HU219055B - Monoklonális anti-idiotipus antitestek, az előállításukra szolgáló eljárás és felhasználásuk - Google Patents

Monoklonális anti-idiotipus antitestek, az előállításukra szolgáló eljárás és felhasználásuk Download PDF

Info

Publication number
HU219055B
HU219055B HU9403337A HU9403337A HU219055B HU 219055 B HU219055 B HU 219055B HU 9403337 A HU9403337 A HU 9403337A HU 9403337 A HU9403337 A HU 9403337A HU 219055 B HU219055 B HU 219055B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
human
binding
cells
murine
serum
Prior art date
Application number
HU9403337A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT71311A (en
Inventor
Helmut Eckert
Herbert Jaksche
Evelyne Janzek
Hans Loibner
Dieter Scholz
Original Assignee
Novartis Ag.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB929210944A external-priority patent/GB9210944D0/en
Priority claimed from GB929210930A external-priority patent/GB9210930D0/en
Priority claimed from GB929210929A external-priority patent/GB9210929D0/en
Application filed by Novartis Ag. filed Critical Novartis Ag.
Publication of HUT71311A publication Critical patent/HUT71311A/hu
Publication of HU219055B publication Critical patent/HU219055B/hu

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3023—Lung
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3053—Skin, nerves, brain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4208—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig
    • C07K16/4241—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig
    • C07K16/4258—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig against anti-receptor Ig
    • C07K16/4266—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig against anti-receptor Ig against anti-tumor receptor Ig
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G01N33/56972—White blood cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G01N33/56988—HIV or HTLV
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57423—Specifically defined cancers of lung
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)

Abstract

A találmány BR55–2 monoklonális antitestek elleni monoklonálisrágcsáló belső képmás-anti-idiotípus antitestekre, ezek előállításáraés felhasználására vonatkozik. Mivel ezek az antitestek képesek aLewis Y poli- szacharidantigént helyettesíteni, alkalmazhatókgyógyszerkészítmények, elsősorban vakcinák hatóanyagaiként emberekimmunizálására. A találmány szerinti anti-idiotípus antitestek BR55–2specificitású molekulák szelektív, mennyiségi meghatározására ésimmunaffinitásos tisztítására is felhasználhatók. ŕ

