KR100425965B1

KR100425965B1 - 보체 활성화의 억제물질

Info

Publication number: KR100425965B1
Application number: KR10-2000-7008454A
Authority: KR
Inventors: 마이클에스.시. 펑; 세실리알.와이. 선; 빌엔.시. 선
Original assignee: 타녹스 인코퍼레이티드
Priority date: 1998-02-20
Filing date: 1999-02-19
Publication date: 2004-04-06
Also published as: AU2870099A; DE69939813D1; CN1298308A; KR20010040585A; SI2033659T1; US7439331B2; CN101298481A; ES2446930T3; EP2033659B1; AU762050B2; JP2002503706A; EP2033659A3; DK2033659T3; EP1054693B8; ATE412431T1; CA2321140A1; CN100366293C; EP1054693B1; US20060240020A1; EP2848634A1

Abstract

본 발명은 D 인자 억제물질에 관하는데, 상기 억제물질은 D인자와 결합하여, D 인자의 보체 활성화 기능을 봉쇄한다. 억제물질에는 항체분자, 이의 상동체, 유사체, 이로부터 변형 또는 유래된 형태(예, 면역글로불린 단편(Fab, F(ab')2, Fv), 소형분자(예, 펩티드), 올리고뉴클레오티드, 유사펩티드, 유기 화합물)가 포함된다. D 인자에 결합하여, 이의 보체활성화 능력을 봉쇄하는 단클론항체를 만들고, 166-32라 칭하였다. 이런 항체를 생산하는 하이브리도마를 ATCC(American Type Culture Collection(10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, Accession Number HB-12476)에 기탁하였다.

Description

보체 활성화의 억제물질{INHIBITORS OF COMPLEMENT ACTIVATION}

보체 시스템은 면역복합체의 제거 및 감염 작용제, 외래 항원, 바이러스-감염된 세포, 종양세포에 대한 면역반응에 중심역할을 한다. 하지만, 보체는 또한, 병인성 염증 및 자가면역질환에 관여한다. 따라서, 보체 캐스케이드의 과도한 또는 무절제한 활성화를 억제하면, 이런 질환 및 이상에 걸린 환자에게 임상적으로 많은 이로움을 줄 수 있다.

보체 시스템은 2개의 상이한 활성경로, 고전적 경로 및 대체 경로를 포함한다(V.M. Holers, In Clinical Immunology: Principles and Practice, ed. R.R. Rich, Mosby Press; 1996, 363-391). 고전적 경로는 칼슘/마그네슘-의존 캐스케이드인데, 이것은 통상적으로, 항원-항체 복합체 형성으로 활성화된다. 대체 경로는 마그네슘-의존 캐스케이드인데, 이것은 특정 표면(예, 효모와 박테리아의 세포벽 다당류, 특정 생체중합 물질)에서 C3의 침착 및 활성화에 의해 활성화된다. 보체 경로가 활성화되면, 보체 단백질의 생물학적 활성단편,

예를 들면, C3a, C4a, C5a 아나필락톡신 및 C5b-9 막 공격 복합체(MAC)가 만들어지는데, 상기 MAC는 백혈구 화학주성과 관련된 염증활성, 대식세포, 호중구, 혈소판, 비만세포, 내피 세포의 활성, 혈관 투과성, 세포용해, 조직손상을 매개한다.

D 인자는 고 특이적 세린 프로테아제로, 대체 보체 경로의 활성에 필수적이 다. 이것은 C3b에 결합한 B 인자를 분할하고, 이로 인해, 대체 경로 C3b/C5 전환효소의 활성성분인 C3/Bb 효소가 만들어진다. D 인자는 억제를 위한 적당한 표적이 되는데, 그 이유는 인체에서, 이의 혈장농도가 매우 낮고(1.8㎍/㎖), 이것이 대체 보체 경로 활성화의 제한효소인 것으로 보이기 때문이다(P.H. Lesavre and H.J. Muller-Eberhard. J. Exp. Med., 1978; 148: 1498-1510; J.E. Volanakis et al., New Eng. J. Med., 1985; 312: 395-401).

보체 활성화의 하향-조절은 동물 모델 및 탈체 연구에서, 악성질병 징후, 예를 들면, 전신 홍반성 루프스와 사구체 신염(Y. Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci.; 1996, 93: 8563-8568), 류머티스 관절염(Y. Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci.; 1995; 92: 8955-8959), 심폐 바이패스와 혈액투석(C.S. Rinder, J. Clin. Invest., 1995; 96: 1564-1572), 장기 이식에서 고민감성 거부반응(T.J. Kroshus et al., Transplantation, 1995; 60: 1194-1202), 심근경색(J. W. Homeister et al., J. Immunol., 1993; 150: 1055-1064; H.F. Weisman et al., Science, 1990; 249: 146-151), 재관류 손상(E.A. Amsterdam et al, Am. J. Physiol., 1995; 268: H448-H457), 성인 호흡곤란증(R. Rabinovici et al., J. Immunol., 1992; 149: 1744-1750)의 치료에 효과적인 것으로 확인되었다. 다른 염증 질환 및 자가면역/면역 복합체 질병 또한, 보체 활성화와 밀접하게 연관하는데(V.M. Holers, ibid., B.P. Morgan. Eur. J. Clin. Invest., 1994: 24: 219-228), 이런 질환에는 열손상, 심한 천식, 아나필락 쇼크, 보웰 염증, 두드러기, 맥관부종, 맥관염, 다발성경화증, 중증근무력증, 막증식성 사구체 신염, 쇼그렌 증후군이 포함된다.

본 발명의 요약

본 발명에는 D 인자 억제물질이 포함되는데, 상기 억제물질은 D 인자와 결합하여, 대체 경로 보체 활성화에서 D 인자 보체 활성화의 기능활성을 봉쇄한다. 억제물질에는 항체 분자, 이의 상동체, 유사체, 이로부터 변형 또는 유도한 형태가 포함되는데, 이런 변형 또는 유도한 형태의 예로는 Fab, F(ab')₂, Fv와 같은 면역글로불린 단편을 들 수 있다. 또한, D 인자에 결합하여, 이의 기능활성을 봉쇄하는 펩티드, 올리고뉴클레오티드, 유사펩티드, 유기 화합물이 포함된다.

D 인자에 결합하여, 이의 보체 활성화 능력을 봉쇄하는 단클론항체를 만들고, 이를 166-32로 칭하였다. 이 항체를 생산하는 하이브리도마는 ATCC(American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, Accession Number HB-12476)에 기탁하였다.

본 발명은 D 인자에 특이적인 억제물질에 관하고, 또한, 보체 시스템 활성화 및 대체 경로 보체 활성화의 억제시 이런 억제물질의 용도에 관한다.

도1은 ELISA에서, 항-D 인자 단클론항체(MAbs)의 정제된 사람 D 인자로의 결합을 보여준다. 채워진 원(●)으로 표시된 선은 MAb 166-11를 나타낸다. 채워진 삼각형(▲)으로 표시된 선은 MAb 166-32를 나타낸다. 채워진 다이아몬드(◆)로 표시된 선은 MAb 166-188을 나타낸다. 채워진 사각형(■)으로 표시된 선은 MAb 166-222를 나타낸다. Y-축은 450nm에서의 광밀도(OD)로 표현한 인자 D와 MAb의 반응도를 나타내고, X-축은 MAb의 농도를 나타낸다.

도2는 10% 사람 혈청의 존재하에서, 무감작화된 토끼 적혈구(RBC)의 대체 경로(AP) 용혈의 MAb 166-32에 의한 억제를 보여준다. 채워진 사각형으로 표시된 선은 MAb 166-32를 나타낸다. 채워진 원으로 표시된 선은 무관한 이소타입-대응 컨트롤 MAb G3-519를 나타내는데, 상기 G3-519는 HIV 외피 당단백질 gp120에 특이적이다. Y-축은 문장에서 추가로 설명하는 바와 같이, 용혈 억제 %를 나타낸다.

X-축은 MAb의 농도를 나타낸다.

도3은 90% 사람 혈청의 존재하에서, 무감작화된 토끼 적혈구(RBC)의 대체 경로 용혈(AP)의 MAb 166-32에 의한 억제를 보여준다. 채워진 사각형으로 표시된 선은 MAb 166-32를 나타낸다. 채워진 원으로 표시된 선은 무관한 이소타입-대응 컨트롤 MAb G3-519를 나타내는데, 상기 G3-519는 HIV 외피 당단백질 gp120에 특이적이다. Y-축은 문장에서 추가로 설명하는 바와 같이, 용혈 억제 %를 나타낸다. X-축은 MAb의 농도를 나타낸다.

도4는 MAb 166-32가 감작화된 병아리 RBC의 고전적 경로(CP) 용혈을 억제하지 못하는 반면, 양성 컨트롤 항-사람 C5 MAb 137-76은 이를 억제한다는 것을 보여준다. 채워진 원으로 표시된 선은 MAb 137-76를 나타낸다. 채워진 다이아몬드와 채워진 사각형으로 표시된 선은 각각, MAb 166-32와 음성 컨트롤 MAb G3-519를 나타낸다. Y-축은 용혈 억제 %를 나타낸다. X-축은 MAb의 농도를 나타낸다.

도5는 MAb 166-32에 의한 대체 경로(AP) 용혈의 억제를 보여준다. 용혈은 상이한 농도의 정제된 사람 D 인자를 사람 혈청에 첨가하여 증폭시켰는데, 상기 사람 혈청은 항-D 인자 D MAb 166-222를 이용한 친화성 크로마토그래피에 의해 D 인자가 고갈된 것이다. 0.3㎍/㎖ 시험 MAb의 존재 또는 부재하에, 분석을 실시하였다. 채워진 사각형으로 표시된 선은 항체 무(無)첨가를 나타낸다. 채워진 원으로 표시된 선은 MAb 166-32를 나타낸다. 채워진 삼각형으로 표시된 선은 무관한 이소타입-대응 컨트롤 MAb G3-519를 나타낸다. Y-축은 용혈 억제 %를 나타낸다. X-축은 D 인자의 농도를 나타낸다.

도6은 D 인자-의존 EAC3b 세포용해의 MAb 166-32에 의한 억제를 보여준다. 대체 C3 전환효소는 B 인자, P 인자, D 인자로 배양하여 EAC3b 세포에서 조합하였다. 상이한 농도의 MAb 166-32를 배양버퍼에 첨가하여 D 인자의 활성을 억제하였다. 채워진 사각형으로 표시된 선은 MAb 166-32를 나타낸다. 채워진 원으로 표시된 선은 MAb G3-519를 나타낸다. Y-축은 용혈 억제 %를 나타낸다. X-축은 MAb의 농도를 나타낸다.

도7은 자이모산(Zymosan)으로부터 C3a 생산의 MAb 166-32에 의한 억제를 보여준다. 자이모산은 사람 혈청의 존재하에서, 대체 보체 경로를 활성화시켰다. C3a의 생산은 ELISA 분석 키트를 이용하여 측정하였다. 채워진 사각형으로 표시된 선은 MAb 166-32를 나타낸다. 채워진 원으로 표시된 선은 무관한 이소타입-컨트롤 MAb G3-519를 나타낸다. Y-축은 C3a 생산의 억제 %를 나타낸다. X-축은 MAb의 농도를 나타낸다.

도8은 자이모산(Zymosan)으로부터 sC5b-9 생산의 MAb 166-32에 의한 억제를 보여준다. 자이모산은 사람 혈청의 존재하에서, 대체 보체 경로를 활성화시켰다. sC5b-9의 생산은 ELISA 분석 키트를 이용하여 측정하였다. 채워진 사각형으로 표시된 선은 MAb 166-32를 나타낸다. 채워진 원으로 표시된 선은 무관한 이소타입-컨트롤 MAb G3-519를 나타낸다. Y-축은 sC5b-9 생산의 억제 %를 나타낸다. X-축은 MAb의 농도를 나타낸다.

도9는 무감작화된 토끼 RBC의 대체 경로 용혈의 MAb 166-32 및 이의 Fab에 의한 억제를 보여준다. 채워진 원으로 표시된 선은 MAb 166-32(전체 IgG)를 나타낸다. 채워진 사각형으로 표시된 선은 MAb 166-32의 Fab를 나타낸다. Y-축은 용혈 억제 %를 나타낸다. X-축은 MAb의 농도를 나타낸다.

도10은 무감작화된 토끼 RBC의 대체 경로 용혈에서, 다른 동물종으로부터 얻은 혈청에서 D 인자에 대한 MAb 166-32의 억제효과를 보여준다. 채워진 사각형으로 표시된 선은 사람 혈청을 나타낸다. 채워진 원으로 표시된 선은 침팬지 혈청을 나타낸다. 채워진 삼각형으로 표시된 선은 붉은털 원숭이 혈청을 나타낸다. 채워진 역삼각형(▽)으로 표시된 선은 개코원숭이를 나타낸다. 채워진 다이아몬드로 표시된 선은 게잡이원숭이를 나타낸다. 열린 원(○)으로 표시된 선은 양 혈청을 나타낸다. 열린 삼각형(△)으로 표시된 선은 개 혈청을 나타낸다. Y-축은 용혈 억제 %를 나타낸다. X-축은 MAb 166-32의 농도를 나타낸다.

도11은 ELISA에서, 상이한 바쿨로바이러스(Baculovirus)-발현된 D 인자("FD") 변이체 및 하이브리드와 MAb 166-32의 반응을 보여준다. 채워진 사각형으로 표시된 선은 사람 D 인자, FD/Hu를 나타낸다. 채워진 원으로 표시된 선은 돼지 D 인자, FD/Pig를 나타낸다. 채워진 삼각형으로 표시된 선은 FD/Pighu를 나타낸다. 채워진 역삼각형으로 표시된 선은 하이브리드 단백질, FD/Hupig를 나타낸다. 채워진 다이아몬드로 표시된 선은 변이체 단백질, FD/VDA을 나타낸다. 열린 원으로 표시된 선은 변이체 단백질, FD/L을 나타낸다. 열린 삼각형으로 표시된 선은 변이체 단백질, FD/RH을 나타낸다. 열린 다이아몬드로 표시된 선은 무(無)피복 항원의 대상물을 나타낸다. 재조합 단백질은 본문에서 추가로 설명한다.

