BRPI9909220B1 - hibridoma, anticorpo monoclonal, anticorpo humanizado, anticorpo quimérico, anticorpo desimunizado ou fragmento de tais anticorpos - Google Patents

Abstract

patente de invenção: <b>"inibidores de ativação de complemento"<d>. a invenção refere-se a inibidores de fator d, que se ligam a fator d e bloqueiam a atividade de fator d em ativação de complemento. os inibidores incluem moléculas de anticorpos, assim como seus homólogos, análogos e formas modificadas ou derivadas, incluindo fragmentos de imunoglobulina como fab, (fab')~ 2~ e fv, moléculas pequenas, incluindo peptídios, oligonucleotídios, peptídiomiméticos, e compostos orgânicos. um anticorpo monoclonal que ligou-se a fator d e bloqueou sua habilidade em ativar complemento foi gerado e designado 166-32. o hidridoma produzindo este anticorpo foi despositado no american type culture collection, 10801 university blvd., manassas, va 20110-2209, sob número de acesso hb-12476.

Description

(54) Título: HIBRIDOMA, ANTICORPO MONOCLONAL, ANTICORPO HUMANIZADO, ANTICORPO QUIMÉRICO, ANTICORPO DESIMUNIZADO OU FRAGMENTO DE TAIS ANTICORPOS (51) Int.CI.: A61K 39/395; C07K 16/36; C12N 5/12 (30) Prioridade Unionista: 20/02/1998 US 60/075,328 (73) Titular(es): GENENTECH, INC.

(72) Inventor(es): MICHAEL S. C. FUNG; CECILY R. Y. SUN; BILL N. C. SUN (85) Data do Início da Fase Nacional: 21/08/2000

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para HIBRIDOMA, ANTICORPO MONOCLONAL, ANTICORPO HUMANIZADO, ANTICORPO QUIMÉRICO, ANTICORPO DESIMUNIZADO OU FRAGMENTO DE TAIS ANTICORPOS.

Campo da Invenção

Esta invenção refere-se a inibidores específicos fator D e o uso de tais inibidores em inibição de ativação de sistema complemento e inibição de ativação de complemento de caminho alternativo.

Antecedentes da Invenção

O sistema complementar desempenha um papel central na remoção de complexos imuno e a resposta imuno a agentes infecciosos, antígenos estranhos, células infectadas com vírus e células de tumor. Entretanto, também está envolvido em inflamação patológica e em doenças imunes. Por isso, inibição de ativação excessiva ou descontrolada da cascata complemento pode prover benefício clínico para pacientes com tais doenças e condições.

O sistema complemento encampa dois caminhos distintos de ativação, designados os caminhos clássico e alternativo (V.M. Holers, In Clinicai Immunology: Principies and Practice, ed. R.R. Rich, Mosby Press; 1996, 363391). O caminho clássico é uma cascata dependente de cálcio/magnésio que é normalmente ativada pela formação de complexos antígeno - anticorpo. O caminho alternativo é cascata dependente de magnésio que é ativada por deposição e ativação de C3 sobre certas superfícies susceptíveis (por exemplo, polissacarídios de parede de célula levedura e batérias, e certos materiais biopolímero). Ativação da via complemento gera fragmentos biologicamente ativos de proteínas complementar, por exemplo, anafilatoxinas C3a, C4a, e C5a e complexos de ataque de membrana C5b-9 (MAC), que mediam atividades inflamatórias envolvendo quimiotaxia de leucócito, ativação de macrófagos, neutrófilos, plaquetas, mastócitos, e células endoteliais, permeabilidade vascular, citólise, e dano de tecido.

Fator D é uma serina protease altamente específica essencial para a ativação do caminho complementar alternativo. Ele cliva fator B liga2 do a C3b, gerando a enzima C3b/Bb que é o componente ativo do caminho alternativo convertases C3/C5. Fator D pode ser um alvo apropriado para inibição, uma vez que sua concentração em plasma em humanos é muito baixa (1,8 gg/ml), e ele foi mostrado ser a enzima limitante para ativação do caminho complementar alternativo (P. H. Lesavre and H. J. Müller-Eberhard. J. Exp. Med., 1978; 148:1498-1510; J. E. Volanakis et al., New Eng. J. Med., 1985;312:395-401).

A regulação descendente de ativação de complemento foi demonstrada ser eficaz no tratamento de várias indicações de doenças em modelos animais e em estudos ex vivo, por exemplo, lupus sistêmico eritematoso e glomerulonefrite (Y. Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci.; 1996, 93:8563-8568), artrite reumatóide (Y. Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 1995; 92: 8955-8959), desvio cardiopulmonar e hemodiálise (C.S. Rinder, J. Clin. Invest, 1995; 96: 1564-1572), rejeição hiperaguda em transplante de órgãos (T.J. Kroshus et al., Transplantation, 1995; 60: 1194-1202), infarto miocardial (J.W. Homeister et al., J. Immunol., 1993; 150: 1055-1064; H.F. Weisman et al., Science, 1990; 249: 146-151), dano de reperfusão (E.A. Amsterdam et al., Am. J. Physiol., 1995; 268: H448-H457), e síndrome de doença respiratória de adulto (R.Rabinovici et al., J. Immunol., 1992;

149:1744-1750). Em adição, outras condições inflamatórias e doenças complexas auto-imune/imune também estão associadas de perto com ativação de complemento (V.M. Holers, ibid., B.P. Morgan. Eur. J.Clin. Invest., 1994:24:219-228), incluindo dano térmico, asma severa, choque anafilático, inflamação de intestino, urticária, angioedema, vasculite, esclerose múltipla, miastenia graves, glomerulonefrite membranoproliferativa e síndrome de Sjõgren.

Resumo da Invenção

A invenção inclui inibidores de fator D, que se ligam a fator D e bloqueiam a atividade funcional de ativação de complemento de fator D, incluindo em ativação de complemento de caminho alternativo. Os inibidores incluem moléculas de anticorpos, assim como homólogos, análogos e suas formas modificadas ou derivadas, incluindo fragmentos de imunoglobulina como Fab, (Fab’)₂ e Fv. Moléculas pequenas incluindo peptídios, oligonucleotídeos, peptidomiméticos e compostos orgânicos que se ligam ao fator D e bloqueiam sua atividade funcional também são incluídos.

Um anticorpo monoclonal que se liga a fator D e bloqueou sua habilidade de ativar complemento foi gerado e designado 166-32. O hibridoma produzindo este anticorpo foi depositado no American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, sob Accession Number HB-12476.

Descrição dos Desenhos

Figura 1 mostra a ligação de anticorpos monoclonais antifator D (MABs) a fator D humano purificado em ELISA. A linha marcada com círculos enchidos representa MAB 166-11. A linha marcada com triângulos enchidos representa MAB 166-32. A linha marcada com diamantes enchidos representa MAB 166-188. A linha marcada com quadrados enchidos representa MAB 166-222. O eixo-Y representa a reatividade dos Mabs com fator D expressa como densidade ótica (OD) em 450 nm e o eixo-X representa a concentração dos Mabs.

A Figura 2 mostra a inibição de hemólíse de caminho alternativo (AP) de células vermelhas de sangue de coelho (RBCs) não sensibilizadas por MAB 166-32 na presença de soro humano 10%. A linha marcada com quadrados enchidos representa MAB 166-32. A linha marcada com círculos enchidos representa o controle de isótipo ajustado irrelevante MAB G3-519, que é específico para glicoproteína envelope de HIV gp120. O eixo-Y representa a % de inibição de hemólíse, como ainda descrito no texto. O eixo-X representa a concentração dos Mabs.

A Figura 3 mostra a inibição de hemólíse de caminho alternativo (AP) de células vermelhas de sangue de coelho não sensibilizadas (RBCs) por MAB 166-32 na presença de soro humano 90%. A linha marcada com quadrados enchidos representa MAB 166-32. A linha marcada com círculos enchidos representa o controle de isótipo ajustado irrelevante MAB G3-519, que é específico para glicoproteína envelope de HIV gp120. O eixo-Y representa a % de inibição de hemólise, como ainda descrito no texto. O eixo-X representa a concentrçaão dos MAbs.

A Figura 4 mostra que MAB 166-32 não inibe hemólise de caminho clássico (CP) de RBCs de galinha sensibilizadas, enquanto C5 MAB 137-76 anti - humano controle positivo o faz. A linha marcada com círculos enchidos representa MAB 137-76. A linha marcada com diamantes enchidos e com quadrados enchidos representa MAB 166-32 e o controle negativo MAB G3-519, respectivamente. O eixo-Y representa a % de inibição de hemólise. O eixo-X representa a concentração dos MAbs.

A Figura 5 mostra a inibição de hemólise de caminho alternativo (AP) por MAB 166-32. Hemólise foi aumentada através de adição de diferentes concentrações de fator D humano purificado a um soro humano esgotado de seu fator D por cromatografia de afinidade usando-se antifator D MAB 166-222. Os ensaios foram realizados na presença ou ausência de 0,3 gg/ml MAbs teste. A linha marcada com quadrados enchidos representa nenhum anticorpo adicionado. A linha marcada com círculos enchidos representa MAB 166-32. A linha marcada com triângulos enchidos representa o MAB G3-519 controle de isótipo ajustado irrelevante. O eixo-Y representa a % de inibição de hemólise. O eixo-X representa a concentração de fator D.

A Figura 6 mostra a inibição de lise de célula EAC3b dependente de fator por MAB 166-32. A C3 convertase alternativa foi montada sobre células EAC3b através de incubação com fator B, fator P e fator D. Diferentes concentrações de MAB 166-32 foram adicionadas ao tampão de incubação para inibir a atividade de fator D. A linha marcada com quadrados cheios representa MAB 166-32. A linha marcada com círculos cheios representa MAB G3-519. O eixo-Y representa a % de inibição de hemólise. O eixo-X representa a concentração dos MAbs.

A Figura 7 mostra a inibição de produção de C3a de zymosan por MAB 166-32. Zymosan ativou o caminho complementar alternativo na presença de soro humano. A produção de C3a foi medida através do uso de um kit de ensaio ELISA. A linha marcada com quadrados cheios representa MAB 166-32. A linha marcada com círculos cheios representa o MAB G3519 controle de isótipo irrelevante. O eixo-Y representa a % de inibição de produção de C3a. O eixo -X representa a concentração dos MAbs

A Figura 8 mostra a inibição de produção de sC5b-9 a partir de zymosan por MAB 166-32. Zymosan ativou o caminho complementar alternativo na presença de soro humano. A produção de sCb-9 foi medida usando-se um kit de ensaio ELISA. A linha marcada com quadrados cheios representa MAB 166-32. A linha marcada com círculos cheios representa o MAB G3-519 controle de isótipo irrelevante. O eixo - Y representa a % de inibição de produção de sC5b-9. O eixo - X representa a concentração dos MAbs .

A Figura 9 mostra a inibição de hemólise de caminho alternativo de RBCs de coelho não sensibilizadas por MAB 166.32. e seu Fab. A linha marcada com círculos cheios representa MAB 166-32 (IgG integral). A linha marcada com quadrados cheios representa Fab do MAB 166-32.0 eixo - Y representa a % de inibição de hemólise. O eixo - X representa a concentração dos MAbs .

A Figura 10 mostra o efeito de inibição de MAB 166-32 sobre fator D em soros de diferentes espécies animais em hemólise de caminho alternativo de RBCs de coelho não sensibilizadas. A linha marcada com quadrados cheios representa soro humano. A linha marcada com círculos cheios representa soro de chimpanzé. A linha marcada com triângulos cheios representa soro de macaco rhesus. A linha marcada com triângulos invertidos, cheios representa soro de babuíno. A linha marcada com diamantes cheios representa soro de macaco cynomlgus. A linha marcada com círculos abertos representa soro de carneiro. A linha marcada com triângulos abertos representa soro canino. O eixo - Y representa a % de inibição de hemólise. O eixo - X representa a concentração de MAB 166-32.

A Figura 11 mostra a reatividade de MAB 166-32 com diferentes mutantes e híbridos de fator D (FD) expresso em diferentes Baculovirus em ELISA. A linha marcada com quadrados cheios representa fator D humano, FD/Hu. A linha marcada com círculos cheios representa fator D de porco, FD/pig. A linha marcada com triângulos cheios representa FD/Pighu. A linha marcada com triângulos invertidos, cheios, representa a proteína híbrida, FD/Hupig. A linha marcada com diamantes cheios representa a proteína mutante FD/VDA. A iinha marcada com círculos abertos representa a proteína mutante, FD/L. A linha marcada com triângulos abertos representa a proteína mutante, FD/RH. A linha marcada com diamantes abertos representa o branco sem revestimento de antígeno. As proteínas recombinantes são ainda descritas no texto.

A Figura 12 mostra a representação esquemática dos plasmídios vetores de expressão para Fab 166-32 quimérico: (A) pSV2dhfrFd e (B) pSV2neok. Caixas sólidas representam os exons codificando para gene Fd ou u. Segmentos tracejados representam os elementos aperfeiçoador derivado - HCMV e promotor (E-P), como indicado abaixo. Caixas abertas são os genes diidrofolato redutase (dhfr) e neo, como marcados. O plasmídio pSV2 consiste em segmentos de DNA de várias fontes: pBR322DNA (linha fina) contém o pBR322 origem de replicação de DNA (pBR ori) e o gene de resistência lactamase ampicilina (Amp); SV40 DNA, representado por tracejado mais amplo e marcado, contém SV40 origem de replicação de DNA (SV40 ori), promotor inicial (5’ para os genes dhfr e neo), e sina! de poliadenilação (3’ para os genes dhfr e neo). O sinal de poliadenilação derivado SV40 (pA) é também colocado na extremidade 3’do gene Fd.

A Figura 13 mostra a inibição de hemólise de caminho alternativo (AP) de RBCs de coelho não sensibilizadas. A iinha marcada com quadrados cheios representa MAB 166-32 murino. A linha marcada com círculos cheios representa MAB 166-32 quimérico. A linha marcada com triângulos cheios representa anticorpo controle negativo de isótipo ajustado G3519. O eixo - Y representa a % de inibição de hemólise. O eixo - X representa a concentração de anticorpos.

A Figura 14 mostra a inibição de hemólise de caminho alternativo (AP) de RBCs de coelho não sensibilizadas. A linha marcada com quadrados cheios representa 166-32 IgG quimérico. A linha marcada com círculos cheios representa cFab/9aa. A linha marcada com triângulos cheios representa cFab. O eixo - Y representa % de inibição de hemólise. O eixo X representa a concentração de proteína da IgG e Fab.

Ί

Α Figura 15 mostra os efeitos de tratamentos MAB 166-32 antifator D sobre as funções hemodinâmicas de corações de coelhos isolados perfusados com plasma humano. Pressão de extremidade diastólica ventricular esquerda (LVEDP) é representada por círculos cheios (para MAB 16632) e quadrados cheios (para MAB G3-519). Pressão desenvolvida em ventrículo esquerdo (LVDP) é representada por círculos abertos (para MAB 166-32) e quadrados abertos (para MAB G3-519). MAB G3-519 é o controle irrelevante ajustado de isótipo.