Description

A jelen találmány BR55-2 monoklonális antitestek elleni monoklonális rágcsáló belső képmás-anti-idiotípus antitestekre, ezek előállítására és gyógyszerkészítményekben, valamint analitikai eljárásokban való alkalmazására vonatkozik.
Az immunrendszer befolyásolására irányuló kísérletek egy része idiotípus kölcsönhatásokon alapul. Az egyes antigéndeterminánsokat, amelyek egy Ig-molekula antigénkötő helyén vagy e körül helyezkednek el, és amelyek az egyik antitestet a másiktól megkülönböztetik, idiotípusnak nevezzük. Egy adott antitest variábilis részén jelen lévő idiotópok összességét antitest idiotípusnak (id) nevezzük. Egy idiotípus molekuláris szerkezete a komplementaritást meghatározó szakaszokban (CDR=complementarity determining region) és a variábilis dómén ffamework szakaszaiban rejlik, és ehhez általában, de nem mindig, hozzájárul mind a nehéz, mind a könnyű láncok speciális társulása.
Az idiotípusok szerológiailag meghatározott egységet képviselnek, ugyanis ha egy antitestet (gyakran Ab 1-nek nevezzük) szingén, allogén vagy xenogén recipiensbe oltunk be, ez anti-idiotípus antitestek (gyakran Ab2-nek nevezzük) képződését indítja meg. Arra a feltételezésre alapozva, miszerint léteznek idiotípus/anti-idiotípus kölcsönhatások, Niels Jeme [Ann. Immunoi., 125C, 373 (1974)] lehetségesnek tartotta, hogy az immunrendszer fiziológiai szempontból receptoralapú szabályozás alatt áll. Az ő hálózatelmélete úgy tekinti az immunrendszert, mint olyan Ig-molekulák és T-limfocita-receptorok gyűjteményét, amelyek közül mindegyik, kötőhelye (paratóp) révén, egy antigéndetermináns (epitóp) felismerésére képes, ugyanakkor ezeket, az általuk kifejezett idiotópok révén, a rendszer más antitestjei vagy sejtfelületi receptorai ismerik fel. Számos tanulmány valóban kimutatta, hogy idiotípus és anti-idiotípus receptorok vannak jelen mind a B-, mind a T-limfociták felületén, valamint a szekretált antitesteken.
Ha az Abl és Ab2 egymáshoz kötődését gátolja az az antigén, amely ellen az Abl keletkezett, ezt az idiotípust kötőhelyhez kötöttnek (binding-site-related) tekintjük, mivel az antitest variábilis doménje olyan kötőhelyet tartalmaz, amely az antigén felismerését biztosítja. Az ilyen idiotípusokat, amelyek szerkezetileg antigénepitópot mímelnek, ezen epitóp belső képmásának (internál image) nevezzük. Minthogy mind az Ab2, mind az antigén kötődik a szóban forgó Ab 1-hez, ezek feltehetően hasonló olyan háromdimenziós szerkezettel rendelkeznek, amely az adott antigén belső képmását reprezentálja. A belső képmás-anti-idiotípus antitestek elvben azon antigén helyetteseiként foghatók fel, amelyből az idiotípus-hálózat útján leszármaztak. Ennélfogva ezeket a helyettesítő antigéneket aktív immunizálási eljárásokban felhasználhatjuk. Előnyösek lehetnek például akkor, ha az eredeti antigén nem eléggé immunogén ahhoz, hogy jelentős immunválaszt indukáljon. Tehát a megfelelő belső képmás-anti-idiotípus antitestek, amelyek egy nem immunogén szénhidrátantigént mímelnek, különösen hasznosak lehetnek bizonyos vakcinálási kísérletekben.
A hibridómatechnológia bevezetésének eredményeként, számos humán karcinóma típus elleni monoklonális antitestet (mAb) - főként egéreredetűt - állítottak elő. A legtöbb olyan marker, amelyet xenogén mAb-ek határoznak meg, szorosan véve nem tumorspecifikus, hanem olyan differenciált antigén, amely mind tumorokon, mind bizonyos normál és/vagy fetális szöveteken megjelenik. Ezeket tehát helyesebb, ha tumorhoz társult antigéneknek (TTAg) nevezzük. Az illető TTAg tulajdonságaitól - amelyeket még nem ismerünk teljesen - függ, hogy a xenogén mAb-ek által kimutatott humán tumormarkerek képesek-e antitumorválaszt kiváltani rákos betegekben, és hogy az ilyen antigének valójában kapcsolatban vannak-e a rákos betegben lévő autológ tumorokkal szembeni válasszal. A TTAg-eket, amelyek vagy természetüknél fogva immunogének a szingén gazdában, vagy amelyeket immunogénné tehetünk, potenciálisan terápiás és feltehetően profilaktikus előnyökkel járó antitumorimmunitás indukálására használhatjuk.
A tumorhoz társult antigének gyakran a „self’ egy részét alkotják, és igen gyenge immunválaszt váltanak ki a rákos betegekben. Ezzel szemben a belső képmásanti-idiotípus antitesteket, amelyek az illető TTAg szerkezeti epitópjait megközelítő háromdimenziós formában jelennek meg, a tumort viselő gazdaszervezet idegen molekulákként fogja felismerni. Tehát a megfelelő anti-idiotípus (anti-id) mAb-ekkel végzett terápiás vagy éppen profilaktikus immunizálással kiváltott immunválasz antitumorimmunitást eredményezhet.
A rák elleni terápiás immunizálás anti-id mAb-ekkel különösen eredményes lehet a betegség korai szakaszaiban: primer tumor operációjakor gyakran megtörténik, hogy egyes rejtőző tumorsejtek már szétszóródtak a beteg különböző szerveibe. Tudjuk, hogy ezek a mikrometasztatikus sejtek okozzák a metasztázisok későbbi növekedését, gyakran évekkel a diagnózis és a klinikailag bizonyított tumorszövet sebészi eltávolítása után. Mindeddig az epiteliális eredetű metasztatikus karcinóma majdnem minden esetben gyógyíthatatlan volt. Ennélfogva a „minimális maradék karcinóma” hatékony kezelése, azaz a rejtőző mikrometasztatikus sejtek elpusztítása annak érdekében, hogy megakadályozzuk a makrometasztázisok növekedését, sürgető szükségként jelentkezik a belgyógyászatban. A betegség ezen fázisaiban a hagyományos kemoterápiás (kiegészítő kezelés) próbálkozások meglehetősen eredménytelenek. Azonban „minimális maradék betegség” esetén, megfelelő belső képmás-anti-id mAb-ekkel kivitelezett immunizálással, egy specifikus antitumorimmunitás indukciója révén, a mikrometasztatikus sejteket szelektíven el lehet távolítani az immunrendszer segítségével, és ez súlyosbodásmentes, növekvő túlélési időhöz vezet.
A BR55-2 specificitású monoklonális antitestek [lásd például: Wistar, EP 285059 számú európai szabadalmi leírás; M. Blaszcyk-Turin et al., J. Bioi. Chem., 262, 372-379 (1987); Z. Steplewski et al., Hybridoma, 9, 201-210 (1992)] határozzák meg a Lewis Y6 antigént, amely egy olyan szénhidrát-determináns, amely szelektíven fejeződik ki humán szolid tumorok többsé2
HU 219 055 Β gén. Tulajdonságaik alapján a BR55-2 antitesteket fel lehet használni a lényegében epiteliális karcinóma passzív immunterápiájára.
A tumorral társult Lewis Y oligoszacharid-determináns, amely az embrionális fejlődés bizonyos fázisai folyamán szintén kifejeződik, önmaga nem immunogén. Azonban a BR55-2 (Abl) elleni belső képmás tulajdonságokkal rendelkező monoklonális anti-idiotípus antitesteket (Ab2) azáltal, hogy a Lewis Y antigén szerkezeti epitópjaihoz hasonlítanak, felhasználhatjuk protektív antitumorimmunitás kiváltására, különösen a betegség korai szakaszaiban.
Amellett, hogy a Lewis Y szénhidrátantigén az epiteliális eredetű karcinómán kifejeződik, szerepet játszik a humán immunelégtelenség vírus (HlV)-fertőzés patogenezisében is. A szerzett immunhiányos szindrómát (AIDS) mint megkülönböztető betegséget tartjuk számon, amelynek az etiológiája szerint a betegség egy limfotrop retrovírus (HlV)-fertőzéssel van kapcsolatban. A betegséget csökkent sejtközvetített immunitással társult rendellenesség és teljes limfocitopénia és különösen csökkent helper T-limfocita-szám (CD4) jellemzi. A betegséget egy preszindróma előzheti meg, amely rendszerint jellegzetes klinikai képek együttese, és helper T-limfocitopénia révén nyilvánul meg. A preszindrómát AIDS-szel kapcsolatos komplexnek (ARC=AIDSrelated complex) is nevezik.
A HÍV a vírusok egy olyan csoportjához tartozik, amelyet az elmúlt két évtized folyamán behatóan tanulmányoztak. Ha egy retrovírus behatol egy emberi vagy állati sejtbe, RNS-e DNS-sé változik, és beépül a gazdasejtbe, amely ezután becsapottként úgy kezeli a vírusgéneket, mintha saját génjei lennének. A HÍV a szervezet immunrendszerének támadásától biztonságban évekig latens módon fennmaradhat ezekben a sejtekben, és valahányszor a gazdasejt osztódik, vakon lemásolódik. A termelt víruspartikulák csak a fertőzött sejtek aktiválódása révén megindult gyors vírusreplikáció esetén ölik meg ezeket a sejteket, és ömlenek be a vérkeringésbe.
A HÍV specifikus tulajdonságai miatt nehéz gyógyulást elérni olyan módon, hogy a már fertőzött betegből mind a vírust, mind a humán genomba már átírt provirális genetikai információt eltávolítjuk. Ezért a legtöbb terápiás kísérletet olyan szerekre koncentrálták, amelyek a betegség kifejlődését a virális replikáció lényeges lépéseinek a zavarásával lassítják.
A fő cél a HIV-fertőzés megelőzése és a már megfertőződött betegnél a terápiás beavatkozás ártalmatlan és hatékony vakcina segítségével. Számos kísérleti vakcina vizsgálatát végezték el preklinikai és korai klinikai fázisokban. Ezek a vakcinák főként virális szerkezeteken alapulnak, azaz antigénen, különösen a gpl20 fő burokglükoproteinen.
A vírus ellen fellépő természetes immunválasz az összes virális protein elleni antitestekből és a sejtes immunitás aktiválásából áll. Úgy látszik azonban, hogy a gazdaszervezetnek a HIV-fertőzésre adott reakciója egy tünetmentes fázis után, amely évekig eltarthat, végül is nem állítja meg a betegség előrehaladását. Tehát azoknak a vakcinálási kísérleteknek az eredményessége, amelyek a természetesen fellépő és végül nem protektív immunválaszt kiváltó antigéneken alapulnak, kétséges marad. A legnagyobb problémát a HÍV messzemenő heterogenitása okozza, amelynek révén a vírus kitér a típusspecifíkus neutralizáló anti-gpl20 antitestek támadása elől.
A HÍV elleni hatékony védekezés vakcinálással két védelmi stratégiát követel meg: az egyik a vérkeringésbe került szabad vírus ellen irányul, a másik a már fertőzött sejtek ellen irányul. Ismert, hogy a HIV-fertőzött sejtek felületén, in vitro és in vivő, módosult glükozilációs mintázat - nevezetesen a Lewis Y szénhidrátdetermináns - fejeződik ki. Minthogy ez az antigén rendszerint csak bizonyos fetális fejlődési fázisokban fordul elő, és ezenkívül számos rosszindulatú folyamattal társul, a HIV-fertőzött sejteken való kifejeződése valószínűleg a retrovirális transzformáció által indukált, megváltozott differenciáltságú állapotot tükrözi. Tehát ez a felületi fenotípus egy különleges, a HIV-vel transzfektált humán genommal szembeni, sejtes gazdareakciónak felel meg.
A HIV-burok glükoproteinjét a fertőzött sejt glükozilációs mechanizmusa állítja elő. A HIV-et termelő fertőzött sejtek glükozilációs mintázatában létrejött változások a kiszabadult víruspartikulákon is megtalálhatók. Ebből következik, hogy az ilyen sejtekben képződött HIV-burokglükoprotein szintén tartalmaz Lewis Y szénhidrát-determinánsokat. Tehát a Lewis Y oligoszacharid egy olyan specifikus gazdaválaszt képvisel, ami mind a HIV-fertőzött sejteken, mind a szabad HIV-partikulákon kifejeződik.
Fenti meggondolások alapján a Lewis Y szerkezet mind a szabad vírus, mind a HIV-fertőzött sejt elleni vakcinálási stratégia fontos követelményeit teljesíti. Ezenkívül, miután a Lewis Y antigén egy HIV-vel szembeni általános gazdareakciót testesít meg, független a HIV-törzstől, és nem befolyásolja a vírus genetikai változatossága. Sajnos a Lewis Y, szénhidrátszerkezete következtében, és mint teljes differenciáltságú antigén „self tulajdonságai miatt, önmaga nem immunogén. Ez ellen az antigén ellen nem észleltek emberben immunválaszt. Azonban a BR55-2 (Abl) elleni monoklonális anti-idiotípus antitestek (Ab2) olyan belső képmás tulajdonságokkal rendelkeznek, amelyek a Lewis Y antigén szerkezeti epitópjaihoz hasonlóak, tehát felhasználhatók lehetnének profilaktikus és terápiás immunitás kiváltására, mind a szabad HIV-vel, mind a HIV-fertőzött sejtekkel szemben a vírustörzstől függetlenül.
Azonkívül, hogy mint speciális vakcinák, profilaktikusan és terápiásán használhatók, a monoklonális belső képmás-anti-id antitestek nagymértékben specifikus reagensei annak az antitest-idiotípusnak, amelynek révén előállították. Majdnem kizárólag csupán az Abl kötőszakaszát ismerik fel. Ez a felismerési terület az Abl más determinánsaitól független. Más szavakkal, a megfelelő anti-id mAb-ek szelektíven ismernek fel minden olyan molekulát, amelyek az Abl egyetlen idiotípusát, annak pontos háromdimenziós formájában,
HU 219 055 Β képviselik. Tehát ezek az anti-id mAb-ek jó affinitással kötődnek a mAbl F(ab’)2-, F(ab)- és Fv-fragmentumaihoz, valamint ezek variánsaihoz (a switch variánsok különböző konstans szakaszokból állnak, ilyen például az azonos idiotípusú egér-IgG2a, -IgG2b, -IgG 1). A belső képmás-anti-id mAb-ek ezen nagymértékben specifikus felismerőrendszeréhez tartoznak a rekombináns DNS-technológiával előállított eredeti egér-mAb variánsai is.
Annak érdekében, hogy úrrá legyünk az egérantitesteknek az emberek passzív immunterápiájában való ismételt használata következtében felmerült problémákon, egér/humán kiméra mAb-eket készíthetünk úgy, hogy kombináljuk a kiválasztott eredeti egér-mAb variábilis doménjeit humán konstans szakaszokkal. Ahhoz, hogy emberi szérumban az egér/humán kiméra mAb-eket kimutassuk, nagymértékben specifikus reagensekre van szükség, mivel ezen kiméra mAb-ek konstans szakaszai azonosak a humán immunglobulinokban természetesen jelen lévő konstans szakaszokkal. Az eredeti egér-Abl elleni belső képmás-anti-id mAb-ek szintén felismerik a belőlük származó kiméraantitesteket. Azaz az anti-idiotípus mAb-ek reagensekként használhatók például az egér/humán mAb-ek szérumkoncentrációjának specifikus és érzékeny mennyiségi meghatározására, a normál humán immunglobulinok óriási túlsúlya jelenlétében is.
Passzív immunterápiában való felhasználáshoz a terápiásán hasznos mAb-ek tulajdonságainak javítására rekombináns DNS-technológiával olyan „teljesen humanizált” antitesteket szerkeszthetünk, amelyek az eredeti egérantitestből csak a minimálisan szükséges részeket tartalmazzák: a komplementaritást meghatározó szakaszokat (CDR-eket) humán variábilis szakasz framework szakaszokkal és humán konstans szakaszokkal kombináljuk. A „teljesen humanizált” mAb-ek tervezéséhez és szerkesztéséhez felhasználjuk a szekvenciahomológiát és a molekulamodellezést, annak érdekében, hogy kiválasszuk az egér és humán szekvencia elemeknek azt a kombinációját, amely tovább csökkenti az immunogenitást, de megtartja a kötési tulajdonságokat. Bizonyos belső képmás-anti-id mAb-ek, amelyeket az eredeti egér-Abl idiotípus ellen termeltünk, még mindig kötődhetnek a CDR-átültetett humanizált változathoz, ha a következő követelményeket kielégítik.
a) A humanizált változat kötést létesítő szakaszának háromdimenziós szerkezete nagyon hasonló az eredeti egérantitestéhez.
b) A konkrét anti-id antitest pontosan felismeri a kötést létesítő szakaszok háromdimenziós alakját („valódi belső képmás antitest”).
A fent említett tulajdonságokkal rendelkező antiidiotípus mAb-ek különösen alkalmas reagensek például a teljes humanizált (CDR-átültetett) mAb-ek szérumkoncentrációjának specifikus és érzékeny mennyiségi meghatározásához, normál humán immunglobulinok óriási túlsúlyának jelenlétében is.
A fentiek alapján a találmány a BR55-2 monoklonális antitestek (Abl) elleni rágcsáló (murine), azaz patkány- vagy egéreredetű monoklonális belső képmásanti-idiotípus antitestek (Ab2) előállítására, termelésére és vizsgálatára vonatkozik. A találmány továbbá ezen anti-idiotípus mAb-eknek az epiteliális eredetű karcinómák elleni és a HIV-fertőzés által okozott betegségek elleni aktív terápiás és profilaktikus immunizálásban való felhasználására is vonatkozik. A találmány tárgyát képezi ezen anti-idiotípus antitesteknek a BR55-2 specificitású antitestek, fragmentumok, származékok - beleértve a kimerizált és teljesen humanizált variánsokat is (lásd a WO 92/03165 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentést) - nagymértékben szelektív és mennyiségi meghatározására való felhasználása. Továbbá, mint a BR55-2 specificitású molekulák szelektív, immunaffinitással végzett tisztítására szolgáló általános módszer, szintén a találmány részét képezi.
