NO316120B1 - Monoklonale anti-idiotypiske antistoffer, fremgangsmåte for fremstilling ogfarmasöytiske preparater av disse, samt anvendelse - Google Patents

Description

MONOKLONALE ANTISTOFFER OG DERES ANVENDELSE

1. Bakgrunn og innføring

En mulighet for å manipulere immunsystemet er basert på ldiotypiske interaksjoner De

unike antigene determinanter i og omkring antigen-kombinasjonsstedet i et lg molekyl som gjør et antistoff forskjellig fra et annet er definert som ldiotoper Helheten av alle ldiotoper tilstede på den variable del av et gitt antistoff regnes som dets ldiotype (id) Molekylstrukturen til en ldiotype er blitt lokalisert til både de komplementantetsbestemmende regioner og "framework" regionene til det variable domene og generelt, men ikke alltid, har både de tunge og lette kjeder bidratt i spesifikk assosiasjon

Idiotyper er serologisk definerte entiteter da injeksjon av et antistoff (ofte omtalt som

Abl) mn i en syngen, allogen eller xenogen mottager induserer dannelsen av anti-idioty-

piske antistoffer (ofte omtalt som Ab2) Basert på den antakelse om at ldiotype/anti-

ldiotype interaksjoner eksisterer fysiclogisk, ble en reseptorbasert regulering av immunsystemet postulert av Niels Jerne (Ann Immunol 125C, 373,1974) Hans nettverks-

teori ser immunsystemet som en samling av lg molekyler og reseptorer på T-lymfocyt-

ter som hver er istand til å gjenkjenne en antigemsk determinant (epitop) gjennom sitt bindingssted (paratop), og som hver kan gjenkjennes ved hjelp av andre antistoffer eller celleoverflatereseptorer i systemet gjennom ldiotopene som de fremviser Mange studier har vist at ldiotype og anti-idiotype reseptorer er tilstede på overflaten til både B- og T-lymfocytter så vel som på utskilte antistoffer

Når bindingen mellom Abl og Ab2 inhiberes ved hjelp av antigenet mot hvilke Abl er

rettet, er ldiotypen betraktet til være bindingsstedsrelatert da det involverer et sted på antistoffVariabelt domene som er engasjert i antigengjenkjennelse De idiotyper som konformasjonsmessig etterligner en antigen epitop kalles det interne bilde av epitopen Da både et Ab2 og et antigen binder til det relevante Abl, kan de dele en omtrent lik tredimensjonal konformasjon som representerer det interne bildet av det gitte antigen Intemt-bilde antiidiotype antistoffer kan prinsipielt sees som erstatning for antigenet

hvorfra de er blitt avledet via det ldiotypiske nettverk Derfor kan disse surrogateantige-

ner anvendes i aktive lmmunisenngsprotokoUer De gir f eks fordeler dersom de origi-

nale antigener ikke er tilstrekkelig immunogene til å indusere en signifikant immuneres-

pons Således kan passende internt-bilde anti-idiotypiske antistoffer som etterligner et ikke-immunogent karbohydratantigen være særlig anvendbare for bestemte vaksinasjo-

ner I det etterfølgende er disse emner omtalt mer spesifikt

Som et resultat av introduksjonen av hybndomteknologien er monoklonale antistoffer (Mab'er), for det meste av museoppnmnelse, blitt dannet mot en rekke typer human cancer Nesten alle av markørene som er definert ved xenogene Mab'er er ikke strengt tumorspesifikke, men er differensienngsantigener delt mellom tumorer og visse nor-

male og/eller fetale vev De er derfor best omtalt som tumorassosierte antigener (TAAer) Om humane tumormarkører detektert ved hjelp av xenogene Mab'er er istand Ul å fremkalle en anti-tumorrespons i cancerpasienter, og om slike antigener er relatert

til responsen mot autologe tumorer i cancerpasienter, avhenger av naturen til de respek-

tive TAAer og er fremdeles ikke helt forstått TAAer som enten er naturlig immunogene i den syngene vert eller som kan gjøres immunogene, kan potensielt anvendes til å indu-

sere anti-tumonmmumtet for terapeutisk og eventuelt profylaktisk nytte

Tumorassosierte antigener er ofte en del av "seif og fremkaller en svært dårlig immunrespons i cancerpasienter I motsetmng til dette er internt-bilde anti-idiotype antistoffer med tredimensjonale former som ligner strukturelle epitoper av det respektive TAA,

gjenkjent som fremmede molekyler i den tumorbærende vert Derfor kan immunrespon-

sen som dannet ved terapeutisk eller til og med profylaktisk lmmunisenng med pas-

sende anti-id Mab'er, gi anti-tumonmmumtet

Terapeutisk immunisenng mot cancer med anti-id Mab'er kan være særlig vellykket i

tidlige stadier av sykdommen Ved tidspunktet for operasjon av en pnmær tumor er ofte skjulte enkle tumorceller allerede blitt spredd i forskjellige av pasientens organer Disse mikrometastatiske celler er kjent til å være årsaken til den senere metastasevekst, ofte år etter diagnose og operativ fjernelse av alt klinisk påvist tumorvev Til nå er metastase-

cancer av epiteloppnnnelse uhelbredelig i nesten alle tilfeller Derfor er en effektiv behandling av "minimal residualcancer", f eks ødeleggelse av skjulte mikrometastasecel-

ler for å forhindre vekst av makrometastaser et presserende medisinsk behov Ved alle disse stadier i sykdommen ("adjuvant setting") er konvensjonelle kjemoterapeutiske prosedyrer heller lite vellykkede Induksjon av en spesifikk anti-tumonmmumtet på tidspunktet med minimal residualsykdom via immunisenng med passende interntbilde anti-id Mab'er, gjør at mikrometastaseceller kan elimineres selektivt ved hjelp av immunsystemet, noe som fører til økt overlevelsestid uten tilbakefall

Monoklonale antistoffer med spesifisitet Ul BR55-2 (omtalt i f eks Wistar EP 285 059,

M Blaszyk-Thunn et al, J Biol Chem 262 (1987) 372-379, eller Z Steplewski et al, Hybndoma 9 (1990) 201-210) definerer Lewis Y6 antigenet, en karbohydratdeterminant selektivt uttrykt på et flertall humane fase tumorer Basert på deres egenskaper kan antistoffer BR55-2 anvendes for passiv immunterapi av hovedsakelig epitelcancer

Den tumorassosierte Lewis Y oligosakkanddeterminant som også uttrykkes under be-

stemte stadier av embryoutvikling, er i seg selv nesten ikke immunogen Monoklonale anti-idiotype antistoffer (Ab2) mot BR55-2 (Abl) med internt-bilde egenskaper ved at de ligner strukturelle epitoper av Lewis Y antigenet, er anvendbare for induksjon av en beskyttende anti-tumonmmumtet, særlig i de tidligere stadier av sykdommen

I tillegg til dets ekspresjon på cancer av epitelopprmnelse er Lewis Y karbohydrat-antigenet også involvert i patogenesen av infeksjon med Human Immundeficiency Virus (HIV) Acquired immune deficiency syndrome (AIDS) gjenkjennes som en typisk syk-

dom hvis etiologi er blitt identifisert til å være forbundet med infeksjon av et lymfotro-

fisk retrovirus (HIV) Sykdommen er karakterisert ved en forstyrrelse forbundet med en svekket cellemediert immunitet og absolutt lymfofem, særlig redusert hjelper T-lymfo-

cytter (CD4) Et presyndrom som vanligvis er mamfistert ved et kompleks av designerte kliniske trekk og hjelper T-lymfofem kan gå forut for AIDS Presyndromet kalles AIDS-relatert kompleks (ARC)

HIV tilhører en gruppe virus som er studert inngående i løpet av de siste to tiår Når et retrovirus invaderer en human celle eller en dyrecelle, går RNA over til DNA og innfø-

res i vertscellen som deretter narres til å behandle vimsenes gener som sine egne HIV

kan forbli latent i disse cellene i flere år, i sikkerhet fra angrep ved kroppens immunesy-

stem og blindt kopiert hver gang vertscellene deler seg Kun i tilfellet av utløsning av rask virusrephkasjon ved aktivering av de infiserte celler vil de dannede viruspartikler drepe disse celler og strømme inn i blodstrømmen

På grunn av de spesifikke trekk til HIV er helbredelse ved eliminering av både viruset

og den provirale genetiske informasjon som allerede er transkribert inn i det humane ge-

nom fra allerede infiserte pasienter vanskelig å oppnå De fleste terapeutiske forsøk er derfor blitt konsentrert mot midler som nedsetter utviklingen av sykdommen ved å in-terferere essensielle trinn i forbindelse med virusrephkasjon

Forebygging av HIV infeksjon og terapeutisk intervensjon i allerede infiserte pasienter

ved hjelp av en sikker og effektiv vaksine er et hovedmål En rekke mulige vaksiner er testet i prekliniske eller tidlige kliniske faser De er hovedsakelig basert på virusstruktu-

rer som antigen, særlig på det viktige kappeglykoprotein gpl20

Den naturlig forekommende immunrespons mot viruset består av antistoffer mot alle vi-rusproteiner så vel som aktivering av cellular immunitet Denne vertsreaksjon mot HIV-infeksjon virker imidlertid ikke til å endelig stanse sykdomsutviklingen etter en symp-tomfn fase som ofte varer i flere år Derfor forblir vaksinasjonsmåter som er basert på de samme antigener og som bevirker den naturlig forekommende og til slutt lkkebeskyt-tende immunrespons tvilsomme Et annet stort problem er den utstrakte heterogemtet til HW, hvorved dette virus unnslipper angrep av type-spesifikke nøytraliserende anti-gpl20 antistoffer

Effektiv HlV-beskyttelse ved vaksinasjon krever to forsvarsstrategier en mot fritt virus som er tilstede i blodstrømmen og en annen mot celler som allerede er infiserte Det er kjent at HIV-infiserte celler in vitro og in vivo uttrykker, på deres overflate, et endret glykosylenngsmønster, nemlig Lewis Y karbohydratdeterminanten Da dette antigen normalt kun forekommer under bestemte fosterutviklingstnnn og også er forbundet med en rekke kreftformer, kan ekspresjonen på HIV-infiserte celler reflektere deres endrede differensienngsstatus indusert ved retrovirustransformasjon Derfor ligner denne over-flatefenotype en unik cellulær vertsreaksjon mot transfeksjon av det humane genom ved

HIV

HIV kappeglykoproteinet virker ved hjelp av glykosylenngsmaskinenet til de infiserte celler Forandringer i glykosylenngsmønsteret til infiserte celler som danner HIV er derfor også funnet på fne viruspartikler Følgelig består HIV kappeglykoproteinet dannet i slike celler også av Lewis Y karbohydratdeterminanter Følgelig representerer Lewis Y ohgosakkandet en spesifikk vertsrespons uttrykt både på HIV-infiserte celler og frie HIV partikler

