SK281086B6 - Monoklonálne myšie antiidiotypové protilátky, spôsob ich prípravy, farmaceutický prostriedok a ich použitie - Google Patents

Monoklonálne myšie antiidiotypové protilátky, spôsob ich prípravy, farmaceutický prostriedok a ich použitie Download PDF

Info

Publication number
SK281086B6
SK281086B6 SK1398-94A SK139894A SK281086B6 SK 281086 B6 SK281086 B6 SK 281086B6 SK 139894 A SK139894 A SK 139894A SK 281086 B6 SK281086 B6 SK 281086B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
antibody
antibodies
serum
binding
mouse
Prior art date
Application number
SK1398-94A
Other languages
English (en)
Other versions
SK139894A3 (en
Inventor
Helmut Eckert
Herbert Jaksche
Evelyne Janzek
Hans Loibner
Dieter Scholz
Original Assignee
Novartis Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB929210930A external-priority patent/GB9210930D0/en
Priority claimed from GB929210929A external-priority patent/GB9210929D0/en
Priority claimed from GB929210944A external-priority patent/GB9210944D0/en
Application filed by Novartis Ag filed Critical Novartis Ag
Publication of SK139894A3 publication Critical patent/SK139894A3/sk
Publication of SK281086B6 publication Critical patent/SK281086B6/sk

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3023—Lung
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3053—Skin, nerves, brain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4208—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig
    • C07K16/4241—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig
    • C07K16/4258—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig against anti-receptor Ig
    • C07K16/4266—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig against anti-receptor Ig against anti-tumor receptor Ig
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G01N33/56972—White blood cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G01N33/56988—HIV or HTLV
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57423—Specifically defined cancers of lung
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)

Abstract

Opisujú sa monoklonálne myšie antiidiotypové protilátky s vnútorným obrazom (Ab2) proti monoklonálnym protilátkam BR55-2 (Ab1), spôsob ich prípravy, farmaceutický prostriedok a ich použitie na preventívnu a/alebo terapeutickú imunizáciu proti infekciám spôsobeným vírusom HIV, proti rakovine epiteliálneho pôvodu a proti rakovine malých pľúcnych buniek.ŕ

