ES2344645T3 - Moleculas de union al abeta. - Google Patents
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Abstract
Un anticuerpo o una parte de unión antigénica del mismo, que se une específicamente al Aβ humano, en el que dicho anticuerpo comprende: a) Una CDR1 de cadena liviana que comprende la secuencia de aminoácidos del NÚM. ID. SEC.: 8; b) Una CDR2 de cadena liviana que comprende la secuencia de aminoácidos del NÚM. ID. SEC.: 23; c) Una CDR3 de cadena liviana que comprende la secuencia de aminoácidos del NÚM. ID. SEC.: 34; d) Una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del NÚM. ID. SEC.: 38; e) Una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del NÚM. ID. SEC.: 59; y f) Una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del NÚM. ID. SEC.: 71.
Description
Moléculas de unión al A\beta.
La invención se refiere a anticuerpos
humanizados que se unen al péptido beta amiloide (A\beta) y al
tratamiento preventivo y terapéutico de las afecciones asociadas
con el péptido A\beta, tales como la enfermedad de Alzheimer, el
síndrome de Down y la angiopatía cerebral amiloide.
El péptido A\beta en la forma circulante se
compone de 39 - 43 aminoácidos (principalmente de 40 ó 42
aminoácidos) que resultan de la división de una proteína
precursora, proteína precursora amiloide (APP). La conversión de
A\beta de formas solubles a formas insolubles con un alto
contenido de láminas \beta y su deposición como placas neuríticas
y cerebrovasculares en el cerebro parece estar asociada con un
número de afecciones y enfermedades. Entre estas afecciones y
enfermedades están la enfermedad de Alzheimer, tanto preclínica como
clínica, el síndrome de Down y la angiopatía cerebral amiloide
(CAA), tanto preclínica como clínica. La prevención y/o la
inversión de la deposición de A\beta son procedimientos
prometedores para el tratamiento de afecciones asociadas con el
péptido A\beta.
Los agentes terapéuticos que pueden prevenir o
invertir la deposición de A\beta incluyen desde anticuerpos
hasta péptidos A\beta. Los documentos WO 00/72880 y "Nature
Med." de Bard. F. y colaboradores (2000) 6: 916 - 919 describen
una reducción significativa de la placa en el cortex y en el
hipocampo en un modelo de ratón transgénico de la enfermedad de
Alzheimer cuando se trata utilizando fragmentos del terminal N de
péptidos y anticuerpos A\beta que se unen a ellos, pero no cuando
se trata con el conjugado del fragmento A\beta
13-28 para el IgG ovino antimurínico o con un
anticuerpo contra el fragmento 13 - 28, anticuerpo 266. Basándose
en estudios in vitro así como un posterior ensayo ex
vivo (Bard, F. y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. (2003)
100:2023-2038), se ha comprobado que los anticuerpos
dirigidos del terminal N cruzan la barrera sangre - cerebro y para
inducir la fagocitosis de las placas amiloides.
Las patentes de EE.UU. 5.766.846; 5.837.672 y
5.593.846 describen la producción de anticuerpos monoclonales
murinos para el dominio central del péptido A\beta. Entre los
anticuerpo que se sabe que se unen entre los aminoácidos 13 y 28 de
A\beta están los anticuerpos murinos 266, 4G8 y IC2.
Previamente se había hallado, tal como se
describe en el documento WO 01/62801, que la administración del
anticuerpo murino 266 (m266) restaura casi completamente la
cognición que sigue a períodos prolongados de administración
semanal del anticuerpo 266 (memoria objeto) en ratones transgénicos
hemicigotos de 24 meses (APP^{V717F}). También se había observado
que la administración periférica del anticuerpo 266 da como
resultado un rápido eflujo de cantidades relativamente grandes de
película de péptido A\beta del SNC dentro del plasma. El
tratamiento prolongado también dio como resultado un aclaramiento
alterado del A\beta soluble, la prevención de la formación de la
placa y la mejora en la cognición incluso sin tener necesariamente
las características que según la técnica se requieren para que un
anticuerpo sea efectivo, nominalmente, la reducción de la cantidad
de placa amiloide del A\beta, el cruce de la barrera
sangre/cerebro hasta una cantidad significativa, la decoración de
la placa, la activación de los mecanismos celulares o la unión con
una gran afinidad al A\beta agregado.
En conjunción con los resultados puestos de
manifiesto con un modelo muríno que indican una utilidad terapéutica
de un anticuerpo 266, el documento WO 01/62801 también presenta
anticuerpos 266 humanizados. Estos anticuerpos contienen
variaciones en las regiones estructurales que rodean regiones
determinantes complementarias (CDR) del anticuerpo m266, así como
dos sustituciones de aminoácidos en una posición simple en la CDR1
de la cadena liviana del anticuerpo m266. Anticuerpos 266
humanizados adicionales se presentan en el documento WO 03/016466,
en los cuales las sustituciones de aminoácidos se producen en tres
posiciones en la CDR2 a partir de la cadena pesada del anticuerpo
m266.
Los anticuerpos terapéuticamente beneficiosos
que se unen al epítopo reconocido por el m266 deseablemente serán
estables en solución, mostrarán farmacocinéticas favorables y
poseerán afinidad hacia un epítopo formado por los aminoácidos 13 y
28 del A\beta. Así, existe la necesidad de anticuerpos adicionales
que posean características similares o mejores que las del m266 que
sean eficaces en humanos.
La invención suministra un anticuerpo, o una
parte de unión antigénica del mismo, que específicamente se une al
A\beta humano, dicho anticuerpo comprende:
- a)
- una CDR1 de cadena liviana que comprende la secuencia de aminoácidos del Identificador de Secuencia Núm.: 8;
- b)
- una CDR2 de cadena liviana que comprende la secuencia de aminoácidos del Identificador de Secuencia Núm.: 23;
- c)
- una CDR3 de cadena liviana que comprende la secuencia de aminoácidos del Identificador de Secuencia Núm.: 34;
- d)
- una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del Identificador de Secuencia Núm.: 38;
- e)
- una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del Identificador de Secuencia Núm.: 59; y
- f)
- una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del Identificador de Secuencia Núm.: 71
En otro aspecto, la invención se refiere a un
ácido nucleico aislado que comprende un polinucleótido que codifica
un anticuerpo o una parte de unión antigénica del mismo aquí
suministrado y un vector de expresión que comprende ácido nucleico
codificador. Se suministra una célula anfitriona transfectada de
forma estable con este vector de expresión en la que la célula
anfitriona expresa una proteína del anticuerpo o de la parte de
unión antigénica de la invención.
La invención se refiere además al uso del
anticuerpo proporcionado por la invención para la fabricación de un
medicamento para el tratamiento de un sujeto con la enfermedad de
Alzheimer.
Similarmente, se suministra un anticuerpo o una
parte de unión antigénica del mismo que se une específicamente al
A\beta humano de acuerdo con la invención para su utilización en
la terapia, más particularmente para su uso en el tratamiento, de
la enfermedad de Alzheimer.