Basert på det ovennevnte oppfyller Lewis Y strukturen viktige krav for anvendelse i en vaksinasjonsstrategi mot både fritt virus og HIV-infiserte celler Videre, til å være en

vertsreaksjon mot HIV generelt, er Lewis Y antigenet uavhengig av HIV-stamme og er ikke påvirket av den genetiske variabilitet av dette virus Dessverre, basert på dens kar-bohydratstruktur og dens "seif egenskaper som foster-differensienngsantigen, er Lewis Y nesten ikke lmmunogent i seg selv Ingen naturlig immunrespons mot dette antigen er oppdaget i mennesker Monoklonale anti-idiotypiske antistoffer (Ab2) mot BR55-2

(Abl) med mtemt-bilde egenskaper ved å ligne strukturelle epitoper av Lewis Y antigenet, kan være anvendbare for å indusere profylaktisk og terapeutisk immunitet mot både fh HIV og HIV-infiserte celler uavhengig av virusstamme

I tillegg til deres profylaktiske og terapeutiske anvendelse som unike vaksiner, er monoklonale internt-bilde anti-id antistoffer svært spesifikke reagenser for ldiotypen av det antistoff hvorfra de er blitt dannet De gjenkjenner nesten utelukkende bindingsregionen til Abl Dette gjenkjenmngsmønster er uavhengig av andre determinanter av Abl Med andre ord vil passende anti-id Mab'er selektivt definere hvilket som helst molekyl som består av den unike ldiotypen av Abl i sin korrekte tredimensjonale form Derfor binder disse anti-id Mab'er med sammenlignbar affinitet til F(abV, Fab- og Fv-fragmenter av Abl så vel som til "switch"-vanantene derav ("switch"-vananter består av forskjellige konstante regioner, f eks munn IgG2a, IgG2b, IgGl, men deler den samme ldiotypen)

I tillegg inkluderer dette svært spesifikke gjenkjenmngsmønster til intemt-bilde anti-id Mab'er også vananter av et moder-munnt Mab oppnådd ved rekombinant DNA-teknologi

For å overvinne eventuelle problemer med gjentatt bruk av munne antistoffer for passiv immunterapi i mennesker, kan mus/human kimære Mab'er dannes ved å kombinere de vanable domener til det moder-munne Mab som velges med humane konstante region-ner For deteksjon av slike mus/human kimære Mab'er i humant serum kreves svært spesifikke reagenser, da disse kimære Mab'er bærer konstante regioner som er identiske med dem til naturlig forekommende humane immunoglobulmer Internt-bilde anti-id Mab'er dannet mot moder-munnt Abl gjenkjenner også de kimære antistoffer avledet derav Slike anti-idiotype Mab'er er således anvendbare reagenser for den spesifikke og sensitive kvantitative bestemmelse av f eks serumkonsentrasjoner av mus/human kimære Mab'er i nærvær av et stort overskudd av normale humane immunoglobulmer

For ytterligere å forbedre egenskapene til Mab'er med terapeutisk interessante egenskaper for anvendelse i passiv immunterapi, kan "fully humanized" antistoffer konstrueres ved hjelp av rekombinant DNA teknologi hvor kun de absolutt nødvendige deler av det oppnnnehge museantistoff, de komplementantetsbestemmende regioner (CDRer), kom-bineres med humane vanabel region strukturer og humane konstante regioner For ut-forming og konstruksjon av disse "fully humanized" Mab'er, anvendes sekvenshomo-logi og molekylær modellenng for å velge er~kombinasjon av mus og humane sekvens-elementer som videre vil kunne redusere immungenisitet mens bindingsegenskapene opprettholdes Enkelte internt-bilde anti-id Mab'er dannet mot ldiotypen av det oppnnnehge munne Abl kan fremdeles binde til CDR-podede humaniserte vananter dersom de etterfølgende krav oppfylles a) Den tredimensjonale struktur til bindingsregionen til den humaniserte variant er svært lik den til det opprinnelige museantistoff b) Det spesielle anti-id antistoff gjenkjenner akkurat denne tredimensjonale form til bindmgsregionene ("true internal image antibody")

Således er anti-idiotypiske Mab'er som bærer den ovennevnte egenskap særlig anvendbare reagenser for den spesifikke og sensitive kvantitative bestemmelse av f eks serumkonsentrasjoner av totalt humaniserte (CDR-podede) Mab'er i nærvær av et stort overskudd av normale humane immunoglobulmer

Den foreliggende oppfinnelse vedrører dannelse, produksjon og karakterisering av munne monoklonale intemt-bilde antudiotypiske antistoffer (Ab2) mot monoklonale antistoffer BR55-2 (Abl) Videre omfatter oppfinnelsen anvendelse av disse anti-idiotypiske Mab'er til fremstilling av et terapeutisk preparat for aktiv terapeutisk og profylaktisk immunisenng mot cancer av epiteloppnnnelse og lungecancer i de små celler så vel som mot sykdommer bevirket ved HIV infeksjon Videre er bruk av disse anti-idiotypiske Mab'er for den svært selektive og kvantitative bestemmelse av antistoffer eller deres fragmenter og denvater med BR55-2 spesifisitet inkluderende kimænserte og fullstendig humaniserte vananter (som beskrevet i WO 92/03165) scAvel som en generelt an-vendbar metode for selektiv lmmunaffinitetsrensing av molekyler med BR55-2 spesifisitet, også en del av oppfinnelsen

2. Dannelse og karakterisering av munne monoklonale anti-idiotypiske antistoffer mot ldiotypen av antistoffer BR552

I et forsøk på å minimalisere uønsket anti-isotypiske immunresponser, ble F(ab')2 fragmentet av BR55-2, munn IgG3, valgt for immunisenng For vellykket dannelse av munne anti-id Mab'er mot ldiotypen av det munne Mab BR55-2, er det viktig å maksima-lisere lmmungemteten for å bevirke en passende i mmunrespons i den syngemske vert Derfor ble F(ab')2 fragmentet som er uten Fc-delen (spalting og rensing beskrevet i EPA 528 767) koblet til Keyhole Limpet Hemocyamn (KLH) som immunogen bærer ved anvendelse av den heterobifunksjonelle linker N-suksimmidyl-3-(2-pyndylditio)propionat (=SPDP) i henhold til beskrevene metoder (J Carlsson et al, Biochem J 173,723,

1978)

Balb/c-mus ble immunisert med dette BR55-2/munn IgG3-F(ab')2KLH konjugat ved anvendelse av Freund's fullstendige hjelpestoff basert på en typisk prosedyre for dannelsen av munne Mab'er Etter gjentatte lmmumsennger ble munne miltceller fusjonert med den munne myelomcellelinje SP2/0 (for forsøksdetaljer, se eksempel 1)

For et passende utvalg av de dyrkede hybndomceller ble en rekke tester av supernatantene derav gjennomført Dette utvalg var basert på følgende kntener a) Sekresjonshastighet til hybndomer ved å bestemme konsentrasjonen av munn IgG i supernatantene (for forsøksdetaljer, se eksempel 2) Celler som dannet

store mengder munn IgG ble subklonet til enkelcellekulturer

b) Binding av valgte supernatanter til F(ab')2 fragmentet av BR55-2/munn IgG3 (for forsøksdetaljer, se eksempel 3) c) Inhibenng av binding av BR55-2/munn IgG2a til Lewis Y antigenpositive SKBR5 humane brystcancerceller ved hjelp av valgte supernatanter (for forsøks-detaljer, se eksempel 4)

Den sistnevnte test er utformet til å være indikerende for mternt-bilde egenskaper til Ab2er Den munne IgG2a "switch"-vanant av BR55-2 ble anvendt for binding for å minimalisere deteksjon av Ab2er som gjenkjenner gjenværende konstante regioner av F(ab')2-fragmentet av BR55-2/munn IgG3 anvendt for immunisenng Denne test ble gjennomført på en kvantitativ måte basert på IgG konsentrasjonen bestemt i test a) (eksempel 2) Videre ble et overskudd av uspesifikk mus IgG tilsatt til dette lnhibenngsfor-søk for å unngå enhver deteksjon av Ab2er som ikke er spesifikke for BR55-2 ldiotypen Det ble valgt hybndomer som danner IgG med en inhibenngskapasitet på mer enn 95% (inhibenng av binding av BR552/munn IgG2a til SKBR5 cellelinjen)

Ved anvendelse av de ovennevnte forsøksprosedyrer ble seks forskjellige hybndomer til slutt utvalgt og dyrket (E4, Cl 1, B3, B9, G6, G9) Alle de seks hybndomer danner munn IgGl som påvist ved subtype ELISA ved anvendelse av kanin anti-mus IgG 1/peroksidase (som reagensene til Zymed)

Alle seks hybndomer ble dyrket i ruUeflasker (37°C, 5% C021 medium G, forandnng av medium hver 3 til 4 dag) og supernatantene ble samlet for etterfølgende rensing

Hver supernatant som inneholder det respektive anti-id BR55-2 Mab ble renset ved anvendelse av lmmunaffimtetskromatografi Generelt er affinitetskromatografi basert på interaksjonen mellom en rmmobilisert ligand og substansen av interesse I tilfellet med anti-idiotypiske antistoffer BR55-2, er den svært spesifikke ligand for affimtetskolon-

nen Mab BR55-2/munn IgG2a som binder de valgte anti-idiotypiske Mab'"er (for for-søksdetaljer se eksempel 5)

Renhetsgraden til de isolerte anti-id BR55-2 Mab'er (E4, Cl 1, B3, B9, G6, G9) ble tes-

tet ved analytisk FPLC lonebytterkromatografi, størrelsesekskluderende kromatografi, SDS-PAGE og isoelektnsk fokusering Renheten til alle seks anti-id BR55-2 Mab'er

var >95% (for forsøksdetaljer se eksempel 6, SDS-PAGE og isoelektnsk fokusering er vist i fig 1 og 2)

De rensede anti-id Mab'er ble kvantitativt karakterisert ved bestemme deres kapasitet til

å inhibere binding av BR552/munn IgG3 til den Lewis Y antigenpositive SKBR5 celle-

linjen Alle anti-id Mab'er inhiberer bindingen av Abl til dets antigen basert på en 1 1 støkiometn (for forsøksdetaljer se eksempel 7, representative resultater er vist i fig 3)

