CZ277198A3 - Imunogenní peptidy, způsob jejich přípravy, farmaceutický prostředek, který je obsahuje a jejich použití - Google Patents
Imunogenní peptidy, způsob jejich přípravy, farmaceutický prostředek, který je obsahuje a jejich použití Download PDFInfo
- Publication number
- CZ277198A3 CZ277198A3 CZ982771A CZ277198A CZ277198A3 CZ 277198 A3 CZ277198 A3 CZ 277198A3 CZ 982771 A CZ982771 A CZ 982771A CZ 277198 A CZ277198 A CZ 277198A CZ 277198 A3 CZ277198 A3 CZ 277198A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- gly
- peptide
- antibody
- ser
- bsw17
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 190
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 title claims abstract description 42
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims description 59
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 20
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title abstract description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims abstract description 20
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 18
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 claims abstract description 17
- 230000007815 allergy Effects 0.000 claims abstract description 11
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 78
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 71
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 49
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 46
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 10
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 claims description 10
- 239000000863 peptide conjugate Substances 0.000 claims description 8
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 6
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 3
- 230000009435 amidation Effects 0.000 claims description 2
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 claims description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 2
- ZGEGCLOFRBLKSE-UHFFFAOYSA-N methylene hexane Natural products CCCCCC=C ZGEGCLOFRBLKSE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- XTQFHTHIAKKCTM-YFKPBYRVSA-N Gly-Glu-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O XTQFHTHIAKKCTM-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims 1
- LHRXAHLCRMQBGJ-RYUDHWBXSA-N Gly-Glu-Phe Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)CN LHRXAHLCRMQBGJ-RYUDHWBXSA-N 0.000 claims 1
- PDQDCFBVYXEFSD-SRVKXCTJSA-N Leu-Leu-Asp Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O PDQDCFBVYXEFSD-SRVKXCTJSA-N 0.000 claims 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 claims 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 claims 1
- 206010012438 Dermatitis atopic Diseases 0.000 abstract description 4
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 abstract description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 abstract 1
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 66
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 55
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 36
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 33
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 33
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 32
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 32
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 31
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 30
- VYLDEYYOISNGST-UHFFFAOYSA-N bissulfosuccinimidyl suberate Chemical compound O=C1C(S(=O)(=O)O)CC(=O)N1OC(=O)CCCCCCC(=O)ON1C(=O)C(S(O)(=O)=O)CC1=O VYLDEYYOISNGST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 28
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 26
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 20
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 19
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 18
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 17
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 16
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 16
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 16
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 16
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 15
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 15
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 13
- 230000002052 anaphylactic effect Effects 0.000 description 12
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 12
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 12
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 12
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 11
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 11
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 11
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 10
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 10
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 10
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 9
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 9
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 9
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 9
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 9
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 8
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 7
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 7
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 6
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 6
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 6
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 6
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 6
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 150000002617 leukotrienes Chemical class 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 241000282322 Panthera Species 0.000 description 5
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 5
- 230000003266 anti-allergic effect Effects 0.000 description 5
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 5
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 5
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 4
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 4
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 4
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 4
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 4
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 4
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 4
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- LQRJAEQXMSMEDP-XCHBZYMASA-N peptide a Chemical compound N([C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCCCC[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)C(\NC(=O)[C@@H](CCCCN)NC(=O)CNC(C)=O)=C/C=1C=CC=CC=1)C(N)=O)C(=O)C(\NC(=O)[C@@H](CCCCN)NC(=O)CNC(C)=O)=C\C1=CC=CC=C1 LQRJAEQXMSMEDP-XCHBZYMASA-N 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 3
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 3
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 3
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 3
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 3
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AHPWQERCDZTTNB-FXQIFTODSA-N Arg-Cys-Cys Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)CN=C(N)N AHPWQERCDZTTNB-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108010069514 Cyclic Peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000001189 Cyclic Peptides Human genes 0.000 description 2
- OABOXRPGTFRBFZ-IMJSIDKUSA-N Cys-Cys Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O OABOXRPGTFRBFZ-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 101710193132 Pre-hexon-linking protein VIII Proteins 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 125000000218 acetic acid group Chemical group C(C)(=O)* 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 2
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 2
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 2
- 108010004073 cysteinylcysteine Proteins 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 2
- TXOUDPQJASQYBZ-UHFFFAOYSA-N n,n'-dihexylmethanediimine Chemical compound CCCCCCN=C=NCCCCCC TXOUDPQJASQYBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- INGWEZCOABYORO-UHFFFAOYSA-N 2-(furan-2-yl)-7-methyl-1h-1,8-naphthyridin-4-one Chemical compound N=1C2=NC(C)=CC=C2C(O)=CC=1C1=CC=CO1 INGWEZCOABYORO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 4-chloronaphthalen-1-ol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=C(Cl)C2=C1 LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 5DS237 and SDS2S3 Chemical compound 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 206010002198 Anaphylactic reaction Diseases 0.000 description 1
- PSOPJDUQUVFSLS-GUBZILKMSA-N Arg-Met-Cys Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N PSOPJDUQUVFSLS-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- IJYZHIOOBGIINM-WDSKDSINSA-N Arg-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N IJYZHIOOBGIINM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 241000244186 Ascaris Species 0.000 description 1
- ZKDGORKGHPCZOV-DCAQKATOSA-N Asn-His-Arg Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N ZKDGORKGHPCZOV-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- ZBYLEBZCVKLPCY-FXQIFTODSA-N Asp-Ser-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O ZBYLEBZCVKLPCY-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 1
- 241000244203 Caenorhabditis elegans Species 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000257465 Echinoidea Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 102100038006 High affinity immunoglobulin epsilon receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 108050001540 High affinity immunoglobulin epsilon receptor subunit beta Proteins 0.000 description 1
- KRBMQYPTDYSENE-BQBZGAKWSA-N His-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CNC=N1 KRBMQYPTDYSENE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 101001033279 Homo sapiens Interleukin-3 Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 102000016844 Immunoglobulin-like domains Human genes 0.000 description 1
- 108050006430 Immunoglobulin-like domains Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 241001625930 Luria Species 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 241000542855 Megathura crenulata Species 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 241000269980 Pleuronectidae Species 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 229920002594 Polyethylene Glycol 8000 Polymers 0.000 description 1
- 108010020346 Polyglutamic Acid Proteins 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- FFOKMZOAVHEWET-IMJSIDKUSA-N Ser-Cys Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O FFOKMZOAVHEWET-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- YZMPDHTZJJCGEI-BQBZGAKWSA-N Ser-His Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 YZMPDHTZJJCGEI-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- LDEBVRIURYMKQS-WISUUJSJSA-N Ser-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO LDEBVRIURYMKQS-WISUUJSJSA-N 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- WITCOKQIPFWQQD-FSPLSTOPSA-N Val-Asn Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O WITCOKQIPFWQQD-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 1
- 238000000333 X-ray scattering Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 1
- 230000009833 antibody interaction Effects 0.000 description 1
- 229940125715 antihistaminic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000739 antihistaminic agent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 208000010216 atopic IgE responsiveness Diseases 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 230000003851 biochemical process Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N chloramine T Chemical compound [Na+].CC1=CC=C(S(=O)(=O)[N-]Cl)C=C1 VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 238000001142 circular dichroism spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000013377 clone selection method Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 229960003983 diphtheria toxoid Drugs 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000007824 enzymatic assay Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 108010018006 histidylserine Proteins 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000005965 immune activity Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000010807 negative regulation of binding Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001956 neutron scattering Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 229940043515 other immunoglobulins in atc Drugs 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 229920002643 polyglutamic acid Polymers 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 210000004896 polypeptide structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 229940070741 purified protein derivative of tuberculin Drugs 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 108010048818 seryl-histidine Proteins 0.000 description 1
- 108010071207 serylmethionine Proteins 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000009121 systemic therapy Methods 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229960001479 tosylchloramide sodium Drugs 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 229960001005 tuberculin Drugs 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
- C07K16/4283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig
- C07K16/4291—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig against IgE
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
- C07K2317/528—CH4 domain
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Imunogenní peptidy, způsob jejich přípravy, farmaceutický prostředek, který je obsahuje a jejich použití
Oblast techniky
Předmětem vynálezu jsou imunogenní peptidy. Zvláštní důraz je kladen na inhibici interakcí, které by mohly za normálních okolností být signálem ke spuštění činnosti mastocytů a bazofilů pomocí buněk nesoucích IgE s navázaným alergenem. Důsledkem tohoto pochodu je uvolnění farmakologicky aktivních medíátorů, jakož i de novo syntéza cytokinů, které se podílejí na regulaci alergických a zánětlivých reakcí. Vynález se týká imunogenních molekul obsahujících část mimotopového peptidu protilátky BSW17 a jejich použití.
Dosavadní stav techniky
Alergické příznaky jsou vyvolány uvolněním farmakologicky aktivních medíátorů, zejména histaminu, leukotrienů a enzymů. Tyto látky jsou uvolňovány z buněk do okolní tkáně a cévního systému. Tyto mediátory jsou za normálních okolností skladovány nebo syntetizovány de novo ve speciálních buňkách známých jako žírné buňky (mastocyty) a bazofilní granulocyty. Mastocyty jsou rozptýleny živočišných tkáních, zatímco bazofily cirkulují v cévním systému. Tyto buňky syntetizují a skladují mediátory, dokud nedojde ke speciální sekvenci pochodů vedoucích k jejich uvolnění.
Role imunoglobulinových protilátek E (IgE) v průběhu alergických reakcí je dobře známá. Protilátka IgE je komplex uspořádaných polypeptidových řetězců, které se tak, jako u ostatních imunoglobulínů, skládají z lehkého a těžkého řetězce, spojených dohromady disulfidovými můstky takovým ···· • ··· • « » * I · · · · ·
-2způsobem, že zaujmou konfiguraci ve tvaru písmene Y. Každý lehký řetězec má dvě domény, jednu variabilní (VL) doménu, spojenou s doménou s relativně neměnnou aminokyselinovou sekvencí, která se nazývá konstantní doména (CL). Oproti tomu, těžký řetězec má jednu variabilní doménu (VH) a v případě IgE, čtyři konstantní domény (C^l, Ch2, 0^3, 0^4) které jsou také známy jako Cel, Ce2, Ce3 a Ce4. Dvě ramena protilátky jsou zodpovědná za vazbu antigenu, protože nesou oblasti, kde je polypeptidová struktura velmi variabilní a jsou ukončena fragmenty Fab'nebo F(ab')2< což představuje dva ramena Fab'spojená dohromady disulfidovými vazbami. Ocásek centrální osy protilátky obsahuje konstantní sekvenci peptidů a nazývá se Fc fragment. Fc fragment obsahuje interaktivní místa umožňující protilátce komunikovat s dalšími molekulami imunitního systému nebo s buňkami. K interakci s buňkami dochází prostřednictvím vazby k jejích Fc receptoru.
Fc receptory jsou molekuly, které se specificky vážou k aktivním místům na molekule imunoglogulinu v Fc oblastech. Fc receptoty se vyskytují jako integrální membránové proteiny ve venkovní buněčné plazmatické membráně, nebo mohou existovat ve formě rozpustných molekul, které volně cirkulují v krevní plazmě a ostatních tělních tekutinách. V lidském systému se dosahuje vysoké afinity vazby IgE k receptorům FceRI pomocí komplexní protein-proteinové interakce různých částí konstantní oblasti (Ce3) třetího těžkého řetězce IgE a k membráně otočené části imunoglobulinům podobné domény (a.2) podjednotky FceRIa.
Ačkoli byly v Ce3 doméně konstantní oblastí těžkého řetězce IgE a v oblasti patřící do a.2 domény FceRI a identifikovány aminokyselinové zbytky pro vazbu nezbytné, detailní mechanismus vazebného procesu je stále málo známý.
-3Na základě měření přenosu fluorescenční energie a dále z měření využívajících rozptylu roentgenových a neutronových paprsků byly podány experimentální důkazy, že lidský IgE zaujímá zakřivenou strukturu, o které se předpokládá, že přispívá k neobvykle vysoké hodnotě afinity IgE pro FceRI (Kd- 1010M).
Kromě toho je tato zakřivená struktura také považována za příčinu tvorby ekvimolárního komplexu mezi IgE a buněčně vázaným nebo rozpustným FceRI a, ačkoli molekula IgE může poskytnout identický epitop pro vazbu receptoru na dvou Ce3 doménách. Tato schopnost monovalence je funkční nutností, jestliže má být zábráněno zapojení receptoru za nepřítomnosti alergenu (viz Obrázek 1). Místa pro interakci mohou tedy být, v závislosti na jejich funkci, vždy přístupná a tudíž schopná vázat se k buněčným receptorům. V jiném případě mohou být tato místa schována, dokud nedojde k vazbě protilátky na antigen, čímž protilátka změní svoji strukturu a následně odhalí další aktivní místa, která mohou vést ke spuštění specifické imunitní aktivity. Na základě dat vyplývajících z měření spekter cirkulárního dichroismu se konformační změnou postihující Ce3 po vazbě na receptor vysvětluje stechiometrický poměr 1:1 Fce3/FceRI na buněčném povrchu.
Pro alergické (imunologické) uvolnění histaminu v organizmu z mastocytů a bazofilů je tedy nezbytné, aby molekula IgE zapadla nebo se připojila svou Fc částí k buněčnému Fc receptorovému místu, a tímto způsobem je zajištěna vazba IgE na mastocyty a bazofily. Fab' části na buňku navázaných molekul IgE musí být v dalším kroku navzájem propojeny pomocí konkrétního kompatibilního antígenu (alergenu). Jestliže se uskuteční takováto interakce, pro mastocyty a bazofily je to bezprostřední pokyn pro uvolňování histaminu do okolního prostředí, a to • · · · · · • · ·· · · • · • · <
-4se projeví dobře známými alergickými příznaky. Potom následují další biochemické pochody pozdní fáze reakce, které vyústí v syntézu a uvolnění cytokinů a dalších mediátorů (J.V. Ravetch a J.P. Kinet, Ann.Rev. Immuno 19 (1991), strana 457 až 492).
Přístupy k léčení alergií známé ze stavu zahrnují obvykle systémovou terapii pomocí podávání antihistaminik nebo steroidů, nebo postupy vedoucí ke snížení citlivosti pacientů na daný alergen. Tyto léčebné způsoby nejsou přímo zaměřeny na základní interakci IgE s mastocyty nebo bazofily. Další způsoby léčby zahrnují přípravu polypeptidových řetězců, které jsou schopné blokovat vazbu protilátky IgE k Fc receptorů na povrchu buněk a vytěsní tak IgE z vazebných míst, na která se molekuly IgE obvykle vážou. Dále se provádí výzkum za účelem definování vlastností uvažovaného efektorového místa uvnitř oblasti IgE Fc, o kterém se předpokládá, že vyvolává imunologický signál, který je hlavní podmínkou vedoucí k uvolnění mediátorů z mastocytů nebo bazofilů.
Bylo rovněž vyzkoušeno a ukázalo se jako účinné použití rekombinantních IgE fragmentů jako imunogenů k přípravě ochranné anti-IgE vakcíny. Hlavním argumentem proti tomuto postupu se ukázal fakt, že při přípravě takovéto vakcíny se používá k imunizaci velkých fragmentů IgE, což by mohlo iniciovat nejen tvorbu inhibičních protilátek, ale také by mohly vzniknout křížové reakce a následkem toho by vznikly anafylaktogenní (způsobující přecitlivělost) protilátky v těle pacientů, viz Obrázek 2.
Strategie, jak překonat tento problém, by mohla spočívat v určení nejmenšího možného fragmentu IgE, v ideálním případě skládajícího se jen z receptorového vazebného místa, které je po vazbě skryto v komplexu IgE/FcsRI, a tak není k dispozici pro křížovou vazbu s vakcínou vyvolanou imunitní odpovědí. Pokusy o rekonstrukci takovéto komplexní molekulární entity však stěží povedou k úspěchu a to hlavně kvůli prostorovým vzdálenostem různých Ce3 oblastí, které se zapojují do interakce IgE/FceRI.
Podstata vynálezu
V poslední době se zjistilo, že problémy skutečně spojené s přístupem ke klasické vakcíně lze překonat užitím BSW17 mimotopů pro aktivní imunizaci. Lze je použít buď jako chemicky syntetizované peptidy vázané na vhodné nosiče, nebo jako rekombinantní fúzní konstrukty (například s ovalbuminem, IgG, a tak dále).