도12는 키메라 166-32 Fab에 대한 발현벡터 플라스미드: (A)pSV2dhfrFd, (B)pSV2neok의 개요도를 보여준다. 무늬없는 박스는 Fd 또는 k 유전자를 인코드한 엑손을 나타낸다. 교차 평행선무늬 부분은 아래에서 지시한 바와 같이, HCMV-유도된 증폭제 및 프로모터 요소(E-P)를 나타낸다. 열린 박스는 표시한 바와 같이, 디하이드로폴레이트 환원효소(dhfr)와 neo 유전자이다. pSV2 플라스미드는 다양한 공급원으로부터 얻은 DNA 분절로 이루어진다: pBR322 DNA(엷은 선)는 pBR322의 DNA 복제기점(pBR ori) 및 락타마제 앰피실린 저항 유전자(Amp)로 이루어진다; 더 넓은 교차 평행선과 기호로 나타낸 SV40 DNA는 SV40의 DNA 복제기점(SV40 ori), 초기 프로모터(dhfr과 neo 유전자의 5'말단), 폴리아데닐화 신호(dhfr과 neo 유전자의 3'말단)을 보유한다. SV40-유도된 폴리아데닐화 신호(pA) 또한, Fd 유전자의 3'말단에 위치한다.

도13은 무감작화된 토끼 RBC의 대체 경로(AP) 용혈의 억제를 보여준다. 채워진 사각형으로 표시된 선은 뮤린 MAb 166-32를 나타낸다. 채워진 원으로 표시된선은 키메라 MAb 166-32를 나타낸다. 채워진 삼각형으로 표시된 선은 이소타입-대응 음성 컨트롤 항체 G3-519를 나타낸다. Y-축은 용혈의 억제 %를 나타낸다. X-축은 항체농도를 나타낸다.

도14는 무감작화된 토끼 RBC의 대체 경로(AP) 용혈의 억제를 보여준다. 채워진 사각형으로 표시된 선은 키메라 166-32 IgG를 나타낸다. 채워진 원으로 표시된 선은 cFab/9aa를 나타낸다. 채워진 삼각형으로 표시된 선은 cFab를 나타낸다. Y-축은 용혈의 억제 %를 나타낸다. X-축은 IgG 및 Fab의 단백질 농도를 나타낸다.

도15는 사람 혈장을 관류한 분리된 토끼 심장의 혈류역학적 기능에 대한 항-D 인자 MAb 166-32 처리효과를 보여준다. 좌심실확장종기압(LVEDP)은 채워진 원(MAb 166-32에 대해)과 채워진 사각형(MAb G3-519에 대해)으로 표시하였다. 좌심실확장기압(LVDP)은 열린 원(MAb 166-32에 대해)과 열린 사각형(MAb G3-519에 대해)으로 표시하였다. MAb G3-519는 이소타입-대응 무관한 컨트롤이다.

도16은 분리된 토끼 심장연구에서, 2가지 항체군에 의한 좌심실확장기압(LVDP)의 전형이다. 상부는 음성 컨트롤 항체, MAb G3-519로 처리한 심장을 나타내고, 하부는 MAb 166-32로 처리한 심장을 나타낸다. MAb G3-519 처리한 심장은 4% 사람 혈장으로 자극한후, LVDP를 유지할 수 없었던 반면, MAb 166-32 처리한 심장은 4% 사람 혈장을 60분 관류한 후에도 기준 LVDP를 계속 보유했다.

도17은 선택된 시점에서, 4% 사람 혈장을 관류한 분리된 토끼 심장으로부터 얻은 림프성 유해추출물에서 Bb 농도를 보여준다. MAb 166-32 처리한 심장에서 얻은 샘플(열린 원)은 MAb G3-519 처리한 심장(채워진 사각형)에서 샘플보다, Bb를 훨씬 적게 함유했다(p<0.05).

도18은 상이한 시점에서, MAb 166-32(채워진 사각형) 또는 MAb G3-519(채워진 원)로 처리한 체외 회로에서 수거한 혈장 샘플의 대체 경로 용혈활성을 보여준다.

도19는 상이한 시점에서, MAb 166-32(채워진 사각형) 또는 MAb G3-519(채워진 원)로 처리한 체외 회로에서 수거한 혈장 샘플에서 C3a의 농도를 보여준다.

도20은 상이한 시점에서, MAb 166-32(채워진 사각형) 또는 MAb G3-519(채워진 원)로 처리한 체외 회로에서 수거한 혈장 샘플에서 sC5b-9의 농도를 보여준다.

도21은 상이한 시점에서, MAb 166-32(채워진 사각형) 또는 MAb G3-519(채워진 원)로 처리한 체외 회로에서 수거한 혈장 샘플에서 Bb의 농도를 보여준다.

도22는 상이한 시점에서, MAb 166-32(채워진 사각형) 또는 MAb G3-519(채워진 원)로 처리한 체외 회로에서 수거한 혈장 샘플에서 C4d의 농도를 보여준다.

도23은 상이한 시점에서, MAb 166-32(채워진 사각형) 또는 MAb G3-519(채워진 원)로 처리한 체외 회로에서 수득한 호중구의 표면에서 CD11b의 발현수준을 보여준다. CD11b의 발현수준은 면역세포형광계수분석으로 얻은 평균 형광 강도(MFI)로 표현한다.

도24는 상이한 시점에서, MAb 166-32(채워진 사각형) 또는 MAb G3-519(채워진 원)로 처리한 체외 회로에서 수득한 혈소판의 표면에서 CD62P의 발현수준을 보여준다. CD62P의 발현수준은 면역세포형광계수분석으로 얻은 평균 형광 강도(MFI)로 표현한다.

도25는 상이한 시점에서, MAb 166-32(채워진 사각형) 또는 MAb G3-519(채워진 원)로 처리한 체외 회로에서 수거한 혈장 샘플에서 호중구-특이적 미엘로페록시다제(MPO)의 농도를 보여준다.

서열 목록의 설명

SEQ ID No:1은 사람 D 인자의 뉴클레오티드 서열을 보여준다.

SEQ ID No:2는 사람 D 인자의 아미노산 서열을 보여준다.

SEQ ID No:3은 돼지 D 인자의 뉴클레오티드 서열을 보여준다.

SEQ ID No:4는 돼지 D 인자의 아미노산 서열을 보여준다.

SEQ ID No:5는 MAb 166-32의 V_K유전자를 클로닝하는데 사용한 프라이머다.

SEQ ID No:6은 후술한 바와 같이, MAb 166-32의 V_K유전자를 클로닝하기 위한 어닐링된 어댑터 및 프라이머로 사용하였다.

SEQ ID No:7은 후술한 바와 같이, MAb 166-32의 V_K유전자를 클로닝하기 위한 어닐링된 어댑터로 사용하였다.

SEQ ID No:8은 후술한 바와 같이, MAb 166-32의 V_H유전자를 클로닝하기 위한 3' 프라이머로 사용하였다.

SEQ ID No:9는 MAb 166-32의 V_H유전자를 클로닝하기 위해 사용된 프라이머다.

SEQ ID No:10은 MAb 166-32의 V_H유전자를 클로닝하기 위한 프라이머로 사용하였다.

SEQ ID No:11은 MAb 166-32의 Fd 유전자 PCR을 위한 5'프라이머다.

SEQ ID No:12는 MAb 166-32의 Fd 유전자 PCR을 위한 3'프라이머다.

SEQ ID No:13은 MAb 166-32의 Fd 유전자 PCR을 위한 5'프라이머다.

SEQ ID No:14는 MAb 166-32의 Fd 유전자 PCR을 위한 3'프라이머다.

SEQ ID No:15는 재조합 Fab를 얻기 위하여, Fd에 첨가된 추가 아미노산에 대한 서열이다.

본 발명의 실시와 용도

A.사람 D 인자에 대한 단클론항체(MAb)의 생성

본 발명의 한 구체예에서, 항-사람 D MAb는 사람 혈장 또는 오줌으로부터 정제한 고유 D 인자, 또는 원핵이나 진핵 시스템에 의해 발현된 재조합 D 인자 또는 이의 단편으로 설치류(예, 생쥐, 쥐, 햄스터, 기니 돼지)를 면역하여 생성시킬 수 있다. 면역에는 다른 동물을 사용할 수 있는데, 예를 들면, 비-사람 영장류, 사람 면역글로불린을 발현하는 이종원성 생쥐 , 사람 B 림프구가 이식된 중증 면역결핍(SCID) 생쥐가 있다. 하이브리도마는 통상적 방법으로, 면역된 동물로부터 얻은 B 림프구와 골수종 세포(예, Sp2/0, NS0)를 융합하여 만들 수 있다(G. Kohler and C. Milstein, Nature, 1975: 256: 495-497). 또한, 항-D 인자 항체는파이지-전시 시스템에서, B 림프구로부터 재조합 단일-사슬 Fv 또는 Fab 라이버러리를 선별하여 만들 수 있다. 사람 D 인자에 대한 MAb의 특이성은 효소연결 면역흡착법(ELISA), 웨스턴 면역블라팅 또는 다른 면역화학적 기술로 검사할 수 있다. 보체 활성화에 대한 항체의 억제활성은 대체 경로의 경우, 무감작화된 토끼 또는 기니 돼지 적혈구(RBC)를 이용한 용혈분석으로 평가하고, 고전적 경로의 경우, 감작화된 병아리 또는 양 적혈구(RBC)를 이용한 용혈분석으로 평가할 수 있다. 양성 웰에서 하이브리도마는 제한 희석하여 클론한다. 항체는 사람 D 인자에 대한 특이성 분석을 통한 특성화를 위하여 정제한다.

사람에서 염증 또는 자가면역질환의 치료에 사용하는 경우, 항-D 인자 항체는 가급적, 키메라 항체, 비면역화 항체, 인화 항체 또는 사람 항체로 사용한다. 이런 항체는 면역원성을 줄일 수 있고, 따라서 사람 항-생쥐 항체(HAMA)반응을 회피할 수 있다. 가급적, 항체는 IgG4, IgG2, 또는 다른 유전적으로 돌연변이된 IgG 또는 IgM이 되는데, 이런 유전적으로 돌연변이된 항체는 항체-의존한 세포내독성(S.M. Canfield and S.L. Morrison, J. Exp. Med., 1991: 173: 1483-1491) 및 보체 매개의 세포독성(Y.Xu et al., J. Biol. Chem. 1994: 269: 3468-3474; V.L. Pulito et al., J. Immunol., 1996; 156: 2840-2850)을 증폭시키지 않는다.

키메라 항체는 당분야에 잘 알려진 재조합 과정으로 만드는데, 이것은 동물 변이영역과 사람 불변영역을 갖는다. 인화 항체는 키메라 항체보다 더 많은 사람 펩티드 서열을 보유한다. 인화 항체에서, 항원 결합 및 특이성을 주관하는 상보성결정영역(CDR)은 동물에서 유래한 것인데, 이것은 동물항체에 상응하는 아미노산 서열을 갖고, 분자의 거의 모든 나머지 영역(단, 몇가지 경우에, 변이영역내 골격영역 일부분은 제외)은 사람에서 유래한 것으로, 이의 아미노산 서열은 사람 항체와 상응한다(L. Riechmann et al., Nture, 1988; 332: 323-327; G. Winter, United States Patent No. 5,225,539; C.Queen et al., U.S. patent number 5,530,101).

비면역화된 항체는 T 및 B 세포 에피토프가 제거된 항체다(국제 특허 출원 PCT/GB98/01473). 생체내에 투여되는 경우, 이들은 면역원성이 없거나 또는 거의 없다.

사람 항체는 여러 가지 방법, 예를 들면, 사람 면역글로불린 발현 라이버러리(Stratagene Corp., La Jolla, California)를 이용하여, 사람 항체의 단편(VH, VL, Fv, Fd, Fab 또는 F(ab')₂를 만들 수 있는데, 이들 단편을 이용하여, 키메라 항체를 만드는 것과 유사한 기술로 완전 사람 항체를 작제할 수 있다. 사람 항체는 사람 면역글로불린 게놈을 갖는 이종원성 생쥐에서 만들 수 있다. 이런 생쥐는 Abgenix, Inc.(Fremont, California, and Medarex, Inc., Annandale, New Jersey)에서 구할 수 있다.

또한, H 및 L사슬 Fv 영역이 연결된 단일 펩티드 사슬 결합 분자를 만들 수 있다. 단일 사슬 항체("ScFv") 및 이들의 작제방법은 미국 특허 No. 4,946,778에서 제시한다. 대안으로, Fab를 유사한 방법으로 작제하고, 발현시킬 수 있다(M.J. Evans et al., J. Immunol. Meth., 1995; 184: 123-138). 모든 완전 및 부분 사람항체는 완전 뮤린 MAb보다 면역원성이 덜하고, 이의 단편 및 단일 사슬 항체 또한 면역원성이 덜하다. 따라서, 이런 유형의 항체들은 면역 또는 알레르기 반응을 야기할 가능성이 적다. 결과적으로, 이들은 사람의 생체내에 투여하는 경우, 특히, 반복 또는 장기간의 투여가 필요한 경우에, 완전 동물 항체보다 훨씬 적합하다. 또한, 항체 단편의 크기가 작을수록, 조직 생체이용성이 증가하는데, 이런 조직 생체이용성은 급성 질병징후에서, 더 효율적인 투여량 축적을 위해 필요하다.

항체 D 인자 항체의 변이영역의 분자 구조에서, 분자 모델링 및 합리적인 분자 디자인을 이용하고, 이를 통해, 항체 결합 영역의 분자 구조를 모방하고, D 인자의 활성을 억제하는 소형 분자를 만들고 선별할 수 있었다. 이들 소형 분자는 펩티드, 유사펩티드, 올리고뉴클레오티드 또는 유기 화합물이다. 모방 분자는 염증징후 및 자가면역질환에서 보체 활성화의 억제물질로 사용할 수 있다. 대안으로, 혼합화합물의 적당한 소형 분자 형태 라이버러리를 분리하기 위하여 일반적으로 사용하는 대규모 선별과정을 이용할 수도 있다. 본 발명의 한 구체예에서, 동물(생쥐) 변이영역과 사람 불변영역을 갖는 키메라 Fab를 치료요법적으로 사용하는데, 그 이유는 이것이 완전 면역글로불린보다 소형이고, 따라서, 조직 침투가 더 용이하기 때문이다.