La presente invención también incluye
procedimientos de tratamiento, prevención o inversión de afecciones
y enfermedades asociadas con el péptido A\beta, que incluyen la
enfermedad de Alzheimer tanto preclínica como clínica, el Síndrome
de Down y la angiopatía cerebral amiloide (CAA), tanto preclínica
como clínica. Estos procedimientos comprenden la administración a
un sujeto de una cantidad efectiva de un anticuerpo como el aquí
descrito y reivindicado.
El término "anticuerpo", tal como aquí se
usa, tiene la intención de referirse a moléculas de inmunoglobulina
que están compuestas por cuatro cadenas de polipéptidos, dos cadenas
pesadas (H) y dos cadenas livianas (L) interconectadas por enlaces
de bisulfuro. Cada cadena pesada está compuesta de una región
variable de cadena pesada (que aquí se abrevia como HCVR o VH) y
una región constante de cadena pesada. La región constante de
cadena pesada se compone de tres dominios CH1, CH2 y CH3. Cada
cadena liviana está compuesta de una región variable de cadena
liviana (que aquí se abrevia como LCVR o VL) y una región constante
de cadena liviana. La región constante de cadena liviana se compone
de un dominio, CL. Las regiones VH y VL pueden estar subdivididas
además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones de
complementariedad determinante (CDR), intercaladas con regiones que
están más conservadas, denominadas regiones de estructura (FR). Cada
VH y VL se compone de tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el
extremo amino hasta el extremo carbóxido en el siguiente orden:
FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR2, CDR2, FR4. Basándose en este
ordenamiento, las CDR de la cadena liviana pueden denominarse como
CDR L1, CDR L2 y CDR L3, mientras que las CDR de la cadena pesada
pueden denominarse como CDR H1, CDR H2 y CDR H3. La asignación de
aminoácidos a cada dominio está de acuerdo con las convenciones
bien conocidas [Kabat "Sequences of Proteins of Immunologial
Interest," National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 y
1991; Chothia y colaboradores, J. Mol. Biol. (1987)
196:901-917; Chothia y colaboradores, Nature (1989)
342:878-883]. Las CDR incluyen residuos definidos
por Kabat y Chothia (subrayados en la secuencia m266). Las cadenas
livianas se clasifican como kapa y lambda. Las cadenas pesadas se
clasifican como gamma, mi, alfa, delta o epsilon, y definen el
isótopo del anticuerpo como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE,
respectivamente. Dentro de las cadenas livianas y pesadas, las
regiones variables y constantes están unidas por una región "J"
de aproximadamente 12 o más aminoácidos, incluyendo también la
cadena pesada, una región "D" de aproximadamente 3 o más
aminoácidos.
Los anticuerpos IgG son la inmunoglobulina más
abundante en el plasma. Los IgG tienen también la vida media más
larga en el plasma de cualquier inmunoglobulina. A diferencia de
otras inmunoglobulinas, la IgG se recircula de forma eficaz después
de unirse a la FcR. Hay cuatro subclases de IgG, G1, G2, G3 y G4,
cada una de las cuales tienen diferentes funciones efectoras. G1,
G2 y G3 pueden unirse a C1q y fijar complemento mientras que G4 no.
Aunque G3 es capaz de unirse a C1q de forma más eficiente que G1, G1
es más efectiva en la lisis celular dirigida por complemento
mediador. G2 fija el complemento de forma poco eficaz. La zona de
unión de C1q en la IgG se sitúa en la región del terminal carboxilo
del dominio CH2.
Todas las subclases de IgG son capaces de unirse
a receptores Fc (CD16, CD32, CD64) siendo G1 y G3 más efectivos que
G2 y G4. La región de unión del receptor Fc de la IgG está formada
por residuos situados en las regiones tanto bisagra como del
terminal carboxilo del dominio CH2.
El término "fragmento" de un anticuerpo,
tal como aquí se utiliza, se refiere a uno o más fragmentos de un
anticuerpo que conservan la capacidad de unirse a un antígeno, por
ejemplo A\beta. Se ha visto que la función de unión antigénica de
un anticuerpo puede ser realizada por un fragmento o por un
anticuerpo de longitud completa. Ejemplos de fragmentos de unión
incluidos dentro del término "fragmento" de un anticuerpo
incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente
constitutivo de los dominios VL, VH, CL y CH 1; (ii) un fragmento
F(ab')_{2}, un fragmento bivalente que comprende dos
fragmentos Fab unidos por un puente de disulfuro en la región
bisagra; (iii) un fragmento Fv constitutivo de los dominios VH y CH
1; (iv) un fragmento Fv constitutivo de los dominios VL y VH de un
brazo simple de un anticuerpo y (v) un fragmento dAb (Ward y
colaboradores), 1989 Nature 341:544-546), que
consta de un dominio VH. Además, aunque los dos dominios del
fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes separados,
pueden unirse, usando procedimientos recombinantes, mediante un
enlazador sintético que hace posible que constituyan una cadena de
proteínas simple en la cual las regiones VL y VH se emparejan para
formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena simple
(scFv)), consulte, por ejemplo Bird y colaboradores (1988) Science
242: 423 - 426: y Huston y colaboradores (1988) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 85: 5879 - 5883). También se tiene la intención de que
dichos anticuerpos de cadena simple están incluidos dentro del
término "fragmento" de un anticuerpo. También se incluyen otras
formas de anticuerpos de cadena simple, tales como los diacuerpos.
Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes específicos en los cuales
los dominios VH y VL se expresan sobre una cadena de polipéptidos
simple, pero usando un enlazador que sea demasiado corto para
permitir el emparejamiento entre los dos dominios sobre la misma
cadena, forzando así a los dominios a emparejarse con dominios
complementarios de otra cadena y creando dos zonas de unión de
antígenos (consulte, por ejemplo, Holliger P y colaboradores (1993)
Proc. Natal. Acad. Sci. USA 90: 6444 - 6448; Poljak, R. J. y
colaboradores (1994) Structure 2: 1121 - 1123.
Además, un anticuerpo o un fragmento del mismo
puede ser parte de una molécula de inmunoadhesión de mayor tamaño,
formada con asociación covalente o no covalente del anticuerpo o de
parte del anticuerpo con una o más proteínas o péptidos. Ejemplos
de tales moléculas de inmunoadhesión incluyen el uso de la región
del núcleo de la streptavidina para hacer una molécula scFv
tetramérica (Kipriyanov, S.M. y colaboradores (1985) Human
Atibodies and Hybridomas 6: 93 - 101) y el uso de un residuo de
cisteína, de un péptido marcador y de una etiqueta de polihistidina
del terminal C para hacer moléculas scfv bivalentes y biotiniladas
(Kipriyanov, S.M. y colaboradores (1994) Mol. Immunol. 31:
1047 - 1058). Pueden preparase fragmentos de anticuerpos (tales
como fragmentos de Fab y F(av')_{2}) a partir de
anticuerpos completos usando técnicas convencionales, tales como la
digestión de la papaína y de la pepsidina, respectivamente, de los
anticuerpos completos. Además pueden obtenerse anticuerpos, partes
de anticuerpos y moléculas de inmunoadhesión usando técnicas de ADN
recombinante estándar (tal como se conocen en la técnica).