Et avgjørende bevis på interrit-bilde egenskapene til anti-id BR55-2 Mab'er som beskre-

vet over og deres anvendelse som surrogat-tumoranhgen er basert på deres evne til å

danne en Ab3-respons mot tumorassosiert antigen i andre spesier I henhold til "network"-teonen til N Jeme har antistoffer (Ab3) indusert ved immunisenng med mtemt-bilde anti-id Mab'er (Ab2) en bindingsspesifisitet som er lik den til Abl Derfor bør immunresponsen bevirket ved immunisenng med anti-id BR55-2 Mab'er være spesifikk for Lewis Y antigenpositive tumorceller Følgelig kan beskyttende antitumor-lmmumtet induseres i mennesker ved-immunisenng med anti-id BR55-2 Mab'er

For å undersøke egenskapene til en Ab3 respons ble kaniner så vel som rhesusaper immunisert med anti-id BR55-2 nr E4 og alumimumhydroksid som bærer og adjuvans Denne milde adjuvans er vanlig brukt i forskjellige vaksiner for human anvendelse

Som en negativ kontroll ble dyrene også immunisert med den samme mengde uspesi-

fikk mus IgGl Etter fire immunisennger i løpet av 5 uker ble serum samlet i uke 9 (for forsøksdetaljer se eksempel 8) Binding av serum lg til Lewis Y antigenpositiv SKBR5 brystcancercellelmje og til Lewis Y antigennegativ WM9 melanomcellehnje ble be-

stemt (for forsøksdetaljer se eksempler 9 og 10)

Anti-id BR55-2 nr E4 utløser en høytiter humoral immunrespons både i kaniner og rhesusaper Serum lg til dyr immunisert med anti-id BR55-2 nr E4 binder selektivt til den Lewis Y antigenpositive SKBR5 cellelinje, men ikke til den Lewis Y antigennegative WM9 cellelinje I motsetning til dette blir det ved immunisenng med uspesifikk mus IgGl nesten ikke påvist tumorcellebindende serum lg Disse resultatene er opp-

summert i tabell 1 I figurene 4 og 5 er representative lg bindingskurver oppnådd med preserum og immunt serum fra kanin og rhesusaper i en celle-ELIS A (SKBR5 celler)

vist Binding av serum lg fra dyr immunisert med anti-id BR55-2 nr E4 ul SKBR5-cel-

ler kan fremdeles detekteres ved en serumfortynning på 1 10 000

To år etter det initiale immumsenngsforløp mottok de respektive rhesusaper en første

enkel boost-injeksjon av anti-id BR55-2 nr E4 eller uspesifikk mus IgGl På samme måte ble en annen enkel boost-injeksjon gitt tre år etter initial immunisenng (= ett år etter første boost-injeksjon, for forsøksdetaljer se eksempel 8) Serum ble samlet før og etter disse boost-injeksjoner

Den totale humoral immunrespons til rhesusapene vaksinert med anti-id BR55-2 nr E4

ble bestemt ved anvendelse av en ELISA basert på anti-id BR55-2 nr E4 belagt på mikrotiterplatene (for forsøksdetaljer se eksempel 13) I serumet til alle rhesusapene fant man en svært høy titer immunrespons etter den første immunisenng så vel som etter den første og andre boost-vnjeksjon Ig-bmding til anti-id BR55-2 nr E4 detekteres fremde-

les ved serumfortynninger på 1 50 000 Et noe lavere, men fremdeles svært signifikant titer er funnet i serum før boost-injeksjoner Disse resultatene er vist i fig 6-8

Den humorale immunrespons til rhesusapene vaksinert med uspesifikk mus IgGl ble

også bestemt ved anvendelse av den samme ELISA som nevnt i det foregående (for forsøksdetaljer se eksempel 13) Som ventet er serumtitere av Ig-bmding til anti-id

BR55-2 nr E4 lavere enn Uteme som er funnet i serum til aper vaksinert med anti-id BR55-2 nr E4 Mens immunresponsen til rhesusapene immunisert med uspesifikk mus

IgGl kryssreagerer med de konstante regioner av anti-id BR55-2 nr E4, er den fraksjon

av immunresponsen som er rettet mot de hypervanable regioner av anti-id tydeligvis manglende Disse resultater er vist i fig 9-10

Som bevis på tumorspesifisiteten til immunresponsen etter den initiale immunisenng så

vel som før og etter boost-immunisenngene, ble binding av apeserum lg til flere Lewis Y antigenpositive cancercellehnjer (bryst, mage, kolon og lunge) så vel som til en

Lewis Y negativ melanomcellehnje bestemt (for forsøksdetaljer se eksempel 10) I rhesusaper behandlet med anti-id BR55-2 nr E4 og to år etter første immunisenng og før første boost-immumsenng, kan serum-Ig som binder til Lewis Y antigenpositive tumorceller fremdeles påvises Etter den første boost-immumsenng finner man svært økte ti-tere av serum-Ig som spesifikt binder bl Lewis Y antigenpositive tumorceller i dyr som er immunisert med anti-id BR55-2 nr E4, men nesten ingen binding til en antigennega-

tiv cellelinje påvises Ingen spesifikk binding observeres på noe tidspunkt i-serum til rhesusaper som er immunisert med uspesifikk mus IgGl Lignende resultater er funnet med serum oppnådd før og etter den andre boost-immumsenng Disse titrenngsresulta-

ter for serum oppnådd på forskjellige tidspunkter i celle-ELISA ved anvendelse av flere tumorcellehnjer er vist i fig 11 - 20

Et lignende mønster på immunreaktivitet for lg i forskjellige apesera før og etter første immunisenng så vel som før og etter den første boost-immumsenng kan også vises ved bindmgsforsøk til et membranpreparat av Lewis Y antigenpositive SKBR5 celler (for forsøksdetaljer se eksempel 11) Resultatene er oppsummert i tabell 2

For videre å analysere mer detaljert den humorale immunrespons indusert i rhesusaper

ved immuniseringer med anti-id BR5S-2 nr E4, ble forskjellige serum av vaksinerte aper immunrenset på en kolonne fylt med anti-id BR5S-2 nr E4 koblet til Sepharose (for forsøksdetaljer se eksempel 12) Ved denne selektive én-tnnns prosedyre separeres hele den humorale immunrespons mot anti-id BR55-2 nr E4 fra alle andre i relevante serumprotemer I et første forsøk ble lg fra en rhesusape immunisert med anti-id BR55-2 nr E4 immunrenset fra serumet oppnådd i uke 9 etter den initiale immunisenng I et annet forsøk ble lg til en rhesusape immunisert med anti-id BR55-2 nr E4 immunrenset fra det samlede serum som er oppnådd i uke 4 og 9 etter den andre boost Basert på

deres retensjon på anti-id BR55-2 nr E4 kolonnen, binder de oppnådde lg fraksjoner spesifikt til forskjellige epitoper av anti-id BRS5-2 nr E4 antistoffmolekylet Disse Ig-fraksjoner inneholder antistoffer mot de konstante regioner til anti-id BR55-2 nr E4 (anti-isotyp immunrespons) så vel som antistoffer mot de vanable regioner inklude-

rende bindingsregionen til anti-id BR55-2 nr E4 (anti-idiotyp immunrespons) Basert på den ldiotype nettverksteon som nevnt i innledningen, er den siste del (AB3) særlig viktig da den utviser bmdingsegenskaper som er sammenlignbare med dem hos antistof-

fer med BR552 (AB1) spesifisitet

Bindingen av den immunrensede Ig-fraksjon fra det samlede serum oppnådd i uke 4 og

9 etter den andre boost og av gjennomstrømmngsfraksjonen til anti-id BR5S-2 nr E4

ble bestemt (for forsøksdetaljer se eksempel 13) Mens den immunrensede Ig-fraksjonen binder sterkt til anti-id BR5S-2 nr E4, påvises ingen binding for gjennomstrømmngs-fraksjonen Ved dette resultat er selektivitet og effektivitet for denne immunrensingsme-

tode bevist (resultatene er vist i fig 21)

Deretter ble bindingsegenskaper til den immunrensede Ig-fraksjon fra det samlede

serum oppnådd i uke 4 og 9 etter den andre boost, av gjennomstrørrmin<g>sfraksjonen og av en humanisert reaksjon av moder-munn Mab (AB1) sammenlignet på SKBR5 brystcancerceller Denne humaniserte AB1 variant (BR552/humanisert IgGl) ble valgt for å forenkle sammenligningen da den kan detekteres med det samme reagens som også an-

vendes for deteksjon av rhesusape lg (geit-anti-human-Ig/peroksidase som likeledes også binder til det nært beslektede rhesusape lg) Nesten all tumorcellebindingsreaktivi-

tet er akkumulert i den immunrensede Ig-fraksjon Ved dette resultat er kryssreaktivite-ten av rhesusape lg indusert ved immunisenng med anti-id BRSS-2 nr E4 med en Lewis Y antigenposihv tumorcellehnje bevist Videre, på en vekt-til-vekt basis er bm-dingsstyrken til den immunrensede Ig-fraksjon kun 5 ganger lavere enn den til BR55-2 /humanisert IgGl (AB1) Når man tar i betraktning at kun en bestemt del av den immunrensede Ig-fraksjon er rettet mot bindingsregionen av anti-id BR55-2 nr E4 og at i henhold til nettverksteonen utviser kun denne del bindingsegenskaper som er sammenlignbare med AB 1, er dette resultat påfallende Basert på utbyttet av lmmunaffimtets-rensingen av rhesusapeserum, kommer titeret av den immunrensede lg fraksjon opp til omtrent 200 ug/ml serum, tilsvarende til omtrent 40 ug/ml lg med tumorcellebindings-egenskaper som er hk dem til BR55-2/humamsert IgGl (resultatene er vist i fig 22, for forsøksdetaljer se eksempler 10 og 12)

En sammenligning av bindmgsegenskapene til immunrenset ape lg (AB3) med dem til BR55-2/humamsert IgGl på den Lewis Y positive brystcancercellelmje SKBR5 og den

Lewis Y negative melanomcellehnje WM9 er vist i fig 23 (for forsøksdetaljer se ek-

sempel 10) Mens både AB3 fraksjonen og BR55-2/humamsert IgGl binder sterkt til den Lewis Y positive cellelinje som beskrevet over, binder begge antistoffer ikke spe-

sielt til den Lewis Y negative cellelinje Med disse resultater er likheten mellom bin-dingsmønsteret til AB3 fraksjonen og den humaniserte AB1 variant bevist

Et lignende immunreaktivitetsmønster for AB3 fraksjonen er også observert i ELISA

ved anvendelse av membranrfaksjoner av den Lewis Y positive SKBR5 cellelinje og den Lewis Y negative cellelinje WM9 Vesentlig binding av AB3 fraksjonen detekteres kun hl den Lewis Y positive cellemembran (resultatene er vist i fig 24, for forsøksde-

taljer se eksempel 11)

