JPH09511492A - アミロイドーシスの前進性グリコシル化終末産物仲介モジュレーション用組成物及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、一般的には、アミロイド原性タンパク質の非酵素的グリコシル化及びその結果として生じる前進性グリコシル化終末産物（ＡＧＥ）の形成に関する。本発明は、更に、アミロイド疾患と関連のあるアミロイドーシス、詳細には神経変性疾患及びII型糖尿病、更に詳細にはアルツハイマー病を予防及び治療する組成物及び方法に関する。個々の実施例においては、アミロイド原性ペプチド、βＡＰの凝集はβＡＰのグリコシル化反応によって高められ、本明細書で定義されるＡＧＥ−βＡＰを形成する。従って、本発明は、広範囲には、ＡＧＥ−アミロイドポリペプチドの形成及び存在を制御することによりアミロイドポリペプチドの生体内凝集及び付随したアミロイドーシスをモジュレートする方法に関する。対応する診断用途は、ＡＧＥ、特にＡＧＥ−アミロイドの存在及び量の測定によるアミロイドーシスの過程及び程度の測定を含んでいる。本発明のＡＧＥ−アミロイドポリペプチドを用いてＡＧＥ−アミロイドの存在を特徴とする病態を同定することができる分析が含まれる。更に、かかる分析は、治療法を監視するために、もって、ＡＧＥ−アミロイドの存在を特徴とする所定の病態に対して投薬用法を調整するために用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】 アミロイドーシスの前進性グリコシル化終末産物仲介 モジュレーション用組成物及び方法 関連出願 本出願は、本出願が35U.S.C.I§§120及び365に従って出願日の恩典を主張す る1994年２月３日出願の同時係属米国出願第08/191,579号の一部継続出願である 1994年９月23日出願の同時継続米国出願第08/311,768号の一部継続出願であり、 これらを参考として全て本明細書に詳細に引用する。 発明の分野 本発明は、一般的には、アミロイドタンパク質の非酵素グリコシル化及びたい ていその結果として生じる前進性グリコシル化終末産物（ＡＧＥ）の形成に関す る。ＡＧＥアミロイドの形成は、病状又は合併症を引き起こすことがある。本発 明は、特に、神経変性疾患、特にアルツハイマー病と関連のあるアミロイドーシ ス及びII型（成人発症型）糖尿病と関連のあるアミロイドーシスの予防及び治療 用組成物及び方法に関する。 発明の背景 アミロイドーシス及びβ−アミロイドペプチド アミロイドーシスは、一般的には、アミロイドポリペプチド又はアミロイドタ ンパク質と呼ばれる不溶性ポリペプチドの沈着を伴う生理的症状を意味する。被 検者全体の種々の組織に見られる広範囲のアミロイドタンパク質及び種々のアミ トイドーシスと関連のある多数の病態がある。例えば、多発性骨髄腫は、免疫グ ロブリンタンパク質によりアミロイドーシスを引き起こすことができる。真性家 族性地中海熱も、全身性アミロイドーシスを伴う。おそらく、アミロイドーシス と関連のある最もよく知られた疾患は、アルツハイマー病であろう。 アルツハイマー病（ＡＤ）は、８０歳以上の３０％を超えるヒトが罹患し、そ れだけで先進国の最も重要な健康問題の１つを表している(Evansら，1989，JAMA 262:2551-56; Katzman & Saitoh，1991，FASEB J．280:278-286)。この進行性痴 呆の病因と発病ははっきり理解されていないが、症候性疾患は脳及び脳血管系に おけるアミロイドプラーク、脳血管性アミロイド及び神経原線維タングルの沈着 物と関連がある。ＡＤ患者の脳におけるプラークの数は、典型的には、年齢の釣 り合った健康な対照より５〜１０倍多い。プラークのレベルの増大は、プラーク の成分の合成速度の増大、分解速度の減少又はその２つの組合わせに起因するも のである。 プラークの主要なタンパク質成分は、４２アミノ酸（4.2ｋＤａ）β−アミロ イドペプチド（βＡＰ）であり、大きなアミロイドペプチド前駆体（ＡＰＰ）タ ンパク質ファミリーに由来する(Glenner & Wong，1984，Biochem．Biophys．Res ．Commun．120:885-890; Glenner & Wong，1984，Biochem．Biophys．Res．Comm un．122:1131-35; Goldgaberら，1987，Science 235:8778-8780; Kangら，1987 ，Nature 325:733-736; Robakisら，1987，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:419 0-4194; Tanziら，1987，Science 235:880-884)。