ES2302693T3 - Anticuerpos antiidiotipicos contra anticuerpos que inhiben el enlazamiento de inmunoglobulina a su receptor de alta afinidad. - Google Patents

Anticuerpos antiidiotipicos contra anticuerpos que inhiben el enlazamiento de inmunoglobulina a su receptor de alta afinidad. Download PDF

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Abstract

Un anticuerpo monoclonal recombinante o fragmento de anticuerpo que es antiidiotípico al anticuerpo BSW17 que interfiere con el enlazamiento de la región Ce3 de IgE al receptor de alta afinidad para IgE que comprende - un dímero de 2 cadenas livianas que contiene las 3 regiones que determinan la complementariedad de las SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48 y SEQ ID NO: 50, o - un dímero de una cadena liviana que contiene las 3 regiones que determinan la complementariedad de las SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48 y SEQ ID NO: 50 y de una cadena pesada que contiene las 3 regiones que determinan la complementariedad de las SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 44, o - un dímero de una cadena liviana que contiene las 3 regiones que determinan la complementariedad de las SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60 y SEQ ID NO: 62 y de una cadena pesada que contiene las 3 regiones que determinan la complementariedad de las SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54 y SEQ ID NO: 56.

Description

Anticuerpos antiidiotípicos contra anticuerpos que inhiben el enlazamiento de inmunoglobulina a su receptor de alta afinidad.
La presente invención se relaciona con anticuerpos antiidiotípicos. Está dirigida a la inhibición de interacciones que normalmente causarían la activación de mastocitos y basófilos inducidos por inmunoglobulina E confinada en la célula (IgE) enlazada a un alérgeno, resultando en la liberación de histamina y de otros mediadores así como en la síntesis nueva de citoquinas involucradas en la regulación de reacciones alérgicas e inflamatorias. Involucra anticuerpos antiidiotípicos o fragmentos de anticuerpos que interfieren con el enlazamiento de la región Ce3 de IgE al receptor de alta afinidad para IgE.
El conocimiento de los sitios específicos de enlazamiento sobre IgE que interactúan con su receptor de alta afinidad (PccRI) proporciona una base para la generación de anticuerpos que evitan esta interacción por medio del reconocimiento de los epítopos de enlazamiento. La inducción de tales anticuerpos por medio de vacunación da como resultado una nueva terapia generalmente aplicable para la alergia. La presente invención describe la identificación y producción, en particular, de fragmentos de anticuerpo recombinante que se pueden formular en una vacuna para la generación de anticuerpos anti-IgE que protegen de la inducción de reacciones alérgicas mediadas por IgE.
Los síntomas alérgicos son inducidos por la liberación de aminas vasoactivadoras (mediadoras), notablemente histamina, a partir de células dentro del tejido circundante y estructuras vasculares. La histamina se almacena normalmente en células especiales conocidas como mastocitos y granulocitos basófilos. Los mastocitos se dispersan a través de todo el tejido animal mientras que los basófilos circulan dentro del sistema vascular. Estas células sintetizan y almacenan histamina dentro de la célula a menos que ocurra una secuencia especializada de eventos para activar su liberación.
El papel de los anticuerpos IgE en la mediación de reacciones alérgicas es bien conocido. IgE es un ordenamiento complejo de cadenas de polipéptido que, como en otras inmunoglobulinas consta de dos cadenas livianas y dos cadenas pesadas enlazadas juntas por medio de enlaces disulfuro en una configuración en forma de "Y". Cada cadena liviana tiene dos dominios, un dominio variable (V_{L}) enlazado a un dominio con una secuencia relativamente invariable de aminoácidos llamado un dominio constante (C_{L}). Las cadenas pesadas por el contrario, tienen un dominio variable (V_{H}) y en el caso de IgE, cuatro dominios constantes (C_{H}1, C_{H}2, C_{H}3, C_{H}4, también conocidos como C_{\varepsilon}1, C_{\varepsilon}2, C_{\varepsilon}3, C_{\varepsilon}4). Los dos "brazos" del anticuerpo son responsables por el enlazamiento del antígeno, teniendo regiones en donde la estructura del polipéptido varía, son llamados fragmentos Fab' o F(ab')_{2} que representan dos brazos Fab' enlazados juntos por medio de enlaces disulfuro. La "cola" o eje central del anticuerpo contiene una secuencia fija o constante de péptidos y es llamado el fragmento Fc. El fragmento Fc contiene sitios interactivos que permiten que el anticuerpo se comunique con otras moléculas del sistema inmune o células por medio del enlazamiento a sus receptores Fc. Los receptores Fc son moléculas que se enlazan específicamente a sitios moleculares activos dentro de las regiones Fc de la inmunoglobulina. Los receptores Fc pueden existir como proteínas integrantes de la membrana dentro de una membrana exterior del plasma de la célula o pueden existir como moléculas "solubles" libres que circulan libremente en el plasma sanguíneo o en otros fluidos corporales. En el sistema humano, el enlazamiento de alta afinidad de IgE a Fc\varepsilonRI se logra por medio de una interacción compleja proteína-proteína que involucra diferentes partes del tercer dominio de la región constante de la cadena pesada (C\varepsilon3) de IgE - inmunoglobulina próxima - como el dominio (\alpha_{2}) de la subunidad Fc\varepsilonRI\alpha. Aunque se han identificado los residuos dentro del dominio C\varepsilon3 de Fc\varepsilon y de las regiones que pertenecen al dominio \alpha2 de Fc\varepsilonRI\alpha que son importantes para el enlazamiento, aún resta caracterizar el mecanismo detallado del proceso de enlazamiento. La evidencia experimental ha mostrado que la IgE humana adopta una estructura curvada que se especula que contribuye a la alta afinidad de IgE para Fc\varepsilonRI\alpha (Kd \cong 10^{-10} M). Además, esta estructura curvada también está postulada de ser responsable por el complejo equimolar entre IgE y Fc\varepsilonRI\alpha soluble o enlazado a la célula, aunque la molécula de IgE proporcionaría epítopos idénticos sobre los dos dominios C\varepsilon3 para el enlazamiento del receptor. Esta monovalencia es una necesidad funcional si se debe evitar la activación del receptor en ausencia del alérgeno.
Los sitios interactivos, dependiendo de su función, pueden ser expuestos ya y por lo tanto ser capaces de enlazarse a los receptores celulares. Alternativamente, pueden estar escondidos hasta que el anticuerpo se enlace al antígeno, con lo cual el anticuerpo puede cambiar en estructura y posteriormente exponer otros sitios activos que pueden activar luego una actividad específica inmune. Se ha propuesto un reordenamiento conformacional que afecta a C\varepsilon3 por enlazamiento del receptor como una explicación para la estequiometría 1:1 del complejo Fc\varepsilon/ Fc\varepsilonRI\alpha sobre la superficie celular.
La liberación alérgica (inmunológica) de mediadores dentro del organismo de los mastocitos y basófilos puede ocurrir únicamente bajo las siguientes circunstancias: una molécula de IgE debe enlazarse o unirse por si misma con su porción de Fc al sitio del receptor celular de Fc, asegurando así la molécula de IgE al mastocito o al basófilo; y las porciones de Fab' de las moléculas de IgE enlazadas a la célula se deben entrelazar por medio de un antígeno compatible particular (el alérgeno). En el caso de que ocurra tal interacción, se activa automáticamente el mastocito o el basófilo para liberar histamina al ambiente local, manifestando los síntomas alérgicos familiares (Figura 1). Vienen después otros eventos bioquímicos en una fase tardía de reacción que resulta en nueva síntesis y liberación de citoquinas y de otros mediadores.
Los enfoques convencionales para el tratamiento de la alergia han involucrado terapia sistémica con antihistaminas o intentos para desensibilizar a los pacientes, enfoques que en si mismos no han estado dirigidos a la interacción básica mastocito/basófilo-IgE. Otro enfoque tiene se ha ocupado de la producción de cadenas de polipéptidos capaces de bloquear el enlazamiento del anticuerpo IgE con los receptores Fc sobre las superficies de la célula y desplazando a IgE de los sitios de enlazamiento en los que IgE ya está enlazada, e investigado la naturaleza de un sitio "efector" putativo dentro de la región Fc de IgE que se especuló que suministraba una señal inmunológica que activa los mastocitos/basófilos para liberación de histamina.
También se ha intentado el uso de fragmentos recombinantes de IgE como inmunógenos para la generación de una vacuna protectora anti-IgE que mostraron ser efectivos. La principal objeción contra este tipo de vacuna proviene de la posibilidad de que utilizando fragmentos grandes de IgE se podría iniciar no solamente la producción de anticuerpos inhibidores sino también generar entrelazamiento y por lo tanto anticuerpos anafilactógenos en los pacientes.
Una estrategia para superar este problema apuntaría a la identificación del fragmento más pequeño posible de IgE, que consiste idealmente únicamente en el sitio receptor del enlazamiento, que está sepultado dentro del complejo IgE/IgERI después del enlazamiento y por lo tanto no es ya accesible para entrelazamiento por la respuesta inmune generada por la vacuna. Aunque aún se hacen intentos, es improbable que esta estrategia sea exitosa en vista de las distancias espaciales de las diferentes regiones C\varepsilon3 involucradas en la interacción IgE/IgERI.
