CZ20013673A3 - Anti-idiotypová protilátka k protilátce inhibující vazbu imunglobulínu E na jeho receptor s vysokou afinitou a farmaceutický přípravek obsahující takovou protilátku - Google Patents

Description

Předkládaný vynález se týká anti-idiotypových protilátek. Týká se inhibice interakcí, které by normálně spustily aktivitu mastocytů a bazofilů indukovanou tím, že se na buňku naváže imunoglobulín E (IgE) spojený s alergenem, což vede k uvolnění histaminu a dalších mediátorů a také k de novo syntéze cytokinů zúčastněných v regulaci alergických a zánětlivých reakcí. Tudíž se předkládaný vynález týká anti-idiotypových protilátek nebo jejich fragmentů, které interferují s vazbou úseku Ce3 imunoglobulínu E (IgE) na vysokoafinitní receptor pro IgE.

Dosavadní stav techniky

Znalost specifických vazebných míst na IgE, která interagují se svými vysokoafinitními receptory (FcsRI) představuje výchozí bod pro přípravu protilátek, které mohou tyto interakce inhibovat tím, že rozpoznávají vazebné epitopy. Indukce takových protilátek vakcinací představuje zcela novou a obecně využitelnou terapii pro alergie. Předkládaný vynález popisuje identifikaci produkci protilátek, zejména fragmentů rekombinantních protilátek, které lze formulovat jako vakcinační přípravky pro indukci tvorby anti-IgE protilátek, které chrání před vznikem alergických reakcí zprostředkovaných IgE.

• · ♦ · • · · · · ·· ·· ·

Alergické symptomy jsou vyvolány uvolněním vazoaktivních aminů (mediátorů), zejména histaminu, z buněk do okolních tkání a vaskulatury. Histamin je normálně shromažďován ve specializovaných buňkách známých jako mastocyty (žírné buňky) a bazofilní granulocyty. Mastocyty jsou rozptýleny v různých tkáních, zatímco bazofilní granulocyty (bazofily) cirkulují v cévním systému. Tyto buňky syntetizují a skladují histamin uvnitř buňky, dokud nedojde ke specializovanému sledu událostí, které spustí jeho uvolňování.

Role IgE protilátek ve zprostředkování (mediaci) alergických reakcí je dobře známa. IgE je komplexním souborem polypeptidových řetězců, které sestávají, jako u dalších imunoglobulínů, ze dvou těžkých a dvou lehkých řetězců spojených dohromady disulfidickými vazbami do uspořádání v podobě písmene Y. Každý z lehkých řetězců má dvě domény, jednu variabilní (V_L) doménu spojenou s doménou s relativně neměnnou sekvencí aminokyselin, zvanou konstantní doména (Cl). Těžké řetězce naproti tomu mají jednu variabilní doménu (V_H) a v případě IgE, čtyři konstantní domény (C_H1, C_H2, C_H3 a C_H4, známé také pod označením Cel, Cs2, Cs3 a Ce4) . Dvě ramena protilátky zodpovědná za vazbu antigenu, mající úseky s proměnlivou strukturou polypeptidu, se nazývají fragmenty Fab', nebo F(ab')₂ v případě, kdy jde o dvě ramena Fab' spojená disulfidickými vazbami. Ocásek neboli centrální osa protilátky obsahuje fixní neboli konstantní sekvence peptidů a nazývá se fragment Fc. Fragment Fc obsahuje interaktivní místa, která umožňují protilátce komunikovat s ostatními molekulami imunitního systému nebo s buňkami tím, že se naváže na jejich Fc receptory. Fc receptory jsou molekuly, které se specificky váží na aktivní molekulární místa na Fc úsecích imunoglobulínů.

• ·

Fc receptory existují jako integrální membránové proteiny ve vnější buněčné membráně nebo se vyskytují jako volné rozpustné molekuly cirkulující v krevní plazmě nebo jiných tělních tekutinách. U člověka se vysokoafinitní vazba IgE na Fc RI uskutečňuje pomocí komplexní protein-proteinové interakce zahrnující různé části třetí konstantní domény těžkého řetězce (Ce3) IgE a k membráně proximální části imunoglobulínu - jako je doména (a2) podjednotky FctRIa. Ačkoliv byly v doméně Ce3 Fc a úsecích domény a2 v FcsRIa identifikovány zbytky, které jsou důležité pro vazbu, detailní mechanismus vazby dosud nebyl charakterizován. Experimentální důkazy ukázaly, že humánní IgE zaujímá ohnutou strukturu, která zřejmě přispívá k vysoké afinitě IgE pro FcsRI (Kd = ΙΟ'¹⁰ M) . Kromě toho se má zato, že tato ohnutá struktura je zodpovědná za vytvoření ekvimolárního komplexu mezi IgE a FcsRIa, vázaným na buňku nebo volným, přestože molekula IgE poskytuje identické epitopy pro vazbu receptorů na dvou Cs3 doménách. Tato monovalentnost je však funkční nutností, pokud se má zabránit tomu, aby se receptor nespustil v nepřítomnosti alergenu.

Místa interakce, v závislosti na jejich funkci, již mohou být exponována a tudíž schopna vazby na buněčné receptory. Alternativně mohou být skrytá dokud se nenaváže protilátka na antigen, čímž protilátka změní svou strukturu a poté exponuje jiné aktivní místo, které specificky spouští určitou aktivitu imunitní systému. Konformační změna působící na Cs3 po navázání receptorů se předpokládá jakožto vysvětlení pro stechiometrii 1:1 v komplexu Fcs/FcsRI na povrchu buněk.

K alergickému (imunologickému) uvolnění mediátorů z mastocytů a bazofilů v organismu může dojít pouze za následujících okolností: molekula IgE se musí zasunout nebo

známých

Další biochemické události a vedou k de novo syntéze spojit sama svým Fc úsekem s buněčným recept ořem Fc a tím zabezpečit spojení molekuly IgE s mastocytem nebo bazofilem, a přitom části Fab¹ molekuly IgE vázané na buňky musí být zesítěny (crosslinked) určitým kompatibilním antigenem (alergenem). Pokud k takové interakci dojde, mastocyty nebo bazofily jsou automaticky spuštěny, aby uvolňovaly histamin do lokálního prostředí, což vede k manifestaci alergických symptomů (obr. 1) následují v pozdní fázi reakce a uvolňování cytokinů a dalších mediátorů.

Konvenční postupy léčení alergií zahrnovaly systémovou terapii s anti-histaminy nebo pokusy o desensibilizaci pacientů, což byly přístupy, které nebyly zaměřeny na základní interakci IgE-mastocyty/bazofily. Další přístup se týkal produkce polypeptidových řetězců, které byly schopny blokovat vazbu protilátky IgE a receptory Fc na povrchu buněk, a vytěsnit IgE z vazebných míst, kam už se IgE navázal, a zkoumal povahu domnělých efektorových míst v Fc úseku IgE, o kterých se přepokládalo, že poskytují imunologický signál pro spuštění uvolňování histaminu z mastocytů/bazofilů.

Užití rekombinantních fragmentů IgE jakožto imunogenů pro vytváření protektivní anti-IgE vakcíny bylo také zkoušeno a ukázalo se jako účinné. Hlavní námitkou proti takové vakcíně byla možnost, že užití velkých IgE fragmentů pro imunizaci by mohlo vyvolat nejen tvorbu inhibičních protilátek, ale také vyvolat zesítění a tím protilátky vyvolávají u pacientů anafylaktickou reakci.

Strategie, která eliminuje tento problém, by měla být zaměřena na identifikaci co nejmenších IgE fragmentů, v ideálním případě složených pouze z vazebného místa pro receptor, které je po navázání zanořeno uvnitř komplexu IgE/IgERI a tudíž je nepřístupné pro zesítění při imunitní ovalbuminem napodobeniny reakci vyvolané vakcínou. Ačkoliv pokusy tohoto typu stále probíhají, tato strategie má jen malou šanci na úspěch vzhledem k prostorovým vzdálenostem různých úseků Ce3 účastnících se v interakci IgE/lgERI.

Problémy neoddělitelně spojené s klasickým vakcinačním přístupem mohou být eliminovány užitím krátkých mimotopových peptidů pro aktivní imunizaci, buďto v podobě chemicky syntetizovaných peptidů konjugovaných s vhodnými nosiči nebo ve formě rekombinantních fúzních konstruktů s např.

nebo IgG. Takové peptidy jsou strukturní (mimics) epitopu rozpoznávaného monoklonální protilátkou BSW17, která rozpoznává konformační epitop na Fce, jehož část leží uvnitř úseku Ce3 a část leží uvnitř úseku C£4. Hybridomová buněčná linie produkující BSW17 byla uložena podle Budapešťské dohody dne 19. prosince 1996 ve sbírce mikroorganismů ECACC jako depozit č. 96121916. Tato protilátka vykazuje zajímavý profil biologických aktivit, jak je přehledně znázorněno na obr. 2. Tato protilátka sama není anafylaktogenní a chrání humánní mastocyty a bazofily před IgE-závislým uvolňováním histaminu indukovaným spouštěcími agens. BSW17 sama nebo protilátky BSW17-podobné cirkulující v cévním systému chrání před alergickou reakcí tím, že a) inhibují spuštění mastocytů a bazofilů prostřednictvím kompetitivní inhibice s interakcí hladinu IgE v séru tím, že tlumí

IgE na úrovni B lymfocytů. Chemicky syntetizované mimotopové peptidy, jakožto strukturní napodobeniny epitopu anti-IgE protilátky, indukují imunitní reakci, která vede u hostitele k tvorbě protilátek podobných BSW17. Jelikož bylo ukázáno, že protilátka BSW17 není anafylaktogenní, že má inhibiční účinek na vazbu IgE/lgERI a na syntézu protilátky vyvolané proti vakcíně

IgE/lgERI, a b) snižují (downregulation) syntézu

IgE v B lymfocytech, založené na BSW17

mimotopovém peptidů mají podobné ochranné vlastnosti. Mošnou nevýhodou vakcíny založené na BSW17 mimotopovém peptidů může být důsledkem nutnosti navázat chemicky syntetizovaný peptid na nějaký nosičový protein, aby se zvýšila imunogenicita peptidů. Navíc strukturní flexibilita krátkých peptidů jim umožňuje zaujmout mnoho různých sterických konformací. Takže pouze frakce polyklonální anti-mimotopové imunitní odpovědi bude terapeuticky účinná zesítěním s humánním IgE.

Předkládaný vynález umožňuje eliminovat možné nevýhody, které jsou vlastní užití mimotopových peptidů. Předkládaný vynález je založen na protilátkách nebo fragmentech protilátek, které jsou anti-idiotypovými protilátkami, které interferují s vazbou IgE na jeho vysokoafinitní receptor, konkrétně např. rekombinantní anti-idiotypové protilátce k BSW17. Podle Jerneho teorie sítě (Jerne N. , Ann. Immunol. 125 C [1974] 373), samotné hypervariabilní úseky protilátky (Abl) mohou působit jako antigeny. Protilátky takto produkované jsou známy jako anti-idiotypové (anti-id) protilátky (Ab2), neboř se váží na idiotypový úsek první protilátky (obr. 3) . Tyto anti-id protilátky jsou namířeny proti vazebnému místu (paratopu) první protilátky (Abl) a tudíž představují vnitřní obraz (internal image) původního antigenu. Tudíž anti-id protilátka (Ab2), zvaná též protilátka vnitřního obrazu a označovaná Ab2 , je také schopna vyvolat tvorbu protilátek k jejich hypervariabilním úsekům. Tyto anti-anti-id protilátky (Ab3) strukturně napodobují paratop protilátky Abl a mají tudíž podobné biologické vlastnosti jako protilátka Abl. V případě systému hIgE/BSW17 představuje IgE původní antigen a BSW17 je protilátka Abl. Paratop anti-BSW17 idiotypové protilátky Ab2 tudíž představuje strukturní napodobeninu úseku hlgE (epitopu) rozpoznávaného BSW17. Strukturně je Ab2 paratop ekvivalentní chemicky syntetizovanému mimotopovému peptidů

BSW17 zmíněnému výše. Když se užije taková (rekombinantní) anti-BSW17 idiotypová protilátka jako vakcína, u vakcinovaného pacienta bude indukována imunitní odpověď typu BSW17 (Ab3). Stejně jako BSW17, tyto (polyklonální) Ab3 imunoglobulíny budou interferovat s vazbou mezi IgE a jeho vysokoafinitním receptorem, a tudíž budou působit jako anti-alergická agens. Na rozdíl od flexibilních syntetických mimotopových peptidů, je Ab2 paratop prezentován svému okolí ve strukturně definované konformaci. Tudíž imunitní reakce namířená proti definovanému hlgE epitopu bude více specifická. Kromě toho nejsou potřeba žádné heterologní imunogenní nosičové proteiny. Takže se zabrání případným nežádoucím vedlejším účinkům způsobovaných proteinovými nosiči jako je např. tetanový nebo difterický toxoid.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týká protilátek nebo fragmentů protilátek, které jsou anti-idiotypovými protilátkami k protilátkám jako je např. protilátka E25 (olizumab) nebo CGP56901, nebo výhodně BSW17, které interferují s vazbou Cs3 úseku v IgE s vysokoaf initním receptorem pro IgE, a jsou dále označovány jako mimolátky podle vynálezu. Pokud jde konkrétně o anti-idiotypové BSW17 protilátky, ty jsou označovány zkráceně jako BSW17-mimolátky.