Bindmgsegenskapene til immunrenset ape lg (AB3) ble ytterligere dokumentert på flere Lewis Y positive humane tumorcellehnjer ("small cell" lungecancer, magecancer, ko-loncancer, brystcancer) Immunrenset ape lg binder sterkt til alle de testede cellelinjer

(resultatene er vist i fig 25, for forsøksdetaljer se eksempel 10)

AB1 antistoffet BR55-2/munn IgG3 vil etter binding til tumorceller mediere tumorcel-lenedbryting via aktivering av humane effektormekamsmer For å teste evnen til tumor-celleødeleggelse for rhesusape lg indusert ved immunisenng med anti-id BR55-2 nr E4, ble immunrenset ape lg (AB3) anvendt For dette forsøk ble AB3 fraksjonen immunrenset (se det foregående) fra serum til en rhesusape oppnådd 9 uker etter den initi-

ale immunisenng med anti-id BR55-2 nr E4 Denne AB3-fraksjonen ble sammenlignet med BR55-2/munn IgG3 (ABI) i et ADCC forsøk ved anvendelse av human PBMC som effektorceller (resultatene er vist i fig 26, for forsøksdetaljer, se eksempel 14) Den immunrensede AB3 fraksjon medierer tumorcelleødeleggeise via aktivenng av humane effektorceller ved høyere konsentrasjoner sammenlignet med munn ABI Ved dette re-

sultat er induksjon av selektiv tumorcellecytotoksisitet ved vaksinasjon med anti-id BR55-2 nr E4 demonstrert En høyere konsentrasjon av AB3- er nødvendig da kun en bestemt del av den immunrensede lg-fraksjon er rettet mot bmdingsregionen til anti-id BR55-2 nr E4 og kun denne del forventes å binde tit tumorcellene og mediere ADCC

Som nevnt i innledningen er det kjent at Lewis Y karbohydrat-antigenet også er uttrykt på humane leukocytter infisert med HIV For å undersøke bindingsatferden av serum lg fra rhesusaper immunisert med anti-id BR55-2 nr E4 eller med uspesifikk mus IgGl til HIV-infiserte celler, ble apeserum oppnådd før og 9 uker etter den initiale immunisenng testet i et kommersielt tilgjengelig testkit som opprinnelig er utformet for deteksjon av HIV serumpositivitet i humant serum Denne test er basert på evnen for humant serum

lg til å binde til den HIV-infiserte humane T-cellehnje PALL som detektert ved indi-

rekte lmmunfluorescens ved anvendelse av anti-human IgG-FITC På grunn av den store likhet mellom human og rhesusape lg kan det oppnnnehge reagens i testkittet også anvendes for rhesusape lg Binding til ikke-infisert PALL celler tjener som kontroll (for forsøksdetaljer, se eksempel 15)

Med normalt rhesusapesemm er bakgrunnsimmunfluorescensen til bade HIV infiserte

og lkke-mfiserte PALL celler litt større enn bakgrunnsimmunfluorescensen detektert med normalt humant serum Kun serum lg til rhesusaper immunisert med anti-id BR55-2 nr E4 binder imidlertid vesentlig til de HIV-infiserte PALL-celler mens nesten ingen binding til uinfiserte PALL-celler detekteres Reaktiviteten av serum lg fra rhesusaper immunisert med uspesifikk mus IgGl til HIV-infiserte PALL-celler er klart mindre mar-kert og nær bakgrunnsimmunfluorescensen som observert med normale apeserum (resultatene er oppsummert i tabell 3)

lg til en rhesusape immunisert med anti-id BR55-2 nr E4 ble immunrenset fra det sam-

lede serum oppnådd i uke 4 og 9 etter den andre boost ved anvendelse av en anti-id BR55-2 nr E4 kolonne (se det foregående) Bindmgsegenskapene til denne immunren-

sede lg (AB3) ble sammenlignet med dem for BR552/munn IgG3 (ABI) i det allerede nevnte kommersielt tilgjengelige testkit som er utformet for deteksjon av HIV serumpositivitet i humant serum (for forsøksdetaljer, se eksempel 15) Den immunrensede lg fraksjon (AB3) binder selektivt til de HIV-infiserte PALL-celler, og ingen binding detekteres til ikke-infiserte PALL celler Et lignende bindingsmønster finner man for BR55-2/munn IgG3 (ABI) Disse resultater er oppsummert i tabell 4

I tillegg til deres anvendelse som enestående vaksine for profylakse for og behandling

av forskjellige cancere og sykdommer forårsaket av HIV, er internt-bilde anti-idioty-

piske Mab'er dannet mot bindingsregionen av BR55-2 som beskrevet i den foreliggende oppfinnelse, et sterkt virkende redskap for den kvantitative bestemmelse av monoklo-

nale antistoffer, deres derivater eller fragmenter med BR55-2 bindingsspesifisitet De kan f eks anvendes for den selektive bestemmelse av konsentrasjonen av alle munne subtyper av BR55-2 i humant serum På grunn av gjenkjennelsen av den tredimensjo-

nale form til bindingsregionen i BR55-2 binder disse anti-id Mab'er kun til lmmunreak-

tive BR55-2 strukturer Denne egenskap fører til deteksjonssystemer som er overlegne dem som er basert på konvensjonelle anti-konstant region reagenser Et ELISA-system for den kvantitative bestemmelse av lmmunreaktive BR55-2/munn IgG3 eller BR55-2/- munn IgG2a er beskrevet i eksempel 16 og en typisk standardkurve for disse Mab'er i humant serum er vist i fig 27

Et lignende ELISA system basert på anti-id Mab'er og beskrevet i den foreliggende oppfinnelse kan anvendes for den meget selektive kvantitative bestemmelse av lmmun-reaktive mus/humane kimærer av BR55-21 humant serum Disse kimærer består av de vanable domener av BR55-2 og av humane konstante regioner (f eks human IgGl eller human IgG3) På grunn av det store overskudd av normal human lg i humant serum

(>10 mg/ml), kan slike mus/humane kimærer ikke detekteres i humant serum ved anvendelse av konvensjonelle anh-human-Fc reagenser som binder til alle humane lg til-

stede i serum Det selektive ELISA-system er beskrevet i eksemplene 17 og 18, typiske standardkurver i humant serum er vist i fig 28 og 29

Fullstendig humaniserte varianter av BR55-2 er blitt konstruert ved å pode de komplementantetsbestemmende regioner (CDRer) til det munne moder-Mab ul humane "framework" og konstante regioner Ved hjelp av datamodellforsøk førte enkelte punkt-mutasjoner i det valgte humane "framework" Ul humaniserte vananter uten vesentlig tap i bmdmgsaffimtet Ul Lewis Y posiUve tumorceller sammenlignet med oppnnnehg mu-

nn Mab I disse humaniserte vananter forblir således kun den ubetydelige delen av de oppnnnehge munne aminosyresekvenser som bestemmer bindmgsegenskapene ufor-

andret Alle anti-id BR55-2 Mab'er beskrevet i den foreliggende oppfinnelse binder be-merkelsesverdig også sterkt til ldiotypen av disse humaniserte IgGl vananter av det oppnnnehge mus IgG3 Mab Bindingsoppførselen av anti-id Mab'er til de humaniserte vananter av ABI kan sammenlignes med den til de mus/humane kimære Mab'er nevnt i det foregående Dette er vist ved biospesifikk lnteraksjonsanalyse ved anvendelse av BIAcore TM-systemet fra Pharmacia I de fleste tilfeller ved høyere konsentrasjoner

observeres nesten en 1 1 støkiometn mellom anti-id BRSS-2 og Br55-2/kimær human IgGl eller BR55-2/humanisert IgGl Forsøksdetaljer er beskrevet i eksempel 19, tttre-nngskurver er vist i fig 30 - 35 Disse funn kaster lys over bindingsselektiviteten av anti-id Mab'er til den intakte Uedimensjonale form av den hypervanable region til alle vananter av BR55-2 og viser deres internt-bilde egenskaper

Basert på dette unike og selektive gjenkjennelsesmønster kan anti-id BR55-2 Mab<*>er

også anvendes for den svært selektive kvantitative bestemmelse av lmmunreaktive humaniserte antistoffer med BR55-2 spesifisitet i humant serum Ul tross for det store overskudd av humant immunglobulin tilstede i serum Det samme ELISA-system kan også anvendes for den kvantitative bestemmelse av humaniserte anUstoffer med BR55-2 spesifisitet i apeserum Dette er f eks viktig for ape-toksisitets- og farmakokineUske studier som kreves under den prekliniske utvikling av et humanisert BR55-2 Mab for passiv immunterapi ELIS A-systemet er beskrevet i eksempel 20, en typisk standardkurve i humant serum er vist i fig 36

Gjenkjennelsen av bindingsregionen til alle vananter av BR552 ved hjelp av anti-id

BR55-2 Mab<*>er er også demonstrert ved den konkurrerende binding av BR55-2/munn

IgG3 Ul anti-id BR55-2 nr E4 ved BR55-2/kimær human IgGl og BR55-2/kimær

human IgG3 Begge kimærer inhiberer kompetiUvt binding av en fast konsentrasjon av moder-munn Mab Ul anti-id BR55-2 nr E4 på en doseavhengig måte Denne konkurre-

rende ELISA er beskrevet i eksempel 21 og resultatene er vist i fig 37

Binding av BR55-2/munn IgG3 til antigenpositive tumorcellehnjer er en betingelse for komplementmediert destruksjon Således vil inhibenng av tumorcytotoksisitet ved anti-id BR55-2 Mab'er reflektere deres evne til å blokkere bindingen av Abl til dets antigen på celleoverflaten Den potente nøytralisenng ved anti-id BR55-2 nr E4 av komplementavhengig cytotoksisitet mot SKBR5 humane brystcancerceller mediert ved BR55-2/munn IgG3 er vist i fig 38, for forsøksdetaljer, se eksempel 22

På grunn av den svært spesifikke gjenkjennelse av alle strukturer med intakt BR55-2 bindingsregjon kan anti-id BRS5-2 Mab'er anvendes for en ett-tnnns lmmunrensmgs-prosedyre av alle vananter av BR55-2 Anti-id BR55-2 nr E4 er blitt koblet til CH-Sepharose 4B Dette lmmunaffmitetsmatenale kan f eks anvendes for en direkte rensing av BR55-2/kimær human IgGl dyrket in vitro Kimær Mab ble oppnådd i et utbytte på 75% med en renhet >95% På grunn av den mye høyere selektivitet er denne lmmun-rensemetoden overlegen affinitetsrensing hvor det anvendes Protein A For forsøks-detaljer, se eksempel 23, SDS-PAGE er vist i fig 39 Ingen forurensninger påvises Den samme metode kan vellykket anvendes med lignende resultater for en svært effektiv ett-tnnns rensing av cellekultursupernatanter av en humanisert vanant av BR55-2 oppnådd ved poding av CDRer

