SK284856B6 - Imunogénna molekula, farmaceutická kompozícia, ligand, spôsob prípravy imunogénnej molekuly a jej použitie - Google Patents
Imunogénna molekula, farmaceutická kompozícia, ligand, spôsob prípravy imunogénnej molekuly a jej použitie Download PDFInfo
- Publication number
- SK284856B6 SK284856B6 SK1181-98A SK118198A SK284856B6 SK 284856 B6 SK284856 B6 SK 284856B6 SK 118198 A SK118198 A SK 118198A SK 284856 B6 SK284856 B6 SK 284856B6
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- gly
- peptide
- bsw17
- leu
- ser
- Prior art date
Links
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 title claims abstract description 40
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims abstract description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 17
- 239000003446 ligand Substances 0.000 title claims description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 187
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims abstract description 19
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 18
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 claims abstract description 17
- 230000007815 allergy Effects 0.000 claims abstract description 11
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 8
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 73
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 72
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 51
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 44
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 10
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 claims description 10
- 239000000863 peptide conjugate Substances 0.000 claims description 9
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 8
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 2
- XTQFHTHIAKKCTM-YFKPBYRVSA-N Gly-Glu-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O XTQFHTHIAKKCTM-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims 1
- LHRXAHLCRMQBGJ-RYUDHWBXSA-N Gly-Glu-Phe Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)CN LHRXAHLCRMQBGJ-RYUDHWBXSA-N 0.000 claims 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims 1
- 206010012438 Dermatitis atopic Diseases 0.000 abstract description 4
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 abstract description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 abstract 1
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 66
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 54
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 54
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 37
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 37
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 33
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 33
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 32
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 32
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 32
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 32
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 31
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 26
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 21
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 19
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 18
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 17
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 17
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 15
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 13
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 13
- 230000002052 anaphylactic effect Effects 0.000 description 12
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 12
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 11
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical group SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 10
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 10
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 10
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 9
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 9
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 9
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 9
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 9
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 9
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 8
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 8
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 8
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 8
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 8
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 230000004044 response Effects 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 6
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 6
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 6
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000009438 IgE Receptors Human genes 0.000 description 6
- 108010073816 IgE Receptors Proteins 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 6
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 150000002617 leukotrienes Chemical class 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 5
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 5
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 5
- 230000003266 anti-allergic effect Effects 0.000 description 5
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 5
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 5
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 4
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 3
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 3
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 3
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 3
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 3
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 3
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 3
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 125000000218 acetic acid group Chemical group C(C)(=O)* 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 2
- VYLDEYYOISNGST-UHFFFAOYSA-N bissulfosuccinimidyl suberate Chemical compound O=C1C(S(=O)(=O)O)CC(=O)N1OC(=O)CCCCCCC(=O)ON1C(=O)C(S(O)(=O)=O)CC1=O VYLDEYYOISNGST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 2
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 2
- TXOUDPQJASQYBZ-UHFFFAOYSA-N n,n'-dihexylmethanediimine Chemical compound CCCCCCN=C=NCCCCCC TXOUDPQJASQYBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 229960001005 tuberculin Drugs 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- INGWEZCOABYORO-UHFFFAOYSA-N 2-(furan-2-yl)-7-methyl-1h-1,8-naphthyridin-4-one Chemical compound N=1C2=NC(C)=CC=C2C(O)=CC=1C1=CC=CO1 INGWEZCOABYORO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 4-chloronaphthalen-1-ol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=C(Cl)C2=C1 LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 206010002198 Anaphylactic reaction Diseases 0.000 description 1
- 241000244186 Ascaris Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000283153 Cetacea Species 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- FNAJNWPDTIXYJN-CIUDSAMLSA-N Gln-Pro-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O FNAJNWPDTIXYJN-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- MXXXVOYFNVJHMA-IUCAKERBSA-N Gly-Arg-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)CN MXXXVOYFNVJHMA-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- NIKBMHGRNAPJFW-IUCAKERBSA-N His-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 NIKBMHGRNAPJFW-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- 101000913074 Homo sapiens High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Proteins 0.000 description 1
- 101001033279 Homo sapiens Interleukin-3 Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 102000016844 Immunoglobulin-like domains Human genes 0.000 description 1
- 108050006430 Immunoglobulin-like domains Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 1
- 102000000646 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- XWOBNBRUDDUEEY-UWVGGRQHSA-N Leu-His Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 XWOBNBRUDDUEEY-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- QWWPYKKLXWOITQ-VOAKCMCISA-N Leu-Thr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C QWWPYKKLXWOITQ-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- 241001625930 Luria Species 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCS(O)(=O)=O JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 101100026203 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) neg-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- APJPXSFJBMMOLW-KBPBESRZSA-N Phe-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 APJPXSFJBMMOLW-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 229920002594 Polyethylene Glycol 8000 Polymers 0.000 description 1
- 108010020346 Polyglutamic Acid Proteins 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 101710193132 Pre-hexon-linking protein VIII Proteins 0.000 description 1
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 101100441500 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) saf4 gene Proteins 0.000 description 1
- PBUXMVYWOSKHMF-WDSKDSINSA-N Ser-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO PBUXMVYWOSKHMF-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- XKFJENWJGHMDLI-QWRGUYRKSA-N Ser-Phe-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)NCC(O)=O XKFJENWJGHMDLI-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 239000007994 TES buffer Substances 0.000 description 1
- AMXMBCAXAZUCFA-RHYQMDGZSA-N Thr-Leu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O AMXMBCAXAZUCFA-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- AOAMKFFPFOPMLX-BVSLBCMMSA-N Trp-Arg-Phe Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)N)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 AOAMKFFPFOPMLX-BVSLBCMMSA-N 0.000 description 1
- SMDQRGAERNMJJF-JQWIXIFHSA-N Trp-Cys Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O)=CNC2=C1 SMDQRGAERNMJJF-JQWIXIFHSA-N 0.000 description 1
- YCQXZDHDSUHUSG-FJHTZYQYSA-N Trp-Thr-Ala Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)=CNC2=C1 YCQXZDHDSUHUSG-FJHTZYQYSA-N 0.000 description 1
- WPSXZFTVLIAPCN-WDSKDSINSA-N Val-Cys Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O WPSXZFTVLIAPCN-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 1
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005576 amination reaction Methods 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 1
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 1
- 230000009833 antibody interaction Effects 0.000 description 1
- 229940125715 antihistaminic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000739 antihistaminic agent Substances 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N chloramine T Chemical compound [Na+].CC1=CC=C(S(=O)(=O)[N-]Cl)C=C1 VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 238000001142 circular dichroism spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000013377 clone selection method Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Chemical group SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 229960003983 diphtheria toxoid Drugs 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000002964 excitative effect Effects 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000005965 immune activity Effects 0.000 description 1
- 210000004201 immune sera Anatomy 0.000 description 1
- 229940042743 immune sera Drugs 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000424 optical density measurement Methods 0.000 description 1
- 229940043515 other immunoglobulins in atc Drugs 0.000 description 1
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 229920002643 polyglutamic acid Polymers 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 210000004896 polypeptide structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 108010071207 serylmethionine Proteins 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000009121 systemic therapy Methods 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 229960001479 tosylchloramide sodium Drugs 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
- C07K16/4283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig
- C07K16/4291—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig against IgE
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
- C07K2317/528—CH4 domain
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Opisujú sa imunogénne molekuly obsahujúce (a) aspoň jednu časť napodobňujúcu prirodzený epitop na povrchu ľudskej protilátky IgE, rozpoznávaný monoklonálnou protilátkou BSW17, a (b) skupinu schopnú vyvolať imunitnú odpoveď proti tomuto peptidu. Tieto molekuly sú vhodné na prípravu farmaceutických prostriedkov na liečenie ochorení ovplyvnených IgE, ako sú alergie a atopická dermatitída, napríklad na výrobu vakcín proti alergiám.
Description
Predmetom vynálezu sú imunogénne peptidy. Zvláštny dôraz sa kladie na inhibíciu interakcií, ktoré by mohli byť za normálnych okolností signálom na spustenie činnosti mastocytov a bazofilov pomocou buniek nesúcich IgE s naviazaným alergénom. Dôsledkom tohto deja je uvoľnenie farmakologicky aktívnych mediátorov, ako aj de novo syntéza cytokínov, ktoré sa podieľajú na regulácii alergických a zápalových reakcií. Vynález sa týka imunogénnych molekúl obsahujúcich časť mimotopového peptidu protilátky BSW17 a ich použitia.
Doterajší stav techniky
Alergické príznaky sú vyvolané uvoľnením farmakologicky aktívnych mediátorov, najmä histamínu, leukotriénov a enzýmov. Tieto látky sú uvoľňované z buniek do okolitého tkaniva a cievneho systému. Tieto mediátory sú za normálnych okolností skladované alebo syntetizované de novo v špeciálnych bunkách známych ako žírne bunky (mastocyty) a bazofilné granulocyty. Mastocyty sú rozptýlené v živočíšnych tkanivách, zatiaľ čo bazofily cirkulujú v cievnom systéme. Tieto bunky syntetizujú a skladujú mediátory, pokiaľ nedôjde k špeciálnej sekvencií dejov, ktoré vedú k ich uvoľneniu.
Úloha imunoglobulinových protilátok E (IgE) v priebehu alergických reakcií je dobre známa. Protilátka IgE je komplex usporiadaných polypeptidových reťazcov, ktoré sa tak, ako pri ostatných imunoglobulínoch skladajú z ľahkého a ťažkého reťazca, ktoré sú spojené disulfidovými mostíkmi takým spôsobom, že zaujmú konfiguráciu v tvare písmena „Y“. Každý ľahký reťazec má dve domény, jednu variabilnú (VL) doménu, spojenú s doménou s relatívne nemennou aminokyselinovou sekvenciou, ktorá sa nazýva konštantná doména (CL). Naopak, ťažký reťazec má jednu variabilnú doménu (VH) a v prípade IgE, štyri konštantné domény (CH1, CH2, CH3, CH4), ktoré sú tiež známe ako Csl, Ce2, Ce3 a Ce4. Dve „ramená“ protilátky sú zodpovedné za väzbu antigénu, pretože nesú oblasti, kde je polypeptidová štruktúra veľmi variabilná a sú ukončené fragmentmi Fab' alebo F (ab')2, čo predstavuje dve ramená Fab' spojené disulfidovými väzbami. „Chvostík“ centrálnej osi protilátky obsahuje konštantnú sekvenciu peptidov a nazýva sa Fc fragment. Fc fragment obsahuje interaktívne miesta, ktoré umožňujú protilátke komunikovať s ďalšími molekulami imunitného systému alebo s bunkami. K interakcii s bunkami dochádza prostredníctvom väzby k ich Fc receptoru.
Fc receptory sú molekuly, ktoré sa špecificky viažu k aktívnym miestam na molekule imunoglobulínu v Fc oblastiach. Fc receptory sa vyskytujú ako integrálne membránové proteíny vo vonkajšej bunkovej plazmatickej membráne, alebo môžu existovať vo forme rozpustných molekúl, ktoré voľne cirkulujú v krvnej plazme a ostatných telových tekutinách. V ľudskom systéme sa dosahuje vysoká afinita väzby IgE k receptorom FceRI pomocou komplexnej proteín-proteínovej interakcie rôznych častí konštantnej oblasti (Cc3) tretieho ťažkého reťazca IgE a k membráne otočenej časti imunoglobulínom podobnej domény (<x2) podjednotky FceRI .
Aj keď boli v Ce3 doméne konštantnej oblasti ťažkého reťazca IgE a v oblasti, ktorá patrí do a2 domény FceRIa identifikované aminokyselinové zvyšky nevyhnutné pre väzbu, podrobný mechanizmus väzbového procesu je stále málo známy.
Na základe meraní prenosu fluorescenčnej energie a ďalej z meraní využívajúcich rozptyl rôntgenových a neutrónových lúčov boli podané experimentálne dôkazy, že ľudský IgE zaujíma zakrivenú štruktúru, o ktorej sa predpokladá, že prispieva k neobyčajne vysokej hodnote afinity IgE pre FceRI (Kd-10‘°M).
Okrem toho je táto zakrivená štruktúra tiež považovaná za príčinu tvorby ekvimolámeho komplexu medzi IgE a bunkou viazaným alebo rozpustným FceRIcí , aj keď molekula IgE môže poskytnúť identický epitop pre väzbu receptora na dvoch Cs3 doménach. Táto schopnosť monovalencie je funkčnou nevyhnutnosťou, ak sa má zabrániť zapojeniu receptora v neprítomnosti alergénu (pozri obrázok 1). Miesta na interakciu môžu teda byť, v závislosti od ich funkcie, vždy prístupné a teda schopné viazať sa k bunkovým receptorom. V inom prípade môžu byť tieto miesta schované, pokiaľ nedôjde k väzbe protilátky na antigén, čím protilátka zmení svoju štruktúru a následne odhalí ďalšie aktívne miesta, ktoré môžu viesť k spusteniu špecifickej imunitnej aktivity. Na základe údajov vyplývajúcich z merania spektier cirkulámeho dichroizmu sa konformačnou zmenou postihujúcou Ce3 po väzbe na receptor vysvetľuje stechiometrícký pomer 1 : 1 Fce3/ FceRI na bunkovom povrchu.
Na alergické (imunologické) uvoľnenie histamínu v organizme z mastocytov a bazofilov je teda nevyhnutné, aby molekula IgE zapadla alebo sa pripojila svojou Fc časťou k bunkovému Fc receptorovému miestu, a týmto spôsobom je zaistená väzba IgE na mastocyty a bazofily. Fab’ časti na bunku naviazaných molekúl IgE musia byť v ďalšom kroku navzájom prepojené pomocou konkrétneho kompatibilného antigénu (alergénu). Ak sa uskutoční takáto interakcia, pre mastocyty a bazofily je to bezprostredný pokyn na uvoľňovanie histamínu do okolitého prostredia, a to sa prejaví dobre známymi alergickými príznakmi. Potom nasledujú ďalšie biochemické deje neskorej fázy reakcie, ktoré vyústia do syntézy a uvoľnenia cytokínov a ďalších mediátorov (J. V. Ravetch a J.P. Kinet, Ann. Rev. Immuno. 19 (1991), strana 457 až 492).
Prístupy k liečeniu alergií známe zo stavu zahŕňajú zvyčajne systémovú terapiu pomocou podávania antihistaminík alebo steroidov, alebo postupy vedúce k zníženiu citlivosti pacientov na daný alergén. Tieto liečebné spôsoby nie sú priamo zamerané na základnú interakciu IgE s mastocytmi alebo bazofilmi. Ďalšie spôsoby liečenia zahŕňajú prípravu polypeptidových reťazcov, ktoré sú schopné blokovať väzbu protilátky IgE k Fc receptoru na povrchu buniek a vytesnia tak IgE z väzbových miest, na ktoré sa molekuly IgE zvyčajne viažu. Ďalej sa uskutočňuje výskum s cieľom definovať vlastnosti uvažovaného „efektorového“ miesta vnútri oblasti IgE Fc, o ktorom sa predpokladá, že vyvoláva imunologický signál, ktorý je hlavnou podmienkou vedúcou k uvoľneniu mediátorov z mastocytov alebo bazofilov.
Rovnako bolo vyskúšané a ukázalo sa ako účinné použitie rekombinantných IgE fragmentov ako imunogénov na prípravu ochrannej anti-IgE vakcíny. Hlavným argumentom proti tomuto postupu sa ukázal fakt, že pri príprave takejto vakcíny sa používajú na imunizáciu veľké fragmenty IgE, čo by mohlo iniciovať nielen tvorbu inhibičných protilátok, ale tiež by mohli vzniknúť krížové reakcie a následkom toho by vznikli anafylaktogénne (spôsobujúce precitlivelosť) protilátky v tele pacientov (pozri obrázok 2).
