DE69324584T2 - Antiidiotypische monoklonale antikörper gegen den lewis y-spezifischen monoklonalen antikörper br55-2 und deren verwendungen - Google Patents
Antiidiotypische monoklonale antikörper gegen den lewis y-spezifischen monoklonalen antikörper br55-2 und deren verwendungenInfo
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Description
- Ein Ansatz zur Beeinflussung des Immunsystems basiert auf idiotypischen Wechselwirkungen. Die einzigartigen antigenen Determinanten in und um die Antigenkombinationsstelle eines Ig Moleküls, die einen Antikörper vom anderen unterscheiden, werden als Idiotypen bezeichnet. Die Gesamtheit aller Idiotypen, die auf dem variablen Teil eines gegebenen Antikörpers vorkommt, wird als dessen Idiotyp (id) bezeichnet. Die molekulare Struktur eines Idiotyps wurde sowohl auf den komplementaritätsbestimmenden Regionen als auch den Frameworkregionen der variablen Domäne lokalisiert und kommt im allgemeinen aber nicht immer durch sowohl die schweren als auch die leichten Ketten in ihrer spezifischen Anordnung zustande.
- Idiotypen sind serologisch definierte Einheiten, da die Injektion eines Antikörpers (oft als Ab1 bezeichnet) in einen syngenen, allogenen oder xenogenen Empfänger die Bildung von antiidiotypischen Antikörpern induziert (oft als Ab2 bezeichnet). Aufgrund der Annahme, daß Idiotyp / Antiidiotyp-Wechselwirkungen existieren, wird von Niels Jerne (Ann. Immunol. 125C, 373, 1974) physiologisch eine Rezeptor-basierte Regulation des Immunsystems postuliert. Seine Netzwerktheorie sieht das Immunsystem als eine Sammlung an Ig Molekülen und Rezeptoren auf T-Lymphozyten, wobei beide zu einer Erkennung einer antigenen Determinante (Epitop) durch die Kombinationsstelle (Paratop) fähig sind und beide durch andere Antikörper oder Zelloberflächenrezeptoren des Systems durch die Idiotypen erkannt werden können, die gezeigt werden. Viele Untersuchungen haben tatsächlich gezeigt, daß idiotypische und antiidiotypische Rezeptoren auf der Oberfläche von sowohl B- als auch T-Lymphozyten wie auch auf sekretierten Antikörpern vorkommen.
- Wenn die Bindung zwischen Ab1 und Ab2 durch das Antigen gehemmt wird, gegen das Ab1 gerichtet ist, wird der Idiotyp als bindungsstellenspezifisch betrachtet, da er eine Stelle auf der variablen Domäne des Antikörpers einbezieht, die bei der Antigenerkennung beteiligt ist. Die Idiotypen, die konformationsmäßig ein antigenes Epitop nachahmen, werden als internes Abbild dieses Epitops bezeichnet. Da sowohl Ab2 als auch ein Antigen an den relevanten Ab1 bindet, können sie eine ähnliche dreidimensionale Konformation teilen, die das interne Abbild des gegebenen Antigens darstellt. Antiidiotypische, ein internes Abbild darstellende Antikörper können im Prinzip als Ersatz des Antigens betrachtet werden, von dem sie durch das idiotypische Netzwerk stammen. Daher können diese Ersatzantigene in aktiven Immunisierungsprotokollen verwendet werden. Beispielsweise bieten sie Vorteile, falls das ursprüngliche Antigen nicht ausreichend immunogen ist, um eine signifikante Immunreaktion zu induzieren. Daher können geeignete ein internes Abbild darstellende antiidiotypische Antikörper, die ein nicht immunogenes Kohlenhydratantigen nachahmen, für bestimmte Impfansätze besonders brauchbar sein. Im folgenden werden diese Betrachtungen genauer ausgeführt.
- Als Ergebnis der Einführung der Hybridomtechnik, wurden monoklonale Antikörper (mAk), meist aus der Maus, gegen viele Arten von humanem Krebs hergestellt. Fast alle dieser durch xenogene mAk definierte Marker sind nicht strikt tumorspezifisch, sondern sind Differenzierungsantigene, die Tumoren und bestimmte normale und/oder fetale Gewebe gemeinsam haben. Daher werden sie am besten als tumorassoziierte Antigene (TAA) bezeichnet. Ob humane Tumormarker, die durch xenogene mAk detektiert werden, zum Hervorrufen einer Antitumorreaktion bei Krebspatienten fähig sind und ob solche Antigene tatsächlich mit der Reaktion auf autologe Tumoren in Krebspatienten zusammenhängen, hängt von der Art des jeweiligen TAA ab und ist immer noch nicht vollkommen verstanden. TAAs, die entweder natürlich im syngenen Wirt immunogen sind oder immunogen ge macht werden können, können potentiell zur Induktion einer Antitumorimmunität für therapeutischen und möglicherweise prophylaktischen Nutzen verwendet werden.
- Tumorassoziierte Antigene sind oft ein Teil des "Selbst" und rufen eine sehr schwache Immunantwort in Krebspatienten hervor. Im Gegensatz dazu werden ein internes Abbild darstellende antiidiotypische Antikörper, die dreidimensionale Formen exprimieren, welche den strukturellen Epitopen des jeweiligen TAA ähneln, im tumortragenden Wirt als fremde Moleküle erkannt. Daher kann die Immunreaktion durch therapeutische oder sogar prophylaktische Immunisierung mit geeigneten Anti-Id-mAks eine Antitumorimmunität verursachen.
- Die therapeutische Immunisierung gegen Krebs mit anti-id mAks kann besonders in früheren Stadien der Erkrankung erfolgreich sein: Bei der Operation eines primären Tumors haben sich häufig bereits einzelne bösartige Tumorzellen in die verschiedenen Organe des Patienten verteilt. Diese Mikrometastasezellen sind als Ursache für das spätere Wachstum von Metastasen bekannt, das oft Jahre nach der Diagnose und operativen Entfernung des gesamten klinisch bestätigten Tumorgewebes auftritt. Bisher sind in fast allen Fällen Krebsmetastasen epithelialen Ursprungs unheilbar. Daher besteht für eine effektive Behandlung von "minimal verbleibendem Krebs", beispielsweise der Zerstörung von bösartigen Mikrometastasezellen, um das Wachstum von Makrometastasen zu verhindern, ein dringender medizinischer Bedarf. Bei diesem Stadium der Erkrankung (unterstützende Einnistung) sind herkömmliche chemotherapeutische Ansätze relativ erfolglos. Jedoch können durch die Induktion einer spezifischen Antitumorimmunität zum Zeitpunkt minimal verbleibender Erkrankung durch die Immunisierung mit geeigneten ein internes Abbild darstellenden anti-id mAks Mikrometastasezellen selektiv durch das Immunsystem eliminiert werden, was zu einer verlängerten rückfallfreien Überlebenszeit führt.
- Monoklonale Antikörper mit einer Spezifität von BR55-2 (beispielsweise beschrieben in Wistar EP 0 285 059 A, M. Blaszcyk-Thurin et al., J. Biol. Chem. 2G2 (1987) 372-379 oder Z. Steplewski et al., Hybridoma 9 (1990) 201-210) definieren das Lewis Y6 Antigen, eine Kohlenhydratdeterminante, die selektiv auf einer Mehrzahl an humanen soliden Tumoren exprimiert wird. Aufgrund ihrer Eigenschaften können BR55-2 Antikörper zur passiven Immuntherapie von ursprünglich epithelialem Krebs verwendet werden.
- Die tumorassoziierte Lewis Y Oligosacchariddeterminante, die auch während bestimmten Stadien der Embryonalentwicklung exprimiert wird, ist an sich fast nicht immunogen. Monoklonale Antiidiotypantikörper (Ab2) gegen BR55-2 (Ab1) mit den Eigenschaften eines internen Abbilds durch Ähnlichkeit mit strukturellen Epitopen auf dem Lewis Y Antigen sind jedoch zur Induktion einer schützenden Antitumorimmunität brauchbar, insbesondere in früheren Stadien der Erkrankung.
- Zusätzlich zu seiner Expression auf Krebs epithelialen Ursprungs ist das Lewis Y Kohlenhydratantigen auch bei der Pathogenese der Infektion mit humanem Immundefizienzvirus (HIV) beteiligt. Das erworbene Immundefizienzsyndrom (ASS) wird als getrennte Erkrankung betrachtet, deren Ätiologie in Zusammenhang mit der Infektion eines lymphotrophen Retrovirus (HIV) identifiziert wurde. Die Erkrankung ist durch eine Störung charakterisiert, die mit einer gestörten zellvermittelten Immunität und einer absoluten Lymphopenie, insbesondere verringerten Helfer T-Lymphozyten (CD4), zusammenhängt. AIDS kann durch ein Präsyndrom angekündigt werden, das gewöhnlich durch einen Komplex an festgelegten klinischen Merkmalen und einer Helfer T-Lymphopenie manifestiert wird. Das Präsyndrom wird als mit AIDS-zusammenhängender Komplex (ARC) bezeichnet.
- HIV gehört zu einer Virusgruppe, die während der letzten zwei Jahrzehnte intensiv untersucht wurde. Wenn ein Retrovirus in eine Mensch- oder Tierzelle eindringt, wird die RNA in DNA umgewandelt und in die Wirtszelle integriert, die dann getäuscht wird und die Virusgene als eigen behandelt. HIV kann in diesen Zellen für Jahre latent bleiben, wobei es vor den Angriffen des Immunsystems des Körpers geschützt ist und jedesmal blind kopiert wird, wenn die Wirtszelle sich teilt. Nur im Fall einer Auslösung der schnellen viralen Replikation durch die Aktivierung der infizierten Zellen töten die gebildeten Viruspartikel diese Zellen und kommen in den Blutstrom.
- Aufgrund der bestimmten Merkmale von HIV ist eine Heilung durch Eliminierung sowohl des Virus als auch der proviralen genetischen Information, die bereits in das humane Genom von bereits infizierten Patienten transkribiert ist, schwer zu erreichen. Daher konzentrieren sich die meisten therapeutischen Versuche auf Mittel, die die Entwicklung dieser Erkrankung verlangsamen, indem sie mit essentiellen Schritten für die virale Replikation wechselwirken.
- Die Prävention einer HIV Infektion und das therapeutische Eingreifen bei bereits infizierten Patienten mittels eines sicheren und wirksamen Impfstoffs ist ein Hauptziel. Es werden mehrere Impfstoffansätze in präklinischen oder frühen klinischen Phasen getestet. Sie basieren hauptsächlich auf viralen Strukturen als Antigen, insbesondere auf dem Haupthüllglykoprotein gp120.
- Die natürlich auftretende Immunreaktion gegen das Virus besteht aus Antikörpern gegen alle viralen Proteine, wie auch aus der Aktivierung der zellulären Immunität. Jedoch scheint diese Reaktion des Wirts gegen die HIV Infektion den Fortschritt dieser Erkrankung nach einer asymptomatischen Phase schließlich nicht aufzuhalten, die häufig Jahre dauert. Daher bleiben Impfansätze, die auf denselben Antigenen basieren, die die natürlich vorkommende und schließlich nicht schützende Immunreaktion hervorrufen, zweifelhaft. Ein Hauptproblem ist die extreme Heterogenität von HIV, durch die das Virus dem Angriff der typspezifischen Neutralisierung der anti-gp 120 Antikörper entkommt.
- Der wirksame Schutz vor HIV durch die Impfung erfordert zwei Defensivstrategien: Eine gegen das freie Virus, das im Blutstrom verweilt, und eine weitere gegen Zellen, die bereits infiziert sind. Es ist bekannt, daß HIV infizierte Zellen in vitro und in vivo auf ihrer Oberfläche ein verändertes Glykosylierungsmuster exprimieren, nämlich die Lewis Y Kohlenhydratdetenninante. Da dieses Antigen normalerweise nur während bestimmter fetaler Entwicklungsstadien auftritt und auch mit einer Vielzahl an Malignitäten assoziiert ist, wobei die Expression auf HIV infizierten Zellen ihren veränderten Differenzierungsstatus widerspiegeln kann, der durch die retrovirale Transformation induziert wird. Daher zeigt dieser Phänotyp eine einzigartige zelluläre Wirtsreaktion gegen die Transfektion des humanen Genoms durch HIV.