Som konklusjon ser man at immunisenng av kaniner og rhesusaper med et munnt monoklonalt IgGl anti-idiotypisk antistoff mot ldiotypen av antistoffer med BR55-2 spesifisitet (anti-id BR55-2 nr E4) forer til en hoytiter immunrespons som spesifikt binder til Lewis Y positive humane tumorceller Som vist i forsøkene i rhesusaper, vil anti-tumor-lmmumteten ved gjentatte boost-immumsennger opprettholdes i flere år lg utløst ved disse immunisenngene i nærvær av humane effektorceller utviser tumorcytotoksisitet i ADCC Spesifisiteten til anti-id lmmumsenngen er vist ved immunisenng av en kon-trollgruppe av rhesusaper med uspesifikk mus IgGl Til tross for en vesentlig immunrespons mot det uspesifikke mus IgGl påvises ingen spesifikk binding til noen type av tumorceller

Ved disse resultater er bruken av anti-id BR55-2 Mab'er som sunogat for det Lewis Y tumorassosierte antigen for terapeutisk og profylaktisk aktiv immunisenng med det for-mål å redusere en beskyttende anti-tumonmmumtet i mennesker blitt belyst

Videre fører immunisenng av rhesusaper med et anti-id BR55-2 Mab til en høytiter immunrespons som også selektivt binder til HIV infiserte positive celler Disse celler er kjent til å uttrykke Lewis Y I motsetning til dette fører immunisenng av rhesusaper med uspesifikk mus IgGl ikke til noen spesifikk binding til HIV positive eller negative celler

Ved disse resultater er bruk av anti-id BR55-2 Mab'er som surrogat for Lewis Y karbo-hydratantigenet for terapeutisk og profylaktisk vaksinasjon av mennesker med det for-

mål å indusere en beskyttende immunitet mot HIV og sykdommer forårsaket av HIV-infeksjon belyst

I tillegg til bruk av anti-id BR55-2 Mab'er som profylaktiske og terapeutiske vaksiner,

er disse intemt-bilde anti-id Mab'er anvendbare reagenser for den svært selektive og kvantitative bestemmelse av molekyler med BR55-2 spesifisitet inkluderende kimære og humaniserte vananter i serum eller andre kroppsflmder Disse anti-id Mab'er kan ved kovalent kobling til en passende matnks også anvendes for svært selektive én-tnnns immunaffimtetsrensinger av alle molekyler med BR55-2 spesifisitet i høyt utbytte

Foreliggende oppfinnelse vedrører antistoffer, kjennetegnet ved at de er monoklonale

munne internt-billeddannende anti-idiotypiske antistoffer (Ab2) mot monoklonale antistoffer BR55-2 (Abl)

Foreliggende oppfinnelse vedrører også en fremgangsmåte for fremstilling av anh-idiotypiske antistoffer som angitt ovenfor, kjennetegnet ved at den omfatter å immunisere mus med BR55-2/munnt IgG3-F(ab')2-KLH-konjugat, fusjonere de munne miltceller med den munne myelomcellehnje SP 2/0, selektere de dyrkede hybndomceller som produserer IgG med en inhibenngskapasitet på mer enn 95% inhibenng av binding av BR55-2 munn IgG2a til SKBR5 cellelinjen, rense og isolere det anti-idiotypiske anti-

stoff

Videre vedrører foreliggende oppfinnelse en anvendelse av anti-idiotypiske antistoffer

som angitt ovenfor for fremstilling av et terapeutisk preparat for profylaktisk og/eller terapeutisk immunisenng mot HIV-infeksjoner

Oppfinnelsen vedrører også et farmasøytisk preparat som som aktiv bestanddel omfatter

et anti-idiotypisk antistoff som angitt i krav 1 sammen med en farmasøytisk tålbar adju-

vans, bærer eller fortynmngsmiddel for anvendelse i profylaktisk og/eller terapeutisk immunisenng mot HIV infeksjoner

Den vedrører også anvendelse av monoklonale anti-idiotypiske antistoffer som angitt ovenfor for fremstilling av et terapeutisk preparat for immunisenng mot cancer av epitel opprinnelse og mot "small cell" lungecancer

Foreliggende oppfinnelse vedrører også et farmasøytisk preparat som omfatter et anti-ldiotypisk monoklonalt antistoff som angitt i krav 1 sammen med en farmasøytisk tilbar adjuvans, bærer eller fortynmngsmiddel for rmmumsenng mot cancer av epitel oppnn-

nelse og mot "small cell" lungecancer

Videre vedrører oppfinnelsen anvendelse av anti-idiotypiske antistoffer som beskrevet over, for den kvantitative bestemmelse av monoklonale antistoffer, deres denvater eller fragmenter med BR55-2 bindingsspesifisitet

Oppfinnelsen vedrører videre anvendelse av anti-idiotypiske antistoffer som angitt over

for den kvantitative bestemmelse av monoklonal mus/humane kimærer av BR5S-2 og fullstendig humaniserte vananter av BR55-2

Til slutt vedrører oppfinnelsen også anvendelse av anti-idiotypiske antistoffer som

tidligere angitt for en ett-tnnns immunrensing av vananter av BR55-2

De etterfølgende eksempler illustrerer oppfinnelsen Forkortelsene har følgende

betydninger

ADCC antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet

BSA bovint serumalbumin

CDC komplementavhengig cytotoksisitet

DMEM Dulbecco-modifisert Eagle medium

EDC N-etyl-N,-(3-dimetylamonopropyl)karbodiimidhydroklond

ELISA enzym-linket immunosorbentassay

FCS føtalt kalveserum

HBS hepes-bufret saltvann

Mab monoklonalt antistoff NHS N-hydroksysuksimmid PBffC

mononukleære penfere blodceller

PBS fosfatbufret saltvann

RAM-IgGl kanin anti-mus IgGl immunglobulin

RPMI Roswell Park Memonal Institute

SDS natnumdodesylsulfat

KLH keyhole hmpet hemocyanin

SPDP N-suksinimidyl-3 -(2-pyndyl-ditio-propionat)

PAGE polyakrylamidgelelektroforese

IEF isoelektnsk fokusenng PEG polyetylenglykol

FITC fluonsotiocyanat

IFA lrnmunfluorescensbesternmelse

Matenalene omtalt i eksemplene er som følger

Eksempel 1: Dannelse av anti-id BR55-2 Mab'er

1 1 Immunisenng av mus

Balb/c mus immuniseres hver med 100 ug F(ab')2-fragment av BR55-2/munn IgG3, koblet til KLH via SPDP som beskrevet (J Carlsson et al, Biochem J 173, 723,1978) ved intrapentoneal injeksjon i henhold til følgende skjema

På dagene 8,9,10 og 11 etter primær immunisenng i v gis totalt 4 boost-injeksjoner

(hver på 100 ug konjugat 1100 ul PBS def) På dag 12 fjernes milten aseptisk, suspen-

deres i PBS def og vaskes tre ganger i PBS def

1 2 Hvbndisenng

Disse miltceller tilsettes til en suspensjon av SP2/0 celler i et forhold 1 1 og sentnfuge-

res ved 900 G i 5 minutter 1 ml PEG-oppløsning (37°C) tilsettes dråpevis til cellepelle-

ten i løpet av 1 minutt og man fortynner med 1 ml PBS def (37°C) i løpet av det neste minutt 10 ml medium C tilsettes under forsiktig omrøring og suspensjonen fortynnes til 50 ml med PBS def Suspensjonen sentnfugeres ved 800 g i 5 minutter, pelleten resuspenderes i medium D og cellene overføres til brønnene i en mikrotiterplate (Nunc 96) i en konsentrasjon på 2,5 x 105 celler/brønn Etter inkubasjon over natten ved 37°C, 5%

CO2 tilsettes 100 ul medium E/brønn Etter 72 timer og deretter hver fjerde dag erstattes mediumet med medium D

Eksempel 2: Kvantitativ bestemmelse av mus IgG 1 hybndomsupernatanter

100 ul prøver av kanin-anti-mus-IgG (som reagenset til Nordte, 1 10001 belegningsbuf-

fer) tilsettes til brønnene 1 mikrotiterplater og inkuberes ved 37°C 160 minutter Platene vaskes deretter 6 ganger med vaskebuffer, 200 ul PBS def /5% FCS tilsettes og man in-kuberer 1 30 minutter ved 37°C Platene vaskes som beskrevet 1 det foregående 100 ul prøver av hybndomsupernatantene oppnådd etter 2 ukers dyrking tilsettes og platene inkuberes 160 minutter ved 37°C Ubundet antistoff vaskes ut som beskrevet over og 100 ul prøver av penoksidase-konjugert antistoff (kamn-anti-musIgG/peroksidase som Dianova-reagensene, 1 10001 PBS/2% FCS) tilsettes Etter inkubasjon 1 30 minutter

ved 37°C vaskes platene 4 ganger med vaskebuffer og to ganger med fargebuffer 100

ul prøver av substraUøsmng tilsettes og fargeutvikling stanses etter 5 minutter med 50

p.1 prøver av 4N H2SO4 Fotometnsk ekstinksjon måles ved 492 nm (referansemåling 620 nm)

Eksempel 3: Spesifikk binding av hybridomsupernatant-IgG til BR55-2 F(ab')2 fragment (ELISA)

Hybndomer som danner tilstrekkelig mus IgG (det vil si med optisk tetthet som er mer

enn 10 ganger den for medium-blindprøven) subklones til enkeltcelle-kultur 1 medium F

og dyrkes 1 medium C 1 ytterligere 2 uker Supernatantene testes som beskrevet 1 eksem-

pel 2, ved anvendelse av 100 ul prøver av F(ab')2 fragment av BR55-2 (10 ug/ml, fortynning i belegmngsbuffer)

Eksempel 4: Inhibering av binding av BR55-2/murin IgG2a til SKBR5 humane brystcancerceller ved hybndomsupernatant-IgG (celle-ELISA)

Alle hybndomsupematanter som er positive i den ovennevnte analyse testes som følger

Mikrotiterplater forvarmes med poly-L-lysinhydrobromid (20-30 kD, 20 ug/ml i PBS def, 100 ul/brønn, 30 minutter, romtemperatur), vaskes to ganger med PBS def (200 ul/brønn) og inkuberes deretter over natten ved 4°C med 50 ul/brønn av en suspensjon av SKBR5 celler i medium B (4 x 106 celler/ml) Etter fjerning av supematanten fikseres cellene med 50 ul glutardialdehyd/brønn (0,1% i fysiologisk saltvann) i 5 minutter ved romtemperatur, supernatantene fjernes, cellene resuspenderes 1200 ul/brønn i PBS def/1% BSA/0,1% NaN3 og får stå 11 time ved romtemperatur Supernatantene fjernes og platene vaskes to ganger med 200 [il/brønn PBS inneholdende 0,05% Tween 20