A Figura 16 é uma representação típica de pressão desenvolvida ventricular esquerda (LVDP) pelos dois grupos de anticorpos em um estudo de coração de coelho isolado. O painel superior representa um coração tratado com o anticorpo controle negativo, MAB G3-519, e o painel inferior um coração tratado com MAB 166-32. O coração tratado com MAB G3-519 não foi capaz de manter LVDP após desafio com plasma humano 4%, enquanto o coração tratado com MAB 166-32 reteve LVDP quase linha base após 60 minutos de perfusão com plasma humano 4%.

A Figura 17 mostra a concentração de Bb em efluentes linfáticos em pontos de tempo selecionados a partir de corações de coelho isolados perfusados com plasma humano 4%. Amostras de corações tratados com MAB 166-32 (círculos abertos) contiveram significantemente menos Bb que corações tratados com MAB G3-519 (quadrados cheios), p<0,05.

A Figura 18 mostra a atividade hemolítica de caminho alternativo de amostras de plasma coletadas em diferentes pontos de tempo a partir de circuitos extracorporais tratados com MAB 166-32 (quadrados cheios) ou MAB G3-519 (círculos cheios).

A Figura 19 mostra a concentração de C3a em amostras de plasma coletadas em diferentes pontos de tempo a partir dos circuitos extracorporais tratados com MAB 166-32 (quadrados cheios) ou MAB G3-519 (círculos cheios).

A Figura 20 mostra a concentração de sC5b-9 em amostras de plasma coletadas em diferentes pontos de tempo a partir dos circuitos extracorporais tratados com MAB 166-32 (quadrados cheios) ou MAB G3-519 (círculos cheios).

A Figura 21 mostra a concentração de Bb em amostras de plasma coletadas em diferentes pontos de tempo a partir dos circuitos extracorporais tratados com MAB 166-32 (quadrados cheios) ou MAB G3-519 (círculos cheios).

A Figura 22 mostra a concentração de C4d em amostras de plasma coletadas em diferentes pontos de tempo a partir dos circuitos extracorporais tratados com MAB 166-32 (quadrados cheios) ou MAB G3-519 (círculos cheios).

A Figura 23 mostra o nível de expressão de CD11b sobre a superfície de neutrófilos obtidos em diferentes pontos de tempo a partir dos circuitos extracorporais tratados com MAB 166-32 (quadrados cheios) ou MAB G3-519 (círculos cheios). O nível de expressão de CD11b é representado por intensidade de fluorescência média (MFI) obtida por análises imunocitofluorométricas.

A Figura 24 mostra o nível de expressão de CD62P sobre a superfície de plaquetas obtidas em diferentes pontos de tempo a partir dos circuitos extracorporais tratados com MAB 166-32 (quadrados cheios) ou MAB G3-519 (círculos cheios). O nível de expressão de CD62P é representado por intensidade de fluorescência média (MFI) obtida por análises imunocitofluorométricas.

A Figura 25 mostra a concentração de mieloperoxidase neutrófilo específica (MPO) em amostras de plasma coletadas em diferentes pontos de tempo a partir de circuitos extracorporais tratados com MAB 166-32 (quadrados cheios) ou MAB G3-519 (círculos cheios).

Descrição da Listagem de Seqüências

SEQ ID NO: 1 mostra a seqüência de nucleotídios de fator D humano.

SEQ ID NO: 2 mostra a seqüência de aminoácidos de fator D humano.

SEQ ID NO: 3 mostra a seqüência de nucleotídios de fator D de

porco.

SEQ ID NO: 4 mostra a seqüência de aminoácidos de fator D de porco.

SEQ ID NO: 5 é o iniciador usado para clonagem de gene V_k de MAB 166-32.

SEQ ID NO: 6 foi usada como um adaptador anelado para clonagem de gene V_k de MAB 166-32 como descrito abaixo, e como um iniciador.

SEQ ID NO: 7 também foi usada como um adaptador anelado para clonagem de gene V_k de MAB 166-32, como descrito abaixo.

SEQ ID NO: 8 foi usado como um iniciador 3’ para clonagem de gene V_H de MAB 166-32, como descrito abaixo.

SEQ ID NO: 9 foi um iniciador usado para clonagem de gene V_H de MAB 166-32.

SEQ ID NO: 10 foi usada como um iniciador para clonagem de gene V_H de MAB 166-32.

SEQ ID NO: 11 foi o iniciador 5' para a PCR do gene Fd de MAB

166-32.

SEQ ID NO: 12 foi o iniciador 3’ para a PCR do gene Fd de MAB

166-32.

SEQ ID NO: 13 foi o iniciador 5’ para a PCR de gene Fd de MAB

166-32.

SEQ ID NO: 14 foi o iniciador 3’ para PCR de gene Fd de MAB

166-32.

SEQ ID NO: 15 é a seqüência para aminoácidos adicionais adicionado ao Fd para obter Fab recombinante.

Fabricando e Usando a Invenção

A. Geração de Anticorpos Monoclonais (MAbs) para fator D humano

Em uma realização da invenção, MAbs antifator D podem ser elevados através de imunização de roedores (por exemplo, camundongos, ratos, hamsters e porquinho da índia) com tanto fator D nativo purificado de plasma humano ou urina, como fator D recombinante ou seus fragmentos expressos por sistemas eucarióticos ou procarióticos. Outros animais podem ser usados para imunização, por exemplo, primatas não-humanos, camundongos transgênicos expressando imunoglobuiinas humanas e camundongos imunodeficientes combinados severos (SCID) transplantados com linfócitos B humanos. Hibridomas podem ser gerados através de procedimentos convencionais por fusão de linfócitos B dos animais imunizados com céiulas de mieloma (por exemplo, Sp2/0 e NSO), como descrito por G. Kõhler e C. Milstein (Nature, 1975: 256: 495-497). Em adição, anticorpos antifator D podem ser gerados por seleção de bibliotecas de Fv ou Fab de cadeia simples recombinante de linfócitos B humanos em sistemas amostra - fago. A especificidade dos MAbs para fator D humano pode ser testada por ensaio imunossorvente ligado enzima (ELISA), manchamento imuno Western, ou outras técnicas ímunoquímicas. A atividade inibidora dos anticorpos sobre ativação complemento pode ser avaliada por ensaios hemoiíticos usando céiulas vermelhas de sangue(RBCs) de coelho ou porquinho da índia não sensibilizadas para o caminho alternativo, e usando RBCs de galinha ou carneiro sensibilizadas para o caminho clássico. Os hibridomas nas cavidades positivas são clonados por diluição limitante. Os anticorpos são purificados para caracterização para especificidade a fator D humano através dos ensaios descritos acima.

Se usados no tratamento de doenças inflamatórias ou autoimunes em humanos, os anticorpos antifator D podem ser usados preferivelmente como anticorpos quiméricos, desimunizados, humanizados ou humanos. Tais anticorpos podem reduzir imunogenicidade e assim evitarem resposta anticorpo anticamundongo humano (HAMA). É preferível que o anticorpo seja lgG4, lgG2 ou outro IgG ou IgM de mutação genética que não aumenta a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (S.M. Canfield and S.L. Morrison, J.Exp. Med., 1991: 173: 1483-1491) e citólise mediada complemento (Y.Xu et al., J. Biol. Chem., 1994: 269:3468-3474; V.L. Pulito et al., J. Immunol·, 1996; 156: 2840-2850).

Anticorpos quiméricos são produzidos através de processos recombinantes bem conhecidos na técnica, e têm uma região variável animal e uma região constante humana. Anticorpos humanizados têm um maior graus de seqüências de peptídios humanas que anticorpos quiméricos. Em um anticorpo humanizado, somente as regiões determinando complementaridade (CDRs) que são responsáveis por ligação de antígeno e especificidade são derivadas de animal e têm uma seqüência de aminoácidos correspondendo ao anticorpo animal, e substancialmente todas as porções restantes da molécula (exceto, em alguns casos, porções pequenas das regiões de estrutura dentro da região variável) são derivadas humanas e correspondem em seqüência de aminoácidos a um anticorpo humano. Ver L. Riechmann et al., Nature, 1988; 332:323-327; G. Winter, United States Patent N-5 225 539; C. Queen et al., patente US número 5 530 101.

Anticorpos desimunizados são anticorpos nos quais os epítopos célula T e B foram eliminados, como descrito no pedido de patente internacional PCT/GB98/01473. Eles não têm nenhuma ou reduzida imunogenicidade quando aplicados in vivo.

Anticorpos humanos podem ser obtidos através de várias maneiras diferentes, incluindo através do uso de bibliotecas de expressão de imunoglobulina humana (Stratagene Corp., La Jolla, Califórnia) para produzir fragmentos de anticorpos humanos (VH, VL, Fv, Fd, Fab, ou (Fab’)₂, e usando estes fragmentos para construir anticorpos humanos integrais usando-se técnicas similares àquelas para produção de anticorpos quiméricos. Anticorpos humanos também podem ser produzidos em camundongos transgênicos com um genoma de imunoglobulina humana. Tais camungongos são disponíveis de Abgenix, Inc., Fremont, Califórnia, e Medarex, Inc., Annandale, New Jersey.

Também é possível criar-se moléculas ligantes de cadeia peptídio simples onde as regiões Fv de cadeia pesada e leve estão conectadas. Anticorpos de cadeia simples (ScFv) e o método de sua construção são descritos na patente US 4 946 778. Aiternativamente, Fab pode ser construído e expresso por meios similares (M.J. Evans et al., J. Immunol. Meth., 1995; 184: 123-138). Todos os anticorpos integral e parcialmente humanos são menos imunogênicos que MAbs inteiramente murino, e os fragmentos e anticorpos de cadeia simples também são menos imunogênicos. Todos estes tipos de anticorpos são por isso menos prováveis de evocarem uma resposta imuno ou alérgica. Conseqüentemente, eles são melhor apropriados para administração in vivo em serès humanos que anticorpos animais integrais, especialmente quando administração repetida ou de longo termo é necessária. Em adição, o menor tamanho do fragmento anticorpo pode ajudar a aperfeiçoar biodisponibilidade de tecido, que pode ser crítica para melhor acumulação de dose em indicações de doença aguda.

Baseado nas estruturas moleculares das regiões variáveis dos anticorpos antifator D, é possível usar-se modelagem molecular e desenho molecular racionai para geração e seleção de moléculas pequenas que imitem as estruturas moleculares da região ligante dos anticorpos e inibam as atividades de fator D. Estas moléculas pequenas podem ser peptídios, peptidomiméticos, oligonucleotídios, ou compostos orgânicos. As moléculas imitantes podem ser usadas como inibidores de ativação de complemento em indicações inflamatórias e doenças autoimunes. Alternativamente é possível usar-se procedimentos de seleção de larga escala comumente usados no campo para isolar-se moléculas pequenas apropriadas de bibliotecas de compostos combinatoriais.

Em uma realização preferida da invenção, um Fab quimérico, tendo regiões variáveis de animal (camundongo) e regiões constantes humanas é usado terapeuticamente. O Fab é preferido porque:

1. Ele é menor que uma imunoglobulina inteira e pode prover melhor permeação de tecido;

2. Como molécula monovalente, há menos chance de formação de complexos imunes e agregados; e

3. Ele pode ser produzido em um sistema microbial, que pode ser mais facilmente aumentado do que um sistema mamífero.

B. Aplicações das Moléculas Antifator D

As moléculas ligantes antifator D, anticorpos, e fragmentos desta invenção, podem ser administradas a pacientes em uma formulação farmacêutica apropriada através de uma variedade de rotas, incluindo, mas não limitado a, infusão intravenosa, injeção de bolos intravenosa, e rotas intraperitoneal, intradérmica, intramuscular, subcutânea, intranasal, intratraqueal, intraespinha, intracraniana e oral. Tal administração permite que as mesmas se liguem a fator D endógeno e assim inibam a geração de anafilatoxinas C3b, C3a e C5a, e C5b-9.

A dosagem preferida estimada de tais anticorpos e moléculas está entre 10 e 500 pg/ml de soro. A real dosagem pode ser determinada em experimentos clínicos seguindo a metodologia convencional para determinação de dosagens ótimas, isto é, administração de várias dosagens e determinando qual é mais eficaz.

As moléculas antifator D podem funcionar para inibição de ativação de complemento in vivo e/ou o caminho complementar alternativo e manifestações inflamatórias que acompanham, tal como recrutamento e ativação de macrófagos, neutrófilos, plaquetas, e mastócitos, edema, e dano de tecido. Estes inibidores podem ser usados para tratamento de doenças ou condições que são mediadas por ativação excessiva ou descontrolada do sistema complementar. Estas incluem, mas não são limitadas a; (1) dano de tecido devido a isquemia de reperfusão seguindo infarto agudo do miocárdio, aneurisma, acidente vascular cerebral, choque hemorrágico, dano de esmagamento, falência múltipla de órgãos, choque hipovolêmico e isquemia intestinal; (2) distúrbios inflamatórios, por exemplo, queimaduras, endotoxemia e choque séptico, sindrome de doença respiratória de adulto, desvio cardiopulmonar, hemodiálise; choque anafilático, asma séria, angioedema, doença de Crohn, anemia de célula foice, glomerulonefrite pósstreptococal e pancreatite; (3) rejeição de transplante, por exemplo, rejeição de xenoenxerto hiperaguda; e (4) reações adversas a drogas, por exemplo, alergia a droga, sindrome de vazamento vascular induzido por IL-2 e alergia de meios de constraste raiográficos. Distúrbios autoimunes incluindo, mas não limitado a, lupus eritematosos sistêmico, miastenia grave, artrite reumatóide, doença de Alzheimer e escierose múltipla, também podem ser tratadas com os inibidores da invenção.

As moléculas antifator D também podem ser usadas diagnosticamente para avaliar a presença de, ou para quantificar, fator D em um espécime de tecido ou uma amostra de fluido de corpo, tal como plasma, soro, urina ou fluido espinhal. Neste pedido, formatos de ensaios bem conhecidos podem ser usados, tais como imuno - histoquímica ou ELISA, respectivamente. Tais testes diagnósticos podem ser úteis na determinação de se certos indivíduos são deficientes em, ou superproduzem fator D.

G. Modelos Animais da Eficácia Terapêutica de Inibidores de Fator f

D

A atividade terapêutica de inibidores de fator D em várias indicações de doença descritas acima pode ser confirmada através do uso de modelos animais disponíveis para várias manifestações inflamatórias e autoimunes. Os testes in vitro descritos abaixo nos exemplos são adequados para estabelecimento de sua eficácia.

Modelos animais relevantes para várias doenças clínicas relacionadas ao complemento em humanos também podem ser usados para confirmarem a eficácia in vivo de inibidores de fator D. Estes incluem, mas não são limitados a: isquemia do miocárdio/insuficiência de reperfusão (H.F.

Weisman et al., Science, 1990; 249: 146-151); infartação miocárdica (J.W.

