ES2279646T3 - Anticuerpos de integrina monoclonales humanizados. - Google Patents
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Abstract
El uso de un anticuerpo que neutraliza el receptor proteico AlfavBeta3 humano y el receptor proteico AlfavBeta5 humano que comprende una cadena pesada que tiene CDHR3 de: RGVRGSMDY en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o diagnóstico de una enfermedad seleccionada entre el grupo constituido por; aterosclerosis, restenosis, cáncer, metástasis cancerosa, artritis reumatoide, retinopatía diabética, degeneración macular, osteoporosis, hiperparatiroidismo, enfermedad de Paget, hipercalcemia de tumores malignos, lesiones osteolíticas producidas por metástasis ósea, pérdida ósea debida a inmovilización, deficiencia de hormonas sexuales.
Description
Anticuerpos de integrina monoclonales
humanizados.
Esta invención se refiere a nuevos anticuerpos
monoclonales humanizados (mAb) y a los genes que los codifican. Más
específicamente, esta invención se refiere a anticuerpos
monoclonales humanos específicamente reactivos con varias
integrinas heterodiméricas. Dichos anticuerpos son útiles para el
tratamiento terapéutico y/o profiláctico de diversas enfermedades
asociadas con angiogénesis (por ejemplo, metástasis cancerosa,
artritis reumatoide, aterosclerosis) entre otros trastornos.
Las integrinas son una superfamilia de
receptores de adhesión celular, que son glicoproteínas transmembrana
heterodiméricas expresadas en diversas células, y que están hechas
de diversas cadenas alfa y beta. Entre esas integrinas están las
que llevan el ligando RGD, en el que una cadena de proteína se
denomina \alpha_{v}. Las integrinas o receptores de adhesión de
la superficie celular que comparten la cadena \alpha_{v}
incluyen el receptor de vitronectina \alpha_{v}\beta_{3},
expresado en varias células incluyendo células endoteliales, del
músculo liso, osteoclastos, y tumorales; y también los receptores
\alpha_{v}\beta_{5}, \alpha_{v}\beta_{6},
\alpha_{v}\beta_{8} y \alpha_{v}\beta_{1}. Estos
receptores se expresan principalmente en células cancerosas, tales
como células tumorales y en lesiones metastásicas. Están presentes
en algunas lesiones inmunohistológicas, en la placenta y también
están implicados trastornos angiogénicos que implican la
vasculatura.
Como un ejemplo, se ha postulado que el receptor
\alpha_{v}\beta_{3} expresado en la membrana de células
osteoclastos media en el proceso de reabsorción del hueso y
contribuye al desarrollo de osteoporosis [Ross, y col., J. Biol.
Chem., 1993, 268 (13): 9901-7].
Como otro ejemplo, se ha postulado que el receptor
\alpha_{v}\beta_{3} expresado en células de músculo liso
aórtico humano estimula su migración a la neoíntima, lo que conduce
a la formación de aterosclerosis y restenosis después de la
angioplastia [Brown, y col., Cardiovascular Res.,
1994, 28: 1815]. La conexión entre el antagonismo del
receptor de vitronectina y la restenosis después de procedimientos
vasculares se mencionó por Choi y col, J. Vasc. Surg.,
1994, 19: 125-34. La Publicación de
Patente Internacional Nº WO95/25543, publicada el 9 de marzo de
1995, se refiere a un procedimiento para inhibir la angiogénesis
administrando un antagonista del receptor de vitronectina.
Adicionalmente, un estudio reciente mencionaba a
un antagonista de \alpha_{v}\beta_{3} cómo promotor de la
regresión tumoral induciendo apoptosis en vasos sanguíneos
angiogénicos [P. C. Brooks, y col., Cell, 1994,
79: 1157-1164]. Análogamente, se mencionó un
anticuerpo monoclonal murino LM609 desarrollado para el receptor de
vitronectina presentado en la Publicación de Patente Internacional
Nº WO89/05155, publicada el 9 de junio de 1995, como útil en la
inhibición del crecimiento tumoral. Véase, también, D. A. Cheresh
y col, Cell, 1998, 57:
59-69.
Aunque se ha sugerido la inmunoterapia pasiva
que emplea anticuerpos monoclonales de una especie heteróloga (por
ejemplo, murino) como un mecanismo útil para tratar o prevenir
diversas enfermedades o trastornos, una alternativa para reducir el
riesgo de una respuesta inmune no deseable por parte del paciente,
dirigida contra el anticuerpo extraño es emplear anticuerpos
"humanizados". Estos anticuerpos son sustancialmente de origen
humano, siendo solamente las Regiones Determinantes Complementarias
(CDR) y ciertos restos de marco que influyen la conformación de
CDR, de origen no humano. Ejemplos particularmente útiles de este
enfoque para el tratamiento de algunos trastornos se describen en
la Solicitud PCT PCT/GB91/01554, Nº de Publicación WO 92/04381 y
Solicitud PCT PCT/GB93/00725, Nº de Publicación WO 93/20210.
Los nuevos mAb humanos o anticuerpos humanizados
son particularmente útiles en solitario o en combinación con
moléculas existentes para formar composiciones inmunoterapéuticas.
Existe aún una necesidad en la técnica de mAb adicionales para
receptores de la superficie celular o anticuerpos humanizados de los
mismos que puedan bloquear de forma selectiva la integrina y
muestren una larga semivida en suero.
En un aspecto, esta invención se refiere a un
nuevo anticuerpo monoclonal humanizado que neutraliza la función
biológica de los receptores que llevan la cadena \alpha_{v}.
Específicamente, Este anticuerpo es reactivo con diversas de dichas
integrinas heterodiméricas y fragmentos funcionales de las mismas
que llevan la cadena de subunidad \alpha_{v}. Este anticuerpo
humanizado neutraliza específicamente el receptor
\alpha_{v}\beta_{3} humano (receptor de vitronectina) y el
\alpha_{v}\beta_{5} humano.
En otro aspecto más, la presente invención
proporciona una composición farmacéutica que contiene uno (o más)
anticuerpos alterados y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto más, la presente invención
proporciona procedimientos para y componentes útiles en, la
producción recombinante de anticuerpos humanizados y alterados (por
ejemplo, anticuerpos manipulados, CDR, fragmentos Fab o
F(ab)_{2}, o análogos de los mismos) que se obtienen
de anticuerpos monoclonales de neutralización (mAb) para los
receptores que contienen \alpha_{v} humana. Estos componentes
incluyen secuencias de ácidos nucleicos aisladas y secuencias que
los codifican, así como plásmidos recombinantes que contienen las
secuencias de ácidos nucleicos bajo el control de secuencias
reguladoras seleccionadas que son capaces de dirigir la expresión
de las mismas en células huésped (preferiblemente de mamífero)
transfectadas con los plásmidos recombinantes. El procedimiento de
producción implica cultivar una célula huésped transfectada de la
presente invención en condiciones tales que el anticuerpo humano o
alterado se exprese en dicha célula, y aislar el producto expresado
de la misma.
Otra realización más de la invención es una
composición farmacéutica que comprende al menos una dosis de una
cantidad inmunoterapéuticamente eficaz de los anticuerpos de esta
invención junto con al menos un anticuerpo monoclonal o alterado
adicional. Una composición particularmente deseable comprende como
anticuerpo adicional, un anticuerpo anti-receptor
\alpha_{v}\beta_{3} humano, que se distingue del anticuerpo
sujeto en virtud de ser reactivo con un epítope diferente del
receptor \alpha_{v}\beta_{3} humano heterodimérico. Uno de
dichos ejemplos es el anticuerpo D12 descrito en la Solicitud de
Patente Internacional Nº WO98/40488, publicada el 17 de septiembre
de 1998.
Otros aspectos y ventajas de la presente
invención se describen adicionalmente en la descripción detallada y
las realizaciones preferidas de la misma.
La Fig. 1A ilustra las secuencias ADN y de
aminoácidos de región variable de cadena pesada del mAb B9 murino
[SEC ID Nº 1, 2 y 38], en la que las CDR se representan en negrita y
subrayadas.
La Fig. 1B es la secuencia de aminoácidos de
región variable de cadena pesada de la secuencia de aminoácidos de
consenso del subgrupo I de VH humano [SEC ID Nº 3], en la que las
CDR se representan en negrita y subrayadas.
La Fig. 1C ilustra las secuencias ADN y de
aminoácidos de región variable de cadena pesada sintéticas de la
cadena pesada humanizada de consenso de B9HZHC 1-0,
[SEC ID Nº 4 y 5], en las que las CDR se representan en negrita y
subrayadas. Los asteriscos por encima de los aminoácidos indican
restos marco murino preferidos conservados en la cadena pesada
sintética.
La Fig. 2A ilustra las secuencias ADN y de
aminoácidos de cadena ligera del mAb B9 murino [SEC ID Nº 6 y 7],
en las que las CDR se representan en negrita y subrayadas.
La Fig. 2B es la secuencia de aminoácidos de
cadena ligera de la secuencia de aminoácidos de consenso del
subgrupo I de V kappa humano de [SEC ID Nº 8], en la que las CDR se
representan en negrita y subrayadas.
La Fig. 2C es las secuencias ADN y de
aminoácidos de región variable de cadena ligera sintéticas del
B9HZLC 1-0 de cadena ligera humanizado, sintético
de consenso, [SEC ID Nº 9 y 10], en la que las CDR se representan
en negrita y subrayadas. Los asteriscos indican restos marco murino
preferidos y se ilustran por encima del resto de aminoácido.
La Fig. 3 ilustra las secuencias de ADN y
aminoácidos que representan el intermedio de la región variable de
cadena pesada de B9 sintética [SEC ID Nº: 11 y 12]. Los sitios de
restricción de la enzima endonucleasa están subrayados.
La Fig. 4 ilustra las secuencias de ADN y
aminoácidos que representan el intermedio de la región variable de
cadena ligera de B9 sintética [SEC ID Nº: 13 y 14]. Los sitios de
restricción de la enzima endonucleasa están subrayados.
La Fig. 5 es la secuencia de aminoácidos de la
región marco de REI kappa V humano modificado con las CDR subrayadas
y en negrita. El último QQ de la secuencia representa los dos
primeros aminoácidos de la tercera CDR [SEC ID Nº 15].
La Fig. 6 ilustra las secuencias de ADN y
aminoácidos [SEC ID Nº 28 y 29] que representan una secuencia que
codifica la cadena ligera de B9 humanizado AB9HZLCREIº. Las CDR se
muestran en negrita.
La Fig. 7 ilustra las secuencias de ADN y
aminoácidos [SEC ID Nº 30 y 31] de la secuencia que codifica la
cadena ligera de B9 humanizado,
AB9HZLC1-1\equiv.
La Fig. 8 es un gráfico que muestra los
resultados del modelo de xenoinjerto tumoral murino con el ensayo
HT29 del Ejemplo 14, con las células inyectadas por vía
intraperitoneal.
La Fig. 9 es un gráfico que muestra los
resultados del modelo de xenoinjerto tumoral murino con el ensayo
HT29 del Ejemplo 14, con las células inyectadas por vía
subcutánea.
La presente invención proporciona anticuerpos
útiles incluyendo anticuerpos monoclonales, recombinantes y
sintéticos (y fragmentos de los mismos) que neutralizan el receptor
de vitronectina \alpha_{v}\beta_{3} humano y los receptores
\alpha_{v}\beta_{5} humanos, así como la unión a otras
integrinas que llevan la subunidad \alpha_{v}; ácidos nucleicos
aislados que las codifican y diversos medios para su producción
recombinante así como usos terapéuticos, profilácticos y de
diagnóstico de dichos anticuerpos y fragmentos de los mismos.
Los anticuerpos de esta invención inhiben la
unión de vitronectina y otros ligandos al receptor de vitronectina
(\alpha_{v}\beta_{3}). Los anticuerpos de esta invención
inhiben la unión de ligandos al receptor
\alpha_{v}\beta_{5}. Estos anticuerpos también pueden
inhibir la unión de ligandos a los receptores
\alpha_{v}\beta_{1} y \alpha_{v}\beta_{6} y
\alpha_{v}\beta_{8}. Estos anticuerpos pueden bloquear de
forma selectiva las integrinas \alpha_{v}\beta_{3} y
\alpha_{v}\beta_{5} y muestran una semivida en suero de
aproximadamente 60 horas in vivo en modelos animales.
Específicamente, los anticuerpos incluyendo el B9 monoclonal murino
y el anticuerpo humanizado HuB9, que neutralizan de forma
específica \alpha_{v}\beta_{3} y
\alpha_{v}\beta_{5}, son deseables para su uso como
reactivos terapéuticos agudos y subagudos para el tratamiento de
los trastornos mediados por estos receptores. La inhibición de
estos receptores por los anticuerpos de esta invención permite el
tratamiento terapéutico o la profilaxis de dichas enfermedades.
Como se usa en esta memoria descriptiva y las
reivindicaciones, los siguientes términos se definen de la siguiente
manera:
La frase "trastornos mediados por receptores
heterodiméricos que contienen \alpha_{v}" incluye, aunque
sin limitación, trastornos cardiovasculares o trastornos
relacionados con angiogénesis, tales como cánceres, por ejemplo,
tumores sólidos y metástasis, angiogénesis asociada con retinopatía
diabética, aterosclerosis y restenosis, trastornos inflamatorios
crónicos, degeneración macular, y enfermedades en las que la
reabsorción del hueso está asociada con patología tal como
osteoporosis. Los anticuerpos de esta invención son principalmente
útiles también como agentes anti-metastásicos y
antitumorales.
"Anticuerpo alterado" se refiere a una
proteína codificada por una región codificante de inmunoglobulina
alterada de su forma natural, que puede obtenerse mediante
expresión en una célula huésped seleccionada. Dichos anticuerpos
alterados son anticuerpos manipulados (por ejemplo, anticuerpos
humanos quiméricos, humanizados o conformados de nuevo o
modificados inmunológicamente) o fragmentos de los mismos que
carecen de toda o parte de una región constante de inmunoglobulina,
por ejemplo, Fv, Fab, o F(ab')_{2} y similares.
"Región codificante de inmunoglobulina
alterada" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que
codifica un anticuerpo alterado de la invención o un fragmento del
mismo.
