DE69718150T2 - Peptid-immunogene zur schutzimpfung gegen und behandlung von allergien - Google Patents
Peptid-immunogene zur schutzimpfung gegen und behandlung von allergienInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft Peptidimmunogene und zielt auf die Hemmung der Wechselwirkung, die normalerweise die Auslösung von Mastzellen und Basophilen verursachen würde, die durch zellgebundenes mit einem Allergen verknüpftes IgE hervorgerufen wird, was zur Freisetzung von pharmakologisch aktiven Mediatoren wie auch zur de novo Synthese von Cytokinen führt, die bei der Regulation der allergischen und entzündlichen Reaktionen beteiligt sind. Sie betrifft immunogene Moleküle, die einen Rest eines BSW17 Mimotoppeptids umfassen und ihre Verwendung.
- Allergische Symptome werden durch die Freisetzung von pharmakologisch aktiven Mediatoren, vor allem Histamin, Leukotriene und Enzyme, aus den Zellen in das umgebende Gewebe und die vaskulären Strukturen herbeigeführt. Diese Mediatoren werden normalerweise in speziellen Zellen gelagert oder de novo synthetisiert, die als Mastzellen oder basophile Granulozyten bekannt sind. Mastzellen sind im ganzen Tiergewebe verteilt, während Basophile in den Gefäßen zirkulieren. Diese Zellen synthetisieren und lagern Mediatoren in der Zelle falls keine spezialisierte Ereignissequenz auftritt, um deren Freisetzung auszulösen.
- Die Rolle der Immunglobulin E Antikörper (IgE) bei der Vermittlung von allergischen Reaktionen ist gut bekannt. IgE ist eine komplexe Anordnung von Polypeptidketten, die wie bei anderen Immunglobulinen aus zwei leichten und zwei schweren Ketten bestehen, die durch eine "Y" förmige Konformation durch Disulfidbrücken zusammengehalten werden. Jede leichte Kette hat zwei Domänen, eine variable Domäne (VL), die an eine Domäne mit einer relativ invarianten Anxinosäuresequenz gebunden ist, die konstante Domäne genannt wird (CL). Schwere Ketten haben im Gegensatz dazu eine variable Domäne (VH) und im Fall von IgE vier konstante Domänen (CH1, CH2, CH3 und CH4, die auch bekannt sind als Cε1, Cε2, Cε3 und Cε4). Die zwei "Arme" des Antikörpers sind für die Antigenbindung verantwortlich, wobei die Polypeptidstruktur variiert und Fab' Fragmente oder F(ab')&sub2; genannt werden, das zwei durch Disulfidbindungen verbundene Fab' Arme darstellt. Der "Schwanz" oder die zentrale Achse des Antikörpers enthält eine fixierte oder konstante Sequenz an Peptiden und wird Fc Fragment genannt. Das Fc Fragment enthält interaktive Stellen, die es dem Antikörper ermöglichen, mit den anderen Molekülen des Immunsystems oder mit Zellen durch die Bindung an ihre Fc Rezeptoren zu kommunizieren.
- Fc Rezeptoren sind Moleküle, die spezifisch an aktive molekulare Stellen innerhalb der Fc Regionen des Inunungloulins binden. Fc Rezeptoren können als integrale Membranproteine innerhalb einer äußeren Plasmamembran der Zelle vorkommen oder können als frei "lösliche" Moleküle vorkommen, die im Blutplasma oder in anderen Körperflüssigkeiten zirkulieren. Im humanen System wird die hochaffine Bindung von IgE an den Rezeptor FcεRI durch eine sehr komplexe Protein-Protein-Wechselwirkung erreicht, die verschiedene Teile der 3. Domäne konstanten Region der schweren Kette (Cε3) von IgE und der membranproximalen Immunglobulin-ähnlichen Domäne (α2) der FCεRTα Untereinheit umfaßt.
- Obwohl Reste innerhalb der Cε3 Domäne der konstanten Region der schweren IgE Kette und Regionen, die zur α2 Domäne des FCεRIα Rezeptors gehören, als für die Bindung wichtig identifiziert wurden, bleibt der exakte Mechanismus des Bindungsprozesses immer noch unbekannt. Durch Fluoreszenzenergietransfermessungen wie auch Röntgen und Neutronenbeugung wurde eine experimentelle Evidenz geliefert, daß humanes IgE eine gebogene Struktur annimmt, die zur einzigartig hohen Affinität von IgE für FcεRIα beitragen dürfte (Kd~10&supmin;¹&sup0; M). Darüberhinaus dürfte die gebogene Struktur für den äquimolaren Komplex zwischen IgE und zellgebundenem oder löslichem FCεRIα verantwortlich sein, obwohl das IgE Molekül identische Epitope auf den zwei Cε3 Domänen für die Rezeptorbindung bereitstellen würde. Diese Monovalenz ist eine funktionelle Notwendigkeit, falls die Rezeptorauslösung in Abwesenheit von Allergen vermieden werden soll (Fig. 1). Interaktive Stellen können in Abhängigkeit ihrer Funktion bereits exponiert und daher zur Bindung von zellulären Rezeptoren fähig sein. Alternativ dazu können sie verborgen sein bis der Antikörper an das Antigen bindet, wonach der Antikörper seine Struktur ändern kann und anschließend andere aktive Stellen exponieren kann, die dann eine spezifische Immunaktivität auslösen. Auf der Grundlage von Daten, die aus Zirkulardichroismusspektren erhalten wurden wurde eine Konformationsänderung, die Cε3 betrifft, nach der Rezeptorbindung als Erklärung für die 1 : 1 Stöchiometrie des Fcε/FcεRI Komplexes auf der Zelloberfläche vorgeschlagen.
- Für eine allergische (immunologische) Freisetzung von Histamin innerhalb des Organismus aus Mastzellen und Basophilen muß ein IgE Molekül mit dessen Fc Teil an die zelluläre Fc Rezeptorstelle andocken oder daran binden, was das IgE Molekül an die Mastzelle oder den Basophilen anbindet. Die Fab' Teile der zellgebundenen IgE Moleküle müssen durch ein bestimmtes kompatibles Antigen (das Allergen) quervernetzt werden. Wenn eine solche Wechselwirkung auftritt, wird die Mastzelle oder der Basophile automatisch veranlaßt, Histamin in die lokale Umgebung auszuschütten, was die bekannten Allergiesymptome hervorruft. Es folgen andere biochemische Ereignisse in einer Spätphasenreaktion, die zu einer de novo Synthese und Freisetzung von Cytokinen und anderen Mediatoren führt [J. V. Ravetch und J. P. Kinet, Ann. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492].
- Herkömmliche Ansätze für eine Allergiebehandlung umfassen eine systemische Therapie mit Antihistaminika oder Steroiden oder Versuche zur Desensibilisierung der Patienten, wobei diese Ansätze aber nicht auf die grundlegende Wechselwirkung IgE-Mastzelle/Basophiler angesetzt sind. Andere Ansätze haben sich mit der Herstellung von Polypetidketten beschäftigt, die zur Blockierung der Bindung des IgE Antikörpers an die Fc Rezeptoren auf der Zelloberfläche und die Verdrängung des IgE aus den Bindungsstellen fähig sind, an die IgE bereits gebunden ist. Darüberhinaus wurden viele Untersuchungen durchgeführt, um die Art einer putativen "Effektorstelle" innerhalb der IgE Fc Region zu definieren, die ein immunologisches Signal liefern könnte, welches bei den Mastzellen/Basophilen die Mediatorfreisetzung auslöst.
- Die Verwendung rekombinanter IgE Fragmente als Immunogene zur Erzeugung eines schützenden anti-IgE Impfstoffs wurde ebenfalls versucht und hat sich als wirksam erwiesen. Das Hauptargument gegen einen solchen Impfstoff resultiert aus der Angst, daß große IgE Fragmente für die Immunisierung nicht nur die Bildung von hemmenden Antikörpern auslösen könnten, sondern auch eine Quervernetzung und hierdurch anaphylaktogene Antikörper in den Patienten erzeugen könnten (Fig. 2).
- Eine Strategie, dieses Problem zu überwinden, würde auf die Identifizierung des kleinstmöglichen IgE Fragments abzielen, das nur aus der Rezeptorbindungsstelle besteht, die nach der Bindung am IgE/FcεRI Komplex begraben ist und daher nicht länger für eine Quervernetzung durch die Impfstoff bedingte Immunreaktion für eine Quervernetzung verfügbar ist. Versuche zur Konstruktion einer solchen komplexen Moleküleinheit scheinen in Anbetracht der Raumabstände der verschiedenen Cε3 Regionen nicht erfolgreich zu sein, die bei der IgE/FcεRI Wechselwirkung beteiligt sind.
- Es wurde nun festgestellt, daß die intrinsisch mit dem "klassischen" Impfstoffansatz verbundenen Probleme unter Verwendung von BSW17 Mimotopen für eine aktive Immunisierung entweder als chemisch synthetisierte Peptide, die an geeignete Träger gekuppelt sind, oder als rekombinante Fusionskonstrukte (beispielsweise mit Ovalbumin, IgG usw.) überwunden werden können.
- BSW17 ist ein monoklonaler Antikörper, der ein Konformationsepitop auf Fcε erkennt, wobei zumindest ein Teil innerhalb von Cε3 liegt. Die Hybridomzellinie, die den monoklonalen Antikörper BSW17 bildet, wurde am 19. Dezember 1996 bei der ECACC unter den Maßgaben des Budapester Vertrags über die Hinterlegung von Mikroorganismen unter der Hinterlegungsnummer 96121916 hinterlegt. Dieser Antikörper zeigt ein interessantes Profil an biologischen Aktivitäten, wie sie in Fig. 3 zusammengefaßt sind. BSW17 oder BSW17-ähnliche Antikörper, die im Kreislaufsystem zirkulieren, schützen vor allergischen Reaktionen durch
- a) Hemmung der Auslösung von Mastzellen und Basophile durch die kompetitive Hemmung der IgE/IgERI Wechselwirkung, und
- b) Verringerung der Serum IgE Spiegel durch das Herabregulieren der IgE Synthese auf B-Zellebene.