A BR55-2 idiotípus antitestek elleni rágcsáló monoklonális anti-idiotípus antitestek előállítása és vizsgálata.
Egy, a nem kívánt anti-idiotípus válaszok minimálisra csökkentése érdekében végzett kísérletben a BR55-2 rágcsáló-IgG3 F(ab’)2 fragmentumát választottuk ki immunizálás céljára. A BR55-2 rágcsáló-mAb elleni rágcsáló-anti-id mAb-ek eredményes előállítása érdekében maximálisra szükséges növelni immunogenitását abból a célból, hogy a szingén gazdában megfelelő immunválasz keletkezzék. Ennek érdekében az Fc-résztől megfosztott F(ab’)2 fragmentumot (a hasítást és tisztítást az EP-A-528,767 számon közzétett európai szabadalmi bejelentés írja le) csigahemocianinnal (Keyhole Limpet Hemocyanin=KLH) mint immunogénhordozóval konjugáltuk, N-szukcinimidil3-(2-piridil-ditio)-propionát (=SPDP) heterobifunkciós linkeren keresztül a J. Carlsson és munkatársai által leírt [Biochem J., 173, 723 (1978)] módszer szerint.
Balb/c egereket immunizáltunk BR55-2/rágcsálóIgG3-F(ab’)2-KLH konjugátummal komplett Freundadjuváns segítségével, rágcsáló-mAb-ek előállítására szolgáló technológia alapján. Az ismételt immunizáló oltások után a rágcsálólépsejteket SP2/O rágcsáló-mielómasejtvonallal fuzionáltuk (a kísérlet részletezését lásd az 1. példában).
A tenyésztett hibridómasejtek megfelelő szelektálására sorozatban vizsgáltuk a felülúszókat. A szelektálást a következő kritériumok alapján végeztük.
a) Megállapítottuk a hibridómák szekréciós sebességét, amelyet a felülúszókban mért egér-IgG koncentrációja határoz meg (a kísérlet részleteit a 2. példa tartalmazza). A nagy mennyiségű rágcsáló-IgG-t termelő sejteket egysejttenyészetekbe szubklónoztuk.
b) Megvizsgáltuk a szelektált felülúszók kötődését a BR55-2/rágcsáló-IgG3 F(ab’)2 fragmentumához (a kísérlet részleteit a 3. példa tartalmazza).
c) Vizsgáltuk a BR55-2/rágcsáló-IgG2a Lewis Y pozitív SKBR5 humán mellkarcinómasejtekhez való kötődésének szelektált felülúszókkal való gátlását (a kísérlet részleteit illetően lásd a 4. példát).
Ez utóbbi tesztet arra szántuk, hogy ebből az Ab2 antitestek belső képmás tulajdonságaira következtethessünk. A BR55-2 rágcsáló-IgG2a switch variánsát használtuk a kötéshez, hogy minimálisra csökkent4
HU 219 055 Β sük az immunizálásra használt BR55-2/rágcsálóIgG3 F(ab’)2 fragmentuma megmaradt konstans szakaszait felismerő Ab2 antitestek kimutatását. Ezt a tesztet mennyiségi meghatározásként végeztük az a) vizsgálat szerint meghatározott IgG koncentrációk alapján (2. példa). Ezenkívül aspecifikus egér-IgG-t adtunk feleslegben a gátlási vizsgálathoz, hogy mindenképpen elkerüljük az Ab2 antitestek észlelését, amelyek a BR55-2 idiotípusra nem specifikusak. Olyan hibridómákat választottunk ki, amelyeknek a gátló kapacitása több mint 95%-os (a BR55-2/rágcsáló-IgG2a SKBR5 sejtvonalhoz való kötődésének gátlása).
A fent említett vizsgálati eljárások felhasználása révén végül hat különböző hibridómát szelektáltunk és szaporítottunk (E4, Cll, B3, B9, G6, G9). Mind a hat hibridóma egér-IgGl-et termelt. Ezt szubtípus ELISAmódszerrel határoztuk meg, nyúl-anti-egér-IgGl-peroxidáz (ilyenek a Zymed reagensei) használatával.
Mind a hat hibridómát hengeres palackokban tenyésztettük (37 °C; 5% CO2; G táptalaj; a táptalajt 34 naponként cseréltük), és az összegyűjtött felülúszókat tisztítottuk.
A megfelelő anti-id mAb-et tartalmazó felülúszókat immunaffinitás-kromatográfiával tisztítottuk. Az affinitáskromatográfia általában egy immobilizált ligandum és a szóban forgó anyag közötti kölcsönhatáson alapul. A BR55-2 anti-idiotípus antitestek esetében az affinitásoszlophoz szükséges erősen specifikus ligandum a BR55-2/rágcsáló-IgG2a mAb, amely megköti az illető anti-idiotípus antitesteket (a kísérlet részletezését lásd az 5. példában).
Az izolált anti-id BR55-2 mAb-ek (E4, Cll, B3, B9, G6, G9) tisztasági fokát analitikai FPLC ioncserés kromatográfiával, méretkizárásos kromatográfiával, SDS-PAGE módszerrel és izoelektromos fokuszálással vizsgáltuk. Mind a hat anti-id BR55-2 mAb tisztasága 95% feletti volt (a 6. példa tartalmazza a kísérlet részletezését); az SDS-PAGE és izoelektromos fokuszálás eredményeit az 1. és 2. ábra mutatja be).
A tisztított anti-id mAb-ek kvantitatív jellemzésére meghatároztuk, hogy mennyire képesek gátolni a BR55-2/rágcsáló-IgG3 kötődését Lewis Y antigén pozitív SKBR5 sejtvonalhoz. Mind a hat mAb gátolta az Abl kötődését antigénjéhez 1:1 sztöchiometriai arányok mellett (a 7. példa tartalmazza a kísérlet részletezését; a 3. ábrán láthatók a jellemző eredmények).
A fent leírt anti-id BR55-2 mAb-ek belső képmás tulajdonságúak, és használatuknak, mint tumorantigénhelyettesítőknek, döntő bizonyítása azon alapul, hogy képesek-e Ab3-választ kiváltani különböző fajokban a tumorral társult antigén ellen. N. Jeme hálózatelmélete szerint belső képmás-anti-id mAb-ekkel (Ab2) végzett immunizálással kiváltott antitestek (Ab3) kötési specifitása hasonló az Abl-éhez. Ennélfogva az anti-id BR55-2 mAb-ek használatával végzett immunizálással kapott immunválasznak specifikusnak kell lennie a Lewis Y antigén pozitív tumorsejtekre. Ennek következtében protektív antitumorimmunitás keletkezhet emberben anti-id BR55-2 mAb-ekkel végzett immunizálás következtében.
Az Ab3-válasz tulajdonságainak tanulmányozása céljából nyulakat és rhesusmajmokat immunizáltunk a találmány szerinti anti-id BR55-2 E4 mAb-bel. Hordozó és adjuváns gyanánt alumínium-hidroxidot használtunk. Ezt az enyhe adjuvánst széles körben alkalmazzák a különböző embergyógyászati vakcinákban. Negatív kontrollként ugyanilyen mennyiségű aspecifikus egér-IgGl-gyel is immunizáltunk állatokat. Öt hét alatt négy immunizáló oltást adtunk, majd a szérumokat a 9. héten vettük le (a kísérlet részleteit lásd a 8. példában). Vizsgáltuk a szérum-Ig kötődését a Lewis Y antigén pozitív SKBR5 mellkarcinóma-sejtvonalhoz és a Lewis Y negatív WM9 melanóma-sejtvonalhoz (a kísérlet részletezését lásd a 9. és 10. példában).
Az anti-id BR55-2 E4 magas titerű humorális immunválaszt váltott ki mind nyulakban, mind rhesusmajmokban. Az anti-id BR55-2 E4-gyel immunizált állatok szérum-immunglobulinja (lg) szelektíven kötődött a Lewis Y antigén pozitív SKBR5 sejtvonalhoz, de nem kötődött a Lewis Y antigén negatív WM9 sejtvonalhoz. Ezzel szemben a nem specifikus egér-IgGlgyel immunizált állatok szérumában szinte egyáltalán nem volt kimutatható tumorsejtkötő lg. Ezeket az eredményeket az 1. táblázat foglalja össze. A 4. és az 5. ábrán jellemző Ig-kötődési görbéket mutatunk be, amelyeket nyulak és rhesusmajmok natív és immunszérumával kaptunk sejt-ELISA (SKBR5 sejtek) vizsgálatban. Az anti-id BR55-2 E4-gyel immunizált állatok szérumának kötődését SKBR5 sejtekhez még 1:10 000 szérumhígítás esetén is ki lehetett mutatni.
Két évvel az első immunizálási menet után az illető rhesusmajmok egy első emlékeztető oltást kaptak antiid BR55-2 E4 vagy aspecifikus egér-IgGl oltóanyagból. A kezdeti immunizálás után három évvel (=egy évvel az első emlékeztető oltás után; a kísérlet részletezését lásd a 8. példában), hasonló módon, egy második emlékeztető oltást kaptak az állatok. Az emlékeztető oltások előtt és után szérummintákat vettünk.
Az anti-id BR55-2 E4-gyel vakcináit rhesusmajmok teljesen humorális immunválaszát ELISA-módszerrel határoztuk meg, amikor is anti-id BR55-2 E4gyel fedtük a mikrotitrálólemezeket (a kísérlet részleteire vonatkozóan lásd a 13. példát). Mindegyik rhesusmajom szérumában igen magas titerű immunválaszt találtunk az első immunizálási menet után, valamint az első és második emlékeztető oltás után. Még 1:50 000 szérumhígítás esetén is kimutattuk az lg kötődését antiid BR55-2 E4-hez. Kissé alacsony, de még mindig jelentékeny litert kaptunk az emlékeztető oltások előtti szérumokban. Ezeket az eredményeket a 6-8. ábrák mutatják be.
Az aspecifikus egér-IgGl-gyel vakcináit rhesusmajmok immunválaszát szintén meghatároztuk a fent említett ELISA-módszerrel (a kísérlet részletezését lásd a 13. példában). Mint vártuk, az anti-id BR55-2 E4-hez kötődő szérum-Ig titerek alacsonyabbak voltak, mint az anti-id BR55-2 E4-gyel vakcináit majmok szérumában talált titerek. Míg az aspecifikus egér-IgGl-gyel immunizált rhesusmajmok immunválasza keresztreagál az anti-id BR55-2 E4 konstans szakaszaival, addig az
HU 219 055 Β anti-id hipervariábilis szakaszai ellen irányuló immunválaszrész nyilvánvalóan hiányzik. Ezeket az eredményeket a 9-10. ábrák mutatják be.
Az immunválasz tumorspecificitásának a bizonyítására meghatároztuk a kezdő immunizálási menet utáni és az emlékeztető oltások előtti és utáni majomszérumokban az lg kötődését több Lewis Y antigén pozitív karcinóma-sejtvonalhoz (mell-, gyomor-, vastagbélés kissejtes tüdőkarcinóma), valamint egy Lewis Y negatív melanóma-sejtvonalhoz (a kísérlet részleteit a 10. példa tartalmazza). Az anti-id BR55-2 E4-gyel kezelt rhesusmajmokban két évvel az első immunizáló oltások után és az első emlékeztető oltás előtt még ki tudtunk mutatni Lewis Y antigén pozitív tumorsejtekhez kötődő szérum-Ig-t. Az első emlékeztető immunizáló oltást követően az anti-id BR55-2 E4-gyel immunizált állatokban azt találtuk, hogy a Lewis Y antigén pozitív tumorsejtekhez specifikusan kötődő szérum-Ig titere rendkívüli módon megnőtt, ugyanakkor antigén negatív sejtvonalhoz szinte nem volt kimutatható kötődés. Aspecifikus egér-IgGl-gyel immunizált rhesusmajmok szérumában egyik időpontban sem figyeltünk meg specifikus kötődést. Hasonló eredményeket kaptunk a második emlékeztető oltás előtt és után levett szérumokkal. A különböző időpontokban levett szérumok titrálási eredményeit sejt-ELISA meghatározásokkal kaptuk, amelyekben számos tumorsejtvonalat használtunk. Az eredményeket a 11-20. ábrák mutatják be.
A kezdeti immunizálási menet előtt és után, valamint az első emlékeztető immunizáló oltás előtt és után levett különböző majomszérum-Ig-ok immunreaktivitása hasonló képet mutatott egy, a Lewis Y antigén pozitív SKBR5 sejtekből készített membránkészítményhez való kötődést vizsgáló kísérletekben (a kísérlet részleteit illetően lásd all. példát). Az eredményeket a 2. táblázatban foglaljuk össze.
Annak érdekében, hogy tovább analizáljuk az anti-id BR55-2 E4-gyel végzett immunizálásokkal a rhesusmajmokban kiváltott Immorális immunválaszt, a vakcináit majmok különböző szérumait immunaffinitással tisztítottuk Sepharose-hoz kötött anti-id BR55-2 E4gyel töltött oszlopon (a kísérletet a 12. példában részletezzük). Ezzel a szelektív, egylépéses eljárással az antiid BR55-2 E4 elleni teljes Immorális immunválaszt elválasztottuk az egyéb aspecifikus szérumproteinektől. Az első kísérletben egy anti-id BR55-2 E4-gyel immunizált rhesusmajom immunglobulinját tisztítottuk (immunaffinitással) egy olyan szérumból, amelyet a kezdeti immunizálási menet utáni 9. héten vettünk le. A második kísérletben egy anti-id BR55-2 E4-gyel immunizált rhesusmajom immunglobulinját tisztítottuk (immunaffinitással) egy olyan szérumkeverékből, amely a második emlékeztető immunizáló oltás utáni 4. és 9. héten levett szérumokból állt. A kapott Ig-frakciók - amelyeket az anti-id BR55-2 E4-oszlop visszatartott - specifikusan kötődtek az anti-id BR55-2 E4 antitestmolekula különböző epitópjaihoz. Ezek az Ig-frakciók az anti-id BR55-2 E4 konstans szakaszai elleni antitesteket (antiizotípus immunválasz), valamint az anti-id BR55-2 E4 variábilis szakaszai elleni - beleértve a kötődésre képes szakaszt - antitesteket (anti-idiotípus immunválasz) tartalmazták. A bevezetőben említett idiotípus hálózatelmélet alapján, az utóbbi frakció (Ab3) különösen fontos, mivel ennek a kötőtulajdonságai hasonlíthatók a BR55-2 specificitású antitestek (Abl) kötőtulajdonságaihoz.
Meghatároztuk a második emlékeztető oltás utáni 4. és 9. héten levett szérumok keverékéből tisztított (immunaffinitással) Ig-frakciónak és az átfolyt frakciónak anti-id BR55-2 E4-hez való kötődését (a kísérletet a 13. példában részletezzük). Míg az immunaffinitással tisztított Ig-frakció erősen kötődött az anti-id BR55-2 E4hez, addig az átfolyt frakciónál nem volt kimutatható kötődés. Ez az eredmény bizonyítja ezen immunológiai tisztítási módszer szelektivitását és hatékonyságát (az eredményeket a 21. ábra foglalja össze).
Ezután összehasonlítottuk a második emlékeztető oltás utáni 4., 9. héten levett szérumok keverékéből kapott, immunaffinitással tisztított Ig-frakciónak, az átfolyt frakciónak és az eredeti egér-mAb (Abl) egy humanizált változatának kötőtulajdonságait SKBR5 mellkarcinómasejteken. E humanizált Abl változatot (BR55-2/humanizált IgGl) azért választottuk, hogy megkönnyítsük az összehasonlítást, ugyanis ez ugyanazon reagenssel mutatható ki, mint amit a rhesusmajom-Ig kimutatására használtunk (kecske anti-humán Ig/peroxidáz, amely hasonló módon kötődik a szoros rokonságban lévő rhesusmajom-Ig-hoz is). Majdnem minden tumorsejtkötő reaktivitás a tisztított Ig-ffakcióban akkumulálódott. Ez az eredmény bizonyítja az anti-id BR55-2 E4-gyel immunizált rhesusmajom-Ig-nak Lewis Y antigén pozitív tumorsejtvonallal való reakcióját. Ezenkívül tömeg/tömeg alapon a tisztított Ig-frakció kötési ereje csak ötször alacsonyabb, mint a BR55-2/humanizált IgGl-é (Abl). Ha figyelembe vesszük, hogy a tisztított Ig-frakciónak csupán egy bizonyos része irányul az anti-id BR55-2 kötésre képes szakasza ellen, és a hálózat elmélet alapján csak ennek a résznek vannak az Ab 1-hez mérhető kötési tulajdonságai, ez az eredmény figyelemre méltó. Az immunaffinitással tisztított rhesusmajomszérumok kihozatala alapján a tisztított Ig-frakció titere közel 200 pg/ml szérumnak felel meg, amely körülbelül 40 pg/ml Ig-t jelent, s ezen lg tumorsejtkötő tulajdonságai hasonlóak a BR55-2/humanizált IgGl-éhez (az eredményeket a
22. ábra mutatja be; a kísérlet részleteit a 10. és 12. példa tartalmazza).
A 23. ábra mutatja be az immunaffinitással tisztított majom-Ig (Ab3) kötési tulajdonságainak és a BR55-2/humanizált IgGl kötési tulajdonságainak összehasonlítását Lewis Y pozitív SKBR5 mellkarcinóma-sejtvonalon és a Lewis Y negatív WM9 melanómasejtvonalon (a kísérlet részleteit a 10. példa tartalmazza). Míg mind az Ab3-frakció, mind a BR55-2/humanizált IgGl erősen kötődik a Lewis Y pozitív sejtvonalhoz - mint fent leírtuk -, ugyanakkor egyik antigén sem kötődik specifikusan a Lewis Y negatív sejtvonalhoz. Ezek az eredmények bizonyítják az Ab3-frakció és a humanizált Abl-variáns kötési viselkedésének hasonlóságát.
HU 219 055 Β
Megfigyeltük, hogy ELISA-vizsgálatban, amikor is a Lewis Y pozitív SKBR5 sejtvonal és a Lewis Y negatív WM9 sejtvonal membránfrakcióit használtuk, az Ab3-frakció immunreaktivitása szintén hasonló képet mutatott. Kimutattuk, hogy az Ab3 frakció lényegében csak a Lewis Y pozitív sejtmembránokhoz kötődik (az eredményeket a 24. ábra mutatja be; a kísérlet részleteit illetően lásd all. példát).
Az immunaffinitással tisztított majom-Ig (Ab3) kötőtulajdonságait még további számos Lewis Y pozitív humán tumorsejtvonalon (kissejtes tüdőrák, gyomorrák, vastagbélrák, mellrák) is igazoltuk. Az immunaffinitással tisztított majom-Ig erősen kötődött minden vizsgált sejtvonalhoz (az eredményeket a 25. ábra mutatja be; a kísérlet részleteit a 10. példa tartalmazza).