"Anticuerpo humano conformado de nuevo" se
refiere a un anticuerpo alterado en el que como mínimo al menos una
CDR de un segundo anticuerpo aceptor humano se sustituye por al
menos una CDR de un primer anticuerpo donador monoclonal humano.
Preferiblemente se sustituyen las seis CDR. Más preferiblemente, una
región de combinación de antígenos completa, por ejemplo, un Fv,
Fab, o F(ab')_{2}, de un segundo anticuerpo monoclonal
aceptor humano se sustituye por la región correspondiente en un
primer anticuerpo monoclonal donador humano. Más preferiblemente la
región Fab de un primer donador humano se une de forma operativa a
las regiones constantes apropiadas de un segundo anticuerpo aceptor
humano para formar un anticuerpo monoclonal de longitud
completa.
"Primer compañero de inmunoglobulina" se
refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica una región
marco o variable de inmunoglobulina humana en la que las regiones
que codifican CDR nativas (o de origen natural) se sustituyen por
las regiones que codifican CDR de un anticuerpo humano donador. La
región variable humana puede ser una cadena pesada de
inmunoglobulina, una cadena ligera (o las dos cadenas), un análogo o
fragmento funcional de las mismas. Dichas regiones que codifican
CDR, situadas en la región variable de anticuerpos
(inmunoglobulinas) pueden determinarse mediante procedimientos
conocidos en la técnica. Por ejemplo Kabat y col. Sequences of
Proteins of Inmunological Interest, 4ª Ed., U.S. Department of
Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)
describe normas para situar CDR. Además, se conocen programas
informáticos que son útiles para identificar regiones/estructuras
de CDR.
"Segundo compañero de fusión" se refiere a
otra secuencia de nucleótidos que codifica una proteína o péptido a
la que el primer compañero de inmunoglobulina se fusiona en marco o
por medio de una secuencia engarce convencional (es decir, se une
de forma operativa). Preferiblemente el compañero de fusión es un
gen de inmunoglobulina y cuando es así, se denomina un "segundo
compañero de inmunoglobulina". El segundo compañero de
inmunoglobulina puede incluir una secuencia de ácido nucleico que
codifica la región constante completa del mismo (es decir, homólogo
- el primer y segundo anticuerpo alterados se obtienen de la misma
fuente) o un anticuerpo adicional (es decir, heterólogo) de
interés. Puede ser una cadena pesada o cadena ligera de
inmunoglobulina, o las dos cadenas como parte de un único
polipéptido. El segundo compañero de inmunoglobulina no se limita a
una clase o isotipo de inmunoglobulina particular. Además, el
segundo compañero de inmunoglobulina puede comprender parte de una
región constante de inmunoglobulina, tal como se encuentra en una
Fab, o F(ab)_{2} (es decir, una parte discreta de
una región constante o región marco humana). Un segundo compañero de
fusión también puede comprender una secuencia que codifica una
proteína integral de membrana expuesta en la superficie externa de
una célula huésped, por ejemplo como parte de una biblioteca de
exposición de fagos, o una secuencia que codifica una proteína para
detección analítica o de diagnóstico, por ejemplo, peroxidasa de
rábano rusticano, \beta-galactosidasa, etc.
Los términos Fv, Fc, Fd, Fab o
F(ab')_{2} se usan con sus significados convencionales
[véase por ejemplo, Harlow y col, Antibodies A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)].
Como se usa en este documento, un "anticuerpo
manipulado" describe un tipo de anticuerpo alterado, es decir un
anticuerpo sintético de longitud completa (por ejemplo, un
anticuerpo quimérico, humanizado, conformado de nuevo o modificado
inmunológicamente en oposición a un fragmento de anticuerpo) en el
que una porción de los dominios variables de cadena ligera y/o
pesada de un anticuerpo aceptor seleccionado, se sustituyen por
partes análogas de uno o más anticuerpos donadores que tienen
especificidad por el epítope seleccionado. Por ejemplo, dichas
moléculas pueden incluir anticuerpos caracterizados por una cadena
pesada humanizada asociada con una cadena ligera no modificada (o
cadena ligera quimérica), o viceversa. Los anticuerpos manipulados
también pueden caracterizarse por la alteración de las secuencias de
ácidos nucleicos que codifican las regiones marco del dominio
variable ligero y/o pesado del anticuerpo aceptor para conservar la
especificidad de unión del anticuerpo donador. Estos anticuerpos
pueden comprender la sustitución de una o más CDR (preferiblemente
todas) del anticuerpo aceptor con CDR de un anticuerpo donador
descrito en este documento.
Un "anticuerpo quimérico" se refiere a un
tipo de anticuerpo manipulado que contiene una región variable de
origen natural (cadena ligera y cadena pesada) obtenida de un
anticuerpo donador junto con regiones constantes de cadena ligera y
pesada obtenidas de un anticuerpo aceptor de una especie
heteróloga.
Un "anticuerpo humanizado" se refiere a un
tipo de anticuerpo manipulado que tiene sus CDR obtenidas de una
inmunoglobulina donadora no humana, obteniéndose las restantes
partes obtenidas de inmunoglobulina de una (o más)
inmunoglobulina(s) humana(s). Además, los restos de
soporte en marco pueden alterarse para preservar la afinidad de
unión [véase, por ejemplo, Queen y col., 1991,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 10029-10032
y Hodgson y col., 1991, Biol Technology, 9:
421].
Un "anticuerpo inmunológicamente
modificado" se refiere a un tipo de anticuerpo manipulado en el
que se realizan cambios en secuencias donadoras y/o aceptoras para
modificar regiones que implican artefactos de clonación,
potenciaciones de líneas microbianas, etc. con el objetivo de
reducir la posibilidad de una respuesta inmune al anticuerpo por
parte del paciente tratado con el anticuerpo modificado.
La expresión "anticuerpo donador" se
refiere a un anticuerpo (monoclonal o recombinante) que aporta las
secuencias de ácidos nucleicos de sus regiones variables, CDR, u
otros fragmentos funcionales o análogos de los mismos a un primer
compañero de inmunoglobulina, para proporcionar la región
codificante de inmunoglobulina alterada y dar como resultado el
anticuerpo alterado expresado con la especificidad antigénica y
actividad neutralizadora característica del anticuerpo donador. Un
anticuerpo donador adecuado para uso en esta invención es una
anticuerpo anti-\alpha_{v}\beta_{3} y
anti-\alpha_{v}\beta_{5} monoclonal murino
de neutralización, denominado B9. Se define que B9 tiene las
secuencias de aminoácidos de cadena pesada variable y cadena ligera
variable que se muestran en las Fig. 1A y 2A, respectivamente [SEC
ID Nº 2 y 7].
La expresión "anticuerpo aceptor" se
refiere a un anticuerpo (monoclonal o recombinante) de una fuente no
relacionada genéticamente con el anticuerpo donador, que aporta
todas (o cualquier porción, pero preferiblemente todas) las
secuencias de ácidos nucleicos que codifican sus regiones marco de
cadena pesada y/o ligera y/o sus regiones constantes de cadena
pesada y/o ligera al primer compañero de inmunoglobulina.
Preferiblemente un anticuerpo humano es el anticuerpo aceptor.
Regiones "VH de consenso" o "VL de
consenso" se refieren a secuencias de aminoácidos que pueden
funcionar de manera similar a las regiones marco del anticuerpo
aceptor, pero se seleccionan mediante técnicas informáticas
convencionales. En resumen, provista de una secuencia de aminoácidos
VH o VL dada, las secuencias VH y VL humanas más próximas a la
secuencia dada se reúnen para identificar el subgrupo de anticuerpos
más próximo. Una vez que se ha seleccionado el subgrupo, se
comparan todos los anticuerpos humanos de ese subgrupo y se prepara
una secuencia consenso de las cadenas VH y VL. Las secuencias
consenso se usan para generar una región marco sintética deseable
para el anticuerpo humanizado.
"CDR" son las secuencias de aminoácidos de
región determinante complementaria de un anticuerpo. Las CDR son
las regiones hipervariables de cadenas pesada y ligera de
inmunoglobulina. Véase por ejemplo, Kabat y col, Sequences of
Proteins of Inmunological Interest, 4ª Ed., U.S. Department of
Health and Human Services, National Institutes of Health (1987).
Hay tres CDR de cadena pesada y tres CDR de cadena ligera (o
regiones CDR) en las porciones variables de una inmunoglobulina.
Por tanto "CDR" como se usa en este documento se refiere a las
tres CDR de cadena pesada, o las tres CDR de cadena ligera (o a
todas las CDR de cadena pesada y ligera, si fuera apropiado). Las
CDR proporcionan la mayoría de restos de contacto para la unión del
anticuerpo al antígeno o epítope. Las CDR de interés de esta
invención se obtienen de secuencias de cadena pesada y ligera
variables del anticuerpo donador, e incluyen análogos de las CDR de
origen natural, cuyos análogos también comparten o conservan la
misma especificidad de unión y/o capacidad de neutralización del
antígeno que el anticuerpo donador del que se obtuvieron.
Por "compartir la especificidad de unión y/o
capacidad de neutralización del antígeno" se entiende, por
ejemplo, que aunque mAb B9 puede caracterizarse por cierto nivel de
afinidad por el antígeno, una CDR codificada por una secuencia de
ácido nucleico de mAb B9 en un entorno estructural apropiado puede
tener una afinidad menor o mayor. Se espera que las CDR de mAb B9
en dichos entornos reconozcan no obstante el(los)
mismo(s) epítope(s) que el mAb B9 intacto.
Un "fragmento funcional" es una secuencia
variable de cadena pesada o ligera parcial (por ejemplo, deleciones
menores en los extremos amino o carboxilo de la región variable de
la inmunoglobulina) que conserva la misma especificidad de unión
y/o capacidad de neutralización del antígeno que el anticuerpo del
que se obtuvo el fragmento.
Un "análogo" es una secuencia de
aminoácidos modificada en al menos un aminoácido, en la que dicha
modificación puede ser una modificación química o sustitución en un
aminoácido o una sustitución o una redisposición de unos pocos
aminoácidos (es decir, no más de 10), cuya modificación permite que
la secuencia de aminoácidos conserve las características
biológicas, por ejemplo, especificidad y alta afinidad por el
antígeno, de la secuencia no modificada. Por ejemplo, pueden
construirse diferentes variantes humanizadas usando las secuencias
descritas en este
documento.
documento.
También pueden surgir análogos en forma de
variaciones alélicas. Una "variación o modificación alélica" es
una alteración en la secuencia de ácido nucleico que codifican las
secuencias de aminoácidos o péptidos de la invención. Dichas
variaciones o modificaciones pueden deberse a la degeneración del
código genético o pueden manipularse de forma deliberada para
proporcionar características deseadas. Estas variaciones o
modificaciones pueden o no dar como resultado alteraciones en
cualquier secuencia de aminoácidos codificada. Por ejemplo, pueden
construirse mutaciones silenciosas, mediante sustituciones, cuando
se crean ciertos sitios de restricción de endonucleasa en o
alrededor de regiones que codifican CDR.
La expresión "agentes efectores" se refiere
a moléculas vehículo no proteicas a las que pueden asociarse los
anticuerpos alterados, y/o cadenas ligeras o pesadas naturales o
sintéticas del anticuerpo donador u otros fragmentos del anticuerpo
donador mediante procedimientos convencionales. Dichos vehículos no
proteicos pueden incluir vehículos convencionales usados en el
campo del diagnóstico, por ejemplo, poliestireno u otras perlas
plásticas, polisacáridos, por ejemplo, como los usados en el sistema
BIAcore (Pharmacia), u otras sustancias no proteicas útiles en el
campo médico, y seguras para la administración a seres humanos y
animales. Otros agentes efectores pueden incluir un macrociclo,
para quelar un átomo de metal pesado, o radioisótopos. Dichos
agentes efectores también pueden ser útiles para aumentar la
semivida de los anticuerpos alterados, por ejemplo
polietilenglicol.
Para uso en la construcción de los anticuerpos
humanizados, fragmentos y proteínas de fusión de esta invención,
puede usarse una especie no humana para generar la inmunoglobulina
deseable después de la presentación con un receptor heterodimérico
que contiene \alpha_{v} humano como antígeno. Se emplean
técnicas de hibridoma convencionales para proporcionar una línea
celular de hibridoma que secreta un anticuerpo monoclonal no humano
(mAb) a los receptores que contienen \alpha_{v}. Como ejemplo,
la producción de mAb B9 murino se describe en detalle en el Ejemplo
2 a continuación. Para facilitar la descripción a continuación, el
término B9 puede referirse al mAb B9 o a cualquiera de los otros
mAb del Ejemplo 2.
B9 es un anticuerpo donador deseable para uso en
el desarrollo de un anticuerpo quimérico o humanizado de esta
invención. Las características del mAb B9 murino de neutralización
obtenido como se describe en el Ejemplo 2 incluyen una
especificidad de unión al antígeno para \alpha_{v}\beta_{3}
y \alpha_{v}\beta_{5} humanos, y posiblemente a otros
receptores heterodiméricos que contienen \alpha_{v}, y las
características que se muestran en la Tabla 1 a continuación. El
isotipo del mAb B9 del Ejemplo 2 es IgG_{1}, y tiene una afinidad
de entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 0,3 nM contra los
receptores \alpha_{v}\beta_{3} y
\alpha_{v}\beta_{5}, dependiendo del ensayo empleado. El
anticuerpo reconoce la subunidad \alpha_{v} de los receptores
\alpha_{v}\beta_{3} y \alpha_{v}\beta_{5}
heterodiméricos y no reconoce ninguna subunidad \beta de forma
individual. La unión se ilustra mediante unión y actividad funcional
(neutralización) en los ensayos in vitro de los Ejemplos
3-10 a continuación.
Dadas las secuencias proporcionadas, es decir,
la región variable de cadena ligera de B9 [SEC ID Nº 6] y la región
variable de cadena pesada de B9 [SEC ID Nº 1], un especialista en la
técnica podría obtener las restantes porciones de la cadena pesada
usando, por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa, y de este
modo obtener una molécula de mAb completa. Como alternativa, podría
construirse una molécula de B9 usando técnicas análogas a las
descritas a continuación para los mAb sintéticos y recombinantes de
la invención y empleando otras cadenas pesadas de subtipo de IgG
murino.