El término "anticuerpo humanizado" se
refiere a un anticuerpo que comprende parcial o completamente
secuencias de aminoácidos derivadas de una línea germinal de
anticuerpos humanos o de secuencias redistribuidas y hechas
alterando la secuencia de un anticuerpo que tenga regiones
complementariamente determinantes no humanas (CDR). Las regiones de
estructura de las regiones variables son sustituidas por las
regiones de estructura humanas correspondientes. Las regiones de
estructura humana incluyen regiones de estructura genómica, así como
aquellas que contienen una o más sustituciones de aminoácidos. En
particular, dichas sustituciones incluyen mutaciones en las cuales
un aminoácido en una posición particular de la estructura humana se
sustituye con el aminoácido de la posición correspondiente de la
estructura natural de la CDR no humana. Por ejemplo, un anticuerpo
humanizado que tiene CDR murínicas puede contener una o más
sustituciones que sustituyen un aminoácido de estructura humana
particular con el correspondiente aminoácido de estructura murínica.
Según se analizó aquí, anticuerpo en el contexto de anticuerpo
humanizado no se limita a un anticuerpo de longitud completa y puede
incluir fragmentos y formas de cadena simple.
Los anticuerpos de la presente invención son
anticuerpos monoclonales. Tales anticuerpos, sin embargo, son
monoclonales solamente en el sentido de que pueden derivarse de un
clon de un tipo celular simple. Sin embargo, esto no significa que
se limitan a un origen particular. Dichos anticuerpos pueden
producirse fácilmente en células que comúnmente no producen
anticuerpos, tales como células CHO, NSO o COS. Además, dichos
anticuerpos pueden producirse en otros tipos de células,
especialmente células de mamíferos e incluso de plantas, modificando
genéticamente dichas células para expresar y ensamblar cadenas
livianas y pesadas de polipéptidos que forman el producto del
anticuerpo. Además, dichas cadenas pueden sintetizarse químicamente
pero, ya que serían específicas para un determinante antigénico
dado, podrían aún constituir anticuerpos "monoclonales" dentro
del espíritu en el cual se utiliza el término. Así, según aquí se
utiliza, el término anticuerpo monoclonal tiene la intención de
significar más la especificidad y la pureza de las moléculas del
anticuerpo que el mero mecanismo utilizado para la producción de
dichos anticuerpos.
El término "K_{D}" tal como aquí se
utiliza, tiene la intención de referirse a la constante de
disociación de una interacción anticuerpo - antígeno en particular.
Se calcula mediante la fórmula:
K_{D} =
k_{off}/k_{on}
\hskip1cm(medida en M)
El término "k_{on}" según aquí se utiliza
tiene la intención de referirse a la constante de tasa de
asociación, o a la tasa de reacción específica, de la reacción de
envío o de formación de complejos, medida en unidades:
M^{-1}sec^{-1}. El término "k_{off}" tal como aquí se
utiliza, tiene la intención de referirse a la constante de la tasa
de disociación o a la tasa de reacción específica, para la
disociación de un anticuerpo del complejo anticuerpo/antígeno,
medida en unidades: seg^{-1}.
El término "molécula de ácido nucleico",
tal como aquí se utiliza, tiene la intención de incluir moléculas
de ADN y moléculas de ARN. Una molécula de ácido nucleico puede ser
monocatenario bicatenario, pero preferiblemente es ADN
bicatenario.
El término "vector", según aquí se utiliza,
tiene la intención de referirse a una molécula de ácido nucleico
capaz de transportar otro ácido nucleico con el cual se ha unido. Un
tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de
ADN bicatenario circular dentro del cual pueden ligarse segmentos de
ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector vírico en el que
segmentos de ADN adicionales pueden ligarse dentro del genoma
vírico. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una
célula anfitriona dentro de la cual se han introducido (por
ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de
vectores de replicación y de mamíferos episomáticos). Otros
vectores (por ejemplo, vectores de mamíferos no episomáticos) pueden
integrarse dentro del genoma de una célula anfitriona después de su
introducción dentro de la célula anfitriona y, de esta forma, se
replican junto con el genoma anfitrión. Además, ciertos vectores son
capaces de dirigir la expresión de genes con los cuales están
operativamente unidos. Dichos vectores se denominan aquí "vectores
de expresión recombinante" (o simplemente, "vectores de
expresión"). En general, los vectores de expresión de utilidad
en las técnicas de ADN recombinante tienen a menudo la forma de
plásmidos. En la presente memoria, "plásmido" y "vector"
pueden usarse de forma intercambiable ya que el plásmido es la forma
de vector más comúnmente utilizada. Sin embargo, la invención tiene
la intención de incluir otras formas de vectores de expresión,
tales como vectores virales (por ejemplo, retrovirus, adenovirus y
virus adenoasociados de replicación defectuosa) que presentan
funciones equivalentes.
El término "célula anfitriona recombinante"
(o simplemente "célula anfitriona") tal como aquí se utiliza,
tiene la intención de referirse a una célula dentro de la cual se ha
introducido un vector de expresión recombinante. Debe entenderse
que dichos términos tienen la intención de referirse a las
generaciones subsiguientes debidas bien a mutaciones o bien a
influencias medio ambientales, dicha progenie, de hecho, puede no
ser idéntica a la célula precursora, pero todavía se incluyen
dentro del ámbito del término "célula anfitriona" tal como
aquí se utiliza.
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Las cadenas livianas y pesadas del m266 tienen
las siguientes secuencias:
m266 cadena liviana:
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m266 cadena pesada:
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Las CDR incluyen los residuos definidos por
Rabat y Chothia. Las partes subrayadas representan las secuencias
que se han identificado como las CDR del m266, que se listan en la
tabla 1.
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Los anticuerpos de la presente invención
incluyen anticuerpos humanizados, en los cuales las secuencias CDR
que se corresponden o que se derivan de aquellas del m266 se
injertan de forma eficaz en una estructura humana de anticuerpos.
Un aspecto importante de los anticuerpos humanizantes de otras
especies es reducir la posibilidad de que el anticuerpo provoque
una respuesta inmune cuando se inyecta en un paciente humano como
agente terapéutico. Cuantas más secuencias, de las empleadas en un
anticuerpo humanizado, se parezcan a aquellas de los anticuerpos
humanos, menor será el riesgo de inmunogenicidad. Además, los
anticuerpos humanizados inyectados tienen generalmente una vida
media en la circulación mayor que los anticuerpos no humanos
inyectados. Además, si se desea una función efectora, ya que la
parte efectora es humana, pueden interactuar mejor con las otras
partes del sistema inmune humano.
El principio, una secuencia de una estructura de
cualquier anticuerpo humano puede servir como plantilla para el
injerto de la CDR. Sin embargo, el contexto de la estructura de las
CDR tiene influencia en su unión a un antígeno, de forma que esa
variación entre diferentes estructuras puede tender a algunas
pérdidas significativas de afinidad de unión con el antígeno.