Takže mimolátky (mimobodies) podle vynálezu jsou anti-idiotypové protilátky nebo fragmenty protilátek, které se specificky váží na epitop, který je paratopem anti-IgE protilátky, která rozpoznává místo na úseku Cs3 molekuly IgE vázající se na vysokoafinitni receptor pro IgE (FctRI) .

• ·· ·

Mimolátky podle vynálezu jsou v principu humánního původu, alespoň pokud jsou užívány u lidí. Výhodně jsou rekombínantní a výhodně jsou také monoklonální. Výhodně se jedná o fragmenty protilátek, které obsahují např.:

- oba těžké i lehké řetězce (např. Fab fragmenty) nebo jen lehké nebo těžké řetězce (např. dimery lehkého řetězce), výhodně dohromady s konstantním úsekem, např. jak je definován na obr. 4 (sekvence id. č. 35, 36, 37 a 38), přičemž konstantní úsek obsahuje i drobné sterické modifikace jako jsou např. allotypové varianty, např. v 1 až 5, typicky jen v 1, aminokyselinové pozici v konstantním úseku,

- jen jejich části, zejména alespoň úseky determinující specifitu, např. jak jsou definovány na obr. 5a až 5d (sekvence id. č. 2, 4, 6, 8), nebo jejich podčásti, zejména alespoň jejich hypervariabilní podčásti, jako jsou peptidy tvořené úsekem aminokyselin zahrnujícím alespoň jeden úsek CDR, např. obsahující alespoň jeden CDR, nebo výhodně dva, a nebo ještě výhodněji tři CDR podle obr. 5a, 5b, 5c nebo 5d (sekvence id. č. 2, 4, 6 a 8), případně dohromady s přilehlými rámcovými sekvencemi, např. do 10 aminokyselin na jednom nebo na obou koncích CDR.

Mimolátky podle vynálezu představují izolované a v podstatě purifikované protilátky nebo fragmenty protilátek připravené z přirozeně se vyskytujících anti-id anti-IgE protilátek. Zejména jsou zbaveny jiných protilátek. Termínem v podstatě čisté se rozumí čistota alespoň 60 % hmotnostních, výhodně 90 % a nejvýhodněji 99 % hmotnostních nebo více.

Předkládaný vynález se dále týká farmaceutických přípravků, zejména vakcín, které obsahují protilátky podle vynálezu, buďto jako jednotlivé molekuly nebo jako konjugáty, tj. chemicky konjugované s molekulou imunogenního nosiče, a je-li to potřeba, společně s adjuvans nebo dalšími konvenčními excipienty.

Další aspekt se týká mimolátek podle vynálezu pro použití jako léčiva, zejména jako vakcíny, a zvláště k léčení nemocí zprostředkovaných IgE.

Další aspekt vynálezu se týká protilátek, které interferují s vazbou úseku Ce3 IgE k vysokoafinitnímu receptoru IgE, jako je např. BSW17, pro identifikaci mimolátek podle vynálezu, a sice konvenčními postupy jako je např. technologie fágového displeje (phage display, exprese a prezentace proteinu prostřednictvím fága).

Další aspekt vynálezu se týká léčení nemocí zprostředkovaných IgE, zejména vakcinací, která spočívá v tom, že se podává terapeuticky účinné množství mimolátek podle vynálezu pacientovi, který takové léčení nebo vakcinací potřebuj e.

Dále se vynález týká použití mimolátek podle vynálezu pro výrobu léku k léčení nemocí zprostředkovaných IgE, zejména vakcíny.

Dále se vynález týká požití mimolátek podle vynálezu pro vyvolání tvorby polyklonálních nebo monoklonálních pro pasivní monoklonálních mimolátkám podle vynálezu pro pasivní imunizaci, a sice buďto podáváním mimolátek podle vynálezu vhodnému zvířeti kromě člověka a pak izolací a purifikací protilátek proti nim vyvolaných, nebo konvenční hybridomovou technologií, a použití těchto polyklonálních nebo monoklonálních protilátek jakkoliv získaných pomocí mimolátek podle vynálezu k léčení nemocí zprostředkovaných IgE pasivní imunizací.

protilátek proti nim polyklonálních nebo imunizaci, pripravu protilátek proti • · · · · · • · · • · · • · · · ·· »·

Předkládaný vynález se dále týká způsobu identifikace mimolátek podle vynálezu, který obsahuje kroky identifikace přirozeně se vyskytujících anti-idiotypových anti-IgE protilátek,

- izolace fragmentů těchto protilátek, a

- výběr jejich rekombinantních fragmentů, a sice vazbou na vhodnou monoklonální anti-IgE protilátku, jako je např. BSW17, kteréžto fragmenty interferují s vazbou úseku Cs3 IgE na vysokoafinitní receptor pro IgE.

Jakmile jsou jednou identifikovány a charakterizovány, mimolátky podle vynálezu mohou být připraveny konvenčními postupy, např. technikami rekombinantní DNA nebo i chemickou syntézou. Pro identifikaci anti-idiotypových protilátek vykazujících stejnou specifitu jako mimotopové peptidy zmiňované výše (tj. vybraný epitop na IgE) se může užít bakteriofágová displejová knihovna, která exprimuje Fab části celého repertoáru protilátek. Taková knihovna se zkonstruuje pomocí „poolu B lymfocytů získaných z tonsil pacienta pomocí imobilizované protilátky BSW17 použité jako cílová molekula pro vyhledávací biologický test („biopanning). Fágové částice exprimující lidské Fab se izolují a přednostně se vyberou takové, které specificky rozpoznávají BSW17. Takže tyto rekombinantní fragment Fab jsou mimolátky podle vynálezu představující anti-idiotypy proti hypervariabilním úsekům BSW17. Pokud se užijí jako vakcína u alergických pacientů, indukují imunitní reakci vedoucí k tvorbě protilátek podobných BSW17. Jelikož BSW17 není anafylaktogenní a má inhibiční účinek na IgE/IgERI vazbu a syntézu IgE v B lymfocytech, polyklonální protilátky vytvořené u pacientů proti BSW17 anti-idiotypové Fab vakcíně mají podobné vlastnosti. Imunitní reakce je velmi specifická a bezpečná, jelikož, na rozdíl od klasické vakcíny, zde nejsou ♦ · 9 99 9

9 ·

9 9 9 9 9 9 9 9 9 · · * ♦ · 9 · · • · · · ·· ···

99 999 9·99 ·· ··· přítomny proteinové fragmenty pocházející z IgE, které by mohly vyvolat u imunizovaných pacientů zesíúující protilátky, a vakcinační přípravek je navíc také bez nosičové molekuly.

Tyto BSW17-mimolátky jsou tedy rekombinantní protilátky nebo fragmenty protilátek obsahující variabilní domény (V-domény) a konstantní domény (C-domény) z lidského imunoglobulínu G. Dva různé klony (52 a 43), exprimující na povrchu různé mimolátkové fragmenty byly identifikovány biologickým vyhledávacím testem z fágových knihoven na imobilizovanou protilátku BSW17. Struktura mimolátky napodobující epitop BSW17 na lidském IgE obsahuje hypervariabilní úseky (CDR) a přilehlé rámcové úseky (FR) V-domény. Sekvence cDNA a aminokyselinová sekvence V-domén

těžkého a lehkého	řetězce	klonů	52	a 43 jsou uvedeny na
obr. 5a až 5d (sekvence id.	- v c. 1 az	8) .
Konstrukt	lehkého	řetězce	(L.	C.)2 klonu 52 sestává
z Fab-podobného	dimérního	fragmentu	lehkého řetězce. Úplná

struktura těchto BSW17-mimolátek je schematicky znázorněna na obr. 4A až 4C, přičemž se rozumí, že části konstantního úseku zahrnují i malé sterické modifikace jak jsou např. vyskytující se allotypické varianty zmíněné výše. Aminokyselinové sekvence všech úplných těžkých a lehkých řetězců jsou uvedeny na obr. 12a až 12d (sekvence id. č. 35 až 38) .

Mimolátky podle vynálezu jsou farmakologicky účinné. Jsou proto určeny pro použití jako léčiva, např. jako antigeny nebo vakcíny. Zatímco v podstatě nejsou schopné zprostředkovat necytolytické uvolnění histaminu, jsou dobře schopné vyvolat protilátky se silnou serologickou zkříženou reaktivitou s cílovými aminokyselinovými sekvencemi úseku Fc v IgE.

*· ·«

Počáteční dávka mimolátky podle vynálezu je např. přibližně 0,05 mg až přibližně 5 mg, výhodně přibližně 1 mg; podává se např. nasálně nebo subkutánně nebo intramuskulárně, přičemž se např. po 14 až 28 dnech podává stejná dávka jakožto podpůrná nebo tzv. booster dávka. Dávky do jisté míry závisejí na věku, hmotnosti a celkovém stavu pacienta a lze je podle potřeby upravovat.

Přímá vakcinace, zejména aktivní imunizace, se výhodně provádí pomocí rekombinantních peptidů (Fab fragment, lehký nebo těžký řetězec), které lze připravovat v různých hostitelských systémech, např. bakteriích nebo houbách nebo eukaryotických buňkách konvenčními metodami.

Výhodné je podávání volných rekombinantních mimolátek. Avšak je také dále možné zvýšit imunogenicitu imunogenu chemickým navázáním (konjugací) na imunogenní nosič. Termín imunogenní nosičový materiál zde označuje jakýkoliv materiál, který má schopnost nezávisle vyvolat u hostitele imunitní reakci, a který může být kovalentně navázán na polypeptid, buďto přímo vytvořením peptidové nebo esterové vazby mezi volnými karboxylovými skupinami, aminoskupinámi nebo hydroxylovými skupinami v polypeptidu a odpovídajícími skupinami imunogenního nosičového materiálu, alternativně prostřednictvím konvenčních bifunkčních spojovacích skupin. K příkladům takových nosičových materiálů (nosičů) patří albuminy ze séra zvířat, zvířecí thyreoglobuliny, zvířecí hemoglobiny. Zvířecí hemocyaniny (zejména hemocyanin z mořské přílipky, KLH), proteiny extrahované ze škrkavky (Ascaris), např. extrakty ze škrkavek podle publikací J. Immun. 111 [1973] 260-268, J. Immun. 122 [ 1979] 302-308, J. Immun. 98 [1967] 893-900 a Am. J. Physiol. 199 [1960] 575-578, nebo z nich purifikované produkty, polylysin, polyglutamová kyselina, kopolymery kyseliny lysinové a kyseliny glutamové, • · ··· ·

9 99 99 99 99

9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

99 999 9999 99 999 kopolymery obsahující lysin nebo ornitin apod. Nedávno byly připraveny vakcíny s diftérickým toxoidem jak např. CRM197 nebo tetanovým toxoidem jakožto nosičovým imunogenním metariálem (Lepow. M. L., et al. , J. Infectious Diseases 150 (1984] 402-406; a Coen Beuvery, E. et al. , Infection and

Immunity 40 [1983] 39-45), a tyto toxoidové nosičové materiály lze užít i pro vakcíny podle vynálezu. Místo chemicky detoxifikovaného difterického toxinu je výhodně užit rekombinantní mutovaný difterický toxin CRM197. V CRM197 je aminokyselinový zbytek glycin-52 nahrazen kyselinou glutamovou, což poskytuje netoxický produkt. CRM197 je dobře charakterizovaný netoxický nosičovy protein a je užíván v již registrovaném humánním vakcinačním přípravku. Také purifikovaný proteinový derivát tuberkulínu (PPD) může být použit při aktivní imunizaci, jelikož : (1) sám neindukuje odpověď T lymfocytů (tj . účinkem jde o T-lymfocytový hapten), a přitom se chová jako plně opracovaný antigen a je rozpoznáván T lymfocyty, (2) jde o jeden z nejúčinnějších haptenových nosičů při spojeném způsobu rozpoznávání, a (3) může být použit u lidí bez dalšího testování.