BSW17 je monoklonální protilátka, která rozpoznává konformační epitop na Fce, který má přinejmenším jednu svou část v oblasti uvnitř Cs3. Hybridomové buněčné linie produkující monoklonální protilátku BSW17 byly uloženy 19. prosince roku 1996 v ECACC podle pravidel Budapešťské smlouvy o skladování mikroorganismů, pod depozitním číslem 96121916. Tato protilátka vykazuje zajímavý profil biologických aktivit, který je shrnut v obrázku 3. Protilátka BSW17 nebo BSW17-podobné protilátky cirkulující v cévním systému ochraňují organismus před alergickými reakcemi, a to buď
a) zabráněním spuštění reakce probíhající v mastocytech a bazofilech pomocí kompetitivní inhibice interakce IgE/IgERI, nebo
b) snížením hladiny IgE v séru snížením syntézy IgE na úrovni B buněk.
BSW17 mimotopové peptidy byly v tomto případě identifikovány výběrem z náhodné kombinatorické knihovny peptidu exprimovaných na povrchu fágů (phage display ·· ·· > · · « » · · « ··· · ’ • · 4 ♦ · ··
-6library), a to jako peptidy, které napodobují přinejmenším část komplexního konformačního epitopu na IgE molekule. Chemicky syntetizované mimotopové peptidy vázané na imunogenní nosný protein mohou být užity pro přípravu vakcíny pro vyvolání specifických protilátek alergickém hostiteli. Tyto protilátky inhibují činnost komplexu mastocytů a bazofilů, a to buď blokováním vazby IgE/FcsRI, nebo syntézy IgE. Jako mimotopy protilátek IgE indukují imunitní odpověď, která v hostiteli vede k produkci protilátek podobných BSW17. Jelikož BSW17 nevyvolává anafylaktickou reakci a inhibuje vazbu IgE/FcsRI a syntézu IgE na úrovni B buněk, mají vakcíny založené na protilátkách připravených proti BSW17 mimotopu analogické ochranné vlastnosti. Imunitní odpověď je velmi specifická, protože oproti přístupu s použitím klasické vakcíny, nejsou přítomny proteinové fragmenty odvozené od IgE, které by mohly vyvolat tvorbu křížově reagujících (crosslinking) protilátek v imunizovaných pacientech (viz obrázek 4).
Vynález tedy popisuje imunogenní molekuly obsahující:
a) alespoň jednu část mimotopového peptidu BSW17 a
b) části schopné vyvolat imunitní odpověď proti peptidu (nosiče).
V následujícím textu je zkráceně nazýváme imunogeny podle vynálezu.
Komponenta a) se skládá z maximálně pěti částí, ve výhodném uspořádání však z jedné nebo dvou, ve zvláště výhodném uspořádání z jedné části mimotopového peptidu BSW17. Komponenta b) je výhodně běžně používaný imunogenní nosič, zvláště pak BSA (hovězí sérový albumin) nebo KHL (hemocyanin z mořských přílipek).
-7Mimotopový peptid BSW17 v komponentě a) ve výhodném uspořádání obsahuje dohromady až 15 aminokyselin a jeho sekvence je například jedna ze sekvencí (A) až (Q) (Sekvence číslo 1 až 17, viz dále) . Nicméně tato komponenta může zahrnovat další součásti vhodné pro vytvoření vazby haptennosič, například složky usnadňující navázání komponenty a na komponentu b, nebo další zpracování. Je-li například mimotopový peptid BSW17 cyklický, jeho dva konce mohou být například spojeny dohromady pomocí dodaných cysteinových zbytků, které utvoří disulfidový můstek, nebo mohou být konce chemicky propojeny, například lysinem. Jsou-li BSW mimotopové peptidy lineární, používá se s výhodou blokování koncových karboxylových skupin amidací, nebo mohou být koncové aminoskupiny aminokyselin ve výhodném uspořádání blokovány acylací. Funkční prostorové mimotopového peptidu BSW17 v komponentě (a) výhodné skupiny podle Sekvencí (A) až (Q) , imunogenech podle vynálezu rovněž obklopeny struktury například mohou být v několika, ve výhodném uspořádání jednou nebo dvěma, dodatečnými pomocnými skupinami, jako je acetyl, cystein nebo lysin, a nebo dodatkovou vazebnou částí, jako jsou DC nebo BSS. Tato činidla byla použita například pro přípravu specifických imunogenů podle vynálezu v Příkladu 8, dále v textu uváděných jako konjugáty (2) až (4) a (6) až (11), (13) a (14) .
Protilátky připravené pomocí imunogenů podle vynálezu jsou oproti protilátkám produkovaným hybridomem BSW17 endogenní a tak mohou být použity pro preventivní léčebné zásahy i u lidských pacientů.
Tyto protilátky mohou být připraveny vhodnou vazbou výše definovaných komponent (a) a (b).
· 4 4
9 44
4 4 4
4 4
44
44 • ·· · ·9 · • 9 4 · 4
-8Podrobný popis vynálezu
Imunogen dle vynálezu může být například ve formě polymerního peptidu nebo rekombinantního fúzního proteinu, přičemž monomerní část polymerního peptidu, nebo jedna ze součástí fúzního proteinu tvoří část BSW17 mimotopového peptidu (a) a zbytek polymerního peptidu nebo fúzního proteinu vyvolajicí imunitní odpověď tvoří komponentu (b).
Tyto imunogeny se výhodně používají ve formě konjugátů alespoň jedné funkční mimotopový peptid BSW17 imunogenní nosič (b).
prostorové struktury tvořící (a) a jedné skupiny tvořící
Ve zvláště výhodném uspořádání vynálezu se funkční prostorové struktury mimotopového peptidu BSW17, to jest části tvořící komponentu (a), skládají nebo obsahují aminokyselinové sekvence vybrané z následujících:
Ile-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val (A) (Sekvence č.l),
Arg Asn-His-Arg Gly-Tyr-Trp-Val (B) (Sekvence č.2),
Arg-Ser-Arg-Ser-Gly-Gly-Tyr-Trp-Leu-Trp (C)
Val-Asn-Leu-Thr-Trp-Ser-Arg-Ala-Ser-Gly (D)
Val-Asn-Leu-Pro-Trp-Ser-Arg-Ala-Ser-Gly (E)
Val-Asn-Leu-Thr-Trp-Ser-Phe-Gly-Leu-Glu (F)
Sekvence č.3),
Sekvence č.4),
Sekvence č.5),
Sekvence č.6),
Val-Asn-Leu-Pro-Trp-Ser-Phe-Gly-Leu-Glu (G) (Sekvence č.7)
-9• ··· • · · ·· w · *· · · ···· • · · » · · ·· • · ··· · ·«?· · · • · · · · · ·· ·· »· ··
Val-Asn-Arg-Pro-Trp-Ser-Phe-Gly-Leu-Glu (H) (Sekvence č.8),
Val-Lys-Leu-Pro-Trp-Arg-Phe-Tyr-Gln-Val (I) (Sekvence č.9),
Val-Trp-Thr-Ala-Cys-Gly-Tyr-Gly-Arg-Met (J) (Sekvence č.10),
Gly-Thr-Val-Ser-Thr-Leu-Ser (K) (Sekvence č.ll),
Leu-Leu-Asp-Ser-Arg-Tyr-Trp (L) (Sekvence č.12),
Gln-Pro-Ala-His-Ser-Leu-Gly (M) (Sekvence č.13),
Leu-Trp-Gly-Met-Gln-Gly-Arg (N) (Sekvence č.14),
Leu-Thr-Leu-Ser-His-Pro-His-Trp-Val-Leu-Asn-His-Phe-Val-Ser (O) (Sekvence č.15),
Ser-Met-Gly-Pro-Asp-Gln-Thr-Leu-Arg (P) (Sekvence č.16), nebo
Val-Asn-Leu-Thr-Trp-Ser (Q) (Sekvence č.17).
Ve výhodném uspořádání se nejvíce používají sekvence (A), (D) a (G) , ve zvláště výhodném uspořádání sekvence (A) a (D) .
Vynález dále zahrnuje farmaceutické směsi, zvláště pak vakcíny, skládající se z molekul imunogenu, tak je definován výše a příslušného adjuvans.
-10* Λ »·«· • · * • ··* • · · • · ···» ·♦· • · · · • · « · • a * * » • · * ·« ·♦ «Β ··
Β · * * « « ·· • · · · · '<» • · · ·· ·»
Vynález se dále týká ligandů, to znamená protilátek a fragmentů od nich odvozených, namířených proti mimotopovým peptidům BSW17, užitých pro pasivní imunizaci (viz níže), přičemž protilátka nebo její fragmenty také rozpoznávají přirozený epitop pro BSW17 na lidském IgE. Ve výhodném uspořádání vynález popisuje ligandy obsahující doménu protilátky specifickou pro část mimotopového peptidů BSW17, tak, jak je definován výše, přičemž doména protilátky reaguje se sekvencí aminokyselin na těžkém řetězci IgE, který obsahuje přirozený epitop rozpoznávaný BSW17. Takovéto ligandy se mohou produkovat v těle savců jako polyklonální a monoklonální protilátky. Ve výhodném uspořádání vynálezu jsou upřednostňovány monoklonální protilátky, zvláště pak ve formě svých Fab'fragmentů nebo F(ab')2 fragmentů.
Vynález dále popisuje způsob přípravy imunogenu podle vynálezu, což zahrnuje kovalentní vazbu
a) nejméně jednoho mimotopového peptidů se
b) skupinou schopnou vyvolat imunitní odpověď proti tomuto peptidů.
Vynález dále popisuje popisuje použití výše popsaných imunogenních molekul jako léčiva, to znamená pro léčbu nemocí ovlivněných IgE, jako jsou alergie a atopická dermatitida.
Vynález se dále týká použití výše popsaných imunogenních molekul k přípravě farmaceutických kompozic, zvláště pak vakcín, proti nemocem zapříčiněným IgE, zejména alergiím a atopické dermatitidě.
Další výhodné použití vynálezu se týká způsobu preventivní a léčebné imunizace proti nemocem zapříčiněným IgE jako jsou alergie a atopická dermatitida, což zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství výše definovaných ·· ····
-11imunogenních molekul léčení.
pacientovi, který potřebuje takovéto
Imunogeny podle vynálezu, které nejsou schopny v podstatě zprostředkovat ne-cytolytické uvolnění histaminu jsou na druhé straně schopny vyvolat tvorbu protilátek se silnou serologickou křížovou reaktivitou s cílovou aminokyselinovou sekvencí Fc části IgE. Jsou proto použitelné pro přípravu vakcín nebo přímo jako vakcíny.
Počáteční dávka imunogenu (to znamená přibližně od 0,2 mg do přibližně 5 mg, výhodně okolo 1 mg) je například podávána intramuskulárně, následují stejné opakované dávky o 14 a 28 dní později. Dávky jsou závislé na věku, váze a všeobecném zdravotním imunizačni samozřejmě stavu pacienta. Imunizace může být aktivní nebo pasivní.
Při aktivní imunizaci pacient dostává imunogen podle vynálezu a tím je aktivně indukována anti-hlgE odpověď pacientovým imunitním systémem.
Pasivní imunizace spočívá v podávání anti-BSW17 mimotopových protilátek, ať polyklonálních nebo monoklonálních pacientovi trpícímu nemocí vyvolanou IgE, nejlépe ve formě injekcí.
Polyklonální anti-BSW17 mimotopové protilátky mohou být připraveny podáváním imunogenu podle vynálezu, ve výhodném užití spolu s adjuvans, savci, nikoli však člověku. Poté se shromažďuje vznikající antisérum. Zvýšení títrů antisér může být dosaženo pomocí opakovaných injekcí v určitém časovém úseku. Není speciální omezení pro druh savců užívaných pro tvorbu protilátek, obecně se používají králíci nebo morčata, ale mohou být použiti koně, kočky, psi, kozy, krysy, krávy, ovce a tak dále. Pro přípravu protilátek se určité množství imunogenu podle vynálezu • ·· ·
-12zředí fyziologickým pufrovaným roztokem na požadovanou koncentraci a vzniklý zředěný roztok se smíchá s kompletním Freundovým adjuvans tak, aby vznikla suspenze.
Suspenze je podávána savcům, a to intraperitoneálně, to znamená králíkovi od okolo 50 pg do 2500 pg imunogenu podle vynálezu na jednu dávku. Suspenze se ve výhodném uspořádání podává každých čtrnáct dnů po dobu dvou až tří měsíců, nej častěji jeden měsíc, tím se ovlivní účinnost imunizace. Protiláka se získává shromažďováním krve imunizovaných zvířat po dobu jednoho až dvou týdnů po poslední dávce, krev se centrifuguje a izoluje se z ní sérum.
Monoklonální anti-BSW17 mimotopové protilátky mohou být jednak lidské nebo myší. Ve výhodném uspořádání je pacient léčen podáváním Fab' fragmentů z myších monoklonálních protilátek nebo chimérických lidských-myších protilátek (obsahujících Fc oblast lidských a Fab' část myších protilátek), tak aby se minimalizovala nepříznivá reakce na cizí živočišný imunoglobulin. Myší monoklonální protilátky byly připraveny způsobem podle Kohlera a Milsteina (Kohler,G. A Milstein,C. , Nátuře 256(1975), strana 495), to znamená fúzí slezinných buněk hyperimunizovaných myší s odpovídající myší myelomovou buněčnou linií. K přípravě lidských monoklonálních protilátek se používá mnoha způsobů, včetně přípravy pomocí:
(1) (2) (3) (4) (5)
B-buněk transformovaných virem Epsteina a Barrové (EBV) buněčných linií pro hybridizaci B lymfocytů myších-lidských hybridomů lidských-lidských hybridomů lidských x lidských -myších heterohybridomů a • 9
• · · • 9
9 ··
-13(6) klonování náhodných fragmentů (phage display)
Ve zvláště výhodném uspořádání se užívají lidské x lidské-myší heterohybridomy, čímž se docílí kombinace výhodných vlastností obu použitých typů, jak lidských, tak myších rodičovských buněčných linií. Prokázalo se, že lidské-myší heterohybridomové buněčné linie jsou vhodné pro fúzi B buněk (Teng, N.N.M. a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 80(1983) strana 7308).
Jsou-li tyto heterohybridomy použity pro imunizaci, lze ve výhodném uspořádání protilátku zavést do hostilského organismu intramuskulární injekcí. S výhodou lze použít všech kapalných nebo pevných nosičů, které jsou přijatelné pro hostitelský organismus a nevyvolávají v hostiteli vedlejší účinky ani nemají škodlivé účinky na vakcínu. Jako nosič je možno použít fosfátem pufrovaný fyziologický roztok (PBS) při fyziologickém pH, to je okolo pH 6,8 až 7,2, nejlépe okolo pH 7, a to samotný nebo ve směsi s vhodným adjuvans, jako jsou adjuvanty na bázi hydroxidu hlinitého. Koncentrace imunogenního antigenu se může pohybovat v rozmezí od 50 pg do 500 pg, nejčastěji však od 200 pg do 300 pg na injekci. Celkový objem aplikovaného roztoku s antigenem se obecně pohybuje v rozmezí 0,25 ml až do 1 ml, nejčastěji okolo 0,5 ml.
Po aplikaci počáteční injekce je zapotřebí aplikovat další injekce, které mohou být dávány například v ročních intervalech.
Pokud jde o aktivní imunizaci, která se přednostně používá v humánní medicíně, avšak lze ji použít podobně i u dalších savčích druhů, lze aplikovat mimotopy odpovídající IgE příslušného druhu, jako jsou například psí IgE mimotopy při imunizaci psů. Použitý termín imunogenní nosič zahrnuje takové materiály, jejichž vlastností je, že po • · ·· • · • · · ·
-14• · ·· ·· aplikaci samy vyvolávají imunitní odpověď v živočišném hostiteli a které mohou být kovalentně vázány na polypeptid, a to buď přímo cestou tvorby daného peptidu, nebo pomocí esterových vazeb mezi volnými karboxylovými, amino nebo hydroxy skupinami v polypeptidu a odpovídajícími skupinami na imunogenním materiálu nosiče, nebo též pomocí vazby užitím obvyklých bifunkčních spojovacích skupin, či jako fúzní protein.