Los problemas intrínsecamente relacionados con el enfoque "clásico" de vacuna se pueden superar por medio del uso de péptidos cortos mimótopo para inmunización activa, ya sea como péptidos químicamente sintetizados acoplados a portadores adecuados, o como construcciones recombinantes de fusión, por ejemplo con, ovoalbúmina o IgE. Tales péptidos son imitaciones estructurales del epítopo reconocido por el anticuerpo monoclonal BSW17, que reconoce un epítopo conformacional sobre Fc\varepsilon, con una parte de él residiendo dentro de C\varepsilon4. La línea celular de hibridoma que produce BSW17 ha sido depositada el 19 de diciembre de 1996 en la ECACC de acuerdo a lo previsto en el Tratado de Budapest sobre el depósito de microorganismos, bajo el número de depósito 9612916. Este anticuerpo muestra un perfil interesante de actividad biológica como se resume en la Figura 2. Es por si mismo un no anafilactógeno, y protege a los mastocitos y a los basófilos humanos de la liberación de histamina dependiente de IgE inducida por lo agentes activadores. Los anticuerpos BSW17 o tipo BSW17 que circulan dentro del sistema vascular protegen de las reacciones alérgicas a) inhibiendo la activación de las mastocitos y de los basófilos a través de inhibición competitiva de la interacción IgE/IgERI y b) disminuyendo los niveles en suero de IgE a través de la reducción de la expresión de la síntesis de IgE sobre el nivel de células B. Mientras las imitaciones estructurales de un epítopo del anticuerpo anti-IgE, los péptidos del mimótopo químicamente sintetizado BSW17 inducen una respuesta inmune que resulta en la producción de anticuerpos tipo BSW17 en el huésped. Ya que BSW17 ha mostrado ser no anafilactógeno, inhibidor del enlazamiento de IgE/IgERI y de la síntesis de IgE sobre células B, estos anticuerpos surgidos contra la vacuna con base en un péptido mimótopo de BSW17 tienen propiedades protectoras similares. Una posible desventaja de tal vacuna con base en un péptido mimótopo de BSW17 puede surgir de la necesidad de acoplar los péptidos químicamente sintetizados a proteínas portadoras para incrementar la inmunogenicidad de los péptidos. Además, la flexibilidad estructural de los péptidos cortos permite que ellos adopten muchas conformaciones estéricas diferentes. Por lo tanto, únicamente una fracción de la respuesta policlonal inmune anti-mimótopo será terapéuticamente activa por medio de la reacción cruzada con IgE humano.
La presente invención evita las posibles desventajas intrínsecas a una metodología de péptido mimótopo. Se basa en anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que son antiidiotípicos a los anticuerpos que interfieren con el enlazamiento de IgE a su receptor de alta afinidad, en particular sobre un anticuerpo antiidiotípico recombinante a BSW17. De acuerdo con la teoría de la red de Jerne (Jerne N., Ann. Immunol. 125C [1974] 373), las regiones hipervariables de un anticuerpo (Ab1) pueden por si mismas actuar como antígenos. Los anticuerpos producidos en esta forma son conocidos como un antiidiotípo (anti-id) anticuerpos (Ab2) ya que ellos se enlazan a la región idiotípica del primer anticuerpo (Figura 3). Tales anticuerpos anti-id están dirigidos al sitio de enlazamiento (parátopo) del primer anticuerpo (Ab1) y por lo tanto representa una "imagen interna" del antígeno original. Por consiguiente, los anticuerpos anti-id (Ab2), llamados anticuerpos de imagen interna o Ab2\beta, son también capaces de producir la formación del anticuerpo a través de sus regiones hipervariables. Estos anticuerpos anti-anti-id (Ab3) imitan estructuralmente al parátopo de Ab1 y por lo tanto tienen propiedades biológicas similares al anticuerpo Ab1. En el caso del sistema hIgE/BSW17, IgE representa al antígeno original y BSW17 al anticuerpo Ab1. El parátopo de un anticuerpo idiotipo anti-BSW17 Ab2 representa por lo tanto una imitación estructural de la región hIgE (el epítopo) reconocido por BSW17. Estructuralmente, el parátopo Ab2 es equivalente a los péptidos mimótopo BSW17 sintetizados químicamente y mencionados anteriormente. Si tal anticuerpo idiotipo anti-BSW17 (recombinante) es utilizado como una vacuna, se inducirá una respuesta inmune como la de BSW17 (Ab3) en el paciente vacunado. Al igual que BSW17, estas inmunoglobulinas Ab3 (policlonales) interferirán con el enlazamiento entre IgE y su receptor de alta afinidad, actuando por lo tanto como agentes antialérgicos. En contraste con los péptidos mimótopos sintéticos flexibles, el parátopo Ab2 será presentado al ambiente en una conformación estructuralmente definida. La reacción inmune dirigida contra el epítopo definido hIgE será por lo tanto más específica. Además, no será necesaria una proteína heteróloga inmunogénica portadora. Se evitarán por lo tanto los posibles efectos secundarios causados por una proteína portadora tal como el toxoide del tétano o el toxoide de la difteria.
La presente invención comprende anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que son antiidiotípicos para los anticuerpos BSW17 que interfieren con el enlazamiento de la región C\varepsilon3 de IgE al receptor de alta afinidad para IgE de acuerdo con la reivindicación 1 y 2; a partir de ahora ellos se denominarán en forma resumida como "los mimocuerpos de la invención" o "mimocuerpos de BSW17".
Los mimocuerpos de la invención son por lo tanto anticuerpos antiidiotipo o fragmentos de anticuerpo que se enlazan específicamente a un epítopo que es el parátopo de un anticuerpo anti-IgE que reconoce el sitio sobre la región C\varepsilon3 de la molécula de IgE que se enlaza al receptor de alta afinidad para IgE (Fc\varepsilonRI).
Los mimocuerpos de la invención son en principio de origen humano, en cuanto se contempla el uso en humanos, ellos son anticuerpos monoclonales recombinantes o fragmentos de anticuerpo.
Los mimocuerpos de la invención representan anticuerpos aislados y sustancialmente puros o fragmentos de anticuerpo derivados de anticuerpos anti-IgE anti-id de ocurrencia natural. En particular, ellos están sustancialmente libres de otros anticuerpos. Bajo "sustancialmente puro" se entiende una pureza al menos aproximadamente del 60% en peso, preferiblemente aproximadamente 90% en peso, más preferiblemente aproximadamente 99% en peso o más.
La invención también se relaciona con composiciones farmacéuticas, especialmente vacunas, que comprenden mimocuerpos de la invención, ya sea como entidades moleculares únicas o como un conjugado de proteína químicamente acoplado a una molécula portadora inmunogénica, en su caso junto con un adyuvante y excipientes convencionales adicionales.
Los mimocuerpos de la invención se relacionan además con el uso como compuestos farmacéuticos, en particular como vacunas, en particular en el tratamiento de enfermedades mediadas por IgE.
Se relaciona además con el uso de anticuerpos que interfieren con el enlazamiento de la región CE3 de IgE al receptor de alta afinidad para IgE, tal como BSW17, para la identificación de mimocuerpos de la invención, utilizando métodos convencionales, tales como la tecnología con despliegue de fagos.
Se relaciona además con el uso de los mimocuerpos de la invención en la preparación de un medicamento contra enfermedades mediadas por IgE, en particular de una vacuna.
Se relaciona además con el uso de los mimocuerpos de la invención para elevar los anticuerpos monoclonales o policlonales en contra de estos para inmunización pasiva; la preparación de anticuerpos monoclonales o policlonales contra mimocuerpos de la invención para inmunización pasiva, ya sea por medio de la administración de mimocuerpos de la invención a un animal no humano adecuado y aislamiento y purificación de los anticuerpos generados en contra de estos, o por medio de tecnología convencional de hibridoma, y el uso de anticuerpos policlonales o monoclonales siempre que sean obtenidos a partir de mimocuerpos de la invención en el tratamiento de enfermedades mediadas por IgE por medio de inmunización pasiva.
Se relaciona además con un proceso para la identificación de los mimocuerpos de la invención que comprende:
\vskip1.000000\baselineskip
-
identificar anticuerpos anti-IgE antiidiotípicos de ocurrencia natural;
-
aislar fragmentos de los mismos; y
-
seleccionar fragmentos recombinantes de los mismos por medio de enlazamiento a un anticuerpo monoclonal anti-IgE adecuado, tal como BSW17, que interfiere con el enlazamiento de la región C\varepsilon3 de IgE al receptor de alta afinidad para IgE.
\vskip1.000000\baselineskip
Una vez identificados y caracterizados, se pueden preparar los mimocuerpos de la invención en forma convencional, por ejemplo por medio de tecnología de ADN recombinante o de síntesis química.
Para la identificación de anticuerpos antiidiotípicos que muestran la misma especificidad que los péptidos mimótopos mencionados anteriormente (esto es, el epítopo seleccionado sobre IgE), se puede utilizar una biblioteca que muestra bacteriófagos que expresan la parte Fab de un repertorio de anticuerpos humanos. Esta biblioteca se construye por ejemplo a partir de una reserva de células B obtenida a partir de amígdalas de individuos humanos, y anticuerpo BSW17 inmovilizado utilizado como objetivo para bioselección. Se aíslan y se enriquecen las partículas de fago que expresan Fab humano, que reconocen específicamente a BSW17. Por lo tanto, estos fragmentos recombinantes de Fab son mimocuerpos de la invención y representan antiidiotipos contra las regiones hipervariables de BSW17. Cuando se los utiliza como vacunas, ellos inducen una respuesta inmune que resulta en la producción de anticuerpos tipo BSW17 en el paciente alérgico. Ya que BSW17 no es anafilactogénico ni inhibidor del enlazamiento de IgE/IgERI ni de la síntesis de IgE sobre las células B, los anticuerpos policlonales surgidos en el paciente contra la vacuna Fab antiidiotípica BSW17 tienen propiedades similares. La respuesta inmune es muy específica y segura ya que, en contraste con el "método clásico de la vacuna", no están presentes fragmentos de proteína derivados de IgE lo cual generaría el entrelazamiento de los anticuerpos en los pacientes inmunizados, y se pueden contemplar composiciones que están exentas de excipiente.