A BR55-2/rágcsáló-IgG3 Abl antitest, miután kötődött a tumorsejtekhez, úgy közvetíti a tumorsejt elpusztítását, hogy aktiválja a humán effektor mechanizmusokat. Az immunaffínitással tisztított majom-Ig-t (Ab3) használtuk arra a célra, hogy megvizsgáljuk az anti-id BR55-2 E4-gyel való immunizálással indukált rhesusmajom-Ig (Ab3) tumorsejtpusztító kapacitását. Ebben a kísérletben egy rhesusmajom anti-id BR55-2 E4-gyel végzett kezdeti immunizálás utáni 9. héten levett szérumából immunaffinitással tisztítottuk az Ab3-frakciót (lásd fentebb). Ezt az Ab3 frakciót hasonlítottuk össze a BR55-2/rágcsáló-IgG3-mal (Abl) egy ADCC-kísérletben, ahol humán PBMC-t használtunk effektor sejtek gyanánt (az eredményeket a 26. ábra mutatja be; a kísérlet részleteit a 14. példa tartalmazza; ADCC=antibodydependent cellular citotoxicity=antitestfüggő celluláris citotoxicitás; PBMC=peripheral blood mononuclear cell=perifériás vér mononukleáris sejt). Az immunaffinitással tisztított Ab3-frakció magasabb koncentrációi úgy közvetítik a tumorsejtek elpusztítását, hogy hasonlóan az egér-Abl-hez, aktiválják a humán effektor sejteket. Ez az eredmény bizonyítja, hogy az anti-id BR55-2 E4-gyel végzett vakcinálás szelektív tumorsejt-citotoxicitást indukál. Magasabb koncentrációjú Ab3-ra azért van szükség, mivel az immunaffinitással tisztított Ig-frakciónak csak egy bizonyos része irányul az anti-id BR55-2 E4 kombinációra képes szakasza ellen, csak ez a rész fog kötődni a tumorsejtekhez, és csak ez közvetíti az ADCC-t.
Mint a bevezetőben említettük, ismert, hogy a Lewis Y szénhidrátantigén HIV-fertőzött humán leukocitákon is kifejeződik. Az anti-id BR55-2 E4-gyel vagy az aspecifikus egér-IgGl-gyel immunizált rhesusmajomszérum Ig-ok kötődési viselkedésének tanulmányozása céljából, a kezdeti immunizálási menet előtt és ez után a 9. héten levett majomszérumokat egy kereskedelemben kapható olyan tesztkészlettel vizsgáltuk meg, amelyet humán szérumok HIV-pozitivitásának kimutatására állítottak elő. Ez a teszt azon alapul, hogy a humán szérum-Ig képes kötődni a HIV-fertőzött humán PÁLL T sejtvonalhoz, amely indirekt immunfluoreszcenciával - anti-humán IgG-FITC használatával - kimutatható. A humán és rhesusmajom-Ig nagy hasonlósága miatt a tesztkészlet eredeti reagense rhesusmajomIg-ra is alkalmazható. A nem fertőzött PALL-sejtekhez való kötődés szolgált kontroll gyanánt (a kísérlet részleteit illetően lásd a 15. példát).
Normál rhesusmajomszérummal a háttér immunfluoreszcencia mind a HIV-fertőzött, mind a nem fertőzött PALL-sejtek esetén kismértékben nagyobb volt, mint a normál humán szérummal észlelt háttér immunfluoreszcencia. Azonban lényegében csak az anti-id BR55-2 E4-gyel immunizált rhesusmajomszérum immunglobulinja kötődött a HIV-fertőzött PALL-sejtekhez, míg a nem fertőzött PALL-sejtekhez majdnem egyáltalán nem volt kimutatható kötődés. Az aspecifikus egér-IgGl-gyel immunizált rhesusmajmok szérum-Ig reaktivitása a HIV-fertőzött PALL-sejtekkel szemben tisztán kivehetően kevésbé volt kifejezett, és megközelítette a normál majomszérumnál megfigyelt háttérimmunfluoreszcenciát (az eredményeket a 3. táblázat foglalja össze).
Egy anti-id BR55-2 E4-gyel immunizált rhesusmajomból a második emlékeztető oltás utáni 4. és 9. héten levett szérumok keverékéből kapott Ig-t immunaffinitással tisztítottunk, anti-id BR55-2 E4 oszlopon (lásd fentebb). Ezen immunaffinitással tisztított lg (Ab3) kötőtulajdonságát összehasonlítottuk a BR55-2/egérIgG3 (Abl) kötőtulajdonságaival a már említett, kereskedelemben kapható, a humán szérumok HlV-szeropozitivitásának kimutatására szolgáló tesztkit alkalmazásával (a kísérlet részleteit lásd a 15. példában). Az immunaffínitással tisztított Ig-frakció (Ab3) szelektíven kötődött a HIV-fertőzött PALL-sejtekhez, de nem volt kimutatható kötődés nem fertőzött PALL-sejtekkel. Hasonló volt a kötődés képe a BR55-2/rágcsáló-IgG3-nál (Abl). Ezeket az eredményeket a 4. táblázat foglalja össze.
A találmányban leírt, a BR55-2 kötésre képes szakaszai elleni belső képmás-anti-idiotípus mAb-ek amellett, hogy mint különleges vakcinák a különböző rákbetegségek és HÍV által okozott betegségek megelőzésére és kezelésére használhatók, hatásos eszközei a BR55-2 kötőkapacitással rendelkező monoklonális antitestek, ezek származékai vagy fragmentumai mennyiségi meghatározásának. Felhasználhatók például minden BR55-2 egérszubtípus koncentrációjának a meghatározására humán szérumokban. Minthogy ezek az anti-id mAb-ek a BR55-2 kötőszakaszának háromdimenziós alakját ismerik fel, csak az immunreaktív BR55-2 szerkezetekhez kötődnek. Ez a tulajdonság különb kimutatási rendszereket eredményez, mint a hagyományos anti-konstans-szakasz reagenseken alapuló kimutatási rendszerek. A 16. példában ismertetünk egy, az immunreaktív BR55-2/rágcsáló-IgG3 vagy BR55-2/rágcsáló-IgG2a kvantitatív meghatározására szolgáló ELISA-rendszert. A humán szérumban lévő ezen mAb-ek egy tipikus standard görbéjét a 27. ábra ábrázolja.
A találmány egy anti-id monoklonális antitesteken alapuló hasonló ELISA-rendszert ír le, amely az immunreaktív BR55-2 egér/humán kimérák igen szelektív mennyiségi meghatározására alkalmazható, humán szérumban. Ezek a kimérák BR55-2 variábilis doménekből és humán konstans szakaszokból (például:
HU 219 055 Β humán IgGl vagy humán IgG3) állnak. Minthogy humán szérumban a normál humán lg óriási túlsúlyban van (>10 mg/ml), ezeket az egér/humán kimérákat olyan hagyományos anti-humán Fc-reagensekkel, amelyek a szérumban jelen lévő minden humán Ig-hoz kötődnek, nem lehet kimutatni humán szérumban. A szelektív ELISA-rendszert a 17. és 18. példában ismertetjük, a humán szérum tipikus standard görbéi a 28. és
29. ábrákon láthatók.
A BR55-2 teljesen humanizált változatát úgy állítjuk elő, hogy az eredeti egér-mAb komplementaritást meghatározó szakaszait (CDR-eket) beültetjük humán frameworkbe és konstans szakaszokba. A komputermodellezés segítségével kiválasztott humán ffameworkben végzett néhány pontmutáció eredményeként olyan humanizált változatot kapunk, amelyben a Lewis Y pozitív tumorsejtekhez való kötőaffinitásban, összehasonlítva az eredeti egér-mAb-bel, lényeges veszteség nincs. Ezekben a humanizált variánsokban tehát a kötési jellemzőket meghatározó eredeti egér-aminosavszekvenciáknak csak egy kis része marad változatlan. Megjegyzendő, hogy az eredeti egér-IgG3 mAb humanizált IgGl variánsainak idiotípusához is erősen kötődik mindegyik találmány szerinti anti-id BR55-2 mAb. Az anti-id mAb-ek kötési viselkedését az Abl humanizált változataival szemben a fent említett egér/humán kiméra mAb-ekével vethető össze. Ez biospecifikus hatásanalízissel (biospecific interaction analysis) igazolható, a Pharmacia-féle BIAcore™ rendszert alkalmazva. Magasabb koncentrációknál legtöbb esetben csaknem 1:1 sztöchiometrikus arány figyelhető meg az anti-id BR55-2 és a BR55-2/kiméra humán IgGl vagy BR55-2/humanizált IgGl között. A kísérlet részleteit a
19. példa íqa le, a titrálási görbéket a 30-35. ábrák mutatják be. Ezek az eredmények az anti-id mAb-ek kötődési szelektivitását hangsúlyozzák a BR55-2 összes variánsában lévő hipervariábilis szakaszokon intakt háromdimenziós alakjával szemben, és bizonyítják belső képmás tulajdonságaikat.
A BR55-2 mAb-eket, egyedülálló és szelektív felismerő mintázatuk alapján, a BR55-2 specificitású immunreaktív humanizált antitestek igen szelektív mennyiségi meghatározására lehet felhasználni humán szérumban, a szérumban jelen lévő humán immunglobulin óriási túlsúlya ellenére. Ugyanez az ELISA-rendszer használható a BR55-2 specificitású humanizált antitestek mennyiségi meghatározására majomszérumban, s ez majomnál például azon toxicitási és farmakokinetikai vizsgálatokban fontos, amelyeket a humanizált BR55-2 mAb passzív immunterápiára való felhasználása végett preklinikai tanulmányok folyamán szükséges elvégezni. Az ELISA-rendszer leírását a 20. példa tartalmazza. Egy tipikus standard görbét - humán szérumban mutat be a 36. ábra.
A BR55-2 változatai kötési helyének anti-id BR55-2 mAb-ek által történő felismerését úgy is bemutattuk, hogy a BR55-2/rágcsáló-IgG3 anti-id BR55-2 E4-hez való kötődéséért a BR55-2/kiméra humán IgGl-et és a BR55-2/kiméra humán IgG3-at versenyeztettük. Mindkét kiméra kompetitíven gátolta az eredeti egér-mAb kötődését - egy állandó koncentráció mellett - anti-id BR55-2 E4-hez. E kompetitív
ELISA-vizsgálatot a 21. példa tartalmazza, az eredményeket a 37. ábra szemlélteti.
A BR55-2/rágcsáló-IgG3-nak az antigén pozitív tumorsejtvonalhoz való kötődése az előfeltétele a komplement-közvetített sejtpusztulásnak. Tehát az anti-id BR55-2 mAb-ek által kifejtett tumorcitotoxicitás gátlása abban tükröződik, hogy képesek a sejt felületén blokkolni az Abl kötődését antigénjéhez. Az SKBR5 humán mellkarcinómasejtekkel szembeni, BR55-2/rágcsáló-IgG3 által közvetített komplementfiiggő citotoxicitás anti-id BR55-2 E4-gyel való hatásos neutralizálását a 38. ábrán mutatjuk be. A kísérlet részleteit a 22. példa tartalmazza.
A BR55-2 ép kötőszakaszát tartalmazó szerkezetek igen specifikus felismerhetőségének köszönhető, hogy a BR55-2 mAb-eket felhasználhatjuk minden BR55-2 variáns egylépéses immunaffinitás-tisztítási eljárásában. Az anti-id BR55-2 E4-et CH-Sepharose 4B-hez kötjük. Ezt az immunaffinitás anyagot felhasználhatjuk például az in vitro tenyésztett BR55-2/kiméra humán IgGl végleges tisztítására. A kapott kiméra mAb-kihozatala 75%-os, tisztasága >95%. A sokkal nagyobb szelektivitás következtében ez az immunaffinitásos tisztítási módszer felülmúlja a Protein A-val végzett affinitástisztítási módszert. A kísérlet részletezését illetően lásd a 23. példát. Az SDS-PAGE képe a 39. ábrán látható. Szennyezés nem volt kimutatható. Ugyanez a módszer eredményesen alkalmazható hasonló eredményekkel egy CDR-beültetésekkel kapott humanizált BR55-2 variáns sejttenyészet felülúszóinak nagyon hatékony egylépéses tisztításához.
Összefoglalva a fentieket, nyulak és rhesusmajmok immunizálása BR55-2 specificitású antitestek idiotípusa (anti-id BR55-2 E4) elleni egér monoklonális anti-idiotípus IgGl antitesttel, magas titerű immunválaszt vált ki, amely specifikusan kötődik Lewis Y pozitív humán tumorsejtekhez. Rhesusmajmokkal végzett kísérletekkel igazoltuk, hogy ismételt emlékeztető immunizáló oltásokkal az antitumor-immunitást évekig fenntartottuk. Humán effektor sejtek jelenlétében az ezen immunizáló oltások révén keletkező lg tumorcitotoxicitást fejt ki ADCC-ben. Az antitumor-immunizálás specificitását úgy bizonyítottuk, hogy rhesusmajmok egy kontrollcsoportját aspecifikus egér-IgGl-gyel immunizáltuk. Az aspecifikus egér-IgGl elleni lényegi immunválaszon kívül semmiféle tumorsejthez való specifikus kötődés nem volt kimutatható.
Ezek az eredmények bizonyítják, hogy az anti-id BR55-2 mAb-ek, mint Lewis Y tumorral társult antigén helyettesítő Ab-k, terápiás és profilaktikus aktív immunizálásra használhatók azzal a céllal, hogy emberben protektív antitumorimmunitást indukáljanak.
Továbbá rhesusmajmok immunizálása anti-id BR55-2 mAb-bel magas titetű immunválaszt váltott ki, amely HIV-fertőzésre pozitív sejtekhez is szelektíven kötődött. Ismeretes, hogy ezek a sejtek Lewis Y-t fejeznek ki. Ezzel ellentétben a rhesusmajmok aspecifikus egér-IgGl-gyel való immunizálása semmilyen kötő8
HU 219 055 Β dést nem eredményezett sem HIV-pozitív, sem negatív sejtekhez.
Ezek az eredmények világosan igazolják, hogy a Lewis Y szénhidrátantigént helyettesítő BR55-2 mAbek használata terápiás és profilaktikus vakcinálás céljára emberben a HÍV- és a HIV-fertőzés okozta betegségek ellen protektív immunitást indukál.
Az anti-id BR55-2 mAb-eknek, mint profilaktikus és terápiás vakcináknak a használata mellett, ezen belső képmás-anti-id mAb-ek hasznos reagensei a BR55-2 specificitású molekulák - beleértve a kimerizált és humanizált variánsokat is - szelektív és mennyiségi meghatározásának szérumban és más testfolyadékokban. A megfelelő mátrixhoz kovalens kötéssel kötött anti-id mAb-eket fel lehet használni minden BR55-2 specificitású molekula szelektív, egylépéses immunaffinitás-tisztításához, magas kitermeléssel.
A találmányt az alábbi példákkal szemléltetjük. A példákkal nem óhajtjuk korlátozni a találmány oltalmi körét.
A rövidítések jelentése a következő:
ADCC: antitestfuggő celluláris citotoxicitás (antibody dependent cellular cytotoxicity)
BSA: marha-szérumalbumin (bovine serumalbumin)
CDC: komplementfuggő citotoxicitás (complement dependent cytotoxicity)
DMEM: Dulbecco által módosított Eagle-táptalaj (Dulbecco modified Eagle Médium)
EDC: N-etil-N’-[3-(dimetil-amino)-propil]- karbodiimid-hidroklorid
ELISA: enzim-immunassay (enzyme-linked immunosorbent assay)
FCS: fetális borjúszérum (fetal calf serum)
HBS: HEPES-pufferrel pufferolt konyhasóoldat (HEPES-buffered saline)
mAb: monoklonális antitest
TEA: trietanol-amin
NHS: N-hidroxi-szukcinimid
PBMC: perifériás vér mononukleáris sejt (peripheral blood mononuclear cell)
PBS: foszfáttal pufferolt konyhasóoldat (phosphate-buffered saline)
RAM-IgGl: : nyúl-antiegér-IgGl immunglobulin (rabbit anti-mouse IgGl immunoglobulin)
RPMI: Roswell Park Memóriái Institute
SDS: nátrium-dodecil-szulfát (sodium dodecyl sulfate)
KLH: csigahemocianin (Keyhole Limpet Hemocyanin)
SPDP: N-szukcinimidil-3-(2-piridil-ditio-propio- nát)
PAGE: poliakrilamid-gélelektroforézis
IEF: izoelektromos fokuszálás
PEG: poli(etilénglikol)
FITC: fluoreszcein-izotiocianát
IFA: immunfluoreszcenciás vizsgálat (immunfluorescence assay)
A példákban ismertetett anyagok a következők: Mikrotitrálólemezek: Immunoplates II (NUNC)
Sejtvonalak:
SKBR5: humán mellkarcinóma-sejtvonal
CATO: humán gyomorkarcinóma-sejtvonal
SW948: humán vastagbélkarcinóma-sejtvonal
SW2: humán kissejtes tüdőkarcinóma-sejtvonal
WM9: humán melanóma-sejtvonal
PÁLL: humán T -sejtvonal
SP2: egérmielóma-sejtvonal
A táptalaj: RPMI 1640 + 2 g/1 nátrium-hidrogén karbonát
100 E/ml penicillin G
100 pg/ml sztreptomicin-szulfát mM glutamin
10% FCS (hővel inaktivált, γ-globulinmentes)
Btáptalaj: RPMI 1640 + 2 g/1 nátrium-hidrogénkarbonát
100 E/ml penicillin G
100 pg/ml sztreptomicin-szulfát mM glutamin
5% FCS (hővel inaktivált)
C táptalaj: DNEM
10% NCTC (szintetikus táptalaj, GIBCO) 1% MÉM nem esszenciális aminosavak (GIBCO)
0,5% nátrium-piruvát 0,5% oxál-ecetsav (Sigma)
20% FCS (hővel inaktivált) mM glutamin
100 E/ml penicillin G
100 pg/ml sztreptomicin-szulfát
D táptalaj: C táptalaj + 1,36 mg/l hipoxantin 0,39 mg/l timidin
E táptalaj: D táptalaj + 0,4 mg/l aminopterin F táptalaj: C táptalaj + egértimociták (egy Balb/c egér timocitái 25 ml C táptalajban reszuszpendálva)
G táptalaj: DNEM
10% FCS (hővel inaktivált) mM glutamin
100 E/ml penicillin G
100 pg/ml sztreptomicin-szulfát
H táptalaj: 10 mM N-(2-hidroxi-etil)-piperazin-N’2-etánszulfonsav
3.4 mM etilén-dinitrilo-tetraecetsav 0,15 M nátrium-klorid
0,005% P20 (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Svédország)
PEG: 1 g polietilénglikol (molekulatömeg=3400) ml DMEM-ben feloldva
Deficiens PBS: 138,0 mM nátrium-klorid
1.5 mM kálium-hidroxid 2,7 mM kálium-klorid
6.5 mM dinátrium-hidrogén-foszfát pH=7,2
Pufferfedéshez: 15 mM nátrium-karbonát mM nátrium-hidrogén-karbonát 3 mM nátrium-azid pH=9,6
HU 219 055 Β
Pufferfestéshez: 24,3 mM citromsav
51,4 mM dinátrium-hidrogén-foszfát pH=5,0
Puffermosáshoz: 2% nátrium-klorid 0,2% Triton X-100 deficiens PBS-ben
Szubsztrátumoldat: 40 mg o-fenilén-diamin-dihidroklorid
100 ml festéshez való puffer 20 μΐ 30%-os hidrogén-peroxid
Pufferkötéshez: 0,1 M trisz/HCl 0,2 M nátrium-klorid pH=7,5
Pufferkioldáshoz: 0,15 M glicin/HCl 0,2 M nátrium-klorid pH=2,8
Pufferkonjugáláshoz: 0,1 nátrium-hidrogén-karbonát 0,5 M nátrium-klorid pH=8,0
1. példa
Anti-id BR55-2 mAb-ek előállítása
1.1. Egerek immunizálása
Balb/c egereket immunizálunk 100-100 pg
BR55-2/egér-IgG3 F(ab’)2 fragmentummal, melyet SPDP-n keresztül KLH-val konjugáltunk J. Carlsson és munkatársai szerint [Biochem. J., 173, 723 (1978)]. Az immunizálást intraperitoneális oltásokkal végezzük a következő séma szerint:
0. nap: 100 pg konjugátum (1 mg/ml def.PBSben) + 100 pg komplett Freund-adjuváns
7. és 28. nap: 100 pg konjugátum (1 mg/ml def.PBSben) + 100 pg inkomplett Freund-adjuváns