Příklady takovýchto nosičů zahrnují: albuminy, jako je BSA, globuliny, thyreoglobuliny, hemoglobiny, hemocyaniny (zvláště pak z mořských přílipek - Keyhole limpet hemocyanin, KLH), proteiny izolované ze škrkavek, to znamená extrakt ze škrkavek (ascaris), jak je popsaný v J. Immun. 111 (1973) atrana 260 až 268), J. Immun. 122 (1979), strana 302 až 308, J. Immun. 98 (1967), strana 893 až 900 a Am. J. Physiol. 199 (1960), strana 575 až 578. Dále se používají také jejich purifikované produkty, dále polylysin, polyglutamová kyselina, kopolymery lysinu a kyseliny glutamové, kopolymery obsahující lysin nebo ornitin, a tak dále. Jako materiál pro imunogenní nosiče se v poslední době pro přípravu vakcíny používá difterického toxoidu a tetanového toxoidu (Lepow M.L. a další, J. of Infectious Diseases 150 (1984), strana 402 až 406, Coen Beuvery,E. a další, Infection and Immunity 40, (1983) strana 39 až 45. Tyto toxoidní materiály byly také použity ve vynálezu. Ve výhodném uspořádání podle schématu pro aktivní imunizaci se používá purifikovaný protein odvozený od tuberkulinu (PPD), protože (1) sám o sobě neindukuje odpověď T buněk, (to znamená, že zde jde T -buněčný hapten) avšak chová se jako plně funkční antigen a je rozpoznáván T-buňkami jako takovými • · • · ··*« · ·· · * ··· • · · · · ··· · ··· · · • ·«· · · · · ······ · · · · ·« ··
-15(2) je znám jako jeden z kovalentně připojených haptenů a (3) může být použit v dalšího testování nejúčiněj ších nosičů lidském organismu bez
Pro přípravu antigenu podle vynálezu lze výhodně použít všech činidel pro vazbu hapten-nosič, která se k těmto reakcím používají, například ta, která jsou uvedena výše, či dále v příkladech.
Podle vynálezu lze kovalentní vazbu komponenty (a) k části (b) docílit známými postupy. Tak, například, pro přímou kovalentní vazbu se dává přednost užití vazebných činidel jako jsou bis-N-sukcinimidylové deriváty, ve zvláště výhodném uspořádání bis(sulfosukcinimidyl)suberát (BSS). K vytvoření kovalentní vazby peptidu (a) k materiálu imunogenního nosiče (b) lze také využít glutaraldehyd nebo karbodiimid, výhodněji však dicvklohexylkarbodiimid (DC) nebo l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl) karbodiimid.
Množství haptenu a činidel užívaných pro vazbu haptennosič (to jest komponenty (a)) a nosiče (to jest komponenty (b) ) lze zjistit obvykým způsobem. Ve výhodném uspořádání se množství nosiče pohybuje v jedna až šestinásobku hmotnosti haptenu, v ještě výhodnějším uspořádání vynálezu v jedna až pětinásobku hmotnosti haptenu. Vazebné činidlo se používá v množství pěti až desetinásobku molárního ekvivalentu haptenu. Po proběhnutí reakce, kdy haptenu pomocí vazebného činidla, antigen skládající se z peptidu a
Vzniklý imunogen podle vynálezu může být dále izolován všeobecně používanými postupy, jako jsou například dialýza, gelová filtrace, frakční precipitace, a tak dále.
je nosič navázán k se získá požadovaný nosičového komplexu.
Také příprava počátečního materiálu může být uskutečněna pomocí běžných postupů. Peptidy vhodné pro užití • · · ··
-16jako komponenta (a) mohou být například identifikovány výběrem náhodných peptidů exprimovaných na povrchu fágů v tak zvaných phage display knihovnách, nebo klasicky syntetizovány postupem syntézy na pevné fázi, například pro cyklické peptidy dobře známá metoda využívající F-moc chemie, nebo také mohou být identifikovány užitím peptidomimetické strategie výběrem z náhodně syntetizovaných peptidů.
Seznam použitých zkratek
Ac acetyl
AMS síran amonný
BSA hovězí sérový albumin
BSS bis(sulfosuccinimidyl)suberate
BSW 17 monoklonální protilátka IgG namířená proti
CH3 epitopu native IgE (viz J.Knutti-Muller a další, Allergy 41 (1986) strana 457 až 465;
S.Miescher a další, Int. Arch. Allergy Immunol. 105 (1994) strana 75) mimotopový peptid protilátky BSW 17 peptid napodobující přirozený epitop na povrchu lidské IgE, který je také rozeznáván monoklonální protilátkou BSW17 proti lidské IgE cfu kolonii tořící jednotka, měřítko koncentrce bakterií
DC dihexylkarbodiimid
EBV virus Epsteina a Barrové ·· ···· ···· • ··· · ·· · « ···
| * · · · · »·· » ···· · * ftft· · · · · -17- | |
| ELISA | imuno-enzymatický test na pevné fázi |
| FcERI | vysoce afinní receptor I pro konstantní oblast IgE |
| FCS | fetalní telecí sérum |
| h | lidský |
| HEPES | N-2-hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonová kyselina |
| HRP | křenová peroxidáza |
| HSA | lidský sérový albumin |
| IgE | immunoglobulin E |
| IPTG | isopropyl-fi-D-thiogalaktosid |
| KLH | hemocyanin z mořský přílipek Megathura crenulata (keyhole limpet hemocyanin) |
| Le27 | monoklonální protilátka proti lidským IgE (Allergy (1986), viz výše; Int.Arch. Allergy Immunol. (1994) viz výše) |
| plotny LB | plotny podle Lurii a Bertaniho |
mimotopový peptid peptid napodobující alspoň část přirozeného konformačního cílového epitopu
| protilátky | |
| PBS | fosfátem pufrovaný fyziologický roztok |
| PEG | polyethylen-glykol |
| PPD | purifikovaný proteinový derivát tuberkulinu |
rh II.-3 rekombinantní lidský interleukin-3 ·· ·«· • · · • · ··
-18plotny RIA
RPMI1640 sLt
TBS
VCS plotny pro radio-immuno testy standardní médium pro buněčné kultury (Sigma, St. Luis, USA) rozpustný leukotrien fyziologický roztok pufrovaný Tris-bazí pomocný fág VCS M13 (Stratagene, USA).
Popis obrázků
Obrázek 1: Interakce mezi protilátkou IgE a jejím vysoce afinním receptorem
Obrázek 2: Schéma vakcinace proti IgE klasickou cestou, tmavé protilátky jsou protilátky neutralizační, světlé znázorňují ne-inhibiční protilátky s možným anafylaktogenním účinkem
Obrázek 3: Profil biologické aktivity protilátky BSW17. Označená místa účinku znamenají: 1: ne-anafylaktogenní vazbu na IgE, 2. odstranění IgE vázaných na buněčném povrchu, 3. Neutralizace rozpustných IgE, 4. Inhibice syntézy IgE
Obrázek 4: Imunoterapie založená napoužití mimotopových peptidů protilátky BSW17, tmavě vyznačené protilátky jsou analogy BSW17 se všemi čtyřmi výše zmíněnými způsoby účinku.
Obrázek 5: Specifická interakce mezi mimotopovými peptidy protilátky BSW17 vystavenými na povrchu fága a protilátkou BSW17, vlevo jsou vždy částice fága klonu 1 a vpravo klonu 18.
·· φφφφ • φ • · ··
-19Obrázek 6: Kompetitivní inhibice vazby protilátky BSW17 na IgE pomocí mimotopových peptidů protilátky BSW17. Na svislé ose je udána aktivita vázané (V Cpm) na ose vodorovné je kompetice s IgE-SUSll (pg/ml), čtvereček platí pro peptid PhBSW.Negl, trojúhleníček s vrchlem nahoru pro peptid PhBSW.6-9 a konečně trojúhleníček s vrchlem dolů pro peptid PhBSW.29-8.
Obrázek 7: Vazba chemicky syntetizovaného mimotopového peptidu protilátky BSW17 k této protilátce. Na svislé ose je poměr emitovaného (530 nm) záření k záření excitačnímu (500 nm) v procentech, na ose vodorovné pak koncentrace protilátky BSW17 v μΜ. Vazebné podmínky jsou uvedeny v rámečku.
Obrázek 8a: Rozpoznávání cyklického mimotopového peptidu protilátky BSW17 GEFCINHRGYWVCGDPA navázaného na KLH pomocí BSS (SDS 236) a peptidu Fce (500-509) navázaného na KLH rovněž pomocí BSS (SDS 237) protilátkou BSW17. Na svislé ose jsou uvedeny odečtené hodnoty OD405, na ose vodorovné koncentrace protilátky BSW17 v pg. Křivka se čtverečky platí pro peptid SDS236, trojúhleníčky s vrchlem nahoru pro peptid SDS237 a konečně křivka s kolečky pro samotný KLH.
Obrázek 8b: Rozpoznávání různých mimotopových konjugátů protilátky BSW17 touto protilátkou. Na vodorovné ose jsou uvedeny odečtené hodnoty OD4Q5.
Obrázek 9a: Specifické rozpoznávání mimotopových konjugátů protilátky BSW17 (BSA (DC)) a konjugátů peptidu Fcs (500-509) s KLH (spojeno pomocí glutaraldehydu) protilátkou BSW17. Na svislé ose jsou uvedeny odečtené hodnoty OD405.
Obrázek 9b: Specifické rozpoznávání konjugátů mimotopových peptidů protilátky BSW17 spojených s KLH pomocí ·· 9999 99 99 99 99 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
9999 9 9 9 9 9 999 9 9 9 9 · 999 9 999 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9999 999 99 99 99 99
-20DC nebo lyzinu protilátkou BSW17. Na svislé ose jsou uvedeny hodnoty OD405. Experimentální hodnoty ve sloupcích označených n.d. nebyly stanoveny.
Obrázek 10a: Imunitní odpověď proti lidským protilátkám IgE vyvolaná v králíkovi po imunizaci konjugáty mimotopových peptidů protilátky BSW17 (1) . Na svislé ose jsou uvedeny hodnoty OD405. R1 až R4 jsou různá pokusná zvířata, ředění séra bylo následující: nej tmavší sloupce 1:50, středně šedé 1:100 a bílé sloupce 1:500.
Obrázek 10b: Imunitní odpověď proti lidským protilátkám IgE vyvolaná v králíkovi po imunizaci konjugáty mimotopových peptidů protilátky BSW17 (2). Na svislé ose jsou uvedeny hodnoty OD405. Na ose vodorovné pak různé použité peptidy.
Obrázek 11: Titr protilátek v séru králíků imunizovaných mimotopovými peptidy protilátky BSW17. Na svislé ose jsou uvedeny hodnoty OD405. Na ose vodorovné pak ředění séra. Křivky s prázdnými čtverečky odpovídají protilátkám ragujícím s KLH, s plnými čtverečky protilátkám reagujícím s mimotopy a křivky s kolečky protilátkám ragujícím s hlgE (JW8). V horní části obrázku byl králík imunizován konjugátem KLH SDS213, v dolní části obrázku
Obrázek 12: Izotypová specifita odpovědi proti lidským IgE u králíků imunizovaných konjugátem mimotopového peptidu protilátky BSW17. Na svislé ose jsou uvedeny hodnoty OD405. R2 a R4 jsou různá pokusná zvířata, která byla imunizována různými peptidy (R2 peptidem SDS214; R4 peptidem SDS213).
Obrázek 13: Kompetitivní vazebný test séra po imunizaci mimotopovým peptidem BSW 17 a protilátky BSW17. Sérum i protilátka se kompetitivně váží na IgE. Na svislé ose jsou uvedeny hodnoty OD405. Světleji šrafovaný sloupec odpovídá ·· ···· ·« 99 ·9 99
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
999 9 9 9 9 9 999
9999 999 9 999 9 9
9 9 9 9 9 9 9
9999 999 99 99 99 99
-21vazbě v nepřítomnosti protilátky BSW17, tmavě šrafovaný sloupec pak s přídavkem 5 pg neznačené protilátky BSW17.
Obrázek 14: Vazba afinitně purifikovaných protilátek proti mimotopovým peptidům BSW17 na lidský IgE.
Obrázek 15: Test anafylaktogenních účinků králičího antiBSW17 mimotopového séra a afinitně purifikovaných anti-BSW17 mimotopových protilátek na lidské krevní buňky (pg/ml sLt).
Uvedené symboly znamenají:
R2/0 a R4/0 jsou preimunní séra králíků R2 a R4;
R2/SDS214 a R4/SDS213 jsou séra králíků R2 a R4 65 dní po primární imunizaci;
anti-SDS213 a anti-SDS214 jsou afinitně purifikované anti BSW17 mimotopové protilátky;
R2/0 PC a R4/0 PC jsou pozitivní kontroly u nichž došlo ke spuštění odpovědi v přítomnosti králičího séra.
Koncentrace vzorků:
A = 0,1 pg anti BSW17 mimotopové protilátky v úplném králičím séru) na 1 ml;
B = 1,0 pg anti BSW17 mimotopové protilátky v úplném králičím séru) na 1 ml;
(nebo ekvivalent (nebo ekvivalent
C = 5, 0 pg anti BSW17 mimotopové v úplném králičím séru) na 1 ml;
protilátky (nebo ekvivalent
Vynález bude blíže popsán v následujících příkladech. Příklady mají možná provedení vynálezu pouze ilustrovat a v žádném případě jej nijak neomezují.
···
-22·« ···« • · ♦ ··· ♦ · ·» ·· ·♦ ·· • · · ·
9 99
9 9 9
9 9
99
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1: Antialergický potenciál moklonální protilátky BSW17 generované proti lidskému hlgE
Jako model pro testování antialergické kapacity protilátky BSW17 a protilátek podobných protilátce BSW17 vyvolaných v lidských pacientech aktivní imunizací mimotopovými peptidy BSW17 byl sledován účinek protilátky BSW17 na uvolňování histaminu buňkami podobnými bazofilům. Bazofilům podobné buňky byly získány z buněčné kultury buněk kostní dřeně s rhIL-3.
Z kostní dřeně z pacientů vyžadujících náhradu hlavice stehenní kosti byly připraveny monocyty pomocí sedimentace v systému Ficoll-Hypaque o hustotě 1.077 g/ml při 400 g. 5xl05 buňek/ml bylo kultivováno v RPMI1640 médiu obsahujícím 15% FCS (fetálního telecího séra) a 2 ng/ml lidského rhIL-3. Po 6 dnech kultivace při teplotě 37°C v atmosféře 5% CO^ byl přidán stejný objem média s obsahem rhIL-3. Dvanáctého dne byly buňky shromážděny a použity pro pasivní senzibilizaci (alergizaci) a pro testy uvolňování histaminu.
Přibližně 5x10^ kultivovaných buněk z kostní dřeně bylo inkubována v HA pufru (20 mM HEPES; pH-7,4; 0,3 mg/ml HSA) s přídavkem 500 ng/ml lidské IgE v přítomnosti nebo nepřítomnosti 50-násobného přebytku moklonální protilátky anti-IgE v celkovém objemu 1 ml. Po 2 hodinové inkubaci při teplotě 37 °C byla v buněčných supernatantech změřena koncentrace histaminu uvolněného v průběhu během pasivní senzibilizace. Pro spuštění uvolňování histaminu byla použita buněčná peleta. Pro určení množství přímo uvolněného histaminu byly buňky pasivně senzibilizované kostní dřeně resuspendovány v 0,3 ml pufru HCM (pufr HA s přídavkem 0,6 M
00
000· 0 0· • ··· ·
♦ 0000 000 · ·
0 0
0 0 0 00
00 • 0 0 < 0 0 00
0 0 1 0 0 <
00
-23CaCl2 a 1 ηιΜ MgCl2> a inkubovány s 0,1 pg/ml anafylaktogenní moklonální anti-IgE protilátky Le27. Množství histaminu v supernatantu a v buněčném sedimentu bylo měřeno pomocí automatického analyzátoru Technicon Autoanalyzer II (Technicon, Tarrytown, New York, USA) . Procento uvolněného histaminu bylo vypočítáno pomocí vzorce: uvolněný histamin (%) = histamin v supernatantu/ (histamin v supernatantu + histamin v buněčné peletě) ★ 100). Procento uvolněného histaminu během pasivní senzibilizace bylo vypočítáno pomocí vzorce : uvolněný histamin (%) = histamin v supernatantu (po pasivní senzibilizaci)/[histamin v supernatantu (po spuštění buněčnou peletou) + histamin v supernatantu (po pasivní senzibilizaci) + histamin v buněčné peletě] * 100). Mmožství histaminu specificky uvolněného pomocí anti-IgE protilátek bylo vypočítáno pomocí vzorce : specificky uvolněný histamin (%) = % celkově uvolněného histaminu - % spontánně uvolněného histaminu.