Stratégia, ako prekonať tento problém, by mohla spočívať v určení najmenšieho možného fragmentu IgE, v ideálnom prípade skladajúceho sa len z receptorového väzbového miesta, ktoré je po väzbe skryté v komplexe IgE/FcsRI, a tak nie je k dispozícii pre krížovú väzbu s vakcínou vyvolanou imunitnou odpoveďou. Pokusy o rekonštrukciu takejto komplexnej molekulárnej entity však sotva budú úspešné, a to hlavne kvôli priestorovým vzdialenostiam rôznych Cc3 oblastí, ktoré sa zapájajú do interakcie IgE/ FceRI.
Podstata vynálezu
V poslednom čase sa zistilo, že problémy skutočne spojené s prístupom ku klasickej vakcíne je možné prekonať použitím BSW17 mimotopov na aktívnu imunizáciu. Dajú sa použiť buď ako chemicky syntetizované peptidy viazané na vhodné nosiče, alebo ako rekombinantné fúzne konštrukcie (napríklad s ovoalbumínom, IgG, a tak ďalej).
BSW17 je monoklonálna protilátka, ktorá rozpoznáva konformačný epitop na Fcs, ktorý má najmenej jednu svoju časť vo vnútornej oblasti Ce3. Hybridómové bunkové línie produkujúce monoklonálnu protilátku BSW17 boli založené 19. decembra v roku 1996 v ECACC podľa pravidiel Budapeštianskej zmluvy o skladovaní mikroorganizmov, pod depozitným číslom 96121916. Táto protilátka má zaujímavý profil biologických aktivít, ktorý je zhrnutý na obrázku 3. Protilátka BSW17 alebo BSW17-podobné protilátky cirkulujúce v cievnom systéme ochraňujú organizmus pred alergickými reakciami, a to buď
a) zabránením spustenia reakcie prebiehajúcej v mastocytoch a bazoftloch pomocou kompetitívnej inhibicie interakcie IgE/ IgERI, alebo
b) znížením hladiny IgE v sére znížením syntézy IgE na úrovni B buniek.
BSW17 „mimotopové“ peptidy boli v tomto prípade identifikované výberom z náhodnej kombinatorickej knižnice peptidov exprimovaných na povrchu fágov (phage display library), a to ako peptidy, ktoré napodobňujú prinajmenšom časť komplexného konformačného epitopu na IgE molekule. Chemicky syntetizované mimotopové peptidy viazané na imunogénny nosný proteín môžu byť použité na prípravu vakcíny na vyvolanie špecifických protilátok v alergickom hostiteľovi. Tieto protilátky inhibujú činnosť komplexu mastocytov a bazofilov, a to buď blokovaním väzby IgE/FceRI, alebo syntézy IgE. Ako mimotopy protilátok IgE indukujú imunitnú odpoveď, ktorá v hostiteľovi vedie k produkcii protilátok podobných BSW17. Keďže BSW17 nevyvoláva anafylaktickú reakciu a inhibuje väzbu IgE/ FceRI a syntézu IgE na úrovni B buniek, majú vakcíny založené na protilátkach pripravených proti BSW17 mimotopu analogické ochranné vlastnosti. Imunitná odpoveď je veľmi špecifická, pretože oproti prístupu s použitím „klasickej vakcíny“, nie sú prítomné proteínové fragmenty odvodené od IgE, ktoré by mohli vyvolať tvorbu križovo reagujúcich (crosslinking) protilátok v imunizovaných pacientoch (pozri obrázok 4).
Vynález teda opisuje imunogénne molekuly obsahujúce:
a) aspoň jednu časť mimotopového peptidu BSW17 a
b) časti schopné vyvolať imunitnú odpoveď proti peptidu (nosiče).
V nasledujúcom texte ich skrátene nazývame „imunogény podľa vynálezu“.
Komponent a) sa skladá maximálne z piatich častí, vo výhodnom usporiadaní však z jednej alebo dvoch, vo zvlášť výhodnom usporiadaní z jednej časti mimotopového peptidu BSW17. Komponent b) je výhodne bežne používaný imunogénny nosič, najmä potom BSA (hovädzí sérový albumín) alebo KHL (hemocyanin z morských priliepavcov).
Mimotopový peptid BSW17 v komponente a) vo výhodnom usporiadaní obsahuje spolu až 15 aminokyselín a jeho sekvencia je napríklad jedna zo sekvencií (A) až (Q) (Sekvencia číslo 1 až 17, pozri ďalej). Ale tento komponent môže zahŕňať ďalšie súčasti vhodné na vytvorenie väzby haptén-nosič, napríklad zložky uľahčujúce naviazanie komponentu a na komponent b, alebo ďalšie spracovanie. Ak je napríklad mimomotopový peptid BSW17 cyklický, jeho dva konce môžu byť spojené napríklad pomocou dodaných cysteínových zvyškov, ktoré vytvoria disulfidový mostík, alebo môžu byť konce chemicky prepojené, napríklad lyzínom. Ak sú BSW mimotopové peptidy lineárne, používa sa výhodne blokovanie koncových karboxylových skupín amináciou (amidáciou), alebo môžu byť koncové aminoskupiny aminokyselín vo výhodnom usporiadaní blokované acyláciou. Funkčné priestorové štruktúry mimotopového peptidu BSW17 v komponente (a), napríklad výhodné skupiny podľa sekvencií (A) až (Q), môžu byť v imunogénoch podľa vynálezu tiež obklopené niekoľkými, vo výhodnom usporiadaní jednou alebo dvoma, dodatočnými pomocnými skupinami, ako je acetyl, cysteín, lyzin, alebo dodatkovou väzbovou časťou, ako sú DC alebo BSS. Tieto činidlá sa použili napríklad na prípravu špecifických imunogénov podľa vynálezu v príklade 8, ďalej v texte uvádzaných ako konjugáty (2) až (4) a (6) až (11), (13) a (14).
Protilátky pripravené pomocou imunogénov podľa vynálezu sú oproti protilátkam produkovaným hybridómom BSW17 endogénne a tak môžu byť použité na preventívne liečebné zásahy aj u ľudských pacientov.
Tieto protilátky môžu byť pripravené vhodnou väzbou na definovaný komponent (a) a (b).
Podrobný opis vynálezu
Imunogén podľa vynálezu môže byť napríklad vo forme polymérneho peptidu alebo rekombinantného fúzneho proteínu, pričom monoméma časť polymérneho peptidu, alebo jedna zo súčastí fúzneho proteínu tvorí časť BSW17 mimotopového peptidu (a) a zvyšok polymérneho peptidu alebo fúzneho proteínu vyvolávajúci imunitnú odpoveď tvorí komponent (b).
Tieto imunogény sa výhodne používajú vo forme konjugátov aspoň jednej funkčnej priestorovej štruktúry tvoriacej imunogénny nosič (b).
V obzvlášť výhodnom usporiadaní vynálezu sa funkčné priestorové štruktúry mimotopového peptidu BSW17, t. j. časti tvoriace komponent (a), skladajú alebo obsahujú aminokyselinové sekvencie vybraté z nasledujúcich sekvencií: Ile-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val (A) (Sekvencia č. 1), Arg-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val (B) (Sekvencia č. 2), Arg-Ser-Arg-Ser-Gly-Gly-Tyr-Trp-Leu-Trp (C) (Sekvencia č. 3), Val-Asn-Leu-Thr-Trp-Ser-Arg-Ala-Ser-Gly (D) (Sekvencia č. 4), Val-Asn-Leu-Pro-Trp-Ser-Arg-Ala-Ser-Gly (E) (Sekvencia č.5), Val-Asn-Leu-Thr-Trp-Ser-Phe-Gly-Leu-Glu (F) (Sekvencia č. 6), Val-Asn-Leu-Pro-Trp-Ser-Phe-Gly-Leu-Glu (G) (Sekvencia č. 7), Val-Asn-Arg-Pro-Trp-Scr-Phe-Gly-Leu-Glu (H) (Sekvencia č. 8), Val-Lys-Leu-Pro-Trp-Arg-Phe-Tyr-Gln-Val (I) (Sekvencia č. 9), Val-Trp-Thr-Ala-Cys-Gly-Tyr-Gly-Arg-Met (J) (Sekvencia č. 10), Gly-Thr-Val-Ser-Thr-Leu-Ser (K) (Sekvencia č. 11), Leu-Leu-Asp-Ser-Arg-Tyr-Trp (L) (Sekvencia č. 12), Gln-Pro-Ala-His-Ser-Leu-Gly (M) (Sekvencia č. 13), Leu-Trp-Gly-Met-Gln-Gly-Arg (N) (Sekvencia č. 14), Leu-Thr-Leu-Ser-His-Pro-His-Trp-Val-Leu-Asn-His-Phe-Val-Ser (O) (Sekvencia č. 15), Ser-Met-Gly-Pro-Asp-Gln-Thr-Leu-Arg (P) (Sekvencia č. 16), alebo
Val-Asn-Leu-Thr-Trp-Ser (Q) (Sekvencia č. 17).
Vo výhodnom usporiadaní sa najviac používajú sekvencie (A), (D) a (G), v obzvlášť výhodnom usporiadaní sekvencie (A) a (D).
Vynález ďalej zahŕňa farmaceutické zmesi, hlavne vakcíny, skladajúce sa z molekúl imunogénu, ako už bol definovaný a príslušného adjuvans.
Vynález sa ďalej týka ligandov, to znamená protilátok a fragmentov od nich odvodených, namierených proti mimotopovým peptidom BSW17, použitých na „pasívnu imunizáciu“ (pozri ďalej), pričom protilátka alebo jej fragmenty tiež rozpoznávajú prirodzený epitop pre BSW17 na ľudskom IgE. Vo výhodnom usporiadaní vynález opisuje ligandy obsahujúce doménu protilátky špecifickú pre časť mimotopového peptidu BSW17 tak, ako bol definovaný, pričom doména protilátky reaguje so sekvenciou aminokyselín na ťažkom reťazci IgE, ktorý obsahuje prirodzený epitop rozpoznávaný BSW17. Takéto ligandy sa môžu produkovať v tele cicavcov ako polyklonálne a monoklonálne protilátky. Vo výhodnom usporiadaní vynálezu sú uprednostňované monoklonálne protilátky, obzvlášť vo forme svojich Fab' fragmentov alebo F(ab')2 fragmentov.
Vynález ďalej opisuje spôsob prípravy imunogénu podľa vynálezu, čo zahŕňa kovalentná väzbu
a) najmenej jedného mimotopového peptidu so
b) skupinou schopnou vyvolať imunitnú odpoveď proti tomuto peptidu.
Vynález ďalej opisuje použitie spomenutých imunogénnych molekúl ako liečiva, to znamená na liečenie ochorení ovplyvnených IgE, ako sú alergie a atopická dermatitída.
Vynález sa ďalej týka použitia opísaných imunogennych molekúl na prípravu farmaceutických kompozícií, predovšetkým vakcín, proti ochoreniam zapríčineným IgE, najmä alergiám a atopickej dermatitíde.
Ďalšie výhodné použitie vynálezu sa týka spôsobu preventívnej a liečebnej imunizácie proti ochoreniam zapríčineným IgE, ako sú alergie a atopická dermatitída, čo zahŕňa podávanie terapeuticky účinného množstva definovaných imunogénnych molekúl pacientovi, ktorý potrebuje takéto liečenie.
Imunogény podľa vynálezu, ktoré v podstate nie sú schopné sprostredkovať necytologické uvoľnenie histamínu, sú na druhej strane schopné vyvolať tvorbu protilátok so silnou sérologickou krížovou reaktivitou s cieľovou aminokyseiinovou sekvenciou Fc časti IgE. Sú preto použiteľné na prípravu vakcín alebo priamo ako vakcíny.
Začiatočná dávka imunogénu (to znamená približne od 0,2 mg do približne 5 mg, výhodne okolo 1 mg) je napríklad podávaná intramuskuláme, nasledujú rovnaké opakované imunizačné dávky o 14 a 28 dní neskôr. Dávky sú samozrejme závislé od veku, hmotnosti a všeobecného zdravotného stavu pacienta. Imunizácia môže byť „aktívna“ alebo „pasívna“.
Pri „aktívnej“ imunizácii pacient dostáva imunogén podľa vynálezu a tým je aktívne indukovaná anti-hlgE odpoveď pacientovým imunitným systémom.
„Pasívna“ imunizácia spočíva v podávaní anti-BSW17 mimotopových protilátok, polyklonálnych alebo monoklonálnych, pacientovi trpiacemu ochorením vyvolaným IgE, najlepšie vo forme injekcií.
Polyklonálne anti-BSW17 mimotopové protilátky môžu byť pripravené podávaním imunogénu podľa vynálezu, vo výhodnom použití spolu s adjuvans, cicavcom, nie však človeku. Potom sa zhromažďuje vznikajúce antisérum. Zvýšenie titrov antisér sa môže dosiahnuť pomocou opakovaných injekcií v určitom časovom úseku. Nie je špeciálne obmedzenie pre druh cicavcov používaných na tvorbu pro tilátok, vo všeobecnosti sa používajú králiky alebo morčatá, ale môžu byť použité aj kone, mačky, psy, kozy, potkany, kravy, ovce a tak ďalej. Na prípravu protilátok sa určité množstvo imunogénu podľa vynálezu zriedi fyziologickým pufrovaným roztokom na požadovanú koncentráciu a vzniknutý zriedený roztok sa zmieša s kompletným Freundovým adjuvans tak, aby vznikla suspenzia.
Suspenzia sa podáva cicavcom, a to intraperitoneálne, to znamená králikovi od okolo 50 g do 2500 g imunogénu podľa vynálezu na jednu dávku. Suspenzia sa vo výhodnom usporiadaní podáva každých štrnásť dní počas dvoch až troch mesiacov, najčastejšie však jeden mesiac, čím sa ovplyvni účinnosť imunizácie. Protilátka sa získava zhromažďovaním krvi imunizovaných zvierat počas jedného až dvoch týždňov po poslednej dávke, krv sa centrifuguje a izoluje sa z nej sérum.
Monoklonálne anti-BSW17 mimotopové protilátky môžu byť buď ľudské alebo myšie. Vo výhodnom usporiadaní je pacient liečený podávaním Fab' fragmentov z myších monoklonálnych protilátok alebo chimérických ľudských-myších protilátok (obsahujúcich Fc oblasť ľudských a Fab1 časť myších protilátok) tak, aby sa minimalizovala nepriaznivá reakcia na cudzí živočíšny imunoglobulín. Myšie monoklonálne protilátky boli pripravené spôsobom podľa Kohlera a Milsteina (Kohler, G., Milstein, C., Náture 256 (1975), strana 495), to znamená fúziou buniek sleziny hyperimunizovaných myši so zodpovedajúcou myšou myelómovou bunkovou líniou. Na prípravu ľudských monoklonálnych protilátok sa používa mnoho spôsobov vrátane prípravy pomocou:
1. B-buniek transformovaných vírusom Epsteina a Barovej (EBV)
2. bunkových línií na hybridizáciu B lymfocytov
3. myších-ľudských hybridómov
4. ľudských-ľudských hybridómov
5. ľudských x ľudských - myších heterohybridómov a
6. klonovania náhodných fragmentov (phage display)
V obzvlášť výhodnom usporiadaní sa používajú ľudské x ľudské-myšie heterohybridómy, čím sa dosiahne kombinácia výhodných vlastnosti oboch použitých typov, tak ľudských, ako aj myších rodičovských bunkových línií. Dokázalo sa, že ľudské-myšie heterohybridómové bunkové línie sú vhodné na fúziu B buniek (Teng, N.N.M. a ďalší, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983) strana 7308).
