny na povrchu jak B-, tak T-lymfocytů, jakož i na sekretovaných protilátkách.
V případě, zeje vazba mezi Abl a Ab2 inhibována antigenem, proti kterému je namířena Abl, je idiotyp považován za blízký vazebnému místu, protože se vztahuje k místu ve variabilní oblasti protilátky, která váže antigen. Takovéto idiotypy, které svojí konformací napodobují antigenní epitopy, se nazývají vnitřní obrazy tohoto epitopu. Vzhledem ktomu, že jak Ab2 tak antigen se vážou na stejnou Abl, mohou sdílet podobnou trojrozměrnou konformaci, která reprezentuje vnitřní obraz daného antigenu. Na anti-idiotypové protilátky (vnitřní obraz) se můžeme v principu dívat jako na náhradu antigenu, od kterého byly odvozeny pomocí idiotypové sítě. Proto mohou být tyto náhradní idiotypy použity při aktivní imunizaci. Poskytují výhody například jestliže původní antigen není dostatečně imunogenní na to, aby vzbudil významnou imunitní odpověď. Takovýto vhodný vnitřní obraz, tvořený anti-idiotypovými protilátkami, které napodobují neimunogenní sacharidový antigen, mohou být obzvláště užitečné při určitých způsobech vakcinace. V následujícím textu jsou tato témata blíže specifikována.
Díky zavedení hybridomové technologie byly vytvořeny monoklonální protilátky (Mabs), většinou myšího původu, proti mnoha typům lidských nádorů. Většina markérů určených xenogenními Mabs nejsou vyložené tumorově specifické, ale jsou to diferenciační antigeny sdílené jak tumory, tak i určitými normálními a/nebo fetálními tkáněmi. Proto je nejlépe se o nich zmiňovat jako o nádorově sdružených antigenech (tumor associated antigens - TAA). Zdali jsou lidské markéry tumorů detekované pomocí xenogenních Mabs schopny vyvolat protitumorovou odpověď u pacientů s rakovinou, závisí na povaze těchto TAA a mechanismus
-1 CZ 286547 B6 tohoto jevu není ještě zcela objasněn. TAA jsou buď přirozeně imunogenní v syngenním hostiteli, nebo mohou být na imunogenní upraveny, mohou být potenciálně použity k indukci protitumorové imunity pro terapeutické nebo preventivní účely.
Nádorově sdružené antigeny jsou často přímo součástí vlastního organismu a vyvolávají velice slabou imunitní odpověď u pacientů s rakovinou. Naproti tomu anti-idiotypové protilátky s vlastnostmi vnitřního obrazu vyjadřující trojrozměrnou strukturu, která se podobá struktuře epitopů daného TAA, jsou u hostitele s tumorem rozeznávány jako cizí molekuly. Proto imunitní odpověď, která vznikla jako důsledek terapeutické nebo dokonce preventivní imunizace vhodnými anti-id Mabs, může způsobit protinádorovou imunitu.
K. Hirashima a kol., J. Immunol. 145 (1990) 224-232 popisují anti-idiotypové Mabs proti Lewis Y antigenu Mabs, kde je Lewis Y antigen vyjadřován jako antigen související s rakovinou. Konkrétně se používají anti-id Mabs proti Lewis Y antigenu Mabs AH-6. Toto řešení dosavadního stavu techniky se používá k imunizaci myší, zatímco podle vynálezu může být glycidový Lewis Y antigen nahrazen anti-id Mabs BR55-2 s vlastnostmi vnitřního obrazu, pro ochrannou imunitu u člověka.
H. Lehmann a kol., Int. J. Cancer 50 (1992) 56 - 92 popisují anti-idiotypové protilátky zaměřené proti myší IgM protilátce LAM8. Tato protilátka rozpoznává glykoprotein sGPqo-bs související s rakovinou malých plicních buněk (SCLC). Tento membránový glykoprotein související s rakovinou malých plicních buněk je zcela nepříbuzný s Lewis Y glycidovým determinantem: SGP90-135 je protein, Lewis Y je oligosacharid. Anti-idiotypové protilátky proti anti-Lewis Y protilátkám se specificitou BR55-2 nejsou příbuzné s anti-idiotypovými protilátkami proti LAM8.
V EP-A 0 445 078 je popsáno použití protilátek se specificitou BR55-2 pro léčení rakoviny malých plicních buněk (SCLC). Na základě jejich schopnosti rozeznávat Lewis Y glycidový antigen související s rakovinou malých plicních buněk jsou tyto protilátky vhodné k pasivní imunoterapii. Naproti tomu, anti-idiotypové protilátky s vlastnostmi vnitřního obrazu proti idiotypu BR55-2 jsou vhodné pro specifickou aktivní imunoterapii rakoviny a slouží jako specifické vakcíny proti rakovině napodobující neimunogenní Lewis Y glycidový determinant.
V dokumentu WO 90/617 je nárokováno použití protilátek se specificitou kgp48 a rovněž použití anti-idiotypových protilátek proti těmto protilátkám. Protilátky anti-gp48 se vážou na CD4 receptory T4 lymfocytů, čímž inhibují reakci HIV s nimi. gp48 mohou tvořit část úplné CD4 proteinové složky HIV nebo celou tuto složku. Výše uvedená přihláška neobsahuje žádný popis použití nárokovaných anti-idiotypových protilátek jako vakcíny pro indukci specifických a terapeuticky užitečných Ab3, ani tam není žádná charakterizace vlastností indukovaných Ab3. Způsob působení těchto protilátek je zcela odlišný od způsobu působení anti-idiotypových protilátek s vlastnostmi vnitřního obrazu proti idiotypu BR55-2: gp48 je proteinový determinant související s CD4, který je jako takový exprimován na všech T4 lymfocytech, Lewis Y je glycidový determinant selektivně exprimovaný na HlV-infikovaných buňkách, ale vůbec neexprimovaný na normálních lymfocytech.
V dokumentu WO 92/3165 je nárokováno použití protilátek se specificitou BR55-2 k léčení infekce HIV. Na základě toho, že rozpoznávají Lewis Y glycidový antigen související nejen s rakovinou ale rovněž s HlV-infikovanými leukocyty, jsou tyto protilátky vhodné pro pasivní imunoterapii. Naproti tomu, anti-idiotypové protilátky s vlastnostmi vnitřního obrazu proti idiotypu BR55-2 jsou vhodné pro specifickou aktivní imunoterapii rakoviny a slouží jako specifické vakcíny proti AIDS, zaměřené proti HlV-infikovaným buňkám, napodobující neimunogenní Lewis Y glycidový determinant selektivně exprimovaný na HlV-infikovaných buňkách.
-2CZ 286547 B6
Kozí polyklonální anti-idiotypové protilátky, které popsali C. Zwicky a kol., Br. J. Cancer 63. Suppl. 14 (1991) 67-70 jsou zaměřeny proti myší IgG2a protilátce SW A20. Tato protilátka rozpoznává glykoproteinový antigen shluku 5A související s rakovinou malých plicních buněk (SCLC). Tento membránový glykoprotein související s rakovinou malých plicních buněk je zcela nepříbuzný s Lewis Y glycidovým determinantem: antigen shluku 5A je sialoglykoprotein, Lewis Y je oligosacharid, antigen shluku 5A je spojen s méně než 50 % SCLC, Lewis Y je exprimován na přibližně 75 % SCLC, ale rovněž na 60 až více než 90 % rakovin epiteliálního původu. Anti-idiotypové protilátky proti anti-Lewis Y protilátkám se specificitou BR55-2 nejsou příbuzné s anti-idiotypovými protilátkami proti SW A20. Kromě toho jsou antiidiotypové protilátky proti anti-Lewis Y protilátkám se specificitou BR55-2 podle vynálezu monoklonální, zatímco příprava anti-idiotypových protilátek popsaná ve výše uvedeném dokumentu je polyklonální. Příprava a charakterizace (identita jednotlivých partií) v případě polyklonálních anti-idiotypových protilátek je podstatně komplikovanější než v případě monoklonálních protilátek.
Podstata vynálezu
Terapeutická imunizace proti rakovině pomocí anti-id Mabs může být obzvláště úspěšná u ranných stádií nemoci. V době, kdy je chirurgicky odstraněn primární tumor, jsou již často jednotlivé skryté tumorové buňky rozšířeny v mnohých orgánech pacienta. O těchto mikrometastatických buňkách je známo, že jsou příčinou dalšího růstu metastáz, často až několik let po diagnóze a chirurgickém odstranění klinicky dokázané tumorové tkáně. Doposud je téměř ve všech případech metastázující nádorové bujení epiteliálního původu neléčitelné. Proto je efektivní léčba „minimální zbytkové rakoviny“, například destrukce skrytých mikrometastatických buněk, za účelem zabránění růstu makrometastáz naléhavou potřebou současné medicíny. V těchto stadiích nemoci (podávání adjuvans) jsou konvenční chemoterapeutické přístupy velmi málo úspěšné. Nicméně indukce specifické antitumorové imunity v době minimální zbytkové nemoci pomocí imunizace vhodnými anti-id monoklonálními protilátkami může vést ktomu, že jsou mikrometastatické buňky selektivně eliminovány imunitním systémem, což vede k prodloužení života pacienta bez dalších recidiv.
Monoklonální protilátky se specificitou BR55-2 (popsané například ve Wistar EP 285 059, M. Blaszcyk-Thurin a kol., J. Biol. Chem. 262 (1987) 372-379, nebo Z. Steplewski a kol., Hybridoma 9 (1990) 201-210) rozeznávají antigen Lewis Y6, což je sacharidová determinanta selektivně expriminovaná u většiny lidských pevných nádorů. Vzhledem ke svým vlastnostem mohou být protilátky BR55-2 použity pro pasivní imunoterapii v případě epitaliální rakoviny. Nádorově sdružená oligosacharidová determinanta Lewis Y6, která je též exprimována během určitých fází embryonálního vývoje, není sama o sobě téměř imunogenní. Nicméně monoklonální anti-idiotypové protilátky (Ab2) proti protilátce BR55-2 (Abl) s vlastnostmi vnitřního obrazu jsou, díky strukturní podobnosti s epitopy antigenu Lewis Y6, užitečné pro indukci ochranné protitumorové imunity, obzvláště v časnějších stádiích nemoci.
Kromě své exprese na buňkách nádorů epitiálního původu se sacharidový antigen Lewis Y6 objevuje také při pathogenesi infekce virem lidské imunitní nedostatečnosti (HIV - Human imunodefíciency virus). Syndrom získané imunitní nedostatečnosti (AIDS - Acquired immune deficiency syndrom) je znám jako choroba, jejíž původ byl identifikován jako související s infekcí lymfotrofním retrovirem (HTV). Tato choroba je charakterizována poruchou, která je spojena se zhoršením buněčné imunity a absolutní lymfopenií, významným sníženým množstvím T-lymfocytů (CD4+). Rozvoji choroby AIDS může předcházet presyndrom, který se zpravidla projevuje komplexem určitých klinických znaků a lymfopenií pomocných T-lymfocytů. Tento presyndrom se nazývá komplex doprovázející AIDS (ARC-AIDS related complex).
-3CZ 286547 B6
HIV patří do skupiny virů, které byly intenzivně studovány v průběhu posledních dvaceti let. Když retrovirus pronikne do lidské nebo zvířecí buňky, jeho RNA se přepíše do DNA a vloží se do hostitelské buňky, která je tímto oklamána a jedná s geny viru jako se svými vlastními. HIV může v těchto buňkách zůstat latentní po dobu několika let v bezpečí před útokem imunitního systému a je slepě kopírován pokaždé, když se dělí hostitelská buňka. Pouze v případě aktivace infikovaných buněk se spustí rychlá virová replikace. Poté virové částice usmrtí tyto buňky a uvolní se do krevního oběhu.
Díky specifickým vlastnostem viru HIV je léčba eliminací jak vlastního viru, tak provirové informace, která již byla přepsána do lidského genomu u infikovaných pacientů, velmi obtížná. Proto se většina terapeutických přístupů zaměřovala na látky, které zpomalují rozvoj nemoci tím, že zasahují do hlavních kroků replikace virů.
Hlavním cílem je prevence infekce virem HIV a terapeutický zákrok u již infikovaných pacientů pomocí bezpečné a efektivní vakcíny. Některé vakcinační postupy jsou testovány v preklinickém nebo ranně klinickém stádiu. Většinou používají jako antigen některou virovou strukturu, zvláště pak hlavní obalový glykoprotein gpl20.
Přirozeně se vyskytující imunitní odpověď na virus spočívá v tvorbě protilátek proti všem virovým proteinům jakož i v aktivaci buněčné imunity. Nicméně zdá se, že tato reakce hostitele na infekci virem HIV, není schopná zcela zastavit rozvoj nemoci po bezpříznakové fázi, která často trvá léta. Proto jsou postupy vakcinace založené na týchž antigenech, které způsobují přirozenou a v konečných důsledcích neochraňující imunitní odpověď, zůstávají pochybné. Jeden z hlavních problémů je veliká heterogenita viru HIV, pomocí které virus uniká před útokem typově specifických neutralizujících protilátek anti-gpl20.
Efektivní ochrana vakcinací proti viru HIV vyžaduje dvě obranné strategie: jednu proti volnému pohybu viru v krevním oběhu a druhou proti buňkám, které již byly infikovány. Je známo, že buňky infikované virem HIV exprimují na svém povrchu in vitro a in viro pozměněnou glykosylační strukturu, jmenovitě sacharidovou determinantu Lewis Y. Vzhledem k tomu, že se tento antigen za normálních okolností vyskytuje pouze během určitých stádií vývoje plodu a jeho výskyt je také spojován s některými zhoubnými bujeními, může jeho exprese na buňkách infikovaných virem HIV odrážet jejich pozměněný diferenciační stav, který byl vyvolán retrovirovou transformací. Proto tento povrchový fenotyp představuje unikátní buněčnou reakci hostitele na transfekci lidského genomu virem HIV.
Povrchový glykoprotein viru HIV je tvořen glykosylačním aparátem infikovaných buněk. Proto byly změny v glykosylačním vzoru infikovaných buněk produkujících virus HIV také nalezeny na uvolněných virových částicích. V důsledku toho také povrchový protein viru HIV, jenž byl produkován v těchto buňkách, obsahuje sacharidové determinanty Lewis Y. Oligosacharid Lewis Y takto představuje specifickou hostitelovu odpověď, která je exprimována jak na buňkách infikovaných virem HIV, tak i na volných virových částicích.
Podle výše uvedených předpokladů splňuje determinanta Lewis Y důležité požadavky na použití při vakcinaci jak proti volnému viru, tak proti buňkám infikovaným virem HIV. Dále, vzhledem k tomu, že jde o obecnou reakci hostitele na virus HIV, je antigen Lewis Y nezávislý na kmeni viru HIV a není ovlivněn genetickou variabilitou tohoto viru. Bohužel, vzhledem ke své sacharidové struktuře a vzhledem ktomu, že je jakožto fetální diferenciační antigen pro organismus vlastní, není antigen Lewis Y sám o sobě imunogenní. U člověka nebyla detekována žádná přirozená imunitní odpověď proti tomuto antigenu. Nicméně monoklonální antiidiotypové protilátky (Ab2) proti protilátce BR55-2 (Abl) s vlastnostmi vnitřního obrazu napodobující strukturní epitopy antigenu Lewis Y mohou být užitečné pro indukci preventivní a terapeutické imunity jak proti volnému viru HIV, tak i proti buňkám infikovaných virem HTV, a to nezávisle na kmeni viru.
-4CZ 286547 B6
Kromě jejich terapeutického a preventivního použití jako unikátní vakcíny, jsou monoklonální anti-id protilátky s vlastnostmi vnitřního obrazu použitelné jako vysoce specifické reagencie pro idiotyp protilátky, proti které byly odvozeny. Téměř výlučně rozeznávají vazebnou část protilátky Abl. Tato schopnost není závislá na jiných determinantách protilátky Abl. Jinými slovy vhodné anti-id Mabs selektivně určují jakoukoli molekulu, která obsahuje unikátní idiotyp Abl ve správném trojrozměrném tvaru. Tudíž tyto anti-id Mabs se vážou se srovnatelnou afinitou na F(ab)2, Fab a Fv fragmenty protilátky Abl jakož i na jejich výměnné varianty (switch variants - obsahují různé konstantní oblasti například myších IgG2a, IgG2b, IgGl, ale mají stejný idiotyp). Kromě toho mezi tyto vysoce specifické rozpoznávací struktury antiidiotypových Mabs s vlastnostmi vnitřního obrazu patří také varianty rodičovské myší Mab získané technologií rekombinantní DNA.