- Es wurden nun BSW17 "Mimotoppeptide" durch Screenen einer zufälligen Phagenpeptidbank identifiziert, das heißt Peptide, die zumindest einen Teil des komplexen Konformationsepitops auf dem IgE Molekül nachahmen. Chemisch synthetisierte Mimotoppeptide, die an ein immunogenes Trägerprotein gekuppelt werden, können beispielsweise als Impfstoffe für die spezifische Erzeugung von Antikörpern in einem allergischen Wirt verwendet werden, die die Auslösung von Mastzellen/Basophilen durch die Blockierung der IgE/FcεRIα Bindung und/oder IgE Synthese hemmen. Als Mimotope eines anti-IgE Antikörpers induzieren sie eine Immunreaktion, die zur Bildung der BSW17-ähnlichen Antikörper im Wirt führt. Da von BSW17 gezeigt wurde, daß er nicht anaphylaktogen ist und gegenüber der IgE/FCεRI Bindung und der IgE Synthese auf B Zellen hemmend wirkt, haben die Antikörper, die gegen die auf dem BSW17 Mimotop basierenden Impfstoffe gebildet werden, analoge Schutzeigenschaften. Die Immunreaktion ist sehr spezifisch, da im Gegensatz zum "klassischen Impfansatz" keine von IgE abgeleiteten Fragmente vorhanden sind, die quervernetzende Antikörper in den immunisierten Patienten erzeugen könnten (Fig. 4).
- Die Erfindung betrifft daher immunogene Moleküle, die umfassen
- (a) zumindest einen Rest eines BSW17 Mimotoppeptids mit der ECACC Hinterlegungsnummer 96121916 mit insgesamt bis zu 15 Aminosäuren, das geeigneterweise weitere Komponenten für die Hapten-Trägerbindung umfaßt, um die Kupplung an die Komponente (b) oder das weitere Prozessieren zu vereinfachen, oder wenn das BSW17 Mimotoppeptid cyclisch ist, kann es die zwei Enden durch zwei zusätzliche Cysteinreste zusammenhalten, die eine Disulfidbrücke bilden, oder chemisch vernetzt sein, oder wenn das BSW17 Mimotoppeptid linear ist, kann es die carboxyterminale Aminosäure in amidierter Form blockiert aufweisen und/oder die aminoterminale Aminosäure in acetylierter Form blockiert aufweisen, oder kann durch ein oder zwei Hilfsgruppen und/oder eine zusätzliche Kupplungsgruppe flankiert sein, und
- (b) einen Rest der zur Auslösung einer Immunreaktion gegenüber diesem Peptid fähig ist, wobei die Komponente (a) nicht Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe ist, die hierin später kurz die "erfindungsgemäßen Immunogene" genannt werden.
- Die Verbindung (a) besteht vorzugsweise aus bis zu 5, vorzugsweise ein oder zwei, speziell einem Rest eines BSW17 Mimotoppeptids. Die Komponente (b) ist vorzugsweise ein herkömmlicher immunogener Träger, wie er später beschrieben wird, speziell BSA oder KLH.
- Das BSW17 Mimotoppetid in der Komponente (a) besteht vorzugsweise aus insgesamt etwa 15 Aminosäuren und es ist beispielsweise eine der später aufgeführten Sequenzen (A) bis (Q) (SEQ ID Nr. 1 bis Nr. 17). Jedoch kann es geeigneterweise weitere Komponenten für eine Hapten-Trägerbindung umfassen, um beispielsweise die Kupplung an die Komponente (b) oder eine weitere Prozessierung zu erleichtern. Wenn daher das BSW17 Mimotoppeptid cyclisch ist, können die zwei Enden beispielsweise durch 2 zusätzliche Cysteinreste unter Bildung einer Disulfidbrücke zusammengehalten werden oder die Enden können chemisch quervernetzt werden, beispielsweise mit Lysin, oder wenn das BSW17 Mimotoppeptid linear ist kann die carboxyterminale Aminosäure bequemerweise durch eine Amidierung blockiert werden und/oder die aminoterminale Aminosäure kann bequemerweise durch eine Acetylierung blockiert werden. Darüberhinaus können die BSW17 Mimotoppeptidreste in Komponente (A), beispielsweise die hierin später bevorzugten Reste (A) bis (Q) in den Immunogenen der Erfindung durch wenige, beispielsweise ein oder zwei zusätzliche Hilfsgruppen flankiert sein, wie Acetyl, Cystein oder Lysin und/oder eine zusätzliche Kupplungsgruppe, wie DC oder BSS, wie dies beispielsweise für spezifische Immunogene der Erfindung beschrieben ist wie sie im späteren Beispiel 8 als Konjugate (2) bis (4), (6) bis (11), (13) und (14) beschrieben sind.
- Die durch die erfindungsgemäßen Immunogene hervorgerufenen Antikörper sind im Gegensatz zu den durch das Hybridom BSW17 gebildeten Antikörper endogen und so können sie bei einem Patienten für eine prophylaktische Behandlung verwendet werden.
- Sie können durch geeignete Kupplung der Komponenten (a) und (b) hergestellt werden, wie dies oben definiert ist.
- Die erfindungsgemäßen Immunogene liegen beispielsweise in Form eines polymeren Peptids oder eines rekombinanten Fusionsproteins vor, wobei eine monomere Komponente des polymeren Peptids oder eines Partners des Fusionsproteins einen Rest eines BSW17 Mimotoppeptids (a) darstellt und der Rest des polymeren Peptids oder Fusionsproteins den Rest (b) darstellt, der die Immunreaktion auslöst.
- Sie liegen speziell in Form eines Konjugats von zumindest einem BSW17 Mimotoppetidrest (a) und einem immunogenen Trägerrest (b) vor.
- Bevorzugte BSW17 Mimotoppeptidreste, das heißt die Komponente (a) der erfindungsgemäßen Immunogene besteht aus einer der folgenden Aminosäuren oder enthält diese
- Am bevorzugtesten sind (A), (D) und (G), speziell (A) und (D).
- Die Erfindung betrifft auch pharmazeutische Zusammensetzungen, speziell Impfstoffe, die wie oben definierte Immunogenmoleküle und ein Adjuvans enthalten.
- Sie betrifft auch Liganden, das heißt Antikörper oder Fragmente hiervon, die gegen BSW17 Mimotoppelide gerichtet sind, die in einer "passiven Immunisierung" (siehe später) verwendet werden, wobei der Antikörper oder die Antikörperfragmente auch das natürliche Epitop für BSW17 auf humanem IgE erkennen, das heißt sie betrifft Liganden, die eine Antikörperdomäne umfassen, die für einen Rest eines wie oben definierten BSW17 Mimotoppetids spezifisch ist, wobei die Antikörperdomäne auch innerhalb der Aminosäuresequenz der schweren Kette von IgE reaktiv ist, die das von BSW17 erkannte natürliche Epitop umfaßt. Solche Liganden können in Säugern als polyklonale oder monoklonale Antikörper erzeugt werden, wobei sie vorzugsweise in Form von monoklonalen Antikörpern vorliegen, vorzugsweise in Form eines Fab' Fragments oder eines F(ab')&sub2; Fragments hiervon.
- Sie betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Immunogens, das die geeignete Kupplung von
- (a) zumindest einem Rest eines BSW17 Mimotoppeptids mit
- (b) einem Rest, der zur Auslösung einer Immunreaktion gegenüber diesem Peptid fähig ist umfaßt.
- Sie betrifft auch wie oben definierte immunogene Moleküle zur Verwendung bei der Herstellung eines Pharmazeutikums zur Behandlung von IgE-vermittelten Erkrankungen, wie Allergie und atopische Dermatitis.
- Sie betrifft ferner auch die Verwendung von wie oben definierten immunogenen Molekülen zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, speziell Impfstoffen, gegen IgE-vermittelte Erkrankungen, insbesondere Allergie und atopische Dermatitis.
- Sie betrifft ferner ein Verfahren zur prophylaktischen oder heilenden Immunisierung gegen IgE-vermittelte Erkrankungen, wie Allergien und atopische Dermatitis, die die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge von wie oben definierten immunogenen Molekülen an einen Patienten umfaßt, der einer solchen Behandlung bedarf.
- Die erfindungsgemäßen Immunogene sind, während sie im wesentlichen unfähig sind zur Vermittlung einer nicht-cytolytischen Histaminfreisetzung, zur Hervorrufung von Antikörpern mit starker serologischer Kreuzreaktivität mit den Zielaminosäuresequenzen der Fc Region von IgE fähig. Sie sind daher als oder in Impfstoffen brauchbar.
- Die anfängliche Dosis des Immunogens (beispielsweise von etwa 0,2 mg bis etwa 5 mg, speziell etwa 1 mg) wird beispielsweise intramuskulär verabreicht, gefolgt von wiederholten (Booster)Dosierungen desselben 14 bis 28 Tage später. Die Dosen hängen in gewissen Ausmaß vom Alter, Gewicht und der allgemeinen Gesundheit des Patienten ab. Die Immunisierung kann "aktiv" oder "passiv" sein.
- Bei einer aktiven Immunisierung erhält der Patient das erfindungsgemäße Immunogen und hierbei wird eine anti-hIgE Reaktion aktiv im Immunsystem des Patienten induziert.
- Die "passive" Immunisierung wird durch die Verabreichung von anti-BSW17 Mimotopantikörper, entweder polyklonal oder monoklonal, an einen Patienten vorzugsweise durch Injektion erreicht, der an einer IgE- vermittelten Erkrankung leidet.
- Die polyklonalen anti-BSW17 Mimotopantikörper können durch die Verabreichung eines erfindungsgemäßen Immunogens, vorzugsweise mittels eines Adjuvans an einen Säuger, der kein Mensch ist, und die Gewinnung des entstehenden Antiserums hergestellt werden. Es können verbesserte Titer durch wiederholte Injektionen über einen Zeitraum erhalten werden. Es gibt keine besondere Beschränkung bezüglich der Art des Säugers, die zur Hervorrufung der Antikörper verwendet wird, wobei es im allgemeinen bevorzugt ist, Kaninchen oder Meerschweinchen zu verwenden, aber Pferde, Katzen, Hunde, Ziegen, Schweine, Ratten, Kühe, Schafe usw. können auch verwendet werden. Bei der Herstellung von Antikörpern wird eine definierte Menge an erfindungsgemäßem Immunogen beispielsweise mit physiologischer Kochsalzlösung auf eine geeignete Konzentration verdünnt und die entstehende verdünnte Lösung wird mit komplettem Freundschen Adjuvans unter Bildung einer Suspension gemischt. Die Suspension wird Säugern verabreicht, beispielsweise intraperitoneal, beispielsweise einem Kaninchen, wobei etwa 50 ug bis etwa 2500 ug erfindungsgemäßes Immunogen pro Verabreichung verwendet werden. Die Suspension wird vorzugsweise alle zwei Wochen über einen Zeitraum von etwa 2-3 Wochen, vorzugsweise etwa 1 Monat verabreicht, um die Immunisierung zu bewirken. Der Antikörper wird durch die Gewinnung von Blut aus dem immunisierten Tier nach einer Passage von 1 bis 2 Wochen nach der letzten Verabreichung, Zentrifugation des Bluts und Isolierung des Serums aus dem Blut gewonnen.