Hybndomsupematanter justert til 1 ug/ml mus-IgG preinkuberes med 10-ganger overskudd av uspesifikk mus-IgG i 30 minutter ved 37°C Deretter fonnkuberes disse prøver med 0,5 ug/ml BR55-2/munn IgG2a 130 minutter ved 37°C 100 ul av denne blanding tilsettes til cellene og platene inkuberes 11 time ved 37°C

Bearbeiding av blandingen Ubundet antistoff vaskes ut to ganger med 100 ul/brønn iskald PBS inneholdende 0,05% Tween 20 100 ul prøver av peroksidase-konjugert antistoff (kanin-anti-mus IgG2a/peroksidase som reagensene til Zymed, 1 10001 PBS def /2% FCS) tilsettes Etter inkubasjon 145 minutter ved 37°C vaskes brønnene tre ganger med PBS/Tween 20 løsningen nevnt i det foregående og deretter tilsettes 100 ul av substratløsmngen til hver brønn Etter 5 minutter stanses fargeutvikhngen ved tilset-ning av 50 ul 4 N ^SOybrønn Binding av antistoffet til cellene bestemmes ved å måle ekstinksjonen ved 492 nm (referansemåling 620 nm)

Eksempel 5* Imanunoaffinitetsrensing av anti-id BR55-2 Mab'er

5 1 Fremstilling av BR55- 2/ munn IeG2a Sepharose

10 g frysetørket aktivert CH-Sepharose 4B suspenderes 11 mM HC1, overføres til et sinterglassfilter og vaskes med 2 1 1 mM HC1 115 minutter Liganden (120 mg BR55-2/munn IgG2a) oppløst 150 ml koblingsbuffer blandes med den vaskede gel i en lukket beholder og roteres opp ned i en time ved romtemperatur Gelen vaskes med koblmgs-buffer og inkuberes i en time med 50 ml 1 M etanolamin for å blokkere resterende aktive grupper Det affinitetsabsorberte vaskes deretter med tre sykluser med alternerende pH Hver syklus består av en vasking ved pH 4 (0,1 M acetat, 0,5 M NaCl) etterfulgt av én vask ved pH 8 (0,1 M Tris, 0,5 M NaCl)

5 2 Isolasion av anti- id BR55- 2 Mab' er

Kromatografi gjennomføres ved 4°C Kolonnen (BIO REX MP kolonnediameter 1,5 cm) er fylt med Mab BR55-2/munn IgG2a Sepharose (volum 35 ml) Gelen vaskes med bindingsbuffer og eluenngsbuffer Etter ekvihbrenng med bindingsbuffer påføres kondisjonert medium inneholdende anti-id BR55-2 på kolonnen i en strømningstakt på 15 ml/mm Etter eluenng av gjennomslagfraksjonen desorberes bundet anu-id BR55-2 med eluenngsbuffer, og nøytraliseres umiddelbart etter desorpsjon med 1 M Tns/HCl buffer pH 7,5

5 3 Konsentrenng av anti- id BR55- 2 Mab' er

Konsentrenng av den eluerte antistoffoppløsmng (0,12 mg/ml) gjennomføres i en om-rørt Amicon ultrafiltrenngscelle ved anvendelse av en PM 10 Diaflo membran Forkast-ningen for IgG er mer enn 98%, sluttkonsentrasjonen av IgG strekker seg til 3,7 mg/ml Eksempel 6: Karakterisering av renhet anti-id BR5S-2 Mab'er

6 1 Ionebvtterkromatoerafi på Mono- 0

6 2 Høwtelseskromatografi med størrelsesutelukkelse

6 3 SDS- PAGE

Forsøk gjennomføres under både redusering og ikke-reduserende betingelser i henhold

til metoden etter Laemmh ved anvendelse av 10% akrylamidgeler Ingen forurensninger påvises (resultatene er vist i fig 1)

6 4 Isoelektnsk fokusering

Analyse gjennomføres med Phast-systemet (Pharmacia) ved anvendelse av en pH-gradi-ent 3-9 (Phast gel IEF 3-9) og ved hjelp av sølvfarging (resultatene er vist i fig 2)

Eksempel 7: Binding av BR55-2/murin IgG3 til SKBR5 cellelinje (celle-ELISA) -

Inhibenng med rensede anti-id Mab'er.

Forbehandlingen av mikrotiterplatene gjennomføres som beskrevet i eksempel 4 Det respektive anti-id BR55-2 Mab er fortynnet i PBS def inneholdende 2% FCS (10 til 0,5 ug/ml) Til hver av disse fortynninger tilsettes 1 ug/ml BR55-2/munn IgG3 100 ul av denne blanding tilsettes til cellene og platene inkuberes 11 time ved 37°C Blandingen bearbeides som beskrevet i eksempel 4 Graden av binding av BR552/munn IgG3 til cellene bestemmes ved å måle ekstinksjonen ved 492 nm (referansemåling ved 620 nm)

Eksempel 8: Immunisenng av kaniner og rhesusaper med anti-id BR55-2 nr E4.

8 1 Immunisenng av kaniner med anti- id BR55- 2 nr E4

Tre chinchilla hunnkaniner immuniseres ved lntradermal tilførsel av 300 \ ig anti-id

BR55-2 nr E4 adsorbert på alumimumhydroksid (1 mg antistoff pluss 3,3 mg

Al(OH)3/ml PBS def) på dag 1, 8,15 og 36 Tre kaniner immuniseres med den samme mengde uspesifikk mus-IgG 1 som negativ kontroll under de samme betmgelser Serum ble samlet før immunisenng og i uke 9 etter første immunisenng

8 2 Immunisenng av rhesusaper med anti- id BR55- 2 nr E4

Tre rhesusaper immuniseres ved subkutan (s c) tilførsel av 0,1 mg anti-id BR55-2 nr

E4/kg adsorbert på alummiumhydroksid (1 mg antistoff pluss 3,3 mg Al(OH)3/ml PBS

def) på dag 1, 8,15 og 36 To rhesusaper immuniseres med den samme mengde uspesi-

fikk mus-IgGl som negativ kontroll og under samme betmgelser Serum samles før immunisenng og i uke 4 og 9 etter den første immunisenng

To år etter det initiale unmunisenngsforløp mottok de samme aper en første subkutan boost-injeksjon med anti-id BR55-2 nr E4 eller henholdsvis uspesifikk mus-IgGl (samme mengde og formulenng som over) Serum samles før så vel som 1 og 4 uker etter den første boost-immumsenng

Tre år etter det initiale lmmumsenngsforløp (= ett år etter den første boost-injeksjon)

mottar de samme aper en andre subkutan boost-injeksjon med anti-id BR55-2 nr E4 eller med henholdsvis uspesifikk mus-IgGl (samme mengde og formulenng som i det foregående) Serum samles før så vel som 1,4 og 9 uker etter denne andre boost-immumsenng

Eksempel 9:Binding av kaninserum lg til SKBR5 eller WM9 cellelinje (celle-

ELISA)

Forbehandlingen av mikrotiterplatene gjennomføres som beskrevet i eksempel 4 100 ul prøver av kaninserum i passende forfortynninger tilsettes til cellene og platene inkube-

res 11 time ved 37°C Binding av antistoff til cellene bestemmes ved å måle ekstinksjo-

nen ved 492 nm (referansemåling ved 620 nm)

Eksempel 10.Binding av rhesusapeserum lg eller immunrenset lg (AB3) til

SKBE5, CATO, SW948, SW2 og WM9 humane tumorcellelinjer (celle-ELISA)

Forbehandlingen av mikrotiterplatene gjennomføres som beskrevet i eksempel 4 100 ul prøver av rhesusapeserum eller immunrenset rhesusape lg (se også eksempel 12) og BR55-2 humanisert IgGl som kontroll i passende forfortynninger tilsettes til cellene og platene inkuberes 11 time ved 37°C Blandingen bearbeides som beskrevet i eksempel 4 Binding av antistoffet til cellene bestemmes ved å måle ekstinksjonen ved 492 nm

(referansemåling ved 620 nm)

Eksempel 11 Binding av rhesusapeserum lg eller immunrenset lg (AB3) til et SKBR5- eller WM9-tumorcelle-membranpreparat (ELISA)

Membraner av den Lewis Y antigenpositive SKBR5 humane brystcancercellelinje og

den Lewis Y antigennegative WM9 melanomcellehnje ble fremstilt som beskrevet av

D Thom et al, Biochem J 168, 187-194 (1977) 100 ul prøver av det respektive membranpreparat (10 ug/ml, fortynning i belegningsbuffer) tilsettes til brønnene i mikrotiter-

plater og inkuberes over natten ved +4°C Platene vaskes 4 ganger med vaskebuffer,

200 ul PBS def/5% FCS bisettes og platene inkuberes i 30 minutter ved 37°C Platene vaskes som beskrevet over 100 ul prøver av rhesusapeserum eller immunrenset rhesus-

ape lg (se også 2) i passende fortynninger i PBS def 12% FCS tilsettes og platene inku-

beres 160 minutter ved 37°C Ubundet antistoff vaskes ut som beskrevet i det foregå-

ende og 100 ul prøver av peroksidase-konjugert anbstoff (geit-anti-human-Ig/peroksi-

dase som reagenset fra Chemicon & Co, 1 10001 PBS/2% FCS) bisettes Etter inkuba-

sjon i 30 minutter ved 37°C vaskes platene to ganger med vaskebuffer og to ganger med fargebuffer

100 ul prøver av substratoppløsmng tilsettes og fargeutviklmg stanses etter 5 minutter med 50 ul prøver av 4N H2SO4 Optisk tetthet (OD) måles ved 492 nm (referansemåling ved 620 nm)

Eksempel 12' Immunaffinitetsrensing av serum lg fra rhesusaper immunisert med anti-id BR55-2 nr. E4 (AB3) ved anvendelse av anti-id BR55-2 nr. E4-Sepharose

12 1 Fremstillin<g> av anb- id BR55- 2 nr E4- Sepharose

9 g frysetørket aktivert CH-Sepharose 4B suspenderes 11 mM HC1, overføres bl et sinterglassfilter og vaskes med 2 1 1 mM HC1115 minutter Liganden (95 mg anb-id BR55-2 nr E4) oppløst 1 50 ml koblingsbuffer blandes med den vaskede gel 1 en lukket beholder og snus opp ned 11 time ved romtemperatur Gelen vaskes med koblingsbuffer og inkuberes 1 én time med 50 ml IM etanolamin for å blokkere eventuelle gjenværende aktive grupper Det affinitetsabsorberte vaskes deretter med tre sykluser med alterner-

ende pH Hver syklus består av en vasking ved pH 4 (0,1 M acetat, 0,5 M NaCl) etter-

fulgt av en vasking ved pH 8 (0,1 M Tris, 0,5 M NaCl)