Ak sú tieto hybridómy použité na imunizáciu, je možné vo výhodnom usporiadaní protilátku zaviesť do hostiteľského organizmu intramuskulámou injekciou. Výhodne sa dajú použiť všetky kvapalné alebo pevné nosiče, ktoré sú prijateľné pre hostiteľský organizmus a nevyvolávajú v hostiteľovi vedľajšie účinky ani nemajú škodlivé účinky na vakcínu. Ako nosič Je možné použiť fosfátom pufrovaný fyziologický roztok (PBS) pri fyziologickom pH, to je okolo pH 6,8 až 7,2, najlepšie okolo 7,0, a to samotný alebo v zmesi s vhodným adjuvans, ako sú adjuvanty na báze hydroxidu hlinitého. Koncentrácia imunogénneho antigénu sa môže pohybovať v rozmedzí od 50 g do 500 g, najčastejšie však od 200 g do 300 g na injekciu. Celkový objem aplikovaného roztoku s antigénom sa všeobecne pohybuje v rozmedzí 0,25 ml až do 1 ml, najčastejšie okolo 0,5 ml.
Po aplikácii začiatočnej injekcie je potrebné aplikovať ďalšie injekcie, ktoré môžu byť podávané napríklad v ročných intervaloch.
Pokiaľ ide o „aktívnu“ imunizáciu, ktorá sa prednostne používa v humánnej medicíne, aleje možné ju použiť podobne aj pri ďalších cicavčích druhoch, je možné aplikovať mimotopy zodpovedajúce IgE príslušného druhu, ako sú napríklad psie IgE mimotopy pri imunizácii psov. Použitý termín imunologický nosič zahŕňa také materiály, ktorých vlastnosťou je, že po aplikácii samy vyvolávajú imunitnú odpoveď v živočíšnom hostiteľovi, a ktoré môžu byť kovalentne viazané na polypeptid, a to buď priamo cestou tvorby daného peptidu, alebo pomocou esterických väzieb medzi voľnými karboxylovými, amino alebo hydroxyskupinami v polypeptide a zodpovedajúcimi skupinami na imunogénnom materiáli nosiča, alebo tiež pomocou väzby použitím bežných bifunkčných spojovacích skupín, či ako fúzny proteín.
Príklady takýchto nosičov zahŕňajú: albumíny, ako je BSA, globulíny, tyreoglobulíny, hemoglobíny, hemocyaníny, (zvlášť potom z morských priliepavcov - Keyhole limpet hemocyanin, KLH), proteiny izolované z hlíst, to znamená extrakt z hlíst (ascaris), ako je opísaný v J. Immun. 111 (1973) strana 260 až 268), J. Immun. 122 (1979), strana 302 až 308, J. Immun. 98 (1967), strana 893 až 900 a Am. J. Physiol. 199 (1960), strana 575. Ďalej sa používajú aj ich purifíkované produkty, ďalej polylyzín, polyglutámová kyselina, kopolyméry lyzínu a kyseliny glutámovej, kopolyméry obsahujúce lyzín alebo omitín, a tak ďalej. Ako materiál pre imunogénne nosiče sa v poslednom čase na prípravu vakcíny používa difterický toxoid a tetanový toxoid (Lepow, M.L. a ďalší, J. of Infectious Diseases 150 (1984), strana 402-406, Coen Beuvery, E. a ďalší, Infection and Immunity 40 (1983), strana 39-45). Tieto toxoidné materiály boli tiež použité vo vynáleze. Vo výhodnom usporiadaní podľa schémy na „aktívnu“ imunizáciu sa používa purifikovaný proteín odvodený od tuberkulínu (PDD), pretože
1. sám osebe neindukuje odpoveď T buniek, (to znamená, že tu ide o „T -bunkový haptén“), ale správa sa ako úplne funkčný antigén a je rozpoznávaný samotnými T bunkami,
2. je známy ako jeden z najúčinnejších „nosičov“ kovalentne pripojených hapténov a
3. môže byť použitý v ľudskom organizme bez ďalšieho testovania.
Na prípravu antigénu podľa vynálezu sa dajú použiť všetky činidlá na väzbu haptén-nosič, ktoré sa na tieto reakcie používajú, napríklad tie, ktoré už boli spomenuté, alebo budú ďalej uvedené v príkladoch.
Podľa vynálezu je možné kovalentnú väzbu komponentu (a) k časti (b) dosiahnuť známymi postupmi. Tak napríklad na priamu kovalentnú väzbu sa dáva prednosť použitiu väzbových činidiel, ako sú bis-N-sukcinimidylové deriváty, v zvlášť výhodnom usporiadaní bis(sulfosukcinimidjsuberát (BSS). Na vytvorenie kovalentnej väzby peptidu (a) k materiálu imunogénneho nosiča (b) je možné tiež využiť glutaraldehyd alebo karbodiimid, výhodnejší je však dicyklohexylkarbodiimid (DC) alebo l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid.
Množstvo hapténu a činidiel používaných na väzbu haptén-nosič (t. j. komponentu (a) a nosiča (t. j. komponentu (b)) sa dá zistiť obvyklým spôsobom. Vo výhodnom usporiadaní sa množstvo nosiča pohybuje v jeden až šesťnásobku hmotnosti hapténu, v ešte výhodnejšom usporiadaní vynálezu v jeden až päťnásobku hmotnosti hapténu. Väzbové činidlo sa používa v množstve päť- až desaťnásobku molámeho ekvivalentu hapténu. Po prebehnutí reakcie, keď je nosič naviazaný na haptén pomocou väzbového činidla, sa získa požadovaný antigén skladajúci sa z peptidu a nosičového komplexu. Vzniknutý imunogén podľa vynálezu môže byť ďalej izolovaný všeobecne používanými postupmi, ako sú napríklad dialýza, gélová filtrácia, frakčná precipitácia, a tak ďalej.
cfu
DC EBV ELISA FcERI
FcS h HEPES
HRP HSA
IgE
IPTG KLH
Tiež príprava východiskového materiálu môže byť uskutočnená pomocou bežných postupov. Peptidy vhodné na použitie ako komponent (a) môžu byť napríklad identifikované výberom náhodných peptidov exprimovaných na povrchu fágov v takzvaných „phage display knižniciach“, alebo klasicky syntetizované postupom syntézy na pevnej fáze, napríklad pre cyklické peptidy dobre známa metóda využívajúca „F-moc“ chémie, alebo tiež môžu byť identifikované použitím peptidomimetickej stratégie výberom z náhodne syntetizovaných peptidov.
Zoznam použitých skratiek Ac acetyl
AMS síran amónny
BSA hovädzí sérový albumín
BSS bis(sulfosuccinimidyl) suberate
BSW 17 monoklonálna protilátka IgE namierená proti CH3 epitopu native IgE (pozri J.Knutti-MuHer a ďalší, Allergy 41 (1986) strana 457 až 465; S. Miescher a ďalší, Int. Árch. Allergy Immunol. 105 (1994) strana 75) mimotopový peptid protilátky BSW17 peptid napodobňujúci prirodzený epitop na povrchu ľudskej IgE, ktorý je tiež rozoznávaný monoklonálnou protilátkou BSW17 proti ľudskej IgE kolóniu tvoriaca jednotka, meradlo koncentrácie baktérií dihexylkarbodiimid vírus Epsteina a Barovej imuno-enzymatický test na pevnej fáze vysoko afínitný receptor 1 pre konštantnú oblasť IgE fetálne teľacie sérum ľudský N-2-hydroxyetylpiperazin-N'-2-etánsulfónová kyselina chrenová peroxidáza ľudský sérový albumín imunoglobulín E izopropyl-D-tiogalaktozid hemocyanin z morských priliepavcov Megathura crenulata (keyhole limpet hemocyanin) monoklonálna protilátka proti ľudským IgE Allergy (1986), pozri vyššie; Int. Árch. Allergy Immunol. (1994) pozri vyššie) platne podľa Luriu a Bertaniho peptid napodobňujúci aspoň časť prirodzeného konformačného cieľového epitopu protilátky fosfátom pufrovaný fyziologický roztok polyetylénglykol purifikovaný proteínový derivát tuberkulínu rekombinantný ľudský interleukín-3 platne pre rádio-imunologické testy štandardné médium pre bunkové kultúry (Sigma, St. Luis, USA) rozpustný leukotrién fyziologický roztok pufrovaný Tris-bázou pomocný fág VCS M13 (Stratagene, USA).
Le27 platne LB mimotopový peptid
PBS
PEG
PPD rh IL-3 platne RIA RPMI1640 sLt
TBS
VCS
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obrázok 1: Interakcia medzi protilátkou IgE a jej vysokoafínitným receptorom.
Obrázok 2: Schéma vakcinácie proti IgE „klasickou“ cestou, tmavé protilátky sú protilátky neutralizačné, svetlé znázorňujú neinhibičné protilátky s možným anafylaktogénnym účinkom.
Obrázok 3: Profil biologickej aktivity protilátky BSW17. Označené miesta účinku znamenajú: 1. neanafylaktogénnu väzbu na IgE, 2. odstránenie IgE viazaných na bunkovom povrchu, 3. neutralizáciu rozpustných IgE, 4. inhibíciu syntézy IgE.
Obrázok 4: Imunoterapia založená na použití mimotopových peptidov protilátky BSW17, tmavo vyznačené protilátky sú analógy BSW17 so všetkými štyrmi spomenutými spôsobmi účinku.
Obrázok 5: Špecifická interakcia medzi mimotopovými peptidmi protilátky BSW17 vystavenými na povrchu fága a protilátkou BSW17, vľavo sú vždy častice fága klonu 1 a vpravo klonu 18.
Obrázok 6: Kompetitívna inhibícia väzby protilátky BSW17 na IgE pomocou mimotopových peptidov protilátky BSW17. Na zvislej osi je znázornená aktivita viazanej l25I-IgG (v cpm) na vodorovnej osi je kompetícia s IgE-SUS11 (pg/ml), štvorček platí pre peptid PhBSW.Negl, trojuholník s vrcholom hore pre peptid PhBSW.6-9 a nakoniec trojuholník s vrcholom dole pre peptid PhBSW.29-8.
Obrázok 7: Väzba chemicky syntetizovaného mimotopového peptidu protilátky BSW17 k tejto protilátke. Na zvislej osi je pomer emitovaného (530 nm) žiarenia k žiareniu excitačnému (500 nm) v percentách, na vodorovnej osi je koncentrácia protilátky BSW17 v M. Väzbové podmienky sú uvedené v rámčeku.
Obrázok 8a: Rozpoznávanie cyklického mimotopového peptidu protilátky BSW17 GEFCINHRGYWVCGDPA naviazaného na KLH pomocou BSS (SDS 236) a peptidu Fc (500-509) naviazaného na KLH tiež pomocou BSS (SDS 237) protilátkou BSW17. Na zvislej osi sú uvedené odčítané hodnoty OD405, na osi vodorovnej koncentrácia protilátky BSW17 v g. Krivka so štvorčekmi platí pre peptid SDS236, trojuholníky s vrcholom hore pre peptid SDS237 a nakoniec krivka s krúžkami pre samotný KHL.
Obrázok 8b: Rozpoznávanie rôznych mimotopových konjugátov protilátky BSW17 touto protilátkou. Na vodorovnej osi sú uvedené odčítané hodnoty OD405.
Obrázok 9a: Špecifické rozpoznávanie mimotopových konjugátov protilátky BSW17 (BSA (DC)) a konjugátov peptidu Fc (500-509) s KLH (spojené pomocou glutaraldehydu) protilátkou BSW17. Na zvislej osi sú uvedené odčítané hodnoty OD450.
Obrázok 9b: Špecifické rozpoznávanie konjugátov mimotopových peptidov protilátky BSW17 spojených s KLH pomocou DC alebo lyzínu protilátkou BSW17. Na zvislej osi sú uvedené hodnoty OD405. Experimentálne hodnoty v stĺpcoch označených „n.d.“ neboli stanovené.
Obrázok 10a: Imunitná odpoveď proti ľudským protilátkam IgE vyvolaná v králikovi po imunizácii konjugátmi mimotopových peptidov protilátky BSW17 (1). Na zvislej osi sú uvedené hodnoty OD405. R1 až R4 sú rôzne pokusné zvieratá, riedenie séra bolo nasledujúce: najtmavšie stĺpce 1 : 50, stredne sivé 1 : 100 a biele stĺpce 1 : 500.
Obrázok 10b: Imunitná odpoveď proti ľudským protilátkam IgE vyvolaná v králikovi po imunizácii konjugátmi mimotopových peptidov protilátky BSW17 (2). Na zvislej osi sú uvedené hodnoty OD405. Na vodorovnej osi potom rôzne použité peptidy.
Obrázok 11: Titer protilátok v sére králikov imunizovaných mimotopovými peptidmi protilátky BSW17. Na zvislej osi sú uvedené hodnoty OD450. Na osi vodorovnej potom riedenie séra. Krivky s prázdnymi štvorčekmi zodpovedajú protilátkam reagujúcim s mimotopmi a krivky s krúžkami protilátkam reagujúcim s hlgE (JW8). V hornej časti obrázku bol králik imunizovaný konjugátom KLH SDS213, v dolnej časti obrázku.
Obrázok 12: Izotypová špecificita odpovede proti ľudským IgE u králikov imunizovaných konjugátom mimotopového peptidu protilátky BSW17. Na zvislej osi sú uvedené hodnoty OD450. R1 a R4 sú rôzne pokusné zvieratá, ktoré boli imunizované rôznymi peptidmi (R2 peptidom DSD214; R4 peptidom SDS213).
Obrázok 13: Kompetitívny väzbový test séra na imunizáciu mimotopovým peptidom BSW17 a protilátky BSW17. Sérum aj protilátka sa kompetitívne viažu na IgE. Na zvislej osi sú uvedené hodnoty OD450. Svetlejšie šrafovaný stĺpec zodpovedá väzbe v neprítomnosti protilátky BSW17, tmavo šrafovaný stĺpec potom s prídavkom 5 g neoznačenej protilátky BSW17.
Obrázok 14: Väzba afinitne purifikovaných protilátok proti mimotopovým peptidom BSW17 na ľudský IgE.
Obrázok 15: Test anafylaktogénnych účinkov králičieho anti-BSW17 mimotopového séra a afinitne purifikovaných anti-BSW17 mimotopových protilátok na ľudské krvné bunky (pg/ml sLt).
Uvedené symboly znamenajú:
R2/0 a R4/0 sú preimúnne séra králikov R2 a R4; R2/SDS214 a R4/SDS213 sú séra králikov R2 a R4 65 dní po primárnej imunizácii;
anti-SDS213 a anti-SDS214 sú afinitne purifikované anti BSW17 mimotopové protilátky;
R2/0 PC a R4/0 PC sú pozitívne kontroly pri ktorých došlo k spusteniu odpovede v prítomnosti králičieho séra.
Koncentrácia vzoriek:
A = 0,1 pg anti BSW 17 mimotopovej protilátky (alebo ekvivalent v úplnom králičom sére) na 1 ml;
B = 0,1 pg anti BSW17 mimotopovej protilátky (alebo ekvivalent v úplnom králičom sére) na 1 ml;
C = 5,0 pg anti BSW17 mimotopovej protilátky (alebo ekvivalent v úplnom králičom sére) na 1 ml;
Vynález bude bližšie opísaný v nasledujúcich príkladoch. Príklady majú možno uskutočnenie vynálezu len ilustrovať a v žiadnom prípade ho nijako neobmedzujú.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Antialergický potenciál monoklonálnej protilátky BSW17 generovanej proti ľudskému hlgE
Ako model na testovanie antialergickej kapacity protilátky BSW17 a protilátok podobných protilátke BSW17 vyvolaných v ľudských pacientoch aktívnou imunizáciou mimotopovými peptidmi BSW17 sa sledoval účinok protilátky BSW17 na uvoľňovanie histamínu bunkami podobnými bazofilom. Bazofilom podobné bunky sa získali z bunkovej kultúry buniek kostnej drene s rhIL-3.
Z kostnej drene pacientov vyžadujúcich náhradu hlavice stehennej kosti boli pripravené monocyty pomocou sedimentácie v systéme Ficoll-Hypaque s hustotou 1,077 g/ml pri 400 g. 5 x 105 buniek/ml bolo kultivovaných v RPMI1640 médiu obsahujúcom 15 % FCS (fetálneho teľacieho séra a 2 ng/ml ľudského rhIL-3. Po 6 dňoch kulti vácie pri teplote 37 °C v atmosfére 5 % CO2 bol pridaný rovnaký objem média s obsahom rhIL-3. Na dvadsiaty deň boli bunky zhromaždené a použité na pasívnu senzibilizáciu (alergizáciu) a na testy uvoľňovania histamínu.