Za účelem překonání možných problémů při opakovaném použití myších protilátek pro lidskou pasivní imunoterapii, byly vytvořeny chimérické Mabs typu myš/člověk. Tyto chimérické protilátky byly vytvořeny kombinací variabilních domén libovolné rodičovské myší Mab s lidskými konstantními doménami. Pro detekci takovýchto chimérických Mabs typu myš/člověk v lidském séru jsou zapotřebí vysoce specifické reagencie, protože tyto chimérické monoklonální protilátky mají konstantní oblast stejnou jaká je v běžných lidských imunoglobulinech.
Pro další zlepšení vlastností těchto Mabs s terapeuticky zajímavými vlastnostmi pro použití v pasivní imunoterapii, mohou být zkonstruovány „zcela humanizované polidštěné“ protilátky pomocí technologie rekombinantní DNA. V takovýchto protilátkách je pouze minimum nezbytných částí rodičovské myší protilátky (CDR-complementarity determining regions, komplementaritu určující oblasti) které jsou spojeny s úseky základní struktury lidské variabilní oblasti a s lidskými konstantními oblastmi. Pro návrh a konstrukci takovýchto „zcela polidštěných“ Mabs se používá sekvenční homologie a molekulárního modelování tak by se získala vhodná kombinace lidských a myších sekvencí, která dále sníží imunogenicitu při zachování vazebných vlastností. Jsou-li splněny následující požadavky, mohou se určité antiidiotypové monoklonální protilátky generované proti idiotypu rodičovské myší Abl vázat na humanizované varianty protilátek, na které byly transplantovány CDR oblasti (CDR-grafted). Tyto požadavky jsou:
A. trojrozměrná struktura vazebného místa humanizované protilátky je velmi podobná vazebnému místu rodičovské myší protilátky.
B. konkrétní anti-id protilátka přesně rozeznává tento trojrozměrný tvar vazebného místa („pravá protilátka s vlastnostmi vnitřního obrazu“).
Takovéto anti-idiotypové Mabs mající výše zmíněné vlastnosti jsou zvláště užitečnými reagenciemi pro specifické a citlivé kvantitativní určení např. sérových koncentrací zcela humanizovaných monoklonálních protilátek (s transplantáty CDR) v přítomnosti velikých přebytků normálních lidských imunoglobulinů.
Vynález se týká generování, produkce a charakterizace myších monoklonálních antiidiotypových protilátek s vlastnostmi vnitřního obrazu (Ab2) k monoklonálním protilátkám BR55-2 (Abl). Dále vynález popisuje využití těchto anti-idiotypových Mabs pro aktivní terapeutickou a preventivní imunizaci proti nádorům epiteliálního původu a rakovině malých plicních buněk, jakož i proti nemocem způsobeným infekcí virem HIV. Dále vynález popisuje využití těchto ani-idiotypových Mabs pro vysoce selektivní a kvantitativní určení protilátek nebo jejich fragmentů a derivátů se specifitou BR55-2 včetně chimerizovaných a zcela humanizovaných variant (viz WO92/03165) jakož i obecně použitelný způsob selektivní imunoafinitní purifikaci molekul se specifitou BR55-2.
CŽ 286547 B6
Popis obrázků
Obr. 1: Na obrázku jsou znázorněny výsledky elektroforetického stanovení čistoty monoklonálních protilátek podle vynálezu. Význam zkratek je následující: St znamená standardy; E4, Cil, B3, B9, G6 a G9 jsou jednotlivé monoklonální protilátky. V levé části, ohraničené oběma standardy, jsou výsledky pokusu provedené v redukčním prostředí, zatímco v pravé části v neredukčním.
Obr. 2: Na obrázku jsou znázorněny výsledky stanovení čistoty monoklonálních protilátek podle vynálezu isoelektrickou fokusací. Význam zkratek je následující: St znamená standardy; E4, Cl 1, B3, B9, G6 a G9 jsou jednotlivé monoklonální protilátky. Na svislé oseje uvedeno pH.
Obr. 3: Na obrázku jsou výsledky kompetitivní inhibice vazby myší protilátky IgG3/BR55-2 na buněčnou linii SKBR5, která je způsobena anti-id protilátkou BR55-2 č. E4. Koncentrace protilátky BR55-2/myší IgG3 je 1 pg/ml. Na vodorovné ose jsou koncentrace inhibující protilátky anti-id BR55-2 č. E4 v pg/ml. Na svislé oseje vynesena absorbance při vlnové délce 492 nm, vynásobená 1000.
Obr. 4: Na obrázku je znázorněna vazba králičích protilátek na buněčnou linii SKBR5 před a po imunizaci anti-id protilátkou BR55-2 č. E4 (buněčná ELISA). Na vodorovné ose vyznačeno ředění séra. Na svislé ose je vynesena absorbance při vlnové délce 492 nm, vynásobená 1000. —I— platí pro sérum odebrané před imunizací, —b— pro sérum odebrané 9 týdnů po imunizaci.
Obr. 5: Na obrázku je znázorněna vazba protilátek opic druhu Rhesus na buněčnou linii SKBR5 před a po imunizaci anti-id protilátkou BR55-2 č. E4 (buněčná ELISA). Na vodorovné ose vyznačeno ředění séra. Na svislé oseje vynesena absorbace při vlnové délce 492 nm, vynásobená 1000. —l— platí pro sérum odebrané před imunizací, —a— pro sérum odebrané 9 týdnů po imunizaci.
Obr. 6: Na obrázku je znázorněna imunizace opice č. 246 protilátkou anti-id BR55-2 č. E4. Hodnocena byla vazba sérových Ig na protilátku anti-id BR55-2 č. E4 (ELISA). Na vodorovné ose vyznačeno ředění séra. Na svislé ose je vynesena absorbance při vlnové délce 492 nm, vynásobená 1000 (referenční měření při 620 nm). Křivky platí pro sérum opice 246:
odebrané před imunizací odebrané 4 týdny po imunizaci odebrané 9 týdnů po imunizaci —*— odebrané před první upomínací dávkou
·.? odebrané 1 týden po první upomínací dávce —H— odebrané před druhou upomínací dávkou —i— odebrané 4 týden po druhé upomínací dávce
-f&- odebrané 9 týden po druhé upomínací dávce
Obr. 7: Na obrázku je znázorněna imunizace opice č. 287 protilátkou anti-id BR55-2 č. E4. Podmínky pokusu a popis os byly stejné jako na obrázku 6. Křivky platí pro sérum opice 287:
-6CZ 286547 B6 —odebrané před imunizací
-Π— odebrané 4 týdny po imunizaci —odebrané 9 týdnů po imunizaci odebrané před první upomínací dávkou odebrané 4 týden po první upomínací dávce odebrané před druhou upomínací dávkou —odebrané 4 týden po druhé upomínací dávce -S- odebrané 9 týden po druhé upomínací dávce
Obr. 8: Na obrázku je znázorněna imunizace opice č. E23 protilátkou anti-id BR55-2 č. E4. Podmínky pokusu a popis os byly stejné jako na obrázku 6. Křivky platí pro sérum opice č. E23:
odebrané před imunizací
-Θ— odebrané 4 týdny po imunizaci odebrané 9 týdnů po imunizaci —*— odebrané před první upomínací dávkou —odebrané 4 týden po první upomínací dávce —h— odebrané před druhou upomínací dávkou odebrané 1 týden po —a— odebrané 4 týden po odebrané 9 týden po druhé upomínací dávce druhé upomínací dávce druhé upomínací dávce
Obr. 9: Na obrázku je znázorněna imunizace opice č. 215 nespecifickou myší IgGl protilátkou.
Hodnocena byla vazba sérových Ig na protilátku anti-id BR55-2 č. E4 (ELISA). Popis os 10 odpovídá obrázku 6. Křivky platí pro sérum opice č. 215:
—e— odebrané před imunizaci
-O- odebrané 4 týdny po imunizaci odebrané 9 týdnů po imunizaci —odebrané před první upomínací dávkou —odebrané 1 týden po první upomínací dávce odebrané 4 týden po první upomínací dávce —odebrané před druhou upomínací dávkou -t-·- odebrané 1 týden po druhé upomínací dávce —odebrané 4 týden po druhé upomínací dávce odebrané 9 týden po druhé upomínací dávce
Obr. 10: Na obrázku je znázorněna imunizace opice č. 252 nespecifickou myší IgGl protilátkou. Hodnocena byla vazba sérových Ig na protilátku anti-id BR55-2 č. E4 (ELISA). Popis os odpovídá obrázku 6. Křivky platí pro sérum opice č. 252:
odebrané před imunizací odebrané 9 týdnů po imunizaci —w— odebrané před druhou upomínací dávkou —Φ— odebrané 9 týden po druhé upomínací dávce
Obr. 11; Na obrázku je znázorněna imunizace opice č. 246 protilátkou anti-id BR55-2 č. E4. Hodnocena byla vazba sérových Ig na buněčnou linii SKBR5 z nádoru plic (buněčná ELISA). Popis os odpovídá obrázku 6. Křivky platí pro sérum opice 246:
odebrané před imunizaci —«— odebrané 9 týdnů po imunizaci odebrané před první upomínací dávkou —odebrané 4 týden po první upomínací dávce —**— odebrané před druhou upomínací dávkou —τ*τ— odebrané 4 týden po druhé upomínací dávce
-a- odebrané 9 týden po druhé upomínací dávce
Obr. 12: Na obrázku je znázorněna imunizace opice č. 287 protilátkou anti-id BR55-2 č. E4.
Podmínky pokusu a popis os byly stejné jako na obrázku 11. Křivky platí pro sérum opice č. 287:
odebrané před imunizací —odebrané 1 týden po imunizaci -e- odebrané 4 týdny po imunizaci odebrané 9 týdnů po imunizaci odebrané před první upomínací dávkou odebrané týden po první upomínací dávce odebrané před druhou upomínací dávkou
-U— odebrané 1 týden po druhé upomínací dávce odebrané 4 týdny po druhé upomínací dávce —ffi— odebrané 9 týdny po druhé upomínací dávce
Obr. 13: Na obrázku je znázorněna imunizace opice č. E23 protilátkou anti-id BR55-2 č. E4. Podmínky pokusu a popis os byly stejné jako na obrázku 11. Křivky platí pro sérum opice Č.E23:
odebrané před imunizací odebrané 9 týdnů po imunizaci —odebrané před první upomínací dávkou odebrané 4 týden po první upomínací dávce —odebrané před druhou upomínací dávkou
-O- odebrané 1 týden po druhé upomínací dávce odebrané 4 týdny po druhé upomínací dávce odebrané 9 týdny po druhé upomínací dávce
-8CZ 286547 B6
Obr. 14: Na obrázku je znázorněna imunizace opice č. 215 nespecifickou myší IgGl protilátkou.
Podmínky pokusu a popis os byly stejné jako na obrázku 11. Křivky platí pro sérum opice č. 215:
odebrané před imunizací —a— odebrané 9 týdnů po imunizaci odebrané před první upomínací dávkou —a— odebrané 4 týden po první upomínací dávce odebrané před druhou upomínací dávkou —odebrané 4 týdny po druhé upomínací dávce -Φ- odebrané 9 týdny po druhé upomínací dávce
Obr. 15: Na obrázku je znázorněna imunizace opice č. 246 protilátkou anti-id BR55-2 č. E4. Hodnocena byla vazba sérových Ig na buněčnou linii CATO z žaludečního nádoru (buněčná ELISA). Popis os odpovídá obrázku 6. Křivky platí pro sérum opice č. 246:
odebrané před imunizací odebrané 9 týdnů po imunizaci odebrané před první upomínací dávkou odebrané 4 týden po první upomínací dávce —h— odebrané před druhou upomínací dávkou -β- odebrané 9 týden po druhé upomínací dávce
Obr. 16: Na obrázku je znázorněna imunizace opice č. 215 nespecifickou myší protilátkou IgGl. Hodnocena byla vazba sérových Ig na buněčnou linii CATO z žaludečního nádoru (buněčná ELISA). Popis os odpovídá obrázku 6. Křivky platí pro sérum opice č. 215:
odebrané před imunizací odebrané 9 týdnů po imunizaci odebrané před první upomínací dávkou —odebrané 4 týden po první upomínací dávce —M— odebrané před druhou upomínací dávkou
-β- odebrané 9 týden po druhé upomínací dávce
Obr. 17: Na obrázku je znázorněna imunizace opice č. E 23 protilátkou anti-id BR55-2 č. E4. Hodnocena byla vazba sérových Ig na buněčnou linii SW2 z nádoru malých plicních buněk (buněčná ELISA). Popis os odpovídá obrázku 6. Křivky platí pro sérum opice č. E23:
odebrané před imunizací odebrané 9 týdnů po imunizaci odebrané před první upomínací dávkou odebrané 4 týdny po první upomínací dávce
-9CZ 286547 B6
-w— odebrané před druhou upomínací dávkou —a— odebrané 4 týdny po druhé upomínací dávce —a— odebrané 9 týdnů po druhé upomínací dávce
Obr. 18: Na obrázku je znázorněna imunizace opice ě. 215 nespecifickou myší protilátkou IgGl.
Hodnocena byla vazba sérových Ig na buněčnou linii SW2 z nádoru malých plicních buněk (buněčná ELIS A). Popis os odpovídá obrázku 6. Křivky platí pro sérum opice č. 215:
odebrané před imunizací odebrané 9 týdnů po imunizaci _ A._ odebrané před první upomínací dávkou
- t _ odebrané 4 týdny po první upomínací dávce w . odebrané před druhou upomínací dávkou —ΐτ- odebrané 4 týdny po druhé upomínací dávce _Φ_ odebrané 9 týdnů po druhé upomínací dávce
Obr. 19: Na obrázku je znázorněna imunizace opice č. E 23 protilátkou anti-id BR55-2 č. E4. Hodnocena byla vazba sérových Ig na buněčnou linii SW948 z nádoru tlustého střeva (buněčná ELISA). Popis os odpovídá obrázku 6. Křivky platí pro sérum opice č. E 23:
odebrané před imunizací
-e- odebrané 9 týdnů po imunizaci —odebrané před první upomínací dávkou odebrané 4 týdny po první upomínací dávce odebrané před druhou upomínací dávkou
-ύ- odebrané 4 týdny po druhé upomínací dávce _a_ odebrané 9 týdnů po druhé upomínací dávce
Obr. 20: Na obrázku je znázorněna imunizace opice č. E 23 protilátkou anti-id BR55-2 č. E4. Hodnocena byla vazba sérových Ig na melanomovou buněčnou linii WM 9 (buněčná ELISA). Popis os odpovídá obrázku 6. Křivky platí pro sérum opice č. E 23:
—— odebrané před imunizací odebrané 9 týdnů po imunizaci —a— odebrané před první upomínací dávkou —♦— odebrané 4 týdny po první upomínací dávce —odebrané před druhou upomínací dávkou
-e- odebrané 4 týdny po druhé upomínací dávce
Obr. 21: Na obrázku je znázorněna vazba Ig, imunitně purifikovaných ze séra opice druhu Rhesus, na protilátku anti-id BR55-2 č. E4 (ELISA). Sérum opice č. 246 ze 4. a 9. týdne po druhé upomínací dávce bylo shromážděno a imunitně purifikováno na afmitní koloně s protilátkou anti-id BR55-2 č. E4. Na vodorovné oseje vyznačena koncentrace Ig v pg/ml. Na
-10CZ 286547 B6 svislé oseje vynesena absorbance při vlnové délce 492 nm, vynásobená 1000 (referenční měření při 620 nm). Jednotlivé křivky platí pro tyto frakce:
imunitně purifikovaná frakce Ig (Ab3) —frakce prošlá kolonou
Obr. 22: Na obrázku je znázorněna vazba Ig, imunitně purifikovaných ze séra opice druhu Rhesus, na buňky SKBR5 z prsního nádoru (buněčná ELISA). Sérum opice č. 246 ze 4. a 9. týdne po druhé upomínací dávce bylo shromážděno a imunitně purifikováno na afinitní koloně s protilátkou anti-id BR55-2 č. E4. Popis os odpovídá příkladu 21. Jednotlivé křivky platí pro tyto frakce:
purifikovaná frakce Ig
-o- frakce prošlá kolonou humanizovaná IgGl
Obr. 23: Na obrázku je znázorněna vazba Ig, imunitně purifikovaných ze séra opice druhu Rhesus, na buňky SKBR5 z prsního nádoru a na melanomové buňky WM9 (buněčná ELISA). Sérum opice č. 246 ze 4. a 9. týdne po druhé upomínací dávce, bylo shromážděno a imunitně purifikováno na afinitní koloně s protilátkou anti-id BR55-2 č. E4. Popis os odpovídá příkladu 21. Jednotlivé křivky platí pro vazbu na tyto buňky:
WM9 (Ab3)
SKBR5 (Ab3)
-Θ- WM9 (Abl) _O_ SKBR5 (Abl)
Obr. 24: Na obrázku je znázorněna vazba Ig, imunitně purifikovaných ze séra opice druhu Rhesus, na buněčné membrány z buněk SKBR5 a WM9 (ELISA). Sérum opice č. 246 ze 4. a 9. týdne po druhé upomínací dávce, bylo shromážděno a imunitně purifikováno na afinitní koloně s protilátkou anti-id BR55-2 č. E4. Popis os odpovídá příkladu 21. Jednotlivé křivky platí pro vazbu purifikovaných Ig na tyto buňky:
SKBR5
-q- WM9
Obr. 25: Na obrázku je znázorněna vazba Ig, imunitně purifikovaných ze séra opice druhu Rhesus, na různé buněčné linie (buněčná ELISA). Sérum opice č. 246 ze 4. a 9. týdne po druhé upomínací dávce, bylo shromážděno a imunitně purifikováno na afinitní koloně s protilátkou anti-id BR55-2 č. E4. Popis os odpovídá příkladu 21. Jednotlivé křivky platí pro vazbu purifikovaných Ig na tyto buněčné linie:
SW2
CATO
SKBR5
-4- SW948
-11CZ 286547 B6
Obr. 26: Na obrázku je znázorněna ADCC proti buněčné linii SK.BR5, způsobená buňkami PBMC. Úlohu protilátky hrají BR55-2/myší IgG3 nebo imunitně purifikované Ig ze séra opice druhu Rhesus, která byla imunizována anti-id protilátkou BR55-2 č. E4. Bylo použito sérum opice č. 246 ze 4. a 9. týdne po druhé upomínací dávce. Na vodorovné ose je vyznačena koncentrace Ig v pg/ml (nejvyšší koncentrace Abl nebyla testována). Na svislé oseje vyneseno procento lysovaných buněk, zjištěné z množství uvolněného 51Cr. Jednotlivé sloupce platí pro tyto protilátky:
B imunitně purifikovaná opičí Ig (Ab3) g BR55-2/myší IgG3 (Abl)
Obr. 27: Systém ELISA pro stanovení protilátky BR55-2/myší IgG3 v lidském séru (kalibrační křivka). Na vodorovné ose je vyznačena koncentrace protilátky BR55-2/myší IgG3 v pg/ml. Na svislé oseje vynesena absorbance při vlnové délce 492 nm, vynásobená 1000.