B. 항-인자 D 분자의 용도

본 발명의 항-D 인자 결합 분자, 항체, 이의 단편은 다양한 루트를 통해, 다양한 제약학적 조성물로 환자에게 투여할 수 있는데, 상기 루트의 예로 정맥내 주입, 정맥내 거환주사, 복강, 경피, 근육내, 피하, 비강, 기관내, 척수내, 두개골내, 경구루트를 들 수 있지만, 이들에 한하지 않는다. 이렇게 투여된 것들은 내인성 D 인자와 결합하고, 따라서, C3b, C3a, C5a 아나필락톡신 및 C5b-9의 발생을 억제할 수 있다.

이런 항체 및 분자의 바람직한 추정용량은 10 내지 500㎍/㎖의 혈청이다. 실제 용량은 최적 용량을 결정하기 위한 통상의 방법, 다시 말하면, 다양한 용량을 투여하고, 가장 효율적인 것을 결정하는 방법에 따른 임상실험으로 결정할 수 있다.

항-D 인자 분자는 생체내 보체 활성화 및/또는 대체 보체 경로, 이에 따른 염증 징후, 예를 들면, 대식세포, 호중구, 혈소판, 비만 세포의 활성화, 부종, 조직손상을 억제할 수 있다. 이들 억제물질은 과도한 또는 무절제한 보체 시스템의 활성화에 의한 질병 또는 이상의 치료에 사용할 수 있다. 이런 질환 또는 이상의 예로는 (1) 급성 심근경색, 동맥류, 발작, 출혈성 쇼크, 다발성 장기부전, 혈액량 감소성 쇼크, 내장 국소빈혈이후의 국소빈혈-재관류로 인한 조직손상; (2) 염증 질환(예, 내독소혈증, 폐혈증 쇼크, 성인 호흡곤란증, 심폐 바이패스, 혈액투석), 아나필락 쇼크, 심한 천식, 맥관부종, 크로온병, 겸상 적혈구성 빈혈, 스트렙토코커스이후 사구체신염, 췌장염; (3) 이식 거부반응, 예를 들면, 초민감성 이종이식 거부반응; (4) 약물 역반응, 예를 들면, 약물 알레르기, IL-2 유도된 맥관 누출 증후군, 방사선사진 조영제(造影劑) 알레르기를 들 수 있지만, 이들에 한하지 않는다.

본 발명의 억제물질은 또한, 전신 홍반성 루프스, 중증근무력증, 류머티스 관절염, 알츠하이머병, 다발성경화증을 포함하나, 이에 한하지 않는 자가 면역질환의 치료에 사용할 수 있다.

항-D 인자 분자는 조직 견본 또는 체액 샘플(예, 혈청, 혈장, 오줌 또는 척수액)에서, D 인자의 존재를 확인하거나 또는 정량하기 위한 진단용으로 사용할 수도 있다. 이런 목적으로는, 잘 알려진 분석형태, 예를 들면, 면역조직화학 또는 ELISA를 각각 사용할 수 있다. 이런 진단실험은 특정 개체에서 D 인자가 결핍되었는지 또는 과다생산되는지를 결정하는데 유용하다.

C. D 인자 억제물질의 치료요법적으로 효율적인 동물 모델

전술한 다양한 질병징후에서, D 인자 억제물질의 치료요법적 활성은 다양한 염증 및 자가면역 징후에 대한 가용 동물모델을 이용하여 입증할 수 있다. 후술한 실시예에서, 시험관내 실험은 이들의 효능을 입증하는데 적당하다.

사람에서 다양한 보체-관련 임상질환에 적절한 동물 모델을 사용하여, D 인지 억제물질의 생체내 효능을 확인할 수 있다. 이런 질환의 예로는 심근 국소빈혈/재관류 손상(H.F. Weisman et al., Science, 1990; 249: 146-151), 심근 경색(J.W. Homeister et al., J. Immunol. 1993; 150: 1055-1064), 전신 홍반성 루프스 및 사구체 신염(S.K. Datta. Meth. Enzymol., 1988; 162: 385-442; D.J. Salvant and A.V. Cybulsky, Meth. Enzymol., 1988; 162: 421-461), 류머티스 관절염(Y. Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1995; 92: 8955-8959), 성인 호흡곤란증(R. Rabinovici et al., J. Immunol., 1992; 149: 1744-1750), 장기 이식에서 초민감성 거부반응(T.J. Kroshus et al., Transplantation, 1995; 60: 1194-1202), 화상(M.S. Mulligan et al., J. Immunol., 1992; 148: 1479-1485), 심페바이패스(C.S. Rinder et al., J. Clin. Invest., 1995; 96; 1564-1572)를 들 수 있지만, 이들에 한하지 않는다.

본 발명을 실시하고, 이용하는 실시예 및 이의 유용성 입증은 아래에 제시한다.

실시예 1: 항-인자 D MAb의 생성

200㎕의 인산염-완충식염수(PBS)pH7.4에 녹인 완전 프레운드 애쥬번트(Difco Laboratories, Detroit, Michigan)상의 사람 혈청(Advanced Research Technologies, San Diego, CA)으로부터 정제된 25㎍의 D 인자를 8-12주된 수컷 A/J 생쥐(Harlan, Houston, TX)의 피하에 주사하였다. D 인자 제제는 도데실황산나트륨(SDS)-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(PAGE)하여 >95% 순도로 검사하였다. 검사결과, D 인자는 후술한 바와 같이, 용혈에 생물학적활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 2주 간격으로, 불완전 프레운드 애쥬번트상의 25㎍ 사람 D 인자를 생쥐의 피하에 주사하였다. 2주후 및 희생 3일전, 생쥐의 복강에 다시 한번, PBS상의 25㎍ 동일 항원을 주사하였다. 융합을 위해, 면역된 생쥐의 지라로부터 단일 세포 현탁액을 만들고, 이를 Sp2/0 골수종 세포와 융합하였다.

5x10⁸Sp2/0 및 5x10⁸지라 세포는 50% 폴리에틸렌 글리콜(M.W. 1450)(Kodak, Rochester, NY) 및 5% 디메틸설폭사이드(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)를 함유한 배지에서 융합하였다. 이후, 세포는 10% 태아 소 혈청, 100단위/㎖ 페니실린, 100㎍/㎖ 스트렙토마이신, 0.1mM 히폭산틴, 0.4μM 아미노프테린, 16μM 티민딘으로 보충한 이스코브 배지(Gibco, Grand Island, NY)에서, 200㎕ 현탁액당 1.5x 10⁵지라 세포 농도로 조정하였다. 200㎕ 세포 현탁액은 20개의 96-웰 미소배양 평판의 각 웰에 첨가하였다. 10일후, 배양상청액은 ELISA에서 정제된 D 인자와의 반응성 선별을 위하여 뽑아냈다.

Immulon 2(Dynatech Laboratories, Chantilly, VA) 미소실험 평판의 웰은 실온에서 하룻밤동안, 50ng/㎖로 정제된 사람 인자 50㎕로 피복하였다. 피복을 위한 D 인자의 농도가 적어, 고-친화성 항체의 선별이 가능했다. 평판을 명멸(明滅)하여 피복용액을 제거한후, PBS에 녹인 200㎕ BLOTTO(무-지방 분유)를 1시간동안 각 웰에 첨가하여 비-특이적 위치를 봉쇄하였다. 1시간후, 웰은 PBST 버퍼(0.05% Tween 20을 함유한 PBS)로 세척하였다. 각 융합 웰로부터 50㎕ 배양상청액을 수거하고, 50㎕ BLOTTO와 혼합하고, 이후 미소실험 평판의 개별 웰에 첨가하였다. 1시간 배양후, 웰은 PBST로 세척하였다. 결합된 뮤린 항체는 이후, 양고추냉이 페록시다제(HRP) 접합된 염소 항-생쥐 IgG(Fc 특이적)(Jackson ImmunoResearch Labortories, West Grove, PA)와 반응시켜 검출하고, BLOTTO에서 1:2,000로 희석하였다. 색 현상을 위해, 0.1% 3,3,5,5 테트라메틸 벤지딘(Sigma, St. Louis, MO) 및 0.0003% 과산화수소(sigma)를 함유한 페록시다제 기질 용액을 30분동안 웰에 첨가하였다. 반응은 웰당 50㎕ 2M H₂SO₄를 첨가하여 종결시켰다. 450nm에서 반응 혼합물의 OD는 BioTek ELISA 판독기(BioTek Instruments, Winooski, VM)로 판독하였다.

양성 웰로부터 배양상청액은 이후, 2가지 분석검사하였다: i) 후술한 방법에 따라, 무각작화된 토끼 RBC의 대체 경로 용혈의 선-적정된 사람 혈청에 의한 억제, ii) 후술한 방법과 같이, 사람 혈청으로 처리한 자이모산에 의한 C3a 형성의 억제. 이들 양성 웰에서 세포는 제한희석하여 클론하였다. MAb는 다시 한번, ELISA에서 D 인자와의 반응성을 검사하였다. 선별된 하이브리도마는 교반 플라스크에서 생장시키고, 소모된 배양 상청액은 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의한 항체 정제를 위해 수거하였다. 검사결과, 4개의 MAb가 ELISA에서 사람 D 인자와 강하게 반응하였다. 이들 MAb는 166-11, 166-32, 166-188, 166-222(도1)로 칭한다. 이들 중에서, MAb 166-32(IgG1)는 후술한 바와 같이, 무감작화된 토끼 RBC의 대체 경로 용혈을 강하게 억제하였다.

실시예 2:표면 플라스몬 동조방법에 의한 항-D 인자 MAb의 운동상수 결정

MAb 166-11, 166-32, 166-188, 166-22와 사람 D 인자와의 결합에 대한 운동 상수는 BIAcore 장치(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden)를 이용한 표면 플라스몬 동조-기초 측정으로 결정하였다. 모든 결합 측정은 HEPES-완충식염수(HBS)(10mM HEPES, pH 7.4, 150mM NaCl, 3.4mM EDTA, 0.005% P20 계면활성제)에서 25℃로 실시하였다. D 인자의 MAb에 대한 결합비율상수를 측정하기 위하여, 토끼 항-생쥐 IgG(H+L)는 N-히드록시슈시니미드 및 N-에틸-N'-(3-디에틸아미노프로필) 카르보디미드를 이용해 아민결합시켜 CM5 센서칩에 고착시켰다. 개별 MAb는 이후, 상이한 농도로 D 인자를 주사하기전, 피복된 센서칩으로 포획하였다. 결합비율상수(k_assoc)를 측정하기 위하여, D 인자의 5가지 희석물(2.5nM 5nM, 10nM, 15nM, 20nM)은 제조업자가 지시한 농도에 기초하여 만들고, 5㎕/분의 유속으로 유동세포에 주사하였다. 분해비율상수(k_dissoc)를 측정하기 위하여, 100nM D 인자는 5㎕/분의 유속으로 유동세포에 주사하였다. 센서그램(sensorgram)형태인 데이터는 BIAcore 시스템에서 제공한 데이터-적합 프로그램을 이용하여 분석하였다. MAb 166-32는 대량 전달효과의 한계로 인해, 분석형의 신뢰한도를 벗어나는 급속한 k_assoc를 갖기 때문에, 추가의 결합형을 이용하여, 이의 운동상수를 측정하였다. 인자 D는 전술한 바와 같이, 아민결합시켜 센서칩에 고착시키는데, k_assoc측정의 경우, 상이한 농도(5nM, 10nM, 15nM, 20nM, 25nM)의 MAb 166-32, k_dissoc측정의 경우, 200nM의 MAb 166-32를 5㎕/분의 유속으로 센서칩으로 흘러보냈다. 센서그램형태인 데이터는 전술한 바와 같이 분석하였다. BIAcore에서, MAb에 대한 D 인자결합의 운동상수는 표1에 제시한다. MAb 166-32와 166-222는 D 인자에 매우 높은 친화성을 가지며, 이들의 평형 분해상수(K_D)는 0.1nM이하다.

실시예 3:보체-활성화된 용혈의 억제

시험관내 보체 활성화의 억제에서 항-D 인자 MAb의 기능활성을 연구하기 위하여, 2가지 용혈분석을 이용하였다.

대체 경로의 경우, 무감작화된 토끼 RBC는 2mM MgCl₂과 1.6mM EGTA를 함유한 젤라틴/베로날-완충 식염수(GVB/Mg-EGTA)로 3번 세척하였다. 10mM 농도의 EGTA를사용하여, 고전적 경로를 억제하였다(K Whaley et al., in A.W. Dodds (Ed), Complement: A Practical Approach. Oxford University Press, Oxford, 1997, pp. 19-47). 세척된 세포는 1.7x10⁸세포/㎖로 동일 버퍼에서 재-현탁하였다. 각 원형-바닥 96-웰 미소실험 평판에서, 50㎕ 정상 사람 혈청(20%)은 50㎕ GVB/Mg-EGTA 또는 연속희석한 실험 MAb와 혼합하고, 이후 30㎕의 세척된 토끼 RBC 현탁액을 상기 혼합물을 함유한 웰에 첨가하였다. 50㎕의 정상 사람 혈청(20%)은 80㎕의 GVB/Mg-EGTA와 혼합하여, 혈청 본 바탕을 만들었다. 음성 컨트롤의 경우, 이소타입-대응 항-HIV-1 gp120 MAb인 G3-519를 사용하였다. 최종 혼합물은 30분동안 37℃에서 배양하였다. 평판은 이후 마이크로-실험평판 진탕기에서 15초동안 휘저었다. 평판은 이후, 3분동안 300 x g로 원심분리하였다. 상청액(80㎕)은 수거하고, 편평-바닥 96-웰 미소실험평판상의 웰로 옮겨, 405nm에서 OD를 측정하였다. 용혈 억제 %는 100x[(무(無)MAb OD - 혈청 본 바탕 OD) - (유(有) MAb OD- 혈청 본 바탕 OD)]/(무(無)MAb OD - 혈청 본 바탕 OD)으로 정의한다.