- Monoklonale anti-BSW17 Mimotopantikörper können beispielsweise vom Menschen oder der Maus sein. Vorzugsweise wird der Patient mit einer Fab' Fragmentpräparation des monoklonalen Antikörpers von der Maus oder einem chimären Mensch-Maus-Antikörper (der aus der humanen Fc Region und der Maus-Fab' Region besteht) behandelt, um jegliche schädliche Reaktion gegenüber dem fremden, tierischen Immunoglobulin zu minimieren. Monoklonale Antikörper der Maus können durch das Verfahren von Köhler und Milstein (G. Köhler und C. Milstein, Nature [1975] 495) hergestellt werden, beispielsweise durch die Fusion von Milzzellen von hyperimmunisierten Mäusen mit einer geeigneten Mausmyelomzellinie. Es können mehrere Verfahren verwendet werden, um humane monoklonale Antikörper zu erzeugen, einschließlich der Herstellung durch
- (1) Epstein Barr Virus (EBV) transformierte B-Zellen,
- (2) eine Zellinie für die B-Lymphozytenhybridisierung,
- (3) Mensch-Maus-Hybridome,
- (4) Mensch-Mensch-Hydridome,
- (5) Mensch · Mensch-Maus Heterohybridome, und
- (6) Repertoireklonierung (Phagendisplay).
- Mensch · Mensch-Maus Heterohybridome sind am meisten bevorzugt und umfassen die Kombination der zu bevorzugenden Eigenschaften von Ausgangszellinien sowohl vom Mensch als auch von der Maus. Mensch-Maus Heterohybridomzellinien wurden für die B-Zellfusion geeignet gemacht (N. N. M. Teng et al., Proc. Nad. Acad. Sci. USA 80 [1983] 7308).
- Wenn er zur Immunisierung verwendet wird, kann der Antikörper am bequemsten durch intramuskuläre Injektion in den Wirt eingeführt werden. Es kann jeder herkömmliche flüssige oder feste Träger verwendet werden, der für den Wirt annehmbar ist und keine schädlichen Effekte für den Wirt und auch keine schädlichen Effekte auf den Impfstoff hat. Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit einem physiologischen pH, beispielsweise etwa pH 6,8 bis 7,2, vorzugsweise etwa pH 7,0 kann als Träger alleine oder zusammen mit einem geeigneten Adjuvans, wie einem auf Aluminiumhydroxid basierenden Adjuvans verwendet werden. Die Konzentration des immunogenen Antigens kann von etwa 50 ug bis etwa 500 ug, vorzugsweise von etwa 200 ug bis etwa 300 ug pro Injektion in einem Lösemittelvolumen von im allgemeinen etwa 0,25 ml bis etwa 1 ml, vorzugsweise etwa 0,5 ml variieren. Es sind mehrfache Injektionen nach der anfänglichen Injektion erforderlich und können beispielsweise in jährlichen Intervallen verabreicht werden.
- Bezüglich der "aktiven" Immunisierung gilt, daß diese für den Menschen bevorzugt ist, aber es können andere Spezies ähnlich mittels analoger Mimotope behandelt werden, die dem IgE dieser Säugerspezies entsprechen, wie beispielsweise der Hund. Der Ausdruck "immunogener Träger", wie er hierin verwendet wird, umfaßt Materialien, die die Eigenschaft haben, unabhängig eine immunogene Reaktion in einem Wirtstier auszulösen und die kovalent an das Polypeptid entweder direkt oder durch die Bildung von Peptid- oder Esterbindungen zwischen den freien Carboxyl-, Amino- oder Hydroxylgruppen im Polypeptid und entsprechenden Gruppen im immunogenen Trägermaterial gekuppelt werden können oder alternativ dazu durch die Bindung über eine herkömmliche bifunktionelle Verbindungsgruppe, wie einem Fusionsprotein.
- Beispiele für solche Träger umfassen: Albumine, wie BSA, Globuline, Thyreoglobulin, Hämoglobine, Hämocyanine (insbesondere Keyhole Limpet Hemocyanin-Protein [KLH]), Proteine, die aus Ascaris extrahiert werden, beispielsweise Ascarisextrakte, wie sie beschrieben sind in J. Immun. 111 [1973] 260-268, J. Immun. 122 [1979] 302-308, J. Immun. 98 [1967] 893-900 und Am. J. Physiol. 199 [1960] 575-578 oder gereinigte Produkte hiervon, Polylysin, Polyglutaininsäure, Lysin-Glutaininsäure-Copolymere, Copolymer, die Lysin oder Ornithin enthalten, usw. Kürzlich wurden Impfstoffe mittels Diphtherietoxoid oder Tetanustoxoid als immunogenes Trägermaterial hergestellt (M. L. Lepow et al., J. of Infectious Diseases 150 [1984] 402-406, E. Coen Beuvery et al., Infection and Immunity 40 [1983] 39-45) und diese Toxoidmaterialien können auch in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Das gereinigte Proteinderivat von Tuberculin (PPD) ist insbesondere zur Verwendung als "aktives" Immunisierungsschema bevorzugt, da es (1) selbst keine T-Zellreaktion induziert (das heißt es ist in der Tat ein "T- Zellhapten") und verhält sich daher als vollkommen prozessiertes Antigen und wird von T-Zellen als solches erkannt, (2) bekanntermaßen eines der stärksten "Haptenträger" im gebundenen Erkennungsmodus ist und (3) beim Menschen ohne weitere Tests verwendet werden kann.
- Als Hapten-bindende Mittel können auch die verwendet werden, die bei der Herstellung von Antigenen herkömmlich verwendet werden, wie dies oben oder in den Beispielen beschrieben ist.
- Das erfindungsgemäße Verfahren zur kovalenten Kupplung der Komponente (a) an den Rest (b) kann auf bekannte Weise ausgeführt werden. So ist es beispielsweise für die direkte kovalente Kupplung bevorzugt, N-Succinimidylderivate, bevorzugter Bis(sulfosuccinimidyl)suberat (BSS) als Kupplungsmittel zu verwenden. Glutaraldehyd oder Carbodiimid, bevorzugter Dicyclohexylcarbodiimid (DC) oder 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)- carbodiimid können auch zur kovalenten Kupplung des Peptids (a) an das immunogene Trägermaterial (b) verwendet werden.
- Die Mengen an Hapten und Hapten-Träger-Bindungsmittel [das heißt der Komponente (a)] und an Träger [das heißt der Komponente (b)] können leicht auf herkömmliche Weise ermittelt werden. Es ist bevorzugt, daß der Träger in einer Menge von etwa einmal bis etwa sechsmal, vorzugsweise etwa einmal bis etwa fünfmal des Gewichts des Haptens verwendet wird und das Hapten-Träger-Bindungsmittel kann in einer Menge von etwa fünfmal bis etwa zehnmal des molaren Äquivalents des Haptens verwendet werden. Nach der Umsetzung wird der Träger über das Hapten-Träger-Bindungsmittel unter Bildung des gewünschten Antigens gebunden, das sich aus einem Peptid-Träger-Komplex zusammensetzt. Das entstehende Immunogen der Erfindung kann leicht auf herkömmliche Weise isoliert werden, beispielsweise durch Dialyse, Gelitration, fraktionierter Fällung usw.
- Die Herstellung der Ausgangsmaterialien kann auf herkömmliche Weise ausgeführt werden. Geeignete Peptide zur Verwendung als Komponente (a) können beispielsweise durch Screenen von zufälligen Peptidphagenbanken identifiziert und leicht synthetisiert werden, beispielsweise durch herkömmliche Festphasenverfahren, beispielsweise für cyclische Peptide durch das Festphasenverfahren unter Verwendung des gut bekannten "F-moc" Verfahrens, oder können alternativ dazu mittels einer peptidomimetischen Strategie durch Screenen von zufällig synthetisierten Peptiden identifiziert werden.
- Die folgenden Dokumente erläutern den Hintergrund des Stands der Technik, der in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung zitiert wird:
- D1: Celltech WO 95/14779 A und
- D2: Pasteur WO 95/20606 A.