Obr. 28 a 29: Systém ELISA pro stanovení protilátky BR55-2/chimerická lidská IgGl v lidském séru (kalibrační křivka). Na vodorovné ose je vyznačena koncentrace protilátky BR552/chimerická lidská IgGl v pg/ml. Na svislé ose je vynesena absorbance při vlnové délce 492 nm, vynásobená 1000.
Obr. 30: Vazba protilátek BR55-2/chimerická IgGl a BR55-2/humanizovaná IgGl na antiidiotypovou protilátku BR55-2 č. E4. Na vodorovné ose je vyznačena koncentrace protilátky v pg/ml. Na svislé ose je vynesen poměr Jednotek odpovědi“ RU (RU viz příklad 19) dosažených příslušnou monoklonální protilátkou ku RU antiidiotypové protilátky BR55-2 č. E4. Jednotlivé křivky platí pro:
BR55-2/chimerická IgGl
BR55-2/humanizovaná IgG
Obr. 31: Vazba protilátek BR55-2/chimerická IgGl a BR55-2/humanizovaná IgGl na antiidiotypovou protilátku BR55-2 č. Cil. Popis os odpovídá obrázku 30 stím, že RU dané protilátky je vztažena k hodnotě RU protilátky anti-id BR55-2 č. Cil. Jednotlivé křivky platí pro:
BR55-2/chimerická IgGl
BR55-2/humanizovaná IgG
Obr. 32: Vazba protilátek BR55-2/chimerická IgGl a BR55-2/humanizovaná IgGl na antiidiotypovou protilátku BR55-2 č. B3. Popis os odpovídá obrázku 30 s tím, že RU dané protilátky je vztažena k hodnotě RU protilátky anti-id BR55-2 č. B3. Jednotlivé křivky platí pro:
BR55-2/chimerická IgGl
-·- BR55-2/humanizováná IgG
Obr. 33: Vazba protilátek BR55-2/chimerická IgGl a BR55-2/humanizovaná IgGl na antiidiotypovou protilátku BR55-2 č. B9. Popis os odpovídá obrázku 30 s tím, že RU dané protilátky je vztažena k hodnotě RU protilátky anti-id BR55-2 č. B9. Jednotlivé křivky platí pro:
-12CZ 286547 B6
BR55-2/chimerická IgGl
BR55-2/humanizovaná IgG
Obr. 34: Vazba protilátek BR55-2/chimerická IgGl a BR55-2/humanizovaná IgGl na antiidiotypovou protilátku BR55-2 č. G6. Popis os odpovídá obrázku 30 s tím, že RU dané protilátky je vztažena k hodnotě RU protilátky anti-id BR55-2 č. G6. Jednotlivé křivky platí pro:
BR55-2/chimerická IgGl
-·- BR55-2/humanizováná IgG
Obr. 35: Vazba protilátek BR55-2/chimerická IgGl a BR55-2/humanizovaná IgGl na antiidiotypovou protilátku BR55-2 č. G9. Popis os odpovídá obrázku 30 s tím, že RU dané protilátky je vztažena k hodnotě RU protilátky anti-id BR55-2 č. G9. Jednotlivé křivky platí pro:
BR55-2/chimerická IgGl
BR55-2/humanizovaná IgG
Obr. 36: Systém ELISA pro stanovení protilátky BR55-2/humanizovaná IgGl v lidském séru (kalibrační křivka). Na vodorovné ose je vyznačena koncentrace protilátky BR55-2/humanizovaná IgGl v pg/ml. Na svislé ose je vynesena absorbance při vlnové délce 492 nm, vynásobená 1000.
Obr. 37: Kompetitivní inhibice vazby protilátky BR55-2/myší IgG3 na anti-id BR55-2 způsobená protilátkou BR55-2/lidská chimérická IgGl a BR55-2/lidská chimérická IgG3. Na vodorovné ose je vyznačena koncentrace protilátky v pg/ml. Na svislé ose je vynesena absorbance při vlnové délce 492 nm, vynásobená 1000. Jednotlivé křivky platí pro:
BR55-2/myší IgG3 —i— lidská chimérická IgGl + 0.05 |xg/ml mIgG3 —lidská chimérická IgG3 + 0.05 μg/ml mIgG3
Obr. 38: Buněčná cytotoxicita způsobená komplementem (CDC) zprostředkovaná protilátkou BR55—2/myší IgG3 — Inhibice anti-id protilátkou BR55-2 č. E4. Na vodorovné oseje vyznačena koncentrace anti-di protilátky v pg/ml. Koncentrace protilátky BR55-2/myší IgG3 byla konstantně 1,4 pg/ml. Na svislé oseje vyneseno procento lysovaných buněk SKBR5.
Obr. 39: Na obrázku jsou znázorněny výsledky elektroforetického stanovení čistoty (redukční podmínky) monoklonálních protilátky po imunitní purifikaci. Význam zkratek je následující: St znamená standardy; Rje referenční protilátka, Ch je protilátka BR55-2/lidská chimérická IgGl.
Generování a charakterizace myších monoklonálních anti-idiotypových protilátek proti idiotypu protilátek BR55-2
Ve snaze minimalizovat nežádoucí anti-isotypovou imunitní odpověď, byl pro imunizaci použit fragment F(ab)2 myší protilátky IgG3 BR55-2. Pro úspěšnou tvorbu myších anti-id Mabs proti idiotypu myší Mab BR55-2 je důležité zvýšit její imunogenicitu, čímž se zvýší příslušná imunitní odpověď v syngenním hostiteli. Proto byly fragmenty F(ab)2 zbavené části Fc (štěpení a purifikace jsou popsány viz EP-A-528 767) konjugovány s hemocyaninem z mořských přílipek Megathura crenulata (KLH - Keyhole Limpet hemocyanin) který sloužil jako
-13CZ 286547 B6 imunogenní nosič. Ke konjugaci byl použit heterobifunkční linker N-sukcinimidil-3-(2pyridyldithio)propionát (=SPDP) podle popsaného způsobu (J. Carlsson a kol., Biochem. J. 173, 723, 1978).
Myši balb/c se imunizovaly tímto konjugátem BR55-2/myší IgG3 - F(ab)2 - KLH v úplném Freundově adjuvans podle běžného protokolu pro generování myších Mabs. Po opakované imunizaci se slezinné buňky myší nechaly fušovat s buňkami myší myelomové linie SP2/0 (experimentální podrobnosti viz příklad 1).
Pro výběr vhodných kultivovaných hybridomových buněk byly jejich supematanty podrobeny sledu testů. Tento výběr byl založen na následujících kriteriích:
A. Sekreční rychlost hybridomů - byla určena z koncentrace myších IgG v supematantech (experimentální podrobnosti viz příklad 2). Buňky, které produkovaly vysoká množství myších IgG byly rozklonovány do kultur z jediné buňky.
B. Vazba vybraných supematantů na F(ab)2 fragment myší protilátky IgG3 BR55-2 (experimentální detaily viz příklad 3).
C. Inhibice vazby myších protilátek IgG2 nebo IgG2a/BR55-2 na Lewis Y pozitivní buňky SKBR5 z nádoru lidského prsu pomocí vybíraných supematantů (experimentální detaily viz příkladu 4).
V posledním testu se zjišťuje schopnost protilátek Ab2 vytvářet vnitřní obraz. IgG2a výměnná varianta myší protilátky BR55-2 byla použita proto, aby se minimalizovala detekce protilátek Ab2 rozeznávajících zbytkové konstantní oblasti ve fragmentu Fab nebo F(ab)2 myší protilátky IgG3 BR55-2, která byla použita pro imunizaci. Tento test byl proveden kvantitativně podle koncentrace IgG zjištěné v testu A. (viz příklad 2). Dále byl při tomto experimentu přidán k testovanému supematantů přebytek myších nespecifických IgG proto, aby se zabránilo detekci protilátek Ab2, které nejsou specifické pro idiotyp BR55-2. Byly vybrány takové hybridomy, které produkovaly IgG s inhibiční kapacitou více než 95 % (inhibice vazby myších protilátek IgG2a/BR55-2 na buněčnou linii SKBR5).
Pomocí výše zmíněných procedur bylo nakonec vybráno a pomnoženo 6 různých hybridomů (E4, Cil, B3, B9, G6, G9). Všech 6 hybridomů produkovalo myší IgGl, což bylo zjištěno testem ELISA za použití systému králičí-anti-myší-IgGl/peroxidasa (např. od firmy Zymed).
Všech šest hybridomů bylo kultivováno ve válcových nádobách (37 °C, 5% CO2 v médiu G, výměna média každé 3 až 4 dny) a supematanty byly sbírány pro následnou purifikaci. Každý supematant obsahující příslušnou anti-id BR55-2 Mab byl purifikován pomocí imunoafmitní chromatografie. Obecně je afinitní chromatografie založena na interakci mezi imobilizovaným ligandem a požadovanou látkou. V případě anti-idiotypových látek BR55-2 je takovým vysoce specifickým ligandem pro afinitní kolonu protilátka. Mab BR55-2/myší IgG2a, která se váže na vybrané anti-idiotypové Mabs (experimentální detaily viz příklad 5). Stupeň čistoty izolovaných monoklonálních protilátek proti idiotypu BR55-2 (E4, Cil, B3, B9, G6, G9) byl testován analytickou FPLC (fast performance liquid chromatography - chromatografie s rychlým průtokem elučního činidla) chromatografií na iontoměniči, chromatografií s dělením podle velikosti, SDS-PAGE a izoelektrickou fokusací. Čistota všech šesti monoklonálních protilátek anti-id BR55-2 Mabs byla vyšší než 95% (experimentální detaily viz příklad 6, SDS-PAGE a isoelektrická fokusace jsou na obrázcích 1 a 2).
Purifikované anti-id Mabs byly kvantitativně charakterizovány určením jejich schopnosti inhibovat vazbu protilátka BR55-2/myší IgG3 na antigen Lewis Y pozitivní buněčnou linii SKBR5. Všechny anti-idiotypové Mabs inhibují vazbu Abl na tento antigen ve
-14CZ 286547 B6 stechiometrickém poměru 1:1 (experimentální detaily viz příklad 7, reprezentativní výsledky viz obrázek 3).
Rozhodující důkaz o tom, že monoklonální protilátky anti-id BR55-2 mají vlastnosti vnitřního obrazu je popsán výše. Použití těchto protilátek jakožto náhradního tumorového antigenu je založeno na jejich schopnosti vyvolávat protilátkovou odpověď Ab3 proti nádorově sdruženým antigenům u různých živočišných druhů. Podle teorie sítě (N. Jeme) jsou protilátky (Ab3) indukované imunizací anti-idiotypovými monoklonálními protilátkami (Ab2) s vlastnostmi vnitřního obrazu svojí vazebnou specifitou podobné protilátkám Abl. To znamená, že imunitní odpověď, vyvolaná imunizací monoklonálními protilátkami anti-id BR55-2, by měla být specifická proti tumorovým buňkám nesoucím antigen Lewis Y. Z toho vyplývá, že imunizací monoklonálními protilátkami anti-id BR55-2 může být ve člověku vyvolána ochranná antitumorová imunita. Při vyšetřování vlastností protilátkové odpovědi Ab3 byli králíci a opice druhu Rhesus imunizovány protilátkou anti-id BR55-2 č. E4 podávanou spolu s hydroxidem hlinitým, který sloužil jako nosič a adjuvans. Tento jemný adjuvans má široké použití v různých lidských vakcínách. Jako negativní kontrola byla také imunizována zvířata stejným množstvím nespecifické myší IgGl. Po čtyřech imunizačních dávkách v průběhu pěti týdnů bylo v 9. týdnu odebráno sérum (experimentální detaily viz příklad 8). Poté byla určena vazba sérových Ig na Lewis Y pozitivní buňky z buněčné linie SKBR5 z nádoru prsu a na Lewis Y negativní buňky z melanomové buněčné linie WM9 (experimentální detaily viz příklady 9 a 10). Protilátky antiid BR55-2 č. E4 vyvolávají vysoký titr protilátkové imunitní odpovědi jak u králíků tak i u opic druhu Rhesus. Sérové Ig zvířat imunizovaných protilátkou anti-id BR55-2 č. E4 se selektivně vážou na Lewis Y pozitivní buňky buněčné linie SKBR5, ale ne už na Lewis Y negativní buňky buněčné linie WM9. Naproti tomu při imunizaci nespecifickými myšími IgGl se nepodařilo detekovat téměř žádné sérové Ig, které by se vázaly na nádorové buňky. Tyto výsledky jsou shrnuty v tabulce 1. Na obrázcích 4 a 5 jsou zobrazeny reprezentativní křivky vazby Ig, které byly získány ze séra králíků a opic druhu Rhesus před a po imunizaci. Toto sérum bylo podrobeno testu ELIS A, přičemž se vázalo na buňky SKBR5. Vazba sérových Ig ze zvířat imunizovaných protilátkou anti-id BR55-2 č. E4 na buňky SKBR5 je detekovatelná ještě při zředění 1:10 000.
Dva roky po počáteční imunizaci obdržely příslušné opice druhu Rhesus první injekci upomínací dávky (boost) protilátky anti-id BR55-2 č. E4 nebo nespecifické myší IgGl. Stejným způsobem dostaly i druhou jednorázovou upomínací dávku 3 roky po počáteční imunizaci (tzn. 1 rok po první upomínací látce, experimentální detaily viz příklad 8) séra byla odebrána před a po těchto upomínacích dávkách.