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Las secuencias de aminoácidos de estructura
humana preferidas para la región variable de cadena liviana de los
anticuerpos de la presente invención incluyen las siguientes
secuencias que, para propósitos ilustrativos se representan con las
CDR del m266 (secuencias subrayadas) insertadas:
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Las secuencias de aminoácidos de estructura
humana preferidas para la región variable de cadena pesada de los
anticuerpos de la presente invención incluyen las siguientes
secuencias, que para propósitos ilustrativos se representan con las
CDR del m266 (secuencias subrayadas) insertadas:
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En realizaciones preferidas, los anticuerpos de
la presente invención pueden tener una estructura de cadena liviana
tal como se muestra en el NÚM. ID. SEC.: 3 y una estructura de
cadena pesada tal como se muestra en el NÚM. ID. SEC.: 5. En
realizaciones alternativas, los anticuerpos de la presente invención
tendrán una estructura de cadena liviana tal como se muestra en el
NÚM. ID. SEC.: 4 y una estructura de cadena pesada tal como se
muestra en el NÚM. ID. SEC.: 6.
La administración periférica del m266 a un
modelo murínico transgénico de la enfermedad de Alzheimer (ratón
APP^{V717F}) da como resultado un rápido aumento del A\beta en
el plasma, indicando que el m266 circulante es capaz de alterar el
equilibrio del A\beta entre el SNC y el plasma, dando como
resultado un incremento neto del eflujo de A\beta desde el SNC y
una disminución del eflujo de A\beta al interior del SNC (WO
01/62801; DeMattos y colaboradores. Proc. Natl. Acad. Sci. 98: 8850
- 8855 (2001)). Preferiblemente, después de la administración
periférica, los anticuerpos o los fragmentos de los mismos de la
presente invención son capaces de facilitar el eflujo de A\beta
desde el sistema nervioso central (SNC) hasta el plasma. Los
anticuerpos aquí presentados preferiblemente facilitarán el eflujo
de A\beta desde el SNC al interior del plasma en los humanos de
forma que sea comparable o, más preferiblemente, más eficiente que a
través del que el m266 facilita el eflujo de A\beta desde el SNC
al interior del plasma en ratones.
Los anticuerpos de la presente invención o sus
fragmentos contienen cadenas livianas y cadenas pesadas que tienen
CDR con secuencias de aminoácidos del NÚM. ID. SEC.: 8, para la CDR
L1, el NÚM. ID. SEC.: 23, para la CDR L2, el NÚM. ID. SEC.: 34,
para la CDR L3 el NÚM. ID. SEC.: 38, para la CDR H1, el NÚM. ID.
SEC.: 59, para la CDR H2, y el NÚM. ID. SEC.: 71, para la CDR
H3.
La CDR H2 del anticuerpo m266 se glicosila
debido a su secuencia Asn - Ser - Thr, según se describe en el
documento PCT/US02/21322. Esta secuencia es un ejemplo de una señal
Asn-X-Ser/Thr para la glicosilación
N-enlazada, en la que Asn está en la zona de unión
de las cadenas glicosil N-enlazadas. La eliminación
de la zona de glicosilación de CDR H2 en los anticuerpos derivada
del m266 proporciona de forma ventajosa una producción de
anticuerpos, más fiable y con menos variabilidad entre lotes en la
glicosilación mientras que se conserva o se mejora la afinidad y la
especificidad.
Los anticuerpos aquí presentados contienen seis
CDR, tres de cadena liviana y tres de cadena pesada. Un anticuerpo
dado puede contener 1, 2, 3, 4 ó hasta 5 CDR que son idénticas a las
CDR correspondientes del m266, derivándose las restantes 5, 4, 3, 2
ó 1 CDR del m266. Por ejemplo, un anticuerpo de la presente
invención podría contener CDR L1, L2, L3, H1 y H2 que sean
idénticas a las CDR L1, L2, L3, H1 y H2 del m266, siendo la CDR H3
una CDR derivada de la CDR H3 del m266 (según se representan
mediante los NÚM. ID. SEC.: 70, 71, 72, 73, 74, 75 y 76).
Las CDR aquí descritas pueden utilizarse para
hacer anticuerpos de longitud completa así como fragmentos
funcionales y análogos u otras proteínas que incorporen las CDR en
una conformación estructural activa, de forma que la proteína que
emplea las CDR se una al A\beta.
La tabla 2 indica las secuencias de aminoácidos
(utilizando un código estándar de aminoácidos de una letra) de las
CDR empleadas en los anticuerpos aquí presentados. Las CDR se
presentan en una tabla en el contexto de clones de anticuerpos
individuales (fragmentos Fab). En la tabla 2, las posiciones de las
sustituciones de aminoácidos hechas con respecto a las
correspondientes CDR del m266 listadas en la tabla 1 (es decir, las
posiciones en las cuales las CDR se diferencian en aminoácidos) se
indican en negrita y subrayado. Cada uno de estos clones tienen las
respectivas secuencias de estructura de cadena liviana y pesada de
los NÚM. ID. SEC.: 23 y 5, con la excepción del clon A7, que tiene
las respectivas secuencias de estructura de cadena liviana y pesada
de los NÚM. ID. SEC.: 4 y 6.
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Se ha demostrado que cada uno de los clones
listados en la tabla 2 se une al A\beta, según se determinó
mediante pruebas de evaluación, incluyendo una prueba de elevación
de filtro de captura y una ELISA de captura. Subsecuentemente, se
caracterizaron adicionalmente algunos clones por sus propiedades de
unión según se describe a continuación en los ejemplos.
Los anticuerpos representados por los diferentes
clones listados en la tabla 2 se diferencia entre sí por los
cambios de secuencia en al menos una CDR y hasta un total de 6 CDR.
Las diferencias de CDR entre los clones son indicativas de la
naturaleza intercambiable de las CDR, en las que una CDR L1 puede
sustituirse por otra CDR L1, una CDR L2 sustituirse por otra CDR L2
y así sucesivamente. Consecuentemente, se prevé que las diferentes
combinaciones de CDR presentes en los anticuerpos aquí descritos se
unan al A\beta.
Algunos de los anticuerpos aquí descritos se
obtuvieron a través de la combinación de sustituciones de CDR
halladas en otros anticuerpos, estos anticuerpos incluyen 1F3, 1A1,
1A7, 11F12, 1F2, 1A12, 1A10, 1B3, 1C1, 1S12, 1D10 y 7F7. Por
ejemplo, el anticuerpo 1A1 se obtuvo combinando las mutaciones
halladas en los anticuerpos 2B2 y 1B1. Teóricamente, cada una de
las sustituciones de aminoácidos indicadas en la tabla 2 puede
combinarse para dar como resultado anticuerpos adicionales que
probablemente se unen específicamente al A\beta. Los anticuerpos
aquí descritos comprenden por lo tanto CDR adicionales derivadas a
través de la combinación de las sustituciones de las CDR listadas
en la tabla 2.