Az első immunizáló oltás után a 8., 9., 10. és 11. napon összesen 4 reakciófokozó (boost) intravénás (iv.) injekciót (injekciónként 100 pg konjugátum 100 pl def.PBS-ben) adunk. A 12. napon a lépeket aszeptikusán kivesszük, def.PBS-ben szuszpendáljuk, és háromszor mossuk def.PBS-ben.
1.2. Hibridizálás
A lépsejteket SP2/0 sejtszuszpenzióhoz adjuk
1:1 arányban, és 900 g mellett 5 percig centrifugáljuk. A sejtüledékhez cseppenként 1 ml PEG-oldatot (37 °C) adunk 1 percen belül, és a következő 1 percen belül 1 ml def.PBS-sel hígítjuk. Enyhe forgatással való rázás közben 10 ml C táptalajt adunk hozzá, és a szuszpenziót 50 ml-re hígítjuk def.PBS-sel. A szuszpenziót 800 g mellett 5 percig centrifugáljuk, az üledéket D táptalajban reszuszpendáljuk, és a sejteket mikrotitrálólemez (NUNC 96) tartályaiba visszük át, 2,5 χ 105 sejt/tartály koncentráció mellett. A lemezt egy éjszakán át 37 °C-on 5% szén-dioxid mellett inkubáljuk, majd 100 μΐ E táptalajt adunk a tartályokhoz. Ezután 72 óra múlva és minden negyedik napon a táptalajt D táptalajjal cseréljük ki.
2. példa
Egér-IgG mennyiségi meghatározása hibridóma-felülúszókban
Nyúl-antiegér-IgG-ből (ilyen a Nordic-féle reagens; 1:1000 hígítás fedéshez való pufferben) 100-100 μΐeket mérünk mikrotitrálólemezek tartályaiba, és a lemezeket 37 °C-on, 60 percig inkubáljuk. A lemezeket hatszor mossuk mosópufferrel, hozzáadunk 200 μΐ def.PBS/5% FCS-oldatot, és 30 percig 37 °C-on inkubáljuk. A lemezeket úgy mossuk, mint fent leírtuk. A két hétig tartó tenyésztés után kapott hibridóma-felülúszókból 100-100 μΐ-eket adunk a lemezekhez, majd 60 percig 37 °C-on inkubálunk. A kötetlen antitesteket - mint fent - kimossuk, és peroxidázzal konjugált antitestből (nyúl-antiegér-IgG/peroxidáz; ilyenek a Dianova-reagensek; 1:1000 hígítás PBS/2% FCS-oldattal) 100-100 μΐ-eket adunk a lemezekhez. Harminc perces 37 °C-on való inkubálás után a lemezeket négyszer mossuk mosópufferrel és kétszer festéshez való pufferrel. A szubsztrátumoldatból 100-100 μΐ-eket adunk a lemezekhez, majd a szín kifejlesztését 5 perc múlva 50 μΐ 2M kénsav aliquot mennyiségeinek hozzáadásával állítjuk le. Az extinkciót fotométeren 492 nm-en olvassuk le (referenciamérés 620 nm-en).
3. példa
A hibridóma-felülúszó IgG specifikus kötődése
BR55-2 F(ab’)2 fragmentumhoz (ELISA)
A kielégítő mennyiségben egér-IgG-t termelő (azaz a táptalajvakpróbához képest 10-szer magasabb optikai sűrűséget produkáló) hibridómákat F táptalajban egysejttenyészetekbe szubklónozzuk, majd további 2 héten át C táptalajban tenyésztjük. A felülúszókat a 2. példában leírtak szerint teszteljük, BR55-2 F(ab’)2 fragmentum 100 μΐ aliquot mennyiségeinek használatával (10 pg/ml; fedéshez szolgáló pufferrel hígítva).
4. példa
A BR55-2/rágcsáló-IgG2a SKBR5 humán mellkarcinómasejtekhez való kötődésének gátlása hibridóma-felülúszó IgG-vel (sejt-ELISA)
A fent leírt vizsgálat szerint pozitív felülúszókat a következőképpen teszteljük.
A mikrotitrálólemezeket poli-L-lizin-hidrobromiddal előkezeljük (20-30 ki); 20 pg/ml def.PBSben; 100 μΐ/tartály; 30 perc, szobahőmérséklet), kétszer mossuk def.PBS-sel (200 μΐ/tartály), és ezután egy éjszakán át 50 μΐ/tartály B táptalajjal készített SKBR5 sejtszuszpenzióval (4xl06 sejt/ml) 4 °C-on inkubáljuk. A felülúszók eltávolítása után a sejteket tartályonként 50 pl glutáraldehiddel (0,1% fiziológiás konyhasóoldatban) 5 percig szobahőmérsékleten fixáljuk, a felülúszókat eltávolítjuk, a sejteket tartályonként 200 pl def.PBS/1% BSA/1% NaN3-oldatban reszuszpendáljuk, és 1 órán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk. A felülúszókat eltávolítjuk, és a lemezeket kétszer mossuk 200 μΐ/tartály 0,05% Tween 20 tartalmú PBS-sel.
A hibridóma-felülúszókat, amelyeket 1 pg/ml egérIgG-tartalomra állítottunk be, 30 percig 37 °C-on aspecifikus egér-IgG 10-szeres feleslegével előinkubáljuk. Ezeket a mintákat ezután 0,5 pg/ml BR55-2/rágcsálóIgG2a-val 30 percig 37 °C-on előinkubáljuk. Ebből a
HU 219 055 Β keverékből 100 μΐ-t adunk a sejtekhez, és a lemezeket 1 órán át 37 °C-on inkubáljuk.
A keverék feldolgozása: a kötetlen antitesteket tartályonként 100 μΐ 0,05% Tween 20 tartalmú jéghideg PBS-sel kétszer kimossuk. A peroxidázzal konjugált antitestekből (nyúl-antiegér-IgG2a/peroxidáz; ilyenek a Zymed-reagensek; 1:1000 hígításban def.PBS/2% FCS-ben) 100-100 μΐ-eket adunk hozzá. Miután a lemezeket 45 percig 37 °C-on inkubáltuk, a tartályokat háromszor mossuk a fent említett PBS/Tween 20 oldattal, majd minden tartályba 100 μΐ szubsztrátumoldatot mérünk be. Öt perc múlva a szín kifejlesztését tartályonként 50 μΐ 2M kénsavoldat hozzáadásával állítjuk le. Az antitest kötődését a sejtekhez a 492 nm-en leolvasott extinkcióból határozzuk meg (referenciamérés 620 nm-en).
5. példa
Anti-id BR55-2 mAb-ek immunaffinitás-tisztítása
5.1. BR55-2/rágcsáló-IgG2a - Sepharose készítése g liofilizált, aktivált CH-Sepharose 4B-t szuszpendálunk 1 mM sósavban, a szuszpenziót zsugorított üvegszűrőre visszük át, ahol 2 liter 1 mM sósavval mossuk 15 percig. A ligandumot (120 mg BR55-2/rágcsáló-IgG2a) üvegdugós lombikban, 50 ml konjugáláshoz való pufferben oldjuk fel, majd összekeverjük a mosott géllel, és egy órán át szobahőmérsékleten forgatással keveijük. Az affinitásadszorbenst ezután három ciklusban, váltakozó pH-η mossuk. Minden mosási ciklusban egy pH 4-en való mosást (0,1 M acetát; 0,5 M nátrium-klorid) és egy pH 8-on való mosást (0,1 M trisz; 0,5 M nátrium-klorid) végzünk.
5.2. Anti-id BR55-2 mAb-ek izolálása
A kromatografálást 4 °C-on végezzük. Az oszlopot (BIO REX MP oszlop; átmérő: 1,5 cm) megtöltjük a BR55-2/rágcsáló-IgG2a mAb-Sepharose adszorbenssel (35 ml). A gélt a kötéshez való pufferrel és a kioldópufferrel mossuk. A kötéshez szolgáló pufferrel kiegyensúlyozott oszlopra 15 ml/perc átfolyási sebességgel rávisszük az anti-id BR55-2-t tartalmazó kondicionált táptalajt. Az átfolyó frakció kioldása után a kötött anti-id BR55-2-t eluálópufferrel deszorbeáljuk, és a deszorpció után azonnal semlegesítjük 1 M trisz/HCl pufferrel (pH=7,5).
5.3. Anti-id BR55-2 mAb-ek koncentrálása.
Az eluált antitestoldat (0,12 mg/ml) koncentrálását keverós Amicon ultraszűrő cellában végezzük PM10 Diaflo membránt használva. Az oldott IgG több mint 98%-át nyertük vissza, az IgG végső koncentrációja 3,7 mg/ml.
6. példa
Tisztított anti-id BR55-2 mAb-ek vizsgálata
6.1. Ioncserés kromatográfia Mono-Q oszlopon Oszlop: Mono-Q HR5/5 (Pharmacia)
A puffer: 20 mM trietanolamin; pH=7,7
B puffer: 20 mM trietanolamin, 1 M NaCl; pH=7,7 Átfolyási sebesség: 1 ml/perc
Észlelés: UV 280 nm
Gradiens: lineáris, 2%/perc
Eredmények: mindegyik anti-id BR55-2 mAb-nél a kapott tisztaság >95%.
6.2. Nagy teljesítményű méretkizárásos kromatográfia
Oszlop: Zorbax GF250, 9,4 χ 250 mm
Puffer: 0,1 M nátrium-foszfát, 0,2 M NaCl;
pH=7,0
Átfolyási sebesség: 1 ml/perc
Észlelés: UV 280 nm
Eredmények: mindegyik anti-id BR55-2 mAb-nél a kapott tisztaság >95%.
6.3. SDS-PAGE
A kísérleteket Laemmli módszere szerint mind redukáló, mind nem redukáló körülmények között elvégeztük, 10% akrilamidgélek használatával. Szennyezést nem észleltünk (az eredményeket az 1. ábra mutatja be).
6.4. Izoelektromos fokuszálás.
Az analíziseket Phast-rendszerrel (Pharmacia) végeztük el, 3-9 pH-gradienst (Phast-gél IEF 3-9) és ezüst festést alkalmaztunk (az eredményeket a 2. ábra mutatja be).
7. példa
A BR55-2/rágcsáló-IgG3 kötődése SKBR5 sejtvonalhoz (sejt-ELISA) - Anti-id mAb-ekkel való gátlás
A mikrotitrálólemezek előkezelését a 4. példában leírt módon végezzük el. A szóban forgó anti-id BR55-2 mAb-et 2% FCS-tartalmú def.PBS-ben hígítjuk (10-0,05 pg/ml-re). Mindegyik hígításhoz 1 pg/ml BR55-2/rágcsáló-IgG3-at adunk. E keverékekből 100 μΐ-t adunk a sejtekhez, és a lemezeket ezután 1 órán át 37 °C-on inkubáljuk. A keverékeket úgy dolgozzuk fel, ahogyan ezt a 4. példában leírtuk. A BR55-2/rágcsáló-IgG3 sejtekhez való kötődésének mértékét a 492 nm-en mért extinkció mérésével határozzuk meg.
8. példa
Nyulak és rhesusmajmok immunizálása anti-id
BR55-2 E4-gyel
8.1. Nyulak immunizálása anti-id BR55-2 E4-gyel
Három nőstény csincsillanyulat immunizáltunk
300 pg alumínium-hidroxidra adszorbeált anti-id BR55-2 E4-gyel (1 mg antitest plusz 3,3 mg Al(OH)3/ml def.PBS). A nyulak az 1., 8., 15. és 36. napon kapták az injekciókat intradermálisan. Három nyulat ugyanilyen mennyiségű aspecifikus egér-IgGl-gyel immunizáltunk negatív kontroll gyanánt, azonos feltételek mellett. Szérummintát vettünk az immunizálás előtt és az első oltás utáni 9. héten.
8.2. Rhesusmajmok immunizálása anti-id BR55-2 E4gyel
Három rhesusmajmot immunizáltunk 0,1 mg/kg alumínium-hidroxidra adszorbeált anti-id BR55-2 E4gyel [1 mg antitest plusz 3,3 mg Al(0H)3/ml def.PBS]. A majmok az L, 8., 15. és 36. napon kapták az injekciókat szubkután (se.). Két rhesusmajmot ugyanilyen mennyiségű aspecifikus egér-IgGl-gyel immunizáltunk negatív kontroll gyanánt, azonos feltételek mellett. Az immunizálás előtt és az első oltás utáni 4. és 9. héten szérummintákat vettünk.
HU 219 055 Β
A kezdő immunizálási menet után két évvel ugyanezek a majmok egy első emlékeztető oltást kaptak se. anti-id BR55-2 E4-gyel, illetve aspecifikus egér-IgGlgyel (azonos mennyiséggel és összetételben, mint fent). Szérummintákat vettünk az oltás előtt és ezen első emlékeztető oltás utáni 1. és 4. héten.
Három évvel a kezdő immunizálási menet után (= egy évvel az első emlékeztető injekció után) ugyanezek a majmok egy második emlékeztető oltást kaptak se. anti-id BR55-2 E4-gyel, illetve aspecifikus egérIgGl-gyel (azonos mennyiséggel és összetételben, mint fent). Szérummintákat vettünk ezen második emlékeztető oltás előtt és 1, 4 és 9 héttel ez után.
9. példa
A nyúlszérum-Ig kötődése SKBR5 vagy WM9 sejtvonalhoz (sejt-ELISA)
A mikrotitrálólemezek előkezelését úgy végezzük, mint ahogy a 4. példában leírtuk. A megfelelően előzőleg felhígított nyúlszérumokból 100-100 μΐ-eket adunk a sejtekhez, és a lemezeket 1 órán át 37 °C-on inkubáljuk. Az antitest kötődését a sejtekhez a 492 nm-en mért (referenciamérés 620 nm-en) extinkció mérésével határozzuk meg.
10. példa
A rhesusmajomszérum-Ig vagy immunaffinitással tisztított lg (Ab3) kötődése SK.BR5, CATO, SW948, SW2 és WM9 humán tumorsejtvonalakhoz (sejt-ELISA)
A mikrotitrálólemezek előkezelését a 4. példában leírtak szerint végezzük. A megfelelően hígított rhesusmajomszérum-Ig vagy immunaffinitással tisztított lg (lásd a 12. példát is) és kontrollként a BR55-2 humanizált IgGl 100-100 μΐ-eit hozzáadjuk a sejtekhez, és a lemezeket 1 órán át 37 °C-on inkubáljuk. A keveréket a továbbiakban úgy kezeljük, ahogyan a 4. példában leírtuk. Az antitest sejtekhez való kötődését a 492 nm-en (referenciamérés 620 nm-en) mért extinkció segítségével határozzuk meg.
11. példa
A rhesusmajomszérum-Ig vagy immunaffinitással tisztított lg (Ab3) kötődése egy SKBR5 vagy WM9 tumorsejtmembrán-készítményhez (ELISA) A membránkészítményeket a D. Thom és munkatársai által leírtak [Biochem, J., 168,187-194 (1977)] szerint, Lewis Y antigén pozitív SKBR5 humán mellkarcinóma-sejtvonalból és Lewis Y negatív WM9 melanóma-sejtvonalból állítjuk elő. Az illető membránkészítményből (10 pg/ml; hígítás a fedéshez való pufferrel) 100 pl aliquot mennyiségeket mérünk mikrotitrálólemezek tartályaiba, majd a lemezeket +4 °C-on egy éjszakán át inkubáljuk. A lemezeket négyszer mossuk mosópufferrel, hozzáadunk 200 pl def.PBS/5% FCS-oldatot, és 30 percig 37 °C-on inkubáljuk. A lemezeket, mint fent, mossuk. A def.PBS/2% FCS-oldattal megfelelően hígított rhesusmajomszérum-Ig vagy immunaffinitással tisztított rhesusmajomszérum-Ig (lásd a
2. példát is) 100 pl aliquot mennyiségeit bemérjük, és a lemezeket 60 percig 37 °C-on inkubáljuk. A kötetlen antitesteket kimossuk, mint fent leírtuk, majd peroxidázzal konjugált antitestoldatból (kecske-antihumán Ig/peroxidáz; ilyenek a Chemicon and Co. reagensei; 1:1000 hígítás PBS/2% FCS-ben) 100-100 μΐ-eket adunk hozzá. A lemezeket ezután 30 percig 37 °C-on inkubáljuk, kétszer mossuk mosópufferrel és kétszer a festéshez való pufferrel.
A szubsztrátumoldatból 100 μΐ-eket mérünk a tartályokba, majd a szín kifejlődését 5 perc múlva 50 μΐ 2M kénsav hozzáadásával állítjuk le. Az optikai sűrűséget (OD) 492 nm-en mérjük (referenciamérés 620 nm-en).
12. példa
Anti-id BR55-2 E4-gyel (Ab3) immunizált rhesusmajmok szérum-Ig-jának immunaffinitás-tisztítása anti-id BR55-2 E4 - Sepharose alkalmazásával
12.1. Anti-id BR55-2 E4 - Sepharose készítése
Liofilizált, aktivált CH-Sepharose 4B 9 g-ját 1 mM sósavban szuszpendáljuk, rávisszük zsugorított üvegszűrőkre, 2 liter 1 mM sósavval mossuk 15 percig. A ligandumot (95 mg anti-id BR55-2 E4) 50 ml konjugálópufferben oldjuk, és hozzákeverjük a mosott gélhez egy üvegdugós lombikban, majd forgatással keverjük egy órán át szobahőmérsékleten. A gélt a konjugálópufferrel mossuk, és egy órán át 50 ml 1 M etanolaminban inkubáljuk a visszamaradt aktív csoportok blokkolása céljából. Az affinitásadszorbenst ezután három ciklusban, váltakozó pH-η mossuk. Mindegyik ciklus egy pH 4-en való mosásból (0,1 M acetát, 0,5 M nátriumklorid) és egy ezt követő pH 8-on való mosásból (0,1 M trisz, 0,5 M nátrium-klorid) áll.
12.2. Anti-id BR55-2 E4-gyel immunizált rhesusmajomszérum-Ig (Ab3) izolálása
A kromatografálást 4 °C-on végezzük. Az oszlopot (Pharmacia HR 5/2 oszlop; ágyméret: 5 x25 mm) megtöltjük anti-id BR55-2 E4 - Sepharose géllel (mennyisége : 0,5 ml). A gélt a kötéshez való pufferrel és az elúciós pufferrel mossuk. Kiindulási anyag: anti-id BR55-2 E4-gyel immunizált rhesusmajmokból az immunizálás elkezdése utáni 9. héten vett szérumminta 2 ml-e. Egy másik kísérletsorozatban egy anti-id BR55-2 E4-gyel immunizált majomból a második emlékeztető oltás után a 4. és 9. héten vett szérumok keverékéből is 2 ml-t használtunk. Az illető szérumot 1:2 arányban hígítjuk a kötéshez való pufferben, és felvisszük az oszlopra. Az átfolyó frakciók kioldása után a megkötött rhesusmajom-immunglobulint a kioldópufferrel deszorbeáljuk, és a deszorpció után azonnal semlegesítjük 1 M trisz/HCl pufferrel (pH=7,5).
13. példa
Anti-id BR55-2 E4-gyel vagy aspecifikus egérIgGl-gyel immunizált rhesusmajmokból származó szérum-Ig vagy immunaffinitással tisztított lg kötődése anti-id BR55-2 E4-hez (ELISA) Mikrotitrálólemezek tartályaiba bemérünk anti-id
BR55-2 E4-ből (10 pg/ml; hígítás fedéshez szolgáló pufferben) 100 μΐ-eket, és a lemezeket 60 percig inkubáljuk 37 °C-on. A lemezeket hatszor mossuk mosó12
HU 219 055 Β pufferrel, hozzáadunk 200 μΐ def.PBS/5% FCS-oldatot, és 30 percig 37 °C-on inkubáljuk. A lemezeket mossuk, mint fent. A majomszérumokat vagy az immunaffinitással tisztított majom-Ig-t def.PBS/2% FCS-oldattal hígítjuk. Ezekből a mintákból 100 μΐ aliquot mennyiségeket adunk a mikrotitrálólemezek tartályaihoz, és 60 percig inkubáljuk 37 °C-on. A kötetlen antitesteket kimossuk, mint fent, és hozzáadunk 100 μΐ peroxidázzal konjugált antitestoldatot (kecske-antihumán Ig/peroxidáz; ilyenek a Chemicon and Co. reagensei, 1:1000 arányban PBS/2% FCS-sel hígítva). A lemezeket 30 percig 37 °C-on inkubáljuk, majd négyszer mossuk mosópufferrel és kétszer festéshez való pufferrel. Ezután hozzáadunk 100-100 μΐ-eket a szubsztrátumoldatból, és a szín kifejlődését 5 perc múlva 50 μΐ 2 M kénsavval állítjuk le. Az optikai sűrűséget (OD) 492 nm-en méljük (referenciamérés 620 nm-en).
14. példa
Immunaffinitással tisztított majom-Ig (Ab3) vagy
BR55-2/rágcsáló-IgG3 által közvetített, SK.BR5 sejtekkel szemben megnyilvánuló antitestfüggő celluláris citotoxicitás (ADCC) vizsgálata humán PBMC használatával
A vizsgálatot megelőző napon az SKBR5 sejteket átvisszük friss A táptalajba, és 37 °C-on 5% széndioxid mellett tartjuk sejttenyésztő palackban.
A célsejtek jelzése 51Cr-rel
A sejteket összegyűjtjük a sejttenyésztő palackból, és 800 μΐ A táptalajban 5xlO5 sejt koncentrációban 37 °C/5% CO2 mellett egy órán át inkubáljuk 100 pCi Na251CrO4-gyel. A sejteket ezután A táptalajjal mossuk az 51Cr feleslegének eltávolítása céljából, majd friss A táptalajban reszuszpendáljuk, és koncentrációját