Description

Oblasť techniky
Vynález opisuje monoklonálne myšie antiidiotypové protilátky s vnútorným obrazom (Ab2) proti monoklonálnym protilátkam BR55-2 (Abl), spôsob ich produkcie a ich použitie na preventívnu a/alebo terapeutickú imunizáciu proti infekciám vírusom HIV a proti rakovine epiteliálneho pôvodu a proti rakovine malých pľúcnych buniek.
Doterajší stav techniky
Jeden z prístupov k manipulovaniu s imunitným systémom je založený na idiotypových interakciách. Ako idiotopy sa označujú unikátne antigénové determinanty buď priamo alebo v blízkosti väzbového miesta pre antigén v molekule imunoglobulínu (Ig). Tieto determinanty tiež odlišujú jednu protilátku od druhej. Súhrn všetkých idiotopov prítomných vo variabilnej časti danej protilátky sa nazýva idiotyp (id). Molekulárna štruktúra idiotypu bola lokalizovaná tak v oblastiach určujúcich komplementaritu, ako aj v oblastiach úseku základnej štruktúry variabilnej domény. Všeobecne, ale nie vždy, prispieva k špecifickým asociáciám ťažkého i ľahkého reťazca.
Idiotypy sú sérologicky definované entity, pretože injekcia protilátky (často uvádzaná ako Abl) do syngénneho, alogénneho alebo xenogénneho príjemcu indukuje tvorbu antiidiotypových protilátok (často uvádzané ako Ab2). Na predpoklade, že existujú interakcie idiotyp/antiidiotyp, boli postulované fyziologické zákonitosti a na receptoroch založené regulácie imunitného systému (pozri Niels Jeme, Ann. Immunol. 125C, 373, 1974). Jeho teória siete posudzuje imunitný systém ako sústavu molekúl Ig a receptorov T-lymfocytov, ktoré sú schopné svojím väzbovým miestom (paratopom) rozpoznať antigénový determinant (epitop) a ktoré môžu byť zároveň rozoznávané inými protilátkami alebo bunkovými povrchovými receptormi tohto systému vďaka idiotopom, ktoré samotné vykazujú. Mnohé štúdie skutočne dokazujú, že idiotypové a antiidiotypové receptory sú prítomné na povrchu B- aj T-lymfocytov, ako aj na sekrétovaných protilátkach.
V prípade, že je väzba medzi Abl a Ab2 inhibovaná antigénom, proti ktorému je namierená Abl, považuje sa idiotyp za blízky väzbovému miestu, pretože sa vzťahuje na miesto vo variabilnej oblasti protilátky, ktorá viaže antigén. Takéto idiotypy, ktoré svojou konformáciou napodobňujú antigénové epitopy, sa nazývajú vnútorné obrazy tohto epitopu. Vzhľadom na to, že Ab2 i antigén sa viažu na rovnakú Abl, môžu mať podobnú trojrozmernú konformáciu, ktorá reprezentuje vnútorný obraz daného antigénu. Na antiidiotypové protilátky s vnútorným obrazom sa môžeme v princípe pozerať ako na náhradu antigénu, od ktorého boli odvodené pomocou idiotypovej siete. Tieto náhradné idiotypy sa preto môžu použiť pri aktívnej imunizácii. Sú výhodné, ak napríklad pôvodný antigén nie je dostatočne imunogénny na to, aby vzbudil významnú imunitnú odpoveď. Takéto vhodné antiidiotypové protilátky s vnútorným obrazom, ktoré napodobňujú neimunogénny sacharidový antigén, môžu byť zvlášť užitočné pri určitých spôsoboch vakcinácie. V nasledujúcom texte sú tieto témy bližšie špecifikované.
Vďaka zavedeniu hybridómovej technológie boli vytvorené monoklonálne protilátky (Mabs), väčšinou myšieho pôvodu, proti mnohým typom ľudských nádorov. Väčšina markerov určených xenogénnymi Mabs nie sú vyložene tumorovo špecifické, ale sú to diferenciačné antigény obsiahnuté tak v tumoroch, ako i v určitých normálnych a/alebo fetálnych tkanivách. Najlepšie je preto o nich hovoriť ako o nádorovo združených antigénoch (tumor associated antigens-TAAs). Či sú ľudské markery tumorov detegované pomocou xenogénnych Mabs schopné vyvolať protitumorovú odpoveď u pacientov s rakovinou, závisí od povahy týchto TAA a mechanizmus tohto javu nie je ešte úplne objasnený. TAAs sú buď prirodzene imunogénne v syngénnom hostiteľovi, alebo sa môžu na imunogénne upraviť, môžu sa potenciálne použiť na indukciu protitumorovej imunity na terapeutické alebo preventívne účely.
Nádorovo združené antigény sú často priamo súčasťou vlastného organizmu a vyvolávajú veľmi slabú imunitnú odpoveď u pacientov s rakovinou. Naproti tomu antiidiotypové protilátky s vnútorným obrazom vyjadrujúce trojrozmernú štruktúru, ktorá sa podobá štruktúre epitopov daného TAA, sa u hostiteľa s tumorom rozoznávajú ako cudzie molekuly. Preto imunitná odpoveď, ktorá vznikla ako dôsledok terapeutickej a/alebo preventívnej imunizácie vhodnými anti-id Mabs, môže spôsobiť protinádorovú imunitu.
V článku „High idiotypic connectivity of the Vh7183-eneoded antibodies directed to a murine embryonic carbohydrate antigén Lewis Y, as ascertained by syngenic antiidiotype monoclonal antibodies“ od autorov K. Hirashima a kol. sa opisujú antiidiotypové monoklonálne protilátky proti myším monoklonálnym protilátkam AH6. Selektivita týchto AH6 je odlišná v porovnaní s protilátkami označenými ako BR55-2. Protilátky AH6 sa viažu na Lewis Y a taktiež sa viažu aj na uhľovodíkové štruktúry nachádzajúce sa v ľudských erytrocytoch, najmä v krvnej skupine 0, a preto sa nemôžu používať ako liečivá pre ľudí. Ale protilátky BR55-2 sa neviažu na ľudské erytrocyty žiadnej krvnej skupiny. Teda vakcinácia s antiidiotypovými protilátkami s vnútorným obrazom proti idiotypu BR55-2 ako je opísaná v predmetnej prihláške vynálezu nevedie k vzniku žiadnych protilátok (Ab3) viažucich sa na ľudské erytrocyty z niektorej krvnej skupiny.
Podstata vynálezu
Terapeutická imunizácia proti rakovine pomocou anti-íd Mabs môže byť obzvlášť úspešná v ranných štádiách choroby. V čase, keď je chirurgicky odstránený primárny tumor, sú už často jednotlivé skryté tumorové bunky rozšírené v mnohých orgánoch pacienta. O týchto mikrometastatických bunkách je známe, že sú príčinou ďalšieho rastu metastáz, často až niekoľko rokov po diagnóze a chirurgickom odstránení klinicky dokázaného tumorového tkaniva. Dosiaľ takmer vo všetkých prípadoch je metastázujúce nádorové bujnenie epiteliálneho pôvodu neliečiteľné. Preto je efektívna liečba „minimálnej zvyškovej rakoviny“, napr. deštrukcia skrytých mikrometastatických buniek, s cieľom zabrániť rastu makrometastáz naliehavou potrebou súčasnej medicíny. V týchto štádiách choroby (podávanie adjuvans) sú konvenčné chemoterapeutické prístupy veľmi málo úspešné. Ale indukcia špecifickej antitumorovej imunity v čase minimálnej zvyškovej choroby pomocou imunizácie vhodnými anti-id monoklonálnymi protilátkami môže viesť k tomu, že sú mikrometastatické bunky selektívne eliminované imunitným systémom, čo vedie k predĺženiu života pacienta bez ďalších recidív.
Monoklonálne protilátky so špecifitou BR55-2 (opísané napr. vo Wistar 285 059, M. Blaszcyk-Thurin a kol., J.
Biol. Chem. 262 (1987) 372-379, alebo Z. Steplewski a kol., Hybridoma 9 (1990) 201-210) rozoznávajú antigén
Lewis Y6, čo je sacharidový determinant selektívne exprimovaný pri väčšine ľudských pevných nádorov. Vzhľadom
SK 281086 Β6 na svoje vlastnosti môžu byť protilátky BR55-2 použité na pasívnu imunoterapiu v prípade epiteliálnej rakoviny. Nádorovo združený oligosacharidový determinant Lewis Y6, ktorý je tiež exprimovaný v priebehu určitých fáz embryonálneho vývoja, sám osebe takmer nie je imunogénny. Ale monoklonálne antiidiotypové protilátky s vnútorným obrazom (Ab2) proti protilátke BR55-2 (Abl) sú vďaka štruktúrnej podobnosti s epitopmi antigénu Lewis Y6 užitočné na indukciu ochrannej protitumorovej imunity, obzvlášť v skorších štádiách choroby.
Okrem svojej expresie na bunkách nádorov epiteliálneho pôvodu sa sacharidový antigén Lewis Y6 objavuje tiež pri patogenéze infekcie vírusom ľudskej imunitnej nedostatočnosti (H1V - Human imunodefíciency vírus). Syndróm získanej imunitnej nedostatočnosti (AIDS - Acquired immune deficiency syndróm) je známy ako choroba, ktorej pôvod bol identifikovaný ako súvisiaci s infekciou lymfotrofným retrovírusom (HIV). Táto choroba je charakterizovaná poruchou, ktorá je spojená so zhoršením bunkovej imunity a absolútnou lymfopéniou, významným zníženým množstvom T-lymfocytov (CD4+). Rozvoju choroby AIDS môže predchádzať presyndróm, ktorý sa spravidla prejavuje komplexom určitých klinických znakov a lymfopéniou pomocných T-lymfocytov. Tento presyndróm sa nazýva komplex sprevádzajúci AIDS (ARC-AIDS related complex).
HIV patrí do skupiny vírusov, ktoré boli intenzívne študované v priebehu posledných dvadsiatich rokov. Keď retrovírus prenikne do ľudskej alebo zvieracej bunky, jeho RNA sa prepíše do DNA a vloží sa do hostiteľskej bunky, ktorá je týmto oklamaná a zaobchádza s génmi vírusu ako so svojimi vlastnými. HIV môže v týchto bunkách zostať latentný v priebehu niekoľkých rokov v bezpečí pred útokom imunitného systému a je slepo kopírovaný vždy, keď sa delí hostiteľská bunka. Iba v prípade aktivácie infikovaných buniek sa spustí rýchla vírusová replikácia. Potom vírusové častice usmrtia tieto bunky a uvoľnia sa do krvného obehu.
Vďaka špecifickým vlastnostiam vírusu HIV je liečba eliminácie tak vlastného vírusu, ako aj protivírusovej informácie, ktorá už bola prepísaná do ľudského genómu u infikovaných pacientov, veľmi ťažká. Väčšina terapeutických prístupov sa preto zameriavala na látky, ktoré spomaľujú rozvoj choroby tým, že zasahujú do hlavných krokov replikácie vírusu.
Hlavným cieľom je prevencia infekcie vírusom HIV a terapeutický zákrok u už infikovaných pacientov pomocou bezpečnej a efektívnej vakcíny. Niektoré vakcinačné postupy sú testované v preklinickom alebo ranom klinickom štádiu. Väčšinou sa pri nich ako antigén používa niektorá vírusová štruktúra, zvlášť hlavný obalový glykoproteín gpl20.
Prirodzene sa vyskytujúca imunitná odpoveď na vírus spočíva v tvorbe protilátok proti všetkým vírusovým proteínom, ako i v aktivácii bunkovej imunity. Ale zdá sa, že táto reakcia hostiteľa na infekciu vírusom HIV, nie je schopná úplne zastaviť rozvoj choroby po bezpríznakovej fáze, ktorá často trvá roky. Preto sú postupy vakcinácie založené na tých istých antigénoch, ktoré spôsobujú prirodzenú a v konečnom dôsledku neochraňujúcu imunitnú odpoveď, pochybné. Jeden z hlavných problémov je veľká heterogenita vírusu HľV, pomocou ktorej vírus uniká pred útokom typovo špecifických neutralizujúcich protilátok anti-gpl20.
Efektívna ochrana vakcináciou proti vírusu HIV vyžaduje dve obranné stratégie: jednu proti voľnému pohybu vírusu v krvnom obehu a druhú proti bunkám, ktoré už boli infikované. Je známe, že bunky infikované vírusom HIV exprimujú na svojom povrchu in vitro a in vivo pozmenenú glykozylačnú štruktúru, najmä sacharidový determinant Lewis Y. Vzhľadom na to, že sa tento antigén za normálnych okolností vyskytuje iba počas určitých štádií vývoja plodu a jeho výskyt je tiež spojovaný s niektorými zhubnými bujneniami, môže jeho expresia na bunkách infikovaných vírusom HIV odrážať ich pozmenený diferenciačný stav, ktorý bol vyvolaný retrovírusovou transformáciou. Tento povrchový fenotyp preto predstavuje unikátnu bunkovú reakciu hostiteľa na transfekciu ľudského genómu vírusom HIV.
Povrchový glykoproteín vírusu HIV je tvorený glykozylačným aparátom infikovaných buniek. Zmeny v glykozylačnom vzore infikovaných buniek produkujúcich vfrus HIV boli preto nájdené aj na uvoľnených vírusových časticiach. V dôsledku toho aj povrchový proteín vírusu HIV bez toho, aby bol produkovaný v týchto bunkách, obsahuje sacharidové determinanty Lewis Y. Oligosacharid Lewis Y takto predstavuje špecifickú hostiteľovu odpoveď, ktorá je exprimovaná tak v bunkách infikovaných vírusom HIV, ako aj na voľných vírusových časticiach.
Podľa uvedených predpokladov spĺňa determinant Lewis Y dôležité požiadavky na použitie pri vakcinácii proti voľnému vírusu i proti bunkám infikovaným vírusom HIV. Ďalej, vzhľadom na to, že ide o všeobecnú reakciu hostiteľa na vírus HIV, je antigén Lewis Y nezávislý od kmeňa vírusu HIV a nie je ovplyvňovaný genetickou variabilitou tohto vírusu. Žiaľ, vzhľadom na svoju sacharidovú štruktúru a vzhľadom na to, že je ako fetálny diferenciačný antigén organizmu vlastný, samotný antigén Lewis Y nie je imunogénny. U človeka nebola detegovaná žiadna prirodzená imunitná odpoveď proti tomuto antigénu. Ale monoklonálne antiidiotypové protilátky (Ab2) proti protilátke BR55-2 (Abl) s vlastnosťami vnútorného obrazu napodobňujúce štruktúrne epitopy antigénu Lewis Y môžu byť užitočné na indukciu preventívnej a terapeutickej imunity proti voľnému vírusu HIV i proti bunkám infikovaným vírusom HIV, a to nezávisle od kmeňa vírusu.
Okrem ich terapeutického a preventívneho použitia ako unikátnej vakcíny, sú monoklonálne anti-id protilátky s vnútorným obrazom použiteľné ako vysoko špecifické reagencie pre idiotyp protilátky, proti ktorej boli odvodené. Takmer výlučne rozoznávajú väzbovú časť protilátky Abl. Táto schopnosť nie je závislá od iných determinantov protilátky Abl. Inými slovami, vhodné anti-id Mabs selektívne určujú akúkoľvek molekulu, ktorá obsahuje unikátny idiotyp Abl v správnom trojrozmernom tvare. A teda tieto protilátky sa preto viažu s porovnateľnou afinitou na F(ab')2, Fab a Fv fragmenty protilátky Abl, ako aj na ich výmenné varianty (switch variants - obsahujú rôzne konštantné oblasti napríklad myšich IgG2a, IgG2b, IgGl, ale majú rovnaký idiotyp). Okrem toho medzi tieto vysoko špecifické rozpoznávacie štruktúry anti-id Mabs s vnútorným obrazom patria tiež varianty rodičovskej myšej Mab získanej technológiou rekombinantnej DNA.
Na prekonanie možných problémov pri opakovanom použití myších protilátok na ľudskú pasívnu imunoterapiu boli vytvorené chimerické Mabs typu myš/človek. Tieto chimerické protilátky boli vytvorené kombináciou variabilných domén ľubovoľnej rodičovskej myšej Mab s ľudskými konštantnými doménami. Na detekciu takýchto chimerických Mabs typu myš/človek v ľudskom sére sú potrebné vysoko špecifické reagencie, pretože tieto chimerické monoklonálne protilátky majú konštantnú oblasť rovnakú s tou, ktorá je v bežných ľudských imunoglobulínoch.
Na ďalšie zlepšenie vlastnosti týchto Mabs s terapeuticky zaujímavými vlastnosťami na použitie v pasívnej imunoterapii môžu byť skonštruované „úplne humanizované“ protilátky pomocou technológie rekombinantnej DNA. V takýchto protilátkach je iba minimum nevyhnutných častí rodičovskej myšej protilátky (CDR-complementarity determining regions, oblasti určujúce komplementaritu), ktoré sú spojené s úsekmi základnej štruktúry ľudskej variabilnej oblasti a s ľudskými konštantnými oblasťami. Na návrh a konštrukciu takýchto „úplne poľudštených“ Mabs sa používa sekvenčná homológia a molekulárne modelovanie tak, aby sa získala vhodná kombinácia ľudských a myších sekvencií, ktoré ďalej znížia imunogenicitu pri zachovaní väzbových vlastností. Ak sú splnené nasledujúce požiadavky, môžu sa určité antiidiotypové monoklonálne protilátky generované proti idiotypu rodičovskej myšej Abl viazať na humanizované varianty protilátok, na ktoré boli transplantované CDR oblasti (CDR-grafted). Tieto požiadavky sú:
A. Trojrozmerná štruktúra väzbového miesta humanizovanej protilátky je veľmi podobná väzbovému miestu rodičovskej myšej protilátky.
B. Konkrétna anti-id protilátka presne rozoznáva tento trojrozmerný tvar väzbového miesta („pravá protilátka s vnútorným obrazom“).
Takéto antiidiotypové Mabs s uvedenými vlastnosťami sú zvlášť užitočné reagencie na špecifické a citlivé kvantitatívne určenie napríklad sérových koncentrácií úplne humanizovaných monoklonálnych protilátok (s transplantantmi CDR) v prítomnosti veľkých prebytkov normálnych ľudských imunoglobulínov.
Vynález sa týka generovania, produkcie a charakterizácie myších monoklonálnych antiidiotypových protilátok s vnútorným obrazom (Ab2) proti monoklonálnym protilátkam BR55-2 (Abl). Ďalej vynález opisuje využitie týchto antiidiotypových Mabs na aktívnu terapeutickú a preventívnu imunizáciu proti nádorom epiteliálneho pôvodu a rakovine malých pľúcnych buniek, ako i proti chorobám spôsobeným infekciou vírusom HIV. Ďalej vynález opisuje využitie týchto antiidiotypových Mabs na vysoko selektívne a kvantitatívne určenie protilátok alebo ich fragmentov a derivátov so špecifitou BR55-2 vrátane chimerizovaných a úplne humanizovaných variantov (pozri WO92/O3165), ako i všeobecne použiteľný spôsob selektívnej imunoafínitnej purifikácie molekúl so špecifitou BR55-2.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Na obrázku 1 sú znázornené výsledky elektroforetického stanovenia čistoty monoklonálnych protilátok podľa vynálezu. Význam skratiek je nasledujúci: St znamená štandardy; E4, Cll, B3, B9, G6 a G9 sú jednotlivé monoklonálne protilátky. V ľavej časti ohraničenej oboma štandardmi sú výsledky pokusov uskutočnených v redukčnom prostredí, zatiaľ čo v pravej časti v neredukčnom.
Na obrázku 2 sú znázornené výsledky stanovení čistoty monoklonálnych protilátok podľa vynálezu izoelektrickou fokusáciou. Význam skratiek je nasledujúci: St znamená štandardy; E4, Cll, B3, B9, G6 a G9 sú jednotlivé monoklonálne protilátky. Na zvislej osi je uvedené pH.
Na obrázku 3 sú výsledky kompetitívnej inhibície väzby myšej protilátky IgG43/BR55-2 na bunkovú líniu SKBR5, ktorá je spôsobená anti-id protilátkou BR55-2 č. E4. Koncentrácia protilátky BR55-2/myšej IgG3 je 1 pg/ml. Na vodorovnej osi sú koncentrácie inhibujúcej protilátky anti-id BR55-2 č. E4 v gg/ml. Na zvislej osi je znázornená absorbancia pri vlnovej dĺžke 492 nm, vynásobená 1000.
Na obrázku 4 je znázornená väzba králičích proti- látok na bunkovú líniu SKBR5 pred imunizáciou a po imunizácii anti-id protilátkou BR55-2 č. E4 (bunková ELISA). Na vodorovnej osi je vyznačené riedenie séra. Na zvislej osi je vynesená absorbancia pri vlnovej dĺžke 492 nm, vynásobená 1000.
platí pre sérum odobrané pred imunizáciou,
-0— pre sérum odobrané 9 týždňov po imunizácii.
Na obrázku 5 je znázornená väzba protilátok opíc druhu Rhestis na bunkovú líniu SKBR5 pred imunizáciou a po imunizácii anti-id protilátkou BR55-2 č. E4 (bunková ELISA). Na vodorovnej osi je vyznačené riedenie séra. Na zvislej osi je vynesená absorbancia pri vlnovej dĺžke 492 nm, vynásobená 1000.
platí pre sérum odobrané pred imunizáciou,
S— pre sérum odobrané 9 týždňov po imunizácii.
Na obrázku 6 je znázornená imunizácia opice č. 246 protilátkou anti-id BR55-2 č. E4. Bola hodnotená väzba sérových Ig na protilátku anti-id BR55-2 č. E4 (ELISA). Na vodorovnej osi je vyznačené riedenie séra. Na zvislej osi je vynesená absorbancia pri vlnovej dĺžke 492, vynásobená 1000 (referenčné meranie pri 620 nm). Krivky platia pre sérum opice 246:
odobrané pred imunizáciou
-C— odobrané 4 týždne po imunizácii
-e- odobrané 9 týždňov po imunizácii —odobrané pred prvou upomínacou dávkou
-ä- odobrané 1 týždeň po prvej upomínacej dávke odobrané pred druhou upomínacou dávkou
-t- odobrané 4. týždeň po druhej upomínacej dávke odobrané 9. týždeň po druhej upomínacej dávke
Na obrázku 7 je znázornená imunizácia opice č. 287 protilátkou anti-id BR55-2 č. E4. Podmienky pokusu a opis osí boli rovnaké ako na obrázku 6. Krivky platia pre sérum opice 287:
—odobrané pred imunizáciou
-C— odobrané 4 týždne po imunizácii odobrané 9 týždňov po imunizácii odobrané pred prvou upomínacou dávkou odobrané 4. týždeň po prvej upomínacej dávke -h— odobrané pred druhou upomínacou dávkou odobrané 4. týždeň po druhej upomínacej dávke -ä- odobrané 9. týždeň po druhej upomínacej dávke
Na obrázku 8 je znázornená imunizácia opice č. E23 protilátkou anti-id BR55-2 č. E4. Podmienky pokusu a opis osí boli rovnaké ako na obrázku 6. Krivky platia pre sérum opice č. E23:
odobrané pred imunizáciou odobrané 4 týždne po imunizácii
-·- odobrané 9 týždňov po imunizácii odobrané pred prvou upomínacou dávkou odobrané 4. týždeň po prvej upomínacej dávka
-tt- odobrané pred druhou upomínacou dávkou
-=ŕ- odobrané 1 týždeň po druhej upomínacej dévke
-t- odobrané 4. týždeň po druhej upomínacej dávke
-3- odobrané 9. týždeň po druhej upomínacej dávke
Na obrázku 9 je znázornená imunizácia opice č. 215 nešpecifickou myšou IgGl protilátkou. Hodnotená bola väzba sérových Ig na protilátku anti-id BR55-2 č. E4 (ELI4
SA). Opis osí zodpovedá obrázku 6. Krivky platia pre sérum opice č. 215:
odobrané pred imunízáciou
-Eb- odobrané 4 týždne po imunizácii —odobrané 9 týždňov p© iounizácii odobrané pred prvou upomínacou dávkou — odobrané 1 týždeň po prvej upomínacej dávke —♦— odobrané 4. týždeň po prvej upomínacej dávke —h— odobrané pred druhou upomínacou dávkou -r— odobrané 1 týždeň po druhej upomínacej dávke odobrané 4. týždeň po druhej upomínacej dávke odobrané 9. týždeň po druhej upomínacej dávke
Na obrázku 10 je znázornená imunizácia opice č. 252 nešpecifickou myšou IgGl protilátkou. Hodnotená bola väzba sérových lg na protilátku anti-id BR55-2 č. E4 (ELISA). Opis osí zodpovedá obrázku 6. Krivky platia pre sérum opice č. 252:
odobrané pred imunízáciou —e— odobrané 9 týždňov po imunizácii
-**— odobrané pred druhou upomínacou dávkou
-í— odobrané 9. týždeň po druhej upomínacej dávke
Na obrázku 11 je znázornená imunizácia opice č. 246 protilátkou anti-id BR55-2 δ. E4. Hodnotená bola väzba sérových lg na bunkovú líniu SKBR5 z nádoru pľúc (bunková ELISA). Opis osí zodpovedá obrázku 6. Krivky platia pre sérum opice 246:
odobrané pred imunízáciou odobrané 9 týždňov po imunizácii odobrané pred prvou upomínacou dávkou odobrané 4. týždeň po prvej upomínacej dávke odobrané pred druhou upomínacou dávkou odobrané 4. týždeň po druhej upomínacej dávke -β- odobrané 9. týždeň po druhej upomínacej dávke
Na obrázku 12 je znázornená imunizácia opice č. 287 protilátkou anti-id BR55-2 č. E4. Podmienky pokusu a opis osí boli rovnaké ako na obrázku 11. Krivky platia pre sérum opice C. 287:
-·— odobrané pred imunízáciou odobrané 1 týždeň po imunizácii
-e- odobrané 4 týždne po imunizácii odobrané 9 týždňov po imunizácii odobrané pred prvou upomínacou dávkou —4— odobrané 4. týždeň po prvej upomínacej dávke «n— odobrané pred druhou upomínacou dávkou odobrané 1 týždeň po druhej upomínacej dávke —e- odobrané 4 týždne po druhej upomínacej dávke -a- odobrané 9 týždňov po druhej upomínacej dávke
Na obrázku 13 je znázornená imunizácia opice č. E 23 protilátkou anti-id BR55-2 č. E4. Podmienky pokusu a opis osí boli rovnaké ako na obrázku 11. Krivky platia pre sérum opice č. E 23:
odobrané pred imunízáciou odobrané 9 týždňov po imunizácii —odobrané pred prvou upomínacou dávkou -t- odobrané 4. týždeň po prvej upomínacej dávke -h»— odobrané pred druhou upomínacou dávkou -O- odobrané 1 týždeň po druhej upomínacej dávke odobrané 4 týždne po druhej upomínacej dávke odobrané 9 týždňov po druhej upomínacej dávke
Na obrázku 14 je znázornená imunizácia opice č. 215 nešpecifickou myšou IgGl protilátkou. Podmienky pokusu a opis osí boli rovnaké ako na obrázku 11. Krivky platia pre sérum opice č. 215:
odobrané pred imunízáciou
-e- odobrané 9 týždňov po imunizácii odobrané pred prvou upomínacou dávkou —odobrané 4. týždeň po prvej upomínacej dávke odobrané pred druhou upomínacou dávkou odobrané 4 týždne po druhej upomínacej dávke odobrané 9 týždňov po druhej upomínacej dávke
Na obrázku 15 je znázornená imunizácia opice č. 246 protilátkou anti-id BR55-2 č. E4. Hodnotená bola väzba sérových lg na bunkovú líniu CATO zo žalúdkového nádoru (bunková ELISA). Opis osi zodpovedá obrázku 6. Krivky platia pre sérum opice č. 246:
odobrané pred imunízáciou odobrané 9 týždňov po imunizácii odobrané pred prvou upomínacou dávkou
-4— odobrané 4. týždeň po prvej upomínacej dávke _odobrané pred druhou upomínacou dávkou odobrané 9 týždňov po druhej upomínacej dávke
Na obrázku 16 je znázornená imunizácia opice č. 215 nešpecifickou myšou protilátkou IgGl. Hodnotená bola väzba sérových lg na bunkovú líniu CATO zo žalúdkového nádoru (bunková ELISA). Opis osí zodpovedá obrázku 6. Krivky platia pre sérum opice 215:
odobrané pred imunízáciou odobrané 9 týždňov po imunizácii odobrané pred prvou upomínacou dávkou odobrané 4. týždeň po prvej upomínacej dávke odobrané pred druhou upomínacou dávkou
-S- odobrané 9 týždňov po druhej upomínacej dávke
Na obrázku 17 je znázornená imunizácia opice č. E 23 protilátkou anti-id BR55-2 č. E4. Hodnotená bola väzba sérových lg na bunkovú líniu SW2 z nádoru malých pľúcnych buniek (bunková ELISA). Opis osí zodpovedá obrázku 6. Krivky platia pre sérum opice E 23:
..g i odobrané pred imunízáciou odobrané 9 týždňov po imunizácii —odobrané pred prvou upomínacou dávkou
-t- odobrané 4. týždeň po prvej upomínacej dávke
-a- odobrané pred druhou upomínacou dávkou odobrané 4 týždne po druhej upomínacej dávke
-e- odobrané 9 týždňov po druhej upomínacej dávke
Na obrázku 18 je znázornená imunizácia opice č. 215 nešpecifickou myšou protilátkou IgGl. Hodnotená bola väzba sérových lg na bunkovú líniu SW2 z nádoru malých pľúcnych buniek (bunková ELISA). Opis osi zodpovedá obrázku 6. Krivky platia pre sérum opice 215:
odobrané pred imunízáciou odobrané 9 týždňov po imunizácii odobrané pred prvou upomínacou dávkou —odobrané 4. týždeň po prvej upomínacej dávke odobrané pred druhou upomínacou dávkou odobrané 4 týždne po druhej upomínacej dávke -S- odobrané 9 týždňov po druhej upomínacej dávke Na obrázku 19 je znázornená imunizácia opice č. E 23 protilátkou anti-id BR55-2 č. E4. Hodnotená bola väzba sérových lg na bunkovú líniu SW948 z nádoru hrubého čreva (bunková ELISA). Opis osi zodpovedá obrázku 6. Krivky platia pre sérum opice E 23:
odobrané pred imunízáciou
-e- odobrané 9 týždňov po imunizácii
-e- odobrané pred prvou upomínacou dávkou —·— odobrané 4 týždne po prvej upomínacej dávke odobrané pred druhou upomínacou dávkou —e— odobrané 4 týždne po druhej upomínacej dávke
-ä- odobrané 9 týždňov po druhej upomínacej dávke
SK 281086 Β6
Na obrázku 20 je znázornená imunizácia opice č. E 23 protilátkou anti-id BR55-2 č. E4. Hodnotená bola väzba sérových lg na melanómovú bunkovú líniu WM 9 (bunková ELISA). Opis osí zodpovedá obrázku 6. Krivky platia pre sérum opice E 23:
-e- odobrané pred imunizáciou odobrané 9 týždňov po imunizácii —ar— odobrané pred prvou upomínaccu dávkou odobrané é týždne po prvej upomínacej dávke —H— odobrané pred druhou upomínacou dávkou -e- odobrané 4 týždne po druhej upomínacej dávke
Na obrázku 21 je znázornená väzba lg, imunitné purifikovaných zo séra opice druhu Rhesus, na protilátku anti-id BR55-2 č. E4 (ELISA). Sérum opice č. 246 zo 4. a 9. týždňa po druhej upomínacej dávke bolo zhromaždené a imunitné purifikované na afinitnej kolóne s protilátkou anti-id BR55-2 č. E4. Na vodorovnej osi je vyznačená koncentrácia lg v pg/ml. Na zvislej osi je vynesená absorbancia pri vlnovej dĺžke 492 nm, vynásobená 1000 (referenčné meranie pri 620 nm). Jednotlivé krivky platia pre tieto frakcie: imunitné purifikovaná frakcia lg (Ab3) —9- frakcia, ktorá prešla kolónou
Na obrázku 22 je znázornená väzba lg, imunitné purifikovaných zo séra opice druhu Rhesus, na bunky SKBR5 z prsného nádoru (bunková ELISA). Sérum opice č. 246 zo
4. a 9. týždňa po druhej upomínacej dávke bolo zhromaždené a imunitné purifikované na afinitnej kolóne s protilátkou anti-id BR55-2 č. E4. Opis osí zodpovedá príkladu 21. Jednotlivé krivky platia pre tieto frakcie:
purifikovaná frakcia lg
-a- frakcia, ktorá preäla kolónou humanizovaná igGi
Na obrázku 23 je znázornená väzba lg, imunitné purifikovaných zo séra opice druhu Rhesus, na bunky SKBR5 z prsného nádoru a na melanómové bunky WM9 (bunková ELISA). Sérum opice č. 246 zo 4. a 9. týždňa po druhej upomínacej dávke bolo zhromaždené a imunitné purifikované na afinitnej kolóne s protilátkou anti-id BR55-2 č. E4. Opis osí zodpovedá príkladu 21. Jednotlivé krivky platia pre väzbu na tieto bunky:
WM9 (Ab3)
SKBR5 (Ab3)
-e- WM9 (Abl)
-C- SKBRS (Abl)
Na obrázku 24 je znázornená väzba lg, imunitné purifikovaných zo séra opice druhu Rhesus, na bunkové membrány z buniek SKBR5 a WM9 (ELISA). Sérum opice č. 246 zo 4. a 9. týždňa po druhej upomínacej dávke bolo zhromaždené a imunitné purifikované na afinitnej kolóne s protilátkou anti-id BR55-2 č. E4. Opis osí zodpovedá príkladu 21. Jednotlivé krivky platia pre väzbu purifikovaných lg na tieto bunky:
SKBRS
-O- WM9
Na obrázku 25 je znázornená väzba lg, imunitné purifikovaných zo séra opice druhu Rhesus, na rôzne bunkové línie (bunková ELISA). Sérum opice č. 246 zo 4. a 9. týždňa po druhej upomínacej dávke bolo zhromaždené a imunitné purifikované na afinitnej kolóne s protilátkou anti-id BR55-2 č. E4. Opis osí zodpovedá príkladu 21. Jednotlivé krivky platia pre väzbu purifikovaných lg na tieto bunkové línie:
SW2
CATO
SKBRS
SW948
Na obrázku 26 je znázornená ADCC proti bunkovej línii SKBR5, spôsobená bunkami PBMC. Úlohu protilátky majú BR55-2/myšie IgG3 alebo imunitné purifikované lg zo séra opice druhu Rhesus, ktorá bola imunizovaná anti-id protilátkou BR55-2 č. E4. Bolo použité sérum opice č. 246 zo 4. a 9. týždňa po druhej upomínacej dávke. Na vodorovnej osi je vyznačená koncentrácia lg v pg/ml (najvyššia koncentrácia Abl nebola testovaná). Na zvislej osi je vynesené percento lyzovaných buniek, zistené v množstve uvoľneného 51Cr. Jednotlivé stĺpce platia pre tieto protilátky: | imunitné purifikovaná opičia lg (Ab3)
g] BR55-2/rrryšie IgG3 (Abl)
Na obrázku 27 je znázornený systém ELISA na stanovenie protilátky BR55-2/ myšej IgG3 v ľudskom sére (kalibračná krivka). Na vodorovnej osi je vyznačená koncentrácia protilátky BR55-2/myšia IgG3 v pg/ml. Na zvislej osi je vynesená absorbancia pri vlnovej dĺžke 492 nm, vynásobená 1000.
Na obrázkoch 28 a 29 je znázornený systém ELISA na stanovenie protilátky BR55-2/chimerická ľudská IgGl v ľudskom sére (kalibračná krivka). Na vodorovnej osi je vyznačená koncentrácia protilátky BR55-2/chimerická ľudská IgGl v pg/ml. Na zvislej osi je vynesená absorbancia vlnovej dĺžke 492 nm, vynásobená 1000.
Na obrázku 30 je znázornená väzba protilátok BR55-2/chimerická IgGl a BR55- 2/humanizovaná IgGl na antiidiotypovú protilátku BR55-2 č. E4. Na vodorovnej osi je vyznačená koncentrácia protilátky v pg/ml. Na zvislej osi je vynesený pomer Jednotiek odpovedí“ RU (RU pozri príklad 19) dosiahnutých príslušnou monoklonálnou protilátkou k RU antiidiotypovej protilátky BR55-2 č. E4. Jednotlivé krivky platia pre: -·- BR55-2/chimerická IgGl
BRS 5-2/humanizovaná IgG
Na obrázku 31 je znázornená väzba protilátok BR55-2/chimerická IgGl a BR55- 2/humanizovaná IgGl na antiidiotypovú protilátku BR55-2 č. Cll. Opis osí zodpovedá obrázku 30 s tým, že RU danej protilátky je vztiahnutá na hodnotu RU protilátky anti-id BR55-2 č. Cll. Jednotlivé krivky platia pre:
-e- BR55-2/chimerická IgGl —BR55-2/humanizovaná IgG
Na obrázku 32 je znázornená väzba protilátok BR55-2/chimerická IgGl a BR55- 2/humanizovaná IgGl na antiidiotypovú protilátku BR55-2 č. B3. Opis osí zodpovedá obrázku 30 s tým, že RZ danej protilátky je vztiahnutá na hodnotu RU protilátky anti-id BR55-2 č. B3. Jednotlivé krivky platia pre:
-e- BR55-2/chimerická IgGl
BR55-2/humanizovaná IgG
Na obrázku 33 je znázornená väzba protilátok BR55-2/chimerická IgGl a BR55-2/humanizovaná IgGl na antiidiotypovú protilátku BR55-2 č. B9. Opis osí zodpovedá obrázku 30 s tým, že RU danej protilátky je vztiahnutá na hodnotu RU protilátky anti-id BR55-2 č. B9. Jednotlivé krivky platia pre:
BR5S-2/chimerická IgGl BR55-2/hunmanizovaná IgG
Na obiázku 34 je znázornená väzba protilátok BR55-2/chimerická IgGl a BR55- 2/humanizovaná IgGl na antiidiotypovú protilátku BR55-2 č. G6. Opis osí zodpovedá obrázku 30 s tým, že RU danej protilátky je vztiahnutá na hodnotu RU protilátky anti-id BR55-2 č. G6. Jednotlivé krivky platia pre:
—e— BR55-2/chimerická IgGl
-·- BR55-2/humanizovaná IgG
SK 281086 Β6
Na obrázku 35 je znázornená väzba protilátok BR55-2/chimerická IgGl a BR55- 2/humanizovaná IgGl na antiidiotypovú protilátku BR55-2 č. G9. Opis osí zodpovedá obrázku 30 s tým, že RU danej protilátky je vztiahnutá na hodnotu RU protilátky anti-id BR55-2 č. G9. Jednotlivé krivky platia pre:
BR55-2/chimerickä IgGl BR55-2/humanizovaná IgG
Na obrázku 36je znázornený systém ELISA na stanovenie protilátky BR55-2/ humanizovaná IgGl v ľudskom sére (kalibračná krivka). Na vodorovnej osi je vyznačená koncentrácia protilátky BR55-2/ humanizovaná IgGl v pg/ml. Na zvislej osi je vynesená absorbancia pri vlnovej dĺžke 492 nm, vynásobená 1000.
Na obrázku 37 je znázornená kompetítívna inhibícia väzby protilátky BR55-2/ myšia IgG3 na anti-id BR55-2 spôsobená protilátkou BR55-2/ľudská chimerická IgGl a BR55-2/ľudská chimerická IgG3. Na vodorovnej osi je vyznačená koncentrácia protilátky v pg/ml. Na zvislej osi je vynesená absorbancia pri vlnovej dĺžke 492 nm, vynásobená 1000. Jednotlivé krivky platia pre:
BR55-2/myäia IgG3
-t— ľudská chimerická IgGl + 0,05 Mg/ml mIgG3 _4_ ľudeká chimerická IgG3 + 0,05 Mg/ml mIgG3
Na obrázku 38 je znázornená bunková cytotoxicita spôsobená komplementom (CDC) sprostredkovaná protilátkou BR55-2/myšou IgG3 - Inhibícia anti-id protilátkou BR55-2 č. E4. Na vodorovnej osi je vyznačená koncentrácia anti-id protilátky v pg/ml. Koncentrácia protilátky BR55-2/myšia IgG3 bola konštantné 1,4 pg/ml. Na zvislej osi je vynesené percento lyzovaných buniek SKBR5.
Na obrázku 39 sú znázornené výsledky elektroforetického stanovenia čistoty (redukčnej podmienky) monoklonálnej protilátky na imunitnú purifikáciu. Význam skratiek je nasledujúci: St znamená štandardy; R je referenčná protilátka, Ch je protilátka BR55-2/ľudská chimerická IgGl .
Generovanie a charakterizácia myších monoklonálnych antiidiotypových protilátok proti idiotypu protilátok BR55-2
V snahe minimalizovať nežiaducu antiizotypovú imunitnú odpoveď sa použil na imunizáciu fragment F(ab')2 myšej protilátky IgG3 BR55-2. Pre úspešnú tvorbu myších anti-id Mabs proti idiotypu myšej Mab BR55-2 je dôležité zvýšiť jej imunogenicitu, čím sa zvýši príslušná imunitná odpoveď v syngénnom hostiteľovi. Preto boli fragmenty F(ab')2 zbavené časti Fc (štiepenie a purifikácia sú opísané pozri EPA528.767) konjugované s hemocyanínom z morských prílepiek Megathura crenulata (KLH - Keyhole Lipmet hemocyanin), ktorý slúžil ako imunogénny nosič. Na konjugáciu bol použitý heterobifunkčný linker N-sukcínimidyl-3-(2-pyridylditio)propionát (=SPDP) podľa opísaného spôsobu (J. Carlsson a kol., Biochem. J. 173, 723, 1978).
Myšie Balb/c sa imunizovali týmto konjugátom BR55-2/myšia IgGl-F(ab')2-KLH v úplnom Freundovom adjuvans podľa bežného protokolu na generovanie myších Mabs. Po opakovanej imunizácii sa slezinové bunky myší nechali fuzovať s bunkami myšej myelómovej línie SP2/O (experimentálne podrobnosti pozri príklad 1).
Kvôli výberu vhodných kultivovaných hybridómových buniek boli ich supematanty podrobené sledu testov. Tento výber bol založený na nasledujúcich kritériách:
A. Sekrečná rýchlosť hybridómov - bola určená z koncentrácie myších IgG v supematantoch (experimentálne podrobnosti pozri príklad 2). Bunky, ktoré produkovali vyso ké množstvá myších IgG boli rozklonované do kultúr z jedinej bunky.
B. Väzba vybraných supematantov na F(ab')2 fragment myšej protilátky IgG3 BR55-2 (experimentálne detaily pozri príklad 3).
C. Inhibícia väzby myších protilátok IgG2a/BR55-2 na Lewis Y pozitívne bunky SKBR5 z nádoru ľudského prsníka pomocou vyberaných supematantov (experimentálne detaily pozri príklad 4).
V poslednom teste sa zisťuje schopnosť protilátok Ab2 vytvárať vnútorný obraz. IgG2a výmenný variant myšej protilátky BR55-2 bol použitý preto, aby sa minimalizovala detekcia protilátok Ab2 rozoznávajúcich zvyškové konštantné oblasti vo fragmente Fab alebo F(ab')2 myšej protilátky IgG3 BR55-2, ktorá bola použitá na imunizáciu. Tento test bol uskutočnený kvantitatívne podľa koncentrácie IgG zistenej v teste A. (pozri príklad 2). Ďalej sa pri tomto experimente pridal k testovanému supematantu prebytok myších nešpecifických IgG preto, aby sa zabránilo detekcii protilátok Ab2, ktoré nie sú špecifické pre idiotyp BR55-2. Vybrali sa také hybridómy, ktoré produkovali IgG s inhibičnou kapacitou viac ako 95 % (inhibícia väzby myších protilátok IgG2a/BR55-2 na bunkovú líniu SKBR5).
Pomocou spomenutých procedúr bolo nakoniec vybraných a rozmnožených 6 rôznych hybridómov (E4, Cl 1, B3, B9, G6, G9). Všetkých 6 hybridómov produkovalo myšiu IgGl, čo sa zistilo testom ELISA pomocou systému králičia-antimyšia-IgGl/peroxidáza (napr. od firmy Zymed).
Všetkých šesť hybridómov bolo kultivovaných vo valcových nádobách (37 °C, 5 % CO2 v médiu G, výmena média každé 3 až 4 dni) a supematanty sa zbierali na následnú purifikáciu. Každý supematant obsahujúci príslušnú anti-id BR55-2 Mab bol purifikovaný pomocou imunoafinitnej chromatografie. Všeobecne je afinitná chromatogTafia založená na interakcii medzi imobilizovaným ligandom a požadovanou látkou. V prípade antiidiotypových látok BR55-2 je takýmto vysoko špecifickým ligandom pre afinitnú kolónu protilátka Mab BR55-2/myšia IgG2a, ktorá sa viaže na vybrané antiidiotypové Mabs (experimentálne detaily pozri príklad 5). Stupeň čistoty izolovaných monoklonálnych protilátok proti idiotypu BR55-2 (E4, Cl 1, B3, B9, G6, G9) bol testovaný analytickou FPLC (chromatografia s rýchlym prietokom elučného činidla) chromatografiou na ionexe, chromatografiou s delením podľa veľkosti, SDSPAGE a izoelektrickou fokusáciou. Čistota všetkých šiestich monoklonálnych protilátok anti-id BR55-2 Mabs bola vyššia ako 95 % (experimentálne detaily pozri príklad 6, SDS-PAGE a izoelektrická fokusácia sú na obrázkoch 1 a 2).
Purifikované anti-id Mabs boli kvantitatívne charakterizované určením ich schopnosti inhibovať väzbu protilátok BR55-2/myšia IgG3 na antigén Lewis Y pozitívnou bunkovou líniou SKBR5. Všetky antiidiotypové Mabs inhibujú väzbu Abl na tento antigén v stechiometrickom pomere 1 : : 1 (experimentálne detaily pozri príklad 7, reprezentatívne výsledky pozri obr. 3).
Rozhodujúci dôkaz o monoklonálnych protilátkach anti-id BR55-2 s vnútorným obrazom už bol opísaný. Použitie týchto protilátok ako náhradného tumorového antigénu je založené na ich schopnosti vyvolávať protilátkovú odpoveď Ab3 proti nádorovo združeným antigénom pri rôznych živočíšnych druhoch. Podľa teórie siete (N. Jeme) sú protilátky (Ab3) indukované imunizáciou monoklonálnymi antiidiotypovými protilátkami s vnútorným obrazom (Ab2) svojou väzbovou špecifitou podobné protilátkam Abl. To znamená, že imunitná odpoveď, vyvolaná imunizáciou monoklonálnymi protilátkami anti-id BR55-2, by mala byť špecifická proti tumorovým bunkám nesúcim antigén Lewis Y. Z toho vyplýva, že imunizáciou monoklonálnymi protilátkami anti-id BR55-2 môže byť u človeka vyvolaná antitumorová imunita.
Pri vyšetrovaní vlastností protilátkovej odpovede Ab3 boli králiky a opice druhu Rhesus imunizované protilátkou anti-id BR55-2 č. E4 podávanou spolu s hydroxidom hlinitým, ktorý slúžil ako nosič a adjuvans. Toto jemné adjuvans má široké použitie v rôznych ľudských vakcínach. Ako negatívna kontrola boli tiež imunizované zvieratá rovnakým množstvom nešpecifickej myšej IgGl. Po štyroch imunizačných dávkach v priebehu piatich týždňov sa v 9. týždni odobralo sérum (experimentálne detaily pozri príklad 8). Potom bola určená väzba sérových lg na Lewis Y pozitívne bunky z bunkovej línie SKBR5 z nádoru prsníka a na Lewis Y negatívnej bunky z melanómovej bunkovej línie WM9 (experimentálne detaily pozri príklady 9 a 10).