Približne 5 x 105 kultivovaných buniek z kostnej drene bolo inkubovaných v HA pufri (20 mM HEPES; pH = 7,4; 0,3 mg/ml HAS) s prídavkom 500 ng/ml ľudského IgE v prítomnosti alebo neprítomnosti 50-násobného prebytku monoklonálnej protilátky anti-IgE v celkovom objeme 1 ml. Po 2 hodinovej inkubácii pri teplote 37 °C sa v bunkových supematantoch odmerala koncentrácia histamínu uvoľneného v priebehu pasívnej senzibilizácie. Na spustenie uvoľňovania histamínu sa použil bunkový sediment. Na určenie množstva priamo uvoľneného histamínu sa bunky pasívne senzibilizovanej kostnej drene resuspendovali v 0,3 ml pufra HMC (HA pufor s prídavkom 0,6 M CaCl2 a 1 mM MgCl2) a inkubované s 0,1 pg/ml anafylaktogénnej monoklonálnej anti-IgE protilátky Le27. Množstvo histamínu v supematante a v bunkovom sedimente sa meralo pomocou automatického analyzátora Technicon Autoanalyzer II (Technicon, Tarrytown, New York, USA). Percento uvoľneného histamínu sa vypočítalo pomocou vzorca: uvoľnený histamín (%) = histamín v supematante / (histamín v supematante + histamín v bunkovom sedimente * 100). Percento uvoľneného histamínu počas pasívnej senzibilizácie sa vypočítalo pomocou vzorca: uvoľnený histamín (%) = histamín v supematante (po pasívnej senzibilizácii) / [histamín v supematante ( po spustení bunkovým sedimentom) + histamín v supematante (po pasívnej senzibilizácii) + histamín v bunkovom sedimente]. Množstvo histamínu špecificky uvoľneného pomocou anti-IgE protilátok sa vypočítalo pomocou vzorca: špecificky uvoľnený histamín(%) = % celkovo uvoľneného histamínu - % spontánne uvoľneného histamínu.
Výsledky troch nezávislých experimentov sú zhrnuté v tabuľke:
Tabuľka 1
Účinok anti-IgE protilátok na uvoľňovanie histamínu v bunkách senzibilizovanej kostnej drene
| Špecifické uvoľnenie histamínu (%)** | ||||
| Experiment 1 | Experiment 2 | Experiment 3 | ||
| Aktivované A B | A | B | A | B |
| pomocou* | ||||
| IgE (kontrola) 3,0 10,3 | 4,3 | 11,0 | 1,5 | 36,5 |
| + BSW17 3,6 3,1 | 3,0 | 1.5 | 4,4 | 0,9 |
| + Le27 11,0 2,7 | 8,7 | 1.7 | 15,7 | 3,8 |
*) bunky z ľudskej kostnej drene kultivované s prídavkom 2 ng/ml rhIL-3 sú pasívne senzibilizované pomocou 0,5 g/ml IgE alebo pomocou 0,25 g/ml IgE a anti IgE protilátok.
**) A: Histamín uvoľnený počas senzibilizácie
B: Histamín uvoľnený po aktivácii 0,1 g/ml monoklonálnej protilátky anti-IgE Le27.
Údaje v tabuľke 1 jasne ukazujú, že bunky kostnej drene inkubované s IgE a s protilátkou BSW17 neuvoľňujú počas senzibilizácie histamín, ale nie sú aktivované prídavkom protilátky Le27. Bunky kostnej drene inkubované s IgE a Le27 sú aktivované už počas pasívnej senzibilizácie do takej miery, že väčšie množstvo histamínu sa neuvoľ ňuje ani počas druhej inkubácie s touto anafylaktogénnou monoklonálnou protilátkou.
Bunky kostnej drene pasívne senzibilizované v neprítomnosti jednej z monoklonálnych anti-IgE protilátok však po aktivácii protilátkou Le27 účinne uvoľňujú histamín.
Dá sa predpokladať, že a) samotná protilátka BSW17 nie je anafylaktogénna a b) protilátka BSW17 chráni ľudské bazofily pred uvoľňovaním histamínu indukovaným prídavkom aktivačných látok. Preto vznik protilátok podobných BSW17 u alergických pacientov po aktívnej imunizácii mimotopovými peptidmi k BSW 17 môže imunizovanému hostiteľovi poskytnúť ochranu pred alergickými reakciami.
Príklad 2
Prehľadávanie kombinatorickej knižnice peptidov exprimovaných na povrchu fágových častíc (phage display library) a výber pozitívneho klonu
Častice bakteriofágov špecificky rozpoznávané protilátkou BSW17 sa dajú identifikovať pri prehľadávaní knižníc fágov exprimujúcich na povrchu lineárne alebo cyklické náhodné peptidy pozostávajúce zo 6 až 15 aminokyselinových zvyškov naviazaných na fágové peptidy pili respektíve p VIII. Na amplifikáciu fágovej knižnice sa použili 2 ml tekutej kultúry E. coli kmeňa XL-I Blue vypestovanej v SB médiu po dosiahnutí hustoty ODmo=1,0. Baktérie sa inkubujú s 1010 fágovými časticami počas 15 minút pri izbovej teplote. Potom sa pridá 10 ml SB média obsahujúceho 10 mg/ml tetracyklínu a 20 pg/ml karbenicilínu a 10 μΐ, 1 μΐ a 0,1 pl alikvóty sa vysejú na platne LB s obsahom 100 pg/ml karbenicilínu. Kultúry sa inkubujú pri teplote 37 °C pri energickom pretrepávaní počas jednej hodiny, potom sa pridá 100 ml SB média obsahujúceho 10 pg/ml tetracyklínu a 50 pg/ml karbenicilínu a inkubácia pokračuje ďalšiu hodinu. Po tejto hodinovej inkubácii sa pridá 1012 cfu (colony forming units) pomocného fága VCS M13. Po dvoch hodinách energického pretrepávania pri 37 °C sa pridá kanamycín tak, aby jeho výsledná koncentrácia bola 70 pg/ml a inkubácia pokračuje cez noc. Po 20 minútovej centrifugácii pri 4 000 g a 4 °C sa k supematantom pridá 38 ml ľadového sterilné prefiltrovaného roztoku 12 % NaCl a 16 % PEG 8000, médium sa 30 minút chladí na ľade a potom opäť 30 minút centrifuguje pri 10 000 g a 4 °C. Fágový sediment sa rozpustí v 2 ml TES pufra s obsahom 1,5 % kazeínu a uskladní sa pri 4 °C. Na testovanie biologickej aktivity sa používajú RIA platne Costar 3690 potiahnuté protilátkou BSW17 s koncentráciou 20 pg/ml v 0,1 M uhličitanovom pufri pH 9,6. Poťahujúca protilátka sa inkubuje cez noc pri teplote 4 °C. Voľné väzbové miesta sa potom zablokujú TBS pufrom s obsahom 1,5 % kazeínu. Do jamiek sa potom pridá 2 x 10 pfu fágov a platne sa inkubujú pri teplote 37 °C. Po aplikácii fágových častíc sa platne desaťkrát premyjú pufrom PBS s 0,1 % Tweenom 20. Jamky sa potom ešte vypláchnu vodou a naviazané fágové častice sa 10 minút eluujú prídavkom 200 μΐ 0,1 M HC1, pH 2,2. Eluované fágové častice sa neutralizujú 2M Tris-bázou a amplifikujú už opísaným spôsobom.
Selekcia pozitívneho klonu sa uskutočňuje tak, že sa inkubuje 50 TI kvapalnej kultúry E.coli XL-1 blue vypestovanej v médiu-SB po dosiahnutie OD60o= 1,0 s 1 μΐ 108-krát zriedenými amplifikovanými fágovými časticami po treťom kole selekcie. Inkubácia prebieha 15 minút pri izbovej teplote, potom sa fágy vysejú na LB platne s 100 pg/ml karbenicilínu a pestujú sa cez noc. Náhodne vybraté kolónie sa vysejú na platne LB obsahujúce 100 pg/ml karbenicilínu. Po 4 hodinách pri teplote 37 °C sa na platne priložia tiitrocelulózové filtre navlhčené lOmM IPTG a v inkubácii sa pokračuje pri teplote 32 °C cez noc.
Potom sa filtre odstránia a inkubujú sa 30 minút pri teplote 37 °C v atmosfére CHC13. Zvyšky baktérií sa odstránia pomocou 1 hodinovej inkubácie filtrov v pufri obsahujúcom 50 mM Tris, pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 3 % BSA, 100 U DNAázy I a 40 mg lyzozýmu na 100 ml. Potom sa filtre zablokujú pufrom TBS obsahujúcim 1,5 % kazeín a inkubujú sa cez noc s protilátkou BSW 17-POX (protilátka BSW17 naviazaná na proteín POX) v TBS pufri s 5 % obsahom kazeínu. Filtre sa potom premývajú každým z pufrov TBS, TBS s 0,5 % Tweenom 20 a opäť s TBS. Prúžky vyrezané z filtrov sa farbia inkubáciou v roztoku obsahujúcom 600 pg 4-chloro-l-naftolu na 1 ml a 0,042 % peroxidu vodíka v TBS.
Príklad 3
Charakterizácia fágových častíc exprimujúcich peptid napodobňujúci prirodzený epitop protilátky BSW17 (mimotopový peptid protilátky BSW17)
Rôzne fágové častice, ktoré nesú na povrchu cirkulámy peptid pozostávajúci zo siedmich, ôsmich alebo deviatich aminokyselín a lineárne peptidy pozostávajúce z desiatich a pätnástich aminokyselinových zvyškov, boli identifikované vďaka schopnosti viazať sa na protilátku BSW17. Bola zistená nukleotidová sekvencia DNA kódujúca tieto peptidy. Na základe ich vzájomnej homológie so zodpovedajúcimi oblasťami Fc, môžu byť z DNA sekvencií rozlíšené 3 skupiny fágov vystavujúcich peptidy rozoznávané protilátkou BSW17. Ich prehľad jc v tabuľke 2.
Druhý peptid v skupine A nižšie (SEQ ID NO: 19) je peptid (A) s dvoma dodatočnými Cys na cirkularizáciu. Ďalšie tri peptidy (sekvencia SEQ ID NO: 18, 20, 21) sú ďalšie peptidy pripravené podobným spôsobom.
Tabuľka 2
Peptidové sekvencie vystavené na povrchu fágov s mimotopovým peptidom protilátky BSW17
Skupina A:
| CyS | xŕc | Arg | H1S | Asn | Tyr | p Glv | O ?h e | 0 TrD | O VaL | Cys | n=3 | |
| D Íle | P Asn | His | Arg | P Glv | P Tvr | 0 Trn | o Val | Cvs | r,= 3 | - | ||
| CVS | P Thr | o Leu | His | P Thr | P Glv | P Tvr | 0 Trp | 0 Val | Cvs | n=2 | ||
| Cys | P | O Leu | P Ser | 0 Val | 0 Phe | P Glv | P | 0 'rp | o Val | cys | n= 1 | --------------------J |
+ = pozitívne nabitý p = nenabitý polárny o = nepolámy a = počet klonov, ktoré majú zodpovedajúce sekvencie +(++), +/- = intenzita rozpoznania pomocou protilátky BSW17 (t. j. sekvencia SEQ ID NO: 18, 19, 20, respektíve 21)
Skupina B:
| vsi | Leu | Pro | Css ! S« | Phe | Gly | Leu | Glu | |
| ( V c' | Asn | -c | ?so | Tro Ser | Phe | Gly | Leu | Glu |
| i Val | r yc | Pro | Trp Arg | Phe | Tvr | Gin | Val |
Tieto tri peptidy zo skupiny B sú peptid (G) (sekvencia SEQ ID NO: 7), peptid (H) (sekvencia SEQ ID NO: 8) a peptid (I) (sekvencia SEQ ID NO: 9).
Skupina C:
| Leu | Thr | Leu | Ser | -----------------------------------------------------! | Trp | Val | Leu | A S r. | Hr? | ?rpjval | Per | ||
| Val | Trp | Thr | Ala | Gly | Arg | Met | j | ||||||
| <ys | Ser | Met | »1? | 1 | Thr | Leu | Arg | cys | i | ||||
| « '1. | Aíp | Trp | Cys | ! | |||||||||
| F . | Ala | í?.i s | S e- | c:.y | -y s | ||||||||
| --- | Trp | Glv | Met. | G1 | “C | :ys | : | ||||||
| Cys | G' y | ľhr | Včl | Leu | S e. r | Cys |
Uvedené peptidy zo skupiny C sú peptid (0) (sekvencia SEQ ID NO: 15), peptid (J) (sekvencia SEQIDNO: 10) a peptid (P) s dvoma dodatočnými cysteínmi (Cys) (sekvencia SEQ ID NO: 22), peptid (L) s dvoma dodatočnými cysteínmi (sekvencia SEQ ID NO: 23), peptid (M) s dvoma dodatočnými cysteínmi (sekvencia SEQ ID NO: 24), peptid (N) s dvoma dodatočnými cysteínmi (sekvencia SEQ ID NO: 25) a nakoniec peptid (K) s dvoma dodatočnými cysteínmi (sekvencia SEQ IDNO:26). Peptidy skupiny C s dvoma koncovými cysteínmi sú vysoko afinitné k protilátke BSW17. Celá skupina C nevykazuje sekvenčnú homológiu s Fcc; ide teda o pravé mimotopy, ktoré len napodobňujú priestorovú štruktúru povrchu pôvodného epitopu protilátky BSW17.
Ako vyplýva z tabuľky 2, C-koncové časti peptidov zo skupiny A sú vysoko konzervované a N-koncové časti, aj keď sú viac degenerované, obsahujú spoločné pozitívne nabité poláme aminokyselinové zvyšky. Toto rozdelenie náboja sa zdá byť podstatné na rozpoznanie protilátky BSW17, pretože jeden kloň, ktorému chýbajú v N-koncovej časti pozitívne nabité aminokyselinové zvyšky, vykazuje len veľmi slabú väzbu na protilátku BSW 17. V oblasti Fc nebol nájdený žiadny súvislý úsek aminokyselín s významnou sekvenčnou homológiou. Porovnanie sekvencii na základe podobných vzorov však dovoľuje prirovnanie týchto peptidov k úseku aminokyselín 500 až 508 v oblasti Ce4 domény. Stanworth a ďalší (Lancet 336 (1990) strana 1279) určili, že dekapeptid Fc 500 až 509 hrá úlohu v aktivácii žírnych buniek (mastocytov) pomocou na receptor viazaného IgE.
Peptidy zo skupiny B sú tiež navzájom vysoko homologické. Ich ďalšou vlastnosťou je, že ich N-koncová časť je takmer identická s aminokyselinovými zvyškami v pozíciách 370 až 375 Fce. Táto sekvencia je časťou C í: 3 a obsahuje oblasť, ktorá preukázateľne hrá úlohu vo väzbe IgE na príslušný vysoko afinitný receptor, alebo je v tesnej blízkosti tejto oblasti. To tiež vysvetľuje inhibíciu interakcie IgE/IgERI spôsobenú protilátkou BSW17.
Na základe uvedených údajov sa dá predpokladať, že komplexný konformačný epitop rozpoznávaný protilátkou BSW 17 obsahuje konformačné štruktúry pozostávajúce z úsekov aminokyselinových zvyškov 500 až 508 (v oblasti Ce3) a 370 až 375 (v oblasti Ce3) molekuly IgE. Uvedené číslovanie je podľa publikácie E. A. Padlana a D.R. Daviesa, Molecul. Immunol. 23 (1986), strana 1063. Protilátky, ktoré sa vytvoria v jedincovi po imunizácii mimotopmi skupín A a B naviazanými na vhodnú imunogénnu nosnú molekulu tak môžu chrániť pred alergickými reakciami. Mechanizmus ochrany spočíva v tom, že dôjde k zablokovaniu väzby IgE k príslušnému vysoko afinitnému miestu receptora alebo spusteniu degranulácie cieľovej bunky.