- Das HIV Hüllglykoprotein wird durch den Glykosylierungsapparat der infizierten Zellen gebildet. Daher werden Veränderungen im Glykosylierungsmuster von infizierten Zellen, die HIV bilden, auch auf freigesetzten Viruspartikeln gefunden. Daher besteht das in solchen Zellen gebildete Hüllprotein von HIV auch aus Lewis Y Kohlenhydratdeterminanten. Daher stellt das Lewis Y Oligosaccharid eine bestimmte Wirtsreaktion dar, die sowohl auf HIV infizierten Zellen und HIV Partikeln exprimiert wird.
- Basierend auf den oben beschriebenen Betrachtungen erfüllt die Lewis Y Struktur wichtige Erfordernisse für die Verwendung in einer Impfstrategie gegen sowohl freies Virus als auch HIV infizierte Zellen. Darüberhinaus ist das Lewis Y Antigen unabhängig vom HIV Stamm und nicht durch die genetische Variabilität dieses Virus beeinflußt, da es eine allgemeine Reaktion gegen HIV ist. Unglücklicherweise ist Lewis Y aufgrund der Kohlenhydratstruktur und der "Selbst" Eigenschaften als fetales Differenzierungsantigen selbst fast nicht immunogen. Es wurde keine Immunreaktion gegen dieses Antigen beim Menschen detektiert. Jedoch können monoklonale Antiidiotypantikörper (Ab2) gegen BR55-2 (Ab1) mit Eigenschaften eines internen Abbilds, durch Ähnlichkeit mit den strukturellen Epitopen auf dem Lewis Y Antigen zur Induktion einer prophylaktischen und therapeutischen Immunität gegen sowohl freies HIV als auch HIV infizierte Zellen unabhängig vom Virusstamm brauchbar sein.
- Zusätzlich zu ihrer prophylaktischen und therapeutischen Verwendung als einzigartige Impfstoffe sind monoklonale, ein internes Abbild darstellende anti-id Antikörper hochspezifsche Reagenzien für den Idiotyp des Antikörpers, durch den sie erzeugt wurden. Sie erkennen fast ausschließlich die Bindungsregion von Ab1. Dieses Erkennungsmuster hängt von anderen Determinanten des Ab1 ab. Mit anderen Worten definieren geeignete anti-id mAks selektiv jedes Molekül, das aus dem einzigartigen Idiotyp von Ab1 in seiner korrekten dreidimensionalen Form besteht. Daher binden diese anti-id mAks mit einer vergleichbaren Affinität an F(ab')&sub2;-, Fab- und Fv- Fragmente von Ab1 wie auch an dessen Switchvarianten (Switchvarianten bestehen aus verschiedenen konstanten Regionen, beispielsweise IgG2a, IgG2b, IgG1 der Maus, aber weisen denselben Idiotyp auf). Zusätzlich umfaßt dieses hochspezifische Erkennungsmuster der ein internes Abbild darstellenden anti-id mAks auch Varianten eines Ausgangs-Maus-mAk, der durch rekombinante DNA Technologie erhalten wurde.
- Um die möglichen Probleme der wiederholten Verwendung von Mausantikörpern für eine passive Immuntherapie bei Menschen zu überwinden, können chimäre Maus/Mensch mAks durch die Kombination der variablen Domänen des Ausgangs-Maus-mAk der Wahl mit humanen konstanten Regionen erzeugt werden. Zur. Detektion solcher chimären Maus/Mensch mAks in humanem Serum sind hochspezifische Reagenzien erforderlich, da diese chimären mAks konstante Regionen tragen, die zu denen von natürlich vorkommenden humanen Immunglobulinen identisch sind. Ein internes Abbild darstellende anti-id mAks, die gegen den Ausgangs-Maus- Ab1 erzeugt wurden, erkennen auch die chimären Antikörper, die hiervon abstammen. Daher sind solche antiidiotypischen mAks brauchbare Reagenzien für die spezifische und empfindliche quantitative Bestimmung beispielsweise von Serumkonzentrationen der chimären Maus/Mensch mAks in Gegenwart eines großen Überschusses an normalen humanen Immunglobulinen.
- Um die Eigenschaften von mAks mit therapeutisch interessanten Eigenschaften zur Verwendung in der passiven Immuntherapie weiter zu verbessern, können "vollkommen humanisierte" Antikörper durch die rekombinante DNA Technik hergestellt werden, worin nur die minimal notwendigen Teile des Ausgangs-Mausantikörpers, nämlich die komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDRs), mit Framework der humanen variablen Region und humanen konstanten Regionen zusammengebracht werden. Zum Entwurf und zur Konstrukticih dieser "vollkommen humanisierten" mAks wird die Sequenzhomologie und die molekulare Modellierung verwendet, um eine Kombination von Sequenzelementen der Maus und des Menschen auszuwählen, die die Immunogenität weiter verringert, während die Bindungseigenschaften erhalten bleiben. Bestimmte ein internes Abbild darstellende anti- id mAks, die gegen den Idiotyp des Ausgangs-Maus-Ab1 erzeugt wurden, können immer noch an die CDRtransplantierten humanisierten Varianten binden, falls die folgenden Erfordernisse erfüllt sind:
- a) Die dreidimensionale Struktur der Kombinationsregion der humanisierten Variante ist zu der des Ausgangs- Maus-Antikörpers sehr ähnlich.
- b) Der bestimmte anti-id Antikörper erkennt exakt die dreidimensionale Struktur der Kombinationsregionen ("Antikörper mit echtem internem Abbild")
- Daher sind antiidiotypische mAks, die die oben erwähnte Eigenschaft aufweisen, besonders brauchbare Reagenzien für die spezifische und empfindliche quantitative Bestimmung beispielsweise von Serumkonzentrationen vollkommen humanisierter (CDR-transplantierter) mAks in Gegenwart eines großen Überschusses an normalen humanen Immunglobulinen.
- Die vorliegende Erfindung betrifft die Erzeugung, Herstellung und Charakterisierung von monoklonalen ein internes Abbild darstellenden antiidiotypischen Antikörpern der Maus (Ab2) gegen die monoklonalen Antikörper BR55-2 (Ab1). Ein weiterer Teil der Erfindung ist die Verwendung dieser antiidiotypischen mAks für eine aktive therapeutische und prophylaktische Immunisierung gegen Krebs epithelialen Ursprungs und kleinzelligem Lungenkrebs, wie auch gegen Erkrankungen, die durch eine HIV-Infektion verursacht werden. Darüberhinaus ist die Verwendung dieser antiidiotypischen mAks zur selektiven und quantitativen Bestimmung von Antikörpern oder ihren Fragmenten und Derivaten mit einer Spezifität von BR55-2, einschließlich chimerisierter und vollkommen humanisierter Varianten (wie dies in WO 92/03165 beschrieben ist), wie auch ein allgemein anwendbares Verfahren zur selektiven Immunaffinitätsreinigung von Molekülen mit der Spezifität von BR55-2 auch ein Teil der Erfindung.
- Bei einem Versuch zur Minimierung der unerwünschten Antiidiotypimmunreaktionen wird das F(ab')&sub2;- Fragment von BR55-2, ein Maus-IgG3, zur Immunisierung ausgewählt. Für die erfolgreiche Erzeugung von anti- id Maus-mAks gegen den Idiotyp des Maus-mAk BR55-2 ist es wichtig, die Immunogenität zu maximieren, um eine geeignete Immunreaktion im syngenen Wirt zu erzeugen. Daher wird das F(ab')&sub2;-Fragment, dem der Fc-Teil fehlt (Spaltung und Reinigung sind in EP 0 528 767 A beschrieben) an Keyhole Limpet Hämocyanin (KLH) als immunogenen Träger mittels des heterobifunktionellen Linkers N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat (= SPDP) gemäß beschriebener Verfahren gekuppelt (J. Carlsson et al., Biochem. J. 173, 723, 1978).
- Balb/c Mäuse werden mit diesem BR55-2/Maus-IgG3-F(ab')&sub2;-KLH-Konjugat mittels koplettem Freundschem Adjuvans auf der Grundlage eines typischen Protokolls zur Erzeugung von Maus-mAks immunisiert. Nach wiederholten Immunisierungen werden die Milzzellen der Maus mit der Mausmyelomzellinie SP2/O fusioniert (experimentelle Details siehe Beispiel 1).
- Zur geeigneten Selektion der kultivierten Hybridomzellen wird eine Reihe an Tests ihrer Überstände durchgeführt. Die Auswahl basiert auf folgenden Kriterien:
- a) Sekretionsrate der Hybridome durch Bestimmung der Konzentration an Maus-IgG in den Überständen (experimentelle Details siehe Beispiel 2). Zellen, die große Mengen an Maus-IgG bilden, werden zu Einzelzellkulturen subkloniert.
- b) Bindung von ausgwählten Überständen an das F(ab')&sub2;-Fragment des BR55-2/Maus-IgG3 (experimentelle Details siehe Beispiel 3).
- c) Hemmung der Bindung des BR55-2/Maus-IgG2a an Lewis Y Antigen positive humane SKBR5 Brustkrebszellen durch ausgewählte Überstände (experimentelle Details siehe Beispiel 4).
- Der letztere Test ist so entworfen, daß er die internen Abbildeigenschaften der Ab2 anzeigt. Die Mausswitchvariante IgG2a von BR55-2 wird zur Bindung verwendet, um die Detektion von Ab2 zu minimieren, die die verbleibenden konstanten Regionen des zur Immunisieung verwendeten F(ab')&sub2;-Fragments von BR55-2/Maus- IgG3 erkennen. Dieser Test wird auf eine quantitative Weise basierend auf der in Test a) (Beispiel 2) bestimmten IgG Konzentration durchgeführt. Darüberhinaus wird ein Überschuß des unspezifischen Maus-IgG zu diesem Hemmexperiment zugegeben, um jede Detektion der Ab2 zu vermeiden, die nicht für den Idiotyp von BR55-2 spezifisch sind. Es werden Hybridome ausgewählt, die IgG mit einer Hemmkapazität von mehr als 95% bilden (Hemmung der Bindung des BR55-2/Maus-IgG2a an die SKBR5 Zellinie).
- Mittels der oben erwähnten Testverfahren werden schließlich sechs unterschiedliche Hybridome ausgewählt und vermehrt (E4, C11, B3, B9, G6, G9). Alle sechs Hybridome bilden Maus-IgG1, wie dies durch einen Subtyp-ELISA mittels Kaninchen-anti-Maus-IgG1/Peroxidase detektiert wird (wie die Reagenzien von Zymed). Alle sechs Hybridome werden in Rollflaschen (37ºC, 5% CQ in Medium G, Mediumswechsel alle 3 bis 4 Tage) kultiviert und die Überstände werden für eine anschließende Reinigung gewonnen.
- Jeder Überstand, der den jeweiligen anti-id BR55-2 mAk enthält, wird mittels Immunaffinitätschromatographie gereinigt. Im allgemeinen basiert die Affnitätschromatographie auf der Wechselwirkung zwischen einem immobilisierten Liganden und der Substanz von Interesse. Im Fall der antiidiotypischen Antikörper BR55-2 ist der hochspezifische Ligand für die Affinitätssäule mAk BR55-2/Maus-IgG2a, der an die antiidiotypischen mAks der Wahl bindet (experimentelle Details siehe Beispiel 5).
- Der Reinheitsgrad der isolierten anti-id BR55-2 mAks (E4, C11, B3, B9, G6, G9) wird durch analytische FPLC Ionenaustauschchromatographie, Größenausschlußchromatographie, SDS-PAGE und isoelektrische Fokussierung getestet. Die Reinheit aller sechs anti-id BR55-2 mAks beträgt > 95% (experimentelle Details siehe Beispiel 6, SDS-PAGE und isoelektrische Fokussierung sind in den Fig. 1 und 2 gezeigt).
- Die gereinigten anti-id mAks werden quantitativ durch die Bestimmung ihrer Kapazität zur Bindungshemmung des BR55-2/Maus-IgG3 an die Lewis Y Antigen positive SKBR5 Zellinie charakterisiert. Alle anti-id mAks hemmen die Bindung von Ab1 an dessen Antigen basierend auf einer 1 : 1 Stöchiometrie (experimentelle Details siehe Beispiel 7, repräsentative Ergebnisse sind in Fig. 3 gezeigt).