Protilátky anti-id BR55-2 č. E4 vyvolávajú vysoký titer protilátkovej imunitnej odpovede u králikov i opíc druhu Rhesus. Sérové lg zvierat imunizovaných protilátkou anti-id BR55-22 č. E4 sa selektívne viažu na Lewis Y pozitívnej bunky bunkovej línie SKBR5, ale už nie na Lewis Y negatívne bunky bunkovej línie WM9. Naproti tomu pri imunizácii nešpecifickými myšími IgGl sa nepodarilo detegovať takmer žiadne sérové lg, ktoré by sa viazali na nádorové bunky. Tieto výsledky sú zhrnuté v tabuľke 1.
Tabuľka 1
Imunizácia králikov a opíc druhu Rhesus anti-id protilátkou BR55-2 č. E4 alebo nešpecifickou myšou IgGl
Relatívny vzrast titra protilátok v sáre ©dobrant» v 9. týždni po imunizácii v porovnaní «o sérom odobraným pred imunizáciou a riedeným 1:4 (bunkoví BLISAl
Králik anti-id BR55-2 myiia IgGl Opica anti-id. BRSS-2 tnyáia IgGl
SKBRS (Y+) 1000 16 1000 β
WM9 (V) 3 n.t. 25 n.t
Na obrázkoch 4 a 5 sú zobrazené reprezentatívne krivky väzby lg, ktoré boli získané zo séra králikov a opíc druhu Rhesus pred imunizáciou a po imunizácii. Toto sérum bolo podrobené testu ELISA, pričom sa viazalo na bunky SKBR5. Väzba sérových lg zo zvierat imunizovaných protilátkou anti-id BR55-2 č. E4 na bunky SKBR5 je detegovateľná ešte pri zriedení 1:10 000.
Dva roky po začatí imunizácie dostali príslušné opice druhu Rhesus prvú injekciu upomínacej dávky protilátky anti-id BR55-2 č. E4 alebo nešpecifickej myšej IgGl. Rovnakým spôsobom dostali i druhú jednorazovú upomínaciu dávku 3 roky po počiatočnej imunizácii (t. j. 1 rok po prvej upomínacej látke, (experimentálne detaily pozri príklad 8) sa séra odobrali pred upomínacími dávkami a po týchto upomínacích dávkach.
Celková humorálna odpoveď opíc druhu Rhesus, ktoré boli vakcinované protilátkou anti-id BR55-2 C. E4, bola určená pomocou testu ELISA. Tento test sa robil na mikrotitračných doskách potiahnutých protilátkou anti-id BR55-2 č. E4 (experimentálne detaily pozri príklad 13). V sére všetkých opíc Rhesus bola po prvej imunizácii, ako i po prvej a druhej upomínacej dávke, dokázaná imunitná odpoveď s veľmi vysokým titrom. Väzba sérových lg na protilátku anti-id BR55-2 č. E4 je detegovateľná ešte pri zriedení 1 : 50 000. O niečo nižší titer, ale stále veľmi významný, bol nájdený v sére pred upomínacími dávkami. Tieto výsledky sú zobrazené na obrázkoch 6 až 8.
Humorálna imunitná odpoveď opíc druhu Rhesus, ktoré boli vakcinované nešpecifickou myšou IgGl bola určená pomocou toho istého uvedeného testu ELISA (experimentálne detaily pozri príklad 13). Podľa očakávania sú titre sérových lg týchto zvierat pri väzbe na protilátku anti-id BR55-2 č. E4 nižšie ako titre v sére opíc vakcinovaných látkou anti-id BR55-2 č. E4. Zatiaľ čo imunitná odpoveď opíc Rhesus imunizovaných nešpecifickou myšou protilátkou IgGl krížovo reaguje s konštantnými oblasťami protilátky anti-id BR55-2 č. E4, zreteľne chýba frakcia imunitnej odpovede namierená proti hypervariabilným úsekom antiidiotipovej protilátky. Tieto výsledky sú zobrazené na obrázkoch 9 a 10.
Aby sa zistila nádorová špecificita imunitnej odpovede po prvej imunizácii, ako i pred upomínacími imunizačnými dávkami a po upomínacích imunizačných dávkach, bola určená schopnosť väzby opičích sérových lg na rôzne nádorové Lewis Y pozitívne bunkové línie (z nádoru prsníka, žalúdka, hrubého čreva a malých pľúcnych buniek), ako i na Lewis Y negatívnu melanómovú bunkovú líniu (experimentálne detaily pozri príklad 10). Pri opiciach imunizovaných protilátkou anti-id BR55-2 č. E4 boli v sére odobranom dva roky po prvej imunizácii a pred prvou upomínacou dávkou detegované sérové lg viažuce sa na Lewis Y pozitívne nádorové bunky. Po prvej upomínacej imunizácii výrazne vzrástli titre sérových lg špecificky sa viažucich na Lewis Y pozitívne nádorové bunky zvierat imunizovaných protilátkou anti-id BR55-2 č. E4, pričom nebola detegovaná takmer žiadna schopnosť väzby na antigén negatívnu bunkovú líniu. Pri opiciach imunizovaných nešpecifickou myšou IgGl sa v sére odobranom v ľubovoľnom čase počas experimentu neobjavila žiadna schopnosť špecifickej väzby. Podobné výsledky sa dosiahli pred druhou upomínacou dávkou a po druhej upomínacej dávke. Výsledky titrácií sér získaných v rôznych okamihoch sú zobrazené na obrázkoch 11 - 20. Testy sa vykonávali metodikou ELISA pomocou niekoľkých nádorových bunkových línií. Podobná imunoreaktivita imunoglobulinov z rôznych opičích sér pred prvou imunizáciou a po prvej imunizácii, ako i pred prvou upominacou dávkou a po prvej upomímacej dávke, môže byť demonštrovaná i pri väzbových experimentoch s membránovými prípravkami z Lewis Y pozitívnych buniek SKBR5 (experimentálne detaily pozri príklad 11). Výsledky sú zhrnuté v tabuľke 2.
Tabuľka 2
Upomínacia imunizačná dávka aplikovaná opiciam druhu Rhesus. Opice boli imunizované buď anti-id protilátkou BR55-2 č. E4 alebo nešpecifickou myšou IgGl
Väzba opičích sérových lg na membránové prípravky buniek SKBR5 (ELISA). Relatívny nárast titra proti* látok v porovnaní s 1:4 riedeným predimunižačným sérom
9 týždňov 2 roky po 1. imunizácii 1 týždeň 4 týždne po 1. upomínacej dávke
anti-id BR55-2 40 1 80 50
mlgGl 1 2 n.t. 2
Na podrobnejšie analýzy protilátkovej imunitnej odpovede, indukovanej pri opiciach druhu Rhesus imunizáciou protilátkou anti-id BR55-2 č. E4, boli rôzne séra vakcinovaných opíc imunitné purifikované na stĺpci naplnenom
Sepharosou™ konjugovanou s protilátkou anti-id BR55-2
č. E4 (experimentálne detaily pozri príklad 12). Touto se8
SK 281086 Β6 lektívnou jednokrokovou procedúrou sa separuje úplná frakcia protilátkovej imunitnej odpovede namierená proti protilátke anti-id BR55-2 č. E4 od všetkých ostatných vedľajších sérových proteínov. V prvom experimente boli imunitne purifikované Ig opice druhu Rhesus, imunizované protilátkou anti-id BR55-2 č. E4, zo séra získaného v 4. a 9. týždni po druhej upomlnacej dávke. Podľa ich retenčných časov na kolóne s protilátkou anti-id BR55-2 č. E4 sa získané imunoglobulínové frakcie špecificky viažu na rôzne epitopy molekuly protilátky anti-id BR55-2 č. E4. Tieto Igfrakcie obsahujú protilátky proti konštantným oblastiam protilátky anti-id BR55-2 č. E4 (antiizotypová odpoveď), ako i protilátky proti variabilným oblastiam vrátane väzbového miesta protilátky anti-id BR55-2 č. E4 (antiidiotypová imunitná odpoveď). Podľa teórie idiotypovej siete, uvedenej v úvode, je posledne uvedená časť protilátok (Ab3) obzvlášť dôležitá, pretože má väzbové vlastnosti porovnateľné s vlastnosťami protilátok so špecifitou BR55-2 (Abl).
Ďalej sa určovala väzbová schopnosť tejto imunitné purifikovanej Ig-frakcie zo spojených sér, získaných v 4. a 9. týždni po druhej upomínacej dávke a frakcie, ktorá prešla kolónou, s protilátkami anti-id BR55-2 č. E4 (experimentálne detaily pozri príklad 13). Zatiaľ čo imunitné purifikované Ig-frakcie sa viažu na protilátku anti-id BR55-2 č. E4, vo frakcii, ktorá prešla kolónou, nemožno zistiť žiadnu schopnosť väzby. Týmito výsledkami je dokázaná selektivita a účinnosť tejto imunopurifikačnej metódy (výsledky sú zobrazené na obrázku 21).
Ďalej sa porovnávali väzbové vlastnosti imunitné purifikovanej Ig-frakcie zo zhromaždeného séra, ktoré sa získalo v 4. a 9. týždni po druhej upomínacej dávke, s vlastnosťami frakcie, ktorá prešla kolónou a humanizovanými verziami rodičovských myších Mab (Abl) väzbou na bunky SKBR5 z nádoru prsníka. Tento humanizovaný variant protilátky Abl (BR55-2/humanizovaná IgGl), bol vybraný, aby sa zjednodušilo porovnanie, pretože sa môže detegovať rovnakým činidlom, ktoré sa používa tiež na detekciu imunoglobulínu opíc druhu Rhesus (kozia-antiľudská-Ig/peroxidáza, toto antisérum sa, podobne ako na ľudské, viaže na blízko príbuzné Ig-opic druhu Rhesus). Takmer všetka reaktivita, ktorá viaže nádorové bunky, je akumulovaná do imunitné purifikovanej Ig-frakcie. Týmto výsledkom je dokázaná krížová reaktivita imunoglobulínu opíc druhu Rhesus indukovaných imunizáciou protilátkou anti-id BR55-2 č. E4 s Lewis Y pozitívnou nádorovou líniou. Na základe hmotnostného pomeru je väzbová sila imunitné purifikovanej Ig-frakcie len päťkrát nižšia ako väzbová sila protilátky BR55-2/ humanizovaná IgGl (Abl). Ak vezmeme do úvahy, že len určitá časť z imunitné purifikovanej Ig-frakcie je namierená proti väzbovému miestu protilátky anti-id BR55-2 č. E4, a že podľa teórie siete iba táto časť má väzbové vlastnosti porovnateľné s Abl, je tento výsledok pozoruhodný. Podľa výťažku imunoafínitnej purifikácie séra opíc druhu Rhesus, ktorý bol približne 200 pg imunitné purifíkovanej Ig-frakcie na 1 ml séra, čo zodpovedá približne 40 pg/ml imunoglobulínu so schopnosťou viazať nádorové bunky podobne ako BR55-2/humanizovaná IgGl (výsledky sú zobrazené na obrázku 22, experimentálne detaily pozri príklady 10 a 12).
Porovnanie väzbových vlastností imunitné purifikovaných opičích Ig (Ab3) s protilátkami BR55-2/humanizované IgGl pri väzbe na Lewis Y pozitívnu bunkovú líniu SKBR5 z prsného nádoru a na Lewis Y negatívnu melanómovú bunkovú líniu WM9 je zobrazené na obrázku 23 (experimentálne detaily pozri príklad 10). Zatiaľ čo Ab3 frakcia a protilátka BR55-2/humanizovaná IgGl majú silnú väzbu na Lewis Y pozitívnu bunkovú líniu, ako už bolo o písané, žiadna z protilátok sa špecificky neviaže na Lewis Y negatívnu bunkovú líniu. Týmito výsledkami je dokázaná podobnosť väzbových štruktúr Ab3 - frakcie a humanizovanej Abl.
Podobná imunoreaktivita Ab3-frakcie bola tiež pozorovaná v ELISA teste použitím časti membrán z buniek Lewis Y pozitívnej bunkovej línie SKBR5 a z buniek Lewis Y negatívnej bunkovej línie WM9. Detegovaná bola iba významná väzba Ab3-frakcie iba na membrány pochádzajúce z Lewis Y pozitívnych buniek (výsledky sú zobrazené na obrázku 24, experimentálne detaily pozri príklad 11). Väzbové vlastnosti imunitné purifíkovaných opičích imunoglobulínov (Ab3) boli ďalej dokázané na niekoľkých Lewis Y pozitívnych ľudských nádorových bunkových líniách (z nádorov malých pľúcnych buniek, žalúdka, hrubého čreva, prsníka). Imunitné purifikované opičie Ig sa silne viazali na všetky testované bunkové línie (výsledky sú zobrazené na obrázku 25, experimentálne detaily pozri príklad 10).
Protilátka BR55-2/myšia IgG3 (Abl) spôsobí po naviazaní na nádorové bunky ich deštrukciu pomocou aktivácie ľudských efektorových mechanizmov. Po zistení nádorovo deštrukčnej kapacity opičích Ig, indukovaných imunizáciou protilátkou BR55-2 č. E4, sa použili imunitné purifikované opičie Ig (Ab3). Kvôli tomuto experimentu bola Ab3 frakcia imunitné purifikovaná zo séra opíc druhu Rhesus odobraného 9 týždňov po počiatočnej imunizácii protilátkou anti-id BR55-2 č. E4. Táto Ab3 frakcia bola porovnaná s protilátkou BR55-2/myšia IgG3 (Abl) v ADCC experimente (ADCC-antibody depended cellular cytotoxicity - protilátkami sprostredkovaná bunková cytotoxicita), pri ktorom boli použité ľudské monocyty z periférnej krvi (PBMC) ako efektorové bunky (výsledky sú zobrazené na obrázku 26, experimentálne detaily pozri príklad 14). Imunitné purifikovaná Ab3 frakcia vo vyšších koncentráciách spôsobuje deštrukciu nádorových buniek pomocou aktivácie ľudských efektorových buniek, a to spôsobom porovnateľným s myšou Abl. Týmito výsledkami je dokázaná indukcia selektívnej cytotoxicity namierenej proti nádorovým bunkám pomocou vakcinácie protilátkou anti-id BR55-2 č. E4. Vyššia koncentrácia Ab3 je potrebná iba preto, že iba určitá časť imunitné purifikovanej Ig frakcie je namierená proti väzbovému miestu protilátky anti-id BR55-2 č. E4 a iba táto časť je zodpovedná za väzbu nádorových buniek a sprostredkúva ADCC.
Ako bolo spomenuté už v úvode, je známe, že sacharidový antigén Lewis Y je exprimovaný tiež na ľudských leukocytoch infikovaných vírusom HIV. Na určenie väzbovej afinity sérových Ig opíc druhu Rhesus imunizovaných protilátkou anti-id BR55-2 č. E4 alebo nešpecifickou myšou protilátkou IgGl k bunkám infikovaným vírusom HIV, sa použilo sérum získané pred počiatočnou imunizáciou a 9 týždňov po počiatočnej imunizácii. Tieto séra sa testovali komerčne dostupným kitom, ktorý bol pôvodne určený na detekciu HIV séropozitivity v ľudskom sére. Tento test je založený na schopnosti ľudských sérových Ig viazať sa na ľudské T-lym-focyty bunkovej línie PALL infikované vírusom HIV. Táto väzba je detegovaná nepriamou imunofluorescenciou použitím konjugátu anti-ľudská Ig/FITC (fluoresceín-izo-tio-kyanát). Vďaka veľkej podobnosti ľudských imunoglobulínov s Ig opíc druhu Rhesus, môže byť pôvodné reagens zo skúšobného kitu použité tiež pre opičie IgG. Ako kontrola sa použila väzba na neinfikované PALL bunky (experimentálne detaily pozri príklad 15).
Použitím normálneho séra opíc druhu Rhesus je imunofluorescenčné pozadie tak vírusom HIV infikovaných, ako i neinfikovaných PALL buniek, o niečo vyššie ako imunofluorescenčné pozadie detegované u normálneho ľudské9
SK 281086 Β6 ho séra. Ale na PALL bunky infikované vírusom HIV sa výrazným spôsobom viažu iba sérové Ig opíc Rhesus, ktoré boli imunizované protilátkou anti-id BR55-2 č. E4, zatiaľ čo na neinfikované PALL bunky nebola detegovaná takmer žiadna väzba. Reaktivita sérových Ig od opíc druhu Rhesus imunizovaných nešpecifickou myšou protilátkou IgGl s PALL bunkami infikovanými vírusom HIV je zreteľne menej výrazná a bližšie imunofluorescenčnému pozadiu, ktoré je pozorované pri normálnom opičom sére (výsledky sú zhrnuté v tabuľke 3).
Tabuľka 3
Väzba sérových Ig opíc druhu Rhesus na vírusom HIV infikované/neinfikované bunky línie PALL (nepriama imunofluorescencia, IFA-Anti-HIV 1-Kit Waldheim)
Imunizécía opíc druhu Rhesus Ľudské sérum (kontrola, obsah kitu)
protilátkou anti-id BR5S-2 δ. E4 nelpecífickou mySou IgGl
PALL: HIV+ HIV- HIV+ HIV- HIV+ HIV-
presérum HIV neg. lud. sérum
kone. 1 1 1 1 0 0
1:10 1 1 1 1
sérum 9 týždňov po 1. iiRunizicíí HIV poz. lud. sérum
kone. 3 1 1-2 1 5 0
1:10 3 1 1-2 1
0-5 = intenzita fluorescencie (antiľudský IgG-FITC) 0 = žiadna fluorescencia = maximálna fluorescencia
Ig opíc druhu Rhesus imunizovaných protilátkou anti-id BR55-2 e. E4 boli imunitné purifikované zo zhromaždených sér, ktoré sa získali v 4 a 9. týždni po druhej upomínacej dávke, pomocou afinitnej kolóny s protilátkou anti-id BR55-2 č. E4 (ako už bolo uvedené). Väzbové vlastnosti týchto imunitné purifíkovaných Ig (Ab3) boli porovnané s vlastnosťami protilátky BR55-2/myšia IgG3 (Abl) pomocou spomenutého komerčne dostupného skúšobného kitu, ktorý je určený na zisťovanie HlV-séropozitivity v ľudskom sére (experimentálne detaily pozri príklad 15). Imunitné purifikovaná Ig-frakcia (Ab3) selektívne viaže PALL bunky infikované vírusom HIV, zatiaľ čo na neinfikované PALL bunky nebola zistená žiadna väzba. Podobné väzbové vlastnosti boli zistené i pri protilátke BR55-2/myšia IgG3 (Ab3). Tieto výsledky sú zhrnuté v tabuľke 4.
Tabuľka 4
Väzba Ig opíc druhu Rhesus (Ab3) imunitné purifikovaných na protilátke anti-id BR55-2 č. E4 a protilátky BR55/myšia IgG3 (Abl) na vírusom infikované/neinfikované bunky línie PALL (nepriama imunofluorescencia, IFA-Anti-HIV 1 -Kit Waldheim)
Ab3 BR55-2/myäia igG3 Ľudské sérum
(20gg/ml) (20 pg/ml) (kontrola, obsah
kitu)
PALL: H1V+ HIV- HIV+ HIV- HIV* HIV-
HIV neg. lud. sérum
3 0 2 0 0 0
HIV poz. lud. sérum 5 0
0-5 = intenzita fluorescencie (antiľudský IgG-FITC) 0 = žiadna fluorescencia = maximálna fluorescencia
Okrem svojho použitia ako unikátnej vakcíny na prevenciu a liečbu rôznych druhov nádorov a chorôb spôsobených vírusom HIV, sú antiidiotypové Mabs podľa vynálezu, ktoré majú vlastnosti vnútorného obrazu a sú vytvorené proti väzbovej oblasti protilátky BR55-2, výkonným nástrojom na kvantitatívne určenie monoklonálnych protilátok a ich derivátov alebo fragmentov s väzbovou špecifitou BR55-2. Môžu sa napríklad použiť na selektívne určenie koncentrácie všetkých myších subtypov protilátky BR55-2 v ľudskom sére. Vďaka tomu, že rozoznávajú trojrozmerný tvar väzbovej časti protilátky BR55-2, sú tieto antiidiotypové Mabs schopné väzby iba na imunoreaktívne štruktúry protilátky BR55-2. Táto vlastnosť vedie k tvorbe detekčných systémov, ktoré sú lepšie ako systémy založené na konvenčných reagenciách proti konštantnej oblasti. ELISA systém na kvantitatívne stanovenie imunoreaktívnych protilátok BR55-2/myšia IgG3 alebo BR55-2/ myšia IgG2a je opísaný v príklade 16 a typická kalibračnú krivka týchto Mabs v ľudskom sére je zobrazená na obrázku 27.
Podobný ELISA systém, založený na antiidiotypových Mabs podľa vynálezu, sa môže použiť na vysoko selektívne kvantitatívne stanovenie imunoreaktívnych chimér typu myš/človek vychádzajúcich z protilátky BR55-2, v ľudskom sére. Tieto chiméry pozostávajú z variabilných domén protilátky BR55-2 a z ľudských konštantných oblastí (napr. ľudská IgGl alebo ľudská IgG3 oblasť). Vďaka obrovskému prebytku bežných ľudských Ig v ľudskom sére (> 10 mg/ml) nemôžu byť takéto chimerické protilátky typu myš/človek detegované v ľudskom sére pomocou konvenčných reagencií, ktoré sa viažu na ľudský Fc-koniec, a teda na akékoľvek ľudské Ig prítomné v sére. Tento selektívny ELISA systém je opísaný v príkladoch 17 a 18, typické kalibračné krivky v ľudskom sére sú zobrazené na obrázkoch 28 a 29.
Úplne humanizované varianty protilátky BR55-2 boli skonštruované prenesením oblasti určujúcich komplementaritu (CDRs) myšej rodičovskej Mab na ľudský úsek základnej štruktúry a konštantné oblasti. Pomocou počítačového modelovania bolo vybraných niekoľko bodových mutácií v úseku základnej štruktúry ľudskej protilátky, čo viedlo k humanizovaným variantom, ktoré nijako výrazne nestratili väzbovú afinitu na Lewis Y pozitívne nádorové bunky v porovnaní s rodičovskou myšou Mab. Tak zostala v týchto humanizovaných variantoch zachovaná iba malá časť pôvodnej myšej aminokyselinovej sekvencie, ktorá zaisťuje väzbové charakteristiky. Je pozoruhodné, že všetky monoklonálne protilátky anti-id BR55-2 opisované v tomto vynáleze sa silne viažu tiež na idiotyp týchto humanizovaných IgGl variantov pôvodných rodičovských myších monoklonálnych protilátok IgG3. Väzbové správanie antiidiotypových monoklonálnych protilátok k humanizovaným variantom Abl je porovnateľné so správaním uvedených chimerických monoklonálnych protilátok typu myš/človek. To bolo dokázané pomocou systému BIAcore™ od firmy Pharmacia, ktorý slúži na analýzu biošpecifických interakcií. Vo väčšine prípadov, pri vyšších koncentráciách, bola medzi protilátkami anti-id BR55-2 a BR55-2/chimerická ľudská IgGl alebo BR55-2/humanizovaná IgGl pozorovaná stechiometria takmer 1:1. Experimentálne detaily sú opísané v príklade 19, titračné krivky zobrazujú obrázky 30 až 35. Tieto zistenia zdôrazňujú väzbovú selektivitu antiidiotypových monoklonálnych protilátok k intaktnej trojrozmernej štruktúre hypervariabilnej oblasti všetkých variantov protilátky BR55-2 a dokazujú ich vlastnosti vnútorného obrazu.
Vďaka svojej unikátnej a selektívnej rozpoznávacej štruktúre môžu sa monoklonálne protilátky anti-id BR55-2