Homeister et al., J. Immunol. 1993; 150: 1055-1064), lupus sistêmico eritematoso e glomerulonefrite (S.K. Datta Meth. Enzymol., 1988; 162: 385-442;

D.J. Salvantand A.V. Cybuisky, Meth. Enzymoí., 1988; 162: 421-461), artrite reumatóide (Y. Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sei., 1995; 92: 8955-8959), síndrome de doença respiratória adulta (R. Rabinovici et al., J. Immunol.,

1992; 149: 1744-1750), rejeição hiperaguda em transplante de órgão (T.J.

Kroshus et al., Transplantation, 1995; 60: 1194-1202), dano de queimadura (M. S. Mulligan et al., J. Immunol., 1992; 148: 1479-1485), desvio cardiopulmonar (C.S. Rinder et ai., J. Clin. Invest., 1995; 96: 1564-1572).

Exemplificação de como obter e usar a invenção, e verificação de sua utilidade, aparecem abaixo.

Exemplo 1: Geração de MAbs antifator D

Camundongos A/J machos (Harlan, Houston, TX), de 8-12 se15 manas, foram injetados subcutaneamente com 25 pg de fator D purificado de soro humano (Advanced Research Technologies, San Diego, CA) em adjuvante Freund completo (Difco Laboratories, Detroit, Michigan) em 200 μΐ de solução salina tamponada com fosfato (PBS) pH 7,4. A preparação de fator D foi testada ser > 95% pura por eletroforese de gel de dodecil sulfato de sódio (SDS) - poliacrilamida (PAGE). O fator D foi testado e verificado ser biologicamente ativo em hemólise como descrito abaixo. Em intervalos de duas semanas os camundongos foram injetados duas vezes subcutaneamente com 25 μg de fator D humano em adjuvante de Freund incompleto. Então duas semanas depois e três dias antes de sacrifício, os camundongos foram novamente injetados intraperitonealmente com 25 pg do mesmo antígeno em PBS. Para cada fusão, suspensões de célula simples foram preparadas do baço de um camundongo imunizado e usadas para fusão com célula mieloma Sp2/0. 5x10⁸ das células Sp2/0 e 5x10⁸ células de baço foram fundidas em um meio contendo polietileno glicol 50% (P.M. 1450)(Kodak, Rochester, NY) e sulfóxido de dimetila 5% (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). As células então foram ajustadas para uma concentração de 1,5x10⁵ células de baço por 200 μΙ da suspensão em meio Iscove (Gibco, Grand Island, NY), suplementado com soro fetal bovino 10%, 100 unidades/ml de penicilina, 100 pg/ml de streptomicina, hipoxantina 0,1 mM, aminopterina 0,4 μΜ, e timidina 16 μΜ. Duzentos microlitros da suspensão de células foram adicionados a cada cavidade de placas de mícrocultura de 96cavidades. Após cerca de dez dias de cultura sobrenadantes foram retirados para seleção para reatividade com fator D purificado em ELISA.

Cavidades em placas de microteste Immulon 2 (Dynatech Laboratories, Chantilly, VA) foram revestidadas pela adição de 50 μΙ de fator humano purificado em 50 ng/ml por toda a noite em temperatura ambiente. A baixa concentração de fator D para revestimento permitiu a seleção de anticorpos de alta afinidade. Após a solução de revestimento ser removida por tremulação da placa, 200 μΙ de BLOTTO (leite seco sem gordura) em PBS foram adicionados a cada cavidade por uma hora para bloquear os sítios não-específicos. Uma hora depois, as cavidades foram lavadas com um

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Y tampão PBST (PBS contendo Tween 20 0,05%). Cinqüenta microlitros de sobrenadantes de cultura de cada cavidade de fusão foram coletados e misturados com 50 μΙ de BLOTTO e então adicionados às cavidades individuais das placas de microteste. Após uma hora de incubação, as cavidades foram lavadas com PBST. Os anticorpos murino ligados foram então detectados por reação com IgG anticamundongo de cabra conjugado peroxidase de raiz forte (HRP)(Jackson Immu no Research Laboratories, West Grove, PA) e diluídos a 1:2000 em BLOTTO. Solução substrato peroxidase contendo 3,3,5,5,-tetra metil benzidina 0,1% (Sigma, St. Louis, MO) e peróxido de hidrogênio 0,0003% (Sigma) foram adicionadas às cavidades para desenvolvimento de cor por 30 minutos. A reação foi terminada por adição de 50 μΙ de H₂SO₄ 2 M por cavidade. A OD em 450 nm da mistura de reação foi lida com um BioTek ELISA Reader (BioTek Instruments, Winooski, VM).

Os sobrenadantes de cultura das cavidades positivas foram então testados através de dois ensaios: i) inibição de hemólise de caminho alternativo de RBCs de coelho não sensibilizadas por soro humano prétitulado através do processo descrito abaixo; e ii) inibição de formação de 03a por zymosan tratado com soro humano como descrito abaixo. As células naquelas cavidades positivas foram clonadas por diluição limitante. Os MAbs foram testados novamente para reatividade com fator D no ELISA. Os hibridomas selecionados foram desenvolvidos em frascos que giram e o sobrenadante de cultura gasta coletado para purificação de anticorpos através de cromatografia de afinidade de proteína A. Quatro MAbs foram testados fortemente reativos com fator D humano em ELISA. Estes MAbs são designados 166-11, 166-32, 166-188, e 166-222 (Figura 1). Entre eles, MAB 166-32 (lgG1) inibiu fortemente a hemólise de caminho alternativo de RBCs de coelho não sensibilizadas como descrito abaixo.

Exemplo 2: Determinação de constantes cinéticas dos MAbs antifator D pelo processo de ressonância de plasmon de superfície

As constantes cinéticas para a ligação de MAbs 166-11, 166-32, 166-188, e 166-22 a fator D humano foram determinadas por medições baseadas em ressonância plasmon de superfície usando-se o instrumento BI17

Acore (Pharmacia Biosensor AB, (Jppsala, Sweden). Todas as medições de ligação foram realizadas em solução salina tamponada com HEPES (HBS) (HEPES 10mM, pH 7,4, NaCl 150mM, EDTA 3,4mM, Tensoativo P20

0,005%) a 25°C. Para medição de constantes de taxa de ligação de fator D aos MAbs, um lgG(H+L) anticamundongo de coelho foi imobilizado sobre um sensorchip CMS por acoplamento de amina usando-se N-hidróxi succinimida e N-etil-N’-(3-dietil amino propií)carbodiimida. Cada MAB individual foi capturado sobre o chip sensor (sensorchip) revestido antes de injeção de fator D em diferentes concentrações. Para medir as constantes de taxa de associação (K_assoc), cinco diluições de fator D (2,5 nM, 5nM, 10nM, 15nM e 20nM) foram feitas baseadas na concentração indicada pelo fabricante, e foram injetadas para a célula de fluxo em uma taxa de fluxo de 5 μΙ/minuto. Para medir as constantes de taxa de dissociação (K^oc), fator D 100nM foi injetado na célula de fluxo (flowcell) na taxa de 5 μΙ/minuto. Os dados, na forma de grams sensores (sensorgrams), foram analisados usando-se os programas de adaptação de dados implementados no BIAcore system. Uma vez que MAB 166-32 tem um muito rápido que está além do limite de confiabilidade do formato de ensaio devido à limitação do efeito de transporte de massa, um formiato de ligação adicional também foi usado para medir suas constantes de taxa cinética. Fator D foi imobilizado sobre o sensorchip através de acoplamento com amina como descrito acima enquando MAB 166-32 de diferentes diluições (5nM, 10nM, 15nM, 20nM e 25nM para a medição de K_assoc-e 200nM para a medição de Kdissoc fluiu apara o sensorchip na taxa de fluxo de 5 μΙ/minuto. Os dados, na forma de grams sensores (sensorgrams) aos MAbs sobre BI Acore são mostrados na Tabela 1 abaixo. MAbs 166-32 e 166-222 têm afinidade muito alta ao fator D, com constante de dissociação de equilíbrio (K_D) de menos que 0,1nM.

Tabela 1 Constantes Cinéticas de Fator D Ligando a MAbs Sobre BIAcore

MABs	Kassoc (X 105	Kdissoc (X 1 04S 1)	KD(x10'’°M)c
166-32a	>10	1,1	<1
166-32b	4,6	0,76	i 1,6
166-188a	8,75 .	2,1	2,4
166-11a	8,0	1,0 .	1,24
166-222’	>10	0,8	<1

^aFator D foi usado como o analito que fluiu sobre o sensorchip revestido com MAB antifator D capturado por IgG anticamundongo de coelho durante a determinação.

^bMAB 166-32 foi usado como o analito e fator D foi reticulado ao chip sensor (sensorchip) através do processo de acoplamento de amina. ^c K_D,constante de dissociação de equilíbrio, = Kd_issOc/Kassoc Exemplo 3: Inibição de hemólise ativada - complemento

Para estudar a atividade funcional do MAbs antifator D em inibição de ativação complemento in vitro, dois ensaios hemolíticos foram usados.

Para o caminho alternativo, RBCs de coelho não sensibilizadas foram lavadas três vezes com solução salina tamponada veronal/gelatina (GVB/Mg-EGTA) contendo MgCI₂ 2mM e EGTA 1,6 mM. EGTA em uma concentração de 10mM foi usada para inibir o caminho clássico (K. Whaley et al,, em A.W.Dodds (Ed.), Complement: A Practical Approach. Oxford University Press, Oxford, 1997, pp. 19-47). As células lavadas foram ressuspensas no mesmo tampão em 1,7x10⁸ células/ml. Em cada cavidade de uma placa de mícroteste de 96 cavidades, 50μί de soro humano normal (20%) foram misturados com 50μΙ de GVB/Mg-EGTA ou MAB teste diluído sertalmente então 30μΙ da suspensão de RBCs de coelho lavadas foram adicionados às cavidades contendo as misturas. Cinqüenta microlitros de soro humano norma! (20%) foram misturados com 80μΙ de GVB/Mg-EGTA para render o fundo de cor de soro. Para controle negativo, MAB gp120 anti-HIV1 de isótipo ajustada, G3-519, foi usado. A mistura final foi incubada a 37°C por 30 minutos. A piaca então foi agitada sobre um agitador de placa de mi19 croteste por 15 segundos. A placa então foi centrifugada em 300xg por 3 minutos. Sobrenadantes (80μΙ) foram coletados e transferidos para cavidades sobre placas de microteste de 96 cavidades de fundo chato para medição de OD em 405nm. A porcentagem de inibição de hemólise é definida como 100 x [(OD sem MAB - OD fundo de cor de soro) - (OD com MAB - OD fundo de cor de soro)]/(OD sem MAB - OD de fundo de cor de soro).

A Figura 2 mostra os dados que MAB 166-32 inibe fortemente em uma maneira dependente de dose a hemólise de caminho alternativo de RBCs de coelho não sensibilizadas na presença de soro humano 10%, en10 quanto o MAB G3-519 controle de isótipo ajustado irrelevante não o faz. MAB G3-519 é específico para glicoproteína envelope de HIV gp120.

Em ensaios para testar a atividade ínibidora de MAB 166-32 em soro humano 90%, soro humano congelado foi descongelado e pré - tratado com EGTA em uma concentração final de 10mM. Dez microlitros de MAB

166-32 ou G3-519 serialmente diluídos foram adicionados a 90μΙ de soro humano tratado EGTA em cavidades duplicatas de uma placa de microteste de 96 cavidades por 15 minutos em temperatura ambiente. Trinta microlitros das RBCs de coelho lavadas foram adicionados a cada cavidade. A placa foi incubada a 37°C por 30 minutos. A placa foi agitada sobre um agitador de placa por 15 segundos e então centrifugada a 300xg por 3 minutos. Sobrenadantes (80μΙ) foram coletados e transferidos para cavidades sobre uma placa de microteste de 96 cavidades de fundo chato para medição de OD em 405nm. Cada placa conteve duas cavidades contendo 100μΙ de soro humano 90% e 30μΙ do tampão como fundo de cor de soro e também duas cavidades contendo as RBCs lisadas com 100μΙ de soro humano 90%, na ausência de anticorpo monoclonal, para representar lise total. A Figura 3 mostra os dados que MAB 166-32 inibe fortemente em uma maneira dependente de dose a hemólise de caminho alternativo de RBCs de coelho não sensibilizadas mesmo na presença de soro humano 90%.

Para o caminho clássico, RBCs de galinha (5x10⁷ células/ml) em solução salina tamponada - veronal/gelatina (GVB⁺⁺) contendo MgCI₂0,5mM e CaCI₂ 0,15mM foram sensibilizadas com imunoglobulinas de RBC antiga20 linha de coelho purificadas em 8pg/ml (Inter-Cell Technologies, Hopewell,

NJ) por 15 minutos a 4°C. As células então foram lavadas com GVB⁺⁺. A concentração de soro humano final usada foi 2%.

A Figura 4 mostra dados que MAB 166-32 e o controle irrelevante G3-519 não inibem a hemólise de caminho clássico de RBCs de galinha sensibilizadas, enquanto o C5 MAB 137-76 anti-humano controle positivo o faz. Os dados a partir das Figuras 2, 3 e 4 indicam que MAB 166-32 é específico para a inibição do caminho alternativo de ativação de complemento.

Exemplo 4: Especificidade de MAB 166-32 para fator D

Dois ensaios hemoiíticos, como descrito abaixo, foram usados para demonstrar a especificidade de MAB 166-32 para fator D humano.

(1) Inibição de ensaios hemoiíticos dependentes de fator D usando-se RBCs de coelho não sensibilizadas

Uma amostra de soro humano foi primeiro esgotada de fator D através de passagem da mesma através de uma coluna de afinidade empacotada com 3M Emphaze Biosupport Médium (Pierce, Rockford, IL) acoplado com o MAB 166-222 antifator D. O soro através da vazão foi testado ser inativo em disparar hemólise de caminho alternativo devido ao completo esgotamento de fator D. O procedimento deste ensaio é similar àquele descrito no Exemplo 3 descrito acima, exceto que fator D purificado de concentrações variáveis foi adicionado ao soro esgotado de fator D para reconstituir a atividade hemolítica. Sob estas condições, a hemólise de RBCs de coelho foi dependente de fator D. Foi mostrado que a atividade hemolítica reconstituída é linearmente proporcional à concentração do fator D suplementado (de 0,01 μg/mi a 2gg/ml (Figura 5)). Os dados da Figura 5 também mostram que 0,3pg/ml de MAB 166-32 podem inibir completamente hemólise de RBCs de coelho não sensibilizadas na presença de 0,1pg/ml de fator D suplementado, enquanto o MAB G3-519 controle negativo não tem efeito sobre a hemólise dependente de fator D. Estes dados sugerem que MAB 166-32 pode inibir efetivamente a atividade biológica de fator D humano em uma razão molar de 1:2 (MAB 166-32 para fator D). Por isso MAB 166-32 é um anticorpo de alta afinidade, potente para fator D. O anticorpo tem o potencial para ser usado clinicamente para tratar doenças ou indicações causadas por ativação do caminho complemento alternativo.