도2는 MAb 166-32가 10% 사람 혈청의 존재하에, 투여량-의존방식으로, 무감작화된 토끼 RBC의 대체 경로 용혈을 강하게 억제하는 반면, 무관한 이소타입-대응 컨트롤 MAb G3-519는 그렇지 못하다는 것을 보여준다. MAb G3-519는 HIV 외피 당단백질 gp120에 특이적이다.

90% 사람 혈청에서, MAb 166-32의 억제활성을 검사하는 분석에서, 동결된 사람 혈청은 해동하고, EGTA로 선-처리하여 최종농도를 50mM로 하였다. 10㎕의 연속희석된 MAb 166-32 또는 G3-519는 실온에서 15분동안, 96-웰 미소실험 평판의 중복웰상의 90㎕ EGTA-처리한 사람혈청에 첨가하였다. 30㎕의 세척된 토끼 RBC를 각 웰에 첨가하였다. 평판은 30분동안 37℃로 배양하였다. 평판은 15초동안 평판-진탕기에서 휘젓고, 이후, 3분동안 300 x g로 원심분리하였다. 상청액(80㎕)은 수거하고, 평편-바닥 96-웰 미소실험 평판으로 옮겨 405nm에서 OD를 측정하였다. 각 평판은 혈청 본 바탕으로 30㎕의 버퍼 및 100㎕의 90% 사람 혈청을 함유한 2개의 웰을 보유하고, 또한, 단클론항체의 부재하에, 100㎕의 90% 사람혈청으로 용해한 RBC를 함유한 2개의 웰을 보유하는데, 이것은 전체 용해를 나타낸다. 도3은 MAb 166-32가 90% 사람 혈청의 존재하에서도, 투여량-의존방식으로, 무감작화된 토끼 RBC의 대체 경로 용혈을 강하게 억제한다는 것을 보여준다.

고전적 경로에서, 0.5 mM MgCl₂와 0.15mM CaCl₂를 함유한 젤라틴/베로날-완충식염수(GBV++)에 녹인 병아리 RBC(5 x 10⁷세포/㎖)는 15분동안 4℃로, 8㎍/㎖의 정제된 토끼 항-병아리 RBC면역글로불린(Inter-Cell Technologies, Hopewell, NJ)으로 감작화시켰다. 세포는 이후, GVB⁺⁺로 세척하였다. 사용한 최종 사람 혈청농도는 2%이었다.

도4는 MAb 166-32와 무관한 컨트롤 G3-519가 감작화된 병아리 RBC의 고전적 경로 용혈을 억제하지 못하는 반면, 양성 컨트롤 항-사람 C5 MAb 137-76은 이를 억제한다는 것을 보여준다. 도2, 3, 4의 데이터에서, MAb 166-32가 보체 활성화 대체경로의 억제에 특이적임을 짐작할 수 있다.

실시예 4: MAb 166-32의 D 인자에 대한 특이성

후술한 2번의 용혈분석을 이용하여, MAb 166-32의 사람 D 인자에 대한 특이성을 입증하였다.

(1) 무감작화된 토끼 RBC를 이용한 D 인자 의존 용혈분석의 저해

사람 혈청샘플은 먼저, 항-D 인자 MAb 166-222와 결합된 3M Emphaze 생물지지 배지(Pierce, Rockford, IL)로 채워진 친화성 칼럼에 통과시켜 D 인자를 고갈시켰다. 검사결과, 통과혈청은 D 인자의 완전한 고갈로 인해 대체 경로 용혈을 자극하지 못하였다. 이런 분석방법은 전술한 실시예3의 방법과 유사한데, 단, 다양한 농도의 정제된 D 인자를 D 인자 고갈된 혈청에 첨가하여, 용혈활성을 복원시킨 점은 예외로 한다. 이런 조건하에서, 토끼 RBC의 용혈은 D 인자에 의존하였다. 복원된 용혈은 보충된 D 인자의 농도(0.01㎍/㎖ 내지 2㎍/㎖)에 선형비례하였다(도5). 도5의 데이터는 0.3㎍/㎖의 MAb 166-32가 0.1㎍/㎖ 보충된 D 인자의 존재하에, 무감작화된 토끼 RBC의 용혈을 완전히 억제할 수 있는 반면, 음성 컨트롤 MAb G3-519는 D 인자 의존용혈에 아무런 영향을 주지 않는다는 것을 보여준다. 이들 데이터는 1:2 몰비율(MAb 166-32 대 D 인자)로, MAb 166-32가 사람 D 인자의 생물활성을 효과적으로 억제할 수 있음을 암시한다. 따라서, MAb 166-32은 D 인자에 대한 강력한 고-친화성 항체가 된다. 이 항체는 대체 보체 경로의 활성화에 의해 야기된 질병 또는 징후의 치료에 임상적으로 사용할 수 있다.

(2) EAC3b 세포에서 대체 C3 전환효소 형성의 억제

EAC3b 세포는 사람 C3b(National Jewish Center of Immunology andRespiratory Medicine, Denver, CO)로 피복한 양 RBC이다. 이런 분석에서, 대체 C3 전환효소는 B 인자, P 인자(프로페르딘), D 인자를 첨가하여, EAC3b 세포표면에서 조합하였다. EAC3b세포(5 x 10⁸)는 DGVB⁺⁺배지(0.075mM CaCl₂, 0.25mM MgCl₂, 0.1% 젤라틴, 2.5%(w/w)덱스트로스, 0.01% 아지화나트륨을 함유한 50% 베로날 완충식염수, pH7.2)에서 3번 세척하였다. 세척된 세포는 이후, 1.5 ㎖의 DGVB⁺⁺, P 인자(30㎍), B 인자(20㎍)에서 재현탁시켰다. P 인자와 B 인자는 과도하게 선-결정하였다. 50㎕의 세포현탁액은 원형-바닥 미소실험 평판의 각 웰에 첨가하였다. 이후, D 인자(1.2ng/㎖) 및 연속희석한 MAb 166-32 또는 MAb G3-519의 50㎕ 혼합물은 웰에 첨가하고, 30℃로 15동안 배양하였다. D 인자의 농도(1.2ng/㎖)는 이들 조건하에서, 90%이상 용혈이 가능하도록 선-결정하였다. 배양후, 세포는 GVB-EDTA 배지(10mM EDTA를 함유한 제랄틴/베로날-완충 식염수)에서 2번 세척하였다. 세포는 이후, 30㎕의 GVB-EDTA 배지에서 재현탁시켰다. 용혈을 개시하기 위하여, 100㎕의 기니 돼지 혈청(Sigma)(GVB-EDTA에서 1:10 희석)을 각 웰에 첨가하였다. 혼합물은 이후, 30분동안 37℃로 배양하였다. 미소실험 평판은 이후, 3분동안 300 x g로 원심분리하였다. 상청액은 수거하여 405nm에서 OD를 측정하였다.

도6은 MAb 166-32가 EAC3b 세포의 용해를 억제하는 반면, 무관한 MAb G3-519은 그렇지 못하다는 것을 보여준다. MAb 166-32는 B 인자로부터 D 인자의 분할을 저해하고, 따라서, EAC3b 세포표면에서 C3 전환효소의 형성을 예방한다.

실시예 5:보체-활성화된 자이모겐으로부터 C3a 발생의 MAb 166-32에 의한억제

D 인자에 대한 MAb 166-32의 기능특이성을 추가로 확인하기 위하여, 자이모산(활성화된 효모 입자)에서 대체 보체 활성화에 대한 MAb의 효과를 검사하였다. 자이모산 A(맥주 효모균(Saccharromyces cerevisiae)으로부터, Sigma)(1mg/㎖)는 GVB/Mg-EGTA에서 3번 세척하고, 동일배지에서 1mg/㎖로 재현탁시켰다. 상이한 농도의 25㎕ MAb 166-32 또는 G3-519는 25㎕ 사람혈청(GVB/Mg-EGTA에서 1:5 희석)과 미소관에서 혼합하고, 실온에서 15분동안 배양하였다. 백색중심부에는 항체는 없지만, 평배지와 혈청은 존재했다. 배양후, 50㎕의 세척된 자이모산 현탁액은 각 튜브에 첨가하고, 30분동안 37℃로 배양하였다. 미소관은 이후, 5분동안 2000 x g로 원심분리하고, 상청액은 수거하고, 동등부피의 견본 안정화 용액(Quidel, San Diego, CA)과 혼합하였다. 샘플은 분석할 때까지, -25℃로 동결하였다. 샘플에서 C3a와 sC5b-9의 농도는 제조업자가 제공한 과정에 따라 정량 ELISA 키트(Quidel)로 측정하였다.

도7은 MAb 166-32가 보체-활성화된 자이모산으로부터 C3a 발생을 억제하는 반면, 무관한 MAb G3-519는 아무런 영향을 주지 못한다는 것을 보여준다. 이들 데이터는 MAb 166-32가 D 인자에 의한 C3 전환효소의 형성을 억제한다는 것을 암시한다. MAb 166-32로 D 인자를 완전 억제하면, C3a 생성불능에서와 같이, C3 전환효소의 형성을 효과적으로 봉쇄할 수 있다. 이로 인해, sC5b-9(MAC) 형성억제에서와 같이, C5 전환효소가 보체 캐스케이드의 연이은 단계에서 억제된다(도8).

실시예 6:MAb 166-32의 Fab에 의한 보체-활성화된 용혈의 억제

1가형(monovalent form)의 MAb 166-32가 양친 2가 MAb 166-32처럼 대체 보체 경로의 억제에 효과적인지를 확인하기 위하여, 상업용 시약 키트(Pierce)를 이용한 파파인 절단으로 MAb 166-32의 Fab를 준비하였다. Fab는 이후, 전술한 바와 같이, 무감작화된 토끼 RBC를 이용한 대체 경로 용혈에 대한 억제활성을 검사하였다.

도9는 항체 분자당 2개의 결합위치가 존재한다는 점을 고려하여, 전체 IgG 및 Fab가 대체 보체 활성화의 봉쇄에 유사한 효능을 보인다는 것을 보여준다. 이들 결과는 1가형 MAb 166-32가 활성을 나타내고, D 인자에 대하여 양친 2가 항체와 유사한 효능을 보유한다는 것을 암시한다. 이런 특성은 Fab 또는 단일-사슬 Fv를 대체산물로 이용하려 하려는 경우, 중요하다. 1가형을 사용하는 장점중의 하나는 이들의 크기가 더 적어, 조직침투가 더 효율적이라는 점이다. Mab 166-32의 Fab가 활성을 나타내는 동안, MAb에 의해 인식되는 D 인자에 대한 결합 에피토프는 기능적으로 중요하다.

실시예 7:상이한 동물종에서 얻은 혈청을 이용한 대체 경로 용혈에 대한 MAb 166-32의 효과

상이한 동물종에서 얻은 D 인자와 MAb 166-32의 교차-반응성을 조사하기 위하여, 상이한 동물종으로부터 얻은 혈청을 이용하여 대체 경로 용혈분석을 실시하였다. 상이한 동물종(사람, 붉은털원숭이, 침팬지, 개코원숭이, 게잡이원숭이, 양, 개, 생쥐, 햄스터, 쥐, 토끼, 기니 돼지, 돼지)에서 얻은 새로운 혈청은 먼저, CH50 수치를 검사하였는데, 상기 수치는 무감작화된 토기 RBC의 50% 용해를 성취하기 위한 혈청의 희석수로 정의한다. 이후, 각 혈청의 동일 용혈 활성(CH50)에 대한 MAb 166-32의 억제활성을 검사하고, 비교하였다.

도10은 MAb 166-32가 사람, 붉은털원숭이, 침팬지, 개코원숭이, 게잡이원숭이에서 얻은 혈청에 대하여 강한 억제활성을, 양, 개에서 얻은 혈청에 대하여 중간정도의 억제활성을 갖는다는 것을 보여준다. 이 항체는 생쥐, 햄스터, 쥐, 토끼, 기니 돼지, 돼지에서 얻은 혈청을 억제하지 않는다. 이들 데이터는 MAb 166-32가 사람, 붉은털원숭이, 침팬지, 개코원숭이, 게잡이원숭이, 양, 개가 공유한 D 인자상의 에피토프에 결합한다는 것을 암시한다.

실시예 8:MAb 166-32의 에피토프 지도작성을 위한 사람 D 인자 변이체의 작제

MAb 166-32에 의해 인식되는 사람 D 인자상의 결합에피토프 윤곽을 알기 위하여, 웨스턴 블랏에서 사람 D 인자와 항체의 반응성을 먼저 검사하였다. MAb 166-32는 니트로셀룰로스 막에 고착된 SDS-변형 사람 D 인자(감소된 또는 감소되지 않은)와 반응하지 않았다. 이들 결과에서, MAb 166-32는 고유 D 인자에는 결합하나, 변성된 D 인자와는 결합하지 않는다는 것을 짐작할 수 있다.

MAb 166-32는 실시예 7에서 밝힌 바와 같이, 생쥐 및 돼지 D 인자의 용혈활성을 억제하지 않기 때문에, 사람 D 인자상의 특정 위치와 결합할 가능성이 높은데, 상기 사람 D 인자는 생쥐 및 돼지 D 인자와 아미노산서열에서 상당한 차이가 난다. 이런 개념에 기초하여, MAb 166-32 결합에피토프의 지도작성을 위해 사람 D 인자상의 아미노산 잔기를 돼지 대응부에 해당하는 아미노산 잔기로 치환한 D 인자변이체 및 하이브리드를 다수 만들었다.