Las CDR de los anticuerpos de la presente
invención también pueden comprender sustituciones alternativas
obtenidas mediante sustituciones de aminoácidos conservadoras de
las sustituciones específicas indicadas en la tabla 2. Los
términos "sustitución conservadora" o "sustitución de
aminoácidos conservadora" son bien conocidas en la técnica y se
refieren a la sustitución de uno o más residuos de aminoácidos en
una proteína o un péptido con un residuo de aminoácido que tenga
una propiedad de cadena lateral común. Tal como se conoce en la
técnica, los agrupamientos de aminoácidos basándose en las
propiedades de las cadenas laterales incluyen, aunque no en sentido
limitativo, aminoácidos hidrófobos, hidrófilos neutros, ácidos,
básicos y aromáticos. Por ejemplo, puede obtenerse una alternativa
a la CDR H2 del anticuerpo 1B7 (consulte la tabla 2, clon 1B7)
sustituyendo el residuo de arginina básica R del NÚM. ID. SEC.: 41
con lisina (K).
La afinidad de un anticuerpo dado para EL
A\beta es una de las diferentes propiedades que probablemente
contribuyen a su utilidad para una aplicación particular del
anticuerpo. En una realización, los anticuerpos de la presente
invención tendrán una afinidad para A\beta igual o, más
preferiblemente, mayor que el m266 según se determina mediante
K_{D}. Según se describió anteriormente, K_{D} se mide mediante
la relación de las constantes k_{on} y k_{off}. Por ejemplo,
una k_{on} de 3,1 x 10^{7} (M^{-1}sec^{-1}) y una
k_{off} de 0,9 x 10^{-4}(sec^{-1}) podrían combinarse
para dar una K_{D} de 2,8 x 10^{-12} M. Así, puede mejorarse la
afinidad aumentando k_{on} o disminuyendo k_{off}. Algunos de
los anticuerpos listados en la tabla 2 tienen una afinidad mejorada
para A\beta, basándose en la determinación de K_{D} o k_{on},
según se describe en los ejemplos 1 y 2.
Los anticuerpos de la invención pueden estar
presentes en una forma relativamente pura o aislada así como en un
sobrenadante extraído a partir de células cultivadas en alvéolos o
sobre placas. Los anticuerpos de la invención también pueden estar
presentes en la forma de una composición que comprende el anticuerpo
de la invención y un diluyente o excipiente farmacológicamente
aceptable, en el cual está suspendido el anticuerpo. Los
anticuerpos de la invención pueden estar presentes en dicha
composición en una concentración o en una cantidad suficiente para
tener un valor terapéutico o farmacológico en el tratamiento o la
prevención de enfermedades (por ejemplo, en la prevención de la
enfermedad de Alzheimer). Los anticuerpos también pueden estar
presentes en una composición en una forma más diluida.
En otro aspecto, la presente invención también
se dirige a un ADN recombinante que codifica los anticuerpos y
fragmentos de la invención. La secuencia de ADN recombinante que
codifica un anticuerpo o fragmento de la invención puede ser
fácilmente determinada por cualquier experto en la materia
utilizando el código genético. Un ácido nucleico que tiene la
secuencia determinada puede prepararse y expresarse en cualquiera de
una amplia variedad de sistemas anfitriones utilizando
procedimientos bien conocidos en la técnica.
El ADN aquí presentado codifica anticuerpos que,
cuando se expresan, comprenden entre una y cinco CDR de cadena
liviana y pesada del m266 [NÚM. ID. SEC.: 7, 23, 28, 37, 39, 69] y
una o más de las CDR de cadena liviana y pesada [NÚM. ID. SEC.: 8 -
22, 24 - 27, 29 - 36, 38, 40 - 68, 70 - 76]. Además, el ADN
preferiblemente codifica anticuerpos que, cuando se expresan,
comprenden estas CDR en combinación con una estructura de cadena
liviana de cualquiera de los NÚM. ID. SEC.: 3 ó 5, y una estructura
de cadena pesada de cualquiera de los NÚM. ID. SEC.: 4 ó 6. Más
preferiblemente, las cadenas livianas y pesadas constarán de
cualquiera de los NÚM. ID. SEC.: 3 y 5 o de los NÚM. ID. SEC.: 4 y
6.
El ADN que codifica los anticuerpos de la
presente invención típicamente incluirá además una secuencia de
polinucleótidos de control de expresión operativamente unida a las
secuencias de codificación de los anticuerpos, incluyendo regiones
promotoras y naturalmente asociadas o heterólogas. Preferiblemente,
las secuencias de control de expresión serán sistemas promotores
eucarióticos en vectores capaces de transformar o transfectar
células anfitrionas eucarióticas, pero también pueden usarse
secuencias de control para anfitriones procarióticos. Una vez que
el vector se ha incorporado dentro de la línea celular anfitriona
apropiada, la célula anfitriona se propaga bajo condiciones
adecuadas para expresar las secuencias de nucleótidos y, según se
desee, puede seguirse con la recogida y purificación de las cadenas
livianas, las cadenas pesadas, los dímeros de cadenas
livianas/pesadas o los anticuerpos intactos, los fragmentos de unión
y otras formas de inmunoglobulina.
Las secuencias de ácidos nucleicos de la
presente invención capaces de expresar finalmente los anticuerpos
deseados pueden realizarse a partir de una variedad de
polinucleótidos diferentes (ADN genómico o ADNc, ARN,
oligonucleótidos sintéticos, etc) y de componentes (por ejemplo,
regiones V, J, D y C) usando cualquiera de una variedad de técnicas
bien conocidas. La unión de secuencias genómicas y sintéticas
apropiadas es un procedimiento común para su producción, pero
también pueden utilizarse secuencias de ADNc.
Pueden aislarse secuencias de ADN humano de
región constante, de acuerdo con procedimientos bien conocidos, a
partir de una variedad de células humanas, pero preferiblemente a
partir de células B inmortalizadas. Pueden obtenerse células fuente
adecuadas para las secuencias de polinucleótidos y células
anfitrionas para la expresión y secreción de inmunoglobulina a
partir de un número de fuentes bien conocidas en la técnica.
Según aquí se describe, además de los
anticuerpos aquí descritos específicamente, pueden designarse y
manufacturarse fácilmente otros anticuerpos modificados
"substancialmente homólogos" utilizando diferentes técnicas de
ADN recombinante bien conocidas por aquellos expertos en la
materia. Por ejemplo, las regiones de estructura pueden
diferenciarse de las secuencias nativas al nivel de la estructura
primaria mediante varias sustituciones de aminoácidos, adiciones y
eliminaciones terminales e intermedias. Además, debe usarse una
variedad de diferentes regiones de estructura humana de forma
simple o en combinación como base para las inmunoglobulinas
humanizadas de la presente invención. En general, las
modificaciones de los genes pueden realizarse fácilmente mediante
una variedad de técnicas bien conocidas, tales como la mutagénesis
dirigida al sitio.