SK 281086 Β6 tiež použiť na vysoko selektívne kvantitatívne stanovenie imunoreaktívnych humanizovaných protilátok so špecifítou BR55-2 v ľudskom sére napriek veľkému prebytku ľudských imunoglobulínov prítomných v sére. Ten istý ELISA systém je použiteľný na kvantitatívne stanovenie humanizovaných protilátok so špecifítou BR55-2 v opičom sére. Toto je napr. dôležité na vykonávanie farmakokinetických a toxikologických skúšok, ktoré sú potrebné počas preklinického vývoja humanizovaných monoklonálnych protilátok BR55-2 na pasívnu imunoterapiu. Tento ELISA systém je opísaný v príklade 20, typická kalibračná krivka v ľudskom sére je zobrazená na obrázku 36.
Rozpoznanie väzbového miesta všetkých variantov protilátok BR55-2 monoklonálnymi protilátkami anti-id BR55-2 je tiež demonštrované kompetitívnou inhibíciou väzby protilátky BR55- 2/myšia IgG3 na anti-id BR55-2 č. E4, ktorá je spôsobená protilátkami BR55-2/chimerická ľudská IgGl a BR55-2/chimerická ľudská IgG3. Obe chiméry kompetitívne inhibujú väzbu stálej koncentrácie rodičovskej myšej Mab na protilátku anti-id BR55-2 č. E4, a to spôsobom závislým od dávky. Táto kompetitívna ELISA je opísaná v príklade 21 a výsledky opisuje obrázok 27.
Väzba protilátky BR55-2/myšia IgG3 na antigén-pozitívne nádorové bunkové línie je nutná na následnú deštrukciu týchto buniek pomocou komplementu. Inhibícia nádorovej cytotoxicity monoklonálnymi protilátkami anti-id BR55-2 odráža ich schopnosť blokovať väzbu protilátky Abl na svoj antigén na bunkovom povrchu. Silná neutralizácia cytotoxicity, závislej od komplementu, protilátkou anti-id BR55-2 č. E4, je zobrazená na obrázku 38. Pri tomto pokuse boli bunky SKBR5 z ľudského nádoru prsníka atakované protilátkou BR55-2/myšia IgG3 (experimentálne detaily pozri príklad 22).
Vzhľadom na veľmi špecifickú schopnosť rozpoznať všetky štruktúry s intaktným väzbovým miestom BR55-2, môžu sa monoklonálne protilátky anti-id BR55-2 použiť na jednostupňovú imunopurifikačnú procedúru, ktorá slúži na získanie všetkých variantov protilátky BR55-2. Protilátka anti-id BR55-2 č. E4 bola naviazaná na CH-Sepharosu 4B. Tento imunoafinitný materiál sa môže napríklad použiť na priamu postupujúcu purifikáciu protilátky BR55-2/chimerická ľudská IgGl, ktorá bola kultivovaná in vitro. Chimerická Mab sa získala vo výťažku 75 % pri čistote 95 %. Vďaka svojej vyššej selektivite je tento spôsob imunopurifikácie výhodnejší než afínitná purifíkácia pomocou proteínu A. Experimentálne detaily pozri príklad 23, SDS-PAGE je zobrazená na obrázku 39. Neboli zistené žiadne nečistoty. Rovnaký spôsob, s podobnými výsledkami, sa môže úspešne použiť na vysoko efektívnu jednostupňovú purifíkáciu supematantov bunkových kultúr, ktoré obsahujú humanizované varianty protilátky BR55-2 získané prenosom oblasti CDR.
Imunizácia králikov a opíc druhu Rhesus myšími monoklonálnymi anti-idiotypovými protilátkami IgGl proti idiotypu protilátok so špecifítou BR55-2 (anti-id BR55-2 č. E4) vedie k vysokým titrom protilátok, ktoré sa špecificky viažu na Lewis Y pozitívne ľudské nádorové bunky. Ako bolo demonštrované v experimetoch s opicami Rhesus, zostáva po opakovanej upomínacej imunizačnej dávke antitumorová imunita počas niekoľkých rokov. Ig, ktoré vznikli pri týchto imunizáciách, majú v prítomnosti ľudských efektorových buniek nádorovú cytotoxicitu v rámci ADCC. Špecifita imunizácie antiidiotypovými protilátkami je dokázaná súčasnou imunizáciou kontrolnej skupiny opíc druhu Rhesus nešpecifickou myšou IgGl. Napriek výraznej imunitnej odpovedi na nešpecifickú myšiu protilátku IgGl, nebola detegovaná žiadna špecifická väzba na akýkoľvek druh nádorových buniek.
Tieto výsledky potvrdzujú možnosť použitia monoklonálnych protilátok anti-id BR55-2 ako náhradky za nádorovo združený antigén Lewis Y na terapeutickú a preventívnu aktívnu imunizáciu s cieľom indukovať ochrannú protinádorovú imunitu. Imunizácia opič druhu Rhesus monoklonálnou protilátkou anti-id BR55-2 ďalej vedie k tvorbe vysokého titra protilátok, ktoré sa selektívne viažu na bunky infikované vírusom HIV. O týchto bunkách je známe, že exprimujú antigén Lewis Y. Oproti tomu imunizácia opíc druhu Rhesus nešpecifickou myšou protilátkou IgGl nevedie k tvorbe protilátok so špecifickou väzbou na HIV pozitívne alebo negatívne bunky. Týmito výsledkami je potvrdené použitie monoklonálnych protilátok anti-id BR55-2 ako náhradky za sacharidový antigén Lewis Y na terapeutickú a preventívnu vakcináciu človeka s cieľom indukovať ochrannú imunitu proti vírusu HIV a chorobám spôsobených infekciou vírusom HTV.
Okrem použitia monoklonálnych protilátok anti-id BR55-2 ako preventívnych a terapeutických vakcín, sú tieto antiidiotypové monoklonálne protilátky s vlastnosťami vnútorného obrazu použiteľné ako reagencie na vysoko selektívne a kvantitatívne stanovenie molekúl so špecifítou BR55-2 vrátane chimerických a humanizovaných variantov v sére alebo v iných telových tekutinách. Tieto anti-id Mabs, kovalentne naviazané na vhodnej matrici, sa môžu použiť aj na vysoko selektívnu jednostupňovú imunoafinitnú purifikáciu všetkých molekúl so špecifítou BR55-2, a to s vysokými výťažkami.
Vynález je ďalej opísaný v nasledujúcich príkladoch; Význam použitých skratiek:
ADCC: antibody depended cellular cytotoxicity - bunková cytotoxicita sprostredkovaná protilátkami.
BSA: bovine sérum albumín - hovädzí sérový albu- ~mín . CDC: complement depended cytotoxicity - cyto toxicita sprostredkovaná komplementom
DMEM: Dulbeccovo modifikované Eaglove médium
EDC: N-etyl-N-(3-dimetyl-aminopropyl)-karboimid hydrochlorid
HEPES: kyselina N-(2-hydroxyetyl)piperazín-N-2-etano-sulfónová
ELISA: enzýme linked imunosorbent assay - imunosorpčná metóda používajúca enzýmové konjugáty FCS: fetal calf sérum - fetálne teľacie sérum
HBS: HEPES buffered saline - fyziologický roztok tlmený HEPES
Mab: monoklonálna protilátka
NHS: N-hydroxy-sukcínimid
PBMC: peripheral blood mononuclear cells - ľudské monocyty z periférnej krvi
PBS: phosphate buffered saline - fyziologický roztok tlmený fosfátom
RAM-IgGl: rabbit-anti-mouse IgGl - králičia-antimyšia IgGl
RPMI: Roswell Park Memoriál Inštitúte - aminokyselinové médium
SDS: dodecyl-sulfát sodný
KLH: keyhole limpet hemocyanin - hemocyanín z morských živočíchov Megathura crenulata
SPDP: N-sukcínimidyl-3-(2-pyridyl-ditio-propionát)
PAGE: polyakrylamidová gélová elektroforéza
IEF: izoelektrická fokusácia
PEG: poly-etylénglykol
FITC: fluoresceín izotiokyanát
1FA: immunofluorescence assay
SK 281086 Β6
Materiál opisovaný v príkladoch:
Mikrotitračné dosky: Immunoplates II (Nunc)
Bunkové línie:
SKBR5: bunková línia z ľudského nádoru prsníka
CATO: bunková línia z ľudského nádoru žalúdka
SW948: bunková línia z ľudského nádoru hrubého čreva
SW2: bunková línia z ľudského nádoru malých pľúcnych buniek
WM9: ľudská melanómová bunková línia
PALL: ľudská línia T-lymfocytov
SP2: myšia myelómová bunková línia
Médium A: RPMI 1640 + 2 g/1 NaHCOj
100 U/ml penicilínu G
100 pg/ml sulfátu streptomycínu mM glutamín % FCS (tepelne inaktivovaný, zbavený γ-globulínu)
Médium B: RPMI 1640 + 2 g/l NaHCOj
100 U/ml penicilínu G
100 pg/ml sulfátu streptomycínu mM glutamín % FCS (tepelne inaktivovaný)
Médium C: DMEM % NCTC-135 (syntetické médium, Gibco) % MEM (neesenciálne aminokyseliny, Gibco)
0,5 % pyruvát sodný
0,5 % kyselina oxaloctová (Sigma) % FCS (tepelne inaktivovaný)
100 U/ml penicilínu G
100 pg/ml sulfátu streptomycínu mM glutamín
Médium D: Médium C + 1,36 mg/1 hypoxantínu
0,39 mg/1 tymidínu
Médium E: Médium D + 0,4 mg/1 aminopterínu
Médium F: Médium C + myšie tymocyty (tymocyty jednej myši Balb/c resuspendované v 25 ml média C)
Médium G: DMEM % FCS (tepelne inaktivovaný)
100 U/ml penicilínu G
100 pg/ml sulfátu streptomycínu mM glutamín
Médium H: 10 mM kyselina N-(2-hydroxyetyl)piperazín-Ν-2-etanosulfónová
3,4 mM kyselina etylén-dinitrilo-tetraoctová 0,15 M NaCl
0,005 % P20 (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Švédsko)
PEG: polyetylén-glykol (mol. hm. 3400) g rozpustený v 1 ml DMEM
Neúplný PBS: 138,0 mM NaCl l,5mMK0H
2,7 mM KC1
6,5 mM Na2HPO4 pH 7,2
Poťahovací pufer: 15 mM Na2COj mM NaHCOj mM NaNj pH 9,6
Farbiaci pufer: 24,3 mM kyselina citrónová 35mMNa2HPO4 pH 5,0
Premývací pufer: 2 % NaCl
0,2 %TritonX-100 v neúplnom PBS
Roztok substrátu: 40 mg o-fenyléndiamín-dihydrochloridu
100 ml farbiaceho pufŕa μΐ 30%H2O2
Väzbový pufer: 0,1 M Tris/HCl
0,2 M NaCl pH 7,5
Elučný pufer: 0,15 M glycín/HCl
0,2 M NaCl pH 2,8
Konjugačný pufer: 0,1 M NaHCOj
0,5MNaCl pH 8,0
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1: Tvorba monoklonálnych protilátok BR55-2 Imunizácia myší
Myši BALB sa imunizujú vždy 100 pg dávkou F(ab')2 fragmentu protilátky BR55-2/myšia IgG3, ktorý je naviazaný pomocou SPDP na KLH, ako bolo opísané (J. Carlson a kol., Biochem. J. 173,723,1978). Imunizácia sa vykonáva intraperitoneálnou injekciou podľa nasledujúcej schémy: Deň 0:100 pg konjugáiu (1 mg/ml v neúplnom PBS) + 100 pl úplného Freundovho adjuvans.
Deň 7-28: 100 pg konjugátu (1 mg/ml v neúplnom PBS) + + 100 pl neúplného Freundovho adjuvans.
V dňoch 8, 9, 10 a 11 po počiatočnej imunizácii sa intravenózne podajú celkom 4 upomínacie dávky (každá so 100 pg konjugátu v 100 μΐ neúplného PBS). 12. deň sa aseptický odoberú sleziny, suspendujú sa v neúplnom PBS a potom
3-krát premyjú neúplným PBS.
Hybridizácia
Tieto slezinové bunky sa pridajú k suspenzii buniek SP2/O v pomere 1:1a centrifiigujú sa pri 900 g počas 5 minút. Potom sa k sedimentu buniek po kvapkách pridá 1 ml roztoku PEG (37 °C, v priebehu 1 minúty), potom sa sediment rozpustí v 1 ml neúplného PBS (37 °C) v priebehu ďalšej minúty. Pri miernom miešaní sa k suspenzii pridá 10 ml média C a potom sa suspenzia nariedi do celkového objemu 50 ml neúplným pufrom PBS. Suspenzia sa 5 minút centrifuguje pri 800 g, potom sa sediment resuspenduje v médiu B a bunky sa prenesú do jamiek na mikrotitračnej doske (Nunc 96) pri koncentrácii 2,5 x 105 buniek na jamku. Na doskách sa nechajú inkubovať cez noc pri 37 °C v atmosfére 5 % CO2 a potom sa pridá 100 μΐ na jamku média E. Po 72 hodinách a potom každé 4 dni sa médium vymieňa za médium D.
SK 281086 Β6
Príklad 2: Kvantitatívne stanovenie myších IgG v supematantoch hybridómov
100 μΐ králičej-antimyšej IgG (napr. reagencie firmy Nordic, 1 : 1000 v poťahovacom pufri) sa vloží do jamiek na mikrotitračnej doske, potom sa dosky nechajú 60 minút inkubovať pri 37 °C. Potom sa dosky 6-krát premyjú premývacím pufrom, pridá sa 200 μΐ neúplného PBS s 5 % FCS a potom sa inkubujú 30 minút pri 37 °C. Potom sa dosky opäť premyjú tak, ako už bolo opísané. Potom sa pridá 100 μΐ supematantov z hybridómov, ktoré sa získali po 2 týždňoch kultivácie. Dosky sa inkubujú 60 minút pri 37 °C. Nenaviazaná protilátka sa vymyje, ako už bolo opísané, a potom sa pridá 10 μΐ konjugátu peroxidáza/králičiaantimyšia IgG (napr. od firmy Dianova, 1: 1000 v PBS s 2 % FCS). Po polhodinovej inkubácii pri 37 °C sa dosky
4-krát premyjú premývacím pufrom a 2-krát farbiacim pufrom. Potom sa pridá 100 μΐ roztoku substrátu a farebná reakcia sa po 5 minútach zastaví pridaním 50 μΐ 4N H2SO4. Fotometrická extincia sa meria pri vlnovej dĺžke 492 nm (referenčné meranie 620 nm).
Príklad 3: Špecifická väzba IgG z hybridómových supernatantov na F(ab')2 fragment protilátky BR55-2 (ELISA)
Hybridómy produkujúce dostatočné množstvo myších IgG (t. j. s 10-krát vyššou absorbanciou než médium - blank) sa rozklonujú na jednotlivé bunky, ktoré dajú základ vzniku bunkových kultúr. Klonovanie prebieha v médiu F a počas nasledujúcich 2 týždňov sa kultúry kultivujú v médiu C. Supematanty sa testujú tak, ako bolo opísané v príklade 2, použitím 100 μΐ fragmentu F(ab')2 protilátky BR55-2 (10 pg/ml v poťahovacom pufri).
Príklad 4: Inhibícia protilátky BR55-2/myšia IgG2 na bunky SKBR5 z nádore ľudského prsníka spôsobená IgG z hybridómových supematantov (bunková ELISA)
Všetky hybridómové supematanty, ktoré sú pozitívne podľa opísaných skúšok, sa testujú nasledovne: mikrotitračné dosky sa najprv potiahnu hydrobromidom poly-L-lyzínu (20-30 kD, 20 pg/ml v neúplnom PBS, 100 μΐ na jamku, 30 minút, izbová teplota), premyjú sa 2-krát neúplným PBS (200 μΐ na jamku) a potom sa cez noc inkubujú pri 4 °C s 50 ml (na jamku) suspenzie buniek SKBR5 v médiu B (4 x 10δ buniek/ml). Po odstránení supematantov sa bunky fixujú 50 μΐ glutaraldehydu na jamku (0,1 % vo fyziologickom roztoku) v priebehu 5 minút pri izbovej teplote, potom sa supematanty odstránia, bunky sa resuspendujú v 200 μΐ na jamku neúplného PBS (1 % BSA) 0,1 % NaN3 a nechajú sa 1 hodinu pri izbovej teplote. Potom sa supematanty odstránia a dosky 2-krát premyjú 200 μΐ na jamku PBS s obsahom 0,05 % TWEENu™.
Supematanty hybridómov sa nariedia tak, aby koncentrácia myších IgG bola 1 μΐ/ml. Najprv sa inkubujú s 10-násobným prebytkom nešpecifickej myšej IgG 30 minút pri 37 °C. Potom sa tieto vzorky inkubujú s 0,5pg/ml protilátky BR55-2/myšia IgG2 v priebehu 30 minút pri 37 °C. Potom sa 100 μΐ tejto zmesi pridá k bunkám na doskách a inkubuje sa 1 hodinu pri 37 °C.
Spracovanie zmesi: Nenaviazaná protilátka sa odstráni dvojnásobným premytím 100 μΐ na jamku ľadového PBS, ktofy obsahuje 0,05 % TWEENu™, potom sa pridá 100 μΐ konjugátu peroxidáza/králičia-antimyšia IgG2 (napr. reagencia firmy Zymed, 1 : 1000 v neúplnom PBS v 2 % FCS). Po 45 minútovej inkubácii pri 37 °C sa jamky 3-krát premyjú spomenutým roztokom PBS/TWEEN™ 20 a potom sa do každej jamky pridá 100 μΐ substrátového roztoku. Po 5 minútach sa farebná reakcia zastaví pridaním 50 μΐ 4N H2SO4 na jamku. Väzba protilátok na bunky sa stanoví meraním extinkcie pri vlnovej dĺžke 492 nm (referenčné meranie 620 nm).
Príklad 5: Imunoafinitná purifikácia monoklonálnych protilátok anti-id BR55-2
Príprava SepharosyTM konjugovanej s protilátkou BR55-2/myšia IgG2a g mrazom vysušenej aktivovanej CH-Sepharosy 4B sa suspenduje v 1 mM HC1, potom sa prenesie na filter z kremičitého skla a premýva sa 15 minút 2 11 mM HC1. Ligand (120 mg protilátky BR55-2/myšia IgG2a) rozpustený v 50 ml konjugačného pufra sa zmieša s premytým gélom v uzavretej nádobe, ktorá sa otáčaním intenzívne mieša 1 hodinu pri izbovej teplote. Gél sa potom premyje konjugačným pufrom a inkubuje 1 hodinu s 50 ml IM etanolamínu, čím sa zablokujú všetky zvyšné aktívne skupiny. Afinitný sorbent sa potom premyje tromi cyklami meniaceho sa pH. Každý cyklus pozostáva z premytia pri pH 4 (0,1 M acetát, 0,5M NaCl), po ktorom nasleduje premytie pri pH 8 (0,1 M Tris, 0,5MNaCl).
Izolácia monoklonálnych protilátok anti-id BR55-2
Chromatografia sa vykonáva pri 4 °C. Kolóna (BIO REX MP s priemerom stĺpca 1,5 cm) sa naplní Sepharosou™ s naviazanou Mab BR55-2/myšia IgG2 (objem 35 ml). Gél sa premyje väzbovým a elučným pufrom. Potom, keď sa ustanoví rovnováha s väzbovým pufrom, nechá sa kolónou pretekať médium obsahujúce protilátku anti-id BR55-2 prietokovou rýchlosťou 15 ml/min. Po elúcii priechodnej frakcie sa väzba protilátky anti-id BR55-2 na kolónu uvoľní elučným pufrom a okamžite po desorpcii sa neutralizuje IM pufrom Tris(HCl pH 7,5.
Koncentrovanie monoklonálnych protilátok anti-id BR55-2.
Uskutoční sa skoncentrovanie eluovaného roztoku pror tilátok (0,12 mg/ml v miešanej ultrafiltračnej cele Amicon pomocou membrány PM10 Diaflo. V roztoku zostane viac, ako 98 % IgG, konečná koncentrácia IgG je 3,7 mg/ml.
Príklad 6: Charakterizácia purifikovaných monoklonálnych protilátok anti-id BR55-2
Chromatografia na ionexe Mono-Q Kolóna: Mono-Q HR5/5 (Pharmacia) Pufer A: 20 mM trietanolamín pH 7,7 Pufer B: 20 mM trietanolamín, 1M NaCl, pH 7,7 Rýchlosť prietoku: 1 ml/min.
Detekcia: UV 280 nm Gradient: lineárny, zvýšenie o 2 % za minútu Výsledky: > 95 % čistota všetkých anti-id BR55-2 Mabs
Vysoko výkonná chromatografia s rozdelením podľa veľkosti
Kolóna: Zorbax™ GF250,9,4 x 250 mm
Pufer: 0,1 M fosfát sodný, 0,2M NaCl, pH 7,0
Rýchlosť prietoku: 1 ml/min.
Detekcia: UV 280 nm
Výsledky: > 95 % čistota všetkých anti-id BR55-2
Mabs
SDS-PAGE
Experimenty sa vykonávali tak v redukujúcich, ako aj neredukujúcich podmienkach, podľa Laemmliho metódy v % akrylamidovom géli. Neboli zistené žiadne nečistoty (výsledky sú zobrazené na obrázku 1).
SK 281086 Β6
Izoelektrická fokusácia
Analýza sa vykonala pomocou systému Phast (Pharmacia) v pH gradiente od 3 do 9 (Phast gél IEF 3 až 9). Potom sa vykonalo farbenie striebrom (výsledky sú zobrazené na obrázku 2).
Príklad 7: Väzba protilátky BR55-2/myšia IgG3 na bunkovú líniu SKBR5 (bunková ELISA), inhibícia purifikovanými antiidiotypovými protilátkami
Mikrotitračné dosky sa potiahnu tak, ako bolo opísané v príklade 4. Príslušná monoklonálna protilátka anti-id BR55-2 sa rozpustí v neúplnom PBS obsahujúcom 2 % FCS (10 až 0,5pg/ml). Ku každému z týchto zriedení sa pridá 1 pg/ml protilátky BR55-2/myšia IgG3. 100 μΐ tejto zmesi sa potom pridá k bunkám, a potom sa dosky inkubujú 1 hodinu pri 37 °C. Zmes sa spracuje tak, ako je opísané v príklade 4. Rozsah väzby protilátky BR55-2/myšia IgG3 bunky sa stanoví meraním extinkcie pri vlnovej dĺžke 492 nm (referenčné meranie 620 nm).
Príklad 8: Imunizácia králikov a opíc druhu Rhesus protilátkami anti-id BR55-2 č. E4
Imunizácia králikov protilátkou anti-id BR55-2 č. E4
Tri samičky činčilieho králika sa imunizujú intradermálnou aplikáciou 300 pg protilátky anti-id BR55-2 č. E4 adsorbovanej na hydroxide hlinitom (1 mg protilátky s 3,3 mg A1(OH)3 v 1 ml neúplného PBS) v dňoch 1,8, 15 a 36. Tri králiky sa imunizujú rovnakým množstvom nešpecifickej myšej protilátky IgGl v rovnakých podmienkach a slúžia tak ako negatívna kontrola. Séra sa odoberú pred imunizáciou a v 9. týždni po prvej imunizácii.
Imunizácia opíc druhu Rhesus protilátkou anti-id BR55-2 č. E4
Tri opice druhu Rhesus sa imunizujú subkutánnou (s. c.) aplikáciou protilátky (0,1 mg protilátky anti-id BR55-2 č. E4 na 1 kg živej váhy) adsorbovanej na hydroxid hlinitý (1 mg protilátky s 3,3 mg A1(OH)3 na 1 ml neúplnej PBS) v dňoch 1, 8,15 a 36. V rovnakých podmienkach sa dve opice imunizujú rovnakým množstvom nešpecifickej myšej protilátky IgGl ako negatívna kontrola. Séra sa odoberú pred imunizáciou a v 4. a 9. týždni po prvej imunizácii. Dva roky po počiatočnej imunizácii dostali tie isté opice prvú s. c. upomínaciu dávku s protilátkou anti-id BR55-2 č. E4 alebo s nešpecifickou myšou IgGl (rovnaké množstvo a zloženie ako vyššie). Séra sa odobrali 1. a 4. týždeň po prvej upomínacej imunizácii.
Tri roky po počiatočnom imunizačnom cykle (t. j. 1 rok po prvej upomínacej dávke) dostali tie isté opice druhú s. c. upomínaciu látku s protilátkou anti-id BR55-2 č. E4 alebo s nešpecifickou IgGl (rovnaké množstvá a zloženia ako predtým). Sérum sa odobralo pred druhou upomínacou dávkou, ako aj v 1., 4. a 9. týždeň po tejto druhej upomínacej dávke.
Príklad 9: Väzba králičích sérových Ig na bunkové línie SKBR5 alebo WM9 (bunková ELISA)
Najprv sa mikrotitračné dosky potiahnu tak, ako bolo opísané v príklade 4. Potom sa pridá k bunkám 100 pl králičieho séra vo vhodnom zriedení a dosky sa inkubujú 1 hodinu pri 37 °C. Väzba protilátky na bunky sa stanoví meraním extinkcie pri vlnovej dĺžke 492 nm (referenčné meranie 620 nm).
Príklad 10: Väzba sérových Ig opíc druhu Rhesus alebo imunitne purifikovaných Ig (Ab3) na ľudské nádorové bun kové línie SKBR5, CATO, SW948, SW2 a SW9 (bunková ELISA)
Najprv sa mikrotitračné dosky potiahnu tak, ako bolo opísané v príklade 4. Potom sa k bunkám na doskách pridá 100 μΐ séra opíc druhu Rhesus alebo imunitné purifikovaná Ig opíc druhu Rhesus (pozri tiež príklad 12) a protilátka BR55-2/humanizovaná IgGl ako kontrola, všetko vo vhodných riedeniach. Dosky sa inkubujú 1 hodinu pri 37 “C. Zmes sa spracuje tak, ako bolo opísané v príklade 4. Väzba protilátky na bunky sa stanoví meraním extinkcie pri vlnovej dĺžke 492 nm (referenčné meranie 620 nm).
Príklad 11: Väzba sérových Ig opíc druhu Rhesus alebo imunitne purifikovaných Ig (Ab3) na prípravky z bunkových membrán nádorových buniek SKBR5 alebo WM9 (ELISA)
Najprv sa pripravia, spôsobom opísaným v práci D. Thom a kol., Biochem. J. 168,187 - 194 (1977), membrány z Lewis Y pozitívnych buniek z nádoru ľudského prsníka a z Lewis Y negatívnych melanómových buniek WM9. Do jamiek na mikrotitračných doskách sa pridá 100 μΐ príslušného membránového prípravku (10 pg/ml, riedené v poťahovacom pufri), potom sa dosky cez noc inkubujú pri 4 °C. Potom sa dosky premyjú 4-krát premývacím pufrom, pridá sa 200 μΐ neúplného PBS s 5 % FCS a inkubujú sa 30 minút pri 37 °C. Potom sa dosky premyjú tak, ako už bolo opísané. Potom sa pridá 100 μΐ séra opíc druhu Rhesus alebo imunitné purifikovaných Ig opíc druhu Rhesus (pozri tiež príklad 2) vo vhodných zriedeniach v neúplnom pufri PBS s 2 % FCS a dosky sa inkubujú 60 minút pri 37 °C. Nenaviazaná protilátka sa vymyje tak, ako už bolo opísané. Potom sa pridá 100 μΐ konjugátu peroxidáza/kozia-antiľudská IgG (napr. od firmy Chemicon & Co, 1 : 1000 v PBS s 2 % FCS). Po inkubácii 30 minút pri 37 °C sa dosky 2-krát premyjú premývacím pufrom a 2-krát farbiacim pufrom.
Potom sa pridá 100 μΐ substrátového roztoku a po 5 minútach sa farebná reakcia zastaví pridaním 50 μΐ 4N H2SO4. Absorbancia sa zmeria pri vlnovej dĺžke 492 nm (referenčné meranie pri 620 nm).
Príklad 12: Imunoafinitná purifikácia sérových Ig (Ab3) opíc druhu Rhesus imunizovaných protilátkou anti-id BR55-2 č. E4, pomocou afinitného nosiča Sepharosa™ /anti-id protilátka BR55-2 č. E4
Príprava afinitného nosiča Sepharosa-protilátka anti-id BR55-2 č. E4 g mrazom vysušenej aktivovanej CH-Sepharosy 4B sa suspenduje v 1 mM HCl, prenesie sa na filter z kremičitého skla a premýva 21 lmM HCl 15 minút. 95 mg ligandu (protilátka anti-id BR55-2 č. E4) rozpusteného v 50 ml konjugačného pufra sa zmieša s premytým gélom v uzavretej nádobe, ktorá sa dôkladne otáčaním premiešava 1 hodinu pri izbovej teplote. Gél sa potom premyje konjugačným pufrom a inkubuje 1 hodinu s 50 ml IM etanolamínu tak, aby sa zablokovali akékoľvek zvyšné aktívne skupiny. Afmitný sorbent sa potom premyje tromi cyklami meniaceho sa pH. Každý cyklus pozostáva z premytia pri pH 4 (0,lM acetát, 0,5M NaCl), po ktorom nasleduje premytie pri pH 8 (0,1 M Tris, 0,5M NaCl).
Izolácia sérových Ig opíc druhu Rhesus (Ab3) imunizovaných protilátkou anti-id BR55-2 č. E4
Chromatografia sa uskutočňuje pri 4 °C. Kolóna Pharmacia HR5/2 (vnútorné rozmery 5 x 25 mm) sa naplní Sepharosou™ s naviazanou protilátkou anti-id BR55-2 č. E4
SK 281086 Β6 (objem 0,5 ml). Gél sa premyje väzbovým a elučným pufrom. Počiatočným materiálom sú 2 ml séra opíc druhu Rhesus imunizovaných protilátkou anti-id BR55-2 č. E4, ktoré sa získali 9 týždňov po počiatočnej imunizácii. Na ďalšie série experimentov boli použité 2 ml spojených sér opíc druhu Rhesus imunizovaných protilátkou anti-id BR55-2 č. E4, získaných v 4. a 9. týždni po druhej upomínacej dávke. Príslušné sérum sa nariedi 1 : 2 vo väzbovom pufri a nanesie na kolónu. Po elúcii priechodnej frakcie sa naviazaný opičí imunoglobulín desorbuje elučným pufrom a neutralizuje okamžite po desorpcii pufrom IM Tris/HCl pH 7,5.
Príklad 13: Väzba sérových Ig alebo imunitné purifikovaných Ig opíc druhu Rhesus, ktoré boli imunizované protilátkou anti-id BR55-2 č. E4 alebo nešpecifickou myšou IgGl, na protilátku anti-id BR55-2 č. E4 (ELI- SA)
100 μΐ roztoku protilátky anti-id BR55-2 č. E4 (10 pg/ml, riedené v poťahovacom pufri) sa nanesie do jamiek na mikrotitračných doskách a inkubujú sa 60 minút pri 37 °C. Dosky sa 6-krát premyjú premývacím pufrom a potom sa pridá 200 μΐ neúplného PBS s 5 % FCS a inkubujú sa 30 minút pri 37 °C. Potom sa dosky opäť rovnakým spôsobom premyjú. Opičie sérum alebo imunitné purifikované opičie Ig sa nariedi v neúplnom PBS s 2 % FCS. 100 μΐ týchto vzoriek sa pridá do jamiek na mikrotitračných doskách a inkubujú sa 60 minút pri 37 °C. Nenaviazaná protilátka sa vymyje tak, ako už bolo opísané, a potom sa pridá 100 pg konjugátu peroxidáza/kozia-antiľudská Ig (napr. reagencie od firmy Chemicon & Co., 1 : 1000 v PBS s 2 % FCS). Po 30 minútach inkubácie pri 37 °C sa dosky premyjú 4-krát premývacim pufrom a 2-krát farbiacim pufrom. Potom sa pridá 100 μΙ roztoku substrátu a po 5 minútach sa farebná reakcia zastaví pridaním 50 μΐ 4N H2SO4. Absorbancia sa zmeria pri vlnovej dĺžke 492 nm (referenčné meranie pri 620 nm).
Príklad 14: Protilátkami sprostredkovaná bunková cytotoxicita (ADCC) buniek SKBR5 sprostredkovaná imunitné purifikovanými opičími Ig (Ab3) alebo protilátkou BR55-2/myšia IgG3 použitím ľudských monocytov PBMC
Deň pred vlastným testom sa bunky SKBR5 prenesú do čerstvého média A a inkubujú sa pri 37 °C v atmosfére 5 % CO2 vo fľaši na pestovanie bunkových kultúr.
Označovanie cieľových buniek chrómom 5lCr
Bunky sa odoberú z kultivačnej nádoby a inkubujú sa pri koncentrácii 5 x 106 v 800 μΐ média A pri 37 °C v 5 % CO2 počas jednej hodiny spolu so 100 pCi Na2 51CrO4. Potom sa bunky premyjú médiom A, aby sa odstránil prebytok 51Cr, resuspendujú sa v čerstvom médiu, a nariedia sa na koncentráciu 2,5 x 10s buniek na 1 ml.
Izolácia PBMC ml heparízovanej čerstvej ľudskej krvi sa zmieša so 60 ml úplného PBS s obsahom 0,1 glukózy. 15 ml tohto roztoku sa navrství na 15 ml roztoku Ficoll-Paque, kyvety sa centrifiigujú pri 400 g v priebehu 30 až 60 minút. Plazmatické supematanty sa odstránia, vrstvy obsahujúce PBMC sa zhromaždia a rozpustia v 50 ml úplného PBS s obsahom 0,1 % glukózy. Potom sa centrifúgujú pri 80 g (10 minút), sediment sa resuspenduje 25 až 30 ml úplného PBS s 0,1 % glukózy, znovu sa centrifiigujú (80 g, 10 minút), sediment sa odoberie, suspenduje v médiu A, bunky sa spočítajú a suspenzia sa nariedi médiom A na koncentráciu približne 2 x 106 až 9 x 106 buniek/ml. 100 μΙ sa napipetuje do každej jamky na mikrotitračnej doske a potom sa efektorové bunky inkubujú cez noc pri 37 °C v 5 % CO2.
Bunková cytotoxicita závislá od protilátok (ADCC)
100 μΐ cieľových buniek označených 51Cr sa pridá k preinkubovaným bunkám vo zvolenom pomere efektorových buniek k cieľovým. Potom sa pridá 50 μΐ imunitné purifikovaného opičieho Ig (Ab3) alebo protilátky BR55-2/myšia IgG3, nariedené do zvolenej koncentrácie neúplným PBS a potom sa dosky inkubujú cez noc (približne 18 hodín) pri 37 °C v 5 % CO2. Supematanty sa potom odoberú pomocou Skatron-Harvesting Press a ich žiarenie sa zmeria na γ-počítači. Tieto výsledky sú hodnoty platné pre experimentálne uvoľnenie. Celkové uvoľnenie 5lCr sa stanoví, ako je opísané, s tým, že bunky PBMC sa nahradia 100 μΐ 2 % SDS, 50 mM Na2CO3 a 10 mM EDTA, a roztok protilátok sa nahradí 50 μΐ neúplného PBS. Spontánne uvoľnenie 5lCr sa získa tak, že sa nahradia bunky PBMC 100 μΐ média A a roztok protilátok 50 μΐ neúplného PBMC.
% Lyzovaných experim.uvoľnenie - spontánne uvoľnenie buniek ..........— —— ----------- x 1OO celková uvoľnenie - spontánne uvoľnenie
Príklad 15: Väzba séra opíc druhu Rhesus, imunitné purifikovaných Ig opíc druhu Rhesus alebo protilátky BR55-2/ /myšia IgG3 na PALL bunky infikované a neinfikované vírusom HIV (nepriama imunofluorescencia, IFA-anti-HIVlKit, Waldheim)
V komerčne dostupnej imunofluorescenčnej skúšobnej súprave (Waldheim, zakúpenej na stanovenie HIV séropozitivity) sú PALL bunky (ľudská bunková línia T-lymfocytov) infikované a neinfikované vírusom HIV už fixované na mikroskopických sklíčkach. Experimentálna procedúra je v princípe založená na návode dodávateľa. Po inkubácii s 1 % BSA počas 30 minút pri 37 “C sa mikroskopické sklíčka inkubujú so sérom opíc druhu Rhesus (koncentrované a 1 : 10 nariedené v neúplnom PBS), alebo s imunitne purifikovanými opičími Ig (Ab3) riedenými v normálnom ľudskom sére, alebo s protilátkou BR55-2/myšia IgG3. Inkubácia trvá 1 hodinu pri teplote 37 °C. HIV pozitívne ľudské sérum (dodané ako súčasť skúšobnej súpravy) slúži ako pozitívna kontrola, zatiaľ čo normálne ľudské sérum ako negatívna kontrola. Nenaviazané determinanty testovaných vzoriek sa vymyjú trojnásobným premytím neúplným PBS. Potom sa pridá konjugát antiľudský-IgG-FITC (súčasť skúšobnej súpravy) v riedení 1 : : 20 v neúplnom PBS s 2 % FCS, alebo antimyšia-IgG-FITC (na detekciu myších Mab). Potom sa sklíčka inkubujú 30 minút pri 37 °C, trikrát premyjú neúplným PBS, zafixujú, potom sa vo fluorescenčnom mikroskope sleduje a vyhodnocuje imunofluorescencia preparátov (0 - žiadna fluorescencia, 5 - maximálna fluorescencia).
Príklad 16: Systém ELISA na stanovenie protilátok BR55-2/myšia IgG3 alebo BR55-2/myšia IgG2a v ľudskom sére pomocou anti-id BR55-2 č. E4 μΐ roztoku protilátky anti-id BR55-2 č. E4 (10 μΙ/ml, riedené v poťahovacom pufri) sa nanesie do jamiek na mikrotitračných doskách a inkubujú sa 60 minút pri 37 °C. Dosky sa 6-krát premyjú premývacím pufrom a potom sa pridá 200 μΐ neúplného PBS s 5 % FCS a inkubuje sa 30 minút pri 37 °C. Potom sa dosky opäť rovnakým spôsobom premyjú. Ľudské séra obsahujúce BR55-2/myšia IgG3 alebo BR55-2/myšia IgG2a sa testujú vo vhodných zriedeniach neúplným PBS s 2 % FCS. 100 μΐ objemy týchto vzoriek sa pridajú do jamiek na mikrotitračných doskách a inkubujú sa 60 minút pri 37 °C. Ako štandard sa používa BR55-2/myšia IgG3 alebo BR55-2/myšia IgG2 riedené v normálnom ľudskom sére na koncentráciu 10 μΙ/ml. S vhodnými riedeniami štandardu v neúplnom PBS s 2 %
FCS sa postupuje ako so vzorkami. Nenaviazaná protilátka sa vymyje tak, ako už bolo opísané, a potom sa pridá 100 μΐ konjugátu (králičia-antimyšia IgG3/ peroxidáza alebo králičia-antimyšia IgG2/peroxidáza, napr. od firmy Chemicom & Co, 1 : 1000 v PBS s 2 % FCS). Po 30 minútach inkubácie pri 37 °C sa dosky 4-krát premyjú premývacím pufrom a 2-krát farbiacim pufrom. Potom sa pridá 100 μΐ roztoku substrátu a po 5 minútach sa farebná reakcia zastaví pridaním 50 μΐ 4N H2SO4. Absorbancia sa zmeria pri vlnovej dĺžke 492 nm (referenčné meranie pri 620 nm).
Hodnoty absorbancie vzoriek séra môžeme pomocou kalibračnej krivky vyjadriť v pg/ml.
Príklad 17: Systém ELISA na stanovenie protilátky BR55-2/ľudská chimerická IgGl v ľudskom sére pomocou protilátky anti-id BR55-2 č. E4
Ľudské séra obsahujúce protilátku BR55-2/ľudská chimerická IgGl sa testujú rovnakým spôsobom ako v príklade 16, použitím konjugátu kozia-antiľudská IgG/peroxidáza (napr. od firmy Chemicon & Co., 1 : 1000 v PBS s 2% FCS).
Príklad 18: Systém ELISA na stanovenie protilátky BR55-2/ľudská chimerická IgG3 v ľudskom sére pomocou protilátky anti-id BR55-2 č. E4
Ľudské séra obsahujúce protilátku BR55-2/ľudská chimerická IgGl sa testujú rovnakým spôsobom ako v príklade 17.
Príklad 19: Biošpecifická interakčná analýza protilátok BR55-2 /ľudská chimerická IgGl a BR55-2/humanizovaná IgGl s monoklonálnymi anti-id protilátkami BR55-2 v reálnom čase
Experimenty sa vykonávali s použitím systému BIAcore™ od firmy Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Švédsko. Väzba protilátok BR55-2/ľudská chimerická IgGl alebo BR55-2/humanizovaná IgGl, zachytených na imobilizovanej protilátke RAM-IgGl (napr. od firmy Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Švédsko), sa stanovila pomocou biošpecifickej interakčnej analýzy v reálnom čase.
Prietoková rýchlosť systému sa nastaví na 5 μΐ/min. Senzorový čip sa aktivuje zmesou 0,201 mg NHS a 1,313 mg EDC, ktoré sú rozpustené v 35 μΐ destilovanej vody. Protilátka RAM-IgGl, rozpustená v 35 μΐ 10 mM pufra octanu sodného pH 5,0 tak, aby jej koncentrácia bola 30 μΐ/ml, sa potom nechá reagovať s aktivovaným povrchom senzora. Zvyšné voľné aktívne miesta sa blokujú 35 μΐ IM roztoku etanolamin-hydrochloridu/NaOH, pH
8,5.
Analýza sa uskutočňuje v troch krokoch:
L Príslušnáanti-id BR55-2 Mab (E4, Cll, B3, B9, G6, G9) sa nariedi v médiu H na výslednú koncentráciu 10 až 17 pg/ml. Pri každej analýze sa antiidiotypová protilátka naviaže na RAM-IgGl tým, že sa 30 μΐ jej roztoku nechá pretiecť cez povrch senzora. Potom sa zaznamenajú a uložia do pamäte „Jednotky odpovede“, ktoré sú úmerné množstvu naviazanej anti-id protilátky.
2. 20 μΐ rôznych riedení (1 až 100 pg/ml) chimerickej IgGl typu myš/človek a humanizovanej UgGl v médiu H sa injikuje do systému a nechá sa naviazať na už zachytenú antiidiotypovú protilátku. Potom sa zaznamenajú a uložia do pamäte „Jednotky odpovedí“, ktoré sú úmerné množstvu naviazanej monoklonálnej protilátky.
3. Povrch senzora sa potom regeneruje na ďalšie použitie po sebe nasledujúcich dávok 5 μΐ IM kyseliny mravčej a 5 μΐ 8M močoviny.
Miera väzby sa stanoví tak, že sa spočíta pomer medzi maximálnou hodnotou Jednotiek odpovede“ získanou druhou protilátkou (BR55-2/chimerická ľudská IgGl alebo BR55-2/humanizovaná IgGl 1) a hodnotou maximálnej odpovede, ktorú dosiahla prvá protilátka (príslušná antiidiotypová Mab).
Príklad 20: Systém ELISA na stanovenie protilátky BR55•2/ľudská chimerická IgGl v ľudskom sére pomocou protilátky anti-id BR55-2 č. E4
Ľudské séra obsahujúce protilátku BR55-2/ľudská chimerická IgGl sa testujú rovnakým spôsobom ako v príklade 17.
Príklad 21: Kompetitívna inhibicia väzby protilátky BR55-2/myšia IgG3 na anti-id BR55-2 č. E4, spôsobená protilátkou BR55-2/ľudská chimerická IgGl alebo BR55-2/ľudská chimerická IgG3
100 μΐ roztoku protilátky anti-id BR55-2 č. E4 (10 μΐ/ml, riedené v poťahovacom pufri) sa nanesie do jamiek na mikrotitračných doskách a inkubujú sa 6 minút pri 37 °C. Dosky sa 6-krát premyjú poťahovacím pufrom a potom sa pridá 200 μΐ neúplného PBS s 5 % FCS a inkubuje sa 30 minút pri 37 °C.
Potom sa dosky opäť rovnakým spôsobom premyjú. Ľudská chimerická IgGl protilátka alebo ľudská chimerická IgG3 sa nariedi v neúplnom PBS s 2 % FCS (0,5pg/ml až 3 ng/ml). Ku každému riedeniu sa pridá 0,05 pg/ml protilátky BR55-2/myšia IgG3. 100 μΐ objemy tejto zmesi sa pridajú do jamiek na mikrotitračných doskách a inkubujú sa 60 minút pri 37 °C. Nenaviazaná protilátka sa vymyje tak, ako už bolo opísané, a potom sa pridá 100 μΐ konjugátu peroxidáza/kozia-antiľudská Ig (napr. reagencie of firmy Chemicon & Co, 1: 1000 v PBS s 2 % FCS).
Po 30 minútach inkubácie pri 37 °C sa dosky premyjú 4-krát premývacim pufrom a 2-krát farbiacim pufrom. Potom sa pridá 100 μΐ roztoku substrátu a po 5 minútach sa farebná reakcia zastaví pridaním 50 μΐ 4N H2SO4. Absorbancia sa zmeria pri vlnovej dĺžke 492 nm (referenčné meranie pri 620 nm).
Príklad 22: Bunková cytotoxicita spôsobená komplementom (CDC) namierená proti bunkám SKBR5 a sprostredkovaná protilátkou BR55-2/myšia IgG3 - Inhibicia anti-id protilátkou BR55-2 č. E4
Deň pred vlastným testom sa bunky SKBR5 prenesú do čerstvého média A a inkubujú sa pri 37 °C v atmosfére 5 % CO2, vo fľaši na pestovanie bunkových kultúr.
Označovanie cieľových buniek chrómom 31Cr
Bunky sa odoberú z kultivačnej nádoby a inkubujú sa, pričom koncentrácia buniek je 5 x 106 v 800 μΐ média A, pri 37 °C v 5 % CO2 v priebehu 1 hodiny, spolu so 100 pCi Na2CrO4. Potom sa bunky premyjú médiom A, aby sa odstránil prebytok 51Cr, resuspendujú sa v čerstvom médiu, a nariedia sa na koncentráciu 2,5 x 105 buniek/ml.
Bunková cytotoxicita závislá od komplementu (CDC)
100 μΐ tohto roztoku cieľových buniek sa napipetuje do jamiek na mikrotitračných doskách. Potom sa pridá 50 μΐ anti-id BR55-2 č. E4, nariedené do potrebnej koncentrácie v neúplnom PBS. Potom sa pridajú 100 μΐ objemy ľudského séra s obsahom 2 pg/ml BR55-2/IgG3 do každej jamky a dosky sa inkubujú cez noc pri 37 °C v 5 % CO2. Supernatanty sa potom odoberú pomocou Skatron-Harvesting Press a ich žiarenie sa zmeria na počítači. Tieto výsledky sú hodnoty platné pre experimentálne uvoľnenie.
SK 281086 Β6
Aby sa určila hodnota celkového uvoľnenia slCr, bunky sa spracujú tak, ako už bolo opísané, s tým, že sa ľudské sérum nahradí roztokom 2 % SDS, 50 mM Na2CO3 a 10 mM EDTA, a roztok protilátky anti-id BR55-2 č. E4 sa nahradí 50 μΐ neúplného PBS. Hodnota spontánneho uvoľnenia 51Cr sa získa tak, že sa ľudské sérum nahradí médiom A a roztok anti-id protilátky BR55-2 č. E4 sa nahradí 50 μΐ neúplného PBMC.
Po zmeraní aktivity sa výsledky spočítajú nasledovne I lyzovaných experiB. uvoľnenie - spontánne uvoľnenie brniiek --—--------------------------------x 100 celková uvoľnenie - spontánne uvoľnenie
Príklad 23: Imunoafinitná purifikácia protilátky BR55-2/ľudská chimerická IgGl pomocou Sepharosy™ s naviazanou BR55-2 č. E4
Príprava Sepharosy™ konjugovanej s protilátkou BR55-2/ myšia IgG2a.
g mrazom vysušenej aktivovanej CH-Sepharosy 4B sa suspenduje v 1 mM HC1, potom sa prenesie na filter z kremičitého skla a premýva sa 2 1 lmM HC1 15 minút. Ligand (95 mg anti-id protilátky BR55-2 č. E4) rozpustený v 50 ml konjugačného pufra sa zmieša s premytým gélom v uzavretej nádobe, ktorá sa otáčaním intenzívne mieša 1 hodinu pri izbovej teplote. Gél sa potom premyje konjugačným pufrom a inkubuje 1 hodinu s 50 rrú IM etanolamínu, čím sa zablokujú všetky zvyšné aktívne skupiny. Afinitný sorbent sa potom premyje tromi cyklami meniaceho sa pH. Každý cyklus pozostáva z premytia pri pH 4 (0,1 M acetát, 0,5M NaCl), po ktorom nasleduje premytie pri pH 8 (0,1 M Tris, 0,5MNaCl).
Izolácia protilátok BR55-2/ľudská chimerická IgGl
Chromatografia sa vykonáva pri 4 °C. Kolóna (BIO REX MP s priemerom stĺpca 1,5 cm) sa naplní Sepharosou™ s naviazanou anti-id BR55-2 č. E4 (objem 35 ml). Gél sa premyje väzbovým a elučným pufrom. Počiatočným materiálom je 100 1 média protilátky BR55-2/ľudská chimerická IgG. Najprv sa vzorka zakoncentruje v pomere 1 : : 5 pomocou systému Amicon DC2, ktorý je vybavený náplňou P10 z dutých vlákien a potom sa tento koncentrát nanesie na kolónu. Po elúcii priechodnej frakcie sa väzba protilátky anti-id BR55-2 na kolónu uvoľní elučným pufrom a okamžite po desorpcii sa neutralizuje IM pufrom Tris/HCl pH 7,5.
Koncentrovanie protilátky BR55-2/ľudská chimerická IgG
Vykoná sa skoncentrovanie eluovaného roztoku protilátok v miešanej ultrafiltračnej cele Amicon pomocou membrány PM 10 Diaflo. V roztoku zostane viac ako 98 % IgG, konečná koncentrácia IgG je 3,36 mg/ml.
Charakterizácia purifikovanej protilátky BR55-2/ľudská chimerická IgGl
Chromatografia na ionexe Mono-Q Kolóna: Mono-Q HR/5 (Pharmacia)
Pufer A: 20 mM trietanolamin, pH 7,7
Pufer B: 20 mM trietanolamin, IM NaCl, pH 7,7
Rýchlosť prietoku: 1 ml/min.
Detekcia: UV 280 nm
Gradient: lineárny, zvýšenie o 2 % za minútu
Výsledky: > 95 % čistota
Vysoko výkonná chromatografia s rozdelením podľa veľkosti
Kolóna: Zorbax™ GF250, 9,4 x 250 mm
Pufer: 0,lM fosfát sodný, 0,2M NaCl, pH 7,0
Rýchlosť prietoku: 1 ml/min.
Detekcia: UV 280 nm
Výsledky: > 95 % čistota všetkých
SDS-PAGE
Experimenty sa vykonávali v redukujúcich podmienkach, podľa BR55-2 Laemmliho metódy v 10 % akrylamidovom géli. (Výsledky sú zobrazené na obrázku 10).
Počiatočný materiál
Myšie monoklonálne protilátky BR55-2 možno získať napríklad z hybridómu BR55.2 (BR55-2/IgG3) a prípadne z BR55.2S2a (BR-55-2/IgG2a).
Tieto hybridómy boli pôvodne deponované 17. februára 1987, respektíve 10. marca 1987 podľa pravidiel Budapeštianskej zmluvy v Americkej zbierke typových kultúr (ATCC - Američan Type Culture Collection), Rockville, MD 20852, USA, a to s depozičnými číslami ATCC HB9324, respektíve ATCC HB 9347.

Claims (9)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Monoklonálne myšie antiidiotypové protilátky s vnútorným obrazom (Ab2) proti monoklonálnym protilátkam BR55-2 (Abl).
  2. 2. Spôsob prípravy antiidiotypových protilátok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa myši imunizujú konjugátom BR55-2/myšia IgG3-F(ab')2-KLH, myšie slezinové bunky sa nechajú sfúzovať s bunkami myšej myelómovej línie SP 2/O, vyberú sa vzniknuté hybridómové bunky, ktoré produkujú IgG s inhibičnou kapacitou, ktorú predstavuje inhibícia väzby protilátky BR55-2/myšia IgG2a na bunkovú líniu SKBR5, vyššou než 95 %, a potom sa po prečistení izolujú antiidiotypové protilátky.
  3. 3. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa t ý m , že obsahuje ako aktívnu zložku antiidiotypovú protilátku podľa nároku 1 spolu s farmaceutický prijateľným adjuvans, nosičom alebo riedidlom, na použitie na preventívnu a/alebo terapeutickú imunizáciu proti infekciám vírusom HIV.
  4. 4. Farmaceutický prostriedok na imunizáciu proti rakovine epiteliálneho pôvodu a proti rakovine malých pľúcnych buniek, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa antiidiotypovú monoklonálnu protilátku podľa nároku 1 spolu s farmaceutický prijateľným adjuvans, nosičom alebo riedidlom.
  5. 5. Použitie antiidiotypových protilátok podľa nároku 1, na prípravu prostriedku na preventívnu a/alebo terapeutickú imunizáciu proti infekciám vírusom HIV.
  6. 6. Použitie monoklonálnych antiidiotypových protilátok podľa nároku 1 na prípravu prostriedku na imunizáciu proti rakovine epiteliálneho pôvodu a proti rakovine malých pľúcnych buniek.
  7. 7. Použitie antiidiotypových protilátok podľa nároku 1 na kvantitatívne stanovenie monoklonálnych protilátok, ich derivátov alebo fragmentov s väzbovou špecificitou BR55-2.
    SK 281086 Β6
  8. 8. Použitie antiidiotypových protilátok podľa nároku 1 na kvantitatívne stanovenie chimerických monoklonálnych protilátok typu myš/človek z protilátky BR55-2 a úplne humanizovaných variantov BR55-2.
  9. 9. Použitie antiidiotypových protilátok podľa nároku 1 na jednostupňovú imunopurifikáciu variantov protilátky BR55-2.
SK1398-94A 1992-05-22 1993-05-14 Monoklonálne myšie antiidiotypové protilátky, spôsob ich prípravy, farmaceutický prostriedok a ich použitie SK281086B6 (sk)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB929210930A GB9210930D0 (en) 1992-05-22 1992-05-22 Monoclonal antibodies and their use
GB929210929A GB9210929D0 (en) 1992-05-22 1992-05-22 Monoclonal antibodies and their use
GB929210944A GB9210944D0 (en) 1992-05-22 1992-05-22 Monoclonal antibodies and their use
PCT/EP1993/001215 WO1993024647A1 (en) 1992-05-22 1993-05-14 Anti-idiotypic monoclonal antibodies against the lewis y-specific monoclonal antibody br55-2 and their uses

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK139894A3 SK139894A3 (en) 1995-07-11
SK281086B6 true SK281086B6 (sk) 2000-11-07

Family

ID=27266199

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1398-94A SK281086B6 (sk) 1992-05-22 1993-05-14 Monoklonálne myšie antiidiotypové protilátky, spôsob ich prípravy, farmaceutický prostriedok a ich použitie

Country Status (20)

Country Link
EP (1) EP0644947B1 (sk)
JP (3) JPH07507207A (sk)
KR (1) KR100279317B1 (sk)
AT (1) ATE179214T1 (sk)
AU (1) AU678160B2 (sk)
CA (1) CA2134751C (sk)
CZ (1) CZ286547B6 (sk)
DE (1) DE69324584T2 (sk)
DK (1) DK0644947T3 (sk)
ES (1) ES2133395T3 (sk)
FI (1) FI111518B (sk)
GR (1) GR3030701T3 (sk)
HU (1) HU219055B (sk)
NO (1) NO316120B1 (sk)
NZ (1) NZ252161A (sk)
PL (1) PL175651B1 (sk)
RU (1) RU2208642C2 (sk)
SG (1) SG50721A1 (sk)
SK (1) SK281086B6 (sk)
WO (1) WO1993024647A1 (sk)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AT500650B1 (de) 2003-04-17 2009-11-15 Altropus Gmbh Immunogener rekombinanter antikörper
JP2007528868A (ja) * 2003-08-14 2007-10-18 ワイス 抗ルイスｙ抗イディオタイプ抗体およびその使用
AT504231A1 (de) 2006-10-03 2008-04-15 Hans Dr Loibner Prädiktive parameter
WO2012030982A1 (en) 2010-09-01 2012-03-08 Biogen Idec Ma Inc Rapid generation of anti-idiotypic antibodies
RU2735653C2 (ru) * 2016-08-23 2020-11-05 Тран-Сцелл Биологицс Привате Лимитед Платформа с клетками-предшественниками человека для поиска активных веществ лекарственных препаратов

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0423198B1 (en) * 1988-07-06 1996-05-08 VERIGEN, INC. (a Corporation of Delaware) Antibodies specific towards hiv 1 gp 48
DE4006308A1 (de) * 1990-02-28 1991-08-29 Sandoz Ag Verwendung des monoklonalen antikoerpers br 55.2 gegen kleinzelliges lungenkarzinom
DE4025499A1 (de) * 1990-08-11 1992-02-13 Sandoz Ag Verwendung der antikoerper br55-2, deren derivate, konjugate und fragmente zur bekaempfung von hiv-infektionen
PT528767E (pt) * 1991-08-21 2000-06-30 Novartis Ag Derivados de anticorpos

Also Published As

Publication number Publication date
DE69324584D1 (de) 1999-05-27
KR950701685A (ko) 1995-04-28
DK0644947T3 (da) 1999-11-01
EP0644947B1 (en) 1999-04-21
RU94046321A (ru) 1997-01-27
KR100279317B1 (ko) 2001-01-15
NO944443L (no) 1995-01-20
NO316120B1 (no) 2003-12-15
JPH07507207A (ja) 1995-08-10
WO1993024647A1 (en) 1993-12-09
CA2134751C (en) 2003-12-16
CZ286547B6 (cs) 2000-05-17
NO944443D0 (no) 1994-11-21
FI945485A (fi) 1994-11-22
JP2006143738A (ja) 2006-06-08
DE69324584T2 (de) 1999-09-23
SK139894A3 (en) 1995-07-11
HUT71311A (en) 1995-11-28
CZ285194A3 (en) 1995-05-17
FI111518B (fi) 2003-08-15
HU219055B (hu) 2001-02-28
SG50721A1 (en) 2000-11-21
ATE179214T1 (de) 1999-05-15
AU4068893A (en) 1993-12-30
FI945485A0 (fi) 1994-11-22
ES2133395T3 (es) 1999-09-16
EP0644947A1 (en) 1995-03-29
JPH11178594A (ja) 1999-07-06
AU678160B2 (en) 1997-05-22
NZ252161A (en) 1996-10-28
GR3030701T3 (en) 1999-11-30
CA2134751A1 (en) 1993-12-09
RU2208642C2 (ru) 2003-07-20
PL175651B1 (pl) 1999-01-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Uytdehaag et al. Induction of neutralizing antibody in mice against poliovirus type II with monoclonal anti-idiotypic antibody.
KR100547049B1 (ko) 바이러스 감염증 치료를 위한 조성물 및 방법
EP1241264A1 (en) Monoclonal antibodies to colon cancer antigen
US5653977A (en) Anti-idiotypic antibody that mimics the GD2 antigen
KR920008744B1 (ko) Hiv 감염의 치료 및 진단용 모노클로날항체 및 펩티드
KR19990087425A (ko) 알레르기에 대한 백신 접종 및 치료를 위한 펩티드 임뮤노겐
US20110212106A1 (en) Hiv-1 neutralizing antibodies and uses thereof
JPH11502414A (ja) ｇＣ１ｑレセプター、このレセプターに結合するＨＩＶ−１のｇｐ１２０領域、ならびに関連ペプチドおよび標的抗体
CA2253602A1 (en) Method and composition for reconforming multi-epitopic antigens to initiate an immune response
US20050163768A1 (en) Monoclonal antibodies and their use
JP2006143738A (ja) ルイスｙ−特異的モノクローナル抗体ｂｒ５５−２に対する抗イディオタイプモノクローナル抗体およびその使用
AU2003214044B8 (en) Anti-idiotypic antibody inducing HIV-1 neutralizing antibodies
CA1341391C (en) Protective peptides derived from human immunodeficiency virus-1 gp160
JPH04501061A (ja) 抗イディオタイプ抗体による抗腫瘍応答の誘導
EP0370090B1 (en) Immunogens and biologically active peptides derived from shared sequences from antigens and anti-idiotypic antibodies or antibodies specific for cellular receptors of the antigens
Powell Jr et al. Activation of a functional idiotype network response by monoclonal antibody specific for a virus (M-MuLV)-induced tumor antigen.
US20060177454A1 (en) Method of promoting an immune response with a bispecific antibody
EP0344211A1 (en) Monoclonal antibodies in vaccine formulations
JPH06506947A (ja) 抗ウィルスハイブリッド抗体
Kearney et al. Thomas J. Powell, Jr., Richard Spann, Meenal Vakil
NZ503032A (en) Use of a binding agent to reconforming multi-epitopic antigens to initiate an immune response