2,5 χ 105 sejt/ml-re állítjuk be.
PBMC izolálása ml heparinozott friss humán vért 60 ml 0,1% glükózt tartalmazó teljes PBS-sel hígítunk. Az oldatból 15 ml aliquot mennyiségeket 15 ml Ficoll-Paque-oldat fölé rétegezünk, és a csöveket 400 g mellett 30-60 percig centrifugáljuk. A felülúszó plazmát eldobjuk, a PBMC-rétegeket összegyűjtjük, és 50 ml 0,1% glükóztartalmú teljes PBS-sel hígítjuk. Centrifügálás (körülbelül 80 g; 10 perc) után az üledéket 25-30 ml 0,1% glükóztartalmú teljes PBS-ben reszuszpendáljuk, és újból centrifugálunk (80 g, 10 perc). Az üledéket összegyűjtjük, A táptalajban szuszpendáljuk, a sejteket megszámoljuk, és a szuszpenziót úgy hígítjuk A táptalajjal, hogy körülbelül 2χ 106-9x 106 sejt/ml sűrűséget kapjunk. A sejtszuszpenzióból 100 μΐ-eket pipettázunk egy mikrotitrálólemez tartályaiba, és az effektor sejteket egy éjszakán át 37 °C/5% CO2 mellett inkubáljuk.
ADCC
Az előinkubált effektor sejtekhez hozzáadunk 100100 μΐ 51Cr-jelzett célsejtet, figyelembe véve az effektor sejtek kívánt arányát a célsejtekhez viszonyítva. Az immunaffinitással tisztított majom-Ig vagy a BR55-2/egér-IgG3 def.PBS-oldattal a kívánt koncentrációra hígított oldataiból 50 μΐ-t adunk a lemezekhez, amelyeket egy éjszakán át (körülbelül 18 óra) 37 °C/5% CO2 mellett inkubálunk. A felülúszókat ezután Skatron-Harvesting Press készülékkel aratjuk le, és gamma-számlálóban számláljuk. Ez adja a kísérleti kibocsátás értékét. Az összes 51Cr-kibocsátást úgy határozzuk meg, mint fent, helyettesítvén a PBMC-t 100 μΐ 2%-os SDS, 50 mM dinátrium-hidrogén-karbonát és 10 mM EDTA tartalmú oldattal, és helyettesítvén az antitestoldatot 50 μΐ def.PBS-oldattal. A spontán 51Cr-kibocsátást úgy kapjuk, hogy a PBMC-t 100 μΐ A táptalajjal és az antitestoldatot 50 μΐ def.PBS-oldattal helyettesítjük.
Számlálás után az eredményeket a következőképpen számítjuk ki:
kísérleti kibocsátás-spontán kibocsátás Lízis%=-χ 100 összkibocsátás-spontán kibocsátás
15. példa
Rhesusmajomszérumok immunaffinitással tisztított rhesusmajom-Ig vagy BR55-2/rágcsáló-IgG3 kötődése HIV-fertőzött/nem fertőzött PALL-sejtekhez (indirekt immunfluoreszcencia, IFA-Anti-HIVl-Kit Waldheim)
Egy kereskedelemben kapható kittel (Waldheim and Co.; HIV-szeropozitivitás meghatározása céljára beszerezve) végzett vizsgálatban HIV-fertőzött és nem fertőzött PALL-sejteket (humán T-sejtvonal) fixálunk tárgylemezen. A kísérleti eljárás elvben a gyártó cég útmutatóján alapul. A lemezeket 1% BSA-val inkubáljuk 30 percig 37 °C-on, majd rhesusmajomszérummal (koncentráltan és def.PBS-oldattal 1:10 arányban hígítva) vagy normál humán szérummal hígított, immunaffínitással tisztított rhesusmajom-Ig-nal (Ab3) 1 órán át 37 °C-on inkubáljuk. A HIV-pozitív humán szérum (a tesztkit részét képezi) pozitív kontrollként szolgál, a normál humán szérum negatív kontrollként. A vizsgálandó minták kötetlen determinánsait kimossuk def.PBS-sel való háromszori mosással, majd hozzáadjuk az antihumán IgG-FITC reagenst (a tesztkit része), 2% FCS-t tartalmazó def.PBS-oldattal 1:20 arányban hígítva, vagy az antiegér-IgG-FITC reagenst (az egér-mAb kimutatására). A lemezeket 30 percig 37 °C-on inkubáljuk, háromszor mossuk def.PBS-sel, és beágyazván a lemezeket, az immunfluoreszcenciát fluoreszcencia-mikroszkóp alatt figyeljük, és osztályozzuk (0=nincs fluoreszcencia; 5=maximális fluoreszcencia).
16. példa
Immunreaktív BR55-2/rágcsáló-IgG3 vagy
BR55-2/rágcsáló-IgG2a humán szérumban való meghatározására szolgáló ELISA, anti-id BR55-2 E4 használatával
Mikrotitrálólemezek tartályaiba bemérünk 100100 μΐ anti-id BR55-2 E4-et (10 pg/ml; hígítva fedéshez való pufferrel), és a lemezeket 60 percig 37 °C-on inkubáljuk.
A lemezeket hatszor mossuk mosópufferrel, ezután 200 μΐ def.PBS/5% FCS-oldatot mérünk be, majd
HU 219 055 Β percig 37 °C-on inkubáljuk. A lemezeket, mint fent, mossuk. A BR55-2/rágcsáló-IgG3 vagy BR55-2/rágcsáló-IgG2a tartalmú humán szérumok def.PBS/2% FCS-oldattal végzett megfelelő hígításait teszteljük. Ezekből a mintákból 100 μΐ-eket mérünk a mikrotitrálólemezek tartályaiba, és a lemezeket 60 percig 37 °C-on inkubáljuk. Standardként a BR55-2/egér-IgG3-at vagy BR55-2/egér-IgG2a-t normál humán szérummal előzőleg úgy hígítjuk, hogy koncentrációjuk 10 pl/ml legyen. A megfelelő hígításokat def.PBS/2% FCS-oldattal végezzük, és úgy kezeljük, mint fent. A kötetlen antitestet kimossuk, mint fent leírtuk, és 100 μΐ-eket mérünk be peroxidázzal konjugált antitestből (nyúl-antiegér-IgG3/peroxidáz vagy nyúl-antiegér-IgG2a/peroxidáz; mint a Zymed-reagensek, 1:1000 hígításban PBS/2% FCS-oldatban). A lemezeket 30 percig 37 °Con inkubáljuk, négyszer mossuk mosópufferrel és kétszer festéshez szolgáló pufferrel.
A szubsztrátumoldatból 100 μΐ-eket adunk a lemezekhez, és a szín kifejlődését 5 perc múlva 50 pl 2 M kénsavval állítjuk le. Az optikai sűrűséget (OD) 492 nm-en mérjük (referenciamérés 620 nm-en).
A szérumminták OD-értékét a standard görbéről olvassuk le, és pg/ml-ben fejezzük ki.
17. példa
Immunreaktív BR55-2/kiméra humán IgGl humán szérumban való meghatározására szolgáló ELISA, anti-id BR55-2 E4 használatával
A BR55-2/kiméra humán IgGl-et tartalmazó humán szérumokat úgy teszteljük, ahogyan a 16. példában leírtuk, peroxidázzal konjugált antitest (kecske-antihumán IgG/peroxidáz; mint a Chemicon and Co. reagensei, 1:1000 hígításban PBS/2% FCS-oldatban) használatával.
18. példa
Immunreaktív BR55-2/kiméra humán IgG3 humán szérumban való meghatározására szolgáló ELISA, anti-id BR55-2 E4 használatával
A BR55-2/kiméra humán IgG3-at tartalmazó humán szérumok tesztelését a 17. példában leírtak szerint végezzük.
19. példa
A BR55-2/kiméra humán IgGl és a BR55-2/humanizált IgGl anti-id BR55-2 mAb-ekkel végbemenő valós idejű biospecifikus reakciójának analízise
A kísérleteket BIAcore™ rendszerrel (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Svédország) végezzük. A BR55-2/kiméra humán IgGl-nek vagy a BR55-2/humanizált IgGl-nek az immobilizált RAM-IgG 1-hez kapcsolt különböző anti-id BR55-2 monoklonális egér-IgGl antitesthez való kötődését valós idejű biospecifikus reakcióanalízissel (real-time biospecific interaction analysis) határozzuk meg.
A rendszer átfolyási idejét 5 μΐ/percre állítjuk be. Egy szenzorcsipet aktiválunk 35 μΐ desztillált vízben oldott 0,201 mg NHS és 1,313 mg EDC elegyével.
RAM-IgGl-et oldunk 35 μΐ 10 mM nátrium-acetát-pufferben (pH=5,0) úgy, hogy koncentrációja 30 pg/ml legyen, majd az aktivált szenzor felületével reagáltatjuk. A fennmaradó szabad aktivált helyeket 35 μΐ 1 M etanolamin-hidroklorid/nátrium-hidroxid oldattal (pH=8,5) blokkoljuk.
A reakciót három lépésben végezzük.
1. Az illető anti-id BR55-2 mAb-et (E4, Gll, B3, B9, G6, G9) H táptalajban oldjuk úgy, hogy végső koncentrációja 10-17 pg/ml legyen. Az analízisekhez az anti-idiotípus antitestet RAM-IgG 1-hez kötjük oly módon, hogy az oldatból 35 pl-t a szenzor felületén viszünk át. A „Válasz Egységeket” (Response Units”), amelyek a megkötött anti-id BR55-2 mAb mennyiségével arányosak, feljegyezzük és tároljuk.
2. Az egér/humán kiméra IgGl és a humanizált IgGl H táptalajjal készített 1-100 pg/ml koncentrációjú hígításaiból 20 pl-eket injektálunk, és hagyjuk, hogy az immobilizált anyaghoz kapcsolt anti-id-hez kötődjék. A „Response Units” értékét, amely a megkötött mAb-bel arányos, feljegyezzük és tároljuk.
3. Ezután a következő analízishez a szenzor felületét 5 pl 1 M hangyasav és 5 pl 8 M karbamid egymást követő injektálása révén regeneráljuk.
A kötődés sebességét úgy határozzuk meg, hogy kiszámítjuk a második antitesttel (BR55-2/kiméra humán IgGl vagy BR55-2/humanizált IgGl) kapott Response Units maximumának és az első antitesttel (az illető anti-idiotípus mAb) kapott Response Units maximumának arányát.
20. példa
Immunreaktív BR55-2/humanizált IgGl meghatározása humán szérumban ELISA-módszerrel, antiid BR55-2 E4 használatával
A BR55-2/humanizált IgGl-et tartalmazó humán szérumokat úgy teszteljük, ahogyan a 17. példában leírtuk.
21. példa
A BR55-2/kiméra humán IgGl vagy BR55-2/kiméra humán IgG3 versengése BR55-2/rágcsáló-IgG3-mal az anti-id BR55-2 E4-hez való kötődésért
Anti-id BR55-2 E4-ből (10 pg/ml; hígítás fedéshez való pufferrel) 100 pl-eket mérünk mikrotitrálólemezek tartályaiba, és a lemezeket 37 °C-on 60 percig inkubáljuk.
A lemezeket hatszor mossuk mosópufferrel, hozzáadunk 200 pl def.PBS/5% FCS-oldatot, és 30 percig 37 °C-on inkubáljuk. A lemezeket, mint fent, mossuk. A kiméra humán IgGl-et vagy kiméra humán IgG3-at def.PBS/2% FCS-oldatban hígítjuk (0,5 pg/ml-től 3 ng/ml-ig). Minden hígításhoz hozzáadunk 0,05 pg/ml BR55-2/rágcsáló-IgG3-at. Ezekből a keverékekből 100 pl-eket mérünk a mikrotitrálólemezek tartályaiba, és a lemezeket 60 percig 37 °C-on inkubáljuk. A kötetlen antitestet kimossuk, mint fent, majd peroxidázzal konjugált antitestből (kecske-antihumán IgG/peroxidáz; ilyenek a Chemicon Co. reagensei 1:1000-re hígít14
HU 219 055 Β va PBS/2% FCS-oldattal) 100 μΐ-eket mérünk a tartályokba.
A lemezeket 30 percig 37 °C-on inkubáljuk, majd négyszer mossuk mosópufferrel és kétszer festéshez szolgáló pufferrel. Ezután a szubsztrátumoldatból 100 μΐ-eket adunk a tartályokhoz, és a szín kifejlődését 5 perc múlva 50 μΐ 2 M kénsav bemérésével állítjuk le. Az optikai sűrűséget 492 nm-en mérjük (referenciamérés 620 nm-en).
22. példa
BR55-2/rágcsáló-IgG3 által közvetített, SK.BR5 sejtvonallal szembeni komplementfuggő citotoxicitás (CDC) - Gátlás anti-id BR55-2 E4-gyel A vizsgálatot megelőző napon az SKBR5 sejteket friss A táptalajba visszük, és sejttenyésztő palackokban, 37 °C/5% CO2 mellett tartjuk fenn.
Célsejtek jelzése 5lCr-rel
A palackokból összegyűjtjük a sejteket, és 800 μΐ A táptalajban 5xl06 koncentráció és 37 °C/5% CO2 mellett inkubáljuk 1 órán át 100 pCi Na251Cr04-oldattal. A sejteket ezután A táptalajjal mossuk, hogy eltávolítsuk az 51Cr feleslegét, majd friss A táptalajban reszuszpendáljuk, és koncentrációját 2,5 xlO5 sejt/ml-re állítjuk be.
CDC
A célsejtekkel készült szuszpenzióból 100 μΐ-eket pipettázunk mikrotitrálólemezek tartályaiba. Ehhez hozzáadunk def.PBS-oldattal kívánt koncentrációkra hígított anti-id BR55-2 E4-ből 50 μΐ-eket. Ezután tartályonként 50 pg/ml BR55-2/IgG3 tartalmú humán szérumot mérünk be, és a sejteket egy éjszakán át 37 °C/5% CO2 mellett inkubáljuk. A felülúszókat Skatron-Harvesting Press készülékkel aratjuk le, és gamma-számlálóban számláljuk. Ez szolgáltatja a kísérleti kibocsátás értékét.
Az összes 51Cr-kibocsátás meghatározásához a sejteket úgy kezeljük, mint fent, de a humán szérumot egy 2% SDS, 50 mM nátrium-karbonát és 10 mM EDTA tartalmú oldattal helyettesítjük, az anti-id BR55-2 E4 oldatot pedig 50 μΐ def.PBS-oldattal. A spontán 51Cr-kibocsátás értékét úgy kapjuk meg, hogy a humán szérumot a táptalajjal és az anti-id BR55-2 E4 oldatot 50 μΐ def.PBS-oldattal helyettesítjük.
Számlálás után az eredményeket a következőképpen számítjuk ki:
kísérleti kibocsátás-spontán kibocsátás Lízis%=-χ 100 összkibocsátás-spontán kibocsátás
23. példa
BR55-2/kiméra humán IgGl tisztítása immunaffinitással, anti-id BR55-2 E4 - Sepharose használatával
23.1. Anti-id BR55-2 E4 - Sepharose készítése
Liofilizált, aktivált CH-Sepharose 4B 9 g-ját 1 mM sósavban szuszpendáljuk, zsugorított üvegszűrőre visszük, és 2 liter 1 mM sósavval mossuk. A ligandumot (95 mg anti-id BR55-2 E4) 50 ml konjugálópufferben oldjuk, összekeverjük a mosott géllel egy üvegdugós lombikban, amelyet szobahőmérsékleten egy órán át forgatva keverünk. A gélt a kötéshez való pufferrel mossuk, és 1 órán át 50 ml 1 M etanolaminnal inkubáljuk a maradék aktív csoportok blokkolása végett. Az affmitásadszorbenst ezután váltakozó pH-η három ciklusban mossuk. Egy-egy ciklus egy pH 4-en (0,1 M acetát, 0,5 M nátrium-klorid) és ezután egy pH 8-on (0,1 M trisz, 0,5 M nátrium-klorid) való mosásból áll.
23.2. BR55-2/kiméra humán IgGl izolálása
A kromatografálást 4 °C-on végezzük. Az oszlopot (BIO REX MP oszlop, átmérő: 1,5 cm) megtöltjük az anti-id BR55-2 E4 - Sepharose géllel (35 ml). A gélt a kötéshez és kioldáshoz szolgáló pufferrel mossuk. A kiindulási anyag 100 liter BR55-2/kiméra humán IgGl-gyei kondicionált táptalaj, amelyet 5:1 arányban bekoncentráltunk P10 porózus rostanyag patronnal ellátott Amicon DC2 koncentrálórendszerben, majd a koncentrátumot felvisszük az oszlopra. Az áttörő frakció leoldása után a megkötött BR55-2/kiméra humán IgGlet az elúciós pufferrel deszorbeáljuk, és rögtön ez után 1 M trisz/HCl pufferrel (pH=7,5) semlegesítjük.
23.3. A BR55-2/kiméra humán IgGl koncentrálása
A kioldott antitestoldat koncentrálását rázott Amicon ultraszűrő cellában, PM 10 Diaflo membrán használatával végezzük. Az oldott anyag kihozatala IgG-re nézve több mint 98%, az IgG végső koncentrációja 3,36 mg/ml volt.
23.4. A tisztított BR55-2/kiméra humán IgGl vizsgálata
23.4.1. Ioncserés kromatográfia Mono-Q oszlopon
Oszlop: Mono-Q HR5/5 (Pharmacia)
A puffer: 20 mM TE A, pH=7,7
B puffer: 20 mM TEA, 1 M NaCl; pH=7,7
Átfolyási sebesség: 1 ml/perc
Észlelés: UV 280 nm
Gradiens: lineáris, 2%/perc
Eredmény: > 95%-os tisztaság
23.4.2. Nagy teljesítményű méretkizárásos kromatográfia
Oszlop: Zorbax GF
Puffer: 0,1 M nátrium-foszfát, 0,2 M NaCl;
pH=7,0
Átfolyási sebesség: 1 ml/perc
Észlelés: UV 280 nm
Eredmény: > 95%-os tisztaság.
23.4.3. SDS-PAGE
A vizsgálatokat redukálókörülmények mellett végeztük, Laemmli módszere szerint, 10%-os akrilamidgélek használatával (az eredményeket a 10. ábra tartalmazza).
Kiindulási anyag
BR55-2 rágcsáló monoklonális antitesteket kaphatunk például BR55.2 (BR55-2/IgG3), illetve BR55.2S2a (BR-55-2/IgG2a) hibridómákból.
Ezeket a hibridómákat a Budapesti Egyezmény alapján eredetileg 1987. február 17-én, illetve 1987. március 10-én helyeztük letétbe az American Type Culture Collection intézményben (Rockville, MD., 20852, USA) ATCC HB 9324, illetve ATCC HB 9347 letéti számok alatt.
HU 219 055 Β
1. táblázat
Nyulak és rhesusmajmok immunizálása anti-id BR55-2 E4-gyel vagy aspecifikus egér-IgGl-gyel A 9. héten mért titemövekedés a natív szérumminta 1:4 hígításához viszonyítva (sejt-ELISA)
Nyúl Majom
anti-id BR55-2 egér-IgGl anti-id BR55-2 egér-IgGl
SKBR5 (Y+) 1000 16 1000 8
WM9 (Y-) 3 nincs titere 25 nincs titere
2. táblázat
Rhesusmajmok emlékeztető immunizáló oltása anti-id BR55-2 E4-gyel vagy aspecifikus egér-IgGl-gyel Majomszérum-Ig kötődése SKBR5-membránkészítményhez (ELISA), titemövekedés a natív szérum 1:4 hígításához viszonyítva
9 héttel az első menet után 2 évvel az első menet után 1 héttel az első emlékeztető oltás után 4 héttel az első emlékeztető oltás után
anti-Id BR55-2 40 1 80 50
mlgGl 1 2 nincs titere 2
3. táblázat
Rhesusmajomszérum-Ig kötődése HIV-fertőzött/nem fertőzött PALL-sejtvonalhoz (Indirekt immunfluoreszcencia; IFA-Anti-HIVl-K.it Waldheim)
Rhesusmajmok immunizálása anti-id Br55-2 E4-gyel aspecifikus egér-IgGl-gyel Humán szérum kontrollok (Kit)
PÁLL: HIV+ HÍV- HIV+ HÍV- PÁLL: HIV+ HÍV-
előzetes szérumminta HIV-negatív humán szérum
konc. 1 1 1 1 0 0
1:10 1 1 1 1
első immunizálás utáni 9. héten vett szérumminta HIV-pozitív humán szérum
konc. 3 1 1-2 1 5 0
1:10 3 1 1-2 1
0-5=fluoreszcenciaintenzitás (antihumán IgG-FITC) 0=nincs fluoreszcencia 5=maximális fluoreszcencia
4. táblázat
Anti-id BR55-2 E4 (Ab3) és BR55-2/rágcsáló-IgG3 (Abl) oszlopon tisztított rhesusmajom-Ig kötődése HIV-fertőzött/nem fertőzött PALL-sejtvonalhoz (Indirekt immunfluoreszcencia; IFA-Anti-HIVl-Kit Waldheim)
Ab3 (20 pg/ml) BR55-2 rágcsáló IgG3 (20 pg/ml) Humán szérum kontrollok (Kit)
PÁLL: HIV+ HÍV- HIV+ HÍV- PÁLL: HIV+ HÍV-
HIV-negatív humán szérum
3 0 2 0 0 0
HIV-pozitív humán szérum
5 1
0-5=fluoreszcenciaintenzitás (antihumán IgG-FITC) 0=nincs fluoreszcencia 5=maximális fluoreszcencia