Celková humorální odpověď opic druhu Rhesus, které byly vakcinované protilátkou anti-id BR55-2 č. E4, byla určena pomocí testu ELISA. Tento test se prováděl na mikrotitračních deskách potažených protilátkou anti-id BR55-2 č. E4 (experimentální detaily viz příklad 13). V séru všech opic Rhesus byla po první imunizaci, jakož i po první a druhé upomínací dávce, dokázána imunitní odpověď s velmi vysokým titrem. Vazba sérových Ig na protilátku anti-id BR55-2 č. E4 je detekovatelná ještě při zředění 1:50 000. O něco nižší, ale stále velmi významný, titr byl nalezen v séru před upomínacími dávkami. Tyto výsledky jsou zobrazeny na obrázcích 6 až 8.
Humorální imunitní odpověď opic druhu Rhesus, které byly vakcinovány nespecifickou myší IgGl byla určena pomocí stejného, výše zmíněného ELISA testu (experimentální detaily viz příklad 13). Podle očekávání jsou titry sérových Ig těchto zvířat při vazbě na protilátku anti-id BR55-2 č. E4 nižší než titry v séru opic vakcinovaných látkou anti-id BR55-2 č. E4. Zatímco imunitní odpověď opic Rhesus imunizovaných nespecifickou myší protilátkou IgGl křížově reaguje s konstantními oblastmi protilátky anti-id BR55-2 č. E4, zřetelně chybí frakce imunitní odpovědi naměřená proti hypervariabilním úsekům anti-idiotypové protilátky. Tyto výsledky jsou zobrazeny na obrázcích 9 a 10.
-15CZ 286547 B6
Aby se zjistila nádorová specifita imunitní odpovědi po první imunizaci, jakož i před a po upomínacích imunizačních dávkách, byla určena schopnost vazby opičích sérových Ig na různé nádorové Lewis Y pozitivní buněčné linie (z nádoru prsu, žaludku, tlustého střeva a malých plicních buněk), jakož i na Lewis Y negativní melanomovou buněčnou linii (experimentální detaily viz příklad 10). U opic imunizovaných protilátkou anti-id BR55-2 č. E4 byly v séru odebraném dva roky po první imunizaci a před první upomínací dávkou detekovány sérové Ig vázající se na Lewis Y pozitivní nádorové buňky. Po první upomínací imunizaci výrazně vzrostly titry sérových Ig specificky se vázajících na Lewis Y pozitivní nádorové buňky u zvířat imunizovaných protilátkou anti-id BR55-2 č. E4, přičemž nebyla detekována téměř žádná schopnost vazby na antigen negativní buněčnou linii. U opic imunizovaných nespecifickou myší IgGl se v séru odebraném v libovolnou dobu v průběhu experimentu neobjevila žádná schopnost specifické vazby. Podobných výsledků bylo dosaženo před a po druhé upomínací dávce. Výsledky titrací sér získaných v různých okamžicích jsou zobrazeny na obrázcích 11 až 20. Testy byly prováděny metodikou ELISA za pomoci několika nádorových buněčných linií. Podobná imunoreaktivita imunoglobulinů z různých opičích sér před a po první imunizaci, jakož i před a po první upomínací dávce může být demonstrována i při vazebných experimentech s membránovými přípravky z Lewis Y pozitivních buněk SKBR5 (experimentální detaily viz příklad 11). Výsledky jsou shrnuty v tabulce 2.
Za účelem podrobnější analýzy protilátkové imunitní odpovědi, indukované v opicích druhu Rhesus imunizací protilátkou anti-id BR55-2 č. E4, byla různá séra vakcinovaných opic imunitně purifikována na sloupci naplněném Sepharosou konjugovanou s protilátkou anti-id BR55-2 č. E4 (experimentální detaily viz příklad 12). Touto selektivní a jednokrokovou procedurou se separuje úplná frakce protilátkové imunitní odpovědi namířená proti protilátce anti-id BR55-2 č. E4 od všech ostatních vedlejších sérových proteinů. V prvním experimentu byly imunitně purifikovány Ig opice druhu Rhesus, imunizované protilátkou anti-id BR55-2 č. E4, ze séra získaného ve 4. a 9. týdnu po druhé upomínací dávce. Podle jejich retenčních časů na koloně s protilátkou anti-id BR55-2 č. E4 se získané imunoglobulinové frakce specificky vážou na různé epitopy molekuly protilátky anti-id BR55-2 č. E4. Tyto Ig-frakce obsahují protilátky proti konstantním oblastem protilátky anti-id BR55-2 č. E4 (anti-isotypová odpověď), jakož i protilátky proti variabilním oblastem včetně vazebného místa protilátka anti-id BR55-2 č. E4 (anti-idiotypová imunitní odpověď). Podle teorie idiotypové sítě, zmíněné v úvodu, je posledně jmenovaná část protilátek (Ab3) obzvláště důležitá, protože vykazuje vazebné vlastnosti srovnatelné s vlastnostmi protilátek se specifitou BR55-2 (Abl).
Dále byla určována vazebná schopnost této imunitně purifikované Ig-frakce ze spojených sér, získaných ve 4. a 9. týdnu po druhé upomínací dávce a frakce, která prošla kolonou, s protilátkami anti-id BR55-2 č. E4 (experimentální detaily viz příklad 13). Zatímco imunitně purifikované Ig-frakce se váží na protilátku anti-id BR55-2 č. E4, u frakce prošlé kolonou nelze zjistit žádnou schopnost vazby. Těmito výsledky je dokázána selektivita a účinnost této imunopurifikační metody (výsledky jsou zobrazeny na obrázku 21).
Dále byly srovnávány vazebné vlastnosti imunitně purifikované Ig-frakce ze shromážděného séra, které bylo získáno v 4. a 9. týdnu po druhé upomínací dávce, s vlastnostmi frakce, která prošla kolonou a humanizovanými verzemi rodičovských myších Mab (Abl) vazbou na buňky SKBR5 z nádoru prsu. Tato humanizovaná varianta protilátky Abl (BR55-2/humanizovaná IgGl), byla vybrána, aby se zjednodušilo srovnání, protože se může detekovat stejným činidlem, které se používá také pro detekci imunoglobulinu opic druhu Rhesus (kozí-anti-lidskýIg/peroxidasa, toto antisérum se, podobně jako na lidské, váže na blízce příbuzné Ig-opic druhu Rhesus). Téměř veškerá, nádorové buňky vázající reaktivita, je akumulována do imunitně purifikované Ig-frakce. Tímto výsledkem je dokázána křížová reaktivita imunoglobulinu opic druhu Rhesus indukovaných imunizací protilátkou anti-id BR55-2 č. E4 s Lewis Y pozitivní nádorovou buněčnou linií. Na základě hmotnostního poměru je vazebná síla imunitně
-16CZ 286547 B6 purifíkované Ig-frakce jenom pětkrát nižší než vazebná síla protilátky BR55-2/humanizovaný IgGl (Abl). Vezmeme-li v úvahu, že jen určitá část z imunitně purifíkované Ig-frakce je namířena proti vazebnému místu protilátky anti-id BR55-2 č. E4, a že podle teorie sítě pouze tato část vykazuje vazebné vlastnosti srovnatelné s Abl, je tento výsledek pozoruhodný. Podle výtěžku imunoafinitní purifikace séra opic druhu Rhesus, který byl přibližně 200 pg imunitně purifíkované Ig-frakce na 1 ml séra, což odpovídá přibližně 40 pg/ml imunoglobulinu se schopností vázat nádorové buňky podobně jako BR55-2/humanizovaná IgGl (výsledky jsou zobrazeny na obrázku 22, experimentální detaily viz příklady 10 a 12).
Srovnání vazebných vlastností imunitně purikovaných opičích Ig (Ab3) s vlastnostmi protilátky BR55/humanizovaný IgGl při vazbě na Lewis Y pozitivní buněčnou linii SKBR5 z prsního nádoru a na Lewis Y negativní melanomovou buněčnou linii WM9 je zobrazeno na obrázku 23 (experimentální detaily viz příklad 10). Zatímco Ab3 frakce a protilátka BR55-2/humanizovaný IgGl vykazují silnou vazbu na Lewis Y pozitivní buněčnou linii, jak bylo popsáno výše, žádná z protilátek se specificky neváže na Lewis Y negativní buněčnou linii. Těmito výsledky je dokázána podobnost vazebných struktur Ab3 - frakce a humanizované Abl.
Podobná imunoreaktivita Ab3-frakce byla též pozorována v ELISA testu při použití části membrán z buněk Lewis Y pozitivní buněčné linie SKBR5 a z buněk Lewis Y negativní buněčné linie WM9. Detekována byla pouze významná vazba Ab3-frakce pouze na membrány pocházející z Lewis Y pozitivních buněk (výsledky jsou zobrazeny na obrázku 24, experimentální detaily viz příklad 11). Vazebné vlastnosti imunitně purifikovaných opičích imunoglobulinů (Ab3) byly dále dokázány na několika Lewis Y pozitivních lidských nádorových buněčných liniích (z nádorů malých plicních buněk, žaludku, tlustého střeva, prsu). Imunitně purifíkované opičí Ig se silně vázaly na všechny testované buněčné linie (výsledky jsou zobrazeny na obrázku 25, experimentální detaily viz příklad 10).
Protilátka BR55-2/myší IgG3 (Abl) způsobí po navázání na nádorové buňky jejich destrukci pomocí aktivace lidských efektorových mechanismů. Pro zjištění nádorově destrukční kapacity opičích Ig, indukovaných imunizací protilátkou BR55-2 č. E4, byly použity imunitně purifíkované opičí Ig (Ab3). Pro tento experiment byla Ab3 frakce imunitně purifíkována ze séra opic druhu Rhesus odebraného 9 týdnů po počáteční imunizaci protilátkou anti-id BR55-2 č. E4. Tato Ab3 frakce byla srovnána s protilátkou BR55-2/myší IgG3 (Abl) vADCC experimentu (ADCC-antibody dependent cellular cytotoxicity-protilátkami zprostředkovaná buněčná cytotoxicita), při které, byly použity lidské monocyty z periferní krve (PBMC- peripheral blood mononuclear cells) jako efektorové buňky (výsledky jsou zobrazeny na obrázku 26, experimentální detaily viz příklad 14). Imunitně purifíkovaná Ab3 frakce ve vyšších koncentracích způsobuje destrukci nádorových buněk pomocí aktivace lidských efektorových buněk, a to způsobem srovnatelným smyší Abl. Těmito výsledky je dokázána indukce selektivní cytotoxicity namířené proti nádorovým buňkám pomocí vakcinace protilátkou anti-id BR55-2 č. E4. Vyšší koncentrace Ab3 je zapotřebí pouze proto, že jenom určitá část imunitně purifíkované Ig frakce je namířená proti vazebnému místu protilátky anti-id BR55-2 č. E4 a pouze tato část je zodpovědná za vazbu nádorových buněk a zprostředkovává ADCC.
Jak bylo zmíněno již v úvodu, je známé, že sacharidový antigen Lewis Y je exprimován také na lidských leukocytech infikovaných virem HTV. Pro určení vazebné afinity sérových Ig opic druhu Rhesus imunizovaných protilátkou anti-id BR55-2 č. E4 nebo nespecifickou myší protilátkou IgGl k buňkám infikovaným virem HIV, bylo použito sérum získané před a 9 týdnů po počáteční imunizaci. Tato séra byla testována komerčně dostupným kitem, který byl původně určen pro detekci HIV seropozitivity v lidském séru. Tento test je založen na schopnosti lidských sérových Ig vázat se na virem HIV infikované lidské T-lymfocyty buněčné linie PALL. Tato vazba je detekována nepřímou imunofluorescencí za použití konjugátu anti-lidský IgG /FITC (fluorescein-iso-thiokyanát). Díky velké podobnosti lidských imunoglobulinů s Ig opic druhu
-17CZ 286547 B6
Rhesus, může být původní reagens ze zkušebního kitu použito také pro opičí IgG. Jako kontroly bylo použito vazby na neinfikované PALL buňky (experimentální detaily viz příklad 15).
Při použití normálního séra opic druhu Rhesus je imunofluorescenční pozadí jak virem HTV infikovaných, tak i neinfikovaných PALL buněk, o něco vyšší než imunofluorescenční pozadí detekované u normálního lidského séra. Nicméně na PALL buňky infikované virem HTV se výrazným způsobem váží pouze sérové Ig opic Rhesus, které byly imunizované protilátkou antiid BR55-2 č. E4, zatímco na neinfikované PALL buňky nebyla detekována téměř žádná vazba. Reaktivita sérových Ig od opic druhu Rhesus imunizovaných nespecifickou myší protilátkou IgGl s PALL buňkami infikovanými virem HTV je zřetelně méně výrazná a blíže imunofluorescenčními pozadí, které je pozorováno u normálního opičího séra (výsledky jsou shrnuty v tabulce 3).
Ig opic druhu Rhesus imunizovaných protilátkou anti-id BR55-2 č. E4 byly imunitně purifikovány ze shromážděných sér, které byly získány ve 4. a 9. týdnu po druhé upomínací dávce, pomocí afinitní kolony s protilátkou anti-id BR55-2 č. E4 (viz výše). Vazebné vlastnosti těchto imunitně purifikovaných Ig (Ab3) byly srovnány s vlastnostmi protilátky BR55-2/myší IgG3 (Abl) pomocí výše zmíněného komerčně dostupného zkušebního kitu, který je určen pro zjišťování HIV-seropozitivity v lidském séru (experimentální detaily viz příklad 15). Imunitně purifikovaná Ig-frakce (Ab3) selektivně váže PALL buňky infikované virem HIV, zatímco na neinfikované PALL buňky nebyla zjištěna žádná vazba. Podobné vazebné vlastnosti byly shledány i u protilátky BR55-2/myší IgG3 (Ab3). Tyto výsledky jsou shrnuty v tabulce 4.
Kromě svého použití jako unikátní vakcíny pro prevenci a léčbu různých druhů nádorů a nemocí způsobených virem HIV, jsou anti-idiotypové Mabs podle vynálezu, mající vlastnosti vnitřního obrazu a vytvořené proti vazebné oblasti protilátky BR55-2, výkonným nástrojem pro kvantitativní určení monoklonálních protilátek a jejich derivátů nebo fragmentů s vazebnou specifitou BR55-2. Například mohou být použity pro selektivní určení koncentrace všech myších subtypů protilátky BR55-2 v lidském séru. Díky tomu, že rozeznávají trojrozměrný tvar vazebné části protilátky BR55-2, jsou tyto anti-idiotypové Mabs schopny vazby pouze na imunoreaktivní struktury protilátky BR55-2. Tato vlastnost vede k tvorbě detekčních systémů, které jsou lepší než systémy založené na konvenčních reagenciích proti konstantní oblasti. ELISA systém pro kvantitativní stanovení imunoreaktivních protilátek BR55-2/myší IgG3 nebo BR55-2/myší IgG2a je popsán v příkladu 16 a typická kalibrační křivka těchto Mabs v lidském séru je zobrazena na obrázku 27.
Podobný ELISA systém, založený na anti-idiotypových Mabs podle vynálezu, může být použit pro vysoce selektivní kvantitativní stanovení imunoreaktivních chimér typu myš/člověk vycházejících z protilátky BR55-2, v lidském séru. Tyto chiméry sestávají z variabilních domén protilátky BR55-2 a z lidských konstantních oblastí (např. lidská IgGl nebo lidská IgG3 oblast). Díky obrovskému přebytku běžných lidských Ig v lidském séru (>10mg/ml) nemohou být takovéto chimérické protilátky typu myš/člověk detekovány v lidském séru pomocí konvenčních reagencií, které se vážou na lidský Fc-konec, a tudíž na veškeré lidské Ig přítomné v séru. Tento selektivní ELISA systém je popsán v příkladech 17 a 18, typické kalibrační křivky v lidském séru jsou zobrazeny na obrázcích 28 a 29.