(1) D 인자 변이체 및 하이브리드의 작제

사람 D 인자 유전자 분절은 사람 지방세포 cDNA(Clontech, San Francisco, CA)를 주형으로 하고, 적당한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용한 중합효소 연속반응(PCR)으로 수득하였다. 증폭된 DNA 단편은 BamHI 및 EcoRI 제한효소로 절단하고, 절단산물은 바쿨로바이러스(Baculovirus)전이벡터 pVL1393(Pharmingen, San Diego, CA)의 BamHI 및 EcoRI위치에 삽입하여 야생형 pVL1393-D 인자/Hu를 만들었다. 사람 D 인자는 D 인자/Hu로 칭한다. 성숙 사람 D 인자 단백질의 뉴클레오티드 서열 및 유추한 아미노산서열은 SEQ ID NOS: 1과 2에 제시한다(R.T. White et al., J. Biol. Chem., 1992; 267: 9210-9213; GenBank accession number: M84526).

돼지 D 인자 cDNA 클론 pMon24909는 J.L. Miner of University of Nebraska (GenBank accession number: U29948)에서 얻었다. pMon24909의 BamHI-EcoRI 단편을 pVL1393으로 클론하여 pVL1393-D 인자/Pig를 만들었다. 돼지 D 인자는 D 인자/Pig로 칭한다. 성숙 돼지 D 인자 단백질의 뉴클레오티드 서열 및 유추한 아미노산서열은 SEQ ID NOS: 3과 4에 제시한다.

적당한 프라이머를 이용하고, PCR를 반복하여 3개의 사람 D 인자 변이체를 작제하였다. 상동성 비교를 위해 사람과 돼지 D 인자의 아미노산 서열을 정렬한 후, 사람서열상의 아미노산 잔기를 돼지 서열의 상응하는 아미노산 잔기로 치환하여, 아미노산 돌연변이를 성취하였다. 제 1 변이체인 D 인자/VDA는 3개의 아미노산 돌연변이를 보유한다: V113E, D116E, A118P(돌연변이의 속기명, 예를 들면,V113E는 사람 D 인자상의 113번 잔기인 발린(valine)이 돼지 D 인자상의 글루타민산으로 바뀐 것이다). 제 2 변이체인 D 인자/RH는 2개의 아미노산 돌연변이를 보유한다: R156L, H159Y. 제 3 변이체인 D 인자/L은 단일 돌연변이를 보유한다: L168M. 이들 변이체를 인코드한 DNA 서열은 DNA 서열분석으로 확인하였다. 적당한 효소로 절단한후, DNA 단편은 바쿨로바이러스(Baculovirus)전이 벡터 pVL1393의 BamHI 및 EcoRI 위치로 삽입하여, 각각 pVL1393-D 인자/VDA와 pVL1393-D 인자/RH, pVL1393-D 인자/L을 만들었다.

2개의 키메라 사람-돼지 D 인자 하이브리드 또한, 적당한 프라이머를 사용하고, PCR을 반복하여 작제하였다. 제 1 하이브리드인 D 인자/Hupig는 N-말단에 52개의 사람 D 인자-유래 아미노산을 보유하고, 나머지 아미노산은 돼지 D인자로부터 유래한 것이다. 다른 하이브리드인 D 인자/Pighu는 N-말단에 52개의 돼지 D 인자-유래 아미노산을 보유하고, 나머지 아미노산은 사람 D 인자로부터 유래한 것이다. BamHI 및 EcoRI-절단된 DNA 단편은 바쿨로바이러스(Baculovirus)전이 벡터 pVL1393의 BamHI 및 EcoRI 위치로 삽입하여, pVL1393-D 인자/Hupig와 pVL 1393-D 인자/Pighu를 만들었다.

(2)D 인자 변이체 및 하이브리드의 발현

플라스미드의 트랜스펙션, 재조합 바쿨로바이러스(Baculovirus)의 발생, 곤충 세포 Sf9에서 재조합 D 인자 단백질의 생산을 위한 과정은 제조업자의 안내서에 따라 행하였다(Baculovirus Expression Vector System, Pharmingen).

(3)D 인자 변이체 및 하이브리드의 정제

감염된 Sf9 세포의 배양상청액에서 얻은 D 인자 변이체 및 하이브리드 단백질은 정제된 양 항-사람 D 인자 단클론항체를 이용한 친화성 크로마토그래피로 정제하였다(The Binding Site Limited, San Diego, CA). 3㎖의 양 항-사람 D 인자 항체(13.2㎎/㎖)는 결합버퍼(0.1M 보레이트, 0.75M Na₂SO₄, pH9.0)에서 평형유지시키고, 실온에서 2시간동안 4㎖의 울트라링크 생물지지 배지(Prerce)와 결합시켰다. 비드는 먼저, 50mM 디에틸아민(pH 11.5)으로 세척하여 남아있는 반응위치를 모두 포화시키고, 이후, 10mM Tris, 0.15 M NaCl, 5mM EDTA, 1% 트리톤 X-100, 0.02% NaN₃을 함유한 버퍼(pH 8.0)로 세척하였다. 겔은 4℃로 버퍼에 저장하였다. 다양한 바쿨로바이러스(Baculocvirus) 변이체로 감염된 Sf9 세포의 100㎖ 교반배양에서 수거한 배양상청액은 양 항-D 인자 친화성 칼럼을 통과시키는데, 상기 친화성 칼럼은 PBS로 선-평형유지하여, 저장버퍼를 제거하였다. 결합된 D 인자 단백질은 50mM 디에틸아민(pH 11.5)으로 용출시켰다. 수거된 분취물은 1M 헤페스 버퍼를 이용하여, pH 7.0으로 즉시 중화시켰다. 잔류 염은 Millipore 막 한외(限外)여과(M.W. cut-off: 3,000)(Millipore Corp., Bedford, MA)로, PBS와 버퍼 교환하여 제거하였다. 단백질 농도는 BCA 방법(Pierce)으로 결정하였다.

(4)D 인자 ELISA

다양한 D 인자 변이체 및 하이브리드와 MAb 166-32의 반응성은 ELISA로 검사하였다. 상이한 96-웰 미소실험 평판은 PBS에, 0.5㎍/㎖로 100㎕의 각 단백질을 첨가하여 단백질(D 인자/Hu, D 인자/Pig, D 인자/Hupig, D 인자/Pighu, D인자/VDH, D 인자/RH, D 인자/L)로 피복하였다. 실온에서 하룻밤동안 배양한후, 웰은 PBSTB(2% BSA를 함유한 PBST)로 처리하여 남아있는 결합위치를 포화시켰다. 이후, 웰은 PBST로 세척하였다. 100㎕의 연속희석된 MAb 166-32(1㎍/㎖ 내지 0.5ng/㎖)를 실온에서 1시간동안 웰에 첨가하였다. 웰은 이후, PBST로 세척하였다. 결합된 항체는 실온에서 1시간동안 희석된 HRP-염소 항-생쥐 IgG(Fc)(Jackson ImmunoResearch)로 배양하여 검출하였다. 과산화 지질용액은 이후, 전술한 바와 같이, 색 현상을 위해 첨가하였다. OD는 450nm에서, ELISA 판독기를 이용하여 측정하였다.

도11은 MAb 166-32가 D 인자/Hu, D 인자/Pighu, D 인자/VDA와는 반응하지만, D 인자/Pig, D 인자/Hupig, D 인자/RH, D 인자/L과는 반응하지 않는다는 것을 보여준다. ELISA 결과에서, 사람 D 인자의 아미노산 잔기 Arg156, His159, Leu168이 MAb 166-32의 결합에 필수적임을 알 수 있다. 이것은 사람 D 인자의 C-말단영역이 돼지의 C-말단영역으로 치환되는 경우, MAb 166-32가 D 인자/Hupig에 결합하지 않는다는 사실과 일치한다. 아미노산 잔기 Arg156, His159, Leu168은 169번 위치의 메티오닌 잔기 및 Cys154와 Cys170사이의 이황화결합으로 구성된 "메티오닌 루프"에 위치한다(J.E. volanakis et al., In: The Human Complement System in Health and Disease, J.E. Volanakis and M.M. Franks, eds., Marcel Dekker, 1998, pp.49-81). 구조적으로, "메티오닌 루프"는 경직된 1β회전의 일부다. X-레이 결정사진술 연구데이터에서, 이것은 D 인자 분자의 표면에 노출되어 존재하는 것으로 밝혀졌다(S.V.L. Narayana et al., J. Mol. Biol., 1994, 235; 695-708). 하지만,D 인자의 기질특이성 및 촉매작용에 대한 "메티오닌 루프"의 기여는 아직 연구되지 않고 있다(J.E. volanakis et al., Protein Sci., 1996; 5: 553-564). 본 데이터에서, 처음으로 "메티오닌 루프"가 D 인자의 기능활성에 중요한 역할을 한다는 것이 밝혀졌다. MAb 166-32와 이의 Fab는 D 인자상의 이런 영역에 결합하는 경우, D 인자의 촉매작용을 효율적으로 억제할 수 있다.

실시예 9:D MAb 166-32 변이영역 유전자의 클로닝, 키메라 166-32 IgG과 이의 Fab 작제 및 발현

사람에 사용되는 경우, MAb 166-32의 면역원성을 감소시키기 위하여, IgG1의 생쥐 불변영역과 사람 불변영역을 치환한 키메라형 MAb 166-32를 만들었다. 항체의 2가지 키메라형 Fab는 생쥐 불변영역을 사람 대응영역과 치환하여 만들었다. MAb 166-32 변이영역 유전자의 클로닝, 키메라 166-32 IgG과 이의 Fab의 작제 및 발현은 아래에서 상술한다.

(1)항-D 인자 MAb 변이영역 유전자의 클로닝

전체 RNA는 제조업자의 프로토콜(Biotech, Houston, TX)에 따라, RNAzol을 이용하여 항-D 인자 MAb 166-32를 분비하는 하이브리도마 세포로부터 분리하였다. 제 1 가닥 cDNA는 올리고 dT를 프라이머로 이용하여, 전체 RNA로부터 합성하였다. PCR은 면역글로불린 불변(C)영역-유래 3'프라이머 및 뮤린 V_H또는 V_K유전자의 리드 펩티드 또는 제 1 골격영역유래 퇴행 프라이머 세트를 5' 프라이머로 이용하여 실시하였다. V_H의 경우에는, 증폭된 DNA가 눈에 띄었지만, V_K의 경우에는, 예상길이의 DNA 단편은 전혀 증폭되지 않았다. V_H와 V_K유전자 모두, 고정 PCR로 클론하였다.

고정 PCR은 Chen과 Platsucas(Scand. J. Immunol., 1992; 35: 539-549)가 제시한 대로 실시하였다. V_K유전자를 클로닝하는 경우, 이중-가닥 cDNA는 Notl-MAK1 프라이머(5'-TGCGGCCGCTGTAGGTGCTGTCTTT-3' SEQ ID NO:5)를 이용하여 만들었다. 어닐링된 어댑터 AD1 (5'-GGAATTCACTCGTTATTCTCGGA-3' SEQ ID NO:6)과 AD2 (5'-TCCGAGAATAACGAGTG-3' SEQ ID NO:7)는 이중-가닥 cDNA의 5' 및 3'말단에 결찰시켰다. 3'말단의 어댑터는 Notl 절단하여 제거하였다. 절단산물을 PCR에서 주형으로 사용하였는데, AD1 올리고뉴클레오티드는 5'프라이머로, MAK2 (5'-CATTGAAAGCTTTGGGGTAGAAGTTGTTC-3' SEQ ID NO:8)를 3'프라이머로 사용하였다. 대략 500 bp의 DNA를 pUC19로 클론시켰다. 추가 분석을 위해, 12개의 클론을 선별하였다. 7개의 클론이 Sp2/0 V 메시지에 특이적인 CDR3 서열을 보유하는 것으로 밝혀졌는데, 이들은 166-32 하이브리도마 세포계에 대한 융합 상대의 이상형(異常型) k L사슬 메시지로부터 유래한 것으로 보인다.

Notl-MAK1와 MAK2 올리고뉴클레오티드는 뮤린 C_k영역으로부터 유래한 것으로, 각각 C_k유전자의 첫 번째 bp로부터 182bp와 84bp 하류에 존재한다. 3개의 클론을 DNA 서열분석하고, 뮤린 C_k의 일부, 완전 V_k, 리드 펩티드를 포함하는 서열을 만들었다.

V_H유전자를 클로닝하는 경우, 이중-가닥 cDNA는 Notl-MAG1 프라이머(5'- CGCGGCCGCAGCTGCTCAGAGTGTAGA-3' SEQ ID NO:9)를 이용하여 만들었다. 어닐링된 어댑터 AD1과 AD2는 이중-가닥 cDNA의 5' 및 3'에 결찰시켰다. 3'말단의 어댑터는 Notl 절단하여 제거하였다. 절단산물을 PCR에서 주형으로 사용하였는데, AD1 올리고뉴클레오티드 및 MAG2(5'-CGGTAAGCTTCACTGGCTCAGGGAAATA-3' SEQ ID NO:10)를 프라이머로 사용하였다. 500 내지 600 bp 길이의 DNA 단편을 pUC19로 클론시켰다. Notl-MAG1와 MAG2 올리고뉴클레오티드는 뮤린 Cr1영역으로부터 유래한 것으로, 각각 뮤린 Cr1 유전자의 첫 bp로부터 180bp와 93bp 하류에 위치한다. 3개의 클론을 DNA 서열분석하고, Cr1영역의 일부영역, 완전 V_H, 리드펩티드를 포함하는 서열을 만들었다.