Výsledky tří nezávislých experimentů jsou shrnuty tabulce I:
• 4 ···· • · · • 4 44
4 4
4
4444 444
-24Tabulka 1: Účinek anti-IgE protilátek na uvolňování histaminu v buňkách senzibilizované kostní dřeně
Specifické uvolnění histaminu (%)**
Experiment 1 Experiment 2 Experiment 3
| Aktivováno pomocí* | A | B | A | B | A | B |
| IgE(kontrola) | 3, 0 | 10, 3 | 4,3 | 11,0 | 1,5 | 36, 5 |
| + BSW 17 | 3, 6 | 3,1 | 3, 0 | 1,5 | 4,4 | 0,9 |
| + Le27 | 11,0 | 2,7 | 8,7 | 1,7 | 15, 7 | 3, 8 |
| *) buňky z | lidské | kostní | dřeně | kultivované | s pří |
ng/ml rhIL-3 jsou pasivně senzibilizovány pomocí 0,5 pg/ml IgE nebo pomocí 0,25 pg/ml IgE a anti-IgE protilátek .
**) A: Histamin uvolněný během senzibilizace
B: Histamin uvolněný po aktivaci 0,1 pg/ml moklonální protilátky anti-IgE Le27.
Data v tabulce 1 jasně ukazují, že buňky kostní dřeně inkubováné s IgE a protilátkou BSW 17 neuvolňují během senzibilizace histamin, ale nejsou aktivovány přídavkem protilátky Le27 . Buňky kostní dřeně inkubováné s IgE a Le27 jsou aktivovány již během pasivní senzibilizace takovou měrou, že větší množství histaminu se neuvolňuje ani během druhé inkubace s touto anafylaktogenní moklonální protilátkou.
Buňky kostní dřeně pasivně senzibilizované v nepřítomnosti jedné z moklonálních anti-IgE protilátek však po aktivaci protilátkou Le27 účinně uvolňují histamin.
• 0 0 0*0 ·
0
0
0
0
-25• · 0 · · 0 0 ♦ ··· 0 0 · 0 • *000 000 • 0 0 0 0 0000 000 00 00
0·
000
0
Lze předpokládat, že a) samotná protilátka BSW 17 není anafylaktogenní a b) protilátka BSW 17 chrání lidské basofily před uvolňováním histaminu indukovaným přídavkem aktivačních látek. Proto tedy, vznik protilátek podobných BSW 17 u alergických pacientů po aktivní imunizaci mimotopovými peptidy k BSW 17 může imunizovanému hostiteli poskytnout ochranu před alergickými reakcemi.
Příklad 2: Prohledávání kombinatorické knihovny peptidů exprimovaných na povrchu fágových částic (phage display library) a výběr pozitivního klonu
Částice bakteriofágů specificky rozpoznávané protilátkou BSW 17 lze identifikovat při prohledání knihoven fágů exprimujících na povrchu lineární nebo cyklické náhodné peptidy sestávající z 6 až 15 aminokyselinových zbytků navázaných na fágové peptidy plil respektive pVIII. Pro ampiifikaci fágové knihovny bylo použito 2 ml tekuté kultury E.coli kmene XL-I blue vypěstované v SB médiu do dosažení hustoty ODgoo=1'0· Bakterie se inkubují s ΙΟ^θ fágovými částicemi po dobu 15 minut za pokojové teploty. Poté se přidá 10 ml SB média obsahujícího 10 mg/ml tetracyklinu a 20 pg/ml karbenicilinu a 10μ1, lpi a Ο,ΐμΐ alikvoty se vysejí na plotny LB obsahující 100 pg/ml karbenicilinu. Kultury se inkubují při teplotě 37 °C za energického protřepávání po dobu jedné hodiny, poté se přidá 100 ml SB média obsahujícího 10 pg/ml tetracyklinu a 50 pg/ml karbenicilinu a inkubace pokračuje další hodinu. Po této hodinové inkubaci se přidá ÍO^-2 cfu (colony forming units) pomocného fága VCS M13. Po 2 hodinách energického třepání při 37 °C se přidá kanamycin tak, aby jeho výsledná koncentrace činila 70 pg/ml a inkubace pokračuje přes noc. Po 20 minutové centrifugaci při 4000 g a 4°C se k supernatantům přidá 38 ml ledového sterilně přefiltrovaného roztoku 12% NaCl a 16% PEG 8000, • 9 9999
9
9 99
9
-269999 999 • 9
9
99 • 9 9 9 • 9 99 • 99 9 9 • · 9 ·· 99 médium se 30 minut chladí na ledu a poté opět 30 minut centrifuguje při 10.000 g a 4°C. Fágová peleta se rozpustí ve 2 ml TBS pufru s obsahem 1,5 % kaseinu a uskladní se při 4°C. Pro testování biologické aktivity se požívají RIA plotny Costar 3690 potažené protilátkou BSW 17 o koncentraci 20 pg/ml v 0,lM uhličitanovém pufru pH 9,6. Potahová protilátka se inkubuje přes noc při teplotě 4°C. Volná vazebná místa se poté zablokují TBS pufrem obsahujícím 1,5 % kaseinu. Do jamek se poté přidá 2 x 10-^-1 pfu fágů a plotny se inkubují 2 hodiny při teplotě 37°C. Po aplikaci fágových částice se desky desetkrát promyjí pufrem PBS s 0,1% Tweenem 20. Jamky se pak ještě vypláchnou vodou a navázané fágové částice se 10 minut eluují přídavkem 200 μΐ 0,1Μ HCI, pH 2,2. Eluovaný fágové částice se neutralizují 2M Tris-bazí a amplifikují se výše popsaným způsobem.
Selekce pozitivního klonu se provádí tak, že se inkubuje 50 μΐ kapalné kultury E.coli XL-I blue napěstovaný v médiu-SB do dosažení OD^qq =1,0 s Ιμΐ 108-krát naředěnými amplifikovánými fágovými částicemi po třetím kole selekce. Inkubace probíhá 15 minut za pokojové teploty, poté se fágy vysejí na plotny LB plotny se 100 pg/ml karbenicilinu a pěstovány přes noc. Náhodně vybrané kolonie se vysejí na plotny LB obsahující 100 pg/ml karbenicilinu. Po 4 hodinách při teplotě 37°C se na plotny přiloží nitrocelulózové filtry navlhčené lOmM IPTG a v inkubaci se pokračuje při teplotě 32°C přes noc.
Poté se filtry odstraní a inkubují se 30 minut při teplotě 37°C v atmosféře CHCI3. Zbytky bakterií se odstraní pomocí 1 hodinové inkubace filtrů v pufru obsahujícím 50mM Tris, pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 3% BSA, 100 U DNAázy I a 40mg lysozymu na 100 ml. Poté se filtry zablokují pufrem TBS obsahujícím 1,5% kasein a inkubují se přes noc s protilátkou BSW 17-POX (protilátka BSW 17 navázaná na
0000 ·· 0« 00 00 000 0000 0000
0000 0 00 0 0 000
000 0 0000 0 0 0 0 0 0 000 0 000
0000 000 00 00 00 00
-27protein POX) v TBS pufru s 5% obsahem kaseinu. Filtry se poté 10 promývají každým z pufrů TBS, TBS s 0,5% Tweenem 20 a opět TBS. Proužky vyříznuté z filtrů se barví inkubací v roztoku obsahujícím 600 pg 4-chloro-l-naftolu na 1 ml a 0,042 % peroxidu vodíku v TBS.
Příklad 3: Charakterizace fágových částic exprimujících peptid napodobující přirozený epitop protilátky BSW17 (mimotopový peptid protilátky BSW17)
Různé fágové částice nesoucí na povrchu cirkulární peptid sestávající ze sedmi, osmi nebo devíti amino kyselin a lineární peptidy sestávající z deseti a patnácti aminokyselinových zbytků byly identifikovány díky schopnosti vázat se na protilátku BSW 17. Byla zjištěna nukleotidová sekvence DNA kódující tyto peptidy. Na základě jejich vzájemné homologie jakož i homologie s odpovídajícími oblastmi Fcs, mohou být z DNA sekvencí rozlišeny 3 skupiny fágů vystavujících peptidy rozeznávané protilátkou BSW 17. Jejich přehled viz tabulka 2.
Druhý peptid ve skupině A níže (Sekvence id.č. 19) je peptid (A) se dvěma dodatečnými Cys pro cirkularizaci. Další tři peptidy (Sekvence id.č.18, 20 a 21) jsou další peptidy připravené podobným způsobem.
• 4 4444 • 9
• 4 • · 44 *4 44 • 9 4 4 • · β 4
-28Tabulka 2; Peptidové sekvence vystavené na povrchu fágů s mimotopovým peptidem protilátky BSW17
Skupina A:
| Cys | + Arg | + Arg | + His | P Asn | P Tyr | P Gly | o Phe | o Trp | o Val | Cys | n=7 | ++ |
| Cys | 0 Ile | P Asn | + His | + Arg | P Gly | P Tyr | 0 Trp | 0 Val | Cys | n=3 | +++ | |
| Cys | P Thr | + Arg | o Leu | + His | P Thr | P Gly | P Tyr | 0 Trp | o Val | Cys | n=2 | + |
| Cys | P Thr | o Leu | P Ser | o Val | 0 Phe | P Gly | P Tyr | 0 Trp | o Val | Cys | n=l | + /- |
+ =pozitivně nabitý p -nenabitý polární o =nepolární a =počet klonů, které mají odpovídající sekvence + (++),+/~ ^intenzita rozpoznání pomocí protilátky BSW17 (t.j. Sekvence id.č. 18,19,20, respektive 21)
Skupina B:
| Val | Asn | Leu | Pro | Trp | Ser | Phe | Gly | Leu | Glu |
| Val | Asn | Arg | Pro | Trp | Ser | Phe | Gly | Leu | Glu |
| Val | Lys | Leu | Pro | Trp | Arg | Phe | Tyr | Gin | Val |
Tyto tři peptidy ze skupiny B jsou peptid (G) (Sekvence id.č. 7), peptid (H) (Sekvence id.č. 8) a peptid (I) (Sekvence id.č. 9).
·· ···· 99 99 99 99
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
999 9 9 9 9 9 9 99
9 9 9 9 999 9 999 · · • · · · · ···
9999 999 99 99 99 99
-29Skupina C:
| Leu | Thr | Leu | Ser | His | Pro | His | Trp | Val | Leu | Asn | His | Phe | Val | Ser |
| Val | Trp | Thr | Ala | Cys | Gly | Tyr | Gly | Arg | Met | |||||
| Cys | Ser | Met | Gly | Pro | Asp | Gin | Thr | Leu | Arg | Cys | ||||
| Cys | Leu | Leu | Asp | Ser | Arg | Tyr | Trp | Cys | ||||||
| Cys | Gin | Pro | Ala | His | Ser | Leu | Gly | Cys | ||||||
| Cys | Leu | Trp | Gly | Met | Gin | Gly | Arg | Cys | ||||||
| Cys | Gly | Thr | Val | Ser | Thr | Leu | Ser | Cys |
Uvedené peptidy ze skupiny C jsou peptid (0) (Sekvence id.č. 15), peptid (J) (Sekvence id.č. 10) a peptid (P) se dvěma dodatečnými cysteiny (Cys) (Sekvence id.č. 22), peptid (L) se dvěma dodatečnými cysteiny (Sekvence id.č. 23), peptid (M) se dvěma dodatečnými cysteiny (Sekvence id.č. 24), peptid (N) se dvěma dodatečnými cysteiny (Sekvence id.č. 25) a konečně peptid (K) se dvěma dodatečnými Cys (Sekvence id.č. 26). Peptidy skupiny C se dvěma koncovými cysteiny jsou vysoce afinní k protilátce BSW17. Celá skupina C nevykazuje sekvenční homologii s Fcs; jde tedy o pravé mimotopy, které pouze napodobují prostorovou strukturu povrchu původního epitopu protilátky BSW17.
Jak vyplývá z Tabulky 2, C-koncové části peptid ze skupiny A jsou vysoce konzervované a N-koncové části, přestože jsou poněkud více degenerované, obsahují společné pozitivní-nabité polární aminokyselinové zbytky. Toto rozdělení náboje se zdá být podstatné pro rozpoznání protilátky BSW 17, protože jeden klon, který postrádá v Nkoncové části pozitivně nabité aminokyselinové zbytky • ft ···· · · ·* ·· · · • ftft · ftft · · · · · •ftftft · ·· · · ··· • ··· ft···· ···· · • ftftft · ftftft • ftftft ftftft ftft ·» ·· ··
-30vykazuje pouze velmi slabou vazbu na protilátku BSW 17. V oblasti Fcs nebyl nalezen žádný souvislý úsek aminokyselin s významnou sekvenční homologii. Srovnání sekvencí na základě podobných vzorů však dovoluje přirovnání těchto peptidů k úseku aminokyselin 500 až 508 v oblasti Cs4 domény. Stanworth a další (Lancet 336 (1990) strana 1279) určili, že dekapeptid Fcs 500 až 509 hraje roli v aktivaci žírných buněk (mastocytů) pomocí na receptor navázané IgE.
Peptidy ze skupiny B jsou rovněž navzájem vysoce homologické. Jejich další vlastností je, že jejich N-koncová část je téměř identická s aminokyselinovými zbytky v pozicích 370 až 375 Fcs. Tato sekvence je částí Cs3 a obsahuje oblast, která prokazatelně hraje roli ve vazbě IgE na příslušný vysoce afinní receptor, a nebo je v těsné blízkosti této oblasti. To také vysvětluje inhibici interakce IgE/IgERI způsobenou protilátkou BSW 17.
Na základě uvedených údajů lze předpokládat, že komplexní konformační epitop rozpoznávaný protilátkou BSW 17 obsahuje konformační struktury sestávající z úseků aminokyselinových zbytků 500 až 508 (v oblasti Cs4) a 370 až 375 (v oblasti Cs3) molekuly IgE. Uvedené číslování je podle publikace E.A. Padlana a D.R. Daviese , Molecul. Immunol. 23 (1986), strana 1063. Protilátky, které se vytvoří v jedinci po imunizaci mimotopy skupin A a B navázanými na vhodnou imunogenní nosnou molekula tak mohou chránit před alergickými reakcemi. Mechanismus ochrany spočívá v tom, že dojde k zablokování vazby IgE k příslušnému vysoce afinnímu receptoru a/nebo spuštění degranulace cílové buňky.
Peptidy zahrnuté ve skupině C tabulky 2 nevykazují žádnou významnou vzájemnou homologii, rovněž tak nevykazují homologii s Fcs. Tyto peptidy tedy reprezentují pravé mimotopy napodobující trojrozměrnou strukturu rozpoznávanou monoklonální protilátkou BSW 17. Použití těchto mimotopů • · · · · · · ···· • ··· · · · · · · ·· « · · · · ··· · ···· · .:.....· ·..· ..·
-31jako imunogenů rovněž povede v imunizovaném hostiteli ke vzniku antialergických protilátek podobných BSW 17.
Vznik imunnitní odpovědi podobné BSW 17, specificky namířený proti cílovému epitopu protilátky BSW 17 na lidské IgE byl dokázán pro vybrané mimotopy a je znázorněn v následujících příkladech 4 až 6.