Peptidy zahrnuté v skupine C tabuľky 2 nevykazujú žiadnu významnú vzájomnú homológiu, rovnako tiež nevykazujú homológiu s Fce. Tieto peptidy teda reprezentujú „pravé mimotopy“ napodobňujúce trojrozmernú štruktúru rozpoznávanú monoklonálnou protilátkou BSW17. Použitie týchto mimotopov ako imunogénov rovnako bude viesť v imunizovanom hostiteľovi k vzniku antialergických protilátok podobných BSW17.
Vznik imunitnej odpovede podobnej BSW17, špecificky namierený proti cieľovému epitopu protilátky BSW17 na ľudský IgE bol dokázaný pre vybrané mimotopy a je znázornený v nasledujúcich príkladoch 4 až 6.
Príklad 4
Bakteriofágy vystavujúce na povrchu mimotopové peptidy BSW17 sú špecificky rozpoznávané protilátkou BSW17
Väzba mimotopových peptidov exprimovaných a vystavených na fágových časticiach (skupina A z tabuľky 2: prvý kloň zodpovedá klonu 1 na obrázku 5, t. j. peptidu Cys-Arg-Arg- -His-Asn-Tyr-Gly-Phe-Trp-Val-Cys podľa sekvencie SEQ ID NO: 18; druhý kloň zodpovedá klonu 18 na obrázku 5 t. j. peptidu Cys-Ile-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val-Cys podľa sekvencie SEQ ID NO: 19) na antigénšpecifickej hypervariabilnej oblasti protilátky BSW17 bola dokázaná pomocou ELISA testu. 10 pg monoklonálnej protilátky BSW17 (alebo podobnej protilátky) sa pokryjú jamky na mikrotitračnej platničke COSTAR podľa nasledujúceho štandardného ELISA postupu. Po zablokovaní pomocou BSA sa jamky inkubujú so 100 μΐ štandardného inkubačného ELISA pufra s obsahom častíc bakteriofága zo supematantov infikovaných bakteriálnych kultúr. Titer použitých bakteriofágov bol 109 cfu/ml. Po premytí sa platne inkubujú s 5 pg antiséra anti-M13 naviazaného na chrenovú peroxidázu (HRP) - (Pharmacia, Uppsala, Švédsko) v inkubačnom pufŕi. Všetky opísané inkubácie sa uskutočňujú pri izbovej teplote počas 1 hodiny. Po poslednom premytí sa fágové častice naviazané na poťahujúcu protilátku stanovia pomocou konjugátu anti-M13/HRP a chromogénneho substrátu v štandardných podmienkach. Na obrázku 5 je znázornená vysoká špecificita mimotopových fágov (fágov exprimujúcich mimotopový peptid) pri väzbe protilátky BSW17. Tieto fágy sa viažu len na protilátku BSW17 a nie na ostatné použité monoklonálne anti-CE3 protilátky, ako sú 8E7, 3G9 a 5H10. Tieto protilátky boli vytvorené použitím rekombinantného Ce3 ako imunogénu. Tieto peptidy tiež nereagujú na protilátku 5H5/F8, čo je ďalšia monoklonálna protilátka namierená proti extracelulámej časti ľudského FccRIa reťazca. Ako negatívna kontrola bol použitý rekombinantný FceRIa-reťazec a ako pozitívna kontrola poslúžili jamky potiahnuté polyklonálnym anti-M13 antisérom.
Príklad 5
Bakteriofágy exprimujúce mimotopové peptidy protilátky BSW17 kompetitívne inhibujú väzbu protilátky BSW17 na IgE^
Špecifickosť interakcii mimotop - protilátka BSW17 je ďalej preukázaná tým, že naviazaný mimotop exprimujúceho fága interferuje s väzbou protilátky BSW17 na IgE. Bakteriálne bunky sa nechajú narásť na SB obsahujúcom 10 pg/ml tetracyklínu a 50 pg/ml karbenicilínu po dosiahnutie OD600 = 0,4, potom sa pridá pomocný fág VCS M13 a ďalšie 2 hodiny sa pokračuje v inkubácii pri teplote 37 °C. Potom sa pridá kanamicin tak, aby jeho výsledná koncentrácia bola 70 pg/ml a bunky sa inkubujú cez noc. Fágové častice sa vyzrážajú polyetylénglykolom. Mäkké RIA platne sa pokryjú 20 pg/ml protilátky BSW17 v 0,1 M uhličita novom pufŕi pH 9,6 a potom sa blokujú obsahom 1,5 % kazeínu. Ľudský IgE značený 23I metódou chloramín-T sa použije v aktivite 100 000 cpm na jamku na naviazanie na protilátku BSW17, ktorou boli pokryté platne RIA v prítomnosti zvyšujúcich sa koncentrácií neznačeného IgE (vzniká tak kalibračná krivka) alebo v prítomnosti zvyšujúcich sa koncentrácií fágových častíc. Všetky pokusy sa uskutočnili pri izbovej teplote. Platne sa 3-krát premyjú 0,9 % NaCl + 0,05% Tweenom 20, narežú na kusy, ktoré sa jednotlivo zmerajú na r -počítači (1 minútu).
Fágy exprimujúce mimotopy (PhBSW.6-9 na obrázku 6, t. j. kloň 1 z obrázku 5 = CRRHNYGFWVC = sekvencie SEQ ID NO: 18; PhBSW.29-8 na obrázku 6 = kloň 18 z obrázku 5 = CINHRGYWVC = sekvencia SEQ ID NO: 19) (pozri príklad 4) inhibujú väzbu protilátky BSW17 na IgE. Obrázok 6 ukazuje väzbu 125I-značeného IgE na protilátku BSW17 v prítomnosti BSW17 mimotop exprimujúceho fágového klonu. Plné kružnice znázorňujú štandardnú inhibičnú krivku neznačeného IgE, ktorá umožňuje odhad inhibície väzby značeného IgE v prítomnosti 1011 cfu/ml fágových častíc.
Inhibícia dosiahnutá fágovými klonmi je zrovnateľná s neznačenými IgE s koncentráciou 1 pg/ml, respektíve 1,7 pg/ml.
Príklad 6
Indukcia epitopovo špecifickej imunitnej reakcie imunizáciou králikov mimotop-exprimujúcimi klonmi fágov
Na otestovanie praktickej použiteľnosti vakcín založených na mimotopoch protilátky BSW17 boli králičí imunizovaní fágovými časticami expnmujúcimi na svojom povrchu mimotopové peptidy protilátky BSW17. V kontrolnom experimente boli králičí imunizovaní rovnakým spôsobom pomocným fágom VCS M13. 10l2cfu čerstvo pripravených fágových častíc bolo dialyzovaných proti PBS pri teplote 4 °C. Na prvú imunizáciu boli vírusové častice emulgované v 1 ml úplného Freundovho adjuvans, alebo v 1 ml neúplného Freundovho adjuvans pre opakované dávky. Podkožná imunizácia bola opakovaná každých 14 dní. Po tretej opakovanej dávke bolo odobraných 12 ml krvi. Krv sa nechala zrážať 4 hodiny pri izbovej teplote v sklenených ampuliach a potom sa 10 minút centri fugo val a pri 2000 g. Supematanty sa testovali na prítomnosť protilátok proti ľudským IgE pomocou ELISA testu. Ľudské IgE protilátky odobraté z troch rôznych jedincov (SUS11 -IgE; PS-IgE; WT-IgE) boli zriedené v PBS pufŕi na koncentráciu 50 g/ml a 11 alikvóty boli potom nakvapkané na nitrocelulózu. Nitrocelulózová membrána sa potom 1 hodinu blokuje pomocou TBS pufri obsahujúceho 1,5 % kazeín. Králičie sérum bolo potom zriedené 1 : 200 v TBS pufŕi obsahujúceho 1,5 % kazeín a inkubované cez noc. Premývanie bolo uskutočňované 10 minút v každom z nasledujúcich pufrov: TBS, TBS + 0,05 % Tween 20 a TBS. Konjugát kozej anti-králičej protilátky s HRP bol zriedený 1 : 1000 v TBS obsahujúcom 1,5 % kazeín a inkubovaný s membránou 4 hodiny. Premývanie a farbenie bolo uskutočnené opísaným spôsobom. Ako vyplýva z tabuľky 3, kontrolní králičí imunizovaní pomocným fágom VCS M13, ako aj neimunizovani králičí vykazujú slabú reakciu proti ľudskej IgE protilátke vo svojom sére. To je pravdepodobne spôsobené prirodzene sa vyskytujúcimi autoprotilátkami proti králičím IgE, ktoré sú schopné krížovej reakcie s ľudskými IgE. Ale sérum králikov imunizovaných BSW17 mimotopovými fágmi okrem masívnej imunitnej odpovede na obalový proteín bakteriofága pVIII obsahujú tiež silno zvýšenú hladinu protilátok špecificky rozoznávajúcich ľudské IgE protilátky:
Rozpoznanie IgE (Relatívna OD)
| Králičie sérum | SUSll-IgE | PS-IgE | WT-IgE |
| Neimunizovaní | 2.0 + 0.3 | 2.0+0.2 | 2.0+1.0 |
| pomocný fágVCS Ml3 2.0 + 0.6 | 2.0 + 0.1 | 3.0 + 0.5 | |
| PhBSW.6-9(= kloní) 5.0 + 0.2 | 8.0 + 0.6 | 21.0+1.0 | |
| PhBSW.29-8 (= kloň 18) 16.5 + 0.7 | 9.0 + 0.4 | 25.0+1.0 |
BSW 17 epitopovú špecifickosť tohto antiséra je možné demonštrovať pomocou kompetitívneho ELISA testu: prúžky nitrocelulózovej membrány boli pripravené už opísaným spôsobom a cez noc inkubované s králičím sérom v riedení 1 : 50 v pufri TBS obsahujúcom 1,5 % kazeínu. Po premytí bola na 4 hodiny pridaná monoklonálna protilátka BSW17 značená chrenovou peroxidázou (BSW17-HRP) v riedení 1 : 50000 v pufri TBS obsahujúcom 1,5 % kazeín. Potom boli NC membrány premyté a farbené už opísaným spôsobom. Ako vyplýva z tabuľky 4, väzba BSW 17-HRP na IgE preparáty z rôznych zdrojov je inhibovaná sérom z králikov imunizovaných BSW17 mimotopovými fágmi, zatiaľ čo sérum z králikov imunizovaných pomocnými fágmi nemá žiadny inhibičný účinok:
Tabuľka 4
Inhibícia interakcie medzi fágom B5W17 a IgE pomocou séra z králikov imunizovaných mimotop fágom B5W17
Schopnosť rozpoznania rôznych IgE (v % inhibicie)
| SUS 11-IgE | WT-IgE | PS-IgE | ||
| pomocný fág VCS M13 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| PhBSW.6-9 | 34 | 65 | 63 | 51 |
| PhBSW.29-8 | 52 | 65 | 48 | 47 |
V nasledujúcich príkladoch 7 a 8 je opísané vhodné použitie chemicky syntetizovaných mimotopových peptidov spojených s nosičovým proteínom ako imunogénov na prípravu anti-alergickej vakcíny.
Príklad 7
Chemicky syntetizovaný mimotopový peptid BSW17 sa viaže k B5W17 s vysokou afinitou
Nevyhnutné bolo potvrdiť, že oblasť mimotopového fága (t. j. fága nesúceho mimomotopový peptid) BSW17 odvodená do bakteriofága môže byť vynechaná bez toho, aby došlo k poškodeniu biologickej aktivity sekvencie mimotopového peptidu. Z tohto dôvodu bol syntetizovaný nasledujúci peptid, ktorý obsahuje cyklický mimotopový oktapeptid BSW17 (jeho lineárnu formu ukazuje tabuľka 2, skupina A, druhý kloň vo forme peptidu (A) s dvoma dodatočnými Cys (sekvencia SEQ ID NO: 19) obsahujúci tu 7 priľahlých, od bakteriofága odvodených, dodatočných aminokyselinových zvyškov Gly-Glu-Phe- a -Gly-Asp-Pro-Ala. Sú to hraničné sekvencie, ktoré uľahčujú správne skladanie cirkulámeho mimotopového peptidu: Gly-Glu-Phe-Cys-Ile-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val-Cys-Gly-Asp-Pro-Ala (sekvencia SEQ ID NO: 17)
Po syntéze, ktorá bola uskutočnená štandardnou technikou, bol uvedený peptid cirkularizovaný pomocou dvoch cysteínov a fluorescenčné označený farbivom rodolovou zelenou. Z intenzity fluorescencie potom bola určená miera väzby k zvyšujúcim sa koncentráciám protilátky BSW 17. Protilátka BSW17 bola imobilizovaná v jamkách mikrotitračnej platničky za podmienok ELISA testu, čo je znázornené na obrázku 7.
Príklad 8
Chemicky syntetizované mimotopové peptidy protilátky BSW17 pripojené k nosičovému proteínu sú špecificky rozpoznané pomocou protilátky BSW17
Chemicky boli nasyntetizované rôzne mimotopové peptidy a potom boli naviazané na imunogénne nosičové proteíny. Pomer hmotností peptidu a nosičového proteínu pri konjugačných reakciách bol 1 : 1. Reakcie boli uskutočňované štandardnými spôsobmi (Sha S. Wong, Chemistry of Proteín Conjugation and Crosslinking, CRC Press (1993)). Rôzne spôsoby prípravy konjugátov zahŕňajú:
- konjugácia pomocou glutaraldehydu
- konjugácia pomocou DC (dihexylkarbodiímidu)
- konjugácie pomocou BSS [bis(sulfosukcinimidyl) suberátu]
- konjugácia prostredníctvom lyzínu
Výsledné mimotopové konjugáty sú nasledovné:
(1) PI = lineárny KTKGSGFFVF - BSA (glutaraldehyd) (2) P4 = lineárny ACINHRGYWVC - BSA (DC) (3) PS = lineárny ACRSRSGGYWLWC - BSA (DC) (4) SAF1-KLH = cyklický GEFCINHRGYWVCGDPA -
- KLH (DC) (5) SAF2-KLH = lineárny KTKGSGFFVF - KLH (DC) (6) SAF3-KLH = lineárny VNLPWSFGLE - KLH (DC) (7) SAF3-Lys = lineárny VNLPWSFGLE - spojenie pomocou lyzínu (8) SAF4-KLH = lineárny VNLTWSRASG - KLH (DC) (9) SAFS-KLH = VNLTWS - KLH (DC) (10) SDS 14 = cyklický GEFCRRHNYGFWVCGDPA -
- KLH (BSS) (11) SDS13, DSD227, SDS236, SDS2S2 = cyklický GEFCINHRGYWVCGDPA - KLH (BSS) (12) SDS237, SD5253 = lineárny KTKGSGFFVF - KLH (BSS) (13) SDS242, SDS2S4 = lineárny VLNPWSFGLE - KLH (BSS) a (14) SDS243 = lineárny VLNTWSRASG - KLH (BSS), pričom konjugáty (1), (5) a (12) sú referenčné imunogénové molekuly t. j. známe zo stavu techniky pripravené konjugáciou pomocou glutaraldehydu (1), DC (5) a BSS (12); teda:
(1), t. j. PI, je oblasť ľudského IgE zahrnujúca aminokyseliny 500-509, sekvencia SEQ ID NO: 28, pozri The Lancet (1990) supra, pripojený k BSA pomocou glutaraldehydu (5), t.j. SAF2-KLH, je ten istý peptid, sekvencia SEQ ID NO: 28, pripojený ku KLH pomocou DC a (12), t.j. 5DS237 a SDS2S3, je ten istý peptid, sekvencia SEQ ID NO: 28, pripojený ku KLH pomocou BSS.