Jako vazebná činidla pro hapten-nosič mohou být užita taková činidla, která se obvykle užívají pro přípravu antigenů. Kovalentní navázání mimolátek podle vynálezu na imunogenní nosičový materiál se provede obvyklým způsobem. Tak např. pro přímé kovalentní navázání se mohou užít bis-N-sukcinimidylové deriváty, výhodně bis(sulfosukcinimidyl)suberát jakožto konjugační činidlo, nebo glutaraldehyd nebo karbodiimid, nejvýhodněji (dicyklohexyl)karbodiimid nebo l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimid.

Poměry haptenu, vazebného činidla hapten-nosič a nosiče mohou být vhodně stanoveny, ale je výhodné, když je nosič v množství (hmotnostním) 1 až 6 x, výhodně 1 až 5 x vyšším než

Ι· ·«Φ · φφ φφ je hapten, a vazebné činidlo hapten-nosič je v množství představujícím 5 až 10 násobek molárního ekvivalentu haptenu. Ve výše zmíněné konjugační reakci je nosič spojen s haptenem prostřednictvím vazebného činidla hapten-nosič, aby byl získán požadovaný antigen složený z komplexu peptid-nosič mimotopu podle vynálezu a nosiče.

Po ukončení reakce může být vzniklý imunogen izolován a purifíkován obvyklým způsobem, jako je např. dialýza, gelová filtrace nebo frakcionační precipitace.

Předkládaný vynález se v podstatě týká aktivní imunizace přímou vakcinací, avšak zahrnuje také pasivní imunizaci, j sou mimolátky kromě č1ověka, podle vynálezu podávány a protilátky proti nim purifikují, a poté jsou podány aby se vyvolal proces zmírňující

V takové vhodnému vyvolané situaci zvířeti, se izolují a pacientovi (tj . člověku), alergické symptomy.

Mimolátky podle vynálezu jsou určeny pro použití jako léky, zejména vakcíny, zvláště pro léčení nemocí zprostředkovaných IgE, jako jsou alergie, např. astma, atopická dermatitida, alergické formy eosinofilie, rhinitida chronická urtikárie (kopřivka) a různé alergie na potraviny.

Termínem léčení se v předkládané přihlášce míní jak skutečné léčebné použití tak i profylaktické použití léku. Příjemcem terapie je obvykle člověk, ale vynález je široce aplikovatelný v podstatě na jakéhokoliv savce, např. kočku nebo psa.

Následující publikace a dokumenty byly posuzovány jako nejbližší stav techniky při mezinárodním průzkumu předkládané přihlášky:

Dl: Progr. Allergy Clip. Immunol. (Proč. Int. Congress Allergol. Clin. Immunol., 16th) 4 [1997) 339-342;

·· 99«9 • ♦ 9 • 9 «

999 9999

D2: Int. Arch. Allergy Immunol. 118 (1999) 119-121;

D3: Tumor Biology 18 (1997) Suppl. 2, 59;

D4: Tanox WO 89/06138;

D5: Patent Abstracts of Japan 4 (1999) [C.A. 130 (1999)

138296k) [JP 11/000174].

Popis obrázků

Obr. 1: Interakce mezi IgE a jeho vysokoafinitním receptorem

Obr. 2: Vlastnosti monoklonální anti-hlgE protilátky BSW17.

Obr. 3: Anti-idiotypová sít:

hlgE epitop rozpoznávaný BSW17 a anti-idiotypový paratop jsou schematicky znázorněny černými tečkami. Černé kroužky označují homologní hypervariabilní úseky protilátky BSW17 (Abl) a polyklonální protilátky 3 (Ab3), indukovaných imunizací anti-idiotypovou protilátkou Ab2.

Obr. 4: Struktura tří rekombinantních BSW17 mimolátek:

A:	Anti-id-BSW17, klon	52	(SDS426)	; lehký řetězec: (L.C.)2
(sekvence id. č. 36),
B:	Anti-id-BSW17, klon	52	(SDS427)	; Fab: Fab (sekvence id.
c.	35 a 36),
C:	Anti-id-BSW17, klon	43	(SDS463)	; Fab: Fab (sekvence id.
č.	37 a 38).
Obr	5: Antí-BSW17	Fab	klony:	DNA sekvence humánního

imunoglobulínu prezentovaného fágem a příslušná dedukovaná aminokyselinová sekvence:

• · ·#· · • · « · · · · · • · · · · · · · · · • · · · ·· ·»· ·· ·· ··· ···· ·« ···

Hypervariabilní úseky (úseky určující komplementaritu, CDR Complementarity Determining Regions) jsou vyznačeny kurzívou.

Obr. 5a: klon 52; variabilní těžký řetězec (sekvence id. č. 1 a 2) (CDRl: sekvence id. č. 39 a 40; CDR2: sekvence id. č. 41 a 42; CDR3: sekvence id. č. 43 a 44);

Obr. 5b: klon 52; variabilní lehký řetězec (sekvence id. č. 3 a 4) (CDRl: sekvence id. č. 45 a 46; CDR2: sekvence id. č. 47 a 48; CDR3: sekvence id. č. 49 a 50);

Obr. 5c: klon 43; variabilní těžký řetězec (sekvence id. č. 5 a 6) (CDRl: sekvence id. č. 51 a 52; CDR2: sekvence id. č. 53 a 54; CDR3: sekvence id. č. 55 a 56);

Obr. 5d: klon 43; variabilní lehký řetězec (sekvence id. č. 7 a 8) (CDRl: sekvence id. č. 57 a 58; CDR2: sekvence id. č. 59 a 60; CDR3: sekvence id. č. 61 a 62).

Obr. 6: Homologie aminokyselinové sekvence mezi anti-BSW17 rFab a Ce3 doménou humánního IgE:

A: anti-id Fab, klon 52, těžký řetězec (hIGE,C 3: sekvence id. č. 25; klon 52: sekvence id. č. 26);

anti-id Fab, klon 52, lehký řetězec, přiřazení 1 (hlGE, Ce3:

sekvence id. č. 27; klon 52: sekvence id. č. 28); anti-id Fab, klon 52, lehký řetězec, přiřazení 2 (hlGE, Ce3:

sekvence id. č. 29; klon 52: sekvence id. č. 30).

B: anti-id Fab, klon 43, těžký řetězec (hlGE, Ce3 : sekvence id. č. 31; klon 43: sekvence id. č. 32);

anti-id Fab, klon 43, lehký řetězec (hlGE, Ce3 : sekvence id. č. 33; klon 43: sekvence id. č. 34).

Přiřazení aminokyselinových sekvencí: identické aminokyselinové zbytky jsou znázorněny v černých rámečcích, podobné aminokyseliny jsou v šedých rámečcích (podle Lipman a • « ·«· ·

Pearson). Poloha zbytků Fcs je znázorněna nad každým přiřazením. Příspěvek hypervariabilnich (CDR) a rámcových (FR) úseků rekombinantních fragmentů Fab je ukázán pod každým párem sekvencí.

Obr. 7: Kompetitivni vazba anti-id BSW17 rFab na IgEinstruované CHOa buňky s FITC-značenou BSW17.

Obr. 8: Vazba afinitně purifikovaných králičích anti-BSW17 mimolátkových imunoglobulínů na humánní ICE:

Stanovení hlgE/anti-mimolátkových komplexů sendvičovým ELISA testem (sandwich ELISA): hlgE a imunoafinitně purifkovaný preparát anti-BSW17 mimolátky byly smíchány v ekvimolárních koncentracích a inkubovány přes noc při 4°C. Inkubovaná směs byla pak přidána do jamek mikrotitrační destičky potažených monoklonální anti-hlgE protilátkou LE27 (1 μg/ml) jakožto vychytávací (capturing) protilátkou. Navázaný mimolátkový imunoglobulín IgG byl detekován pomocí kozího anti-králičího IgG konjugovaného s HRP:

= hIgE/SDS410 komplexy; o = hIgE/SDS411 komplexy.

Obr. 9: Anti-BSW17 mimolátková imunitní rekce u myší Balb/c:

= myš 1; · = myš 2; myš 3; - myš 4; ♦ = myš 5

A: anti-id-BSW17, 52; lehký řetězec (SDS426);

B: anti-id-BSW17, 52; Fab (SDS427);

C: anti-id-BSW17, 43; Fab (SDS463);

O.D. hodnoty představují odečty měření optické denzity korigované vzhledem k šumu pozadí danému vazbou na nepotažené destičky. Jsou uvedeny průměrné hodnoty ze dvou opakování. Rozptyl byl obecně menší než 0,05 O.D.

·· 9 99 ·

9 99 99 99 99

9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

99 999 9999 99 999

Obr. 10: Inhibice vazby HlgE/Fc RI imunoafinitně purifikovanými anti-mimolátkovými protilátkami:

A: = BSW17, · = anti-klon 52; lehký řetězec (SDS41O),

Δ = anti-klon 52; Fab (SDS411) , = anti-klon 52; lehký řetězec (po průchodu kolonou)

B: = BSW17, •=anti-klon 43 Fab (SDS476) .

Obr. 11: Profily PCA skóre skupin makaků rhesus (n = 2), imunizovaných různými preparáty mimolátek:

A: Imunogen: anti-id-BSW17,52; lehký řetězec (SDS426);

B: Imunogen: anti-id-BSW17,52; Fab (SDS427);

C: Imunogen: anti-id-BSW17,43; Fab (SDS463) .

Pasivní kutánní anafylaktická reakce (PCA) na kůži makaků rhesus v různých časových okamžicích po imunizaci. Hodnoty PCA skóre představují PCA intenzity vypočtené z plochy pod křivkou (AUC), získanou vynesením průměrů modrých skvrn na kůži proti koncentraci injikovaného IgE (JW8). Uvedená skóre jsou průměrné hodnoty pro každou skupinu dvou opic imunizovaných stejným protilátkovým preparátem, vypočtené z hodnot pro jednotlivé opice uvedených v tabulce 4. Variabilita je znázorněna jako úsečky představující střední chybu. Okamžiky podpůrných boosting injekcí jsou uvedeny pod osou x.

Obr. 12: Úplné aminokyselinové sekvence těžkého a lehkého řetězce tří rekombinantních BSW17-mimolátek:

Obr. 12a: Anti-id-BSW17, klon 52: variabilní a první konstantní doména těžkého řetězce (sekvence id. č. 35);

Obr. 12b: Anti-id-BSW17, klon 52: variabilní a konstantní doména lehkého řetězce kapa (sekvence id. č. 36) ;

Obr. 12c: Anti-id-BSW17, klon 43: variabilní a první konstantní doména těžkého řetězce (sekvence id. č. 37);

©· ····

• · * · · · • · · · • · © · © • · © © • ···· ·© «· ©

Obr. 12d: Anti-id-BSW17, klon 43: variabilní a konstantní doména lehkého řetězce lambda (sekvence id. č. 38).

Mimolátka (L.C.)₂ klonu 52 obsahuje lehké řetězce podle obr. 12b (sekvence id. č. 36) vázané disulfidickými můstky, jak je ukázáno na obr. 4A.

Mimolátka Fab klonu 52 obsahuje lehký řetězec podle obr. 12b (sekvence id. č. 36) a těžký řetězec podle obr. 12a (sekvence id. č. 35), vázané disulf idickými můstky, jak je ukázáno na obr. 4B.

Mimolátka Fab klonu 43 obsahuje lehký řetězec podle obr. 12d (sekvence id. č. 38) a těžký řetězec podle obr. 12c (sekvence id. č. 37), vázané disulfidickými můstky, jak je ukázáno na obr. 4C.