Příklad 4: Bakteriofágy vystavující na povrchu mimotopové peptidy BSW 17 jsou specificky rozpoznávány protilátkou BSW 17
Vazba mimotopových peptidů exprimovaných a vystavených na fágových částicích (skupina A z tabulky 2: první klon odpovídá klonu 1 na obrázku 5, t.j. peptidu Cys-Arg-Arg-HisAsn-Tyr-Gly-Phe-Trp-Val-Cys podle Sekvence id.č.: 18; druhý klon odpovídá klonu 18 na obrázku 5 t.j. peptidu Cys-IleAsn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val-Cys podle Sekvence id.č.: 19) na antigen-specifické hypervariabilní oblasti protilátky BSW 17 byla prokázána pomocí ELISA testu. 10pg moklonální protilátky BSW 17 (nebo obdobné protilátky) se potáhnou jamky na mikrotitrační destičce COSTAR podle následujícího standardního ELISA postupu. Po zablokování pomocí BSA se jamky inkubují se 100 μΐ standardního inkubačního ELISA pufru s obsahem částic bakteriofága ze supernatantů infikovaných bakteriálních kultur. Titr použitých bakteriofágů činil 109 cfu/ml. Po promytí se plotny inkubují s 5 pg antiséra anti-M13 navázaného na křenovou peroxidázy (HRP) -(Pharmacia, Uppsala, Švédsko) v inkubačním pufru. Všechny popsané inkubace se provádějí za pokojové teploty po dobu 1 hodiny. Po konečném promytí se fágové částice navázané na potahovou protilátku stanoví pomocí konjugátu anti-M 13/HRP a chromogenního substrátu za standardních podmínek. Na obrázku 5 je znázorněna vysoká specifita • · • · • · ··
-32mimotopových fágů (fágů exprimujících mimotopový peptid) při vazbě protilátky BSW 17. Tyto tágy se vážou pouze na protilátku BSW17 a nikoli na ostatní použité moklonální anti-CE3 protilátky jako jsou 8E7, 3G9 a 5H10. Tyto protilátky byly vytvořeny za použití rekombinantního Ce3 jakožto imunogenu. Tyto peptidy rovněž nereagují na protilátku 5H5/F8, což je další moklonální protilátka namířená proti extracelulární části lidského FcsRIa řetězce. Jako negativní kontrola byl použit rekombinantní FcsRI ařetězec a jako pozitivní kontrola posloužily jamky potažené polyklonálním anti-M 13 antisérem.
Příklad 5: Bakteriofágy exprimující mimotopové peptidy protilátky BSW17 kompetitivně inhibuji vazbu protilátky BSW17 na IgE
Specifita interakcí mimotop - protilátka BSW 17 je dále doložena tím, že navázání mimotop exprimujícího fága interferuje s vazbou protilátky BSW 17 na IgE. Bakteriální buňky se nechají narůst na SB obsahujícím 10 pg/ml tetracyklinu a 50 pg/ml karbenicilinu do dosažení ODggo “ 0,4, poté se přidá pomocný fág VCS M13 a další 2 hodiny se pokračuje v inkubaci při teplotě 37°C. Poté se dodá kanamycin tak, aby jeho výsledná koncentrace činila 70 pg/ml a buňky se inkubují přes noc. Fágové částice se vysrážejí polyethylenglykolem. Měkké RIA plotny se potáhnou 20 pg/ml protilátky BSW 17 v 0, 1M uhličitanovém pufru pH 9,6 a poté se blokují TBS s obsahem 1,5% kaseinu. Lidská IgE značená metodou chloramin-T se použije v aktivitě 100000 cpm na jamku pro vázání na protilátku BSW17, kterou byly potaženy desky RIA v přítomnosti zvyšujících se koncentrací neznačené
IgE (vzniká tak kalibrační křivka) nebo v přítomnosti zvyšujících se koncentrací fágových částic. Všechny pokusy byly prováděny za pokojové teploty. Desky se 3-krát promyjí • · · · · · · · · · · • ··· · · · · · · ·· • · · · · ··· · ···· · • ··· · ··· ···· ··· ·· ·· ·· ··
-330,9% NaCl + 0,05% Tweenem 20, nařezají na kusy, které se jednotlivě změří na γ-počítači (1 minutu).
Fágy exprimující mimotopy (PhBSW.6-9 na obrázku 6, t.j. klon 1 z obrázku 5 = CRRHNYGFWVC = Sekvence id.č.:18; PhBSW.29-8 na obrázku 6 = klon 18 z obrázku 5 = CINHRGYWVC = Sekvence id.č.:19)(viz Příklad 4) inhibují vazbu protilátky BSW 17 na IgE. Obrázek 6 ukazuje vazbu l25i-značené jgE na protilátku BSW 17 v přítomnosti BSW 17 mimotop exprimujícího fágového klonu. Plné kružnice znázorňují standardní inhibiční křivku neznačené IgE, která umožňuje odhad inhibice vazby značené IgE v přítomnosti 1011 cfu/ml fágových částic.
Inhibice dosažená fágovými klony je srovnatelná s neznačenými IgE o koncentraci 1 pg/ml respektive 1,7 pg/ml.
Příklad 6: Indukce epitopově specifické imunnitní reakce imunizací králíků mimotop-exprimujícími klony f ágů
Pro otestování praktické použitelnosti vakcín založených na mimotopech protilátky BSW 17 byli králíci imunizováni fágovými částicemi exprimujícími na svém povrchu mimotopové peptidy protilátky BSW 17. V kontrolním experimentu byli králíci imunizování stejným způsobem pomocným fágem VCS M13. 1012 cfu čerstvě připravených fágových částic bylo dialyzováno proti PBS při teplotě 4°C. Pro první imunizaci byly virové částice emulgovány v lml úplného Freundova adjuvans, nebo v 1 ml neúplného Freundova adjuvans pro upomínací dávky. Podkožní imunizace byla opakována každých 14 dní. Po třetí upomínací dávce bylo odebráno 12 ml krve. Krev byla 4 hodiny nechána srážet se za pokojové teploty ve skleněných ampulích a poté byla 10 minut centrifugována na 2000 g. Supematanty byly testovány na • · » 4 4 4 4 4 4 44 44 • 4 4 4 4 4 ··· ···· 4 44 4 4 ··( ► ··· 4 4··4 4444 • 4 4 4 4 4 »4444 4 4 ·· 4 4 4«
-34přítomnost protilátek proti lidským IgE pomocí ELISA testu. Lidský IgE protilátky odebrané ze tří různých jedinců (SUS 11-IgE; PS-IgE; WT-IgE) byly naředěny v PBS pufru na koncentrace 50 pg/ml a Ιμΐ alikvoty byly poté nakapány na nitrocelulózu. Nitrocelulózová membrána se poté 1 hodinu blokuje pomocí TBS obsahujícího 1,5 % kasein. Králičí sérum bylo poté naředěno 1:200 v TBS pufru obsahujícím 1,5% kasein a inkubováno přes noc. Promývání bylo prováděno 10 minut v každém z následujících pufrů: TBS, TBS + 0,05% Tween 20 a TBS. Konjugát kozí anti-králičí protilátky s HRP byl naředěn 1:1.000 v TBS obsahujícím 1,5% kasein a inkubován s membránou 4 hodiny. Promytí a barvení bylo provedené popsaným způsobem. Jak vyplývá z tabulky 3, kontrolní králíci imunizovaní pomocným fágem VCS M13, jakož i neimunizovaní králíci vykazují slabou reakci proti lidské IgE protilátce ve svém séru. To je pravděpodobně způsobeno přirozeně se vyskytujívcími se autoprotilátkami proti králičím IgE, které jsou schopy křížové reakce s lidskými IgE. Avšak sérum králíků imunizovaných BSW17 mimotopovými fágy kromě masívní imunitní odpovědi na obalový protein bakteriofága pVIII obsahují rovněž silně zvýšenou hladinu protilátek specificky rozpoznávajících lidské IgE protilátky:
Rozpoznání IgE (Relativní OD)
| Králičí sérum | SUS 11-IgE | PS-IgE | WT-IgE | |
| Neimunizovaní | 2.0 ± 0.3 | 2.0 ± | 0.2 | 2.0 ± 1.0 |
| pomocný fág VCS Ml3 | 2.0 ± 0.6 | 2.0 ± | 1.0 | 3.0 ± 0.5 |
| PhBSW.6-9(=klon 1) | 5.0 ± 0.2 | 8.0 ± | 0.6 | 21.0 ± 1.0 |
| PhBSW.29-8(= klon 18) | 16.5 ± 0.7 | 9.0 + | 0.4 | 25.0 ± 1.0 |
• ·
| • · · · · · • · · • · ftft • · • · | ftft · · ftft ·· • ftftft · · · · • ft· · · ftftft • · · ftftft · ftftftft · • · · ftftft • ft ftft ft* ·· | |
| -35- | ||
| BSW 17 | epitopovou specifitu tohoto | antiséra lze |
| demonstrovat | pomocí kompetitivního ELISA | testu: proužky |
nitrocelulózové membrány byly připraveny výše popsaným způsobem a přes noc inkubovány s králičím sérem v ředění 1:50 v pufru TBS obsahujícím 1,5 % kaseinu. Po promytí byla na 4 hodiny přidána monoklonální protilátka BSW 17 značená křenovou peroxidázou (BSW 17-HRP) v ředění 1:50000 v pufru TBS obsahujícím 1,5% kasein. Poté byly NC membrány promyty a barveny výše popsaným způsobem. Jak vyplývá z tabulky 4, vazba BSW 17-HRP na IgE preparáty z různých zdrojů je inhibována šerem z králíků imunizovaných BSW 17 mimotopovými fágy, zatímco sérum z králíků imunizovaných pomocnými fágy nevykazuje žádný inhibiční účinek:
Tabulka 4: Inhibice interakce mezi fágem B5W17 a IgE pomocí séra z králíků imunizovaných mimotop fágem B5W17
Schopnost rozpoznání různých IgE (v % inhibice)
| SUS 11-IgE | WT-IgE | PS-IgE | ||
| pomocný fág VCS M13 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| PhBSW.6-9 | 34 | 65 | 63 | 51 |
| PhBSW.29-8 | 52 | 65 | 48 | 47 |
V následujících příkladech 7 a 8 je popsáno vhodné použití chemicky syntetizovaných mimotopových peptidů spojených s nosičovým proteinem jako imunogenů na přípravu anti-alergické vakcíny.
• · · 0 • · · · ·· 0 0 • · · · · ·· · ···· · · · 0 ♦ · 0 0 • · · · « ··· · ··· · · • · · · 0 0 0
Příklad 7: Chemicky syntetizovaný mimotopový peptid BSW17 se váže k B5W17 s vysokou afinitou
Bylo nutné potvrdit, že oblast mimotopového fága (t.j. fága nesoucího mimotopový peptid) BSW17 odvozená od bakteriofága může být vynechána, aniž by došlo k poškození biologické aktivity sekvence mimotopého peptidu. Z tohoto důvodu byl syntetizován následující peptid, který obsahuje cyklický mimotopový oktapeptid BSW17 [jehož lineární formu ukazuje tabulka 2, skupina A, druhý klon ve formě peptidu (A) s dvěma dodatečnými Cys (Sekvence id.č.19) obsahující zde 7 přilehlých, od bakteriofága odvozených, dodatečných aminokyselinových zbytků Gly-Glu-Phe- a -Gly-Asp-Pro-Ala. Jsou to hraniční sekvence, které usnadňují správné skládání cirkulárního mimotopého peptidu:
Gly-Glu-Phe-Cys-Ile-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val-Cys-Gly-AspPro-Ala (Sekvence id.č.27)
Po syntéze, která byla provedena standardní technikou, byl uvedený peptid cirkularizován pomocí dvou cysteinů a fluorescenčně označen barvivém rodolovou zelení. Z intenzity fluorescence pak byla určena míra vazby ke zvyšujícím se koncentracím protilátky BSW17. Protilátka BSW17 byla imobilizována v jamkách mikrotitrační destičky za podmínek ELISA testu, což je znázorněno na obrázku 7.
Příklad 8: Chemicky syntetizované mimotopové peptidy protilátky BSW17 připojené k nosičovému proteinu jsou specificky rozpoznány pomocí protilátky BSW17
Chemicky byly nasyntetizovány různé mimotopové peptidy a poté byly navázány na imunogenní nosičové proteiny. Poměr • 0
-37·· 0· * ·0 ·
0 0
0 0 <
0 4 ♦ 0 ·· hmotností peptidu a nosičového proteinu při konjugačních reakcích byl 1:1. Reakce byly prováděny standardními způsoby (Shan S. Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking, CRC Press [1993]). Různé způsoby přípravy konjugátů zahrnuj í:
- konjugace pomocí glutaraldehydu
- konjugace pomocí DC (dihexylkarbodiimidu)
- konjugace pomocí BSS [bis(sulfosukcinimidyl) suberátu]
- konjugace prostřednictvím lyzinu
Výsledné mimotopové konjugáty jsou následující:
(1) Pl= lineární KTKGSGFFVF - BSA (glutaraldehyd) (2) P4 = lineární AcINHRGYWVC - BSA (DC) (3) PS = lineární AcRSRSGGYWLWC - BSA (DC) (4) SAF1-KLH = cyklický GEFCINHRGYWVCGDPA - KLH (DC) (5) SAF2-KLH = lineární KTKGSGFFVF - KLH (DC) (6) SAF3-KLH = lineární VNLPWSFGLE - KLH (DC) (7) SAF3-Lys = lineární VNLPWSFGLE - spojení pomocí lyzinu (8) SAF4-KLH = lineární VNLTWSRASG - KLH (DC) (9) SAFS-KLH = VNLTWS - KLH (DC) (10) SDS214 = cyklický GEFCRRHNYGFWVCGDPA - KLH (BSS) (11) SDS213, SDS227, SDS236, SDS2S2 = cyklický GEFCINHRGYWVCGDPA - KLH (BSS) (12) SDS237, SD5253 = lineární KTKGSGFFVF - KLH (BSS)
·· · ·· · • · • · ·· ·« ·· • · · · · • · · · · • · 9 9 9 9
9·· · ··
-38(13) SDS242, SDS2S4 = lineární VNLPWSFGLE - KLH (BSS) a (14) SDS243 = lineární VNLTWSRASG - KLH (BSS), přičemž konjugáty (1), (5) a (12) jsou referenční imunogenové molekuly t.j. známé ze stavu techniky připravené konjugací pomocí glutaraldehydu (1), DC (5) a BSS (12); tedy:
(1), t.j. P 1, je oblast lidského IgE zahrnující aminokyseliny 500-509, Sekvence id.č. 28, viz The Lancet [ 1990] supra, připojený k BSA pomocí glutaraldehydu (5), t.j. SAF2-KLH, je tentýž peptid, Sekvence id.č. 28, připojený ke KLH pomocí DC a (12), t.j. 5DS237 a SDS2S3, je tentýž peptid, Sekvence id.č. 28, připojený ke KLH pomocí BSS.
Ostatní peptidy jsou imunogeny podle vynálezu, jmenovitě:
(2) (P4) je N-acetylovaný peptid (A) (Sekvence id.č.l) s dodatečným Cys na C-konci (Sekvence id.č. 29), navázaný na BSA konjugací pomocí DC;
- (3) (PS) je N-acetylovaný peptid (C) (Sekvence id.č. 3) s dodatečným Cys na C-konci (Sekvence id.č. 30), navázaný na BSA konjugací pomocí DC;
(4) (SAF1-KI.H) je peptid z příkladu 7 (Sekvence id.č. 31), cirkularizovaný přes disulfidický můstek tvořený dvěmi hraničními Cys a navázaný na KLH konjugací pomocí DC;
(6) (SAF3-KLH) je peptid (G) (Sekvence id.č.7), navázaný na KLH konjugací pomocí DC;
• · · · · * • · • · ··
-39·« ·· ·· 99
9 9 9 9 9 9 «
9 9 9 9 9 99 ··· · 99 9 9 999 9 4 • · 9 9 9 9«
I ·· 99 99 99
| — | (7) | (SAF3-Lys) je peptid ( | :g) | (Sekvence | id.č.7), |
| navázaný | na | KLH pomocí lyzinu | |||
| - | (8) | (SAF4-KLH) je peptid ( | :d) | (Sekvence | id.č.4), |
| navázaný | na | KLH konjugací pomocí DC; | |||
| - | (9) | (SAF5-KLH) je peptid (Q) | (Sekvence | id.č.17), | |
| navázaný | na | KLH konjugací pomocí DC; | |||
| - ( | :io) | (SDS214) je první peptid | ze | skupiny A | v tabulce |
2, se 7 přilehlými aminokyselinovými zbytky odvozenými od bakteriofága, stejnými jaké obsahuje peptid v přikladu 7 (Sekvence id.č.32); tento peptid byl cirkularizován a připojen ke KLH konjugací pomocí BSS;
- (11) (SDS213, SDS227, SDS236, SDS252) je tentýž peptid jako (4) (Sekvence id.č.31), tento peptid byl cirkularizován a navázán na KLH konjugaci pomocí BSS;
- (13) (SDS242, SDS254) je peptid (G) (Sekvence id.č.