Ostatné peptidy sú imunogény podľa vynálezu, menovite:
- (2) (P4) je N-acetylovaný peptid (A) (sekvencia SEQ ID NO: 1) s dodatočným Cys na C-konci (sekvencia SEQ ID NO: 29), naviazaný na BSA konjugáciou pomocou DC;
SK 284856 Β6
- (3) (PS) je N-acetylovaný peptid (C) (sekvencia SEQ ID NO: 3) s dodatočným Cys na C-konci (sekvencia SEQ ID NO: 30), naviazaný na BSA konjugáciou pomocou DC;
- (4) (SAF1-KLH) je peptid z príkladu 7 (sekvencia SEQ ID NO: 31), cirkulovaný cez disulftdický mostík tvorený dvoma hraničnými Cys a naviazaný na KLH konjugáciou pomocou DC;
- (6) (SAF3-KLH) je peptid (G) (sekvencia SEQ ID NO: 7), naviazaný na KLH konjugáciou pomocou DC;
- (7) (SAF3-Lys) je peptid (G) (sekvencia SEQ ID NO: 7), naviazaný na KLH pomocou lyzínu
- (8) (SAF4-KLH) je peptid (D) (sekvencia SEQ ID NO: 4), naviazaný na KLH konjugáciou pomocou DC;
- (9) (SAF5-KLH) je peptid (Q) (sekvencia SEQ ID NO: 17), naviazaný na KLH konjugáciou pomocou DC;
- (10) (SDS214) je prvý peptid zo skupiny A v tabuľke 2, so 7 prihľahlými aminokyselinovými zvyškami odvodenými od bakteriofága, rovnakými ako obsahuje peptid v príklade 7 (sekvencia SEQ ID NO: 32); tento peptid bol cirkularizovaný a pripojený ku KLH konjugáciou pomocou BSS;
- (11) (SDS213, SDS227, SDS236, SDS252) je ten istý peptid ako (4) (sekvencia SEQ ID NO: 31), tento peptid bol cirkularizovaný a naviazaný na KLH konjugáciou pomocou BSS;
- (13) (SDS242, SDS254) je peptid (G) (sekvencia SEQ ID NO: 7), naviazaný na KLH konjugáciou pomocou BSS; a nakoniec
- (14) (SDS234) je peptid (D) (sekvencia SEQ ID NO: 4), naviazaný na KLH konjugáciou pomocou BSS.
Obrázok 8a ukazuje, že ak konjugát cyklického mimotopu protilátky BSW17 s KLH (BSS) (11), t. j. SDS236, tak od Fc odvodený „originálny“ epitopový motív (12), t. j. SDS237, t. j. Fc (500-509) pripojený vo forme lineárneho peptidu ku KLH (BSS), sú rozpoznávané pomocou protilátky BSW17 na dávke závislým spôsobom, zatiaľ čo samotný KLH sa neviaže. Jamky mikrotitračných platničiek boli potiahnuté 1 g buď SDS236 alebo SDS237, alebo samotným KLH a inkubované s protilátkou BSW17 so zvyšujúcou sa koncentráciou. Naviazaná protilátka bola detegovaná pomocou konjugátu kozej anti-myšej protilátky s chrenovou peroxidázou (gamlgG-HRP). Uvedené údaje sú priemery z duplikátov, kde je odčítané pozadie reprezentujúce väzbu protilátky na nepotiahnuté jamky blokované pomocou BSA.
Obrázok 8b zahŕňa výsledky ELISA testu získané použitím rôznych BSW17 mimotopových konjugátov pripojených k nosičovému proteínu rôznymi chemickými postupmi. Jamky mikrotitračných platničiek boli potiahnuté 5 g každého z uvedených mimotopových konjugátov či voľného KLH a inkubované s 10 g protilátky BSW17. Naviazaná protilátka bola detegovaná pomocou konjugátu gamlgG-HRP. Uvedené čísla sú priemery duplikátov, od ktorých bolo odčítané pozadie reprezentujúce väzbu na nepotiahnuté jamky (blokované BSA). Každý z BSW17 mimotopových konjugátov bol, na rozdiel od voľného KLH, rozpoznaný protilátkou BSW17. Počas opakovaných experimentov, ktoré boli uskutočňované v priebehu niekoľkých týždňov, sa však zistilo, že KLH konjugáty spájané pomocou DC sú menej stabilné a čím ďalej, tým viac strácajú svoju väzbovú schopnosť k protilátke BSW17. Naproti tomu sa ukázalo, že BSW17 mimotopové konjugáty spájané pomocou BSS sú stabilné dokonca aj pri 4 °C.
Obrázky 9a a 9b ukazujú, že mimotopy protilátky BSW17 pripojené ku KLH či BSA sú špecificky rozpoznávané protilátkou BSW17, nie však nepríbuznou monoklonálnou protilátkou 3G9 (protilátka proti ľudskému Cc3) a
5H5/F8 (protilátka proti ľudskému RIalfa). Jamky mikrotitračných platničiek boli opäť pokryté 5 pg každého z uvedených mimotopových konjugátov a inkubované s 10 pg zodpovedajúcej monoklonálnej protilátky. Naviazaná protilátka bola detegovaná pomocou konjugátu gam-IgG-HRP. Uvedené čísla sú priemery duplikátov, od ktorých bolo odčítané pozadie reprezentujúce väzbu na nepokryté jamky blokované BSA.
Príklad 9
Po imunizácii králikov pomocou BSW17 mimotopových konjugátov in vivo dochádza k vytváraniu protilátok proti ľudskému IgE
Aby bolo možné potvrdiť špecifickosť imunogenicity BSW17 mimotopových konjugátov, boli králičí imunizovaní súpravou preparátov skladajúcich sa z mimotopového peptidu a nosiča, ako je to tu v hrubých rysoch ukázané:
| Králik č. | Imunogén | Typ konjugátu |
| R1 | (10) 5DS214 | |
| R2 | (10) SDS214 | Ce4 mimotopy |
| R3 | (11) SD5213 | |
| R4 | (11) SDS213 | |
| 1 | KLH (Pierce) | |
| 2 | KLH-BSS linker | KLH kontrola |
| 4 | (12) SDS237 | |
| 11 | (12) SDS237 | |
| 7 | (6) SAF3-KLH | |
| 13 | (7) SAF3-Lys | |
| 14 | (13) SDS242 | Ce3 mimotop |
| 16 | (13) SDS242 | |
| 17 | (13)SDS2S4 | |
| 18 | (7) SAF3-Lys | |
| 5 | (8) SAF4-KLH | Ce3 (370-379) |
| 8 | (8) SAF4-KLH | |
| 19 | (14) SDS243 | |
| 20 | (14) SDS243 | |
| 12 | (4) SAF1-KLH | |
| 15 | (4) SAF1-KLH | Ce4 mimotop |
Králici boli imunizovaní podkožnou injekciou 200 pg zodpovedajúceho prípravku konjugátu rozpusteného vo fosfátom pufrovanom fyziologickom roztoku (PBS) v celkovom objeme 500 pl. Pre prvú imunizáciu boli vzorky zmiešané 1 : 1 s kompletným Freundovým adjuvans (králici R1 až R4) či s TiterMax (Sigma; králici 1 až 20). Pred začiatkom imunizácie sa králikom odobralo 5 ml vzorka krvi. Posilňovacia dávka bola podaná v dňoch 21 až 28 po prvej injekcii s použitím nekompletného Freundovho adjuvans. V dňoch 28 až 49 sa odobrali vzorky krvi. Zo všetkých vzoriek bolo pripravené sérum.
Imunitná odpoveď proti ľudskému IgE vyvolaná v imunizovaných králikoch sa monitorovala pomocou ELISA testu. Jamky mikrotitračných doštičiek sa pokryli 5 pg ľudského IgE (SUS-11; JW8) a inkubovali so 100 pl séra z pripravených vzoriek, ktoré sa rozpustili v inkubačnom pufri ELISA v pomere 1 : 50. Králičie protilátky naviazané na imobilizovaný ľudský IgE boli detegované pomocou konjugátu kozej anti-králičej protilátky s HRP (garlgG-HRP). Namerané hodnoty optickej hustoty (OD45o) sa upravili podľa výsledkov získaných so sérom z rovnakých králikov pred imunizáciou, ktoré sa zriedilo v pomere 1 : 50 v ELISA pufri. Údaje na obrázkoch 10a a 10b sú priemery z dvoch riedení. Obrázky 10a a 10b jasne ukazujú, že v králikoch, ktorí boli imunizovaní rôznymi BSW17 mimotopovými konjugátmi, došlo k indukcii protilátok namierených proti ľudskému IgE.
Titre novovytvorených protilátok v sére s ohľadom na KLH nosič, peptid použitý ako imunogén, respektíve ľudský IgE, boli tiež stanovené ELISA testom. Sérum sa použilo v postupných riedeniach na inkubáciu s imobilizovaným KLH, konjugátom mimotopového peptidu s BSA, respektíve s IgE. Dva príklady takéhoto stanovenia titru séra sú uvedené na obrázku 11, pre peptid (11), t. j. SDS213, resp. pre peptid (10), t. j. SDS214.
Uvedené príklady ukazujú možnosť aplikácie BSW17 mimotopových konjugátov ako imunogcnov pri indukcii imunitnej odpovede namierenej proti ľudskému IgE.
Príklad 10
Imunitná odpoveď proti ľudskému IgE indukovaná v králikoch pomocou konjugátov mimotopových peptidov protilátky BSW17 je izotypovo špecifická a kompetuje o väzbu na IgE s protilátkou BSW17
Pomocou ELISA testu sa sledovala izotypová špecificita imunitnej odpovede proti ľudskému IgE indukovaná v imunizovaných králikoch. Jamky na mikrotitračnej platničke boli potiahnuté 3 pg ľudského IgE (SUS-11), IgA, IgG, IgM. Potiahnuté jamky boli inkubované so 100 μΐ vzoriek zo séra. Sérové vzorky sa riedili v pomere 1 : 50 ELISA pufŕom. Králičie protilátky, ktoré sa naviazali na ľudskú protilátku, boli stanovené pomocou konjugátu kozích antikráličích protilátok s chrenovou peroxidázou. Namerané hodnoty OD450 sa opravili o hodnotu pozadia, ktoré sa stanovilo použitím preimúnneho séra zodpovedajúceho králika. Dáta uvedené na obrázku 12 reprezentujú stredné hodnoty z duplikátnych meraní. Je zrejmé, že imunitná odpoveď vyvolaná v králikoch imunizáciou pomocou konjugátov mimotopových peptidov protilátky BSW17 je špecifická pre IgE, aj keď dochádza k častému rozpoznaniu ľudského IgM v sére králika, ktorý bol imunizovaný peptidom 10, t. j. SDS241.
Z kompetitívneho ELISA testu je zrejmé, že sérum králika imunizovaného peptidom SDS214 je schopné čiastočne kompetovať s protilátkou BSW17 pri väzbe na IgE. Jamky v mikrotitračných platničkách boli potiahnuté 1 pg ľudského IgE (SUS-11) a inkubované buď s 5 pg protilátky BSW17 alebo s inkubačným pufŕom bez protilátky BSW17. Po premytí sa pre druhú inkubáciu pridá 100 pl anti-SDS213 antiséra zriedeného 1 : 50 inkubačným pufrom pre ELISA test. Králičie protilátky naviazaného imobilizovaného neošetreného ľudského IgE a IgE preinkubovaného s protilátkou BSW17 sa stanovia inkubáciou s konjugátom kozej anti-králičej protilátky s chrenovou peroxidázou. Údaje na obrázku 13 reprezentujú stredné hodnoty z duplikovaných meraní.
Príklad 11
Králičie anti-hlgE protilátky vzniknuté po imunizácii pomocou BSW17 mimotopových konjugátov sa dajú purifikovať afinitnou chromatografiou použitím mimotopových peptidov naviazaných na Sepharosu
Tento príklad ukazuje, že anti-hlgE odpoveď v králikovi indukovaná imunizáciou BSW17 mimotopovým konjugátom je identická so špecifickou odpoveďou proti mimotopovému peptidu.
Imunoafinitná purifikácia králičej polyklonálnej protilátky proti BSW17 mimotopovým peptidom:
a) zrážanie síranom amónnym:
K 22 ml králičieho antiséra obsahujúceho 60 mg/ml celkového proteínu (podľa Bradfordovho testu, použitý BSA štandard, BIO-RAD) sa pridá 5,5 g suchého AMS (síranu amónneho, vzniká 25 % w/v roztok), zmes sa potom mieša počas 3 hodín a inkubujc ccz noc pri izbovej teplote. Precipitát sa odstráni 45 minútovou centrifugáciou pri 18 000 rpm (Sorvall) a potom sa premyje 25 ml 25 % vodného roztoku (w/v) síranu amónneho. Premyté precipitáty sa centrifugujú pri rovnakých podmienkach, rozpustia sa v 10 ml PBS s 0,05% NaN3, pH 7,2, a cez noc sa dialyzujú oproti 5 1 rovnakého pufra pri teplote +4 C.
b) imunoafinitná chromatografía
Dialyzovaný roztok sa prefiltroval cez filter Millex-GV 0,2 pm (Millipore) a naniesol na kolónu Pharmacia XKL6/30 naplnenú 10 ml CH-sefarózy 4B s kovalentne naviazanými 5 mg BSW17 mimotopového peptidu SDS227. Prietoková rýchlosť bola nastavená na 1 ml/min. Ako elučný pufor sa použil PBS, + 0,05 % NaN3. Po nanesení a elúcii nenaviazanej proteínovej frakcie, sa špecificky naviazaná protilátka eluovala pufŕom 0,1 M glycín/HCl, pH 2,8. Eluát (frakcie 12 až 20 v 9 ml elučného pufra) sa odoberal a okamžite za stáleho miešania neutralizoval na pH 7,4 pomocou 3,3 M Tris/HAc, 0,8 % NaN3 pH 8,0 (50 g/ml) a nakoniec cez noc dialyzovaný oproti 3 1 pufra PBS, 0,05% NaN3, pH 7,2 pri teplote miestnosti. Celkový proteín obsahoval asi 1 mg/ml podľa Bradfordovho testu, (použitý štandard BIgG, BIO-RAD). Znamená to, že výťažok z celkového použitého proteínu bol asi 0,7 %.
Afinitne purifikované IgG frakcie sa testovali, aby sa zistila schopnosť viazať ľudský IgE pomocou ELISA testu. Jamky v mikrotitračnej platni boli potiahnuté rastúcou koncentráciou ľudského IgE (JW8) a inkubované s 5 pg purifikovaného antiséra proti SDS213, respektíve proti SDS214. Naviazaná protilátka bola detegovaná pomocou konjugátu garlgG-HRP. Údaje na obrázku 14 reprezentujú priemerné hodnoty duplikovaných meraní. Ako vyplýva z obrázku, protilátky IgG purifikované na afinitných kolónach s BSW17 mimotopovými peptidmi sú v závislosti od dávky rozpoznávané ľudskými IgE protilátkami. Len slabá väzbová schopnosť porovnateľná s pozadím bola pozorovaná vo vzorkách frakcií, ktoré prešli kolónou bez zdržania. Tieto údaje dokazujú, že aktivita protilátok proti ľudským IgE indukovaná v králikovi je totožná s protilátkami namierenými proti mimotopovému peptidu.