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady podrobněji ilustrují předkládaný vynález avšak nijak vynález neomezují.

Teplota je uváděna ve stupních Celsia.

V příkladech se užívají následující zkratky:

anti-id = anti-idiotypový

ABTS = [2,2¹-azinodi(3-ethylbenzthiazolin)sulfonát]

BSA = hovězí sérový albumin

BSW17 = myší monoklonální anti-humánní IgE protilátka specifická k Cs3

CDR = úsek určující komplementaritu

Cs3 = třetí doména konstantního úseku těžkého řetězce IgE C£4 = čtvrtá doména konstantního úseku těžkého řetězce IgE »··· • · 4 * * · · · • * · · · #4444 ···· 4 » < 4 · • 4 ·Τ »44 4444 44 4··

CeE = mimotopový peptid napodobující Ce3 epitopový úsek BSW17 CAM = mimotopový peptid napodobující Ce4 epitopový úsek BSW17 cfu = jednotky vytvářející kolonie (colony-forming units) ELISA = test s enzymem vázaným na imunosorbent (enzyme linked immunosorbent assay)

Fab = protilátkový fragment postrádající konstantní úseky 2 a 3 těžkého řetězce

FceRI; IgERI = vysokoafinitní receptor pro IgE

FcERIa = alfa řetězec vysokoafinitního receptoru pro IgE FCS = fetální telecí sérum FR = rámcový úsek

FITC - fluoresceinisothiokyanát-konjugovaná HRP = peroxidáza z křenu

HSA = humánní sérový albumin (h)IgE = (humánní) imunoglobulín E mAb = monoklonální protilátka

MNC = mononukleární buňky (lymfocyty)

NIP = 3-nitro-4-hydroxyjodfenyloctová kyselina

p.c. = polyklonální

Phab = fág prezentující Fab fragmenty (tj . bakteriofág exprimující Fab)

PBS = fosfátem pufrovaný solný roztok

PCA = pasivní kutánní anafylaxe

PWM = mitogen z líčidla amerického (Phytolacca americana) r = rekombinantní

RT = teplota místnosti

SPR = povrchová plasmonová resonance

Příklad 1

Konstrukce fágové knihovny pro techniku phage display

a) Zdroj lymfocytů

Dva dospělí dárci mužského pohlaví poskytli materiál pro přípravu mononukleárních lymfocytů (MNC) z periferní krve. První dospělý muž byl atopický dárce, který měl klinické symptomy alergie, byl stimulován intramuskulární injekcí 0,5 ml tetanového toxoidu adsorbovaného na oxid hlintý (Te Anatoxal Bern, Swiss Sérum and Vaccine Institute, Bern, Switzerland). MNC byly izolovány po 7 dnech užitím centrifugace v gradientu Ficollu (Lymphoprep, Pharmacia, Milwaukee, WI, USA) a pak kultivovány 3 dny v médiu RPMI-1640 (Seromed, Basel, Switzerland) obsahujícím 10³ U/ml IL-2 (Sigma, St-Louis, MO, USA), 50 g/ml buněk Pansorbin (Staphylococcus aureus Cowan kmen 1, Calbiochem, La Jolla, CA, USA) a tetanový toxoid naředěný 1:1000 v médiu RPMI-1640.

Z těchto buněk pak byla připravena celková RNA metodou užívající směs fenol-chloroformu a guanidiumisothiokyanátu (Chomczynski, P. and Sacci, N. , Anal. Biochem. 162 [1987]

156) .

Druhý dospělý muž byl hyperimunní Rhesus D dárce, a dostal i.v. podpůrnou injekci 2 ml konzervovaných červených krvinek ze známého mužského dárce s krevní skupinou 0 RhD+. MNC byly izolovány centrifugací na gradientu Ficollu 18 dnů po podpůrné injekci. Buňky byly nejdříve kultivovány 3 dny v médiu RPMI-1640 obsahujícím 10³ U/ml IL-2 a 10 pg/ml mitogenu z líčidla amerického (Phytolacca americana] (PWM; Sigma L9379, Buchs, Switzerland) a pak byla extrahována RNA.

Vzorky humánních tonsil (mandlí) byly získány od tří dětských pacientů po tonsilektomii. Tonsily byly macerovány

v médiu RPMI-1640 ve sterilních Petriho miskách a pak byly nařezány na malé kousky. Tkáně, buňky i médium byly přeneseny do sterilních zkumavek, které byly ponechány, aby se usadil buněčný debris, a pak byly ze supernatantu izolovány MNC užitím centrifugace na gradientu Ficollu. B lymfocyty byly selektovány inkubací MNC s paramagnetickými perličkami potaženými CD19 a RNA z nich byla připravena metodou užívající fenol-chloroform a guanidiumisothiokyanát, která byla citována již výše.

Vektor pComb3 použitý pro klonování řetězců pro všechny mimolátky byl získán z výzkumného ústavu Scripps Research Institute, La Jolla, CA, USA (viz Barbas III, C.F. a Lerner, R.A., Companion Methods Enzymol. 2 [1991] 119) . Kmen Escherichia coli XLl-Blue použitý k transformaci vektoru pComb3 a pomocného fágu VCSM13 byl získán od firmy Stratacyte (La Jolla, CA, USA).

b) Konstrukce bakteriofágových knihoven

Byly zkonstruovány tři samostatné knihovny: první nazvaná

BS byla z MNC izolovaných z prvního atopického mužského dárce, druhá nazvaná LD2 byla z MNC odebraných z druhého mužského dárce v den +18 po podpůrné i.v. injekci a třetí nazvaná CT byla z populace obohacené o B lymfocyty z MNC izolovaných z tonsil odebraných dětským pacientům.' Celková RNA byla ze všech těchto buněk připravena metodou užívající fenol, chloroform a guanidiumisothiokyanát. Z této celkové RNA, bylo užito 10 pg pro přípravu cDNA užitím oligo(dT) primeru (400 ng) a reverzní transkripce s M-MuLV reverzní transkriptázou postupem podle pokynů výrobce enzymu (Boehringer Mannheim, Germany). PCR amplifíkace byla provedena postupem, který popsali Vogel, M. et al. , E.J. of Immunol. 24 (1994) 1200. Stručně shrnuto, 100 μΐ PCR reakčního média

obsahujícího Perkin-Elmer pufr s 10 mM MgCl₂, 5 μΐ cDNA, 150 ng každého z vhodných 5'- a 3'-primerů, směs všech čtyřech dNTP, každý 200μΜ a 2 U/ml Taq polymerázy (Perkin Elmer, NJ, USA) . PCR amplifikace těžkého a lehkého řetězce molekuly Fab byly provedeny samostatně se sadami primerú od firmy Stratacyte (detaily jsou uvedeny dále). Pro těžký řetězec bylo užito šest upstream primerů, které hybridizovaly s každou ze šesti rodin VH genů, zatímco pro lehké řetězce byl užit jeden primer pro kapa a jeden primer pro lambda řetězec. Downstream primery byly konstruovány tak, aby souhlasily s kloubovým úsekem konstantních domén γΐ a γ3 těžkého řetězce. Downstream primery pro lehké řetězce souhlasily s 3¹-koncem konstantních domén kapa a lambda řetězce. PCR produkty těžkých a lehkých řetězců byly sloučeny odděleně, purifikovány na gelu a naštěpeny restrikčními enzymy Xhol/Spel a Sací/ Xbal (Boehringer Mannheim, Germany). Po naštěpení byly PCR produkty extrahovány jedenkrát směsí fenol : chloroform : isoamylalkohol a pak purifikovány vyříznutím z gelu. Inzerce Xhol/Spel fragmentu Fd, následná ligace lehkého řetězce naštěpeného Sacl/Xbal do vektoru pComb3, transformace do buněk XLl-Blue a pak produkce fága byly provedeny postupy které popsali Barbas III, C.F. a Lerner, R.A., Companion Methods Enzymol. 2 [1991] 119. Po transformaci buněk E. coli XLl-Blue byly odebrány vzorky a titrovány na miskách, aby se stanovila velikost knihovny. Výsledky ukázaly expresní knihovny velikosti 1 x 10⁷, 7,7 x 10⁶ a 3 x 10⁶ cfu (kolonie tvořících jednotek, colony forming units) pro BS, LD2 a CT, v uvedeném pořadí.

• · · *

c) PCR Primery

VHI 5'-CAC TCC CAG GTG CAG	CTG
id. č. 9) ;
VHII 51-GTC	CTG TCC	CAG	GTC
(sekvence id.	č. 10);
VHIII 5'-GTC	CAG GTG	GAG	GTG
(sekvence id.	č. 11) ;
VHIV 5'-GTC	CTG TCC	CAG	GTG
(sekvence id.	č. 12);
VHV 5'-GTC	TGT GCC	GAG	GTG
(sekvence id.	č. 13) ;
VHVI 5'-GTC	CTG TCA	CAG	GTA
(sekvence id.	č. eq.id.	no. 14);

CTC GAG TCT GG-3'	(sekvence
AAC	TTA	CTC	GAG	TCT	GG-3 '
CAG	CTG	CTC	GAG	TCT	GG-3 '
CAG	CTG	CTC	GAG	TCG	GG-3 '
CAG	CTG	CTC	GAG	TCT	GG-3 '
CAG	CTG	CTC	GAG	TCA	GG-3 '

CHI(yl) 5' -AGC ATC ACT AGT ACA AGA TTT GGG CTC-3 ' (sekvence id. č. 15);

VL(k) 5'- GT GCC AGA TGT GAG CTC GTG ATG ACC CAG TCT CCA-3 ' (sekvence id. č. 16);

CL (k) 5' - T CCT TCT AGA TTA CTA ACA CTC TCC CCT GTT GAA GCT

CTT TGT GAC GGG CGA ACT C-3' (sekvence id. č. 17);

VL(X) 5'- C TGC ACA GGG TCC TGG GCC GAG CTC GTG GTG ACT CA-3 ' (sekvence id. č. 18);

CL (λ) 5'- G CAT TCT AGA CTA TTA TGA ACA TTC TGT AGG GGC-3 ' (sekvence id. č. 19).

·«·

Příklad 2

Selekce rekombinantnich BSW17-specifických protilátkových fragmentů (BSW-17-mimolátek) z fágových knihoven

Selekce BSW17-specifických fágů byla provedena ve čtyřech cyklech vyhledávání (testů). Každý cyklus obsahoval dvě tzv. pre-absorpce na anti-IgE mAb Le27 před vlastní absorpcí na anti-IgE mAb BSW17. Preabsorpce byla provedena následovně: dvě imunozkumavky (Maxisorp, Nunc) byly potaženy pomocí 4 ml Le27 (2 0 gg/ml) inkubací ve 4° přes noc a pak blokovány hodiny při 37° užitím 4 ml PBS/2% odstředěné mléko. První zkumavka byla inkubována na naklápěcím stolku při RT po

0 minut se 4 ml blokovacího roztoku obsahujícího 2 x 10¹² cfu každé z fágových knihoven (BS, LD2 a CT) . Fágy pak byly přeneseny do druhé zkumavky a celý proces byl ještě jednou opakován. Po druhé preabsorpci byly přidány non-Le27 specifické fágy do zkumavky potažené užitím 4 ml BSW17 (20 pg/ml) a blokované pomocí PBS/2% odstředěné mléko, jak bylo popsáno již výše. Po 2 hodinové inkubaci na naklápěcím stolku při RT byla zkumavka propláchnuta postupně 10 x roztokem PBS/0,1% Tween a poté 10 x jen PBS. Zachycené fágy byly eluovány postupně nejdříve 500 μΐ 0,1 M triethylaminem a pak po třech opláchnutích PBS, 500 μΐ 0,1Μ HCI upravené na pH 2,2 glycinem s 1 mg/ml BSA. Každý eluční krok trval 10 minut při teplotě místnosti a eluovaná fágy byly neutralizovány 250 μΐ 1M Tris.Cl, pH 7,4 a 30 μΐ 2 M Tris-báze. Takto selektované fágy byly amplifikovány užitím buněk E. coli XLl-Blue postupem, který popsali Barbas a Lerner, 1991 (cit. výše) před tím, než byly použity ve třech dalších cyklech vyhledávání. Po

• · · ·· · · ·· ···«*·· • · · « * • · · · · <

• · · · · · «· ·· ©······ každém cyklu vyhledávání byl určen titr eluovaného fágu stanovením cfu (viz tabulka 2).