7), navázaný na KLH konjugací pomocí BSS; a konečně (14) (SDS243) je peptid (D) (Sekvence id.č. 4), navázaný na KLH konjugací pomocí BSS.
Obrázek 8a ukazuje, že, jak konjugát cyklického mimotopu protilátky BSW17 s KLH (BSS) (11), t.j. SDS236, tak od Fce odvozený originální epitopový motiv(12),
t.j.SDS237, t.j peptidu ke KLH
Fce (500-509) připojený ve formě lineárního (BSS), jsou rozpoznávány pomocí protilátky
BSW17 na dávce závislým způsobem, zatímco samotný KLH se neváže. Jamky mikrotitračních destiček byly potaženy 1 pg buď SDS236 či SDS237, nebo samotným KLH a inkubovány s protilátkou BSW17 o zvyšující se koncentraci. Navázaná protilátka byla detekována pomocí konjugátu kozí anti-myší protilátky s křenovou peroxidázou (gamlgG-HRP). Údaje zde uvedené jsou průměry z duplikátů, kde je odečteno pozadí
4 4
4 44 •4 4444
4 4 4 44
44 ► 4 4 4
44
4 4 4
-40reprezentující vazbu protilátky na nepotažené jamky blokované pomocí BSA.
Obrázek 8b shrnuje výsledky ELISA testu získané za použití různých BSW17 mimotopových konjugátů připojených k nosičovému proteinu různými chemickými postupy. Jamky mikrotitračních destiček byly potaženy 5pg každého z uvedených mimotopových konjugátů či volného KLH a inkubovány s 10pg protilátky BSW17. Navázaná protilátka byla detekována pomocí konjugátu gamlgG-HRP. Uvedená čísla jsou průměry duplikátů, od kterých bylo odečteno pozadí reprezentující vazbu na nepotažené jamky (blokované BSA) . Každý z BSW17 mimotopových konjugátů byl, na rozdíl od volného KLH, rozpoznán protilátkou BSW17. Během opakovaných experimentů, které byly prováděny v průběhu několika týdnů, se však zjistilo, že KLH konjugáty spojované pomocí DC jsou méně stabilní a čím dál tím více ztrácí svoji vazebnou schopnost k protilátce BSW17. Naproti tomu se ukázalo, že BSW17 mimotopové konjugáty spojované pomocí BSS jsou stabilní dokonce i ve 4°C.
Obrázky 9a a 9b ukazují, že mimotopy protilátky BSW17 připojené ke KLH či BSA jsou specificky rozpoznány protilátkou BSW17, ne však nepříbuznou monoklonální protilátkou 3G9 (protilátka proti lidskému Cs3) a 5H5/F8 (protilátka proti lidskému Rlalfa). Jamky mikrotitračních destiček byly opět potaženy 5pg každého z uvedených mimotopových konjugátů a inkubovány s 10pg odpovídající monoklonální protilátky. Navázaná protilátka byla detekována pomocí konjugátu gam-IgG-HRP. Uvedená čísla jsou průměry duplikátů, od kterých bylo odečteno pozadí reprezentující vazbu na nepotažené jamky blokované BSA.
.· ···« ·· ·· ·· ·· . . · ···♦ ·· · · •··· · ·· » · ♦ ♦♦ • · 9 · · · · · · »· * · * • 9 9 9 9 9 9 9
9999 999 99 ♦ · ·· ·*
-41Příklad 9: Po imunizaci králíků pomocí BSW17 mimotopových konjugátů in vivo dochází k vytváření protilátek proti lidskému IgE
Tiby bylo možné potvrdit specifitu imunogenicity BSW17 mimotopových konjugátů, byli králíci imunizováni sadou preparátů skládajících se z mimotopového peptidu a nosiče, jak je to zde v hrubých rysech ukázáno:
| Králík č. | Imunogen | Typ konjugátu |
| R1 | (10) 5DS214 | |
| R2 | (10) 5DS214 | Cs4 mimotopy |
| R3 | (11) SD5213 | |
| R4 | (11) SDS213 | |
| 1 | KLH (Pierce) | |
| 2 | KLH-BSS linker | KLH kontrola |
| 4 | (12) SDS237 | |
| 11 | (12) SDS237 | |
| 7 | (6) SAF3-KLH | |
| 13 | (7) SAF3-Lys | |
| 14 | (13) SD5242 | Ce3 mimotop |
| 16 | (13) SDS242 | |
| 17 | (13) SDS2S4 | |
| 1 8 | (7) SAF3-Lys | |
| 5 | (8) SAF4-KLH | Ce3(370-379) |
| 8 | (8) SAF4-KLH | |
| 19 | (14) SDS243 | |
| 20 | (14) SDS243 | |
| 12 | (4) SAF1-KLH | |
| 15 | (4) SAFl-KLH | Cs4 mimotop |
·· ···· • · • ··· ·· *· ·· ·· • · · · · ·· · • · · · 9 9 99
9999 999 · 999 9 9
9 9 9 9 9 9 9
999 999 *· ·· ·· ··
Králíci byli imunizováni podkožní injekcí 200pg odpovídajícího přípravku konjugátu rozpuštěného ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku (PBS) v celkovém objemu 500 μΐ. Pro první imunizaci byly vzorky smíchány 1:1 s kompletním Freundovým adjuvans (králíci Rl až R4) či s TiterMax (Sigma; králíci 1 až 20) . Před začátkem imunizace bylo králíkům odebráno 5ml vzorků krve. Posilovači dávka byla podána ve dnech 21 a 28 po první injekci za použití nekompletního Freundova adjuvans. Ve dnech 28 a 49 byly odebrány vzorky krve. Ze všech vzorků bylo připraveno sérum.
Imunitní odpověď proti lidské IgE vyvolaná v imunizovaných králících byla monitorována pomocí ELISA testu. Jamky mikrotitračních destiček byly potaženy 5pg lidského IgE (SUS-11; JW8) a ínkubovány se ΙΟΟμΙ séra z připravených vzorků, jenž byly rozpuštěny v inkubačním pufru ELISA v poměru 1:50. Králičí protilátky navázané na imobilizovaný lidský IgE byly detekovány pomocí konjugátu kozí anti králičí protilátky s HRP (garlgG-HRP). Naměřené hodnoty optické denzity (OD450) byly upraveny podle výsledků získaných se sérem ze stejných králíků před imunizací, které bylo naředěné v poměru 1:50 v ELISA pufru. Údaje na obrázcích 10a a 10b jsou průměry ze dvou měření. Obrázky 10a a 10b jasně ukazují, že v králících, kteří byli imunizováni různými BSW17 mimotopovými konjugáty, došlo k indukci protilátek namířených proti lidskému IgE.
Titry nově vytvořených protilátek v séru s ohledem na KLH nosič, peptid použitý jako imunogen, respektive lidský IgE, byly též určovány ELISA testem. Sérum bylo použito v postupných ředěních pro inkubaci s imobilizovaným KLH, konjugátem mimotopového peptidu s BSA, respektive s IgE. Dva příklady takového určení titru séra jsou uvedeny na obrázku 11, pro peptid (11), t.j. SDS 213, resp. pro peptid (10), t.j. SDS 214.
-43Výše uvedené příklady ukazují možnost aplikace BSW17 mimotopových konjugátů jako imunogenů pro indukci imunitní odpovědi namířené proti lidské IgE.
Příklad 10: Imunitní odpověď proti lidské IgE indukovaná v králících imunizovaných pomocí konjugátů mimotopových peptidů protilátky BSW17 je izotypově specifická a kompetuje o vazbu na IgE s protilátkou BSW17
Pomocí ELISA testu byla sledována izotypová specifita imunitní odpovědi proti lidské IgE indukovaná v imunizovaných králících. Jamky na mikrotitrační destičce byly potaženy 3 pg lidské IgE (SUS-11), IgA, IgG a IgM. Potažené jamky byly inkubovány se 100 μΐ vzorků ze séra. Sérové vzorky se ředily v poměru 1:50 ELISA pufrem. Králičí protilátky, které se navázaly na lidskou protilátku byly stanoveny pomocí konjugátu kozích anti-králičích protilátek s křenovou peroxidázou. Naměřené hodnoty OD4 05 byly opraveny o hodnotu pozadí, které bylo stanoveno použitím preimunního séra odpovídajícího králíka. Data uvedená na obrázku 12 reprezentují střední hodnoty z duplikátních měření. Je zřejmé, že imunitní odpověď vyvolaná v králících imunizací pomocí konjugátů mimotopových peptidů protilátky BSW17 je specifická pro IgE, i když dochází k částečnému rozpoznání lidské IgM v séru králíka, který byl imunizován peptidem 10, to jest SDS214.
Z kompetitivní ELISY je zřejmé, že sérum králíka imunizovaného peptidem SDS214 je schopno částečně kompetovat s protilátkou BSW 17 při vazbě na IgE. Jamky v mikrotitračních destičkách byly potaženy lpg lidské IgE (SUS-11) a inkubovány buď s 5pg protilátky BSW 17 nebo s inkubačním pufrem bez protilátky BSW 17. Po promytí se pro druhou inkubaci přidá 100μ1 anti-SDS2L3 antiséra zředěného
·· ···· • · • ···
-441:50 inkubačním pufrem pro ELISu. Králičí protilátky navázané zmobilizované neošetřené lidské IgE a IgE preinkubované s protilátkou BSW 117 se stanoví inkubací s konjugátem kozí anti-králičí protilátky s křenovou peroxidázou. Data na obrázku 13 reprezentují střední hodnoty z duplikovaných měření.
Příklad 11: Králičí anti-hlgE protilátky vzniklé po imunizaci pomocí BSW17 mimotopových konjugátů lze purifikovat afinitní chromatografií za použití mimotopových peptidu navázaných na Sepharosu
Tento příklad ukazuje, že anti-hlgE odpověď v králíkovi indukovaná imunizací BSW17 mimotopovým konjugátem je identická se specifickou odpovědí proti mimotopovému peptidu.
Imunoafinitní purifikace králičí polyklonální protilátky proti BSW 17 mimotopovým peptidům:
a) srážení síranem amonným:
Ke 22 ml králičího antiséra obsahujícího 60 mg/ml celkového proteinu (podle Bradfordova testu, použito BSA-standardu, BIO-RAD) se přidá 5,5 g suchého AMS (síranu amonného, vzniká 25% w/v roztok) , směs se poté míchá po dobu 3 hodin a inkubuje přes noc za pokojové teploty. Precipitát se odstraní 45 minutovou centrifugací při 18000 rpm (Sorvall) a poté se promyje 25ml 25% vodného roztoku (w/v) síranu amonného. Promyté precipitáty se zcentrifugují za stejných podmínek, rozpustí se v 10 ml PBS s 0,05% NaN3, pH 7,2, a přes noc se dialyzují proti 5 1 stejného pufru při teplotě + 4°C.
4444 «4 44 44 • 4 4*44 4444
444 4 44 4 4 444
4 4 4 4 444 4 444 4 4
b) imunoafinitní chromatografie:
Dialyzovaný roztok byl přefiltrován přes filtr Millex-GV 0,2 pm (Millipore) a nanesen na kolonu Pharmacia XKL6/30 vyplněnou lOml CH-Sepharosy 4B s kovalentně navázanými 5 mg BSW 17 mimotopového peptidu SDS227. Průtoková rychlost byla nastavena na 1 ml/min. Jako eluční pufr byl použit PBS, +0,05% NaN3· Po nanesení a eluci nenavázané proteinové frakce, byla specificky navázaná protilátka eluována pufrem O,1M glycin/HCl, pH 2,8. Eluát (frakce 12 až 20 v 9 ml elučního pufru) byl odebírán a okamžitě za stálého míchání neutralizován na pH 7,4 pomocí 3,3M Tris/HAc, 0,8% NaN3 pH
8,0 (50 pl/ml) a konečně přes noc dialyzován proti 3 1 pufru PBS, 0,05% NaN3, pH 7,2 při teplotě. Celkový protein činil asi 1 mg/ml podle Bradfordova testu, (použit standard BIgG (BIO-RAD). Znamená to , že výtěžnost z celkového použitého proteinu činila asi 0,7 %.
Afinitně purifikované IgG frakce byly testovýny na schopnost vázat lidské IgE pomocí ELISA testu. Jamky v microtitrační desce byly potaženy rostoucí koncentrací lidské IgE (JW8) a inkubovány s 5 pg puriflakovaného antiséra proti SDS-213 respektive proti SDS-214. Navázaná protilátka byla detakována pomocí konjugátu garlgG-HRP. Data na obrázku 14 reprezentují průměrné hodnoty duplikovaných měření. Jak vyplývá z obrázku, protilátky IgG purifikované na afinitních kolonách s BSW 17 mimotopovými peptidy jsou v závislosti na dávce rozpoznávány lidskými IgE protilátkami. Pouze slabá vazebná schopnost srovnatelná s pozadím byla pozorována ve vzorcích frakcí, které prošly kolonou bez zdržení. Tato data dokazují, že aktivita protilátek proti lidským IgE indukovaná v králíkovi je totožná s protilátkami namířenými proti mimotopovému peptidu.
·· ftft·· ftft ·· ftft ft· • ftft ftft·· ···· • ftftft · · · · ftftft· ft ftftft ····· ···· ft • ftftft · ftftft — 46” ···· ··· ·* *· *· *·
Příklad 12: Králičí protilátky proti lidským IgE vznikající po imunizaci BSW17 mimotopovými konjugáty nejsou anafylaktogenní pro lidské krevní buňky
V tomto příkladu je dokázáno, že králičí protilátky proti lidským IgE vznikající po imunizaci BSW17 mimotopovými konjugáty nejsou pro lidské krevní bazofilní buňky anafylaktogenní. Jako experimentální systém byl vybrán komerčně dostupný CAST sLt ELISA kit (Bílhlmann AG, Allschwil, Švýcarsko). V tomto testu se sleduje uvolňování rozpustného leukotrienu (sLt) z lidských basofilních buněk v důsledku aktivace buněk anafylaktogenním činidlem. Podmínky testu odpovídají doporučením dodavatele. Výsledek testu je udáván v pg sLt přítomného v 1 ml supernatantu z lidských bílých krvinek po inkubaci těchto buňek s testovaným vzorkem. Výsledek je stanoven pomocí kalibrační křivky. Kalibrační křivka byla získána pomocí ředicí řady standardu sLt v kompetitivním ELISA testu. Koncentrace rozpustného leukotrienu tvořící pozadí jsou důsledkem spontánního uvolňování sLt preparáty krevních buněk (označeno PB = blank pacient). Maximální dosažitelná koncentrace rozpustného leukotrienu pro daný preparát krevních buněk (PC = kontrolní pacient ) byla získána po aktivaci buněk zesíťující (crosslinking) protilátkou anti-IgERI a) . Každý test obsahuje uvedenou negativní a pozitivní kontrolu.
Úplné králičí sérum ze zvířat imunizovaných BSW 17 mimotopovým konjugátem, jakož i afinitně purifikované protilátky proti BSW 17 mimotopovým peptidům podle Příkladu 11 byly testovány na schopnost aktivace bazofilů a tedy na přítomnost anafylaktgenních protilátek proti lidským IgE.
Jako zdroj bazofilních buněk byla použita celková čerstvě odebraná lidská krev zdravých dárců. Ta byla dále zpracována přesně podle protokolu výrobce CAST -ELISA soupravy. Výsledky jsou shrnuty na obrázku 15. Z výsledků
-47·· ···· · 9 • ··· • * · • · • t *· • · · · • · · ♦ • 9 ··· • · · ·· 99
99 • · 9 9
9 99
999 9 9
9 9
99 vyplývá, že ani nepurifikované králičí sérum obsahující protilátky proti lidským IgE vzniklé po imunizaci BSW 17 mimotopvým konjugátem, ani afinitně purifikované protilátky proti těmto BSW 17 mimotopovým konjugátům nemají schopnost spustit uvolňování leukotrienu z lidských krevních buněk; což znamená, že nejsou anafylaktogenní. Toto je absolutně nezbytný předpoklad pro použití BSW 17 mimotopových peptidů v antialergické vakcíně v humánní medicíně.