- Ein entscheidender Nachweis der Eigenschaften als internes Abbild der oben beschriebenen anti-id BR55- 2 mAks und ihre Verwendung als Ersatztumorantigen basiert auf ihrer Fähigkeit, eine Ab3 Reaktion gegen das tumorassoziierte Antigen in verschiedenen Arten zu erzeugen. Gemäß der Netzwerktheorie von N. Jerne weisen Antikörper (Ab3), die durch eine Immunisierung mit den ein internes Abbild darstellenden anti-id mAks (Ab2) induziert wurden, eine Bindungsspezifität auf, die ähnlich zu der von Ab1 ist. Daher sollte die durch die Immunisierung mit den anti-id BR55-2 mAks hervorgerufene Immunisierung für Lewis Y Antigen positive Tumorzellen spezifisch sein. Als Konsequenz kann eine schützende Antitumorimmunität durch die Immunisierung mit anti-id BR55-2 mAks induziert werden.
- Zur Untersuchung der Eigenschaften einer Ab3 Reaktion werden Kaninchen wie auch Rhesusaffen mit einem anti-id BR55-2 Nr. E4 und Aluminiumhydroxid als Träger und Adjuvans immunisiert. Dieses milde Adjuvans wird häufig in verschiedenen Impfstoffen für den Gebrauch am Menschen verwendet. Als Negativkontrolle werden die Tiere auch mit derselben Menge eines unspezifischen Maus-IgG1 immunisiert. Nach vier Immunisierungen über 5 Wochen werden die Seren in der Woche 9 gewonnen (experimentelle Details siehe Beispiel 8). Die Bindung des Serum Ig an die Lewis Y Antigen positive SKBR5 Brustkrebszellinie und die Lewis Y Antigen negative WM9 Melanomzellinie wird bestimmt (experimentelle Details siehe Beispiele 9 und 10).
- Anti-id BR55-2 Nr. E4 löst eine humorale Immunreaktion mit hohem Titer sowohl in Kaninchen als auch in Rhesusaffen aus. Das Serum-Ig von Tieren, die mit anti-id BR55-2 Nr. E4 immunisiert wurden, bindet selektiv an die Lewis Y Antigen positive SKBR5 Zellinie, aber nicht an die Lewis Y Antigen negative WM9 Zellinie. Im Gegensatz dazu wird durch die Immunisierung mit unspezifischem Maus-IgG1 fast kein Tumorzellen-bindendes Serum Ig detektiert. Diese Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. In den Fig. 4 und 5 sind repräsentative Ig-Bindungskurven gezeigt, die mit Prä- und Immunseren von Kaninchen und Rhesusaffen in einem Zell- ELISA (SKBR5 Zellen) erhalten werden. Die Bindung des Serum-Ig von Tieren, die mit einem anti-id BR55-2 Nr. E4 immunisiert wurden an SKBR5 Zellen kann immer noch in einer Serumverdünnung von 1 : 10 000 detektiert werden.
- Zwei Jahre nach dem anfänglichen Immunisierungsverlauf erhalten die entsprechenden Rhesusaffen eine erste einzelne Boosterinjektion von anti-id BR55-2 Nr. E4 oder unspezifischem Maus-IgG1. Auf dieselbe Weise wird eine zweite Einzelboosterinjektion drei Jahre nach der anfänglichen Immunisierung gegeben (entspricht einem Jahr nach der ersten Boosterinjektion, experimentelle Details siehe Beispiel 8). Die Seren werden vor und nach diesen Boosterinjektionen gewonnen.
- Die gesamte humorale Immunreaktion der mit anti-id BR55-2 Nr. E4 geimpften Rhesusaffen wird mittels eines ELISA bestimmt, der auf anti-id BR55-2 Nr. E4 besteht, mit dem die Mikrotiterplatten beschichtet sind (experimentelle Details siehe Beispiel 13). In den Seren aller Rhesusaffen findet sich eine Immunreaktion mit sehr hohem Titer nach der ersten Immunsierungsrunde, wie auch nach den ersten und zweiten Boosterinjektionen. Die Ig Bindung an anti-id BR55-2 Nr. E4 wird immer noch bei Serumverdünnungen von 1 : 50 000 detektiert. Ein etwas geringerer aber immer noch sehr signifikanter Titer findet sich in den Seren vor den Boosterinjektionen. Diese Ergebnisse sind in den Fig. 6-8 gezeigt.
- Die humorale Immunreaktion der mit unspezifischem Maus-IgG1 geimpften Rhesusaffen wird ebenfalls mittels desselben oben erwähnten ELISA bestimmt (experimentelle Details siehe Beispiel 13). Wie erwartet sind die Serumtiter der Ig Bindung an anti-id BR55-2 Nr. E4 niedriger, als die Titer, die in den Seren der Affen gefunden werden, die mit anti-id BR55-2 Nr. E4 geimpft wurden. Während die Immunreaktion der mit unspezifischem Maus-IgG1 immunisierten Rhesusaffen mit den konstanten Regionen von anti-id BR55-2 Nr. E4 kreuzreagieren, fehlt offensichtlich der Teil der Immunreaktion, der gegen die hypervariablen Regionen von anti-id gerichtet ist. Die Ergebnisse sind in den Fig. 9-10 gezeigt.
- Zum Beweis für die Tumorspezifität der Immunreaktion nach der anfänglichen Immunisierungsrunde wie auch vor und nach den Boosterimmunisierungen wird die Bindung des Affenserum Ig an verschiedene Lewis Y Antigen positive Krebszellinien (Brust-, Magen-, Darm- und kleinzelliger Lungenkrebs) wie auch an eine Lewis Y negative Melanomzellinie bestimmt (experimentelle Details siehe Beispiel 10). Bei Rhesusaffen, die mit anti-id BR55-2 Nr. E4 behandelt wurden, kann zwei Jahre nach der ersten Immunisierung und vor der ersten Boosterimmunisierung immer noch Serum-Ig detektiert werden, das an Lewis Y Antigen positive Tumorzellen bindet. Nach der ersten Boosterinjektion werden extrem erhöhte Serum-Ig Titer, die spezifisch an Lewis Y Antigen positive Tumorzellen binden, bei Tieren gefunden, die mit anti-id BR55-2 Nr. E4 immunisiert wurden, aber es wird fast keine Bindung an eine Antigen negative Zellinie detektiert. Es wird zu keinem Zeitpunkt eine spezifische Bindung bei Seren von Rhesusaffen beobachtet, die mit unspezifischem Maus-IgG1 immunisiert wurden. Ähnliche Ergebnisse findet man mit Seren, die vor und nach der zweiten Boosterimmunisierung erhalten wurden. Diese Titrationsergebnisse von Seren, die zu verschiedenen Zeitpunkten in Zell-ELISAs mittels mehrerer Tumorzellinien erhalten wurden, sind in den Fig. 11-20 gezeigt.
- Ein ähnliches Immunreaktivitätsmuster von Ig von verschiedenen Affenseren vor und nach dem ersten Immunisierungsdurchgang wie auch vor und nach der ersten Boosterimmunisierung kann auch durch Bindungsexperimente an eine Membranpräparation von Lewis Y Antigen-positiven SKBR5 Zellen gezeigt werden (experimentelle Details siehe Beispiel 11). Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefaßt.
- Um die humorale Immunreaktion, die in Rhesusaffen durch Immunisierungen mit anti-id BR55-2 Nr. E4 weiter im Detail zu analysieren, werden verschiedene Seren von geimpften Affen auf einer Säule immungereinigt, die mit anti-id BR55-2 Nr. E4 gekuppelt an Sepharose beladen ist (experimentelle Details siehe Beispiel 12). Durch dieses selektive Einschrittverfahren wird die komplette humorale Immunreaktion gegen anti-id BR55-2 Nr. E4 von allen anderen nicht relevanten Serumproteinen abgetrennt. In einem ersten Experiment wird das Ig eines Rhesusaffen, der mit anti-id BR55-2 Nr. E4 immunisiert wurde, aus dem in Woche 9 erhaltenen Serum nach dem anfänglichen Immunisierungsansatz immungereinigt. In einem zweiten Experiment wird das Ig eines Rhesusaffen, der mit anti-id BR55-2 Nr. E4 immunisiert wurde, aus den vereinigten Seren immungereinigt, die in Woche 4 und 9 nach der zweiten Boosterimmunisierung erhalten wurden. Aufgrund ihrer Retention auf der anti-id BR55-2 Nr. E4 Säule binden die erhaltenen Ig-Fraktionen spezifisch an verschiedene Epitope des anti-id BR55-2 Nr. E4 Antikörpermoleküls. Diese Ig-Fraktionen enthalten Antikörper gegen die konstanten Regionen von anti-id BR55-2 Nr. E4 (antiisotypische Immunreaktion) wie auch Antikörper gegen die variablen Regionen einschließlich der Kombinationsregion von anti-id BR55-2 Nr. E4 (antiidiotypische Immunreaktion). Auf der Grundlage der in der Einleitung erwähnten Idiotypnetzwerktheorie ist der letztere Teil (Ab3) besonders wichtig, da er Bindungseigenschaßen aufweist, die mit denen von Antikörpern der Spezifität von BR55-2 (Ab1) vergleichbar sind.
- Die Bindung der immungereinigten Ig-Fraktion von den vereinigten Seren, die in Woche 4 und 9 nach der zweiten Boosterinjektion erhalten wurden und der Durchflußfraktion an anti-id BR55-2 Nr. E4 wird bestimmt (experimentelle Details siehe Beispiel 13). Während die immungereinigte Ig-Fraktion stark an anti-id BR55-2 Nr. E4 bindet, wird keine Bindung für die Durchflußfraktion detektiert. Durch dieses Ergebnis wird die Selektivität und Effizienz dieses Immunreinigungsverfahrens bewiesen (die Ergebnisse sind in Fig. 21 gezeigt).
- Als nächstes werden die Bindungseigenschaften der immungereinigten Ig-Fraktion von den vereinigten Seren, die in Woche 4 und 9 nach der zweiten Boosterinjektion erhalten wurden, der Durchflußfraktion und einer humanisierten Version des Ausgangs-Maus-mAk (Ab1) auf SKBR5 Brustkrebszellen verglichen. Diese humanisierte Ab1 Variante (BR55-2/humanisiertes IgG1) wird ausgewählt, um den Vergleich zu vereinfachen, da sie mit demselben Reagenz detektiert werden kann, das auch für die Detektion des Ig vom Rhesusaffen verwendet wird (Ziege-anti-Mensch-Ig/Peroxidase, das auch ähnlich an das nah verwandte Ig vom Rhesusaffen bindet). Fast die gesamte Tumorzell-bindende Reaktivität wird in der immungereinigten Ig-Fraktion angehäuft. Mit diesem Ergebnis wird die Kreuzreaktivität des Ig vom Rhesusaffen, das durch die Immunisierung mit anti-id BR55-2 Nr. E4 induziert wurde mit einer Lewis Y Antigen-positiven Tumorzellinie bewiesen. Darüberhinaus ist die Bindungsstärke der immungereinigten Ig-Fraktion auf einer Gewicht zu Gewicht Basis nur fünfmal niedriger, als die des BR55-2/humanisierten IgG1 (Ab1). Wenn man bedenkt, daß nur ein bestimmter Teil der immungereinigten Ig- Fraktion gegen die Kombinationsregion des anti-id BR55-2 Nr. E4 gerichtet ist und gemäß der Netzwerktheorie nur dieser Teil die mit Ab1 vergleichbaren Bindungseigenschaften zeigt, ist das Ergebnis bemerkenswert. Auf der Grundlage der Ausbeute der Immunaffinitätsreinigung der Rhesusaffenseren entspricht der Titer der immungereinigten Ig Fraktion etwa 200 ug/ml Serum, was etwa 40 ug/ml Ig mit tumorzellbindenden Eigenschaften entspricht, die zu denen des BR55-2/humanisierten IgG1 ähnlich sind (die Ergebnisse sind in Fig. 22 gezeigt, die experimentellen Details in den Beispielen 10 und 12).