- Fig. 1: Wechselwirkung zwischen IgE und dessen Hochaffinitätsrezeptor IgERI
- Fig. 2: "Klassischer" anti-IgE Impfstoffansatz
- Fig. 3: Biologisches Aktivitätsprofil von BSW17
- Fig. 4: BSW17 Mimotop-basierte Immuntherapie
- Fig. 5: Phagendisplay für BSW17 Mimotope, die speziell BSW17 erkennen
- Fig. 6: Phagendisplay BSW17 Mimotope, die die IgE/BSW17 Bindung hemmen
- Fig. 7: Bindung eines chemisch synthetisierten BSW17 Mimotoppetids an BSW17
- Fig. 8a: Erkennung des cyclischen BSW17 Mimotops GEFCINHRGYWVCGDPA-KLH (BSS) Konjugat (SDS 236) und Fcε (500-509)-KLH (BSS) Konjugat (SDS237) durch BSW17
- Fig. 8b: Erkennung von verschiedenen BSW17 Mimotopkonjugaten durch BSW17
- Fig. 9a: Spezifische Erkennung von BSW17 Mimotopkonjugaten [BSA(DC)] und des Fcε (500-509) Konjugats [KLH (Glutaraldehyd)] durch BSW17
- Fig. 9b: Spezifische Erkennung von BSW17 Mimotopkonjugaten [KLH(DC), Lys] durch BSW17
- Fig. 10a: Anti-human IgE Immunreaktion, die in Kaninchen nach der Immunisierung mit BSW17 Mimotopkonjugaten (1) induziert wird
- Fig. 10b: Anti-human IgE Immunreaktion, die in Kaninchen nach der Immunisierung mit BSW17 Mimotopkonjugaten (2) induziert wird
- Fig. 11: Serumtiter der anti-BSW17 Mimotopantikörper, die in Kaninchen durch Immunisierung erzeugt wurden
- Fig. 12: Isotypspezitität der anti-human IgE Reaktion in Kaninchen, die mit BSW17 Mimotop immunisiert wurden
- Fig. 13: Kompetition von anti-BSW17 Mimotopserum mit BSW17 um die IgE Bindung
- Fig. 14: Bindung von affinitätsgereinigtem anti-BSW17 Mimotopantikörpern an hIgE
- Fig. 15: Test der Kaninchen-anti BSW17 Mimotopseren und der affinitätsgereinigten anti-BSW17 Mimotopantikörper auf Anaphylaktogenität mit humanen Blutzellen:
- - R2/0, R4/0: Präimmunseren der Kaninchen R2 und R4 vor der Impfung mit BSW17 Mimotop
- - R2/SDS214, R4/SDS213: Seren von den Kaninchen R2 und R4 65 Tage nach der primären Immunisierung
- - antiSDS213, antiSDS214: Affinitätsgereinigte anti-BSW17 Mimotopantikörper
- - R2/0 PC, R4/0 PC: Positivauslösungskontrolle (PC) in Gegenwart von Kaninchenserum
- A = 0,1 ug anti-BSW17 Mimotopantikörper (oder Äquivalente in vollständigen Kaninchenseren) pro ml
- B = 1,0 ug anti-BSW17 Mimotopantikörper (oder Äquivalente in vollständigen Kaninchenseren) pro ml
- C = 5,0 ug anti-BSW17 Mimotopantikörper (oder Äquivalente in vollständigen Kaninchenseren) pro ml
- Ac Acetyl
- AMS Ammoniumsulfat
- BSA Rinderserumalbumin
- BSS Bis(sulfosuccinimidyl)suberat
- BSW17 ein monoklonaler IgG Antikörper, der gegen das CH&sub3; Epitop von nativem IgE gerichtet ist (J. Knutti-Müller et al., Allergy 41 [1986] 457-465, S. Miescher et al., Int. Arch. Allergy Immunol. 105 [1994] 75)
- BSW17 Mimotoppeptid ein Peptid, das das natürliche Epitop auf humanem IgE nachahmt, das vom monoklonalen anti-human IgE Antikörper BSW17 erkannt wird
- CFU Kolonie-bildende Einheiten
- DC Dihexylcarbodiimid
- EBV Eppstein-Barr Virus
- ELISA Enzym-gebundener Immunosorbenttest
- FcεRI Hochaffinitätsrezeptor I für die konstante Region von IgE
- FCS Fetales Kälberserum
- gam Ziege-anti-Maus
- gar Ziege-anti-Kaninchen
- h human
- HEPES N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure
- HRP Meerrettichperoxidase (= POX)
- HSA Humanes Serumalbumin
- IgE Immunglobulin E
- IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactosid
- KLH Keyhole Limpet Hämocyanin
- Le27 ein monoklonaler anti-human IgE Antikörper (Allergy [1986], siehe obige Literaturstelle, Int. Arch. Allergy Immunol. [1994], siehe obige Literaturstelle)
- LB-Platten Platten mit Luria-Bertani-Medium
- Mimotoppeptid ein Peptid, das zumindest einen Teil des Konformationsepitops eines Antikörpermoleküls nachahmt
- PBS Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung
- PEG Polyethylenglycol
- POX Meerrettichperoxidase (= HRP)
- PPD Gereinigtes Proteinderivat von Tuberkulin
- rh IL-3 rekombinantes, humanes Interleukin 3
- RIA Platten Radioimmuntestplatten
- RPMI1640 Standardzellkulturmedium (Sigma, St. Louis, USA)
- SB-Medium Sodium-Bacto-Medium (Pharmacia, Uppsala, Schweden)
- sLt lösliches Leukotrien
- TBS Tris-gepufferte Kochsalzlösung
- VCS VCS M13 Helferphage (Stratagene, USA)
- In den folgenden Beispielen, die die Erfindung erläutern aber ihren Schutzumfang nicht beschränken, sind die Temperaturen in Grad Celsius angegeben.
- Als Modell für das Testen der anti-allergischen Kapazität von BSW17 und BSW17-ähnlichen Antikörpern, die in Patienten durch die aktive Immunisierung mit BSW17 Mimotoppeptiden erzeugt werden, wird die Wirkung von BSW17 auf die Histaminfreisetzung von humanen, Basophilen-ähnlichen Zellen gezeigt, die aus Knochenmarkzellen erhalten werden, welche mit rh IL-3 kultiviert wurden.
- Es werden mononukleare Zellen durch Ficoll-Hypaque Dichtesedimentation (1,077 g/ml, 400 g) aus Knochenmark von Patienten präpariert, bei denen der Kopf des Femurknochens ausgetauscht werden muß. 5 · 10&sup5; Zellen/ml werden in RPMI 1640 Medium kultiviert, das 15% FCS und 2 ng/ml humanes rh IL-3 enthält. Nach 6 Tagen in Kultur bei 37ºC in 5% CO&sub2; wird ein gleiches Volumen an Medium zugegeben, das rh IL-3 enthält. Am Tag 12 werden die Zellen geerntet und für eine passive Sensibilisierung und einen Histaminfreisetzungstest verwendet. Etwa 5 · 10&sup5; kultivierte Knochenmarkzellen werden in HA Puffer (20 mM HEPES, pH = 7,4, 0,3 mg/ml HSA) mit 500 ng/ml an humanem IgE in Gegenwart oder Abwesenheit eines 50-fachen Überschusses an monoklonalem anti- IgE Antikörper in einem Gesamtvolumen von 1 ml inkubiert. Nach einer Inkubation für 2 Stunden bei 37ºC werden die Zellüberstände zur Messung von Histamin während einer passiven Sensibilisierung verwendet. Die Zellpellets werden verwendet, um die Histaminfreisetzung auszulösen. Um das Ausmaß an direkter Histaminfreisetzung zu bestimmen, werden die passiv sensibilisierten Knochnmarkzellen in 0,3 ml HCM Puffer (HA Puffer, der 0,6 M CaCl&sub2; und 1 mM MgCl&sub2; enthält) resuspendiert und mit 0,1 ug/ml des anaphylaktogenen monoklonalen anti-IgE Antikörpers Le27 inkubiert. Die Menge an Histamin im Überstand und im Zellsediment wird in einem Technicon Autoanalyser II (Technicon, Tarrytown, New York, USA) gemessen. Der Prozentsatz an Histaminfreisetzung wird berechnet [gemäß der Formel: Histaminfreisetzung (%) = Histamin im Überstand dividiert durch Histamin im Überstand + Histamin im Zellpellet multipliziert mit 100]. Der Prozentsatz an Histaminfreisetzung während der passiven Sensibilisierung wird berechnet [gemäß der Formel: Histaminfreisetzung (%) = Histamin im Überstand (nach der passiven Sensibilisierung) dividiert durch Histamin im Überstand (nach der Auslösung) + Histamin im Überstand (nach der Sensibilisierung) + Histamin im Zellpellet multipliziert mit 100]. Die anti-IgE Antikörper spezifische Histaminfreisetzung wird berechnet [gemäß der Formel: Spezifische Histaminfreisetzung (%) % an gesamter Histaminfreisetzung minus % spontaner Histaminfreisetzung].
- Die Ergebnisse von drei unabhängigen Experimenten sind in Tabelle 1 zusammengefaßt: Tabelle 1 Effekt der anti-IgE Antikörper auf die Histaminfreisetzung von sensibilisierten Knochenmarkzellen
- *) Humane Knochenmarkzellen, die mit rh IL-3 (2 ng/ml) kultiviert werden, werden passiv mit IgE (0,5 ug/ml) oder mit IgE und anti-IgE Antikörper (0,25 ug/ml) sensibilisiert
- **) A: Histaminfreisetzung während der Sensibilisierung
- B: Histaminfreisetzung nach der Auslösung mit dem monoklonalen anti-IgE Antikörper Le27 (0,1 ug/ml)
- Die Daten in Tabelle 1 zeigen deutlich, daß die mit IgE und BSW17 inkubierten Knochenmarkzellen während der Sensibilisierung kein Histamin freisetzen, sondern die anschließende Auslösung mit Le27 hemmen. Knochenmarkzellen, die mit IgE und Le27 inkubiert werden, werden bereits während der passiven Sensibilisierung in einem Ausmaß ausgelöst, daß nicht mehr Histamin während der zweiten Inkubation mit diesem anaphylaktogenen, monoklonalen Antikörper freigesetzt werden kann. Knochenmarkzellen, die passiv in Abwesenheit von beiden monoklonalen anti-IgE Antikörpern sensibilisiert werden, setzen jedoch Histamin nach einer anschließenden Auslösung mit Le27 wirksam frei.
- Es kann daraus geschlossen werden, daß a) BSW17 selbst nicht anaphylaktogen ist und b) BSW17 die humanen Basophilen vor einer Histaminfreisetzung schützt, die durch auslösende Mittel induziert wird. Daher sollte die Erzeugung von BSW17-ähnlichen Antikörpern bei allergischen Patienten durch eine aktive Immunisierung mit BSW17 Mimotoppeptiden die immunisierten Wirte vor der Entwicklung von allergischen Reaktionen schützen.
- Bakteriophagenpartikel, die spezifisch durch BSW17 erkannt werden, werden durch Screening von Phagenbanken identifiziert, die zufällige lineare oder zirkuläre Peptide mit einer Länge von 6 bis 15 Aminosäuren jeweils fusioniert an die Phagenpeptide pIII und pVIII präsentieren. Zur Amplifizierung von Phagenbanken werden 2 ml einer flüssigen Kultur von E. coli XL-1 Blue, die in SB Medium bis auf eine OD&sub6;&sub0;&sub0; = 1,0 angezogen wurde, mit 10¹&sup0; Pagen für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. 10 ml SB Medium, das 10 mg/ml Tetracyclin und 20 ug/ml Carbenicillin enthält, werden zugegeben und es werden jeweils 10 ul, 1 ul und 0,1 ul auf LB Platten plattiert, die 100 ug/ml Carbenicillin enthalten. Die Kultur wird bei 37ºC unter starkem Schütteln für eine Stunde inkubiert, dann werden 100 ml SB, die 10 ug/ml Tetracyclin und 50 ug/ml Carbenicillin enthalten, zugegeben und die Inkubation wird für 1 Stunde fortgesetzt. Es werden 10¹² CFU des VCS M13 Helferphagen zugegeben. Nach 2 Stunden unter starkem Schütteln bei 37ºC wird Kanamycin in einer Endkonzentration von 70 ug/ml zugegeben und die Inkubation wird über Nacht fortgesetzt. Nach der Zentrifugation bei 4000 · g und 4ºC für 20 Minuten werden die Überstände mit 38 ml einer eiskalten, sterilfiltrierten Lösung aus 12% NaCl und 16% PEG 8000 gemischt, für 30 Minuten auf Eis gekühlt und für 30 Minuten bei 10 000 · g bei 4ºC zentrifugiert. Das Phagenpellet wird in 2 ml TBS solubilisiert, worin 1,5% Casein enthalten sind, und bei 4ºC gelagert. Für das Bioscreening werden Costar RIA Platten (Costar 3690) über Nacht bei 4ºC mit 20 ug/ml BSW17 in 0,1 M Carbonatpuffer mit pH 9,6 beschichtet und danach mit TBS blockiert, der 1,5% Casein enthält. 2 · 10¹¹ CFU an Phagen werden zugegeben und bei 37ºC für 2 Stunden inkubiert und dann zehnmal mit PBS/0,1% Tween 20 gewaschen. Die Vertiefungen werden mit Wasser gespült und die gebundenen Phagen werden mit insgesamt 200 ul an 0,1 M HCl mit pH 2,2 für 10 Minuten eluiert. Die eluierten Phagen werden mit 2 M Trisbase neutralisiert und wie oben beschrieben amplifiziert.