Pueden desarrollarse otros anticuerpos de
subunidad anti-\alpha_{v} seleccionando
hibridomas o bibliotecas combinatorias, o anticuerpos de
presentación de fago [W. D. Huse y col., 1988, Science,
246: 1275-1281] usando el mAb murino descrito
en este documento y su epítope \alpha_{v}. Puede seleccionarse
una colección de anticuerpos, incluyendo productos de hibridoma o
anticuerpos obtenidos del repertorio de inmunoglobulina de
cualquier especie, en un ensayo de competencia convencional, tal
como el descrito en los Ejemplos 5, 8 y 9 a continuación, con uno o
más epítopes descritos en este documento. De este modo, la invención
hace disponible un anticuerpo, diferente de B9, que es capaz de
unirse a y neutralizar los receptores que contienen \alpha_{v}.
Otros mAb generados contra un \alpha_{v} deseado o un epítope de
la cadena \beta adecuado y producidos mediante técnicas
convencionales, incluyen sin limitación, genes que codifican mAb
murino, mAb humanos, y anticuerpos combinatorios.
Donde en la siguiente descripción el anticuerpo
donador se identifica como B9, esta denominación se hace solamente
para ilustración y simplicidad de la descripción.
Como se ha mencionado anteriormente, varios
problemas han dificultado la aplicación directa de la tecnología de
hibridoma de G. Kohler y C. Milstein, 1975, Nature,
256: 495-497 para la generación y aislamiento de
anticuerpos monoclonales humanos. Entre estos hay una carencia de
compañeros de fusión de líneas celulares de mieloma adecuadas
usados para formar líneas celulares de hibridoma así como la mala
estabilidad de dichos hibridomas incluso cuando están formados. Por
lo tanto, se prefiere el enfoque de biología molecular de clonación
combinatoria.
La clonación combinatoria se describe en general
en la publicación de PCT WO90/14430. Expuesto de forma simple, el
objetivo de la clonación combinatoria es transferir a una población
de células bacterianas la capacidad genética inmunológica de una
célula, tejido u órgano humano. Se prefiere emplear células, tejidos
u órganos que sean inmunocompetentes. Las fuentes particularmente
útiles incluyen, aunque sin limitación, bazo, timo, ganglios
linfáticos, médula ósea, amígdalas, y linfocitos de la sangre
periférica. Las células pueden estimularse opcionalmente con el
receptor \alpha_{v}\beta_{3} humano in vitro, o
seleccionarse de donantes que se sepa que han producido una
respuesta inmune o donantes que son VIH^{+} pero
asintomáticos.
La información genética (es decir, los
anticuerpos humanos producidos en los tejidos en respuesta a la
estimulación mediante el antígeno integrina heterodimérica que
contiene \alpha_{v}) aislada a partir de las células donantes
puede estar en forma de ADN o ARN y se amplifica convenientemente
mediante PCR o técnicas similares. Cuando se aísla en forma de ARN,
la información genética se convierte preferiblemente en ADNc
mediante la trascripción inversa antes de la amplificación. La
amplificación puede ser generalizada o puede hacerse a la medida
más específicamente, por ejemplo, mediante una selección cuidadosa
de secuencias cebadoras de PCR, puede conseguirse una amplificación
selectiva de genes de inmunoglobulina o subconjuntos dentro de esta
clase de genes.
Una vez que se obtienen las secuencias del
componente génico, en este caso los genes que codifican las regiones
variables de las diversas cadenas de anticuerpo pesadas y ligeras,
los genes de la cadena pesada y ligera se asocian en combinaciones
aleatorias para formar una biblioteca combinatoria aleatoria. Se han
descrito diversos sistemas de vectores de ADN recombinante para
facilitar la clonación combinatoria. [Véase por ejemplo publicación
de PCT Nº WO90/14430 supra, Scott y Smith, 1990,
Science, 249: 386-406 o la Patente de Estados
Unidos Nº 5.223.409]. Una vez que se ha generado la biblioteca
combinatoria los productos pueden, después de la expresión
seleccionarse convenientemente mediante bioselección con el receptor
que contiene \alpha_{v} humano seleccionado o, si fuera
necesario, mediante bioselección bloqueada por epítopes como se
describe con más detalle a continuación.
Inicialmente se prefiere en general usar
fragmentos Fab de mAb, tales como B9, para la clonación combinatoria
y la exploración y después convertir los Fab a mAb de longitud
completa después de la selección de las moléculas candidato
deseadas. Sin embargo, también pueden usarse anticuerpos de cadena
sencilla para la clonación y exploración.
La presente invención contempla el uso de
fragmentos Fab o fragmentos F(ab')_{2} de mAb de longitud
completa obtenidos, dirigidos contra el receptor
\alpha_{v}\beta_{3} o \alpha_{v}\beta_{5} de
integrina humana. Aunque estos fragmentos pueden ser
independientemente útiles como agentes protectores y terapéuticos
in vivo contra afecciones mediadas por los receptores que
contienen \alpha_{v} humanos o in vitro como parte de un
diagnóstico para una enfermedad mediada por el receptor que contiene
\alpha_{v} humano, se emplea en este documento como un
componente para un anticuerpo humano conformado de nuevo. Un
fragmento Fab contiene toda la cadena ligera y la porción amino
terminal de la cadena pesada; y un fragmento F(ab')_{2} es
el fragmento formado por dos fragmentos Fab unidos por puentes
disulfuro adicionales. Los anticuerpos monoclonales de unión al
receptor que contiene \alpha_{v} humano de la presente invención
proporcionan fuentes de fragmentos Fab y fragmentos
F(ab')_{2}, estos últimos fragmentos pueden obtenerse a
partir de una biblioteca de fagos combinatoria [véase, por ejemplo,
Winter y col., 1994, Ann. Rev. Immunol,
12:433-455 o Barbas y col., 1992,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10164-10168
que se incorporan por la presente como referencia en su totalidad].
Estos fragmentos Fab y F(ab')_{2} son útiles por sí mismos
como agentes terapéuticos, profilácticos o de diagnóstico, y como
donadores de secuencias incluyendo las regiones variables y
secuencias de CDR útiles en la formación de anticuerpos
recombinantes o humanizados como se describen en este documento.
El mAb B9 u otros anticuerpos descritos en este
documento pueden aportar secuencias, tales como secuencias
peptídicas de cadena pesada y/o ligera variable, secuencias marco,
secuencias CDR, fragmentos funcionales, y análogos de los mismos, y
las secuencias de ácidos nucleicos que las codifican, útiles para
diseñar y obtener diversos anticuerpos alterados que se
caracterizan por la especificidad de un antígeno del anticuerpo
donador.
Como ejemplo, la presente invención proporciona
por tanto secuencias de cadena ligera variable y de cadena pesada
variable del mAb B9 anti-humano y secuencias
obtenidas de las mismas. El ADN y las secuencias de aminoácidos de
la región variable de cadena pesada de mAb B9 se presentan
ilustradas mediante la Figura 1A [SEC ID Nº 1 y 2]. Las secuencias
de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de cadena pesada
de mAb B9 se presentan en la Figura 2A [SEC ID Nº 6 y 7].
Las secuencias de ácidos nucleicos de esta
invención, o fragmentos de las mismas, que codifican las secuencias
peptídicas de cadena ligera y cadena pesada variables también son
útiles para la introducción mutagénica de cambios específicos
dentro de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las CDR o
regiones marco, y para la incorporación de la secuencia de ácido
nucleico modificada o de fusión resultante en un plásmido para la
expresión. Por ejemplo, pueden usarse sustituciones silenciosas en
la secuencia de nucleótidos de las regiones que codifican el marco
y la CDR para crear sitios de restricción enzimática que podrían
facilitar la inserción de regiones CDR (y/o marco) mutagenizadas.
Estas regiones que codifican CDR pueden usarse en la construcción
de anticuerpos humanos conformados de nuevo de esta invención.
Teniendo en cuenta la degeneración del código
genético, pueden construirse diversas secuencias codificantes que
codifiquen las secuencias de aminoácidos de cadena pesada y ligera
variables, y secuencias CDR de la invención así como fragmentos
funcionales y análogos de los mismos que compartan la especificidad
por el antígeno del anticuerpo donador. Las secuencias de ácidos
nucleicos aisladas de esta invención, o fragmentos de las mismas,
que codifican las secuencias peptídicas de cadena variable o CDR
pueden usarse para producir anticuerpos alterados, por ejemplo,
anticuerpos quiméricos o humanizados, u otros anticuerpos
manipulados de esta invención cuando se combinan de forma operativa
con un segundo compañero de inmunoglobulina.
Debe observarse que además de las secuencias de
ácidos nucleicos aisladas que codifican porciones del anticuerpo y
anticuerpos alterados descritos en este documento, la presente
invención también abarca otras de dichas secuencias de ácidos
nucleicos, tales como las complementarias para las secuencias que
codifican CDR nativas o complementarias a las regiones marco
humanas modificadas que rodean a las regiones que codifican CDR.
Dichas secuencias incluyen todas las secuencias de ácidos nucleicos
que en virtud de la redundancia del código genético, son capaces de
codificar las mismas secuencias de aminoácidos que se proporcionan
en las Figuras 1A y 2A. Una secuencia variable de cadena ligera
humanizada ejemplar se ilustra en la Figura 2C [SEC ID Nº 9]. Una
secuencia variable de cadena pesada humanizada ejemplar se ilustra
en la Figura 1C [SEC ID Nº 4]. Estas cadenas pesadas y las regiones
variables de cadenas ligeras tienen tres secuencias CDR descritas
con detalle en las secuencias murino de las Figuras 1A y 2A. Otras
secuencias de ADN útiles que abarca está invención incluyen las
secuencias que hibridan en condiciones rigurosas de hibridación
(véase por ejemplo, T. Maniatis y col., 1982,
Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor
Laboratory, páginas 387 a 389] con las secuencias de ADN que
codifican las regiones variables de cadena ligera y pesada de las
Fig. 1A y 2A (incluyendo también Fig. 1C y 2C para las secuencias
humanas sintéticas) y que conservan las propiedades de unión al
antígeno de esos anticuerpos. Un ejemplo de una de dichas
condiciones de hibridación rigurosa es la hibridación a 4x SSC a
65ºC seguida de un lavado en 0,1x SSC a 65ºC durante una hora. Como
alternativa una condición de hibridación rigurosa ejemplar es en
formamida al 50%, 4x SSC a 42ºC. Preferiblemente, estas secuencias
de ADN de hibridación son al menos de aproximadamente 18
nucleótidos de longitud, es decir, aproximadamente el tamaño de una
CDR. Otras secuencias de ADN útiles son por encima del 60%,
preferiblemente por encima del 70% y más preferiblemente por encima
del 80% o el 90% homólogas a la secuencia o fragmentos de la
secuencia de mAb B9.
Donde en esta memoria descriptiva, se definen
secuencias de proteínas y/o ADN mediante sus porcentajes de
homología o identidad con secuencias identificadas, los algoritmos
usados para calcular los porcentajes de identidad o porcentajes de
similitud incluyen los siguientes: algoritmo de
Smith-Waterman [J. F. Collins y col., 1988,
Comput. Appl. Biosci., 4: 67-72; J. F.
Collins y col., Molecular Sequence Comparison and Alignment, (M.J.
Bishop y col., eds.). en Practical Approach Series: Nucleic Acid and
Protein Sequence Analysis XVIII, IRL Press: Oxford, England, UK
(1987) pág. 417], por ejemplo, MPSEARCH y los programas BLAST y
FASTA [E. Gr. Shpaer y col., 1996, Genomics, 38:
179-191], incluyendo el programa BLAST2 [S. D.
Altschul y col., J. Mol. Biol., 215:
403-407 (1990)].
Las regiones que codifican inmunoglobulina
alterada codifican anticuerpos alterados que incluyen anticuerpos
manipulados tales como anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanos
humanizados, conformados de nuevo, y modificados inmunológicamente.
Una región que codifica inmunoglobulina alterada deseada contiene
regiones que codifican CDR en forma de regiones Fab que codifican
péptidos que tienen la especificidad por el antígeno del anticuerpo
B9 anti-humano, preferiblemente un anticuerpo de
alta afinidad tal como los proporcionados por la presente
invención, insertado en un compañero de inmunoglobulina aceptor.
Cuando el aceptor es un compañero de
inmunoglobulina, como se ha definido anteriormente, incluye una
secuencia que codifica una segunda región del anticuerpo de
interés, por ejemplo una región Fc. Los compañeros de
inmunoglobulina también pueden incluir secuencias que codifican
otra inmunoglobulina a la cual la región constante de cadena ligera
o pesada se fusiona en marco o por medio de una secuencia engarce.
Los anticuerpos manipulados dirigidos contra fragmentos funcionales
o análogos de la integrina que contiene la subunidad \alpha_{v}
humana seleccionada, pueden diseñarse para provocar una unión
potenciada con el mismo anticuerpo.
El compañero de inmunoglobulina también puede
asociarse con agentes efectores como se ha definido anteriormente,
incluyendo moléculas vehículo no proteicas, a las cuales el
compañero de inmunoglobulina puede unirse de forma operativa
mediante medios convencionales.
La fusión o engarce entre los compañeros de
inmunoglobulina, por ejemplo, secuencias de anticuerpos y el agente
efector puede ser mediante cualquier medio adecuado, por ejemplo,
mediante enlace covalentes o iónicos convencionales, fusiones de
proteínas, o reticuladores hetero-bifuncionales, por
ejemplo, carbodiimida, glutaraldehído, y similares. Dichas técnicas
se conocen en la técnica y se describen fácilmente en textos
convencionales de química y
bioquímica.
bioquímica.
Adicionalmente, también pueden construirse
secuencias engarces convencionales que proporcionan simplemente una
cantidad deseada de espacio entre el segundo compañero de
inmunoglobulina y el agente efector, en la región codificante de
inmunoglobulina alterada. El diseño de dichos engarces se conoce
bien por los especialistas en la técnica.
Además, pueden modificarse secuencias señal para
las moléculas de la invención para potenciar la expresión. Por
ejemplo, el anticuerpo humano conformado de nuevo que tiene las
secuencias señal y CDR obtenidas de la secuencia de cadena pesada
del mAb B9, puede tener el péptido señal original sustituido con
otra secuencia señal, tal como la secuencia líder Campath [Page, M.
J. y col., 1991, BioTechnology, 9:
64-68].
Un anticuerpo alterado ejemplar, un anticuerpo
humano conformado de nuevo, contiene una secuencia de péptidos o
proteína de cadena pesada variable y toda la de cadena ligera que
tiene la especificidad por el antígeno de mAb B9 fusionada a las
regiones pesadas constantes C_{H1}-C_{H3}
obtenidas de un segundo anticuerpo humano.
En otra realización más, el anticuerpo
manipulado de la invención puede tener unido un agente adicional.
Por ejemplo, el procedimiento de tecnología de ADN recombinante
puede usarse para producir un anticuerpo manipulado de la invención
en el que el fragmento Fc o dominio
C_{H2}-C_{H3} de una molécula de anticuerpo
completa se ha sustituido por una enzima u otra molécula detectable
(es decir, un efector polipeptídico o molécula informadora).
Otra proteína deseable de esta invención puede
comprender una molécula de anticuerpo completa, que tiene cadenas
pesada y ligera de longitud completa, o un fragmento discreto de la
misma, tal como los fragmentos Fab o F(ab')_{2}, un dímero
de cadena pesada, o cualquier fragmento recombinante mínimo de los
mismos tal como un F_{v} o un anticuerpo de cadena sencilla (SCA)
o cualquier otra molécula con la misma especificidad que el mAb B9
donador seleccionado. Dicha proteína puede usarse en forma de un
anticuerpo alterado, o puede usarse en su forma no fusionada.
Allí donde el compañero de inmunoglobulina se
obtiene de un anticuerpo diferente del anticuerpo donador, por
ejemplo, cualquier isotipo o clase de regiones marco o constantes de
inmunoglobulina, o se selecciona mediante un programa informático
en forma de secuencia consenso, como se define anteriormente, se
produce un anticuerpo manipulado. Los anticuerpos manipulados
pueden comprender regiones constantes y regiones marco variables de
inmunoglobulinas (Ig) de una fuente, por ejemplo, el anticuerpo
aceptor o secuencias consenso, y una o más (preferiblemente todas)
CDR del anticuerpo donador, por ejemplo, el anticuerpo B9 antihumano
descrito en este documento. Además, pueden realizarse alteraciones,
por ejemplo, deleciones, sustituciones, o adiciones, de la región
marco del dominio variable ligero y/o pesado del mAb aceptor a los
niveles de ácido nucleico o aminoácidos, o de las regiones CDR del
donador para conservar la especificidad de unión al antígeno del
anticuerpo donador o para reducir la inmunogenicidad potencial.
Dichos anticuerpos manipulados se diseñan para
emplear una (o las dos) de las cadenas ligeras y/o pesadas
variables del mAb receptor que contiene la subunidad \alpha_{v}
anti-humana (modificado opcionalmente como se ha
descrito) o una o más de las CDR de cadena pesada o ligera
identificadas a continuación. Los anticuerpos manipulados de la
invención son neutralizantes, es decir, inhiben de forma deseable la
unión del ligando al receptor \alpha_{v}\beta_{3} o
\alpha_{v}\beta_{5} in vitro e in vivo en
modelos animales de enfermedades mediadas por estos receptores, por
ejemplo, cánceres.
Dichos anticuerpos manipulados pueden incluir un
anticuerpo humano conformado de nuevo que contiene las regiones
constantes de cadena pesada y ligera fusionadas a los fragmentos
funcionales del anticuerpo humano
anti-\alpha_{v}\beta_{3}/\alpha_{v}\beta_{5}.
Un anticuerpo aceptor humano (o de otro animal) adecuado puede ser
uno seleccionado entre una base de datos convencional, por ejemplo,
la base de datos KABAT^{7}, la base de datos de Los Alamos, y la
base de datos Swiss Protein mediante homología con las secuencias
de nucleótidos y aminoácidos del anticuerpo donador. Como
alternativa, puede usarse una secuencia consenso formada mediante
todas las secuencias humanas conocidas en la base de datos de un
subgrupo muy próximo al del anticuerpo donador, para suministrar las
regiones marco. Un anticuerpo humano caracterizado por una
homología con las regiones marco del anticuerpo donador (en base a
aminoácidos) puede ser adecuado para proporcionar una región
constante de cadena pesada y/o una región marco variable de cadena
pesada para la inserción de las CDR donadoras. Un anticuerpo aceptor
adecuado capaz de donar regiones marcos variables o constantes de
cadena ligera puede seleccionarse de forma similar. Debe observarse
que no se requiere que las cadenas ligera y pesada del anticuerpo
aceptor se originen del mismo anticuerpo
aceptor.
aceptor.
Es deseable que las regiones marco y constante
heterólogas se seleccionen de clases e isotipos de inmunoglobulina
humana, tales como IgG (subtipos 1 a 4), IgM, IgA e IgE. Los
dominios Fc no se limitan a secuencias nativas, sino que incluyen
variantes mutantes conocidas en la técnica que alteran la función.
Por ejemplo, se han descrito mutaciones en los dominios Fc de
ciertos anticuerpos de IgG que reducen la unión del complemento
mediado por Fc y el receptor Fc [véase, por ejemplo, A. R. Duncan
y col., 1988, Nature,
332:563-564; A. R. Duncan y G. Winter,
1988, Nature, 332:738-740; M.-L.
Alegre y col., 1992, J. Immunol.,
148:3461-3468; M.-H. Tao y col.,
1993, J. Exp. Med., 178:661-667; V. Xu
y col., 1994, J. Biol. Chem., 269:
3469-2374] y alteran la tasa de eliminación [J.-K.
Kim y col., 1994, Eur. J. Immunol.,
24:542-548] y reducen la heterogeneidad
estructural [S. Angal y col., 1993, Mol. Immunol.,
30: 105-108]. Además, son posibles otras
modificaciones tales como oligomerización del anticuerpo mediante
la adición del segmento de cola de IgM y otras mutaciones [R. I. F.
Smith y S. L. Morrison, 1994, Biotechnology,
12:683-688; R. I. F. Smith y col.,
1995, J. Immunol., 154: 2226-2236] o
adición del segmento de cola de IgA [I. Kariv y col.,
1996; J. Immunol., 157: 29-38]. Sin
embargo, el anticuerpo aceptor no necesita comprender solamente
secuencias de proteína de inmunoglobulina humana. Por ejemplo, puede
construirse un gen en el que una secuencia de ADN que codifica
parte de una cadena de inmunoglobulina humana se fusiona con una
secuencia de ADN que codifica una secuencia de aminoácidos no de
inmunoglobulina tal como un efector polipeptídico o molécula
informadora.
Un ejemplo de un anticuerpo alterado
particularmente deseable es un anticuerpo humanizado que contiene
toda o una porción de las secuencias de aminoácidos del dominio
variable de B9 y algunas porciones de las regiones marco del
anticuerpo donador, o CDR de los mismos insertadas en las regiones
marco de un anticuerpo humano seleccionado. Este anticuerpo
humanizado se dirige contra receptores \alpha_{v}\beta_{3} y
\alpha_{v}\beta_{5} humanos, entre otros. De forma
adecuada, en estos anticuerpos humanizados una, dos, o
preferiblemente tres CDR de las regiones variables de cadena pesada
y/o de cadena ligera del anticuerpo B9 se insertan en las regiones
marco de un anticuerpo humano o secuencia consenso seleccionado,
sustituyendo las CDR nativas de este último anticuerpo o secuencia
consenso.
Preferiblemente, en un anticuerpo humanizado los
dominios variables en las cadenas pesadas y ligeras humanas se han
manipulado mediante una o más sustituciones de CDR. Es posible usar
las seis CDR, o diversas combinaciones de menos de las seis CDR.
Por ejemplo, es posible sustituir solamente las CDR en la cadena
pesada humana, usando como cadena ligera la cadena ligera sin
modificar el anticuerpo aceptor humano. Como otra alternativa,
puede seleccionarse una cadena ligera compatible de otro anticuerpo
humano recurriendo a las bases de datos de anticuerpos
convencionales. El resto del anticuerpo manipulado puede obtenerse
de cualquier inmunoglobulina humana aceptora adecuada.
El anticuerpo alterado tiene por lo tanto la
estructura de un anticuerpo humano natural o un fragmento del
mismo, y posee la combinación de propiedades requeridas para uso
terapéutico eficaz, por ejemplo, tratamiento de enfermedades
mediadas por receptores humanos que contienen la subunidad
\alpha_{v}, o para usos de diagnóstico.
Los especialistas en la técnica entenderán que
un anticuerpo alterado puede modificarse adicionalmente mediante
cambios en los aminoácidos del dominio variable sin afectar
necesariamente la especificidad y la alta afinidad del anticuerpo
donador (es decir, un análogo). Se prevé que los aminoácidos de
cadena pesada y ligera puedan sustituirse por otros aminoácidos en
los marcos de dominio variable o en las CDR o en ambas. Se prefieren
particularmente la modificación inmunológica de dichas secuencias
reconstruidas como se ilustra en los ejemplos en este
documento.
Además, la región variable constante puede
alterarse para potenciar o disminuir las propiedades selectivas de
las moléculas de la presente invención mediante dimerización, unión
a receptores de Fc, o la capacidad de unirse y activar complementos
[véase, por ejemplo, Angal y col., 1993, Mol.
Immunol., 30: 105-108; Xu y col.,
1994, J. Biol. Chem., 269: 3469-3474;
Winter y col., EP 307.434-B], o como se ha
descrito anteriormente.
Dichos anticuerpos son útiles en la prevención y
tratamiento de trastornos mediados por estas integrinas que
contienen la subunidad \alpha_{v}, como se ha descrito en este
documento.
Los anticuerpos humanizados y quiméricos,
conformados de nuevo y manipulados humanos resultantes de esta
invención, pueden expresarse en células huésped recombinantes, por
ejemplo, COS, CHO o células de mieloma, recurriendo a la tecnología
de ADN recombinante usando técnicas de manipulación genética.
También pueden emplearse las mismas o técnicas similares para
generar otras realizaciones esta invención.
Descrito en resumen, se produce un vector de
expresión o plásmido recombinante convencional colocando estas
secuencias codificantes para el anticuerpo alterado en asociación
operativa con secuencias de control reguladoras convencionales
capaces de controlar la replicación y expresión en, y/o la secreción
de, una célula huésped. Las secuencias reguladoras incluyen
secuencias promotoras, por ejemplo, promotor CMV, y secuencias
señal, que pueden obtenerse de otros anticuerpos conocidos.
Análogamente, puede producirse un segundo vector de expresión que
tenga una secuencia de ADN que codifique una cadena ligera o pesada
de un anticuerpo complementario. Preferiblemente este segundo
vector de expresión es idéntico al primero excepto en la medida en
que las secuencias codificantes y marcadores seleccionables están
afectadas, para asegurar en la medida de lo posible que cada cadena
polipeptídica se expresa funcionalmente. Como alternativa, las
secuencias codificantes de cadena pesada y ligera para el
anticuerpo alterado pueden residir en un único vector.
Una célula huésped seleccionada se
co-transfecta mediante técnicas convencionales con
el primer y segundo vectores (o se transfecta simplemente mediante
un único vector) para crear la células huésped transfectadas de la
invención que comprende las cadenas ligera y pesada sintéticas
recombinantes. La célula transfectada se cultiva después mediante
técnicas convencionales para producir el anticuerpo manipulado de la
invención. La producción del anticuerpo que incluye la asociación
de la cadena pesada y la cadena ligera recombinantes se mide en el
cultivo mediante un ensayo apropiado, tal como ELISA o RIA. Pueden
emplearse técnicas convencionales similares para construir otros
anticuerpos alterados y moléculas de esta invención.
Pueden seleccionarse vectores adecuados para las
etapas de clonación y subclonación empleadas en los procedimientos
y construcción de las composiciones de esta invención por un
especialista en la técnica. Por ejemplo, pueden usarse la series
pUC convencionales de vectores de clonación. Un vector usado es
pUC19, que está disponible en el mercado de proveedores, tales como
Amersham (Buckinghamshire, Reino Unido) o Pharmacia (Uppsala,
Suecia). Adicionalmente, puede usarse para la clonación cualquier
vector que sea capaz de replicar fácilmente, tenga abundantes de
sitios de clonación y genes seleccionables (por ejemplo, resistencia
a antibióticos), y se manipule fácilmente. Por tanto, la selección
del vector de clonación no es un factor limitante de esta
invención.
Análogamente, los vectores empleados para la
expresión de los anticuerpos manipulados de acuerdo con la invención
pueden seleccionarse por un especialista en la técnica entre
cualquier vector convencional. Los vectores preferidos incluyen por
ejemplo plásmidos pCD o pCN. Los vectores también contienen
secuencias reguladoras seleccionadas (tales como promotores CMV)
que dirigen la replicación y expresión de secuencias de ADN
heterólogas en células huésped seleccionadas. Estos vectores
contienen las secuencias de ADN descritas anteriormente que
codifican el anticuerpo manipulado o la región codificante de
inmunoglobulina alterada. Además, los vectores pueden incorporar
las secuencias de inmunoglobulinas seleccionadas modificadas
mediante la inserción de sitios de restricción deseables para la
fácil manipulación.
Los vectores de expresión también pueden
caracterizarse mediante genes adecuados para amplificar la expresión
de las secuencias de ADN heterólogas, por ejemplo, el gen de
dihidrofolato reductasa de mamíferos (DHRF). Otras secuencias de
vectores preferibles incluyen una secuencia señal de poliadenilación
(poli A), tal como de la hormona del crecimiento bovina (BGH) y la
secuencia promotora de betaglobina (betaglopro). Los vectores de
expresión útiles en este documento pueden sintetizarse mediante
técnicas bien conocidas por los especialistas en la técnica.
Los componentes de dichos vectores, por ejemplo,
replicones, genes de selección, potenciadores, promotores,
secuencias señal y similares, pueden obtenerse de fuentes
comerciales o naturales o sintetizarse mediante procedimientos
conocidos para uso en la dirección de la expresión y/o secreción del
producto del ADN recombinante en un huésped seleccionado. Otros
vectores de expresión apropiados de los que se conocen numerosos
tipos en la técnica de expresión en mamíferos, bacterias, insectos,
levaduras y hongos también pueden seleccionarse para este fin.
La presente invención también abarca una célula
transfectada con un plásmido recombinante que contiene las
secuencias codificantes de los anticuerpos manipulados o moléculas
de inmunoglobulinas alteradas de los mismos. Las células huésped
útiles para la clonación y otras manipulaciones de estos vectores de
clonación también son convencionales. Sin embargo, de forma más
deseable, se usan células de diversas cepas de E. coli para
la replicación de los vectores de clonación y otras etapas en la
construcción de anticuerpos alterados de esta invención.
Las células huésped adecuadas o las líneas
celulares para la expresión del anticuerpo manipulado o anticuerpo
alterado de la invención son preferiblemente células de mamífero
tales como CHO, COS, células de fibroblastos (por ejemplo, 3T3) y
células de mieloma. Más preferiblemente se usa una CHO o una célula
de mieloma. Pueden usarse células humanas, que permiten que la
molécula se modifique con patrones de glicosilación humanos. Como
alternativa, pueden emplearse otras líneas celulares eucariotas. La
selección de células huésped de mamífero adecuadas y procedimientos
para la transformación, cultivo, amplificación, selección y
producción y purificación del producto se conocen en la técnica.
Véase, por ejemplo, Sambrook y col., 1989 Molecular
Cloning (A Laboratory Manual), 2ª edición., Cold Spring Harbor
Laboratory (Nueva York).
Las células bacterianas pueden mostrarse útiles
como células huésped adecuadas para la expresión de los Fab
recombinantes de la presente invención [véase, por ejemplo,
Plückthun, A., 1992, Immunol. Rev.,
130:151-188]. La tendencia de las proteínas
expresadas en células bacterianas de estar en forma no plegada o
plegada de forma incorrecta o en forma no glicosilada no plantea
una preocupación grande, puesto que los Fab no están glicosilados
normalmente y pueden manipularse para la expresión exportada
reduciendo de este modo la alta concentración que facilita el
plegamiento incorrecto. Sin embargo, debería seleccionarse cualquier
Fab recombinante producido en una célula bacteriana, para la
conservación de la capacidad de unión al antígeno. Si la molécula
expresada por la célula bacteriana se produjo y se exportó en una
forma plegada apropiadamente, esta célula bacteriana sería un
huésped deseable. Por ejemplo, se conocen bien diversas cepas de
E. coli usadas para la expresión como células huésped en el
campo de la biotecnología. También pueden emplearse en este
procedimiento diversas cepas de B. subtilis, Streptomyces,
otros bacilos y similares.
Donde se desee, también están disponibles cepas
de levaduras conocidas por los especialistas en la técnica como
células huésped, así como células de insecto, por ejemplo,
Drosophila y Lepidoprera y sistemas de expresión
virales. Véase, por ejemplo Miller y col., 1986,
Generic Engineering 8: 277-298 y referencias
citadas en ese documento.
Los procedimientos generales mediante los cuales
los vectores de la invención pueden construirse, los procedimientos
de transfección requeridos para producir las células huésped de la
invención, y los procedimientos de cultivo necesarios para producir
el anticuerpo alterado de la invención a partir de dicha célula
huésped, son todos técnicas convencionales. Del mismo modo, una vez
producidos, los anticuerpos alterados de la invención pueden
purificarse a partir de los contenidos del cultivo celular de
acuerdo con procedimientos convencionales de la técnica, incluyendo
precipitación con sulfato de amonio, columnas de afinidad,
cromatografía en columna, electroforesis en gel y similares. Dichas
técnicas están dentro del alcance de la técnica y no limitan esta
invención.
Otro procedimiento más de expresión de
anticuerpos conformados de nuevo puede utilizar la expresión en un
animal transgénico, tal y como se describe en la Patente de Estados
Unidos Nº 4.873.316.
Una vez expresado mediante el procedimiento
deseado, se examina después la actividad in vitro del
anticuerpo manipulado mediante el uso de un ensayo apropiado.
Actualmente se emplean formatos de ensayo de ELISA convencionales
para evaluar cualitativa y cuantitativamente la unión del anticuerpo
alterado a los receptores \alpha_{v}\beta_{3} y
\alpha_{v}\beta_{5} humanos. Véase, el Ejemplo 3 a
continuación. Adicionalmente, pueden usarse también otros análisis
in vitro (tal como el Ejemplo 9) y otros modelos animales
in vivo (tales como Ejemplos 13 y 14) para verificar la
eficacia de neutralización antes de los estudios clínicos humanos
posteriores realizados para evaluar la persistencia del anticuerpo
alterado en el cuerpo a pesar de los mecanismos normales de
eliminación.
Como ejemplo específico de los procedimientos de
producción descritos anteriormente, se genera un anticuerpo B9
humanizado y se expresa como se describe en detalle en el Ejemplo 11
a continuación.
Esta invención también se refiere a una
procedimiento para tratar seres humano (u otros mamíferos) que
experimentan síntomas relacionados con enfermedades que están
mediadas por receptores tales como \alpha_{v}\beta_{3},
\alpha_{v}\beta_{5}, \alpha_{v}\beta_{1},
\alpha_{v}\beta_{6}, y \alpha_{v}\beta_{8}, que
comprenden administrar una dosis eficaz de anticuerpos incluyendo
uno o más de los anticuerpos alterados descritos en este documento
o fragmentos de los mismos. Los anticuerpos de esta invención son
útiles para tratar enfermedades en las que la patología subyacente
es atribuible a un ligando que interactúa con un receptor que
contiene \alpha_{v}, tal como el receptor de vitronectina. Por
ejemplo, estos anticuerpos son útiles como agentes
anti-tumorales, anti-angiogénicos,
anti-inflamatorios y
anti-metastásicos, y son particularmente útiles en
el tratamiento de aterosclerosis, restenosis, metástasis cancerosa,
artritis reumatoide, retinopatía diabética y degeneración
macular.
Análogamente, estos anticuerpos son útiles para
el tratamiento de afecciones en las que la pérdida de la matriz
ósea crea patología. De este modo, los presentes anticuerpos son
útiles para el tratamiento de osteoporosis, hiperparatiroidismo,
enfermedad de Paget, hipercalcemia de tumores malignos, lesiones
osteolíticas producidas por la metástasis ósea, pérdida ósea debida
a la inmovilización o deficiencia de hormonas sexuales.
La respuesta terapéutica inducida por el uso de
las moléculas de esta invención se produce mediante la unión al
receptor seleccionado, por ejemplo, \alpha_{v}\beta_{3} o
los otros mencionados anteriormente, y de este modo el bloqueo
posterior del desarrollo de la enfermedad. Por tanto, las moléculas
de la presente invención, cuando están en preparaciones y
formulaciones apropiadas para uso terapéutico, son altamente
deseables para las personas que experimentan trastornos mediados
por estos receptores que contienen \alpha_{v} humano. Por
ejemplo, pueden ser deseables tratamientos más largos cuando se
tratan enfermedades crónicas o similares. La dosis y duración del
tratamiento se relaciona con la duración relativa de las moléculas
de la presente invención en la circulación humana, y puede
ajustarla un especialista en la técnica dependiendo de la afección
tratada y del estado general de salud del paciente.
Los anticuerpos alterados, anticuerpos y
fragmentos de los mismos de esta invención también pueden usarse en
solitario o junto con otros anticuerpos, particularmente anticuerpos
humanos o humanizados que reaccionan con otros epítopes en el
receptor de integrina seleccionado como agente profiláctico.
El modo de administración de los agentes
terapéuticos y profilácticos de la invención puede ser cualquier
vía adecuada que suministre el agente al huésped. Los anticuerpos
alterados, anticuerpos, anticuerpos manipulados, y fragmentos de
los mismos, y composiciones farmacéuticas de la invención son
particularmente útiles para administración parenteral, es decir por
vía subcutánea, por vía intramuscular, por vía intravenosa, o por
vía intranasal.
Los agentes terapéuticos y profilácticos de la
invención pueden prepararse en forman de composiciones farmacéuticas
que contienen una cantidad eficaz del anticuerpo alterado de la
invención como ingrediente activo en un vehículo farmacéuticamente
aceptable. Se prefiere una suspensión o solución acuosa que contiene
el anticuerpo, preferiblemente, tamponada a pH fisiológico, en una
forma fácil para inyección. La composición para administración
parenteral comprenderá normalmente una solución del anticuerpo
manipulado de la invención o un cóctel del mismo disuelto en un
vehículo farmacéuticamente aceptable, preferiblemente un vehículo
acuoso. Pueden emplearse diversos vehículos acuosos, por ejemplo,
solución salina al 0,4%, glicina al 0,3% y similares. Estas
soluciones son estériles y están generalmente sin material
particulado. Estas soluciones pueden esterilizarse mediante técnicas
de esterilización convencionales bien conocidas (por ejemplo,
filtración). Las composiciones pueden contener sustancias
auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para
aproximarse a las condiciones fisiológicas tales como ajuste del pH
y agentes tamponantes, etc.
La concentración del anticuerpo de la invención
en dicha formulación farmacéutica puede variar ampliamente, es
decir, de menos de aproximadamente el 0,5%, normalmente a o al menos
aproximadamente el 1%, hasta tanto como el 15 ó el 20% en peso y se
seleccionará principalmente en base a volúmenes de líquido,
viscosidades, etc., de acuerdo con el modo de administración
particular seleccionado.
Por tanto, una composición farmacéutica de la
invención para inyección intramuscular podría prepararse para
contener 1 ml de agua tamponada estéril, y entre aproximadamente 1
ng y aproximadamente 100 mg de un anticuerpo manipulado de la
invención. De forma deseable, las composiciones pueden contener de
aproximadamente 50 ng a aproximadamente 80 mg de anticuerpo, o más
preferiblemente, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 75 mg de
anticuerpo de acuerdo con esta invención. Análogamente, podría
prepararse una composición farmacéutica de la invención para
infusión intravenosa para contener aproximadamente 250 ml de
solución de Ringer estéril, y de aproximadamente 1 a
aproximadamente 75 y preferiblemente de 5 a aproximadamente 50 ng/ml
de un anticuerpo manipulado de la invención. Los procedimientos
reales para preparar composiciones administrables por vía parenteral
los conocen bien o serán evidentes para los especialistas en la
técnica. Dichos procedimientos se describen con más detalle en, por
ejemplo, Remington's Pharmaceutical Science, 15ª ed. Mack Publishing
Company, Easton, Pennsylvania.
Se prefiere que los agentes terapéuticos y
profilácticos de la invención, cuando están en una preparación
farmacéutica, se presenten en formas de dosificación unitaria. Los
especialistas en la técnica pueden determinar fácilmente la dosis
terapéuticamente eficaz apropiada. Para tratar eficazmente un
trastorno inflamatorio en un ser humano u otro animal, debe
administrarse por vía parenteral preferiblemente i.v. o i.m (por vía
intramuscular) una dosis de aproximadamente 0,1 mg a
aproximadamente 20 mg por 70 kg de peso corporal de una proteína o
un anticuerpo de esta invención. Dicha dosis puede, si fuera
necesario, repetirse a intervalos de tiempo apropiados seleccionado
según sea apropiado por un médico.
Los anticuerpos, anticuerpos alterados o
fragmentos de los mismos descritos en este documento puede
liofilizarse para almacenamiento y reconstituirse en un vehículo
adecuado antes de su uso. Esta técnica ha demostrado ser eficaz con
inmunoglobulinas convencionales y pueden emplearse técnicas de
liofilización y reconstitución conocidas en la técnica.
En un régimen terapéutico alternativo más, lo
anticuerpos alterados y anticuerpos monoclonales de esta invención
pueden usarse en una terapia combinada para las enfermedades
descritas como antagonistas de pequeñas moléculas, las
dosificaciones y regímenes de administración se describe en, por
ejemplo la Publicación de Patente Internacional PCT Nº WO96/00730,
publicada el 11 de enero de 1996 y la Publicación de Patente
Internacional PCT Nº WO96/00574, publicada el 11 de enero de 1996.
Dicha terapia de combinación puede implicar administrar un
anticuerpo de esta invención a un paciente durante un periodo de
tiempo corto, es decir, de varias semanas a seis meses, seguido del
tratamiento terapéutico crónico con el antagonista de molécula
pequeña durante un periodo de tiempo más largo. En otra
realización, esta realización de un procedimiento de tratamiento
puede implicar periodos de tratamiento alterno de administrar
inmunoterapia con los anticuerpos de esta invención seguidos de
tratamientos con antagonistas no peptídicos pequeños. Dichos
procedimientos terapéuticos combinados emplearían las mismas
dosificaciones descritas anteriormente para inmunoterapia y las
dosificaciones especificadas en las solicitudes citadas
anteriormente para las terapias no peptídicas.
Los anticuerpos alterados y anticuerpos
manipulados de esta invención también pueden usarse en regímenes de
diagnóstico, tales como para la determinación de trastornos mediados
por receptores que contienen \alpha_{v} humanos o rastrear el
desarrollo del tratamiento de dichos trastornos. Como reactivos de
diagnóstico, estos anticuerpos alterados pueden marcarse de forma
convencional para uso en ELISA y otros formatos de ensayo
convencionales para la medición de los niveles del receptor que
contiene la subunidad \alpha_{v} humana en el suero, plasma, u
otro tejido apropiado o la liberación por células humanas en
cultivo. La naturaleza del ensayo en el que se usan los anticuerpos
alterados es convencional y no limitan esta descripción.
Los siguientes ejemplos ilustran diversos
aspectos de esta invención incluyendo la construcción de anticuerpos
manipulados ejemplares y la expresión de los mismos en vectores y
células huésped adecuadas, y no deben interpretarse como limitantes
del alcance de la invención. Todos los aminoácidos se identifican
mediante los códigos convencionales de tres letras o una letra.
Todas las enzimas de restricción, plásmidos, y otros reactivos y
materiales necesarios se obtuvieron de fuentes comerciales a menos
que se indique otra cosa. Toda la metodología de ligamiento de
clonación general y de ADN recombinante era como se realizó en T.
Maniatis y col., o Sambrook y col., ambos citados
anteriormente.
El receptor de la proteína
\alpha_{V}\beta_{3} humana y otros receptores proteicos se
purificaron a partir de la placenta humana de la siguiente
manera.
Se congelaron placentas inmediatamente después
del parto, después se descongelaron parcialmente y se cortaron en
tiras pequeñas que se picaron en pedazos finos usando una picadora
de carne comercial. Normalmente se picaron de cinco a diez
placentas al mismo tiempo. Los pedazos se colocaron en tubos de
centrífuga de 50 ml (6 tubos por placenta) y se almacenaron
congelados a -20º C hasta su uso.
Se preparó una columna de inmunoafinidad para
cada integrina usando anticuerpos monoclonales individuales. El mAb
anti-\alpha_{V}\beta_{3} (LM609) se purificó
a partir de líquido ascítico murino adquirido de Chemicon
International, Inc. (Temecula, CA). Los anticuerpos monoclonales
23C6 o D12 se purificaron a partir de medios de hibridoma. Un mAb
anti-\alpha_{V}\beta_{5} (P1F6) y mAb
anti-\alpha_{V}\beta_{1} (mAbl6) se
adquirieron de Becton Dickinson. LM609 o 23C6 o D12 (50 mg), P1F6
(25 mg) y mAb16 (25 mg) se inmovilizaron en AffiGel 10 (BioRad) a 5
mg de mAb/ml de resina siguiendo las instrucciones del fabricante.
Para retirar las proteínas de unión no específica, se trataron 20
ml de AffiGel 10 con Tris HCl 1 M pH 7,5 y se introdujeron en una
columna Econo. Los mAb inmovilizados se introdujeron en la columna
EconoColumn (BioRad), columna de 10 ml para LM609 o 23C6 o D12, una
de 5 ml para P1F6 y una de 5 ml para mAb16. Las columnas se
conectaron en tándem: la primera columna contenía AffiGel 10 para
unión no específica, la segunda columna contenía mAb
\alpha_{V}\beta_{3}, la tercera columna contenía mAb
\alpha_{5}\beta_{1} y la cuarta columna contenía mAb P1F6
(el \alpha_{V}\beta_{5}). Las columnas se equilibraron con
tampón T (Tris HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 0,1 M, CaCl 2 mM,
octilglucósido al 1%) en la cámara de frío.
La placenta picada (9 tubos) se descongeló
parcialmente y se dispersó minuciosamente usando una espátula en
tampón T+ octilglucósido al 6% (la concentración final de OG era del
3%). La mezcla se almacenó durante 5 horas o durante una noche a
4ºC. La solución en masa se transfirió a frascos de centrifuga de
250 ml y se centrifugó a 13.000 rpm durante una hora. El
sobrenadante transparente se transfirió a tubos de centrifuga de 50
ml y se centrifugo a 20.000 rpm durante una hora. El sobrenadante
transparente se combinó y se introdujo a un caudal de 30 ml/hora en
las columnas dispuestas y pre-equilibradas en tampón
T en modo en tándem como se ha descrito anteriormente. Al final de
la carga, las columnas se lavaron con >250 ml de tampón T. Las
columnas individuales se separaron después y las integrinas unidas
se eluyeron con ácido acético 0,2 M hasta que el pH del eluato
alcanzó <3,0. Las soluciones de integrina eluida se neutralizaron
rápidamente a >pH 7,0 con base Trizma 1 M. La columna también se
neutralizó mediante un lavado con tampón T.
Las soluciones de integrina eluida (25 ml) se
concentraron a 1 ml usando Aquaside III (Calbiochem) en una bolsa
de diálisis de límite 5.000. Las integrinas concentradas se
dializaron durante una noche contra tampón T. El rendimiento final
fue de aproximadamente 1 mg para cada integrina por placenta.
Se generaron mAb murino con actividad
anti-\alpha_{V}\beta_{3} mediante tecnología
de hibridoma clásica de acuerdo con Lane y col.,
1986, Methods in Enzymol., 121:183. Generalmente, se
administraron 20-50 \Phig de receptor
\alpha_{V}\beta_{3} por vía intraperitoneal, subcutánea, e
intravenosa a dos ratones Balb/c. Se ensayó la actividad de unión y
neutralización anti-\alpha_{V}\beta_{3} en
sueros de los animales inmunizados en ensayos de los Ejemplos 3, 4
y 5 a continuación. Los bazos de ratones que mostraba sueros
positivos se fusionaron con una célula de mieloma SP2 de acuerdo
con los procedimientos de Lane y col., citados anteriormente.
Se obtuvieron diecisiete líneas celulares de hibridoma resultantes,
que secretaban anticuerpos de proteína
anti-\alpha_{V}\beta_{3} humana potenciales.
Estos mAb anti-\alpha_{V}\beta_{3} se
generaron y aislaron a partir del cultivo mediante procedimientos
convencionales y se ensayaron en ensayos de los siguientes
ejemplos.
La Tabla I es un resumen de los datos recogidos
de los Ejemplos 3-10 a continuación sobre el mAb B9
murino, el mAb LM609 murino de la técnica anterior y otros mAb
murino de esta invención. Los datos mostraron que el mAb B9 era un
mAb con un perfil de actividad favorable. El mAb B9 que funcionó
adecuadamente en estos ensayos se seleccionó después para la
humanización como se describe en el Ejemplo 11, y se ensayó
adicionalmente después en modelos animales de los Ejemplos 13 y 14.
El mAb B9 tenía una reactividad cruzada mínima con conejo (no
detectable en estudios in vivo), por lo tanto, los modelos
humanos y de primates de restenosis, angiogénesis o aterosclerosis
son aplicables para la eficacia del ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
La unión de las diversas construcciones de
anticuerpos a la proteína receptora \alpha_{v}\beta_{3} y
proteína receptora \alpha_{v}\beta_{5} de humana purificada
como antígenos (receptor unido a la placa o a las perlas mediante
biotina-avidina) se midió en un ELISA de fase sólida
convencional.
El antígeno diluido en CO_{3} 0,1 M pH 9,2 se
adsorbió en microplacas de poliestireno de fondo redondeado
(Dynatech, Immunolon II) durante 18 horas. Los pocillos se lavaron
después una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS) que
contenía Tween 20 al 0,05%. Los anticuerpos (50 \Phil/pocillo) se
diluyeron a concentraciones variables en PBS/Tween 20 al 0,05% y se
añadieron a los pocillos revestidos con antígeno durante dos horas
a temperatura ambiente. Las placas se lavaron cuatro veces con PBS
que contenía Tween 20 al 0,05%, usando un lavador de microplacas
Titertek 320, seguido de adición de IgG
HRP-anti-ratón (100 \Phil/pocillo)
diluido 1:10.000.
Después de lavar cinco veces, se añadió
diclorhidrato de o-fenilendiamina (OPD) (1 mg/ml) y
se incubaron las placas 10 minutos adicionales. La reacción se
interrumpió mediante la adición de NaF 0,1 M y se leyó la
absorbancia a 450 nm usando un lector de ELISA Dynatech MR
7000.
Los mAb positivos en el ensayo del Ejemplo 3 se
seleccionaron usando los mismos protocolos excepto que el antígeno
era otro receptor humano \alpha_{5}\beta_{1} o
\alpha_{11}\beta_{3}. Estos ensayos se realizaron para
determinar la selectividad para el antígeno heterodimérico
\alpha_{v}\beta_{3} y \alpha_{v}\beta_{5} en
oposición a la selectividad para una subunidad \beta solamente.
Los resultados de estos ensayos se presentan en la Tabla I
anteriormente para todos los mAb del Ejemplo 2 y para LM609.
Se añadieron receptores de vitronectina
\alpha_{v}\beta_{3} y \alpha_{v}\beta_{5} (0,2
\mug/pocillo), purificados a partir de placenta humana, a placas
de ELISA de 96 pocillos (Coming, New York, NY). Las placas se
incubaron durante una noche a 4ºC. En el momento del experimento las
placas se aspiraron y se incubaron en 0,1 ml de tampón A (Tris 50
mM, NaCl 100 mM, CaCl_{2} 1 mM, MgCl_{2} 1 mM, MnCl_{2}, 1mM,
pH 7,4) que contenía albúmina de suero bovino (BSA) al 3% durante 1
hora a temperatura ambiente para bloquear la unión no específica.
Después de aspirar la solución de bloqueo, se añadieron diversas
concentraciones de mAb a los pocillos seguidas de la adición de
fibrinógeno biotinilado 5 nM en 0,1 ml de Tampón A que contenía BSA
al 0,1%. Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura
ambiente.
Después de la incubación, se aspiraron los
pocillos completamente y se lavaron dos veces con 100 \Phil de
tampón de unión. Se cuantificó el fibrinógeno unido mediante la
adición de 0,1 ml de un anticuerpo anti-biotina
conjugado con fosfatasa alcalina (dilución 1:2000, Sigma), seguido
del lavado dos veces con tampón de unión y la adición de 100
\Phil del sustrato p-nitrofenil fosfatasa
preparado diariamente de acuerdo con las instrucciones del
fabricante (kit del sustrato de fosfatasa alcalina, BioRad). La
cinética del desarrollo de coloración se siguió usando un lector de
placas de microtitulación.
Este ensayo detectó la inhibición de la unión
entre el receptor \alpha_{v}\beta_{3} purificado y su
ligando, fibronectina, los resultados de estos ensayos se presentan
en la Tabla I anteriormente, para todos los mAb del Ejemplo 2 y
para LM609.
Para caracterizar varios de los mAb murino
obtenidos como se ha descrito anteriormente con el mAb LM609 murino
conocido, se realizó este ensayo para detectar la unión al receptor
de la superficie nativa y la reactividad cruzada entre
especies.
Descrito brevemente, las células se lavaron en
10 ml de PBS frío y se resuspendieron en PBS frío para dar entre 1
x 10^{7} y 2 x 10^{7} células/ml. Se añadieron alícuotas de 0,1
ml/pocillo a una placa de fondo en "V" de 96 pocillos.
Después, se añaden 25 \Phil de anticuerpo primario. Las placas se
agitan durante cinco minutos, y después se incuban en hielo durante
25 minutos. Las placas se centrifugan durante cinco minutos y se
sacuden. En lo sucesivo, los contenidos de cada pocillo se
resuspenden en 50 \Phil de PBS frío, y se centrifugan y sacuden
de nuevo. Se repite el lavado y los contenidos se resuspenden en 50
\Phil de PBS frío. Se añade anticuerpo secundario marcado con
isotiocianato de fluoresceína (FITC) (50 \Phil) a cada pocillo.
Las placas se agitan durante cinco minutos, y se incuban en hielo en
la oscuridad durante 20 minutos. Se añade un \Phil de yoduro de
propidio (PI) (1mg/ml)/PBS hasta una concentración final de 10
\Phig/ml (1 \Phig en 0,1 ml). La incubación continúa durante
cinco minutos, seguida de centrifugado y lavado dos veces en PBS
frío.
Las células se resuspenden en 0,1 ml de PBS
frío, y se transfieren a tubos Falcon transparentes de 12 x 75. El
volumen se ajusta a 1 ml, y las células se mantienen frías en la
oscuridad hasta la lectura mediante FLOW.
El anticuerpo secundario: IgG,M,A de cabra
anti-ratón, se marca con FITC
1:25/PBS-BSA al 0,2%-NaN_{3} al 0,1% (Sigma F1010
Nº de lote 045H8822) y se mantiene frío en la oscuridad hasta la
lectura mediante FLOW.
Los resultados de estos ensayos se presentan en
la Tabla I y muestran una clara indicación de que B9 se une a las
células que expresan \alpha_{v}\beta_{3} y
\alpha_{v}\beta_{5}. La citometría de flujo usando células
del músculo liso (SMC) humanas indicaba que mAb B9 tiene gran
capacidad para unirse a un receptor nativo en la superficie
celular.
La inmunohistología se realizó en tejidos que
expresaban altos niveles de receptores, tales como osteoclastoma
humano. Los datos de inmunohistología (osteoclastoma humano)
mostraron que B9 tiene una capacidad de detección superior. Véase
la Tabla I. B9 detecta
\alpha_{v}\beta_{3}/\alpha_{v}\beta_{5} humano, de
babuino y de conejo en células y tejido humano.
Se realizó un análisis BIAcore (Pharmacia) para
medir la afinidad de unión de mAb B9 (6 nM) con
\alpha_{v}\beta_{3} y \alpha_{v}\beta_{5}
inmovilizado. Las interacciones de estos receptores con B9 se
estudiaron usando tecnología BIAcore mediante inmovilización de los
receptores en la superficie del sensor, y pasando soluciones del
mAb sobre su superficie. Las descripciones de la instrumentación y
las superficies del sensor se describen en
[Brigham-Burke, Edwards y O'Shannessy, 1992,
Analytical Biochem., 205: 125-131]. Los
receptores se inmovilizaron insertándolos en una vesícula de
fosfolípidos y produciendo una membrana bicapa híbrida sobre una
superficie sensora hidrófoba. Una descripción más completa de la
generación de membranas de bicapa híbrida en superficies de sensor
de BIAcore se proporciona en Plant y col., 1995,
Analyt. Biochem., 226: 342-348: Las muestras
del mAb se pasaron sobre esta superficie y las velocidades a las
que se unen y después se disocian de la superficie se midieron y
analizaron usando el software proporcionado con el instrumento.
La Tabla II proporciona estos datos. Las
constantes de velocidad cinética y la constante de afinidad
calculada (K_{D}) se obtuvieron del análisis de tres
concentraciones de mAb (100, 24, 6 nM) realizado por triplicado.
Los datos del Biacore mostraron que la afinidad de unión (K_{D})
de B9 es aproximadamente 5 veces mayor que la del Mab D12 para el
receptor \alpha_{v}\beta_{3}.
\newpage
En un segundo formato del análisis BIAcore, se
empleó Proteína A para inmovilizar los mAb en la superficie del
sensor y después se pasaron muestras de las proteínas receptoras
sobre esta superficie y las velocidades a las que se unen y después
se disocian de la superficie se midieron y analizaron usando el
software proporcionado con el instrumento. La Tabla III proporciona
datos que permiten la evaluación de diferentes construcciones de B9
humanizadas para su actividad de unión contra el receptor
\alpha_{v}\beta_{3}. Los mAb B9 humanizados en la Tabla
III, se caracterizan por la cadena pesada de IgG1, excepto por
B9HL1G4, que tiene una cadena pesada de IgG4. Se representan tres
cadenas ligeras diferentes mediante L1, L2, y L3. El mAb
anti-\alpha_{v}\beta_{3} (D12IgG1) se
incluyó para comparación. La K_{as} (velocidad de asociación) y la
K_{dis} (velocidad de disociación) son mediciones que calculan la
afinidad de los mAb contra el receptor \alpha_{v}\beta_{3}
(K_{D} en nM). Estos datos de Biacore indican que los mAb tienen
una mayor afinidad por el receptor \alpha_{v}\beta_{3} que
el mAb D12.
La migración de células del músculo liso (SMC)
vascular desde los medios en el área de la herida para iniciar el
crecimiento de la neoíntima es una respuesta de remodelado esencial
después de la lesión vascular. La inhibición de la migración de SMC
atenúa la formación de la neoíntima. La migración de SMC vascular
está mediada por el receptor humano \alpha_{v}\beta_{3},
que se expresa en VSMC y se regula positivamente después de la
lesión vascular. La osteopontina, un ligando del receptor humano
\alpha_{v}\beta_{3}, se regula positivamente después de la
angioplastia y promueve la migración de VSMC mediante la integrina.
Este experimento se realizó para demostrar la capacidad de un
anticuerpo para \alpha_{v}\beta_{3} humano de inhibir la
migración de VSMC in vitro.
Se usaron células del músculo liso aórtico
humano. La migración celular se controló en una cámara de cultivo
celular Transwell usando una membrana de policarbonato con poros de
8 \mum (Costar). La superficie inferior del filtro se revistió
con vitronectina u osteoporina. Las células se suspendieron en medio
mínimo esencial de Difco (DMEM) suplementado con BSA al 0,2% a una
concentración de 2,5-5,0 x 10^{6} células/ml, y se
trataron previamente con anticuerpo de ensayo a diversas
concentraciones durante 20 minutos a 20ºC. El disolvente en
solitario se usó como control. Se colocaron 0,2 ml de la suspensión
celular en el compartimento superior de la cámara. El compartimento
inferior contenía 0,6 ml de DMEM suplementado con BSA al 0,2%. La
incubación se realizó a 37ºC en una atmósfera de aire al
95%/CO_{2} al 5% durante 24 horas.
Después de la incubación, las células no
migradas en la superficie superior del filtro se retiraron raspando
suavemente. El filtro se fijo después en metanol y se tiñó con tinte
Giemsa al 10%. La migración se midió a) contando la cantidad de
células que habían migrado a la superficie inferior del filtro o b)
extrayendo las células teñidas con ácido acético al 10% seguido de
determinación de la absorbancia a 600 nM.
Se obtuvieron células de riñón embrionario
humano (células HEK293) de ATCC (Nº de catálogo CRL 1573). Se
cultivaron las células en medio mínimo esencial de Earl (EMEM),
medio que contenía sales de Earl, suero fetal bovino (FBS) al 10%,
glutamina al 1% y Penicilina-Estreptomicina al
1%.
Un fragmento de EcoRI-KpnI de
3,2 kb de la subunidad \alpha_{v} y un fragmento
XbaI-XhoI de 2,4 kb de la subunidad \beta_{3}
se insertaron en los sitios de clonación EcoRI-EcoRV
del vector pCDN que contiene un promotor CMV y un marcador G418
seleccionable mediante ligamiento de extremos romos. Para la
expresión estable, se electrotransformaron 80 x 10^{6} células
HEK 293 con construcciones \alpha_{v}+\beta_{3} (20 \Phig
de ADN de cada subunidad) usando un Gene Pulser [P. Hensley y
col., 1994, J. Biol. Chem., 269:
23949-23958] y se colocaron en placas de 100 mm (5 x
10^{5} células/placa). Después de 48 horas, el medio de cultivo
se suplementó con 450 \Phig/ml de Geneticin (G418 Sulfate,
GIBCO-BRL, Bethesda, MD). Las células se
mantuvieron en medio de selección hasta que las colonias eran lo
suficientemente grandes para someterse al ensayo.
Se revistieron previamente placas de ELISA de 96
pocillos de Coming durante una noche a 4ºC con 0,1 ml de
vitronectina humana (0,2 \Phig/ml en medio RPMI). En el momento
del experimento, las placas se lavaron una vez con medio RPMI y se
bloquearon con BSA al 3,5% en medio RPMI durante 1 hora a
temperatura ambiente. Las células 293 transfectadas se
resuspendieron en medio RPMI, suplementado con Hepes 20 mM, pH 7,4 y
BSA al 0,1% a una densidad de 0,5 x 10^{6} células/ml. Se
añadieron 0,1 ml de suspensión celular a cada pocillo y se
incubaron durante 1 hora a 37ºC, en presencia o ausencia de diversos
antagonistas de \alpha_{v}\beta_{3}. Después de la
incubación, se añadieron 0,025 ml de una solución de formaldehído al
10%, pH 7,4, y las células se fijaron a temperatura ambiente
durante 10 minutos. Las placas se lavaron 3 veces con 0,2 ml de
medio RPMI y las células adherentes se tiñeron con 0,1 ml de azul
de toluidina al 0,5% durante 20 minutos a temperatura ambiente.
El exceso de tinte se retiró mediante lavado
extenso con agua desionizada. El azul de toluidina incorporado en
las células se eluyó mediante la adición de 0,1 ml de etanol al 50%
que contenía HCl 50 mM. La adhesión celular se cuantificó a una
densidad óptica de 600 nm en un lector de placas de microtitulación
(Titertek Multiskan MC, Sterling, VA).
La neutralización de la inhibición del receptor
de adhesión celular demostró que B9 es superior a D12 y LM609 para
inhibir la adhesión celular (véase Tabla I; véase también).
Se adoptó una estrategia de humanización para
obtener un Mab humanizado al máximo que conservaba completamente la
afinidad y avidez de unión al antígeno. Los ADNc de la cadena pesada
variable (VH) y cadena ligera variable kappa (Vk) se clonaron y
secuenciaron. La secuencia de VHB9 se muestra en la Fig. 1A [SEC ID
Nº 1 y 2] (con las CDR en negrita y subrayadas) y la secuencia de
VkB9 se muestra en la Fig. 2A [SEC ID Nº 6 y 7] (con las CDR en
negrita y subrayadas).
Después de la clonación del ADNc y el análisis
de la secuencia, se descubrió que VHB9 y VkB9 eran más similares al
subgrupo I de Kabat VH (Fig. 1B; [SEC ID Nº 3]) y subgrupo I de Vk
(Fig. 2B; [SEC ID Nº 8]), respectivamente. Las regiones VH y VL
humanizadas se sintetizaron combinando las regiones marco de las
secuencias consenso del subgrupo de la región V humana junto con
las regiones CDR de B9.
El modelado molecular de B9 usando estructuras
cristalinas conocidas revela ciertos restos de marco VH y VL que
pueden contactar con restos CDR, y de este modo influir en su
conformación. Dichos restos marco pueden por lo tanto, contribuir a
la formación de una especificidad de antígeno particular y afinidad
de unión asociada. Ocho de dichos restos marco VH murino (indicados
mediante asteriscos en la Fig. 1C [SEC ID Nº 4 y 5]) y un resto
marco Vk murino (indicado mediante asteriscos en la Fig. 2C [SEC ID
Nº 9 y 10]) se introdujeron en las regiones marco de consenso
humanas, dando como resultado B9HZHC1-0 (Fig. 1C;
[SEC ID Nº 4 y 5]) y B9HZLC1-0 (Fig. 2C; [SEC ID Nº
9 y 10]).
Se realizó microsecuenciación de los aminoácidos
N-terminales de cadenas pesadas y ligeras de B9. La
secuencia VH, QVQLQQSGAELMKPGA [SEC ID Nº 16] y la secuencia Vk
DIQMTQTTSSLAXAXL [SEC ID Nº 17] N-terminales, se
usaron para diseñar cebadores de PCR degenerados que podían dirigir
la amplificación por PCR de las regiones VH y Vk desconocidas,
respectivamente. Estos cebadores degenerados se diseñaron de modo
que las regiones V amplificadas codificaran de todos modos extremos
N auténticos.
Se purificó ARN total de células de hibridoma B9
usando reactivo TRIzol (Life Technologies Nº de Cat.
15596-026) de acuerdo con el protocolo del
fabricante. El ARN se precipitó con isopropanol y se disolvió en
agua destilada. Se transcribieron inversamente cien ng de ARN con
un kit de RT-PCR según las instrucciones del
fabricante (Boehringer Mannheim Nº 1483-188) usando
oligo-dT para el cebado. Para la cadena pesada, se
realizó amplificación por PCR del híbrido de ARN/ADN durante 25
ciclos usando un cebador inverso CH1 de IgG_{1} murino: 5' AGG
GGC CAG TGG ATA GAC 3' [SEC ID Nº 18] y un cebador directo
degenerado basado en la secuencia de proteína VH
N-terminal SBA3204: 5' GCT ACC GGT GTC CAC TCC CAA
GTN CA(A/G) CTN CA(A/G) CA
3' [SEC ID Nº 19].
3' [SEC ID Nº 19].
Análogamente, para la cadena ligera, se realizó
amplificación por PCR del híbrido de ARN/ADN durante 25 ciclos
usando un cebador inverso kappa murino SBA0352: 5' GCA CCT CCA GAT
GTT AAC TGC 3' [SEC ID Nº 20] y un cebador directo degenerado
basado en la secuencia de proteína Vk N-terminal
SBA9258: 5' GCT ACC GGT GTC CAC TCC GA(C/T) AT(A/C/T)
CA(A/G) ATG ACN CA 3' [SEC ID Nº 21]. El ADN de PCR se
analizó en un gel de agarosa al 0,8%. Los insertos de PCR del
tamaño apropiado, -400 pb, se secuenciaron mediante una modificación
del procedimiento de Sanger.
La secuencia de 5 clones de cadena ligera y 5 de
pesada se compararon para generar una secuencia de región variable
de cadena pesada B9 de consenso (Fig. 1C: [SEC ID Nº 4 y 5]) y una
secuencia de región variable de cadena ligera 3G9 de consenso (Fig.
2C: [SEC ID Nº 9 y 10]). Las CDR se muestran en negrita. Las 17
primeras bases de la secuencia de ADN para las cadenas pesadas y
ligeras se generaron con cebadores de PCR, sin embargo la secuencia
de proteína traducida es exacta.
El anticuerpo B9 humanizado como se describe en
este documento está constituido por la cadena pesada de consenso
sintética B9HZHC1-0 [SEC ID Nº 4] de la Fig. 1C, y
la cadena ligera de consenso sintética B9HZLC1-0
[SEC ID Nº 9] de la Fig. 2C. El anticuerpo se construyó de la
siguiente manera:
Se diseñó una región variable de cadena pesada
humanizada sintética usando marcos de secuencia consenso del
subgrupo I de cadena pesada humana de acuerdo con lo definido por
Kabat y las CDR de cadena pesada de B9 murino, descritas
anteriormente. Se introdujeron ocho sustituciones de aminoácidos
marco murino que podían influir en la presentación de CDR (véase
asteriscos en la Fig. 1C). Se sintetizaron cuatro oligonucleótidos
sintéticos solapantes con las siguientes secuencias:
\hskip0,5cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
y
Cuando hibridan y se extienden, las secuencias
de oligonucleótidos codifican los aminoácidos de la región V de la
cadena pesada humanizada (véase Fig. 3; [SEC ID Nº 11 y 12]). Este
gen sintético se amplificó por PCR con los cebadores SBB0191: 5 =
TTA ACC GGT GTC CAC TCC CAA GTT CAG 3 = [SEC ID Nº 36] y SBB0192: 5
= GCT GGG GCC CTT GGT ACT AGC TGA GGA 3 = [SEC ID Nº 37] y se
ligaron al vector de clonación pCR2000 (TA cloning Kit, Invitrogen,
Nº de Cat. K2000-01), y se aislaron después de una
digestión de restricción en AgeI, ApaI.
Este fragmento de ADN se ligó en el vector
pCDHCAGE que se había digerido con restricción previamente con AgeI
y ApaI. pCDHCAGE es una variante de los plásmidos pCDN [Nambi y
col., 1994, Mol. Cell. Biochem.,
131:75-85] y
F9HZLC1-1-pCN [Publicación de
Patente Internacional Nº WO94/05690]. Estos vectores de plásmido
variantes de pCDN contienen, en general, un gen de beta lactamasa,
un origen de replicación SV40, una secuencia promotora de
citomegalovirus, una cadena ligera humanizada seleccionada, una
señal poli A para hormona del crecimiento bovina, un promotor de
betaglobina, un gen de resistencia a neomicina, y otra secuencia
señal poli A para BGH en un trasfondo pUC19. pCDHCAGE contiene
además la secuencia líder de inmunoglobulina CAMPATH en la que se
ha introducido un único sitio AgeI en el extremo 3', una secuencia
de engarce seguida de secuencias codificantes de cadena pesada
ininterrumpidas que comienzan en un único sitio ApaI en el extremo
5' de la región CH1 humana, hasta el final de la región CH3 humana.
El gen resultante codifica una cadena pesada humanizada completa,
que comprende el codón de inicio, el péptido líder CAMPATH, la
región VH humanizada, y una región constante de IgG_{1} completa.
Esta construcción de expresión se denomina
pCDB9HZHC1-0, y cuando se cultiva en una célula
huésped adecuada, produce una cadena de IgG_{1} humana completa
con la región V de cadena pesada de B9 humanizada
B9HZHC1-0 (Fig. 1C; [SEC ID Nº 4 y 5]).
Se diseñó una región variable de cadena ligera
humanizada sintética usando un marco de consenso de región variable
del subgrupo I de cadena ligera humana de acuerdo con lo descrito
por Kabat, y las CDR de cadena ligera de B9 como se ha descrito
anteriormente. Se introdujo una sustitución de aminoácidos marco
murino que podía influir en la presentación de CDR (véase asterisco
en la Fig. 2C: [SEC ID Nº 9 y 10]). Se generaron cuatro
oligonucleótidos sintéticos solapantes con las siguientes
secuencias:
\hskip0,5cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando hibrida y se extiende, la secuencia de
oligonucleótidos codifica los aminoácidos de la región Vk de B9
humanizada, B9HZLC1-0 (véase Fig. 4 [SEC ID Nº 13 y
14]).
Esta región Vk sintética se amplificó después
por PCR usando los cebadores SBB0034: 5' TTT TTG GCT ACC GGT GTC
CAC TCC GAT ATT CAG 3' [SEC ID Nº 26] y SBB0035: 5' ACG GGT ACC TCC
ACC GAA CGT CCA AGG 3' [SEC ID Nº 27] y se ligaron al vector de
clonación pCR2000 (TA cloning Kit, Invitrogen, Nº de Cat.
K2000-01), y se aislaron después de una digestión
de restricción con AgeI, KpnI.
\newpage
Este fragmento de ADN se ligó al vector pCNLCAGE
que se había digerido previamente con restricción con AgeI y KpnI.
pCNLCAGE es una variante de los plásmidos pCDN [A. Nambi y
col., 1994, Mol. Cell. Biochem., 131:
75-85] y
F9HZLC1-1-pCN [Publicación de
Patente Internacional Nº WO94/05690]. Estos vectores variantes del
plásmido pCDN contienen, en general, un gen de beta lactamasa, un
origen de replicación SV40, una secuencia promotora de
citomegalovirus, una cadena ligera humanizada seleccionada, una
señal poli A para hormona del crecimiento bovina, un promotor de
betaglobina, un gen de resistencia a neomicina, y otra secuencia
señal poli A para BGH en un trasfondo pUC19. pCNLCAGE contiene
además la secuencia líder de inmunoglobulina CAMPATH en la que se
ha introducido un único sitio AgeI en el extremo 3', una secuencia
de engarce seguida de secuencias codificantes de cadena ligera
ininterrumpidas que comienzan en un único sitio KpnI en el medio de
la región Jk humana hasta el final de la región Ck humana (es
decir, la región constante de cadena ligera del isotipo k, en
oposición al isotipo lambda). El gen resultante codifica una cadena
ligera humanizada completa, que comprende el codón de inicio en el
extremo del dominio Ck. Esta construcción de expresión se denomina
pCNB9HZLC1-0, y cuando se cultiva en una célula
huésped adecuada, produce una cadena k humana completa con la región
V de cadena ligera de B9 humanizada B9HZLC1-0 (Fig.
2C; [SEC ID Nº 9 y 10]).
El vector de cadena pesada
pCDB9HZHC1-0 y el vector de cadena ligera
pCDB9HZLC1-0 descritos anteriormente, se usaron
para producir anticuerpo HuB9 en células COS y células CHO.
Para la caracterización inicial, las cadenas
pesada y ligera del HuB9 humanizado se expresaron en células COS
esencialmente como se describe en Current Protocols in Molecular
Biology (editado por F. M. Ausubel y col., 1988, John
Wiley & Sons, vol. 1, sección 9.1). Descrito brevemente, las
células COS se co-transfectaron con 10 \Phig de
cada plásmido. En el día 1 después de la transfección, el medio de
cultivo se sustituyó con un medio sin suero que se cambió el día 3.
El medio sin suero era una formulación patentada, pero se obtienen
resultados satisfactorios usando DMEM suplementado con TTS^{TM}
Premix (mezcla de insulina, transferrina, selenio - Collaborative
Research, Bedford, MA) y 1 mg/ml de BSA. El mAb se aisló y preparó a
partir del medio acondicionado del día 3 + día 5 mediante
procedimientos de cromatografía de afinidad de proteína A
convencionales (por ejemplo, como se describe en Protocols in
Molecular Biology) usando, por ejemplo resina de afinidad Prosep A
(Bioprocessing Ltd., UK).
El B9 humanizado se expresó en forma de una
molécula kappa \gamma_{1}, en células COS transfectadas de
forma transitoria. Se descubrió que los sobrenadantes de este
cultivo se unen al receptor \alpha_{v}\beta_{3} y al
receptor \alpha_{v}\beta_{5} en ensayos ELISA y BIAcore
descritos anteriormente.
Para producir grandes cantidades de los mAb HuB9
(100-200 mg), los plásmidos se introdujeron en un
sistema de células CHO patentado, la línea celular
CHO-Ela. Esta línea celular proporciona mayores
cantidades de mAb (aproximadamente 10 mg de cada uno) y permite
ensayar el perfil de actividad de anticuerpos quiméricos y
humanizados. Sin embargo, se obtendrán resultados similares usando
células CHO dhfr^{-} como se ha descrito anteriormente [P.
Hensley y col., citado anteriormente]. En resumen, se
electroporan un total de 30 \Phig de ADN de plásmido linealizado
(15 \mug de cada uno de los plásmidos de cadena pesada o ligera)
en 1 x 10^{7} células. Las células se seleccionan inicialmente en
medio sin nucleósidos en placas de 96 pocillos. Después de tres a
cuatro semanas, se seleccionan medios de pocillos de crecimiento
positivo para inmunoglobulina humana usando el ensayo ELISA del
Ejemplo 3. Las colonias de mayor expresión se multiplican y
seleccionan en concentración en aumento de metotrexato para la
amplificación de los vectores transfectados. El anticuerpo se
purifica a partir de medio acondicionado mediante procedimientos
convencionales usando cromatografía de afinidad de proteína A
(Protein A sepharose, Pharmacia) seguida de cromatografía de
exclusión por tamaños (Superdex 200, Pharmacia).
La concentración y la actividad de unión al
antígeno del anticuerpo eluido, se miden mediante los ensayos de
ELISA de los Ejemplos 3 y 4. Las fracciones que contienen el
anticuerpo se reúnen y se purifican adicionalmente mediante
cromatografía de exclusión por tamaño.
Una segunda construcción tiene una cadena ligera
basada en el marco de consenso REI humano para proporcionar una
cadena ligera alternativa en el caso de expresión inestable en
líneas celulares de producción de B9 humanizado. Esta variante
difiere de B9HZLC1-0 solamente en dos intercambios
de aminoácidos conservativos, L73F y F83I (convención de numeración
de Kabat).
Descrito brevemente, se diseñó una cadena ligera
kappa humanizada en base a un marco de cadena kappa REI humana
modificada de la Fig. 5 [SEC ID Nº 15] y las CDR de Vk de B9
descritas anteriormente. Como para B9HZLC1-0, se
introdujo solamente un resto marco donador (B9), en una posición
identificada en experimentos de modelado que podía influir en la
presentación de CDR. Se usó mutagénesis
sitio-dirigida para incorporar los intercambios de
aminoácidos L73F y F83I en el intermedio de
B9HZLC1-0 (Fig. 4 [SEC ID Nº 13 y 14]). Después de
la digestión con AgeI-KpnI, el fragmento basado en
REI se clonó en pCNLCAGE digerido con AgeI-KpnI como
se ha descrito para B9HZLC1-0. La región V
humanizada resultante era la del B9HZLCREI de la Fig. 6 [SEC ID Nº
28 y 29].
Se creó una tercera variante de cadena ligera
humanizada de B9 que difería de B9HZLC1-0 en el
único intercambio de aminoácidos K103N (convención de numeración de
Kabat). Esta variante se creó mediante mutagénesis
sitio-dirigida del intermedio
B9HZLC1-0 (Fig. 4 [SEC ID Nº 13 y 14]) y se clonó en
pCNLCAGE como se ha descrito anteriormente. La región V humanizada
resultante era la del B9HZLC1-1 de la Fig. 7 [SEC ID
Nº 30 y 31].
Se creó una variante isotípica de IgG4 de
B9HZHC1-0 clonando el fragmento
AgeI-ApaI de la cadena pesada sintética del
intermedio B9HZHC1-0 (Fig. 3; [SEC ID Nº 11 y 12])
en un vector de expresión de IgG_{4} digerido con
AgeI-ApaI. Este vector, pCDHCAGEG4, es un derivado
de pCDHCAGE en el que la región C de IgG_{4} sustituye a las
secuencias de la región C de IgG_{1}. La construcción resultante
codifica una cadena pesada de IgG_{4} completa con la región
variable de B9HZHC1-0.
El modelo SCID, en el que se injerta piel humana
en el ratón SCID, que sirve como fuente de neovascularización
angiogénica, y posteriormente acepta tumor humano (crecimiento
tumoral apoyado por la vasculatura humana), se utiliza para ensayar
la eficacia de los anticuerpos mAb B9 y HuB9. La inhibición del
crecimiento tumoral indica que los mAb B9
(anti-\alpha_{v}\beta_{3} y
anti-\alpha_{v}\beta_{5} humanos positivos,
anti-\alpha_{v}\beta_{3} murino negativo)
juegan un papel en la inhibición de la angiogénesis dependiente de
\alpha_{v}\beta_{3}.
También se ensayan las actividades in
vivo de los anticuerpos de esta invención en otros modelos de
mamífero de metástasis cancerosa, artritis reumatoide y
aterosclerosis, por ejemplo modelos de babuino.
El modelo de xenoinjerto en ratón SCID con
células tumorales humanas HT29 demostró que los mAb de B9 tienen
actividad anti-tumoral. La actividad de los mAb B9
se evaluó modificando el modelo. En el primer experimento, las
células se inyectaron por vía intraperitoneal y el tratamiento
también fue intraperitoneal. El efecto de los mAb sobre el
crecimiento tumoral mostró que el tamaño del tumor de los animales
tratados era 6,5 veces más pequeño. Véase la Fig. 8.
En el segundo modelo experimental, las células
se inyectaron por vía subcutánea. El tratamiento era mediante
inyección intraperitoneal, dos veces por semana a 1 mg/dosis de mAb
B9 (n = 8). Los resultados indicaban que los animales sin el
tratamiento tenían tumores 2-3 veces más grandes que
los animales tratados con los mAb B9. El tumor subcutáneo es un
sistema más vigoroso que el tumor intraperitoneal descrito
anteriormente. Véase la Fig. 9.
La inmunohistología en los tumores de ambos
modelos mostró que los tumores de control no tratados eran positivos
para B9 (marcado directo con B9 biotinilado). Los tumores de los
ratones tratados eran negativos para B9.
Este ensayo in vitro se realiza para
medir la actividad anti-angiogénica. La aorta
torácica humana se extrae y se corta en secciones de
aproximadamente 1 mm y se coloca en placas de cultivo de 24 pocillos
que contienen una matriz tridimensional. Las células endoteliales
forman capilares similares a vasos que se ramifican a partir de la
aorta. Se introducen mAb B9 en este sistema y se estudia su efecto
sobre la angiogénesis.
Los resultados de los Ejemplos 3 a 10 establecen
que los anticuerpos B9 y HuB9 tienen potente actividad
anti-receptor in vitro y es probable que
muestren eficacia profiláctica y terapéutica in vivo en
modelos animales. Por tanto, los anticuerpos B9 y HuB9 son
candidatos para aplicación terapéutica, profiláctica y de
diagnóstico en el hombre.
<110> Jonak, Zdenka L.
\hskip1cmTaylor, Alexander H.
\hskip1cmTrulli Jr., Stephen H.
\hskip1cmJohanson, Kyung O.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Anticuerpos Monoclonales
Humanizados
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P50860
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 09/199.149
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
24-11-1998
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 354
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> B9 murino
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(354)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 118
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> B9 murino
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210>3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 125
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VH Kabat subgrupo I
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 354
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> B9 humanizado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(354)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 118
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> B9 humanizado
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 324
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> células murino
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(324)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 108
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> células murino
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 109
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Vk subgrupo I
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 306
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> B9 humanizado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(306)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> B9 humanizado
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 386
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> B9 murino
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(384)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 128
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> B9 murino
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 324
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> B9 humano y murino
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS)
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(324)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 108
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> B9 humano y murino
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> células humanas y murino
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VH murino
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Val Gln Leu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met
Lys Pro Gly Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Vk murino
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu
Xaa Ala Xaa Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> cebador inverso murino
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaggggccagt ggatagac
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> cebador directo murino
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctaccggtg tccactccca agtncarctn carca
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> cebador inverso kappa murino
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcacctccag atgttaactg c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> cebador directo degenerado
murino
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctaccggtg tccactccga yathcaratg acnca
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 96
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 114
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 99
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 96
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttttggcta ccggtgtcca ctccgatatt cag
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacgggtacct ccaccgaacg tccaagg
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 306
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> células humanas y murino
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(306)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> células humanas y murino
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 315
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> células humana y murino
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(315)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 105
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> células humana y murino
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 120
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 114
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 114
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 123
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttaaccggtg tccactccca agttcag
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctggggccc ttggtactag ctgagga
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (6)
1. El uso de un anticuerpo que
neutraliza el receptor proteico \alpha_{v}\beta_{3} humano
y el receptor proteico \alpha_{v}\beta_{5} humano que
comprende una cadena pesada que tiene CDHR3 de:
RGVRGSMDY
en la fabricación de un medicamento
para el tratamiento o diagnóstico de una enfermedad seleccionada
entre el grupo constituido por; aterosclerosis, restenosis, cáncer,
metástasis cancerosa, artritis reumatoide, retinopatía diabética,
degeneración macular, osteoporosis, hiperparatiroidismo, enfermedad
de Paget, hipercalcemia de tumores malignos, lesiones osteolíticas
producidas por metástasis ósea, pérdida ósea debida a
inmovilización, deficiencia de hormonas
sexuales.
2. El uso de la reivindicación 1, en el
que el anticuerpo comprende las CDR de cadena pesada de la Fig.
1C.
3. El uso de la reivindicación 1, en el
que el anticuerpo comprende las CDR de cadena ligera de la Fig.
2C.
4. El uso de acuerdo con cualquier
reivindicación anterior, en el que el anticuerpo comprende la
secuencia amino de cadena pesada Fig. 1C y una secuencia de
aminoácidos de cadena ligera de la Fig. 2C.
5. El uso de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2, en el que el anticuerpo comprende la secuencia
de aminoácidos de cadena ligera de la Fig. 5.
6. El uso de acuerdo con cualquier
reivindicación anterior, en el que el anticuerpo es un fragmento de
anticuerpo funcional seleccionado entre el grupo constituido por;
Fv, Fab, F(ab')_{2}.
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