- Ein Vergleich der Bindungseigenschaften des immungereinigten Affen-Ig (Ab3) mit denen des BR55- 2/humanisierten IgG1 auf die Lewis Y positive Brustkrebszellinie SKBR5 und die Lewis Y negative Melanomzellinie WM9 ist in Fig. 23 gezeigt (experimentelle Details siehe Beispiel 10). Während sowohl die Ab3 Fraktion als auch das BR55-2/humanisierte IgG1 stark an die oben beschriebene Lewis Y positive Zellinie bilden, binden beide Antikörper nicht spezifisch an die Lewis Y negative Zellinie. Durch diese Ergebnisse wird die Ähnlichkeit des Bindungsmusters der Ab3-Fraktion und der humanisierten Ab1 Variante bewiesen.
- Ein ähnliches Immunreaktivitätsmuster der Ab3-Fraktion wird auch in einem ELISA mittels Membranfraktionen der Lewis Y positiven SKBR5 Zellinie und der Lewis Y negativen Zellinie WM9 beobachtet. Eine signifikante Bindung der Ab3-Fraktion wird nur auf den Lewis Y positiven Zellmembranen detektiert (die Ergebnisse sind in Fig. 24 gezeigt, experimentelle Details siehe Beispiel 11).
- Die Bindungseigenschaften des immungereinigten Affen-Ig (Ab3) werden weiter auf mehreren Lewis Y positiven humanen Tumorzellinien bestätigt (kleinzelliger Lungenkrebs, Magenkrebs, Darmkrebs, Brustkrebs). Das immungereinigte Affen-Ig bindet stark an alle getesteten Zellinien (die Ergebnissse sind in Fig. 25 gezeigt, experimentelle Details siehe Beispiel 10).
- Der Ab1 Antikörper BR55-2/Maus IgG3 vermittelt nach einer Bindung an die Tumorzellen eine Zellzerstörung über die Aktivierung von humanen Effektormechanismen. Um die Fähigkeit zur Tumorzellzerstörung von Ig des Rhesusaffen, das durch eine Immunisierung mit anti-id BR55-2 Nr. E4 induziert wurde, zu testen, wird immungereinigtes Affen-Ig (Ab3) verwendet. Für dieses Experiment wird die Ab3-Fraktion aus dem Serum eines Rhesusaffen immungereinigt (siehe oben), das 9 Wochen nach dem anfänglichen Immunisierungsansatz mit anti- id BR55-2 Nr. E4 erhalten wurde. Diese Ab3-Fraktion wird mit BR55-2/Maus IgG3 (Ab1) in einem ADCC Experiment mittes humaner PBMC als Effektorzellen verglichen (die Ergebnisse sind in Fig. 26 gezeigt, experimentelle Details siehe Beispiel 14). Die immungereinigte Ab3-Fraktion vermittelt bei höheren Konzentrationen eine Tumorzellzerstörung über die Aktivierung von humanen Effektorzellen, die mit dem Maus Ab1 vergleichbar ist. Durch dieses Ergebnis wird die Induktion einer selektiven Tumorzellzytotoxizität durch Impfung mit einem anti-id BR55-2 Nr. E4 gezeigt. Es ist eine höhere Konzentration von Ab3 erforderlich, da nur ein bestimmter Teil der immungereinigten Ig-Fraktion gegen die Kombinationsregion von anti-id BRSS-2 Nr. E4 gerichtet ist und nur dieser Teil an die Tumorzellen binden und die ADCC vermitteln dürfte.
- Wie in der Einleitung erwähnt, ist bekannt, daß das Lewis Y Kohlenhydratantigen auch auf humanen Leukozyten exprimiert wird, die mit HIV infiziert sind. Um das Bindungsverhalten von Serum Ig von Rhesusaffen an HIV infizierte Zellen zu bestimmen, die mit anti-id BR55-2 Nr. E4 oder mit unspezifischem Maus-IgG1 immunisiert worden sind, werden Affenseren, die vor und 9 Wochen nach dem anfänglichen Immunisierungsansatz erhalten wurden, in einem im Handel erhältlichen Testkit getestet, der ursprünglich zur Detektion der HIV Seropositiviät bei humanen Seren entwickelt wurde. Dieser Test basiert auf der Fähigkeit von humanem Serum Ig, die HIV infizierte humane T-Zellinie PALL zu binden, wie dies durch indirekte Immunfluoreszenz mittels eines antihuman IgG-FITC detektiert wird. Aufgrund der großen Ähnlichkeit von Ig vom Menschen und Rhesusaffen kann das Originalreagenz des Testkits auch für Ig vom Rhesusaffen verwendet werden. Die Bindung an nicht-infizierte PALL Zellen dient als Kontrolle (experimentelle Details siehe Beispiel 15).
- Mit normalem Rhesusaffenserum ist die Hintergrundimmunfluoreszenz gegenüber sowohl HIV infizierten als auch nicht-infizierten PALL Zellen leicht höher, als die Hintergrundimmunfluoreszenz, die mit normalem humanem Serum detektiert wird. Jedoch bindet im wesentlichen nur Serum-Ig von Rhesusaffen, die mit anti-id BR55-2 Nr. E4 immunisiert wurden, an die HIV infizierten PALL Zellen, während fast keine Bindung an die nicht-infizierten PALL Zellen detektiert wird. Die Reaktivität von Serum Ig von Rhesusaffen, die mit unspezifischem Maus-IgG1 immunisiert wurden, gegenüber HIV infizierte PALL Zellen ist deutlich weniger ausgeprägt und nahe an der Hintergrundfluoreszenz, die mit normalen Affenseren beobachtet werden (die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefaßt).
- Das Ig eines Rhesusaffen, der mit anti-id BR55-2 Nr. E4 immunisiert wurde, wird aus den vereinigten Seren, die in Woche 4 und 9 nach der zweiten Boosterinjektion erhalten wurden, mittels einer anti-id BR55-2 Nr. E4 Säule (siehe oben) immungereinigt. Die Bindungseigenschaften dieses immungereinigten Ig (Ab3) werden mit denen von BR55-2/Maus-IgG3 (Ab1) im bereits erwähnten im Handel erhältlichen Testkit verglichen, der zur Detektion der HIV Seropositivität von humanen Seren entworfen wurde (experimentelle Details siehe Beispiel 15). Die immungereinigte Ig-Fraktion (Ab3) bindet selektiv an die HIV infizierten PALL Zellen, wobei keine Bindung an nicht-infizierte PALL Zellen detektiert wird. Ein ähnliches Bindungsmuster findet man für BR55-2/Maus IgG3 (Ab1). Diese Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengefaßt.
- Zusätzlich zu ihrer Verwendung als einzigartige Impfstoffe zur Prophylaxe und Behandlung von verschiedenen Krebsarten und durch HIV verursachte Erkrankungen sind die ein internes Abbild darstellenden antiidiotypischen mAks, die gegen die Bindungsregion des erfindungsgemäßen BRSS-2 erzeugt werden, wirkungsvolle Werkzeuge für die quantitative Bestimmung von monoklonalen Antikörpern, ihren Derivaten oder Fragmenten mit der Bindungsspezifität von BR55-2. Beispielsweise können sie zur selektiven Bestimmung der Konzentration aller Maussubtypen von BR55-2 in humanen Seren verwendet werden. Aufgrund der Erkennung der dreidimensionalen Form der Bindungsregion von BR55-2 binden diese anti-id mAks nur an die immunreaktiven Strukturen von BR55-2. Diese Eigenschaft führt zu Detektionssystemen, die besser sind als die, welche auf herkömmliche gegen die konstante Region gerichtete Reagenzien basieren. Ein ELISA System für die quantitative Bestimmung des immunreaktiven BR55-2/Maus IgG3 oder BR55-2/Maus IgG2a ist in Beispiel 16 beschrieben und eine typische Standardkurve dieser mAks in humanem Serum ist in Fig. 27 gezeigt.
- Ein ähnliches ELISA-System, das auf den erfindungsgemäßen anti-id mAks basiert, kann für die hochselektive, quantitative Bestimmung von immunreaktiven Maus/Menschchimären von BR55-2 in humanem Serum verwendet werden. Diese Chimären bestehen aus den variablen Domänen von BR55-2 und aus humanen konstanten Regionen (beispielsweise humanes IgG1 oder humanes IgG3). Aufgrund des großen Überschusses an normalem humanem Ig in humanem Serum (> 10 mg/ml) können solche MausfMenschchimären in humanem Serum mittels herkömmlicher antihuman-Fc-Reagenzien nicht detektiert werden, die an jedes im Serum vorkommende Ig binden. Das selektive ELISA System ist in den Beispielen 17 und 18 beschrieben, wobei typische Standardkurven in humanem Serum in den Fig. 28 und 29 gezeigt sind.
- Vollkommen humanisierte Varianten von BR55-2 wurden konstruiert, indem man die komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDRs) des Ausgangs-Maus-mAk auf das humane Framework und die konstanten Regionen transplantiert. Durch Computermodellierung führen einige ausgewählte Punktmutationen im humanen Framework zu humanisierten Varianten, ohne wesentlichen Verlust in der Bindungsaffinität gegenüber Lewis Y positiven Tumorzellen im Vergleich zu dem Ausgangs-Maus-mAk. Daher verbleibt in diesen humanisierten Varianten nur der kleine Teil der ursprünglichen Mausaminosäuresequenzen unverändert, der die Bindungseigenschaften bestimmt. Bemerkenswerterweise binden auch alle in dieser Erfindung beschriebenen anti-id BR55-2 mAks stark an den Idiotyp dieser humanisierten IgG1 Varianten des Ausgangs-Maus-IgG3-mAk. Das Bindungsverhalten der anti-id mAks gegenüber den humanisierten Varianten von Ab1 ist mit dem gegenüber den oben erwähnten chimären MausfMensch-mAks vergleichbar. Dies wird durch die biospezifische Wechselwirkungsanalye mittels des BIAcore® Systems von Pharmacia gezeigt. In den meisten Fällen beobachtet man bei höheren Konzentrationen fast eine 1 : 1 Stöchiometrie zwischen dem anti-id BR55-2 und BR55-2/chimären humanen IgOl oder BR55- 2/humanisiertes IgG1. Die experimentellen Details sind in Beispiel 19 beschrieben, wobei die Titrationskurven in den Fig. 30-35 gezeigt sind. Diese Feststellungen heben die Bindungsselektivität der anti-id mAks zu der intakten dreidimensionalen Form der hypervariablen Region aller Varianten von BR55-2 hervor und beweisen die Eigenschaften eines internen Abbilds.
- Aufgrund dieses einzigartigen und selektiven Erkennungsmusters können die anti-id BR55-2 mAks auch für die hochselektive quantitative Bestimmung von immunreaktiven humanisierten Antikörpern mit einer Spezifität von BR55-2 in humanem Serum trotz des großen Überschusses an humanem Immunglobulin verwendet werden, das im Serum vorkommt. Dasselbe ELISA-System ist auch für die quantitative Bestimmung von humanisierten Antikörpern mit der Spezifität von BR55-2 in Affenserum brauchbar. Dies ist beispielsweise für die Toxizitätsund Pharmakokinetikuntersuchungen am Affen wichtig, die während der präklinischen Entwicklung eines humansierten BR55-2 mAk für eine passive Immuntherapie erforderlich sind. Das ELISA-System ist in Beispiel 20 beschrieben, wobei eine typische Standardkurve in Humanserum in Fig. 36 gezeigt ist.
- Die Erkennung der Bindungsregion aller Varianten von BR55-2 durch anti-id BR55-2 mAks wird auch durch die Konkurrenz der Bindung von BR55-2/MausIgG3 an anti-id BR55-2 Nr. E4 durch BR55-2/chimäres humanes IgG1 und BR55-2/chimäres humanes IgG3 gezeigt. Beide Chimären hemmen die Bindung einer festgelegten Konzentration des Ausgangs-Maus-mAk an den anti-id BR55-2 Nr. E4 in einer dosisabhängigen Weise. Dieser Konkurrenz-ELISA wird in Beispiel 21 beschrieben und die Ergebnisse sind in Fig. 37 gezeigt.