Alternativamente, pueden producirse fragmentos
de péptidos que comprenden solamente una parte de la estructura
primaria del anticuerpo, dichos fragmentos poseen una o más
actividades de inmunoglobulina (por ejemplo, actividad de fijación
de complementos). Estos fragmentos de polipéptidos pueden producirse
mediante división proteolítica de anticuerpos intactos mediante
procedimientos bien conocidos en la técnica o mediante la inserción
de codones finalizadores en las posiciones deseadas en vectores
utilizando mutagénesis dirigida al sitio tal como después de CH1
para producir fragmentos Fab o después de la región bisagra para
producir fragmentos f(ab')_{2}. Pueden producirse
anticuerpos de cadena simple uniendo VL y VH con un enlazador de
ADN.
Los anticuerpos (incluyendo fragmentos
inmunológicamente reactivos) se administran a un sujeto en riesgo de
exhibir síntomas o patologías relacionados con el A\beta, tales
como la enfermedad de Alzheimer tanto preclínica como clínica, el
Síndrome de Down o la angiopatía amiloide clínica o preclínica
utilizando técnicas de administración estándar, preferiblemente de
forma periférica (es decir, no mediante su administración dentro del
sistema nervioso central, mediante administración intravenosa,
intraperitoneal, subcutánea, pulmonar, transdérmica, intramuscular,
intranasal, bucal, sublingual o en supositorios). Aunque los
anticuerpos pueden administrarse directamente dentro del sistema
ventricular, del fluido espinal o del parénquima cerebral, y las
técnicas para direccionar estas ubicaciones son bien conocidas en
la técnica, no es necesario utilizar estos procedimientos más
dificultosos. Los anticuerpos de la invención son efectivos cuando
se administran mediante técnicas más simples que cuentan con el
sistema de circulación periférica. Las ventajas de la presente
invención incluyen la habilidad del anticuerpo para ejercer sus
efectos beneficiosos incluso si no se administra directamente al
mismo sistema nervioso central. Además, los anticuerpos humanizados
usados en la invención, cuando se administran periféricamente, no
necesitan provocar una respuesta inmune celular en el cerebro
cuando se unen a un péptido A\beta o cuando circulan libremente
para provocar sus efectos beneficiosos. Asimismo, cuando se
administran periféricamente no necesitan unirse apreciablemente a
un péptido A\beta agregado en el cerebro para provocar sus
efectos beneficiosos. En efecto, se ha demostrado que la cantidad de
anticuerpo que cruza la barrera sangre - cerebro es < 0,1% de
los niveles de plasma.
Las composiciones farmacéuticas para su
administración están diseñadas para ser adecuadas para el modo de
administración seleccionado y se utilizan excipientes
farmacológicamente aceptables tales como neutralizadores,
tensoactivos, conservantes, agentes solubilizantes, agentes
isotónicos, agentes estabilizantes, según sea adecuado. La última
edición de Remington Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.,
Easton PA, proporciona un compendio de las técnicas de formulación
que son generalmente conocidas para los profesionales de la
medicina.
La concentración del anticuerpo humanizado en
formulaciones desde aproximadamente un 0,1% hasta un máximo de un
15 ó un 20% en peso se seleccionarán basándose inicialmente en los
volúmenes, las viscosidades, etc del fluido, de acuerdo con el modo
de administración seleccionado en particular. Así, una composición
farmacéutica para inyección podría constituirse para que contuviese
en 1 mL de solución salina neutralizada de fosfato entre 1 y 100 mg
del anticuerpo humanizado de la presente invención. La formulación
podría filtrarse de forma estéril después de constituir la
formulación o bien hacerse microbiológicamente aceptable. Una
composición típica para infusión intravenosa podría tener un
volumen de hasta 250 mL de fluido, tal como una solución estéril de
Ringer, y 1 - 100 mg por mL o más de concentración del anticuerpo.
Los agentes terapéuticos de la invención pueden congelarse o
liofilizarse para su almacenamiento y reconstituirse en un
excipiente estéril adecuado antes de su utilización. La
liofilización y reconstrucción puede tender a grados variables de
pérdida de actividad de anticuerpo (por ejemplo, con
inmunoglobulinas convencionales, los anticuerpos IgM tienden a
tener una mayor pérdida de actividad que los anticuerpos IgG). Las
dosificaciones pueden ajustarse para lograr la compensación. El pH
de la formulación se seleccionará para equilibrar la actividad
(química o física) del anticuerpo y para mejorar al paciente cuando
se administre. Generalmente, se tolera un pH de entre 4 y 8.
Aunque los anteriores procedimientos parecen ser
los más adecuados para la administración de proteínas tales los
como anticuerpos humanizados, mediante una adaptación adecuada,
pueden emplearse otras técnicas para su administración, tales como
la administración transdérmica y la administración oral, teniendo en
cuenta que se diseñe la formulación adecuada. Además, puede ser
deseable emplear formulaciones de liberación controlada que usen
películas y matrices biodegradables o mini-bombas
osmóticas o sistemas de administración basados en perlas de
dextrán, alginato o colágeno. En resumen, las formulaciones están
disponibles para administrar los anticuerpos de la invención y son
bien conocidas en la técnica y pueden seleccionarse entre gran una
variedad de opciones. Pueden optimizarse niveles típicos de
dosificación utilizando técnicas clínicas estándar y dependerán del
modo de administración y del estado del paciente.
Además de su utilidad terapéutica, los
anticuerpos de la presente invención son útiles en la diagnosis de
la cantidad de carga amiloide del cerebro en pacientes que bien
tengan riesgo o bien estén diagnosticados de la enfermedad de
Alzheimer. En estudios con el modelo de ratón transgénico
APP^{V717F} de la enfermedad de Alzheimer, la administración
periférica de m266 murino dio como resultado un rápido aumento de
A\beta en el plasma (DeMattos y colaboradores, Science 295: 2264
- 2267 (2002)). Se encontró que la magnitud de este incremento está
altamente correlacionada con la carga amiloide en el hipocampo y el
córtex del ratón. La administración periférica de m266 suministra
así un procedimiento de cuantificación de la carga amiloide en
ratones. Este procedimiento de diagnosis de la carga amiloide a
través de la administración periférica de anticuerpos que reconocen
el mismo epítopo A\beta del m266 puede ser útil para la
cuantificación de la carga amiloide del cerebro en pacientes.
Consecuentemente, los anticuerpos de la presente invención pueden
utilizarse para diagnosticar la carga amiloide en pacientes que
bien tengan riesgo o bien hayan desarrollado la enfermedad de
Alzheimer.
Los anticuerpos de la presente invención también
tienen aplicaciones útiles in vitro. Por ejemplo, los
anticuerpos pueden utilizarse en la determinación de la presencia y
los niveles de A\beta mediante pruebas inmunocitoquímicas
ELISA.
Los siguientes ejemplos tienen un sentido
ilustrativo aunque no limitan la invención.
Ejemplo
1
Se determinaron las afinidades para el A\beta
de fragmentos de Fab y/o anticuerpos monoclonales de m266 y los
anticuerpos preferidos de la presente invención mediante mediciones
KinExA® (Sapidyne). KinExA® es un instrumento que permite la
medición de la cinética de la unión de la fase de solución. (Glass.
T. (1995), Biomedical Products, 20: 122 - 123, Ohmura, N. y
colaboradores, (2001), Analytical Chemistry, 73: 3392 - 3399).