(2) Inibição da formação de convertase C3 alternativa sobre células EAC3b

Células EAC3b são RBCs de carneiro revestidas com C3b humana (adquirida de National Jewish Center of Immunology and Respiratory Medicine, Denver, CO). Neste ensaio, a convertase C3 alternativa foi montada sobre a superfície de células EAC3b através de adição de fator B, fator P (properdin) e fator D. Células EAC3b (5x10⁸), que foram então lavadas três vezes em meio DGVB⁺⁺ (solução salina tamponada veronal 50%), pH 7,2, contendo CaCI₂ 0,075mM, MgCI₂ 0,25mM, gelatina 0,1%, dextrose 2,5% (peso/volume) e azida sódica 0,01%). As células lavadas foram então ressuspensas em 1,5ml de DGVB⁺⁺, fator P (30μο) e fator B (20pg). As concentrações de fator P e fator B foram predeterminadas estarem em excesso. Cinqüenta microlitros da suspensão de células foram adicionados a cada cavidade de uma placa de microteste de 96 cavidades de fundo redondo. Então 50μΙ de uma mistura de fator D (1,2ng/ml) e MAB 166-32 ou MAB G3519 diluída serialmente foram adicionados às cavidades contendo as células para incubação por 15 minutos a 30°C. A concentração de fator D (1,2ng/ml) foi predeterminada para render acima de 90% de hemólise sob estas condições. Após incubação, as células foram lavadas duas vezes em meio GVB-EDTA (solução salina tamponada-veronal/gelatina contendo EDTA 10mM). As células então foram ressuspensas em 30μί de meio GVBEDTA. Para iniciar hemólise, 100μΙ de soro de porquinho da índia (Sigma) (diluído 1:10 em GVB-EDTA) foram adicionados a cada cavidade. As misturas foram então incubadas a 37°C por 30 minutos. A placa de microteste foi então centrifugada em 300xg por 3 minutos. O sobrenadante foi coletado para medição de OD em 405nm.

A Figura 6 mostra os resultados dos experimentos que MAB

166-32 inibe a lise de células EAC3b, enquanto o MAB G3-519 irrelevante não. MAB 166-32inibe fator D de clivagem de fator B, por isso prevenindo a formação de C3 convertase sobre a superfície de células EAC3b.

Exemplo 5: Inibição da geração de C3a de zimoqênio ativado complementar por MAB 166-32

Para ainda avaliar a especificidade funcional de MAB 166-32 para fator D, o efeito do MAB sobre ativação complemento alternativa sobre zymosan (partículas de levedura ativadas) foi examinado. Zymosan A (de Saccharomyces cerevisiae, sigma)(1 mg/ml) foi lavado três vezes em GVB/Mg-EGTA e então ressuspenso no mesmo meio em 1 mg/ml. Vinte e cinco microlitros de MAB 166-32 ou G3-519 em diferentes concentrações foram misturados com 25μΙ de soro humano (diluído 1:5 em GVB/Mg-EDTA) em um microtubo e incubados por 15 minutos em temperatura ambiente. O branco não conteve anticorpo mas o meio simples e o soro. Após incubação, 50μΙ de suspensão de zymosan lavada foram adicionados a cada tubo para incubação por 30 minutos a 37°C. Os microtubos foram então centrifugados em 2000 x g por 5 minutos, os sobrenadantes foram coletados e misturados com igual volume de Specimen Stabilizing Solution (Quidel, San Diego, CA). As amostras foram congeladas a -25°C até serem ensaiadas. A concentração de C3a e sC5b-9 nas amostras foi medida por kits ELISA quantitativos (Quidel) de acordo com os procedimentos proporcionados pelo produtor.

A Figura 7 mostra que MAB 166-32 inibe a geração de C3a a partir de zymosan ativadocomplementar, enquanto o MAB G3-519 irrelevante não tem efeito. Estes dados sugerem que MAB 166-32 inibe a formação de C3 convertase pelo fator D. A completa inibição de fator D por MAB 166-32 pode bloquear efetivamente a formação de C3 convertase como indicado pela incapacidade de gerar C3a. Isto conduzirá à inibição de C5 convertase nas subsequentes etapas da cascata complementares, como evidenciado pela inibição de formação de sC5b-9 (MAC)(Figura 8)

Exemplo 6: inibição de hemólise ativada complementar pelo Fab de MAB 166-32

De modo a examinar-se se forma monovalente de MAB 166-32 é eficaz na inibição de caminho complementar alternativo como o MAB 166-32

LM r

bivalente parente, o Fab de MAB 166-32 foi preparado por digestão com papaína usando-se um kit reagente comercial (Pierce). O Fab foi então testado para atividade inibidora sobre a hemólise de caminho alternativo usando-se RBCs de coelho não sensibilizadas como descrito acima.

A Figura 9 mostra os dados dos experimentos em que ambos

IgG e Fab mostra similar potência em bloqueio de ativação complemento alternativo levando em consideração que há dois sítios de ligação por molécula de anticorpo. Estes resultados sugerem que forma monovalente de MAB 166-32 é ativa e retém a potência similar contra fator D como seu anti10 corpo bivalente parente. Esta propriedade é importante para a consideração de uso de Fab ou Fv de cadeia simples como os produtos alternativos. Uma vantagem de usar-se as últimas formas monovalentes é que elas terão melhor penetração de tecido devido seu menor tamanho. Tanto quanto Fab de MAB 166-32 é ativo, é provável que o epítopo tigante sobre fator D reco15 nhecido pelo MAB seja funcionalmente importante.

Exemplo 7: Efeitos de MAB 166-32 sobre hemólise de caminho alternativo usando soros de diferentes espécies animais

De modo a estudar-se a reatividade - cruzada de MAB 166-32 com fator D a partir de diferentes espécies animais, ensaios hemolíticos de caminho alternativo foram realizados usando-se soros de diferentes espécies animais. Soros frescos de diferentes espécies animais (humano, macaco rhesus, chimpanzé, babuíno, macaco cynomolgus, carneiro, cão, camundongo, hamster, rato, coelho, porquinho da índia e porco) foram primeiro testados para os valores CH50, que são definidos como a diluição do soro para obter-se 50% de lise das RBCs de coelho não sensibilizadas. A atividade inibidora de MAB 166-32 sobre a mesma atividade hemolítica (CH50) de cada soro foi então testada e comparada.

A Figura 10 mostra que MAB 166-32 tem forte atividade inibidora contra soros de humano, macaco rhesus, macaco cynomolgus e chim30 panzé e atividade inibidora moderada contra soros de babuíno, macaco cynomolgus, carneiro e cão. O anticorpo não inibe soros de camundongo, hamster, rato, coelho, porquinho da índia e porco. Estes dados sugerem que

MAB 166-32 se liga a um epítopo sobre fator D compartilhado por humanos, macaco rhesus, chimpanzés, babuínos, macacos cynomolgus, carneiros e cães.

Exemplo 8: Construção de mutantes de fator D humano para mapeamento 5 de epítopo de MAB 166-32

Para delinear o epítopo de ligação sobre fator D humano reconhecido por MAB 166-32, a reatividade do anticorpo com fator D humano sobre “Western blots foi primeiro testada. MAB 166-32 não reage com fator D humano desnaturado - SDS (tanto reduzido como não-reduzído) imobili10 zado sobre membrana de nitrocelulose. Este resultado indica que MAB 16632 liga fator D nativo mas não desnaturado.

Uma vez que MAB 166-32 não inibe a atividade hemolítica de fator D de camundongo e porco como descrito no Exemplo 7, é provável que MAB 166-32 se ligue a um sítio sobre fator D humano que tem um alto grau de diferença na seqüência de aminoácidos daqueles de fator D de camundongo e porco. Baseado neste conceito, vários mutantes e híbridos de fator D foram feitos através de substituição de resíduos de aminoácidos em fator D humano com os correspondentes resíduos de aminoácidos na contraparte de porco, para mapeamento de epítopo ligante de MAB 166-32, como des20 crito abaixo.

(1) Construção de mutantes e híbridos de fator D

Segmentos de gene de fator D humano foram obtidos por reação de cadeia polimerase (PCR) usando-se CDNA adipócito humano (Clontech, San Francisco, CA) como o molde e apropriados iniciadores oli25 gonucleotídios. Fragmentos de DNA amplificados foram digeridos com enzimas de restrição BamHI e EcoRl e o produto digerido foi inserido nos sítios BamHI e EcoRl do vetor de transferência Baculovírus pVL1393 (Pharmingen, San Diego, CA) para render fator-pVL1393 tipo selvagem D/Hu. O fator D humano é designado como fator D/Hu. A seqüência de nucleotídios e a seqüência de aminoácidos deduzida da proteína de fator D humano madura são mostradas nas SEQ ID NOS: 1 e 2 (R.T.White et al., J.Biol. Chem.,

1992; 267:9210-9213; GenBank accession number: M84526).

Clone CDNA de fator D de porco pMon24909 foi obtido como uma oferta de J.L.Miner of University of Nebraska (GenBank accession number: U29948). Os fragmentos BamHI-EcoRI de pMon24909 foram clonados em pVL1393 para renderem pVL1393-fator D/Porco. O fator D de porco é designado como fator D/Porco. A seqüência de nucleotídios e a seqüência de aminoácidos deduzida da proteína de fator D de porco madura são mostradas nas SEQ ID NOS: 3 e 4.

Três mutantes de fator D humano foram construídos através do uso de iniciadores apropriados e PCR sobreposição. As mutações de aminoácidos foram designadas pela substituição de resíduos de aminoácidos na seqüência humana com os correspodentes resíduos de aminoácidos da seqüência de porco quando as seqüências de aminoácidos de fator D humano e de porco são alinhadas para comparação de homologia. O primeiro mutante, fator D/VDA, conteve três mutações de aminoácidos: V113E, D116E e A118P. (Este é um método estenográfico de designação de mutações no qual, por exemplo, V113E significa que a valina no resíduo de aminoácido número 113 em fator D humano foi alterado para ácido glutâmico em fator D de porco). Ò segundo mutante, fator D/RH, conteve duas mutações de aminoácidos: R156L e H159Y. O terceiro mutante, fator D/L, conteve uma única mutação: L168M. Seqüências de DNA codificando estes mutantes foram confirmadas por seqüencíamento de DNA. Após digestão com enzimas apropriadas, fragmentos de DNA foram inseridos nos sítios BamHI e EcoRI do vetor de transferência de Baculovírus pVL1393 para render pVL1393-fator D/VDA, pVL1393-fator D/RH e pVL1393-fator D/L, respectivamente.

Dois híbridos fator D humano - porco quiméricos também foram construídos através do uso de iniciadores apropriados e PCR de sobreposição. O primeiro híbrido, fator D/Hupig, conteve 52 aminoácidos derivados de fator D humano no N-terminal, e os aminoácidos restantes foram derivados do fator D de porco. O outro híbrido, fator D/Pighu, conteve 52 aminoácidos derivados de fator D de porco no N-terminal e os aminoácidos restantes foram derivados de fator D humano. Os fragmentos de DNA digeridos com

BamHl e EcoRI foram ineridos nos sítios BamHl e EcoRI do vetor de transferência Baculovírus pVL1393 para render pVL1393-fator D/Hupig e pVL1393fator D/Pighu.

(2) Expressão de mutantes e híbridos de fator D

Os procedimentos para transfecção dos plasmídios, geração de

Baculovírus recombinantes, e produção das proteínas fator D recombinantes em células de inseto Sf9 foram realizados de acordo com o manual dos fabricantes (Baculovírus Expression Vector System, Pharmingen).

(3) Purificação de mutantes e híbridos de fator D

Proteínas mutantes e híbridas de fator D a partir de sobrenadantes de cultura de células Sf9 infectadas foram purificadas por cromatografia de afinidade usando-se anticorpos policlonais fator D anti-humanos de carneiro purificados (The Binding Site Limited, San Diego, CA). Três mililitros de anticorpos fator D anti-humano de carneiro (13,2 mg/ml) foram equilibrados em um tampão de acoplamento (borato 0,1 M e Na2SO₄ 0,75M, pH 9,0) e acoplados com 4ml de Ultralink Biosupport Médium (Pierce) por 2 horas em temperatura ambiente. As pérolas foram lavadas primeiro com dietilamina 50mM, pH 11,5 para saturar todos os sítios reativos restantes e então com um tampão contendo Tris 10mM, NaCl 0,15M, EDTA 5mM, Triton

X-100 1%, NaN₃ 0,02%, pH 8,0. O gel foi estocado no tampão a 4°C.

Sobrenadante de cultura colhido de 100ml de cultura de isca com células Sf9 infectadas com os vários Baculovírus mutantes foram passados através da coluna de afinidade de antifator D de carneiro que foi préequilibrada com PBS para remoção de tampão de estocagem. As proteínas fator D ligadas foram eluídas com dietilamina 50mM, pH 11,5. As frações coletadas foram imediatamente neutralizadas para pH 7,0 com tampão Hepes 1M. Sais residuais foram removidos por troca de tampão com PBS através de ultrafiltração com membrana Millipore (corte de PM.: 3000)(Millipore Corp., Bedford, MA). Concentrações de proteína foram determinadas pelo processo BCA (Pierce).

(4) ELISA de Fator D

A reatividade de MAB 166-32 com os vários mutantes e híbridos fator D foi testada por ELISA. Diferentes cavidades de placas de microteste de 96 cavidades foram revestidas com as proteínas (fator D/Hu, fator D/Pig, fator D/Hupig, fator D/Pighu, fator D/VDH, fator D/RH, e fator D/L), através de adição de 10Ομ,Ι de cada proteína em 0,5 pg/ml em PBS. Após incubação por toda a noite em temperatura ambiente, as cavidades foram tratadas com PBSTB (PBST contendo 2% BSA) para saturar os sítios ligantes restantes. As cavidades então foram lavadas com PBST. Cem microlitros de MAB 16632 diluído serialmente (1gg/ml a 0,5 ng/ml) foram adicionados às cavidades por uma hora em temperatura ambiente. As cavidades então foram lavadas com PBST. O anticorpo ligado foi detectado por incubação com IgG (Fc) anti - camundongo cabra - HRP diluído (Jackson ImmunoResearch) por uma hora em temperatura ambiente. Solução de substrato peroxidase foi então adicionada para desenvolvimento de cor como descrito acima. A OD foi medida usando-se um leitor ELISA em 450nm.