Tabulka 2

Obohacení BSW17 specifických fágů exprimujících Fab v postupných cyklech vyhledávání

Cyklus vyhledávání	Množství eluovaného fága (cfu)
1	3 x 10=
2	2 x 104
3	5 x 105
4	5 x 107

Pro každý cyklus vychytávání (panning) bylo 6 x 10¹² fágových částic preabsorbováno dvakrát ve zkumavkách potažených 20 pg/ml Le27 a pak inkubováno ve zkumavce potažené 20 pg/ml BSW17

Příklad 3

Nukleotidová sekvence rekombinantních BSW17-mimolátek

Plazmiová DNA byla připravena z fágových klonů užitím soupravy Nucleotrap (Machery-Nagel, Diiren, Německo) a její sekvencování byloprovedeno pomocí automatického zařízení ABI 373A užitím soupravy pro dideoxy-sekvencování PRISM Ready Reactin DyeDeoxy Terminátor Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Německo).

Použité primery pro sekvencování těžkých řetězců byly následuj ící:

CHyl (5'-CGCTGTGCCCCCAGAGGT-3') (sekvence id. č. 20) a ······ · ·♦ ·· • · · ···· ♦ · « • · a a · · · ···· · · φφ a · aa ······♦ aa pCH (5'-GGCCGCAAATTCTATTTCAAGG-3') (sekvence id. č. 21).

Pro získání sekvencí lehkých řetězců byly použity následující primery:

CX (5'-GAGACACACCAGTGTGGC-3') (sekvence id. č. 22),

Ck (5'-CACAACAGAGGCAGTTCC-3') (sekvence id. č. 23) a pCL (5'-CTAAACTAGCTAGTCGCC-3') (sekvence id. č. 24).

Primery byly syntetizovány firmou Microsynth (Balgach, Švýcarsko). Ze sekvencí DNA pro různé vybrané fágové byly dedukovány dvě odlišné aminokyselinové sekvence pro lehký a těžký řetězec BSW17-specifické rekombinantní (klon 52 a klon 43). Sekvence a jejich alokace hypervariabilních úseků (CDR) a rámcových sekvencí jsou ukázány na obr. 5a až 5d (sekvence id. č. 1 až 8) .

Srovnání aminokyselinových sekvencí fragmentů BSW17specifických rekombinantních protilátek exprimovaných ve fágových klonech 52 a 43 s humánním IgE odhalilo homologie v úsecích humánní domény Ce3, která se účastní vazby k vysokoafinitnímu receptoru (viz obr. 6)(sekvence id. č.25 až 34) . Takže paratopy vystavené rekombinantními protilátkovými fragmenty napodobují definované struktury přítomné v humánním IgE (mimolátky). Protilátky generované v alergických pacientech po vakcinaci těmito rekombinantními mimolátkami tudíž rozpoznávají humánní IgE a zabraňuj alergické reakci tím, že inhibují vazbu IgE/IgERI.

Příklad 4

Příprava a purifikace rekombinantních BSW17-mimolátek

Byly připraveny rozpustné mimolátky pocházející z klonů 43 a 52 (obr. 5) (viz sekvence id. č. 1 až 8) . Aby bylo možné ······ * «· ·· β · · ··«« · » · « · « · · 9 · «··· · 9 9 9 ·· · ··· ···· 99 9 produkovat rozpustné fragmenty Fab, byla z fágu odstraněna sekvence glll kódující plil protein fágového ocásku a byla nahrazena hexahistidinovou značkou (tag) pro usnadnění purifikace Fab fragmentů afinitní chromatografií s Ni²⁺-chelátem.

Fagemidová DNA byl připravena užitím soupravy Nucleotrap (Macherey-Nagel, Diiren, Německo) a naštěpena restrikčními enzymy Spěl a Nhel. DNA fragment velikosti 4,7 kb postrádající úsek glll byl ošetřen alkalickou fosfatázou a purifikován elektroforézou na agarózovém gelu. Linearizovaná DNA byla ligována s DNA fragmentem kódujícím šest histidinů s 5'- a 3'-konci kompatibilními s restrikčními místy Spěl a Nhel, v uvedeném pořadí. Po ligaci byla DNA transformována do buněk E. coli XLl-Blue a pak byly selektovány individuální klony produkující rozpustné mimolátky. Jeden z těchto klonů byl vybrán pro purifikaci ve velkém měřítku a byl kultivován vil SB (Super Broth) obsahujícího 50 μg/ml karbenicillinu při 37° C až do OD 1,0 při 600 nm. Kultura pak byla indukována lmM isopropyl-P-D-thiogalaktopyranosidem (IPTG) (Biofinex, Praroman, Švýcarsko) a pak kultivována další 4 hodiny při 37° C. Bakterie byly peletovány stočením 20 minut při 6000 rpm a 4° C, resuspendovány v 30 ml sonikačního pufru (0,1 M NaP0₄, 8M močovina, pH 8,0) a pak sonikovány na ledu. Nerozpustné složky byly odstraněny centrifugací při 15 000 rpm po 3 0 minut při 4° Ca supernatant obsahující Fab byl purifikován na 1 ml nikl-nitriloacetátové koloně. Kolona byla promyta sonikačním pufrem, aby se odstranily kontaminace a pak následovaly dva eluční kroky sonikačním pufrem při pH 5,1 a 4,9. Frakce byly monitorovány měřením OD při 280 nm a alikvoty byly analyzovány na SDS-PAGE (12% neredukující) pro potvrzení čistoty a identity mimolátek. Frakce obsahující mimolátky byly pak sloučeny, koncentrovány a dialyzovány proti PBS.

····»* · *· ··

9 4 999· φ 9 9 : : ·. . : .· . : j • ••4 · » · * • · 9 9 99 9 9 » 9 9 · · ·

Čistota výsledného mimolátkového preparátu (viz specifikace na obr. 4 a 12) (sekvence id. č. 35, 36, 37 a 38) byla hodnocena testováním vzorku na SDS-PAGE. Proteinové pásy byly detekovány barvením Coomassie modří. Koncentrace byla určena srovnáním Coomassie modří obarvených pásů mimolátek s pásy standardu obsahujícího známé množství standradního proteinu (BSA) a také užitím spektrofotometrie. Tyto mimolátkové preparáty pak byly použity pro test kompetitivní vazby a pro imunizaci králíků.

Příklad 5

Inhibice BSW17-zprostředkovaného vytěsnění na vázaného IgE rekombinantními BSW17-mimolátkami receptor

BSW17 rozpoznává vysokoafinitní receptor anti-id BSW17 rFab a vytěsňuje IgE vázaný na jeho

Aby bylo možné stanovit, zda jsou fragmenty schopné inhíbovat tuto vytěsňovací reakci, byl proveden kompetitivní vazebný test užitím IgE navázaného na IgERI na buněčném povrchu. Pro tento test byla užita rekombinantní linie buněk vaječníkú čínského křečka (CHO), trvale transformovaná DNA kódující a-řetězec humáního IgERI (buněčná linie CHOa, Blank, U. et al. , Eur. J. Biol. Chem. 266 (1991) 2639). Série testovaných vzorků obsahujících 5 χ 10⁴ CHOa buněk byla inkubována ve FACS pufru 0,02% NaN₃) se 48 ng IgE Bil hybridomu et al., Immunol. Lett. 46 (1995) 49-57) minut při teplotě místnosti. Po opláchnutí jedenkrát ve

FACS pufru byl každý vzorek inkubován 15 minut při teplotě místnosti s přeformovanými komplexy BSW17 konjugované s fluoresceinisothiokyanátem (BSW17-FITC) a zvyšujícím se (PBS, 0,3% BSA, (Ziircher, A. W.

množstvím anti-id BSW17 rFab. Komplexy byly připraveny následujícím způsobem:

μΐ BSW17-FITC v koncentraci 1,3 se inkubovalo s různým množstvím anti-id-BSW17 rFab (40 nM; 200 nM; 1 μΜ; 4 μΜ; a 40 μΜ) po 30 minut při teplotě místnosti. Kontrolní vzorky obsahující pouze buňky CHOa byly inkubovány po 15 minut při teplotě místnosti s BSW17-FITC, aby se stanovila nespecifická vazba. Buňky CHOa byly opláchnuty jedenkrát FACS pufrem a po přidání 100 μΐ FACS pufru byly buňky analyzovány průtokovým cytometrem FACSCalibur (Becton Dickinson) vybaveným argonovým laserem nastaveným na 488 nm. Meze (gates) byly nastaveny v čelním a postranním vynesení na okolí monomerních buněk a fluorescence byla kvantifikována jako průměrná fluorescence kanálu (mcf) . Procento pozitivních buněk bylo vypočteno jako procento BSW17 navázané na buňky CHOa. Jak je vidět na obr. 7, vazba BSW17 na buňky CHOa se snižuje s rostoucí koncentrací fragmentů anti-id-BSW17 Fab, což ukazuje, že oba testované klony anti-id BSW17 Fab byly schopny inhibovat vazbu BSW17 na IgE.

Příklad 6

Imunizace králíků rekombinantními BSW17-mimolátkami

Tento příklad ukazuje, že imunizace jak anti-BSW17 rFab (skládajícího se z těžkého a lehkého řetězce klonu 52, jak je ukázáno na obr. 4B společně s obr. 12a a 12b) (sekvence id. č. 35 a 36), tak rekombinantní mimolátkou sestávající pouze z lehkého řetězce (viz obr. 4A společně s obr. 12b) (sekvence id. č. 36) indukuje u králíků humorální imunitní odpověď

Φ · ··♦♦ φ · · φ · « « · · φ · ««· • · ♦ φ · φ * «φφφ φ · · ·· · » ····*·· ·« zkříženě reagující s humánním IgE. Dvě samice králíka New Zealand white byly primárně imunizovány subkutánní dávkou 300 pg/ml anti-BSW17 rFab nebo fragmentů lehkého řetězce klonu 52, v emulzi 1:1 s Freundovým kompletním adjuvans a pak podpořeny (boost) celkem třikrát vždy po dvou týdnech stejnou dávkou mimolátky emulzifikované 1 : 1 Freundovým nekompletním adjuvans. Séra byly odebrána 0. den (před vykrvácením) a zvířata byla vykrvácena 7 dní po poslední podpůrné inj ekc i.

Králičí imunní séra byla purifikována imunoafinitní chromatografií užitím humánní IgE (SUS-11 IgE) navázané chemickým zesítěním na kolonu Sepharose 4B. Tímto postupem byla z celkového imunoglobulinu izolována anti-hlgE frakce, což dovolilo přesně charakterizovat terapeuticky relevantní imunitní odpověď vzhledem k titru a afinitě protilátek.

Imunoafinitní purifikace anti-mimolátkových protilátek, které zkříženě reagují s humánním IgE obsahovala dva kroky. V prvním kroku byla izolována frakce IgG z králičího antiséra amoniumsulfátovou precipitací, ve druhém kroku byly hlgEspecifické anti-BSW17 mimolátkové protilátky navázány na humánní IgE (SUS-11 IgE), kovalentně navázány na CH-Sepharose 4B, a pak eluovány, dialyzovány a koncentrovány.

Na koncentraci závislé vytváření komplexů imunoafinitně purifikováných imunoglobulínů s humánním IgE v roztoku bylo potvrzeno v ELISA: SUS-11 IgE byl inkubován s ekvimolárním množstvím anti-mimolátkových imunoglobulínů přes noc při 4° C. Komplexy vytvořené v roztoku byly přidány do jamek mikrotitrační destičky potažené monoklonální anti-hlgE protilátkou LE27 jakožto vychytávací protilátkou. Navázaný anti-mimolátkový IgG byl detekován polyklonálním anti-králičím IgG konjugovaným s křenovou peroxidázou (IgG-HRP). Výsledky jsou ukázány na obr. 8.

Příklad 7

Imunizace myší rekombinantními BSW17-mimolátkami

Rekombinantní mimolátky získané z klonů 43 a 52 mohou indukovat anti-mimolátkové protilátky. Imunizace byla provedena na myších. Skupiny pěti myší Balb/c byly injikovány subktánně dávkou 5 μ9/ηψ§ rekombinantní BSW17 mimolátky

připravené expresí v baktériích	E. coli	a	purifikované
nikl-afinitní chromatografií. Jako	adj uvans	byl	užit hydroxid
hlinitý.
Skupina 1 byla imunizována	šarží SDS426	anti-Id-

BSW17.52; lehký řetězec.