(2)키메라 166-32 IgG 및 Fab에 대한 발현벡터의 작제

V_H와 V_K유전자를 PCR에 주형으로 사용하여, 5'말단에는 코자크(Kozak) 서열을, 3'말단에는 조각 공여체를 첨가하였다. 서열을 분석하여 PCR 오류없음을 확인한 후, V_H와 V_K유전자를 각각, 사람 Cr1과 C_k를 보유한 발현벡터 캐세트에 삽입하여, pSV2neoV_H-huCr1과 pSVneoV-huC_k를 만들었다. H- 및 L-사슬 벡터의 CSC 농도차-정제된 플라스미드 DNA를 사용하여, 에렉트로포레이션으로 COS 세포를 트랜스펙션시켰다. 48시간후, 배양상청액은 대략 200ng/㎖의 키메라 IgG를 보유하는지 ELISA로 검사하였다. 세포는 수거하고, 전체 RNA를 만들었다. 제 1 가닥 cDNA는올리고 dT를 프라이머로 이용하여 전체 RNA로부터 합성하였다. 이 cDNA를 PCR에서 주형으로 이용하여, Fd와 k DNA 단편을 만들었다. Fd 유전자의 경우, PCR은(5'-AAGAAGCTTGCCGCCACCATGGATTGGCTGTGGAACT-3' SEQ ID NO:11)를 5'프라이머로 하고, CH1-유래 3'프라이머(5'-CGGGATCCTCAAACTTTCTTGTCCACCTTGG-3' SEQ ID NO:12)를 이용하여 실시하였다. DNA 서열은 사람 IgG1의 완전 V_H와 CH1 도메인을 보유하는 것으로 확인되었다. 적절한 효소로 절단한후, Fd DNA 단편은 발현 벡터 캐세트 pSV2dhfr-TUS의 Hindlll와 BamHI 제한위치로 삽입하여, pSV2dhfrFd(도12A)를 만들었다.

k유전자의 경우, PCR은 (5'-AAGAAAGCTTGCCGCCACCATGTTCTCACTAGCTCT-3' SEQ ID NO:13)를 5'프라이머로 하고, C_k-유래 3'프라이머(5'-CGGGATCCTTCTCCCTCTAACAC TCT-3' SEQ ID NO:14)를 이용하여 실시하였다. DNA 서열은 완전 V_k와 사람 C_k영역을 보유하는 것으로 확인되었다. 적절한 효소로 절단한후,_kDNA 단편은 발현벡터 캐세트 pSV2neo-TUS의 Hind Ⅲ와 BamHI 제한위치에 삽입하여, pSV2neo_k(도12B)를 만들었다. Fd와_k유전자의 발현은 HCMV-유래 증폭제 및 프로모터 요소에 의해 조종된다. Fd 유전자에는 사슬-사이 이황화결합에 관여하는 시스테인 아미노산 잔기가 없기 때문에, 재조합 키메라 Fab는 비-공유결합된 H- 및 L-사슬을 보유한다. 이 키메라 Fab는 cFab라 칭한다.

H 및 L사슬사이 이황화결합을 갖는 재조합 Fab를 수득하기 위하여, 상기 Fd유전자는 사람 IgG1의 접번영역에서 추가된 9개의 아미노산(EPKSCDKTH SEQ ID NO:15)에 대한 코딩서열을 포함하도록 확장하였다. Fd 유전자의 3'말단에 30개의 아미노산을 인코드한 BstEII-BamHI DNA 분절은 확장된 Fd를 인코드한 DNA 분절로 치환하였다. 사람 IgG1의 접번영역에서 추가된 9개의 아미노산을 갖는 확장된 Fd 서열은 DNA 서열분석으로 확인하였다. 이 Fd/9aa 유전자는 발현벡터 캐세트 pSV2dhfr-TUS로 삽입하여, pSV2dhfrFd/9aa를 만들었다. 이 키메라 Fab는 cFab/9aa로 칭한다.

(2)키메라 166-32 IgG과 Fab의 발현

키메라 166-32 IgG를 분비하는 세포계를 만들기 위하여, NSO 세포는 pSV2neoV_H-HuC_r1과 pSV2neoV-huC_k의 정제된 플라스미드 DNA로 에렉트로포레이션하여 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션된 세포는 0.7mg/㎖ G418의 존재하에서 선별하였다. 세포는 혈청-포함 배지를 이용하여, 250-㎖ 교반 플라스크에서 생장시켰다.

키메라 166-32 Fab를 분비하는 세포계를 만들기 위하여, CHO 세포는 pSV2dhfrFd(또는 pSV2dhfrFd/9aa)와 pSV2neo_k의 정제된 DNA로 에렉트로포레이션하여 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션된 세포는 G418 및 메토트렉세이트의 존재하에서 선별하였다. 선별된 세포계는 메토트렉세이트의 농도가 증가함에 따라 증폭되었다. 세포는 제한 희석하여 단일-세포 서브클론하였다. 고-생산 단일-세포 서버클론된 세포계는 이후, 혈청-무(無) 배지를 이용한 100㎖ 교반 배양으로 생장시켰다.

(4)키메라 166-32 IgG의 정제

100㎖ 교반배양의 배양상청액은 10-㎖ PROSEP-A 칼럼(Bioprocessing, Inc., Princeton, NJ)에 적하하였다. 칼럼은 PBS의 10 베드 부피로 세척하였다. 결합된 항체는 50mM 시트르산염 버퍼(pH3.0)로 용출하였다. 정제된 항체를 보유한 분취물에 동등부피의 1M 헤페스(pH 8.0)를 첨가하여, pH를 7.0으로 조정하였다. 잔류 염은 Millipore 막 한외여과(M.W. cut-off: 3,000)로, PBS와 버퍼 교환하여 제거하였다. 정제된 항체의 단백질 농도는 BCA 방법(Pierce)으로 결정하였다.

(5)키메라 166-32 Fab의 정제

키메라 166-32 Fab는 Mab 166-32에 대한 생쥐 항-이디오타입 MAb를 이용한 친화성 크로마토그래피로 정제하였다. 항-이디오타입 MAb는 MAb 172-25-3로 칭한다. 이것은 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)과 접합된 MAb 166-32로 생쥐를 면역하였는데, 특정 MAb 166-32 결합에 대한 선별은 사람 D 인자와 경쟁할 수도 있다.

친화성 크로마토그래피 메트릭스는 실온에서 2시간동안 결합 버퍼(0.1M 보레이트, 0.75M Na₂SO₄, pH 9.0)에서, 25mg MAb 172-25-3과 5㎖ 건조 아즈락톤 비드(UltraLink Biosupport Medium, Pierce)를 혼합하여 만들 수 있다. 이후, 잔류 반응위치는 실온에서 2.5시간동안, 1M 에타올아민(pH 9.0)으로 봉쇄하였다. 비드는 이후, 10mM Tris, 0.15M NaCl, 5mM EDTA, 1% Triton X-100, 0.02% NaN₃을 함유한 버퍼(pH8.0)에서 세척하고, 이후, 4℃에서 보관하였다.

정제를 위해, cFab 또는 cFab/9aa를 생산하는 CHO세포의 교반배양으로 얻은 100㎖의 상청액은 MAb 172-25-3과 결합된 친화성 칼럼에 적하하였다. 칼럼은 이후, 결합된 Fab를 50mM 디에틸아민(pH 11.5)으로 용출하기전, PBS로 완전히 세척하였다. 잔류 염은 전술한 바와 같이, 버퍼 교환으로 제거하였다. 정제된 Fab의 단백질 농도는 BCA 방법(Pierce)으로 결정하였다.

(6)키메라 166-32IgG, cFab, cFab/9aa의 SDS-PAGE

정제된 키메라 166-32 IgG, cFab, cFab/9aa는 SDS-PAGE로 순도 및 분자크기를 분석하였다. 단백질은 멀캡토에탄올 유무(有無)하에 동일버퍼로 처리하였다. 샘플은 이후, 선-염색된 분자량 표준(저분자량 범위)(BIO-RAD LAboratories, Hercules, CA)과 함께, PhastSystem(Amersham Pharmacia Biotech)를 이용하여 선-주조 겔(12.5%)(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)에 걸었다. 겔은 이후, 쿠마시 브릴런트 블루 용액(BIO-RAD)에서 5분동안 염색하고, 이후, 40% 메탄올과 10% 아세트산을 함유한 수용성용액에서 탈색하였다.

cFab, cFab/9aa, 무-감소 및 감소 조건하에 처리된 키메라 IgG의 SDS-PAGE 결과에서, 키메라 IgG는 150kD의 단백질 밴드 및 각각 50kD와 29kD의 헤비(HC)사슬과 라이트(LC)사슬의 2개 단백질 밴드를 갖는다는 것을 알 수 있다. 예상한 대로, cFab/9aa는 무-감소 조건하에서, 40kD의 1개 단백질 밴드만을 갖는데, 이것은 H사슬과 L사슬이 사슬-사이 이황화결합에 의해 연결된다는 것을 암시한다. 한편, cFab는 무-감소 조건하에서, 2개의 단백질 밴드를 보이는데, 이것은 H사슬과 L사슬이 사슬-사이 이황화결합에 의해 연결되지 않는다는 것을 암시한다.

(7) 키메라166-32 IgG, cFab, cFab/9aa의 활성결정

키메라 166-32 IgG, cFab, cFab/9aa의 활성은 전술한 대체 보체 용혈분석으로 결정하였다. 도13은 MAb 166-32의 뮤린형과 키메라형이 D 인자억제에 동일한 효능을 갖는다는 것을 보여준다. 도14는 cFab와 cFab/9aa가 D 인자억제에서 거의 동일한 효능을 갖는다는 것을 보여준다. IgG 분자당 2개의 결합위치가 존재한다는 것을 고려하면, 가장 중요한 점은 2가지 키메라형 Fab의 효능이 키메라 IgG의 효능과 동일하다는 것이다. 또한, 결과에서, 키메라 IgG, cFab, cFab/9aa가 양친 뮤린 MAb 166-32의 효능을 계속 보유한다는 것을 알 수 있다.

실시예 10:사람 혈장을 관류한 토끼 심장의 탈체 모델에서 보체-매개 조직손상의 MAb 166-32에 의한 보호

보체 시스템의 활성화는 이종이식편의 초민감성 거부반응의 원인이 된다. 이것은 보체 고정 항체의 결합, 외래 세포표면에서 대체 경로를 통한 보체의 직접활성화, 외래 장기에 의한 보체 억제의 실패의 결과로 일어난다(J.L.Platt et al., Transplantation, 1991; 52: 937-947). 특정한 종간(種間) 상호작용에 따라, 고전적 경로 또는 대체 경로를 통한 보체 활성화가 주도적으로 나타나긴 하지만, 몇몇 경우에는 두 경로가 동시에 작동되기도 한다(T. Takahashi et al., Immunol. Res., 1997; 16: 273-297). 이전의 연구에서, 초민감성 거부반응은 항-공여체 항체의 부재하에서, 대체 경로의 활성화를 통해 일어날 수 있다는 것이 밝혀졌다(P.S. Johnston et al., Transplant. Proc., 1991; 23: 877-879).

조직손상에서 대체 보체 경로의 중요성을 입증하기 위하여, 항-인자 D MAb 166-32를 탈체 모델에서 시험하였는데, 여기서, 분리된 토끼 심장은 희석된 사람 혈장으로 관류하였다. 이 모델은 이전에, 대체 보체 경로의 활성화로 인해 토끼심근에 손상을 주는 것으로 보였다(M.R. Gralinski et al., Immunopharmacology, 1996: 34: 79-88).

(1)란젠도르프(langendorff) 관류된 토끼 심장:

수컷, New Zealand 흰토끼(2.2-2.4kg)는 경부탈구로 안락사시켰다. 심장은 신속하게 떼어내고, 대동맥을 통하여 관류용 캐뉼라에 결합시켰다. 관류배지는 20-25㎖/분의 일정비율로 전달되는 재순환부피(250㎖) 변형된 크레브스-한세레이트(K-H) 버퍼(pH 7.4, 37℃)로 이루어진다. 버퍼 배지의 조성물(mM/ℓ단위)은 다음과 같다: NaCl, 117; KCl, 4.0; CaCl₂.H₂O, 2.4; MgCl₂.6H₂O, 1.2; NaHCO₃, 25; KH₂PO₄, 1.1; 글루코스, 5.0; L-글루타민산 모노나트륨, 5.0; 포도산나트륨, 2.0; BSA, 0.25%(w/v). K-H 버퍼는 Silastic^TM실험실 등급 관(Dow Corning, Midland, MI)으로 이루어진 가스 다공성 "렁(lung)"을 통과하는데, 상기 관은 55.49m의 길이, 1.47mm의 내부직경, 1.96mm의 외부직경을 갖는다. 막성 "렁(lung)"은 95% O₂/5% CO₂의 혼합물에 지속적으로 노출시켜, 관류배지내 산소분압이 500 mm Hg가 되도록 하였다. 프로토콜 전과정동안, 우심방에 결합된 전극을 통해 심장의 속도를 일정하게 하였다. 속도조절 자극(3Hz, 4msec 지속)은 실험실 방형파 발생기(Grass SD-5, Quincy, MA)로부터 전달하였다. 폐동맥에 폴리에틸렌 관을 캐뉼러하여, 폐동맥 유해방출물의 수거를 용이하게 하는데, 이것은 심장정맥 복구를 의미한다. 상부와 하부 대정맥 및 폐정맥은 손상된 관으로부터 유해방출물의 이탈을 예방하기 위하여 결찰하였다. 좌심실 드레인(drain), 서미서트(thermistor) 프로브, 유액(latex)구는 좌심방을 지나, 좌심실에 위치시켰다. 액-충전 유액구는 경관(硬管)으로 압력전달기와 연결시켜, 좌심실 수축압과 확장종기압을 측정하였다. 좌심실 생성압은 왼심실 수축압과 확장압의 차이로 정의한다. 실심내구는 증류된 물로 팽창시켜, 5mm Hg의 초기 기저 좌심실 수축압과 확장종기압을 얻었다. 심장 관류압은 대동맥 캐뉼러의 측면-팔에 연결된 압력전달기로 측정하였다. 모든 혈류역학적 변수는 다채널 기록기(Grass Polygraph 79D, Quincy, MA)를 이용하여 지속적으로 모니터하였다. 분리된 심장은 실험 전기간동안, 온도-조절 이중-루멘유리실에 밀폐하고, 관류배지를 열보관 및 전달장치를 통과시켜 37℃로 유지시켰다.