- Die Bindung von BR55-2/Maus-IgG3 an antigenpositive Tumorzellinien ist eine Voraussetzung für eins durch Komplement vermittelte Zerstörung. Daher zeigt die Hemmung der Tumorcytotoxizität durch anti-id BR55- 2 mAks ihre Fähigkeit zur Blockierung der Bindung von Ab1 an das Antigen auf der Zelloberfläche. Die starke Neutralisation der Komplement-abhängigen Cytotoxizität durch anti-id BR55-2 Nr. E4 gegenüber humanen SKBR5 Brustkrebszellen, die durch BR55-2/Maus IgG3 vermittelt wird, ist in Fig. 38 gezeigt, die experimentellen Details sind in Beispiel 22 beschrieben.
- Aufgrund der hochspezifischen Erkennung aller Strukturen mit der intakten Bindungsregion von BR55-2 können die anti-id BR55-2 mAks für ein Einschrittimmunreinigungsverfahren für alle Varianten von BR55-2 verwendet werden. Der anti-id BR55-2 Nr E4 wird an CH-Sepharose 4B® gekuppelt. Dieses Immunaffinitätsmaterial kann beispielsweise für eine direkte Reinigung des BR55-2/chimäres humanes IgG1 verwendet werden, das in vitro kultiviert wird. Der chimäre mAk wird in einer Ausbeute von 75% und einer Reinheit von > 95% erhalten. Aufgrund der viel höheren Selektivität ist dieses Immunreinigungsverfahren einer Reinigung mittels Protein A überlegen. Die experimentellen Details können in Beispiel 23 eingesehen werden, die SDS-PAGE ist in Fig. 39 gezeigt. Es werden keine Verunreinigungen detektiert. Dasselbe Verfahren kann erfolgreich mit ähnlichen Ergebnissen für eine hocheffiziente Einschrittreinigung der Zellkulturüberstände einer humanisierten Variante von BR55-2 angewendet werden, die durch Transplantierung der CDRs erhalten wird.
- Zusammengefaßt führt die Immunisierung von Kaninchen und Rhesusaffen mit einem monoklonalen Maus-IgG1 Antiidiotypantikörper gegen den Idiotyp von Antikörpern mit der Spezifität von BR55-2 (anti-id BR55-2 Nr. E4) zu einer Immunreaktion mit hohem Titer, die spezifisch an Lewis Y positive humane Tumorzellen bindet. Wie in den Experimenten mit den Rhesusaffen gezeigt, wird durch wiederholte Boosterimmunisierungen die Antitumorimmunität für Jahre aufrechterhalten. Die durch diese Immunisierungen hervorgerufenen Ig entwickeln in Gegenwart von humanen Effektorzellen eine Tumorcytotoxizität in ADCC. Die Spezifität der anti-id Immunisierung wird durch die Immunisierung einer Kontrollgruppe von Rhesusaffen mit unspezifischem Maus-IgG1 gezeigt. Trotz einer wesentlichen Immunreaktion gegen das unspezifische Maus-IgG1 wird keine spezifische Bindung an jede Art von Tumorzellen detektiert.
- Durch diese Ergebnisse wird die Verwendung der anti-id BR55-2 mAks als Ersatz für das Lewis Y tumorassoziierte Antigen zur therapeutisch und prophylaktisch aktiven Immunisierung mit dem Ziel der Induzierung einer schützenden Antitumorimmunität beim Menschen hervorgehoben.
- Darüberhinaus führt die Immunisierung der Rhesusaffen mit einem anti-id BR55-2 mAk zu einer Immunreaktion mit hohem Titer, die auch selektiv an HIV infizierte positive Zellen bindet. Diese Zellen exprimieren bekanntermaßen Lewis Y. Im Gegensatz dazu führt die Immunisierung von Rhesusaffen mit unspezifischem Maus-IgG1 nicht zu einer spezifischen Bindung an HIV-positive oder -negative Zellen.
- Durch diese Ergebnisse wird die Verwendung von anti-id BR55-2 mAks als Ersatz für das Lewis Y Kohlenhydratantigen für eine therapeutische und prophylaktische Impfung beim Menschen mit dem Ziel der Induktion einer schützenden Immunität gegen HIV und durch HIV hervorgerufene Erkrankungen hervorgehoben.
- Zusätzlich zur Verwendung der anti-id BR55-2 mAks als prophylaktische und therapeutische Impfstoffe sind die ein internes Abbild darstellenden anti-id mAks brauchbare Reagenzien für die hochselektive und quantitative Bestimmung von Molekülen mit der Spezifität von BR55-2, einschließlich chimärisierter und humanisierter Varianten im Serum oder anderen Körperflüssigkeiten. Diese anti-id mAks können auch durch kovalente Kupplung an eine geeignete Matrix zu hochselektiven Einschrittimmunaffinitätsreinigungen aller Moleküle mit der Spezifität von BR55-2 mit hoher Ausbeute verwendet werden.
- Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Die Abkürzungen haben die folgenden Bedeutungen:
- ADCC: Antikörper-abhängige zelluläre Toxizität
- RSA: Rinderserumalbumin
- CDC: Komplement-abhängige Cytotoxizität
- DMEM: Dulbeccos modifiziertes Eagle Medium
- EDC: N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid
- ELISA: Enzym-gebundener Immunosorbenttest
- FCS: Fetales Rinderserum
- HBS: Hepes-gepufferte Kochsalzlösung
- mAk: monoklonaler Antikörper
- NHS: N-Hydroxysuccinimid
- PBMC: Mononukleäre Zellen des peripheren Bluts
- PBS: Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung
- RAM-IgG1: Kaninchen-anti-Maus IgG1 Immunglobulin
- RPMI: Roswell Park Memorial Institute
- SDS: Natriumdodecylsulfat
- KLH: Keyhole Limpet Hämocyanin
- SPDP: N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithiopropionat)
- PAGE: Polyacrylamidgelelektrophorese
- IEF: Isoelektrische Fokussierung
- PEG: Polyethylenglykol
- FITC: Fluoresceinisothiocyanat
- IFA: Immunfluoreszenztest
- Die in den Beispielen aufgeführten Materialien sind folgende:
- Mikrotiterplatten: Immunoplates II (Nung)
- Zellinien:
- SKBR5: humane Brustkrebszellinie
- CATO: humane Magenkrebszellinie
- SW948: humane Darmkrebszellinie
- SW2: humane kleinzellige Lungenkrebslinie
- WM9: humane Melanomzellinie
- PALL: humane T-Zellinie
- SP2: Mausmyelomzellinie
- Medium A: RPMI1640 + 2 g/l NaHCO&sub3;
- 100 E/ml Penicillin G
- 100 ug/ml Streptomycinsulfat
- 4 mM Glutamin
- 10% FCS (hitzeinaktiviert, γ-globulinfrei)
- Medium B: RPMI1640 + 2 g/l NaHCO&sub3;
- 100 E/ml Penicillin G
- 100 ug/ml Streptomycinsulfat
- 4 mM Glutamin
- 5% FCS (hitzeinaktiviert)
- Medium C: DMEM
- 10% NCTC-135 (synthetisches Medium, Gibco)
- 1% MEM nicht essentielle Aminosäuren (Gibco)
- 0,5% Natriumpyruvat
- 0,5% Oxalessigsäure (Sigma)
- 20% FCS hitzeinaktiviert
- 4 mM Glutamin
- 100 E/ml Penicillin G
- 100 ug/ml Streptomycinsulfat
- Medium D: Medium C + 1,36 mg/l Hypoxanthin
- 0,39 mg/l Thymidin
- Medium E: Medium D + 0,4 mg/l Aminopterin
- Medium F: Medium C + Mausthymocyten (Thymocyten einer Balb/c Maus, die in 25 ml Medium C resuspendiert sind)
- Medium G: DMEM
- 10% FCS hitzeinaktiviert
- 4 mM Glutamin
- 100 E/ml Penicillin G
- 100 ug/ml Streptomycinsulfat
- Medium H: 10 mM N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N'-2-ethansulfonsäure
- 3,4 mM Ethylendinitrilotetraessigsäure
- 0,15 M NaCl
- 0,005% P20 (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Schweden)
- PEG: Polyethylenglykol (MG = 3400)
- 1 g ist in 1 ml DMEM gelöst
- PBS defizient: 138,0 mM NaCl
- 1,5 mM KOH
- 2,7 mM KCl
- 6,5 mM Na&sub2;HPO&sub4;
- pH 7,2
- Beschichtungspuffer: 15 mM Na&sub2;CO&sub3;
- 35 mM NaHCO&sub3;
- 3 mM NaN&sub3;
- pH 9,6
- Färbepuffer: 24,3 mM Citronensäure
- 51,4 mM Na&sub2;HPO&sub4;
- pH 5,0
- Waschpuffer: 2% NaCl
- 0,2% Triton X-100
- in PBS defizient
- Substratlösung: 40 mg o-Phenylendiamindihydrochlorid
- 100 ml Färbepuffer
- 20 ul H&sub2;O&sub2; 30%
- Bindungspuffer: 0,1 M Tris/HCl
- 0,2 M NaCl
- pH 7,5
- Elutionspuffer: 0,15 M Glycin/HCl
- 0,2 M NaCl
- pH 2,8
- Kupplungspuffer: 0,1 M NaHCO&sub3;
- 0,5 M NaCl
- pH 8,0
- In K. Hirashima et al. J. Immunol. 145 (1990) 224-232 werden antiidiotypische mAks gegen Lewis Y Antigen-mAks beschrieben, worin das Lewis Y Antigen als Krebsassoziiertes Antigen exprimiert wird. Insbesondere werden anti-id mAks gegen Lewis Y Antigen-mAks AH-6 verwendet. Diese Lösung des Stands der Technik wird auf die Immunisierung von Mäusen angewendet, während bei der vorliegenden Erfindung die ein internes Abbild darstellenden anti-id mAks BR55-2 das Kohlenhydrat Lewis Y Antigen für eine schützende Immunität beim Menschen ersetzen können.
- Balb/c Mäuse werden mit jeweils 100 ug F(ab')&sub2;-Fragment eines BR55-2/Maus-IgG3, der wie beschrieben (J. Carlsson et al., Biochem. J. 173, 1978) über SPDP an KLH gekuppelt ist, durch intraperitoneale Injektion gemäß dem folgenden Schema immunisiert:
- Tag 0: 100 ug Konjugat (1 mg/ml in PBS def.) + 100 ul Freundsches komplettes Adjuvans
- Tag 7 und 28: 100 ug Konjugat (1 mg/ml in PBS def) + 100 ul Freundsches inkomplettes Adjuvans
- An den Tagen 8, 9, 10 und 11 nach der primären Immunisierung werden insgesamt 4 Boosterinjektionen (jede 100 ug Konjugat in 100 ul PBS def.) i. v. verabreicht. Am Tag 12 werden die Milzen aseptisch entnommen, in PBS def. suspendiert und dreimal in PBS def. gewaschen.
- Diese Milzzellen werden zu einer Suspension von SP2/0 Zellen in einem Verhältnis von 1 : 1 gegeben und bei 900 · g für 5 Minuten zentrifugiert. 1 ml PEG-Lösung (37ºC) wird tropfenweise innerhalb von 1 Minute zum Zellpellet gegeben und mit 1 ml PBS def. (37ºC) innerhalb der nächsten Minute verdünnt. 10 ml Medium C werden unter vorsichtiger Rotation zugegeben und die Suspension wird mit PBS def. auf 50 ml verdünnt. Die Suspension wird bei 800 · g für 5 Minuten zentrifugiert, das Pellet wird in Medium D resuspendiert und die Zellen werden in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte (Nung 96) in einer Konzentration von 2,5 · 10&sup5; Zellen/Vertiefung überführt. Nach einer Inkubation über Nacht bei 37ºC und 5% CO&sub2; werden 100 ul/Vertiefung Medium E zugegeben. Nach 72 h und dann alle vier Tage wird das Medium durch Medium D ersetzt.