Príklad 12
Králičie protilátky proti ľudským IgE vznikajúce po imunizácii BSW17 mimotopovými konjugátmi nie sú anafylaktogénne pre ľudské krvné bunky
V tomto príklade je dokázané, že králičie protilátky proti ľudským IgE vznikajúcim po imunizácii BSW17 mimotopovými konjugátmi nie sú pre ľudské krvné bazofilnc bunky anafylaktogénne. Ako experimentálny systém sa vybral komerčne dostupný CAST sLt ELISA kit (Buhlmann AG, Allschwill, Švajčiarsko). V tomto teste sa sleduje uvoľňovanie rozpustného leukotriénu (sLt) z ľudských bazofilných buniek v dôsledku aktivácie buniek anafylaktogénnym činidlom. Podmienky testu zodpovedajú doporučeniam dodávateľa. Výsledok testu sa udáva v pg sLt prítomného v 1 ml supematantu z ľudských bielych krviniek po inkubácii týchto buniek s testovanou vzorkou. Výsledok je stanovený pomocou kalibračnej krivky. Kalibračná krivka sa získala pomocou riediaceho radu štandardu sLt v kompetitívnom ELISA teste. Koncentrácie rozpustného leukotriénu tvoriace pozadie sú dôsledkom spontánneho uvoľňo
SK 284856 Β6 vania sLt preparátmi krvných buniek (označené PB = = „blank pacient“). Maximálna dosiahnuteľná koncentrácia rozpustného leukotriénu pre daný preparát krvných buniek (PC = „kontrolný pacient“) sa získala po aktivácii kontrolných buniek zosieťujúcou (crosslinking) protilátkou antiIgERIa. Každý test obsahuje uvedenú negatívnu a pozitívnu kontrolu.
Úplné králičie sérum zo zvierat imunizovaných BSW17 mimotopovým konjugátom, ako aj afinitne purifíkované protilátky proti BSW17 mimotopovým peptidom podľa príkladu 11 sa testovali, aby sa určila schopnosť aktivácie bazofilov a teda prítomnosť anafylaktogénnych protilátok proti ľudským IgE.
Ako zdroj bazofilných buniek sa použila celková čerstvo odobraná ľudská krv zdravých darcov. Tá bola ďalej spracovávaná presne podľa protokolu výrobcu CAST - ELISA súpravy. Výsledky sú zhrnuté na obrázku 15. Z výsledkov vyplýva, že ani nepurifikované králičie sérum obsahujúce protilátky proti ľudským IgE vzniknuté po imunizácii BSW17 mimotopovým konjugátom, ani afinitne purifíkované protilátky proti týmto BSW17 mimotopovým konjugátom nemajú schopnosť spustiť uvoľňovanie leukotriénu z ľudských krvných buniek; čo znamená, že nie sú anafylaktogénne. Toto je absolútne nevyhnutný predpoklad na použitie BSW17 mimotopových peptidov v antialergickej vakcíne v humánnej medicíne.
INFORMÁCIE O SEKVENCII SEQ ID NO: 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 8 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: áno (iv) ANTI-SENSE: nie (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 1 Ilc-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val
INFORMÁCIE O SEKVENCII SEQ ID NO: 2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 8 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: áno (iv) ANTI-SENSE: nie (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 2 Arg-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val
INFORMÁCIE O SEKVENCII SEQ ID NO: 3:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 10 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: áno (iv) ANTI-SENSE: nie (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 3 Arg-Ser-Arg-Ser-Gly-Gly-Tyr-Trp-Leu-Trp
INFORMÁCIE O SEKVENCII SEQ ID NO: 4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 10 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: áno (iv) ANTI-SENSE: nie (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 4 Val-Asn-Leu-Thr-Trp-Ser-Arg-Ala-Ser-Gly
INFORMÁCIE O SEKVENCII SEQ ID NO: 5:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 10 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: áno (iv) ANTI-SENSE: nie (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 5 Val-Asn-Leu-Pro-Trp-Ser-Arg-Ala-Ser-Gly
INFORMÁCIE O SEKVENCII SEQ ID NO: 6:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 10 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: áno (iv) ANTI-SENSE: nie (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 6 Val-Asn-Leu-Thr-Trp-Ser-Phe-Gly-Leu-Glu
INFORMÁCIE O SEKVENCII SEQ ID NO: 7:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 10 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: áno (iv) ANTI-SENSE: nie (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 7 Val-Asn-Leu-Pro-Trp-Ser-Phe-Gly-Leu-Glu
INFORMÁCIE O SEKVENCII SEQ ID NO: 8:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
A) DĹŽKA: 10 aminokyselín
B) TYP: aminokyselina
C) POČET VLÁKIEN: jedno
D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: áno (iv) ANTI-SENSE: nie (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 8 Val-Asn-Arg-Pro-Trp-Ser-Phe-Gly-Leu-Glu
INFORMÁCIE O SEKVENCII SEQ ID NO: 9:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 10 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: áno (iv) ANTI-SENSE: nie (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 9 V al-Lys-Leu-Pro-Trp-Arg-Phe-Tyr-Gln-V al
INFORMÁCIE O SEKVENCII SEQ ID NO: 10:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 10 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: áno (iv) ANTI-SENSE: nie (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 10 Val-Trp-Thr-Ala-Cys-Gly-Tyr-Gly-Arg-Met
INFORMÁCIE O SEKVENCII SEQ ID NO: 11:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 7 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: áno (iv) ANTI-SENSE: nie (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 11 Gly-Thr-Val-Ser-Thr-Leu-Ser
INFORMÁCIE O SEKVENCII SEQ ID NO: 12:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 7 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: áno (iv) ANTI-SENSE: nie (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 12 Leu-Leu-Asp-Ser-Arg-Tyr-Trp
INFORMÁCIE O SEKVENCII SEQ ID NO: 13:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 7 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: áno (iv) ANTI-SENSE: nie (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 13 Gln-Pro-Ala-His-Ser-Leu-Gly
INFORMÁCIE O SEKVENCII SEQ ID NO: 14:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 7 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: áno (iv) ANTI-SENSE: nie (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 14
Leu-Trp-Gly-Met-Gln-Gly-Arg
INFORMÁCIE O SEKVENCII SEQ ID NO: 15:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 15 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: áno (iv) ANTI-SENSE: nie (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 15
Leu-Thr-Leu-Ser-His-Pro-His-Trp-Val-Leu-Asn-His-Phe-Val-Ser
INFORMÁCIE O SEKVENCII SEQ ID NO: 16:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: áno (iv) ANTI-SENSE: nie (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 16
Ser-Met-Gly-Pro-Asp-Gln-Thr-Leu-Arg
INFORMÁCIE O SEKVENCII SEQ ID NO: 17:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 6 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: áno (iv) ANTI-SENSE: nie (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 17
Val-Asn-Leu-Thr-Trp-Ser
INFORMÁCIE O SEKVENCII SEQ ID NO: 18:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 11 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: áno (iv) ANTI-SENSE: nie (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 18
Cys-Arg-Arg-His-Asn-Tyr-Gly-Phe-Trp-Val-Cys
INFORMÁCIE O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 19:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 10 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: áno (iv) ANTI-SENSE: nie (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 19 Cys-lle-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val-Cys
INFORMÁCIE O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 20:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 11 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: áno (iv) ANTI-SENSE: nie (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 20 Cys-Thr-Arg-Leu-His-Thr-Gly-Tyr-Trp-Val-Cys
INFORMÁCIE O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 21:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 11 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: áno (iv) ANTI-SENSE: nie (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 21 Cys-Thr-Leu-Ser-Val-Phe-Gly-Tyr-Trp-Val-Cys
INFORMÁCIE O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 22:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 11 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: áno (iv) ANTI-SENSE: nie (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 22 Cys-Ser-Met-Gly-Pro-Asp-Gln-Thr-Leu-Arg-Cys
INFORMÁCIE O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 23:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: áno (iv) ANTI-SENSE: nie (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 23 Cys-Leu-Leu-Asp-Ser-Arg-Tyr-Trp-Cys
INFORMÁCIE O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 24:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: áno (iv) ANTI-SENSE: nie (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 24 Cys-Gln-Pro-Ala-His-Ser-Leu-Gly-Cys
INFORMÁCIE O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 25:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: áno (iv) ANTI-SENSE: nie (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 25
Cys-Leu-Trp-Gly-Met-Gln-Gly-Arg-Cys
INFORMÁCIE O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 26:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: áno (iv) ANTI-SENSE: nie (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 26
Cys-Gly-Thr-Val-Ser-Thr-Leu-Ser-CysINFORMÁCIE O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 27:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 17 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: áno (iv) ANTI-SENSE: nie (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 27
Gly-Glu-Phe-Cys-Ile-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val-Cys-Gly-Asp-Pro-Ala
INFORMÁCIE O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 28:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 10 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: áno (iv) ANTI-SENSE: nie (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 28
Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe
INFORMÁCIE O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 29:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: áno (iv) ANTI-SENSE: nie (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 29
Ile-Asn-H i s-Arg-Gly-Tyr-Trp-V al-Cys
INFORMÁCIE O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 30:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 11 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: áno (iv) ANTI-SENSE: nie (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 30 Arg-Ser-Arg-Ser-Gly-Gly-Tyr-Trp-Leu-Trp-Cys
INFORMÁCIE O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 31:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 17 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: oba typy (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: áno (iv) ANTI-SENSE: nie (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 31 Gly-Glu-Phe-Cys-Ile-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val-Cys-Gly-Asp-Pro-Ala
INFORMÁCIE O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 32:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 18 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: obidva typy (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: áno (iv) ANTI-SENSE: nie (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 32 Gly-Glu-Phe-Cys-Arg-Arg-His-Asn-Tyr-Gly-Phe-Trp-Val-Cys-Gly-Asp-Pro-Ala
Claims (11)
1. Imunogénna molekula, vyznačujúca sa t ý m , že obsahuje
a) aspoň jednu časť mimotopového peptidu BSW17, pričom hybridómové bunkové línie produkujúce monoklonálnu protilátku BSW17 boli uložené v ECACC pod depozitným číslom 96121916, s celkovou dĺžkou do 15 aminokyselín, ktorá môže prípadne obsahovať ďalšie komponenty na väzbu haptén-nosič na uľahčenie naviazania na komponent (b) alebo ďalšie spracovanie; alebo ak je mimotopový peptid BSW17 cyklický, môžu byť dva konce peptidu spo jené dvomi dodanými cysteínovými zvyškami tvoriacimi disulfidový mostík, alebo prepojené chemicky; alebo ak je mimotopový peptid BSW17 lineárny, môže byť karboxykoniec aminokyseliny blokovaný v amidovanej forme a/alebo amino-koniec aminokyseliny blokovaný v acetylovanej forme; alebo môže byť na koncoch jedna alebo viac pomocných skupín a/alebo dodatočná väzbová skupina a b) skupinu schopnú vyvolať imunitnú odpoveď proti tomuto peptidu, pričom komponent (a) sa odlišuje od peptidu Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe.
2. Imunogénna molekula podľa nároku 1 vo forme polymémeho peptidu alebo rekombinantného fúzneho proteínu, vyznačujúca sa tým, že jedna monoméma zložka polymérneho peptidu, alebo jedna súčasť rekombinantného fúzneho proteínu vytvára časť mimotopového peptidu BSW17 a zvyšok polymérneho peptidu alebo fúzneho proteínu tvorí zložka vyvolávajúca imunitnú odpoveď.
3. Imunogénna molekula podľa nároku 1 vo forme konjugátu mimotopového peptidu BSW17 s imunogénnym nosičom.
4. Imunogénna molekula podľa nároku 1, v y z n a čujúca sa tým, že mimotopový peptid BSW17 v podstate pozostáva alebo obsahuje aminokyselinovú sek- venciu vybranú z nasledujúcich sekvencií: Ile-Asn-His-Arg-Giy-Tyr-Trp-Val(A)
Arg-Asn-His-Arg-Gly-T yr-Trp-Val(B)
Arg-Ser-Arg-Ser-Gly-Gly-Tyr-Trp-Leu-Trp(C)
Val-Asn-Leu-Thr-Trp-Ser-Arg-Ala-Ser-Gly(D)
Val-Asn-Leu-Pro-Trp-Ser-Arg-Ala-Ser-Gly(E)
Val-Asn-Leu-Thr-Trp-Ser-Phe-Gly-Leu-Glu(F)
V al-Asn-Leu-Pro-Trp-Ser-Phe-Gly-Leu-Glu(G)
V al-Asn-Arg-Pro-Trp-Ser-Phe-Gly-Leu-Glu(H)
Val-Lys-Leu-Pro-Trp-Arg-Phe-Tyr-Gln-Val(I)
Val-Trp-Thr-Ala-Cys-Gly-Tyr-Gly-Arg-Met(J)
Gly-Thr-Val-Ser-Thr-Leu-Ser(K)
Leu-Leu-Asp-Ser-Arg-Tyr-Trp(L)
Gln-Pro-Ala-His-Ser-Leu-Gly(M)
Leu-Trp-Gly-Met-Gln-Gly-Arg(N)
Leu-Thr-Lcu-Ser-His-Pro-His-Trp-Val-Leu-Asn-His-Phe-Val-Ser(O)
Ser-Met-Gly-Pro-Asp-GIn-Thr-Leu-Arg(P) a
Val-Asn-Leu-Thr-Trp-Ser(Q)
5. Imunogénna molekula podľa nároku 1, v y z n a čujúca sa tým, že časť (a) mimotopového peptídu BSW17 má aminokyselinovú sekvenciu Gly-Glu-Phe-Cys-Ile-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val-Cys-Gly-Asp-Pro-Ala (SEQ ID NO: 27) a je cyklická, konkrétne je to peptid Ile-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val (A), ktorého dva konce sú spojené dvoma dodatočnými cysteínovými zvyškami tvoriacimi disulfidový mostík a obsahuje ďalšie zložky Gly-Glu-Phe a Gly-Asp-Pro-Ala na uľahčenie väzby haptén - nosič a naviazania.
6. Farmaceutická kompozícia, vyznačujúca sa t ý m , že obsahuje imunogénnu molekulu podľa ľubovoľného z nárokov 1 až 5 a adjuvans.
7. Ligand, vyznačujúci sa t ý m , že obsahuje protilátkovú doménu špecifickú pre časť mimotopového peptidu BSW17 podľa ľubovoľného z nárokov 1 až 5, pričom protilátková doména je reaktívna aj so sekvenciou aminokyselín ťažkého reťazca IgE, ktorý zahrnuje prirodzený epitop rozpoznávaný protilátkou BSW17.
8. Ligand podľa nároku 7, vyznačujúci sa t ý m , že je vo forme monoklonálnej protilátky alebo jej Fab' alebo F(ab')2 fragmentu.
9. Spôsob prípravy imunogénnej molekuly podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že zahŕňa vhodné naviazanie časti (a) mimotopového peptidu BSW17 na skupinu (b) schopnú vyvolať imunitnú odpoveď proti tomuto peptidu.
10. Imunogénna molekula podľa ľubovoľného z nárokov 1 až 5 na použitie ako liečivo na liečenie ochorení súvisiacich s IgE.