アミロイドーシスのプロセス ははっきり理解されていないが、少なくともβＡＰを必要とする。最近の証拠は 、βＡＰが脳の脳脊髄液（ＣＳＦ）のように細胞外間隙及び多くの細胞型の順化 培養液に見られることを示している。増加量のアミロイド沈着物がＡＤ脳内に存 在するので、１つの単純な仮説はβＡＰ産生の増加がアミロイドーシスの増加を もたらすことである。βＡＰのＡＰＰ前駆体をコードするメッセンジャーＲＮＡ はＡＤ脳内で約２倍増加し、翻訳速度が２倍増加する可能性を示しており、これ はアミロイドプラーク形成の増加を説明するものである（例えば、Jacobsenら， 1991，Neurobiol．Aging 12:585-592及びその中に引用された文献; Palmertら， 1989，Prog．Clin．Biol．Res．317:971-984; Tanakaら，1990，Rinsho Byori 3 8:489-493; Tanakaら，1989，Biochem．Biophys．Res．Commun．165:1406-1414) 。プラークレベルの増加と相関するβＡＰ産生効率の上昇の例は、βＡＰのアミ ノ末端近傍のＡＰＰにリシン−メチオニン（ＫＭ）のアスパラギン−ロイシン（ ＮＬ）への二重突然変異を含むスウェーデン病として既知のアルツハイマー病の めったに遺伝的連鎖性のない家族性形態に見られる(Caiら，1992，Science 259: 514-516; Citronら，1992，Nature 360:672-674;Mullanら，1992，Nature Genet .1:345-347)。この突然変異により、培養細胞では細胞外βＡＰの遊離が高 められる。しかしながら、この所見はスウェーデン病（及びダウン症候群）にお けるアミロイドーシスを部分的に説明することができるが、ＡＤと健康な患者の ＣＳＦにおけるβＡＰペプチドレベルは同じである（Oosawaら，1993，Soc．Neu rosci．Abst．19:1038; Shojiら，1992，Science258:126-129)。即ち、健康な被 検者はＡＤ患者と同じ量のβＡＰを有するように見えるが、ＡＤ相対者に見られ た高いアミロイドプラーク数及び量を蓄積しない。 後翻訳は、アミロイドーシスの原因になる事象である。翻訳速度が増大し過ぎ て、前駆体からのβＡＰ産生効率の増大、原線維構造への凝集及びタンパク質分 解に対する抵抗のような生理的事象が分解過程の平衡を失うことになり、プラー ク形成を引き起こす。 アミロイド成分の凝集は、アミロイドーシスの発生に重要な段階である。βＡ Ｐの原線維凝集体は形成されると、非常に安定であり、簡単に分解しない。アミ ロイドプラークは、沸騰ＳＤＳにおける可溶化に対する抵抗及び種々のプロテア ーゼによる消化で精製される。更に、８０％ギ酸又は６Mグアニジンチオシアネ ートで処理すると、最終的にプラーク物質の一部が可溶化される。可溶化された タンパク質は、主として４２アミノ酸βＡＰである。これらの過酷な変性処理後 でさえ、免疫反応性βＡＰを含む二量体、四量体及び高分子量凝集体が見られる 。この可溶性又は単量体成分への可溶化に対する抵抗は、多くのタンパク質修飾 を示している。 更に、実験により、可溶性形態の全長βＡＰ１〜４２で処理した主要なニュー ロン培養液が生存が保たれていることが示された。即ち、可溶性βＡＰ１〜４２ は、毒性を示していない。対照的に、βＡＰ１〜４２の不溶性凝集体で処理した 培養液は、毒性応答を示している(Pikeら，1991，Eur．J．Pharm．207:367-368; Pikeら，1993，J．Neurosci．13:1676-87)。この実験は、βＡＰの毒性が凝集 状態に関係していることを示している。即ち、可溶性βＡＰから原線維及び／又 は不溶性凝集体を形成する機序の理解は、毒性を防止すること及び神経変性疾患 をきたすことに重要である。 ＡＤのたいていの場合の可溶性βＡＰの増大のないとき、アミロイドがどのよ うに種々の速度で非常に大きく蓄積するかの問題が残っている。βＡＰの最初の ２８、４０又は４２アミノ酸に対応する合成βＡＰ（即ち、各々βＡＰ１〜２８ 、βＡＰ１〜４０及びβＡＰ１〜４２）は、試験管内インキュベーションにおい て濃度依存性凝集速度論を示す。