Skupina 2	byla	imunizována	šarží	SDS427	= anti-id-
BSW17.52; Fab.
Skupina 3	byla	imunizována	šarží	SDS463	= anti-Id-

BSW17.43; Fab.

21. a 41. Den po primární imunizaci byly aplikovány dvě podpůrné (booster) injekce (5 μ9/π^ζ). Vzorky krve pak byly odebrány v dny 0, 20, 28, 35, 42, 49 a 56 po primární imunizaci. Bylo připraveno sérum a testováno na přítomnost anti-mimolátkových protilátek v ELISA testu.

Jamky mikrotitračních destiček byly potaženy 1 μ9/πι1 polyklonálního humánního IgG a inkubovány s 1:50 ředěním myšího séra připraveného z krevních vzorků odebraných v uvedených časových okamžicích po primární imunizaci. Navázané anti-mimolátkové protilátky (ahlgG, namířené proti úsekům rámce a konstantní domény humánní protilátky) byly detekovány druhou inkubací s kozím anti-myším IgG konjugovaným s křenovou peroxidázou (gamlgG-HRP). Barevná reakce byla vyvinuta pomocí chromogenního substrátu ABTS.

Všechny myši tvořily anti-mimolátkové protilátky po druhé podpůrné imunizaci všemi preparáty rekombinantních mimolátek (Obr. 9).

Příklad 8

Imunoglobulíny tvořené v králících proti rekombinantním BSW17-mimolátkám váží humánní IgE s vysokou afinitou.

Vakcinace rekombinantními BSW17-mimolátkami indukuje humorální imunitní odpověď s vysokou afinitou k humánnímu IgE. Kinetické parametry reprezentativní pro vazbu imunoafinitně purifikovaných anti-mimolátkových imunoglobulínu k humánnímu IgE byly analyzovány povrchovou plasmonovou resonancí (SPR).

SPR měření byla provedena na zařízení BIAcore (Biacore, Uppsala, Sweden). Specifické vazebné povrchy byly připraveny navázáním humánního IgE nebo myšího IgG3 na CMS senzorový čip užitím aminové kondenzace podle instrukcí výrobce. Tímto postupem byly biomolekuly navázány prostřednictvím primárních aminoskupin na povrch karboxymethylováného dextranu senzorového čipu. 10 pmol humánního myelomového IgE nebo SUS-11 IgE bylo navázáno na odlišné průtokové buňky čipu. Myší monoklonální protilátka IgG₃, ABL 364 (ATCC HB9324) byla imobilizována na odlišných dráhách téhož senzorového čipu. ABL 364 byla použita jako reference pro stanovení vazby anti-mimolátkových protilátek k non-hlgE imunoglobulinovým strukturám a pro korekci možných změn refraktivního indexu způsobených změnami pufru. Hustoty navázání byly - 13000 RU.

Všechny biomolekulární interakce byly měřeny pomocí zařízení BIAcore při teplotě 25° C, užitím pufru HBS ······ · · · · · • « « ♦ · · · 9 9 9

9 9 9 · · · • · · · 9 9 9 9 9

99 999 9999 99 999 (lOmM Hepes, pH = 7,4, 150 mM NaCl, 3,4 mM EDTA, a 0,005% (objem.) surfaktant P-20) jakožto kontinuálního průtokového pufru. Koncentrační rozsah každého analytu procházejícího přes povrch senzorového čipu pro kinetickou analýzu byl od 33 nM do 499 nM. Průtok byl 5 μΐ/min. Analyty byly injikovány na 1200 s, a pak následoval pufr HBS na přibližně 1800 s pro monitorování disociace navázaného analytu. Čip byl regenerován 12Os pulzem lOmM HCl. Nespecifická vazba byla monitorována průchodem analytu přes kontrolní dráhu s ABL 364, která pak před kinetickou analýzou byla odečtena od specifické vazby.

Vazebné křivky generované v měření SPR byly vyhodnoceny pomocí programového balíku BIAevaluation 3.0. Pro relativní srovnání interakcí anti-mimolátka/IgE byl užit jednofázový model. Rychlostní konstanta asociace k_a, rychlostní konstanta disociace k_d a rovnovážná disociační konstanta K_D = 1/K_A (K_A = afinitní konstanta) byly vypočteny pro každou křivku a jsou přehledně uvedeny v tabulce 3.

Z výsledků je vidět, že vysokoafinitní protilátky proti humánnímu IgE mohou být indukovány u králíka imunizovaného rekombinantními BSW17-mimolátkami (K_D jsou v řádu nanomolů).

Fab pocházející z klonu 43 (SDS463, obr. 4C, anti-idBSW17.43) měl schopnost indukovat imunitní reakci s velmi vysokou afinitou k humánnímu IgE (K_D < 1 nM) .

Takže užitím monoklonální anti-idiotypové protilátky bylo možné indukovat silnou polyklonální reakci proti IgE, což bylo zamýšlenou vakcinační strategií.

• 9 • · 9 9 9«

9 · • 99

9

Tabulka 3

Kinetické konstanty (SPR/BIAcore) interakce mezi polyklonálním (p.c.) králičím anti-mimolátkovým IgG a hlgE

Myelom. IgE

SUS-11 IgE

BSW17	Ka	(1/ms)	n.d.				0,8	+	0,3 x	10
	Kd	(1/s)	n.d.				4,2	+	0,9 X	10'6
	KD	(nM)	n.d.				0,53	±	0,33
a(anti-id-BSW17.52;	Ka	(1/ms)	2,1	+	0,8	X	TO1 2?2“	+	0,9 x	γθ?
lehký řetězec)1’
(SDS410)	Ka	(1/s)	2,8	+	0,5	X	104 2,3	±	0,2 x	10'4
	KD	(nM)	13,3	±	: 6,	8	10,7	±	3,3
a(anti-id-BSW17.52;	Ka	(1/ms)	4,6	+	2,7	X	10 2,5	+	1,0 x	10
Fab) 2)
(SDS 411)	Kd	(1/s)	2,3	+	0,3	X	10'4 1,5	+	0,1 x	104
	KD	(nM)	5,0	+	2,2		6,0	+	1,8

a(anti-id-BSW17. 43; K^ (l/ms) n.d.

Fab)³¹

(SDS476)	Kd KD	(1/s (nM)	) n.d. n.d.
a = anti-	1)	t j ·	anti-SDS426
n.d. = nebylo	2)	t j ·	anti-SDS427
stanoveno	3)	t j ·	anti-SDS463

2,2 ± 0,4 x 10'

1,6 + 0,1 x 10 0,75 + 0,02 ··

• · · · © · ©

Příklad 9

Imunoglobulíny generované v králících proti rekombinantním BSW17-mimolátkám inhibují vazbu humánního IgE k jeho vysokoafinitnímu receptorů

Aby byly aktivní jako antialergické vakcíny, očekává se, že vytváření komplexů mezi anti-mimolátkovými protilátkami a hlgE zabrání vazbě IgE na jeho vysokoafinitní receptor. Úsek epitopu Cs3 Val (370)-Gly(379) v oblasti Val(370)-Asn(383) (viz obr. 6)(sekvence id. č. 25), který vykazuje sekvenční homologii s CDR BSW17-mimolátek, se účastní vysokoafinitní vazby na receptor. Tudíž se očekává, že IgE-specifické protilátky připravené proti rekombinantním BSW17-mimolátkám budou projevovat terapeutický účinek inhibicí vazby IgE na vysokoafinitní receptor, a sice tím, že zablokují vazebnou doménu. Pro potvrzení tohoto očekávání byly purifikované anti-mimolátkové protilátky získané z imunizovaných králíků testovány na inhibicí vazby hlgE/FcsRIa v kompetičním testu ELISA. Jakožto výstup relevantní pro nemoc byl měřen volný IgE na základě schopnosti vázat rekombínantní FcsRIa (DFP, dvojitý fúzní protein Rla-HSA- Rla)(viz obr. 10).

HlgE (SUS-11, 1 pg/ml, viz obr. 10A, a 0,1 pg/ml, viz obr. 10B) byl preinkubován 16 hodin ve 4 °C s rostoucím množstvím anti-mimolátkových imunoglobulínů nebo monoklonální protilátkou BSW17 jakožto referenční protilátkou. Celkové imunoglobulíny přítomné v rozpouštědle preparátu SDS410 po průchodu imunoafinitní kolonou byly použity jako negativní kontrola. Vytvořené komplexy byly naneseny na mikrotitrační destičku potaženou 1 pg/ml anti-IgE protilátky Le27 jakožto vychytávací protilátkou a destičky pak byly inkubovány

44		4 44 4	• «4	4 4
•	•	•	4 4 4 4	4 4
•	•	4	4 4	4 4
4 • ·	•	4 4 • ·	4 * 444 4 4 4 4	4 4 4·

s dvojitým fúznim proteinem DFP (FcsRIa-HSA-FceRIa) značeným křenovou peroxidázou po 1 hodinu při 37 °C. Navázaný DFP byl detekován pomocí chromogenního substrátu. OD hodnoty byly vyjádřeny jako procenta vazby. Vazba na SUS-11 IgE zcela bez kompetitoru byla definována jako 100 %. Jsou ukázány průměrné hodnoty ze dvou měření, odchylky byly zpravidla menší než 2 %.

Výsledky ukázaly, že imunizace BSW17-mimolátkami vedla u hlodavců k tvorbě specifických vysokoafinitních anti-IgE protilátek. Tyto anti-mimolátkové protilátky inhibuj£ in vitro vazbu IgE na jeho vysokoaf initní receptor, což ukazuje velký význam vakcinační strategie s BSW17-mimolátkami pro vývoj antialergických vakcín.

Příklad 10

Inhibice pasivní kutánní anafylaxe vakcinací rekombinantními BSW17-mimolátkami u makaků rhesus

Inhibice pasivní kutánní anafylaxe (PCA) u opic může být užita k testování in vivo účinnosti anti-alergických sloučenin.

Vakcinace mimolátkami vedla k inhibici anafylaktické kožní reakce u makaků rhesus. Skupiny po dvou opicích byly injikovány dávkou 500 μg/zvíře rekombinantní anti-BSW17 mimolátky. Po primární imunizaci dostala zvířata ještě dvě podpůrné injekce. Přibližně 10 dnů po každé podpůrné injekci byl proveden test PCA. Opice označené VI91, VI92, VI93 a VI95 byly testovány na PCA reakci ještě jednou, a sice tři měsíce po poslední podpůrné injekci. Imunizační schéma je shrnuto v následující tabulce 1:

·· ··· · • ·* ·· • · « · 9 · · • 9 9»

9 9 9 9

9 9 9

9999999 99 9

Tabulka 1

Opice	Imunogen	Den podpůrné	Den PCA
injekce	(boost)
7191	anti-id-BSW17,52; lehký řetězec (SDS426) (Obr. 4A)	0,	21, 54, 92	0, 30, 61, 105, 203
VI92	anti-id-BSW17,52; lehký řetězec (SDS426) (Obr. 4A)	0,	21, 54, 92	0, 30, 61, 105, 203
VI93	anti-id-BSW17,52; Fab (SDS427) (Obr. 4B)	0,	21, 54, 92	0, 30, 61, 105, 203
VI95	anti-id-BSW17,52; Fab (SDS427) (Obr. 4B)	0,	21, 54, 92	0, 30, 61, 105, 203
VI2	anti-id-BSW17,43; Fab (SDS463) (Obr. 4C)	o,	21, 54, 112	0, 33, 64, 123
VI75	anti-id-BSW17,43; Fab (SDS463) (Obr. 4C)	0,	21, 54, 112	0, 33, 64, 123

Makakům byla nejdříve podána malá dávka ketaminhydrochloridu (10-15 mg/kg, i.m.) (Ketalar® , Parke Davis, GB), aby byli znehybněni, a pak dostali i.c. injekce různých dávek IgE (JW8) (Serotec, Oxford, U.K.) do kůže na břichu. IgE (JW8) je chimérická protilátka složená z myší části vázající antigen specifické pro NIP a humánního těžkého řetězce Fc . Zvyšující se množství (0, 2, 10, 50, 250 ng/ml solného roztoku) IgE (JW8) v objemu 100 1 bylo injikováno v cefalokaudální sérii jehlou velikosti 30. Po dvou hodinách bylo každému zvířeti podáno i.v. 25 mg NIP konjugovaného s BSA. Po intravenózní provokační dávce konjugátu NIP-BSA byla zvířata opět zklidněna sedativem. Pro vizualizaci kožní reakce byla injikována intravenózně Evansova modř (1%, 0,5 ml/kg) okamžitě po antigenní provokační dávce. Kožní reakce byla odečítána 20 minut po injekci antigenu měřením 2 průměrů modré skvrny a výpočtem průměrné hodnoty v mm.