12 2 Isolering av serum lg fra rhesusaper ( AB3) immunisert med anti-id BR55- 2 nr E4 Kromatografi gjennomføres ved 4°C Kolonne (Pharmacia-kolonne HR o/2, fylldimen-

sjon 5 x 25 mm) fylles med anti-id BR55-2 nr E4-Sepharose (volum 0,5 ml) Gelen vaskes med bindingsbuffer og eluenngsbuffer Utgangsmatenaler er 2 ml serum fra en rhesusape immunisert med anti-id BR55-2 nr E4 oppnådd 9 uker etter begynnende immumsennger For en annen forsøkssene ble 2 ml samlet serum fra en rhesusape immu-

nisert med anti-id BR55-2 nr E4 oppnådd 4 og 9 uker etter den andre boost anvendt Det respektive serum fortynnes 1 2 1 bindingsbuffer og påføres på kolonnen Etter elu-

enng av den gjennomgående fraksjon, desorberes bundet rhesusapeimmunglobulin med eluenngsbuffer og nøytraliseres umiddelbart etter desorpsjon med 1 M Tns/HCl buffer pH 7,5

Eksempel 13: Binding av serum lg eller immunrenset lg fra rhesusaper immuni-

sert med anti-id BR55-2 nr. E4 eller uspesifikk mus-IgGl til anti-id BR55-2 nr E4

(ELISA)

100 ul prøver av anti-id BR55-2 nr E4 (10 ug/ml, fortynnmg i belegningsbuffer) tilsettes til brønnene i en mikrotiterplate og inkuberes ved 37°C 160 minutter Platene vaskes 6 ganger med vaskebuffer, 200 ul PBS def 15% FCS tilsettes og man lnkuberer 130 mi-

nutter ved 37°C Platene vaskes som beskrevet i det foregående Apeserum eller immunrenset ape lg fortynnes i PBS def 12% FCS 100 ul prøver av disse prøvene tilsettes til brønnene i mikrotiterplatene og inkuberes 160 minutter ved 37°C Ubundet antistoff vaskes ut som beskrevet over og 100 ul prøver av peroksidase-konjugert antistoff (geit-anti-human lg/peroksidase som reagensen til Chemicon & Co, 1 10001 PBS/2% FCS) tilsettes Etter inkubasjon i 30 minutter ved 37°C vaskes platene 4 ganger med vaske-

buffer og to ganger med fargebuffer 100 fil prøver av substratløsning tilsettes og fargeutvikhngen stanses etter 5 minutter med 50 ul prøver av 4N H2SO4 Optisk tetthet (OD) måles ved 492 nm (referansemåling ved 620 nm)

Eksempel 14: Antistoffavhengig cellulaer cytotoksisitet (ADCC) ved anvendelse av human PBMC mot SKBR5 celler mediert ved immunrenset ape lg (AB3) eller BR55-2/munn IgG3

På dagen før analysen overføres SKBR5 cellene til nylaget medium A og holdes ved 37°C/5% C021 en cellekulturflaske

<51> Cr merking av targetcellene

Cellene samles fra dyrkingsflasken og inkuberes ved en konsentrasjon pd 5xl0<6> celler 1

800 ul medium A ved 37°C/5% C0211 time med 100 uCi Naz<5!>Cr04 Cellene vaskes deretter med medium A for å fjerne overskudd av51 Cr, resuspenderes 1 nylaget medium A, og deres konsentrasjon justeres til 2,5x10<5> celler/ml

Isolenng av PBMC

50 ml hepannisert friskt humant blod fortynnes med 60 ml fullstendig PBS innehol-

dende 0,1% glukose 15 ml prøver av denne oppløsning legges 1 et lag på toppen av 15

ml FicollPaque oppløsmng og rørene sentrifugeres ved 400 G130 til 60 minutter Plas-masupematantene fjernes, PBMC-lagene samles og fortynnes til 50 ml med fullstendig PBS + 0,10 glukose Etter sentnfugermg ved omtrent 80 G (10 minutter), resuspende-

nng av pelleten 125-30 ml fullstendig PBS 0,1% glukose, og ny sentnfugenng (80 g, 10 minutter), samles pelleten, suspenderes i medium A, cellene telles og suspensjonen fortynnes med medium A til omtrent 2xl0<6> til 9xl06 celler/ml 100 ul prøver pipetteres inn i hver brønn til en mikrotiterplate og effektorcellene inkuberes over natten ved 37°C/5% C02

ADCC

100 ul <sl>Cr-merkede targetceller tilsettes til de preinkuberte effektorceller i ønsket for-

hold mellom effektorceller og targetceller 50 ul immunrenset ape lg (AB3) eller BR55-2/munn IgG3 fortynnet til ønskede konsentrasjoner med PBS def tilsettes og platene inkuberes over natten (omtrent 18 timer) ved 37°C/5% CO2 Supernatantene høstes der-

etter med en Skatron-Harvesting Press og telles 1 en y-teller Dette gir verdien for den eksperimentelle frigivelse Total 51Cr-frigivelse bestemmes som over ved å erstatte PBMC med 100 ul 2% SDS, 50 mM Na2C03 og 10 mM EDTA og ved å erstatte anti-stoffoppløsmngen med 50 pl PBS def Spontan 51Cr-fhgivelse oppnås ved å erstatte PBMC med 100 ul medium A og antistoffoppløsmngen med 50 gl PBS def Etter telling beregnes resultatene som følger

Eksempel 15. Binding av rhesusapeserum, immunrenset rhesusape lg eller BR55-2/murin IgG3 til HIV-infiserte/ikke-infiserte PALL-celler (indirekte immunfluor-escens, IFA-anti-HIVl-kit Waldheim)

I et kommersielt tilgjengelig lmmunfluorescens-bestemmelseskit (Waldheim & Co, an-skaffet for bestemmelse av HTV seropositivitet) fikseres HIV-infiserte og lkke-infiserte PALL-celler (human T-cellehnje) på preparatglass Forsøksprosedyren er hovedsakelig basert på produsentens retningslinjer Etter inkubasjon med 1% BSA 130 minutter ved 37°C inkuberes preparatglassene med rhesusapeserum (konsentrert og fortynnet 1 101 PBS def) eller immunrenset rhesusape lg (AB3) fortynnet 1 normalt humant serum eller BR55-2/munn IgG3 11 time ved 37°C HIV-positivt humant serum (levert som en del av forsøkskittet) tjener som en positiv kontroll, normalt humant serum som negativ kontroll Ubundne determinanter av testprøvene vaskes ut tre ganger med PBS def og en

1 20 fortynning av anti-human-IgG-FrTC reagenset (del av testkittet) i PBS def inneholdende 2% FCS eller anu-munn-IgG-FITC (for deteksjon av munn Mab) tilsettes Etter inkubasjon i 30 minutter ved 37°C, vasking tre ganger med PBS def og lnneslutting av glassene, observeres immun fluorescensen i et fluorescensmikroskop og bedømmes

(0 = ingen fluorescens, 5 = maksimal fluorescens)

Eksempel 16: ELISA for bestemmelse av immunreaktiv BR552/murin IgG3 eller BR55-2/murin IgG2a i humant serum ved anvendelse av anti-id BR55-2 nr E4

100 ul prøver av anti-id BR55-2 nr E4 (10 ug/ml, fortynning i belegningsbuffer) tilsettes til brønnene i mikrotiterplater og inkuberes ved 37°C 160 mmutter

Platene vaskes 6 ganger med vaskebuffer, 200 ul PBS def /5% FCS tilsettes og inkuberes 130 minutter ved 37°C Platene vaskes som beskrevet i det foregående Humant serum inneholdende BR55-2/munn IgG3 eller BR55-2/munn IgG2a testes i passende fortynninger i BPS def 12% FCS 100 ul prøvemengder av disse prøver tilsettes til brøn-nene i mikrotiterplater og inkuberes 160 minutter ved 37°C Som standard anvendes BR552/munn IgG3 eller BR55-2&/munn IgG2a forfortynnet i normalt humant serum til 10 ug/ml Passende fortynninger i PBS def /2%FCS behandles som i det foregående Ubundet antistoff vaskes ut som beskrevet i det foregående og 100 ul prøvemengder peroksidase-konjugert antistoff (kanm-antt-mus IgG3/peroksidase eller kanin-anti-mus-IgG2a/peroksidase som Zymed reagensene, 1 10001 PBS/2% FCS) tilsettes Etter inkubasjon 130 minutter ved 37°C vaskes platene 4 ganger med vaskebuffer og to ganger med fargebuffer

100 ul substratløsning tilsettes og fargeutvikhngen stanses etter 5 minutter med 50 ul 4N H2S04 Optisk tetthet (OD) måles ved 492 nm (referansemåling ved 620 nm)

OD-verdiene for serumprøvene avleses på standardkurven og uttrykkes 1 ug/ml

Eksempel 17: ELISA for bestemmelse av immunreaktiv BR552/kimær human IgGl i humant serum ved anvendelse av anti-id BR55-2 nr. E4

Humant serum inneholdende BR55-2/kimær human IgGl testes som beskrevet 1 eksempel 16 ved anvendelse av peroksidase-konjugert antistoff (geit-anti-human IgG/peroksidase som reagensene til Chemicon & Co , 1 10001 PBS/2% FCS)

Eksempel 18' ELISA for bestemmelse av lmmunreaktivt BR552/kimær human

IgG3 i humant serum ved anvendelse av anti-id BR55-2 nr. E4

Humant serum inneholdende BR55-2/kimært humant IgG3 testes som beskrevet i

eksempel 17

Eksempel 19. Sann tid biospesifikk interaksjonsanalyse av BR55-2/kimær human

IgGl og BR55-2/humanisert IgGl med anti-id BR55-2 Mab'cr

Forsøkene ble gjennomført med et BIAcore™-system fra Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sverige Binding av BR55-2/kimær human IgGl eller BR55-2/humanisert

IgGl til de forskjellige munne IgGl anti-id BR55-2 Mab'er festet til lmmobihsert

RAM-IgGl (som reagenset fra Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Svenge) ble bestemt

ved anvendelse av sann tid biospesifikk interaksjonsanalyse

Strømmngsmengden til systemet ble satt til 5 ul/minutt En sensorchip ble aktivert med

en blanding av 0,201 mg NHS og 1,313 mg EDC oppløst i 35 ul destillert vann RAM-

IgGl oppløst 135 gl 10 mM natnumacetatbuffer pH 5,01 en konsentrasjon på 30 ug/ml

ble deretter reagert med den aktiverte sensoroverflate Gjenværende frie aktiverte seter ble blokkert med 35 ul 1 M etanolaminhydroklond/NaOH, pH 8,5

Analysen ble gjennomført i tre tnnn

1) De respektive anti-id BR55-2 Mab'er (E4, Cl 1, B3, B9, G6, G9) ble fortynnet med medium H til en sluttkonsentrasjon på 10 til 17 ug/ml For hver analyse ble anti-idiotypisk antistoff bundet til RAM-IgGl ved å føre 35 ul av denne oppløs-

ning over sensoroverflaten "Responsenhetene" som er proporsjonelle med mengden bundet anti-id BR55-2 Mab ble målt og lagret

2) 20 ul fortynninger av mus/human kimær IgGl og humanisert IgGl i medium H i konsentrasjon på 1 -100 ug/ml ble deretter injisert og fikk binde til festet anti-

id "Responsenhetene" som er proporsjonelle med mengden bundet Mab ble målt og lagret

3) Sensoroverflaten ble deretter regenerert for neste analyse med påfølgende injek-

sjon av 5 ul IM maursyre og 5 u 8M urea

Graden av binding ble bestemt ved å beregne forholdet mellom de maksimale responsenheter oppnådd med det andre antistoff (BR55-2/kimær human IgGl eller BR55-2/humanisert IgGl) og de maksimale responsenheter oppnådd med det første antistoff (re-

spektiv anti-idiotypisk Mab)

Eksempel 20: ELISA for bestemmelse av immunreaktiv BR552/humanisert IgGl i humant serum ved anvendelse av anti-id BR55-2 nr. E4.