Zcela humanizované varianty protilátky BR55-2 byly zkonstruovány přenesením komplementaritu určujících oblastí (CDR) myší rodičovské Mab na lidský úsek základní struktury a konstantní oblasti. Pomocí počítačového modelování bylo vybráno několik bodových mutací v úseku základní struktury lidské protilátky, což vedlo k humanizovaným variantám, které nijak výrazně neztratily vazebnou afinitu na Lewis Y pozitivní nádorové buňky ve srovnání s rodičovskou myší Mab. Tak v těchto humanizovaných variantách zůstala zachována pouze malá část původní myší aminokyselinové sekvence, která zajišťuje vazebné charakteristiky. Je
-18CZ 286547 B6 pozoruhodné, že všechny monoklonální protilátky anti-id BR55-2 popisované v tomto vynálezu se silně vážou také na idiotyp těchto humanizovaných IgGl variant původních rodičovských myších monoklonálních protilátek IgG3. Vazebné chování anti-idiotypových monoklonálních protilátek khumanizovaným variantám Abl je srovnatelné schováním výše zmíněných chimérických monoklonálních protilátek typu myš/člověk. To bylo dokázáno pomocí systému BIAcore™ od firmy Pharmacia, který slouží k analýze biospecifíckých interakcí. Ve většině případů, za vyšších koncentrací, byla mezi protilátkami anti-id BR55-2 a BR55-2/chimerická lidská IgGl nebo BR55-2/humanizovaná IgGl pozorována stechiometrie téměř 1:1. Experimentální detaily jsou popsány v příkladu 19, titrační křivky zobrazují obrázky 30 až 35. Tato zjištění zdůrazňují vazebnou selektivitu anti-idiotypových monoklonálních protilátek k intaktní trojrozměrné struktuře hypervariabilní oblasti všech variant protilátky BR55-2 a dokazují jejich vlastnosti vnitřního obrazu.
Díky své unikátní a selektivní rozpoznávací struktuře mohou být monoklonální protilátky anti-id BR55-2 také použity pro vysoce selektivní kvantitativní stanovení imunoreaktivních humanizovaných protilátek se specifitou BR55-2 v lidském séru navzdory velkému přebytku lidských imunoglobulinů přítomných v séru. Tentýž ELISA systém je také použitelný pro kvantitativní stanovení humanizovaných protilátek se specifitou BR55-2 v opičím séru. Toto je např. důležité pro provádění farmakokinetických a toxikologických zkoušek, kterých je zapotřebí během preklinického vývoje humanizovaných monoklonálních protilátek BR55-2 pro pasivní imunoterapii. Tento ELISA systém je popsán v příkladu 20, typická kalibrační křivka v lidském séru je zobrazena na obrázku 36.
Rozpoznání vazebného místa všech variant protilátek BR55-2 monoklonálními protilátkami anti-id BR55-2 je také demonstrováno kompetitivní inhibici vazby protilátky BR55-2/myší IgG3 na anti-id BR55-2 č. E4, která je způsobená protilátkami BR55-2/chimerická lidská IgGl a BR55-2/chimerická lidská IgG3. Obě chiméry kompetitivně inhibují vazbu stálé koncentrace rodičovské myší Mab na protilátku anti-id BR55-2 č. E4, a to na dávce závislým způsobem. Tato kompetitivní ELISA je popsána v příkladu 21 a výsledky popisuje obrázek 27.
Vazba protilátky BR55-2/myší IgG3 na antigen-pozitivní nádorové buněčné linie je nutná pro následnou destrukci těchto buněk pomocí komplementu. Inhibice nádorové cytotoxicity monoklonálními protilátkami anti-id BR55-2 odráží jejich schopnost blokovat vazbu protilátky Abl na svůj antigen na buněčném povrchu. Silná neutralizace na komplementu závislé cytotoxicity protilátkou anti-id BR55-2 č. E4, je zobrazena na obrázku 38. Při tomto pokusu byly buňky SKBR5 z lidského nádoru prsu atakovány protilátkou BR55-2/myší IgG3 (experimentální detaily viz příklad 22.
Vzhledem k velice specifické schopnosti rozpoznat všechny struktury s intaktním vazebným místem BR55-2 mohou být monoklonální protilátky anti-id BR55-2 použity pro jednostupňovou imunopurifíkační proceduru, sloužící k získání všech variant protilátky BR55-2. Protilátka anti-id BR55-2 č. E4 byla navázána na CH-Sepharosu 4B. Tento imunoafinitní materiál může být např. použit pro přímou dopřednou purifíkaci protilátky BR55-2/chimerický lidský IgGl, která byla kultivována in vitro. Chimérická Mab byla získána s výtěžkem 75 % při čistotě 95 %. Díky své vyšší selektivitě je tento způsob imunopurifikace výhodnější než afmitní purifikace pomocí proteinu A. Experimentální detaily viz příklad 23, SDS-PAGE je zobrazena na obrázku 39. Nebyly zjištěny žádné nečistoty. Stejný způsob může být úspěšně použit, s podobnými výsledky, pro vysoce efektivní jednostupňovou purifíkaci supematantů buněčných kultur, které obsahují humanizované varianty protilátky BR55-2 získané přenosem oblasti CDR.
Imunizace králíků a opic druhu Rhesus myšími monoklonálními anti-idiotypovými protilátkami IgGl proti idiotypu protilátek se specifitou BR55-2 (anti-id BR55-2 č. E4) vede k vysokým titrům protilátek, které se specificky vážou na Lewis Y pozitivní lidské nádorové buňky. Jak bylo demonstrováno v experimentech s opicemi Rhesus, zůstává po opakované upomínací imunizační
-19CZ 286547 B6 dávce antitumorová imunita po dobu několika let. Ig, které vznikly při těchto imunizacích, vykazují v přítomnosti lidských efektorových buněk nádorovou cytotoxicitu v rámci ADCC. Specifita imunizace anti-idiotypovými protilátkami je dokázána současnou imunizací kontrolní skupiny opic druhu Rhesus nespecifickou myší IgGl. Přes výraznou imunitní odpověď na nespecifickou myší protilátku IgGl, nebyla detekována žádná specifická vazba na jakýkoliv druh nádorových buněk.
Těmito výsledky je potvrzena možnost použití monoklonálních protilátek anti-id BR55-2 jako náhražky za nádorově sdružený antigen Lewis Y pro terapeutickou a preventivní aktivní imunizaci za účelem indukce ochranné protinádorové imunity. Dále vede imunizace opic druhu Rhesus monoklonální protilátkou anti-id BR55-2 k tvorbě vysokého titru protilátek, které se selektivně vážou na buňky infikované virem HIV. O těchto buňkách je známo, že exprimují antigen Lewis Y. Oproti tomu imunizace opic Rhesus nespecifickou myší protilátkou IgGl nevede ke tvorbě protilátek se specifickou vazbou na HIV pozitivní nebo negativní buňky. Těmito výsledky je potvrzeno použití monoklonálních protilátek anti-id BR55-2 jako náhražky za sacharidový antigen Lewis Y pro terapeutickou a preventivní vakcinaci člověka, za účelem indukce a ochranné imunity proti viru HIV a nemocem způsobeným infekcí virem HIV.
Kromě použití monoklonálních protilátek anti-id BR55-2 jakožto preventivních a terapeutických vakcín, jsou tyto anti-idiotypové monoklonální protilátky s vlastnostmi vnitřního obrazu použitelné jako reagencie pro vysoce selektivní a kvantitativní stanovení molekul se specifítou BR55-2 včetně chimérických a humanizovaných variant v séru nebo v jiných tělních tekutinách. Tyto anti-id Mabs kovalentně navázané na vhodné matrici mohou být také použity pro vysoce selektivní jednostupňové imunoafitivní purifikace všech molekul se specifítou BR55-2, a to s vysokými výtěžky.
Vynález je dále popsán v následujících příkladech. Nejdříve význam použitých zkratek:
| ADCC: | antibody dependent cellular cytotoxicity -protilátkami zprostředkovaná buněčná cytotoxicita |
| BSA: | bovine sérum albumin - hovězí sérový albumin |
| CDC: | complement dependent cytotoxicity - cytotoxicita zprostředkovaná komplemen- |
| DMEM: | IvIIl Dulbeccovo modifikované Eaglovo médium |
| EDC: | N-ethyl-N-(3-dimethyl-aminopropyl)-karboimid hydrochlorid |
| HEPES: | N-(2-hydroxyethyl)piperazin-N-2-ethano-sulfonová kyselina |
| ELISA: | enzyme linked imunosorbent assay-imunosorbční zkušební metoda používající enzymových konjugátů |
| FCS: | fetal calf sérum - telecí fetální sérum |
| HBS: | HEPES buffered šalině - fyziologický roztok tlumený HEPES |
| Mab: | monoklonální protilátka |
| NHS: | N-hydroxy-sukcinimid |
| PBMC: | peripheral blood mononuclear cells - lidské monocyty z periferní krve |
| PBS: | phosphate buffered šalině - fyziologický roztok tlumený fosfátem |
| RAM-IgGl: | rabbit-anti-mouse IgGl - králičí-anti-myší IgGl |
| RPMI: | Roswell Park Memoriál Institute - aminokyselinové médium |
| SDS: | dodecyl-sulfát sodný |
| KLH: | keyhole limpet hemocyanin - hemocyanin z mořských přílipek Megathura crenulata |
| SPDP: | N-sukcinimidyl-3-(2-pyridyl-dithio-propionát) |
| PAGE: | polyakrylamidová gelová elektroforéza |
| IEF: | isoelektrická fokusace |
| PEG: | polyethylenglykol |
| FITC: | fluorescein isothiokyanát |
-20CZ 286547 B6
| IFA: | immunofluorescence assay |
Materiál popisovaný v příkladech:
Mikrotitrační desky: Immunoplates II (Nunc)
Buněčná linie:
SKBR5: buněčná linie z lidského nádoru prsu
CATO: buněčná linie z lidského nádoru žaludku
SW948: buněčná linie z lidského nádoru tlustého střeva
SW2: buněčná linie z lidského nádoru malých plicních buněk WM9: lidská melanomová buněčná linie
PALL: lidská linie T-lymfocytů
SP2: myší myelomová buněčná linie
| Médium A: | RPMI 1640 + 2 g/1 NaHCO3 100 U/ml penicilinu G 100 pg/ml sulfátu streptomycinu 4mM glutamin 10% FCS (tepelně inaktivovaný, τ-globulinu prostý) |
| Médium B: | RPMI 1640 + 2 g/1 NaHCO3 100 U/ml penicilinu G 100 pg/ml sulfátu streptomycinu 4mM glutamin 5% FCS (tepelně inaktivovaný) |
| Médium C: | DMEM 10% NCTC-135 (syntetické médium, Gibco) 1% MEM (neesenciální aminokyseliny, Gibco) 0,5% pyruvát sodný 0,5% kyselina oxaloctová (Sigma) 20% FCS (tepelně inaktivovaný) 100 U/ml penicilinu G 100 pg/ml sulfátu streptomycinu 4mM glutamin |
| Médium D: | Médium C + 1,36 mg/1 hypoxanthinu 0,39 mg/1 thymidinu |
| Médium E: | Médium D + 0,4 mg/1 aminopterinu |
| Médium F: | Médium C + myší thymocyty (thymocyty jedné myší Balb/c resuspendované v 25 ml média C) |
| Médium G: | DMEM 10% FCS (tepelně inaktivovaný) 100 U/ml penicilinu G 100 pg/ml sulfátu streptomycinu 4mM glutamin |
| Médium H: | lOmM N-(2-hydroxyethyl)piperazin-N-2-ethanosulfonová kyselina 3,4mM ethylen-dinitrilo-tetraoctová kyselina 0,15MNaCl |
-21CZ 286547 B6
| 0,005% P20 (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Švédsko) | |
| PEG: | polyethylen-glykol (mol.hm. 3400) 1 g rozpuštěný v lml DMEM |
| Neúplný PBS: | 138,0mMNaCl l,5mM KOH 2,7mM KC1 6,5mM Na2HPO4 pH 7,2 |
| Potahovací pufr: | 15mMNa2CO3 35mM NaHCOj 3mM NaN3 pH 9,6 |
| Barvicí pufr: | 24,3mM kyselina citrónová 35mMNa2HPO4 pH 5,0 |
| Promývací pufr: | 2% NaCl 0,2% Triton X-100 v neúplném PBS |
| Roztok substrátu: | 40 mg o-fenylendiamin-dihydrochloridu 100 ml barvicího pufru 20 μΐ 30% H2O2 |
| Vazebný pufr: | 0,lMTris/HCl 0,2M NaCl pH 7,5 |
| Eluční pufr: | 0,15M glycin/HCl 0,2MNaCl pH 2,8 |
| Konjugační pufr: | 0,lMNaHCO3 0,5M NaCl pH 8,0 |
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1: Tvorba monoklonálních protilátek BR55-2
Imunizace myší
Myší BALB se imunizují vždy 100 pg dávkou F(ab)2 fragmentu protilátky BR55-2/myší IgG3, který je navázaný pomocí SPDP na KJLH jak bylo popsáno (J. Carlson a kol., Biochem. J. 173, 723, 1978). Imunizace se provádí intraperitoneální injekcí podle následujícího schématu:
-22CZ 286547 B6
Den 0: 100 pg konjugátu (1 mg/ml v neúplném PBS) + 100 μΐ úplného Freundova adjuvans
Den 7-28: 100 pg konjugátu (1 mg/ml v neúplném PBS) + 100 μΙ neúplného Freundova adjuvans
Ve dnech 8, 9, 10 a 11 po počáteční imunizaci se intravenózně podají celkem 4 upomínací dávky (každá se 100 pg konjugátu ve 100 μΐ neúplného PBS). 12. dne se asepticky odeberou sleziny, suspendují se v neúplném PBS a poté 3krát promyjí neúplným PBS.
Hybridizace
Tyto slezinné buňky se přidají k suspenzi buněk SP2/0 v poměru 1:1a centrifugují se při 900 g po dobu 5 minut. Pak se k buněčné peletě po kapkách přidá 1 ml roztoku PEG (37 °C, po dobu 1 minuty) poté se peleta rozpustí v 1 ml neúplného PBS (37 °C) v průběhu další minuty. Za mírného míchání se k suspenzi přidá 10 ml média C a poté se suspenze naředí do celkového objemu 50 ml neúplným pufrem PBS. Suspenze se centrifuguje při 800 g po dobu 5 minut, poté se peleta resuspenduje v médiu B a buňky se přenesou do jamek na mikrotitrační desce (Nunc 96) při koncentraci 2,5 x 105 buněk na jamku. Na deskách se nechají inkubovat přes noc při 37 °C v atmosféře 5% CO2 a poté se přidá 100 μΐ na jamku média E. Po 72 hodinách a poté každé 4 dny se médium vyměňuje za médium D.
Příklad 2: Kvantitativní stanovení myších IgG v supematantech hybridomů
100 μΐ množství králičí-anti-myší IgG (např. reagencie fy Nordic, 1 : 1000 v potahovacím pufru) se přidají do jamek na mikrotitrační desce, poté se desky nechají inkubovat při 37 °C po dobu 60 minut. Pak se desky 6-krát promyjí promývacím pufrem, přidá se 200 μΐ neúplného PBS s 5 % FCS a poté se inkubují po dobu 30 minut při 37 °C. Pak se desky opět promyjí tak, jak bylo popsáno výše. Pak se přidají 100μ1 množství supematantů z hybridomů, které byly získány po 2 týdnech kultivace. Desky se inkubují 60 minut při 37 °C. Nenavázaná protilátka se vymyje jak bylo popsáno výše a poté se přidají 10μ1 množství konjugátu peroxidasa/králičí- anti-myší IgG (např. od fy Dianova, 1 : 1000 v PBS s 2 % FCS). Po půlhodinové inkubaci při 37 °C se desky 4-krát promyjí promývacím pufrem a 2-krát barvicím pufrem. Pak se přidá 100 μΐ roztoku substrátu a barevná reakce se po 5 minutách zastaví přidáním 50 μΐ 4M H2SO4. Fotometrická extinkce se měří při vlnové délce 492 nm (referenční měření 620 nm).
Příklad 3: Specifická vazba IgG z hybridomových supematantů na F(ab)2 fragment protilátky BR55-2 (ELISA)
Hybridomy, produkující dostatečné množství myších IgG (tzn. s 10-krát vyšší absorbancí než médium - blank) se rozklonují na jednotlivé buňky, které dají vzniknout buněčným kulturám. Klonování probíhá v médiu F a po následující 2 týdny se kultury kultivují v médiu C. Supematanty se testují tak, jak bylo popsáno v příkladu 2 za použití 100 μΐ fragmentu F(ab)2 protilátky BR55-2 (10 pg/ml v potahovacím pufru).