PCA byla testována v uvedených časových okamžicích po primární imunizaci a podpůrných injekcích. Intenzita PCA byla

4« ···* vypočítána z plochy pod křivkou (AUC) závislosti průměru plochy modré skvrny na koncentraci injikovaného IgE (JW8). Skóre PCA uvedená v následující tabulce 4 reprezentují pro každé zvíře vypočtené hodnoty AUC:

Tabulka 4

Účinek vakcinace BSW-17 mimolátkami na pasivní kutánní anafylaxi u makaků rhesus

A

PCA Skóre

Dny po imuniza- ci	Imunogen: anti-id-BSW17,52; lehký	Imunogen: anti-id-BSW17,52; Fab
řetězec	(SDS426	(Obr.	4A)	(SDS427) (Obr.	4B)
	Zvíře	Zvíře	zvíře	zvíře
	VI91	VI92	VI93	VI95
0	11,6	(100)	10,6	(100)	15,8 (100)	15,6 (100
30	10,5	(9Ϊ)	10,5	T99)	15,4 (97)	16,8 (108
61	10,1	(87)	1,8	ΤΪ7)	21,4 (139)	16,5 (106
105	4,6	(40)	2,1	T20)	5,6 (35)	7,0 (45)
203	9,8	(84)	6,3	159)	12,6 (80)	11,2 (72)

·» ·©·· » >« ·· ·· « · · © · ··© • · © · · · · • · · · · » · · · ·· ·· ··· ·»·· ·* te··

Β

PCA skóre

Dny po imunizaci	Imunogen: anti-id-BSW17,43; Fab
(SDS463) (Obr.	4C)
	Zvíře	Zvíře
	VI2	VI75
0	15,81 (100)2	15,8 (100)
33	16,5 (104)	18,9 (120)
64	9,8 (62)	13,0 (82)
124	16,8 (106)	18,9 (120)

¹ PCA skóre bylo vypočteno z plochy pod křivkou (AUC) získanou vynesením průměrů modré skvrny na koncentraci injikovaného (JW8), jak bylo již dříve popsáno (77) ² PCA intenzita je vyjádřena relativně vzhledem k preimunizačním hodnotám. PCA v den 0 = 100%.

Pokud se vzala jednotlivá preimunizační PCA skóre (hodnoty v den 0) jakožto referenční hodnoty, pak všechny zvířata reagovala na vakcinaci BSW17-mimolátkami redukcí PCA intenzity. Nej lepších výsledků bylo dosaženo s konstruktem lehkého řetězce klonu 52 (SDS426, viz obr. 4A) s mírou inhibice 60 až 83 % (PCA skóre 40 a 17). Opice imunizované Fab klonu 52 (šarže SDS427, viz obr. 4B) snížily PCA o 55 až 65 % (PCA skóre 45 a 35) . Poněkud nižší PCA inhibice v rozmezí 18 až 3 8 % (PCA skóre 82 a 62) byla pozorována s Fab klonu 43 (šarže SDS463, viz obr. 4C) , přestože mimolátka klonu 43 má lepší vlastnosti než klon 52 pokud jde o vazbu k BSW17 a indukci vysokoafinitního anti-hlgE u králíků.

		9999	9 99		99
•	9	9	99 9 9	•	9
9	9	9	9 9	•	9
9 99	9	9 9 99	9 · ··· ·· ··	•	• ··

Při postupu podle vakcinačního protokolu byla vakcinace mimolátkou klonu 52 účinná po třetí podpůrné injekci (kromě opice VI92) a částečné snížení PCA bylo patrné ještě po více než třech měsících. Naproti tomu vakcinace Fab klonu 43 byla účinná po druhé podpůrné injekci a třetí antigenní provokace již neměla žádný účinek.

Profil průměrného PCA skóre pro každou skupinu dvou opic imunizovaných stejným preparátem mimolátky, vypočtený z hodnot pro jednotlivé opice v tabulce 4, je znázorněn na obr. 11.

Pozitivní PCA výsledky u vakcinovaných zvířat (ve srovnání se skóre před ošetřením nebo s neošetřenými kontrolními zvířaty) jasně ukazuje účinnost vakcinace mimolátkami a dokazuje platnost tohoto konceptu. Vakcinace makaků rhesus rekombinantními BSW17-mimolátkami vedla k vytvoření vysokoafinitních anti-humánní IgE protilátek, které in vivo inhibují PCA.

• ·· ·

3£?J

SEZNAM SEKVENCI <210> 1 <211> 345 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 caggtgaaac tgctcgagtc ggggggaggc ctggtcaagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag tctctggatt caccttcagt aactataata tgaactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gactagagtg ggtctcatcc attagtagtc gaaattctta catatactac 180 gcagactcag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccgagag taccttgtat 240 ctgcaaatgg acaacctggg agtcgaagac acggctgtct atttttgtac gagcggccgc 300 cttttcgact actggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctct 345 <210>2 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>2

Gin Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Val

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Asn

Tyr

20

25

30

Asn

Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Ser

Ser

Ile

Ser

Ser

Arg

Asn

Ser

Tyr

Ile

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Glu

Ser

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gin

Met

Asp

Asn

Leu

Gly

Val

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Phe

Cys

85

90

95

Thr

Ser

Gly

Arg

Leu

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

100

105

110

Val Ser Ser 115 <210> 3 <211> 315 <212>DNA <213> Homo sapiens <400> 3 gtgatgaccc agtctccatc ctcactgtct gcatctgtag gagacagagt caccatcact 60 tgtcgggcta gtcagggcat taacaattat ttagcctggt ttcagcagaa accagggaaa 120 gcccctaagt ccctgatcta tagtgcatcc attttgcaaa gtggggtccc atccaagttc 180 agcggcagtg gatctgggac agatttcact ctcaccatca gcaacctgca gcctgaagat 240 tttgcaactt attactgcca acaatataat tattatccgc tcactttcgg cggagggacc 300 aaggtggaga tcaaa 315 <210>4 <211> 105 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4

Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg

1

5

10

15

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Gly

Ile

Asn

Asn

Tyr

Leu

Ala

20

25

30

Trp

Phe

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Ser

Leu

Ile

Tyr

Ser

35

40

45

Ala

Ser

Ile

Leu

Gin

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Lys

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Asn

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

65

70

75

80

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Tyr

Asn

Tyr

Tyr

Pro

Leu

Thr

Phe

85

90

95

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

100

105

<210>5 <211> 378 <212>DNA <213> Homo sapiens <400> 5 caggtgaaac tgctcgagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtggtt actactggac ctggatccgc 120 cagcgcccag ggaagggcct ggagtggatt ggatacatct attacagtgg gagcacctcc 180 tacaacccgt ccctcaagag tcgagtcacc atgtcagtgg acacgtctaa aaaccagttc 240 tccctgaggc tgacctctgt gactgccgcg gacacggccg tctattactg tgcgcgagag 300 cggggtgaga ccggtctata ttacccctat tactacatag acgtctgggg cacagggacc 360 accgtcaccg tctcctca 378 <210> 6 <211> 126 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>6

Gin Val 1

Lys Leu

Leu 5

Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

10

15

Thr

Leu

Ser

Leu

Thr

Cys

Thr

Val

Ser

Gly Gly

Ser

Ile

Ser

Ser

Gly

20

25

30

Gly

Tyr

Tyr

Trp

Thr

Trp

Ile

Arg

Gin

Arg

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

35

40

45

Trp

Ile

Gly

Tyr

Ile

Tyr

Tyr

Ser

Gly

Ser

Thr

Ser

Tyr

Asn

Pro

Ser

50

55

60

Leu

Lys

Ser

Arg

Val

Thr

Met

Ser

Val

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Gin

Phe

65

70

75

80

Ser

Leu

Arg

Leu

Thr

Ser

Val

Thr

Ala

Ala

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

85

90

95

Cys

Ala

Arg

Glu

Arg

Gly

Glu

Thr

Gly

Leu

Tyr

Tyr

Pro

Tyr

Tyr

Tyr

100

105

110

Ile

Asp

Val

Trp

Gly

Thr

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

125

<210>7 <211> 342 <212> DNA <213> Homo sapiens <400>7 gagctcgtgg tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60 tcctgcactg gaaccagaag tgacgttggt ggttataact atgtctcctg gtaccaacaa 120 cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tatgatgtca gtaatcggcc ctcaggggtt 180 tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240 caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcatata caagcagcag cactctcggg 300 gtgttcggcg gagggaccaa gttgaccgtc ctaggtcagc cc 342 <210> 8 <211> 114 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>8

Glu Leu Val Val Thr Gin Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gin

1

5

10

15

Ser

Ile

Thr

Ile

Ser

Cys

Thr

Gly

Thr

Arg

Ser

Asp

Val

Gly

Gly

Tyr

20

25

30

Asn

Tyr

Val

Ser

Trp

Tyr

Gin

Gin

His

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

35

40

45

Met

Ile

Tyr

Asp

Val

Ser

Asn

Arg

Pro

Ser

Gly

Val

Ser

Asn

Arg

Phe

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Lys

Ser

Gly

Asn

Thr

Ala

Ser

Leu

Thr

Ile

Ser

Gly

Leu

65

70

75

80

Gin

Ala

Glu

Asp

Glu

Ala

Asp

Tyr

Tyr

Cys

Ser

Ser

Tyr

Thr

Ser

Ser

85

90

95

Ser

Thr

Leu

Gly

Val

Phe

Gly

Gly Gly

Thr

Lys

Leu

Thr

Val

Leu

Gly

100

105

110

Gin Pro • 9 9 99 9

• 9

<210>9 <211> 29 <212>DNA <213> Homo sapiens <400>9 cactcccagg tgcagctgct cgagtctgg <210> 10 <211>32 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 gtcctgtccc aggtcaactt actcgagtct gg <210> 11 <211> 32 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 gtccaggtgg aggtgcagct gctcgagtct gg <210> 12 <211>32 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 gtcctgtccc aggtgcagct gctcgagtcg gg <210> 13 <211> 32 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 gtctgtgccg aggtgcagct gctcgagtct gg <210> 14 <211> 32 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 gtcctgtcac aggtacagct gctcgagtca gg • · · ·

<210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 agcatcacta gtacaagatt tgggctc <210> 16 <211> 35 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 gtgccagatg tgagctcgtg atgacccagt ctcca <210> 17 <211> 56 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 tccttctaga ttactaacac tctcccctgt tgaagctctt tgtgacgggc gaactc <210> 18 <211> 36 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 ctgcacaggg tcctgggccg agctcgtggt gactca <210> 19 <211> 34 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 gcattctaga ctattatgaa cattctgtag gggc <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 cgctgtgccc ccagaggt

<210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 ggccgcaaat tctatttcaa gg <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 gagacacacc agtgtggc <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 cacaacagag gcagttcc <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 24 ctaaactagc tagtcgcc <210> 25 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25

Val Asn Leu Thr Trp Ser Arg Ala Ser Gly Lys Pro Val Asn 15 10 <210> 26 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26

Tyr Asn Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 15 10 15 • · ♦ · · ·

<210> 27 ' · ’ <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27

Pro Ser Pro Phe Asp Leu Phe Ile Arg Lys Ser Pro Thr Ile Thr Cys 15 10 15 <210> 28 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28

Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 15 10 15 <210> 29 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29

Val Asn Leu Thr Trp Ser Arg Ala Ser Gly 15 10 <210> 30 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30

Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly 15 10 <210> 31 <211>29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>31

Thr 1

Ile

Thr Cys

Leu Val Val Asp Leu Ala Pro Ser Lys Gly Thr Val

5

10

15

Asn

Leu

Thr

Trp

Ser

Arg

Ala

Ser

Gly

Lys

Pro

Val

Asn

20

25

♦ · • · · ♦ ·· «· <210> 32 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32