Humant serum inneholdende BR55-2/humanisert IgGl testes som beskrevet i eksempel

17

Eksempel 21 ■ Konkurrering av binding av BR55-2/murin IgG3 til anti-id BR55-2

nr E4 ved BR55-2/kimær human IgGl eller BR552/kimer human IgG3.

100 fil prøve anti-id BR55-2 nr E4 (10 ug/ml, fortynmng i belegningsbuffer) tilsettes til brønnene i mikrotiterplater og inkuberes ved 37°C 160 minutter

Platene vaskes 6 ganger med vaskebuffer, 200 gl PBS def 15% FCS tilsettes og platene inkuberes 130 minutter ved 37°C Platene vaskes som beskrevet i det foregående Kimær human IgGl eller kimær human IgG3 fortynnes i PBS def /2o FCS (0,5 ug/ml til

3 ug/ml) Til hver fortynning tilsettes 0,05 ug/ml BR55-2/munn IgG3 100 ul prøve-mengder av disse blandinger tilsettes til brønnene i mikrotiterplatene og platene inku-

beres i 60 minutter ved 37°C Ubundet antistoff vaskes ut som beskrevet i det foregå-

ende og 100 ul prøvemengder av peroksidase-konjugert antistoff (geit-anti-human IgG/peroksidase som reagensene fra Chemicon Co 1 10001 PBS/2% FCS) tilsettes

Etter inkubasjon i 30 minutter ved 37°C vaskes platene 4 ganger med vaskebuffer og to ganger med fargebuffer

100 ul prøvemengder av substratløsning tilsettes og fargeutviklingen stanses etter 5 minutter med 50 ul prøvemengder av 4N H2S04 Optisk tetthet (OD) måles ved 492 nm

(referansemåling ved 620 nm)

Eksempel 22: Komplementavhengig cytotoksisitet (CDC) overfor SKBR5 cellelinje mediert ved BR55-2/murin IgG3-inhibering ved anti-id BR55-2 nr. E4

På dagen før analysen overføres SKBR5 celler bl nylaget medium A og holdes ved

37°C/5o C02 i en cellekulturflaske

51 CR merking av targetceller

Cellene samles fra dyrkingsflasken og inkuberes i en konsentrasjon på 5xl0<6> celler i

800 ul medium A ved 37°C/5% C0211 hme med 100 uCi Na2<51>Cr04 Cellene vaskes deretter med medium A for å fjerne overskuddet av 51 Cr, resuspenderes i nylaget medium A og konsentrasjonen av cellene justeres til 2,5xl0<5> celler/ml

CDC

100 ul prøvemengder av denne suspensjon av targetceller pipetteres inn i brønnene hl mikrotiterplater 50 ul prøvemengder av anti-id BR55-2 nr E4 fortynnet til ønskede konsentrasjoner i PBS def bisettes Deretter bisettes 100 ul prøvemengder av humant serum inneholdende 2 ug/ml BR55-2/IgG3 pr brønn og cellene inkuberes over natten ved 37°C/5% C02 Supernatantene høstes med en Skatron-Harvestmg-Press og telles i en y-teller Dette gir verdien for eksperimentell frigivelse

For å bestemme total51 Cr-rfigivelse behandles cellene som over idet humant serum er-

stattes med en løsning av 2% SDS, 50 mM Na2C03 og 10 mM EDTA og hvor anh-id BR55-2 nr E4 løsningen erstattes med 50 ul PBS def Verdien for spontan <5l>Cr-fhgi-

velse oppnås ved å erstatte humant serum med medium A og anb id BR55-2 nr E4 opp-løsning med 50 ul PBS def

Etter telling beregnes resultatet som følger

Eksempel 23: Immnnaffinitetsrensing av BR55-2/kimær human IgGl ved anvendelse av anti-id BR55-2 nr. E4-Sepharose

23 1 Fremstilling av anti- id BR55- 2 nr E4-Sepharose

9 g frysetørket aktivert CH-Sepharose 4B suspenderes 11 mM HC1, overføres til et sin-terglassfllter og vaskes med 2 1 1 mM HC1115 minutter Liganden (95 mg anti-id BR55-2 nr E4) oppløst i 50 ml koblingsbuffer blandes med den vaskede gel i en lukket beholder og vendes opp ned i en time ved romtemperatur Gelen vaskes med koblings-

buffer og inkuberes i én time med 50 ml 1 M etanolamin for å blokkere gjenværende aktive grupper Det affinitetsabsorberte vaskes deretter med tre sykluser med alternerende pH Hver syklus består av en vasking ved pH 4 (0,1 M acetat, 0,5 M NaCl) etter-

fulgt av en vasking ved pH 8 (0,1 M Tns, 0,5 M NaCl)

23 2 Isolering av BR55- 2/ kimær human IgGl

Kromatografi gjennomføres ved 4°C Kolonnen (BIO REX MP kolonne diameter 1,5

cm) fylles med anti-id BR55-2 nr E4-Sepharose (volum 35 ml) Gelen vaskes med bindingsbuffer og eluenngsbuffer Utgangsmatenalet er 100 1 BR55-2/kimær human IgGl kondisjonert medium Etter konsentrenng til 5 1 ved anvendelse av et Amicon

DC2 konsentrasjonssystem utstyrt med en hulfiberpatron P 10, ble konsentratet påført på kolonnen Etter eluenng av den gjennomgående fraksjon blir bundet BR55-2/kimær human IgGl desorbert med eluenngsbuffer og nøytralisert umiddelbart etter desorpsjon med 1 M Tns/HCl buffer pH 7,5

23 3 Konsentrenn<g> av BR55- 2/ kimær human IgGl

Konsentrenng av den eluerte antistoffløsning gjennomføres i en omrørt Amicon ultrafiltrenngscelle ved anvendelse a^ en PM 10 Diaflo membran Forkasting for IgG er mer enn 98%, idet sluttkonsentrasjonen av IgG strekker seg til 3,36 mg/ml 23 4 Karaktensenng av renhet BR55- 2/ kimær human IgGl

23 4 1 Ionebvtterkromato<g>rafi på mono- 0

23 4 2 Høyytelseskrornatografi med størrelsesekskludenng

23 4 3 SDS- PAGE

Forsøk gjennomføres under reduserende betingelser i henhold til metoden etter Laemmh ved anvendelse av 10% akrylamidgeler (resultatene er vist i fig 10)

Utangsmatenal

Munne monoklonale antistoffer BR55-2 er tilgjengelige fra f eks henholdsvis hybndomer BR55 2 (BR55-2/IgG3) og, BR55 2S2a (BR55-2/IgG2a)

Disse hybndomer ble oppnnnehg deponert henholdsvis 17 februar 1987 og 10 mars 19871 the Amencan Type Culture Collection, Rockville, MD 20852, USA, i henhold til Budapestkonvensjonen og under henholdsvis deponenngsnummer ATCC HB 9324 og ATCC HB 9347

Claims (9)

1 Antistoffer, karakterisert ved at de er monoklonale munne lnternt-billeddannende anti-idiotypiske antistoffer (Ab2) mot monoklonale antistoffer BR55-2 (Abl)

2 Fremgangsmåte for fremstilling av anti-idiotypiske antistoffer som angitt i krav 1, karakterisert ved at den omfatter å immunisere mus med BR55-2/munnt IgG3-F(ab')2-KLH-konjugat, fusjonere de munne miltceller med den munne myelomcellelinje SP 2/0, selektere de dyrkede hybndomceller som produserer IgG med en inhibenngskapasitet på mer enn 95% inhibenng av binding av BR55-2 munn IgG2a hl SKBR5 cellelinjen, rense og isolere det anti-idiotypiske antistoff

3 Anvendelse av anti-idiotypiske antistoffer som angitt i krav 1 for fremstilling av et terapeutisk preparat for profylaktisk og/eller terapeutisk immunisenng mot HIV-infeksjoner

4 Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det som aktiv bestanddel omfatter et anti-idiotypisk antistoff som angitt i krav 1 sammen med en farmasøytisk tålbar adjuvans, bærer eller fortynningsmiddel for anvendelse i profylaktisk og/eller terapeutisk immunisenng mot HIV infeksjoner

5 Anvendelse av monoklonale anti-idiotypiske antistoffer som angitt i krav 1 for fremstilling av et terapeutisk preparat for immunisenng mot cancer av epitel oppnnnelse og mot "small cell" lungecancer

6 Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det omfatter et antudiotypisk monoklonalt antistoff som angitt i krav 1 sammen med en farmasøytisk tålbar adjuvans, bærer eller fortynningsmiddel for immunisenng mot cancer av epitel oppnnnelse og mot "small cell" lungecancer

7 Anvendelse av anti-idiotypiske antistoffer som angitt i krav 1, for den kvantitative bestemmelse av monoklonale antistoffer, deres derivater eller fragmenter med BR55-2 bindingsspesifisitet

8 Anvendelse av anti-idiotypiske antistoffer som angitt i krav 1 for den kvantitative bestemmelse av monoklonal mus/humane kimærer av BR55-2 og fullstendig humaniserte vananter av BR55-2

9 Anvendelse av anti-idiotypiske antistoffer som angitt i krav 1 for en ett-tnnns lmmunrensing av vananter av BR55-2