Příklad 4: Inhibice vazby protilátky BR55-2/myší IgG2 na buňky SKBR5 z nádoru lidského prsu způsobená IgG z hybridomových supematantů (buněčná ELISA)
Všechny hybridomové supematanty, které jsou pozitivní podle výše popsaných zkoušek, se testují následovně:
-23CZ 286547 B6 mikrotitrační desky se nejdříve potáhnou hydrobromidem poly-L-lysinu (20 - 30kD, 20 pg/ml v neúplném PBS, 100 μΐ na jamku, 30 minut, pokojová teplota), promýjí se 2-krát neúplným PBS (200 μΐ na jamku) a poté se přes noc inkubují při 4 °C s 50 μΐ (na jamku) suspenze buněk SKBR5 v médiu B (4x106 buněk/ml). Po odstranění supematantů se buňky fixují 50 μΐ glutaraldehydu na jamku (0,1% ve fyziologickém roztoku) po dobu 5 minut při pokojové teplotě, pak se supematanty odstraní, buňky se resuspendují v 200 μΐ na jamku neúplného PBS /1% BSA/ 0,1% NaN3 a nechají se 1 hodinu při pokojové teplotě. Pak se supematanty odstraní a desky 2-krát promyjí 200 μΐ na jamku PBS s obsahem 0,05 % TWEENu.
Supematanty hybridomů se naředí tak, aby koncentrace myších IgG byla 1 pg/ml. Nejdříve se inkubují s 10-násobným přebytkem nespecifické myší IgG po dobu 30 minut při 37 °C. Pak se tyto vzorky inkubují s 0,5 pg/ml protilátky BR55-2/myší IgG2a po dobu 30 minut při 37 °C. Poté se 100 μΐ této směsi přidá k buňkám na deskách a inkubuje se po dobu 1 hodiny při 37 °C.
Zpracování směsi: Nenavázaná protilátka se odstraní dvojnásobným promytím 100 μΐ na jamku ledového PBS, který obsahuje 0,05% TWEENu, pak se přidá 100 μΐ konjugátu peroxidasa/králičí-anti-myší IgG2a (např. reagencie firmy Zymed, 1:1000 v neúplném PBS v 2% FCS). Po 45 minutové inkubaci při 37 °C se jamky 3-krát promyjí výše zmíněným roztokem PBS/TWEEN 20 a pak se do každé jamky přidá 100 μΐ substrátového roztoku. Po 5 minutách se barevná reakce zastaví přidáním 50 μΐ 4M H2SO4 na jamku. Vazba protilátek na buňky se stanoví měřením extinkce při vlnové délce 492 nm (referenční měření 620 nm).
Příklad 5: Imunoafinitní purifíkace monoklonálních protilátek anti-id BR55-2
Příprava Sepharosy konjugované s protilátkou BR55-2/myší IgG2a g mrazem vysušené aktivované CH-Sepharosy 4B se suspenduje v lmM HC1 pak se přenese na filtr zkřemitého skla a promývá se 2 1 lmM HC1 po dobu 15 minut. Ligand (120mg protilátky BR55-2/myší IgG2a) rozpuštěný v 50 ml konjugačního pufru se smísí s promytým gelem v uzavřené nádobě, která se otáčením intenzivně míchá po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě. Gel se poté promyje konjugačním pufrem a inkubuje po dobu 1 hodiny s 50 ml 1M ethanolaminu, čímž se zablokují všechny zbývající aktivní skupiny. Afínitní sorbent se poté promyje třemi cykly měnícího se pH. Každý cyklus sestává zpromytí při pH4(0,lM acetát, 0,5M NaCl), po kterém následuje promytí při pH 8 (0,lM Tris, 0,5M NaCl).
Izolace monoklonálních protilátek anti-id BR55-2
Chromatografíe se provádí při 4 °C. Kolona (BIO REX MP s průměrem sloupce 1,5 cm) se naplní Sepharosou s navázanou Mab BR55-2/myší IgG2a (objem 35 ml). Gel se promyje vazebným a elučním pufrem. Poté co se ustaví rovnováha s vazebným pufrem se kolonou nechá protékat médium obsahující protilátku anti-id BR55-2 průtokovou rychlostí 15 ml/min. Po eluci průchozí frakce se vazba protilátky anti-id BR55-2 na kolonu rozvolní elučním pufrem a okamžitě po desorbci se neutralizuje 1M pufrem Tris/HCl pH 7,5.
Koncentrování monoklonálních protilátek anti-id BR55-2
Provede se zkoncentrování eluovaného roztoku protilátek 0,12 mg/ml vmíchané ultrafiltrační cele Amicon pomocí membrány PM10 Diaflo. V roztoku zůstane více než 98 % IgG, konečná koncentrace IgG je 3,7 mg/ml.
-24CZ 286547 B6
Příklad 6: Charakterizace purifikovaných monoklonálních protilátek anti-id BR55-2
Chromatografie na iontoměniči Mono-Q
| Kolona: | Mono-Q HR5/5 (Pharmacia) |
| Pufr A: | 20mM triethanolamin pH 7,7 |
| Pufr B: | 20mM triethanolamin, 1M NaCl, pH 7,7 |
| Rychlost průtoku: | 1 ml/min |
| Detekce: | UV 280 nm |
| Gradient: | lineární, zvýšení o 2 % za minutu |
| Výsledky: | > 95% čistota všech anti-di BR55-2 Mabs |
Vysoce výkonná chromatografie s rozdělením podle velikosti
| Kolona: | Zorbax GF250, 9,4 x 250 mm |
| Pufr: | 0,lM fosfát sodný, 0,2M NaCl, pH 7,0 |
| Rychlost průtoku: | 1 ml/min |
| Detekce: | UV 280 nm |
| Výsledky: | > 95% čistota všech anti-di BR55-2 Mabs |
SDS-PAGE
Experimenty se prováděly jak za redukujících, tak i za neredukujících podmínek, podle Laemmliho metody v 10% akrylamidovém gelu. Nebyly zjištěny žádné nečistoty (výsledky jsou zobrazeny na obrázku 1).
Isoelektrická fokusace
Analýza byla provedena s použitím systému Phast (Pharmacia) v pH gradientu od 3 do 9 (Phast gel IEF 3 až 9). Pak bylo provedeno barveni stříbrem (výsledky jsou zobrazeny na obrázku 2).
Příklad 7: Vazba protilátky BR55-2/myší IgG3 na buněčnou linii SKBR5 (buněčná ELISA) inhibice purifikovanými anti-idiotypovými protilátkami
Mikrotitrační desky se potáhnou tak, jak bylo popsáno v příkladu 4. Příslušná monoklonální protilátka anti-id BR55-2 se rozpustí v neúplném PBS obsahujícím 2 % FCS (10 až 0,5 pg/ml). Ke každému z těchto zředění se přidá 1 pg/ml protilátky BR55-2/myší IgG3. 100 μΐ této směsi se poté přidá k buňkám, a poté se desky inkubují po dobu 1 hodiny při 37 °C. Směs se zpracuje tak, jak je popsáno v příkladu 4. Rozsah vazby protilátky BR55-2/myší IgG3 buňky se stanoví měřením extinkce při vlnové délce 492 nm (referenční měření 620 nm).
Příklad 8: Imunizace králíků a opic druhu Rhesus protilátkami anti-id BR55-2 č. E4
Imunizace králíků protilátkou anti-id BR55-2 č. E4
Tři samičky činčilího králíka se imunizují intradermální aplikací 300 μg protilátky anti-id BR55-2 č. E4 adsorbované na hydroxidu hlinitém (1 mg protilátky se 3,3 mg A1(OH)3 v 1 ml neúplného PBS) ve dnech 1,8, 15 a 36. Tři králíci se imunizují stejným množstvím nespecifické myší protilátky IgGl za stejných podmínek a slouží tak jako negativní kontrola. Séra se odeberou před imunizací a v 9. týdnu po první imunizaci.
-25CZ 286547 B6
Imunizace opic druhu Rhesus protilátkou anti-id BR55-2 č. E4
Tři opice druhu Rhesus se imunizují subkutánní (s.c.) aplikací protilátky (0,1 mg protilátky antiid BR55-2 č. E4 na 1 kg živé váhy) adsorbované na hydroxid hlinitý (1 mg protilátky s 3,3 mg A1(OH)3 na 1 ml neúplného PBS) ve dnech 1, 8, 15 a 36. Za stejných podmínek se dvě opice imunizují stejným množstvím nespecifické myší protilátky IgGl jako negativní kontrola. Séra se odeberou před imunizací a v 4. a 9. týdnu po první imunizaci. Dva roky po počáteční imunizaci dostaly tytéž opice první s.c. upomínací dávku s protilátkou anti-id BR55-2 č. E4 nebo s nespecifickou myší IgGl (stejné množství a složení jako výše). Séra byla odebrána 1. a 4. týden po první upomínací imunizaci.
Tři roky po počátečním imunizačním cyklu (tzn. 1 rok po první upomínací dávce) obdržely tytéž opice druhou s.c. upomínací látku s protilátkou anti-id BR55-2 č. E4 nebo s nespecifickou myší IgGl (stejná množství a složení jako výše). Sérum bylo odebráno před, jakož i 1., 4. a 9. týden po této druhé upomínací dávce.
Příklad 9: Vazba králičích sérových Ig na buněčné linie SKBR5 nebo WM9 (buněčná ELISA)
Nejprve se mikrotitrační desky potáhnou tak, jak bylo popsáno v příkladu 4. Potom se přidají k buňkám 100μ1 množství králičího séra ve vhodném zředění a desky se inkubují 1 hodinu při 37 °C. Vazba protilátky na buňky se stanoví měřením extinkce při vlnové délce 492 nm (referenční měření 260 nm).
Příklad 10: Vazba sérových Ig opic druhu Rhesus nebo imunitně purifikovaných Ig (Ab3) na lidské nádorové buněčné linie SKBR5, CATO, SW948, SW2 a SW9 (buněčná ELISA)
Nejprve se mikrotitrační desky potáhnou tak, jak bylo popsáno v příkladu 4. Pak se k buňkám na deskách přidá 100 μΐ séra opic druhu Rhesus nebo imunitně purifikovaný Ig opic druhu Rhesus (viz též příklad 12) a protilátka BR55-2/humanizovaná IgGl jako kontrola, vše ve vhodných ředěních. Desky se inkubují 1 hodinu při 37 °C. Směs se zpracuje tak, jak bylo popsáno v příkladu 4. Vazba protilátky na buňky se stanoví měřením extinkce při vlnové délce 492 nm (referenční měření 620 nm).
Příklad 11: Vazba sérových Ig opic druhu Rhesus nebo imunitně purifikovaných Ig (Ab3) na přípravky z buněčných membrán nádorových buněk SKBR5 nebo WM9 (ELISA)
Nejdříve se připraví, způsobem popsaným v práci D. Thom a kol., Biochem. J. 168, 187- 194 (1977), membrány z Lewis Y pozitivních buněk z nádoru lidského prsu a z Lewis Y negativních melanomových buněk WM9. Do jamek na mikrotitračních deskách se přidá 100 μΐ příslušného membránového přípravku (10pg/ml, ředěno v potahovacím pufru), poté se desky přes noc inkubují při 4 °C. Pak se desky promyjí 4-krát promývacím pufrem, přidá se 200 μΐ neúplného PBS s 5 % FCS a inkubují se 30 minut při 37 °C. Potom se desky promyjí, tak jak bylo popsáno výše. Poté se přidá 100 μΐ séra opic druhu Rhesus nebo imunitně purifikovaných Ig opic druhu Rhesus (viz také příklad 2) ve vhodných zředěních v neúplném pufru PBS se 2 % FCS a desky se inkubují 60 minut při 37 °C. Nenavázaná protilátka se vymyje tak, jak bylo popsáno výše. Poté se přidá 100 μΐ konjugátu peroxidasa/kozí-anti-lidská IgG (např. od fy Chemicon & Co, 1 : 1000 v PBS s 2% FCS). Po inkubaci 30 minut při 37 °C se desky 2-krát promyjí promývacím pufrem a 2-krát barvicím pufrem.
-26CZ 286547 B6
Pak se přidá 100 μΐ substrátového roztoku a po 5 minutách se barevná reakce zastaví přidáním 50 μΐ 4M H2SO4. Absorbance se změří při vlnové délce 492 nm (referenční měření při 620 nm).
Příklad 12: Imunoafinitní purifikace sérových Ig (Ab3) opic druhu Rhesus imunizovaných protilátkou anti-id BR55-2 č. E4, pomocí afinitního nosiče Sepharosa/anti-id protilátka BR55-2 č.E4
Příprava afinitního nosiče Sepharosa-protilátka anti-id BR55-2 č. E4 g mrazem vysušené aktivované CH-Sepharosy 4B se suspenduje v lmM HC1, přenese se na filtr z křemitého skla a promývá 2 1 lmM HC1 po dobu 15 minut. 95 mg ligandu (protilátka antiid BR55-2 č. E4) rozpuštěného v 50 ml konjugačního pufru se smísí s promytým gelem v uzavřené nádobě, která se důkladně otáčením promíchává po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě. Gel se poté promyje konjugačním pufrem a inkubuje po dobu 1 hodiny s 50 ml 1M ethanolaminu tak, aby se zablokovaly veškeré zbývající aktivní skupiny. Afinitní sorbent se poté promyje třemi cykly měnícího se pH. Každý cyklus se stává zpromytí při pH4 (0,lM acetát, 0,5M NaCl), po kterém následuje promytí při pH 8 (0,lM Tris, 0,5M NaCl).
Izolace sérových Ig opic druhu Rhesus (Ab3) imunizovaných protilátkou anti-id BR55-2 č. E4
Chromatografie se provádí při 4 °C. Kolona Pharmacia HR5/2 (vnitřní rozměry 5 x 25 mm) se naplní Sepharosou s navázanou protilátkou anti-id BR55-2 č. E4 (objem 0,5 ml). Gel se promyje vazebným a elučním pufrem. Počátečním materiálem jsou 2 ml séra opic druhu Rhesus imunizovaných protilátkou anti-id BR55-2 č. E4, které byly získány 9 týdnů po počáteční imunizaci. Pro další série experimentů byly použity 2 ml spojených sér opic druhu Rhesus imunizovaných protilátkou anti-id BR55-2 č. E4, získané 4. a 9. týdne po druhé upomínací dávce. Příslušné sérum se naředí 1 : 2 ve vazebném pufru a nanese na kolonu. Po eluci průchozí frakce se navázaný opičí imunoglobulin desorbuje elučním pufrem a neutralizuje okamžitě po desorbci pufrem 1M Tris/HCl pH 7,5.
Příklad 13: Vazba sérových Ig nebo imunitně purifikovaných Ig opic druhu Rhesus, které byly imunizovány protilátkou anti-id BR55-2 č. E4 nebo nespecifickou myší IgGl, na protilátku anti-id BR55-2 ě. E4 (ELISA)
100μ1 množství roztoku protilátky anti-id BR55-2 č. E4 (10 pg/ml, ředěno v potahovacím pufru) se nanesou do jamek na mikrotitračních deskách a inkubují se 60 minut při 37 °C. Desky se 6krát promyjí promývacím pufrem a pak se přidá 200 μΐ neúplného PBS s 5% FCS a inkubuje se 30 minut při 37 °C. Pak se desky opět stejným způsobem promyjí. Opičí sérum nebo imunitně purifikované opičí Ig se naředí v neúplném PBS s 2 % FCS. 100 μΐ objemy těchto vzorků se přidají do jamek na mikrotitračních deskách a inkubují se 60 minut při 37 °C. Nenavázaná protilátka se vymyje tak, jak bylo popsáno výše a pak se přidá 100 μΐ konjugátu peroxidasa/kozíanti-lidský Ig (např. reagencie od fy Chemicon & Co, 1:1000 v PBS s 2 % FCS). Po 30 minutách inkubace při 37 °C se desky promyjí 4-krát promývacím pufrem a 2-krát barvicím pufrem. Pak se přidá 100 μΐ roztoku substrátu a po 5 minutách se barevná reakce zastaví přidáním 50 μΐ 4M H2SO4. Absorbance se změří při vlnové délce 492 nm (referenční měření při 620 nm).
-27CZ 286547 B6
Příklad 14: Protilátkami zprostředkovaná buněčná cytotoxicita (ADCC) buněk SKBR5 zprostředkovaná imunitně purifíkovanými opičími Ig (Ab3) nebo protilátkou BR55-2/myší IgG3 za použití lidských monocytů PBMC
Den před vlastním testem se buňky SKBR5 přenesou do čerstvého média A a inkubují se při 37 °C v atmosféře 5% CO2, v lahvi pro pěstování buněčných kultur.