-48INFORMA.CE 0 SEKVENCI ID. C. 1 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 8 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ano (iv) ANTI-SENSE: ne (v) TYP FRAGMENTU: interní (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 1: Ile-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val
INFORMACE 0 SEKVENCI ID. Č. 2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 8 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ano (iv) ANTI-SENSE: ne (v) TYP FRAGMENTU: interní (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 2: Arg-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val
INFORMACE 0 SEKVENCI ID. Č. 3:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) (B) (C) (D)
DÉLKA: 10 aminokyselin TYP: aminokyselina POČET VLÁKEN: j edno TOPOLOGIE: lineární
• · · • ··· · • · ···· ···
-49(ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ano (iv) ANTI-SENSE: ne (v) TYP FRAGMENTU: interní (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 3: Arg-Ser-Arg-Ser-Gly-Gly-Tyr-Trp-Leu-Trp
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 10 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ano (iv) ANTI-SENSE: ne (v) TYP FRAGMENTU: interní (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 4: Val-Asn-Leu-Thr-Trp-Ser-Arg-Ala-Ser-Gly
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 5:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) (B) (C) (D)
DÉLKA: 10 aminokyselin TYP: aminokyselina POČET VLÁKEN: j edno TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ano (iv) ANTI-SENSE: ne (v) TYP FRAGMENTU: interní (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 5:
Val-Asn-Leu-Pro-Trp-Ser-Arg-Ala-Ser-Gly
• · • · · · · · ·
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 6:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) (B) (C) (D)
DÉLKA: 10 aminokyselin TYP: aminokyselina POČET VLÁKEN: jedno TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ano (iv) ANTI-SENSE: ne (v) TYP FRAGMENTU: interní (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 6: Val-Asn-Leu-Thr-Trp-Ser-Phe-Gly-Leu-Glu
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 7:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) (B) (C) (D)
DÉLKA: 10 aminokyselin TYP: aminokyselina POČET VLÁKEN: j edno TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ano (iv) ANTI-SENSE: ne (v) TYP FRAGMENTU: interní (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 7: Val-Asn-Leu-Pro-Trp-Ser-Phe-Gly-Leu-Glu
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 8:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 10 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno
-51• · · · · ·
(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ano (iv) ANTI-SENSE: ne (v) TYP FRAGMENTU: interní (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 8: Val-Asn-Arg-Pro-Trp-Ser-Phe-Gly-Leu-Glu
INFORMACE 0 SEKVENCI ID. Č. 9:
(í) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 10 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ano (iv) ANTI-SENSE: ne (v) TYP FRAGMENTU: interní (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 9: Val-Lys-Leu-Pro-Trp-Arg-Phe-Tyr-Gln-Val
INFORMACE 0 SEKVENCI ID. Č. 10:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) (B) (C) (D)
DÉLKA: 10 aminokyselin TYP: aminokyselina POČET VLÁKEN: jedno TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ano (iv) ANTI-SENSE: ne (v) TYP FRAGMENTU: interní (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 10:
.··.:··· .··..··.
.····..: . . ; . · . ...
.... ··. ·· ·· ·· ··
-52Val-Trp-Thr-Ala-Cys-Gly-Tyr-Gly-Arg-Met
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 11:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 7 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ano (iv) ANTI-SENSE: ne (v) TYP FRAGMENTU: interní (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 11: Gly-Thr-Val-Ser-Thr-Leu-Ser
INFORMACE 0 SEKVENCI ID. Č. 12:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 7 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ano (iv) ANTI-SENSE: ne (v) TYP FRAGMENTU: interní (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 12: Leu-Leu-Asp-Ser-Arg-Tyr-Trp
INFORMACE 0 SEKVENCI ID. Č. 13:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 7 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina • 4*9
-53(C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ano (iv) ANTI-SENSE: ne (v) TYP FRAGMENTU: interní (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 13: Gln-Pro-Ala-His-Ser-Leu-Gly
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 14:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 7 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ano (iv) ANTI-SENSE: ne (v) TYP FRAGMENTU: interní (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 14: Leu-Trp-Gly-Met-Gln-Gly-Arg
| INFORMACE 0 SEKVENCI ID. Č. 15: | |
| (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 15 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární | |
| (ii) | TYP MOLEKULY: peptid |
| (iii) | HYPOTETICKÁ: ano |
| (iv) | ANTI-SENSE: ne |
| (v) | TYP FRAGMENTU: interní |
·· ·· • · ·
-54(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 15: Leu-Trh-Leu-Ser-His-Pro-His-Trp-Val-Leu-Asn-His-Phe-Val-Ser
INFORMACE O SEKVENCI ID. C. 16:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ano (iv) ANTI-SENSE: ne (v) TYP FRAGMENTU: interní (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 16: Ser-Met-Gly-Pro-Asp-Gln-Thr-Leu-Arg
INFORMACE 0 SEKVENCI ID. Č. 17:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 6 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ano (iv) ANTI-SENSE: ne (v) TYP FRAGMENTU: interní (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 17: Val-Asn-Leu-Thr-Trp-Ser
INFORMACE 0 SEKVENCI ID. Č. 18:
·· ·»*·
99
-55(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 11 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ano (iv) ANTI-SENSE: ne (v) TYP FRAGMENTU: interní (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 18: Cys-Arg-Arg-His-Asn-Tyr-Gly-Phe-Trp-Val-Cys
INFORMACE 0 SEKVENCI ID. Č. 19:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) (B) (C) (D)
DÉLKA: 10 aminokyselin TYP: aminokyselina POČET VLÁKEN: jedno TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ano (iv) ANTI-SENSE: ne (v) TYP FRAGMENTU: interní (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 19: Cys-Ile-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val-Cys
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 20:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) (B) (C) (D)
DÉLKA: 11 aminokyselin TYP: aminokyselina POČET VLÁKEN: jedno TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ano
F ♦ · · t · · · • · · · 4
-56···· ····999 ·· (iv) ANTI-SENSE: ne (v) TYP FRAGMENTU: interní (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 20: Cys-Thr-Arg-Leu-His-Thr-Gly-Tyr-Trp-Val-Cys
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 21;
| (i) | CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 11 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární | |
| (ii) | TYP MOLEKULY: peptid | |
| (iii) | HYPOTETICKÁ: ano | |
| (iv) | ANTI-SENSE: ne | |
| (V) | TYP FRAGMENTU: interní | |
| (xi) | POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: | 21: |
| Cys- | Thi-Leu-Ser-Val-Phe-Gly-Tyr-Trp- | -Val |
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 22:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 11 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ano (iv) ANTI-SENSE: ne (v) TYP FRAGMENTU: interní (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 22: Cys-Ser-Met-Gly-Pro-Asp-Gln-Thr-Leu-Arg-Cys
444
4 ·♦· · • · • 444 • 4 44
-57·» ·· • 4 «4
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 23:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ano (iv) ANTI-SENSE: ne (v) TYP FRAGMENTU: interní (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 23: Cys-Leu-Leu-Asp-Ser-Arg-Tyr-Trp-Cys
| INFORMACE 0 SEKVENCI ID. C. 24: | |
| (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární | |
| (ii) | TYP MOLEKULY: peptid |
| (iii) | HYPOTETICKÁ: ano |
| (iv) | ANTI-SENSE: ne |
| (v) | TYP FRAGMENTU: interní |
| (xi) | POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. |
Cys-Gln-Pro-Ala-His-Ser-Leu-Gly-Cys
INFORMACE 0 SEKVENCI ID. C. 25:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid ·· ·*
9 9 · • 9 9 9 · · ·♦·
-58·· ···· • · • ··· ♦ ♦ ·· ♦ · ·
9 9
999 9 9
9 ·
9 9 9 (iii) HYPOTETICKÁ: ano (iv) ANTI-SENSE: ne (v) TYP FRAGMENTU: interní (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 25: Cys-Leu-Trp-Gly-Met-Gln-Gly-Arg-Cys
INFORMACE 0 SEKVENCI ID. Č. 26:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ano (iv) ANTI-SENSE: ne (v) TYP FRAGMENTU: interní (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 26: Cys-Gly-Thr-Val-Ser-Thr-Leu-Ser-Cys
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 27:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 17 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ano (iv) ANTI-SENSE: ne (v) TYP FRAGMENTU: interní (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 27:
Gly-Glu-Phe-Cys-Ile-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val-Cys-Gly-Asp-Pro-Ala
·
0
000 ·
0000 * · 0
0 0
-59INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 28:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 10 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ano (iv) ANTI-SENSE: ne (v) TYP FRAGMENTU: interní (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 28: Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 29:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) (B) (C) (D)
DÉLKA: 9 aminokyselin TYP: aminokyselina POČET VLÁKEN: j edno TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ano (iv) ANTI-SENSE: ne (v) TYP FRAGMENTU: interní (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 29: Ile-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val-Cys
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 30:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 11 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno
(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ano (iv) ANTI-SENSE: ne (v) TYP FRAGMENTU: interní (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 30: Arg-Ser-Arg-Ser-Gly-Gly-Tyr-Trp-Leu-Trp-Cys
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 31:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) (B) (C) (D)
DÉLKA: 17 aminokyselin TYP: aminokyselina POČET VLÁKEN: j edno TOPOLOGIE: oba typy (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ano (iv) ANTI-SENSE: ne (v) TYP FRAGMENTU: interní (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 31:
Gly-Glu-Phe-Cys-Ile-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val-CysGly-Asp-Pro-Ala
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 32:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 18 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKEN: oba typy (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ano (iv) ANTI-SENSE: ne (v) TYP FRAGMENTU: interní ·» ···· · · • ··· • « • 1
9999 999
999
9 ♦·
9 · • ·· ··· · · • · *
99
-61(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 32:
Gly-Glu-Phe-Cys-Arg-Arg-His-Asn-Tyr-Gly-Phe-Trp-Val-Cys-Gly-Asp-Pro-Ala
Claims (1)
- PATENTOVÉ NÁROKYImunogenní molekula vyznačující se tím, že obsahujea) alespoň jednu funkční prostorovou skupinu peptidu protilátky aminokyselin, která další komponenty s vlastnostmi mimotopového BSW17 celkem dlouhou až 15 může popřípadě obsahovat usnadňující vazbu mezi haptenem a nosičem, usnadňující vlastní proces navázání na komponentu (b) nebo další zpracování; nebo je-li mimotopový peptid protilátky BSW17 cyklický, mohou být konce peptidu spojeny dvěma cysteinovýmí zbytky tvořícími disulfidovou vazbu, nebo spojeny chemicky; nebo je-li mimotopový peptid protilátky BSW17 lineární, může být karboxy-konec blokován amidací a/nebo amino-konec blokován acetylací; nebo mohou být na koncích pomocné skupiny a/nebo dodatečné vazebné skupiny a skupinu schopnou vyvolat imunitní odpověď proti tomuto peptidu, přičemž komponenta (a) je rozdílná od peptidu Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-ValPhe.Imunogenní molekula podle nároku 1 ve formě polymerního peptidu nebo rekombinantního fúzního proteinu vyznačující se tím ,že jedna monomerní složka polymerního peptidu, nebo jedna součást fúzního proteinu vytváří prostorovou strukturu mimotopového peptidu protilátky BSW17 a zbytek polymerního peptidu nebo rekombinantního fúzního proteinu představuje složku vyvolávající imunitní odpověď.9 99999·99 99999 ·9 9999999 999-633. Imunogenní molekula podle nároku 1 ve formě konjugátu mimotopového peptidu protilátky BSW17 s imunogenním nosičem.4. Imunogenní molekula podle nároku 1 vyznačující se tím , že funkční prostorová struktura mimotopového peptidu protilátky BSW17 v podstatě sestává nebo obsahuje aminokyselinovou sekvenci vybranou z následujícíchIle-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val (A)Arg-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val (B)Arg-Ser-Arg-Ser-Gly-Gly-Tyr-Trp-Leu-Trp (C)Val-Asn-Leu-Thr-Trp-Ser-Arg-Ala-Ser-Gly (D)Val-Asn-Leu-Pro-Trp-Ser-Arg-Ala-Ser-Gly (E)Val-Asn-Leu-Thr-Trp-Ser-Phe-Gly-Leu-Glu (F)Val-Asn-Leu-Pro-Trp-Ser-Phe-Gly-Leu-Glu (G)Val-Asn-Arg-Pro-Trp-Ser-Phe-Gly-Leu-Glu (H)Val-Lys-Leu-Pro-Trp-Arg-Phe-Tyr-Gln-Val (I)Val-Trp-Thr-Ala-Cys-Gly-Tyr-Gly-Arg-Met (J)Gly-Thr-Val-Ser-Thr-Leu-Ser (K)Leu-Leu-Asp-Ser-Arg-Tyr-Trp (L)Gln-Pro-Ala-His-Ser-Leu-Gly (M)Leu-Trp-Gly-Met-Gln-Gly-Arg (N)Leu-Thr-Leu-Ser-His-Pro-His-Trp-Val-Leu-Asn-His-PheVal-Ser (0)V.-:-.--.-.·-·-·· ?· · / ·· ftftft· • · • ftftft ftft ftft > ftft «I ftftft ftft ♦ ft I • · a • · ·· •64Ser-Met-Gly-Pro-Asp-Gln-Thr-Leu-ArgVal-Asn-Leu-Thr-Trp-Ser (P) a (Q)Imunogenní molekula podle nároku 1 vyznačující se tím , že funkční prostorová struktura mimotopového peptidů protilátky BSW17 (a) má aminokyselinovou sekvenci Gly-Glu-PheCys- Ile-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val-Cys-Gly-Asp-ProAla (Sekvence id.č. 27) a je cyklická, jmenovitě je to peptid Ile-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val jehož konce jsou spojeny dvěma dodatečnými cysteinovými zbytky tvořícími disulfidový můstek a obsahuje další součásti Gly-Glu-Phe a Gly-Asp-Pro-Ala usnadnění navázání heptenu na nosič.Farmaceutická tím ,že kompozice vyznačující se obsahuje imunogenní molekulu podle libovolného z nároků 1 až 5 a adjuvans.Ligand vyznačující se obsahuje protilátkovou doménu tím rozpoznávající funkční mimotopového peptidů , ze specificky strukturu libovolného protilátková z nároků doména sekvencí aminokyselin prostorovou protilátky BSW17 podle 1 až 5, přičemž je tato schopna reagovat rovněž se těžkého řetězce IgE, která představuje přirozený epitop protilátky BSW17.Ligand podle nároku 7 vyznačující se tím , že je ve formě monoklonální protilátky nebo jejího Fab' nebo F(ab')2 fragmentu.