Estos mimocuerpos de BSW17 son anticuerpos recombinantes o fragmentos de anticuerpo que consisten de dominios variables (dominios V) y dominios constantes (dominios C) derivados de la inmunoglobulina humana G. Se han identificado dos clones diferentes (clones 52 y 43), que muestran diferentes fragmentos de mimocuerpo sobre su superficie, por medio de bioselección de bibliotecas de fago anticuerpo sobre anticuerpo BSW17 inmovilizado. La estructura del mimocuerpo que imita al epítopo de BSW17 sobre residuos de IgE humana dentro de las regiones hipervariables (CDR) y las regiones adyacentes del marco (FR) de los dominios V. El ADNc y las secuencias de aminoácidos de los dominios de V de cadena liviana y pesada del clon 52 y del clon 43 son mostrados en las Figuras 5a hasta 5d (Seq. Id. No. 1 a 8). La construcción del clon 52 de cadena liviana (L.C.)_{2} consiste de un fragmento dimérico de cadena liviana "tipo Fab". La estructura completa de estos mimocuerpos de BSW17 está representada esquemáticamente en la Figura 4A hasta 4C, con lo cual las partes de la región constante de la misma se deben entender también como que cubren modificaciones estéricas menores tal como las encontradas en las variantes alotípicas como se mencionó anteriormente. La secuencia de aminoácidos para cada cadena completa liviana y pesada de estos clones es suministrada en las Figuras 12a hasta 12d (Seq. Id. No. 35 a 38).
Los mimocuerpos de la invención poseen actividad farmacológica. Ellos están por lo tanto indicados para uso como productos farmacéuticos, por ejemplo como antígenos para vacunas. Ya que son sustancialmente incapaces de mediar la liberación de la histamina no citolítica, son capaces de producir anticuerpos con fuerte reactividad serológica cruzada con las secuencias objetivo de aminoácidos de la región Fc de IgE.
La dosis inicial de mimocuerpo de la invención está, por ejemplo, aproximadamente entre 0,05 mg y aproximadamente 5 mg, preferiblemente aproximadamente 1 mg; se administrará, por ejemplo, en forma nasal, o subcutánea o intramuscular, seguido por dosis repetidas (refuerzo) del mismo, por ejemplo, 14 a 28 días después. Las dosis a ser utilizadas dependerán en alguna medida de la edad, el peso y la salud general del paciente y se pueden ajustar según sea conveniente.
La vacunación directa, especialmente la inmunización activa con los mimocuerpos de la invención se llevará a cabo preferiblemente utilizando péptidos recombinantes (fragmento Fab, de cadena liviana o cadena pesada) que pueden ser producidos en diferentes sistemas huéspedes de expresión, por ejemplo, bacterias, hongos, o células eucariotas en forma convencional.
Se prefiere la administración del mimocuerpo recombinante libre. Sin embargo, también es posible incrementar la inmunogenicidad del inmunógeno adicionalmente por medio de acoplamiento químico a un portador inmunogénico. El término "material portador inmunogénico" incluye aquí a aquellos materiales que tienen la propiedad de producir independientemente una respuesta inmunogénica en un animal huésped y que se puede acoplar en forma covalente a un polipéptido ya sea directamente a través de la formación de enlaces peptídicos o éster entre grupos carboxilo, amino o hidroxilo libres en el polipéptido y en los grupos correspondientes sobre el material portador inmunogénico o alternativamente por medio del enlazamiento a través de un grupo de enlazamiento bifuncional convencional. Los ejemplos de tales portadores incluyen albúminas de sueros animales, globulinas de sueros animales, tiroglobulinas de animales, hemoglobinas de animales, hemocianinas de animales (particularmente Hemocianina de Lapa de Keyhole [KLH]), proteínas extraídas de ascaris, por ejemplo, extractos de ascaris tales como aquellos descritos en J. Immun. 111 [1973] 260-268, J. Immun. 122 [1979] 302-308, J. Immun. 98 [1967] 893-900 y Am. J. Physiol. 199 [1960] 575-578, o productos purificados de los mismos; polilisina, ácido poliglutámico, copolímeros de lisina-ácido glutámico, copolímeros que contienen lisina u ornitina, etc. Recientemente, se han producido vacunas utilizando al toxoide de la difteria tal como CRM197 o al toxoide del tétano como materiales portadores inmunogénicos (Lepow. M. L., y colaboradores, J. Infectious Diseases 150 [1984] 402-406; y Coen Beuvery, E. y colaboradores, Infection and Immunity 40 [1983] 39-45) y estos materiales toxoides también pueden ser utilizados aquí. En contraste con la toxina de la difteria desintoxicada químicamente, se utiliza preferiblemente toxina de la difteria mutada recombinante CRM197. En CRM197, se reemplaza el residuo 52 de glicina por medio de ácido glutámico, resultando en un producto no tóxico. CRM197 es una proteína portadora no tóxica bien caracterizada y es utilizada en una vacuna humana registrada. La proteína purificada derivada de tuberculina (PPD) puede ser utilizada también en el esquema de inmunización "activa" ya que: (1) no induce por si misma una respuesta de célula T (es decir, es en efecto un "hapteno de célula T") y aún se comporta como un antígeno completamente procesado y es reconocido por las células T como tal; (2) se sabe que es uno de los más potentes "portadores" de hapteno en el modo de reconocimiento enlazado; y (3) puede ser utilizado en humanos sin análisis adicional.
Como agentes de enlazamiento del portador del hapteno, se pueden emplear aquellos convencionalmente empleados en la preparación de antígenos. El acoplamiento covalente de los mimocuerpos de la invención al material portador inmunogénico se puede llevar a cabo en forma convencional. Por ejemplo, para acoplamiento covalente directo es posible utilizar como agentes de acoplamiento derivados de bis-N-succinimidilo, más preferiblemente bis(succinimidil)suberato, o glutaraldehído o carbodiimida, más preferiblemente (diciclohexil)carbodiimida o 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida.
Las proporciones de hapteno, de agente de enlazamiento del portador de hapteno y de portador se pueden determinar apropiadamente, pero se prefiere que el portador esté en una cantidad aproximadamente de 1 hasta aproximadamente 6 veces, preferiblemente aproximadamente desde 1 hasta aproximadamente 5 veces el peso del hapteno, y el agente de enlazamiento del portador del hapteno está en una cantidad aproximadamente desde 5 hasta aproximadamente 10 veces el equivalente molar del hapteno. Por medio de la reacción anterior de acoplamiento, el portador se enlaza al hapteno a través del agente de enlazamiento del portador del hapteno hasta obtener un antígeno deseado compuesto de un complejo péptido-portador de mimótopo de la invención y portador.
Después de completar la reacción, se puede aislar el inmunógeno resultante y purificarlo en forma convencional, tal como por medio de diálisis, filtración por gel o precipitación por fraccionamiento.
La presente invención está esencialmente dirigida a inmunización activa por medio de vacunación directa; sin embargo, también se contempla la inmunización pasiva. En tal situación, se administran los mimocuerpos de la invención a un animal no humano adecuado y se aíslan y purifican los anticuerpos generados en contra de estos, y posteriormente se los administra a un sujeto humano para inducir el alivio de los síntomas alérgicos.
Los mimocuerpos de la invención están indicados para ser utilizados como compuestos farmacéuticos, especialmente vacunas, en particular en el tratamiento de enfermedades mediadas por IgE, tales como alergia, por ejemplo asma, dermatitis atópica, formas alérgicas de eosinofilia, rinitis, urticaria crónica y alergias por alimentos.
Se entiende que el "tratamiento" comprende el tratamiento profiláctico así como el curativo. El huésped es preferiblemente humano, pero la invención es aplicable, con los cambios apropiados, esencialmente a cualquier mamífero, por ejemplo un gato o un perro.
Explicación de las figuras
Figura 1:
Interacción entre IgE y su receptor de alta afinidad.
Figura 2:
Propiedades del anticuerpo BSW 17 anti-hIgE.
Figura 3:
La red antiidiotípica:
\quad
El epítopo hIgE reconocido por BSW 17 y el parátopo antiidiotípico están indicados esquemáticamente como puntos negros. Los círculos negros indican las regiones homólogas hipervariables del anticuerpo BSW 17 (Ab1) y los anticuerpos policlonales 3 (Ab3), inducidos por inmunización con el anticuerpo antiidiotípico Ab2.