(2)항체 처리:

2가지 처리그룹을 사용하여, 사람혈장으로 관류된 분리된 심장토끼에서 보체 활성화 효과를 억제하는 항-D 인자 MAb 166-32의 능력을 결정하였다. 그룹 1: 이소타입-대응 음성 그룹은 HIV-1 gp120에 특이적인 0.3㎍/㎖의 MAb 3G-519(n=6)의 존재하에서, 4% 사람 혈장으로 관류된 심장으로 구성된다. 그룹 2:처리 그룹은 0.3㎍/㎖의 MAb 166-32(n=6)의 존재하에서, 4% 사람 혈장으로 관류된 심장으로 구성된다. 사람 혈장은 새로이 수거한 전체 혈액에서 분리하고, 사용할 때까지 -80℃로 보관하였다. 이 비율의 사람 혈장을 선택하는 이유는 이것이 상당한 기간동안 심근기능을 심각하게 손상시키고, 처리섭생의 효능 평가가 가능하기 때문이다. 이 장치에서 사람 혈장의 농도가 높으면, 심장이 급속히 경축되기 때문에, 저농도에서 약물의 효과를 평가하기가 힘들다. 예비조사에서, 보체 활성화 효과로부터분리된 심장을 보호할 수 있는 최소효과농도는 0.3㎍/㎖인 것으로 밝혀졌다. 모든 심장은 관류배지에 항체를 첨가하기 전, 란겐도르프 장치에서 10-15분동안 평형을 유지시켰다. 항체 첨가 10분후, 4% 사람 혈장을 관류배지(250㎖, 재순환)에 첨가하였다. 심장 관류압(CPP), 좌심실 수축압(LVSP), 좌심실 확장종기압(LVEDP), 좌심실 생성압(LVDP)을 비롯한 혈류역학적 변수는 항체 첨가전(기준), 4% 사람 혈장 첨가전, 이후 60분동안 매 10분마다 기록하였다.

4% 사람 혈장에 노출되는 경우, MAb 166-32(0.3㎍/㎖)는 MAb G3-519(0.3㎍/㎖)로 처리한 심장과 비교할 때, 심장 관류압(CPP)증가를 약화시켰다. CPP의 증가는 심근 조직 손상과 관련된 심장 혈관 저항을 암시한다. MAb 166-32로 관류한 분리된 토끼 심장은 좌심실 확장종기압(LVEDP)을 계속 유지하는데, 이것은 MAb G3-519(도 15)로 얻은 결과와 극히 대조를 이룬다. 후자 그룹의 심장은 4% 사람 혈장에 노출된후, LVEDP가 지속적으로 상승하였는데, 이것은 확장동안 심실의 경축 또는 이완실패를 의미한다(도15). MAb 166-32는 또한, 희석된 사람 혈장에 노출된후, MAb G3-519로 처리한 심장과 비교할 때, 좌심실 생성압(LVDP)의 감소를 약화시켰다(도15).

도16은 4% 사람 혈장의 존재하에서, 관류 10분, 30분, 60분전후에 얻은 심장기능의 기록을 나타낸다. MAb G3-519 처리한 토끼 심장의 LVEDP 점진적 증가 및 LVDP 감소는 10분후에 분명하게 나타나는데, 심실 기능은 이후의 50분동안 점진적으로 악화된다. 한편, MAb 166-32로 처리한 심장의 심실기능은 60분기간동안 계속 유지된다.

또한, 혈류역학 데이터에서, 항-D 인자 MAb 166-32가 분리된 토끼 심장을 사람 보체-매개 손상으로부터 보호한다는 것을 알 수 있는데, 이것은 사람 혈청 자극후, 전반적인 심근기능의 지속으로 확인할 수 있다

(3)보체 Bb ELISA

D 인자는 결합된 B 인자의 분할을 촉진하여, Ba와 Bb 단편을 만든다. 이때, Bb 농도는 D 인자 활성의 지표가 된다. 분리된 토끼 심장에서 수거한 림프액에서, 활성화된 Bb 성분의 농도는 상업적으로 입수가능한 ELISA 키트(Quidel)를 이용하여 측정하였다. 이 분석에서, 사람 보체 Bb에 대항하는 MAb를 이용하여, 사람 혈장의 존재하에서 토끼 심장의 관류동안 사람 보체 시스템의 활성화를 측정하였다. 손상된 림프관에서 나온 림프성 유해방출물은 심첨(心尖)에서 수거하고, 액체질소에서 순간-동결하고, 분석할 때까지, -70℃로 보관하였다. Bb 농도를 정상으로 회복시키기 위하여, 림프성 유해방출물의 유속을 기록하고, 계산하였다.

4% 사람 혈장으로 관류한 후 10분 및 이후의 매 시점에서, MAb 166-32로 처리한 심장에서 나온 림프성 유해방출물상의 Bb는 MAb G3-519로 처리한 심장과 비교할 때, 상당히(p<0.05) 낮은 농도로 존재하였다(도17). MAb 166-32 처리한 토끼 심장에서 보체 활성화 산물 Bb의 생산감소에서, 항체의 D 인자에 대한 억제활성을 확인할 수 있다.

(4)C5b-9 침착의 면역조직화학적 국소화

프로토콜의 종결시점에서, 심장은 란겐도르프 장치로부터 떼어내고, 횡단면으로 절단하고, 액체 질소에 동결시켰다. 심첨 및 심방조직은 버렸다. 조각은O.C.T 화합물 함침 배지(Miles, Inc., Ekhart, IN)에 함침시키고, 3μm로 절단하고, 폴리-L-리신 피복된 슬라이드에 위치시켰다. 인산염-완충 식염수(PBS)로 세척한후, 조각은 실온에서, PBS에 녹인 4% 파라포름알데하이드로 배양하였다. 심장조각은 PBS로 세척하고, 15분동안 1% BSA로 배양하여 비-특이적 염색을 최소화시켰다. PBS로 세척한후, 조각은 실온에서 1시간동안, 1:1,000으로 희석된 뮤린 항-사람 C5b-9 MAb(Quidel)로 배양하였다. 조각은 다시 한번, PBS로 세척하고, 이후, 실온에서 1시간동안, 1:320으로 희석된 염소 항-뮤린 FITC 접합된 항체(Sigma)로 배양하였다. PBS로 최종 세척한후, 조각은 Fluoromount-G(Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA)로 슬라이드에 고정시키고, 커브슬립으로 보호하였다. 컨트롤에는 일차 항체가 제거된 조각 및 항-C5b-9 MAb를 이소타입-대응 뮤린 항체 IgG1(Sigma)로 치환한 조각이 포함되었다.

MAb 166-32와 MAb G3-519 처리한 심장에서 얻은 심장조각은 면역형광염색하고, 사람 MAC(또는 C5b-9) 침착을 조사하였다. MAb 166-32 처리한 심장은 MAb G3-519 처리한 심장과 비하여, MAC 침착 감소를 보였다.

종합적으로, 대체 보체 경로의 억제를 통해 심장 조직의 손상을 예방하는 MAb 166-32의 효능을 토끼 심장의 탈체 연구데이터에서 알 수 있었다. 보체 활성화가 억제되면, 이종이식편의 생존이 연장되는 것으로 보인다(S.C. Makrides, Pharmacological Rev., 1998, 50: 59-87). 따라서, MAb 166-32는 사람 혈장에 의한 파괴로부터 이종이식편을 보호하는 치료요법적 작용제로 사용될 수 있다.

실시예11:심폐 바이패스의 최외 순환모델에서, 보체 활성화 및 염증반응에대한 MAb 166-32의 억제효과

심폐 바이패스(CPB)에 걸린 환자는 자주, 전신 염증 반응증상을 보인다. 임상적으로, 이들 반응은 수술후의 백혈구증가증, 열병, 혈관외 유체 축적으로 나타나는데, 이들은 회복을 더디게 하고, 가끔, 심각한 장기기능 장애를 초래하기도 한다(J.K. Kirklin et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 1983; 86: 845-857; L. Nilsson et al., Scand. J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 1988; 22: 51-53; P.W. Weerwind et al., J. thorac. Cardiovasc. Surg., 1995; 110: 1633-1641). 염증반응은 체액과 세포변화로 이루어지는데, 이런 변화는 조직손상 및 지혈손상의 원인이 된다. 보체 활성은 전신 염증 반응의 일차원인이 된다(P. Haslam et al., Anaesthesia, 1980; 25:22-26; A. Salama et al., N. Eng. J. Med., 1980; 318: 408-414; J. Steinberg et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 1993; 106: 1008-1016). 보체 활성화는 혈액 및 CPB 장치를 구성하는 체외 회로 표면사이의 상호작용에 기인한다(D. Royston, J. Cardiothorac. Vasc. Anesth., 1997; 11:341-354). 일차 염증물질은 보체 시스템의 활성화후 만들어지는데, 이런 보체 시스템에는 아나필락톡신 C3a와 C5a, 오프소닌 C3b, 막공격 복합체 C5b-9가 포함된다. C5a는 시험관내 다형핵 세포 PMN(주로 호중구로 구성)에서, MAC-1 복합체의 CD11b(인테그린)와 CD18(인테그린)을 상향조절하고(M.P. Fletcher et al., Am. J. Physiol., 1993; 265: H1750-1761), PMN에 의한 리소좀 효소 방출을 유도하는 것으로 보인다. C5b-9는 혈소판에서 P-셀렉틴(CD62P)의 발현을 유도할 수 있고(T. Wiedmer et al., Blood, 1991; 78: 2880-2886), C5a와 C5b-9 모두 내피세포에서, P-셀렉틴의 표면발현을 유도한다(K.E. Foreman et al., J. Clin. Invest., 1994; 94: 1147-1155). C3a와 C5a는 사람 비만세포의 화학주성을 자극하고(K. Hartmann et al., Blood, 1997; 89: 2868-2870), 히스타민의 방출을 야기하는데(Y. Kubota, j. Dermatol., 1992; 19: 19-26), 히스타민이 방출되면, 혈관 투과성이 유도된다(T.J. williams, Agents Actions, 1983; 13: 451-455).

체외 바이패스 회로에서 전체 혈액의 시험관내 재순환은 CPB에서, 백혈구(J. Kappelamyer et al., Circ. Res., 1993; 72: 1075-1081; N. Moat et al., Ann. Thorac. Surg., 1993; 56: 1509-1514; C.S. Rinder et al., J. Clin. Invest., 1995: 96: 1564-1572), 혈소판(V.L. Jr. Hennesy et al., Am. J. Physiol., 1977; 2132: H622-H628; Y. Wachtfogel et al., J. Lab. Clin. Med., 1985; 105: 601-607; C.S. Rinder et al., ibid), 보체 활성화(P.G. Loubser, Perfusion, 1987; 2: 219-222; C.S. Rinder et al., ibid; S.T. Baksaas et al., Perfusion, 1998; 13: 429-436)를 자극하기 위한 모델로서 광범위하게 사용되고 있다. 사람 전체 혈액에서, 항-D 인자 MAb 166-32의 세포 및 보체 활성화의 억제효율은 CPB에 대한 이런 체외 순환 모델을 이용하여 조사하였다.

(1)체외 회로 제조

체외 회로는 통합 열교환 모듈이 장착된 중공(中空)-섬유 소아(pediatric)막 산소공급기(D 901 LILLPUT 1; DIDECO, Mirandola (MO), Italy), 통합 심장절개 필터가 장착된 소아정맥 보관장치(D 752 Venomidicard; DIDECO), 관류 배관세트(Sorin Biomedical, Inc., Irvine, CA), 다중공급 롤러 펌프(StockertInstruments GmbH, Munich, Germany)를 이용하여 조립하였다. 산소공급기와 회로소자에 Plasma-Lyte 148 용액(Baxter Healthcare Corp., Deerfield, IL)을 넣었다. 프라임은 냉열기(Sarns; 3M Health Care, Ann Arbor, MI)로 32℃까지 데우고, 500㎖/분으로 순환시키며, 청소가스 유속은 100% 산소를 사용하여, 0.25ℓ/분으로 유지시켰다. 청소가스는 혈액을 회로에 첨가한후, 산소(95%)와 이산화탄소(5%)의 혼합물로 바꾸었다. pH, PC0₂, P0₂, 관류액 온도를 재순환 기간동안 계속하여 모니터하였다. 필요한 경우, 중탄산나트륨을 첨가하여, pH를 7.25-7.40으로 유지하였다.

(2)체외 회로 작동 및 샘플링

5-10분동안, 약물치료 받지 않는 건강한 지원자로부터 450ml의 혈액을 이동 팩(Haemo-Pak; Chartermed, inc., lakewood, NJ)으로 뽑아냈는데, 상기 이동팩은 돼지 헤파린(5단위/㎖, 최종농도; Elkins-Sinn, Cherry Hill, NJ)과 항-D 인자 D MAb 166-32 또는 이소타입-대응 음성 컨트롤 MAb G3-519(18㎍/ml 최종농도)를 보유한다. 항체의 이런 농도는 혈액에서, D 인자 몰농도의 1.5배에 해당한다. 혈액을 체외 회로에 첨가하기전, 이동팩에서 "선-회로 샘플"로 혈액샘플을 취했는데, 이를 "-10분 샘플"로 칭하였다. 혈액은 이후, 프라임 출구를 통하여 보관장치에 첨가하였다. 산소공급기 출구에서 멀리 떨어진 위치에서 프라임액을 뽑아내어, 최종부피는 600ml, 최종 적혈구용적률은 25-28%가 되도록 하였다. 혈액은 프라임과 함께 순환시켜, 3분후에 완전히 섞이게 하였다; 기준샘플을 뽑아내고, O 시간으로 정하였다. 저체온하의 외과수술과정을 흉내내기 위하여, 회로는 70분동안 27℃로 냉각하고, 이후, 50분동안 37℃로 다시 데웠다(총 120분의 재순환).

혈액 샘플은 재순환동안, 10, 25, 40, 55, 70, 80, 120분에 뽑아냈다. 혈장샘플은 4℃에서 2,000xg로, 즉시 원심분리하여 만들었다. 대체 경로 용혈 분석 및 호중구-특이적 미엘로페록시다제 분석을 위해, 일부를 드라이 아이스에 순간-동결시키고, -80℃로 보관하였다. 보체 C3a, C4d, sC5b-9, Bb의 ELISA 측정을 위해, 일부를 견본 안정화 배지(Quidel)의 동등부피와 즉시혼합하고, 드라이 아이스에서 순간-동결시키고, -80℃로 보관하였다. 전체 혈액 샘플은 각각 호중구와 혈소판에서, 활성화 세포 표면 마크 CD11b와 CD62P의 면역염색을 위해 수거하였다. 염색과정동안 전체 혈액 샘플의 연속된 보체 활성화를 예방하기 위하여, 전체 혈액㎖당 10㎕의 1M EDTA를 첨가하여, 최종농도가 10mM이 되도록 하였다.