- 100 ul Aliquots von Kaninchen-anti-Maus-IgG (wie das Reagenz von Nordic, 1 : 1000 in Beschichtungspuffer) werden zu den Vertiefungen der Mikrotiterplatten gegeben und bei 37ºC für 60 Minuten inkubiert. Die Platten werden sechmal mit Waschpuffer gewaschen, 200 ul PBS def. / 5% FCS werden zugegeben und für 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die Platten werden wie oben beschrieben gewaschen. 100 ul Aliquots der nach zweiwöchiger Kultur erhaltenen Hybridomüberstände werden zugegeben und die Platten werden bei 37ºC für 60 Minuten inkubiert. Ungebundener Antikörper wird wie oben beschrieben weggewaschen und 100 ul Aliquots des Peroxidase-konjugierten Antikörpers (Kaninchen-anti-Maus IgG / Peroxidase, wie die Reagenzien von Dianova, 1: 1000 in PBS / 2% FCS) werden zugegeben. Nach einer Inkubation für 30 Minuten bei 37ºC werden die Platten viermal mit Waschpuffer und zweimal mit Färbepuffer gewaschen. 100 ul Aliquots der Substratlösung werden zugegeben und die Farbentwicklung wird nach 5 Minuten mit 50 ul Aliquots 4 N H&sub2;SO&sub4; gestoppt. Die photometrische Extinktion wird bei 492 nm gemessen (Referenzmessung bei 620 nm).
- Hybridome, die ausreichend Maus-IgG bilden (das heißt mehr als die 10 fache optische Dichte, als die Mediumkontrolle) werden in Einzelzellkulturen in Medium F subkultiviert und in Medium C für weitere 2 Wochen kultiviert. Die Überstände werden wie in Beispiel 2 beschrieben mittels 100 ul Aliquots des F(ab')&sub2;- Fragments von BR55-2 (10 ug/ml, Verdünnung in Beschichtungspuffer) getestet.
- Alle Hybridomüberstände, die im oben beschriebenen Test positiv sind, werden folgendermaßen getestet:
- Mikrotiterplatten werden mit Poly-L-Lysinhydrobromid (20-30 kDa, 20 ug/ml in PBS def., 100 ul/Vertiefung 30 Minuten bei Raumtemperatur) vorbehandelt, zweimal mit PBS def. (200 ul/Vertiefung) gewaschen und dann über Nacht bei 4ºC mit 50 ul/Vertiefung einer Suspension aus SKBR5 Zellen in Medium B (4 · 106 Zellen/ml) inkubiert. Nach der Entfernung des Überstands werden die Zellen mit 50 ul Glutardialdehyd/Vertiefung (0,1% in physiologischer Kochsalzlösung) für 5 Minuten bei Raumtemperatur fixiert, die Überstände werden entfernt, die Zellen werden in 200 pl/Vertiefung an PBSdef. / 1% RSA / 0,1% NaN&sub3; resuspendiert und 1 Stunde bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Überstände werden entfernt und die Platten werden in 200 ul/ Vertiefung PBS zweimal gewaschen, worin 0,05% Tween 20 ® enthalten ist.
- Hybridomüberstände, die auf 1 ug/ml Maus-IgG eingestellt sind, werden mit einem zehnfachen Überschuß an unspezifischem Maus-IgG für 30 Minuten bei 37ºC vorinkubiert. Dann werden diese Proben mit 0,5 ug/ml BR55-2 / Maus IgG2a für 30 Minuten bei 37ºC vorinkubiert. 100 ul dieses Gemisches werden zu den Zellen gegeben und die Platten werden für 1 Stunde bei 37ºC inkubiert.
- Aufarbeitung des Gemisches: Ungebundener Antikörper wird mit 100 ul/Vertiefung an eiskaltem PBS herausgewaschen, der 0,05% Tween 20 ® enthält. 100 ul Aliquots an Peroxidase-konjugiertem Antikörper (Kaninchen-anti-Maus-IgG2a / Peroxidase, wie die Reagenzien von Zymed, 1 : 1000 in PBS def. / 2% FCS) werden zugegeben. Nach einer Inkubation für 45 Minuten bei 37ºC werden die Vertiefungen dreimal mit der oben erwähnten PBS/Tween 20 ® Lösung gewaschen und dann werden 100 ul der Substratlösung zu jeder Vertiefung gegeben. Nach 5 Minuten wird die Farbentwicklung durch die Zugabe von 50 ul 4 N H&sub2;SO&sub4; / Vertiefung gestoppt. Die Bindung des Antikörpers an die Zellen wird durch Messen der Extinktion bei 492 nm bestimmt (Referenzmessung bei 620 nm).
- 10 g gefriergetrocknete aktivierte CH-Sepharose 4B wird in 1 mM HCl suspendiert, auf eine Glasnutsche überführt und mit 2 l 1 mM HCl für 15 Minuten gewaschen. Der Ligand (120 mg BR55-2/Maus-IgG2a), der in 50 ml Kupplungspuffer gelöst ist, wird mit dem gewaschenen Gel in einem verschlossenen Gefäß gemischt und für eine Stunde bei Raumtemperatur durch Kopfüberrollen gemischt. Das Gel wird mit Kupplungspuffer gewaschen und für eine Stunde tnit 50 ml 1 M Ethanolamin für die Blockierung aller verbleibenden aktiven Gruppen inkubiert. Das Affinitätssorbens wird dann mit drei Zyklen mit alternierendem p11 gewaschen. Jeder Zyklus besteht aus einem Waschschritt bei pH 4 (0,1 M Acetat, 0,5 M NaCl) gefolgt von einem Waschschritt bei pH 8 (0,1 M Tris, 0,5 M NaCl).
- Die Chromatographie wird bei 4ºC durchgeführt. Die Säule (BIO REX MP® Säule mit einem Durchmesser von 1,5 cm) wird mit der mAk BR55-2 /Maus IgG2a Sepharose (Volumen 35 ml) gefüllt. Das Gel wird mit Bindungs- und Elutionspuffer gewaschen. Nach der Äquilibrierung mit Bindungspuffer wird konditioniertes Medium, das anti-id BR55-2 enthält, auf die Säule mit einer Flußrate von 15 ml/min aufgetragen. Nach der Elution der Durchflußfraktion wird das gebundene anti-id BR55-2 mit Elutionspuffer desorbiert und unmittelbar nach der Desorption mit 1 M Tris-HCl Puffer pH 7,5 neutralisiert.
- Die Konzentrierung der eluierten Antikörperlösung (0,12 mg/ml) wird in einer gerührten Amicon Ultrafiltrationszelle mit einer PM 10 Diaflo-Membran durchgeführt. Die Rückhaltung des gelösten Stoffs beträgt für IgG mehr als 98%, wobei die Endkonzentration von IgG 3,7 mgfml beträgt.
- Säule: Mono Q HR5/5 (Pharmacia)
- Puffer A: 20 mM Triethanolamin, pH 7,7
- Puffer B: 20 mM Triethanolamin, 1 M NaCl, pH 7,7
- Flußrate: 1 ml/min
- Detektion: UV 280 nm
- Gradient: linear 2%/min
- Ergebnisse: > 95% Reinheit wird für alle anti-id BR55-2 mAks gefunden
- Säule: Zorbax GF250®, 9,4 · 250 mm
- Puffer: 0,1 M Natriumphosphat, 0,2 M NaCl, pH 7,0
- Flußrate: 1 ml/min
- Detektion: UV 280 nm
- Ergebnisse: > 95% Reinheit wird für alle anti-id BR55-2 mAks gefunden
- Die Experimente werden sowohl unter reduzierenden als auch nicht-reduzierenden Bedingungen gemäß dem Verfahren von Lämmli mittels 10% Acrylamidgelen durchgeführt. Es werden keine Verunreinigungen detektiert (die Ergebnisse sind in Fig. 1 gezeigt).
- Es wird eine Analyse mit dem Phast-System (Pharmacia) mittels eines pH-Gradienten von 3-9 (Phast-Gel lEF 3-9) und einer Silberfärbung durchgeführt (die Ergebnisse sind in Fig. 2 gezeigt).
- Die Vorbehandlung der Mikrotiterplatten wird ausgeführt, wie dies in Beispiel 4 beschrieben ist. Der jeweilige anti-id BR55-2 mAk wird in PBS def. verdünnt, der 2% FCS enthält (10 bis 0,5 ug/ml). Zu jeder dieser Verdünnungen wird 1 ug/ml BR55-2/Maus-IgG3 gegeben. 100 ul dieses Gemisches werden zu den Zellen gegeben und die Platten werden für 1 Stunde bei 37ºC inkubiert. Das Gemisch wird wie in Beispiel 4 beschrieben aufgearbeitet. Das Ausmaß der Bindung des BR55-2/Maus-IgG3 an die Zellen wird durch Messen der Extinktion bei 492 nm gemessen (Referenzmessung bei G20 nm).
- Drei weibliche Chinchillakaninchen werden durch intradermale Verabreichung von 300 ug anti-id BR55- 2 Nr. E4 adsorbiert auf Aluminiumhydroxid (1 mg Antikörper mit 3,3 mg Al(OH)&sub3;/ml PBS def.) an den Tagen 1, 8, 15 und 36 immunisiert. Drei Kaninchen werden mit derselben Menge unspezifischem Maus-IgG1 als Negativkontrolle unter denselben Bedingungen immunisiert. Die Seren werden vor der Immunisierung und in Woche 9 nach der ersten Immunisierung gewonnen.
- Die Rhesusaffen werden durch subkutane Anwendung (s. c.) von 0,1 mg anti-id BR55-2 Nr. E4/kg adsorbiert auf Aluminiumhydroxid (1 mg Antikörper mit 3,3 ml Al(OH)&sub3;/ml PBS def.) an den Tagen 1, 8, 15 und 36 immunisiert. Zwei Rhesusaffen werden mit derselben Menge an unspezifischem Maus-IgG1 als Negativkontrolle unter denselben Bedingungen immunisiert. Die Seren werden vor und in den Wochen 4 und 9 nach der Immunisierung gewonnen.
- Zwei Jahre nach dem anfänglichen Immunisierungsansatz erhalten dieselben Affen eine erste s. c. Boosterinjektion mit jeweils anti-id BR55-2 Nr. E4 oder unspezifischem Maus-IgG1 (selbe Menge und Formulierung wie oben). Die Seren werden vor wie auch 1 Woche und 4 Wochen nach dieser ersten Boosterimmunisierung gewonnen.
- Drei Jahre nach dem anfänglichen Immunisierungsansatz ( = ein Jahr nach der ersten Boosterinjektion) erhalten dieselben Affen jeweils eine zweite s. c. Boosterinjektion mit anti-id BR55-2 Nr. E4 oder unspezifischem Maus-IgG1 (selbe Menge und Formulierung wie oben). Die Seren werden vor wie auch 1 Woche, 4 Wochen und 9 Wochen nach dieser zweiten Boosterimmunisierung gewonnen.
- Die Vorbehandlung der Mikrotiterplatten wird ausgeführt, wie dies in Beispiel 4 beschrieben ist. 100 ul Aliquots der Kaninchenseren in geeigneten Vorverdünnungen werden zu den Zellen gegeben und die Platten werden für 1 Stunde bei 37ºC inkubiert. Die Bindung des Antikörpers an die Zellen wird durch Messen der Extinktion bei 492 nm bestimmt (Referenzmessung bei 620 nm).
- Die Vorbehandlung der Mikrotiterplatten wird ausgeführt, wie dies in Beispiel 4 beschrieben ist. 100 ul Aliquots eines Rhesusaffenserums oder eines immungereinigten Rhesusaffen-Ig (siehe auch Beispiel 12) und eines humanisierten BR55-2 IgG1 als Kontrolle werden in geeigneten Vorverdünnungen zu den Zellen gegeben und die Platten werden für 1 Stunde bei 37ºC inkubiert. Das Gemisch wird wie in Beispiel 4 beschrieben aufgearbeitet. Die Bindung des Antikörpers an die Zellen wird durch Messen der Extinktion bei 492 nm bestimmt (Referenzmessung bei 620 nm).
- Membranen der Lewis Y Antigen-positiven humanen SKBR5 Krebszellinie und der Lewis Y Antigennegativen WM9 Melanomzellinie werden präpariert, wie dies von D. Thom et al., Biochem. J. 168, 187-194, (1977) beschrieben ist. 100 ul Aliquots der jeweiligen Membranpräparation (10 ug/ml, Verdünnung in Beschichtungspuffer) werden zu den Vertiefungen der Mikrotiterplatten gegeben und bei +4ºC über Nacht inkubiert. Die Platten werden viermal mit Waschpuffer gewaschen, man gibt 200 ul PBS def / 5% FCS zu und inkubiert für 30 Minuten bei 37ºC. Die Platten werden wie oben beschrieben gewaschen. 100 ul Aliquots der Rhesusaffenseren oder des immungereinigten Ig vom Rhesusaffen (siehe auch 2) werden in geeigneten Verdünnungen in PBS def. /2% FCS zu den Platten gegeben und für 60 Minuten bei 37ºC inkubiert. Ungebundener Antikörper wird wie oben beschrieben ausgewaschen und 100 ul Aliquots des Peroxidase-konjugierten Antikörpers (Ziege-anti-Mensch-Ig /Peroxidase wie die Reagenzien von Chemicon & Co., 1 : 1000 in PBS / 2% FCS) werden zugegeben. Nach einer Inkubation für 30 Minuten bei 37ºC werden die Platten zweimal mit Waschpuffer und zweimal mit Färbepuffer gewaschen.