- Für die Selektion von positiven Klonen werden 50 ul einer E. coli XL1 blue Flüssigkultur, die in SB Medium bis OD&sub6;&sub0;&sub0; = 1,0 angezogen wurde, mit 1 ul einer 10&supmin;&sup8; Verdünnung von amplifizierten Phagen nach der 3. Screeningrunde für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, auf LB Platten plattiert, die 100 ug/ml Carbenicillin enthalten, plattiert und über Nacht angezogen. Die Kolonien werden zufällig gepickt und auf LB Platten plattiert, die 100 ug/ml Carbenicillin enthalten. Nach 4 Stunden bei 37ºC werden Nitrocellulosefilter, die mit 10 mM IPTG befeuchtet sind, aufgelegt und die Inkubation wird über Nacht bei 32ºC fortgesetzt. Die Filter werden entfernt und für 30 Minuten bei 37ºC in einer CHCl&sub3; Atmosphäre inkubiert. Der Bakteriendebris wird durch die Inkubation der Filter in 50 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl&sub2;, 3% BSA, 100 E DNase I und 40 mg Lysozym pro 100 ml für 1 Stunde entfernt, in TBS abgeblockt, worin 1,5% Casein enthalten sind, und über Nacht mit BSW17-POX (BSW17 gekuppelt an POX) in TBS inkubiert, worin 1,5% Casein enthalten sind. Die Filter werden mit TBS, TBS/ 0,5% Tween 20 und dann TBS jeweils für 10 Minuten gewaschen. Für die Färbung werden die Streifen in 600 ug 4-Chlor-1-naphthol pro ml und 0,042% Wasserstoffperoxid in TBS inkubiert.
- Es wurden verschiedene Phagenpartikel gefunden, die zirkuläre Peptide, welche aus sieben, acht oder neun Aminosäuren bestehen, und lineare Peptide präsentieren, die aus zehn und fünfzehn Aminosäureresten bestehen, welche an BSW17 binden. Die Nukleotidsequenz der DNA, die diese Peptide kodiert, wird bestimmt. Gemäß ihrer Homologie untereinander wie auch gegenüber homologen Regionen innerhalb von Fcε, können 3 Gruppen an Phagen von der DNA Sequenz abgeleitet werden, die Peptide präsentieren, welche von BSW17 erkannt werden. Ein Überblick wird in Tabelle 2 gegeben. Tabelle 2 Peptidsequenzen, die von BSW17 Mimotopphagen präsentiert werden Gruppe A:
- + = positiv geladen
- p = ungeladen polar
- o = nicht polar
- n = Anzahl an Klonen, die die entsprechende Sequenz zeigen
- +(++), +/- = Intensität der Erkennung durch BSW17
- (das heißt jeweils SEQ ID Nr. 18, Nr. 19, Nr. 20 und Nr. 21)
- Das zweite Peptid der obigen Gruppe A (SEQ ID Nr. 19) ist das Peptid (A) (SEQ ID Nr. 1) mit zwei zusätzlichen Cys zur Zirkularisierung. Die anderen drei Peptide, nämlich jeweils SEQ ID Nr. 18, SEQ ID Nr. 20 und SEQ ID Nr. 21 sind weitere ähnlich hergestellte Peptide. Gruppe B:
- Die drei Peptide der obigen Gruppe B sind jeweils die Peptide (G) (SEQ ID Nr. 7), (H) (SEQ ID Nr. 8) und (I) (SEQ IDNr. 9). Gruppe C:
- Die 7 Peptide der obigen Gruppe C sind jeweils das Peptid (O) (SEQ ID Nr. 15), das Peptid (J) (SEQ ID Nr. 10), das Peptid (P) mit zwei zusätzlichen Cys (SEQ ID Nr. 22). Das Peptid (L) mit zwei zusätzlichen Cys (SEQ 1D Nr. 23), das Peptid (M) mit zwei zusätzlichen Cys (SEQ ID Nr. 24), das Peptid (I) mit zwei zusätzlichen Cys (SEQ ID Nr. 25) und das Peptid (K) mit zwei zusätzlichen Cys (SEQ ID Nr. 26). Die Peptide der Gruppe C, die flankierende Cys enthalten, sind starke BSW17 Binder. Die gesamte Gruppe C zeigt keine Sequenzhomologie mit Fcε, wobei die Peptide ausgezeichnete Mimotope sind, die das BSW17 Epitop nur strukturell nachahmen.
- Wie es aus der Tabelle 2 ersichtlich ist, sind die carboxyterminalen Teile der Peptide von der Gruppe A hochkonserviert und die aminoterminalen Teile enthalten, wenn sie auch degenerierter sind, positiv geladene, polare Aminosäuren. Diese Ladungsverteilung scheint für die BSW17 Erkennung essentiell zu sein, da ein Klon, der sich im Aminoterminus von diesem Merkmal unterscheidet, nur sehr schwach an BSW17 bindet. Man findet keine aufeinanderfolgende Abfolge von Aminosäuren mit einer signifikanten Sequenzhomologie in Fcε. Ein Vergleich durch Musterähnlichkeit erlaubt jedoch die Zuordnung dieser Peptide zu einer Abfolge an Aminosäuren, die von Position 500 bis 508 in der Cε4 Domäne reicht. Es wurde von Stanworth et al. [Lancetz 336 (1990) 1279] postuliert, daß das Decapeptid Fcε 500-509 in der Mastzellauslösung durch rezeptorgebundenes IgE beteiligt ist.
- Peptide, die zur Gruppe B gehören, sind auch untereinander hoch homolog. Darüberhinaus ist der aminoterminale Teil fast identisch mit den Aminosäurepositionen 370-375 von Fcε. Diese Sequenz ist Teil von Cε3 und enthält oder ist benachbart zu einer Region, von der gezeigt wurde, daß sie bei der Bindung von IgE an dessen Hochaffinitätsrezeptor beteiligt ist. Diese Feststellung erklärt die Hemmung der IgE/IgERI Wechselwirkung durch BSW17.
- Es kann geschlossen werden, daß das komplexe Konformationsepitop, das von BSW17 erkannt wird, Konformationsstrukturen enthält, die von der Aminosäureabfolge 500-508 (innerhalb von (Cε4) und 370-375 (innerhalb von Cε3) des IgE Moleküls repräsentiert wird (Nummerierung gemäß E. A. Padlan und D. R. Davies, Molecul. Immunol. 23 (1986) 1063). Antikörper, die in einem Individuum durch die Immunisierung mit Mimotopen aus den obigen Gruppen A und B gekuppelt an ein immunogenes Trägermolekül erzeugt werden, schützen daher vor allergischen Reaktionen durch die Blockierung der Bindung von IgE an dessen Hochaffinitätsrezeptor und/oder vor der Auslösung der Degranulierung von Zielzellen.
- Die in Gruppe C der Tabelle zusammengefaßten Peptide zeigen keine signifikanten Homologien untereinander und auch nicht mit Fcε. Daher repräsentieren sie "eimnalige Mimotope", die die dreidimensionale Struktur nachahmen, die von BSW17 erkannt wird. Die Verwendung dieser Mimotope als Immunogene führt daher auch zur Erzeugung von anti-allergischen, BSW17-ähnlichen Antikörpern im immunisierten Wirt.
- Die Erzeugung einer BSW17-ähnlichen Immunantwort, die spezifisch gegen das BSW17 Epitop auf humanem IgE gerichtet ist, ist für ausgewählte Mimotope in den folgenden Beispielen 4 bis 6 gezeigt:
- Die Bindung der von den Phagenpartikeln präsentierten Mimotoppeptide (Gruppe A der Tabelle 2: Erster Klon = Klon 1 in Fig. 5 = Cys-Arg-Arg-His-Asn-Tyr-Gly-Phe-Trp-Val-Cys = SEQ ID Nr. 18, zweiter Klon = Klon 18 in Fig. 5 = Cys-Ile-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val-Cys = SEQ ID Nr. 19) an die antigenspezifischen hypervariablen Regionen von BSW17 wird durch ELISA gezeigt. 10 ug von BSW17 und verschiedene monoklonale Antikörper werden auf die Vertiefungen von COSTAR Platten beschichtet, wonach Standard ELISA Verfahren folgen. Nach dem Blockieren mit BSA werden die Vertiefungen mit 100 ul Standard-ELISA-Inkubationspuffer inkubiert, der die Bakteriophagenpartikel enthält, die von Phagen-infizierten Bakterienkulturüberständen mit einem Phagentiter von 10&sup9; CFU/ml erhalten werden. Nach dem Waschen werden die Platten mit 5 ug Meerrettichperoxidase (HRP)-gekuppeltem anfi-M13 Antiserum (Pharmacia, Uppsala, Schweden) in Inkubaionspuffer inkubiert. Alle Inkubationen werden bei Raumtemperatur für 1 Stunde ausgeführt. Nach dem letzten Waschschritt werden Phagenpartikel, die an die beschichteten Antikörper gebunden sind, über das gebundene HRP-anti M13 Serum durch die Entwicklung eines chromogenen Substrats gemäß einem Standard-ELISA-Verfahren visualisiert. Die Fig. 5 zeigt, daß Mimotopphagen sehr spezifisch an BSW17 und an keine anderen Antikörper binden, wie 8E7, 3G9 und 5H10, die auch monoklonale anti-Cε3 Antikörper sind und die mittels rekombinantem Cε3 als Immunogen erzeugt wurden, noch an 5H5/F8, der einen weiteren monoklonalen Antikörper darstellt, der gegen den extrazellulären Teil des humanen FcεRIα gerichtet ist. Als negative nicht-Antikörperkontrolle wird die FcεRI α-Kette und als Positivkontrolle Vertiefungen, die mit polyklonalem anti-M13 Antiserum beschichtet sind, miteingeschlossen.