\global\parskip0.900000\baselineskip
El antígeno del A\beta usado en estas
mediciones de afinidad se inmovilizó en perlas de Sefarosa.
Específicamente, 0,1 mg de péptido \beta-amilóide
biotinilado 1 - 40 (Biosource) se unieron a 5 mL de Sefarosa Avidina
(Sigma) durante 1 hora a temperatura ambiente. Entonces las perlas
se lavaron tres veces con 10 mL de solución salina neutralizada con
fosfato con un pH 7,4, con un 0,01% de NaN_{3} (PBSA), y se
resuspendieron en 15 mL de PBSA.
Los Fab para estos experimentos fueron
producidos mediante expresión en E. Coli. Brevemente, se
infectaron celdas XL-0 con un fago que albergaba
los genes Fab durante una hora a 37ºC. Entonces se disminuyó la
temperatura hasta los 25ºC y el cultivo se agitó durante 16 horas.
Entonces se extrajo de las celdas la proteína Fab usando un
reactivo Bugbuster (Novagen) y se purificó usando perlas de níquel
(Qiagen).
Los anticuerpos monoclonales usados en estos
experimentos se produjeron colocando ADN que codificaba las regiones
V de los fragmentos Fab dentro de un vector que codificaba las
partes restantes de un anticuerpo IgG1, de forma que los
anticuerpos IgG1 se expresasen a partir del vector. Las proteínas de
los anticuerpos se expresaron transfectando transitoriamente los
vectores IgG1 dentro de células 293 EBNA. Los anticuerpos se
purificaron usando proteína Sefarosa A. Brevemente, los
sobrenadantes del cultivo se cargaron sobre una columna de 1 ml de
proteína Sefarosa A. Entonces se lavó la columna con 20 ml de PBS y
se eluyó usando 0,1 M de glicina con un pH de 2,7 e inmediatamente
se neutralizó usando 1 M de Tris con un pH 9. Los anticuerpos que
contenían las fracciones se dializaron entonces en PBS. Para las
mediciones de K_{D} mediante KinExA®, se prepararon doce
diluciones en series de dos veces de antígeno a una concentración de
2x en PBSA 0,2% BSA y se mezclaron a 1:1 con una muestra de
anticuerpos de 2x en el mismo neutralizador. Las concentraciones
típicas de 1x fueron 10 pM de sitios activos del anticuerpo (0,75
ng/mL) y una concentración superior de antígeno de 100 pM (0,43
ng/mL). Se permitió entonces que las muestras se equilibraran
durante 24 - 72 horas a temperatura ambiente. Entonces se usaron un
instrumento KinExA® (Sapidyne) y un archivo de ejecución K_{D}
estándar para determinar la K_{D} del sistema. Brevemente, Las
celdas de flujo del KinExA® se cargaron con perlas recubiertas de
péptido \beta-amilóide y se lavaron con PBSA. Para
la primera muestra, el anticuerpo libre en solución fue capturado
por las perlas lavadas con PBSA y se detectó usando Cy5
anti-humano caprino a 1:250 (Jackson
Inmunochemicals) en PBSA. Entonces, la celda de flujo se enjuagó,
se recargó con perlas y se analizó la muestra siguiente. El proceso
se repitió hasta analizar la totalidad de las 12 muestras. Los datos
completos se analizaron usando el software de KinExA® introduciendo
una concentración de antígenos de 1x en cada muestra para calcular
la K_{D} para la reacción de anticuerpo - antígeno.
Para las mediciones de k_{on} y k_{off} de
KinExA®, se preparó antígeno y anticuerpo según se describió
anteriormente. Las muestras de antígeno y anticuerpo a una
concentración activa de 2x se prepararon en PBSA con un 0,2% de
BSA. Las muestras se mezclaron a 1:1 y se inició la ejecución del
experimento. Las concentraciones típicas 1x fueron 1 nM de
concentración de sitios activos del anticuerpo (75 ng/mL) y 2 nM de
antígeno (8,6 ng/mL). Se utilizó un instrumento KinExA® (Sapidyne)
y un archivo de ejecución kineticsdirect para seguir la
reacción. El tiempo de cada medición se determinó usando las
instrucciones del fabricante. Se capturó el anticuerpo libre que
quedaba en la reacción usando perlas recubiertas con
\beta-amiloide empaquetadas dentro de la celda de
flujo lavada con PBSA y se detectó en cada intervalo usando Cy5
anti-humano caprino (Jackson) a 1:250 en PBSA.
Entonces se enjuagó la celda de flujo y se recargó con perlas para
la medición siguiente, el proceso continuó hasta que se obtuvo una
curva de degradación completa. Los datos se analizaron usando el
software Inject de KinExA®. Se utilizaron concentraciones activas de
1x de anticuerpo y antígeno y la K_{D} previamente medida para
calcular las k_{on} y k_{off} de la reacción.
En la tabla 3 se muestran los parámetros
cinéticos de los fragmentos Fab, según se determinaron mediante el
KinExA® después del equilibrado de los fragmentos Fab con antígeno.
Los parámetros cinéticos de los anticuerpos monoclonales que se
equilibraron con antígeno antes de la medición con KinExA® se
presentan en la tabla 4. En la tabla 5 se proporcionan las
determinaciones de la K_{D} de otro conjunto de experimentos, en
los cuales los anticuerpos monoclonales se equilibraron con
antígeno bien durante entre 16 y 24 horas o bien durante 48
horas.
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Ejemplo
2
Las cinéticas de asociación del m266 y de los
anticuerpos monoclonales preferidos de la presente invención con el
A\beta fueron determinadas usando mediciones bien del BIAcore® o
bien del KinExA® (Sapidyne).
BIAcore® es un sistema de biosensores
automáticos que mide las interacciones moleculares (Karlsson y
colaboradores, (1991) J. Immunol. Methods, 145: 229 - 240). Los
análisis de BIAcore® aquí descritos se llevaron a cabo a 25ºC. En
estos experimentos, el anticuerpo fue inmovilizado a baja densidad
sobre un chip CM5 ó B1 de BIAcore®. Para el anticuerpo m266, se
utilizó Fc anti-murino caprino (Jackson
Immunoresearch) inmovilizado sobre CM5 en la celda de flujo 2 para
medir las constantes de unión. Anti-murino caprino
se utilizo como anticuerpo de control en la celda de flujo 1. Para
los anticuerpos humanizados, se inmovilizó proteína A o proteína A/G
a través del acoplamiento amino con las celdas de flujo 1 y 2 de un
chip sensor B1 ó CM5.
Entonces se capturó el anticuerpo en los niveles
deseados (habitualmente una inyección de anticuerpo de 10 - 60
segundos) solamente en la celda de flujo 2 y se permitió su
estabilización durante 5 minutos. Para estos experimentos, se
fundió una parte alícuota nueva de 1 - 40 del A\beta y luego se
diluyó a 1:10 en solución neutralizadora de corrida
HBS-EP. La dilución de 1:10 se utilizo para
constituir una solución de A\beta de 200 nM que se diluyó en
serie (diluciones de 1:2) hasta una concentración menor de 6,25 nM.