Figura 4:
Estructura de tres mimocuerpos recombinantes de BSW 17:
\quad
A: BSW17 anti-id, clon 52 (SDS426), cadena liviana: (L.C.)_{2} \hskip0.5cm (\underbar{Seq. Id. No: 36})
\quad
B: BSW17 anti-id, clon 52 (SDS427), Fab: \hskip2cm Fab (\underbar{Seq. Id. Nos: 35 y 36})
\quad
C: BSW17 anti-id, clon 43 (SDS463), Fab: \hskip2cm F_{AB} (\underbar{Seq. Id. Nos: 37 y 38})
Figura 5:
Clones Fab anti-BSW17: Secuencia de ADN de inmunoglobulina humana desplegada por el bacteriófago y la secuencia deducida del aminoácido:
\quad
Las regiones hipervariables (Regiones que Determinan la Complementariedad; CDR) están en itálicas:
\quad
Figura 5a: clon 52; cadena pesada variable (\underbar{Seq. Id. Nos: 1 y 2}) (CDR1: \underbar{Seq. Id. Nos. 39 y 40}; CDR2: \underbar{Seq. Id. Nos. 41 y 42}; CDR3: \underbar{Seq. Id. Nos. 43 y 44});
\quad
Figura 5b: clon 52; cadena liviana variable (\underbar{Seq. Id. Nos: 3 y 4}) (CDR1: \underbar{Seq. Id. Nos. 45 y 46}; CDR2: \underbar{Seq. Id. Nos. 47 y 48}; CDR3: \underbar{Seq. Id. Nos. 49 y 50});
\quad
Figura 5c: clon 43; cadena pesada variable (\underbar{Seq. Id. Nos: 5 y 6}) (CDR1: \underbar{Seq. Id. Nos. 51 y 52}; CDR2: \underbar{Seq. Id. Nos. 53 y 54}; CDR3: \underbar{Seq. Id. Nos. 55 y 56});
\quad
Figura 5d: clon 43; cadena liviana variable (\underbar{Seq. Id. Nos: 7 y 8}) (CDR1: \underbar{Seq. Id. Nos. 57 y 58}; CDR2: \underbar{Seq. Id. Nos. 59 y 60}; CDR3: \underbar{Seq. Id. Nos. 61 y 62}).
Figura 6:
Homología de la secuencia de aminoácidos entre rFab anti-BSW17 y el dominio C\varepsilon3 de IgE humana:
\quad
A: Fab anti-id, clon 52; cadena pesada (hIGE, C\varepsilon3: \underbar{Seq. Id. No: 25}; clon 52: \underbar{Seq. Id. No: 26});
\quad
Fab anti-id, clon 52; cadena liviana, alineamiento 1 (hIGE, C\varepsilon3: \underbar{Seq. Id. No: 27}; clon 52: \underbar{Seq. Id. No: 28});
\quad
Fab anti-id, clon 52; cadena liviana, alineamiento 2 (hIGE, C\varepsilon3: \underbar{Seq. Id. No: 29}; clon 52: \underbar{Seq. Id. No: 30}), respectivamente;
\quad
B: Fab anti-id, clon 43; cadena pesada (hIGE, C\varepsilon3: \underbar{Seq. Id. No: 31}; clon 43: \underbar{Seq. Id. No: 32});
\quad
Fab anti-id, clon 43; cadena liviana (hIGE, C\varepsilon3: \underbar{Seq. Id. No: 33}; clon 43: \underbar{Seq. Id. No: 34}), respectivamente. Alineación de la secuencia de aminoácidos: los residuos idénticos se muestran en cajones negros, los aminoácidos similares están en cajones grises (Lipman y Pearson). Las posiciones de los residuos de Fc\varepsilon se indican sobre la parte superior de cada alineación. La contribución de regiones hipervariables (CDR) y del marco (FR) de los fragmentos de Fab recombinante se muestran debajo de cada par de secuencias.
Figura 7:
Enlazamiento competitivo de rFab de BSW17 anti-id sobre células CHO\alpha cebadas con IgE con BSW17 marcado con FITC
Figura 8:
Enlazamiento de inmunoglobulinas de mimocuerpo anti-BSW17 de conejo purificadas por afinidad a IgE humana:
\quad
Determinación de complejos de hIgE/anti-mimocuerpo por medio de ELISA tipo sándwich: las preparaciones de mimocuerpo anti-BSW17 purificadas por inmunoafinidad y hIgE fueron mezcladas en concentración equimolar e incubadas durante la noche a 4ºC. A las mezclas de incubación fueron posteriormente añadidas a pozos de placa para microtitulación recubiertas con anticuerpo monoclonal LE27 anti-hIgE (1 \mug/ml) como anticuerpo de captura. Se detectó IgG mimocuerpo enlazado con IgG-HRP anticonejo de cabra:
\quad
\Box = complejos de hIgE / SDS410
\quad
\circ = complejos de hIgE / SDS411
Figura 9
Respuesta inmune del mimocuerpo anti-BSW17 en ratones Balb/c:
\quad
\sqbullet = ratón 1; \bullet = ratón 2; \ding{116} = ratón 3; \ding{115} = ratón 4; \blacklozenge = ratón 5
\vskip1.000000\baselineskip
\quad
A: anti-id-BSW17. 52; cadena liviana (SDS426);
\quad
B: anti-id-BSW17. 52; Fab (SDS427);
\quad
C: anti-id-BSW17. 43; Fab (SDS463); los valores O. D. representan las lecturas de densidad óptica, corregidas por el enlazamiento de fondo a pozos no recubiertos. Se muestran los valores promedio de las mediciones por duplicado. Las variaciones fueron generalmente < 0,05 O. D.
Figura 10:
Inhibición del enlazamiento de HIgE / Fc\varepsilonRI\alpha por medio de anticuerpos anti-mimocuerpo purificados por inmunoafinidad:
\quad
A:
\quad
\sqbullet = BSW17
\quad
\bullet = anti-clon 52; cadena liviana (SDS410)
\quad
\Delta = anti-clon 52; Fab (SDS411)
\quad
\ding{116}= anti-clon 52; cadena liviana (flujo continuo a través de la columna)
\quad
B:
\quad
\sqbullet = BSW17
\quad
\bullet = anti-clon 43; Fab (SDS476)
Figura 11:
Perfiles del recuento de PCA de grupos de monos Rhesus (n = 2), inmunizados con diferentes preparaciones mimocuerpo:
\quad
A: Inmunógeno: anti-id-BSW17. 52; cadena liviana (SDS426);
\quad
B: Inmunógeno: anti-id-BSW17. 52; Fab (SDS427);
\quad
C: Inmunógeno: anti-id-BSW17. 43; Fab (SDS463). Reacción de anafilaxis cutánea pasiva (PCA) en la piel de mono Rhesus en diferentes momentos después de la inmunización. Los valores del recuento de PCA representan las intensidades de PCA calculadas a partir del área bajo las curvas (AUC) generadas graficando los diámetros de los puntos azules de piel contra las concentraciones de IgE inyectado (JW8). Los recuentos son números promedio para cada grupo de dos monos inmunizados con la misma preparación de mimocuerpo, calculados a partir de los valores de un único mono mostrados en la Tabla 4. Las variaciones son mostradas como barras de error. Los valores estadísticos p están indicados por encima de las barras de error. Los períodos de las inyecciones de refuerzo son indicados por debajo del eje X.
Figura 12:
Las secuencias completas de aminoácidos para la cadena liviana y pesada de los tres mimocuerpos de BSW17:
\quad
Figura 12a: Anti-id-BSW17, clon 52: dominios variable y primero constante de cadena pesada (\underbar{Seq. Id.} \underbar{No. 35});
\quad
Figura 12b: Anti-id-BSW17, clon 52: dominios constante y variable de cadena liviana kappa (\underbar{Seq. Id. No.} \underbar{36});
\quad
Figura 12c: Anti-id-BSW17, clon 43: dominios variable y primero constante de cadena pesada (\underbar{Seq. Id.} \underbar{No. 37});
\quad
Figura 12d: Anti-id-BSW17, clon 43: dominios constante y variable de cadena liviana lambda (\underbar{Seq. Id.} \underbar{No.38}).
El clon 52 del mimocuerpo (L.C.)_{2} contiene las cadenas livianas de la Figura 12b (\underbar{Seq. Id. No. 36}) enlazadas por medio de puentes disulfuro como se índica en la Figura 4A.
El clon 52 del mimocuerpo Fab contiene la cadena liviana de la Figura 12b (\underbar{Seq. Id. No. 36}) y la cadena pesada de la Figura 12a (\underbar{Seq. Id. No. 35}), enlazadas por medio de puentes disulfuro como se índica en la Figura 4B.
El clon 43 del mimocuerpo Fab contiene la cadena liviana de la Figura 12d (\underbar{Seq. Id. No. 38}) y la cadena pesada de la Figura 12c (\underbar{Seq. Id. No. 37}), enlazadas por medio de puentes disulfuro como se índica en la Figura 4C.
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes Ejemplos ilustran la invención y no son limitativos. Las temperaturas están en grados Celsius. Se utilizan las siguientes abreviaturas:
anti-id
= antiidiotípico
ABTS
= [2,2'-azinodi(3-etil-benztiazolina) sulfonato]
BSA
= albúmina de suero bovino
BSW17
= anticuerpo IgE antihumano monoclonal de ratón; específico para C\varepsilon3
CDR
= regiones determinantes complementarias
C\varepsilon3
= tercer dominio de la región constante de cadena pesada de IgE
C\varepsilon4
= cuarto dominio de la región constante de cadena pesada de IgE
C\varepsilonE
= péptido mimótopo que imita la región del epítopo de C\varepsilon3 de BSW17
C\varepsilonM
= péptido mimótopo que imita la región del epítopo de C\varepsilon3 de BSW17
cfu
= unidades formadoras de colonias
ELISA
= Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas
Fab
= fragmento de anticuerpo que carece de las regiones constantes de cadena pesad 2 y 3
Fc\varepsilonRI; IgERI
= receptor de alta afinidad para IgE
Fc\varepsilonRI\alpha
= receptor de alta afinidad para IgE, una cadena
FCS
= suero fetal de ternera
FR
= regiones marco
FITC
= conjugado de isocianato de fluoresceína
HRP
= peroxidasa de rábano
HSA
= albúmina de suero humano
(h)IgE
= (humana) inmunoglobulina E
mAb
= anticuerpo monoclonal
MNC
= células mononucleares
NIP
= ácido 3-nitro-4-hidroxi-yodofenil acético
p.c.