- Die Spezifität der Mimotop-BSW17 Wechselwirkung wird ferner dadurch gezeigt, daß die Bindung von Mimotop-präsentierenden Phagenpartikeln mit der BSW17/IgE Bindung wechselwirkt. Es werden Bakterienzellen in SB, das 10 ug/ml Tetracyclin und 50 ug/mI Carbenicillin enthält, bis zu einer OD&sub6;&sub0;&sub0; = 0,4 angezogen, dann werden VCS M13 Helferphagen zugegeben und die Inkubation wird für 2 Stunden bei 37ºC fortgesetzt. Dann wird Kanamycin bis zu einer Endkonzentration von 70 ug/ml zugegeben und die Inkubation wird über Nacht fortgesetzt. Die Phagenpartikel werden mit Polyethylenglycol gefällt. Weiche RIA Platten werden mit 20 ug/ml BSW17 in 0,1 M Carbonatpuffer mit pH 9,6 beschichtet und dann mit TBS blockiert, das 1,5% Casein enthält. Humanes IgE wird mit ¹²&sup5;I durch das Chloramin-T-Verfahren markiert und 100 000 cpm werden pro Vertiefung für die Bindung an BSW17 beschichtete RIA Platten in Gegenwart von steigenden Konzentrationen jeweils an nicht-markiertem IgE (Standardkurve) oder Phagenpartikeln verwendet. Alle Experimente werden bei Raumtemperatur durchgeführt und die Platten werden dreimal mit 0,9% NaCl + 0,05% Tween 20 gewaschen, in Stücke geschnitten und für 1 Minute in einem γ-Zähler gemessen.
- Mimotopphagen (PhBSW.6-9 in Fig. 6 = Klon 1 von Fig. 5 = CRRHNYGFWVC = SEQ ID Nr. 18, PhBSW.29-8 in Fig. 6 = Klon 18 von Fig. 5 = CINHRGYWVC = SEQ ID Nr. 19) (siehe obiges Beispiel 4) hemmen die Bindung von BSW17 an IgE. Die Fig. 6 zeigt die Bindung von ¹²&sup5;I-markiertem IgE an BSW17 in Gegenwart von BSW17 Mimotop-präsentierenden Phagenklonen. Geschlossene Kreise zeigen eine Standardhemmkurve mit unmarkiertem IgE, um eine Abschätzung der Hemmung der Bindung von markiertem IgE in Gegenwart von 10¹¹ CFU/ml an Phagenpartikeln zu erlauben. Die mit den Phagenklonen erreichte Hemmung entspricht der von nichtmarkierten IgE Konzentrationen von jeweils 1 ug/ml und 1,7 ug/ml.
- Um die Machbarkeit eines BSW17 Mimotop-basierten Impfstoffansatzes zu testen, werden Kaninchen jeweils mit Phagenpartikeln, die BSW17 Mimotoppeptide präsentieren, und dem Helferphagen VCS M13 als Kontrolle immunisiert. 10¹² CFU an frisch hergestellten Phagenpartikeln werden bei 4ºC gegen PBS dialysiert. 1 ml wird mit komplettem Freundschem Adjuvans für die erste Immunisierung oder mit 1 ml inkomplettem Freundschem Adjuvans für die Boosterimmunisierungen emulgiert. Die Immunisierung wird alle 14 Tage subkutan wiederholt. Nach der dritter Boosterinjektion werden 12 ml Blut entnommen, diese läßt man für 4 Stunden bei Raumtemperatur in Gläschen gerinnen und zentrifugiert sie für 10 Minuten bei 2000 · g. Die Überstände werden auf das Vorkommen von anti-human IgE Antikörper durch ELISA getestet. Humanes IgE aus drei verschiedenen Individuen (SUS11- IgE, PS-IgE, WT-IgE) wird in PBS auf eine Konzentration von 50 ug/ml verdünnt und 1 ul Aliquots werden auf Nitrocellulose getropft. Die Nitrocellulose wird in TBS für 1 Stunde geblockt, worin 1,5% Casein enthalten sind. Kaninchenserum wird 1 : 200 in TBS verdünnt, worin 1,5% Casein enthalten sind, und über Nacht inkubiert. Das Waschen wird jeweils in TBS, TBS-0,05% Tween 20 und TBS für jeweils 10 Minuten ausgeführt. Das entwickelnde Ziege-anti-Kaninchen-HRP wird 1 : 1000 in TBS verdünnt, worin 1,5% Casein enthalten sind, und für 4 Stunden inkubiert. Das Waschen und Färben wird wie beschrieben ausgeführt. Wie in Tabelle 3 gezeigt, zeigen die mit VCS M13 Phagen immunisierten Kaninchen als auch die nicht-immunisierten Kaninchen eine schwache Reaktion gegen humanes IgE in ihren Seren, die wahrscheinlich natürliche vorkommende anti-Kaninchen IgE Autoantikörper darstellt, die mit humanem IgE kreuzreagieren. Jedoch enthalten Seren vom Kaninchen, die mit BSW17 Mimotop immunisiert wurden, zusätzlich zu einer massiven Immunreaktion gegenüber dem Hüllprotein des Bakteriophagen pVIII auch erhöhte Spiegel an Antikörpern, die spezifisch humanes IgE erkennen. Tabelle 3 Anti-IgE Reaktion in Kaninchen, die mit BSW17 Mimotop präsentierendem Phagen immunisiert wurden
- Die BSW17 Epitopspezifität dieser Antiseren kann in einem Kompetitions-ELISA gezeigt werden: Nitrocellulosestreifen werden wie oben beschrieben hergestellt und mit Kaninchenserum mit einer Verdünnung von 1 : 50 in TBS über Nacht inkubiert, worin 1,5% Casein enthalten sind. Nach dem Waschen wird mAb BSW17, der mit Meerrettichperoxidase markiert ist (BSW17-HRP) in einer Verdünnung von 1 : 50 000 in TBS, worin 1,5% Casein enthalten sind, für 4 Stunden zugegeben. Das anschließende Waschen und Färben wird wie beschrieben ausgeführt. Wie man aus Tabelle 4 entnehmen kann, wird die Bindung von BSW17-HRP an IgE Präparationen von verschiedenen Quellen durch Seren aus diesen Kaninchen gehemmt, die mit BSW17 Mimotopphagen immunisiert wurden, während Serum aus Kaninchen, die mit dem Helferphagen immunisiert wurden, keine hemmende Wirkung zeigen: Tabelle 4 Hemmung der BSW17/IgE Wechselwirkung mit Kaninchenseren, die mit BSW17 Mimotopphagen immunisiert wurden
- In den folgenden Beispielen 7 und 8 wird die Brauchbarkeit der Verwendung von chemisch synthetisierten Mimotoppetiden, die an ein Trägerprotein als Immunogen gekuppelt sind, zur Herstellung eines Anti-allergieimpfstoffs gezeigt:
- Um zu bestätigen, daß der von einem Bakteriophagen stammende Teil der BSW17 Mimotopphagen ohne Zerstörung der biologischen Aktivität der Mimotoppeptidsequenz weggelassen werden kann, wird das folgende Peptid chemisch synthetisiert, das das cyclische BSW17 Mimotopoctapeptid (A) enthält [in linearer Form in Tabelle 2, Gruppe A gezeigt, zweiter Klon wie Peptid (A) mit zwei zusätzlichen Cys (SEQ ID Nr. 19) und der hier die 7 zusätzlichen von Bakteriophagen stammenden Aminosäurereste Gly-Glu-Phe- und -Gly-Asp-Pro-Ala als flankierende Sequenzen zur Erleichterung der korrekten Faltung des zirkulären Mimotoppetids umfaßt]:
- Nach der Synthese durch Standardtechniken wird dieses Peptid über die zwei Cysteine cyclisiert und mit Rhodol Green fluoreszenzmarkiert. Die Bindung an steigende Konzentrationen an BSW17, die in einer Mikrotiterplatte unter ELISA Bedingungen immobilisiert sind, wird durch eine Fluoreszenzmessung bestimmt und ist in Fig. 7 gezeigt.
- Es werden verschiedene Mimotoppetide chemisch synthetisiert und an immunogene Trägerproteine gekuppelt. Die Kupplungreaktionen werden mit einem 1 : 1 Massenverhältnis von Peptid und Trägerprotein gemäß Standardverfahren ausgeführt (Shan S. Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press [1993]). Konjugate, die aus den folgenden Kupplungsvarianten erhalten werden, werden hergestellt:
- - Glutaraldehydkupplung
- - DC (Dihexylcarbodiimid) Kupplung
- - BSS [Bis(sulfosuccinimidyl)suberat] Kupplung
- - Lysinquervernetzung
- Die entstehenden Mimotopkonjugate sind:
- (1) P1 = lineares KTKGSGFFVF-BSA (Glutaraldehyd)
- (2) P4 = lineares AcINHRGYWVC - BSA (DC)
- (3) PS = lineares AcRSRSGGYWLWC - BSA (DC)
- (4) SAF1-KLH = cyclisches GEFCINHRGYWVCGDPA - KLH (DC)
- (5) SAF2-KLH = lineares KTKGSGFFVF - KLH (DC)
- (6) SAF3-KLH = lineares VNLPWSFGLE - KLH (DC)
- (7) SAF3-Lys = lineares VNLPWSFGLE - Lysinquervernetzung
- (8) SAF4-KLH = lineares VNLTWSRASG - KLH (DC)
- (9) SAF5-KLH = VNLTWS - KLH (DC)
- (10) SDS214 = cyclisches GEFCRRHNYGFWVCGDPA - KLH (BSS)
- (11) SDS213, SDS227, SDS236, SDS252 = cyclisches GEFCINHRGYWVCGDPA - KLH (BSS)
- (12) SDS237, SDS253 = lineares KTKGSGFFVF-KLH (BSS)
- (13) SDS242, SDS254 = lineares VNLPWSFGLE - KLH (BSS) und
- (14) SDS243 = lineares VNLTWSRASG - KLH (BSS)
- wobei (1), (5) und (12) Referenzimmunogene sind, die jeweils durch Kupplung mit Glutaraldehyd, DC und BSS hergestellt wurden:
- (1) nämlich P1, das aus den Aminosäuren 500-509 von humanem IgE, SEQ ID Nr. 28 besteht, siehe The Lancet [1990], obige Literaturstelle, ist durch die Glutaraldehydkupplung an NSA gekuppelt,
- (5) nämlich SAF2-KLH ist das gleiche Peptid mit der SEQ ID Nr. 28, das durch DC Kupplung an KLH gekuppelt ist und
- (12) nämlich SDS237 und SDS253, ist dasselbe Peptid mit der SEQ ID Nr. 28, das durch BSS Kupplung an KLH gekuppelt ist.
