CN1798767B - 通过诱变来改变抗体对FcRn的结合亲和力或血清半衰期 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种修饰的IgG类抗体，其中所述抗体的重链恒定区中至少一个选自氨基酸残基250、314和428处的氨基酸被不同于未修饰抗体中的另一个氨基酸取代，因此，与未修饰抗体相比，改变了其对FcRn的结合亲和力和/或其血清半衰期。

Description

通过诱变来改变抗体对FcRn的结合亲和力或血清半衰期
                          技术领域
本发明涉及免疫学和蛋白质工程领域。具体说，本发明关于IgG类的修饰抗体，该抗体在Fc区域的一个或多个氨基酸得到修饰，从而改变了其FcRn的结合亲和力或改变了血清半衰期。
                          背景技术
抗体是对特殊的抗原表现出结合特异性的蛋白质。天然的(即天然存在的或野生型的)抗体一般是约150,000道尔顿的异源四聚糖蛋白，它由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)组成。如图1所示，每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而在不同的免疫球蛋白同种型的重链之间二硫键的数量是变化的。每条重链在一端具有一个可变区(VH)，其后是一些恒定区。每条轻链在一端具有可变区(VL)，在另一端具有一个恒定区。轻链的恒定区与重链的第一个恒定区配对。
各抗体之间可变区某些部分的序列极为不同并负责每个特殊抗体对其特殊抗原的结合特异性。恒定区不直接涉及抗体与抗原的结合，但表现出各种效应子功能。抗体或免疫球蛋白依照重链恒定区的氨基酸序列可分为不同的类。人有5种主要的免疫球蛋白类(同种型)：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这5个中的几种还可再分为亚类(亚型)，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4以及IgA1和IgA2。
图1是天然IgG结构的示意图，其中指出了天然抗体分子的各种部分。重链恒定区包括CH1、绞链区、CH2和CH3。木瓜蛋白酶消化抗体得到两个片段，Fab和Fc。Fc片段由CH2、CH3和部分绞链区组成。人IgG1Fc片段的晶体结构已得到确定(Deisenhofer，Biochemistry 20：2361-2370(1981))。在人IgG分子中，通过用木瓜蛋白酶切断绞链区N-末端到Cys226产生Fc片段。因此，人IgG重链Fc区域一般定义为从226位的氨基酸残基延伸到C-末端的片段(依照Kabat等的EU索引编号，“感兴趣的免疫球蛋白的蛋白质序列”(″Sequences ofProteins of Immunological Interest″)，第五版，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)；以下使用EU编号图)。
Fc区域是抗体的效应子功能所必需的。效应子功能包括启动补体依赖的细胞毒性(CDC)、启动吞噬作用和抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)并通过胞转作用转运抗体通过细胞屏障。此外，Fc区域对维持IgG类抗体的血清半衰期至关重要(Ward和Ghetie，Ther.Immunol.2：77-94(1995))。
研究发现IgG抗体的血清半衰期由Fc和新生Fc受体(FcRn)的结合来介导。FcRn是由跨膜α链和可溶性β链(β2-微球蛋白)组成的异源二聚体。FcRn与I类MHC分子具有22-29％的序列相同性并具有非功能性的MHC肽结合沟(Simister和Mostov，Nature 337：184-187(1989))。FcRn的α1和α2结构域与Fc区域的CH2和CH3结构域相互作用(Raghavan等，Immunity 1：303-315(1994))。
关于FcRn如何调控抗体的血清半衰期，已提出了一种模型。如图2所示，IgG由上皮细胞通过非特异性的胞饮作用摄取，然后进入酸性的胞内体。FcRn在胞内体酸性pH(＜6.5)下结合IgG并在血流中碱性pH(＞7.4)下释放IgG。因此，FcRn从溶酶体降解途径补救IgG。当血清水平降低时，更多的FcRn分子可用于结合IgG，使得更多数量的IgG被补救。相反，如果血清IgG水平上升，FcRn变得饱和，就增加了被胞饮降解的IgG部分(Ghetie和Ward，Annu.Rev.Immunol.18：739-766(2000))。
许多研究的结果与上述模型一致，均支持了FcRn的结合亲和力与抗体的血清半衰期之间是相关的(Ghetie和Ward，同上)。很重要的是，这种相关性已被扩展到比其野生型亲本分子具有更高FcRn亲和力的工程抗体。
Ghetie等在小鼠IgG1 Fc-绞链片段的252位、254位和256位进行了随机突变。一个突变体显示，与野生型的片段相比该片段对小鼠FcRn的亲和力高了3.5倍并且在两种小鼠株系中半衰期分别延长了23％或65％(Ghetie等，Nat.Bioteclmol.15：637-640(1997))。
Shields等使用丙氨酸扫描突变来改变人IgG1抗体Fc区域的残基并评价了与人FcRn的结合。他们发现几个突变体比野生型具有更高的人FcRn结合亲和力，但未鉴定在250位、314位或428位的突变(Shields等，J.Biol.Chem.276：6591-6604(2001))。
Martin等提出在人IgG Fc一些位置的突变可增加与FcRn的结合，除很多其它位置以外，还包括250位、314位和428位。然而，Martin等提出的突变体中没有一个被构建或测试了与FcRn的结合能力(Martin等，Mol.Cell7：867-877(2001))。
Dall′Acqua等描述了随机突变并筛选了抗小鼠FcRn的人IgG1绞链-Fc片段的噬菌体展示文库。他们公开了428-436位的随机突变，但未鉴定428位的突变对小鼠FcRn结合亲和力的作用，并提出在该位置的野生型甲硫氨酸有利于有效的结合(Dall′Acqua等，J.Immunol.169：5171-5180(2002))。
Kim等通过在Fc区域的253位、310位或435位进行氨基酸取代使人IgG1突变，他们发现在小鼠中突变型Fc-绞链片段与野生型IgG1 Fc-绞链片段相比血清半衰期降低，并得出结论Ile253、His310和His435在调控IgG的血清半衰期中起着核心作用(Kim等，Eur.J.Immunol.29：2819-2825(1999))。
Honzick等指出嵌合人IgG1抗体的Fc区域中253位的单氨基酸取代加速了小鼠中的清除并改善了实体瘤的免疫闪烁扫描(Homick等，J.Nucl.Med.41：355-362(2000))。
美国专利号6,165,745公开了一种通过将突变引入编码抗体的DNA片段生产生物半衰期减少的抗体的方法。该突变包括在Fc-绞链结构域的位置253、310、311、433或434处的氨基酸取代。美国专利号6,165,745的所有公开内容，以及本文引用的所有其它美国专利文献的所有公开内容，均纳入作为参考。
美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,761；5,693,762和6,180,370公开了免疫球蛋白的人化。
美国专利号6,277,375B1公开了含有突变型IgG分子的组合物，该分子相对野生型IgG血清半衰期增加，其中该突变型IgG分子含有以下氨基酸取代：在252位苏氨酸取代亮氨酸，在254位苏氨酸取代丝氨酸，或在256位苏氨酸取代苯丙氨酸。也公开了在位置433、435或436处具有氨基酸取代的突变型IgG。
美国专利申请号20020098193A1和PCT公开号WO 97/34621公开了相比IgG血清半衰期增加的突变型IgG分子，其中该突变型IgG分子在Fc-绞链区域至少有一个氨基酸取代。然而，未提供250位、314位或428位突变的实验支持。
美国专利号6,528,624公开了含有IgG Fc区域的一种抗体的变体，该变体在人IgG Fc区域的一个或多个氨基酸位置(位置270、322、326、327、329、331、333和334)具有氨基酸取代。
PCT公开号WO 98/05787公开了为降低BR96抗体的诱导毒性，在其位置310-331删除或取代氨基酸，但未公开造成与FcRn的结合改变的氨基酸修饰。
PCT公开号WO 00/42072公开了FcRn结合亲和力得到改变的含有变体Fc区域的一种多肽，该多肽在Fc区域的以下任一个或多个氨基酸位置具有氨基酸修饰：238、252、253、254、255、256、265、272、286、288、303、305、307、309、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、386、388、400、413、415、424、433、434、435、436、439和447，其中Fc区域中残基的编号是EU索引的编号(Kabat等，同前)。
PCT公开号WO 02/060919A2公开了修饰的IgG，该修饰的IgG包含的IgG恒定区相对于野生型IgG恒定区含有一个或多个氨基酸修饰，其中该修饰的IgG与含有野生型IgG恒定区的IgG相比增加了半衰期，并且其中一个或多个氨基酸修饰位于以下一个或多个位置：251、253、255、285-290、308-314、385-389、和428-435。然而，未公开314位或428位突变改变FcRn结合能力的例子。
Martin，W.L.(博士论文，名为“蛋白-蛋白识别：新生Fc受体与免疫球蛋白G”(“Protein-Protein Recognition：The Neonatal Fc Receptor and Immuneglobulin G”)，加州理工学院(2001))提出在大鼠γ-2a恒定区的几个Fc位置(包括位置250和428)的理论突变可增加FcRn结合亲和力。Martin提出在250位用异亮氨酸取代缬氨酸或在428位用苯丙氨酸取代亮氨酸的可能性，还提出了其它取代的可能性。Martin未提及任何314位的取代。Martin未证明任何这些提出的突变增加了与FcRn的结合亲和力。
上述出版物未指出IgG类抗体的血清半衰期或FcRn结合亲和力可通过在Fc区域的250位、314位或428位的氨基酸修饰得到改变。本发明使用分子模型来选择接近FcRn接触位点的Fc残基，其可能对结合具有作用，但对于pH依赖的结合不是必需的。在IgG类免疫球蛋白重链的恒定区的250位、314位或428位进行氨基酸修饰。含有所述修饰的抗体的血清半衰期或FcRn结合亲和力被改变，并且因此而不同于那些未修饰的抗体。
                          发明概述
本发明是以发明人在人IgG分子的恒定区中鉴定的几个突变为基础，这些突变改变了(即增加或降低)IgG分子对FcRn的亲和力。本发明提供修饰的抗体，这些抗体相对于未修饰的抗体FcRn结合亲和力和/或血清半衰期有所改变。抗体以及其它生物活性分子的体内(即，在受试者的血清或其它组织中的持续时间)半衰期是确定抗体(或任何其它药学分子)施用的量和频率的重要临床参数。因此，这种半衰期增加(或降低)的分子，包括抗体，具有显著的药学重要性。
本发明涉及修饰的分子(优选抗体)，该分子由于具有修饰的IgG(优选来自人IgG)恒定区或其FcRn结合部分(优选Fc或绞链-Fc区域)而增加(或降低)了体内半衰期，其中IgG恒定区或其片段被修饰(优选通过氨基酸取代)来增加(或降低)对FcRn的亲和力。
在具体的实施方案中，本发明涉及修饰的IgG类抗体，该类抗体的体内半衰期通过氨基酸残基变化得以延长(或降低)，经结构研究鉴定，这些氨基酸残基的位置直接或间接参与绞链-Fc区域和FcRn受体的相互作用。在优选的实施方案中，修饰的IgG类抗体选自：达克力珠单抗(daclizumab)、方托力珠单抗(fontolizumab)、维西力珠单抗(visilizumab)和M200。
在优选的实施方案中，恒定区(或其片段)在pH6.0时对FcRn的亲和力高于pH7.4时对FcRn的亲和力。即，FcRn结合亲和力的pH依赖性模拟了野生型的pH依赖性。在其它实施方案中，本发明修饰的抗体可表现出相对于野生型有变化的pH依赖性分布的。这种改变了的pH依赖性分布在一些治疗或诊断应用中是有用的。
在一些实施方案中，本发明的抗体修饰物会改变FcRn结合力和/或血清半衰期而不改变其它的抗体效应子功能，例如ADCC或CDC。在特别优选的实施方案中，本发明修饰的抗体在Fc-γ受体或C1q的结合方面未表现出有变化。在其它实施方案中，本发明修饰的抗体可导致效应子功能的增加(或降低)以及血清半衰期的增加。在特别优选的实施方案中，本发明修饰的抗体的ADCC活性可增加(或降低)，血清半衰期可增加。
应注意，本发明的修饰也可改变(即，增加或降低)修饰的抗体的生物利用度(例如，转运至粘膜表面或其它靶组织)。
在优选的实施方案中，本发明提供IgG类的修饰抗体，其中重链恒定区的至少一个选自氨基酸残基250、314和428位的氨基酸被不同于未修饰抗体中的氨基酸残基所取代。这种取代优选能使所述修饰抗体的FcRn结合亲和力和/或血清半衰期相比野生型抗体得到改变。本发明还提供一种修饰的抗体，该抗体相比未修饰的抗体，其FcRn的结合亲和力与血清半衰期增加了，其中重链恒定区的氨基酸残基250被谷氨酸或谷氨酰胺取代；或重链恒定区的氨基酸残基428被苯丙氨酸或亮氨酸取代。
本发明还提供一种抗体，该抗体相比未修饰的抗体，其FcRn的结合亲和力与血清半衰期增加了，其中(a)重链恒定区的氨基酸残基250被谷氨酸或谷氨酰胺取代，并且重链恒定区域的氨基酸残基428被苯丙氨酸取代；(b)重链恒定区的氨基酸残基250被谷氨酰胺取代并且重链恒定区域的氨基酸残基428被苯丙氨酸取代；或(c)重链恒定区的氨基酸残基250被谷氨酰胺取代，并且重链恒定区域的氨基酸残基428被亮氨酸取代。
本发明还提供一种修饰的抗体，该抗体相比未修饰的抗体，其FcRn的结合亲和力与血清半衰期降低了，其中重链恒定区的氨基酸残基314被另一个不同于未修饰抗体中的氨基酸残基所取代。
本发明还提供一种修饰的抗体，该抗体相比未修饰的抗体，其FcRn的结合亲和力与血清半衰期降低了，其中重链恒定区的氨基酸残基250被精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸或酪氨酸取代；或重链恒定区域的氨基酸残基428被丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸或缬氨酸取代。
本发明也提供一种抗体，该抗体的恒定区基本上与天然存在的IgG类抗体的恒定区相同，其中至少一个选自残基250、314和428的氨基酸残基不同于天然存在的IgG类抗体，因此所述抗体与天然存在的抗体相比其FcRn结合亲和力和/或血清半衰期得到改变。在优选的实施方案中，天然存在的IgG类抗体含有人IgG1、IgG2、IgG2M3、IgG3或IgG4分子的重链恒定区。也是在优选的实施方案中，恒定区基本上与天然存在的IgG类抗体相同的抗体，其重链恒定区的氨基酸残基250是谷氨酸或谷氨酰胺；或者重链恒定区的氨基酸残基428是苯丙氨酸或亮氨酸。在其它优选的实施方案中，恒定区基本上与天然存在的IgG类抗体相同的抗体，其在250位是谷氨酸而在428位是苯丙氨酸；或者氨基酸残基250是谷氨酰胺而氨基酸残基428是苯丙氨酸；或者氨基酸残基250是谷氨酰胺而氨基酸残基428是亮氨酸。
在一些实施方案中，恒定区基本上与天然存在的IgG类抗体恒定区相同的抗体，在位置314处的氨基酸残基不同于天然存在的抗体，因此其FcRn结合亲和力和/或血清半衰期相比于天然存在的抗体得到降低。实施方案所包括的抗体中的氨基酸残基314位是丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸或缬氨酸。在一个优选的实施方案中，氨基酸残基314位是精氨酸。
在其它实施方案中，恒定区基本上与天然存在的IgG类抗体的恒定区相同的抗体，在位置250处的氨基酸残基选自精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸或酪氨酸，因此其FcRn结合亲和力和/或血清半衰期相比于天然存在的抗体得到降低。类似地，位置428处的氨基酸残基可被以下氨基酸所取代：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸或缬氨酸，因此其FcRn结合亲和力和/或血清半衰期相比于天然存在的抗体得到降低。
本发明还提供了一种修饰IgG类抗体的方法，其中所述方法包括用不同于未修饰抗体中的氨基酸取代至少一个选自氨基酸残基250、314和428位的重链恒定区的氨基酸，藉此改变所述的未修饰抗体的FcRn结合亲和力和/或血清半衰期。
本发明还提供一种生产修饰的IgG类抗体的方法，该抗体相比于未修饰抗体改变了其FcRn结合亲和力和/或血清半衰期，该方法包括：
(a)制备一种含有合适启动子的表达载体(优选可复制表达载体)，该启动子可操作性连接于至少编码免疫球蛋白重链恒定区的DNA，其中重链恒定区的至少一个选自氨基酸残基250、314和428的氨基酸被不同于未修饰抗体中的氨基酸取代，藉此改变FcRn结合亲和力和/或血清半衰期；
(b)用所述载体转化宿主细胞；和
(c)培养所述转化的宿主细胞来生产所述修饰的抗体。
这种方法还可任选包括：制备第二种含有启动子的表达载体(优选可复制表达载体)，该启动子可操作性连接于编码互补的免疫球蛋白轻链的DNA，并用所述的第二种载体转化所述的细胞系。
本发明也包括使用本发明改变了半衰期的修饰的免疫球蛋白(包括偶联了毒素和放射性核素的免疫球蛋白)、蛋白质和其它生物活性分子来预防和治疗的药物组合物和方法。本发明也包括使用本发明改变了半衰期的修饰的免疫球蛋白、蛋白质和其它生物活性分子来诊断的方法。在优选的实施方案中，本发明的氨基酸修饰可用于延长治疗性或诊断性抗体的血清半衰期。例如，本发明提供的修饰的治疗性或诊断性IgG类抗体具有的体内清除半衰期比对应的未修饰抗体至少长约1.3倍。该修饰的治疗性或诊断性抗体中至少一个选自残基250、314和428的氨基酸不同于未修饰抗体。在优选的实施方案中，该修饰的治疗性或诊断性抗体的体内清除半衰期比对应的未修饰抗体至少长约1.3倍、1.5倍、1.8倍、1.9倍或大于2倍。
本发明也提供体内清除率比对应的未修饰抗体至少低约1.3倍的IgG类修饰的治疗性或诊断性抗体。该修饰的治疗性或诊断性抗体中至少一个选自残基250、314和428的氨基酸不同于未修饰抗体。在优选的实施方案中，该修饰的治疗性或诊断性抗体的体内清除率比对应的未修饰抗体的至少低约1.3倍、1.5倍、1.8倍、2.0倍、2.3倍、2.5倍、2.8倍或大于3.0倍。在优选的实施方案中，该治疗性抗体选自达克力珠单抗、方托力珠单抗、维西力珠单抗和M200。
本发明还提供体内浓度-时间曲线下的面积比对应的未修饰抗体至少高约1.3倍的IgG类修饰的治疗性或诊断性抗体。该修饰的治疗性或诊断性抗体中至少一个选自残基250、314和428的氨基酸不同于未修饰抗体。在优选的实施方案中，该修饰的治疗性或诊断性抗体的体内清除半衰期比对应的未修饰抗体的至少高约1.3倍、1.5倍、1.8倍、2.0倍、2.3倍、2.6倍、2.8倍或大于3.0倍。
在其它优选的实施方案中，本发明的氨基酸修饰也可用于降低治疗性或诊断性抗体的血清半衰期。这些治疗性或诊断性抗体是本领域熟知的并列于以下说明内容中。
本发明也提供含有轻链氨基酸序列为SEQ ID NO：118和重链氨基酸序列选自SEQ ID NO：119-128的修饰的治疗性抗体。本发明也提供含有编码一个或多个这种轻链或重链氨基酸序列的多核苷酸的载体。本发明还提供含有这种载体的宿主细胞。
此外，本发明还提供：含有轻链氨基酸序列为SEQ ID NO：129和重链氨基酸序列选自SEQ ID NO：130-134的修饰的治疗性抗体；含有轻链氨基酸序列为SEQ ID NO：135和重链氨基酸序列选自SEQ ID NO：136-140的修饰的治疗性抗体；和含有轻链氨基酸序列为SEQ ID NO：141和重链氨基酸序列选自SEQ IDNOs：142-146的修饰的治疗性抗体。本发明还提供含有以上所列修饰的治疗性抗体的一个或多个重链和/或轻链氨基酸序列的载体；并且本发明提供含有任何以上所列载体的宿主细胞。
                     附图简述
图1.阐述IgG分子的结构。
图2.IgG分子的补救途径。
图3A.OST577-IgG2M3和OST577-IgG1的氨基酸序列，其中重链的250位、314位和428位是加亮的。“OST577-VH”(SEQ ID NO：1)描述了OST577-IgG2M3或OST577-IgG1的重链可变区的氨基酸序列。“IgG2M3-CH”(SEQ ID NO：2)描述了OST577-IgG2M3的重链恒定区的氨基酸序列。“IgG1-CH”(SEQ ID NO：3)描述了OST577-IgG1的重链恒定区的氨基酸序列。“OST577-VL”(SEQ ID NO：4)描述了OST577-IgG2M3或OST577-IgG1的轻链可变区的氨基酸序列。“λ2-CL”(SEQ ID NO：5)描述了OST577-IgG2M3或OST577-IgG1的轻链恒定区的氨基酸序列。
图3B.与未修饰的OST577-IgG2M3相比的修饰的OST577-IgG2M3的恒定区氨基酸序列(见表1中公开的每条氨基酸序列的SEQ ID NO)。
图3C.与未修饰的OST577-IgG1相比的修饰的OST577-IgG1的恒定区氨基酸序列。
图3D.Hu1D10-IgG2M3和Hu1D10-IgG1的氨基酸序列，其中重链的250、314和428位是加亮的。“Hu1D10-VH”(SEQ ID NO：6)描述了Hu1D10-IgG2M3或Hu1D10-IgG1的重链可变区的氨基酸序列。“IgG2M3-CH”(SEQ ID NO：2)描述了Hu1D10-IgG2M3的重链恒定区的氨基酸序列。“IgG1-CH”(SEQ IDNO：7)描述了Hu1D10-IgG1的重链恒定区的氨基酸序列。“Hu1D10-VL”(SEQ IDNO：8)描述了Hu1D10-IgG2M3或Hu1D10-IgG1的轻链可变区的氨基酸序列。“κ-CL”(SEQ ID NO：9)描述了Hu1D10-IgG2M3或Hu1D10-IgG1的轻链恒定区的氨基酸序列。
图3E.与未修饰的Hu1D10-IgG2M3相比的修饰的Hu1D10-IgG2M3的恒定区氨基酸序列。
图3F.与未修饰的Hu1D10-IgG1相比的修饰的Hu1D10-IgG1的恒定区氨基酸序列。
图3G.Hu1D10-Ig3和Hu1D1O-IgG4的氨基酸序列，其中重链的250和428位是加亮的。“Hu1D10-VH”(SEQ ID NO：6)描述了Hu1D10-Ig3或Hu1D10-IgG4的重链可变区的氨基酸序列。“IgG3-CH”(SEQ ID NO：113)描述了Hu1D10-IgG3的重链恒定区的氨基酸序列。“IgG4-CH”(SEQ ID NO：114)描述了Hu1D10-IgG4的重链恒定区的氨基酸序列。“Hu1D10-VL”(SEQ ID NO：8)描述了Hu1D10-IgG3或Hu1D10-IgG4的轻链可变区的氨基酸序列。“κ-CL”(SEQID NO：9)描述了Hu1D10-IgG3或Hu1D10-IgG4的轻链恒定区的氨基酸序列。
图3H.与未修饰的Hu1D10-IgG3相比的M428LHu1D10-IgG3突变体(SEQIDNO：115)的恒定区氨基酸序列。
图3I.与未修饰的Hu1D10-IgG4相比的M428LHu1D10-IgG4(SEQ IDNO：116)和T250Q/M428LHu1D10-IgG4(SEQ ID NO：117)突变体的恒定区氨基酸序列。
图4.阐述了重叠延伸PCR方法。
图5A.重链载体pVAg2M3-OST577的限制性酶切图谱。
图5B.重链载体pVAg1.N-OST577的限制性酶切图谱。
图6.轻链载体pVAλ2-OST577的限制性酶切图谱。
图7A.重链载体pVAg2M3-Hu1D 10的限制性酶切图谱。
图7B.重链载体pVAg1.N-Hu1D10的限制性酶切图谱。
图7C.重链载体pHuHCg3.Tt.D-Hu1D10的限制性酶切图谱。
图7D.重链载体pHuHCg4.Tt.D-Hu1D10的限制性酶切图谱。
图8.轻链载体pVk-Hu1D10的限制性酶切图谱。
图9A.人FcRn载体pDL208的限制性酶切图谱。
图9B.恒河猴FcRn载体pDL410的限制性酶切图谱。
图10A.OST577-IgG2M3野生型和突变型抗体的SDS-PAGE分析。
如实施例5所述，纯化的OST577-IgG2M3野生型和突变型抗体在还原条件下用SDS-PAGE分析。
图10B.OST577-IgG1野生型和突变型抗体的SDS-PAGE分析。如实施例5所述，纯化的OST577-IgG1野生型和突变型抗体在还原条件下用SDS-PAGE分析。
图11A.OST577-IgG2M3250位各种突变体与人FcRn的单点竞争性结合实验。如实施例6所述，pH6.0时，存在野生型或250位突变型OST577-IgG2M3竞争性抗体的条件下，生物素化的OST577-IgG2M3抗体在FBB中与转染的NS0细胞上的人FcRn的结合用链霉抗生物素蛋白偶联的RPE测定并用流式细胞技术分析。
图11B.OST577-IgG2M3314位的各种突变体与人FcRn结合的单点竞争性结合实验。如实施例6所述，pH6.0时，存在野生型或314位突变型OST577-IgG2M3竞争性抗体的条件下，生物素化的OST577-IgG2M3抗体在FBB中与转染的NS0细胞上的人FcRn的结合用链霉抗生物素蛋白偶联的RPE测定并用流式细胞术分析。
图11C.OST577-IgG2M3428位的各种突变体与人FcRn结合的单点竞争性结合实验。如实施例6所述，pH6.0时，存在野生型或428位突变型OST577-IgG2M3竞争性抗体的条件下，生物素化的OST577-IgG2M3抗体在FBB中与转染的NS0细胞上的人FcRn的结合用链霉抗生物素蛋白偶联的RPE测定并用流式细胞术分析。
图12A.OST577-IgG2M3野生型和突变型抗体与人FcRn结合的竞争性结合实验。如实施例6所述，pH6.0时，存在浓度增加的野生型或突变型OST577-IgG2M3竞争性抗体的条件下，生物素化的HuEP5C7-IgG2M3抗体在FBB中与转染的NS0细胞上的人FcRn的结合用链霉抗生物素蛋白偶联的RPE测定并用流式细胞术分析。
图12B.OST577-IgG2M3野生型和突变型抗体与人FcRn结合的竞争性结合实验。如实施例6所述，pH6.0时，存在浓度增加的野生型或突变型OST577-IgG2M3竞争性抗体的条件下，生物素化的OST577-IgG2M3抗体在FBB中与转染的NS0细胞上的人FcRn的结合用链霉抗生物素蛋白偶联的RPE测定并用流式细胞术分析。
图13.抗体与用人FcRn转染的细胞和未转染细胞的结合。如实施例7所述，用流式细胞术分析pH6.0时野生型或突变OST577-IgG2M3抗体在FBB中与转染的NS0细胞上的人FcRn或未转染的NS0细胞的结合。
图14.OST577-IgG2M3野生型和突变抗体与人FcRn在37℃的竞争性结合实验。如实施例7所述，pH6.0时，存在浓度增加的野生型或突变型OST577-IgG2M3竞争性抗体的条件下，生物素化的OST577-IgG2M3抗体在FBB中与转染的NS0细胞上的人FcRn的结合可用链霉抗生物素蛋白偶联的RPE测定并用流式细胞术分析。所有的孵育均在37℃进行。
图15A.OST577-IgG2M3野生型和突变抗体与人FcRn的pH依赖性结合与释放。如实施例7所述，用流式细胞术分析pH6.0、6.5、7.0、7.5或8.0时，野生型或突变型OST577-IgG2M3抗体在FBB中与转染的NS0细胞上的人FcRn的结合与释放情况。
图15B.OST577-IgG1野生型和突变抗体与人FcRn的pH依赖性结合与释放。如实施例7所述，用流式细胞术分析pH6.0、6.5、7.0、7.5或8.0时，野生型或突变型OST577-IgG1抗体在FBB中与转染的NS0细胞上的人FcRn的结合与释放情况。
图15C.OST577-IgG1野生型和突变抗体与人FcRn的pH依赖性结合与释放。如实施例7所述，用流式细胞术分析pH6.0、6.5、7.0、7.5或8.0时，野生型或突变型OST577-IgG1抗体在FBB中与转染的NS0细胞上的人FcRn的结合与释放情况。
图15D.OST577-IgG2M3野生型和突变抗体与恒河猴FcRn的pH依赖性结合与释放。如实施例7所述，用流式细胞术分析pH6.0、6.5、7.0、7.5或8.0时，野生型或突变型OST577-IgG2M3抗体在FBB中与转染的NS0细胞上的恒河猴FcRn的结合与释放情况。
图15E.OST577-IgG1野生型和突变抗体与恒河猴FcRn的pH依赖性结合与释放。如实施例7所述，用流式细胞术分析pH6.0、6.5、7.0、7.5或8.0时，野生型或突变体OST577-IgG1抗体在FBB中与转染的NS0细胞上的恒河猴FcRn的结合与释放情况。
图16A.OST577-IgG2M3野生型和突变抗体与HbsAg的竞争性结合实验。如实施例8所述，用ELISA竞争来分析野生型或突变型OST577-IgG2M3与HBsAg的结合。
图16B.OST577-IgG1野生型和突变抗体与HbsAg的竞争性结合实验。如实施例8所述，用ELISA竞争来分析野生型或突变型OST577-IgG1与HBsAg的结合。
图17A.Hu1D10-IgG2M3野生型和突变抗体与HLA-DR β链等位体的结合实验。如实施例8所述，用FACS结合实验来分析野生型或突变型Hu1D10-IgG2M3与Raii细胞的结合。
图17B.Hu1D10-IgG1野生型和突变抗体与HLA-DR β等位体的结合实验。如实施例8所述，用FACS结合实验来分析野生型或突变型Hu1D10-IgG1与Raii细胞的结合能力。
图18A.使用来自158V/V供体的PBMC进行的Hu1D10-IgG1和Hu1D10-IgG2M3野生型和突变抗体的ADCC实验。如实施例8所述，使用分离自携带纯合158V/V Fc γRIII等位体的供体的PBMC来确定野生型或突变型Hu1D10-IgG1和Hu1D10-IgG2M3抗体在Raji细胞上的ADCC活性。
图18B.使用来自158F/F供体的PBMC进行的Hu1D10-IgG1和Hu1D10-IgG2M3野生型和突变抗体的ADCC实验。如实施例8所述，使用分离自携带纯合158F/F Fc γRIII等位体的供体的PBMC来确定野生型或突变型Hu1D10-IgG1和Hu1D10-IgG2M3抗体在Raji细胞上的ADCC活性。
图19.OST577-IgG2M3野生型和变体抗体在恒河猴中的药代动力学。如实施例9所述，以剂量1mg/kg对各组(每组4只恒河猴)注射给药，OST577-IgG2M3野生型和变体抗体观察到的和建模的平均血清浓度(μg/ml)和标准偏差作为时间(输注后的天数)的函数来作图。
图20.OST577-IgG1野生型和变体抗体在恒河猴中的药代动力学。如实施例10所述，以剂量1mg/kg对各组(每组4只恒河猴)注射给药，OST577-IgG1野生型和变体抗体观察到的和建模的平均血清浓度(μg/ml)和标准偏差作为时间(输注后的天数)的函数来作图。
图21A.Hu1D10-IgG3野生型和突变抗体与人FcRn的pH依赖性结合与释放。如实施例11所述，用流式细胞术分析pH6.0、6.5、7.0、7.5或8.0时，野生型或突变型Hu1D10-IgG3抗体在FBB中与转染的NS0细胞上的人FcRn的结合与释放情况。
图21B.Hu1D10-IgG4野生型和突变抗体与人FcRn的pH依赖性结合与释放。如实施例11所述，用流式细胞术分析pH6.0、6.5、7.0、7.5或8.0时，野生型或突变型Hu1D10-IgG4抗体在FBB中与转染的NS0细胞上的人FcRn的结合与释放情况。
图21C.Hu1D10-IgG3野生型和突变抗体与恒河猴FcRn的pH依赖性结合与释放。如实施例11所述，用流式细胞术分析pH6.0、6.5、7.0、7.5或8.0时，野生型或突变型Hu1D10-IgG3抗体在FBB中与转染的NS0细胞上的恒河猴FcRn的结合与释放情况。
图21D.Hu1D10-IgG4野生型和突变抗体与恒河猴FcRn的pH依赖性结合与释放。如实施例11所述，用流式细胞术分析pH6.0、6.5、7.0、7.5或8.0时，野生型或突变型Hu1D10-IgG4抗体在FBB中与转染的NS0细胞上的恒河猴FcRn的结合与释放情况。
图22.具有各种FcRn结合突变的达克力珠单抗的氨基酸序列。
图23.具有各种FcRn结合突变的方托力珠单抗的氨基酸序列。
图24.具有各种FcRn结合突变的维西力珠单抗的氨基酸序列。
图25.具有各种FcRn结合突变的M200的氨基酸序列。
                    优选实施方案祥述
I.具有改变的FcRn结合亲和力和/或血清半衰期的修饰的抗体
为更透彻地理解本发明，给出几个定义。
文中所用的术语“免疫球蛋白”和“抗体”指由基本上由免疫球蛋白基因编码的一种或多种多肽组成的蛋白。已识别的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ(γ1、γ2、γ3、γ4)、δ、ε和μ恒定区基因，以及大量的免疫球蛋白可变区基因。全长免疫球蛋白“轻链”(约25Kd或214个氨基酸)在NH2-末端(约110个氨基酸)由κ或λ可变区基因编码，在COOH-末端由κ或λ恒定区基因编码。全长免疫球蛋白“重链”(约50Kd或446个氨基酸)类似地由重链可变区基因(编码约116个氨基酸)和前述的恒定区基因之一，例如γ(编码约330个氨基酸)编码。
免疫球蛋白的一种形式组成抗体的基础结构单元。这种形式是四聚体，由两对相同的免疫球蛋白链构成，每对具有一条轻链和一条重链。每对中，轻链和重链一起负责与抗原结合，恒定区负责抗体效应子功能。除了四聚体抗体，免疫球蛋白可存在各种其它形式，包括如Fv、Fab和(Fab’)2以及双功能杂合抗体(例如，Lanzavecchia和Scheidegger，Eur.J.Immunol.17：105-111(1987))和单链抗体(例如，Huston等.，Proc.Natl.Acad.Sci.美国，85：5879-5883(1988)和Bird等，Science，242：423-426(1988)，这些均纳入文中作为参考)。(总体上见，Hood等，“免疫学”(“′Immunology”)，第二版，Benjamin，纽约(1984)和Hunkapiller与Hood，Nature，323：15-16(1986)，这些均纳入文中作为参考)。
术语“遗传改变的抗体”指其氨基酸序列从天然或野生型抗体经改变而来的抗体。由于相关的重组DNA技术，本发明并不限于在天然抗体中发现的氨基酸序列中进行修饰。如下所述，为获得改变的FcRn结合亲和力和/或血清半衰期的所需特性，以前的工程抗体可按照本发明重新设计。对本发明有用的修饰抗体的可能变体有许多并可从仅是一个或少数氨基酸变化直至对，例如可变区或恒定区彻底重新设计。总体上，将在恒定区中进行改变以改善或改变特性，诸如补体固定、与各种Fc-γ受体相互作用以及其它效应子功能。将在可变区进行改变以改善抗原结合特性。
具有和天然存在的IgG类抗体的恒定区基本相同恒定区的抗体指恒定区中的任何部分与天然存在的IgG类抗体恒定区的氨基酸序列基本上相同(即，至少约85-90％，优选至少95％相同)的抗体。
在本发明许多优选的用途中，包括在人中体内使用修饰的抗体以及体外测定实验中，优选使用按照本发明修饰的(即，突变的)嵌合、灵长类化(primatized)、人源化或人抗体。
术语“嵌合抗体”指恒定区来自一个物种的抗体(通常是人)而可变区来自另一个物种的抗体(通常是啮齿类动物)的抗体。生产嵌合抗体的方法是本领域已知的。见例如，Morrison，Science 229：1202-1207(1985)；Oi等，BioTechniques4：214-221(1986)；Gillies等.，J.Immunol.Methods 125：191-202(1989)；美国专利号5,807,715；4,816,567和4,816,397，这些全文纳入作为参考。
术语“灵长类化的抗体”指具有猴可变区和人恒定区的抗体。生产灵长类化抗体的方法是本领域已知的。见，例如美国专利号5,658,570；5,681,722和5,693,780，这些全文纳入作为参考。
术语“人源化的抗体”或“人源化免疫球蛋白”指具有人(源化)的构架(framework)，来自非人抗体的至少一个、优选所有互补决定区域(CDR)的免疫球蛋白，其中任何恒定区基本上与人免疫球蛋白相同，即，至少约85-90％、优选至少95％相同。因此，可能除CDR之外，人源化免疫球蛋白的所有部分与一个或多个天然人免疫球蛋白序列的对应部分基本上相同。人构架区域的构架残基通常被来自CDR供体抗体的对应残基取代来改变，优选提高抗原结合能力。这些构架取代由本领域熟知的方法鉴定，例如通过对CDR和构架残基的相互作用建模来鉴定对抗原结合重要的构架残基，以及通过序列比较来鉴定在特殊位置的异常构架残基。见，例如，Queen等.，美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,761；5,693,762；6，180,370(每一篇均全文纳入作为参考)。抗体可用各种本领域已知的技术来人源化，这技术包括，例如CDR-嫁接(欧洲专利239,400；PCT出版物WO 91/09967；美国专利号5,225,539；5,530,101和5,585,089)，覆盖(veneering)或再铺平(resurfacing)(欧洲专利592,106；欧洲专利519,596；Padlan，Mol.Immunol.，28：489-498(1991)；Studnicka等.，Prot.Eng.7：805-814(1994)；Roguska等.，Proc.Natl.Acad.Sci.91：969-973(1994))和链改组(美国专利号5,565,332)，所有这些全文纳入作为参考。
对于人类患者的治疗性处理，可能需要完全的人抗体。人抗体可通过各种本领域已知的方法制造，这些方法包括上述的使用衍生自人免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体展示方法。见美国专利号4,444,887和4,716，111；和PCT出版物WO 98/46645；WO 98/50433；WO 98/24893；WO 98/16654；WO 96/34096；WO 96/33735和WO 91/10741，每一篇均全文纳入作为参考。
人抗体可用转基因小鼠生产，这些小鼠不能表达功能性内源免疫球蛋白但能表达人免疫球蛋白基因。对于这项生产人抗体技术的综述，见Lonberg和Huszar，Int.Rev.Immunol.13：65-93(1995)。对于这项用于生产人抗体和人单克隆抗体技术以及生产这种抗体的方案的详细描述，见，例如，PCT出版物WO98/24893；WO 92/01047；WO 96/34096；WO 96/33735；欧洲专利号0 598 877；美国专利号5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661，016；5,545,806；5,814,318；5,885,793；5,916,771和5,939,598，这些文献均全文纳入作为参考。此外，例如Abgenix，Inc.(Fremont，CA)和Medarex(Princeton，NJ)等公司能使用与上述相似的技术提供定向于抗选择的抗原的人抗体。
可使用称为“指导的选择”的技术来生产识别所选表位的完全的人抗体。在该方法中，利用选择的非人单克隆抗体，例如，小鼠抗体，来指导识别相同表位的完全的人抗体的选择(Jespers等，Biotechnology 12：899-903(1988))。
本文使用的术语“改变”可指“增加”或“降低”。
本发明提供一种IgG类的修饰抗体，其中重链恒定区的选自氨基酸残基250、314和428的至少一个氨基酸被不同于未修饰抗体的氨基酸残基取代。
IgG类抗体包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4抗体。IgG分子的重链恒定区示于图1。重链残基的编号是EU索引的编号(Kabat等，同前)。取代可单独发生在250、314或428位，或其任何组合，例如250位和428位，或250位和314位，或314位和428位，或250，314和428位，优选的组合是250和428位。
就各位置而言，取代氨基酸可是任何不同于未修饰抗体中该位置的氨基酸残基。
就250位而言，取代氨基酸可是除了苏氨酸之外的任何氨基酸残基，包括但不限于，丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸。
就314位而言，取代氨基酸可是除了亮氨酸之外的任何氨基酸残基，包括但不限于，丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸。
就428位而言，取代氨基酸可是除了甲硫氨酸之外的任何氨基酸残基，包括但不限于丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸。
本发明提供至少含有一个上述氨基酸取代的IgG类抗体。例如，本发明提供在250、314和/或428位含有两个上述取代的突变的IgG2M3恒定区。本发明提供的恒定区的一些具体取代(即，突变)的氨基酸序列示于表1(SEQ IDNO：10-66)和图3B。
                                表1
                                     取代氨基酸                                       250                                       314                                       428
                                     丙氨酸(A)                                       T250A；SEQ IDNO：10                                       L314A；SEQ IDNO：29                                       M428A；SEQ IDNO：48
                                     半胱氨酸(C)                                       T250C；SEQ IDNO：11                                       L314C；SEQ IDNO：30                                       M428C；SEQ IDNO：49
                                     天冬氨酸(D)                                       T250D；SEQ IDNO：12                                       L314D；SEQ IDNO：31                                       M428D；SEQ IDNO：50
                                     谷氨酸(E)                                       T250E；SEQ IDNO：13                                       L314E；SEQ IDNO：32                                       M428E；SEQ IDNO：51
                                     苯丙氨酸(F)                                       T250F；SEQ IDNO：14                                       L314F；SEQ IDNO：33                                       M428F；SEQ IDNO：52
                                     甘氨酸(G)                                       T250G；SEQ IDNO：15                                       L314G；SEQ IDNO：34                                       M428G；SEQ IDNO：53
                                     组氨酸(H)                                       T250H；SEQ IDNO：16                                       L314H；SEQ IDNO：35                                       M428H；SEQ IDNO：54
                                     异亮氨酸(I)                                       T250I；SEQ IDNO：17                                       L314I；SEQ IDNO：36                                       M428I；SEQ IDNO：55
                                     赖氨酸(K)                                       T250K；SEQ IDNO：18                                       L314K；SEQ IDNO：37                                       M428K；SEQ IDNO：56
                                     亮氨酸(L)                                       T250L；SEQ IDNO：19                                       野生型                                       M428L；SEQ IDNO：57
                                     甲硫氨酸(M)                                       T250M；SEQ IDNO：20                                       L314M；SEQ IDNO：38                                       野生型
                                     天冬酰胺(N)                                       T250N；SEQ IDNO：21                                       L314N；SEQ IDNO：39                                       M428N；SEQ IDNO：58
                                     脯氨酸(P)                                       T250P；SEQ IDNO：22                                       L314P；SEQ IDNO：40                                       M428P；SEQ IDNO：59
                                     谷氨酰胺(Q)                                       T250Q；SEQ IDNO：23                                       L314Q；SEQ IDNO：41                                       M428Q；SEQ IDNO：60
                                     精氨酸(R)                                       T250R；SEQ IDNO：24                                       L314R；SEQ IDNO：42                                       M428R；SEQ IDNO：61
                                     丝氨酸(S)                                       T250S；SEQ IDNO：25                                       L314S；SEQ IDNO：43                                       M428S；SEQ IDNO：62
                                     苏氨酸(T)                                       野生型                                       L314T；SEQ IDNO：44                                       M428T；SEQ IDNO：63
                                     缬氨酸(V)                                       T250V；SEQ IDNO：26                                       L314V；SEQ IDNO：45                                       M428V；SEQ IDNO：64
                                     色氨酸(W)                                       T250W；SEQ IDNO：27                                       L314W；SEQ IDNO：46                                       M428W；SEQ IDNO：65
                                     酪氨酸(Y)                                       T250Y；SEQ IDNO：28                                       L314Y；SEQ IDNO：47                                       M428Y；SEQ IDNO：48
在优选的实施方案中，本发明提供一种修饰的抗体，该抗体相对于未修饰的抗体具有改变的血清半衰期或FcRn结合亲和力。本发明还提供了一种修饰的IgG类抗体，其中重链恒定区的至少一个选自氨基酸残基250、314和428的氨基酸被不同于未修饰抗体中的另一个氨基酸取代，因此，与未修饰抗体的FcRn结合亲和力和/或血清半衰期相比，改变了所述修饰的抗体的FcRn结合亲和力和/或血清半衰期。
本发明的未修饰抗体包括所有种类的天然抗体。术语“天然抗体”指所有宿主动物产生的抗体。本发明的非限制性的示范性天然抗体包括来自人、小鸡、山羊和啮齿类动物(例如，大鼠、小鼠、仓鼠和兔子)的抗体，包括遗传工程处理以生产人抗体的转基因啮齿类动物(见，例如，Lonberg等.，WO93/12227；美国专利号5,545,806和Kucherlapati等.，WO91/10741；美国专利号6,150,584，这些文献全文纳入作为参考)。
本发明的未修饰抗体也包括具有和天然抗体相同的氨基酸序列的重组抗体，或与天然抗体相比氨基酸序列发生变化的遗传改变的抗体。它们可在包括原核和真核表达系统在内的任何表达系统中生产或使用噬菌体展示方法生产(见，例如，Dower等.，WO91/17271和McCafferty等.，WO92/01047；美国专利号5,969,108，这些文献全文纳入作为参考)。
本发明的未修饰抗体也包括嵌合、灵长类化，人源化和人抗体(见上述)。因此，本发明的修饰的抗体可通过在人源化、灵长类化或嵌合抗体中的250、314或428位取代一个氨基酸残基来生产，其中人源化、灵长类化或嵌合抗体先前来自天然抗体。
嵌合抗体优选包含衍生自啮齿类动物的可变区和衍生自人的恒定区，这样当施用于人受试者时，嵌合抗体具有较长的半衰期和较低的免疫原性。灵长类化抗体包含衍生自灵长类的可变区和得自人的恒定区。人源化抗体通常含有至少一个得自供体抗体(例如，鼠或小鸡抗体)的CDR和重链和/或轻链人构架。人构架中的一些氨基酸残基有时被位于供体抗体等价位置的残基取代来保证人源化抗体与其抗原的正确结合。抗体人源化的详细指导公开于美国专利号：5,530,101；5,585,089；5,693,761；5,693,762和6,180,370，这些文献全文纳入作为参考。
本发明的未修饰抗体可包括遗传改变的抗体，这些抗体的功能等于对应的天然抗体。优选遗传改变从而改善了稳定性和/或疗效的未修饰抗体。改变的抗体的例子包括那些具有氨基酸残基保守取代的、删除或添加一个或多个氨基酸但不显著改变抗原结合作用的抗体。只要能维持抗体的结合和功能作用，取代可从改变或修饰一个或多个氨基酸残基到一段区域的彻底重新设计。本发明的抗体可在翻译后改变(例如，乙酰化和磷酸化)或以合成方式改变(例如，连接有标记基团)。
本发明的未修饰抗体可包括通过遗传改变可变区(见，例如，美国专利号6,350,861，该文献全文纳入作为参考)增强对其抗原的结合亲和力的抗体。在另一个实施方案中，本发明的半衰期比野生型(或未修饰的)IgG长的修饰的IgG也可包括其生物活性位点(例如抗原结合位点)、Fc-受体结合位点或补体结合位点通过遗传工程修饰从而与野生型相比增加或降低这些活性的IgG。
本发明的未修饰的和修饰的抗体可为任何已识别的同种型，但优选四个IgG同种型，IgG1和IgG2是特别优选的。包括恒定区突变从而具有降低的效应子功能的抗体，例如美国专利号5,834,597(该文献全文纳入作为参考)所述的IgG2M3和其它的IgG2突变体。在优选的方面，本发明的未修饰和修饰的抗体含有人IgG的重链恒定区。
本发明可应用于任何含有IgG类重链恒定区的抗体，优选IgG1、IgG2、IgG2M3、IgG3和IgG4。这种抗体的重链可变区可衍生自任何选择的抗体。文中公开的示范性抗体包括OST577-IgG1和OST577-IgG2M3，这些抗体分别含有人抗乙型肝炎抗体OST577的重链和轻链可变区(Ehrlich等.，Hum.AntibodiesHybridomas 3：2-7(1992))，人λ-2的轻链恒定区和人IgG1和IgG2M3的重链恒定区。文中也公开的Hu1D10-IgG1和Hu1D 10-IgG2M3分别含有人源化抗-HLA-DR β链等位抗体Hu1D10的重链和轻链可变区(Kostelny等.，Int.J.Cancer93：556-565(2001))，人κ的轻链恒定区和前述的人IgG1和IgG2M3的重链恒定区。
文中公开的本发明的其它例子包括人IgG1、IgG2M3(遗传改变IgG2变体)、IgG3和IgG4抗体的突变体，说明IgG类抗体的血清半衰期改变情况。衍生自IgG2的IgG2M3重链恒定区通过用丙氨酸取代IgG2的重链恒定区的残基234和237获得。IgG2M3的重链恒定区的生产见美国专利号5,834,597，该文献纳入作为参考。
总体上，本发明的修饰抗体包括结合(优选免疫特异地结合，即如用本领域熟知的用于分析特异性抗原-抗体结合的免疫学实验所确定的，要竞争过非特异性结合)抗原并含有FcRn结合片段的任何免疫球蛋白分子。这种抗原包括(但不限于)多克隆、单克隆、双特异、多特异、人、人源化、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab′)2片段、二硫键连接的Fv和含有VL或VH结构域或甚至是互补决定区域(CDR)的片段，该片段在某些情况下与工程处理为含有FcRn结合结构域或与之融合的抗原特异性结合。
本发明的修饰的IgG分子可包括任何给定动物的IgG亚类。例如，人IgG类包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4；小鼠IgG类包括IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3；大鼠IgG类包括IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c和IgG3。已知某些IgG亚类(例如大鼠IgG2b和IgG2c)比例如IgG1具有更高的清除率(Medesan等.，Eur.J.Immunol.，28：2092-2100(1998))。所以，当使用除IgG1以外的IgG亚类时，用IgG1序列取代一个或多个与IgG1序列不同的残基可能是有利的，特别是在CH2和CH3结构域中，藉此增加其它类型的IgG的体内半衰期。
本发明的免疫球蛋白可是任何动物来源的，包括鸟类和哺乳动物。优选的抗体是人、啮齿类动物、驴、绵羊、兔子、山羊、豚鼠、骆驼、马或小鸡。文中使用的“人”抗体包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，并包括分离自人免疫球蛋白文库或分离自用于产生一种或多种人免疫球蛋白的转基因动物的抗体，这些抗体如下所述同时例如Kucherlapati等的美国专利号5,939,598所述。
此外，本发明的修饰抗体可是单特异的、双特异的、三特异的抗体或具有更大的多重特异性的抗体。多重特异性抗体可对一种多肽的不同表位具有特异性或对异源表位具有特异性，例如异源多肽或固体支持物。见，例如，PCT出版物WO 93/17715；WO 92/08802；WO 91/00360；WO 92/05793；Tutt等.，J.Immunol.147：60-69(1991)；美国专利号4,474,893；4,714,681；4,925,648；5,573,920；5,601，819；Kostelny等.，J.Immunol.148：1547-1553(1992)。
本发明的修饰抗体包括其它修饰的衍生物，即将任何类型的分子共价连接于抗体，使得共价连接物不会阻止抗体与抗原结合和/或产生抗-个体基因型应答。例如(但不限于)，抗体衍生物包括用已知的保护/封闭基团、蛋白酶解切断、与细胞配体或其它蛋白连接等来衍生修饰(例如，通过糖基化、乙酰化、PEG化、磷酸化、酰胺化、衍生作用)的抗体。可用已知的技术进行任何各种化学修饰，这些技术包括(但不限于)特异的化学切断、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。此外，这些衍生物可含有一个或多个非典型的氨基酸。
本发明有用的单克隆抗体可使用各种本领域已知的技术制备，这些技术包括使用杂交瘤、重组子和噬菌体展示技术或其组合。例如，单克隆抗体可用杂交瘤技术生产，该技术包括那些本领域已知的和以下文献所指导的，例如Harlow和Lane，“抗体：实验室手册”(“Antibodies：A LaboratoryManual”)，冷泉港实验室出版社，纽约(1988)；Hammerling等.，“多克隆抗体和T细胞杂交瘤”(“Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas”)，Elsevier，纽约(1981)，563-681页(二者均全文纳入作为参考)。
文中使用的术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”指衍生自单一克隆的抗体，包括真核、原核或噬菌体克隆，而不是指该抗体的生产方法。
使用杂交瘤技术生产和筛选特异性抗体的方法是常规方法并且是本领域熟知的。在一非限制性例子中，用感兴趣的抗原或表达这种抗原的细胞免疫小鼠。一旦检测到免疫应答(例如在小鼠血清中检测到抗原特异性抗体)取出小鼠的脾脏并分离脾细胞。然后用熟知的技术将脾细胞与任何合适的骨髓瘤细胞融合。通过有限稀释选择并克隆杂交瘤细胞。然后通过本领域已知的技术来分析杂交瘤克隆中的分泌能结合抗原的抗体的细胞。将阳性杂交瘤克隆以腹膜内方式接种进小鼠产生一般含有高水平抗体的腹水。
识别特异表位的抗体片段对本发明也是有用的并可通过本领域熟知的技术产生。例如，Fab和F(ab′)2片段可通过使用例如木瓜蛋白酶(生产Fab片段)或胃蛋白酶(生产F(ab′)2片段)等酶蛋白酶解切断免疫球蛋白分子来产生。F(ab′)2片段含有完整的轻链和重链的可变区、CH1区域和绞链区。
例如，也可使用本领域已知的各种展示技术来产生抗体，这些技术包括噬菌体展示。噬菌体展示方法中，功能性抗体的结构域展示在带有编码这些结构域的多核苷酸序列的噬菌体颗粒表面。在具体的实施方案中，这种噬菌体可用于展示从全部的或组合的抗体文库(例如，人或鼠)表达的抗原结合结构域，例如，Fab和Fv或用二硫键稳定的Fv。表达与感兴趣抗原结合的抗原结合结构域的噬菌体可用抗原选择或鉴定，例如，使用标记的抗原或结合或捕获在固体表面或珠子上的抗原。用于这些方法的噬菌体一般是丝状噬菌体，包括fd和M13。抗原结合结构域表达为和噬菌体基因III或基因VIII蛋白重组融合的蛋白。此外，本发明的修饰的免疫球蛋白FcRn结合部分也可在噬菌体展示系统中表达。用于制造本发明的免疫球蛋白或其片段的噬菌体展示方法的例子公开于以下文献：Brinkman等.，J.Immunol.Methods 182：41-50(1995)；Ames等.，J.Immunol.Methods 184：177-186(1995)；Kettleborough 等.，Eur.J.Immunol.24：952-958(1994)；Persic等.，Gene.187：9-18(1997)；Burton等.，免疫学进展(Advances in Immunology)，57：191-280(1994)；PCT申请号PCT/GB91/01134；PCT出版物WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；和美国专利号5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108；每一篇文献均全文纳入作为参考。
如上述参考文献所述，噬菌体选择后，可分离来自噬菌体的抗体编码区域并将之用于生产完整的抗体(包括人抗体)或其它所需的片段并在任何需要的宿主细胞内表达，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母菌和细菌，例如以下将详细描述的。例如，使用本领域已知的方法来重组生产Fab、Fab’和F(ab′)2片段的技术也是可用的，例如以下文献所公开的：PCT出版物WO92/22324；Mullinax等.，BioTechniques 12：864-869(1992)；Sawai等.，Amer.J.Reprod.Immunol.34：26-34(1995)；和Better等.，Science240：1041-1043(1988)，每篇文献均全文纳入作为参考。用于生产单链Fv和抗体的技术的例子描述于以下文献：美国专利号4,946,778和5,258,498；Huston等.，Methods in Enzymology 203：46-88(1991)；Shu等.，Proc.Natl.Acad.Sci.90：7995-7999(1993)和Skerra等.，Science 240：1038-1040(1988)。
在具体的实施方案中，修饰抗体具有体内治疗性和/或预防性用途。可以如此修饰的治疗性和预防性抗体的例子包括(但不限于)用于治疗RSV感染患者的人源化抗-呼吸合胞体病毒(RSV)的单克隆抗体SYNAGIS
Figure 10003_0
(Medimmune，MD)；用于治疗转移性乳腺癌患者的人源化抗-HER2单克隆抗体HERCEPTIN
Figure 10003_1
(曲妥珠单抗)(Genentech，CA)；用于治疗克罗恩病的嵌合抗-TNF-α单克隆抗体REMICADE
Figure 10003_2
(infliximab)(Centocor，PA)；REOPRO(abciximab)(Centocor)，用于预防血块形成的血小板上的抗糖蛋白IIb/IIIa的受体；用于预防急性肾脏异源移植排异的免疫抑制的人源化抗-CD25的单克隆抗体ZENAPAX
Figure 10003_4
(达克力珠单抗)(Roche Pharmaceuticals，瑞士)。其它的例子是人源化抗-CD18F(ab’)2(Genentech)；人源化抗-CD18F(ab’)2的CDP860(Celltech，英国)；与CD4融合的抗-HIV gp120的抗体RP0542(Progenics/Genzyme Transgenics)；人抗乙型肝炎病毒的抗体OSTAVIRTM(Protein Design Labs/Novartis)；人源化的抗-CMV的IgG1抗体PROTOVIRTM(Protein Design Labs/Novartis)；抗-CD14的抗体IC14(ICOS)；人源化的抗-VEGF IgG1的抗体AVASTINTM(Genentech)；嵌合的抗-EGFR的IgG抗体ERBITUXTM(ImClone System)；人源化的抗-αV β3整连蛋白的抗体VITAXINTM(Applied molecular Evolution/Medimmune)；人源化的抗-CD52的IgG抗体Campath-1H/LDP-03(Leukosite)；人源化的抗-CD33的IgG抗体ZAMYLTM(Protein Design Labs/Kanebo)；嵌合的抗-CD20的IgG1抗体RITUXANTM(IDEC Pharmaceuticals/Genentech，Roche/Zenyaku)；人源化的抗-CD22的IgG抗体LYMPHOCIDETM(Immunomedics)；人源化的抗-HLA-DR的抗体REMITOGENTM(Protein Design Labs)；人抗-IL8抗体ABX-IL8(Abgenix)；人源化的IgG1抗体RAPTIVATM(Gengtech/Xoma)；人源化的抗-ICAM3的抗体ICM3(ICOS)；灵长类化的抗-CD80的抗体IDEC-114(IDECPharmaceuticals/Mitsubishi)；人源化的抗-CD40L的抗体IDEC-131(IDEC/Eisai)；灵长类化的抗-CD4的抗体IDEC-151(IDEC)；灵长类化的抗-CD23的抗体IDEC-152(IDEC/Seikagaku)；人源化的抗-CD3的IgG抗体NUVIONTM(ProteinDesign Labs)；人源化的抗-补体因子5(C5)的抗体5G1.1(AlexionPharmaceuticals)；人源化的抗-TNF-α的抗体HUMIRATM(CAT/BASF)；人源化的抗-TNF-c Fab片段的抗体CDP870(Celltech)；灵长类化的抗-CD4的IgG1抗体IDEC-151(IDEC Phmaceuticals/Smith-KlineBeecham)；人的抗-CD4的IgG抗体MDX-CD4(Medarex/Eisai/Genmab)；人源化的抗-TNF-α的IgG4抗体CDP571(Celltech)；人源化的抗-α4β7的抗体LDP-02(LeukoSite/Genentecll)；人源化的抗-CD4的IgG抗体OrthoClone OKT4A(OrthoBiotech)；人源化的抗-CD40L的IgG抗体ANTOVATM(Biogen)；人源化的抗-VLA-4的IgG抗体ANTEGRENTM(Elan)；人的抗-CD64(FcγR)的抗体MDX-33(Medarex/Centeon)；人源化的抗-IL-5的IgG4抗体SCH55700(Celltech/Schering)；人源化的分别抗-IL-5和IL-4的抗体SB-240563和SB-240683(SmithKline Beecham)；人源化的抗-IgE的IgG1抗体rhuMab-E25(Genentech/Novartis/Tanox Biosystems)；灵长类化的抗-CD23的抗体IDEC-152(IDEC Pharmaceuticals)；嵌合的抗-CD25的IgG1抗体SIMULECTTM(Novartis Pharmaceuticals)；人源化的抗-β2-整连蛋白的IgG抗体LDP-01(Leukosite)；人抗-TGF-β2的抗体CAT-152(Cambridge AntibodyTechnology)和嵌合的抗-因子VII的抗体Corsevin M(Centocor)。
本发明允许对这些和其它治疗性抗体进行修饰来增加体内半衰期，允许以较低的有效量和/或较低的给药频率施用这种治疗性抗体。这种用于增加体内半衰期的修饰也可用于改善诊断性免疫球蛋白。例如，诊断性抗体的半衰期增加可允许施用较低的剂量就可达到充分的诊断灵敏度。或者，降低血清半衰期对于应用于需要诊断抗体快速清除的领域是有利的。
文中公开的是OST577-IgG2M3的氨基酸序列，包括其重链可变区(SEQ IDNO：1)(OST577-VH)和位置250、314和428加亮的恒定区(SEQIDNO：2)(IgG2M3-CH)的氨基酸序列，以及其轻链可变区(SEQ IDNO：4)(OST577-VL)和恒定区(SEQ ID NO：5)(λ2-CL)(图3A)的氨基酸序列。
文中公开的是位置250、314和428加亮的OST577-IgG1(SEQ ID NO：3)的重链恒定区的氨基酸序列(图3C)。
本发明提供一种与未修饰抗体相比FcRn的结合亲和力增加和/或血清半衰期增加的修饰抗体，其中重链恒定区的氨基酸残基250或428被另一个不同于未修饰抗体中的氨基酸残基取代。重链恒定区的氨基酸残基250优选被谷氨酸或谷氨酰胺取代。或者，重链恒定区的氨基酸残基428被苯丙氨酸或亮氨酸取代。
在一个实施例中，所述的未修饰抗体含有IgG1、IgG2或IgG2M3分子的重链恒定区，包括(但不限于)OST577-IgG2M3或OST577-IgG1。IgG1、IgG2和IgG2M3在250位是苏氨酸，在428位是甲硫氨酸。250位的苏氨酸优选用谷氨酸(T250E)或谷氨酰胺(T250Q)取代，而428位的甲硫氨酸优选用苯丙氨酸(M428F)或亮氨酸(M428L)取代。图3B公开了具有T250E(SEQ ID NO：13)、T250Q(SEQ ID NO：23)、M428F(SEQ ID NO：52)或M428L(SEQ ID NO：57)的氨基酸取代的修饰IgG2M3的重链恒定区的氨基酸序列。图3C公开了具有T250D(SEQ ID NO：67)、T250E(SEQ ID NO：68)、T250Q(SEQ ID NO：69)、M428F(SEQ ID NO：70)或M428L(SEQ ID NO：71)的氨基酸取代的修饰IgG1的重链恒定区的氨基酸序列。
本发明提供一种与未修饰抗体相比FcRn的结合亲和力增加和/或血清半衰期增加的修饰抗体。氨基酸修饰可是以下氨基酸取代的任何一种：
1)重链恒定区的氨基酸残基250被谷氨酸取代，而重链恒定区的氨基酸残基428被苯丙氨酸取代。
2)重链恒定区的氨基酸残基250被谷氨酰胺取代，而重链恒定区的氨基酸残基428被苯丙氨酸取代。
3)重链恒定区的氨基酸残基250被谷氨酰胺取代，而重链恒定区的氨基酸残基428被亮氨酸取代。
图3B公开了具有T250E/M428F(SEQ ID NO：72)、T250Q/M428F(SEQ IDNO：73)或T250Q/M428L(SEQ ID NO：74)的双重氨基酸取代的修饰IgG2M3的重链恒定区的氨基酸序列。
图3C公开了具有T250E/M428F(SEQ ID NO：75)或T250Q/M428L(SEQ IDNO：76)的双重氨基酸取代的修饰IgG1的重链恒定区的氨基酸序列。
具有所述的在位置250和428的双重氨基酸取代的修饰抗体与未修饰的抗体相比表现出非常高的FcRn结合亲和力。
在本发明优选的实施方案中，修饰的抗体的FcRn结合亲和力和/或血清半衰期至少增加了约30％、50％、80％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、或100倍。
本发明提供一种与未修饰抗体相比FcRn的结合亲和力降低和/或血清半衰期降低的修饰抗体，其中重链恒定区的氨基酸残基314被另一个不同于未修饰抗体中的氨基酸残基取代。在位置314处具有氨基酸残基取代的修饰的抗体表现出降低的结合亲和力，这说明如果需要降低抗体的血清半衰期，应该在位置314进行修饰。重链恒定区的氨基酸位残基314优选被以下氨基酸取代：丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸或缬氨酸。氨基酸取代更优选在位置314处由丙氨酸或精氨酸取代亮氨酸。如实施例所示，含有用精氨酸取代亮氨酸的修饰的OST577-IgG2M3的FcRn结合亲和力降低至未修饰的OST577-IgG2M3的11％。
如图3B所示，L314A描述了修饰的IgG2M3的重链恒定区的氨基酸序列，其中位置314处用丙氨酸取代了亮氨酸(SEQ ID NO：29)。L314R描述了修饰的IgG2M3的重链恒定区的氨基酸序列，其中位置314处用精氨酸取代了亮氨酸(SEQ ID NO：42)。
本发明提供一种与未修饰抗体相比FcRn的结合亲和力降低和/或血清半衰期降低的修饰抗体，其中(1)重链恒定区的氨基酸残基250被精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸和酪氨酸取代；或(2)重链恒定区的氨基酸残基428被丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸或缬氨酸取代。重链恒定区的氨基酸残基250优选被天冬氨酸取代，或重链恒定区的氨基酸残基428优选被甘氨酸取代。这种氨基酸取代可显著降低抗体的血清半衰期。如实施例所示，具有这种氨基酸取代的修饰的OST577-IgG2M3的FcRn结合亲和力降低至未修饰的OST577-IgG2M3的约5-7％。
如图3B所示，T250D描述了修饰的IgG2M3的重链恒定区的氨基酸序列，其中位置250处用天冬氨酸取代了苏氨酸(SEQ ID NO：12)。M428G描述了修饰的IgG2M3的重链恒定区的氨基酸序列，其中位置428处用甘氨酸取代了甲硫氨酸(SEQ ID NO：53)。
在本发明优选的实施方案中，所述修饰的抗体的FcRn结合亲和力和/或血清半衰期降低了至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％。
本发明包括文中所述修饰的IgG抗体的重链恒定区、Fc区域或CH2-CH3区域，优选具有文中所述的氨基酸取代的修饰的IgG1、IgG2或IgG2M3抗体的这些区域。
本发明也包括含有SEQ ID Nos：10-76中任一条氨基酸序列的多肽。在优选的实施方案中，这些多肽是突变的IgG1、IgG2或IgG2M3恒定区。
本发明修饰的抗体的重链恒定区可与任何所选抗体的重链可变区相连来产生所需的杂合重链。所选抗体的例子包括(但不限于)抗IL-2、IL-4、IL-10、IL-12、HSV、CD3、CD33、CMV和IFN-γ的抗体。此外，可变区可是任何种类的天然抗体的可变区，例如人的、灵长类的或啮齿类的。另外，也可是遗传改变的抗体的可变区，包括(但不限于)人源化抗体、通过遗传修饰提高了与其抗原结合亲和力的抗体或完全是人的抗体。这种杂合重链可与各种轻链相连来生产所需的抗体。轻链既可是λ也可是κ轻链。既然抗体的血清半衰期主要由其重链恒定区决定，生产的抗体所需的血清半衰期可通过在文中所述的重链恒定区进行氨基酸取代来实现。
II.生产具有改变的FcRn结合亲和力和/或血清半衰期的修饰的抗体
本发明提供生产蛋白质，特别是生产具有改变的FcRn结合亲和力和/或血清半衰期的抗体的方法。本发明优选提供文中所述在一个或多个位置对给定的IgG类抗体进行修饰的方法。这可用化学方法实现或可通过随机或定点诱变并使用任何已知的生产方法重组生产。
本发明提供修饰IgG类抗体的方法，包括用不同于未修饰抗体中的氨基酸取代重链恒定区氨基酸残基250、314和428处的至少一个氨基酸，藉此改变所述的未修饰抗体的FcRn结合亲和力和/或血清半衰期。
取代可单独在位置250、314或428处进行，也可在其任何组合处发生，例如在位置250和428。
为增加抗体的FcRn结合亲和力和/或血清半衰期，重链恒定区的氨基酸残基250被谷氨酸或谷氨酰胺取代，或者重链恒定区的氨基酸残基428被苯丙氨酸或亮氨酸取代。或者，重链恒定区的氨基酸残基250被谷氨酸取代，并且重链恒定区的氨基酸残基428被苯丙氨酸取代；或者重链恒定区的氨基酸残基250被谷氨酰胺取代，并且重链恒定区的氨基酸残基428被苯丙氨酸取代；或者重链恒定区的氨基酸残基250被谷氨酰胺取代，并且重链恒定区的氨基酸残基428被亮氨酸取代。既然具双重突变的抗体表现出非常高的FcRn结合亲和力，同时在250和428处进行修饰是优选的。
为生产与未修饰抗体相比FcRn的结合亲和力降低和/或血清半衰期降低的修饰抗体，重链恒定区氨基酸残基314被不同于未修饰抗体中的另一个氨基酸取代。重链恒定区的氨基酸残基314优选被丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸或缬氨酸取代。重链恒定区的氨基酸残基314更优选被丙氨酸或精氨酸取代。
为生产与未修饰抗体相比FcRn的结合亲和力和血清半衰期降低的修饰抗体，重链恒定区氨基酸残基250被精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸或酪氨酸取代，或者重链恒定区氨基酸残基428被丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸或缬氨酸取代。重链恒定区的氨基酸残基250更优选被天冬氨酸取代或者氨基酸残基428被甘氨酸取代。
文中所述的氨基酸取代通过标准重组DNA技术实现。在一个实施方案中，定点诱变可用于将氨基酸取代引入编码未修饰的抗体的DNA中。然后将得到的修饰抗体的DNA转入宿主细胞并如此生产修饰抗体。修饰抗体所需的FcRn结合亲和力的改变可通过使用噬菌体展示技术或任何其它合适的本领域已知方法来选择并通过测量结合亲和力来确认。
与未修饰的抗体相比FcRn结合亲和力和血清半衰期改变的IgG类修饰抗体的生产方法优选包括：
(a)制备含有与DNA可操作性相连的合适启动子的可复制表达载体，该DNA至少编码免疫球蛋白重链的恒定区并且其中重链恒定区的至少一个选自氨基酸残基250、314和428的氨基酸被不同于未修饰的抗体中的氨基酸取代，藉此导致血清半衰期改变；
(b)用所述的载体转化宿主细胞；和
(c)培养所述转化的宿主细胞来生产所述的修饰抗体。
这种方法在步骤(a)后还可任选包括：制备第二个含有可操作性与DNA相连的启动子的可复制表达载体，该DNA编码互补的免疫球蛋白轻链并且其中所述的细胞系还要用所述载体转化。
为产生步骤(a)中的DNA，可通过诱变引入氨基酸取代，诱变的方法包括(但不限于)：定点诱变(Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.美国82：488-492(1985))，PCR诱变(Higuchi，“PCR方案：方法与应用指导”(PCR Protocols：A Guide toMethods and Applications)，Academic Press，San Diego(1990)，177-183页)，和表达盒诱变(Wells等.，Gene 34：315-323(1985))。优选通过重叠延伸PCR方法进行定点诱变，该方法公开于实施例中(Higuchi，“PCR技术：DNA扩增的规则与应用”(PCR Technology：Principles and Applications for DNA Amplification)，Stockton Press，纽约(1989)，61-70页)。
重叠延伸PCR技术(Higuchi，同前)可用于将任何所需的突变引入靶序列(起始DNA)。例如，如图4所示，重叠延伸方法的第一轮PCR包括用外部引物(引物1)和内部诱变引物(引物3)扩增靶序列，和独立地用第二个外部引物(引物4)和内部引物(引物2)扩增，得到两个PCR片段(片段A和片段B)。内部诱变引物(引物3)设计为含有靶序列的错配，这种错配确定了所需的突变。在第二轮PCR中，第一轮PCR的产物(片段A和片段B)使用两个外部引物(引物1和4)进行PCR扩增。得到的全长的PCR片段(片段C)用限制性内切酶消化并将得到的限制性片段克隆进合适的载体。
作为诱变的第一步，将起始DNA可操作性克隆进诱变载体。引物设计为反映所需的氨基酸取代(更详细的情况见实施例)。在一个实施例中，用于体外诱变的载体可用于指导蛋白质表达。所以，重叠延伸PCR得到的DNA可克隆回诱变载体，这样可产生含有带所需突变的DNA的表达载体。含有起始DNA的诱变载体的例子包括(但不限于)pVAg2M3-OST577。
例如，可通过以下步骤在位置250处制造突变：使用上述重叠延伸方法在两步中扩增pVAg2M3-OST577的PinAI-BamHI片段附近的区域(见图5A中的限制性内切图)，然后用PinAI和BamHI消化得到的PCR片段并将得到的限制性片段克隆进pVAg2M3-OST577。类似地，可通过以下步骤在位置314或428处制造突变：使用上述重叠延伸方法在两步中扩增PmlI-BamHI片段附近的区域，然后用PmlI和BamHI消化得到的PCR片段并将得到的限制性片段克隆进pVAg2M3-OST577。
只要包括需要修饰的氨基酸残基，起始DNA就可以是编码完整未修饰抗体的、未修饰抗体的完整免疫球蛋白重链的、重链恒定区的或未修饰抗体的重链恒定区的一部分的DNA。
如果编码完整的未修饰抗体的DNA用作诱变的起始DNA，完整的修饰抗体可通过进行文中所述方法的步骤(a)、(b)和(c)来生产。所述方法的步骤(a)和(b)之间用于产生互补轻链的步骤不是必需的。
如果编码未修饰抗体的完整重链的DNA用作诱变起始DNA，诱变会产生含有编码完整修饰重链的DNA的载体。为生产完整的修饰抗体，要进行本文所述方法的步骤(a)和(b)之间的步骤。即，另一个含有合适的可操作性连接于DNA的启动子的可复制表达载体(该DNA编码互补免疫球蛋白轻链)共同转染进相同的宿主细胞。其结果是，互补轻链和修饰的重链均表达于同一个宿主细胞并合适地装配得到完整的修饰抗体。所述含有编码免疫球蛋白轻链的DNA的表达载体的例子包括(但不限于)pVAλ2-OST577。
如果用于诱变的起始DNA是编码重链恒定区一部分(例如CH2-CH3片段或Fc结构域)的DNA，得到的编码这种部分修饰重链的DNA首先与剩余的未修饰重链相连于框架内，这样产生了如本文步骤(a)所述的编码带有突变的完整重链的DNA。然后用含有编码互补轻链的DNA的载体和含有编码这种修饰重链的DNA的载体共同转染宿主细胞产生完整的修饰抗体。编码部分修饰重链和剩余的未修饰重链的DNA的连接可通过分子生物学领域已知的标准分子克隆技术实现，例如限制性消化和连接(Sambrook和Russell，“分子克隆：实验室手册”(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第三版，冷泉港实验室出版社，纽约(2001))。
轻链和重链可克隆进相同或不同的表达载体中。编码免疫球蛋白链的DNA片段操作性连接于表达载体中的控制序列来保证免疫球蛋白多肽的表达。这种控制序列包括信号序列、启动子、增强子和转录终止子(见Queen等.，Proc.Natl.Acad.Sci.美国86：10029-10033(1989)；WO90/07861；Co等.，J.Immunol.148：1149-1154(1992)；“抗体工程：实用指导”(Antibody Engineering：A Practical Guide)，Borrebaeck编，Freeman，纽约(1997))，出于所有目的，这些文献全文纳入作为参考)。
转化宿主细胞使用本领域已知的技术进行，例如脂质体法、磷酸钙法、电穿孔法等。(Sambrook和Russell，同上)。优选脂质体法瞬时转染宿主细胞。
用于生产本发明的修饰抗体的宿主细胞可用本领域已知的各种培养基培养。
文中所述的修饰抗体可在胞内产生、在外周质间隙生产或直接分泌进培养基。本发明的修饰抗体优选分泌进培养基。收集生产修饰抗体的宿主细胞培养基并离心沉淀细胞碎片。收集上清液并用于蛋白质表达实验(更多细节见实施例)。
使用SDS-PAGE还原性或非还原性蛋白质凝胶分析或本领域的任何其它己知的技术进行凝胶电泳来确认修饰抗体的表达。ELISA也可用于测定修饰抗体的表达以及该抗体的量。
与未修饰的抗体相比，修饰抗体应保留适当的与抗原的结合能力。因此，通过本领域已知的方法(例如ELISA)测试适当的抗体-抗原结合能力。可进行额外的实验来确认修饰抗体与未修饰的抗体具有相似的结构特性。这些实验包括(但不限于)SDS-PAGE、SEC、ELISA和蛋白质A结合实验。蛋白A结合实验是优选的，，因为蛋白质A和FcRn结合到CH2-CH3接头的相同区域，虽然结合涉及不同的残基。从宿主细胞制备的修饰抗体可使用本领域已知的技术纯化，这些技术包括(但不限于)凝胶过滤和柱层析法(例如，通过蛋白质A的亲和层析、阳离子交换层析、阴离子交换层析和凝胶过滤)。用于药物制剂的抗体的最小可接受的纯度为90％、优选95％、更优选98％、最优选99％或更高。
生产的抗体的FcRn结合亲和力可通过在pH6.0(与FcRn结合的最佳条件)进行竞争性结合实验来测定。可将FcRn固定于固体基底上(例如Sepharose珠子)测试结合亲和力。或者，可使用ELISA评价结合亲和力。本发明优选在基于细胞的系统中进行竞争性结合实验来测试结合亲和力。比较生产的修饰抗体和未修饰抗体的一系列稀释液与在某种细胞系(优选NS0细胞系)上表达的FcRn的结合能力。进行竞争性结合实验的实验方法详细地描述于实施例中。
本发明的实验显示，使用纯化的抗体或生产抗体的细胞培养基上清液可得到相似的结合亲和力结果。因此，为确认所需的结合亲和力的改变是否达到，上清液可直接用于测试所生产抗体的FcRn结合亲和力。确认后，生产的抗体经过更复杂的纯化过程。
也应当进行直接结合实验来确认修饰抗体以pH依赖的方式与FcRn结合。具体是，同时在pH6.0和pH8.0处测试修饰抗体的FcRn结合亲和力(更详细的情况见实施例)。一般来说，pH6.0处的结合亲和力超过pH8.0处的。
生物学稳定性(或血清半衰期)可通过各种体内或体外方法测量，例如使用放射性标记的蛋白并测量作为时间函数的血清放射性水平，或通过使用ELISA测试作为时间函数的血清中完整抗体(特异性已知的)的水平，特别优选的测量结果是通过血清半衰期增加而清除率降低来证明生物学稳定性增加。
本发明提供编码修饰抗体的多核苷酸分子，或编码具有文中所述突变的修饰抗体的修饰部分或全部重链(例如恒定区、Fc区域或CH2-CH3区域)的多核苷酸分子。
本发明提供的载体含有编码修饰抗体的多核苷酸分子或编码具有文中所述突变(取代)的修饰抗体的部分或全部修饰重链(例如恒定区、Fc区域或CH2-CH3区域)的多核苷酸分子。
本发明包括含有所述载体的宿主细胞，该载体含有文中所述的核酸分子。表达文中所述修饰抗体的合适的宿主细胞衍生自原核生物(例如大肠杆菌(Escherichia coli)或真核多细胞生物，包括酵母菌、植物、昆虫和哺乳动物。
大肠杆菌是一种在克隆和/或表达本发明的DNA序列中特别有用的原核宿主。其它适用的微生物宿主包括杆菌(例如枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis))，和其它肠杆菌(enterobacteriaceae)(例如沙门氏菌(Salmonella)、沙雷氏菌(Serratia))，以及各种假单胞菌(Pseudomonas)种。在这些原核宿主中，也可制造表达载体，该载体通常含有与宿主细胞相容的表达控制序列(例如复制起点)。此外，可存在任何数量的各种熟知的启动子，例如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统或噬菌体λ启动子系统。启动子通常任选与操纵子序列一起控制表达并具有用于启动和完成转录和翻译的核糖体结合位点序列等。
其它微生物(例如酵母菌)也可用于表达。带有合适载体的酿酒酵母(Saccharomyces)是优选的宿主，该载体视需要可具有包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的表达控制序列(例如启动子)、复制起点和终止序列等。
植物和植物细胞培养可用于表达本发明的DNA序列(Larrick和Fry，Hum.Antibodies Hybridomas 2：172-189(1991)；Benvenuto等.，Plant Mol.Biol.17：865-874(1991)；During等.，Plant Mol.Biol.15：281-293(1990)；Hiatt等.，Nature342：76-78(1989))。优选的植物宿主包括，例如：拟南芥(Arabidopsis)、烟草(Nicotiana tabacum)、黄花烟草(Nicotiana rtistica)和马铃薯(Solanun tuberosum)。表达编码本发明的修饰抗体的多核苷酸的优选表达盒是质粒pMOG18，其中插入的编码修饰抗体的多核苷酸序列可操作性连接于带有双倍增强子的CaMV35S启动子；pMOG18按照Sijmons等(Bio/Technology 8：217-221(1990))的方法使用。或者，在植物中表达修饰抗体的优选实施方案按照Hiatt等(同上)的方法，用编码本发明修饰抗体的多核苷酸序列取代Hiatt等(同上)使用的免疫球蛋白序列进行。基于根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumifaciens)T-DNA的载体也可用于表达本发明的DNA序列；这种载体优选包括编码壮观霉素抗性或其它可选择性标记的标记基因。
也可用昆虫细胞培养来生产本发明的修饰抗体，通常使用基于杆状病毒的表达系统。修饰抗体可按照Putlitz等(Bio/Technology 8：651-654(1990))的方法通过表达编码修饰抗体的多核苷酸来生产。
除了微生物和植物，哺乳动物也可用于表达和生产本发明的多肽(见Winnacker，“从基因到克隆”(From Genes to Clones)，VCH Publishers，纽约(1987))。因为本领域开发了很多能分泌完整的免疫球蛋白的合适的宿主细胞系(包括CHO细胞系、各种COS细胞系、HeLa细胞、优选骨髓瘤细胞系等或转化的B细胞或杂交瘤)，所以哺乳动物细胞实际上是优选的。用于这些细胞的表达载体可包括表达控制序列，例如复制起点、启动子、增强子(Queen等.，Immunol.Rev.89：49-68(1986))；和必要的加工信息位点，例如核糖体结合位点、RNA剪切位点、聚腺苷酸化位点和转录终止子序列。优选的表达控制序列是衍生自免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒、巨细胞病毒等的启动子。一般地，可选择性标记(例如neo表达盒)包括在表达载体中。
本发明提供一种制造FcRn结合亲和力和/或血清半衰期改变的药物的方法，该方法将药物偶联或用其它方式结合到鉴定为通过与FcRn相互作用而具有增加或降低的血清半衰期的部分上。这种部分包括(但不限于)含有文中所述氨基酸取代的修饰的IgG或部分或全部修饰重链。这种药物包括(但不限于)抗体、抗体片段、激素、受体配体、免疫毒素、任何种类的治疗性药物、T-细胞受体结合抗原和任何其它可结合到本发明的血清半衰期增加的部分上的药物。为产生体内稳定性改变的融合蛋白，编码这种蛋白的DNA片段可操作性地整合进重组载体，在修饰抗体的恒定区读码框中，无论在上游或下游，其位置使得载体能表达含有这种可操作性地与恒定区相连的蛋白的融合蛋白。由于本文的内容和例如Sambrook和Russell(同上)的参考文献，本领域的技术人员知晓以这种方式操作DNA片段的技术，例如使用限制性内切酶的遗传工程。
提出以上方法是用于生产一系列生物稳定性改善的治疗性化合物。这种化合物包括，例如白介素-2、胰岛素、白介素-4和干扰素-γ，或者甚至是T细胞受体。也可虑了本发明的重组Fc结构域在稳定多种药物中的用途，这种稳定性可能降低这些药物重复施用的需要。然而，本方法并不仅限于生产施用于人的蛋白，也可用于生产大量稳定性增加的任何蛋白，例如可用于免疫接种方案中、兽医用于治疗动物或用于啮齿类动物的体内治疗模型中。
III.FcRn结合亲和力和/或血清半衰期改变的修饰抗体的用途
本发明提供一种含有文中所述的修饰抗体和药学上可接受的运载体的组合物。用于胃肠外施用的该组合物一般含有溶解于可接受的运载体(优选水性运载体)中的抗体溶液或其混合物。可使用各种水性运载体，例如，水、缓冲水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸等。这些溶液是无菌的并且一般不含有颗粒物。该组合物可根据合适生理条件的需要含有药学上可接受的辅助物质，如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等(例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠)。这些制剂中的抗体的浓度可在很大的范围内变化，即从小于约0.01重量％，一般至少从约0.1重量％到高达5重量％并且主要按照具体选择的施用方式以液体的体积和粘度为基础选择浓度。
用于静脉内注射的典型组合物可包装成含有250ml无菌Ringer氏溶液和10mg至100mg的抗体(见“雷明顿药物科学”(Remington′s PharmaceuticalScience)，第十五版，Mack Publishing Company，Easton，PA(1980))。
本发明的修饰抗体可用于各种非治疗性目的。它们可用作亲和纯化试剂。在诊断实验中也是有用的，例如在特定细胞、组织或血清中检测感兴趣抗原的表达。就诊断应用而言，抗体通常用可检测部分作标记，包括放射性同位素、荧光标记和各种酶基质标记。该抗体也可用于任何已知的试验方法，例如竞争性结合试验、直接和间接夹心试验和免疫沉淀试验。该抗体也可用于体内诊断实验。抗体一般用放射性核苷酸作标记，这样抗原或表达抗原的细胞可使用免疫闪烁扫描来定位。
也可提供试剂盒，用于在抗细胞活性的保护，或测定细胞活性或选择的细胞表面受体，或诊断疾病中使用修饰的抗体。所以，本发明的主题组合物通常以放于容器内的冻干形式提供，可单独提供也可以与对所需细胞类型具有特异性的额外抗体接合的形式提供。可与标记或毒素偶联或不偶联的修饰抗体可与以下物质一起包含于试剂盒中：缓冲液，例如Tris、磷酸盐、碳酸盐等，稳定剂，生物杀伤剂，惰性蛋白，例如血清白蛋白等以及一套使用说明。一般地，以活性抗体的量为基准，这些物质的量小于约5重量％，并且再次以抗体浓度为基准，这些物质的总量一般至少约为0.001重量％。惰性填充剂或赋形剂经常需要包括进来以稀释活性成分，其中赋形剂可占总组合物的约1到99重量％。在使用能结合修饰抗体的第二种抗体的实验中，第二种抗体一般以独立小瓶提供。第二种抗体通常与标记偶联并以与上述抗体配方类似的方式来配制。
修饰抗体可应用于各种治疗性领域。修饰抗体可用于治疗可从施用修饰抗体中获益的患有或易患这些疾病或病症的患者。可用这些抗体治疗的病症包括癌症、炎性病症(例如哮喘)、自身免疫疾病和病毒感染等。
可用文中所述的抗体治疗的癌症包括(但不限于)：乳腺癌、鳞状细胞癌症、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃癌、胰腺癌、恶性胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、膀胱癌、肝细胞瘤、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌和各种类型的头颈癌。
自身免疫疾病包括(但不限于)：阿狄森病、耳朵的自身免疫疾病、眼睛的自身免疫疾病(例如色素膜炎)、自身免疫肝炎、克罗恩病、糖尿病(I型)、附睾炎、肾小球肾炎、格雷夫斯病、格-巴综合症、桥本病、溶血性贫血、系统性红斑狼疮、多发性硬化、重症肌无力、寻常天疱疮、银屑病、类风湿性关节炎、结节病、硬皮症、斯耶格伦综合症、脊椎关节病、甲状腺炎、溃疡性结肠炎和脉管炎。
本发明的血清半衰期降低的修饰抗体可用于治疗需要破坏或去除组织或外来微生物的疾病或病症。例如，抗体可用于治疗癌症、炎性疾病、感染；和其它需要去除组织的病症。该抗体一般在较快生物清除时间导致任何施用的抗体的免疫原性降低方面是有用的。其它的应用包括基于抗体的成像方法(imaging regimen)、基于抗体的药物去除或产生寿命较短的免疫毒素。
血清半衰期增加的修饰抗体可是已知抗-组织因子(TF)抗体、抗-IgE抗体和抗-整连蛋白抗体。这种作用所需的机制可能是阻断了配体-受体结合配对。血清半衰期增加的修饰抗体也可是激动剂抗体。这些抗体也可用作治疗性药物，例如疫苗。因为抗体的血清半衰期延长了，就可降低这种疫苗的免疫接种的剂量和频率。
含有本发明抗体的组合物可通过任何合适的方式施用，这些方式包括胃肠外皮下、腹膜内、肺内和鼻内，并且如果需要进行局部免疫抑制治疗，可病灶内施用。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。此外，抗体可通过脉冲输注(特别是用剂量降低的抗体)合适地施用。
含有本发明抗体或其混合物的组合物可作为预防性和/或治疗性处理而施用。在治疗性应用中，组合物施用于已受具体疾病影响的患者，其用量要足以治愈或至少部分控制症状及其并发症。足以达到这些要求的用量定义为“治疗有效剂量”。对此用途有效的用量取决于症状的严重性和患者自身免疫系统的状态，但一般是从每剂约0.01到100mg的修饰抗体，每位患者更常用的剂量是1到10mg。
在预防性应用中，含有修饰抗体及其混合物的组合物施用于未处于患病状态的患者来提高患者的抵抗力。这种用量定义为“预防有效剂量”。在该用途中，精确的用量也是取决于患者的健康状况和免疫的一般水平，但一般是从每剂约0.1到100mg，特别是每位患者的用量是1到10mg。
该组合物可按治疗医生选择的剂量水平和模式单次或多次施用。在任何情况中，该药物制剂应提供充足量的本发明突变抗体来有效地治疗患者。
以下提供的实施例是为了说明而非限制。所有说明书中引用的内容均明确地纳入文中作为参考。
                    实施例
                    实施例1
该实施例描述了本发明使用的抗体表达载体。
以下是重链表达质粒pVAg2M3-OST577的组件，该质粒是pVg2.D.Tt的M3变体的衍生物(Cole等.，J.Immunol.159：3613-3621(1997))。如图5A所示，顺时针方向在EcoRI位点之前，重链单元始于作为EcoRI-XbaI片段的人巨细胞病毒(hCMV)主要的立即早期(IE)启动子和增强子(Boshart等.，Cell41：521-530(1985))。hCMV区域后是作为XbaI片段的OST577 VH区域，包括信号序列、J片段和剪接供体序列。VH区域后是作为XbaI-BamHI片段的含有人γ-2M3重链恒定区的修饰的基因组DNA片段(Cole等.，同上)，包括带有间插内含子的CH1、绞链区(H)、CH2和CH3外显子，部分内含子在CH1之前，而用于mRNA处理的聚腺苷酸化(polyA)信号在CH3之后，然后是作为BamHI-EcoRI片段的人补体基因C2的转录终止子(Ashfield等.，EMBO J.10：4197-4207(1991))。重链单元之后是编码突变形式的二氢叶酸还原酶(dhfr)的基因，以及转录所需的来自猿病毒40(SV40)的调控元件(增强子、启动子、剪接信号和polyA信号)。以BamHI-EcoRI片段从质粒pVg1(Co等.，同上)取出的该区域通过将BamHI位点转换为EcoRI位点来修饰。在该单元中从原来的EcoRI位点逆时针移动，首先是质粒pBR322的一部分(Sutcliffe，Cold SpringHarbor Symp.Quant.Biol.43：77-90(1979))，该部分含有细菌的复制起点和用于从大肠杆菌中选择的氨苄西林抗性基因，其中细菌的复制起点用对应的来自pUC18的片段(Yanisch-Perron等.，Gene 33：103-119(1985))取代从而在细菌宿主内增加载体的拷贝数。然后是SV40的片段(Reddy等.，Science200：494-502(1978))，该片段含有SV40的增强子和早期启动子来保证强力的转录启动。该片段之后是大肠杆菌dhfr基因的编码序列(Simonsen和Levinson，Proc.Natl.Acad.Sci.美国80：2495-2499(1983))。该dhfr基因之后是含有小t抗原内含子的SV40片段，据信该内含子增加了mRNA的水平，其后该质粒含有另一个SV40片段，该片段含有终止mRNA转录的polyA信号。
以下是重链表达质粒pVAgl.N-OST577的组件，该质粒是pVgl的衍生物(Cole等.，同上)。如图5B所示，顺时针方向在EcoRI位点之前，重链单元始于相同的EcoRI-XbaI片段，该片段含有用于pVAg2M3-OST577载体中的hCMVIE启动子和增强子，其后是作为XbaI片段的OST577VH区域。VH区域之后是含有作为XbaI-BamHI片段的人γ-1重链恒定区的基因组DNA片段(Ellison等.，Nucleic Acids Res.10：4071-4079(1982))，包括带有间插内含子的CH1、绞链区(H)、CH2和CH3外显子，部分内含子在CH1之前，而用于mRNA处理的polyA信号在CH3之后。为有助于随后对编码区域的操作，使用重叠-延伸PCR诱变(Higuchi，同上)在绞链区和CH2外显子之间的内含子中产生NheI位点。重链单元之后是相同的编码dhfr的BamHI-EcoRI限制性片段以及调控元件和用于pVAg2M3-OST577载体的质粒pBR322的一部分。
以下是轻链表达质粒pVAλ2-OST577的组件，该质粒是pVk的衍生物(Cole等.，同上)。如图6所示，顺时针方向在EcoRI位点之前，轻链单元始于用于重链载体中的含有hCMV IE启动子和增强子的相同的EcoRI-XbaI片段，其后是作为XbaI片段的OST577VL区域，包括信号序列、J片段和剪接供体序列。VL区域后是作为XbaI-Sau3AI片段的含有人λ-1轻链恒定区的基因组DNA片段(Hieter等，Nature 294：536-540(1981))，该片段通过PCR修饰来编码人λ-2轻链恒定区(Hieter等，同上)，包括人λ-1轻链内含子、人λ-2轻链恒定区外显子(Cλ2)和来自人λ-2轻链的3’未翻译区域的一部分，和来自人λ-1轻链的用于mRNA加工的polyA信号。轻链基因之后是编码黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(gpt)的基因和转录所需的来自SV40的调控元件。以BamHI-EcoRI片段从质粒pSV2-gpt(Mulligan和Berg，同上)取出的该区域的功能是在将该质粒转染进哺乳动物细胞后提供可选择的抗药性标记。在该单元中从EcoRI位点逆时针移动，首先是质粒pBR322的一部分(Sutcliffe，同上)，该部分含有细菌的复制起点和用于从大肠杆菌中选择的氨苄西林抗性基因，其中细菌的复制起点用对应的来自pUC18的片段(Yanisch-Perron等，同上)取代从而在细菌宿主内增加载体的拷贝数。然后是SV40的片段(Reddy等.，同上)，该片段含有SV40的增强子和早期启动子来保证强力转录启动。该片段之后是大肠杆菌gpt基因的编码序列(Richardson等，Nucleic Acids Res.11：8809-8816(1983))。该dhfr基因之后是含有小t抗原内含子的SV40片段，据信该内含子增加了mRNA的水平，其后该质粒含有另一个SV40片段，该片段含有终止mRNA转录的polyA信号。
重链表达质粒pVAg2M3-Hu1D10(见图7A)的组件与pVAg2M3-OST577的组件相同(前者衍生自后者)，除了OST577VH区域用来自质粒pHu1D10.IgG1.rgpt.dE的HuID10VH区域取代(Kostelny等.，(2001)，同上)。重链表达质粒pVAg1.N-Hu1D10(见图7B)的组件与pVAg1-OST577的组件相同(前者衍生自后者)，除了OST577VH区域用来自质粒pHulD10.IgG1.rgpt.dE的HuID10VH区域取代(Kostelny等.，同前)。
重链表达质粒pHuHCg3.Tt.D-Hu1D10(见图7C)的组件与pVg2.D.Tt(Cole等.，同上)相同(前者衍生自后者)，除了含有人γ-2M3重链恒定区的Xbal-BamHI片段用作为XbaI片段的来自质粒pHu1D10.IgG1.rgpt.dE的HuID10VH区域取代(Kostelny等.，(2001)，同上)，其后是作为Xba-BamHI片段的含有人γ-3重链恒定区的基因组DNA片段(Huck等.，NucleicAcids Res.14：1779-1789(1986))，该片段包括带有间插内含子的CH1、4个绞链区(H)、CH2和CH3外显子，部分内含子在CH1之前，而在CH3之后是来自RNA处理的聚腺苷酸化(polyA)信号。重链表达质粒pHuHCg4.Tt.D-Hu1D10(见图7D)的组件与pHuHCg3.Tt.D-Hu1D10的组件相同，除了人γ-3重链恒定区用作为Xba-BamHI片段的含有人γ-4重链恒定区的基因组DNA片段取代(Ellison等.，同上)，该片段包括带有间插内含子的CH1、绞链区(H)、CH2和CH3外显子，部分内含子在CH1之前，而在CH3之后是用于mRNA加工的聚腺苷酸化(polyA)信号。
以下是轻链表达质粒pVk-Hu1D10的组件，该质粒是pVk的衍生物(Co等.，同上)。如图8所示，顺时针方向在EcoRI位点之前，轻链单元始于用于重链载体中的含有hCMV IE启动子和增强子的相同的EcoRI-XbaI片段，其后是作为XbaI片段的Hu1D10 VL区域(Kostelny等.，(2001)，同上)，包括信号序列、J片段和剪接供体序列。VL区域后是作为XbaI-BamHI片段的含有人κ轻链恒定区的基因组DNA片段(Hieter等.，Cell 22：197-207(1980))，包括人κ轻链恒定区外显子(CK)，部分内含子在CK之前，而在CK之后是用于mRNA加工的polyA信号。轻链单元之后是编码gpt的相同的BamHI-EcoRI片段，以及转录所需的调控元件和用于pVk载体的质粒pBR322的一部分。
                         实施例2
该实施例描述了用于本发明的载体。
OST577重链和轻链cDNA从表达人单克隆抗-HBV抗体OST-577的三源杂交瘤细胞系通过PCR完整克隆(Ehrlich等.，同上)。重链和轻链可变区通过PCR转变为小外显子，其两个末端均侧接XbaI位点，包括信号序列、V、(D)和J片段、剪接供体序列和对应的内含子的一部分(如Co等概括的，同上)。表达载体pVAg2M3-OST577(见图5A)，pVg2.D.Tt的M3变体的一种衍生物(Cole等.，同上)，通过用OST577-VH小外显子取代含有OKT3-VH小外显子的XbaI片段来构建。然后将含有细菌复制起点的PciI-FspI片段用来自pUC18的对应的PciI-FspI片段取代(Yanisch-Perron等.，同上)来增加载体在细菌宿主中的拷贝数。表达载体pVAg1.N-OST577(见图5B)，pVg1的一种衍生物(Co等.，同上)，通过以下步骤构建：将含有OST577-VH小外显子的XbaI片段插入pVg1的唯一的XbaI位点，通过重叠-延伸PCR修饰绞链区-CH2内含子(Higuchi，同上)来产生唯一的NheI位点，并将含有细菌复制起点的HindIII-XhoI片段用来自pVAg2M3-OST577的对应的HindIII-XhoI片段取代来增加载体在细菌宿主中的拷贝数。
表达载体pVλ2-OST577，一种pVk的衍生物(Co等.，同上)通过以下步骤构建：首先用含有基因组人λ-1恒定区的XbaI-BglII PCR产物取代含有基因组人κ恒定区的pVk的XbaI-BamHI片段；编码区域和3’未翻译区域的一部分用PCR得到的OST577轻链cDNA的对应片段取代，主要产生基因组人λ-2恒定区外显子。最后，将OST577-VL小外显子插入载体的XbaI位点。表达载体pVAλ2-OST577(见图6)，一种pVλ2-OST577的衍生物通过将含有细菌复制起点的SapI-FspI片段用来自pVAg2M3-OST577对应SapI-FspI片段取代来构建，从而增加载体在细菌宿主中的拷贝数。
表达载体pVAg2M3-Hu1D10(见图7A)通过将来自质粒pVAg2M3-OST577的含有hCMV启动子和增强子(Boshart等.，同上)以及OST577 VH区域的XhoI-XbaI片段用来自质粒pHu1D10.IgG1.rgpt.dE(Kostelny等.，(2001)，同上)的含有hCMV启动子和增强子以及Hu1D10 VH区域的对应的XhoI-Xbal片段取代来构建。表达载体pVAg1.N-Hu1D10(见图7B)通过将来自质粒pVAg1.N-OST577的含有hCMV启动子和增强子(Boshart等.，同上)以及OST577VH区域的XhoI-XbaI片段用来自质粒pHu1D10.IgG1.rgpt.dE(Kostelny等.，(2001)，同上)的含有hCMV启动子和增强子以及Hu1D10 VH区域的对应的XhoI-Xbal片段取代来构建。
表达载体pHuHC.g3.Tt.D-Hu1D 10(见图7C)通过将来自pVg2.D.Tt的M3变体(Cole等.，同上)的含有hCMV启动子和增强子(Boshart等.，同上)以及人γ-2M3重链恒定区的XhoI-BamHI片段用来自质粒pHu1D10.IgG1.rgpt.dE(Kostelny等.，(2001)，同上)的含有hCMV启动子和增强子和Hu1D10 VH区域的XhoI-Xbal片段以及含有人γ-3重链恒定区的XhoI-BamHI片段(Huck等.，同上)分别取代来构建。表达载体pHuHC.g4.Tt.D-Hu1D 10(见图7D)通过将来自pVg2.D.Tt的M3变体(Cole等.，同上)的含有hCMV启动子和增强子(Boshart等.，同上)以及人γ-2M3重链恒定区的XhoI-BamHI片段用来自质粒pHu1D10.IgG1.rgpt.dE(Kostelny等.，(2001)，同上)的含有hCMV启动子和增强子和Hu1D10VH区域的XhoI-Xbal片段以及含有人γ-4重链恒定区的XhoI-BamHI片段(Ellison等.，同上)分别取代来构建。
表达载体pVk-Hu1D10(见图8)通过将来自质粒pVk(Co等.，同上)的含有hCMV启动子和增强子(Boshart等.，同上)的XhoI-XbaI片段用来自质粒pHu1D10.IgG1.rgpt.dE(Kostehny等.，(2001)，同上)的含有hCMV启动子和增强子以及Hu1D10VL区域的XhoI-XbaI片段取代来构建。
基础表达载体pDL172，一种pVk.rg(Cole等.，同上)的衍生物通过将含有基因组人κ恒定区的XbaI-SphI片段用由以下部分组成的XbaI-SpM片段取代来构建：含有M195重链信号序列(Co等.，同上)的N-末端部分的XbaI-NheI片段；0.7kb的NheI-AgeI片段；编码人c-myc十肽的合成的AgeI-EagI片段，其侧翼是连接肽并被小鼠单克隆抗体9E10所识别(Evan等.，Mol.Cell.Biol.5：3610-3616(1985))；AgeI-EagI片段后是来自人衰减加速因子的GPI连接信号(Caras等.，Nature 325：545-549(1987))和含有人免疫球蛋白γ-1基因polyA信号的EagI-SphI片段(Ellison等.，同上)。
人β-2微球蛋白(β2m)和人新生Fc受体(FcRn)α链的胞外结构域通过PCR从用人外周血单核细胞制备的cDNA文库中克隆。人FcRn的α链基因通过PCR修饰在5’端添加侧翼NheI位点和M195重链信号序列的C-末端部分(Co等.，同上)，在3’端添加侧翼AgeI位点，并用之取代pDL172的NheI-AgeI片段，得到表达载体pDL172+HuFcRn。人β2m基因通过PCR修饰分别在5’和3’端添加侧翼XbaI和SalI位点并除去内部EcoRI位点。得到的XbaI-SalI片段亚克隆进中间载体，在5’端侧翼是含有hCMV IE启动子和增强子(Boshart等.，同上)的EcoRI-XbaI片段，在3’端侧翼是含有鼠免疫球蛋白γ-2a基因(Kostelny等.，(1992)，同上)的聚腺苷酸化信号的SalI-BamHI片段，其后是含有人补体基因C2(Ashfield等.，同上)转录终止子的BamHI-EcoRI片段。得到的含有功能性人β2m转录单元的EcoRI-EcoRI片段克隆进pDL172+HuFcRn的唯一的EcoRI位点，得到表达载体pDL172+HuFcRn+Huβ2m，以下称为pDL208(见图9A)。
恒河猴β2m和恒河猴FcRn的α链的胞外结构域通过PCR从用恒河猴外周血单核细胞制备的cDNA文库中克隆。恒河猴β2m基因通过PCR修饰分别在5’和3’端添加侧翼XbaI和SalI位点并除去内部EcoRI位点。得到的XbaI-SalI片段亚克隆进中间载体，在5’端侧翼是含有hCMV IE启动子和增强子(Boshart等.，同上)的EcoRI-XbaI片段，在3’端侧翼是含有鼠免疫球蛋白γ-2a基因(Kostelny等.，(1992)，同上)的聚腺苷酸化信号的SalI-BamHI片段，其后是含有人补体基因C2(Ashfield等.，同上)转录终止子的BamHI-EcoRI片段。得到的含有功能性恒河猴β2m转录单元的EcoRI-EcoRI片段用于取代pDL172+HuFcRn+Hu β2m的EcoRI-EcoRI(含有人β2m转录单元)，得到pDL172+HuFcRn+Rh β2m。恒河猴FcRn的α链基因通过PCR修饰在5’端添加侧翼NheI位点和M195重链信号序列的C-末端部分(Co等.，同上)在3’端添加侧翼AgeI位点，并用之取代pDL172+HuFcRn+Rh β2m的NheI-AgeI片段得到表达载体pDL172+RhFcRn+Rh β2m，以下称为pDL410(见图9B)。
                        实施例3
该实施例描述了人γ2M3重链基因的Fc区域的诱变。
分子模型：
人Fc/FcRn复合物的初始模型以大鼠Fc/FcRn复合物的低分辨率晶体结构(Burmeister等.，Nature 372：379-383(1994)；RCSB蛋白数据库编码为1FRT)为基础建立。首先，通过以和复合物中的大鼠β2m相同的方向添加取自人组织相容抗原HLA-A2的高分辨率晶体结构(Saper等.，J.Mol.Biol.219：277-319(1991)；RCSB编码为3HLA)中的人β2m来取代复合物中的大鼠β2m。然后，通过以和复合物中的大鼠α链相同的方向添加取自人FcRn的高分辨率晶体结构(West和Bjorkman，Biochemistry 29：9698-9708(2000)；RCSB编码为1EXU)的人α链来取代大鼠FcRn的α链。接着复合物的Fc中的大鼠残基被来自人IgG1Fc(Kabat等.，同上)的对应残基取代，并用SEGMOD和ENCAD程序(Levitt，J.Mol.Biol.226：507-533(1992)；Levitt，J.Mol.Biol.168：595-620(1983))计算能量最小值来建立人IgG1Fc/FcRn复合物模型。最后，该模型的人IgG1Fc残基用来自人IgG2M3Fc(Cole等.，同上)的对应残基取代，并再次计算能量最小值来建立人IgG2M3Fc/FcRn复合物模型，以下称为模型1。
以大鼠Fc/FcRn复合物模型(Weng等.，J.Mol.Biol.282：217-225(1998)；RCSB编码为2FRT)为基础，以上述方式建立第二个模型，以下称为模型2。
以异源二聚体大鼠Fc/FcRn复合物的高分辨率晶体结构(Martin等.，Mol.CeLL7：867-877(2001)；RCSB编码为1|1A)为基础，以上述方式建立第三个模型，以下称为模型3。
诱变：
使用重叠-延伸聚合酶链式反应(PCR)方法(Higuchi，同上)在OST577-IgG2M3重链的位置250、314和428处(按照Kabat等的EU索引编号，同上)产生随机的氨基酸取代。为在位置250处产生随机突变，使用诱变引物JY24(5′-GAC CTC AGG GGT CCG GGA GAT CAT GAG MNN GTC CTTGG-3′)(SEQ ID NO：77)和JY25(5′-CTC ATG ATC TCC CGG ACC CCT GAGGTC-3′)(SEQ ID NO：78)，其中M＝A或C，N＝A、C、G或T。第一轮重叠-延伸PCR中，外部引物msc g2-1(5′-CCA GCT CTG TCC CAC ACC G-3′)(SEQ IDNO：79)和JY24用于产生左侧片段，而外部引物kco8(5′-GCC AGG ATC CGACCC ACT-3′)(SEQ ID NO：80)和JY25用于产生右侧片段。PCR反应使用ExpandTM High Fidelity PCR System(Roche Diagnostics公司，Indianapolis，IN)进行，按照生产商的建议，在94℃孵育5分钟，接着在94℃进行5秒、55℃进行5秒、72℃进行60秒，共进行25轮，然后在GeneAmp
Figure 10003_6
PCR System9600(Applied Biosystems，Foster City，CA)中于72℃孵育7分钟。PCR产物在低熔点的琼脂糖凝胶上展开，从琼脂上切下并于70℃熔化。用于结合左侧和右侧片段的第二轮PCR使用外部引物msc g2-1和kco8，以上述方式进行，共进行35轮。最终的PCR产物在低熔点的琼脂糖凝胶上展开，切下预期大小的DNA片段并使用QIAEXTMII Gel Extraction Kit(QIAGEN
Figure 10003_8
，Valencia，CA)纯化。纯化的片段用PinAI和BamHI消化，以上述方式进行凝胶纯化并克隆进pVAg2M3-OST577的对应位点之间。
为产生T250I和T250L突变体，使用诱变引物KH4(5′-GAC CTC AGG GGTCCG GGA GAT CAT GAGAAK GTC CTT GG-3′)(SEQ ID NO：81)和KH3(5′-CTC ATG ATC TCC CGG ACC CCT GAG GTC-3′)(SEQ ID NO：82)，其中K＝G或T。为产生T250C和T250G突变体，使用诱变引物KH5(5′-GAC CTCAGG GGT CCG GGA GAT CAT GAG GCM GTC CTT GG-3′)(SEQ ID NO：83)和KH3，其中M＝A或C。为产生T250N和T250Q突变体，使用诱变引物KH6(5′-GAC CTC AGG GGT CCG GGA GAT CAT GAG NTK GTC CTTGG-3′)(SEQ ID NO：84)和KH3，其中K＝G或T，N＝A、C、G或T。第一轮PCR中，外部引物msc g2-1和KH4、KH5或KH6用于产生左侧片段，而外部引物MGD-1(5′-GCC AGG ATC CGA CCC ACT-3′)(SEQ ID NO：85)和KH3用于产生右侧片段。使用ExpandTM High Fidelity PCR System(Roche Diagnostics公司)进行PCR反应，首先于94℃孵育5分钟，接着在94℃进行5秒、60℃进行5秒、72℃进行60秒，共进行25轮，然后于72℃孵育7分钟。PCR产物在低熔点的琼脂糖凝胶上展开，从琼脂上切下并于70℃熔化。用于结合左侧和右侧片段的第二轮PCR使用外部引物msc g2-1和MGD-1以上述方式进行，首先于94℃孵育5分钟，接着在94℃进行5秒、60℃进行5秒、72℃进行105秒，共进行35轮，然后于72℃孵育7分钟。最终的PCR产物在低熔点的琼脂糖凝胶上展开，切下预期大小的DNA片段并使用QIAquickTM Gel ExtractionKit(QIAGEN)纯化。纯化的片段用PinAI和BamHI消化，以上述方式进行凝胶纯化并克隆进pVAg2M3-OST577的对应位点之间。
为在位置314处产生随机突变，使用诱变引物kco78(5′-ACC GTT GTGCAC CAG GAC TGGNNK AAC GGC AAG GAG-3′)(SEQ ID NO：86)和kco79(5′-CCA GTC CTG GTG CAC AAC GG-3′)(SEQ ID NO：87)，其中K＝G或T，N＝A、C、G或T。第一轮PCR中，外部引物ks g2-5(5′-CTC CCG GAC CCCTGA GGT C-3′)(SEQ ID NO：88)和kco79用于产生左侧片段；而外部引物kco8和kco78用于产生右侧片段。接下来的所有步骤按照上述位置250处随机诱变的进行，除了第二轮PCR使用外部引物ks g2-5和kco8，最终的PCR片段用PmlI和BarmHI消化并克隆进pVAg2M3-OST577中对应的位点。
为产生L314I突变体，使用诱变引物MGD-10(5′-ACC GTT GTG CAC CAGGAC TGG ATC AAC GGC AAG GA-3′)(SEQ ID NO：89)和kco79。为产生L314Y突变体，使用诱变引物MGD-11(5′-ACC GTT GTG CAC CAG GAC TGG TATAAC GGC AAG GA-3′)(SEQ ID NO：90)和kco79。为产生L314H突变体，使用诱变引物MGD-12(5′-ACC GTT GTG CAC CAG GAC TGG CAC AAC GGCAAG GA-3′)(SEQ ID NO：91)和kco79。为产生L314M突变体，使用诱变引物MGD-13(5′-ACC GTT GTG CAC CAG GAC TGG ATG AAC GGC AAGGA-3′)(SEQ ID NO：92)和kco79。为产生L314N突变体，使用诱变引物MGD-14(5′-ACC GTT GTG CAC CAG GAC TGG AAT AAC GGC AAGGA-3′)(SEQ ID NO：93)和kco79。第一轮PCR中，外部引物jt240(5′-GGA CACCTT CTC TCC TCC C-3′)(SEQ ID NO：94)和kco79用于产生左侧片段，外部引物kco41(5′-ATT CTA GTT GTG GTT TGT CC-3′)(SEQ ID NO：95)和MGD-10、MGD-11、MGD-12、MGD-13或MGD-14用于产生右侧片段。使用ExpandTMHigh Fidelity PCR System(Roche Diagnostics公司)进行PCR反应，首先于94℃孵育5分钟，接着在94℃进行5秒、60℃进行5秒、72℃进行60秒，共进行25轮，然后于72℃孵育7分钟。PCR产物在低熔点的琼脂糖凝胶上展开，从琼脂上切下并于70℃熔化。用于结合左侧和右侧片段的第二轮PCR使用外部引物jt240和kco41以上述方式进行，首先于94℃孵育5分钟，接着在94℃进行5秒、60℃进行5秒、72℃进行90秒，共进行35轮，然后于72℃孵育7分钟。最终的PCR产物在低熔点的琼脂糖凝胶上展开，切下预期大小的DNA片段并使用QIAquickTM Gel Extraction Kit(QIAGEN)纯化。纯化的片段亚克隆进pCR
Figure 10003_11
4Blunt-TOPO
Figure 10003_12
(InvitrogenTM，Carlsbad，CA)，然后用PmlI和BamHI消化，以上述方式进行凝胶纯化并克隆进pVAg2M3-OST577的对应位点之间。
为在位置428处产生随机突变，使用诱变引物JY22(5′-GAA CGT CTT CTCATG CTC CGT GNN KCA TGA GGC TCT G-3′)(SEQ ID NO：96)和JY23(5′-CACGGA GCA TGA GAA GAC GTT C-3′)(SEQ ID NO：97)，其中K＝G或T，N＝A、C、G或T。第一轮PCR中，外部引物ks g2-5和JY23用于产生左侧片段；而外部引物kco8和JY22用于产生右侧片段。接下来的所有步骤按照上述位置314处随机诱变的进行。
为在位置428处产生额外的随机突变，依次使用诱变引物MGD-2(5′-GTGTAG TGG TTG TGC AGA GCC TCA TGM NNC ACG GAG CAT GAGAAG-3′)(SEQ ID NO：98)和KHl(5′-CAT GAG GCT CTG CAC AAC CAC TACAC-3′)(SEQ ID NO：99)，其中M＝A或C，N＝A、C、G或T。第一轮PCR中，外部引物msc g2-1和MGD-2用于产生左侧片段，而外部引物MGD-1和KHl用于产生右侧片段。使用ExpandTM High Fidelity PCR System(Roche Diagnostics公司)进行PCR反应，首先于94℃孵育5分钟，接着在94℃进行5秒、60℃进行5秒、72℃进行90秒，共进行25轮，然后于72℃孵育7分钟。PCR产物在低熔点的琼脂糖凝胶上展开，从琼脂上切下并于70℃熔化。用于结合左侧和右侧片段的第二轮PCR使用外部引物msc g2-1和MGD-1以上述方式进行，首先于94℃孵育5分钟，接着在94℃进行5秒、60℃进行5秒、72℃进行75秒，共进行35轮，然后于72℃孵育7分钟。最终的PCR产物在低熔点的琼脂糖凝胶上展开，切下预期大小的DNA片段并使用QIAquickTM Gel ExtractionKit(QIAGEN)纯化。纯化的片段用PinAI和BamHI消化，以上述方式进行凝胶纯化并克隆进pVAg2M3-OST577的对应位点之间。
为产生M428E突变体，使用诱变引物MGD-8(5′-GTG TAG TGG TTG TGCAGA GCC TCA TGT TCC ACG GAG CAT GAG AAG-3′)(SEQ ID NO：100)和KHl。第一轮PCR中，外部引物msc g2-1和MGD-8用于产生左侧片段；而外部引物MGD-1和KH1用于产生右侧片段。接下来的所有步骤按照上述位置428处随机诱变的进行。
将含有T250E突变的pVAg2M3-OST577质粒中的PmlI-BamHI片段用来自含有M428F突变的pVAg2M3-OST577质粒中对应的PmlI-BamHI片段取代产生T250E/M428F双重突变体。将含有T250Q突变的pVAg2M3-OST577质粒中的PmlI-BamHI片段分别用来自含有M428F和M428L突变的pVAg2M3-OST577质粒中对应的PmlI-BamHI片段取代产生T250Q/M428F和T250Q/M428L双重突变体。
在Hu1D10-IgG2M3重链的位置250和428处也形成了几个氨基酸取代。为产生M428L突变体，来自含有hCMV启动子和增强子(Boshart等.，同上)与OST577 VH区域的质粒pVAg2M3-OST577(M428L)的XhoI-XbaI片段用来自含有hCMV启动子和增强子与Hu1D10 VH区域的质粒pHu1D10.IgG1.rgpt.dE(Kostelny等.，(2001)，同上)的对应的XhoI-XbaI片段取代。为产生T250Q/M428L突变体，来自含有hCMV启动子和增强子(Boshart等，同上)与OST577 VH区域的质粒pVAg2M3-OST577(T250Q/M428L)的XhoI-XbaI片段用来自含有hCMV启动子和增强子与Hu1D10 VH区域的质粒pHu1D10.IgG1.rgpt.dE(Kostelny等.，(2001)，同上)的对应的XhoI-XbaI片段取代。
质粒DNA用QIAprepTM Spin Miniprep Kit(QIAGEN)制备，并通过测序鉴定核苷酸取代。大规模制备质粒使用EndoFreePlasmid Maxi Kit(QIAGEN
Figure 10003_16
)进行。OST577-IgG2M3表达质粒的编码区域通过核苷酸测序确认。
结果：
为分离具有较高或较低新生Fc受体(FcRn)亲和力并期望具有改变的血清半衰期的人IgG突变体，在人γ2M3重链的位置250、314和428处(按照Kabat等的EU索引编号，同上)产生随机的氨基酸取代。以人IgG2M3Fc和人FcRn的复合物(见以前实施例中所述的模型1、2和3)的计算机模型为基础选择这三个位置，该计算机模型是从大鼠Fc/FcRn复合物的X-射线晶体结构(Burmeister等.，同上)中推断得到。虽然位置250、314和428处的野生型氨基酸位置接近Fc/FcRn界面，这些残基未显示出直接与pH依赖型的Fc和FcRn的相互作用有关。因此，这些位置的氨基酸取代可能会增加(或降低)Fc对FcRn的亲和力，而仍能维持pH依赖型的结合。在基于PCR诱变产生的单一突变体中，19个突变体将位置250处的野生型T转换为A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、W或Y；19个突变体将位置314处的野生型L转换为A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；19个突变体将位置428处的野生型M转换为A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y(见表1)。将一些与FcRn的结合能力增加的突变结合来产生几个双重突变体，包括T250E/M428F、T250Q/M428F和T250Q/M428L。
                          实施例4
该实施例描述了人γ1重链基因的Fc区域的诱变。
诱变：
使用重叠-延伸PCR方法(Higuchi，同上)在OST577-IgG1重链的位置250和428处(按照Kabat等的EU索引编号，同上)产生氨基酸取代。为产生250E突变体，使用诱变引物JX076(5′-AAC CCAAGG ACG AAC TCA TGA TCT CCCG-3′)(SEQ ID NO：101)和JX077(5′-GGA GAT CAT GAG TTC GTC CTT GGGTIT TG-3′)(SEQ ID NO：102)。第一轮重叠-延伸PCR中，外部引物JX080(5′-CCTCAG CTC GGA CAC CTT CTC-3′)(SEQ ID NO：103)和JX077用于产生左侧片段，而外部引物NT244(5′-GCC TCC CTC ATG CCA CTC A-3′)(SEQ ID NO：104)和JX076用于产生右侧片段。PCR反应使用ExpandTM High Fidelity PCRSystem(Roche Diagnostics公司，Indianapolis，IN)进行，按照生产商的建议，在94℃孵育5分钟，接着在94℃进行20秒、55℃进行20秒、72℃进行90秒，共进行35轮，然后在GeneAmp
Figure 10003_17
PCR System 9600(Applied Biosystems
Figure 10003_18
)中于72℃孵育7分钟。PCR产物在低熔点的琼脂糖凝胶上展开，从凝胶上切下并于70℃熔化。用于结合左侧和右侧片段的第二轮PCR使用外部引物JX080和NT244，以上述方式进行，共进行35轮。最终的PCR产物在低熔点的琼脂糖凝胶上展开，切下预期大小的DNA片段并使用QIAEXTMII Gel ExtractionKit(QIAGEN)纯化。纯化的片段用NheI和EagI消化，以上述方式进行凝胶纯化并克隆进pVAgl.N-OST577的对应位点之间。
为产生T250D突变体，使用诱变引物JX087(5′-AAC CCAAGGACGACCTCA TGA TCT CCC G-3′)(SEQ ID NO：105)和JX088(5′-GGA GAT CAT GAGGTC GTC CTT GGG TTT TG-3′)(SEQ ID NO：106)。第一轮PCR中，外部引物JX080和JX088用于产生左侧片段，而外部引物NT244和JX087用于产生右侧片段。接下来所有的步骤按上述的进行。
为产生M428F突变体，使用诱变引物JX078(5′-CTC ATG CTC CGT GTTCCA TGA GGC TCT GC-3′)(SEQ ID NO：107)和JX079(5′-AGA GCC TCA TGGAAC ACG GAG CAT GAG-3′)(SEQ ID NO：108)。第一轮PCR中，外部引物JX080和JX079用于产生左侧片段，而外部引物NT244和JX078用于产生右侧片段。接下来所有的步骤按上述的进行。
为产生M428L突变体，使用诱变引物JXM428L1(5′-CTC ATG CTC CGTGTTGCA TGA GGC TCT GC-3′)(SEQ ID NO：109)和JXM428L2(5′-AGA GCCTCA TGC AAC ACG GAG CAT GAG-3′)(SEQ ID NO：110)。第一轮PCR中，外部引物JX080和JXM428L2用于产生左侧片段，而外部引物NT244和JXM428L1用于产生右侧片段。接下来所有的步骤按上述的进行。
为产生T250Q突变体，使用诱变引物JXT250Q1(5′-AAC CCA AGG ACCAAC TCA TGA TCT CCC G-3′)(SEQ ID NO：111)和JXT250Q2(5′-GGA GAT CATGAG TTG GTC CTT GGG TTT TG-3′)(SEQ ID NO：112)。第一轮PCR中，外部引物JX080和JXT250Q2用于产生左侧片段，而外部引物NT244和JXT250Q1用于产生右侧片段。接下来所有的步骤按上述的进行。
为产生T250E/M428F双重突变体，使用诱变引物JX076和JX077在含有M428F突变的模板上产生T250E突变。第一轮PCR中，外部引物JX080和JX077用于产生左侧片段，而外部引物NT244和JX076用于产生右侧片段。接下来所有的步骤按上述的进行。
为产生T250Q/M428L双重突变体，使用诱变引物JXT250Q1和JXT250Q2来形成T250Q突变，并使用诱变引物JXM428L1和JXM428L2来形成M428L突变。第一轮PCR中，外部引物JX080和JXT250Q2用于产生左侧片段，JXT250Q1和JXM428L2用于产生中间片段，外部引物NT244和JXM428L1用于产生右侧片段。接下来所有的步骤按上述的进行。
在Hu1D10-IgG1重链的位置250和428处也产生了几个氨基酸取代。为产生M428L突变体，来自含有hCMV启动子和增强子(Boshart等.，同上)与OST577 VH区域的质粒pVAg1.N-OST577(M428L)的XhoI-XbaI片段用来自含有hCMV  启动子和增强子与Hu1D10 VH区域的质粒pHu1D10.IgG1.rgpt.dE(Kostelny等.，(2001)，同上)的对应的XhoI-XbaI片段取代。为产生T250Q/M428L突变体，来自含有hCMV启动子和增强子(Boshart等.，同上)与OST577 VH区域的质粒pVAg1.N-OST577(T250Q/M428L)的XhoI-XbaI片段用来自含有hCMV启动子和增强子与Hu1D10 VH区域的质粒pHu1D10.IgG1.rgpt.dE(Kostelny等.，(2001)，同上)的对应的XhoI-XbaI片段取代。
质粒DNA用QIAprepTM Spin Miniprep Kit(QIAGEN)制备，并通过测序确定核苷酸取代。大规模制备质粒使用EndoFree
Figure 10003_21
 Plasmid Maxi Kit(QLAGEN)进行。OST577-IgG1表达质粒的编码区域通过核苷酸测序确认。
结果：
为鉴定具有改变的新生Fc受体(FcRn)亲和力并期望具有改变的血清半衰期的人IgG突变体，在人γ1重链的位置250和428处(按照Kabat等的EU索引编号，同上)产生了几个随机的氨基酸取代。这两个位置的选择是以鉴定人γ2M3重链中这些位置的突变为基础，这些位置的突变导致FcRn结合能力增加或降低。虽然位置250和428处的野生型氨基酸位置接近Fc/FcRn界面，这些残基未显示出直接与pH依赖型的Fc和FcRn之间的相互作用有关。因此，这些位置的氨基酸取代可能会增加(或降低)Fc与FcRn的亲和力，而仍能维持pH依赖型的结合。在人γ2M3重链中表现出结合能力增加的单一和双重突变体均在人γ1重链中进行评价，包括单一突变体T250E、T250Q、M428F和M428L；双重突变体T250E/M428F和T250Q/M428L。在人γ2M3重链中表现出结合能力降低的单一突变体(T250D)也在人γ1重链中进行评价。
                        实施例5
该实施例描述了突变体IgG2M3和IgG1抗体的性质。
细胞培养：
人肾细胞系293-H(Life Technologies，Rockville，MD)在37℃、7.5％CO2的孵育箱内维持于含有10％胎牛血清(FBS)(HyClone ′，Logan，UT)、0.1mMMEM非必需氨基酸(InvitrogenTM)和2mM L-谷氨酰胺(InvitrogenTM)的DMEM(Bio WhittakerTM，Walkersville，MD)中，以下称为培养基293。为在瞬时转染后表达与纯化单克隆抗体，293-H细胞孵育在含有10％低-IgGFBS(HyClone)、0.1mM MEM非必需氨基酸和2mM L-谷氨酰胺的DMEM中，以下称为低-IgG293培养基。小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0(美国模式培养物保藏所，Manassus，VA)维持于含有10％FBS和2mM L-谷氨酰胺的DMEM。为在稳定转染后纯化单克隆抗体，使Sp2/0细胞适应于生长在Hybridoma-SFM(HSFM)(LifeTechnologies)中。
瞬时转染：
293-H细胞用合适的轻链质粒和合适的野生型或各种突变的重链质粒之一瞬时共转染，该突变的重链质粒在位置250、314或428处含有单一或双重氨基酸取代。对于小规模瞬时转染，每次转染的约1×106个细胞以3ml的293培养基涂布于6-孔板上并生长过夜至汇合。第二天，2μg轻链质粒和2μg野生型或突变的重链质粒与0.25ml HSFM组合。在独立的试管中，10μlLipofectamineTM 2000试剂(InvitrogenTM)和0.25ml HSFM组合并于室温孵育5分钟。0.25ml LipofectamineTM 2000-HSFM混合物与0.25ml DNA-HSFM混合物轻柔混合并于室温孵育20分钟。抽出覆盖293-H细胞的培养基并换以低-IgG293培养基，然后将lipofectamine-DNA复合物滴加于细胞，通过搅动来轻柔混合，在收集上清液之前这些细胞于37℃在7.5％CO2的孵育箱内孵育5-7天。
对于大规模瞬时转染，每次转染的约7×106个细胞以3ml的293培养基涂布于T-75锥形瓶中并生长过夜至汇合。第二天，12μg轻链质粒和12μg野生型或突变的重链质粒与1.5ml HSFM组合。在独立的试管中，60μlLipofectamineTM 2000试剂和1.5ml HSFM组合并于室温孵育5分钟。1.5mlLipofectamineTM 2000-HSFM混合物与1.5ml DNA-HSFM混合物轻柔混合并于室温孵育20分钟。抽出覆盖293-H细胞的培养基并换以-IgG293培养基，然后将lipofectamine-DNA复合物滴加于细胞，通过搅动来轻柔混合，在收集上清液之前这些细胞于37℃在7.5％CO2的孵育箱内孵育5-7天。
抗体浓缩：
通过以约1,200rpm离心5分钟收集小规模瞬时转染的上清液并用0.22μm的Millex
Figure 10003_27
-GV微过滤器(Millipore
Figure 10003_28
公司，Bedford，MA)无菌过滤。使用6mlVivaspin浓缩器(50,000MWCO)(VivascienceAG，Hannover，德国)以3,000rpm离心将样品浓缩约6倍至0.5ml。浓缩的蛋白样品在pH6.0的5ml PBS中重悬并以上述方式浓缩至0.5ml。以下所述的ELISA方法用于测量每个样品中的抗体浓度。
稳定转染：
Sp2/0细胞用合适的轻链质粒和合适的野生型或各种突变的重链质粒之一稳定转染，该突变的重链质粒在位置250或428处含有单一或双重氨基酸取代。约1×107个细胞用10ml PBS洗涤并重悬于1ml PBS中。用FspI使约25-30μg轻链质粒和50-60μg重链质粒线形化并加入细胞。轻柔混合细胞与DNA并在冰上转移至Gene Pulser Cuvette(Bio-Rad
Figure 10003_31
Laboratories，Hercules，CA)。使用设置在0.360kV、25μF的Gene Pulser II(Bio-Rad
Figure 10003_32
Laboratories)对细胞进行电穿孔并返回冰上10-20分钟。细胞稀释到40ml DMEM、10％FBS、2mM L-谷氨酰胺中并以100μl/孔涂到4个96孔板上。48小时后，以100μl/孔加入2×霉酚酸(MPA)选择培养基(DMEM，10％FBS，1×HT Media SupplementHybri-Max(Sigima
Figure 10003_34
，St.Louis，MO)，300μg/ml黄嘌呤(Sigma
Figure 10003_35
)，2μg/ml霉酚酸(Life Technologies
Figure 10003_36
)和2mM L-谷氨酰胺)。10-14天后，来自孔中明显含有单一菌落的上清液通过ELISA筛选。选择生产抗体水平最高的克隆进行扩增并使其适于在HSFM(Life Technologies
Figure 10003_37
)中生长。适于生长的克隆在含有450mlHSFM的辊瓶(roller bottle)中扩增，通含5％CO2的空气，在2天后补加50ml无蛋白加料培养基-2(Protein Free Feed Medium-2)(PFFM-2)(Sauer等.，Biotechnol.Bioeng.67：585-597(2000))，并生长直至营养耗尽。
也使一些生产抗体水平最高的克隆适应于无蛋白质的基础培养基-1(Protein-Free Basal Medium-1)(PFBM-1)(Protein Design Labs，Inc.)，扩增到10L旋转锥形瓶中，2天后补加1/10体积的PFFM-2并生长至营养耗尽。
ELISA：
为定量上清液中的OST577或Hu1D10抗体，进行ELISA。ImmulonTM 4板(DYNETechnologies，Inc.，Chantilly，VA)用1.0μg/ml的山羊F(ab′)2抗-人IgG γ链抗体(BioSource International，Camarillo，CA)或AffiniPureTM山羊抗-人IgG Fc γ片段特异性抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.，WestGrove，PA)的pH9.4的0.2M碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液以4℃覆盖过夜，100μl/孔。第二天，板用ELISA洗涤缓冲液(EWB)(PBS，0.1％吐温20)洗涤并于室温用在TBS中的SuperBlock封闭缓冲液(Pierce Chemical Company，Rockford，IL)以300μl/孔封闭20-30分钟。板用EWB洗涤并向每孔加入适当稀释的测试样品。合适的纯化OST577或Hu1D10抗体以0.2μg/ml为起点在100μl/孔的ELISA缓冲液(EB)(PBS，1％牛血清白蛋白，0.1％吐温20)中连续两倍稀释，并用作标准品。培养上清液首先在100μl/孔的EB中稀释10倍，再在100μl/孔的EB中连续两倍稀释。板于室温孵育1-2小时，然后用EWB洗涤并将在EB中浓度为1.0μg/ml的合适的山羊抗-人λ轻链HRP-偶联抗体(BioSource International，或Southern Biotechnology Associates，Inc.，Birminghanm，AL)或山羊抗-人κ轻链HRP-偶联抗体(Southern Biotechnology Associates，Inc.)以100μl/孔加入。于室温孵育1小时后，板用EWB洗涤，然后以100μl/孔加入ABTS过氧化物酶底物/过氧化物酶溶液B(Kirkegaard & Perry Laboratories，Gaithersburg，MD)。用100μl/孔的2％草酸终止反应，并用VERSAmaxTM微滴定板读数仪(MolecularDevices公司
Figure 10003_39
，Sunnyvale，CA)测量415nm处的吸光度。
抗体纯化：
离心收集瞬时转染的培养上清液并无菌过滤。加入1/50体积pH7.0的1M柠檬酸钠调节过滤上清液的pH。上清液在用20mM柠檬酸钠、150mM NaCl，pH7.0预平衡的1ml HiTrap蛋白质A HP柱(Amersham Biosciences公司，Piscataway，NJ)上展开。用相同的缓冲液洗柱并用pH3.5的20mM柠檬酸钠洗脱结合的蛋白。加入1/50体积pH6.5的1.5M柠檬酸钠中和后，集中的抗体组分在5ml HiTrap
Figure 10003_41
脱盐柱(Amersham BiosciencesTM公司)上展开，该柱用20mM柠檬酸钠、120mM NaCl，pH6.0预平衡。收集流出液，合并OD280＞0.1的组分并使用2ml Vivaspin
Figure 10003_42
浓缩器(50,000道尔顿MWCO)(VivascienceAG)浓缩至～0.5-1.0mg/ml。然后使用0.2μm Millex-GV微过滤器(Millipore公司)将样品过滤无菌。使用紫外分光光度计测量280nm的吸光度来确定纯化抗体的浓度(1mg/ml＝1.4A280)。
对于小规模纯化稳定转染的抗体，离心收集培养上清液并无菌过滤。上清液在用pH7.4的PBS预平衡的5ml POROS50A蛋白质A柱(AppliedBiosystems)展开。用相同的缓冲液洗柱并用0.1M甘氨酸、0.1M NaCl，pH3.0洗脱结合的蛋白。加入1/20体积的1M Tris碱中和后，集中的组分使用PD-10脱盐柱(Amersham BiosciencesTM公司)或通过透析将缓冲液交换成pH7.4的PBS。然后使用0.2μm Millex-GV微过滤器(Millipore
Figure 10003_49
公司)将样品过滤无菌。使用紫外分光光度计测量280nm的吸光度来确定纯化抗体的浓度(1mg/ml＝1.4A280)。
对于大规模纯化稳定转染的抗体，使用Sartorius
Figure 10003_50
过滤囊(SartoriusAG，Goettingen，德国)通过死端式过滤使细胞培养收集液澄清。澄清的收集液使用Pellicon
Figure 10003_52
2盒(cassette)(30,000道尔顿MWCO)(Millipore公司)从约10L浓缩至750ml，然后使用上述的柠檬酸缓冲液系统在rProtein A Sepharose FF柱(Amersham Biosciences
Figure 10003_54
公司)上通过蛋白质A亲和层析纯化。使用YM30膜(Millipore公司)在Amicon
Figure 10003_56
搅拌细胞设备中浓缩蛋白质A洗脱液，然后使用SuperdexTM200柱(Amersham BiosciencesTM公司)将缓冲液交换为20mM柠檬酸钠、120mM NaCl，pH6.0。测量pH和重量克分子渗透浓度，并使用紫外分光光度计测量280nm的吸光度来确定纯化抗体的浓度(1mg/ml＝1.4A280)。
SDS-PAGE：
5μg纯化抗体的样品于还原或非还原条件在NuPAGE
Figure 10003_57
Novex4-12％Bis-Tris凝胶(InvitrogenTM)展开并按照生产商的建议使用SimplyBlueTMSafeStain试剂盒(InvitrogenTM)染色。
结果：
IgG2M3Fc和IgG1 Fc突变体表达为抗-HBV抗体，其分别含有OST577的轻链和重链可变区(Ehrlich等.，同上)，，人λ-2轻链恒定区(Hieter等.，(1981)，同上)，人γ-2突变体3(IgG2M3)的重链恒定区(Cole等.，同上)和IgG1(Ellison等.，同上)。IgG2M3变体在CH2区域含有两个氨基酸取代(V234A and G237A)并表现出极低的残留人Fcγ受体结合能力(Cole等.，同上)。IgG2M3Fc和IgG1Fc突变体也表达为抗-HLA-DR β链等位抗体，其分别含有Hu1D10的轻链和重链可变区(Kostelny等.，(2001)，同上)，人κ的轻链恒定区(Hieter等.，(1980)，同上)，人IgG2M3的重链恒定区(Cole等.，同上)和IgG1(Ellison等.，同上)。如上所述，合适的野生型或突变体重链表达载体与合适的轻链表达载体瞬时共转染进293-H细胞来表达OST-577或Hu1D10单克隆抗体。瞬时转染后5-7天收集的培养上清液的ELISA分析显示抗体的表达水平通常为25ml上清液中5-50μg/ml。OST577或Hu1D10抗体通过蛋白质A亲和层析纯化得到的终产量约100-1000μg。通过ELISA确定OST577或Hu1D10抗体在Sp2/0细胞中稳定表达的典型表达水平为5-50μg/ml。培养上清液中产生的约50-80％的抗体通过小规模蛋白质A亲和层析获得。
纯化的抗体通过在还原或非还原条件下的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定其性质。非还原条件下的SDS-PAGE分析显示纯化的抗体具有约150-160kD(数据未显示)的分子量；还原条件下的分析显示纯化的抗体由分子量约为50kD的重链和分子量约为25kD的轻链组成(见图10A和10B)。从稳定的Sp2/0转染子纯化而来的抗体的SDS-PAGE分析得到与用上述来自瞬时293-H转染子的纯化抗体观察到的相似的结果。
                        实施例6
该实施例描述突变体IgG2M3和IgG1抗体的竞争性结合分析。
细胞培养：
小鼠骨髓瘤细胞系NS0(欧洲动物细胞培养物保藏所(European Collectionof Animal Cell Cultures，Salisbury)，Wiltshire，UK)维持于含有10％FBS的DMEM中。在其表面表达重组的GPI-连接的人或恒河猴FcRn的NS0转染子维持于霉酚酸(MPA)选择培养基(DMEM，10％FBS，1× HT Media SupplementHybri-Max(Sigma)，250μg/ml黄嘌呤(Sigma
Figure 10003_60
)，1μg/ml霉酚酸(LifeTechnologies)和2mM L-谷氨酰胺)或2×MPA选择培养基中。
人FcRn细胞系：
用pDL208稳定转染NSO细胞。约1×107个细胞洗涤一次并重悬于1ml单纯的DMEM中，转移至GenePulser比色皿(Bio-Rad
Figure 10003_63
Laboratories)，并在冰上孵育10分钟。用FspI使40μg质粒pDL208线形化并在冰上与细胞轻柔地混合，然后使用设置于1.5kV、3μF的Gene PulserTM II(Bio-Rad
Figure 10003_64
Laboratories)通过两次脉冲对细胞进行电穿孔并放回冰上10分钟。细胞稀释进20ml含有10％FBS的DMEM并以100μl/孔涂布于两块96孔板上。48小时后培养基替换为MPA选择培养基。明显含有单一菌落的霉酚酸抗性NS0转染子在MPA选择培养基中扩增，并在约3周后用FACSTM筛选。将每次测试的约1.5×105个细胞接种于含有10μg/ml生物素化的小鼠抗-人β2-微球蛋白抗体(Chromaprobe，Inc.，Aptos，CA)的100μl FACS染色缓冲液(FSB)(PBS，1％FBS，0.1％NaN3)中，冰上1小时。细胞用4ml FSB洗涤一次，然后在含有20μg/ml的链霉抗生物素蛋白-FITC偶联物(Southem Biotechnology Associates，Inc.)的25μl FSB中孵育，冰上黑暗30分钟。细胞用4ml FSB洗涤一次，并重悬于1％甲醛中。使用FACScan流式细胞计数器(BD
Figure 10003_65
Biosciences，San Jose，CA)分析样品的抗体与人β2m的结合。具有最明显染色的几个克隆使用FACStar细胞分选仪(BD
Figure 10003_66
Biosciences)亚克隆，在含有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺的DMEM中扩增，并以上述方式用FACSTM再次测试。一个命名为NS0HuFcRn(memb)，clone7-3的亚克隆用于接下来的结合实验。
恒河猴FcRn细胞系：
用pDL410稳定转染NSO细胞。约6×105个细胞以上述方式通过电穿孔来转染。以上述方式通过FACSTM用每次测试100ng的与恒河猴FcRnα链交叉反应的小鼠抗-人FcRnα链抗体(Protein Design LabsTM，Inc.)染色并用山羊抗-小鼠κFITC-偶联抗体(Southem Biotechnology Associates，Inc.)测定来鉴定转染子。命名为NS0 RhFcRn，克隆R-3的细胞系用于接下来的结合实验。
单点竞争性结合实验：
浓缩的OST577-IgG2M3上清液在单点竞争性结合实验中测试与细胞系NS0 HuFcRn(memb)，克隆7-3上的人FcRn的结合能力。将每次测试的约2×105个细胞在pHS.0的FACS结合缓冲液中洗涤一次(FBB)(含有0.5％BSA、0.1％NaN3的PBS)，在pH6.0的FBB中洗涤一次，然后重悬于120μl预混合的生物素化OST577-IgG2M3抗体(8.3μg/ml)中并在pH6.0的FBB中浓缩上清液(含有8.3μg/ml的竞争性抗体)。细胞在冰上孵育1小时，在pH6.0的FBB中洗涤两次，并重悬于在pH6.0的FBB稀释至2.5μg/ml的链霉抗生物素蛋白-RPE偶联物(BioSource Intemational)25μl中。于黑暗环境中在冰上孵育30分钟后，细胞用pH6.0的FBB洗涤两次并重悬于1％甲醛中。使用FACScan流式细胞计数器(BDBiosciences)通过FACSTM分析样品的抗体与人FcRn的结合。每个突变体的平均通路荧光(Mean channel fluorescence)(MCF)与野生型抗体比较并使用Excel(MicrosoftCorporation，Redmond，WA)作图。
竞争性结合实验：
每个纯化的OST577-IgG2M3抗体的一系列稀释液和生物素化的HuEP5C7-IgG2M3抗体(He等.，J.Immunol.160：1029-1035(1998))竞争与细胞系NSO HuFcRn(memb)，克隆7-3上的人FcRn结合。就最初的筛选实验而言，每次测试的约2×105个细胞用pH6.0的FSB洗涤一次并重悬于预混合了生物素化的HuEP5C7-IgG2M3抗体(10μg/ml)和OST577-IgG2M3竞争抗体(从208μg/ml到0.102μg/ml的两倍连续稀释液)的100μl pH6.0的FSB中。细胞与抗体混合物在冰上孵育1小时，在pH6.0的FSB中洗涤两次并重悬于以25μlpH6.0的FSB稀释至2.5μg/ml的链霉抗生物素蛋白-RPE偶联物(BioSourceInternational)中。于黑暗环境中在冰上孵育30分钟后，细胞在pH6.0的FSB中洗涤两次，并重悬于1％甲醛中。使用FACScan流式细胞计数器(BD
Figure 10003_69
Biosciences)通过FACSTM分析样品的抗体与FcRn的结合。平均通路荧光(Mean channelfluorescence)(MCF)对竞争抗体浓度作图并使用GraphPad Prism
Figure 10003_70
(GraphPadTMSoftware，Inc.，San Diego，CA)计算IC50值。为了一致性，示于表中的IC50值基于最终竞争抗体的浓度。
接下来的竞争性结合实验按上述方式进行，除了细胞在pH8.0的FBB中洗涤一次，在pH6.0的FBB中洗涤一次，然后重悬于预混合了生物素化的HuEP5C7-IgG2M3抗体(10μg/ml)和OST577-IgG2M3竞争抗体(从208μg/ml到0.102μg/ml的两倍连续稀释液)的100μl pH6.0的FSB中。所有接下来的孵育和洗涤均使用如上所述的pH6.0的FBB。一组实验在如上所述的预混合了生物素化的OST577-IgG2M3抗体(8.3μg/ml)和OST577-IgG2M3竞争抗体(从208μg/ml到0.102μg/ml的两倍连续稀释液)的120μl pH6.0的FSB中进行。另一组实验在如上所述的预混合了生物素化的OST577-IgG1抗体(5.0μg/ml)和OST577-IgG1竞争抗体(从125μg/ml开始的两倍连续稀释液，或从250μg/ml开始的三倍连续稀释液)的200μl pH6.0的FSB中进行。还有一组实验在如上所述的预混合了生物素化的OST577-IgG抗体(5.0μg/ml)和OST577-IgG1竞争抗体(从750μg/ml开始的三倍连续稀释液)的200μl pH6.0的FSB中进行。
每个纯化的OST577-IgG2M3抗体的一系列稀释液和生物素化的OST577-IgG2M3抗体竞争与细胞系NS0 RhFcRn(memb)，克隆R-3上的恒河猴FcRn结合。在一组实验中，每次测试的约2×105个细胞在pH8.0的FBB中洗涤一次，在pH6.0的FBB中洗涤一次，然后重悬于预混合了生物素化的OST577-IgG2M3抗体(8.3μg/ml)和OST577-IgG2M3竞争抗体(从208μg/ml到0.102μg/ml的两倍连续稀释液)的120μl pH6.0的FBB中。细胞与抗体混合物在冰上孵育1小时，在pH6.0的FSB中洗涤两次并重悬于以25μl pH6.0的FSB稀释至2.5μg/ml的链霉抗生物素蛋白-RPE偶联物(BioSource International)中。于黑暗环境中在冰上孵育30分钟后，细胞在pH6.0的FSB中洗涤两次，并重悬于1％甲醛中。使用FACSCalibur流式细胞计数器(BDBiosciences)通过FACSTM分析样品的抗体与FcRn的结合。另一组实验在如上所述的预混合了生物素化的OST577-IgG1抗体(5.0μg/ml)和OST577-IgG1竞争抗体(从500μg/ml开始的三倍连续稀释液)的200μl pH6.0的FSB中进行。
结果；
使用在其表面稳定表达人FcRn的转染的NS0细胞系来确定野生型OST577-IgG2M3或OST577-IgG1抗体和其各种突变体的相对结合能力。如上所述，按照单点竞争性结合实验测试浓缩的上清液与人FcRn的结合并在竞争性结合实验中测试纯化抗体的FcRn结合能力。浓度递增的未标记竞争抗体在有亚饱和浓度的标记IgG2M3或IgG1抗体的情况下与细胞在pH6.0的FSB或FBB中孵育。
浓缩的OST577-IgG2M3上清液的典型性实验的结果示于图11A、11B和11C。如图11A所示，250位的一些突变体(例如，T250E、T250Q)是比野生型更强的竞争者，说明这些突变体相比野生型抗体其与人FcRn的结合能力增加了。在此位置的其它突变体(例如，T250D、T250F、T250K、T250N、T250P、T250R、T250W、T250Y)相比野生型是较弱的竞争者，说明这些突变体相比野生型抗体其与人FcRn的结合能力极低了。如图11B所示，314位的突变体无一是比野生型更强的竞争者，这说明相比野生型抗体，这些突变体中无一与人FcRn的结合能力增加。大多数在此位置的突变体(例如，L314A、L314C、L314D、L314E、L314F、L314G、L314H、L314K、L314M、L314N、L314P、L314Q、L314R、L314S、L314T、L314V、L314W、L314Y)相比野生型是较弱的竞争者，这说明这些突变体相比野生型抗体其与人FcRn的结合能力降低了。如图11C所示，428位的一些突变体(例如.，M428F、M428L)是比野生型更强的竞争者，这说明这些突变体相比野生型抗体其与人FcRn的结合能力增加了。在此位置的其它突变体(例如，M428A、M428C、M428D、M428E、M428G、M428H、M428K、M428N、M428P、M428Q、M428R、M428S、M428T、M428V、M428Y)相比野生型是较弱的竞争者，这说明这些突变体相比野生型抗体其与人FcRn的结合能力降低了。
表2总结了纯化的野生型OST577-IgG2M3抗体和其一些突变体与人FcRn结合的IC50值(抑制50％的标记抗体与FcRn结合所需的竞争抗体量)。相对结合值以野生型OST577-IgG2M3抗体的IC50值和每个突变体的IC50值之比来计算。在氨基酸位置314，纯化的突变体相比野生型抗体无一表现出与人FcRn的结合能力增加了。事实上，位置314处的所有4个纯化突变体相比野生型抗体均表现出与人FcRn的结合能力降低了。然而，在氨基酸位置250处，一个突变体(T250E)表现出比野生型抗体约高3倍的与人FcRn的结合能力。250位的几个突变体表现出比野生型抗体略微降低的结合能力，一个突变体(T250D)相比野生型抗体表现出与人FcRn的结合能力有很大降低。在氨基酸位置428处，一个突变体(M428F)表现出比野生型抗体约高3倍的与人FcRn的结合能力，而一个突变体(M428G)相比野生型抗体表现出与人FcRn的结合能力有很大降低。
既然鉴定了在两个不同位置的两个氨基酸取代(即T250E、T250Q、M428F和M428L)，均表现出与人FcRn的结合能力增加了，因此，我们构建了双重突变体T250E/M428F、T250Q/M428F和T250Q/M428L，将其瞬时转染入293-H细胞，纯化并测试了与人FcRn的结合能力。如上所述，浓度递增的未标记竞争抗体在有亚饱和浓度的标记HuEP5C7-IgG2M3或OST577-IgG2M3抗体的情况下与细胞在pH6.0的FBB中孵育。
如图12A所示，双重突变体(T250E/M428F)比单一突变体(T250E或M428F)表现出更好的与人FcRn的结合能力并且表现出比野生型抗体约高15倍的与人FcRn的结合能力。如图12B所示，双重突变体(T250Q/M428L)比单一突变体(T250Q或M428L)或双重突变体(T250Q/M428F)表现出更好的与人FcRn的结合能力并且表现出比野生型抗体约高28倍的与人FcRn的结合能力。如表3所总结，在一组实验中，野生型OST577-IgG2M3抗体的IC50是～9μg/ml，而每个单一突变体(T250E和M428F)的IC50是～3μg/ml，双重突变体(T250E/M428F)的IC50小于1μg/ml。如表4所总结，在另一组实验中，野生型OST577-IgG2M3抗体的IC50是～12μg/ml，而每个单一突变体(T250Q和M428L)和双重突变体(T250Q/M428F)的IC50是～2-4μg/ml，双重突变体(T250Q/M428L)的IC50小于1μg/ml。
也生产了野生型OST577-IgG1、单一突变体T250E、T250Q、M428F、M428L和双重突变体T250E/M428F和T250Q/M428L。如表5所总结，在一组实验中，野生型OST577-IgG1抗体的IC50是～14μg/ml，而每个单一突变体(T250E和M428F)的IC50是～3-5μg/ml，双重突变体(T250E/M428F)的IC50小于1μg/ml。如表6所总结，在另一组实验中，野生型OST577-IgG1抗体的IC50是～10μg/ml，而每个单一突变体(T250Q)的IC50是～3μg/ml，单一突变体(M428L)和双重突变体(T250Q/M428L)的IC50小于1μg/ml。
在竞争性结合实验中测试了OST577-IgG2M3和其一些突变体与恒河猴FcRn的结合。如表7所总结，野生型OST577-IgG2M3抗体的IC50是～15μg/ml，而每个单一突变体(T250Q和M428L)和双重突变体(T250Q/M428L)的IC50是～2-4μg/ml，双重突变体(T250Q/M428L)的IC50小于1μg/ml。在竞争性结合实验中也测试了OST577-IgG1和其一些突变体与恒河猴FcRn的结合。如表8所总结，野生型OST577-IgG1抗体的IC50是～9μg/ml，而每个单一突变体(T250Q)的IC50是～3μg/ml，单一突变体(M428L)和双重突变体(T250Q/M428L)IC50是小于1μg/ml。
                           表2
a对每个突变体，第一个字母表示野生型氨基酸，数字表示按照EU索引(Kabat等.，同上)的位置，第二个字母表示突变的氨基酸。
bn表示独立实验的数目。
cIC50值(±S.D.)如实施例6所述，以μg/ml表示(基于最终的竞争抗体浓度)并通过在pH6.0的FSB中竞争性结合实验对生物素化的HuEP5C7-IgG2M3计算其值。
d以野生型OST577-IgG2M3和每个突变体的IC50值之比计算的与人FcRn的相对结合能力。
                          表3
a对每个突变体，第一个字母表示野生型氨基酸，数字表示按照EU索引(Kabat等.，同上)位置，第二个字母表示突变的氨基酸。
bn表示独立实验的数目。
cIC50值(±S.D.)如实施例6所述，以μg/ml表示(以终竞争抗体的浓度为基础)并通过在pH6.0的FBB中竞争性结合实验对生物素化的HuEP5C7-IgG2M3计算其值。
d以野生型OST577-IgG2M3和每个突变体的IC50值之比计算的与人FcRn的相对结合能力。
                              表4
Figure G04815550519960329D000653
a对每个突变体，第一个字母表示野生型氨基酸，数字表示按照EU索引(Kabat等.，同上)位置，第二个字母表示突变的氨基酸。
bn表示独立实验的数目。
cIC50值(±S.D.)如实施例6所述，以μg/ml表示(以终竞争抗体的浓度为基础)并通过在pH6.0的FBB中竞争性结合实验对生物素化的OST577-IgG2M3计算其值。
d以野生型OST577-IgG2M3和每个突变体的IC50值之比计算的与人FcRn的相对结合能力。
                            表5
Figure G04815550519960329D000662
a对每个突变体，第一个字母表示野生型氨基酸，数字表示按照EU索引(Kabat等.，同上)位置，第二个字母表示突变的氨基酸。
bn表示独立实验的数目。
cIC50值(±S.D.)如实施例6所述，以μg/ml表示(以终竞争抗体的浓度为基础)并通过在pH6.0的FBB中竞争性结合实验对生物素化的OST577-IgG1计算其值。
d以野生型OST577-IgG1和每个突变体的IC50值之比计算的与人FcRn的相对结合能力。
                            表6
a对每个突变体，第一个字母表示野生型氨基酸，数字表示按照EU索引(Kabat等.，同上)位置，第二个字母表示突变的氨基酸。
bn表示独立实验的数目。
cIC50值(±S.D.)如实施例6所述，以μg/ml表示(以终竞争抗体的浓度为基础)并通过在pH6.0的FBB中竞争性结合实验对生物素化的OST577-IgG1计算其值。
d以野生型OST577-IgG1和每个突变体的IC50值之比计算的与人FcRn的相对结合能力。
                         表7
a对每个突变体，第一个字母表示野生型氨基酸，数字表示按照EU索引(Kabat等.，同上)位置，第二个字母表示突变的氨基酸。
bn表示独立实验的数目。
cIC50值(±S.D.)如实施例6所述，以μg/ml表示(以终竞争抗体的浓度为基础)并通过在pH6.0的FBB中竞争性结合实验对生物素化的OST577-IgG2M3计算其值。
d以野生型OST577-IgG2M3和每个突变体的IC50值之比计算的与人FcRn的相对结合能力。
                          表8
a对每个突变体，第一个字母表示野生型氨基酸，数字表示按照EU索引(Kabat等.，同上)位置，第二个字母表示突变的氨基酸。
bn表示独立实验的数目。
cIC50值(±S.D.)如实施例6所述，以μg/ml表示(以终竞争抗体的浓度为基础)并通过在pH6.0的FBB中竞争性结合实验对生物素化的OST577-IgG1计算其值。
d以野生型OST577-IgG1和每个突变体的IC50值之比计算的与人FcRn的相对结合能力。
                        实施例7
该实施例描述了对IgG2M3和IgG1突变体在FcRn结合中性能的确认。
直接结合实验：
测试了纯化的OST577-IgG2M3抗体在pH6.0的FBB中与细胞系NSOHuFcRn(memb)，克隆7-3或未转染的NSO细胞上的人FcRn的结合能力。每次测试的约2×105个细胞在pH8.0的FBB中洗涤一次，在pH6.0是FBB中洗涤一次，然后重悬在100μl抗体浓度为11μg/ml的pH6.0的FBB中。细胞与抗体在冰上孵育1小时，在pH6.0的FBB中洗涤两次，并重悬于其中山羊抗-人IgG RPE-偶联抗体(Southern Biotechnology Associates，Inc.)稀释至5μg/ml的25μl pH6.0的FBB中。于黑暗环境中在冰上孵育30分钟后，细胞用pH6.0的FBB洗涤两次并重悬于1％甲醛中。使用FACScan流式细胞计数器(BD
Figure 10003_72
Biosciences)通过FACSTM分析样品的抗体与FcRn的结合能力。每个突变体的平均通路荧光(Mean channel fluorescence)(MCF)使用Excel(Microsoft
Figure 10003_73
Corporation)作图。
于37℃进行的竞争性结合实验：
每个纯化的OST577-IgG2M3抗体的一系列稀释液与生物素化的OST577-IgG2M3抗体在37℃竞争与细胞系NS0 HuFcRn(memb)，克隆7-3上的人FcRn结合。每次测试的约2×105个细胞在pH8.0的FBB中洗涤一次，在pH6.0的FBB中洗涤一次，然后重悬于预混合的生物素化的OST577-IgG2M3抗体(10μg/ml)和OST577-IgG2M3竞争抗体(从208μg/ml到0.102μg/ml的两倍连续稀释液)的100μl pH6.0的FBB中。细胞与抗体混合物在37℃孵育1小时，在pH6.0的FSB中洗涤两次并重悬于其中的链霉抗生物素蛋白-RPE偶联物(BioSource International)稀释至2.5μg/ml的25μl pH6.0的FBB中。于黑暗环境中孵育30分钟后，细胞在pH6.0的FBB中洗涤两次，并重悬于1％甲醛中。使用FACScan流式细胞计数器(BD
Figure 10003_74
Biosciences)通过FACSTM分析样品的抗体与FcRn的结合能力。平均通路荧光(Mean channel fluorescence)(MCF)对竞争抗体浓度作图并使用GraphPad Prism
Figure 10003_75
(GraphPadTM Software)计算IC50值。
pH-依赖性的结合与释放实验：
纯化的OST577-IgG2M3和OST577-IgG1突变抗体与各自的野生型抗体比较与人FcRn的结合能力，然后在使用细胞系NS0 HuFcRn(memb)，克隆7-3进行的单点结合与释放实验中在各种pH值处释放。每次测试的约2×105个细胞在pH8.0的FBB中洗涤一次，在pH6.0的FBB中洗涤一次，然后重悬在纯化抗体(10μg/ml)的100μl pH6.0的FBB中。细胞在冰上孵育1小时，在pH6.0、6.5、7.0、7.5或8.0的FBB中洗涤两次，并重悬于其中山羊F(ab′)2抗-人IgG FITC-偶联抗体(Southern Biotechnology Associates，Inc.)稀释至1.25μg/ml的25μl、合适pH的FBB中。于黑暗环境中在冰上孵育30分钟后，细胞在合适pH的FBB洗涤两次并重悬于1％甲醛中。使用FACSCalibur流式细胞计数器(BDBiosciences)通过FACSTM分析样品的抗体与FcRn的结合能力。每个突变体的平均通路荧光(Mean channel fluorescence)(MCF)使用Excel(Microsoft
Figure 10003_77
Corporation)作图。
如上所述，纯化的OST577-IgG2M3和OST577-IgG1突变抗体与各自的野生型抗体比较与恒河猴FcRn的结合能力，然后在使用细胞系NS0 RhFcRn，克隆R-3进行的单点结合与释放实验中在各种pH值处释放。
结果：
使用在其表面稳定表达人FcRn的转染NSO细胞系确定了野生型OST577-IgG2M3或OST577-IgG1抗体和其各种突变体与人FcRn的结合特性。为证实突变抗体是特异性地与转染的NSO细胞系上的人FcRn结合，而不是通过一些其它受体或未知的机制进行的，比较测试了抗体与未转染的NS0细胞和稳定表达人FcRn的转染NS0细胞系的结合能力。如上所述，细胞与亚饱和浓度的抗体在pH6.0的FBB中孵育。并通过FACSTM分析结合。如图13所示，结果表明没有与亲本NS0细胞系的明显结合，这说明抗体是通过人FcRn与转染细胞特异地结合。
为证实本发明产生的各突变体是以生理相关的方式起作用，更进一步地检测了温度和pH对与人FcRn结合的作用。因为，初始的竞争性结合实验是在4℃进行，在更与生理相关的温度(37℃)重复该实验，结果表明突变体在此温度依然有活性。如上所述，浓度递增的未标记竞争抗体在有亚饱和浓度的标记OST577-IgG2M3抗体的情况下与表达人FcRn的细胞于37℃在pH6.0的FBB中孵育。如图14所示，结果表明在37℃抗体保留了其与人FcRn结合的相关模式。
IgG与FcRn的结合已知是pH依赖性的：IgG在pH6.0处与结合强烈，但在pH8.0处结合弱。为设计具有较长血清半衰期的突变抗体，需要增加在pH6.0处与FcRn结合的能力而在pH8.0处维持从FcRn释放的pH依赖性。为确认结合是pH依赖性的，测试了抗体与稳定表达人FcRn的转染NSO细胞系的结合能力，然后在pH6.0-8.0处释放。如上所述，细胞与亚饱和浓度的抗体在pH6.0的FBB中孵育，用pH6.0、6.5、7.0、7.5或8.0的FBB洗涤并用FACSTM分析结合能力。如图15A所示，结果表明具有T250E、T250Q、M428F、M428L、T250E/M428F、T250Q/M428F或T250Q/M428L突变的修饰OST577-IgG2M3抗体在pH6.0处均表现出与人FcRn的强烈结合，而当pH值增加至8.0时结合能力下降。如图15B所示，结果表明具有T250E、M428F或T250E/M428F突变的修饰OST577-IgG1抗体在pH6.0处均表现出与人FcRn的强烈结合，而当pH值增加至8.0时结合能力下降。具有T250D突变的OST577-IgG1抗体在pH6.0处表现出与人FcRn较弱的结合能力(与野生型相比)，当pH值增加至8.0时结合能力下降。如图15C所示，结果表明具有T250Q、M428L或T250Q/M428L突变的修饰OST577-IgG1抗体在pH6.0处均表现出与人FcRn的强烈结合，而当pH值增加至8.0时结合能力下降。这些结果表明抗体与人FcRn的结合确实是pH-依赖性的。
类似地，测试了抗体与稳定表达恒河猴FcRn的转染NSO细胞系的结合能力，然后在pH6.0-8.0处释放。如图15D所示，结果表明具有T250E、T250Q、M428F、M428L、T250E/M428F、T250Q/M428F或T250Q/M428L突变的修饰OST577-IgG2M3抗体在pH6.0处均表现出与恒河猴FcRn的强烈结合，而当pH值增加至8.0时结合能力下降。如图15E所示，结果表明具有T250Q、M428L或T250Q/M428L突变的修饰OST577-IgG1抗体在pH6.0处均表现出与恒河猴FcRn的强烈结合，而当pH值增加至8.0时结合能力下降。这些结果表明抗体与恒河猴FcRn的结合也是pH-依赖性的。
                         实施例8
该实施例描述了对IgG2M3和IgG1突变体其它性能的确认。
细胞培养：
人Burkitt’s淋巴瘤细胞系Raji(美国模式培养物保藏所(American TypeCulture Collection))维持于含有10％FBS(HyClone)和1％青霉素-链霉素(LifeTechnologies
Figure 10003_79
)以及L-谷氨酰胺(Bio WhittakerTM)的RPMI 1640中。
抗原结合实验：
在竞争性结合ELISA中确认了OST577野生型和突变抗体的抗原结合能力。两块ImmulonTM板(DYNEXTechnologies)于4℃用1.0μg/ml的重组乙型肝炎表面抗原(HBsAg)(Advanced Immuno Chemical，Inc.，Long Beach，CA)覆盖过夜。第二天用EWB洗涤板并于室温以300μl/孔用TBS中的SuperBlock
Figure 10003_81
封闭缓冲液(Pierce Chemical Company)封闭30分钟。用EWB洗涤板，并向每孔加入其中预混合的生物素化的OST577-IgG2M3抗体(0.25μg/ml)和竞争OST577-IgG2M3抗体(从33μg/ml到0.033μg/ml连续两倍稀释)或预混合的生物素化OST577-IgG1抗体(0.25μg/ml)和竞争OST577-IgGl抗体(从67μg/ml到0.067μg/ml两倍连续稀释)的100μl EB。板于室温孵育1小时，然后用EWB洗涤并以100μl/well加入在EB中浓度为1μg/ml的链霉抗生物素蛋白-HRP偶联物(Pierce Chemical Company)。于室温孵育30分钟后，用EWB洗涤板，然后以100μl/孔加入ABTS过氧化物酶底物/过氧化物酶溶液B(Kirkegaard & PerryLaboratories)。用100μl/孔的2％草酸终止反应，并使用VERSAmaxTM微滴定板读数仪(Molecular Devices Corporation)测量415nm的吸光度。
Hu1D10-IgG2M3野生型和突变抗体的抗原结合活性在使用Raji细胞的FACSTM结合实验中确认，该细胞表达由Hu1D10(Kostelny等.，(2001)，同上)识别的HLA-DR β链的等位体。每次测试的约2.5×105个细胞在pH7.4的FBB中洗涤一次，然后重悬在Hu1D10-IgG2M3抗体(从60μg/ml到0.027μg/ml三倍连续稀释)的140μl pH7.4的FBB中。细胞在冰上孵育1小时，在pH7.4的FBB中洗涤两次，并重悬于其中山羊F(ab′)2抗-人κRPE-偶联抗体(SouthernBiotechnology Associates，Inc.)稀释至10μg/ml的25μl、pH7.4的FBB中。于黑暗环境中在冰上孵育30分钟后，细胞在pH7.4的FBB洗涤两次并重悬于1％甲醛中。使用FACSCalibur流式细胞计数器(BDBiosciences)通过FACSTM分析样品的抗体与HLA-DR β链等位体的结合能力。
类似地，Hu1D10-IgG1野生型和突变抗体的抗原结合活性在使用Raii细胞的FACSTM结合实验中确认。每次测试的约2.0×105个细胞在pH7.4的FBB中洗涤一次，然后重悬在Hu1D10-IgG1抗体(从25μg/ml到12.5μg/ml两倍连续稀释，然后从12.5μg/ml到0.0020μg/ml三倍连续稀释)的100μl pH7.4的FBB中。Hu1D10-IgG1抗体(Co等.，Proc.Natl.Acad.Sci.88：2869-2873(1991))的连续稀释液以如上所述方式制备并用作阴性对照。细胞和抗体在冰上孵育1小时，在pH7.4的FBB中洗涤两次，并重悬于其中山羊F(ab′)2抗-人IgG FITC-偶联抗体(Southern Biotechnology Associates，Inc.)稀释至20μg/ml的25μl、pH7.4的FBB中。于黑暗环境中在冰上孵育30分钟后，细胞在pH7.4的FBB洗涤两次并重悬于1％甲醛中。使用FACSCalibur流式细胞计数器(BD
Figure 10003_84
Biosciences)通过FACSTM分析样品的抗体与HLA-DR β链等位体的结合能力。
ADCC实验：
Hu1D10野生型和突变抗体的抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性按照公布的方法(Shields等.，同上)测量乳酸脱氢酶(LDH)释放量来确认，该方法通过使用人外周血单核细胞(PBMC)作为效应子和Raji细胞作为靶位。PBMC使用Ficoll-PaquePlus梯度仪(Amersham BiosciencesTM Corporation)从新鲜全血制备并以8×106细胞/ml重悬于实验培养基(RPMI1640，1％BSA)中。Raji细胞在实验培养基中洗涤三次并以0.4×106细胞/ml重悬于实验培养基中。Hu1D10野生型和突变抗体稀释至4μg/ml、0.25μg/ml和0.016μg/ml。Raji细胞(50μl/孔)和Hu1D10抗体(50μl/孔，即，每次测试200ng、每次测试12.5ng或每次测试0.8ng)组合置于Falcon 96-孔U形底实验平板(BDBiosciences)的孔中并于室温孵育30分钟。将PBMC(100μl/孔，即，40∶1效应子/靶细胞比)加入调理细胞并于37℃在CO2孵育箱内孵育4小时。非抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(AICC)通过在无抗体的条件下孵育效应子和靶细胞来测量。自发的释放通过在无抗体的条件下孵育靶细胞(SR靶细胞)和效应细胞(SR效应子)来测量。最大的释放量(MR)通过向靶细胞加入2％Triton X-100来测量。轻柔地将板离心并将上清液(100μl/孔)转移至Falcon 96-孔平底板。LDH活性通过在室温将上清液与来自细胞毒性检测试剂盒(Roche Diagnostics Corporation)的100μl/孔的LDH反应混合物孵育30分钟来测量。按50μl/孔加入1N HCl终止反应并用VERSAmaxTM微滴定板读数仪(Molecular Devices Corporatione
Figure 10003_87
)测量490nm处的吸光度。细胞毒性百分比以(LDH释放量样品-SR效应子-SR靶细胞)/(MR靶细胞-SR靶细胞)×100计算。
结果：
野生型和突变体OST577和Hu1D10抗体与其各自的抗原的结合特性使用合适的结合实验确认。如上所述，OST577抗体与HbsAg的结合能力在竞争性ELISA中确定。如图16A所示，野生型和突变体OST577-IgG2M3抗体与HBsAg的结合能力基本上相同。类似地，如图16B所示，野生型和突变体OST577-IgG1抗体与HBsAg的结合能力基本上相同。
如上所述，Hu1D10抗体与HLA-DR β链的等位体的结合能力在FACS结合实验中确定。如图17A所示，野生型和突变体Hu1D10-IgG2M3抗体与HLA-DR β链的等位体的结合能力基本上相同。类似地，如图17B所示，野生型和突变体Hu1D10-IgG1抗体与HLA-DR β链的等位体的结合能力基本上相同。这些结果表明，如预期的一样，在位置250和428处描述的突变未影响抗原结合，
Hu1D10野生型和突变抗体的ADCC活性在使用人PBMC作为效应子和Raji细胞作为靶位的LDH释放实验中确认。如图18A所示，使用携带有纯合158V/V FcγRIII等位体的供体，双重突变体(T250Q/M428L)Hu1D10-IgG1抗体的ADCC活性与其野生型抗体很相似，而单一突变体(M428L)Hu1D10-IgG1抗体与野生型抗体相比其ADCC活性略有下降。如预期的一样，野生型和突变体Hu1D10-IgG2M3抗体缺乏ADCC活性。类似地，如图18B所示，使用携带有纯合158F/F FcγRIII等位体的供体，双重突变体(T250Q/M428L)Hu1D10-IgGI抗体的ADCC活性与其野生型抗体很相似，而单一突变体(M428L)Hu1D10-IgG1抗体与野生型抗体相比其ADCC活性有一定下降。野生型和突变型Hu1D10-IgG2M3抗体缺乏ADCC活性。这些结果表明本发明描述的T250Q/M428L突变未影响IgG1形式的抗体的ADCC活性，而M428L突变使IgG1形式的ADCC活性略有下降。位置250和428处描述的突变未影响IgG2M3形式的抗体的ADCC活性。
                          实施例9
该实施例描述体内和体外的血清半衰期实验。
期望在体外具有较高(或较低)的与FcRn亲和力的人IgG抗体在体内也分别具有较长(或较短)的血清半衰期。人IgG突变体与FcRn的亲和力可在体外通过各种方法检测，如使用与合适的生物传感器芯片偶联的可溶性FcRn的表面胞质团共振(SPR)或者也可通过使用表达在转染细胞表面的FcRn的竞争性结合实验进行。用于体外亲和力实验的FcRn可是鼠源的、恒河猴源的或人源的。具有所需性能的人IgG-突变体的血清半衰期可通过按每公斤体重1-10mg抗体的剂量注射入合适的实验动物(例如，小鼠或猴子)或人来测量，然后在横跨抗体预期的血清半衰期的各个时间间隔抽取血清样品，并通过合适的技术(例如ELISA)分析样品中是否有完整的IgG。
恒河猴的药代动力学研究：
名为“OST577的三个变体的药代动力学比较”的非GLP药代动力学研究在加利福尼亚大学，戴维斯分校的加利福尼亚国家灵长类研究中心(CNPRC)进行。12只雄性恒河猴按照体重随机分至3个研究组中的一组。组成每个研究组的4只动物均以1mg/kg的单一剂量野生型或OST577的两种变体中的一种静脉给药超过15分钟。OST577抗体是野生型OST577-IgG2M3，含有单一突变M428L的OST577-IgG2M3的一种变体，和含有双重突变T250Q/M428L的OST577-IgG2M3的另一个变体。所有的三个抗体是由转染的Sp2/0细胞表达并如实施例5所述的方法纯化。
在第0天给药之前抽取血液样品，在给药后的1小时和4小时抽取血液样品，并在第1、7、14、21、28、42和56天抽取血液样品。在每个时间点，从静脉抽取4ml血液，制备血清，分成两等份冷冻并保存于-20℃待用。对于血清化学和血液学测定，在研究前16天、第0天给药前和在第56天研究结束时抽取血液样品。
ELISA：
使用定性实验通过ELISA确定OST577-IgG2M3抗体在恒河猴血清样品中的浓度。富集的正常恒河猴血清(PNRS)得自CNPRC。同一批的PNRS用于制备校正液、阳性血清对照和恒河猴血清样品的预稀释液。校正液通过在PNRS中标准稀释OST577-IgG2M3至3000、1500、750、375、187.5、93.75、46.88、23.44和0ng/ml来制备，校正液于室温平衡2小时，并以等份冷冻于-20℃。阳性血清对照通过在PNRS中掺加OST577-IgG2M3制备，其浓度对于低阳性血清对照是0.2μg/ml，对于中等阳性血清对照是0.4μg/ml，对于高阳性血清对照是0.8μg/ml，阳性血清对照于室温平衡2小时并以等份冷冻于-20℃。每只动物的前剂量血清样品用作阴性血清对照。
两块ImmulonTM平板(DYNEXTechnologies，Inc.)于2-8℃以100μl/孔用在PBS中浓度为1.0μg/ml的小鼠抗-OST577-IgG1独特型单克隆抗体(OST577-γ1抗-id，Protein Design LabsTM，Inc.)覆盖过夜。第二天，平板以300μl/孔的PBS/吐温(磷酸盐缓冲盐水，0.1％吐温20)洗涤三次，在纸巾上扣干，于室温以300μl/孔的PBS中的SuperBlock
Figure 10003_89
封闭缓冲液(Pierce Chemical Company)封闭60±5分钟。校正液、阳性和阴性血清对照与血清样品解冻并在使用前回暖至室温。校正液、阳性和阴性血清对照以1∶10在PBS中的SuperBlock
Figure 10003_90
封闭缓冲液中稀释。血清样品在PNRS中适当地预稀释(1∶10到1∶80)，然后在PBS中的SuperBlock封闭缓冲液中以1∶10稀释。平板以300μl/孔的PBS/吐温洗涤三次，在纸巾上扣干。然后稀释的校正液、阳性和阴性血清对照与血清样品以100μl/孔加入双复孔并于室温孵育60±5分钟。平板以300μl/孔的PBS/吐温洗涤三次，在纸巾上扣干。山羊抗-人λ轻链HRP-偶联的抗体(Southern BiotechnologyAssociates，Inc.)以1∶1000在PBS/BSA/吐温(磷酸盐缓冲盐水，0.5％牛血清白蛋白，0.1％吐温20)中稀释来制备，以100μl/孔加入并于室温孵育60±5分钟。平板以300μl/孔的PBS/吐温洗涤三次，在纸巾上扣干。ABTS过氧化物酶底物/过氧化物酶溶液B(Kirkegaard & Perry Laboratories)以100μl/孔加入，并孵育7±1分钟。以100μl/孔加入底物终止溶液(2％草酸)来终止反应的进行。加入底物终止溶液后的30分钟内使用VERSAmaxTM微滴定板读数仪(MolecularDevices Corporation
Figure 10003_92
)测量415nm处的吸光度。
使用得自校正液的平均吸光度值并使用SOFTmaxPRO，4.0版(MolecularDevices Corporatione
Figure 10003_94
)将数据应用于四参数的对数回归曲线来产生校正曲线。从得自校正液的每个吸光度值中减去阴性血清对照(即，每只动物的前剂量样品平均值)的平均吸光度值。从每个得自阳性血清对照的吸光度值中减去得自阴性血清对照的每个吸光度值确定阳性血清对照的浓度。对应于得到的平均吸光度值的浓度通过内插法从校正曲线获得。血清样品的浓度通过以下方法获得：从每个样品的吸光度值中减去阴性血清对照的平均吸光度值，计算得到吸光度值的平均值，通过内插法从校正曲线得到对应于平均吸光度值的浓度并将所得到的浓度乘以预稀释因子(如果有的话)来得到每个样品的最终浓度。
预计的该实验的量为0.10-0.90μg/ml。当符合以下两个条件时，该实验可认为是合适的：(1)该量范围内的所有三个校正液的平均返算(back-calculated)浓度在其标称值的20％之内；和(2)6个阳性血清对照中的4个的平均计算结果在其标称值的30％以内，并且每个浓度水平的至少一个平均结果在其标称值的30％以内。不符合上述标准的平板数据弃用。当单个血清样品的数据符合以下三种条件之一即弃用：(1)双复孔的吸光度值之间相差超过40％；(2)平均计算浓度低于实验的定量下限(LLOQ)(0.10μg/ml)；(3)平均计算浓度高于实验的定量上限(ULOQ)(0.90μg/ml)。
结果：
血清抗体浓度的数据使用WinNonlin
Figure 10003_95
Enterprise Edition，3.2版(PharsightCorporation，Mountain View，CA)应用于两区室模型。该模型假定了第一次序分布率和第一次序消除率并很好地符合这些数据。模型数据(以每组的基础药代动力学参数的几何平均值为基础模拟)和观察到的平均血清抗体浓度(μg/ml)以及每组四只动物的标准偏差使用GraphPad Prism
Figure 10003_97
3.02版(GraphPadTMSoftware，Inc.)以时间(注射后的天数)的函数作图。如图19所示，这些数据表明OST577-IgG2M3的M428L和T250Q/M428L变体的平均血清抗体浓度在所有时间点均比野生型OST577-IgG2M3维持于较高的浓度。
使用WinNonlinEnterprise Edition，3.2版(PharsightCorporation)从数据中计算各种药代动力学参数。使用GraphPad Prism
Figure 10003_100
3.02版(GraphPadTMSoftware，Inc.)进行这些药代动力学参数的统计学分析。如表9所示，三个测试组中的最大平均血清抗体浓度(Cmax)非常相似，这表明施用的抗体以相似的方式分布于循环系统中。所以，分布阶段后突变型IgG2M3抗体的较高的抗体浓度可归因于其在血清中保留的时间增加了。对平均清除率(CL)的分析表明情况是这样的。与野生型OST577-IgG2M3(0.144±0.047ml/hr/kg)相比，M428L变体的平均CL(每单位时间清除的血清抗体的体积)(0.0811±0.0384ml/hr/kg；p＝0.057)约低1.8倍，T250Q/M428L变体(0.0514±0.0075ml/hr/kg；p＝0.029)的平均CL约低2.8倍(表9)，这表明与野生型相比，OST577-IgG2M3M428L和T250Q/M428L变体从恒河猴循环系统中的清除率有显著下降。
通过计算其它参数进一步分析了OST577-IgG2M3变体的PK分布(表9)。既然AUC(曲线以下的面积)与CL成反比，那么相比于野生型OST577-IgG2M3(7,710±3,110hr*μg/ml)，M428L变体的平均AUC(从时间0点外推至无限的浓度-时间曲线以下的面积)(15,200±8,700hr*μg/ml；p＝0.057)约高2倍，T250Q/M428L变体的平均AUC(19,800±2,900hr*μg/ml；p＝0.029)约高2.6倍(表9)，这表明与野生型相比，OST577-IgG2M3M428L和T250Q/M428L的总暴露有显著的增加。
最后，与野生型OST577-IgG2M3(351±121小时)相比，M428L变体的平均清除(β-阶段)半衰期(642±205小时)约高1.8倍，T250Q/M428L变体的(652±28小时；p＝0.029)约高1.9倍(表9)。该项研究中野生型OST577-IgG2M3的清除半衰期与以前恒河猴的PK研究中OST577-IgG1(324±85小时)的清除半衰期(Ehrlich等.，同上)相似。
                               表9
                                      名字a(IgG2M3)                                       Cmaxb(μg/ml)                                       CLc(ml/hr/kg)                                       AUCd(hr*μg/ml)                                       清除半衰期e(小时)
                                      野生型                                       36.7±12.8                                       0.144±0.047                                       7710±3110                                       351±121
                                      M428L                                       36.5±20.1                                       0.0811*±0.0384                                       15200*±8700                                       642±205
                                      T250Q/M428L                                       39.9±6.8                                       0.0514*±0.0075                                       19800*±2900                                       652*±28
a对每个突变体，第一个字母表示野生型氨基酸，数字表示按照EU索引(Kabat等.，同上)的位置，第二个字母表示突变的氨基酸。
bCmax值(±S.D.)以μg/ml表示并如实施例9所示使用WinNonlin从PK数据计算。
cCL值(±S.D.)以ml/hr/kg表示并如实施例9所示使用WinNonlin从PK数据计算。
dAUC值(±S.D.)以hr*μg/ml表示并如实施例9所示使用WinNonlin从PK数据计算。
e清除半衰期值(±S.D.)以小时表示并如实施例9所示使用WinNonlin从PK数据计算。
*表示在野生型和每个突变体组之间有显著的区别(p＜0.060)。如实施例9所示使用GraphPad Prism进行Mann-Whitney测试。
                       实施例10
该实施例描述了将实施例9所述的体内和体外血清半衰期实验应用于IgG1抗体突变体。
恒河猴药代动力学研究：
名为“OST577的两个变体的药代动力学比较”的非GLP药代动力学研究在加利福尼亚大学，戴维斯分校的加利福尼亚国家灵长类研究中心(CNPRC)进行。8只雄性恒河猴按照体重随机分至两个研究组中的一组。组成每个研究组的4只动物均以1mg/kg的单一剂量的野生型或OST577变体静脉给药超过15分钟。OST577抗体是野生型OST577-IgG1，和含有双重突变T250Q/M428L的OST577-IgG1的一种变体。两种抗体是由转染的Sp2/0细胞表达并如实施例5所述的方法纯化。
在第0天给药之前抽取血液样品，在给药后的1小时和4小时抽取血液样品，并在第1、7、14、21、28、42和56天抽取血液样品。在每个时间点，从静脉抽取4ml血液，制备血清，分成两等份冷冻并保存于-20℃待用。为了血清化学和血液学测定，在第0天给药前和在第56天研究结束时抽取血液样品。
ELISA：
使用确认实验通过ELISA来确定OST577-IgG1抗体在恒河猴血清样品中的浓度。富集的正常恒河猴血清(PNRS)得自CNPRC。同一批的PNRS用于制备校正液、阳性和阴性血清对照和恒河猴血清样品的预稀释液。校正液通过在PNRS中标准稀释OST577-IgG1至3200、1600、800、400、200、100、50、25和0ng/ml来制备，校正液于室温平衡2小时，并以等份冷冻于-80℃。阳性血清对照通过在PNRS中掺加OST577-IgG1制备，其浓度对于低阳性血清对照是0.2μg/ml，对于中等阳性血清对照是0.4μg/ml，对于高阳性血清对照是0.8μg/ml，阳性血清对照于室温平衡2小时并以等份冷冻于-80℃。PNRS用作阴性血清对照。
两块ImmulonTM平板(DYNEX
Figure 10003_101
Technologies，Inc.)于2-8℃以100μl/孔用在PBS中浓度为1.0μg/ml的小鼠抗-OST577-IgG1独特型单克隆抗体(OST577-γ1抗-id，Protein Design LabsTM，Inc.)覆盖过夜。第二天，平板用300μl/孔的PBS/吐温(磷酸盐缓冲的盐水，0.1％吐温20)洗涤三次，在纸巾上扣干，于室温以300μl/孔的PBS中的SuperBlock封闭缓冲液(Pierce Chemical Company)封闭60±5分钟。校正液、阳性和阴性血清对照与血清样品解冻并在使用前回暖至室温。校正液、阳性和阴性血清对照以1∶10在PBS中的SuperBlock
Figure 10003_103
封闭缓冲液中稀释。血清样品在PNRS中适当地预稀释(1∶5到1∶80)，然后在PBS中的SuperBlock
Figure 10003_104
封闭缓冲液中以1∶10稀释。平板用300μl/孔的PBS/吐温洗涤三次，在纸巾上扣干。然后稀释的校正液、阳性和阴性血清对照与血清样品以100μl/孔加双复孔并于室温孵育60±5分钟。平板以300μl/孔的PBS/吐温洗涤三次并在纸巾上扣干。山羊抗-人λ轻链HRP-偶联的抗体(Southem BiotechnologyAssociates，Inc.)以1∶1000在PBS/BSA/吐温(磷酸盐缓冲的盐水，0.5％牛血清白蛋白，0.1％吐温20)中稀释来制备，以100μl/孔加入并于室温孵育60±5分钟。平板以300μl/孔的PBS/吐温洗涤三次并在纸巾上扣干。ABTS过氧化物酶底物/过氧化物酶溶液B(Kirkegaard & Perry Laboratories)以100μl/孔加入，并孵育7±1分钟。以100μl/孔加入底物终止溶液(2％草酸)来终止反应的进行。加入底物终止溶液后的30分钟内使用VERSAmaxTM微滴定板读数仪(MolecularDevices Corporation)测量415nm处的吸光度。
使用得自校正液的平均吸光度值并使用SOFTmax
Figure 10003_106
PRO，4.0版(MolecularDevices Corporatione)将数据应用于四参数的对数回归曲线来产生校正曲线。将得自0.0ng/ml校正液的平均吸光度值从得自剩余校正液的每个吸光度值中减去。从每个得自阳性血清对照的吸光度值中减去得自阴性血清对照的每个吸光度值确定阳性血清对照的浓度。对应于得到的平均吸光度值的浓度通过内插法从校正曲线获得。血清样品的浓度通过以下方法获得：从每个研究样品的吸光度值中减去合适的前剂量样品的平均吸光度值，计算得到吸光度值的平均值，通过内插法从校正曲线得到对应于平均吸光度值的浓度并将所得到的浓度乘以预稀释因子(如果有的话)来得到每个样品的最终浓度。
预计的该实验的量为0.10-0.90μg/ml。当符合以下两个条件时，该实验可认为是合适的：(1)在该量的范围内所有四个校正液的平均返算(back-calculated)浓度在其标称值的20％之内；和(2)6个阳性血清对照中的4个的平均计算结果在其标称值的30％以内，并且每个浓度水平的至少一个平均结果在其标称值的30％以内。不符合上述标准的平板数据弃用。当单个血清样品的数据符合以下两种条件之一即弃用：(1)平均计算浓度低于实验的定量下限(LLOQ)(0.10μg/ml)；(2)平均计算浓度高于实验的定量上限(ULOQ)(0.90μg/ml)。如果双复孔的吸光度值之间相差超过40％，样品在第二个独立实验中再次测试。如果有疑问的样品的第二个实验平均计算结果在第一个实验的平均计算结果的15％以内，使用第一个实验的平均计算结果。否则，样品在第三个独立实验中再次测试，计算所有三次实验的平均值，除非有一个值能在溢出测试中被排除。在这种情况中，报道剩余两个数据的平均值。
结果：
血清抗体浓度的数据使用WinNonlin
Figure 10003_108
Enterprise Edition，3.2版(Pharsight
Figure 10003_109
Corporation，Mountain View，CA)应用于两区室模型。该模型假定了第一次序分布率和第一次序消除率并很好地符合这些数据。模型数据(以每组的基础药代动力学参数的中间值为基础模拟)和观察到的平均血清抗体浓度(μg/ml)以及每组四只动物的标准偏差使用GraphPad Prism
Figure 10003_110
3.02版(GraphPadTM Software，Inc.)以时间(注射后的天数)的函数作图。如图20所示，这些数据表明OST577-IgG1的T250Q/M428L变体的平均血清抗体浓度在所有时间点均比野生型OST577-IgG1维持于较高的浓度。
使用WinNonlin
Figure 10003_111
Enterprise Edition，3.2版(PharsightCorporation)从数据中计算各种药代动力学参数。使用GraphPad Prism
Figure 10003_113
3.02版(GraphPadTMSoftware，Inc.)进行这些药代动力学参数的统计学分析。如表10所示，两个测试组之间的最大平均血清抗体浓度(Cmax)非常相似，这表明施用的抗体以相似的方式分布于循环系统中。所以，分布阶段后突变体IgG1抗体的较高的抗体浓度可归因于其在血清中保留的时间增加了。对平均CL的分析表明是这种情况。与野生型OST577-IgG1(0.190±0.022ml/hr/kg)相比，T250Q/M428L变体的平均CL(0.0811±0.0191ml/hr/kg；p＝0.029)约低2.3倍(表10)，这表明与野生型相比，OST577-IgG1250Q/M428L变体从恒河猴循环系统中的清除率有显著下降。
通过计算其它参数进一步分析了OST577-IgG2M3变体的PK分布(表10)。相比于野生型OST577-IgG1(5,320±590hr*μg/ml)，T250Q/M428L变体的平均AUC(12,900±3,000hr*μg/ml；p＝0.029)约高2.4倍(表10)，这表明与野生型相比，OST577-IgG1T250Q/M428L的总暴露有显著的增加。
最后，与野生型OST577-IgG1(336±34小时)相比，T250Q/M428L变体的平均清除(β-阶段)半衰期(838±187小时；p＝0.029)约高2.5倍(表10)。该项研究中野生型OST577-IgG1的清除半衰期与以前恒河猴中的PK研究中OST577-IgG1(324±85小时)的(Ehrlich等.，同上)相似。
                               表10
                                      名字a(IgG2M3)                                       Cmaxb(μg/ml)                                       CLc(ml/hr/kg)                                       AUCd(hr*μg/ml)                                       清除半衰期e(小时)
                                      野生型                                       26.0±4.1                                       0.190±0.022                                       5320±590                                       336±34
                                      T250Q/M428L                                       29.1±3.7                                       0.0811*±0.0191                                       12900*±3000                                       838*±187
a对每个突变体，第一个字母表示野生型氨基酸，数字表示按照EU索引(Kabat等.，同上)的位置，第二个字母表示突变的氨基酸。
bCmax值(±S.D.)以μg/ml表示并如实施例10所示使用WinNonlin从PK数据计算。
cCL值(±S.D.)以ml/hr/kg表示并如实施例9所示使用WinNonlin从PK数据计算。
d AUC值(±S.D.)以hr*μg/ml表示并如实施例10所示使用WinNonlin从PK数据计算。
e清除半衰期值(±S.D.)以小时表示并如实施例10所示使用WinNonlin从PK数据计算。
*表示在野生型和每个突变体组之间有显著的区别(p＜0.060)。如实施例10所示使用GraphPad Prism进行Mann-Whitney测试。
                      实施例11
该实施例描述了将实施例6和7中所述的各种结合分析应用于IgG3和IgG4抗体的突变体。
诱变：
使用重叠-延伸PCR方法(Higuchi，同上)在Hu1D10-IgG3重链的位置428处，或在Hu1D10-IgG4重链的位置250和428处(按照Kabat等的EU索引编号，同上)产生定点氨基酸取代。在Hu1D10-IgG3重链中产生一个M428L突变体。在Hu1D10-IgG4重链中产生M428L和T250QM428L的突变体。
转染：
如实施例1和2所详述的，野生型或突变体Hu1D10-IgG3或Hu1D10-IgG4重链表达载体和pVk-Hu1D10轻链表达载体共转染进人肾细胞系293-H(LifeTechno1ogies
Figure 10003_114
)。如实施例5所述，Hu1D10-IgG3或Hu1D10-IgG4表达载体也和pVk-Hu1D10表达载体稳定地共转染进Sp2/0细胞。为稳定地在Sp2/0中转染，用Fsp1使IgG3表达载体线形化；然而，因为pHuHC.g4.Tt.D-Hu1D10中有两个FspI位点，使用BstZ171使IgG4表达载体线形化。
抗体纯化：
如实施例5所述，含有IgG4的培养上清液通过ELISA定量、通过离心收集、无菌过滤并通过蛋白质A亲和层析纯化。
如实施例5所述，含有IgG3的培养上清液通过ELISA定量、通过离心收集、无菌过滤。通过加入1/75体积pH8.0的1M Tris-HCl调节过滤的上清液的pH。上清液在用pH7.0的20mM磷酸钠预平衡的1ml HiTrap
Figure 10003_115
蛋白质G HP柱(Amersham BiosciencesTM Corporation)展开。用相同的缓冲液洗柱并用pH2.7的100mM甘氨酸-盐酸洗脱结合的抗体。加入～1/50体积pH8.0的1M Tris-HCl中和后，富集的抗体组分在20mM柠檬酸钠、120mM NaCl，pH6.0中透析过夜或在5ml HiTrap
Figure 10003_116
脱盐柱(Amersham BiosciencesTM Corporation)上展开，该柱用20mM柠檬酸钠、120mM NaCl，pH6.0预平衡。收集来自脱盐柱的流出液，合并OD280＞0.1的组分并使用2ml Vivaspin
Figure 10003_117
浓缩器(50,000道尔顿MWCO)(Vivascience
Figure 10003_118
AG)浓缩至～0.5-1.0mg/ml。以相同方式浓缩经透析的物质。然后使用0.2μm Millex
Figure 10003_119
-GV微过滤器(Millipore
Figure 10003_120
Corporation)将样品过滤除菌。使用紫外分光光度计测量280nm的吸光度来确定纯化抗体的浓度(1mg/ml＝1.4A280)。
SDS-PAGE：
如实施例5所述，5μg纯化抗体的样品在还原性或非还原性条件下展开。
竞争性结合实验：
如实施例6所述，在表面表达重组的、GPI-连接的人或恒河猴FcRn的NSO转染子维持于霉酚酸(MPA)选择培养基(DMEM，10％FBS，1×HT MediaSupplement Hybri-Max
Figure 10003_121
(Sigma
Figure 10003_122
)，250μg/ml黄嘌呤(Sigma)，1μg/ml霉酚酸(LifeTechnologies
Figure 10003_124
)和2mM L-谷氨酰胺)或2× MPA选择培养基中。
每个纯化的Hu1D10-IgG3抗体的一系列稀释液和用生物素标记的人IgG(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)(Pierce Biotechnology，Inc.，Rockford，IL)竞争。测试抗体与在细胞系NSOHuFcRn(memb)，克隆7-3上的人FcRn和细胞系RhFcRn，克隆R-3上的恒河猴FcRn的结合能力。每次测试的约2K 105个细胞用pH8.0的FBB洗涤一次，用pH6.0的FBB洗涤一次，然后重悬于预混合的生物素化的人IgG抗体(8.3μg/ml)和Hu1D10-IgG3竞争抗体(从625μg/ml到0.305μg/ml的两倍连续稀释液)的120μl pH6.0的FBB中。细胞与抗体混合物在冰上孵育1小时，在pH6.0的FBB中洗涤两次并重悬于其中的链霉抗生物素蛋白-RPE偶联物(BioSource International)稀释至2.5μg/ml的25μl pH6.0的FBB中。于黑暗环境中在冰上孵育30分钟后，细胞在pH6.0的FBB中洗涤两次，并重悬于1％甲醛中。使用FACSCalibur流式细胞计数器(BDBiosciences)通过FACSTM分析样品的抗体与FcRn的结合能力。
每个纯化的Hu1D10-IgG4抗体的一系列稀释液和用生物素标记的人IgG(Sigma-Aldrich)(Pierce Biotechnology，Inc.，)竞争。如上述IgG3抗体进行的，测试IgG4抗体与在细胞系NSOHuFcRn(memb)，克隆7-3上的人FcRn和细胞系RhFcRn，克隆R-3上的恒河猴FcRn的结合能力。
pH-依赖性的结合与释放实验：
如实施例7所述，纯化的Hu1D10-IgG3和Hu1D10-IgG4突变抗体与各自的野生型抗体比较与人或恒河猴FcRn的结合能力，然后在使用细胞系NSOHuFcRn(memb)，克隆7-3和NSO RhFcRn，克隆R-3进行的单点结合与释放实验中在各种pH值处释放。为保证两个亚型(IgG3和IgG4)被同等地标记，其中的山羊F(ab′)2抗-人κFITC-偶联的抗体(Southhem Biotechnology Associates，Inc.)稀释至1.25μg/ml的25μlpH适当的FBB用作检测试剂。
结果：
在人γ3重链的位置428处和人γ4重链的位置250和428处(按照Kabat等的EU索引，同上)产生了氨基酸取代。选择这两个位置是基于对的人γ2M3重链的这些位置的突变进行的鉴定，这些位置的突变可导致与FcRn的结合能力增加。M428L突变体在人γ3重链中进行了评价。M428L突变体和T250Q/M428L突变体均在人γ4重链中进行了评价。
IgG3和IgG4Fc突变体作为抗-HLA-DR β链等位体抗体表达，其含有Hu1D 10的轻链和重链可变区(Kostelny等.，(2001)，同上)，人κ的轻链可变区(Hieter等.，(1980)，同上)，人IgG3(Huck等.，同上)和IgG4(Ellison等.，同上)各自的的重链恒定区。如上所述，合适的野生型或突变体重链载体与合适的轻链载体瞬时共转染进293-H细胞来表达Hu1D10单克隆抗体。瞬时转染后5-7天收集的培养上清液的ELISA分析表明抗体的典型表达水平为25ml上清液中5-25μg/ml。Hu1D10-IgG3或Hu1D10-IgG4抗体分别通过使用蛋白质G和蛋白质A亲和层析纯化得到的终产量约100-500μg。通过ELISA确定Hu1D10抗体在Sp2/0细胞中稳定表达的典型表达水平为30-100μg/ml。培养上清液中存在的约50-80％的抗体通过小规模蛋白质G或蛋白质A亲和层析获得。
纯化的抗体通过在非还原或还原条件下的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)来定性。非还原条件下的SDS-PAGE分析表明纯化的抗体具有约150-170kD的分子量(数据未显示)；还原条件下的分析表明纯化的抗体由分子量约为50-60kD的重链和分子量约为25kD的轻链组成(数据未显示)。纯化自稳定Sp/20转染子的抗体的SDS-PAGE分析得到的结果与用纯化自瞬时293-H转染子的抗体的结果类似。
使用在其表面稳定表达人FcRn的转染NS0细胞系确定了野生型Hu1D10-IgG3和Hu1D10-IgG4抗体及其各种变体与FcRn的相对结合能力。如上所述，在竞争性结合实验中测试纯化抗体的FcRn结合能力。浓度递增的未标记竞争抗体在有亚饱和浓度的生物素化的人IgG抗体(Sigma-Aldrich)的情况下与细胞在pH6.0的FBB中孵育。
野生型Hu1D10-IgG3和M428L突变体与人FcRn的结合能力在竞争性结合实验中测试。如表11所总结的，野生型Hu1D10-IgG3抗体的IC50是～15μg/ml，而M428L单一突变体的IC50是～2μg/ml。野生型Hu1D10-IgG4及其突变体与人FcRn的结合能力也在竞争性结合实验中测试。如表12所总结的，野生型Hu1D 10-IgG4抗体的IC50是～76μg/ml，而M428L单一突变体的IC50是～5μg/ml，T250Q/M428L双突变体的IC50是～1μg/ml。
野生型Hu1D10-IgG3和M428L突变体与恒河猴FcRn的结合能力在竞争性结合实验中测试。如表13所总结的，野生型Hu1D10-IgG3抗体的IC50是～14μg/ml，而M428L单一突变体的IC50是～3μg/ml。野生型Hu1D10-IgG4及其突变体与恒河猴FcRn的结合能力也在竞争性结合实验中测试。如表14所总结的，野生型Hu1D10-IgG4抗体的IC50是～98μg/ml，M428L单一突变体的IC50是～7μg/ml，而T250Q/M428L双重突变体的IC50是～1μg/ml。
IgG与FcRn的结合己知是pH-依赖性：在pH6.0时IgG与FcRn结合强烈，但在pH8.0时结合微弱。为设计具有延长的血清半衰期的突变抗体，需要增加在pH6.0处的与FcRn的结合能力而在pH8.0处维持pH依赖性的从FcRn释放。为确认结合是pH依赖性的，测试了抗体与稳定表达人FcRn的转染NSO细胞系的结合能力，然后在pH6.0-8.0处释放。如上所述，细胞与亚饱和浓度的抗体在pH6.0的FBB中孵育，用pH6.0、6.5、7.0、7.5或8.0的FBB洗涤并用FACSTM分析结合能力。如图21A所示，结果表明具有M428L突变的修饰Hu1D10-IgG3抗体在pH6.0处表现出与人FcRn的强烈结合，而当pH值增加至8.0时结合能力下降。如图21B所示，结果表明具有M428L或T250Q/M428L突变的修饰Hu1D10-IgG4抗体在pH6.0处均表现出与人FcRn的强烈结合，而当pH值增加至8.0时结合能力下降。这些结果表明IgG3和IgG4抗体与人FcRn的结合确实是pH-依赖性的。
类似地，测试了抗体与稳定表达恒河猴FcRn的转染NSO细胞系的结合能力，然后在pH6.0-8.0处释放。如图21C所示，结果表明具有M428L突变的修饰Hu1D10-IgG3抗体在pH6.0处均表现出与恒河猴FcRn的强烈结合，而当pH值增加至8.0时结合能力下降。如图21D所示，结果表明具有M428L或T250Q/M428L突变的修饰Hu1D10-IgG4抗体在pH6.0处均表现出与恒河猴FcRn的强烈结合，而当pH值增加至8.0时结合能力下降。这些结果表明抗体与恒河猴FcRn的结合也是pH-依赖性的。
                          表11
Figure G04815550519960329D000861
a对每个突变体，第一个字母表示野生型氨基酸，数字表示按照EU索引(Kabat等，同上)位置，第二个字母表示突变的氨基酸。
bn表示独立实验的数目。
cIC50值(±S.D.)如实施例11所述，以μg/ml表示(以终竞争抗体的浓度为基础)并通过在pH6.0的FBB中竞争性结合实验对生物素化的人IgG(Sigma-Aldrich)计算其值。
d以野生型Hu1D10-IgG3和突变体的IC50值之比计算的与人FcRn的相对结合能力。
                           表12
Figure G04815550519960329D000862
a对每个突变体，第一个字母表示野生型氨基酸，数字表示按照EU索引(Kabat等.，同上)位置，第二个字母表示突变的氨基酸。
bn表示独立实验的数目。
cIC50值(±S.D.)如实施例11所述，以μg/ml表示(以终竞争抗体的浓度为基础)并通过在pH6.0的FBB中竞争性结合实验对生物素化的人IgG(Sigma-Aldrich)计算其值。
d以野生型Hu1D10-IgG4和突变体的IC50值之比计算的与人FcRn的相对结合能力。
                           表13
Figure G04815550519960329D000871
a对每个突变体，第一个字母表示野生型氨基酸，数字表示按照EU索引(Kabat等.，同上)位置，第二个字母表示突变的氨基酸。
bn表示独立实验的数目。
cIC50值(±S.D.)如实施例11所述，以μg/ml表示(以终竞争抗体的浓度为基础)并通过在pH6.0的FBB中竞争性结合实验对生物素化的人IgG(Sigma-Aldrich)计算其值。
d以野生型Hu1D10-IgG3和突变体的IC50值之比计算的与人FcRn的相对结合能力。
                             表14
a对每个突变体，第一个字母表示野生型氨基酸，数字表示按照EU索引(Kabat等.，同上)d位置，第二个字母表示突变的氨基酸。
bn表示独立实验的数目。
cIC50值(±S.D.)如实施例11所述，以μg/ml表示(以终竞争抗体的浓度为基础)并通过在pH6.0的FBB中竞争性结合实验对生物素化的人IgG(Sigma-Aldrich)计算其值。
d以野生型Hu1D10-IgG4和突变体的IC50值之比计算的与人FcRn的相对结合能力。
                    实施例12
该实施例描述了将如实施例9和10所述的体内和体外血清半衰期实验应用于IgG3和IgG4抗体的突变体。
对IgG3和IgG4的突变体进行如实施例9和10所述的“恒河猴药代动力学研究”的方案来确认突变对体内血清半衰期和各种药代动力学参数的影响。
                      实施例13
该实施例描述了熟知的治疗性抗体的FcRn结合突变体的设计和生产，藉此延长(或降低)每个抗体的血清半衰期，从而改善患者的治疗方案。
达克力珠单抗：
达克力珠单抗是正在临床开发的用于大量自身免疫和炎性疾病适应症(包括哮喘、糖尿病、色素层炎、多发性硬化、类风湿性关节炎和溃疡性结肠炎)的人源化抗-CD25单克隆抗体。现在达克力珠单抗以Zenapax
Figure 10003_126
为商品名市售仅用于移植病症。
达克力珠单抗的轻链和重链可变区的氨基酸序列公开于美国专利号5,530,101，该文献纳入文中作为参考。
现在达克力珠单抗的临床实体是一种IgG1同种型抗体，然而，也可生产具有类似治疗特性的达克力珠单抗的IgG2M3同种型抗体。
为增加达克力珠单抗的血清半衰期，可用上述任何FcRn结合突变来修饰其恒定区氨基酸序列。例如，可使用以上实施例1-4所述的载体设计和诱变的方法在达克力珠单抗中产生T250Q/M428L突变。T250Q/M428L达克力珠单抗的序列描述于图22(SEQ ID NO：122)。
可使用如实施例5-7所述的体外结合实验方法或实施例9-10所述的体内实验方法来确定T250Q/M428L达克力珠单抗增加的血清半衰期。
期望T250Q/M428L达克力珠单抗提供未改变的达克力珠单抗的治疗性益处同时具有给药频率和剂量降低的优点。
如图22(SEQ ID NO：119-123)所述的在达克力珠单抗(IgG1同种型)恒定区序列的其它FcRn结合突变可按照以上实施例1-3的方法产生。以这些突变在上述OST577和Hu1D10抗体实施例中的效果为基础，期望这些突变也能如所需的影响达克力珠单抗的血清半衰期。
类似地，按照以上实施例1-4的方法也可在IgG2M3型的达克力珠单抗恒定区序列中产生如图22所示的(SEQ ID NO：124-128)FcRn结合突变。
方托力珠单抗：
方托力珠单抗是一种IgG1同种型的人源化抗-干扰素-γ(IFN-γ)单克隆抗体，也称为HuZAFTM。现在方托力珠单抗正临床开发用于克罗恩病的治疗。方托力珠单抗的可变区序列公开于美国专利号6,329,511，该文献纳入作为参考。如上述达克力珠单抗的一样，使用上述实施例1-4的方法使方托力珠单抗的恒定区序列发生如图23所示的突变(SEQ ID NOs：130-134)也可改变其血清半衰期。
维西力珠单抗：
维西力珠单抗是一种IgG2同种型的人源化抗-CD3单克隆抗体，也称为Nuvion
Figure 10003_127
。维西力珠单抗以在成熟的T细胞上形成抗原受体复合物的CD3分子为靶位。现在维西力珠单抗正临床开发用于治疗甾体不应性溃疡性结肠炎(steroid refractory ulcerative colitis)。如上述达克力珠单抗和方托力珠单抗的一样，使用上述实施例1-4的方法使维西力珠单抗的恒定区序列发生如图24所示的突变(SEQ ID NOs：136-140)也可改变其血清半衰期。
M200：
M200是定向于α5β1整连蛋白的嵌合IgG4抗体，正被开发为血管生成抑制剂用于治疗各种增殖性疾病。如上述达克力珠单抗、方托力珠单抗和维西力珠单抗的一样，使用上述实施例1-3的方法使M200的恒定区序列发生如图25所示的突变(SEQ ID NOs：142-146)也可改变其血清半衰期。
虽然参考目前优选的实施方案描述了本发明，应该了解的是在不背离本发明精神的情况下可做出各种修改。
所有公开、专利、专利申请和网站全文纳入作为参考，就好像每个单独的公开、专利、专利申请或网站明确而独立地全文纳入作为参考一样。

Claims (11)

1.一种具有相对于未修饰IgG类抗体其FcRn结合亲和力有所改变的修饰抗体，其中所述的未修饰的IgG类抗体含有人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型的重链恒定区，所述修饰抗体含有的重链恒定区中依照EU索引编号的氨基酸残基250和428不同于未修饰的IgG类抗体，且(a)所述重链恒定区的氨基酸残基250是谷氨酰胺，所述重链恒定区的氨基酸残基428是亮氨酸；或(b)所述重链恒定区的氨基酸残基250是谷氨酰胺，所述重链恒定区的氨基酸残基428是苯丙氨酸。
2.如权利要求1所述的修饰抗体，其特征在于，所述的未修饰的IgG类抗体含有人IgG2M3分子的重链恒定区。
3.如权利要求1所述的修饰抗体，其特征在于，所述的未修饰的IgG类抗体是人抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
4.如权利要求1所述的修饰抗体，其特征在于，所述修饰抗体在pH6.0处的FcRn结合亲和力高于pH7.4处的FcRn结合亲和力。
5.一种其恒定区与天然存在的IgG类抗体有至少95％相同的抗体，其中所述天然存在的抗体包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型的重链恒定区，且其中所述抗体的重链恒定区中依照EU索引编号的氨基酸残基250和428不同于所述天然存在的IgG类抗体，并且其中所述抗体相对于天然存在的抗体其体内血清半衰期增加了，其中(a)所述重链恒定区的氨基酸残基250是谷氨酰胺，所述重链恒定区的氨基酸残基428是亮氨酸；或(b)所述重链恒定区的氨基酸残基250是谷氨酰胺，所述重链恒定区的氨基酸残基428是苯丙氨酸。
6.如权利要求5所述的抗体，其特征在于，所述天然存在的IgG类抗体含有人IgG2M3分子的重链恒定区。
7.如权利要求5所述的抗体，其特征在于，所述天然存在的IgG类抗体是人抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
8.一种改变IgG类抗体的FcRn结合亲和力和/或血清半衰期的方法，所述方法包括：从依照EU索引编号的残基250和428处选择重链恒定区的至少两个氨基酸残基，并用不同于未修饰的抗体中的氨基酸取代所选择的残基，藉此改变抗体的FcRn结合亲和力和/或血清半衰期，其中未修饰的抗体是IgG类抗体，它含有人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型的重链恒定区，
其中(a)所述重链恒定区的氨基酸残基250是谷氨酰胺，所述重链恒定区的氨基酸残基428是亮氨酸；或(b)所述重链恒定区的氨基酸残基250是谷氨酰胺，所述重链恒定区的氨基酸残基428是苯丙氨酸。
9.一种生产和未修饰IgG类抗体相比FcRn结合亲和力改变的和/或血清半衰期改变的修饰的抗体的方法，包括：
(a)制备含有可操作地与DNA相连的合适启动子的表达载体，该DNA至少编码免疫球蛋白重链的恒定区，其中重链恒定区的选自依照EU索引编号的氨基酸残基250和428处的至少两个氨基酸残基被不同于未修饰的抗体的残基取代，其中所述未修饰IgG类抗体含有人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型的重链恒定区；
(b)用所述载体转化宿主细胞；和
(c)培养所述的转化宿主细胞来生产所述修饰的抗体，其中所述重链恒定区的氨基酸残基250是谷氨酰胺，所述重链恒定区的氨基酸残基428是亮氨酸；或所述重链恒定区的氨基酸残基250是谷氨酰胺，所述重链恒定区的氨基酸残基428是苯丙氨酸。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，还包括：制备含有可操作地与DNA相连的合适启动子的第二个表达载体，该DNA编码互补免疫球蛋白轻链；以及用所述第二个表达载体转化所述的宿主细胞。
11.如权利要求1所述的修饰抗体，它还包含达克力珠单抗的可变区，其中所述达克力珠单抗的可变区包含SEQ ID NO：118的成熟轻链可变区和SEQID NO：122的成熟重链可变区。
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