= policlonal
Phab
= fago que despliega fragmentos de Fab (bacteriófago que expresa a Fab)
PBS
= solución salina amortiguada con fosfato
PCA
= anafilaxis cutánea pasiva
PWM
= mitógeno de la hierba carmín
r
= recombinante
RT
= temperatura ambiente
SPR
= resonancia del plasmón de superficie
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 1 Construcción de bibliotecas que despliegan fagos a) Fuente de linfocitos
Se utilizaron dos donantes adultos machos para preparar células mononucleares (MNC) a partir de sangre periférica. Un primer donante atópico adulto macho que tenía síntomas clínicos de alergia se le administró un refuerzo con una inyección intramuscular de 0,5 ml de toxoide de tétanos adsorbido en alumbre (Te Anatoxal Bern, Swiss Serum and Vaccine Institute, Berna, Suiza). Se aislaron las MNC 7 días después de utilizar centrifugación en gradiente de Ficoll (Lymphoprep, Pharmacia, Milwaukee, WI. EUA) y luego se las cultivó durante 3 días en medio RPMI-1640 (Seromed, Basilea, Suiza) que contenía 10^{3} U/ml de IL-2 (Sigma, St. Louis, MO, EUA), 50 \mug/ml de células Pansorbin (cepa Cowan I de estafilococo áureo, Calbiochem, La Jolla, CA, EUA) y toxoide de tétanos diluido 1:1000 en medio RPMI-1640. Se preparó luego ARN a partir de estas células utilizando un procedimiento de isocianato de guanidinio en fenol - cloroformo (Chomczynsi, P. y Sacci, N., Anal. Biochem. 162 [1987] 156). Al segundo donante adulto macho, un donante Rhesus D hiperinmune, se le suministró un refuerzo intravenoso de 2 ml de hematíes de un donante macho conocido del grupo sanguíneo 0 RhD+. Se aislaron las MNC por medio de centrifugación en gradiente de Ficoll 18 días después del refuerzo. Se cultivaron primero las células durante 3 días en medio RPMI-1640 que contenía 10^{3} U/ml de IL-2 y 10 \mug/ml de mitógeno de la hierba carmín (PWM; Sigma L9379, Buchs, Suiza) antes de extraer el ARN.
Se obtuvieron muestras de amígdala humana a partir de tres niños a los cuales se les había practicado ablación de las amígdalas. Se maceraron las amígdalas en medio RPMI-1640 en cajas de Petri estériles y se las cortó en pedazos pequeños. Se trasfirió luego el tejido, las células y el medio a tubos estériles, a los restos de tejido se les permitió asentarse y se aislaron las MNC del sobrenadante utilizando centrifugación en gradiente de Ficoll. Se seleccionaron las células B por medio de incubación de las MNC con cuentas paramagnéticas recubiertas con CD19 y luego se preparó el ARN de acuerdo con el procedimiento del isocianato de guanidinio en fenol - cloroformo mencionado anteriormente.
El vector pComb3 utilizado para la clonación de las cadenas para todos los mimocuerpos se obtuvo con el Scripps Research Institute La Jolla, CA, EUA (Barbas III, C.F. y Lerner, R.A., Companion Methods Enzymol. 2 [1991] 119). La cepa XL1-Blue de Escherichia coli utilizada para la transformación del vector pComb3 y del fago auxiliar VCSM13 fueron adquiridos a Stratacyte (La Jolla, CA, EUA).
\vskip1.000000\baselineskip
b) Construcción de bibliotecas de bacteriófagos
Se construyeron tres bibliotecas separadas: la primera llamada BS a partir de las MNC aisladas del primer donante atópico macho, la segunda llamada LD2 a partir de las MNC recogidas a los 18 días después de recibir el refuerzo intravenoso del segundo donante macho, y la tercera llamada CT a partir de la población enriquecida con células B de las MNC aisladas de amígdalas de niños. Se preparó el ARN total a partir de estas células utilizando el método del isocianato de guanidinio en fenol - cloroformo. A partir de este ARN, se utilizaron 10 \mug para elaborar ADNc utilizando un iniciador oligo(dT) (400 ng) y se transcribió en forma inversa con transcriptasa inversa M-MuLV de acuerdo con las condiciones especificadas por el proveedor (Boehringer Mannheim, Alemania). Se llevó a cabo la amplificación por PCR como se describe en Vogel, M. y colaboradores, E.J. of Immunol. 24 (1994) 1200. En resumen, 100 \mul de medio de reacción para PCR contenían amortiguador de Perkin-Elmer con MgCl_{2} 10 mM, 5 \mul de ADNc, 150 ng de cada iniciador apropiado 5' y 3', todos los cuatro dNTP en 200 \muM cada uno y 2 U/ml de Taq Polimerasa (Perkin Elmer, NJ, EUA). Se llevó a cabo la amplificación por PCR de las cadenas liviana y pesada de la molécula de Fab separadamente con un juego de iniciadores de Stratacyte (los detalles se encuentran más adelante). Para la cadena pesada, se utilizaron seis iniciadores secuencia arriba que hibridan a cada una de las seis familias de los genes V_{H}, mientras que se utilizaron un iniciador de cadena lambda y uno de cadena kappa para las cadenas livianas. Los iniciadores secuencia abajo fueron diseñados para hacer coincidir la región de bisagra de los dominios constantes \gamma1 y \gamma3 para la cadena pesada. Para la cadena liviana, se acoplaron los iniciadores secuencia abajo con el extremo 3' de los dominios constantes de kappa y lambda. Se reunieron separadamente los productos de la PCR de cadena pesada y liviana, se purificó sobre y se cortó con las enzimas de restricción Xho1/Spe1 y Sac1/ Xba1 (Boehringer Mannheim, Alemania), respectivamente. Después de la digestión, se extrajeron los productos de la PCR una vez con fenol: cloroformo: alcohol isoamílico y se purificó por medio de escisión en gel. La inserción del fragmento de Fd digerido con Xho1/Spe1 y la unión posterior de la cadena liviana digerida con Sac1/Xba1 dentro del vector pComb3, la transformación dentro de células XL1-Blue, y la producción de fagos fue llevada a cabo como se describe en Barbas III, C.F. y Lerner, R.A., Companion Methods Enzymol. 2 [1991] 119. Después de la transformación de las muestras de células XL1-Blue de E. coli, fueron retiradas y tituladas sobre placas para determinar el tamaño de la biblioteca. Estos resultados indicaron bibliotecas de expresión de 1 x 10^{7}, 7,7 x 10^{6} y 3 x 10^{6} cfu (unidades formadoras de colonias) para BS, LD2 y CT, respectivamente.
c) Iniciadores para PCR
100
Ejemplo 2 Selección de fragmentos de anticuerpo específicos para BSW17 recombinante (mimocuerpos de BSW17) de bibliotecas de fago
La selección de fagos específicos para BSW17 se llevó a cabo realizando cuatro rondas de paneo. Cada ronda comprende dos absorciones previas sobre Le27 del mAb anti-IgE antes de la absorción sobre el BSW17 del mAb anti-IgE. La absorción previa se realizó de la siguiente manera: se recubrieron dos inmunotubos (Maxisorp, Nunc) con 4 ml de Le27 (20 \mug/ml) durante la noche a 4ºC, luego se bloqueó durante 2 h a 37ºC con 4 ml de PBS/leche descremada al 2%. Se incubó un primer tubo sobre una plataforma giratoria por encima y por debajo a RT durante 30 min con 4 ml de solución de bloqueo que contiene 2 x 10^{12} cfu de cada biblioteca de fago (BS, LD2 y CT). Los fagos fueron trasferidos luego dentro del segundo tubo y se repitió el proceso una vez más. Después de la segunda absorción previa se añadieron los fagos no específicos de Le27 a un tubo recubierto con 4 ml de BSW17 (20 \mug/ml) y se bloqueó con PBS/leche descremada al 2% como se describió anteriormente. Después de incubación durante 2 h a RT sobre una plataforma giratoria por encima y por debajo, se lavó el tubo sucesivamente 10 veces con PBS/Tween al 0,1% y 10 veces con PBS. Se eluyeron los fagos adherentes sucesivamente primero con 500 \mul de trietilamina 0,1 M y después de enjuagar tres veces en PBS, con 500 \mul de HCl 0,1 M se ajustó el pH en 2,2 con glicina y con un contenido de 1 mg/ml de BSA. Cada etapa de elución fue llevada a cabo durante 10 min a RT y se neutralizaron los fagos eluidos con 250 \mul de Tris-HCl 1 M, pH 7,4 y 30 \mul de Tris base 2 M, respectivamente. Se amplificaron los fagos seleccionados utilizando células XL1-Blue de E. coli como se describe en Barbas y Lerner, ver más arriba (1991) antes de ser utilizados posteriormente en tres rondas más de paneo. Después de cada ronda de paneo, se monitoreó el título de los fagos eluidos por medio de la determinación de cfu (Tabla 2):
TABLA 2 Enriquecimiento de Phabs específicos de BSW17 por medio de rondas consecutivas de paneo
1
Ejemplo 3 Secuencia de nucleótidos de mimocuerpos recombinantes de BSW17
Se preparó el ADN de plásmido a partir de clones seleccionados de fago utilizando un kit Nucleotrap (Machery-Nagel, Düren, Alemania) y se llevó a cabo la secuenciación del ácido nucleico sobre un sistema de secuenciación ABI 373A utilizando un Kit de Secuenciación PRISM Ready Reactin DyeDeoxy Terminator Cycle (Applied Biosystems, Alemania).