- 100 ul Aliquots der Substratlösung werden zugegeben und die Farbentwicklung wird nach 5 Minuten mit 50 ul Aliquots 4 N H&sub2;SO&sub4; gestoppt. Die optische Dichte (OD) wird bei 492 nm gemessen (Referenzmessung bei 620 nm).
- 9 g gefriergetrocknete aktivierte CH-Sepharose 4B® wird in 1 mM HCl suspendiert, auf eine Glasnutsche überführt und mit 2 l 1 mM HCl für 15 Minuten gewaschen. Der in 50 ml Kupplungspuffer gelöste Ligand (95 mg anti-id BR55-2 Nr. E4) wird mit dem gewaschenen Gel in einem verschlossenen Gefäß gemischt und über Kopf bei Raumtemperatur gerollt. Das Gel wird mit Kupplungspuffer gewaschen und für eine Stunde mit 50 ml 1 M Ethanolamin zur Blockierung aller verbleibenden aktiven Gruppen inkubiert. Das Affinitätssorbens wird dann mit drei Zyklen mit alternierendem pH gewaschen. Jeder Zyklus besteht aus einem Waschschritt bei pH 4 (0,1 M Acetat, 0,5 M NaCl) gefolgt von einem Waschschritt bei pH 8 (0,1 M Tris, 0,5 M NaCl).
- Die Chromatographie wird bei 4ºC durchgeführt. Die Säule (Pharmacia Säule HR 5/2, Bettgröße 5 · 25 mm) wird mit anti-id BR55-2 Nr. E4 Sepharose (Volumen 0,5 ml) gefüllt. Das Gel wird mit Bindungs- und Elutionspuffer gewaschen. Das Ausgangsmaterial sind 2 ml Serum eines Rhesusaffen, der mit anti-id BR55-2 Nr. E4 immunisiert wurde, das 9 Wochen nach dem Beginn der Immunisierungen erhalten wurde. Für eine weitere Experimentenreihe werden 2 ml vereinigter Seren eines Rhesusaffen verwendet, der mit anti-id BR55-2 Nr. E4 immunisiert wurde, die 4 und 9 Wochen nach der zweiten Boosterinjektion erhalten wurden. Das jeweilige Serum wird 1 : 2 in Bindungspuffer verdünnt und auf die Säule aufgetragen. Nach der Elution der Durchflußfraktion wird das gebundene anti-id BR55-2 mit Elutionspuffer desorbiert und unmittelbar nach der Desorption mit 1 M Tris-HCl Puffer pH 7,5 neutralisiert.
- 100 ul Aliquots des anti-id BR55-2 Nr. E4 (10 ug/ml, Verdünnung in Beschichtungspuffer) werden zu den Vertiefungen von Mikrotiterplatten gegeben und bei 37ºC für 60 Minuten inkubiert. Die Platten werden sechsmal mit Waschpuffer gewaschen, man gibt 200 ul PBS def. / 5% FCS zu und inkubiert für 30 Minuten bei 37ºC. Die Platten werden wie oben beschrieben gewaschen. Affenserum oder immungereinigtes Affen-Ig werden in PBS def. / 2% FC5 verdünnt. 100 ul Aliquots dieser Proben werden zu den Vertiefungen der Mikrotiterplatten gegeben und für 60 Minuten bei 37ºC inkubiert. Ungebundener Antikörper wird wie oben beschrieben weggewaschen und 100 ul Aliquots des Peroxidase-konjugierten Antikörpers (Ziege-anti-Mensch Ig / Peroxidase, wie die Reagenzien von Chemicon & Co., 1 : 1000 in PBS / 2% FCS) werden zugegeben. Nach einer Inkubation für 30 Minuten bei 37ºC werden die Platten viermal mit Waschpuffer und zweimal mit Färbepuffer gewaschen. 100 ul Aliquots der Substratlösung werden zugegeben und die Farbentwicklung wird nach 5 Minuten mit 50 ul Aliquots 4 N H&sub2;SO&sub4; gestoppt. Die optische Dichte (OD) wird bei 492 nm gemessen (Referenzmessung bei 620 nm).
- Am Tag vor dem Test werden die SKBR5 Zellen in frisches Medium A überführt und bei 37ºC / 5% CO&sub2; in einer Zellkulturflasche gehalten.
- Die Zellen werden aus der Kulturflasche gewonnen und in einer Konzentration von 5 · 106 Zellen in 800 ul Medium A bei 37ºC / 5%, für 1 Stunde mit 100 uCi Na&sub2;&sup5;¹CrO&sub4; inkubiert. Die Zellen werden dann mit Medium A gewaschen, um überschüssiges &sup5;¹Cr zu entfernen, in frischem Medium A resuspendiert und ihre Konzentration wird auf 2,5 · 10&sup5; Zellen/ml eingestellt.
- 50 ml heparinisiertes frisches Humanblut werden mit 60 ml vollständigem PBS verdünnt, worin 0,1% Glucose enthalten sind. 15 ml Aliquots dieser Lösung werden auf 15 ml einer Ficoll-Paque Lösung gegeben und die Röhrchen werden bei 400 · g für 30 bis 60 Minuten zentrifugiert. Die Plasmaüberstände werden verworfen, die PBMC Schichten werden gesammelt und mit vollständigem PBS + 0,1% Glucose auf 50 ml verdünnt. Nach der Zentrifugation bei etwa 80 · g (10 Minuten), einer Resuspension des Pellets in 25-30 ml vollständigem PBS + 0,1 % Glucose und einer Rezentrifugation (80 · g, 10 Minuten) wird das Pellet gewonnen, in Medium A suspendiert, die Zellen werden gezählt und die Suspension wird mit Medium A auf etwa 2 · 106 bis 9 · 106 Zellen/ml verdünnt. 100 ul Aliquots werden in jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte gegeben und die Effektorzellen werden über Nacht bei 37ºC / 5% CO&sub2; inkubiert.
- 100 ul mit &sup5;¹Cr markierten Zielzellen werden zu den vorinkubierten Effektorzellen im gewünschten Verhältnis von Effektorzellen zu Zielzellen gegeben. 50 ul immungereinigtes Affen-Ig (Ab3) oder BR55-2/Maus- IgG3, welche mit PBS def. auf die gewünschten Konzentration verdünnt wurden, werden zugegeben und die Platte wird über Nacht (etwa 18 Stunden) bei 37ºC / 5% CO&sub2; inkubiert. Die Überstände werden dann mit einer Skatron- Harvesting Presse geerntet und in einem γ-Zähler ausgezählt. Dies ergibt den Wert für die experimentelle Freisetzung. Die Gesamtfreisetzung an &sup5;¹Cr wird wie oben durch Ersetzen der PBMC durch 100 ul 2% SDS, 50 mM Na&sub2;CO&sub3; und 10 mM EDTA und durch Ersetzen der Antikörperlösung durch 50 ul PBS def. bestimmt. Die spontane Freisetzung von &sup5;¹Cr wird durch Ersetzen der PBMC durch 100 ul Medium A und der Antikörperlösung durch 50 ul PBS def. bestimmt.
- Nach dem Zählen werden die Ergebnisse wie folgt errechnet:
- In einem im Handel erhältlichen Immunfluoreszenztestkit (Waldheim & Co., gekauft zur Bestimmung der HIV Seropositivitat) werden HIV infizierte und nicht-infizierte PALL Zellen (humane T-Zellinie) auf Objektträgern fixiert. Das experimentelle Verfahren basiert im Prinzip auf den Angaben des Herstellers. Nach einer Inkubation mit 1% RSA für 30 Minuten bei 37ºC werden die Objektträger mit Rhesusaffenserum (konzentriert und 1 : 10 in PBS def. verdünnt) oder immungereinigtem Rhesusaffen-Ig (Ab3), das in normalem Humanserum verdünnt ist, oder BR55-2 / Maus-IgG3 für 1 Stunde bei 37ºC inkubiert. HIV-positives Humanserum (bereitgestellt als Teil des Testkits) dient als Positivkontrolle, normales Humanserum als Negativkontrolle. Ungebundene Determinanten der Testproben werden dreimal mit PBS def. ausgewaschen und eine 1 : 20 Verdünnung des antihuman-IgG-FITC Reagenzes (Teil des Testkits) in PBS def., das 2% FCS enthält, oder anti-Maus-IgG-FITC (zur Detektion des Maus-mAk) wird zugegeben. Nach einer Inkubation für 30 Minuten bei 37ºC, dreimaligem Waschen mit PBS def. und einer Einbettung der Objektträger wird die Immunfluoreszenz in einem Fluoreszenzmikroskop begutachtet und bewertet (0 = keine Fluoreszenz, 5 = maximale Fluoreszenz)
- 100 ul Aliquots von anti-id BR55-2 Nr. E4 (10 ug/ml, Verdünnung in Beschichtungspuffer) werden zu den Vertiefungen der Mikrotiterplatten gegeben und bei 37ºC für 60 Minuten inkubiert. Die Platten werden sechsmal mit Waschpuffer gewaschen, man gibt 200 ul PBS def. / 5% FCS zu und inkubiert für 30 Minuten bei 37ºC. Die Platten werden wie oben beschrieben gewaschen. Humanseren, die BR55-2/Maus-IgG3 oder BR55- 2/Maus-IgG2a enthalten, werden in geeigneten Verdünnungen in PBS def./2% FCS getestet. 100 ul Aliquots dieser Proben werden zu den Vertiefungen der Mikrotiterplatten gegeben und für 60 Minuten bei 37ºC inkubiert. Als Standard wird BR55-2/Maus-IgG3 oder BR55-2/Maus-IgG2a in normalem humanem Serum auf 10 ug/ml vorverdünnt. Geeignete Verdünnungen in PBS def./2% FCS werden wie oben beschrieben behandelt. Ungebundener Antikörper wird wie oben beschrieben weggewaschen und 100 ul Aliquots des Peroxidase-konjugierten Antikörpers (Kaninchen-anti-Maus IgG3/Peroxidase oder Kaninchen-anti-Maus IgG2a/Peroxidase, wie die Reagenzien von Zymed 1 : 1000 in PBS / 2% FCS) werden zugegeben. Nach einer Inkubation für 30 Minuten bei 37ºC werden die Platten viermal mit Waschpuffer und zweimal mit Färbepuffer gewaschen.
- 100 ul Aliquots Substratlösung werden zugegeben und die Farbentwicklung wird nach 5 Minuten mit 50 ul Aliquots 4 N H&sub2;SO&sub4; gestoppt. Die optische Dichte (OD) wird bei 492 nm gemessen (Referenzmessung bei 620 nm).
- Die OD Werte der Serumproben werden auf den Standardkurven abgelesen und in ugg/ml ausgedrückt.
- Humanseren, die BR55-2/chimäres Human-IgG1 enthalten, werden wie in Beispiel 16 beschrieben mittels Peroxidase-konjugiertem Antikörper (Ziege-anti-Human IgG/Peroxidase, wie die Reagenzien von Chemicon & Co., 1 : 1000 in PBSl2% FCS) getestet.
- Humanseren, die BR55-2/chimäres Human-IgG3 enthalten, werden wie in Beispiel 17 beschrieben, getestet.
- Die Experimente werden mit einem BIAcore® System von Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Schweden durchgeführt. Die Bindung des BR55-2/chimären humanen IgG1 oder BR55-2/humanisierten IgG1 an die verschiedenen Maus-IgG1 anti-id BR55-2 mAks, die an das immobilisierte RAM-IgG1 gebunden sind (wie das Reagenz von Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Schweden) wird mittels biospezifischer Echtzeitwechselwirkungsanalyse bestimmt.