jr -65- .··.:··· .··..··· • J · « · · · · ·· .· : ·: : ··: ···::: ·<· ·· ·· *· 9. Způsob přípravy imunogenní vyznačující se vhodné navázání funkční molekuly podle nároku 1 tím r že zahrnuje prostorové skupiny (a) mimotopového peptidu protilátky BSW12 na skupinu schopnou vyvolat imunitní odpověď proti tomuto peptidu.10. Použití imunogenní molekuly podle libovolného z nároků 1 až 5 pro léčbu onemocnění souvisejících s IgE.11. Použití imunogenní molekuly podle libovolného z nároků 1 až 5 pro přípravu vakcíny proti alergii.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB9604412.8A GB9604412D0 (en) | 1996-03-01 | 1996-03-01 | Organic compounds |
| GBGB9617702.7A GB9617702D0 (en) | 1996-08-22 | 1996-08-22 | Organic compounds |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ277198A3 true CZ277198A3 (cs) | 1998-12-16 |
| CZ299551B6 CZ299551B6 (cs) | 2008-08-27 |
Family
ID=26308839
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ0277198A CZ299551B6 (cs) | 1996-03-01 | 1997-02-28 | Imunogenní molekula, zpusob její prípravy a farmaceutický prípravek, který obsahuje tuto molekulu |
Country Status (25)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6610297B1 (cs) |
| EP (1) | EP0885244B2 (cs) |
| JP (2) | JP3421970B2 (cs) |
| KR (2) | KR100584051B1 (cs) |
| CN (1) | CN1174998C (cs) |
| AT (1) | ATE230417T1 (cs) |
| AU (1) | AU719609B2 (cs) |
| BR (1) | BR9707819A (cs) |
| CA (1) | CA2245497C (cs) |
| CY (1) | CY2457B1 (cs) |
| CZ (1) | CZ299551B6 (cs) |
| DE (1) | DE69718150T3 (cs) |
| DK (1) | DK0885244T4 (cs) |
| ES (1) | ES2190799T5 (cs) |
| HK (1) | HK1014962A1 (cs) |
| HU (1) | HUP9901109A3 (cs) |
| IL (1) | IL125590A (cs) |
| NO (1) | NO321043B1 (cs) |
| NZ (1) | NZ331651A (cs) |
| PL (1) | PL187209B1 (cs) |
| RU (1) | RU2193413C2 (cs) |
| SI (1) | SI0885244T2 (cs) |
| SK (1) | SK284856B6 (cs) |
| TR (1) | TR199801722T2 (cs) |
| WO (1) | WO1997031948A1 (cs) |
Families Citing this family (32)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6913749B2 (en) | 1998-11-02 | 2005-07-05 | Resistentia Pharmaceuticals Ab | Immunogenic polypeptides for inducing anti-self IgE responses |
| EP1621209A3 (en) * | 1998-11-02 | 2006-04-19 | Resistentia Pharmaceuticals AB | Vaccines based on domains of chimeric immunoglobulin E peptides |
| NZ512456A (en) | 1998-11-30 | 2003-10-31 | Cytos Biotechnology Ag | Ordered molecular presentation of antigens |
| JP2002537354A (ja) * | 1999-02-25 | 2002-11-05 | スミスクライン ビーチャム バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | ペプチド、及びＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのプロテインＤ由来の担体を含む免疫原 |
| NZ513680A (en) * | 1999-02-25 | 2001-09-28 | Peptide Therapeutics Ltd | Epitodes or mimotopes derived from the c-epsilon-3 or c-epsilon-4 domains of IgE, antagonists thereof, and their therapeutic uses |
| GB9908533D0 (en) * | 1999-04-14 | 1999-06-09 | Novartis Ag | Organic compounds |
| AU2001252262B2 (en) * | 2000-04-13 | 2006-02-02 | Biolife Science Forschungs-und Entwicklungsgesellschaft m.b.H | Vaccine against cancerous diseases which is based on mimotopes of antigens expressed on tumor cells |
| CA2407897A1 (en) | 2000-05-05 | 2001-11-15 | Cytos Biotechnology Ag | Molecular antigen arrays and vaccines |
| EP1967206B1 (en) | 2000-08-30 | 2012-10-10 | Pfizer Products Inc. | Anti-IgE vaccines |
| US7094409B2 (en) | 2001-01-19 | 2006-08-22 | Cytos Biotechnology Ag | Antigen arrays for treatment of allergic eosinophilic diseases |
| US7320793B2 (en) | 2001-01-19 | 2008-01-22 | Cytos Biotechnology Ag | Molecular antigen array |
| US7128911B2 (en) | 2001-01-19 | 2006-10-31 | Cytos Biotechnology Ag | Antigen arrays for treatment of bone disease |
| ES2394293T3 (es) * | 2001-02-28 | 2013-01-30 | Bio Life Science Forschungs- Und Entwicklungsges.M.B.H. | Vacuna contra cánceres que están asociados con el oncogén HER-2/neu |
| EP1239032A1 (en) | 2001-03-02 | 2002-09-11 | Société des Produits Nestlé S.A. | Lactic acid bacteria as agents for treating and preventing allergy |
| JP2003047482A (ja) | 2001-05-22 | 2003-02-18 | Pfizer Prod Inc | 非アナフィラキシー誘発性ＩｇＥワクチン |
| US7604955B2 (en) | 2001-08-13 | 2009-10-20 | Swey-Shen Alex Chen | Immunoglobulin E vaccines and methods of use thereof |
| US7115266B2 (en) | 2001-10-05 | 2006-10-03 | Cytos Biotechnology Ag | Angiotensin peptide-carrier conjugates and uses thereof |
| US20050226894A1 (en) * | 2002-01-15 | 2005-10-13 | Jensen-Jarolim Erika | Oral vaccination |
| AU2003246690B2 (en) | 2002-07-17 | 2010-03-11 | Cytos Biotechnology Ag | Molecular antigen arrays using a virus like particle derived from the AP205 coat protein |
| US6932971B2 (en) | 2002-07-18 | 2005-08-23 | Cytos Biotechnology Ag | Hapten-carrier conjugates and uses thereof |
| CA2492930C (en) | 2002-07-19 | 2013-01-08 | Cytos Biotechnology Ag | Vaccine compositions containing amyloid beta1-6 antigen arrays |
| EP1534335B9 (en) | 2002-08-14 | 2016-01-13 | Macrogenics, Inc. | Fcgammariib-specific antibodies and methods of use thereof |
| US20050065136A1 (en) * | 2003-08-13 | 2005-03-24 | Roby Russell R. | Methods and compositions for the treatment of infertility using dilute hormone solutions |
| US20050239757A1 (en) * | 2004-04-21 | 2005-10-27 | Roby Russell R | Hormone treatment of macular degeneration |
| US20060025390A1 (en) * | 2004-07-28 | 2006-02-02 | Roby Russell R | Treatment of hormone allergy and related symptoms and disorders |
| ITMI20052517A1 (it) * | 2005-12-29 | 2007-06-30 | Lofarma Spa | Varianbtio ipoallergeniche dell'allergene maggiore bet v 1 di polline di betula verrucosa |
| HUE030269T2 (en) | 2006-06-26 | 2017-04-28 | Macrogenics Inc | FC RIIB-specific antibodies and methods for their use |
| EP2012122A1 (en) * | 2007-07-06 | 2009-01-07 | Medigene AG | Mutated parvovirus structural proteins as vaccines |
| US8865179B2 (en) * | 2008-01-26 | 2014-10-21 | Swey-Shen Alexchen | Aptameric IgE peptides in a protein scaffold as an allergy vaccine |
| MX337723B (es) | 2008-12-09 | 2016-03-15 | Pfizer Vaccines Llc | Vacuna de peptido ch3 de ige. |
| EP2575868A1 (en) * | 2010-06-07 | 2013-04-10 | Pfizer Vaccines LLC | Ige ch3 peptide vaccine |
| RU2761431C9 (ru) * | 2020-10-26 | 2022-04-18 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр "Институт иммунологии" Федерального медико-биологического агентства России (ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России) | Рекомбинантный полипептид на основе аллергена пыльцы березы и аллергена яблока в качестве вакцины от аллергии |
Family Cites Families (36)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2602443A1 (de) | 1975-04-04 | 1976-10-21 | Univ California | Biologisch aktive polypeptide |
| US4171299A (en) | 1975-04-04 | 1979-10-16 | The Regents Of The University Of California | Polypeptide agents for blocking the human allergic response |
| EP0000252B1 (en) | 1977-06-29 | 1982-02-03 | Beecham Group Plc | Peptides, pharmaceutical compositions containing the peptides and a process for the preparation of the peptides |
| JPS5944399A (ja) | 1982-09-07 | 1984-03-12 | Takeda Chem Ind Ltd | 新規ｄｎａ |
| GB8616166D0 (en) * | 1986-07-02 | 1986-08-06 | Research Corp Ltd | Polypeptide competitor |
| US4892827A (en) | 1986-09-24 | 1990-01-09 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Recombinant pseudomonas exotoxins: construction of an active immunotoxin with low side effects |
| EP0269455A3 (en) | 1986-11-28 | 1989-09-06 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Highly purified fused protein comprising human ige fc fragment and production thereof |
| AU1484688A (en) | 1987-02-20 | 1988-09-14 | Imclone Systems, Inc. | Monoclonal antibodies in vaccine formulations |
| CA1336818C (en) | 1987-04-16 | 1995-08-29 | International Institute Of Cellular And Molecular Pathology | Treatment of allergy and composition thereof |
| IE81146B1 (en) | 1987-10-13 | 2000-05-03 | Terrapin Tech Inc | Method to produce immunodiagnostic reagents |
| GB8727045D0 (en) | 1987-11-19 | 1987-12-23 | Research Corp Ltd | Immunoglobulin e competitor |
| US5342924A (en) | 1987-12-31 | 1994-08-30 | Tanox Biosystems, Inc. | Extracellular segments of human ε immunoglobulin anchoring peptides and antibodies specific therefor |
| US5449760A (en) | 1987-12-31 | 1995-09-12 | Tanox Biosystems, Inc. | Monoclonal antibodies that bind to soluble IGE but do not bind IGE on IGE expressing B lymphocytes or basophils |
| GB8910263D0 (en) | 1989-05-04 | 1989-06-21 | Ciba Geigy Ag | Monoclonal antibodies specific for an immunoglobulin isotype |
| GB8913737D0 (en) | 1989-06-15 | 1989-08-02 | Univ Birmingham | A novel anti-allergy treatment |
| ES2107454T3 (es) | 1990-01-23 | 1997-12-01 | Tanox Biosystems Inc | Segmentos extracelulares de peptidos de anclaje de la inmunoglobulina ige humana, y anticuerpos especificos para los mismos. |
| CA2082529A1 (en) | 1990-05-25 | 1991-11-26 | Denis R. Stanworth | Immunodiagnostic assay for rheumatoid arthritis |
| US5258289A (en) | 1990-09-05 | 1993-11-02 | Davis Claude G | Method for the selecting of genes encoding catalytic antibodies |
| GB9101550D0 (en) | 1991-01-24 | 1991-03-06 | Mastico Robert A | Antigen-presenting chimaeric protein |
| US5965709A (en) * | 1991-08-14 | 1999-10-12 | Genentech, Inc. | IgE antagonists |
| JP3457962B2 (ja) * | 1991-08-14 | 2003-10-20 | ジェネンテク，インコーポレイテッド | 特定Ｆｃεレセプターのための免疫グロブリン変異体 |
| SE9102808L (sv) | 1991-09-26 | 1993-03-27 | Lars T Hellman Inst F Immunolo | Vaccin, foer humant bruk, vars avsedda effekt aer att lindra symptomen eller foerhindra uppkomsten av ige-medierade allergiska reaktioner |
| GB9125024D0 (en) | 1991-11-25 | 1992-01-22 | Kirby Julian | Rheumatoid arthritus treatment |
| JPH06113881A (ja) | 1992-10-07 | 1994-04-26 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | ヒト型モノクローナル抗ペプチド抗体及びこれをコードするｄｎａ |
| JP3795914B2 (ja) | 1993-04-27 | 2006-07-12 | ユナイテッド・バイオメディカル・インコーポレイテッド | ワクチン用免疫原性ｌｈｒｈペプチド構築体および合成普遍免疫刺激器 |
| US5759551A (en) | 1993-04-27 | 1998-06-02 | United Biomedical, Inc. | Immunogenic LHRH peptide constructs and synthetic universal immune stimulators for vaccines |
| EP0763537A3 (en) | 1993-05-14 | 1997-10-22 | Genentech Inc | Non-peptides farnesyl transfer inhibitors |
| GB9320897D0 (en) | 1993-10-11 | 1993-12-01 | Peptide Therapeutics Ltd | Compounds useful in anti-allergy treatment |
| GB9324013D0 (en) * | 1993-11-22 | 1994-01-12 | 3I Res Expl Ltd | Polypeptides |
| FR2715304B1 (fr) * | 1994-01-26 | 1996-04-26 | Merieux Serums Vaccins Pasteur | Vaccin anti-allergique. |
| JPH09510975A (ja) * | 1994-03-28 | 1997-11-04 | ユナイテッド・バイオメディカル・インコーポレイテッド | アレルギー治療用合成ペプチドベース免疫原 |
| WO1996001643A1 (en) | 1994-07-08 | 1996-01-25 | Thomas Jefferson University | IgE ANTAGONISTS |
| WO1996012740A1 (en) | 1994-10-25 | 1996-05-02 | United Biomedical, Inc. | SYNTHETIC IgE MEMBRANE ANCHOR PEPTIDE IMMUNOGENS FOR THE TREATMENT OF ALLERGY |
| AU6532498A (en) | 1996-12-06 | 1998-06-29 | United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services, The | Inhibition of ige-mediated allergies by a human ige-derived oligopeptide |
| EP0955311A3 (en) | 1998-04-09 | 2000-08-16 | Idexx Laboratories, Inc. | Peptide vaccine for canine allergy |
| TWI229679B (en) | 1998-06-20 | 2005-03-21 | United Biomedical Inc | Artificial T helper cell epitopes as immune stimulators for synthetic peptide immunogens |
-
1997
- 1997-02-28 DK DK97905136T patent/DK0885244T4/da active
- 1997-02-28 KR KR1020057005577A patent/KR100584051B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1997-02-28 WO PCT/EP1997/001013 patent/WO1997031948A1/en active IP Right Grant
- 1997-02-28 CA CA002245497A patent/CA2245497C/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-02-28 CN CNB971926719A patent/CN1174998C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1997-02-28 SK SK1181-98A patent/SK284856B6/sk unknown
- 1997-02-28 HU HU9901109A patent/HUP9901109A3/hu unknown
- 1997-02-28 DE DE69718150T patent/DE69718150T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-28 IL IL12559097A patent/IL125590A/xx not_active IP Right Cessation
- 1997-02-28 SI SI9730490T patent/SI0885244T2/sl unknown
- 1997-02-28 BR BR9707819A patent/BR9707819A/pt not_active Application Discontinuation
- 1997-02-28 AU AU18796/97A patent/AU719609B2/en not_active Ceased
- 1997-02-28 US US09/125,641 patent/US6610297B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-02-28 JP JP53063297A patent/JP3421970B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1997-02-28 EP EP97905136A patent/EP0885244B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-28 CZ CZ0277198A patent/CZ299551B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-02-28 NZ NZ331651A patent/NZ331651A/xx unknown
- 1997-02-28 PL PL97328858A patent/PL187209B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1997-02-28 ES ES97905136T patent/ES2190799T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-28 TR TR1998/01722T patent/TR199801722T2/xx unknown
- 1997-02-28 RU RU98118184/14A patent/RU2193413C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1997-02-28 KR KR10-1998-0706845A patent/KR100498198B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1997-02-28 AT AT97905136T patent/ATE230417T1/de not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-08-31 NO NO19983999A patent/NO321043B1/no unknown
- 1998-12-31 HK HK98119259A patent/HK1014962A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2002
- 2002-12-26 JP JP2002377664A patent/JP2003231696A/ja active Pending
-
2004
- 2004-06-04 CY CY0400044A patent/CY2457B1/xx unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ277198A3 (cs) | Imunogenní peptidy, způsob jejich přípravy, farmaceutický prostředek, který je obsahuje a jejich použití | |
| KR0181313B1 (ko) | 면역활성 펜티드 및 항체와 이것들의 항-알레르기 치료에의 이용 | |
| CZ20013081A3 (cs) | Epitopy a mimotopy získané z oblastí C-epsilon-2 nebo C-epsilon-4 IgE, jejich antagonisté a jejich terapeutické pouľití | |
| CZ20013673A3 (cs) | Anti-idiotypová protilátka k protilátce inhibující vazbu imunglobulínu E na jeho receptor s vysokou afinitou a farmaceutický přípravek obsahující takovou protilátku | |
| WO2000050460A1 (en) | Epitopes or mimotopes derived from the c-epsilon-2 domain of ige, antagonists thereof, and their therapeutic uses | |
| EP0957111B1 (en) | Specific binding proteins for treating canine allergy | |
| CA2329152A1 (en) | Peptide vaccine for canine allergy | |
| AU757334B2 (en) | Specific binding proteins for treating canine allergy | |
| EP0955311A2 (en) | Peptide vaccine for canine allergy | |
| Hannestad et al. | Anti‐idiotypic immune responses against adjuvant‐free isologous IgM monoclonal antibodies and their augmentation by complex formation between IgM and albumin in bovine serum | |
| US20030170229A1 (en) | Vaccine | |
| US20030147906A1 (en) | Epitopes or mimotopes derived from the C-epsilon-3 or C-epsilon-4 domains of lgE, antagonists thereof, and their therapeutic uses | |
| EP0370090A1 (en) | OF COMMON SEQUENCES OF ANTIGENS AND ANTIIDIOTYPICAL ANTIBODIES OR OF ANTIBODIES WITH SPECIFICITY FOR THE CELLULAR RECEPTORS OF THE ANTIQUE DERIVED IMMUNOGENIC AND BIOLOGICALLY ACTIVE PEPTIDES. | |
| US20050214285A1 (en) | Epitopes or mimotopes derived from the C-epsilon-3 or C-epsilon-4 domains of IgE, antagonists thereof, and their therapeutic uses | |
| US20060073139A1 (en) | Vaccine composition for preventing meningococcal disease | |
| ZA200107016B (en) | Epitopes or mimotopes derived from the C-epsilon-2 domain of ige, antagonists thereof, and their therapeutic uses. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20090228 |