A Figura 11 mostra que MAB 166-32 reage com fator D/Hu, fator D/Pighu, e fator D/VDA, mas não com fator DZPig, fator D/Hupig, fator D/HR, e fator D/L. Os resultados ELISA indicam que resíduos de aminoácidos Arg156, His159, e Leu 168 de fator D humano são essenciais para a ligação de MAB 166-32. Isto é consistente com o fato de que MAB 166-32 não se liga a fator D/Hupig quando a porção terminal-C de fator D humano foi substituída com aquela de porco. Resíduos de aminoácidos Arg156, His159 e Leu168 estão localizados em um assim chamado circuito metionina constituído por uma ligação dissulfeto entre Cys154 e Cys170 com um resíduo metionina em posição 169 (J.E.Volanakis et al., em: The Human Complement System in Helth and Disease, J.E.Volanakis and M.M. Franks, eds., Marcei Dekker, 1998, pp. 49-81). Estruturalmente, o circuito metionina é um membro de uma volta 1 β tipo rígida. Ele é verificado ser exposto sobre a superfície da molécula de fator D baseado nos dados de estudos de cristalografia de raios-X (S.V.L. Narayana et al., J.Mol.Biol., 1994, 235:695-708). Entretanto, a contribuição do circuito metionina para especificidade de substrato e catálise de fator D nunca foi estudada (J.E.Volanakis et al., Protein Sei., 1996; 5: 553-564). Os dados aqui demonstraram pela primeira vez que o circuito metionina desempenha um papel importante na atividade funcional de fator D. MAB 166-32 e seu Fab, quando ligado a esta região sobre fator D, podem inibir efetivamente a catálise de fator B.

Exemplo 9: Clonagem de genes de região variável de MAB 166-32 antifator 5 D e construção e expressão de IgG 166-32 guimérica e seu Fab

De modo a reduzir a imunogenicidade de MAB 166-32 quando usado em humanos, uma forma quimérica de MAB 166-32 foi feita por substituição de regiões constantes de camundongo com regiões constantes humanas de lgG1. Duas formas de Fab quimérica do anticorpo também foram feitas por substituição de regiões constantes de camundongo com suas contrapartes humanas. A clonagem de genes de região variável de MAB 166-32 e a construção e expressão do anticorpo 166-32 quimérico e seu Fab são descritas abaixo.

(1) Clonagem de genes de região variável de MAB antifator D

ARN total foi isolado das células de hibridoma secretando MAB

166-32 antifator D usando RNAzol seguindo o protocolo de fabricante (Biotech, Houston, TX). Primeira fita de CDNA foi sintetizada do RNA total usando-se oligo dT como o iniciador. PCR foi realizada usando-se iniciadores 3’ derivados - região constante (C) imunoglobulina e conjuntos de inicia20 dores degenerados derivados do peptídio líder ou a primeira região de quadro de genes V_H ou V_K murino como os iniciadores 5’. Embora DNA amplificado fosse notado para V_H, nenhum fragmento de DNA de comprimentos esperados foi amplificado para V_K. Ambos genes V_H e V_K foram cionados por PCR ancorada.

PCR ancorada foi realizada como descrito por Chen e Platsucas (Scand. J. Immunol. 1992; 35: 539-549). Para clonagem de gene V_K, CDNA de fita dupla foi preparado usando-se o iniciador Notl-MAK1 (5’TGCGGCCGCTGTAGGTGCTGTCTTT-3’ SEQ ID NO:5). Adaptadores anelados AD1 (5’-GGAATTCACTCGTTATTCTCGGA-3’ SEQ ID NO;6) e

AD2 (5’-TCCGAGAATAACGAGTG-3’ SEQ ID NO:7) foram ligados em ambos terminais 5’ e 3’ do CDNA de fita - dupla. Adaptadores nas extremidades 3’ foram removidos por digestão Notl. O produto digerido foi usado

JA3

Γ como o molde em PCR como oligonucleotídio AD1 como o iniciador 5’ e MAK2 (5’-CATTGAAAGCTTTGGGGTAGAAGTTGTTC-3’ SEQ ID NO:8) como o iniciador 3’, Fragmentos de DNA de aproximadamente 500 bp foram clonados em pUC19. Doze clones foram selecionados para análises adicionais. Sete clones foram verificados conterem a seqüência CDR3 específica para a mensagem Sp2/0V, e presumivelmente foram derivados das mensagensde cadeia leve aberrante_k do parceiro de fusão para a linha de célula hibridoma 166-32. Os oligonucleotídios Notl-MAK1 e MAK2 foram derivados da região Ck murino, e foram de 182 e 84 bp, respectivamente, à jusante do primeiro bp do gene C_K. Três clones foram analisados por seqüenciamento de DNA, rendendo seqüências encampando parte de C_K murino, V_K completo, e o peptídio líder.

Para clonagem de gene V_H, CDNA de fita - dupla foi preparado usando-se o iniciador Notl-MAG1 (5’-CGCGGCCGCAGCTGCTCAGAGTGTAGA-3’ SEQ ID NO:9). Adaptadores aneiados AD1 e AD2 foram ligados em ambos terminais 5’ e 3’ do CDNA de fita dupla. Adaptadores nas extremidades 3’ foram removidos por digestão Notl. O produto digerido foi usado como o molde em PCR com o oligonucleotídio AD1 e MAG2 (5’CGGTAAGCTTCACTGGCTCAGGGAAATA-3’ SEQ ID NO: 10) como iniciadores. Fragmentos de DNA de 500 a 600 bp em comprimento foram clonados em pUC19. Os oligonucleotídios Notl-MAG1 e MAG2 foram derivados da região Cy 1 murino, e foram 180 e 93 bp, respectivamente, à jusante do primeiro bp do gene Cy murino. Três clones foram analisados por seqüenciamento de DNA, rendendo seqüências encampando parte de Cy 1 murino, V_H completo, e o peptídio líder.

(2) Construção de vetores de expressão para IgG 166-32 quimérico e Fab

Os genes V_H θ V_K foram usados como moldes em PCR para adição de seqüência Kozak para a extremidade 5’ e o doador de fixação para a extremidade 3’. Após as seqüências terem sido analisadas para confirmação de ausência de erros de PCR, os genes V_H e V_K foram inseridos em cassetes de vetor de expressão contendo Cy 1 humano e C, respectivamente, para renderem pSV2neoV_H-huC₇1 e pSV2neoV-huC_k. DNAs plasmídio purificado - gradiente CsCI dos vetores de cadeia pesada e leve foram usados para transfectar células COS por eletroporação. Após 48 horas, o sobrenadante de cultura foi testado por ELISA para conter aproximadamente 200 ng/ml de IgG quimérica. As células foram colhidas e ARN total foi preparado. CDNA de primeira fita foi sintetizado do ARN total usando-se oligo dT como o iniciador. Este CDNA foi usado como o molde em PCR para gerar os fragmentos Fd e K DNA. Para o gene Fd, PCR foi realizada usando-se (5’AAGAAGCTTGCCGCCACCATGGATTGGCTGTGGAACT-3' SEQ ID NO:11) F como o iniciador 5’ e um iniciador 3’ derivado - CH1 (5CGGGATCCTCAAACTTTCTTGTCCACCTTGG-3’ SEQ ID NO: 12). Seqüência de DNA foi confirmada conter o Vh completo e o domínio CH1 de lgG1 humana. Após digestão com as enzimas próprias, os fragmentos de Fd DNA foram inseridos nos sítios de restrição Hindlll e BamHI do cassete de vetor de expressão pSV2dhfr-TUS para render pSV2dhfrFd (Figura 12A).

Para o gene k, PCR foi realizada usando-se (5¹AAGAAAGCTTGCCGCCACCATGTTCTCACTAGCTCT-3’ SEQ ID NO:13) como o iniciador 5’ e um iniciador 3’ derivado-C_k (5’CGGGATCCTTCTCCCTCTAACACTCT-3’ SEQ ID NO:14). Seqüência de DNA foi confirmada conter as regiões C_k humana e V_k. Após digestão com enzimas de restrição próprias, os fragmentos de k DNA foram inseridos nos sítios de restrição Hindlll e BamHI do cassete vetor de expressão pSV2neoTUS para render pSV2neok (Figura 12B). A expressão de ambos os genes Fd e k são dirigidas pelos elementos promotor e aperfeiçoador derivado HCMV. Uma vez que o gene Fd não inclui o resíduo aminoácido cisteína envolvido na ligação dissulfeto intercadeia, este Fab recombinante químérico contem cadeias leves e pesadas ligadas não covalentemente. Este Fab quiméríco é designado como cFab.

Para obter-se Fab recombinante comum a ligação dissulfeto de cadeia inter leve e pesada, o gene Fd acima foi estendido para incluir a seqüência codificando 9 aminoácidos adicionais (EPKSCDKTH SEQ ID

ΝΟ.Ί5) a partir da região de articulação de lgG1 humano. O segmento DNA

BstEU-BamHI codificando 30 aminoácidos na extremidade 3’ do gene Fd foi substituída com segmentos de DNA codificando o Fd estendido, Seqüência do Fd estendido com 9 aminoácidos adicionais a partir da região de articulação de lgG1 humano foi confirmada por seqüenciamento de DNA. Este gene Fd/9aa foi inserido no cassete vetor de expressão pSV2dhfr-TUS para render pSV2dhfrFd/9aa. Este Fab quimérico foi designado como cFab/9aa.

(3) Expressão de IgG e Fab 166-32 quiméricos

Para gerar linhas de células secretando IgG 166-32, células NSO foram transfectadas com DNAs plasmídio purificados de pSV2neoV_H- Γ huCyl e pSV2neoV-huCk por eletroporação. Células transfectadas foram selecionadas na presença de 0,7 mg/ml G418. Células foram crescidas em um frasco de isca de 250 ml usando-se meio contendo soro.

Para gerar linhas de células secretando Fab 166-32 quimérico, células CHO foram transfectadas com DNAs plasmídio purificados de pSV2dhfrFd (ou pSV2dhfrFd/9aa) e pSV2neok por eletroporação. Células transfectadas foram selecionadas na presença de G418 e metotrexato. Linhas de células selecionadas foram amplificadas em concentrações crescentes de metotrexato. Células foram subclonadas em células - simples por diluição limitante. Linhas de células subclonadas em células - simples de alta produção foram então crescidas em cultura de isca com 100ml usandose meio livre de soro.

(4) Purificação de IgG 166-32 quimérico

Sobrenadante de cultura de lOOml de cultura de isca foi carregado sobre uma coluna PROSEP-A 10ml (Bioprocessing, Inc., Princeton,

NJ). A coluna foi lavada com 10 volumes de leito de PBS. O anticorpo ligado foi eluído com tampão citrato 50mM, pH 3,0. Igual volume de Hepes 1M, pH 8,0 foi adicionado à fração contendo o anticorpo purificado para ajustar o pH para 7,0. Sais residuais foram removidos por troca de tampão com PBS através de ultrafiltração em membrana Míftipore (corte de PM.:3000). A concentração de proteína do anticorpo purificado foi determinada pelo processo BCA (Pierce).

5) Purificação de Fab 166-32 quimérico

Fab 166-32 quimérico foi purificado por cromatografia de afinidade usando-se um MAB antiidiotípico de camundongo para MAB 166-32. O

MAB anti-idiotípico é designado como MAB 172-25-3. Ele foi obtido por imu5 nização de camundongo com MAB 166-32 conjugado com hemocianaína de lapa keyhole” (KLH) e selecionando para ligação MAB 166-32 específica pode ser competido com fator D humano.

A matriz de cromatografia de afinidade foi preparada por mistura de 25mg MAB 172-25-3 com 5ml de pérolas de azlactone seca (Ultralink f

Biosupport Médium, Pierce) em um tampão de acoplamento (borato 0,1 M e Na₂SO₄ 0,75M, pH 9,0) por duas horas em temperatura ambiente. Então os sítios reativos residuais foram bloqueados com etanolamina 1M, pH 9,0 por

2,5 horas em temperatura ambiente. As pérolas foram então lavadas em um tampão contendo Tris 10mM, NaCI 0,15M, EDTA 5mM, Triton X-100 1% e

NaN₃ 0,02%, pH 8,0) e estocadas a 4°C.

Para purificação, 100ml de sobrenadante de culturas de isca de células CHO produzindo cFab ou cFab/9aa foram carregados sobre a coluna de afinidade acoplada com MAB 172-25-3. A coluna foi então inteiramente lavada com PBS antes de Fab ligado ser eluído com dietilamina

50mM, pH 11,5. Sais residuais foram removidos por troca de tampão como descrito acima. A concentração de proteína do Fab purificado foi determinada pelo processo BCA (Pierce).

(6) SDS-PAGE de IgG, cFab e cFab/9aa quiméricos

Os IgG, cFab e cFab/9aa quiméricos purificados foram analisa25 dos para pureza e tamanho molecular por SDS-PAGE. As proteínas foram tratadas com tampões amostra com ou sem mercaptoetanol. As amostras foram corridas sobre géis pré-moldados (12,5%)(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) junto com padrão de peso molecular prémanchado (faixa de peso molecular infertor)(BIO-RAD Laboratories, Hercu30 les, CA) usando-se o PhastSystem (Amersham Pharmacia Biotech). Os géis foram então manchados em solução de Coomassie Brilliant Blue (BIO-RAD) por 5 minutos e então manchas retiradas em solução aquosa contendo me33 tanol 40% e ácido acético 10%.

Os resultados de uma SDS-PAGE de cFab, cFab/9aa e IgG quimérico tratados sob condição não redutora e redutora, mostraram IgG quimérico tem uma banda de proteína de 150 kD, e duas bandas proteína de cadeia pesada (HC) e cadeia leve (LG) de aproximadamente 50 kD e 29 kD, respectivamente. Como esperado, cFab/9aa teve somente 1 banda de proteína de cerca de 40 kD sob condição não-redutora, indicando que as cadeias leve e pesada estão ligadas por uma ligação dissulfeto inter cadeia.

Por outro lado, cFab mostrou duas bandas de proteína sob condição não J⁷ redutora, indicando que as cadeias leve e pesada não estão ligadas por uma ligação dissulfeto inter cadeia.

(7) Determinação das atividades de IgG, cFab e cFab/9aa 166-32 quiméricos

As atividades de IgG, cFab e cFab/9aa 166-32 quiméricos foram 15 determinadas através do uso de ensaio hemolítico complemento alternativo descrito acima. A Figura 13 mostra que as formas murino e quimérica de MAB 166-32 têm idêntica potência em inibição de fator D. A Figura 14 mostra que cFab e cFab/9aa têm potência quase idêntica de inibição de fator D.

Mais importantemente, a potência das duas formas de Fab quimérico é idêntica àquela do IgG quimérico, levando em consideração que existem dois sítios ligantes por molécula IgG. Juntos, os resultados demonstram que IgG, cFab e cFab/9aa quiméricos retêm a potência do MAB 166-32 murino parente.

Exemplo 10: Proteção de dano de tecido mediado por complemento por

MAB 166-32 em um modelo ex vivo de corações de coelho perfusados com plasma humano

Ativação do sistema complementar contribui para rejeição hiperaguda de xenoenxertos. Isto pode ocorrer como um resultado de ligação de anticorpos de fixação de complemento, a ativação direta de complemento via o caminho alternativo sobre superfícies de células estranhas, e/ou a insuficiência de regulação complementar pelo órgão estranho (J.L. Platt et al.,

Transplantation, 1991; 52:937-947). Dependendo da particular interação espécie - espécie, ativação de complemento tanto através de caminho clássico como alternativo predomina, embora em alguns casos ambos caminhos possam ser operativos (T. Takahashi et al., Immunol. Res., 1997; 16:273297). Estudos anteriores mostraram que rejeição hiperaguda pode ocorrer na ausência de anticorpos antidoador via ativação do caminho alternativo (P.S.Johnston et al., Transplant. Proc., 1991; 23: 877-879).