\vskip1.000000\baselineskip
Los iniciadores utilizados para la secuenciación de la secuencia de cadena pesada fueron:
CH\gammal (5'-CGCTGTGCCCCCAGAGGT-3') (Seq. Id. No. 20) y
pCH (5'-GGCCGCAAATTCTATTTCAAGG-3') (Seq. Id. No. 21). 
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Para obtener las secuencias de la cadena liviana se utilizaron los siguientes iniciadores:
C\lambda (5'-GAGACACACCAGTGTGGC-3') (Seq. Id. No. 22),
C\kappa (5'-CACAACAGAGGCAGTTCC-3') (Seq. Id. No. 23) y
pCL (5'-CTAAACTAGCTAGTCGCC-3') (Seq. Id. No. 24). 
\vskip1.000000\baselineskip
Los iniciadores fueron sintetizados por Microsynth (Balgach, Suiza). A partir de las secuencias de ADN de una selección de diferentes clones de fago, se dedujeron dos diferentes secuencias de aminoácidos para las cadenas liviana y pesada de anticuerpo recombinante, específicas de BSW17 (clon 52, clon 43). Las secuencias y su distribución para las regiones hipervariables (CDR) y las secuencias del marco son mostradas en las Figuras 5a a 5d (Seq. Id. Nos. 1 a 8).
La alineación de las secuencias de aminoácidos de los fragmentos de anticuerpo recombinante específicas de BSW17 desplegada por los clones 52 y 43 con IgE humano revela homologías con tramos del dominio C\varepsilon3 humano que están involucrados en el enlazamiento al receptor de alta afinidad (Figura 6) (Seq. Id. Nos. 25 a 34). Por lo tanto, los parátopos desplegados por los fragmentos de anticuerpo recombinante imitan a estructuras definidas presentes en IgE humano ("mimocuerpos"). Los anticuerpos generados en pacientes alérgicos por medio de la vacunación con estos mimocuerpos recombinantes reconocerán por lo tanto a la IgE humana y evitarán reacciones alérgicas por medio de la inhibición del enlazamiento de IgE/IgERI.
Ejemplo 4 Preparación y purificación de mimocuerpos recombinantes de BSW17
Se generaron mimocuerpos solubles derivados de los clones de fago 43 y 52 (Figura 5) (Seq. Id. Nos. 1 a 8). Con el propósito de producir fragmentos solubles de Fab, se removió y reemplazó la secuencia gIII que codifica a la proteína pIII de la cola de la partícula de fago por una marca de hexahistidina para facilitar la purificación del fragmento de Fab por medio de cromatografía de afinidad de quelato de Ni^{2+}.
Se preparó ADN de fagémido utilizando un kit Nucleotrap (Macherey-Nagel, Düren, Alemania) y se digirió con SpeI y NheI. Se trató al fragmento de ADN de 4,7 kb que carecía de la porción gIII con fosfatasa alcalina y se purificó por medio de electroforesis en gel de agarosa. Se ligó el ADN linealizado con un fragmento de ADN que codifica a la histidina seis en el extremo 5' y en los extremos 3' de los sitios de restricción de SpeI y NheI, respectivamente. Después de la unión, se transformó al ADN dentro de células XL1-Blue de E. coli y se seleccionaron los clones individuales que producen mimocuerpos solubles. Uno de estos clones fue escogido para purificación a gran escala y fue cultivado en 1 L de SB (Súper Caldo) que contenía 50 \mug/ml de carbenicilina a 37ºC hasta una OD de 1,0 a 600 nm. Se indujo luego el cultivo con isopropil \beta-D-tiogalactopiranósido 1 mM (IPTG) (Biofinex, Praroman, Suiza) y se desarrolló durante 4h a 37ºC. Se precipitaron las bacterias a 6000 rpm durante 20 min a 4ºC, se las resuspendió en 30 ml de amortiguador de sonicación (NaPO_{4} 0,1 M, urea 8 M, pH 8,0) y posteriormente se sonicó sobre hielo. Se removieron entonces los componentes insolubles por medio de centrifugación a 15.000 rpm durante 30 min a 4ºC y se purificó el sobrenadante que contenía Fab sobre una columna de acetato de nitrilo de 1 ml. Se lavó la columna con amortiguador de sonicación para remover los contaminantes, seguido por dos etapas de elución con amortiguador de sonicación a pH 5,1 y 4,9, respectivamente. Se monitorearon las fracciones a una OD de 280 nm y se analizaron alícuotas por medio de SDS-PAGE (12% de reducción) para confirmar la pureza e identidad del mimocuerpo. Se reunieron luego las fracciones que contenían los mimocuerpos, se las concentró y dializó contra PBS.
La pureza de las preparaciones finales de mimocuerpo (como se especificó en las Figuras 4 y 12) (Seq. Id. Nos. 35, 36, 37, 38) fue evaluada analizando una muestra por medio de SDS-PAGE. Se detectaron las bandas de proteína por medio de coloración con azul de Coomassie. Se determinó la concentración comparando la banda de mimocuerpos coloreada con azul de Coomassie con cantidades conocidas de una proteína estándar (BSA) y también por medio de espectrofotometría. Estas preparaciones de mimocuerpo fueron utilizadas posteriormente para un ensayo de enlazamiento competitivo y para inmunización de conejos.
Ejemplo 5 Inhibición del desplazamiento mediado por BSW17 de la IgE enlazada al receptor por medio de mimocuerpos recombinantes de BSW17
BSW17 reconoce y desplaza a la IgE enlazada a su receptor de alta afinidad. Con el propósito de determinar que los fragmentos rFab de BSW17 anti-id son capaces de inhibir su reacción de desplazamiento, se llevó a cabo un ensayo de enlazamiento competitivo utilizando IgE unida a la superficie de la célula expuesta a IgERI. Se utilizó para el ensayo una línea celular recombinante de ovario de hámster chino (CHO), transfectada en forma estable con ADN que codifica a la cadena \alpha de IgERI humana [línea celular CHO\alpha; Blank, U. y colaboradores, Eur. J. Biol. Chem. 266 (1991) 2639]. Se incubaron una serie de muestras de prueba que contenían 5 x 10^{4} células CHO\alpha en amortiguador FACS (PBS, BSA al 0,3%, NaN_{3} al 0,02%) con 48 ng de hibridoma B11 de IgE (Zürcher, A.W. hibridoma, Immunol. Lett. 46 (1995) 49-57] durante 15 min a RT. Después de lavar una vez con amortiguador FACS, se incubó cada muestra durante 15 min a RT con complejos preformados de BSW17 conjugado con isocianato de fluoresceína (BSW17 - FITC) y cantidades crecientes de rFabs de BSW17 anti-id. Los complejos fueron preparados de la siguiente manera: se incubaron 50 \mul de BSW17 - FITC en una concentración de 1,3 nM con diferentes cantidades de rFabs de BSW17 anti-id (40 nM; 200 nM; 1 \muM; 4 \muM; y 40 \muM) durante 30 min a RT. Se incubó una muestra de control que contenía únicamente las células CHO\alpha durante 15 min a RT con BSW17-FITC para la determinación de enlazamiento no específico. Se lavaron las células CHO\alpha una vez con amortiguador FACS y después de la adición de 100 \mul de FACS se analizaron las células en un citómetro de flujo FACSCalibur (Becton Dickinson) equipado con un láser de argón sintonizado en 488 nm. Las entradas en el dot blot de dispersión lateral/hacia adelante, fueron fijadas alrededor de las células monoméricas y se cuantificó y expresó como el canal medio de fluorescencia (mcf). Se calculó el porcentaje de células positivas como el porcentaje de enlazamiento de BSW17 a las células CHO\alpha. Como se observa en la Figura 7, el enlazamiento de BSW17 a las células CHO\alpha disminuye con las concentraciones crecientes de fragmentos Fab de BSW17 anti-id, indicando que los dos clones Fab de BSW17 anti-id fueron capaces de inhibir el enlazamiento de BSW17 a IgE.
Ejemplo 6 Inmunización de conejos con mimocuerpos recombinantes BSW17
Este Ejemplo muestra que la inmunización ya sea con rFab anti-BSW17 (que consiste de una cadena pesada más una cadena liviana del clon 52 como se muestra en la Figura 4B junto con las Figuras 12a y 12b) (Seq. Id. Nos. 35 y 36), o el mimocuerpo recombinante que consiste únicamente de la cadena liviana (Figura 4A junto con la Figura 12b) (Seq. Id. No. 36) induce en los conejos una respuesta inmune humoral que reacciona en forma cruzada con IgE humana. A dos conejos hembra blancos de Nueva Zelanda se les suministró una inmunización primaria en forma subcutánea con 300 \mug/ml de rFab anti-BSW17 o con un fragmento de cadena liviana del clon 52, emulsionado en una proporción 1:1 en adyuvante completo de Freund y luego recibieron tres refuerzos con la misma cantidad de mimocuerpo emulsionado en proporción 1:1 en adyuvante incompleto de Freund cada dos semanas. Se recolectaron los sueros el día 0 (sangrado previo) y los animales fueron sometidos a sangrado 7 días después de la última inyección.
Se purificaron los sueros inmunes de conejo por medio de cromatografía de inmunoafinidad utilizando IgE humana (IgE de SUS-11), entrelazada químicamente a columnas de Sefarosa 4B. Por medio de este procedimiento se puede aislar la fracción anti-hIgE de las inmunoglobulinas totales permitiendo la caracterización precisa de la respuesta inmune terapéuticamente relevante con respecto a los títulos y afinidad del anticuerpo.