原線維は試験管内で形成し、これらは電子顕微 鏡及び光学顕微鏡を用いる形態学的レベル並びにコンゴ赤及びチオフラビン染色 を用いる分光レベルで脳β−アミロイド原線維と似ているように見える。 試験管内可溶性βＡＰのμM濃度で観察された凝集の速い速度論は、生体内原 線維形成の機序への洞察に対してそれほど関連するものではない。低濃度βＡＰ 、例えば、約５nMの生理的範囲では、測定できる凝集体が試験管内で形成される 前にかなりの遅滞期間がある。この所見は、凝集の速度制限段階が“核”又は“ 種子”を形成することができ、更にβＡＰが急速に蓄積することができることを 示している。 アミリン、膵島細胞及びII型糖尿病 ２種類の糖尿病がある：膵β細胞の破壊及びこれらの細胞によって生産される インスリン及び他のホルモンの損失と関連があり、インスリンで治療されるＩ型 糖尿病（若年発症型糖尿病）及びインスリン抵抗性と関連があるII型糖尿病（成 人発症型糖尿病）。II型糖尿病は、高血圧、肥満症及びインスリン抵抗性を特徴 とするIIＡ型及び痩せた個体、肥満のインスリン感受性個体及び若年個体を含む IIＢ型に更に分けることができる。おそらく、Ｉ型とII型糖尿病間の最も顕著な 相違は、II型糖尿病に自己免疫疾患のないことであり、さもなければこの症候群 は同様に種々の症候と原因を特徴としている。 II型糖尿病の１つの共通の特徴は、膵臓にアミロイドプラークが存在すること である。そのプラークは、剖検でII型糖尿病の９０％に見られる。アルツハイマ ー病についてのように、罹患臓器におけるアミロイドプラークの存在は、剖検ま で決定的に証明することができない（Edgington，1994，Bio/Technology 12:591 参照）。２つのグループが別々に島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）(Weste rmarkら，1987，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:3881-85; Westermarkら，1987 ，Am．J．Physiol．127:414-417)又はアミリン（Cooperら，1987，Proc，Natl． Acad．Sci．USA 84:8628-32: Cooperら，1988，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85 :7763-66）と呼ばれる３７アミノ酸ポリペプチドとして膵アミロイドプラ ークの主成分を同定し、両グループによって同定されたペプチドは同じ意味であ ると考えられる(Amiel，1993，Lancet 341:1249-50)。その可溶性形態では、ア ミリンはインスリンを拮抗し、血流のグルコースレベルの調節に役割があると考 えられる（前記Edgington参照）。 しかしながら、高濃度のアミリンはβＡＰのようにβプリーツシート構造に凝 集し、毒性であると考えられる原線維を形成する(Lorenzoら，1994，Nature 368 :756-760)。特に、この論文は、ヒトアミリン原線維がラット及びヒトの生体膵 臓のインスリン産生β細胞に毒性であることを報告している。アミリン原線維は 島細胞アポトーシスを誘導すると考えられ、II型糖尿病においては細胞機能障害 及び死に至る（前記Lorenzoら）。 前進性グリコシル化終末産物（ＡＧＥ） グルコースとタンパク質間の反応は、以前から既知であった。その初期の発現 は、食品の調理中の褐色色素の外観であった。1912年に、Maillardは、グルコー ス又は他の還元糖がアミノ酸と反応して付加物を形成し、これが一連の脱水と転 位を行って安定な褐色色素を形成することを見いだした(Maillard，1912，C.R． Acad．Sci.154:66-68)。 Maillardによる最初の発見に続く時代には、食品化学者により、仮説の反応が 詳細に研究され、貯蔵及び加熱処理した食品がグルコースとポリペプチド鎖間の 反応の結果として非酵素的褐色化すること及びそれによってタンパク質が架橋さ れ生物利用可能性を減じることが求められた。この点で、タンパク質グリコシル 化の結果として褐色の発生の原因である色素が特徴的なスペクトルと蛍光特性を 有することが求められた。しかしながら、色素の化学的構造は詳細には解明され なかった。 上記で述べた還元糖と食品タンパク質間の反応は、最近、生体内で類似するこ とが見いだされた。即ち、アマドリ産物として既知の安定なアミノ,１−デオキ シケトシル付加物を形成するグルコースとタンパク質の遊離アミノ基との間の非 酵素的反応は、ヘモグロビンで起こることが示されており、グルコースとの反応 によりヘモグロビンのβ鎖のアミノ末端の転位がヘモグロビンＡ_1cとして既知の 付加物を形成する。