Para demonstrar a importância do caminho complementar alternativo em dano de tecido, o MAB 166-32 antifator D foi testado usando-se um modelo ex vivo onde corações de coelhos isolados foram perfusados com plasma humano diluído. Este modelo foi anteriormente mostrado causar dano para o miocárdio de coelho devido à ativação do caminho complementar alternativo (M.R. Gralinski et al., Immunopharmacoiogy, 1996: 34: 79-88).

(1) Corações de coelhos perfusados Langendorff:

Coelhos New Zealand White, machos (2,2-2,4 kg) sofreram eutanásia por deslocamento cervical. Os corações foram rapidamente removidos e ligados a uma cânula para perfusão através da aorta. O meio de perfusão consistiu em um volume recirculante (250ml) de tampão KrebsHenseleit (K-H) modificado (pH 7,4, 37°C) liberado em uma taxa constante de 20-25 ml/minuto. A composição do meio tampão em milimoles por litro foi como se segue: NaCI, 117; KCI, 4,0; CaCI₂.H₂O, 2,4; MgCI₂.6H₂O, 1,2; NaHCO₃, 25; KH₂PO₄, 1,1; glicose, 5,0; L-glutamato de monossódio, 5,0; piruvato de sódio, 2,0; e BSA, 0,25% (peso/volume). O tampão K-H passou através de um pulmão poroso a gás consistindo em Silastic Laboratory Grade Tubing (Dow Corning, Midland, Ml), 55,49 metros de comprimento, com um diâmetro interno de 1,47mm e um diâmetro externo de 1,96 mm. O pulmão membranoso foi continuamente exposto a uma mistura de 95% O₂/5% CO₂ para obter-se uma pressão parcial de oxigênio dentro do meio de reperfusão igual a 500mmHg. Os corações foram regulados por todo o protocolo via eletrodos ligados ao átrio direito. Estímulos de regulagem (3 Hz, 4 ms de duração) foram liberados de um gerador de onda quadrada de laboratório (Grass SD-5, Guincy, MA). A artéria pulmonar foi cânulada com tubulação de polietileno para facilitar coleta do efluente de artéria pulmonar, representando o retorno venoso de coronária. A veia cava superior e inferior e as veias pulmonares foram ligadas para evitar saída do perfusato a partir dos vasos cortados. Um dreno ventricular esquerdo, sonda thermistor, e balão de látex foram inseridos via o átrio esquerdo e posicionados no ventrículo esquerdo. O balão de látex enchido com fluido foi conectado com tubulação rígida a um transdutor de pressão para permitir medida das pressões diastólica final e sístólica ventricular esquerda. A pressão desenvolvida ventricular esquerda é definida como a diferença entre as pressões sistóiica ventricular esquerda θ diastólica final. O balão intraventricular foi expandido com água destilada para obter-se uma pressão diastólica final ventricular esquerda de linha base inicial de 5mmHg. Pressão de perfusão coronária foi medida com um transdutor de pressão conectado a braço lateral da cânula aórtica. Todas as variáveis hemodinâmicas foram continuamente monitora15 das usando-se um gravador multicanais (Grass Polygraph 79D, Quincy, MA). Os corações isolados foram mantidos a 37°C por todo o período experimental através de encerramento dos mesmos em uma câmara de vidro lúmen duplo e passando o meio de perfusão através de um sistema de reservatório e liberação aquecido.

(2) Tratamentos com anticorpo:

Dois grupos de tratamento foram usados para determinar-se a habilidade de MAB 166-32 antifator D em inibir os efeitos de ativação de complemento em corações de coelhos isolados perfusados com plasma humano. Grupo 1: grupo negativo de isótipo ajustado, consistiu em corações perfusados com plasma humano 4% na presença de 0,3gg/ml de MAB G3519 (n=6) específico para gp 120 de HIV-1. Grupo 2: Grupo de tratamento, consistiu em corações perfusados com plasma humano 4% na presença de 0,3gg/ml de MAB 166-32 (n=6). O plasma humano foi separado de sangue integral coletado recentemente e estocada a -80°C até uso. Esta porcenta30 gem de plasma humano foi escolhida porque ele prejudica severamente função miocardial por um razoável comprimento de tempo e permite avaliarse a eficácia de um regime de tratamento. Maiores concentrações de pias36 ma humano neste sistema fazem com que o coração rapidamente desenvolva contratura, tornando difícil analisar os efeitos de uma droga em uma baixa concentração. Estudos preliminares determinaram que 0,3pg/ml foi a concentração efetiva mínima que pode proteger o coração isolado dos efei5 tos de ativação complemento. Todos os corações sofreram 10-15 minutos de equilíbrio no aparelho Langendorff antes de adição de qualquer anticorpo ao meio de perfusão . Dez minutos após a adição de anticorpo, plasma humano 4% foi adicionado ao meio de perfusão (250ml, recirculando). Variáveis hemodinâmicas, incluindo pressão de perfusão coronária (CPP), pres10 são sistólica ventricular esquerda (LVSP), pressão diastólica final ventricular esquerda (LVEDP), e pressão desenvolvida ventricular esquerda (LVDP) foram anotadas antes de adição de anticorpo (linha base), antes de adição de plasma humano 4%, e a cada 10 minutos a seguir, por 60 minutos.

MAB 166-32 (0,3 μg/ml) atenuou o aumento em pressão de perfusão de coronária (CPP) quando comparado a corações tratados com MAB G3-519 (0,3ug/ml) quando expostos a plasma humano 4%. Um aumento em CPP indica resistência vascular coronária que está freqüentemente associada com dano de tecido de miocárdio. Corações de coelhos isolados perfusados com MAB 166-32 mantiveram pressão diastólica final ventricular esquerdo (LVEDP), em acentuado contraste aos resultados obtidos com MAB G3-519 (Figura 15). O último grupo de corações desenvolveu um aumento progressivo em LVEDP após exposição ao plasma humano 4%, indicando contratura ou uma insuficiência do ventrículo para relaxar durante diástole (Figura 15). MAB 166-32 também atenuou a diminuição em pressão desenvolvida ventricular esquerda (LVDP) comparado aos corações tratados com MAB G3-519 após exposição a plasma humano diluído (Figura 15).

A Figura 16 mostra anotações representativas de função cardíaca obtidas antes e após 10, 30 e 60 minutos de perfusão na presença de plasma humano 4%. O aumento progressivo na LVEDP e a diminuição na

LVDP de um coração de coelho tratado com MAB G3-519 é óbvia após 10 minutos com deterioração progressiva de função ventricular nos subseqüentes 50 minutos. Por outro lado, preservação de função ventricular de um coração tratado com MAB 166-32 é evidente no período de 60 minutos.

Tomados juntos, os dados hemodinâmicos indicam que MAB

166-32 antifator D protege corações de coelhos isolados de dano mediado complementar como manifestado por uma manutenção total de função de miocárdio após desafio com plasma humano.

(3) ELISA de Bb Complementar:

Fator D catalisa a ciivagem de fator B ligado, rendendo os fragmentos Ba e Bb. A concentração de Bb presente serve como um índice de atividade de fator D. As concentrações de componente Bb ativado no fluido linfático coletado dos corações de coelhos isolados foram medidas usandose um kit ELISA comerciaimente disponível (Quidel). Os ensaios fizeram uso de um MAB direcionado contra Bb complementar humano para medir a ativação de sistema complementar humano durante perfusão de corações de coelhos na presença de plasma humano. Efluente iinfático dos vasos linfáti15 cos cortados foi coletado no ápice do coração, estalido congelado em nitrogênio líquido, e estocado a -70°C até ensaiado. A taxa de fluxo do efluente linfático foi anotada e contada de modo a normalizar a concentração Bb.

Dez minutos após perfusão com plasma humano 4% e em cada ponto de tempo a seguir, uma concentração significantemente menor (p<0,05) de Bb estava presente em efluentes linfáticos de corações tratados com MAB 166-32 como comparado a corações tratados com MAB G3-519 (Figura 17). A diminuição na produção do produto de ativação de complemento Bb nos corações de coelhos tratados com MAB 166-32 confirma a atividade inibidora do anticorpo sobre fator D.

(4) Localização imunohistoquímica de deposição de C5b-9:

No término do protocolo, corações foram removidos do aparelho

Langendorff, cortados em seções transversas, e congelados em nitrogênio líquido. Os tecidos de ápice e atriais foram descartados. Seções foram embutidas em meio de embutir de composto O.C.T. (Miíes, Inc., Ekhart, IN), cortadas para 3 pm, e colocadas sobre lâminas revestidas com poli-L-lisina.

Após rinsagem com solução salina tamponada com fosfato (PBS), seções foram incubadas com paraformaldeído 4% em PBS em temperatura am38 biente. Seções de coração foram rinsadas com PBS e incubadas com BSA

1% por 15 minutos para minimizar manchamento não específico. Após rinsagem com PBS, seções foram incubadas com um C5b-9 MAB anti - humano murino (Quidel) em uma diluição de 1:1000 em temperatura ambiente por uma hora. Seções foram rinsadas com PBS novamente e então incubadas em temperatura ambiente por uma hora com um anticorpo conjugado FITC antimurino de cabra (Sigma) em uma diluição de 1:320. Após uma rinsagem final com PBS, seções foram montadas com Fluoromount-G (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA) e protegidas como uma cobertura deslizante. Controles incluíram seções onde o anticorpo primário foi omitido e seções nas quais um lgG1 anticorpo de murino ajustado por isótipo (Sigma) foi substituído para o MAB anti-C5b-9.

Seções de coração de corações tratados com MAB 166-32 e MAB G3-519 foram examinadas para deposição de MAC humano (ou C5b15 9) por manchamento de imunofluorescência. Corações tratados com MAB

166-32 exibiram uma redução em deposição em MAC como comparados a corações tratados com MAB G3-519.

No total, os dados dos estudos ex vivo de corações de coelhos demonstraram a eficácia de MAB 166-32 em prevenção de dano de tecido cardíaco como um resultado da inibição do caminho complementar alternativo. Inibição de ativação complemento foi mostrada prolongar a sobrevivência de xenoenxertos (S.C.Makrides, Pharmacological Rev., 1998, 50: 59-87). Por isso, MAB 166-32 potencialmente pode ser usado como um agente terapêutico para proteger xenoenxertos de destruição por plasma humano.

Exemplo 11: Efeitos inibidores de MAB 166-32 sobre ativação de complemento e reações inflamatórias em um modelo de circulação extracorporeal de desvio cardiopulmonar

Pacientes sofrendo de desvio cardiopulmonar (CPB) freqüentemente manifestam uma síndrome de resposta inflamatória sistêmica genera30 lizada. Clinicamente, estas reações são refletidas em leucocitose pósoperatória, febre, e acumulação de fluido extravascular que pode conduzir a recuperação prolongada e ocasionalmente com séria disfunção de órgão (J.K. Kirklin et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 1983; 86: 845-857; L. Nilsson et al., Scand. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. , 1988; 22:51-53; P.W.Weerwind et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 1995; 110: 1633-1641). As respostas inflamatórias consistem em mudanças humorais e celulares que contribuem para ambos, dano de tecido e hemostase prejudicada. Ativação de complemento tem sido implicada como a causa importante da reação inflamatória sistêmica (P. Haslam et al., Anaesthesia, 1980; 25: 22-26; A. Salama et al., N.Eng. J.Med., 1980; 318: 408-414; J. Steinberg et al., J.Thorac. Cardiovasc. Surg. , 1993; 106: 1008-1016). Ativação de complemento é atribuída à interação entre o sangue e a superfície das máquinas CPB constituindo circuito extracorpóreo (D. Royston, J. Cardiothorac. Vasc. Anesth., 1997; 11: 341-354). Substâncias inflamatórias primárias são geradas após ativação do sistema complementar, incluindo as anafilatoxinas C3a e C5a, a opsonina C3b, e o complexo de ataque de membrana C5b-9. C5a foram mostrados regularem ascendentemente CD11b (integrina) e CD18 (integrina) de complexo MAC-1 em células polimorfonucleares PMN (compreendendo principalmente neutrófilos) in vitro (M.P.FIetcher et al., Am. J. Physiol., 1993; 265: H1750-H1761) e induzir liberação de enzima lisossomal por PMN. C5b-9 pode induzir a expressão de P-seíetina (CD62P) sobre plaquetas (T. Wiedmer et al., Blood, 1991; 78: 2880-2886), e ambos C5a e C5b-9 induzem expressão de superfície de P-selectina sobre células endoteliais (K.E.Foreman et al., J.Clin.Invest., 1994; 94: 1147-1155), C3a e C5a estimulam quimiotaxia de mastócitos humanos (K.Hartmann et al., Blood, 1997; 89:2868-2870) e disparam a liberação de histamina (Y. Kubota, J. Dermatol. , 1992; 19: 19-26) que induz permeabilidade vascular (T.J.Williams, Agents Actions, 1983; 13:451-455).

Recirculação in-vitro de sangue integral em um circuito desvio extracorporeal foi usada extensivamente como um modelo para estimular mudanças de leucócitos (J. Kappelamyer et al., Circ. Res., 1993; 72: 10751081; N. Moat et al., Ann. Thorac. Surg., 1993; 56: 1509-1514; C.S.Rinder et al., J. Clin. Invest., 1995: 96: 1564-1572) e plaquetas (V.L.Jr. Hennesy et al., Am. J. Physiol., 1977; 2132: H622- H628; Y.Wachtfogel et al., J.Lab.Clin.

Med., 1985; 105: 601-607; C.S.Rinder et ai., ibid) e ativação de complemento (P.G. Loubser, Perfusion, 1987; 2:219-222; C.S.Rinder et ai., ibid;

S.T. Baksaas et ai., Perfusion, 1998; 13: 429-436) em CPB. A eficácia do

MAB 166-32 antifator D para inibir a ativação celular e de complemento em sangue integral humano foi estudada usando-se este modelo de circulação extracorporeal para CPB.

(1) Preparação de circuito extracorporeal:

Circuitos extracorporais foram montados usando-se um oxigenador de membrana pediátrica de fibra - oca com um módulo trocador de calor integrado (D 901 LILLPUT 1; DIDECO, Mirandola (MO), laly), um reservatório venoso pediátrico com um filtro de cardiotomia integrado (D 752 Venomidicard; DIDECO), um conjunto de tubulação de perfusão (Sorin Biomedical, Inc., Irvine, CA) e uma bomba de rolo multifluxo (Stockert Instruments GmbH, Munich, Germany). Oxigenador e circuito foram iniciados com solução Plasma-Lyte 148 (Baxter Healthcare Corp., Deerfield, IL). O iniciador foi aquecido a 32°C com um aquecedor-resfriador (Sarns; 3M Health Gare, Ann Arbor, Ml) e circulado em 500 ml/minuto, enquanto o fluxo de gás de varredura foi mantido em 0,25 litros por minuto usando-se oxigênio 100%. O gás de varredura foi trocado para uma mistura de oxigênio (95%) e dióxido de carbono(5%) após o sangue ser adicionado ao circuito. O pH, PCO₂, PO₂, e temperatura de perfusato foram continuamente monitoradas por todo o período de recirculação. Bicarbonato de sódio foi adicionado quando requerido para manter pH na faixa de 7,25-7,40.