Claims (9)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Anti-idiotípus antitestek, azzal jellemezve, hogy BR55-2 monoklonális antitestek (Abl) elleni monoklonális rágcsáló (murine) belső képmás-anti-idiotípus antitestek (Ab2).
  2. 2. Gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként egy, az 1. igénypont szerinti anti-idiotípus antitestet tartalmaz gyógyszerészeti szempontból elfogadható adjuvánssal, hordozóval vagy hígítóval együtt.
  3. 3. A 2. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy HIV-fertőzések elleni profilaktikus és/vagy terápiás immunizálásra szolgál.
  4. 4. A 2. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy epiteliális eredetű karcinóma elleni vagy kissejtes tüdőkarcinóma elleni immunizálásra szolgál.
  5. 5. Az 1. igénypont szerinti anti-idiotípus antitestek alkalmazása, azzal jellemezve, hogy
    a) BR55-2-kötő specificitású monoklonális antitestek, ezek származékai vagy fragmentumai mennyiségi meghatározására; vagy
    b) monoklonális BR55-2 egér/humán kimérák és teljesen humanizált BR55-2-variánsok mennyiségi meghatározására; vagy
    c) BR55-2-variánsok egylépéses immunaffinitásos tisztítására használjuk.
  6. 6. Eljárás BR55-2 monoklonális antitestek elleni monoklonális rágcsáló belső képmás-anti-idiotípus antitestek előállítására, azzal jellemezve, hogy a következő lépéseket hajtjuk végre:
    - egereket immunizálunk BR55-2/rágcsálóIgG3-F(ab’)2-KLH konjugátummal;
    - a rágcsálólépsejteket rágcsáló-SP2/O mielóma-sejtvonallal fuzionáljuk;
    - a tenyésztett hibridómasejtek közül kiválasztjuk azokat, amelyek olyan IgG-t termelnek, amelynek gátlókapacitása több mint 95% a BR55-2/rágcsáló-IgG2a SKBR5 sejtvonalhoz való kötődésének gátlása alapján meghatározva;
    - majd tisztítjuk és izoláljuk az anti-idiotípus antitesteket.
  7. 7. Eljárás gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy a 6. igénypont szerinti eljárással előállított anti-idiotípus antitesteket gyógyászatilag elfogadható adjuvánssal, hordozóval vagy hígítóval összekeverve gyógyszerkészítménnyé alakítjuk.
  8. 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy HIV-fertőzések elleni profilaktikus és/vagy terápiás immunizálásra alkalmas gyógyszerkészítményt állítunk elő.
  9. 9. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy epiteliális eredetű karcinóma elleni vagy kissejtes tüdőkarcinóma elleni immunizálásra szolgáló gyógyszerkészítményt állítunk elő.
HU9403337A 1992-05-22 1993-05-14 Monoklonális anti-idiotipus antitestek, az előállításukra szolgáló eljárás és felhasználásuk HU219055B (hu)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB929210944A GB9210944D0 (en) 1992-05-22 1992-05-22 Monoclonal antibodies and their use
GB929210930A GB9210930D0 (en) 1992-05-22 1992-05-22 Monoclonal antibodies and their use
GB929210929A GB9210929D0 (en) 1992-05-22 1992-05-22 Monoclonal antibodies and their use
PCT/EP1993/001215 WO1993024647A1 (en) 1992-05-22 1993-05-14 Anti-idiotypic monoclonal antibodies against the lewis y-specific monoclonal antibody br55-2 and their uses