- Die anderen Peptide sind erfindungsgemäße Immunogene, nämlich:
- - (2) (P4) ist das N-acetylierte Peptid (A) (SEQ ID Nr. 1) mit einem zusätzlichen Cys am C-Terminus (SEQ ID Nr. 29), das durch DC Kupplung an BSA gekuppelt ist,
- - (3) (PS) ist das N-acetylierte Peptid (C) (SEQ ID Nr. 3) mit einem zusätzlichen Cys am C-Terminus (SEQ ID Nr. 30), das durch DC Kupplung an BSA gekuppelt ist,
- (4) (SAF1-KLH) ist das Peptid von Beispiel 7 (SEQ ID Nr. 31), das über eine Disulfidbrücke cyclisiert ist, die durch die zwei flankierenden Cys gebildet wird, und ist durch DC Kupplung an KLH gekuppelt,
- - (6) (SAF3-KLH) ist das Peptid (G) (SEQ ID Nr. 7), das durch DC an KLH gekuppelt ist,
- - (7) (SAF3-Lys) ist das Peptid (G) (SEQ ID Nr. 7), das durch Lysinquervernetzung gekuppelt ist,
- - (8) (SAF4-KLH) ist das Peptid (D) (SEQ ID Nr. 4), das durch DC Kupplung an KLH gebunden ist,
- - (9) (SAF5-KLH) ist das Peptid (Q) (SEQ ID Nr. 17), das durch DC Kupplung an KLH gekuppelt ist,
- - (10) (SDS214) ist das erste Peptid der Gruppe A in Tabelle 2 mit denselben 7 benachbarten, vom Bakteriophagen stammenden Aminosäureresten, wie das Peptid in Beispiel 7 (SEQ ID Nr. 32), das cyclisiert und durch BSS Kupplung an KLH gekuppelt ist,
- - (11) (SDS213, SDS227, SDS236, SDS252) ist dasselbe Peptid, wie (4) oben (SEQ ID Nr. 31), das cyclisiert und durch BSS Kupplung an KLH gebunden ist.
- - (13) (SDS242, SDS254) ist das Peptid (G) (SEQ ID Nr. 7), das durch BSS Kupplung an KLH gekuppelt ist,
- - (14) (SDS243) ist das Peptid (D) (SEQ ID Nr. 4), das durch BSS Kupplung an KLH gebunden ist.
- Die Fig. 8a zeigt, daß sowohl das cyclische BSW17 Mimotop-KLH(BSS) Konjugat (11), das heißt SDS236 als auch das von Fcε-stammende "ursprüngliche" Epitopmotiv (12), das heißt SDS237, nämlich Fcε (500-509) als lineares Peptid an KLH (BSS) gekuppelt ist, durch BSW17 in einer dosisabhängigen Weise erkannt werden, während freies KLH keine Bindung zeigt. Es werden Mikrotiterplatten mit jeweils 1 ug an SDS236, SDS237 oder freiem KLH beschichtet und mit steigenden Konzentrationen an BSW17 inkubiert. Gebundener Antikörper wird mit Ziegeanti-Maus IgG-HRP (gamIgG-HRP) detektiert. Die gezeigten Daten stellen Mittelwerte von Parallelansätzen abzüglich der Hintergrundbindung an unbeschichtete (BSA-blockierte) Vertiefungen dar.
- Die Fig. 8b faßt die mit verschiedenen BSW17 Mimotopkonjugaten erhaltenen ELISA Daten zusammen, die mittels verschiedener chemischer Kupplungstechniken an das Trägerprotein gebunden sind. Die Mikrotiterplattenvertiefungen werden mit jeweils 5 ug der Mimotopkonjugate oder freiem KLH beschichtet und mit 10 ug BSW17 inkubiert. Der gebundene Antikörper wird mit gamIgG-HRP detektiert. Die gezeigten Daten stellen Mittelwerte von Parallelansätzen abzüglich der Hintergrundbindung an unbeschichtete (BSA-blockierte) Vertiefungen dar. Es wird festgestellt, daß im Gegensatz zu freiem KLH das BSW17 Mimotopkonjugat durch BSW17 erkannt wird. Jedoch wird aus wiederholten Experimenten deutlich, die über mehrere Wochen ausgeführt werden, daß die durch DC gekuppelten KLH Konjugate weniger stabil sind und schrittweise ihre Bindungsfähigkeit für BSW17 verlieren. Im Gegensatz dazu sind BSW17 Mimotopkonjugate, die durch BSS Kupplung erhalten wurden, sogar bei 4ºC stabil.
- In den Fig. 9a und 9b wird gezeigt, daß BSW17 Mimotope, die an KLH oder BSA gekuppelt sind, spezifisch durch BSW17 erkannt werden und nicht durch die nicht in Zusammenhang stehenden Antikörper 3G9 (anti-human Cε3) und 5H5/F8 (anti-human RIα). Es werden erneut Mikrotiterplattenvertiefungen mit jeweils 5 ug der jeweils gezeigten Mimotopkonjugate beschichtet und mit 10 ug des entsprechenden monoklonalen Antikörpers inkubiert. Der gebundene Antikörper wird mit gamIgG-HRP detektiert. Die gezeigten Daten stellen Mittelwerte von Parallelansätzen abzüglich der Hintergrundbindung an unbeschichtete (BSA-blockierte) Vertiefungen dar.
- Um die Spezifität der Immunogenität der BSW17 Mimotopkonjugate zu bestätigen, werden Kaninchen mit einem Satz an Mimotop/Trägerpräparationen immunisiert, wie dies im folgenden beschrieben ist.
- Die Kaninchen werden durch s.c. Injektion mit 200 ug der entsprechenden Konjugatpräparation immunisiert, die in einem Gesamtvolumen von 500 ul phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBSdef.) gelöst ist. Für die erste Immunisierung werden die Proben 1 : 1 mit kompletten Freundschen Adjuvans (Kaninchen R1-R4) oder TiterMax (Sigma, Kaninchen 1-20) gemischt. Vor der ersten Immunisierung werden 5 ml umfassende Blutproben entnommen. Die Boosterinjektion wird an den Tagen 21 und 28 nach der ersten Injektion unter Verwendung von inkomplettem Freundschem Adjuvans ausgeführt. Die Blutproben werden am Tag 28 und 49 entnommen und es wird von allen Proben das Serum präpariert.
- Die Erzeugung einer anti-human IgE Immunantwort in den immunisierten Ratten wird durch ELISA verfolgt: Es werden Mikrotiterplatten mit 5 ug humanem IgE (SUS-11, JW8) beschichtet und mit 100 ul der Serumproben inkubiert und mit ELISA Inkubationspuffer 1 : 50 verdünnt. Kaninchenantikörper, die durch das immobilisierte humane IgE gebunden werden, werden durch die Inkubation mit Ziege-anti-Kaninchen IgG-HRP (garIgG-HRP) detektiert. Die gemessenen OD&sub4;&sub0;&sub5; Werte werden durch den Wert korrigiert, der mit Präimmunserum von jedem entsprechenden Kaninchen bei einer Verdünnung von 1 : 50 erhalten wird. Die in den Fig. 10a und 10b angegebenen Daten stellen Mittelwerte von Parallelmessungen dar. Die Fig. 10a und 10b zeigen deutlich die Induktion von Antikörpern bei Kaninchen, die mit verschiedenen BSW17 Mimotopkonjugaten immunisiert wurden, die sich gegen humanes IgE richten.
- Die Serumtiter von neu erzeugten Antikörpern in Bezug auf jeweils den KLH Träger, dem als Immunogen verwendetem Peptid und humanem IgE werden auch durch ELISA mittels Serumreihenverdünnungen für die Inkubation jeweils mit immobilisiertem KLH, Mimotoppeptid-BSA-Konjugat und humanem IgE bestimmt. Zwei Beispiele für solche Serumtierbestimmungen sind in Fig. 11 jeweils für (11), das heißt jeweils für SDS213 und für (10), das heißt SDS214 gezeigt.
- Das obige Beispiel zeigt die Anwendbarkeit von BSW17 Mimotopkonjugaten als Immunogene zur Induktion einer anti-human IgE Reaktion.
- Die Isotypspezifität der anti-human IgE Immunreaktion in den immunisierten Kaninchen wird durch ELI- SA verfolgt: Die Mikrotiterplatten werden jeweils mit 3 ug an humanem IgE (SUS-11), IgA, IgG und IgM beschichtet und mit 100 ul der Serumproben inkubiert, die mit ELISA Inkubationspuffer 1 : 50 verdünnt wurden. Die an die immobilisierten humanen Antikörper gebundenen Kaninchenantikörper werden durch die Inkubation mit garIgG- HRP detektiert. Die gemessenen OD&sub4;&sub0;&sub5; Werte werden durch den Wert korrigiert, der mit 1 : 50 verdünntem Präimmunserum des entsprechenden Kaninchens erhalten wird. Die in Fig. 12 angegebenen Daten stellen Mittelwerte von Parallelmessungen dar. Wie es ersichtlich ist, ist die durch die Immunisierung mit BSW17 Mimotopkonjugaten in Kaninchen erzeugte Immunreaktion bis auf einer partiellen Erkennung von humanem IgM durch das Serum des mit (10), das heißt SDS214 immunisierten Kaninchens, für IgE spezifisch.
- In einem Konkurrenz-ELISA wird ferner gezeigt, daß das Kaninchen-anti-SDS214 Antiserum zur partiellen Kompetition mit BSW17 um die IgE Bindung fähig ist. Mikrotiterplattenvertiefungen werden mit 1 ug humanem IgE (SUS-11) beschichtet und entweder mit 5 ug BSW17 oder Inkubationspuffer ohne BSW17 inkubiert. Nach dem Waschen werden 100 ul anti-SDS213 Antiserum, die mit ELISA Inkubationspuffer 1 : 50 verdünnt sind, für eine zweite Inkubation zugegeben. Kaninchenantikörper, die durch unbehandeltes, immobilisiertes humanes IgE und mit BSW17 vorinkubiertes IgE gebunden werden, werden durch die Inkubation mit garIgG-HRP detektiert. Die in Fig. 13 angegebenen Daten stellen die Mittelwerte von Parallelmessungen dar.
- Das Beispiel zeigt, daß die durch die Immunisierung mit BSW17 Mimotopkonjugaten hervorgerufene anti- hIgE Reaktion mit der spezifischen anti-Mimotoppeptidreaktion identisch ist.
- Immunaffinitätsreinigung von polyklonalen Kaninchen-anti BSW17 Mimotopantikörpern:
- Zu 22 ml Kaninchenantiserum (60 mg/ml Gesamtprotein gemäß Bradford BSA-Standard, BIO-RAD) werden 5,5 g festes AMS (25% G/V) gegeben, das Gemisch wird für 3 Stunden gerührt und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Der Niederschlag wird durch Zentrifugation bei 18 000 Upm (Sorvall) für 45 Minuten entfernt und mit 25 ml wäßriger 25% AMS Lösung (G/V) gewaschen. Der gewaschene Niederschlag wird erneut unter denselben Bedingungen zentrifugiert, in 10 ml PBS, 0,05% NaN&sub3;, pH 7,2 gelöst und gegen 5 l desselben Puffers über Nacht bei +4ºC dialysiert.
- Das Dialysat wird auf einer 0,2 um Millex-GV Filtereinheit (Millipore) filtriert und auf eine Pharmacia XK 16/30 Säule, die mit 10 ml CH-Sepharose 4B gefüllt ist, welche kovalent an 5 mg des BSW17 Mimotoppeptids SDS227 gebunden ist, bei einer Flußrate von 1 ml/min mit PBS und 0,05% NaN&sub3; als Laufpuffer aufgetragen. Nach der Auftragung und der Elution der ungebundenen Proteinfraktion wird spezifisch gebundener Antikörper mit 0,1 M Glycin/HCl Puffer mit pH 2,8 eluiert. Das Eluat (Fraktionen Nr. 12-20 in 9 ml) wird unter Rühren zur sofortigen Neutralisierung auf pH 7,4 mit 3,3 M Tris/HAc, 0,8% NaN&sub3;, pH 8,0 (50 ul/ml) aufgefangen und schließlich gegen 3 1 PBS, 0,05% NaN&sub3;, pH 7,2 über Nacht bei 4ºC dialysiert. Das Gesamtprotein beträgt etwa 1 mg/ml gemäß Bradford, BIgG Standard (BIO-RAD). Die Ausbeute vom aufgetragenen Gesamtprotein beträgt etwa 0,7%.
- Die affinitätsgereinigten IgG Fraktionen werden durch ELISA auf hIgE Bindung getestet. Es werden Mikrotiterplatten mit zunehmenden Konzentrationen an humanem IgE (JW8) beschichtet und mit 5 ug jeweils des gereinigten anti-SDS-213 Antiserums und anti-SDS-214 Antiserums inkubiert. Der gebundene Antikörper wird mit garIgG-HRP detektiert. Die in Fig. 14 gezeigten Daten stellen Mittelwerte von Parallelmessungen dar. Wie es aus der Figur ersichtlich ist, werden die auf der anti-BSW17 Mimotopaffinitätssäule gereinigten IgG Antikörper vom humanen IgE auf eine dosisabhängige Weise erkannt. Es wird nur eine geringe Hintergrundbindungsaktivität mit den Proben des Säulendurchflusses beobachtet. Diese Daten zeigen, daß die anti-hIgE Aktivität, die in den Kaninchen induziert wurde, mit den gegen das Mimotoppeptid gerichteten Antikörpern identisch ist.
- Es wird hier gezeigt, daß die in den Kaninchen durch die Immunisierung mit den BSW17 Mimotopkonjugaten erzeugten anti-IgE Antikörper für Basophile aus dem Humanblut nicht anaphylaktogen sind. Als Testsystem wird der im Handel erhältliche CAST sLt ELISA Kit verwendet (Bühlmann AG, Allschwil, Schweiz). In diesem Test wird die Freisetzung von löslichem Leukotrien (sLt) aus humanen Basophilen als Folge der Auslösung der Zellen durch anaphylaktogene Mittel gemäß dem vom Hersteller bereitgestellten Experimentalprotokoll bestimmt. Die Auswertung des Tests wird als pg sLt pro ml Überstand von humanen weißen Blutzellen nach der Inkubation der Zellen mit der Testprobe angegeben, wie dies durch den Vergleich mit einer Standardkurve bestimmt wird. Die Standardkurve wird mittels Reihenverdünnung von Standard sLt in einem Kompetitions-ELISA erhalten. sLt Hintergrundmengen, die aus einer spontanen Lt Freisetzung aus der Blutzellpräparation resultieren (PB = "Patientennullwert") und das Maximum an sLt, das aus einer gegebenen Blutzellpräparation freigesetzt wird (PC = "Patientenkontrolle", die nach der Auslösung der Zellprobe mit einem quervernetzenden anti-IgERIα Antikörper erhalten wird) werden jeweils in jedem Test als Negativ- und Positivkontrollen aufgenommen.
- Komplette Seren aus Kaninchen, die mit BSW17 Mimotopkonjugaten immunisiert wurden, wie auch die in Beispiel 11 beschriebenen affinitätsgereinigten anti-BSW17 Mimotopantikörper werden auf das Vorkommen einer Basophilenauslösung und somit auf anaphylaktogene anti-hIgE Antikörper getestet. Als Quelle für die Basophilen wird frisch entnommenes Gesamtblut eines gesunden Spenders verwendet und streng gemäß dem Protokoll des CAST ELISA Kits verarbeitet. Die Ergebnisse sind in Fig. 15 zusammengefaßt und zeigen, daß weder ungereinigtes Kaninchenserum, das die durch die Immunisierung mit den BSW17 Mimotopkonjugaten erzeugten anti-IgE Antikörper enthält, noch die affinitätsgereinigten anti-BSW17 Mimotopantikörper die Fähigkeit der Auslösung der Leukotrienfreisetzung bei humanen Blutzellen haben und somit nicht anaphylaktogen sind. Dies ist eine absolute Voraussetzung für die Anwendung der BSW17 Mimotope in einem humanen Anti-allergieimpfstoff.
- (1) Allgemeine Information:
- (i) Anmelder:
- (A) Name: Novartis AG
- (B) Straße: Schwarzwaldallee 215
- (C) Stadt: Basel
- (1E) Land: Schweiz
- (F) Postleitzahl (ZIP): CH-4058
- (G) Telefon: 61 324 5269
- (H) Telefax: 61 322 7532
- (ii) Titel der Erfindung: Peptidimmunogene
- (iii) Anzahl an Sequenzen: 32
- (iv) Computerlesbare Form:
- (A) Mediumtyp: Diskette
- (B) Computer: IBM PC kompatibel
- (C) Betriebssystem: PC-DOS/MS-DOS
- (D) Software: PatentIn Release Nr. 1.0, Version Nr. 1.25 (EPO)
- (v) Daten der vorliegenden Anmeldung:
- Anmeldenummer: WO PCT/EP97/01013 (EP 97 905 136.4-2116)
- (vi) Prioritätsdaten der Anmeldung:
- (A) Anmeldenummer: GB 9604412.8
- (B) Anmeldedatum: 1. März 1996
- (vi) Prioritätsdaten der Anmeldung:
- (A) Anmeldenummer: GB 9617702.7
- (B) Anmeldedatum: 22. August 1996
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- (i) Sequenzeigenschaften:
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Claims (13)
1. Immunogenes Molekül, das umfaßt
(a) zumindest einen Rest eines BSW17 Mimotoppeptids mit der ECACC Hinterlegungsnummer 96121916 mit
insgesamt bis zu 15 Aminosäuren, das geeigneterweise weitere Komponenten für die Hapten-Trägerbindung
umfaßt, um die Kupplung an die Komponente (b) oder das weitere Prozessieren zu vereinfachen, oder wenn das
BSW17 Mimotoppeptid cyclisch ist, kann es die zwei Enden durch zwei zusätzliche Cysteinreste
zusammenhalten, die eine Disulfidbrücke bilden, oder chemisch vernetzt sein, oder wenn das BSW17 Mimotoppeptid linear
ist, kann es die carboxyterminale Aminosäure in amidierter Form blockiert aufweisen und/oder die
aminoterminale Aminosäure in acetylierter Form blockiert aufweisen, oder kann durch ein oder zwei Hilfsgruppen und/oder
eine zusätzliche Kupplungsgruppe flankiert sein, und
(b) einen Rest, der zur Auslösung einer Immunreaktion gegenüber diesem Peptid fähig ist, wobei die
Komponente (a) nicht Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe ist.
2. Immunogenes Molekül nach Anspruch 1 in Form eines polymeren Peptids oder eines rekombinanten
Fusionsproteins, wobei die monomere Verbindung des polymeren Peptids oder ein Partner des Fusionsproteins den Rest eines
BSW17 Mimotoppeptids darstellt und der Rest des polymeren Peptids oder Fusionsproteins den
Immunreaktionsauslösenden Rest darstellt.
3. Immunogenes Molekül nach Anspruch 1 in Form eines Konjugats aus einem BSW17 Mimotoppeptid und einem
immunogenen Träger.
4. Immunogenes Molekül nach Anspruch 1, worin der BSW17 Mimotoppeptidrest im wesentlichen eine
Aminosäuresequenz enthält oder aus dieser besteht, ausgewählt aus
5. Immunogenes Molekül nach Anspruch 1, worin der BSW17 Mimotoppeptidrest im wesentlichen die
Aminosäuresequenz
enthält oder aus dieser besteht.
6. Immunogenes Molekül nach Anspruch 5, das cyclisch ist, wobei die zwei Enden durch zwei zusätzliche
Cysteinreste zusammengehalten werden, die eine Disulfidbrücke bilden und ferner weitere Komponenten umfaßt, um die
Kupplung an die Komponente (b) oder die weitere Prozessierung zu erleichtern.
7. Immunogenes Molekül nach Anspruch 1, worin der BSW17 Mimotoppeptidrest (a) die folgende
Aminosäuresequenz aufweist
und cyclisch ist, wobei es nämlich das Peptid Ile-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val (A) ist, wobei die zwei Enden
durch zwei zusätzliche Cysteinreste zusammengehalten werden, die eine Disulfidbrücke bilden, und die weiteren
Komponenten Gly-Glu-Phe- und -Gly-Asp-Pro-Ala für die Hapten-Träger Bindung und Kupplungsvereinfachung
enthält.
8. Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein immunogenes Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und ein
Adjuvans enthält.
9. Ligand, der eine Antikörperdomäne umfaßt, welche spezifisch ist für einen Rest eines BSW17 Mimotoppeptids
mit der ECACC Hinterlegungsnummer 96121916 nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Antikörperdomäne
auch mit der Sequenz der Aminosäuren der schweren Kette von IgE reagiert, die das natürliche von BSWI7
erkannte Epitop umfaßt.
10. Ligand nach Anspruch 9, der in Form eines monoklonalen Antikörpers oder eines Fab oder F(ab')&sub2; Fragments
hiervon vorliegt.
11. Verfahren zur Herstellung eines immunogenen Moleküls nach Anspruch 1, das die geeignete Kupplung von
(a) einem Rest eines BSW17 Mimotoppeptids mit der ECACC Hinterlegungsnummer 96121916 mit
(b) einem Rest, der zur Auslösung einer Immunreaktion gegenüber diesem Peptid fähig ist umfaßt.
12. Immunogenes Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Verwendung bei der Herstellung eines
Pharmazeutikums zur Behandlung von IgE-vermittelten Erkrankungen.
13. Verwendung eines immunogenen Moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Herstellung eines Impfstoffs
gegen Allergie.
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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