Označování cílových buněk chromém 51Cr
Buňky se odeberou z kultivační nádoby a inkubují se při koncentraci 5 x 106 v 800 μΐ média A při 37 °C v 5% CO2 po dobu 1 hodiny spolu s 100 μθί Na2 51CrO4. Poté se buňky promyjí médiem A, aby se odstranil přebytek 51Cr, resuspendují se v čerstvém médiu, a naředí se na koncentraci 2,5 x 105 buněk na 1 ml.
Izolace PBMC ml heparizované čerstvé lidské krve se smísí s 60 ml úplného PBS s obsahem 0,1 glukózy. 15 ml množství tohoto roztoku se navrství na 15 ml roztoku Ficoll-Paque, kyvety se centrifugují při 400 g po dobu 30 až 60 minut. Plazmatické supematanty se odstraní, vrstvy obsahující PBMC se shromáždí a rozpustí v 50 ml úplného PBS s obsahem 0,1 % glukózy. Poté se centrifugují při 80 g (10 minut), peleta se resuspenduje v 25 až 30 ml úplného PBS s 0,1 % glukózy, znovu se centrifugují (80 g, 10 minut) peleta se odebere, suspenduje v médiu A, buňky se spočítají a suspenze se naředí médiem A na koncentraci přibližně 2 x 106 až 9x 106 buněk/ml. 100μ1 množství se napipetují do každé jamky na mikrotitrační desce a pak se efektorové buňky inkubují přes noc při 37 °C v 5% CO2.
Buněčná cytotoxicita závislá na protilátkách (ADCC)
100 μΐ cílových buněk označených 51Cr se přidá k preinkubovaným buňkám ve zvoleném poměru efektorových buněk k cílovým. Pak se přidá 50 μΐ imunitně purifikovaného opičího Ig (Ab3) nebo protilátky BR55-2/myší IgG3, naředěné do zvolené koncentrace neúplným PBS a poté se desky inkubují přes noc (přibližně 18 hodin) při 37 °C v 5% CO2. Supematanty se poté odeberou pomocí Skatron- Harvesting Press a jejich záření se změří na τ-počítači. Tyto výsledky jsou hodnoty platné pro experimentální uvolnění. Celkové uvolnění 5lCr se stanoví jak je popsáno výše s tím, že buňky PBMC se nahradí 100 μΐ 2% SDS, 50nM Na2CO3 a lOmM EDTA, a roztok protilátek se nahradí 50 μΐ neúplného PBS. Spontánní uvolnění 51Cr se získá tak, že se nahradí buňky PBMC 100 μΐ média A a roztok protilátek 50 μΐ neúplného PBMC.
Po změření aktivity se výsledky spočítají následovně experim. uvolnění - spontánní uvolnění % lysovaných buněk =------------------------------------x 100 celkové uvolnění - spontánní uvolnění
Příklad 15: Vazba séra opic druhu Rhesus, imunitně purifikovaných Ig opic druhu Rhesus nebo protilátky BR55-2/myší IgG3 na PALL buňky infikované a neinfikované virem HTV (nepřímá imunofluorescence, IFA-anti-HIVl-Kit, Waldheim)
V komerčně dostupné imunoscenční zkušební soupravě (Waldheim, zakoupené pro stanovení HIV seropozitivity) jsou PALL buňky (lidská buněčná linie T-lymfocytů) infikované a neinfikované virem HIV již fixovány na mikroskopických sklíčkách. Experimentální procedura je v principu založena na návodu dodavatele. Po inkubaci s 1% BSA po dobu 30 minut
-28CZ 286547 B6 při 37 °C se mikroskopická sklíčka inkubují se sérem opic druhu Rhesus (koncentrováno a 1 : 10 naředěno v neúplném PBS), nebo s imunitně purifikovanými opičími Ig (Ab3) ředěnými v normálním lidském séru, nebo s protilátkou BR55-2/myší IgG3. Inkubace trvá 1 hodinu při teplotě 37 °C. HIV pozitivní lidské sérum (dodáno jako součást zkušební soupravy) slouží jako pozitivní kontrola, zatímco normální lidské sérum jako kontrola negativní. Nenavázané determinanty testovaných vzorků se vymyjí trojnásobným promytím neúplným PBS. Poté se přidá konjugát anti-lidský-IgG-FITC (součást zkušební soupravy) v ředění 1 : 20 v neúplném PBS se 2 % FCS, nebo anti-myší-IgG-FITC (pro detekci myších Mab). Poté se sklíčka inkubují 30 minut při 37 °C, třikrát promyjí neúplným PBS, zafixují, načež se ve fluorescenčním mikroskopu sleduje a vyhodnocuje imunofluorescence preparátů (0-žádná fluorescence, 5maximální fluorescence).
Příklad 16: Systém ELISA pro stanovení protilátek BR55-2/myší IgG3 nebo BR55-2/myší IgG2a v lidském séru pomocí anti-id BR55-2 č. E4
100μ1 množství roztoku protilátky anti-id BR55-2 č. E4 (10 pg/ml, ředěno v potahovacím pufru) se nanesou do jamek na mikrotitračních deskách a inkubují se 60 minut při 37 °C. Desky se 6krát promyjí promývacím pufrem a pak se přidá 200 μΐ neúplného PBS s 5% FCS a inkubuje se 30 minut při 37 °C. Pak se desky opět stejným způsobem promyjí. Lidská séra, obsahující BR552/myší IgG3 nebo BR55-2/myší IgG2a se testují ve vhodných zředěních neúplným PBS se 2 % FCS. 100μ1 objemy těchto vzorků se přidají do jamek na mikrotitračních deskách a inkubují se 60 minut při 37 °C. Jako standardu se používá BR55-2/myší IgG3 nebo
BR55-2/myší IgG2 ředěné v normálním lidském séru na koncentraci 10pg/ml. S vhodnými ředěními standardu v neúplném PBS se 2 % FCS se postupuje jako se vzorky. Nenavázaná protilátka se vymyje tak, jak bylo popsáno výše a pak se přidá 100 μΐ konjugátu (králičí—antimyší IgG3/peroxidasa nebo králičí-anti-myší IgG2a/peroxidasa, např. od fy Chemicon & Co, 1 : 1000 v PBS se 2% FCS). Po 30 minutách inkubace při 37 °C se desky promyjí 4-krát promývacím pufrem a 2-krát barvicím pufrem. Pak se přidá 100 μΐ roztoku substrátu a po 5 minutách se barevná reakce zastaví přidáním 50 μΐ 4M H2SO4. Absorbance se změří při vlnové délce 492 nm (referenční měření při 620 nm). Hodnoty absorbance vzorků séra můžeme pomocí kalibrační křivky vyjádřit v pg/ml.
Příklad 17: Systém ELISA pro stanovení protilátky BR55-2/lidská chimérická IgGl v lidském séru pomocí protilátky anti-id BR55-2 č. E4
Lidská séra, obsahující protilátku BR55-2/lidská chimérická IgGl se testují stejným způsobem, jako v příkladu 16, za použití konjugátu kozí-anti-lidský IgG/peroxidasa (např. od fy Chemicon & Co., 1 : 1000 v PBS se 2 % FCS).
Příklad 18: Systém ELISA pro stanovení protilátky BR55-2/lidská chimérická IgG3 v lidském séru pomocí protilátky anti-id BR55-2 č. E4
Lidská séra, obsahující protilátku BR55-2/lidská chimérická IgGl se testují stejným způsobem, jako v příkladu 17.
-29CZ 286547 B6
Příklad 19: Biospecifická interakční analýza protilátek BR55-2/lidská chimérická IgGl a BR552/humanizovaná IgGl s monoklonálními anti-id protilátkami BR55-2 v reálném čase
Experimenty se prováděly s použitím systému BIAcore™ od firmy Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Švédsko. Vazba protilátek BR55-2/lidská chimérická IgGl nebo BR55-2/humanizovaná IgGl, zachycených na imobilizované protilátce RAM-IgGl (např. od firmy Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Švédsko), se stanovovala pomocí biospecifické interakční analýzy v reálném čase.
Průtoková rychlost systému se nastaví na 5 μΐ/min. Sensorový čip se aktivuje směsí 0,201 mg NHS a 1,313 mg EDC, které jsou rozpuštěny v 35 μΐ destilované vody. Protilátka RAM-IgGl, rozpuštěná v 35 μΐ lOmM v pufru octanu sodného pH 5,0 tak, aby její koncentrace byla 30 pg/ml, se poté nechá reagovat s aktivovaným povrchem sensoru. Zbývající volná aktivní místa se blokují 35 μΐ 1M roztoku ethanolaminhydrochloridu/NaOH, pH 8,5.
Analýza se provádí ve třech krocích:
1) Příslušná anti-id BR55-2 Mab (E4, Cil, B3, B9, G6, G9) se naředí v médiu H na výslednou koncentraci 10 až 17 μg/ml. Při každé analýze se anti-idiotypová protilátka naváže na RAM-IgGl tím, že se 30 μΐ jejího roztoku nechá protéci přes povrch sensoru. Poté se zaznamenají a uloží do paměti „Jednotky odpovědi“, které jsou úměrné množství navázané antiid protilátky.
2) 20 μΐ různých ředění (1 až 100 pg/ml) chimérické IgGl typu myš/člověk a humanizované IgGl v médiu H se injikuje do systému a nechá se navázat na již zachycenou anti-idiotypovou protilátku. Poté se zaznamenají a uloží do paměti „Jednotky odpovědi“, které jsou úměrné množství navázané monoklonální protilátky.
3) Povrch sensoru se poté regeneruje pro další použití po sobě jdoucími dávkami 5 μΐ 1M mravenčí kyseliny a 5 μΐ 8M močoviny.
Míra vazby se stanoví tak, že se spočítá poměr mezi maximální hodnotou „Jednotek odpovědi“ získanou druhou protilátkou (BR55-2/chimerická lidská IgGl nebo BR55-2/humanizovaná IgGl) a hodnoty maximální odpovědi, která byla dosažena první protilátkou (příslušná antiidiotypová Mab).
Příklad 20: Systém ELISA pro stanovení protilátky BR55-2/lidská chimérická IgGl v lidském séru pomocí protilátky anti-id BR55-2 č. E4
Lidská séra, obsahující protilátku BR55-2/lidská chimérická IgGl se testují stejným způsobem, jako v příkladu 17.
Příklad 21: Kompetitivní inhibice vazby protilátky BR55-2/myší IgG3 na anti-id BR55-2 č. E4, způsobená protilátkou BR55-2/lidská chimérická IgGl nebo BR55-2/lidská chimérická IgG3
100μ1 množství roztoku protilátky anti-id BR55-2 č. E4 (10 pg/ml, ředěno v potahovacím pufru) se nanesou do jamek na mikrotitračních deskách a inkubují se 60 minut při 37 °C. Desky se 6krát promyjí promývacím pufrem a pak se přidá 200 μΐ neúplného PBS s 5% FCS a inkubuje se 30 minut při 37 °C.
-30CZ 286547 B6
Pak se desky opět stejným způsobem promyjí. Lidská chimérická IgGl protilátka nebo lidská chimérická IgG3 se naředí v neúplném PBS s 2 % FCS (0,5 pg/ml až 3 ng/ml). Ke každému ředění se přidá 0,05 pg/ml protilátky BR55-2/myší IgG3. 100 μΐ objemy této směsi se přidají do jamek na mikrotitračních deskách a inkubují se 60 minut při 37 °C. Nenavázaná protilátka se 5 vymyje tak, jak bylo popsáno výše a pak se přidá 100 μΐ konjugátu peroxidasa/kozí-anti-lidský
Ig (např. reagencie od fy Chemicon & Co., 1 : 1000 v PBS s 2 % FCS).
Po 30 minutách inkubace při 37 °C se desky promyjí 4-krát promývacím pufrem a 2-krát barvicím pufrem. Pak se přidá 100 μΐ roztoku substrátu a po 5 minutách se barevná reakce ío zastaví přidáním 50 μΐ 4M H2SO4. Absorbance se změří při vlnové délce 492 nm (referenční měření při 620 nm).
Příklad 22: Buněčná cytotoxicita způsobená komplementem (CDC) namířená proti buňkám 15 SKBR5 a zprostředkovaná protilátkou BR55-2/myší IgG3 -Inhibice anti-id protilátkou BR55-2 č. E4
Den před vlastním testem se buňky SKBR5 přenesou do čerstvého média A a inkubují se při 37 °C v atmosféře 5% CO2, v lahvi pro pěstování buněčných kultur.
Označování cílových buněk chromém 51Cr
Buňky se odeberou z kultivační nádoby a inkubují se při koncentraci 5 x 106 buněk v 800 μΙ média A při 37 °C v 5% CO2 po dobu 1 hodiny, spolu s 100 pCi Na2 31CrO4. Poté se buňky 25 promyjí médiem A, aby se odstranil přebytek 51Cr, resuspendují se v čerstvém médiu, a naředí se na koncentraci 2,5 x 105 buněk/ml.
Buněčná cytotoxicita závislá na komplementu (CDC)
1 00 μΐ tohoto roztoku cílových buněk se napipetuje do jamek na mikrotitračních deskách. Pak se přidají 50μ1 množství anti-id BR55-2 č. E4, naředěné do potřebné koncentrace v neúplném PBS. Pak se přidají 100μ1 objemy lidského séra s obsahem 2 pg/ml BR55-2/IgG3 do každé jamky a desky se inkubují přes noc při 37 °C v 5% CO2. Supematanty se poté odeberou pomocí Skatron-Harvesting Press a jejich záření se změří na τ-počítači.
Tyto výsledky jsou hodnoty platné pro experimentální uvolnění. Aby se určila hodnota celkového uvolnění 51Cr, buňky se zpracují tak, jak je popsáno výše stím, že se lidské sérum nahradí roztokem 2% SDS, 50mM Na2CC>3 a lOmM EDTA, a roztok protilátky anti-id BR55-2 č. E4 se nahradí 50 μΐ neúplného PBS. Hodnota spontánního uvolnění 51Cr se získá tak, že se 40 lidské sérum nahradí médiem A a roztok anti-id protilátky BR55-2 č. E4 se nahradí 50 μΐ neúplného PBMC.
Po změření aktivity se výsledky spočítají následovně experim. uvolnění - spontánní uvolnění % lysovaných buněk =-----------------------------------x 100 celkové uvolnění - spontánní uvolnění
-31CZ 286547 B6
Příklad 23: Imunoafinitní purifíkace protilátky BR55-2/lidská chimérická IgGl pomocí Sepharosy s navázanou BR55-2 č. E4
Příprava Sepharosy konjugované s protilátkou BR55-2/myší IgG2a 9 g mrazem vysušené aktivované CH-Sepharosy 4B se suspenduje v lmM HC1 pak se přenese na filtr z křemitého skla a promývá se 2 1 lmM HC1 po dobu 15 minut. Ligand (95 mg anti-id protilátky BR55-2 č. E4) rozpuštěný v 50 ml konjugačního pufru se smísí s promytým gelem v uzavřené nádobě, která se otáčením intenzivně míchá po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě. Gel se poté promyje konjugačním pufrem a inkubuje po dobu 1 hodiny s 50 ml 1M ethanolaminu, čímž se zablokují všechny zbývající aktivní skupiny. Afinitní sorbent se poté promyje třemi cykly měnícího se pH. Každý cyklus sestává z promytí při pH 4 (0,lM acetát, 0,5M NaCl), po kterém následuje promytí při pH 8 (0,lM Tris, 0,5M NaCl).
Izolace protilátek BR55-2/lidská chimérická IgGl
Chromatografie se provádí při 4 °C. Kolona (BIOREXMP s průměrem sloupce 1,5 cm) se naplní Sepharosou s navázanou anti-id BR55-2 č. E4 (objem 35 ml). Gel se promyje vazebným a elučním pufrem. Počátečním materiálem je 100 1 média s obsahem protilátky BR55-2/lidská chimérická IgG. Nejdříve se vzorek zakoncentruje v poměru 1 : 5 pomocí systému Amicon DC2, který je vybaven náplní P10 z dutých vláken a poté se tento koncentrát nanese na kolonu. Po eluci průchozí frakce se vazba protilátky anti-id BR55-2 na kolonu rozvolní elučním pufrem a okamžité po desorbci se neutralizuje 1M pufrem Tris/HCl pH 7,5.