La purificación por medio de inmunoafinidad de los anticuerpos anti-mimocuerpo que reaccionan en forma cruzada con IgE humana consistió de dos etapas. En la primera etapa se aisló la fracción de IgG del antisuero de conejo por medio de precipitación con sulfato de amonio; en la segunda etapa se enlazaron los anticuerpos mimocuerpo anti-BSW17 específicos para hIgE a IgE humana (IgE de SUS-11), acoplada covalentemente a CH-Sefarosa 4B, seguido de elución, diálisis y concentración.
La formación del complejo que depende de la concentración de las inmunoglobulinas purificadas por inmunoafinidad con IgE humana en solución fue confirmada por medio de ELISA: se incubó IgE de SUS-11 con cantidades equimolares de inmunoglobulinas anti-mimocuerpo durante la noche a 4ºC. Se añadieron los complejos formados en solución a los pozos de la placa de microtitulación que habían sido recubiertos con el anticuerpo monoclonal LE27 anti-hIgE como anticuerpo de captura. Se detectó la IgG anti-mimocuerpo enlazada con IgG-HRP policlonal anticonejo. Los resultados se muestran en la Figura 8.
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Ejemplo 7 Inmunización de ratones con mimocuerpos recombinantes BSW17
Los mimocuerpos recombinantes derivados tanto del clon 43 como del clon 52 pueden inducir anticuerpos anti-mimocuerpo. Las inmunizaciones fueron llevadas a cabo en ratones. Grupos de cinco ratones Balb/c fueron inyectados en forma subcutánea con 5 \mug por ratón de mimocuerpos recombinantes BSW17 que habían sido producidos en bacterias E. coli y purificados por medio de cromatografía de afinidad de níquel. Se utilizó hidróxido de aluminio como adyuvante:
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El grupo 1 fue inmunizado con el lote SDS426 = anti-id-BSW17. 52; cadena liviana
El grupo 2 fue inmunizado con el lote SDS427 = anti-id-BSW17. 52; Fab
El grupo 3 fue inmunizado con el lote SDS463 = anti-id-BSW17. 43; Fab
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Los días 21 y 41 después de la inmunización principal, se administraron dos inyecciones de refuerzo (5 \mug por ratón). Se tomaron muestras de sangre los días 0, 20, 28, 35, 42, 49 y 56 después de la inmunización principal. Se preparó el suero y se analizó la presencia de anticuerpos anti-mimocuerpo por medio de ELISA.
Se recubrieron los pozos de la placa de microtitulación con 1 \mug/ml de IgG humana policlonal y se incubó con sueros de ratón diluidos 1:50 preparados a partir de las muestras de sangre tomadas en los momentos ya indicados después de la inmunización principal. Se detectaron los anticuerpos anti-mimocuerpo enlazados (ahIgG, dirigidos contra las regiones humanas marco y de dominio constante) por medio de una segunda incubación con IgG antiratón de cabra conjugada con peroxidasa de rábano (gamIgG-HRP). Se desarrolló una reacción de color utilizando sustrato cromogénico ABTS.
Todos los ratones produjeron anticuerpos anti-mimocuerpo después del segundo refuerzo con todas las preparaciones recombinantes mimocuerpo (Figura 9).
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Ejemplo 8 Inmunoglobulinas generadas en conejos contra los mimocuerpos recombinantes BSW17 que se enlazan a IgE humana con alta afinidad
La vacunación con mimocuerpos recombinantes BSW17 es mostrada aquí para inducir una respuesta inmune humoral con alta afinidad por IgE humana. Se analizaron los parámetros cinéticos representativos para el enlazamiento de las inmunoglobulinas anti-mimocuerpo purificadas por inmunoafinidad a IgE humana por medio de resonancia de plasmón superficial (SPR).
Las mediciones de SPR fueron realizadas en un instrumento BIAcore (Biacore, Uppsala, Suecia). Se prepararon las superficies de enlazamiento específico por medio del acoplamiento de IgE humana o de IgG_{3} de múrido a un chip de sensor CM5 utilizando acoplamiento de amina de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Utilizando este procedimiento, se unen las biomoléculas a través de los grupos amino primarios a la superficie de dextrano carboximetilada del chip del sensor. Se acoplaron 10 pmoles de IgE de mieloma humano o IgE de SUS-11 a celdas de flujo separadas del chip. Se inmovilizó el mAb de IgG_{3} de múrido, ABL 364 (ATCC HB 9324) a una pista separada del mismo chip sensor. Se utilizó ABL 364 como referencia para determinar el enlazamiento de los anticuerpos anti-mimocuerpo a las estructuras de inmunoglobulina no hIgE y para corregir los posibles cambios del índice de refracción provocados por cambios de amortiguador. Las densidades del acoplamiento fueron - 13000 RU.
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Todas las interacciones biomoleculares medidas en el instrumento BIAcore fueron realizadas a 25º, utilizando HBS (Hepes 10 mM, pH = 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3,4 mM, y tensoactivo P-20 al 0,005% v/v) como amortiguador de flujo continuo. El rango de concentración de cada analito entregado a la superficie del chip sensor para análisis cinético fue de 33 nM a 499 nM. La velocidad de flujo fue de 5 \mul/min. Los analitos fueron inyectados durante 1200 s, seguido por HBS aproximadamente durante 1800 s para monitorear la disociación del analito enlazado. Se regeneró el chip con un pulso de 120 s de HCl 10 mM. Se monitoreó el enlazamiento no específico pasando los analitos sobre la pista de control ABL 364 para restarlos del enlazamiento específico antes del análisis cinético.
Las curvas de enlazamiento generadas por las mediciones por SPR fueron analizadas utilizando el paquete para análisis BIAevaluation 3.0. Para la comparación relativa de las interacciones anti-mimocuerpo / IgE se utilizó un modelo monofásico. Las constantes de velocidad de asociación K_{a}, las constantes de velocidad de disociación K_{d} y las constantes de equilibrio de disociación K_{D} = 1/K_{A} (K_{A} = constante de afinidad) fueron calculadas para cada curva y se resumen en la Tabla 3:
TABLA 3 Constantes cinéticas (SPR / BIAcore) de la interacción entre preparaciones policlonales de Ig anti-mimocuerpo de conejo (p.c.) y hIgE
2 
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Parece que los anticuerpos de alta afinidad contra IgE humana podrían ser inducidos en conejos inmunizados con mimocuerpos recombinantes BSW17 (valores de K_{D} en rango nanomolar). Fab derivado del clon 43 (SDS463; Figura 4C; anti-id-BSW17. 43) tiene la capacidad para inducir una respuesta inmune de afinidad muy alta para IgE humana (K_{D} < 1 nM).
De esta forma, por medio del uso de un anticuerpo monoclonal antiidiotípico fue posible inducir una respuesta policlonal fuerte contra IgE como se pretende por medio de la estrategia de vacunación humana.
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Ejemplo 9 Inmunoglobulinas generadas en conejos contra los mimocuerpos recombinantes BSW17 que inhiben el enlazamiento de IgE humana a su receptor de alta afinidad
Para ser activo como una vacuna antialérgica, se espera que la formación del complejo entre anticuerpos anti-mimocuerpo y hIgE, eviten que IgE se enlace a su receptor de alta afinidad. Por lo tanto, se espera que los anticuerpos específicos de IgE surgidos contra los mimocuerpos recombinantes BSW17 ejerzan su efecto terapéutico por medio de la inhibición del enlazamiento de IgE a su receptor de alta afinidad bloqueando el dominio de enlazamiento. Para confirmar esto, se analizaron los anticuerpos anti-mimocuerpo purificados obtenidos a partir de conejos inmunizados por la inhibición del enlazamiento de hIgE / Fc\varepsilonRI\alpha en un ELISA de competición. Como una lectura relevante de la enfermedad, se midió la IgE libre por medio de su capacidad para enlazarse a Fc\varepsilonRI\alpha recombinante (proteína de fusión doble RI\alpha-HSA-RI\alpha; DFP) (Figura 10).
Se incubó previamente hIgE (SUS-11; 1 \mug/ml en la Fig. 10A y 0,1 \mug/ml en la Fig. 10B) durante 16 h a +4º con cantidades crecientes de inmunoglobulinas anti-mimocuerpo o mAb BSW17 como referencia. Las inmunoglobulinas a granel presentes en el flujo a través de la columna de inmunoafinidad de la preparación SDS410 fueron incluidas como control negativo. Se añadieron los complejos formados a los pozos de la placa de microtitulación recubiertos con 1 \mug/ml del anticuerpo Le27 anti-IgE como anticuerpo infectivo y se incubó con una proteína de fusión doble (DFP) Fc\varepsilonRI\alpha -HSA - Fc\varepsilonRI\alpha marcada con peroxidasa de rábano durante 1 h a 37º. Se detectó la DFP enlazada con un sustrato cromogénico. Los valores de densidad óptica se expresaron como % de enlazamiento. El enlazamiento a la IgE de SUS-11 libre de competidor se fijó como el 100%. Se muestran los valores promedio de las mediciones por duplicado. Las variaciones estuvieron generalmente por debajo del 2%.
Los resultados muestran que la inmunización con mimocuerpos BSW17 resultan en la generación de anticuerpos anti-hIgE de alta afinidad específica en roedores. Estos anticuerpos anti-mimocuerpo inhiben el enlazamiento de IgE a su receptor de alta afinidad in vitro, indicando el valor de la estrategia de vacunación con mimocuerpo BSW17 para el desarrollo de la vacuna anti-alérgica.