(3)대체 경로 용혈 분석:

상이한 시점에서, MAb 166-32 처리한 회로와 MAb G3-519 처리한 회로로부터 얻은 혈장샘플에서 대체 보체 활성은 전술한 바와 같이, 토끼 적혈구 세포를 이용하여 검사하였다. 50㎕의 각 샘플(20%)은 30㎕의 토끼 적혈구 세포(1.7 x 10⁸세포/㎖)를 첨가하기전, 50㎕의 GVB/Mg-EGTA 버퍼와 혼합하였다. 30분동안 37℃에서 배양한후, 상청액을 수거하고, ELISA 평판 판독기를 이용하여 450nm에서 OD를 판독하였다.

도18은 MAb 166-32 처리한 회로에서, 대체 보체 활성이 항체에 의해 완전히 억제되는 반면, MAb G3-519는 상응하는 회로에서, 보체 활성에 대해 전혀 영향을주지 못한다는 것을 보여준다. 이 결과에서, MAb 166-32가 대체 보체 경로의 강력한 억제물질임을 짐작할 수 있다. MAb 166-32는 1.5:1의 몰비율(MAb:D 인자)에서도, 대체 보체 활성을 완전히 억제할 수 있다.

(4)보체 활성화 산물의 분석

전술한 용혈분석에 더하여, 2개의 체외 회로에서 얻은 혈장샘플에서, C3a, sC5b-9, Bb, C4d의 수준을 평가하였다. 이들 물질은 제조업자의 안내서를 따라, 상업적으로 입수가능한 ELISA 키트(Quidel)를 이용하여 정량하였다. C5a와 같이, sC5b-9는 완전 캐스케이드에서, C5 전환효소활성에 대한 대체 마크가 된다. C5a와 sC5b-9는 C5 전환효소에 의한 C5의 분할로 만들어진다. 보체 Bb는 대체 보체 경로 활성화에 대한 특이적 마크이며, C4d는 고전적 경로 활성화에 대한 특이적 마크이다.

도19, 20은 MAb 166-32가 각각, C3a와 sCb-9의 생산을 효과적으로 억제하는 반면, 이소타입-대응 음성 컨트롤 MAb G3-519는 그렇지 못하다는 것을 보여준다. MAb 166-32의 특이성과 효능은 도21, 22에 상세히 설명한다. 대체 보체 경로에 의한 Bb의 생산은 MAb 166-32에 의해 완전히 억제되는 반면, G3-519 회로에서 Bb의 수준은 재순환동안 시간이 경과함에 따라 증가한다. 흥미로운 점은 MAb 166-32와 G3 519 회로에서 C4d의 수준은 시간이 경과하여도 그다지 변화하지 않는다는 점이다. Bb와 C4d 수준에 대한 후자의 결과는 체외 순환에서, 보체활성이 대체 경로에 의해 주로 매개된다는 것을 암시한다.

종합하면, 이들 결과는 MAb 166-32가 대체 보체 경로에서 강력한 억제물질이된다는 것을 암시한다. D 인자를 억제하면, 캐스케이드의 연속반응에서 보체 활성을 완전히 제거할 수 있는데, 이것은 C3a와 Sc5b-9 형성의 감소로 알 수 있다.

(5)호중구 및 혈소판의 활성화 분석

호중구 및 혈소판의 활성화는 각각, 호중구 및 혈소판에서 CD11b와 CD62P의 세포-표면 발현의 수준을 측정하여 정량하였다. 호중구의 CD11b 라벨링의 경우, 회로에서 수거한 100㎕의 전체혈액은 미소원심분리관에서 실온으로 10분동안, 20㎕의 피코에리트린(PE)-항-CD11b 항체(클론 D12, Becton Dickinson, San Jose, CA)로 즉시 배양하였다. 이후, 1.4㎖의 FACS 용해 용액(Becton Dickinson)을 실온에서 10분동안 첨가하여, 적혈구를 용해시키고, 백혈구를 고정시켰다. 미소원심분리관은 5분동안 300xg로 원심분리하였다. 상청액은 뽑아내고, 세포는 PBS에서 재현탁하여 세척하였다. 미소원심분리관은 다시 회전시키고, 상청액은 뽑아내고, 세포는 EPIC-XL 유량 혈구계산기(Coulter Corp., Miami, FL)를 이용한 분석직전, 하룻밤동안 0.5㎖의 1% 파라포름알데하이드에 최종적으로 재현탁시켰다. 호중구 개체군을 동시확인하기 위한 이중 라벨링의 경우, 배양을 위해, 5㎕의 플루오레신 이소티오시아네이트(FITC)-항-CD15 항체(클론 MMA, Becton Dickinson)를 PE-항-CD11b 항체와 함께 첨가하였다.

혈소판의 CD62P 라벨링의 경우, 회로에서 수거한 40㎕의 전체혈액은 미소원심분리관에서 실온으로 10분동안, 20㎕의 PE-항-CD62P 항체(클론 AC1.2, Becton Dickinson)로 즉시 배양하였다. 이후, 혼합물은 전술한 바와 같이, FACS 용해 용액으로 처리하였다. 미소원심분리관은 5분동안 2,000xg로 원심분리하였다. 혈소판은 PBS 세척하고, 1% 파라포름알데하이드에 고정시키고, 전술한 바와 같이, 분석하였다. 혈소판 개체군을 동시확인하기 위한 이중 라벨링의 경우, 배양을 위하여, 5㎕의 FITC-항-CD42a를 PE-항-CD62P와 함께 첨가하였다.

유량 혈구계산 측정의 경우, PMN(주로 호중구 함유) 및 혈소판 개체군은 전면-대 측면- 산란 변수 및 각각, FITC-항-CD15와 FITC-항-CD42a 항체와의 특이적 염색에 기초한 라이브-게이팅(live-gating)으로 확인하였다. 바탕 염색은 이소타입-대응 라벨된 항체를 이용하여 조절하였다. CD11b와 CD62P의 발현강도는 형광강도(MFI)로 표현하였다.

도23은 MAb 166-32 처리한 체외 회로에서 얻은 호중구가 MAb G3-519 처리한 회로에서 얻은 호중구에 비하여, 실제적으로 낮은 CD11b 발현을 보인다는 것을 보여준다. 상기 데이터를 종합하면, MAb 166-32로 대체 보체 활성을 억제하는 경우, 호중구의 활성화를 예방할 수 있다는 것을 짐작할 수 있다.

유사하게, 도24는 MAb 166-32 처리한 체외 회로에서 얻은 혈소판이 MAb G3-519 처리한 회로에서 얻은 혈소판에 비하여, 실제적으로 낮은 CD62P 발현을 보인다는 것을 보여준다. 상기 데이터를 종합하면, MAb 166-32로 대체 보체 활성을 억제하는 경우, 혈소판의 활성화를 예방할 수 있다는 것을 짐작할 수 있다.

(6)호중구-특이적 미엘로페록시다제(MPO)의 분석

호중구의 활성화 정도는 상업용 ELISA 키트(R D Systems, Inc., Minneapolis, MN)를 이용하여, 체외 회로로부터 얻은 혈장샘플에서 호중구-특이적 미엘로페록시다제(MPO)의 양을 정량하여 측정하였다. MPO는 호중구의 일차 과립(아주르 친화성)에 저장한다. 이것은 호중구가 활성화동안 탈과립화되면 방출된다. 따라서, MPO는 호중구 활성화의 용해성 마크이다. 이런 분석은 제조업자의 안내서를 따라 실시하였다. 간단히 말하면, 샘플은 미소평판의 셀에서 배양하였는데, 상기 미소평판은 MPO에 대하여, 제 1 MAb로 피복하였다. MPO-MAb 복합체는 염소 MPO-항혈청으로부터 만든 비오틴-연결 다클론항체로 라벨하였다. 상기 분석의 최종단계는 비오딘-아비딘 결합에 기초하였는데, 여기서, 아비딘은 알칼린 포스파타제와 공유결합하였다. 각 샘플에서 MPO의 양은 405nm에서 OD를 판독하여, 기질 4-니트로페닐-인산염(pNPP)을 첨가한 직후에 효소적으로 측정하였다.

도25는 MAb 166-32 처리한 회로에서 MPO 수준이 MAb G3-519 회로에서 MPO 수준보다 실제적으로 낮다는 것을 보여준다. 이런 결과는 전술한 면역형광측정에서, CD11b의 발현결과와 상관관계를 갖는다.

종합하면, 보체, 호중구, 혈소판에 대한 데이터는 체외 순환에서 항-D 인자 D MAb 166-32로 대체 보체 활성화를 효과적으로 억제하면, 염증물질 C3a, C5a, sC5b-9의 형성을 막고, 따라서, 호중구 및 혈소판의 활성화를 감소시킬 수 있다는 가정을 뒷받침한다. MAb 166-32, 이의 단편, 상동체, 유사체, 이에 대응하는 소형분자는 CPB에 의해 야기된 임상적 염증반응의 예방 또는 감소에 효과적일 것으로 예상된다.

실시예 12:국소빈혈 및 재관류 손상의 개 모델에서 MAb 166-32의 효과연구

개에서, MAb 166-32가 국소빈혈 및 재관류에 의한 손상으로부터 심근조직을 보호하는지를 조사하였지만, 개는 MAb 166-32에 대한 징후의 연구에 바람직한 동물모델은 아닌 것으로 인식되고 있다. 용혈분석에서 개 D 인자를 중화시키는 MAb 166-32의 능력은 사람 D 인자에 비하여 10배이상 비효율적이었다(실시예 7). 입수가능한 MAb 166-32의 한정된 양 때문에, MAb 166-32는 심장 혈관을 통해 심장에 투여하였다. 심장에서 개 D 인자를 완전히 억제하기 위하여, 항체의 농도는 심장혈액에서 60㎍/㎖이상이 되도록 하는 것이 바람직하다. 투여량은 6번의 주입동안 3.15mg/kg/주입이 되도록 계산하였다. MAb G3-519는 본 연구에서, 이소타입-대응 컨트롤로 사용하였다.

간단히 말하면, 목적-사육한 사냥개를 마취시켰다. 심장이 노출되도록, 4번 늑간 위치에서 좌개흉술을 실시하였다. 근접 좌회선 심동맥은 분리하고, 90분동안 결찰하여, 국소빈혈을 유도하고, 이후 6시간동안 재관류하였다. 항체는 6번, 다시 말하면, 국소빈혈 30분전, 재관류 10분전, 이후 재관류동안 75분, 150분, 225분, 300분에 투여하였다. 방사활성 미소구체를 상이한 시점에서 주사하여, 부위별 혈류를 측정하였다. 실험 마지막에, 심장은 각각, 에반스(Evans) 블루 염료와 트리페틸테트라졸륨으로 관류하여, 위험부위 및 경색크기를 측정하였다. 경정맥에서 나온 심장 림프와 전체 혈액은 국소빈혈직전과 실험 마지막에 수거하였다. 이들 샘플을 사용하여, 주사된 항체의 농도와 대체 경로 용혈 활성을 측정하였다.

이 결과에서, 심장 림프에서 MAB 166-32의 최고 획득가능 농도가 30㎍/㎖임이 밝혀졌는데, 이 농도는 심장 순환에서 개 D 인자의 완전억제에 필요한 농도보다 훨씬 낮은 것이다. 항체는 또한, 전신순환계에서도 검출되었는데, 이것은 주사된 항체가 심장밖으로 방산된다는 것을 암시한다. 용혈분석 데이터에서, 대체 보체활성이 감소되지 않는다는 것을 알 수 있다. 이것은 항체의 농도가 낮다는 사실과 일맥 상통한다. 따라서, 개 실험으로부터, 재관류에서 MAb 166-32의 효과에 대한 결론을 맺는 것은 불가능하다.

전술한 설명, 용어, 표현, 실시예는 단지 예시한 것으로, 이에 한정하지 않는다. 본 발명에는, 전술한 구체예의 공지된, 비공지된 모든 유사내용이 포함된다. 본 발명은 아래의 청구항으로만 한정하고, 본 문서의 다른 부분의 내용으로는 한정하지 않는다.

Claims

D 인자와 특이적으로 결합하고, ATCC(American Type Culture Collection, Accession)에 기탁되어 수탁번호가 HB-12476인 하이브리도마에 의해 생산되는 것을 특징으로 하는 항체.
제 1 항에 있어서, 1.5:1(억제물질:D 인자)의 몰비율에서 보체 활성화를 억제할 수 있는 것을 특징으로 하는 항체.
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제 2 항에 있어서, 사람 D 인자의 영역중 아미노산 잔기 Cys(154번)와 Cys(170번)사이의 영역에 결합하는 것을 특징으로 하는 항체.
제 6항에 있어서, 아미노산 잔기 Arg(156번), His(159번), Leu(168번)이 없는 경우, 사람 D 인자에 결합하지 않는 것을 특징으로 하는 항체.
제 1항에 있어서, 항체는 단클론항체 166-32인 것을 특징으로 하는 항체.
제 8항에 있어서, 항체는 단클론항체 166-32의 Fab, F(ab')2, Fv 또는 단일사슬 Fv인 것을 특징으로 하는 항체.
제 1 항에 있어서, 항체는 키메라 항체, 비면역화 항체, 인화(人化) 항체 또는 사람 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
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단클론항체 166-32를 생산하는 하이브리도마에 있어서, ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁되고, 수탁번호가 HB-12476인 것을 특징으로 하는 하이브리도마.
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제 9 항에 있어서, 항체의 Fab 단편은 생쥐의 가변 영역과 사람의 불변 영역으로 구성된 키메라 형태로 구성된 것을 특징으로 하는 항체.
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제 15 항에 따른 단편을 생산하는 것을 특징으로 하는 세포주.
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제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 항체는 보체 시스템의 과도한 또는 무절제한 활성으로 인한 질환 치료용 조성물에 이용되는 것을 특징으로 하는 항체.
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제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 항체는 심폐 바이패스(bypass)와 연관된 질환의 치료에 이용되는 것을 특징으로 하는 항체.
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