11. Použitie imunogénnej molekuly podľa ľubovoľného z nárokov 1 až 5 na prípravu vakcíny proti alergii.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB9604412.8A GB9604412D0 (en) | 1996-03-01 | 1996-03-01 | Organic compounds |
| GBGB9617702.7A GB9617702D0 (en) | 1996-08-22 | 1996-08-22 | Organic compounds |
| PCT/EP1997/001013 WO1997031948A1 (en) | 1996-03-01 | 1997-02-28 | Peptide immunogens for vaccination against and treatment of allergy |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK118198A3 SK118198A3 (en) | 1999-03-12 |
| SK284856B6 true SK284856B6 (sk) | 2006-01-05 |
Family
ID=26308839
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK1181-98A SK284856B6 (sk) | 1996-03-01 | 1997-02-28 | Imunogénna molekula, farmaceutická kompozícia, ligand, spôsob prípravy imunogénnej molekuly a jej použitie |
Country Status (25)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6610297B1 (sk) |
| EP (1) | EP0885244B2 (sk) |
| JP (2) | JP3421970B2 (sk) |
| KR (2) | KR100498198B1 (sk) |
| CN (1) | CN1174998C (sk) |
| AT (1) | ATE230417T1 (sk) |
| AU (1) | AU719609B2 (sk) |
| BR (1) | BR9707819A (sk) |
| CA (1) | CA2245497C (sk) |
| CY (1) | CY2457B1 (sk) |
| CZ (1) | CZ299551B6 (sk) |
| DE (1) | DE69718150T3 (sk) |
| DK (1) | DK0885244T4 (sk) |
| ES (1) | ES2190799T5 (sk) |
| HK (1) | HK1014962A1 (sk) |
| HU (1) | HUP9901109A3 (sk) |
| IL (1) | IL125590A (sk) |
| NO (1) | NO321043B1 (sk) |
| NZ (1) | NZ331651A (sk) |
| PL (1) | PL187209B1 (sk) |
| RU (1) | RU2193413C2 (sk) |
| SI (1) | SI0885244T2 (sk) |
| SK (1) | SK284856B6 (sk) |
| TR (1) | TR199801722T2 (sk) |
| WO (1) | WO1997031948A1 (sk) |
Families Citing this family (32)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1621209A3 (en) * | 1998-11-02 | 2006-04-19 | Resistentia Pharmaceuticals AB | Vaccines based on domains of chimeric immunoglobulin E peptides |
| US6913749B2 (en) | 1998-11-02 | 2005-07-05 | Resistentia Pharmaceuticals Ab | Immunogenic polypeptides for inducing anti-self IgE responses |
| MXPA01005389A (es) | 1998-11-30 | 2003-03-27 | Cytos Biotechnology Ag | Presentacion molecular ordenada de antigenos, metodos de preparacion y uso. |
| CA2363118A1 (en) * | 1999-02-25 | 2000-08-31 | Smithkline Beecham Biologicals S.A. | Immunogens comprising a peptide and a carrier derived from h.influenzae protein d |
| AU3281100A (en) * | 1999-02-25 | 2000-09-14 | Peptide Therapeutics Limited | Epitopes or mimotopes derived from the c-epsilon-3 or c-epsilon-4 domains of ige, antagonists thereof, and their therapeutic uses |
| GB9908533D0 (en) * | 1999-04-14 | 1999-06-09 | Novartis Ag | Organic compounds |
| IL152054A0 (en) * | 2000-04-13 | 2003-05-29 | Bio Life Science Forschungs & Entwicklungsgesellschaft Mbh | Vaccine against cancerous diseases which is based on mimotopes of antigens expressed on tumor cells |
| WO2001085208A2 (en) | 2000-05-05 | 2001-11-15 | Cytos Biotechnology Ag | Molecular antigen arrays and vaccines |
| US6887472B2 (en) | 2000-08-30 | 2005-05-03 | Pfizer Inc. | Anti-IgE vaccines |
| US7128911B2 (en) | 2001-01-19 | 2006-10-31 | Cytos Biotechnology Ag | Antigen arrays for treatment of bone disease |
| US7320793B2 (en) | 2001-01-19 | 2008-01-22 | Cytos Biotechnology Ag | Molecular antigen array |
| US7094409B2 (en) | 2001-01-19 | 2006-08-22 | Cytos Biotechnology Ag | Antigen arrays for treatment of allergic eosinophilic diseases |
| ES2394293T3 (es) * | 2001-02-28 | 2013-01-30 | Bio Life Science Forschungs- Und Entwicklungsges.M.B.H. | Vacuna contra cánceres que están asociados con el oncogén HER-2/neu |
| EP1239032A1 (en) * | 2001-03-02 | 2002-09-11 | Société des Produits Nestlé S.A. | Lactic acid bacteria as agents for treating and preventing allergy |
| JP2003047482A (ja) | 2001-05-22 | 2003-02-18 | Pfizer Prod Inc | 非アナフィラキシー誘発性ＩｇＥワクチン |
| US7604955B2 (en) | 2001-08-13 | 2009-10-20 | Swey-Shen Alex Chen | Immunoglobulin E vaccines and methods of use thereof |
| US7115266B2 (en) | 2001-10-05 | 2006-10-03 | Cytos Biotechnology Ag | Angiotensin peptide-carrier conjugates and uses thereof |
| ATE361097T1 (de) * | 2002-01-15 | 2007-05-15 | Bio Life Science Forschungs & Entwicklungsgesellschaft Mbh | Orale vakzinierung mit dem tumor-antigen-mimotop gln-met-trp-ala-pro-gln-trp-gly-pro-asp |
| CN102061288A (zh) | 2002-07-17 | 2011-05-18 | 希托斯生物技术股份公司 | 使用衍生自ap205外壳蛋白的病毒样颗粒的分子抗原阵列 |
| BR0312297A (pt) | 2002-07-18 | 2005-04-12 | Cytos Biotechnology Ag | Conjugados veìculos de hapteno e seu uso |
| SI1524994T1 (sl) | 2002-07-19 | 2011-08-31 | Cytos Biotechnology Ag | Sestavki cepiv, ki vsebujejo amiloidne beta 1-6 antigenske mreĹľe |
| ATE536188T1 (de) | 2002-08-14 | 2011-12-15 | Macrogenics Inc | Fcgammariib-spezifische antikörper und verfahren zur verwendung davon |
| US20050065136A1 (en) * | 2003-08-13 | 2005-03-24 | Roby Russell R. | Methods and compositions for the treatment of infertility using dilute hormone solutions |
| US20050239757A1 (en) * | 2004-04-21 | 2005-10-27 | Roby Russell R | Hormone treatment of macular degeneration |
| US20060025390A1 (en) * | 2004-07-28 | 2006-02-02 | Roby Russell R | Treatment of hormone allergy and related symptoms and disorders |
| ITMI20052517A1 (it) * | 2005-12-29 | 2007-06-30 | Lofarma Spa | Varianbtio ipoallergeniche dell'allergene maggiore bet v 1 di polline di betula verrucosa |
| WO2008019199A2 (en) | 2006-06-26 | 2008-02-14 | Macrogenics, Inc. | FCγRIIB-SPECIFIC ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF |
| EP2012122A1 (en) * | 2007-07-06 | 2009-01-07 | Medigene AG | Mutated parvovirus structural proteins as vaccines |
| US8865179B2 (en) * | 2008-01-26 | 2014-10-21 | Swey-Shen Alexchen | Aptameric IgE peptides in a protein scaffold as an allergy vaccine |
| MX337723B (es) | 2008-12-09 | 2016-03-15 | Pfizer Vaccines Llc | Vacuna de peptido ch3 de ige. |
| EP2575868A1 (en) | 2010-06-07 | 2013-04-10 | Pfizer Vaccines LLC | Ige ch3 peptide vaccine |
| RU2761431C9 (ru) * | 2020-10-26 | 2022-04-18 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр "Институт иммунологии" Федерального медико-биологического агентства России (ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России) | Рекомбинантный полипептид на основе аллергена пыльцы березы и аллергена яблока в качестве вакцины от аллергии |
Family Cites Families (36)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4171299A (en) | 1975-04-04 | 1979-10-16 | The Regents Of The University Of California | Polypeptide agents for blocking the human allergic response |
| DE2602443A1 (de) | 1975-04-04 | 1976-10-21 | Univ California | Biologisch aktive polypeptide |
| DE2861593D1 (en) | 1977-06-29 | 1982-03-11 | Beecham Group Plc | Peptides, pharmaceutical compositions containing the peptides and a process for the preparation of the peptides |
| JPS5944399A (ja) | 1982-09-07 | 1984-03-12 | Takeda Chem Ind Ltd | 新規ｄｎａ |
| GB8616166D0 (en) * | 1986-07-02 | 1986-08-06 | Research Corp Ltd | Polypeptide competitor |
| US4892827A (en) | 1986-09-24 | 1990-01-09 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Recombinant pseudomonas exotoxins: construction of an active immunotoxin with low side effects |
| EP0269455A3 (en) | 1986-11-28 | 1989-09-06 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Highly purified fused protein comprising human ige fc fragment and production thereof |
| EP0344211A4 (en) | 1987-02-20 | 1990-03-12 | Imclone Systems Inc | MONOCLONAL ANTIBODIES IN VACCINE COMPOSITIONS. |
| CA1336818C (en) | 1987-04-16 | 1995-08-29 | International Institute Of Cellular And Molecular Pathology | Treatment of allergy and composition thereof |
| EP0387276B1 (en) | 1987-10-13 | 1997-04-23 | Terrapin Technologies, Inc. | Method to produce immunodiagnostic reagents |
| GB8727045D0 (en) | 1987-11-19 | 1987-12-23 | Research Corp Ltd | Immunoglobulin e competitor |
| US5342924A (en) | 1987-12-31 | 1994-08-30 | Tanox Biosystems, Inc. | Extracellular segments of human ε immunoglobulin anchoring peptides and antibodies specific therefor |
| US5449760A (en) | 1987-12-31 | 1995-09-12 | Tanox Biosystems, Inc. | Monoclonal antibodies that bind to soluble IGE but do not bind IGE on IGE expressing B lymphocytes or basophils |
| GB8910263D0 (en) | 1989-05-04 | 1989-06-21 | Ciba Geigy Ag | Monoclonal antibodies specific for an immunoglobulin isotype |
| GB8913737D0 (en) | 1989-06-15 | 1989-08-02 | Univ Birmingham | A novel anti-allergy treatment |
| EP0512064B1 (en) | 1990-01-23 | 1997-06-18 | Tanox Biosystems, Inc. | Extracellular segments of human ige immunoglobulin anchoring peptides and antibodies specific therefor |
| ES2077857T3 (es) | 1990-05-25 | 1995-12-01 | Peptide Therapeutics Ltd | Prueba de inmunodiagnostico para artritis reumatoide. |
| US5258289A (en) | 1990-09-05 | 1993-11-02 | Davis Claude G | Method for the selecting of genes encoding catalytic antibodies |
| GB9101550D0 (en) | 1991-01-24 | 1991-03-06 | Mastico Robert A | Antigen-presenting chimaeric protein |
| WO1993004173A1 (en) * | 1991-08-14 | 1993-03-04 | Genentech, Inc. | Immunoglobulin variants for specific fc epsilon receptors |
| US5965709A (en) * | 1991-08-14 | 1999-10-12 | Genentech, Inc. | IgE antagonists |
| SE9102808L (sv) | 1991-09-26 | 1993-03-27 | Lars T Hellman Inst F Immunolo | Vaccin, foer humant bruk, vars avsedda effekt aer att lindra symptomen eller foerhindra uppkomsten av ige-medierade allergiska reaktioner |
| GB9125024D0 (en) | 1991-11-25 | 1992-01-22 | Kirby Julian | Rheumatoid arthritus treatment |
| JPH06113881A (ja) | 1992-10-07 | 1994-04-26 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | ヒト型モノクローナル抗ペプチド抗体及びこれをコードするｄｎａ |
| WO1994025060A1 (en) | 1993-04-27 | 1994-11-10 | Ladd Anna E | Immunogenic lhrh peptide constructs and synthetic universal immune stimulators for vaccines |
| US5759551A (en) | 1993-04-27 | 1998-06-02 | United Biomedical, Inc. | Immunogenic LHRH peptide constructs and synthetic universal immune stimulators for vaccines |
| EP0763537A3 (en) | 1993-05-14 | 1997-10-22 | Genentech Inc | Non-peptides farnesyl transfer inhibitors |
| GB9320897D0 (en) | 1993-10-11 | 1993-12-01 | Peptide Therapeutics Ltd | Compounds useful in anti-allergy treatment |
| GB9324013D0 (en) * | 1993-11-22 | 1994-01-12 | 3I Res Expl Ltd | Polypeptides |
| FR2715304B1 (fr) * | 1994-01-26 | 1996-04-26 | Merieux Serums Vaccins Pasteur | Vaccin anti-allergique. |
| EP0811016A1 (en) * | 1994-03-28 | 1997-12-10 | United Biomedical, Inc. | Synthetic peptide based immunogens for the treatment of allergy |
| US5962634A (en) | 1994-07-08 | 1999-10-05 | Thomas Jefferson University | IgE antagonists |
| EP0787150A1 (en) | 1994-10-25 | 1997-08-06 | United Biomedical, Inc. | SYNTHETIC IgE MEMBRANE ANCHOR PEPTIDE IMMUNOGENS FOR THE TREATMENT OF ALLERGY |
| WO1998024808A2 (en) | 1996-12-06 | 1998-06-11 | THE UNITED STATES OF AMERICA represented by THE SECRETARY DEPARTMENT OF HEALTH & HUMAN SERVICES, THE NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH | INHIBITION OF IgE-MEDIATED ALLERGIES BY A HUMAN IgE-DERIVED OLIGOPEPTIDE |
| EP0955311A3 (en) | 1998-04-09 | 2000-08-16 | Idexx Laboratories, Inc. | Peptide vaccine for canine allergy |
| TWI229679B (en) | 1998-06-20 | 2005-03-21 | United Biomedical Inc | Artificial T helper cell epitopes as immune stimulators for synthetic peptide immunogens |
-
1997
- 1997-02-28 KR KR10-1998-0706845A patent/KR100498198B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1997-02-28 RU RU98118184/14A patent/RU2193413C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1997-02-28 AT AT97905136T patent/ATE230417T1/de not_active IP Right Cessation
- 1997-02-28 DK DK97905136T patent/DK0885244T4/da active
- 1997-02-28 CN CNB971926719A patent/CN1174998C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1997-02-28 IL IL12559097A patent/IL125590A/xx not_active IP Right Cessation
- 1997-02-28 EP EP97905136A patent/EP0885244B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-28 CA CA002245497A patent/CA2245497C/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-02-28 CZ CZ0277198A patent/CZ299551B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-02-28 AU AU18796/97A patent/AU719609B2/en not_active Ceased
- 1997-02-28 ES ES97905136T patent/ES2190799T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-28 SK SK1181-98A patent/SK284856B6/sk unknown
- 1997-02-28 KR KR1020057005577A patent/KR100584051B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1997-02-28 DE DE69718150T patent/DE69718150T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-28 WO PCT/EP1997/001013 patent/WO1997031948A1/en active IP Right Grant
- 1997-02-28 BR BR9707819A patent/BR9707819A/pt not_active Application Discontinuation
- 1997-02-28 US US09/125,641 patent/US6610297B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-02-28 JP JP53063297A patent/JP3421970B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1997-02-28 TR TR1998/01722T patent/TR199801722T2/xx unknown
- 1997-02-28 NZ NZ331651A patent/NZ331651A/xx unknown
- 1997-02-28 PL PL97328858A patent/PL187209B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1997-02-28 HU HU9901109A patent/HUP9901109A3/hu unknown
- 1997-02-28 SI SI9730490T patent/SI0885244T2/sl unknown
-
1998
- 1998-08-31 NO NO19983999A patent/NO321043B1/no unknown
- 1998-12-31 HK HK98119259A patent/HK1014962A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2002
- 2002-12-26 JP JP2002377664A patent/JP2003231696A/ja active Pending
-
2004
- 2004-06-04 CY CY0400044A patent/CY2457B1/xx unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6610297B1 (en) | Peptide immunogens for vaccination against and treatment of allergy | |
| KR0181313B1 (ko) | 면역활성 펜티드 및 항체와 이것들의 항-알레르기 치료에의 이용 | |
| CZ20013081A3 (cs) | Epitopy a mimotopy získané z oblastí C-epsilon-2 nebo C-epsilon-4 IgE, jejich antagonisté a jejich terapeutické pouľití | |
| Terness et al. | The natural human IgG anti-F (ab') 2 antibody recognizes a conformational IgG1 hinge epitope. | |
| EP1169353B1 (en) | Anti-idiotypic antibodies against antibodies which inhibit the binding of immunoglobuline to its high affinity receptor | |
| KR20020007313A (ko) | ＩｇＥ의 Ｃ-엡실론-2 도메인으로부터 유도된 에피토프또는 미모토프, 이들의 길항제 및 이들의 치료학적 용도 | |
| US20030147906A1 (en) | Epitopes or mimotopes derived from the C-epsilon-3 or C-epsilon-4 domains of lgE, antagonists thereof, and their therapeutic uses | |
| US20030170229A1 (en) | Vaccine | |
| US20050214285A1 (en) | Epitopes or mimotopes derived from the C-epsilon-3 or C-epsilon-4 domains of IgE, antagonists thereof, and their therapeutic uses | |
| US7250164B2 (en) | Vaccine composition for preventing meningococcal disease |