Ser Leu 1

Thr

Cys

Thr 5

Val Ser

Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr

10

15

Tyr

Trp

Thr

Trp

Ile

Arg

Gin

Arg

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

20

25

30

<210> 33 <211>25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33

Gly Thr Arg Asp Trp	Ile Glu Gly Glu Thr Tyr Gin Cys Arg Val Thr
1	5	10	15
His Pro	His Leu Pro	Arg Ala Leu Met
	20	25

<210> 34 <211>26 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34

Gly Thr Arg Ser Asp	Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gin
1	5	10	15
Gin His	Pro Gly Lys	Ala Pro Lys Leu Met
	20	25

<210> 35 <211> 218 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35

Gin 1

Val

Lys

Leu

Leu 5

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly 10

Leu

Val

Lys

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu 20

Ser

Cys

Ala

Val

Ser 25

Gly

Phe

Thř

Phe

Ser 30

Asn

Tyr

Asn

Met

Asn 35

Trp

Val

Arg

Gin

Ala 40

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu 45

Glu

Trp

Val

Ser

Ser 50

Ile

Ser

Ser

Arg

Asn 55

Ser

Tyr

Ile

Tyr

Tyr 60

Ala

Asp

Ser

Val

Lys 65

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile 70

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala 75

Glu

Ser

Thr

Leu

Tyr 80

Leu

Gin

Met

Asp

Asn 85

Leu

Gly

Val

Glu

Asp 90

Thr

Ala

Val

Tyr

Phe 95

Cys

Thr

Ser

Gly

Arg 100

Leu

Phe

Asp

Tyr

Trp 105

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu 110

Val

Thr

Val

Ser

Ser 115

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly 120

Pro

Ser

Val

Phe

Pro 125

Leu

Ala

Pro

Ser Ser 130

Lys

Ser

Thr

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

Leu

Vál

135

140

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

145

150

155

160

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

165

170

175

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

180

185

190

Thr

Gin

Thr

Tyr

Ile

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

195

200

205

Val

Asp

Lys

Lys

Ala

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

210

215

<210> 36

<211> 211 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 36 Val Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

Asp

Arg

1

5

10

15

Val Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Gly

Ile

Asn

Asn

Tyr

Leu

Ala

20

25

30

Trp Phe

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Ser

Leu

Ile

Tyr

Ser

35

40

45

Ala Ser

Ile

Leu

Gin

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Lys

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

50

55

60

Ser Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Asn

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

65

70

75

80

Phe Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Tyr

Asn

Tyr

Tyr

Pro

Leu

Thr

Phe

85

90

95

Gly Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

100

105

110

Phe Ile

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

115

120

125

Val Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

130

135

140

Trp Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

Ser

Val

145

150

155

160

Thr Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Thr

Leu

165

170

175

Thr Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

Tyr

Ala

Cys

Glu

180

185

190

Val Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ile

Phe

Asn

Arg

195

200

205

Gly Glu

Cys

210

<210> 37

<211>229 <212> PRT

<213> Homo sapiens

·+»»*· * ·· ·· • · 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9

99 999 99 <400> 37

Gin 1

Val

Lys Leu

Leu Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val

Lys

Pro Ser 15

Glu

5

10

Thr

Leu

Ser

Leu

Thr

Cys

Thr

Val

Ser

Gly Gly

Ser

Ile

Ser

Ser

Gly

20

25

30

Gly

Tyr

Tyr

Thr

Trp

Trp

Ile

Arg

Gin

Arg

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

35

40

45

Trp

Ile

Gly

Tyr

Ile

Tyr

Tyr

Ser

Gly

Ser

Thr

Ser

Tyr

Asn

Pro

Ser

50

55

60

Leu

Lys

Ser

Arg

Val

Thr

Met

Ser

Val

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Gin

Phe

65

70

75

80

Ser

Leu

Arg

Leu

Thr

Ser

Val

Thr

Ala

Ala

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

85

90

95

Cys

Ala

Arg

Glu

Arg

Gly

Glu

Thr

Gly

Leu

Tyr

Tyr

Pro

Tyr

Tyr

Tyr

100

105

110

Ile

Asp

Val

Trp

Gly

Thr

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

115

120

125

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

Ser

Lys

Ser

Thr

130

135

140

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

145

150

155

160

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

165

170

175

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

180

185

190

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

Ile

195

200

205

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Lys

Ala

210

215

220

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

225

<210> 38 <211> 219 <212>PRT <213> Homo sapiens <400> 38

Glu 1

Leu

Val

Val

Thr 5

Gin

Pro

Ala

Ser

Val 10

Ser

Gly

Ser

Pro

Gly 15

Gin

Ser

Ile

Thr

Ile 20

Ser

Cys

Thr

Gly

Thr 25

Arg

Ser

Asp

Val

Gly 30

Gly

Tyr

Asn

Tyr

Val 35

Ser

Trp

Tyr

Gin

Gin 40

His

Pro

Gly

Lys

Ala 45

Pro

Lys

Leu

Met

Ile 50

Tyr

Asp

Val

Ser

Asn 55

Arg

Pro

Ser

Gly

Val 60

Ser

Asn

Arg

Phe

Ser 65

Gly

Ser

Lys

Ser

Gly 70

Asn

Thr

Ala

Ser

Leu 75

Thr

Ile

Ser

Gly

Leu 80

Gin

Ala

Glu

Asp

Glu 85

Ala

Asp

Tyr

Tyr

Cys 90

Ser

Ser

Tyr

Thr

Ser 95

Ser

Ser

Thr

Leu

Gly 100

Val

Phe

Gly

Gly

Gly 105

Thr

Lys

Leu

Thr

Val 110

Leu

Gly

Gin

Pro

Gin 115

Pro

Lys

Ala

Ala

Pro 120

Ser

Val

Thr

Leu

Phe 125

Pro

Pro

Ser

Ser

Glu 130

Glu

Leu

Gin

Ala

Asn 135

Lys

Ala

Thr

Leu

Val 140

Cys

Leu

Ile

Ser

Asp 145

Phe

Tyr

Pro

Gly

Ala 150

Val

Thr

Val

Ala

Trp 155

Lys

Ala

Asp

Ser

Ser 160

Pro Val Lys Ala Gly Val Glu

Thr

Thr Thr Pro Ser Lys Gin Ser ASn

165

170

175

Asn

Lys

Tyr

Ala

Ala

Ser

Ser

Tyr

Leu

Ser

Leu

Thr

Pro

Glu

Gin

Trp

180

185

190

Lys

Ser

His

Lys

Ser

Tyr

Ser

Cys

Gin

Val

Thr

His

Glu

Gly

Ser

Thr

195

200

205

Val

Glu

Lys

Thr

Val

Ala

Pro

Thr

Glu

Cys

Ser

210

215

<210> 39 <211> 15 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 39 aactataata tgaac 15 <210> 40 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40

Asn Tyr Asn Met Asn 1 5 <210> 41 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <400>41 tccattagta gtcgaaattc ttacatatac tacgcagact cagtgaaggg c 51 <210>42 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42

Ser Ile Ser Ser Arg Asn Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly <210> 43 <211> 18 <212>DNA <213> Homo sapiens <400> 43 ggccgccttt tcgactac • · • ·· φ ·· <210> 44 <211>6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>44

Gly Arg Leu Phe Asp Tyr 1 5 <210> 45 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 45 cgggctagtc agggcattaa caattattta gcc 33 <210> 46 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46

Arg Ala Ser Gin Gly Ile Asn Asn Tyr Leu Ala 15 10 <210> 47 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 47 agtgcatcca ttttgcaaag t 21 <210> 48 <211>7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>48

Ser Ala Ser Ile Leu Gin Ser 1 5 <210> 49 <211> 27 <212>DNA <213> Homo sapiens <400>49 caacaatata attattatcc gctcact •4 4444

4 44 ·4 444

4 4 4 4 4 4 <210> 50 <211>9 <212> PRT <213> Homo sapíens <400> 50

Gin Gin Tyr Asn Tyr Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 51 <211>24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400>51 agcagtggtg gttactactg gacc 24 <210> 52 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52

Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Thr 1 5 <210> 53 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 53 ggatacatct attacagtgg gagcacctcc tacaacccgt ccctcaagag t 51 <210> 54 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54

Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 15 10 15

Ser <210> 55 <211>48 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 55 gagcggggtg agaccggtct atattacccc tattactaca tagacgtc © © · · 9 · · · · · • · · © · · · ©· ♦· · ©·©· <210> 56 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56

Glu Arg Gly Glu Thr Gly Leu Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Ile Asp Val 1 5 10 15 <210> 57 <211> 42 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 57 actggaacca gaagtgacgt tggtggttat aactatgtct cc 42 <210> 58 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58

Thr Gly Thr Arg Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser 15 10 <210> 59 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 59 gatgtcagta atcggccctc a 21 <210> 60 <211>7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60

Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser 1 5 <210> 61 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400>61 agctcatata caagcagcag cactctcggg gtg

9» ···· • · · <210> 62 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62

Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Leu Gly 15 10

Val ·*··«» · ·· ·· ·· 9 9 9 · 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9

9 9 · 9 9 9 9

999 9999 99 9

W&0O/ - 36

Claims (10)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Rekombinantní monoklonální protilátka nebo fragment protilátky, která je anti-idiotypovou protilátkou k protilátce BSW17, která interferuje s vazbou úseku Cs3 z IgE na vysokoafinitni receptor pro IgE (tj. mimolátka), a která je složena z nebo obsahuje dimer lehkého řetězce nebo jeden ze dvou Fab fragmentů uvedených na obr. 4 (tj. sekvence id. č. 35, 36, 37 a 38), přičemž konstantními úseky se rozumí i úseky obsahující sterické modifikace až 5 aminokyselin, jak se vyskytují v allotypových variantách.
2. 2. Mimolátka podle nároku 1 mající nebo obsahující aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr. 5a, 5b, 5c nebo 5d (sekvence id. č. 2, 4, 6 a 8), přičemž konstantními úseky se rozumí i úseky obsahující sterické modifikace až 5 aminokyselin, jak se vyskytují v allotypových variantách.
3. 3. Mimolátka podle nároku 1 mající nebo obsahující jeden, dva nebo tři úseky CDR uvedené na obr. 5a (sekvence id. č. 2, 40, 42 a 44), 5b (sekvence id. č. 4, 46, 48 a 50), 5c (sekvence id. č. 6, 52, 54 a 56) nebo 5d (sekvence id. č. 8, 58, 60 a 62), volitelně s přilehlými rámcovými sekvencemi do 10 aminokyselin na jednom nebo obou koncích úseku CDR.

   • · »·· · • · 9
4. 4. Mimolátka podle nároku 1 mající nebo obsahující alespoň jednu ze sekvencí definovaných na obr. 6 pro klony 52 a 43, které jsou homologní s doménou C 3 humánního IgE (sekvence id. č. 26, 28, 30, 32 a 34).
5. 5. Farmaceutický přípravek typu vakcíny vyznačující se tím, že obsahuje mimolátku podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 ve formě jediné molekuly nebo proteinového konjugátu, kdy je mimolátka chemicky navázaná na imunogenní nosičovou molekulu, a dále podle potřeby obsahuje adjuvans nebo další obvyklé excipienty.
6. 6. Mimolátka podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 pro použití jako lék pro léčení nemocí zprostředkovaných IgE.
7. 7. Způsob léčení nemocí zprostředkovaných IgE vyznačující se tím, že obsahuje podávání terapeuticky účinného množství mimolátky podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 pacientovi, který takové léčení potřebuje.
8. 8. Způsob léčení astmatu, atopické dermatitidy, rhinitidy, chronické urtikárie nebo potravinových alergií vakcinací, vyznačující se tím, že se podává terapeuticky účinné množství mimolátky podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 pacientovi, který takové léčení potřebuje.

   ·· ··*♦ • 4» · · · < · • 9 9 9 9 9 9 9 9 9
9. 9 9 9 9 9 9 9 9 9

   99 99 999 9999 99 999 ⁵⁹

   9. Použití mimolátky podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 pro indukci polyklonálních protilátek nebo monoklonálních protilátek pasivní imunizací.
10. 10. Použití protilátky BSW17, která interferuje s vazbou úseku C 3 z IgE na vysokoafinitní receptor pro IgE, k identifikaci mimolátky podle kteréhokoliv z nároků 1