- Die Flußrate des Systems wird auf 5 ul/min eingestellt. Ein Sensorchip wird mit einem Gemisch aus 0,201 mg NHS und 1,313 mg EDC aktiviert, das in 35 ul Wasser gelöst ist. RAM-IgG1, das in 35 ul 10 mM Natriumacetatpuüer pH 5,0 in einer Konzentration von 30 ug/ml gelöst ist, wird mit der aktivierten Sensoroberfläche umgesetzt. Die verbleibenden freien aktivierten Stellen werden mit 35 ul 1 M Ethanolaminhydrochlorid/NaOH pH 8,5 blockiert.
- Die Analyse wird in drei Stufen durchgeführt:
- 1) Der jeweilige anti-id BR55-2 mAk (E4, C11, B3, B9, G6, G9) wird mit Medium H auf eine Endkonzentration von 10 bis 17 ug/ml verdünnt. Für jede Analyse wird der antiidiotypische Antikörper an das RAM-IgG1 gebunden, indem 35 ul dieser Lösung die Sensoroberlläche passieren. Die "Reaktionseinheiten", die proportional zur Menge des gebundenen anti-id BR55-2 mAk sind, werden aufgezeichnet und gespeichert.
- 2) 20 ul der Verdünnungen des Maus/Mensch chimären IgG1 und des humanisierten IgG1 in Medium H mit Konzentrationen von 1-100 ug/ml werden dann injiziert und können an das gebundene anti-id binden. Die "Reaktionseinheiten", die proportional zur Menge an gebundenem mAk sind, werden aufgezeichnet und gespeichert.
- 3) Die Sensoroberfläche wird dann ihr die nächste Analyse mit anschließenden Injektionen an 5 ul 1 M Ameisensäure und 5 ul 8 M Harnstoff regeneriert.
- Die Bindungsrate wird durch Berechnung des Verhältnisses der maximalen Reaktionseinheiten, die mit dem zweiten Antikörper erhalten wurden (BR55-2/chimäres humanes IgG1 oder BR55-2/humanisiertes IgG1) und der maximalen Reaktionseinheiten berechnet, die mit dem ersten Antikörper (jeweiliger antiidiotypischer mAk) erhalten wurden.
- Humanseren, die BR55-2/humanisiertes IgG1 enthalten, werden wie in Beispiel 17 beschrieben getestet.
- 100 ul Aliquots von anti-id BR55-2 Nr. E4 (10 ug/ml, Verdünnung in Beschichtungspuffer) werden zu den Vertiefungen der Mikrotiterplatten gegeben und bei 37ºC für 60 Minuten inkubiert.
- Die Platten werden sechsmal mit Waschpuffer gewaschen, man gibt 200 ul PBS def. / 5% FCS zu und inkubiert für 30 Minuten bei 37ºC. Die Platten werden wie oben beschrieben gewaschen. Chimäres humanes IgG1 oder chimäres humanes IgG3 wird in PBS def. / 2% FCS verdünnt (0,5 ug/ml bis 3 ng/ml). Zu jeder Verdünnung werden 0,05 ug/ml BR55-2/Maus IgG3 gegeben. 100 ul Aliquots dieses Gemisches werden zu den Vertiefungen der Mikrotiterplatten gegeben und für 60 Minuten bei 37ºC inkubiert. Ungebundener Antikörper wird wie oben beschrieben weggewaschen und 100 ul Aliquots des Peroxidase-konjugierten Antikörpers (Ziege-anti-Mensch IgG/Peroxidase, wie die Reagenzien von Chemicon Co. 1 : 1000 in PBS / 2% FCS) werden zugegeben.
- Nach einer Inkubation für 30 Minuten bei 37ºC werden die Platten viermal mit Waschpuffer und zweimal mit Färbepuffer gewaschen.
- 100 ul Aliquots Substratlösung werden zugegeben und die Farbentwicklung wird nach 5 Minuten mit 50 111 Aliquots 4 N H&sub2;SO&sub4; gestoppt. Die optische Dichte (OD) wird bei 492 nm gemessen (Referenzmessung bei 620 nm)..
- Am Tag vor dem Test werden die SKBR5 Zellen in frisches Medium A überführt und bei 37ºC / 5% CQ in einem Zellkulturkolben gehalten.
- Die Zellen werden aus der Kulturflasche gewonnen und in einer Konzentration von 5 · 106 Zellen in 800 ul Medium A bei 37ºC / 5% CO&sub2; für 1 Stunde mit 100 uCl Na&sub2;&sup5;¹CrO&sub4; inkubiert. Die Zellen werden dann mit Medium A gewaschen, um überschüssiges &sup5;¹Cr zu entfernen, in frischem Medium A resuspendiert und ihre Konzentration wird auf 2,5 · 10&sup5; Zellen/ml eingestellt.
- 100 gd Aliquots dieser Zielzellsuspensionen werden in die Vertiefungen der Mikrotiterplatten gegeben. 50 ul Aliquots anti-id BR55-2 Nr. E4, die in PBS def. auf die gewünschte Konzentration verdünnt wurden, werden zugegeben. Dann werden 100 ul Aliquots eines Humanserums pro Vertiefung zugegeben, das 2 ug/ml BR55- 2/IgG3 enthält und die Zellen werden über Nacht bei 37ºC / 5% CO&sub2; inkubiert. Die Überstände werden dann mit einer Skatron-Harvesting Presse geerntet und in einem γ-Zähler ausgezählt. Dies ergibt den Wert für die experimentelle Freisetzung.
- Zur Bestimmung der Gesamtfreisetzung an &sup5;¹Cr werden die Zellen wie oben behandelt, außer daß das Humanserum durch eine Lösung aus 2% SDS, 50 mM Na&sub2;CO&sub3; und 10 mM EDTA und die anti-id BR55-2 Nr. E4 Lösung durch 50 ul PBS def. ersetzt wird. Die Werte für die spontane Freisetzung von &sup5;¹Cr werden durch Ersetzen des Humanserums durch Medium A und der BR55-2 Nr. E4 Lösung durch 50 ul PBS def. bestimmt.
- Nach dem Zählen wird das Ergebnis wie folgt errechnet:
- 9 g gefriergetrocknete aktivierte CH-Sepharose 4B wird in 1 mM HCl suspendiert, auf eine Glasnutsche überführt und mit 2 l 1 mM HCl für 15 Minuten gewaschen. Der in 50 ml Kupplungspuffer gelöste Ligand (95 mg anti-id BR55-2 Nr. E4) wird mit dem gewaschenen Gel in einem verschlossenen Gefäß gemischt und über Kopf bei Raumtemperatur gerollt. Das Gel wird mit Kuplungspuffer gewaschen und für eine Stunde mit 50 ml 1 M Ethanolamin zur Blockierung aller verbleibenden aktiven Gruppen inkubiert. Das Affinitätssorbens wird dann mit drei Zyklen mit alternierenden pH gewaschen. Jeder Zyklus besteht aus einem Waschschritt bei pH 4 (0,1 M Acetat, 0,5 M NaCl) gefolgt von einem Waschschritt bei pH 8 (0,1 M Tris, 0,5 M NaCl).
- Die Chromatographie wird bei 4ºC durchgeführt. Die Säule (BIO REX MP, Säulendurchmesser 1,5 cm) wird mit anti-id BR55-2 Nr. E4 Sepharose (Volumen 35 ml) gefüllt. Das Gel wird mit Bindungs- und Elutionspuffer gewaschen. Das Ausgangsmaterial sind 100 l konditioniertes Medium mit BR55-2/chimären humanen IgG1. Nach einer 5 : 1 Konzentrierung mittels eines Amicon DC2 Konzentrierungssystems, das mit einer Hohlfaserkartusche P10 ausgestattet ist, wird das Konzentrat auf die Säule aufgetragen. Nach der Elution der Durchflußfraktion wird das gebundene BR55-2/chimäre humane IgG1 mit Elutionspuffer desorbiert und unmittelbar nach der Desorption mit 1 M Tris-HCl Puffer pH 7,5 neutralisiert.
- Die Konzentrierung der eluierten Antikörperlösung wird in einer gerührten Amicon Ultrafiltrationszelle mittels einer PM10 Diaflo Membran durchgeführt. Die Rückhaltung des gelösten Stoffs für IgG beträgt mehr als 98%, wobei die Endkonzentration des IgG 3,36 mg/ml beträgt.
- Säule: Mono Q HR5/5 (Pharmacia)
- Puffer A: 20 mMTEA, pH 7,7
- Puffer B: 20 mM TEA, 1 M NaCl, pH 7,7
- Flußrate: 1 ml/min
- Detektion: UV 280 nm
- Gradient: linear 2% / Minute
- Ergebnis: Reinheit > 95%
- Säule: Zorbax GF250, 9,4 · 250 mm
- Puffer: Natriumphosphat 0,1 M, 0,2 M NaCl, pH 7,0
- Flußrate: 1 ml/min
- Detektion: UV 280 nm
- Ergebnis: Reinheit > 95%
- Die Experimente werden unter reduzierenden Bedingungen gemäß dem Verfahren von Lämmli mittels, 10% Acrylamidgelen durchgeführt (die Ergebnisse sind in Fig. 10 gezeigt).
- Die monoklonalen Antikörper BR55-2 der Maus sind beispielsweise jeweils von den Hybridomen BR55.2 (BR55-2/IgG3) und BR55.2S2a (BR55-2/IgG2a) erhältlich.
- Diese Hybridome wurden ursprünglich jeweils am 17. Februar 1987 und 10. März 1987 bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD 20852, USA mit den Maßgaben des Budapester Vertrags jeweils unter den Hinterlegungsnummern ATCC HB 9324 und ATCC HB 9347 hinterlegt.
Claims (10)
1. Monoklonale antiidiotypische, ein internes Abbild darstellende Antikörper der Maus (Ab2) gegen die
monoklonalen Antikörper BR55-2 (ATCC HB9324) (Ab1).
2. Verfahren zur Herstellung von antiidiotypischen Antikörpern nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch
Immunisierung von Mäusen mit einem BR55-2/Maus-IgG3-F(ab')&sub2;-KLH Konjugat, Fusion der Mausmilzzellen mit der
Mausmyelomzellinie SP2/0, Auswahl der kultivierten Hybridomzellen, die IgG mit einer Hemmkapazität
(Hemmung der Bindung des Maus IgG2a BR55-2 an die SKBR5 Zellinie) von mehr als 95% bilden,
Reinigung und Isolierung des antiidiotypischen Antikörpers.
3. Antiidiotypischer Antikörper nach Anspruch 1 zur Verwendung bei der Herstellung eines Arzneimittels zur
prophylaktischen und/oder therapeutischen Immunisierung gegen HIV Infektionen.
4. Antikörper nach Anspruch 1, der anti-id BR55-2 Nr. E4 ist.
5. Pharmazeutische Zusammensetzung, die als Wirkstoff einen antiidiotypischen Antikörper nach Anspruch 1
zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Adjuvans, Träger oder Verdünnungsmittel zur
Verwendung bei der prophylaktischen und/oder therapeutischen Immunisierung gegen HIV-Infektionen enthält.
6. Antiidiotypischer Antikörper nach Anspruch 1 zur Verwendung bei der Herstellung eines Arzneimittels zur
Immunisierung gegen Krebs epithelialen Ursprungs und gegen kleinzelligen Lungenkrebs.
7. Pharmazeutische Zusammensetzung, die als Wirkstoff einen antiidiotypischen Antikörper nach Anspruch 1
zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Adjuvans, Träger oder Verdünnungsmittel zur
Verwendung bei der Immunisierung gegen Krebs epithelialen Ursprungs und gegen kleinzelligen Lungenkrebs enthält.
8. Verwendung von antiidiotypischen Antikörpern nach Anspruch 1 zur quantitativen Bestimmung von
monoklonalen Antikörpern, ihren Derivaten oder Fragmenten mit der Bindungsspezifität von BR55-2.
9. Verwendung von antiidiotypischen Antikörpern nach Anspruch 1 zur quantitativen Bestimmung von
monoklonalen Maus/Mensch-Chimären von BR55-2 und vollkommen humanisierten Varianten von BR55-2.
10. Verwendung von antiidiotypischen Antikörpern nach Anspruch 1 für eine Einschrittimmunreinigung von
Varianten von BR55-2.
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