Koncentrování protilátky BR5 5-2/1 idská chimérická IgG
Provede se zkoncentrování eluovaného roztoku protilátek v míchané ultrafiltrační cele Amicon pomocí membrány PM 10 Diaflo. V roztoku zůstane více než 98 % IgG, konečná koncentrace IgG je 3,36 mg/ml.
Charakterizace purifikované protilátky BR55-2/lidská chimérická IgGl
Chromatografie na iontoměniči Mono-Q
| Kolona: | Mono-Q HR5/5 (Pharmacia) |
| Pufr A: | 20mM triethanolamin, pH 7,7 |
| Pufr B: | 20mM triethanolamin, 1M NaCl, pH 7,7 |
| Rychlost průtoku: | 1 ml/min |
| Detekce: | UV 280 nm |
| Gradient: | lineární, zvýšení o 2 % za minutu |
| Výsledky: | > 95% čistota |
Vysoce výkonná chromatografie s rozdělením podle velikosti
| Kolona: | Zorbax GF250, 9.4 x 250 mm |
| Pufr: | 0,lM fosfát sodný, 0,2M NaCl, pH 7,0 |
| Rychlost průtoku: | 1 ml/min |
| Detekce: | UV 280 nm |
| Výsledky: | > 95% čistota všech |
SDS-PAGE
Experimenty se prováděly za redukujících podmínek, podle BR55-2 Laemmliho metody v 10% akrylamidovém gelu, (výsledky jsou zobrazeny na obrázku 10).
-32CZ 286547 B6
Počáteční materiál
Myší monoklonální protilátky BR55-2 je možno získat například z hybridomů BR55.2 (BR552/IgG3) a, popřípadě z BR55.2S2a (BR-55-2/OgG2a).
Tyto hybridomy byly původně deponovány 17. února 1987 respektive 10. března 1987 podle pravidel Budapešťské smlouvy v Americké sbírce typových kultur (ATCC - Američan Type Culture Collection), Rockville, MD 20852, USA, a to s deposičními čísly ATCC HB9324 respektive ATCC HB 9347.
Tabulka 1
Imunizace králíků a opic druhu Rhesus anti-id protilátkou BR55-2 č. E4 nebo nespecifickou myší IgGl
Relativní vzrůst titru protilátek v séru odebraném 9. týden po imunizaci ve srovnání se sérem odebraným před imunizací a ředěným 1:4 (buněčná ELISA)
| Králík | Opice | |||
| anti-id BR55-2 | myší IgGl | anti-id BR55-2 | myší IgGl | |
| SKBR5 (Y+) | 1000 | 16 | 1000 | 8 |
| WM9 (Y-) | 3 | n.t. | 25 | n.t. |
Tabulka 2
Upomínací imunizační dávka opicím druhu Rhesus. Opice byly imunizovány buď anti-id protilátkou BR55-2 č. E4, nebo nespecifickou myší IgGl
Vazba opičích sérových Ig na membránové přípravky buněk SKBR5 (ELISA)
Relativní nárůst titru protilátek ve srovnání s 1:4 ředěným předimunizačním sérem
| 9 týdnů po 1. imunizaci | 2 roky po 1. imunizaci | 1 týden po 1. upomínací dávce | 4. týdny po 1. upomínací dávce | |
| anti-id BR55-2 | 40 | 1 | 80 | 50 |
| mlgGl | 1 | 2 | n.t. | 2 |
-33CZ 286547 B6
Tabulka 3
Vazba sérových Ig opic druhu Rhesus na virem HIV infikované/neinfikované buňky z linie PALL (nepřímá imunofluorescence, IFA-Anti-HIVl-Kit Waldheim)
| PALL: | Imunizace opic druhu Rhesus protilátkou anti-id BR55-2 č.E4 nespecifickou myší IgGl | Lidské sérum (kontrola, obsah kitu) | |||
| HIV+ HIV- HIV+ | HIV- | PALL: | HTV+ HIV- | ||
| presérum | HTV-neg. | lidské sérum | |||
| konc. | 1 1 | 1 | 1 | 0 0 | |
| 1:10 | 1 1 | 1 | 1 | ||
| sérum 9 týdnů po 1 | . imunizaci | HTV-pos. | lidské sérum | ||
| konc. | 3 1 | 1-2 | 1 | 5 0 | |
| 1:10 | 3 1 | 1-2 | 1 |
0-5 = intenzita fluorescence (anti-lidský IgG-FITC) 0 = žádná fluorescence = maximální fluorescence
Tabulka 4
Vazba Ig opic druhu Rhesus (AB3) imunitně purifíkovaných na protilátce anti-id BR55-2 č. E4 a protilátky BR55/myší IgG3 (AB1) na virem HIV infikované/neinfikované buňky linie PALL (nepřímá imunofluorescence, IFA-Anti-HTVl-Kit Waldheim)
| AB3 (20 pg/ml) | BR55-2/murine IgG3 (20 pg/ml) HIV+ HIV- | Lidské sérum (kontrola, obsah kitu) PALL: HTV+ HIV- | |
| PALL: HTV+ | HIV- | ||
| 3 | 0 | 2 0 | HlV-neg. lidské sérum 0 0 |
| HIV-pos. lidské sérum 5 1 |
0-5 = intenzita fluorescence (anti-lidský IgG-FITC) 0 = žádná fluorescence = maximální fluorescence
Claims (9)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Myší monoklonální anti-idiotypové protilátky š vlastnostmi vnitřního obrazu (Ab2) proti monoklonálním protilátkám BR55-2 (Abl).
- 2. Anti-idiotypová protilátka podle nároku 1, kterou je protilátka č. E4, inhibující vazbu BR55-2/myší IgG2a na buněčnou linii SKBR5 z více než 95 %.
- 3. Anti-idiotypové protilátky podle nároku 1 pro použití k imunizaci proti rakovině epiteliálního původu a proti rakovině malých plicních buněk.-34CZ 286547 B6
- 4. Způsob přípravy anti-idiotypových protilátek podle nároku 1, vyznačující se tím, že se myši imunizují konjugátem BR55-2/myší IgG3-F(ab')2-KLH, myší slezinné buňky se nechají sfusovat s buňkami myší myelomové linie SP 2/0, vyberou se vzniklé hybridomové buňky, které produkují IgG s inhibiční kapacitou, jíž se míní inhibice vazby protilátky BR552/myší IgG2a na buněčnou linii SKBR5, vyšší než 95 %, načež se po přečištění izolují antiidiotypové protilátky.
- 5. Farmaceutická kompozice pro použití k preventivní nebo/a terapeutické imunizaci proti infekcím virem HIV, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku antiidiotypovou protilátku podle nároku 1 spolu s farmaceuticky přijatelným adjuvantem, nosičem nebo ředidlem.
- 6. Farmaceutická kompozice pro imunizaci proti rakovině epiteliálního původu a proti rakovině malých plicních buněk, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku anti-idiotypovou protilátku podle nároku 1 spolu s farmaceuticky přijatelným adjuvantem, nosičem nebo ředidlem.
- 7. Použití anti-idiotypových protilátek podle nároku 1 ke kvantitativnímu stanovení monoklonálních protilátek, jejich derivátů nebo fragmentů s vazebnou specificitou BR55-2 in vitro.
- 8. Použití anti-idiotypových protilátek podle nároku 1 ke kvantitativnímu stanovení chimérických monoklonálních protilátek typu myš/člověk z protilátky BR55-2 a zcela humanizovaných variant BR55-2 in vitro.
- 9. Použití anti-idiotypových protilátek podle nároku 1 kjednostupňové imuno-purifikaci variant protilátky BR55-2 in vitro.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB929210944A GB9210944D0 (en) | 1992-05-22 | 1992-05-22 | Monoclonal antibodies and their use |
| GB929210930A GB9210930D0 (en) | 1992-05-22 | 1992-05-22 | Monoclonal antibodies and their use |
| GB929210929A GB9210929D0 (en) | 1992-05-22 | 1992-05-22 | Monoclonal antibodies and their use |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ285194A3 CZ285194A3 (en) | 1995-05-17 |
| CZ286547B6 true CZ286547B6 (cs) | 2000-05-17 |
Family
ID=27266199
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19942851A CZ286547B6 (cs) | 1992-05-22 | 1993-05-14 | Monoklonální protilátky a jejich použití |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0644947B1 (cs) |
| JP (3) | JPH07507207A (cs) |
| KR (1) | KR100279317B1 (cs) |
| AT (1) | ATE179214T1 (cs) |
| AU (1) | AU678160B2 (cs) |
| CA (1) | CA2134751C (cs) |
| CZ (1) | CZ286547B6 (cs) |
| DE (1) | DE69324584T2 (cs) |
| DK (1) | DK0644947T3 (cs) |
| ES (1) | ES2133395T3 (cs) |
| FI (1) | FI111518B (cs) |
| GR (1) | GR3030701T3 (cs) |
| HU (1) | HU219055B (cs) |
| NO (1) | NO316120B1 (cs) |
| NZ (1) | NZ252161A (cs) |
| PL (1) | PL175651B1 (cs) |
| RU (1) | RU2208642C2 (cs) |
| SG (1) | SG50721A1 (cs) |
| SK (1) | SK281086B6 (cs) |
| WO (1) | WO1993024647A1 (cs) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AT500650B1 (de) | 2003-04-17 | 2009-11-15 | Altropus Gmbh | Immunogener rekombinanter antikörper |
| JP2007528868A (ja) * | 2003-08-14 | 2007-10-18 | ワイス | 抗ルイスｙ抗イディオタイプ抗体およびその使用 |
| AT504231A1 (de) | 2006-10-03 | 2008-04-15 | Hans Dr Loibner | Prädiktive parameter |
| EP2611834B1 (en) | 2010-09-01 | 2018-03-07 | Biogen MA Inc. | Rapid generation of anti-idiotypic antibodies |
| RU2735653C2 (ru) * | 2016-08-23 | 2020-11-05 | Тран-Сцелл Биологицс Привате Лимитед | Платформа с клетками-предшественниками человека для поиска активных веществ лекарственных препаратов |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE137801T1 (de) * | 1988-07-06 | 1996-05-15 | Verigen Inc A Corp Of Delaware | Gegen hiv 1 gp48 spezifische antikörper |
| DE4006308A1 (de) * | 1990-02-28 | 1991-08-29 | Sandoz Ag | Verwendung des monoklonalen antikoerpers br 55.2 gegen kleinzelliges lungenkarzinom |
| DE4025499A1 (de) * | 1990-08-11 | 1992-02-13 | Sandoz Ag | Verwendung der antikoerper br55-2, deren derivate, konjugate und fragmente zur bekaempfung von hiv-infektionen |
| ES2145004T3 (es) * | 1991-08-21 | 2000-07-01 | Novartis Ag | Derivados de anticuerpos. |
-
1993
- 1993-05-14 RU RU94046321/13A patent/RU2208642C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1993-05-14 CZ CZ19942851A patent/CZ286547B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1993-05-14 WO PCT/EP1993/001215 patent/WO1993024647A1/en active IP Right Grant
- 1993-05-14 KR KR1019940704163A patent/KR100279317B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1993-05-14 ES ES93909997T patent/ES2133395T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1993-05-14 EP EP93909997A patent/EP0644947B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-05-14 AU AU40688/93A patent/AU678160B2/en not_active Ceased
- 1993-05-14 HU HU9403337A patent/HU219055B/hu not_active IP Right Cessation
- 1993-05-14 PL PL93306001A patent/PL175651B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1993-05-14 DE DE69324584T patent/DE69324584T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1993-05-14 AT AT93909997T patent/ATE179214T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-05-14 CA CA002134751A patent/CA2134751C/en not_active Expired - Fee Related
- 1993-05-14 DK DK93909997T patent/DK0644947T3/da active
- 1993-05-14 SK SK1398-94A patent/SK281086B6/sk unknown
- 1993-05-14 SG SG1996009665A patent/SG50721A1/en unknown
- 1993-05-14 JP JP6500128A patent/JPH07507207A/ja active Pending
- 1993-05-14 NZ NZ252161A patent/NZ252161A/en unknown
-
1994
- 1994-11-21 NO NO19944443A patent/NO316120B1/no unknown
- 1994-11-22 FI FI945485A patent/FI111518B/fi not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-09-03 JP JP10249573A patent/JPH11178594A/ja active Pending
-
1999
- 1999-07-07 GR GR990401784T patent/GR3030701T3/el unknown
-
2005
- 2005-11-30 JP JP2005346456A patent/JP2006143738A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH11178594A (ja) | 1999-07-06 |
| FI945485A0 (fi) | 1994-11-22 |
| ES2133395T3 (es) | 1999-09-16 |
| RU2208642C2 (ru) | 2003-07-20 |
| SG50721A1 (en) | 2000-11-21 |
| RU94046321A (ru) | 1997-01-27 |
| AU678160B2 (en) | 1997-05-22 |
| ATE179214T1 (de) | 1999-05-15 |
| KR950701685A (ko) | 1995-04-28 |
| NZ252161A (en) | 1996-10-28 |
| WO1993024647A1 (en) | 1993-12-09 |
| CZ285194A3 (en) | 1995-05-17 |
| AU4068893A (en) | 1993-12-30 |
| CA2134751C (en) | 2003-12-16 |
| EP0644947A1 (en) | 1995-03-29 |
| KR100279317B1 (ko) | 2001-01-15 |
| NO316120B1 (no) | 2003-12-15 |
| NO944443D0 (no) | 1994-11-21 |
| JPH07507207A (ja) | 1995-08-10 |
| SK139894A3 (en) | 1995-07-11 |
| GR3030701T3 (en) | 1999-11-30 |
| CA2134751A1 (en) | 1993-12-09 |
| DE69324584D1 (de) | 1999-05-27 |
| DK0644947T3 (da) | 1999-11-01 |
| SK281086B6 (sk) | 2000-11-07 |
| JP2006143738A (ja) | 2006-06-08 |
| FI945485A (fi) | 1994-11-22 |
| FI111518B (fi) | 2003-08-15 |
| HUT71311A (en) | 1995-11-28 |
| HU219055B (hu) | 2001-02-28 |
| NO944443L (no) | 1995-01-20 |
| DE69324584T2 (de) | 1999-09-23 |
| EP0644947B1 (en) | 1999-04-21 |
| PL175651B1 (pl) | 1999-01-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1241264A1 (en) | Monoclonal antibodies to colon cancer antigen | |
| KR20000048994A (ko) | 바이러스 감염증 치료를 위한 조성물 및 방법 | |
| CA2253602A1 (en) | Method and composition for reconforming multi-epitopic antigens to initiate an immune response | |
| CA2132540C (en) | A monoclonal antibody to a human mdr1 multidrug resistance gene product, and uses | |
| PL201533B1 (pl) | Zastosowanie przeciwciała skierowanego przeciwko antygenowi błony komórkowej Ep-CAM | |
| US20050163768A1 (en) | Monoclonal antibodies and their use | |
| JP2006143738A (ja) | ルイスｙ−特異的モノクローナル抗体ｂｒ５５−２に対する抗イディオタイプモノクローナル抗体およびその使用 | |
| JP4495969B2 (ja) | Ｈｉｖ−１中和抗体を誘導する抗イディオタイプ抗体 | |
| EP0503916A1 (en) | Methods for selecting antibody reagents; anti-idiotype antibodies; and aids vaccine formulations | |
| CA1341391C (en) | Protective peptides derived from human immunodeficiency virus-1 gp160 | |
| Smorodinsky et al. | Towards an idiotype vaccine against mammary tumors. Induction of an immune response to breast cancer‐associated antigens by anti‐idiotypic antibodies | |
| JPH04501061A (ja) | 抗イディオタイプ抗体による抗腫瘍応答の誘導 | |
| JPH05506142A (ja) | Ｈｉｖ蛋白質の非免疫支配エピトープに特異的なモノクローナル抗体 | |
| Lehmann et al. | Tumor‐antigen‐specific humoral immune response of animals to anti‐idiotypic antibodies and comparative serological analysis of patients with small‐cell lung carcinoma | |
| US20130028908A1 (en) | MONOCLONAL ANTIBODIES DIRECTED AGAINST HIV p17 PROTEIN | |
| EP0344211A1 (en) | Monoclonal antibodies in vaccine formulations | |
| RU2014845C1 (ru) | Способ получения вакцины против спида | |
| Ma et al. | Characterization and evaluation of a novel anti-MUC-1 monoclonal antibody: induction of the idiotypic network in experimental mice | |
| NZ503032A (en) | Use of a binding agent to reconforming multi-epitopic antigens to initiate an immune response |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20060514 |