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT71311A HUT71311A (en) 1995-11-28
HU219055B true HU219055B (hu) 2001-02-28

Family

ID=27266199

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9403337A HU219055B (hu) 1992-05-22 1993-05-14 Monoklonális anti-idiotipus antitestek, az előállításukra szolgáló eljárás és felhasználásuk

Country Status (20)

Country Link
EP (1) EP0644947B1 (hu)
JP (3) JPH07507207A (hu)
KR (1) KR100279317B1 (hu)
AT (1) ATE179214T1 (hu)
AU (1) AU678160B2 (hu)
CA (1) CA2134751C (hu)
CZ (1) CZ286547B6 (hu)
DE (1) DE69324584T2 (hu)
DK (1) DK0644947T3 (hu)
ES (1) ES2133395T3 (hu)
FI (1) FI111518B (hu)
GR (1) GR3030701T3 (hu)
HU (1) HU219055B (hu)
NO (1) NO316120B1 (hu)
NZ (1) NZ252161A (hu)
PL (1) PL175651B1 (hu)
RU (1) RU2208642C2 (hu)
SG (1) SG50721A1 (hu)
SK (1) SK281086B6 (hu)
WO (1) WO1993024647A1 (hu)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AT500650B1 (de) 2003-04-17 2009-11-15 Altropus Gmbh Immunogener rekombinanter antikörper
AU2004266216A1 (en) * 2003-08-14 2005-03-03 Ludwig Institute For Cancer Research Anti-Lewis Y anti-idiotypic antibodies and uses thereof
AT504231A1 (de) 2006-10-03 2008-04-15 Hans Dr Loibner Prädiktive parameter
US10150817B2 (en) 2010-09-01 2018-12-11 Biogen Ma Inc. Rapid generation of anti-idiotypic antibodies
RU2735653C2 (ru) * 2016-08-23 2020-11-05 Тран-Сцелл Биологицс Привате Лимитед Платформа с клетками-предшественниками человека для поиска активных веществ лекарственных препаратов

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE68926454T2 (de) * 1988-07-06 1997-01-09 Verigen Inc N D Ges Des Staate Gegen hiv 1 gp48 spezifische antikörper
DE4006308A1 (de) * 1990-02-28 1991-08-29 Sandoz Ag Verwendung des monoklonalen antikoerpers br 55.2 gegen kleinzelliges lungenkarzinom
DE4025499A1 (de) * 1990-08-11 1992-02-13 Sandoz Ag Verwendung der antikoerper br55-2, deren derivate, konjugate und fragmente zur bekaempfung von hiv-infektionen
DK0528767T3 (da) * 1991-08-21 2000-04-17 Novartis Ag antistofderivater

Also Published As

Publication number Publication date
NO316120B1 (no) 2003-12-15
RU94046321A (ru) 1997-01-27
CZ286547B6 (cs) 2000-05-17
ES2133395T3 (es) 1999-09-16
DE69324584D1 (de) 1999-05-27
WO1993024647A1 (en) 1993-12-09
SG50721A1 (en) 2000-11-21
FI945485A (fi) 1994-11-22
CA2134751C (en) 2003-12-16
NO944443D0 (no) 1994-11-21
AU4068893A (en) 1993-12-30
JPH11178594A (ja) 1999-07-06
RU2208642C2 (ru) 2003-07-20
NZ252161A (en) 1996-10-28
ATE179214T1 (de) 1999-05-15
JPH07507207A (ja) 1995-08-10
SK281086B6 (sk) 2000-11-07
KR950701685A (ko) 1995-04-28
EP0644947B1 (en) 1999-04-21
CA2134751A1 (en) 1993-12-09
SK139894A3 (en) 1995-07-11
EP0644947A1 (en) 1995-03-29
AU678160B2 (en) 1997-05-22
JP2006143738A (ja) 2006-06-08
NO944443L (no) 1995-01-20
FI111518B (fi) 2003-08-15
DE69324584T2 (de) 1999-09-23
HUT71311A (en) 1995-11-28
DK0644947T3 (da) 1999-11-01
GR3030701T3 (en) 1999-11-30
KR100279317B1 (ko) 2001-01-15
PL175651B1 (pl) 1999-01-29
FI945485A0 (fi) 1994-11-22
CZ285194A3 (en) 1995-05-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kusama et al. Characterization of syngeneic antiidiotypic monoclonal antibodies to murine anti-human high molecular weight melanoma-associated antigen monoclonal antibodies.
AU768002B2 (en) Immunotherapeutic composition and method for the treatment of prostate cancer
US8444974B2 (en) Use of antibodies for the vaccination against cancer
EP1241264A1 (en) Monoclonal antibodies to colon cancer antigen
US5653977A (en) Anti-idiotypic antibody that mimics the GD2 antigen
NZ516264A (en) Cancer antigens CA125 (multiple epitote) recognised by OC125, M11, B43.13, B27.1, where B43.13 is used as a binding agent to elicit host immune response as a vaccination method against cancer
US20050163768A1 (en) Monoclonal antibodies and their use
JP2006143738A (ja) ルイスｙ−特異的モノクローナル抗体ｂｒ５５−２に対する抗イディオタイプモノクローナル抗体およびその使用
Mellstedt et al. Patients treated with a monoclonal antibody (ab1) to the colorectal carcinoma antigen 17–1A develop a cellular response (DTH) to the “internal image of the antigen”(ab2)
JP2583555B2 (ja) ヒト免疫不全ウイルス（ｈｉｖ）の検出と治療のための方法および物質
Lehmann et al. Tumor‐antigen‐specific humoral immune response of animals to anti‐idiotypic antibodies and comparative serological analysis of patients with small‐cell lung carcinoma
O'Boyle et al. Anti-Tn human monoclonal antibodies generated following active immunization with partially desialylated ovine submaxillary mucin
AU711270C (en) Method and composition for reconforming multi-epitopic antigens to initiate an immune response
JP2000511764A (ja) マウスモノクローナル抗イディオタイプ抗体１１ｄ１０およびその使用方法
MXPA98009586A (en) Method and composition for the reconformation of multi-peptide antigens to start an animal response
NZ503032A (en) Use of a binding agent to reconforming multi-epitopic antigens to initiate an immune response

Legal Events

Date Code Title Description
DGB9 Succession in title of applicant

Owner name: NOVARTIS AG, CH

MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees