JP4437192B2 - 補体活性化阻害剤 - Google Patents
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Description
発明の分野
本発明は、D因子に特異的な阻害剤並びに補体系活性化の阻害及び第二経路補体活性化の阻害におけるこのような阻害剤の使用に関する。
【0002】
発明の背景
補体系は、免疫複合物の除去並びに感染物、外来抗原、ウイルス感染細胞及び腫瘍細胞に対する免疫応答において中心的な役割を果たす。しかしながら、補体はまた、病的炎症及び自己免疫疾患にも関与している。従って、補体カスケードの過度の又は制御できない活性化を阻害することは、これらの疾病又は症状を有する患者に対して臨床的な利益を提供し得る。
【0003】
補体系は、古典経路及び第二経路と呼ばれる2つの別個の活性化経路を包含する(V.M. Holers, In Clinical Immunology: Principles and Practice, R.R. Rich編、Mosby Press; 1996, 363-391)。古典経路は、通常、抗原−抗体複合物の形成により活性化されるカルシウム/マグネシウム−依存性カスケードである。第二経路は、ある感受性表面(例えば、酵母及び細菌の細胞壁多糖類、ならびにある種のバイオポリマー材料)上への沈着及びC3の活性化により活性化されるマグネシウム−依存性カスケードである。補体経路の活性化により、例えば、C3a、C4a及びC5aアナフィラトキシン並びにC5b-9膜攻撃複合物(MAC)のような補体タンパク質の生物学的活性断片が生じ、これらは、白血球走化性、マクロファージ、好中球、血小板、マスト細胞及び内皮細胞の活性化、並びに血管透過性、細胞溶解及び組織傷害を包含する炎症活性を媒介する。
【0004】
D因子は、第二補体経路の活性化に必須的な、高度に特異的なセリンプロテアーゼである。これは、C3bに結合したB因子を開裂し、第二経路のC3/C5コンベルターゼの活性成分であるC3b/Bb酵素を生成する。D因子は、阻害の適当な標的であるかもしれない。なぜなら、ヒトにおけるその血漿濃度が非常に低く(1.8μg/ml)、第二補体経路の活性化における律速酵素であることが示されているからである(P.H. LesavreとH.J. Muller-Eberhhard. J. Exp. Med., 1978; 148:1498-1510; J.E. Volanakis et al., New Eng. J. Med., 1985; 312: 395-401)。
【0005】
補体活性化のダウンレギュレーションは、動物モデル及び生体外試験において、例えば、全身性エリテマトーデス及び腎炎(Y. Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci.; 1996, 93: 8563-8568)、リウマチ性関節炎(Y. Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 1995; 92: 8955-8959)、心−肺バイパス及び血液透析(C.S. Rinder, J. Clin. Invest., 1995; 96: 1564-1572)、臓器移植における超急性拒絶(T.J. Kroshus et al., Transplantation, 1995; 60: 1994-1202)、心筋梗塞(J. W. Homeister et al., J. Immunol. 1993; 150: 1055-1064; H.F. Weisman et al., Science, 1990; 249: 146-151)、再潅流傷害(E.A. Amsterdam et al., Am. J. Physiol. 1995; 268: H448-H457)並びに成人呼吸窮迫症候群(R. Rabinovici et al., J. Immunol. 1992; 149: 1744-1750)のような数種類の疾病徴候を治療するのに有効であることが示されている。さらに、火傷、劇症喘息、アナフィラキシーショック、腸炎、じんま疹、血管性浮腫、血管炎、多発性硬化症、重症筋無力症、膜増殖性腎炎及びシェーグレン症候群を包含する他の炎症症状及び自己免疫/免疫複合物疾患と密接に関係している。
【0006】
発明の概要
本発明は、ヒトD因子に結合し、補体活性化の第二経路を包含するD因子補体活性化の機能活性をブロックする、抗体及びその断片を包含する。抗体及びその断片は、抗体分子、並びにFab、(Fab')2及びFvのような免疫グロブリン断片を包含する。
【0007】
D因子に結合し、その補体を活性化する能力をブロックしたモノクローナル抗体が生成され、166-32と命名された。この抗体を産生するハイブリドーマは、バージニア州20110-2209、マナサス、ユニバーシティ ブルバード 10801のアメリカン タイプ カルチャー コレクションにHB-12476の受託番号で寄託されている。
【0008】
配列表の説明
配列番号1は、ヒトD因子の塩基配列を示す。
配列番号2は、ヒトD因子のアミノ酸配列を示す。
配列番号3は、ブタD因子の塩基配列を示す。
配列番号4は、ブタD因子のアミノ酸配列を示す。
配列番号5は、MAb 166-32のVk遺伝子のクローニングに用いたプライマーである。
配列番号6は、後述のように、MAb 166-32のVk遺伝子をクローニングするためのアニールド アダプター(anealed adaptor)として、及びプライマーとして用いられた。
配列番号7もまた、後述のように、MAb 166-32のVk遺伝子をクローニングするためのアニールド アダプター(anealed adaptor)として、及びプライマーとして用いられた。
配列番号8は、後述のように、MAb 166-32のVH遺伝子をクローニングするための3'プライマーとして用いられた。
配列番号9は、MAb 166-32のVH遺伝子をクローニングするためのプライマーとして用いられた。
配列番号10は、MAb 166-32のVH遺伝子をクローニングするためのプライマーとして用いられた。
配列番号11は、MAb 166-32のFd遺伝子のPCRのための5'プライマーとして用いられた。
配列番号12は、MAb 166-32のFd遺伝子のPCRのための3'プライマーとして用いられた。
配列番号13は、MAb 166-32のFd遺伝子PCRのための5'プライマーとして用いられた。
配列番号14は、MAb 166-32のFd遺伝子PCRのための3'プライマーとして用いられた。
【0009】
発明の製造及び使用
A. ヒトD因子に対するモノクローナル抗体 (MAb) の生成
本発明の一具体例では、抗D因子MAbは、齧歯動物(例えば、マウス、ラット、ハムスター及びモルモット)を、ヒト血漿又は尿から精製したネイティブのD因子、又は真核系若しくは前核系で発現された組換えD因子若しくはその断片で免疫することにより生成させることができる。例えばヒト以外の霊長類、ヒト免疫グロブリンを発現するトランスジェニックマウス、及びヒトBリンパ球を移植された、重症複合性免疫不全(SCID)マウスのような他の動物も免疫に用いることができる。ハイブリドーマは、免疫された動物からのBリンパ球とミエローマ細胞(例えばSp2/0及びNS0)とを、G. Kohler及びC. Milstein (Nature, 1975: 256: 495-497)に記載されたような常法により融合させることにより生成させることができる。さらに、抗D因子抗体は、ファージ−ディスプレイシステムにおいて、ヒトBリンパ球からの組換え単鎖Fv又はFabライブラリーのスクリーニングにより生成させることもできる。MAbのヒトD因子に対する特異性は、酵素免疫測定(ELISA)、ウェスタン免疫ブロッティング又は他の免疫化学的方法により試験することができる。補体活性化に対する抗体の阻害活性は、第二経路については非感作ウサギ又はモルモットの赤血球(RBC)、古典経路については感作ニワトリ又はヒツジ赤血球を用いた溶血分析により評価することができる。陽性ウェル中のハイブリドーマは、限界希釈法によりクローニングすることができる。抗体は、上記した測定方法によるD因子への特異性の調査のために精製される。
【0010】
ヒトの炎症又は自己免疫疾患を治療するために用いる場合には、抗D因子抗体は、好ましくは、キメラ性、脱免疫化(deimmunized)、ヒト化又はヒト抗体として用いられる。このような抗体は、免疫原性を低減することができ、従って、ヒト抗マウス抗体(HAMA)応答を避けることができる。抗体は、IgG4、IgG2、又は抗体依存性細胞性細胞障害(S.M. Canfield及びS.L. Morrison, J. Exp. Med., 1991: 173: 1483-1491)及び補体媒介細胞溶解(Y.Xuら、J. Biol. Chem., 1994: 269: 3468-3474; V.L. Pulitoら、J. Immunol., 1996; 156:2840-2850)を増大しない他の遺伝的に変異されたIgG若しくはIgMであることが好ましい。
【0011】
キメラ抗体は、この分野において周知の組換え操作により生産することができ、動物の可変領域とヒトの定常領域とを有する。ヒト化抗体は、キメラ抗体よりもヒトペプチド配列の割合が高い。ヒト化抗体では、抗原結合及び特異性に責任のある相補性決定領域(CDR)のみが動物由来であって動物抗体に対応するアミノ酸配列を有し、分子の実質的に他の全ての部分(ある場合には、可変領域内のフレームワーク領域の小さな部分を除く)がヒト由来であり、ヒト抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する。L. Riechmannら、Nature, 1988; 332: 323-327; G. Winter, 米国特許第5,225,539号; C. Queenら、米国特許第5,530,101号参照。
【0012】
脱免疫化抗体は、国際出願PCT/GB98/01473に記載されているように、T細胞及びB細胞エピトープが除去された抗体である。これらは生体内投与された際に免疫原性がないか又は低減されている。
【0013】
ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン発現ライブラリー(Stratagene Corp., カリフォルニア州La Jolla)を用いてヒト抗体の断片(VH, VL, Fv, Fd, Fab又は(Fab')2)を作製し、キメラ抗体を生産する方法と同様な方法によりこれらの断片を用いて全ヒト抗体を構築することを包含する、数種類の異なる方法により生産することができる。ヒト抗体はまた、ヒト免疫グロブリンゲノムを有するトランスジェニックマウス中で生産することもできる。このようなマウスは、カリフォルニア州FremontのAbgenix, Inc.及びニュー ジャージー州AnnandaleのMedarex, Inc.から入手することができる。
【0014】
また、H鎖及びL鎖のFv領域が結合された、単ペプチド鎖結合性分子を作製することもできる。単鎖抗体(「ScFv」)及びその構築方法は、米国特許第4,946,778号に記載されている。あるいは、Fabを同様な手段により構築し、発現させることもできる(M.J. Evansら、J. Immunol. Meth., 1995; 184: 123-138)。全体的または部分的なヒト抗体の全ては、全体的なネズミMAbよりも免疫原性が低く、断片及び単鎖抗体もまた免疫原性がより低い。従って、これらのタイプの抗体は、免疫またはアレルギー性反応をより誘起しにくい。従って、それらは、ヒトに生体内投与する場合に全体的な動物抗体よりも適しており、特に繰り返しまたは長期間に亘る投与が必要な場合にそうである。さらに、抗体断片のサイズが小さいことにより、組織バイオアベイラビリティが改善され得、これは、急性疾患徴候におけるより高い投与蓄積性のために重要である。
【0015】
抗D因子抗体の可変領域の分子構造に基づき、分子モデリング及び合理的分子設計を用いて、抗体の結合領域の分子構造を模倣し、D因子の活性を阻害する、小さな分子を生成させスクリーニングすることができる。これらの小さな分子は、ペプチド、ペプチド様化合物、オリゴヌクレオチドまたは有機化合物であり得る。模倣分子は、炎症徴候及び自己免疫疾患における補体活性化の阻害剤として用いることができる。あるいは、コンビナトリアル化合物のライブラリーからの適当な小さな分子を単離する分野において一般的に用いられている大規模スクリーニング操作を用いることもできる。
【0016】
本発明の1つの好ましい具体例では、動物(マウス)の可変領域とヒトの定常領域を有するキメラFabが治療のために用いられる。Fabは次の理由により好ましい。
1. それは全免疫グロブリンよりも小さく、より高い組織浸透性を与え得る。
2. 1価の分子であるので、免疫複合物を形成して凝集する可能性がより低い。
3. 哺乳動物系よりも容易に大規模化できる微生物系を用いて生産することができる。
【0017】
B. 抗D因子抗体及びその断片の適用
本発明の抗D結合抗体及び断片は、静脈内注射、静脈内大量注射、並びに腹腔内、皮内、筋肉内、皮下、鼻内、気管内、脊髄内、頭蓋内及び経口経路を包含する種々の経路によって、適当な医薬製剤として患者に投与することができる。このような投与により、それらが内発性D因子と結合することが可能となり、C3b、C3a及びC5aアナフィラトキシン並びにC5b-9の生成が阻害される。
【0018】
このような抗体及び分子の見積もられた好ましい投与量は、血清1 ml当たり10〜500μg/mlである。実際の投与量は、種々の投与量を投与し、どれが最も効果的かを決める、従来の至適投与量決定方法に従って臨床試験により決定することができる。
【0019】
抗D因子抗体及びその断片は、生体内における補体活性化及び/又は第二補体経路、並びにマクロファージ、好中球、血小板及びマスト細胞の補充及び活性化、並びに浮腫及び組織損傷のような、それに付随する炎症徴候を阻害する機能を果たすことができる。これらの抗体及びその断片は、補体系の過度の又は制御できない活性化により媒介される疾患または症状の治療に用いることができる。これらは、(1)急性心筋梗塞、動脈瘤、卒中、出血性ショック、圧挫損傷、多臓器不全、低血液量性ショック及び腸虚血のような虚血−再潅流に起因する組織損傷、(2)例えば火傷、内毒素血症及び敗血症性ショックのような炎症性疾患、成人呼吸窮迫症候群、心−肺バイパス、血液透析、アナフィラキシーショック、重症喘息、血管浮腫、クローン病、鎌状細胞貧血、後連鎖球菌性腎炎並びに膵炎、(3)例えば超急性異種移植片拒絶のような移植拒絶、並びに(4)例えば薬剤アレルギー、IL-2誘導性血管漏出症候群及びラジオグラフィーコントラスト媒体アレルギーのような医薬品副作用を包含するがこれらに限定されるものではない。全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、リウマチ性関節炎、アルツハイマー症及び多発性硬化症を包含し、これらに限定されない自己免疫疾患もまた、本発明の抗体又はその断片で治療することができる。
【0020】
抗D因子分子はまた、組織標本や、血清、血漿、尿及び脊髄液のような体液試料中のD因子の存在を確かめ又は定量するための診断用途に用いることもできる。この用途では、免疫組織化学やELISAのような、周知の分析方法を用いることができる。このような診断試験は、ある個体がD因子欠損であるか過剰生産であるかを決定するために有用であり得る。
【0021】
C. 抗D因子抗体及びその断片の治療効果の動物モデル
上記した種々の疾患徴候における抗D因子抗体及びその断片の治療活性は、種々の炎症性及び自己免疫性徴候のための利用可能な動物モデルを用いることによって確認することができる。実施例において後述する生体外試験は、その有効性を確立するのに十分である。
【0022】
ヒトにおける種々の補体関連臨床疾患に関する動物モデルもまた、抗D因子抗体及びその断片の生体内効果を確認するために用いることができる。これらは、心筋虚血/再潅流損傷(H.F. Weisman et al., Science, 1990; 249: 146-151)、心筋梗塞(J. W. Homeister et al., J. Immunol. 1993; 150: 1055-1064)、全身性エリテマトーデス及び腎炎(S.K. Datta. Meth. Enzymol., 1988; 162: 385-442; D.J. SalvantとA.V. Cybulsky, Meth. Enzymol., 1988; 162: 421-461)、リウマチ性関節炎(Y. Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 1995; 92: 8955-8959)、成人呼吸窮迫症候群(R. Rabinovici et al., J. Immunol. 1992; 149: 1744-1750)、臓器移植における超急性拒絶(T.J. Kroshus et al., Transplantation, 1995; 60: 1994-1202)、火傷(M.S. Mulliganら、J. Immunol., 1992; 148: 1479-1485)、及び心−肺バイパス(C.S. Rinder, J. Clin. Invest., 1995; 96: 1564-1572)を包含するがこれらに限定されるものではない。
【0023】
本発明の製造及び使用の仕方の例並びにその有用性の証明を以下に記載する。
【0024】
実施例1: 抗D因子 MAb の生成
8〜12週齢の雄A/Jマウス(テキサス州HoustonのHarlan)に、ヒト血清(カリフォルニア州San DiegoのAdvanced Research Technologies)から精製した25gのD因子を、200μlのリン酸緩衝液(PBS)pH7.4にフロインドの完全アジュバント(ミシガン州DetroitのDifco Laboratories)に溶解したものを皮下注射した。D因子製剤は、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)により純度が>95%であることを確認した。D因子を試験し、後述のように溶血において生物学的に活性であることを見出した。2週間の間隔をあけて、フロインドの不完全アジュバント中25μgのヒトD因子を2回皮下注射した。次いで2週間後かつ屠殺の3日前に、マウスにPBS中の同一抗原25μgを腹腔内注射した。それぞれの融合のために、免疫したマウスの脾臓から単細胞浮遊液を調製し、Sp2/0ミエローマ細胞との融合に用いた。5 x 108個のSp2/0と5 x 108個の脾細胞を、50%ポリエチレングリコール(分子量1450)(ニューヨーク州RochesterのKodak)と5%ジメチルスルフォキシド(ミズーリー州St. LouisのSigma Chemical Co.)とを含む培地中で融合した。次いで、Iscove培地(ニューヨーク州Grand IslandのGibco)中で、200μlの浮遊液当たり脾細胞が1.5 x 105個になるように細胞密度を調整し、10%ウシ胎児血清、100単位/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、0.1 mMのヒポキサンチン、0.4 Mのアミノプテリン及び16 Mチミジンを添加した。200μlの細胞浮遊液を約20枚の96穴マイクロカルチャープレートの各ウェルに加えた。約10日後、培養上清を吸引し、精製D因子との反応性をELISAによりスクリーニングした。
【0025】
Immulon 2(バージニア州ChantillyのDynatech Laboratories)マイクロテストプレートのウェルに、50 ng/mlの精製ヒト因子50μlを加え、室温で一夜放置してウェルをコートした。コーティングのためのD因子の濃度が低いことにより、高親和性抗体の選択が可能になった。プレートをはたいてコーティング溶液を除去した後、200μlのPBS中BLOTTO(脱脂粉乳)を各ウェルに1時間加えて非特異部位をブロックした。1時間後、ウェルをPBST緩衝液(0.05% Tween 20含有PBS)で洗浄した。各融合ウェルから50μlの培養上清を集め、50μlのBLOTTOと混合し、次いでマイクロテストプレートの各ウェルに加えた。1時間インキュベートした後、ウェルをPBSTで洗浄した。次いで、1:2000にBLOTTOで希釈した、セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合ヤギ抗マウスIgG(Fc特異的)(ペンシルベニア州West GroveのJackson ImmunoResearch Laboratories)との反応により、結合したマウス抗体を検出した。0.1% 3,3,5,5テトラメチルベンジジン(ミズーリー州St. LouisのSigma)と0.0003%過酸化水素(Sigma)とを含むペルオキシダーゼ基質溶液を色発生のために30分間ウェルに加えた。反応は、各ウェル当たり50μlの2M H2SO4を加えることにより終結した。450nmにおける反応混合物の吸光度をBioTek ELISA Reader (VM WinooskiのBioTek Instruments)で読んだ。
【0026】
陽性ウェルからの培養上清を2つの分析方法、すなわち、i)後述する方法による、予め力価を測定したヒト血清による未感作ウサギRBCの第2経路溶血の阻害、及びii)後述する、ヒト血清で処理したザイモサンによるC3aの形成阻害、により測定した。これらの陽性ウェル中の細胞を限界希釈法によりクローニングした。MAbは、ELISAによりD因子との反応性を再度試験した。選択したハイブリドーマは撹拌フラスコ中で増殖させ、使用済みの培養上清を集めてプロテインAアフィニティクロマトグラフィーにより抗体を精製した。4つのMAbがELISAにおいてヒトD因子と強く反応することが試験によりわかった。これらのMAbを166-11、166-32、166-188及び166-222(図1)と命名した。これらのうち、MAb 166-32 (IgG1)は、後述のように、未感作ウサギRBCの第二経路溶血を強く阻害した。
【0027】
実施例2 表面プラズモン共鳴法による抗D因子 MAb の動的定数の決定
BIAcore instrument(スウェーデン、UppsalaのPharmacia Biosensor AB)を用いた表面プラズモン共鳴に基づく測定により、MAb 166-11、166-32、166-188及び166-222のヒトD因子に対する結合の動的定数を測定した。結合測定は、全て、HEPES緩衝塩溶液(HBS)(10 mM HEPES, pH7.4, 150 mM NaCl, 3.4 mM EDTA, 0.005%界面活性剤P20)中で25℃で行った。D因子のMAbに対する結合速度定数を測定するために、N-ヒドロキシスクシンイミド及びN-エチル-N'-(3-ジエチルアミノプロピル)カルボジイミドを用いたアミンカップリングにより、ウサギ抗マウスIgG(H+L)をCM5センサーチップ上に不動化した。異なる濃度のD因子を注入する前に、コーティングされたセンサーチップ上に個々のMAbを捕捉した。会合速度定数(Kassoc)を測定するために、D因子の5種類の希釈物(2.5 nM, 5 nM, 10 nM, 15 nM及び20 nM)を製造者により示された濃度に基づき調製し、5μl/分の流速でフローセルに注入した。解離速度定数(Kdissoc)を測定するために、5μl/分の流速で100 nMのD因子をフローセルに注入した。センサーグラムの形態にあるデータは、BIAcoreシステム中に組み込まれているデータ適合プログラムを用いて解析した。MAb 166-32は、質量輸送効果の限界に起因する、分析フォーマットの信頼限界を超える極めて速いKassocを有しているので、その動的速度定数を測定するための追加的な結合フォーマットも用いた。上記したようにアミンカップリングによりD因子をセンサーチップに不動化し、一方、異なる希釈率(Kassocを測定するためには5 nM, 10 nM, 15 nM, 20 nM及び25 nM、Kdissocを測定するためには200nMのMAb 166-32を、5μl/分の流速でセンサーチップに流した。センサーグラムの形態にあるデータは、上述のように解析した。BIAcore上での、MAbに結合するD因子の動的定数を下記表1に示す。MAb 166-32及び166-222は、D因子に対する親和性が極めて高く、平衡解離定数(KD)は0.1 nM未満であった。
【0028】
【表1】
表1
BIAcore上での、MAbに結合するD因子の動的定数
a ウサギ抗マウスIgGにより捕捉された抗D因子MAbでコートされたセンサーチップ上に、測定中に流したD因子を分析物として用いた。
b MAb 166-32を分析物として用い、D因子は、アミン−カップリング法によりセンサーチップに架橋した。
c KD, 平衡解離定数, = Kdissoc/Kassoc
【0029】
実施例3: 補体活性化溶血の阻害
抗D因子MAbの生体外における補体活性化の阻害の機能活性を試験するために、2つの溶血分析方法を用いた。
【0030】
第二経路のために、2 mM MgCl2と1.6 mM EGTAを含むゼラチン/ベロナール緩衝塩溶液(GVB/Mg-EGTA)で未感作ウサギRBCを3回洗浄した。10 mMのEGTAは、古典経路を阻害するために用いた(K. Whaleyら、A.W. Dodds(編)、Complement: A Practical Approach. Oxford University Press, Oxford, 1997, pp.19-47)。洗浄した細胞を、同じ緩衝液に1.7 x 108細胞/mlで再懸濁した。丸底96穴マイクロテストプレートの各ウェル中で、50μlの正常ヒト血清(20%)を50μlのGVB/Mg-EGTA又は低減希釈した被検MAbと混合し、次いで、この混合物を含むウェルに、30μlの洗浄したウサギRBC浮遊液を加えた。50μlの正常ヒト血清(20%)を80μlのGVB/Mg-EGTAと混合して血清色バックグランドを与えた。陰性対照のために、アイソタイプ適合抗HIV-1 gp120MAb、G3-519を用いた。最終混合物を37℃で30分間インキュベートした。次いで、プレートをマイクロテストプレートシェーカー上で15秒間振盪した。次いで、プレートを300 x gで3分間遠心した。上清(80μl)を集め、丸底96穴マイクロテストプレートのウェルに入れて、405nmにおける吸光度を測定した。溶血の阻害パーセントは、[(MAbなしの吸光度−血清色バックグランドの吸光度)−(MAb有りの吸光度−血清色バックグランドの吸光度)]/(MAbなしの吸光度−血清色バックグランドの吸光度)で定義される。
【0031】
図2は、10%ヒト血清の存在下に置いて、MAb 166-32が未感作ウサギRBCの第2経路溶血を用量依存的に強く阻害するが、無関係なアイソタイプ適合対照MAb G3-519は阻害しないというデータを示している。MAb G3-519は、HIVエンベロープ糖タンパク質gp 120に特異的である。
【0032】
90%ヒト血清中でのMAb 166-32の阻害活性を試験する分析では、凍結ヒト血清を解凍し、最終濃度10 mMのEGTAで前処理した。10μlの低減希釈したMAb 166-32又はG3-519を、96穴マイクロテストプレートのウェル2つずつ中で90μlのEGTA処理ヒト血清に加え、室温で15分間放置した。30μlの洗浄したウサギRBCを各ウェルに加えた。プレートを37℃で30分間インキュベートした。プレートをプレートシェーカー上で15秒間振盪し、次いで300 x gで3分間遠心した。上清(80μl)を集め、丸底96穴マイクロテストプレートのウェルに移し、405nmの吸光度を測定した。各プレートは、100μlの90%ヒト血清と30μlの緩衝液を血清色バックグランドとして含む2つのウェルと、モノクローナル抗体の非存在下で100μlの90%ヒト血清でRBCを溶解させた、完全溶解を表す2つのウェルとを含んでいた。図3は、90%ヒト血清の存在下においてさえ、MAb 166-32が未感作ウサギRBCの第2経路溶血を用量依存的に強く阻害するデータを示している。
【0033】
古典経路のために、0.5 mM MgCl2と0.15 mM CaCl2を含むゼラチン/ベロナール緩衝塩溶液(GVB**)中でニワトリRBC(5 x 107細胞/ml)を、8μg/mlの精製ウサギ抗ニワトリRBC免疫グロブリン(ニュー ジャージー州HopewellのInter-Cell Technologies)で、4℃で15分間感作した。次いで細胞をGVB**で洗浄した。用いた最終ヒト血清濃度は2%であった。
【0034】
図4は、MAb 166-32及び無関係の対照G3-519は、感作ニワトリRBCの古典経路溶血を阻害しないが、陽性対照の抗ヒトC5 MAb 137-76は阻害するというデータを示している。図2、3及び4からのデータは、MAb 166-32が、第二経路の補体活性化の阻害に特異的であることを示している。
【0035】
実施例4 MAb 166-32 のD因子に対する特異性
MAb 166-32のヒトD因子に対する特異性を示すために、後述する2つの溶血分析を用いた。
【0036】
(1) 未感作ウサギRBCを用いたD因子依存性溶血分析の阻害
抗D因子MAb 166-222と結合した3M Emphaze Biosupport Medium(イリノイ州RockfordのPierce)を充填したアフィニティカラムを通すことによって、ヒト血清試料からD因子を除去した。通過血清は、D因子が完全に除去されたことに起因して、第二経路溶血を引き起こすことについて不活性であることを試験した。この分析の手順は、異なる濃度の精製D因子を、D因子枯渇血清に加えて溶血活性を再構築したことを除き、上記した実施例3と同様である。これらの条件下において、ウサギRBCの溶血はD因子依存的である。再構築された溶血活性は、補充されたD因子の濃度に直線的に比例する(0.01μg/mlから2μg/ml(図5))ことが示された。図5のデータはまた、0.1μg/mlの補充D因子の存在下において、未感作ウサギRBCの溶血を、0.3μg/mlのMAb 166-32が完全に阻害することができ、一方、陰性対照MAb G3-519は、D因子依存性溶血に効果を有さないことをも示している。これらのデータは、1:2のモル比(MAb 166-32:D因子)で、MAb166-32がヒトD因子の生物学的活性を有効に阻害できることを示している。従って、MAb 166-32は、D因子に対する有能な高親和性抗体である。この抗体は、第二補体経路の活性化に起因する疾患または徴候を治療するために臨床的に用いられる潜在能力を有している。
【0037】
(2) EAC3b 細胞上での第二 C3 コンベルターゼの形成阻害
EAC3b細胞は、ヒトC3bでコートされたヒツジRBC(コロラド州DenverのNational Jewish Center of Immunology and Respiratory Medicineから購入)である。この分析では、B因子、P因子(プロペルジン)及びD因子を添加することにより、EAC3b細胞の表面上で第二C3コンベルターゼを組み立てた。EAC3b細胞(5 x 108)を次いで、DGVB**培地(0.075 mM CaCl2, 0.25 mM MgCl2、0.1%ゼラチン、2.5% (w/v)デキストロース及び0.01%アジ化ナトリウムを含む50%ベロナール緩衝塩溶液、pH7.2)中で3回洗浄した。洗浄した細胞を次いで1.5 mlのDGVB**、P因子(30μg)及びB因子(20μg)中で再懸濁した。P因子及びB因子の濃度は、過剰であることが予め測定されている。50μlの細胞浮遊液を丸底96穴マイクロプレートの各ウェルに入れた。次いで、細胞を含むウェルに、D因子(1.2 ng/ml)と低減希釈MAb 166-32またはMAb G3-519との混合物50μlを加え、30℃で15分間インキュベートした。D因子の濃度(1.2 ng/ml)は、これらの条件下において90%を超える溶血を起こすことが予め測定されていた。インキュベーション後、GVB-EDTA培地(10 mM EDTAを含むゼラチン/ベロナール緩衝塩溶液)中で細胞を2回洗浄した。細胞を次いで30μlのGVB-EDTA培地に再懸濁した。溶血を開始するために、各ウェルに100μlのモルモット血清(Sigma)(GVB-EDTAで1:10に希釈)を加えた。混合物を次いで37℃で30分間インキュベートした。マイクロテストプレートを次いで300 x gで3分間遠心した。培養上清を集めて405 nmにおける吸光度を測定した。
【0038】
図6は、MAb 166-32がEAC3b細胞の溶解を阻害するが、無関係なMAb G3-519は阻害しないという実験結果を示している。MAb 166-32はD因子がB因子を開裂することを阻害し、従って、EAC3b細胞の表面上でC3コンベルターゼが形成されることを防止する。
【0039】
実施例5: MAb 166-32 による、補体活性化チモーゲンからの C3a の生成阻害
MAb 166-32のD因子に対する機能特異性をさらに確かめるために、ザイモサン(活性化酵母粒子)についての第二補体活性化に対する該MAbの効果を調べた。ザイモサンA(Saccharomyces cerevisiae、Sigma由来)(1 mg/ml)をGVB-EGTA中で3回洗浄し、同じ培地に1 mg/mlの濃度で再懸濁した。異なる濃度のMAb 166-32またはG3-519の25μlを、マイクロチューブ中で25μlのヒト血清(GVB/Mg-EGTAで1:5に希釈)と混合し、室温で15分間インキュベートした。ブランクは、抗体を含まず、培地と血清のみを含んでいた。インキュベーション後、50μlの洗浄ザイモサン懸濁液を各チューブに加え、37℃で30分間インキュベートした。マイクロチューブを次いで2000 x gで5分間遠心した。上清を集め、同体積のSpecimen Stabilizing Solution(カリフォルニア州San DiegoのQuidel)と混合した。試料は、分析まで、-25℃で凍結した。試料中のC3a及びsC5b-9の濃度は、製造者から提供された手順に従って、定量的ELISAキット(Quidel)により測定した。
【0040】
図7は、MAb 166-32が補体活性化ザイモサンからのC3aの生成を阻害するが、無関係なMAb G3-519は効果を有さないことを示している。これらのデータは、MAb 166-32が、D因子によるC3コンベルターゼの形成を阻害することを示唆している。MAb 166-32によるD因子の完全な阻害は、C3aを生成できないことにより示されるように、C3コンベルターゼの形成を有効にブロックし得る。これは、sC5b-9(MAC)形成の阻害(図8)により証明されるように、補体カスケードの後の工程におけるC5コンベルターゼの阻害をもたらすであろう。
【0041】
実施例6: MAb 166-32 の Fab による補体活性化溶血の阻害
MAb 166-32の1価形態が、親の2価MAb 166-32のように第二補体経路の阻害に有効であるかどうかを調べるために、市販の試薬キット(Pierce)を用いたパパイン消化によりMAb 166-32のFabを調製した。該Fabの第二経路溶血に対する阻害活性を、上記したように未感作ウサギRBCを用いて調べた。
【0042】
図9には、全IgG及びFabの両者とも、第二補体活性をブロックする同様な能力を有しているという実験データを示している。これらの結果は、MAb 166-32の1価形態は活性であり、その親の2価抗体と同様に、D因子に対する同様な能力を維持していることを示唆している。この性質は、Fabまたは単鎖Fvを代替産物として用いることを考える上で重要である。後者の1価形態を用いる1つの利点は、そのサイズが小さいので、組織浸透性がより高いであろうということである。MAb 166-32のFabが活性なので、おそらく、該MAbにより認識されるD因子上の結合エピトープは、機能的に重要である。
【0043】
実施例7: 異なる動物種からの血清を用いた第二経路溶血に対する MAb 166-32 の効果
異なる動物種からのD因子に対する、MAb 166-32の交差反応性を調べるために、異なる動物種からの血清を用いて第二経路溶血分析を行った。異なる動物種(ヒト、アカゲザル、チンパンジー、ヒヒ、カニクイザル、ヒツジ、イヌ、マウス、ハムスター、ラット、ウサギ、モルモット及びブタ)からの新鮮な血清のCH50値を先ず調べた。CH50値は、未感作ウサギRBCの50%を溶血できる血清の希釈倍率と定義される。各血清の同じ溶血活性(CH50)に対するMAb 166-32の阻害活性を調べて比較した。
【0044】
図10は、MAb 166-32がヒト、アカゲザル及びチンパンジーからの血清に対して強力な阻害活性を有し、ヒヒ、カニクイザル、ヒツジ及びイヌからの血清に対して緩和な阻害活性を有することを示している。該抗体は、マウス、ハムスター、ラット、ウサギ、モルモット及びブタからの血清については阻害しなかった。これらのデータは、MAb 166-32が、ヒト、アカゲザル、チンパンジー、ヒヒ、カニクイザル、ヒツジ及びイヌに共有されるD因子上のエピトープに結合することを示唆している。
【0045】
実施例8: MAb 166-32 のエピトープマッピングのためのヒトD因子突然変異体の構築
MAb 166-32によって認識されるヒトD因子の結合エピトープを明らかにするために、ウェスタンブロットにおける該抗体とヒトD因子との反応性をまず試験した。MAb 166-32は、ニトロセルロースメンブレン上に不動化されたSDS-変性ヒトD因子(還元状態でも非還元状態でも)とは反応しなかった。この結果は、MAb 166-32がネイティブのD因子と反応するが変性D因子とは反応しないことを示している。
【0046】
実施例7で記載したように、MAb 166-32は、マウス及びブタD因子の溶血活性を阻害しないので、おそらく、MAb 166-32は、マウス及びブタD因子のアミノ酸配列とは大きく異なるアミノ酸配列を有するヒトD因子上の部位に結合する。この概念に基づき、後述のようにMAb 166-32の結合エピトープのマッピングするために、ヒトD因子中のアミノ酸残基を、ブタD因子中の対応するアミノ酸残基で置換することにより種々のD因子突然変異体及びハイブリッドを作製した。
【0047】
(1) D因子突然変異体及びハイブリッドの構築
鋳型としてのヒト脂肪細胞cDNA(カリフォルニア州San FranciscoのClontech)及び適当なオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により、ヒトD因子遺伝子断片を得た。増幅DNA断片を制限酵素BamHI及びEcoRIで消化し、消化産物をバキュロウイルストランスファーベクターpVL1393(カリフォルニア州San DiegoのPharmingen)のBamHI及びEcoRI部位に挿入して野生型pVL1393-D因子/Huを得た。ヒトD因子は、D因子/Huと記載する。成熟ヒトD因子タンパク質の塩基配列及び推定アミノ酸配列を配列番号1及び2に示す(R.T. Whiteら、J. Biol. Chem., 1992; 267:9210-9213; GenBank accession number: M84526)。
【0048】
ブタD因子cDNAクローンpMon24909は、ネブラスカ大学のJ.L. Minerからのギフトとして得られた(GenBank accession number: U29948)。pMon24909のBamHI-EcoRI断片を、pVL1393にクローニングしてpVL1393-D因子/Pigを得た。ブタD因子は、D因子/Pigと記載する。成熟ブタD因子タンパク質の塩基配列及び推定アミノ酸配列を配列番号3及び4に示す。
【0049】
適当なプライマー及び重複PCRを用いて3種類のヒトD因子突然変異体を構築した。アミノ酸突然変異は、ヒト配列中のアミノ酸残基を、ヒト及びブタD因子の相同性比較のためにこれらを整列させた際の、ブタ配列中の対応するアミノ酸残基で置換することにより設計した。第1の突然変異体であるD/VDAは、3つのアミノ酸突然変異、V113E, D116E及びA118P、を含んでいた。(これは、突然変異を記述するための速記方法で、例えば、V113Eは、ヒトD因子中のアミノ酸残基番号113のバリンが、ブタD因子中のグルタミン酸に変えられたことを意味する)。第2の突然変異体であるD因子/RHは、2つのアミノ酸突然変異:R156L及びH159Yを含んでいた。第3の突然変異体であるD因子/Lは、単一の突然変異:L168Mを含んでいた。これらの突然変異体をコードするDNA配列は、DNA塩基配列決定により確認した。適当な酵素で消化した後、DNA断片をバキュロウイルストランスファーベクターpVL1393のBamHI及びEcoRI部位に挿入してpVL1393-D因子/VDA、pVL1393-D因子/RH及びpVL1393-D因子/Lをそれぞれ得た。
【0050】
適当なプライマー及び重複PCRを用いることにより、2つのキメラヒト−ブタD因子ハイブリッドもまた構築した。第1のハイブリッドであるD因子/Hupigは、N末端側に52個のヒトD因子由来アミノ酸を含み、残りのアミノ酸は、ブタD因子由来のものであった。他のハイブリドーマであるD因子/Pighuは、N末端側に52個のブタD因子由来アミノ酸を含み、残りのアミノ酸は、ヒトD因子由来のものであった。BamHI及びEcoRIで消化したDNA断片を、バキュロウイルストランスファーベクターpVL1393のBamHI及びEcoRI部位に挿入してpVL1393-D因子/Hupig及びpVL1393-D因子/Pighuを得た。
【0051】
(2) D因子突然変異体及びハイブリッドの発現
プラスミドのトランスフェクション、組換えバキュロウイルスの生成及び昆虫細胞Sf9中での組換えD因子タンパク質の生産は、製造者のマニュアル(Baculovirus Expression Vector System, Pharmingen)に従って行った。
【0052】
(3) D因子突然変異体及びハイブリッドの精製
感染Sf9細胞の培養上清からのD因子突然変異体及びハイブリッドタンパク質は、精製ヒツジ抗ヒトD因子ポリクローナル抗体(カリフォルニア州San DiegoのThe Binding Site Limited)を用いたアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。3mlのヒツジ抗ヒトD因子抗体(13.2 mg/ml)を結合バッファー(0.1 Mホウ酸塩及び0.75 M Na2SO4, pH9.0)中で平衡化させ、4mlのUltralink Biosupport Medium (Pierce)と室温で2時間結合させた。ビーズを先ず50mMジエチルアミンpH11.5で洗浄して残る全ての反応部位を飽和させ、次いで、10 mM Tris, 0.15 M NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton X-100及び0.02% NaN3, pH8.0を含む緩衝液で洗浄した。ゲルを4℃で該バッファー中で保存した。
【0053】
種々のバキュロウイルス突然変異体を感染させたSf9細胞の100ミリの撹拌培養物から回収した培養上清を、PBSで予備平衡化して貯蔵バッファーを除去したヒツジ抗D因子アフィニティカラムに通した。結合したD因子タンパク質を50mMのジエチルアミンpH 11.5で溶出した。回収した分画は、1 M Hepes緩衝液で直ちにpH7.0に中和した。残留塩は、Millipore膜限外ろ過(カットオフ分子量3000)(マサチューセッツ州BedfordのMillipore Corp)によりPBSとバッファー交換して除去した。タンパク濃度は、BCA法(Pierce)により測定した。
【0054】
(4) D因子ELISA
MAb 166-32と種々のD因子突然変異体及びハイブリドーマとの反応性をELISAにより試験した。96穴マイクロテストプレートの異なるウェルに、各タンパク質を0.5μg/mlの濃度でPBS中に含む溶液100μlを加えることにより、各ウェルをタンパク質(D因子/Hu、D因子/Pig、D因子/Hupig、D因子/Pighu、D因子/VDH、D因子D/RH及びD因子/L)でコートした。室温で一夜インキュベートした後、ウェルをPBSTB(2% BSAを含むPBST)で処理して残る結合部位を飽和させた。ウェルを次いでPBSTで洗浄した。低減希釈したMAb 166-32(1μg/mlから0.5 ng/ml)をウェルに加え、室温で1時間放置した。次いでウェルをPBSTで洗浄した。結合した抗体は、希釈したHRP-ヤギ抗マウスIgG(Fc)(Jackson ImmunoResearch)と室温で1時間インキュベートすることにより検出した。ペルオキシダーゼ基質溶液を次いで、上記のように色発生させるために添加した。450 nmにおける吸光度をELISAリーダーを用いて測定した。
【0055】
図11は、MAb 166-32がD因子/Hu、D因子/Pighu及びD因子/VDAと反応するが、D因子/Pig、D因子/Hupig、D因子/RH及びD因子/Lとは反応しないことを示している。ELISAの結果は、ヒトD因子のArg156、His159及びLeu168のアミノ酸残基がMAb 166-32の結合に必須であることを示している。これは、MAb 166-32が、ヒトD因子のC末端部分をブタのそれと置換したD因子/Hupigと反応しなかったという事実と符合する。アミノ酸残基Arg156、His159及びLeu168は、メチオニン残基が169位に位置する、Cys154とCys170との間のジスルフィド結合により構成されるいわゆる「メチオニンループ」中に位置する(J.E. Volanakisら、In: The Human Complement System in Health and Disease, J.E. Volanakis及びM.M. Franks編、Marcel Dekker, 1998, pp.49-81)。構造的に、「メチオニンループ」は、剛性タイプ1βターンのメンバーである。X線結晶解析研究に基づき、それはD因子の表面上に露出していることがわかっている(S.V.L. Narayanaら、J. Mol. Biol., 1994, 235: 695-708)。しかしながら、D因子の基質特異性及び触媒作用に対する「メチオニンループ」の寄与は研究されたことがない(J.E. Volanakisら、Protein Sci., 1996; 5: 553-564)。ここでのデータは、「メチオニンループ」がD因子の機能活性において重要な役割を果たすことを初めて示したものである。MAb 166-32及びそのFabは、D因子のこの領域に結合すると、B因子の触媒作用を効率的に阻害することができる。
【0056】
実施例9: 抗D因子 MAb 166-32 可変領域遺伝子のクローニング並びにキメラ 166-32 IgG及びその Fab の構築及び発現
ヒトに用いた場合のMAb 166-32の免疫原性を低減させるために、マウス定常領域をIgG1のヒト定常領域で置換することによりMAb 166-32のキメラ型を作製した。マウス定常領域をヒトの対応領域で置換することにより、該抗体の2つの形態のFabもまた作製した。MAb 166-32可変領域遺伝子のクローニング並びにキメラ166-32抗体及びそのFabの構築及び発現を以下に記載する。
【0057】
(1) 抗D因子 MAb 可変領域遺伝子のクローニング
RNAzol(テキサス州HoustonのBiotech)を製造者のプロトコールに従って用いて、抗D因子MAb 166-32を分泌するハイブリドーマ細胞から全RNAを単離した。オリゴdTをプライマーとして用いて全RNAから第一鎖cDNAを合成した。免疫グロブリン定常(C)領域由来の3’プライマーと、マウスVH又はVK遺伝子のリーダーペプチド又は第1フレームワーク領域由来の縮重プライマーセットを5’プライマーとして用いたPCRを行った。VHについては増幅DNAが観察されたが、VKについては、予想される長さのDNA断片が増幅されなかった。VH及びVK遺伝子とも、アンカード(anchored)PCRによりクローニングした。
【0058】
アンカードPCRは、Chen及びPlatsucas (Scand. J. Immunol., 1992; 35: 539-549)により記載された通りに行った。VK遺伝子については、NotI-MAK1プライマー(5'-TGCGGCCGCTGTAGGTGCTGTCTTT-3'、配列番号5)を用いて二本鎖cDNAを調製した。アニールしたアダプターAD1(5'-GGAATTCACTCGTTATTCTCGGA-3'、配列番号6)及びAD2(5'-TCCGAGAATAACGAGTG-3'、配列番号7)を二本鎖cDNAの5’及び3’末端の両方に連結した。3’末端のアダプターは、NotI消化により除去した。消化産物を鋳型とし、AD1オリゴヌクレオチドを5’プライマー、MAK2(5'-CATTGAAAGCTTTGGGGTAGAAGTTGTTC-3'、配列番号8)を3’プライマーとしてPCRを行った。約500 bpのDNA断片をpUC19にクローニングした。12個のクローンを選択してさらに解析した。7つのクローンは、Sp2/0 Vメッセージに特異的なCDR3配列を含んでいることがわかり、おそらく、166-32ハイブリドーマセルラインの融合パートナーの迷入κ軽鎖メッセージから誘導されたものである。NotI-MAK1及びMAK2オリゴヌクレオチドは、マウスCk領域から誘導されたもので、Ck遺伝子の第1bpから下流にそれぞれ182 bp及び84 bpの領域であった。3つのクローンをDNA塩基配列決定により分析し、マウスCk の一部、完全Vk及びリーダーペプチドを含む配列を得た。
【0059】
VH遺伝子をクローニングするために、NotI-MAG1プライマー(5'-CGCGGCCGCAGCTGCTCAGAGTGTAGA-3'、配列番号9)を用いて二本鎖cDNAを調製した。アニールしたアダプターAD1及びAD2を二本鎖cDNAの5’末端及び3’末端の両方に連結した。3’末端のアダプターは、NotI消化により除去した。消化産物を鋳型とし、AD1オリゴヌクレオチド及びMAG2(5'-CGGTAAGCTTCACTGGCTCAGGGAAATA-3'、配列番号10)をプライマーとして用いてPCRを行った。500〜600 bpの長さのDNA断片をpUC19にクローニングした。NotI-MAG1及びMAG2オリゴヌクレオチドは、マウスCγ1領域から誘導されたものであり、マウスCγ1遺伝子の第1bpから下流にそれぞれ180 bp及び93 bpの領域であった。3つのクローンをDNA塩基配列決定により分析し、マウスCγ1の一部、完全Vk及びリーダーペプチドを含む配列を得た。
【0060】
(2) キメラ 166-32 IgG及び Fab のための発現ベクターの構築
コザック配列を5’末端に、スプライスドナーを3’末端に連結するために、VH及びVK遺伝子を鋳型として用いてPCRを行った。配列を解析してPCRエラーが存在しないことを確認した後、VH及びVK遺伝子を、ヒトCγ1及びCをそれぞれ含む発現ベクターカセットに挿入してpSV2neoVH-huCγ1及びpSV2neoV-huCκを得た。H−及びL−鎖ベクターの、CsClで精製したプラスミドDNAを用い、エレクトロポレーションによりCOS細胞をトランスフェクトした。48時間後、培養上清をELISAにより試験したところ、約200 ng/mlのキメラIgGを含んでいた。オリゴdTをプライマーとして用い、全RNAから第1鎖cDNAを合成した。このcDNAを鋳型として用いてPCRを行い、Fd及びκDNA断片を生成した。Fd遺伝子については、PCRは、(5'-AAGAAGCTTGCCGCCACCATGGATTGGCTGTGGAACT-3'、配列番号11)を5’プライマーとし、CH-1由来3’プライマー(5'-CGGGATCCTCAAACTTTCTTGTCCACCTTGG-3'、配列番号12)を用いて行った。DNA配列が、ヒトIgG1の完全なVHとCH1ドメインを含むことが確認された。適正な酵素で消化した後、Fd DNA断片を、pSV2dhfr-TUSの発現ベクターカセットのHindIII及びBamHI制限部位に挿入してpSV2dhfrFd(図12A)を得た。
【0061】
κ遺伝子については、(5'-AAGAAAGCTTGCCGCCACCATGTTCTCACTAGCTCT-3'、配列番号13)を5’プライマーとして用い、Cκ−由来3’プライマー(5'-CGGGATCCTTCTCCCTCTAACACTCT-3'、配列番号14)を用いてPCRを行った。DNA配列が、完全なVκ遺伝子及びヒトCκ領域を含むことを確認した。適切な制限酵素で消化した後、κDNA断片を、発現ベクターカセットpSV2neo-TUSのHindIII及びBamHI制限部位に挿入してpSV2neoκ(図12B)を得た。Fd及びκ遺伝子の両者の発現とも、HCMV-由来エンハンサー及びプロモーター要素により駆動した。Fd遺伝子は、鎖間ジスルフィド結合に関与するシステインアミノ酸残基を含まないので、この組換えキメラFabは、非共有結合的に結合されたH−及びL−鎖を含む。このキメラFabをcFabと記載する。
【0062】
H鎖とL鎖の間のジスルフィド結合を有する組換えFabを得るために、ヒトIgG1のヒンジ領域からさらなる9アミノ酸(EPKSCDKTH、配列番号12)のコード領域をも含むように上記Fd遺伝子を伸長した。Fd遺伝子の3’側の30アミノ酸をコードするBstEII-BamHIDNA部分を、伸長したFdをコードするDNA部分で置換した。ヒトIgG1のヒンジ領域からのさらなる9アミノ酸を有する、伸長されたFdの配列は、DNA塩基配列決定により確認した。このFd/9aa遺伝子を発現ベクターカセットpSV2dhfr-TUSに挿入してpSV2dhfrFd/9aaを得た。このキメラFabをcFab/9aaと記載する。
【0063】
(3) キメラ 166-32 IgG及び Fab の発現
キメラ166-32IgGを分泌するセルラインを生成するために、pSV2neoVH-huCγ1及びpSV2neoV-huCκの精製したプラスミドDNAで、エレクトロポレーションによりNS0細胞をトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞は、0.7 mg/mlのG418の存在下で選択した。細胞は、血清含有培地を用いた250mlの振盪フラスコ中で増殖させた。
【0064】
キメラ166-32 Fabを分泌するを分泌するセルラインを生成するために、pSV2dhfrFd(又はpSV2dhfrFd/9aa)及びpSV2neoκの生成したプラスミドで、エレクトロポレーションによりCHO細胞をトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞は、G418及びメトトレキセートの存在下で選択した。選択したセルラインは、増加する濃度のメトトレキセート中で増幅した。細胞を、限界希釈により単細胞サブクローニングした。単細胞にサブクローニングされた、高生産セルラインを、次いで、無血清培地を用いて100mlで振盪培養した。
【0065】
(4) キメラ 166-32 IgGの精製
100ミリの振盪培養物の培養上清を10mlPROSEP-Aカラム(ニュージャージー州PrincetonのBioprocessing, Inc.)にかけた。カラムをベッド体積の10倍のPBSで洗浄した。結合した抗体を、50mMのクエン酸バッファー、pH3.0で溶出した。精製抗体を含む分画に、同体積の1 M Hepes,pH8.0を加えてpHを7.0に調整した。残留する塩は、Millipore膜限外ろ過(カットオフ分子量3000)を用いた、PBSとのバッファー交換により除去した。精製した抗体のタンパク濃度をBCA法(Pierce)により測定した。
【0066】
(5) キメラ 166-32 Fab の精製
MAb 166-32に対するマウス抗イディオタイプMAbを用いたアフィニティクロマトグラフィーにより、キメラ166-32 Fabを精製した。該抗イディオタイプMAbをMAb 172-25-3と記載する。これは、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)と結合したMAb 166-32でマウスを免疫し、MAb 166-32との特異的結合がヒトD因子と競合する抗体をスクリーニングすることにより作製された。
【0067】
25mgのMAb 172-25-3と5mlの乾燥アザラクトンビーズ(PierceのUltraLink Biosupport Medium)とを結合バッファー(0.1 Mホウ酸塩及び0.75 M Na2SO4,pH9.0)中で室温で2時間混合することにより、アフィニティクロマトグラフィーマトリックスを調製した。次いで、残留する反応部位を、1Mエタノールアミン、pH9.0で室温、2.5時間処理してブロックした。10 mM Tris,0.15 M NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton X-100及び0.02% NaN3, pH8.0)を含むバッファーでビーズを洗浄し、4℃で貯蔵した。
【0068】
精製のために、cFab又はcFab/9aaを産生するCHO細胞の撹拌培養物の上清100 mlを、MAb 172-25-3と結合したアフィニティカラムにかけた。カラムを次いでPBSで完全に洗浄し、結合したFabを50mMのジエチルアミン、pH11.5で溶出した。残留する塩を、上述のようにバッファー交換により除去した。精製Fabのタンパク濃度をBCA法(Pierce)により測定した。
【0069】
(6) キメラ 166-32 IgG、 cFab 及び cFab/9aa の SDS-PAGE
精製したキメラ166-32IgG、cFab及びcFab/9aaの純度及び分子量をSDS-PAGEにより分析した。タンパク質は、メルカプトエタノールを含む又は含まない試料バッファーで処理した。試料を次いで、PhastSystem(Amersham Pharmacia Biotech)を用い、予め染色した分子量標準(低分子量範囲)(カリフォルニア州HerculesのBIO-RAD Laboratories)と共に、予め注型されたゲル(12.5%)(スウェーデンUppsalaのAmersham Pharmacia Biotech)にかけ運転した。ゲルを次いでクマシーブリリアントブルー溶液(BIO-RAD)で5分間染色し、次いで、40%メタノールと10%酢酸とを含む水溶液中で脱染色した。
【0070】
非還元条件及び還元条件の両方で処理したcFab、cFab/9aa及びキメラIgGのSDS-PAGEの結果は、キメラIgGが150kDのタンパクバンドと、それぞれ約50 kDと29 kDのH鎖(HC)及びL鎖(LC)の2つのタンパクバンドを有することを示した。予想通り、cFab/9aaは、非還元条件下において、約40 kDのタンパクバンド1本のみを有していた。このことは、H鎖及びL鎖が、鎖間ジスルフィド結合により結合されていることを示している。一方、cFabは、非還元条件下において2本のタンパクバンドを示した。このことは、H鎖及びL鎖が、鎖間ジスルフィド結合により結合されていないことを示している。
【0071】
(7) キメラ 166-32 IgG、 cFab 及び cFab/9aa の活性の測定
上記した第二補体溶血分析を用いることにより、キメラ166-32IgG、cFab及びcFab/9aaの活性を測定した。図13は、MAb 166-32のマウス抗体及びキメラ形態が、同じD因子阻害能力を有していることを示している。図14は、cFabとcFab/9aaがほとんど同じD因子阻害能力を有していることを示している。最も重要なことは、IgG分子当たり2個の結合部位があるが、2つの形態のキメラFabの能力がキメラIgGの能力と同じであることである。これらを総合すると、これらの結果は、キメラIgG、cFab及びcFab/9aaは、親のマウスMAb 166-32の能力を維持していることを示している。
【0072】
実施例10: ヒト血漿で潅流したウサギ心臓の生体外モデルにおける、 MAb 166-32 による、補体媒介組織損傷の保護
補体系の活性化は、超急性異種移植拒絶に寄与する。これは、補体固定抗体の結合、外来細胞表面上における第二経路を介した補体の直接活性化、及び/又は外来臓器による補体制御の失敗の結果生じるものかもしれない(J.L. Plattら、Transplantation, 1991; 52: 937-947)。古典経路及び第二経路のいずれもが機能し得る場合もあるが、特定の種−種相互作用に依存して、古典経路及び第二経路のいずれかが優勢になる(T. Takahashiら、Immunol. Res., 1997; 16: 273-297)。前の研究により、超急性拒絶は、第二経路の活性化を通じて、抗ドナー抗体の非存在下において起こり得ることが示されている(P.S. Johnstonら、Transplant. Proc., 1991; 23: 877-879)。
【0073】
組織損傷における第二補体経路の重要性を示すために、単離ウサギ心臓を希釈ヒト血漿で潅流した生体外モデルを用いて抗D因子MAb 166-32を試験した。このモデルは、第二補体経路の活性化に起因してウサギ心筋の損傷を引き起こすことが先に示されている(M.R. Gralinskiら、Immunopharmacology, 1996: 34: 79-88)。
【0074】
(1) ランゲルドルフ潅流ウサギ心臓
雄のニュージーランドホワイトウサギ(2.2〜2.4 kg)を、頸椎脱臼により安楽死させた。心臓を迅速に取り出し、大動脈を介した潅流のためのカニューレに取り付けた。潅流媒体は、再潅流体積(250 ml)の修飾クレブス−ヘンセレイト(K-H)バッファー(pH7.4、37℃)から成り、20〜25ml/分の低速で供給した。バッファー培地のmmol/L単位の組成は次の通りであった。NaCl 117; KCl 4.0; CaCl2・H2O 2.4; MgCl2・6H2O 1,2; NaHCO3 25; KH2PO4 1.1; グルコース 5.0; L-グルタミン酸一ナトリウム 5.0; ピルビン酸ナトリウム 2.0; 及びBSA 0.25% (w/v)。K-Hバッファーは、長さ55.49メートル、内径1.47 mm、外径1.96 mmのSilastic(登録商標)Laboratory Grade Tubing (ミシガン州MidlandのDow Corning)から成るガス多孔性「肺」を通過した。膜状の「肺」は、95% O2/5% CO2混合物に連続的にさらし、潅流媒体中の酸素分圧が500 mmmHgになるようにした。心臓は、右心房に取り付けた電極を介して、プロトコールの間ずっとペースメイキングした。ペーシング刺激(3 Hz, 4ミリ秒長さ)は、実験室方形波発生器(Grass SD-5、マサチューセッツ州のQuincy)から供給した。肺動脈は、ポリエチレンチューブにつなぎ、冠静脈回帰である肺動脈流出物の回収を容易にした。上及び下大静脈並びに肺静脈は、結紮してシビアード(severed)血管から潅流液が出ることを防止した。左心室排出、サーミスタープローブ及びラテックスバルーンを、左心房から挿入して左心室内に位置させた。流体を充填したバルーンは、剛性チューブを介して圧力トランスデューサーに接続し、左心室の収縮期及び拡張期圧力を測定することを可能にした。左心室発生圧力は、左心室の収縮期及び拡張期圧力の差と定義される。心室内のバルーンを蒸留水で膨張させて5 mmHgの左心室拡張期圧力の初期ベースラインを達成した。冠状潅流圧力は、大動脈カニューラの側枝に接続された圧力トランスデューサーで測定した。全ての血液動力学的変数は、マルチチャンネルレコーダー(Grass Polygraph 79D、マサチューセッツ州のQuincy)を用いて連続的に監視した。単離した心臓は、これらを温度制御二重ガラス室に封入し、潅流媒体は、加熱した貯蔵容器及び供給システムを通過させることにより、実験期間中37℃に維持した。
【0075】
(2) 抗体治療
ヒト血漿で潅流した単離ウサギ心臓中の補体活性化の効果を阻害する抗D因子MAb166-32の能力を測定するために、2つの試験群を用いた。グループ1:HIV-1 gp120に特異的な、0.3μg/mlのMAb G3-519(n=6)の存在下において、4%ヒト血漿で潅流された心臓から成る、アイソタイプ−適合陰性群。グループ2:0.3μg/mlのMAb 166-32 (n=6)の存在下において、4%ヒト血漿で潅流された心臓から成る、治療群。ヒト血漿は、新たに集めた全欠から分離し、使用まで−80℃で貯蔵した。このヒト血漿のパーセンテージは、合理的な長さの時間に亘って心筋の機能を著しく損ない、治療方法の有効性を評価することができるのでこのパーセンテージを選択した。この系においてヒト血漿の濃度をより高くすると、心臓拘縮が迅速に生じ、低濃度の薬剤の効果を分析することが困難になる。予備試験により、単離心臓を、補体活性化の効果から保護できる最低の有効濃度が0.3μg/mlで有ることが測定されていた。全ての心臓は、潅流溶液にいずれかの抗体を添加する前に、ランゲンドルフ装置中で10〜15分間平衡化した。抗体添加10分後、4%ヒト血漿を潅流媒体(250 ml、循環)に添加した。冠状潅流圧(CPP)、左心室収縮期圧(LVSP)、左心室拡張末期圧(LVEDP)及び左心室発生圧力(LVDP)を包含する血液動力学的変数を、抗体添加前(ベースライン)、4%ヒト血漿添加前及びその後10分間毎に60分間記録した。
【0076】
MAb 166-32(0.3μg/ml)は、MAb G3-519(0.3μg/ml)で処理した心臓に比較して、4%ヒト血漿にさらされた際の冠状潅流圧(CPP)の増加を弱めた。CPPの増加は、心筋組織損傷にしばしば付随する、冠状血管抵抗を示す。MAb 166-32で潅流された単離ウサギ心臓は、左心室拡張末期圧(LVEDP)を維持し、これは、MAb G3-519(図15)について得られた結果と顕著に対照的である。後者の群の心臓では、4%ヒト血漿にさらした後、LVEDPが連続的に増大した。これは、拘縮又は拡張期において、心室がリラックスできないことを示している(図15)。MAb 166-32はまた、希釈ヒト血漿にさらした後、MAb G3-519で心臓を処理した場合に比較して、左心室発生圧(LVDP)の減少を弱めた(図15)。
【0077】
4%ヒト血漿の存在下で潅流する前、並びに10、30及び60分後に得られた心臓機能の記録を示す。MAb G3-519で処理したウサギ心臓では、10分後においてLVEDPの増加及びLVDPの減少が明らかであり、心室機能はその後の50分間に亘って連続的に損なわれた。一方、MAb 166-32で処理した心臓の心筋機能の維持は、60分間に亘って明らかであった。
【0078】
これらを総合すると、血液動力学的データは、ヒト血漿での攻撃後に心筋機能が全体的に維持されたことによって示されるように、抗D因子MAb 166-32は、単離されたウサギ心臓を、ヒト補体−媒介損傷から保護する。
【0079】
(3) 補体 Bb ELISA
D因子は、結合したB因子の開裂を触媒してBa及びBb断片を生じる。存在するBbの濃度は、D因子活性の指標として働く。市販のELISAキット(Quidel)を用い、単離ウサギ心臓から集めたリンパ液中の活性化成分Bbの濃度を測定した。ヒト補体Bbに対するMAbを用いた分析により、ヒト血漿の存在下におけるウサギ心臓の潅流中のヒト補体系の活性化を測定した。シビアードリンパ管からのリンパ流出物を心尖から集め、液体窒素で直ちに凍結し、分析まで−70℃で貯蔵した。Bb濃度を正規化するために、リンパ流出物の流速を記録し考慮した。
【0080】
4%ヒト血漿で潅流10分後、及びその後の全ての時点において、MAb 166-32で処理した心臓からのリンパ流出物中に存在するBbの濃度は、MAb G3-519で処理した心臓に比較して有意に(p<0.05)低かった(図17)。MAb 166-32で処理したウサギ心臓中での補体活性化産物の生産の減少により、D因子に対する該抗体の阻害活性が確認された。
【0081】
(4) C5b-9 被着の免疫組織化学的位置決定
プロトコールの完了時に、心臓をランゲルドルフ装置から取り外し、横断切片に切断し、液体窒素中で凍結した。心尖及び心房組織は捨てた。切片をO.C.T.化合物包埋媒体(インジアナ州EkhartのMiles, Inc.)中に包埋し、3mに切り、ポリL−リジンをコートしたスライドに載せた。リン酸緩衝塩溶液(PBS)ですすいだ後、切片をPBS中4%パラホルムアルデヒドと共に室温でインキュベートした。心臓切片をPBSですすぎ、1% BSAと共に15分間インキュベートして非特異染色を最小化した。PBSですすいだ後、1:1000希釈のマウス抗ヒトC5b-9 MAb(Quidel)と共に室温で1時間インキュベートした。切片を再度PBSですすぎ、1:320希釈のヤギ抗マウスFITC結合抗体(Sigma)と共に室温で1時間インキュベートした。PBSでの最終のすすぎの後、切片をFluoromount-G (ペンシルバニア州Fort WashingtonのElectron Microscopy Sciences)でマウントし、カバーガラスで保護した。対照は、一次抗体を省略した切片及びアイソタイプ適合マウス抗体IgG1(Sigma)を抗C5b-9MAbに置換した切片を包含した。
【0082】
MAb 166-32及びMAb G3-519処理心臓からの心臓切片を、免疫蛍光染色により、ヒトMAC(又はC5b-9)について調べた。MAb 166-32処理心臓では、MAb G3-519処理心臓と比較して、MAC被着が少なかった。
【0083】
総合すると、ウサギ心臓の生体外試験のデータは、第二補体経路の阻害の結果として、心臓組織損傷の防止におけるMAb 166-32の有効性を示している。補体活性化の阻害は、異種移植片の生存を延長することが示されている(S.C. Makrides, Pharmacological Rev., 1998, 50: 59-87)。従って、MAb 166-32は、ヒト血漿による破壊から異種移植片を保護する治療薬として潜在的に用いられ得る。
【0084】
実施例11: 心−肺バイパスの生体外循環モデルにおける、補体活性化及び炎症反応に対する MAb 166-32 の阻害効果
心−肺バイパス(CPB)を受けた患者は、しばしば全身性炎症反応症候群の徴候を示す。臨床的には、これらの反応は、術後白血球増加、発熱、並びに持続的回復及びときどき重篤な臓器不全に導き得る血管外液蓄積として反映される(J.K. Kirklinら、J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 1983; 86:845-857; L. Nilssonら、Scand. J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 1988; 22: 51-53; P.W. Weerwindら、J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 1995; 110: 1633-1641)。炎症反応は、組織損傷及び損なわれた止血の両方に寄与する体液性及び細胞性の変化から成る。補体活性が、全身性炎症反応の重要な原因であることが示唆されている(P. Haslamら、Anaesthesia, 1980; 25: 22-26; A. Salamaら、N. Eng. J. Med., 1980; 318: 408-414; J. Steinbergら、J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 1993; 106: 1008-1016)。補体活性化は、血液と、生体外循環路を構成するCPB装置の表面との相互作用に起因する(D. Royston, J. Cardiothorac. Vasc. Anesth., 1997; 11:341-354)。アナフィラトキシンC3a及びC5a、オプソニンC3b及び膜攻撃複合物C5b-9を包含する一次炎症性物質は、補体系の活性化後に生成する。C5aは、生体外において、多核白血球PMN(主として好中球を含む)中のMAC-1のCD11b(インテグリン)及びCD18(インテグリン)をアップレギュレートし(M.P. Fletcherら、Am. J. Physiol., 1993; 265:H1750-H1761)、PMNによるリソゾーム性酵素放出を誘起することが示されている。C5b-9は、血小板上でのP-セレクチン(CD62P)の発現を誘起することができ(T. Wiedmerら、Blood, 1991; 78: 2880-2886)、C5a及びC5b-9の両方とも、内皮細胞上でのP-セレクチンの表面発現を誘起する(K.E. Foremanら、J. Clin. Invest., 1994; 94: 1147-1155)。C3a及びC5aは、ヒトマスト細胞の走化性を刺激し(K. Hartmannら、Blood, 1997; 89: 2868-2870)、ヒスタミンの放出を引き起こし(Y. Kubota, J. Dermatol., 1992; 19: 19-26)、これは血管透過性を誘起する(T.J. Williams, Agents Actions, 1983; 13: 451-455)。
【0085】
生体外バイパス循環路中での全血の再潅流は、CPBにおける白血球(J.Kappelamyerら、Circ. Res., 1993; 72: 1075-1081; N. Moatら、Ann. Thorac. Surg., 1993; 56: 1509-1514; C.S. Rinderら、J. Clin. Invest., 1995: 96: 1564-1572)及び血小板(V.L. Jr. Hennesyら、Am. J. Physiol., 1977; 2132: h622-h628; Y. Wachtfogelら、J. Lab. Clin. Med., 1985; 105: 601-607; C.S. Rinderら、上記)の変化並びに補体活性化(P.G. Loubser, Perfusion, 1987; 2: 219-222; C.S. Rinderら、上記; S.T. Baksaasら、Perfusion, 1998; 13: 429-436)を刺激するモデルとしてよく用いられている。このCPBに対する生体外循環路モデルを用いて、ヒト全血における細胞性及び補体活性化を阻害する、抗D因子MAb 166-32の有効性を試験した。
【0086】
(1) 生体外循環路調製
一体化熱交換モジュール(D 901 LILLPUT 1;イタリア国Mirandola(MO)のDIDECO)、一体化心臓切開フィルター付き小児用静脈貯蔵器(D 752 Venomidicard; DIDECO)、潅流管セット(カリフォルニア州IrvineのSorin Biomedical, Inc.)及び多流式ローラーポンプ(ドイツ国MunichのStockert Instruments GmbH)を具備する中空繊維小児用膜酸素供給装置を用いて体外循環路を組み立てた。酸素供給器及び循環路は、Plasma-Lyte A溶液(イリノイ州DeerfieldのBaxter Healthcare Corp.)で下塗りした(primed)。プライム (prime)は、クーラー−ヒーター(Sarns;ミシガン州Ann Arborの3M Health Care)で32℃に暖め、100%酸素を用いたスウィープガス流を毎分0.25リットルに維持しながら500 ml/分で循環させた。血液を循環路に加えた後、スウィープガスを酸素(95%)と二酸化炭素(5%)の混合物に変更した。pH、PCO2、PO2及び潅流物温度は、再循環期間中連続的に監視した。必要に応じ、炭酸水素ナトリウムを添加してpHを7.25〜7.40の範囲に維持した。
【0087】
(2) 体外循環路操作及び試料採取
投薬を受けていない健康なボランティアから5〜10分間に亘って450mlの血液を抜き、ブタヘパリン(終濃度5単位/ml、ニュージャージー州Cherry HillのSlkins-Sinn)及び抗D因子MAb 166-32又はアイソタイプ適合陰性対照MAb G3-519(終濃度18μg/ml)を含むトランスファーパック(Haemo-Pak,ニュージャージー州LakewoodのChartermed, Inc.)に入れた。この抗体濃度は、血液中のD因子のモル濃度の約1.5倍に相当する。体外循環路に血液を加える前に、トランスファーパックから血液試料を「前循環」試料として採取し、「−10分試料」とした。血液は次いで、プライム口から血液を貯蔵器に加えた。プライム液を同時に基端から酸素供給装置の出口に引いて、終循環体積600ml、終ヘマトクリット25〜28%とした。血液は、プライムと共に循環させ、3分間以内に完全な混合を達成した。ベースライン試料を引き、時間0とした。低体温における通常の外科手術の操作を真似るために、循環路を次いで27℃で70分間冷却し、その後37℃に再び戻してさらに50分間維持した(全部で120分間の再循環)。
【0088】
血液試料はまた、10、25、40、55、70、80及び120分後に採取した。直ちに2000 x gで4℃で遠心することにより血漿試料を調製した。第二経路溶血分析及び好中球特異的ミエロペルオキシダーゼ分析のためのアリコートはドライアイス上で直ちに凍結し、次いで−80℃で貯蔵した。ELISAによる補体C3a、C4d、sC5b-9及びBbの測定のためのアリコートは、直ちに等体積の標本安定化媒体 (Quidel)と混合し、ドライアイスで急速凍結し、次いで−80℃で貯蔵した。全血試料は、好中球及び血小板上のそれぞれの活性化細胞表面マーカーCD11b及びCD62Pの免疫染色のために採取した。染色操作中の全血試料の引き続く補体活性化を防止するために、全血1ml当たり10μlの1 M EDTAを添加して終濃度を10mMとした。
【0089】
(3) 第二経路溶血分析
MAb 166-32又はMAb G3-519で処理した循環路からの異なる時点の血漿試料中の第二補体活性は、上記のようにウサギ赤血球細胞を用いて試験した。50μlの各試料(20%)を50μlのGVB/Mg-EGTAバッファーと混合し、30μlのウサギ赤血球(1.7 x 108細胞/ml)を添加した。37℃で30分間インキュベートした後、上清を集め、ELISAプレートリーダーを用いて405 nmの吸光度を読んだ。
【0090】
図18は、MAb 166-32で処理した循環路中の第二補体活性は、該抗体により完全に阻害されるが、MAb G3-519は、対応する循環路中に用いた場合、補体活性には全く影響を与えなかった。これらの結果は、MAb 166-32が、第二補体経路の有能な阻害剤であることを示している。わずか1.5:1(MAb:D因子)のモル比においてさえ、MAb 166-32は第二補体活性を完全に阻害することができる。
【0091】
(4) 補体活性化産物の分析
上記した代受け部分析に加え、2つの体外循環路からの血漿試料中のC3a、sC5b-9、Bb及びC4dの濃度を調べた。これらの物質は、市販のELISAキット(Quidel)を用い、製造者のマニュアルに従って定量した。C5aと同様、sC5b-9は、補体カスケード中のC5コンベルターゼ活性の第二マーカーである。C5a及びsC5b-9の両者とも、C5コンベルターゼによるC5の開裂の結果生じる。補体Bbは、第二補体経路の活性化の特異マーカーであり、一方、C4dは、古典経路の活性化の特異マーカーである。
【0092】
図19及び図20は、MAb 166-32がそれぞれC3a及びsC5b-9の生産を効率的に阻害したが、アイソタイプ適合陰性対照MAb G3-519は阻害しなかったことを示している。MAb 166-32の特異性及び能力は、図21及び図22にさらに明らかにされている。第二補体経路によるBbの生産は、MAb 166-32により完全に阻害されたが、G3-519循環路中のBb濃度は、再循環の間増大した。興味深いことに、MAb 166-32及びG3-519循環路の両者とも、C4dの濃度は有意に異ならなかった。Bb及びC4d濃度についての後者の結果は、体外循環における補体活性化は、主として第二経路を介して媒介されることを強く示している。
【0093】
総合すると、結果は、MAb 166-32が第二補体経路の有能な阻害剤であることを示している。D因子の阻害は、C3a及びsC5b-9形成の減少により示されるように、カスケードの以降の段階における補体活性化を廃止できる。
【0094】
(5) 好中球及び血小板の活性化の分析
好中球及び血小板の活性化は、それぞれ、好中球及び血小板上のCD11b及びCD62Pの細胞表面発現の濃度を測定することにより定量した。好中球のCD11b標識化のために、循環路から回収した全血100μlを、直ちに20μlのフィコエリトリン(PE)-抗−CD11b抗体(clone D12、カリフォルニア州San JoseのBecton Dickinson)と共にマイクロ遠心チューブ中で室温で10分間インキュベートした。次いで、1.4 mlのFACS溶解溶液(Becton Dickinson)を加えて室温で10分間インキュベートして赤血球細胞を溶解し、白血球を固定した。マイクロ遠心チューブを300 x gで5分間遠心した。上清を吸引し、細胞を洗浄のためにPBS中に再懸濁した。マイクロ遠心チューブを再度遠心し、上清を吸引し、細胞を最終的に0.5 mlの1%パラフォルムアルデヒド中に再懸濁し、EPIC-XLフローサイトメーター(フロリダ州マイアミのCoulter Corp)を用いて分析した。好中球細胞数を付随的に同定するための二重標識化のために、5μlのフルオレッセインイソチオシアネート(FITC)-抗-CD15抗体(clone MMA、Becton Dickinson)を加えてPE-抗-CD11b抗体とインキュベートした。
【0095】
血小板のCD62P標識化のために、循環路から回収した全血40μlを、直ちに20μlのPE-抗-CD62P抗体(クローンAC1.2, Becton Dickinson)と共にマイクロ遠心チューブ中で室温で10分間インキュベートした。次いで、混合物を上記したようにFACS溶解溶液で処理した。マイクロ遠心チューブを2000 x gで5分間遠心した。血小板をPBS中で洗浄し、1%パラホルムアルデヒド中で固定し、上記のように分析した。血小板数を付随的に同定するための二重標識化のために、5μlのFITC-抗-CD42a抗体を加えてPE-抗-CD62P抗体とインキュベートした。
【0096】
フローサイトメトリー測定のために、前方−対側方−散乱パラメーター並びにそれぞれFITC-抗-CD15抗体及びFITC-抗-CD42a抗体に基づくライブ−ゲーティング(live-gating)により、PMN(主として好中球を含む)及び血小板細胞数を同定した。バックグランド染色は、アイソタイプ適合標識抗体を用いてゲートした。CD11b及びCD62Pの発現の強度は、平均蛍光強度(MFI)により表した。
【0097】
図23は、MAb 166-32処理体外循環路からの好中球が、MAb G3-519処理循環路からの好中球と比較して、実質的により低いCD11b発現を示したことを示している。これらのデータを上記の他のデータと総合すると、MAb 166-32による第二補体活性化の阻害は、好中球の活性化を防止できることが示されている。
【0098】
同様に、図24は、MAb 166-32処理体外循環路からの血小板が、MAb G3-519処理循環路からの血小板と比較して、実質的により低いCD62P発現を示したことを示している。これらのデータを上記の他のデータと総合すると、MAb 166-32による第二補体活性化の阻害は、血小板の活性化を防止できることが示されている。
【0099】
(6) 好中球特異的ミエロペルオキシダーゼ (MPO) の分析
市販のELISAキット(ミネソタ州MinneapolisのR & D Systems, Inc.)を用いて体外循環路からの血漿試料中の好中球−特異的ミエロペルオキシダーゼ(MPO)の量を定量することにより、好中球の活性化の程度もまた測定した。MPOは、好中球の一次顆粒(アズール)中に貯蔵される。それは、好中球が活性化の間に脱顆粒する際に放出される。従って、MPOは、好中球活性化の可溶性マーカーである。分析は、製造者のマニュアルに従って行った。簡単に述べると、MPOに対する一次MAbでコートされたマイクロプレートの細胞と共に試料をインキュベートした。MPO-MAb複合物は、ビオチンを結合した、ヤギMPO抗血清からのポリクローナル抗体で標識した。分析の最終工程は、アリカリフォスファターゼに共有結合されたアビジンと、ビオチンとのビオチン−アビジン結合に基づく。各試料中のMPOの量は、基質4-ニトロフェニル−フォスフェート(pNPP)を加え、405 nmの吸光度を読むことにより酵素的に測定した。
【0100】
図25は、MAb 166-32で処理した循環路中のMPO濃度は、MAb G3-519循環路中の該濃度よりも実質的に低かったことを示している。これらの結果は、上記した免疫蛍光測定実験におけるCD11bの発現における結果を確認するものである。
【0101】
総合すると、補体、好中球及び血小板についてのデータは、抗D因子MAb 166-32による、体外循環における第二補体活性化を有効に阻害することにより、炎症物質C3a、C5a及びsC5b-9の形成を廃止することができ、従って、好中球及び血小板の活性化を低減することができることを支持している。MAb 166-32並びにその断片、同族体、類似体及び低分子対応物質は、CPBにより引き起こされる臨床的炎症反応を防止又は低減するのに有効であると予想される。
【0102】
実施例12:虚血及び再潅流傷害のイヌモデルにおける MAb 166-32 の効果の研究
実験の開始時に、イヌはMAb 166-32についての虚血及び再潅流に起因する心筋組織の損傷を研究する動物モデルとしては好ましくないかもしれないことが認められたが、MAb 166-32がイヌにおいて、虚血及び再潅流に起因する傷害から心筋組織を保護するかどうかを調べる試験を設計した。溶血分析において、MAb 166-32がイヌD因子を阻害する能力は、ヒトD因子を阻害する能力の多くとも10文の1未満であった(実施例7参照)。この時点で利用できるMAb 166-32の量が限られていたので、MAb 166-32は、冠状内血管を介して心臓に投与した。心臓中でイヌD因子を完全に阻害するように、抗体濃度が、冠状血中で少なくとも60μg/mlの濃度にまで蓄積されることが希望された。投与量は、3.15 mg/kg/注入で、6回の注入に相当するものと計算された。この実験において、MAb G3-519をアイソタイプ適合対照として用いた。
【0103】
簡単に述べると、目的育種(purpose-bred)猟犬を麻酔した。第4肋間腔で左開胸術を行い心臓を露出させた。左冠動脈回旋枝基端を単離し、90分間結紮して虚血を誘起し、続いて6時間再潅流した。抗体は、虚血30分前、再潅流10分前、次いで再潅流中75、150、225及び300分の、合計6回投与した。放射能ミクロスフェアーを異なる時点で注射して局所血流量を測定した。危険面積及び梗塞サイズを測定するために、実験の最後に、心臓をそれぞれエバンスブルー染料及びトリフェニルテトラゾリウムで潅流した。虚血前及び実験の最後に冠状リンパと、頚静脈からの全血を集めた。これらの試料は、注射した抗体の濃度及び第二経路溶解活性を調べるために用いた。
【0104】
これらの結果は、冠状リンパ中でのMAb 166-32の達成可能な最高濃度が約30μl/mlであることを示しており、これは、冠状循環中におけるイヌD因子の完全な阻害に必要な濃度よりもずっと低い。抗体はまた、全身循環中でも検出された。これは、注射した抗体が心臓の外に散逸したことを示唆している。溶血分析からのデータは、第二補体活性が減少しなかったことを示している。これは、抗体濃度が低かったことと符合する。従って、イヌにおけるこれらの実験から、再潅流におけるMAb 166-32の効果についての結論を引き出すことはできない。
【0105】
上記の記述、用語、表現及び実施例は、ひたすら例示的なものであり、限定的なものではない。本発明は、公知か未知かを問わず、上記具体例の全ての均等物を包含する。本発明は、以下の請求の範囲によってのみ限定され、この書類の他のあらゆる部分又は他のあらゆるソースにおけるあらゆる陳述によって限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【図1】 図1は、ELISAにおける、抗D因子モノクローナル抗体(MAb)の精製ヒトD因子への結合を示す。黒丸が付された線はモノクローナル抗体166-11を示す。黒三角が付された線はMAb 166-32を示す。黒菱形が付された線はMAb 166−188を示す。黒正方形が付された線はMAb 166-222を示す。Y軸は、450 nmにおける吸光度(OD)で表される、MAbのD因子に対する反応性を示し、X軸は、MAbの濃度を示す。
【図2】 図2は、10%ヒト血清存在下における、MAb 166-32による未感作ウサギ赤血球細胞(RBC)の第二経路(AP)溶血の阻害を示す。黒正方形が付された線はMAb 166−32を示す。黒丸が付された線は、HIVエンベロープ糖タンパク質gp 120に特異的な、無関係のアイソタイプ適合対照MAb G3-519を示す。Y軸は、本文中にさらに記載したように溶血阻害%を示す。X軸はMAbの濃度を示す。
【図3】 図3は、90%ヒト血清中でのMAb 166-32による、未感作ウサギ赤血球細胞(RBC)の第二経路溶血の阻害を示す。黒正方形が付された線はMAb 166-32を示す。黒丸が付された線は、HIVエンベロープ糖タンパク質gp 120に特異的な、無関係のアイソタイプ適合対照MAb G3-519を示す。Y軸は、本文中にさらに記載したように溶血阻害%を示す。X軸はMAbの濃度を示す。
【図4】 図4は、MAb 166-32が感作ニワトリRBCの古典経路(CP)溶血を阻害しないが、陽性対照である抗ヒトC5MAb 137-76は阻害することを示す。黒丸が付された線は、MAb 137-76を示す。黒菱形及び黒正方形が付された線は、それぞれMAb 166-32及び陰性対照であるMAb G3-519を示す。Y軸は、溶血阻害%を示す。X軸はMAbの濃度を示す。
【図5】 図5は、MAb 166-32による第二経路(AP)溶血の阻害を示す。抗D因子MAb 166-222を用いたアフィニティクロマトグラフィーによりD因子を枯渇させたヒト血清に異なる濃度の精製ヒトD因子を加えることにより、溶血は増大した。分析は、0.3μg/mlの被検MAbの存在下又は非存在下で行った。黒正方形が付された線は、抗体を添加しなかった場合を示す。黒丸が付された線は、MAb 166-32を示す。黒三角が付された線は、無関係なアイソタイプ適合対照MAb G3-519を示す。Y軸は、溶血阻害%を示す。X軸はMAbの濃度を示す。