Cada concentración fue inyectada sobre la superficie durante 5
minutos con un caudal de 50 \mul/min (hasta un total de 250
\mul). El A\beta y el anticuerpo se eluyeron a partir de ambas
celdas de flujo con una inyección de 40 seg de glicina con un pH
1,5. Se dejó estabilizar la señal durante 2 minutos antes del ciclo
siguiente. Los datos de la celda de flujo 1 se substrajeron de los
de la celda de flujo 2 para tener en cuenta cualquier
desplazamiento accidental debido a las diferencias o la unión no
específica con el chip sensor o la proteína A. Las diferentes
concentraciones se inyectaron aleatoriamente y cada concentración se
analizó por duplicado. Se usaron solamente dos análisis de control
del neutralizador para controlar cualquier disociación del
anticuerpo de la superficie de captura. Los datos se analizaron
usando el software de Biaevaluation®. Se utilizó un modelo 1:1 con
transferencia de masa y un Rmax local como ajuste óptimo para los
datos.
Las constantes (k_{on}) de velocidad de
asociación se determinaron mediante BIAcore® para las preparación
separadas de anticuerpos. El resultado de estas determinaciones se
resume en la tabla 6.
Las constantes (k_{on}) de velocidad de
asociación con A\beta del m266 y de los anticuerpos de la presente
invención se determinaron mediante KinExA®, usando los
procedimientos anteriormente descritos en el ejemplo 1. En las
tablas 7 y 8 se suministran los resultados de dos determinaciones
separadas de k_{on} efectuadas mediante KinExA® en las que se
usaron preparaciones separadas de anticuerpos. Además, se usaron
preparaciones separadas de anticuerpos y antígeno A\beta para las
determinaciones suministradas en la tabla 8.
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\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizaron una concentraciones de A\beta
humano (1 - 40) entre 200 nM y 1,6 nM en dilución en series de dos
veces para obtener la constante de velocidad. La mitad superior de
la tabla 6 representa las determinaciones hechas con un primer
conjunto de preparaciones de anticuerpos, mientras que la mitad
inferior representa las determinaciones hechas con un segundo
conjunto de preparaciones de anticuerpos.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Elly Lilly and company
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Moléculas de unión Abeta
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> X-16068
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/446380
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
10-02-2003
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 76
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 112
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus sp.
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<223> CDR sustituida
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<211> 17
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<220>
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<223> CDR sustituida
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<211> 3
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<212> PRT
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<212> PRT
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<212> PRT
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<210> 76
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<212> PRT
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<223> CDR sustituida
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<400> 76
\hskip1cm
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<110> Elly Lilly and company
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<130> X-16068
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<150> 60/446380
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<151>
10-02-2003
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<160> 76
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<170> PatentIn versión 3.2
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<210> 1
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<211> 112
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<212> PRT
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<213> Mus sp.
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<211> 112
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<212> PRT
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<213> Mus sp.
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<210> 3
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<211> 112
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> cadena liviana humanizada
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<210> 4
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<211> 112
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> cadena pesada humanizada
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<210> 5
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<211> 112
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cadena liviana humanizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 112
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cadena pesada humanizada
\newpage
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<400> 6
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<210> 7
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<211> 16
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<212> PRT
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<213> Mus sp.
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm
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<210> 8
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<211> 16
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
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<211> 16
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm
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<210> 10
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<211> 16
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
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<210> 11
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<211> 16
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
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<400> 11
\hskip1cm
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<210> 12
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<211> 16
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip1cm
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<210> 13
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<211> 16
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
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<400> 13
\hskip1cm
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<211> 16
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
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<400> 14
\hskip1cm
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<210> 15
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<211> 16
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\hskip1cm
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<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
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<211> 16
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\hskip1cm
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<210> 18
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<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
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<211> 16
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
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<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus sp.
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus sp.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR sustituida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 76
\hskip1cm
Claims (17)
1. Un anticuerpo o una parte de unión antigénica
del mismo, que se une específicamente al A\beta humano, en el que
dicho anticuerpo comprende:
- a)
- Una CDR1 de cadena liviana que comprende la secuencia de aminoácidos del NÚM. ID. SEC.: 8;
- b)
- Una CDR2 de cadena liviana que comprende la secuencia de aminoácidos del NÚM. ID. SEC.: 23;
- c)
- Una CDR3 de cadena liviana que comprende la secuencia de aminoácidos del NÚM. ID. SEC.: 34;
- d)
- Una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del NÚM. ID. SEC.: 38;
- e)
- Una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del NÚM. ID. SEC.: 59; y
- f)
- Una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del NÚM. ID. SEC.: 71.
2. El anticuerpo o una parte de unión antigénica
el mismo de la reivindicación 1, que es un anticuerpo
humanizado.
3. El anticuerpo de la reivindicación 2, que
comprende una estructura de cadena liviana seleccionada entre el
grupo que consta de los NÚM. ID. SEC.: 3 y 4 y una estructura de
cadena pesada seleccionada entre el grupo que consta de los NÚM.
ID. SEC.: 5 y 6.
4. El anticuerpo de la reivindicación 3 que
comprende una estructura de cadena liviana tal como la mostrada en
el NÚM. ID. SEC.: 4 y una estructura de cadena pesada tal como la
mostrada en el NÚM. ID. SEC.: 5.
5. El anticuerpo de la reivindicación 3, que
comprende una estructura de cadena liviana tal como la mostrada en
el NÚM. ID. SEC.: 4 y una estructura de cadena pesada tal como la
mostrada en el NÚM. ID. SEC.: 6.
6. Una parte de unión a un antígeno de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que es un fragmento Fab o
F(ab')_{2}.
7. Una parte de unión a un antígeno de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que es un fragmento
Fab.
8. Una parte de unión a un antígeno de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que es un fragmento
F(ab')_{2}.
9. El anticuerpo de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho anticuerpo o fragmento es un
isotipo IgG.
10. El anticuerpo de la reivindicación 9, en el
que el isotipo se selecciona entre el grupo que consta de regiones
constantes de la cadena pesada de IgG1 y IgG4.
11. Un ácido nucleico aislado, que comprende un
polinucleótido que comprende un anticuerpo o una parte de unión a
un antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
10.
12. Un vector de expresión que comprende un
ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 11.
13. Una célula anfitriona establemente
transfectada con el vector de expresión de la reivindicación 12, en
la que la célula anfitriona expresa una proteína de una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 10.
14. Una composición farmacéutica que comprende
el anticuerpo o una parte de unión a un antígeno del mismo de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a10.
15. El uso del anticuerpo de una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 10 para la manufactura de un medicamento
para tratar a un sujeto con la enfermedad de Alzheimer.
16. Un anticuerpo o una parte de unión a un
antígeno del mismo, que se une específicamente al A\beta humano
de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para su
uso en terapia.
17. Un anticuerpo o una parte de unión a un
antígeno del mismo, que se une específicamente al A\beta humano
de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para su
uso en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.
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|---|---|---|---|
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