(2) Operação de circuito extracorporeal e amostragem

450ml de sangue foram retirados em 5-10 minutos de voluntários saudáveis sem medicações em uma embalagem de transferência (Haemo-Pak; Chartermed, Inc., Lakewood, NJ) contendo heparina suína (5 unidades/ml, concentração final; Elkins-Sinn, Cherry Hill, NJ) e o MAB 166-32 antifator D ou 0 MAB G3-519 controle negativo de isótipo ajustado (18 pg/ml concentração final). Esta concentração de anticorpos é equivalente a cerca de 1,5 vezes a concentração molar de fator D no sangue. Antes de adição do sangue ao circuito extracorporal, uma amostra de sangue foi tomada da embalagem de transferência como a amostra “pré - circuito, designada como a amostra 10 minutos. O sangue foi então adicionado ao reservatório via o orifício inicial. Fluido inicial foi simultaneamente retirado distal da saída de oxigenador para render um volume de circuito final de 600ml e um hematócrito final de 25-28%. Sangue foi recirculado com iniciador, e completa mistura foi realizada dentro de 3 minutos; uma amostra de linha base foi retirada e designada como tempo 0. Para imitar procedimentos usuais de operação cirúrgica sob hipotermia, o circuito foi então resfriado para 27°C por 70 minutos após o que foi reaquecido para 37°C por outros 50 minutos (para um total de 120 minutos de recirculação).

Amostras de sangue também foram retiradas em 10, 25, 40, 55,

70, 80 e 120 minutos durante a recirculação. Amostras de plasma foram preparadas por imediata centrifugação em 2000xg a 4°C. Alíquotas para os ensaios hemolíticos de caminho alternativo e ensaios mieloperoxidase de neutrófilo específicos foram estalido congelados sobre gelo seco e então estocados a -80°C. Alíquotas para medição de complementos C3a, C4d, sC5b-9, e Bb por ELISA foram imediatamente misturadas com igual volume de um Specimen Stabilizíng Médium (Qutdel), estalido congelados sobre gelo seco, e então estocadas a -80°C. Amostras de sangue integral também foram coletadas para imunomanchamento dos marcadores de superfície de célula de ativação CD11b e CD62P sobre neutrófilos e plaquetas, respectivamente. Para evitar subsequente ativação de complemento das amostras de sangue integral durante o procedimento de manchamento, 1ΟμΙ de EDTA 1M foram adicionados a cada ml de sangue integral para render uma con25 centração final de 10 mM.

(3) Ensaios hemolíticos de caminho alternativo

A atividade complemento alternativa nas amostras de plasma em diferentes pontos de tempo dos circuitos tratados com MAB 166-32 e MAB G3-519 foram testadas usando-se células vermelhas de sangue de coelho como descrito acima. Cinqüenta microlitros de cada amostra (20%) foram misturados com 50μΙ de tampão GVB/Mg-EGTA antes de adição de

30μΙ de células vermelhas de sangue de coelho (1,7x10⁸ células/ml). Após incubação a 37°C por 30 minutos, os sobrenadantes foram coletados e OD lida em 405nm usando-se um leitor de placa ELISA.

A Figura 13 mostra a atividade complementar alternativa no circuito tratado com MAB 166-32 foi completamente inibida pelo anticorpo, en5 quanto MAB G3-519 não teve efeito sobre a atividade complementar quando usado no correspondente circuito. Os resultados indicam que MAB 166-32 é um potente inbidor do caminho complementar alternativo. Mesmo em uma razão molar de somente 1,5:1 (MAB : fator D), MAB 166-32pode inibir completamente a atividade complementar alternativa.

(4) Ensaios de produtos de ativação complemento

Em adição aos ensaios hemoiíticos descritos acima, as amostras de plasma dos dois circuitos extracorpóreos foram testadas para os níveis de C3a, sC5b-9, Bb, e C4d. Estas substâncias foram quantificadas usando-se kits ELISA comercialmente disponíveis (Quidel) de acordo com os manuais dos fornecedores. Como C5a, sC5b-9 é um marcador alternativo para atividade C5 convertase nas cascata complemento. Ambas C5a e sC5b-9 são produzidas como um resultado de divagem de C5 por C5 convertase. Bb complemento é um marcador específico para a ativação do caminho complemento alternativo, enquanto C4d é um marcador específico para a ativação do caminho clássico.

As Figuras 19 e 20 mostram que MAB 166-32 inibiu eficazmente a produção de C3a e sC5b-9, respectivamente, enquanto o MAB G3-519 controle negativo de isótipo ajustado não. A especificidade e potência de MAB 166-32 são ainda elucidadas nas Figuras 21 e 22. A produção de Bb pelo caminho complementar alternativo foi completamente inibida por MAB 166-32, enquanto os níveis de Bb no circuito G3-519 aumentaram com o tempo durante recirculação. Interessantemente, os níveis de C4d em ambos circuitos MAB 166-32 e G3-519 não variam significantemente com o tempo. Os últimos resultados sobre níveis de Bb e C4d indicam fortemente que a ativação de complemento na circulação extracorporeal é principalmente mediada via o caminho alternativo.

No total, os resultados indicam que MAB 166-32 é um potente inibidor do caminho complementar alternativo. Inibição de fator D pode abolir a ativação complementar nas etapas subseqüentes da cascata como manifestado pela redução em formação de C3a e sC5b.

(5) Ensaios para a ativação de neutrófilos e plaquetas

A ativação de neutrófilos e plaquetas foi quatificada através de medição de níveis da expressão de superfície de célula de CD11b e CD62P sobre neutrófilos e plaquetas, respectivamente. Para rotulação de CD11b de neutrófilos, 100μΙ de sangue integral coletados dos circuitos foram imediatamente incubados com 20μΙ de anticorpo phycoerythrin (PE)-anti-CD11 (clone D12, Becton Dickinson, San Jose, CA) por 10 minutos em temperatura ambiente em um tubo de microcentrífuga. Então 1,4ml de FACS Lysing Solution (Becton Dickinson) foram adicionados por 10 minutos em temperatura ambiente para lisar células vermelhas de sangue e para fixar leucócitos. Os tubos de microcentrífuga foram centrifugados em 300xg por 5 minu15 tos. O sobrenadante foi aspirado e as células ressuspensas em PBS para lavagem. Os tubos de microcentrífuga fora novamente girados, o sobrenadante aspirado, e as células finalmente ressuspensas em 0,5ml de paraformaldeído 1% por toda a noite antes da análise usando-se um citômetro de vazão EPIC-XL (Coulter Corp. Miami, FL). Para rotulagem dupla para con20 comitantemente identificar a população de neutrófilos, 5μΙ anticorpo isotiocianato de fluoresceína (FITC)-anti-CD15 (clone MMA, Becton Dickinson) foram adicionados para incubação junto com anticorpo PE-anti-CD11b.

Para rotulagem de CD62P de plaquetas, 40μΙ de sangue integral coletados dos circuitos foram imediatamente incubados com 20μΙ de anti25 corpo PE-anti-CD62P (clone AC1.2, Becton Dickinson) por 10 minutos em temperatura ambiente em um tubo de microcentrífuga. Então a mistura foi tratada com FACS Lysing Solution como descrito acima. Os tubos de microcentrífuga foram centrifugados a 2000 x g por 5 minutos. As plaquetas foram lavadas em PBS, fixadas em paraformaldeído 1% e então analisadas como descrito acima. Para rotulagem dupla para concomitantemente identificar a população de plaquetas, 5 μΙ de anticorpo FlTC-anti-CD42a foram adicionados para incubação junto com anticorpo PE-anti-CD62P.

Para medição citométrica de fluxo, as populações de PMN (contendo principalmente neutrófilos) e plaquetas foram identificadas por canais vivos baseado em parâmetros de dispersão dianteira versus lateral e manchamento específico com anticorpo FITC-anti-CD15 e anticorpo FITCanti-CD42a, respectivamente. O manchamento de fundo foi bloqueado usando-se anticorpos rotulados de isótipo ajustados. A intensidade de expressão de CD11b e CD62P foi representada por intensidade de fluorescência média (MFI).

A Figura 23 mostra que neutrófilos do circuito extracorporeal tratado com MAB 166-32 mostrou expressão substancial mente menor de CD11b como comparados àqueles do circuito tratado com MAB G3-519. Estes dados juntos com os outros acima indicam que inibição da ativação de complemento alternativo por MAB 166-32 pode evitar ativação de neutrófiios.

Similarmente, a Figura 24 mostra que plaquetas do circuito extracorporal tratado com MAB 166-32 mostraram expressão substancialmente inferior de CD62P como comparado àquelas do circuito tratado com MAB G3-519. Novamente, estes dados juntos com aqueles acima indicam que inibição da ativação de complemento alternativo por MAB 166-32 pode evitar ativação de plaquetas.

(6) Ensaio de mieloperoxidase de neutrófilo específica (MPQ)

O grau de ativação de neutrófilos também foi medido usando-se um kit ELISA comercial (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN) para quantificar a quantidade de mieloperoxidase de neutrófilo específica (MPO) nas amostras de plasma dos circuitos extracorpóreos. MPO é estocada em grânulos primários (azurofílico) de neutrófilos. Ela é liberada quando neutrófilos sofrem desgranulação durante ativação. Por isso MPO é um marcador solúvel para ativação de neutrófilo. Os ensaios foram realizados de acordo com o manual do fabricante. Em resumo, amostras foram incubadas nas células de uma microplaca, que foram revestidas com um primeiro MAB para MPO. O complexo MPO-MAB é rotulado com um anticorpo policlonal de biotina ligado preparado a partir de MPO - anti-soros de cabra. A etapa

final do ensaio é baseada em um acoplamento biotina - avidina no qual avidina estava covalentemente ligada a fosfatase alcalina. A quantidade de

MPO em cada amostra é enzimaticamente medida com adição do substrato

4-nitrofenii fosfato (pNPP), através de leitura de OD em 405nm.

A Figura 25 mostra que os níveis de MPO no circuito tratado com MAB 166-32 foram substancialmente menores que aqueles no circuito MAB G3-519. Os resultados corroboram com aqueles sobre a expressão de CD11b nos estudos imunofluorométricos descritos acima.

Tomados juntos, os dados sobre complemento, neutrófilos e plaquetas suportam a noção de que inibição efetiva da ativação complemento alternativa em circulação extracorpórea pelo MAB 166-32 antifator D pode abolir a formação de substâncias inflamatórias C3a, C5a, e sC5b-9 e assim reduzir a ativação de neutrófilos e plaquetas. É antecipado que MAB 166-32, assim como seus fragmentos, homólogos, análogos, e suas contra15 partes de moléculas pequenas, serão eficazes em prevenção ou redução de reações clínicas inflamatórias causadas por CPB.

Exemplo 12: Estudo dos efeitos de MAB 166-32 em um modelo de cão de isquemia e dano de reperfusão

Um estudo foi designado para examinar se MAB 166-32 pode proteger tecidos miocardiais de dano devido a isquemia e reperfusão em cães, embora fôsse reconhecido no início que cão pode não ser um modelo animal desejável para estudar esta indicação para MAB 166-32, A habilidade de MAB 166-32 em neutralizar fator D de cão em ensaios hemolíticos foi pelo menos 10 vezes menos efetiva como comparada a fator D humano (ver

Exemplo 7). Devido à quantidade limitada de MAB 166-32 disponível no momento, MAB 166-32 foi administrado no coração via o vaso sangüíneo intracoronário. Foi esperado que o anticorpo possa desenvolver uma concentração de pelo menos 60gg/ml no sangue coronário de modo a inibir completamente fator D de cão no coração. A dosagem foi calculada ser

3,15mg/kg/infusão para 6 infusões. MAB G3-519 foi usado como o controle por isótipo ajustado no estudo.

Resumidamente, cães hound criados para esse propósito foram

anestesiados. Uma toracotomia esquerda foi realizada no quarto espaço intercostal para expor o coração. A artéria coronária circunflexa esquerda próxima foi isolada e ligada por minutos para indução de isquemia que foi seguida por 6 horas de reperfusão. O anticorpo foi dado 6 vezes em 30 minutos antes de isquemia, 10 minutos antes de reperfusão, e então 75, 150, 225, 300 minutos durante reperfusão. Microesferas radioativas foram injetadas em diferentes pontos de tempo para medir-se fluxo de sangue regional. No fim dos experimentos, corações foram perfusados com corante azul de Evans e trifenil tetrazolium para medição de área em risco e tamanho de infarto, respectivamente. Linfa de coronária e sangue integral da veia jugular foram coletados antes de isquemia e no fim do experimento. Estas amostras foram usadas para medir-se a concentração dos anticorpos injetados e atividade hemolítica de caminho alternativo.

Os resultados mostram que a concentração mais alta obtenível de MAB 166-32 na linfa coronária foi cerca de 30 gg/ml, que está bem abaixo da concentração requerida para completa inibição de fator D de cão na circulação coronária. O anticorpo também foi detectado na circulação sistêmica, sugerindo que o anticorpo injetado dissipou-se fora do coração. Os dados dos ensaios hemolíticos mostram que atividade complemento alternativa não foi reduzida; como é consistente com o fato de que a concentração do anticorpo foi baixa. Por isso, não é possível retirar-se uma conclusão sobre o efeito de MAB 166-32 em reperfusão destes experimentos em cães.

A descrição anterior, termos, expressões e exemplos são somente exemplares e não limitantes. A invenção inclui todos os equivalentes das realizações anteriores, conhecidos e desconhecidos. A invenção é somente limitada pelas reivindicações que se seguem e não por qualquer estabelecimento em qualquer outra porção deste documento ou em qualquer outra fonte.

LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA <110> Michael S.C. Fung Bill N.C. Sun Cecily R.Y. Sun <i2o> inibidores de Ativação de Complemento <130> 98-2 <140> 09/253,689 <14l> 20-02-1999 <150> 60/075,328 <15l> 20-02-1998 <1SO> 15 <170> PascSEQ para Versão Windows 4.0 P <210> 1 <211> 699 <212> DNA <213> humano <220>

<221> CDS <222> (4)...(687) <400> 1

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<221> CDS <222> ¢4)...(702) <400> 3

cgg

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tac Tyr

atg Met 15

48

gca

tcg

gtg

cag

gtg

aac

ggc

aag

cac

gtg

tgc

gga

ggc

tte

ctg

gtg

96

Ala

Ser

Val

Gin

Val 20

Asn

Gly

Lys

His

Val 25

cys

Gly Gly

Phe

Leu 30

Val

tct

gag

cag

tgg

gtg

ctg

agt

gca

gca

cac

tgc

ctg

gag

gac

gtg

gcc

144

Ser

Glu

Gin

Trp 35

val

Leu

Ser

Ala

Ala 40

His

Cys

Leu

Glu

Asp 45

Val

Ala

gag

ggg

aag

ctg

cag

gtt

ctc

ctg

ggt

gcg

cac

tcc

ctg

tea

cag

CCC

192

Glu

Gly

Lys 50

Leu

Gin

Val

Leu

Leu 55

Gly

Ala

His

Ser

Leu 60

Ser

Gin

Pro

gag

CCC

tcg

aag

cgc

ctg

tac

gac

gtg

ctc

cgc

gcc

gtg

CCC

cac

cca

240

Glu

Pro 65

Ser

Lys

Arg

Leu

Tyr 70

Asp

Val

Leu

Arg

Ala 75

Val

Pro

His

Pro

gac

age

cag

cct

gac

acc

ate

gac

cat

gat

ctc

ctc

ctg

ctg

aag

ctc

288

Asp 80

Ser

Gin

Pro

Asp

Thr 85

Ile

Asp

His

Asp

Leu 90

Leu

Leu

Leu

Lys

Leu 95

tcc Ser	gag aag gcc gag ctg ggc cct	gcc gtg cag ccc ctt gcc tgg caa	336
Glu Lys Ala Glu Leu 100	Gly Pro	Ala	Vai 105	Gin	Pro Leu Ala	Trp Gin 110
cga	gag gac cac gag gtt	ccg gea	ggc	acg	ctc	tgc gac gtg	gcc ggc	384
Arg	Glu Asp His Glu Vai	Pro Ala	Gly	Thr	Leu	Cys Asp Vai	Ala Gly
	115		120			125
tgg	gga gtg gtc agt cac	act ggc	cgc	cgg	ccc	gac cgt ctg	cag cac	432
Trp	Gly Vai Vai Ser His	Thr Gly	Arg	Arg	Pro	Asp Arg Leu	Gin His
	130	135				140
ctg	ctc cta ccg gtg ctg	gac cgc	acc	acc	tgc	aac ctg cgc	aca tac	480
Leu	Leu Leu Pro Vai Leu	Asp Arg	Thr	Thr	Cys	Asn Leu Arg	Thr Tyr
	145	150				155
cac	gat ggc acc ate acc	gag cgc	atg	atg	tgc	gcg gag age	aac cgt	528
His	Asp Gly Thr Xle Thr	Glu Arg	Met	Met	Cys	Ala Glu Ser	Asn Arg
160	165				170		175
cgg	gac age tgc aag ggc	gac tcc	gga	ggc	ccg	ctg gtg tgc	ggg ggt	576
Arg Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser	Gly	Gly	Pro	Leu Vai Cys	Gly Gly
	180			185			190
gtg	gcc gag gga gtg gtt	acc tea	ggc	tcc	cga	gtc tgc ggc	aac cgc	624
Vai	Ala Glu Gly Vai Vai	Thr Ser	Gly	Ser	Arg	Vai Cys Gly	Asn Arg
	195		200			205
aag	aaa ccc ggc ate tac	acg cgc	ttg	gcg	age	tac gtg gcc	tgg ate	672
Lys	Lys Pro Gly Ile Tyr	Thr Arg	Leu	Ala	Ser	Tyr Vai Ala	Trp Ile
	210	215				220
gac	gga gtg atg gct gac	age gea	gcc	gcc	tagtaggaat tc		714
Asp	Gly Vai Met Ala Asp	Ser Ala	Ala	Ala

225 230 <210> 4 <211> 233 <212> PRT <2i3> porco <400> 4

Ile

Leu

Gly

Gly

Gin

Glu

Ala

Lys

Ser

HÍS

Glu

Arg

Pro

Tyr

Met

Ala

1

5

10

15

Ser

vai

Gin

Vai

Asn

Gly

Lys

His

Val

Cys

Gly

Gly

Phe

Leu

Val

Ser

20

25

30

Glu

Gin

Trp

Vai

Leu

Ser

Ala

Ala

His

Cys

Leu

Glu

Asp

Val

Ala

Glu

35

40

45

Gly

Lys

Leu

Gin

Val

Leu

Leu

Gly

Ala

His

Ser

Leu

Ser

Gin

Pro

Glu

50

55

60

Pro

Ser

Lys

Arg

Leu

Tyr

Asp

Val

Leu

Arg

Ala

Val

Pro

His

Pro

Asp

65

70

75

80

Ser

Gin

Pro

Asp

Thr

Ile

Asp

His

ASp

Leu

Leu

Leu

Leu

Lys

Leu

Ser

85

90

95

Glu Lys Ala Glu Leu Gly Pro Ala Vai Gin Pro Leu Ala Trp Gin Arg

100

105

110

Glu

Asp

His

Glu

Vai

Pro

Ala

Gly

Thr

Leu

Cys

Asp

Val

Ala

Gly

Trp

115

120

125

Gly

Vai

Vai

Ser

His

Thr

Gly

Arg

Arg

Pro

Asp

Arg

Leu

Gin

His

Leu

130

135

140

Leu

Leu

Pro

Vai

Leu

Asp

Arg

Thr

Thr

Cys

Asn

Leu

Arg

Thr

Tyr

His

145

150

155

160

Asp

Gly

Thr

Ile

Thr

Glu

Arg

Met

Met

cys

Ala

Glu

Ser

Asn

Arg Arg

165

170

175

Asp

Ser

Cys

Lys

Gly

ASp

Ser

Gly

Gly

Pro

Leu

Val

Cys

Gly

Gly

Val

180

185

190

Ala

Glu

Gly

Vai

Val

Thr

Ser

Gly

Ser

Arg

Val

Cys

Gly

Asn

Arg

Lys

195

200

205

Lys

Pro

Gly

Ile

Tyr

Thr

Arg

Leu

Ala

Ser

Tyr

Val

Ala

Trp

Ile

Asp

210

215

220

Gly

Vai

Met

Ala

Asp

Ser

Ala

Ala

Ala

225

230

<210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220>

<223> iniciador <400> 5 tgcggccgct gtaggtgctg tcttt <210> 6 <211> 23 <212> DNA <2ΐ3> Seqüência artificial <220>

<223> iniciador <400> 6 ggaattcacfc cgttattctc gga <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> Seqüência artificial

MM r

<220>

<223> iniciador <400> 7 tccgagaata acgagtg <210> 8 <211> 29 <212> DNA

Glu Lys Ala Glu Leu Gly Pro Ala Vai Gin Pro Leu Ala Trp Gin Arg
	100	105	110
Glu Asp Hia	Glu Vai Pro	Ala Gly Thr Leu	Cys Asp Vai Ala Gly Trp
115		120	125
Gly Vai Vai	Ser His Thr	Gly Arg Arg Pro	Asp Arg Leu Gin His Leu
130		135	140
Leu Leu Pro	Vai Leu Asp	Arg Thr Thr Cys	Asn Leu Arg Thr Tyr His
145	150		155 160
Asp Gly Thr	Ile Thr Glu	Arg Met Met Cys	Ala Glu Ser Asn Arg Arg
	165	170	175
Asp Ser Cys	Lys Gly Asp	Ser Gly Gly Pro	Leu Vai Cys Gly Gly Vai
	180	185	190
Ala Glu Gly	Vai Vai Thr	Ser Gly Ser Arg	Vai Cys Gly Asn Arg Lys
195		200	205
Lys Pro Gly	Ile Tyr Thr	Arg Leu Ala Ser	Tyr Vai Ala Trp Ile Asp
210		215	220
Gly Vai Met	Ala Asp Ser	Ala Ala Ala
225	230

<210> 5 <211> 25 <212> DNA <2ΐ3> Seqüência artificial <220>

<223> iniciador <400> 5 tgcggccgct gtaggtgctg tcttt <210> 6 <211> 23 <212> DNA <2i3> Seqüência artificial <220>

<223> iniciador <400> 6 ggaattcact cgttattctc gga <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213 > Seqüência artificial <220>

<223> iniciador <400> 7 tccgagaata acgagtg <210> 8 <211> 29 <212> DNA r

<2i3> Seqüência artificial <220>

<223> iniciador <400> 13 aagaaagctt gccgccacca tgttctcact agctct <210> 14 <211> 26 <212> DNA <2i3> Seqüência artificial <220>

<223> iniciador <4 00> 14 cgggatcctt ctccctctaa cactct <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213 > humano <400> 15

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 1 5

Claims (7)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Hibridoma, caracterizado pelo fato de ser o hidrodoma depositado no American Type Culture Collection sob o número de acesso HB12476.

   5 2. Anticorpo monoclonal ou um fragmento do mesmo, caracterizado pelo fato de ser produzido por um hibridoma, como definido na reivindicação 1.

   3. Anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo, caracterizado pelo fato de ser derivado a partir de um anticorpo monoclonal, como

   10 definido na reivindicação 2.

   4. Fragmento do anticorpo humanizado de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de ser Fab, (Fab’)₂, Fv ou Fv de cadeia simples.

   5. Anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo, caracteriza15 do pelo fato de que possui uma região variável de um anticorpo monoclonal, como definido na reivindicação 2, e uma região humana constante.

   6. Anticorpo desimunizado ou um fragmento do mesmo, caracterizado pelo fato de ser derivado a partir de um anticorpo monoclonal, como definido na reivindicação 2.

   20 7. Anticorpo ou um fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que se liga a uma região de fator D humano entre (e incluindo) resíduo de aminoácido números Cys 154 e Cys 170.

   8. Anticorpo ou um fragmento do mesmo de acordo com a rei25 vindicação 7, caracterizado pelo fato de que não se liga a fator D humano se tanto (i) resíduos de aminoácidos Arg 156 e His 159, como (ii) resíduos de aminoácidos Leu 168 estão ausentes.

   1/25

   REATIVIDADE DE Mabs ANTI-FATOR D COM FATOR D ELISA

   JF-3 O.O1 0.1

   CONCENTRAÇÃO DE ANTICORPOS (pg/ml)
2. 2/25

   INIBIÇÃO DE HEMÓLISEAP POR ANTICORPO 166-32 ANTI-FATOR D t—'—r

   CONCENTRAÇÃO DE ANTICORPOS (gg/ml)

   — 1— -¹ o o V— ¹-1-¹ o co .-1-.-r O o o o CM CQ • z o c>
3. 3/25

   CONCENTRAÇÃO DE ANTICORPOS (gg/ml)
4. 4/25

   CONCENTRAÇÃO DE ANTICORPOS (gg/ml)
5. 5/25

   INIBIÇÃO DE HEMÓLISEAP DEPENDENTE DE FATOR D POR Mab 166-

   CONCENTRAÇÃO FATOR D
6. 6/25

   PIG Q EFEITO DE Mab 166-32 ANTI-FATOR D SOBRE LISE DE * τ CÉLULA EAC3b DEPENDENTE DE FATOR D í£—3 0.01

   CONCENTRAÇÃO DE ANTICORPOS Qjg/ml)
7. 7/25

   EFEITO DE Mab 166-32 SOBRE PRODUÇÃO DE C3a VIA ATIVAÇÃO DE COMPLEMENTO AP SOBRE ZIMOSAN

   CONCENTRAÇÃO DE ANTICORPOS (pg/ml)

   8125 ο

   ο <0 ο

   Μ·

   Ο

   CN <3 ç>

   ÇQ

   9/25

   CONCENTRAÇÃO Fab OU Mab (nM)

   10/25 ο

   11/25

   MAPEAMENTO DE EPÍTOPO DE Mab 166-32 USANDO MUTANTES FATOR D EXPRESSOS-BACULOVÍRUS d

   o o

   CN d

   I

   1E—3 0.01 i

   CONCENTRAÇÃO DE ANTICORPOS (gg/ml)

   12/25

   REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DE PLASMÍDIOS VETORES DE EXPRESSÃO PARA Fab 166-32 QUIMÉRICO: (A) pSV2dhfrFD e (B) pSV2neoK to CD

   X to

   CL

   I fc €

   CX.O ^J |o-a x

   0.0

   CO -J =§

   Cl

   E

   Q.

   i to .00

   O.

   E o

   Q) §

   to

   CL

   13/25

   CONCENTRAÇÃO DE ANTICORPOS (gg/ml) <-r-1-1-1-1-Γ ο

   ο <ο ο

   c:

   ο <

   CÜ

   Ο

   V

   LLI ω

   LU LU ΩΙ

   Ο

   CN

   14/25

   INIBIÇÃO DE HEMÓLISE AP POR IgG 166-32 QUIMÉRICA E SEU Fab ι-1-r τ

   CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNA (nM)

   1 I I Γ- | r

   O

   O)

   O co o

   IO

   15/25 xo

   CM hO ϊ

   Η

   Ζ

   Ο ο

   ο «< ο ΟΩ υ_ Ο LLI — 01 Ο ο 3 ω LL1 'sO Ο SÍ- Ο §Β => ο X <ζ ίο ωθ ί

   χ

   LU α

   £ ί

   D

   Ο

   LLI Ζ LL LU LU >

   5<

   5ο§ ω οι ω WH3 ωζσ οι lu ω ο, > LU

   Ο)

   X

   Ε

   Ε linha base 10 min 30 min 60 min

   TEMPO APÓS ADIÇÃO DE PLASMA HUMANO

   17/25 r

   EFEITOS DE Mab 166-32 SOBRE OS NÍVEIS DE Bb EM LINFA CARDÍACA DE CORAÇÕES DE COELHOS ISOLADOS COM

   FIG 1 7 PLASMA HUMANO

   TEMPO (min.) '

   E

   Cn •O

   CQ

   18/25 •ο

   I <ο <ο σ>

   <η ♦ο ο

   TEMPO (min.)

   I-,-j—1-,-,-,-,-J-,-_Γ ο Ο ο ο ο ο

   JM Ο οο <Ο _ω V C\| ο

   LU

   X

   19/25

   CD 'V—

   G

   PRODUÇÃO DE C3a EM CIRCUITOS EXTRACORPOREOS

   150 r

   TEMPO (min.) ε

   ã°S

   O z

   o o

   20/25 r

   TEMPO (min.) ο

   21/25 r

   PRODUÇÃO DE Bb EM CIRCUITOS EXTRACORPÓREOS (— -Q Z CO LU O z

   TEMPO (min.)

   E

   22125

   PRODUÇÃO DE C4d EM CIRCUITOS EXTRACORPÓREOS '<

   o

   CM

   CM <3

   UZ

   O

   O

   23/25 ο

   r- V r

   Γ¹! ¹ I ¹ I ¹ I Ή '-Τ'Τ'¹ ί ¹ I ¹ I ¹ Γ'¹ I ¹ I ¹ I ¹ I ?

   TEMPO (min.) ρ ο ρ ο ο ιη * cq ·<

   ο ο ο ο ο ο ο

   Ο Ο) 00 IS <Ο ΙΟ * ο ο cq »<Ν

   I

   24/25

   TEMPO'(min.)

   EXPRESSÃO DE Cd62P SOBRE PLAQUETAS E CIRCUITOS EXTRACORPÓREOS

   25/25

   NlVEL DE MIELOPEROXIDASE EM CIRCUITOS EXTRACORPÓREOS

   TEMPO (min,) o

   o