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Ejemplo 10 Inhibición de la anafilaxis cutánea pasiva por medio de la vacunación de monos Rhesus con mimocuerpos recombinantes BSW17
Se puede utilizar la inhibición de anafilaxis cutánea pasiva (PCA) en monos para analizar la actividad anti-alérgica de compuestos in vivo.
Resultados de la vacunación con mimocuerpo en la inhibición de reacciones anafilácticas de la piel en monos Rhesus. Se inyectaron grupos de dos monos en forma subcutánea con 500 \mug por animal de mimocuerpos recombinantes anti-BSW17. Después de la inmunización principal, se administraron dos inyecciones de refuerzo. Aproximadamente 10 días después de cada refuerzo, se llevaron a cabo análisis de PCA. Se analizaron los monos VI 91, VI 92, VI 93 y VI 95 por la reacción de PCA una vez más tres meses después de la última inyección de refuerzo. El esquema de inmunización se resume en la Tabla 1 siguiente:
TABLA 1
3 
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Los monos Rhesus tratados previamente con dosis pequeñas de clorhidrato de ketamina (10 - 15 mg/kg, intramuscular) (Ketalar®, Parke Davis, GB) para mantenerlos inmovilizados, recibieron inyecciones i.c. de dosis diferentes de IgE (JW8) (Serotec, Oxford, Reino Unido) dentro de la piel del abdomen. IgE (JW8) es un anticuerpo quimérico que consiste de una parte de enlazamiento de antígeno específica para el hapteno NIP y una cadena pesada de Fc\varepsilon humano. Se inyectaron cantidades crecientes (0, 2, 10, 50, 250 ng/ml de solución salina) de IgE (JW8) en una serie cefalocaudal con una aguja calibre 30 en un volumen de 100 \mul. Dos horas después, se administraron en forma intravenosa 25 mg de NIP conjugado a BSA, por animal. Los animales fueron sedados nuevamente después del reto intravenoso con el conjugado NIP-BSA. Para la visualización de la reacción de la piel, se inyectó en forma intravenosa colorante azul de Evans (1%, 0,5 ml/kg) inmediatamente después del reto con el antígeno. Se leyeron las reacciones de la piel 20 minutos después de la inyección del antígeno por medio de la medición de dos diámetros de la mancha azul y calculando su diámetro promedio en mm.
Se analizó la PCA en los tiempos indicados después de la inmunización principal y el refuerzo. La intensidad de la PCA se calculó a partir del área bajo las curvas (AUC) generadas graficando los diámetros de las áreas azules de la piel contra las concentraciones de la IgE inyectada (JW8). Los puntajes de PCA mostrados en la Tabla 4 para cada mono individual, representan los valores calculados de AUC:
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TABLA 4 Efecto de la vacunación con mimocuerpo BSW17 sobre la anafilaxis cutánea pasiva en monos Rhesus
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Tomando los puntajes individuales de PCA de inmunización previa (valores el día 0) como referencia, todos los monos respondieron a la vacunación con mimocuerpo BSW17 con una reducción de la intensidad de PCA. Los mejores resultados se obtuvieron con la construcción de cadena liviana del clon 52 (SDS426) (Figura 4A) con tasas de inhibición de 60 - 83% (puntajes de PCA de 40 y 17). Los monos inmunizados con Fab del clon 52 (lote SDS427) (Figura 4B) suprimieron la PCA en un 55 - 65% (puntajes de PCA de 45 y 35). Se observó una inhibición de PCA algo menor en el rango de 18 - 38% (puntajes de PCA de 82 y 62) con Fab del clon 43 (lote SDS463) (Figura 4C), a pesar de su superioridad sobre los mimocuerpos del clon 52 con respecto al enlazamiento de BSW17 y la inducción anti-hIgE de alta afinidad en conejos.
Siguiendo con el protocolo de vacunación, la vacunación con mimocuerpos del clon 52 se tornó efectiva después de la tercera inyección de refuerzo (excepto el mono VI 92) y se observó aún supresión parcial de PCA más de tres meses después. En contraste, Fab del clon 43 fue efectiva después de la segunda inyección de refuerzo, mientras que un tercer reto con mimocuerpo no tuvo efecto.
El perfil del puntaje promedio de PCA para cada grupo de dos monos inmunizados con la misma preparación de mimocuerpo, calculado a partir de los valores de un único mono de la Tabla 4, es mostrado en la Figura 11.
Un resultado positivo de PCA en monos vacunados (con relación a los puntajes individuales previos al tratamiento o a los animales de control no tratados) es una clara indicación de la efectividad de la vacunación con mimocuerpo y prueba la validez de su concepto mecánico. La vacunación de monos Rhesus con mimocuerpos recombinantes BSW17 resulta en la generación de anticuerpos IgE antihumano de alta afinidad que inhiben la PCA in vivo.
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Referencias citadas en la descripción
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Documentos de patente citados en la descripción
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<170> Patentin Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 345
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<213> Homo sapiens 
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gtcctgtccc aggtcaactt actcgagtct gg 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtccaggtgg aggtgcagct gctcgagtct gg 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtcctgtccc aggtgcagct gctcgagtcg gg 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtctgtgccg aggtgcagct gctcgagtct gg 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtcctgtcac aggtacagct gctcgagtca gg 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agcatcacta gtacaagatt tgggctc 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtgccagatg tgagctcgtg atgacccagt ctcca 
\hfill
35 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccttctaga ttactaacac tctcccctgt tgaagctctt tgtgacgggc gaactc 
\hfill
56 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctgcacaggg tcctgggccg agctcgtggt gactca 
\hfill
36 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcattctaga ctattatgaa cattctgtag gggc 
\hfill
34 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgctgtgccc ccagaggt 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggccgcaaat tctatttcaa gg 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gagacacacc agtgtggc 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cacaacagag gcagttcc 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctaaactagc tagtcgcc 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Asn Leu Thr Trp Ser Arg Ala Ser Gly Lys Pro Val Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Asn Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211>16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Ser Pro Phe Asp Leu Phe Ile Arg Lys Ser Pro Thr Ile Thr Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211>16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Asn Leu Thr Trp Ser Arg Ala Ser Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211>29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.8cm13 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.8cm14 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.8cm15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.8cm16 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 218
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 211
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 229
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
19 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 219
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
20
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aactataata tgaac 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Tyr Asn Met Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccattagta gtcgaaattc ttacatatac tacgcagact cagtgaaggg c 
\hfill
51 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Ile Ser Ser Arg Asn Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys}
\sac{Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggccgccttt tcgactac 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211>6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Arg Leu Phe Asp Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgggctagtc agggcattaa caattattta gcc 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr Leu Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agtgcatcca ttttgcaaag t 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Ala Ser Ile Leu Gln Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
caacaatata attattatcc gctcact 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Gln Tyr Asn Tyr Tyr Pro Leu Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agcagtggtg gttactactg gacc 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggatacatct attacagtgg gagcacctcc tacaacccgt ccctcaagag t 
\hfill
51 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys}
\sac{Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gagcggggtg agaccggtct atattacccc tattactaca tagacgtc 
\hfill
48 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Arg Gly Glu Thr Gly Leu Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Ile Asp Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
actggaacca gaagtgacgt tggtggttat aactatgtct cc 
\hfill
42 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Gly Thr Arg Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gatgtcagta atcggccctc a 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agctcatata caagcagcag cactctcggg gtg 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Leu Gly Val}
\vskip1.000000\baselineskip

Claims (6)

1. Un anticuerpo monoclonal recombinante o fragmento de anticuerpo que es antiidiotípico al anticuerpo BSW17 que interfiere con el enlazamiento de la región C\varepsilon3 de IgE al receptor de alta afinidad para IgE que comprende
-
un dímero de 2 cadenas livianas que contiene las 3 regiones que determinan la complementariedad de las SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48 y SEQ ID NO: 50, o
-
un dímero de una cadena liviana que contiene las 3 regiones que determinan la complementariedad de las SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48 y SEQ ID NO: 50 y de una cadena pesada que contiene las 3 regiones que determinan la complementariedad de las SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 44, o
-
un dímero de una cadena liviana que contiene las 3 regiones que determinan la complementariedad de las SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60 y SEQ ID NO: 62 y de una cadena pesada que contiene las 3 regiones que determinan la complementariedad de las SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54 y SEQ ID NO: 56.
2. Un anticuerpo monoclonal recombinante o fragmento de anticuerpo como el definido en la reivindicación 1 que contiene 2 polipéptidos con la SEQ ID NO: 36 o variantes de la región constante alotípica de los mismos, un fragmento Fab que contiene polipéptidos con la SEQ ID NO: 35 y la SEQ ID NO: 36 o variantes de la región constante alotípica de los mismos, o un fragmento Fab que contiene los polipéptidos con la SEQ ID NO: 37 y la SEQ ID NO: 38 o variantes de la región constante alotípica de los mismos.
3. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal o un fragmento de anticuerpo como el definido en la reivindicación 1 ya sea como una entidad molecular única o como un conjugado de proteína químicamente acoplado a una molécula inmunogénica portadora, en su caso junto con un adyuvante y excipientes convencionales adicionales.
4. Un anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo como el definido en la reivindicación 1 para uso como una composición farmacéutica en el tratamiento de enfermedades mediadas por IgE.
5. Anticuerpos monoclonales y policlonales obtenidos a partir de un anticuerpo monoclonal o un fragmento de anticuerpo como el definido en la reivindicación 1 parta uso como una composición farmacéutica en el tratamiento de enfermedades mediadas por IgE.
6. El uso del anticuerpo BSW17 que interfiere con el enlazamiento de la región C\varepsilon3 de IgE al receptor de alta afinidad para IgE para la identificación de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1.
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