【図6】 図6は、MAb 166-32による、因子依存性EAC3b細胞溶解の阻害を示す。B因子、P因子及びD因子とのインキュベーションにより、EAC3b細胞の表面上で第二C3コンベルターゼを組み立てた。異なる濃度のMAb 166-32をインキュベーションバッファーに添加してD因子の活性を阻害した。黒正方形が付された線はMAb 166-32を示す。黒丸が付された線は、MAb G3-519を示す。Y軸は、溶血阻害%を示す。X軸はMAbの濃度を示す。
【図7】 図7は、MAb 166-32によるザイモサンからのC3a生産の阻害を示す。ザイモサンは、ヒト血清の存在下において第二補体経路を活性化した。C3aの生産は、ELISAキットを用いて測定した。黒正方形が付された線はMAb 166-32を示す。黒丸が付された線は、無関係なアイソタイプ対照MAb G3-519を示す。Y軸は、C3a生産の阻害%を示す。X軸はMAbの濃度を示す。
【図8】 図8は、MAb 166-32によるザイモサンからのsC5b-9生産の阻害を示す。ザイモサンは、ヒト血清の存在下において第二補体経路を活性化した。sC5b-9の生産は、ELISAキットを用いて測定した。黒正方形が付された線はMAb 166-32を示す。黒丸が付された線は、無関係なアイソタイプ対照MAb G3-519を示す。Y軸は、sC5b-9生産の阻害%を示す。X軸はMAbの濃度を示す。
【図9】 図9は、MAb 166-32及びそのFabによる、未感作ウサギRBCの第二経路溶血の阻害を示す。黒丸が付された線は、MAb 166-32(全IgG)を示す。黒正方形が付された線は、MAb 166-32のFabを示す。Y軸は、溶血阻害%を示す。X軸はMAbの濃度を示す。
【図10】 図10は、未感作ウサギRBCの第二経路溶血における、異なる動物種からの血清中のD因子に対するMAb 166-32の阻害効果を示す。黒正方形が付された線はヒト血清を示す。黒丸が付された線はチンパンジー血清を示す。黒三角が付された線はアカゲザル血清を示す。黒の逆三角形が付された線はヒヒ血清を示す。黒菱形が付された線はカニクイザル血清を示す。白丸が付された線はヒツジ血清を示す。白三角が付された線はイヌ血清を示す。Y軸は、溶血阻害%を示す。X軸はMAb 166-32の濃度を示す。
【図11】 図11は、ELISAにおける、異なるバキュロウイルス発現D因子(「FD」)及びハイブリッドに対するMAb 166-32の反応性を示す。黒正方形が付された線は、ヒトD因子、FD/Hu、を示す。黒丸が付された線はブタD因子、FD/Pig、を示す。黒三角が付された線は、FD/Pighuを示す。黒の逆三角形が付された線は、ハイブリッドタンパク質、FD/Hupig、を示す。黒菱形が付された線は、突然変異タンパク質、FD/VDA、を示す。白丸が付された線は、突然変異タンパク質、FD/L、を示す。白正方形が付された線は、突然変異タンパク質、FD/RH、を示す。白菱形が付された線は、コーティング抗原がないブランクを示す。組換えタンパク質は本文中にさらに記載されている。
【図12】 図12は、キメラ166-32 Fab:(A)pSV2dhfrFd及び(B)pSV2neoのための発現ベクタープラスミドを模式的に示す。黒塗りの箱は、Fd又はμ遺伝子をコードするエクソンを示す。斜線を引いた部分は、後述のように、HCMV-誘導エンハンサー及びプロモーター要素(E-P)を示す。白抜きの箱は、記載したように、ジヒドロ葉酸リダクターゼ(dhfr)及びneo遺伝子である。pSV2プラスミドは、種々の供給源からのDNA部分から成る。すなわち、pBR322 DNA(細い線)は、pBR322のDNA複製開始点(pBR ori)及びラクタマーゼアンピシリン耐性遺伝子(Amp)を含む。より間隔の広いハッチングが付され、記載されたSV40 DNAは、SV40のDNA複製開始点(SV40 ori)、初期プロモーター(5'からdhfr及びneo遺伝子へ)及びポリアデニレーションシグナル(3'からdhfr及びneo遺伝子へ)を含む。SV40由来ポリアデニレーションシグナル(pA)はまた、Fd遺伝子の3’末端にも置かれている。
【図13】 図13は、未感作ウサギRBCの第二経路(AP)溶血の阻害を示す。黒正方形が付された線は、マウスMAb 166-32を示す。黒丸が付された線は、キメラMAb 166-32を示す。黒三角が付された線は、アイソタイプ適合陰性対照抗体G3-519を示す。Y軸は、溶血阻害%を示す。X軸は抗体濃度を示す。
【図14】 図14は、未感作ウサギRBCの第二経路(AP)溶血の阻害を示す。黒正方形が付された線は、キメラ166-32IgGを示す。黒丸が付された線はcFab/9aaを示す。黒三角が付された線は、cFabを示す。Y軸は、溶血阻害%を示す。X軸はIgG及びFabのタンパク濃度を示す。
【図15】 図15は、ヒト血漿で潅流した単離ウサギ心臓の血液動力学的機能に対する抗D因子MAb 166-32処理の効果を示す。左心室拡張末期圧力(LVEDP)は、黒丸(MAb 166-32について)及び黒正方形(MAb G3-519について)で表す。左心室発生圧力(LVDP)は、白丸(MAb 166-32について)及び白正方形(MAb G3-519について)で表す。MAb G3-519は、アイソタイプ適合無関係対照である。
【図16】 図16は、単離ウサギ心臓試験における2つの抗体群による、左心室発生圧力(LVDP)の典型的な結果を示す。上段のパネルは、陰性対照抗体MAb G3-519で処理した心臓の結果を表し、下段のパネルは、MAb 166-32で処理した心臓の結果を表す。MAb G3-519で処理した心臓は、4%ヒト血漿で攻撃した後、LVDPを維持することができなかった。一方、MAb 166-32で処理した心臓は、4%ヒト血漿での潅流60分後においてほとんどベースラインLVDPを維持した。
【図17】 図17は、4%ヒト血漿で潅流した単離ウサギ心臓からの、選択した時点におけるリンパ流出物中のBb濃度を示す。MAb 166-32処理心臓(白丸)からの試料は、MAb G3-519処理心臓(黒正方形)からの試料よりも実質的に少ないBbを含んでいた。p<0.05
【図18】 図18は、MAb 166-32(黒正方形)又はMAb G3-519(黒丸)で処理した体外循環路から異なる時点において回収された血漿試料の第二経路溶血活性を示す。
【図19】 図19は、MAb 166-32(黒正方形)又はMAb G3-519(黒丸)で処理した体外循環路から異なる時点において回収された血漿試料中のC3a濃度を示す。
【図20】 図20は、MAb 166-32(黒正方形)又はMAb G3-519(黒丸)で処理した体外循環路から異なる時点において回収された血漿試料中のsC5b-9濃度を示す。
【図21】 図21は、MAb 166-32(黒正方形)又はMAb G3-519(黒丸)で処理した体外循環路から異なる時点において回収された血漿試料中のBb濃度を示す。
【図22】 図22は、MAb 166-32(黒正方形)又はMAb G3-519(黒丸)で処理した体外循環路から異なる時点において回収された血漿試料中のC4d濃度を示す。
【図23】 図23は、MAb 166-32(黒正方形)又はMAb G3-519(黒丸)で処理した体外循環路から異なる時点において得られた好中球の表面上でのCD11bの発現レベルを示す。CD11bの発現レベルは、免疫細胞蛍光分析により得られた平均蛍光強度(MFI)により表す。
【図24】 図24は、MAb 166-32(黒正方形)又はMAb G3-519(黒丸)で処理した体外循環路から異なる時点において得られた血小板の表面上でのCD62Pの発現レベルを示す。CD62Pの発現レベルは、免疫細胞蛍光分析により得られた平均蛍光強度(MFI)により表す。
【図25】 図25は、MAb 166-32(黒正方形)又はMAb G3-519(黒丸)で処理した体外循環路から異なる時点において回収された血漿試料中の好中球特異的ミエロペルオキシダーゼ(MPO)濃度を示す。
【配列表】
Claims (24)
- (i) ヒトD因子のアミノ酸残基Cys154とCys170の間に位置する領域、又は(ii) Cys154とCys170の間の領域を含むヒトD因子の領域に結合し、約1.5:1(抗体:D因子)のモル比でヒト血液中での第二経路を介する補体活性化を完全に阻害する、抗体又はその断片。
- アメリカン タイプ カルチャー コレクションにHB-12476の受託番号で寄託されているハイブリドーマにより産生される抗体166-32が結合する、D因子の同一エピトープに結合する、抗体又はその断片。
- (i) ヒトD因子のアミノ酸残基Cys154とCys170の間に位置する領域、又は(ii) Cys154とCys170の間の領域を含むヒトD因子の領域に結合し、治療用途に有効な抗体:D因子のモル比でヒト血液中での第二経路を介する補体活性化を完全に阻害する、抗体又はその断片。
- 補体活性化の阻害は、10%又は90%ヒト血清の存在下における未感作ウサギ赤血球の第二経路溶血の阻害を指標として体外で測定される請求項1又は3記載の抗体又はその断片。
- (i) ヒトD因子のアミノ酸残基Cys154とCys170の間に位置する領域、又は(ii) Cys154とCys170の間の領域を含むヒトD因子の領域に結合する抗体又はその断片。
- 前記抗体又はその断片は精製されたものである請求項1、2、3又は5記載の抗体又はその断片。
- (i) アミノ酸残基Arg156及びHis159が存在しないヒトD因子突然変異体、又は(2) アミノ酸残基Leu168が存在しないヒトD因子突然変異体には結合しない請求項1、2、3又は5記載の抗体又はその断片。
- 抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、脱免疫化(deimmunized)抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体である請求項1、2、3又は5記載の抗体又はその断片。
- Fab、(Fab')2、Fv又は単鎖Fvである請求項1、2、3、5、6又は8記載の抗体断片。
- マウスの可変領域とヒトの定常領域とを含むキメラFabである請求項9記載の抗体断片。
- アメリカン タイプ カルチャー コレクションにHB-12476の受託番号で寄託されているハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体166-32又はそのD因子結合性断片。
- Fab、(Fab')2、Fv又は単鎖Fvである請求項11記載のモノクローナル抗体166-32の断片。
- 請求項11記載のモノクローナル抗体166-32の可変領域とヒト定常領域とを含む、キメラ抗体又はそのD因子結合性断片。
- 請求項11記載のモノクローナル抗体166-32のヒト化抗体又はそのD因子結合性断片。
- Fab、(Fab')2、Fv又は単鎖Fvである請求項13又は14記載の抗体断片。
- アメリカン タイプ カルチャー コレクションにHB-12476の受託番号で寄託されている、モノクローナル抗体166-32を産生するハイブリドーマ。
- 請求項13若しくは14記載の抗体若しくはそのD因子結合性断片、又は請求項9、12若しくは15記載の抗体断片を産生するセルライン。
- 請求項1、2、3、5、6、8又は9に記載の抗体又はそのD因子結合性断片を含む医薬。
- 請求項11、12、13又は14に記載の抗体又はそのD因子結合性断片を含む医薬。
- 補体系の過度の又は制御できない活性化により媒介される疾病又は状態の治療剤である請求項18又は19記載の医薬。
- 前記疾病又は状態は、虚血−再潅流に起因する組織損傷、炎症性疾患、移植拒絶、医薬品副作用、又は自己免疫疾患である請求項20記載の医薬。
- 前記疾病又は状態は、急性心筋梗塞に付随する組織損傷、心−肺バイパスに付随する組織損傷、動脈瘤、卒中、出血性ショック、圧挫損傷、多臓器不全、低血液量性ショック若しくは腸虚血、超急性異種移植片拒絶、IL-2誘導性血管漏出症候群若しくはラジオグラフィーコントラスト媒体アレルギー、火傷、内毒素血症、敗血症性ショック、成人呼吸窮迫症候群、血液透析、アナフィラキシーショック、重症喘息、血管浮腫、クローン病、鎌状細胞貧血、後連鎖球菌性腎炎若しくは膵炎、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、リウマチ性関節炎、アルツハイマー症又は多発性硬化症である請求項20記載の医薬。
- 静脈内注射、静脈内大量注射、又は腹腔内、皮内、筋肉内、皮下、鼻内、気管内、脊髄内、頭蓋内、生体外若しくは経口経路によって患者に投与するのに適した剤形である、請求項18、19、20、21又は22記載の医薬を含む医薬製剤。
- 心−肺バイパスに付随する組織損傷の治療用製剤であって、生体外経路による投与用の剤形である請求項23記載の医薬製剤。
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