この反応は、また、水晶体クリスタリン、コラーゲン及び神 経 タンパク質のような他の種々の体内タンパク質と起こることも見いだされた(Bun nら，1975，Biochem．Biophys．Res．Commun．67:103-109; Koenigら，1975，J ．Biol．Chem．252:2992-2997; Monnier & Cerami，Maillard Reaction in Food and Nutrition，ed．Waller，G.A.,American Chemical Society 1983，pp．431 -448;及びMonnier & Cerami，1982，Clinics in Endocrinology and Metabolism 11:431-452)。 更に、後期段階のメイラード産物と同様のスペクトル及び蛍光特性を有する褐 色色素もまた老齢個体からの水晶体及びコラーゲンのような長命のタンパク質に 付随して生体内に見られた。年齢と関係した直線的な増加は、２０〜９０歳の年 齢の間のヒト硬膜コラーゲンに見いだされた(Monnier & Cerami，1981，Science 211:491-493; Monnier & Cerami，1983，Biochem Biophys．Acta 760:97-103; 及びMonnierら，1984,“糖尿病におけるヒトコラーゲンの年齢と関係した褐色化 の促進”，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 81:583-587)。おもしろいことに、コラ ーゲンの老化は比較的高濃度のグルコースと溶液中でインキュベートすることに より誘導された架橋により非常に短時間で試験管内でまねることができる。他の タンパク質の捕捉及びコラーゲンによる付加物の形成も言及されており、架橋に より起こることが理論づけられ、例えば、腎臓の基礎膜内のアルブミン及び抗体 の蓄積の所見の理由になると考えられる(Brownleeら，1983，J．Exp．Med．158: 1739-1744;及びKohnら，1984，Diabetes 33:57-59)。 グルコースと他の還元糖は、濃度依存方式でタンパク質のアミノ基に非酵素的 に結合する。時間が経つにつれて、これらの最初のアマドリ付加物は他のタンパ ク質と更に転位、脱水及び架橋することができ、前進性グリコシル化終末産物（ ＡＧＥ）と呼ばれる構造の複合体ファミリーとして蓄積する。前進性グリコシル 化終末産物の役割と臨床上の意味の解明に対して実質的に進歩したので、これま では老化の過程又は糖尿病のような疾患の病理学的作用によった症状の多くがい までは生体内でのＡＧＥの形成に少なくとも部分的に起因することが認められて いる。 上で述べたように、前進性グリコシル化終末産物は、特に比較的高い糖濃度の 条件下で半減期の長い分子上に蓄積する傾向がある。即ち、ＡＧＥ蓄積は、タン パク質半減期、糖濃度又はその両者を表すことができる。これらの因子は、重要 な結果を有する。多数の研究により、ＡＧＥが老化及び慢性疾患中に生じる構造 上及び機能上の変化に重要な役割を果たすことが示された。更に、前進性グリコ シル化終末産物は、正常組織より糖尿病及び他の疾患組織において非常に大きく 蓄積することがわかる。 ＡＧＥの“ファミリー”としては、単離することができかつ化学構造を特徴と する化合物が含まれ、非常に安定なものもあれば不安定又は反応性のものもある 。還元糖とタンパク質の反応性基間の反応は、前進性グリコシル化プロセスを開 始することができる。このプロセスは、典型的には還元糖と反応性基間の可逆反 応で開始してシッフ塩基を形成し、進行して共有結合したアマドリ転位産物を形 成する。アマドリ産物が形成されると、更に転位してＡＧＥ修飾化合物を生成す る。 米国特許第4,665,192号では、蛍光発色団が単離及び同定され、ウシ血清アル ブミン及びポリ−Ｌ−リシンのようなある種の褐色化ポリペプチドに存在するこ とが判明し、２−（２−フロイル）−４（５）−２（フラニル）−１Ｈ−イミダ ゾールの構造に帰属された。更に最近、他の前進性グリコシル化産物、例えば、 Farmarらの1992年８月18日発行の米国特許第5,140,048号に記載されているよう に；ピラリン（Hayaseら，1989,“タンパク質の老化：生体内メイラード反応中 に形成されたグルコース誘導ピロールの免疫学的検出”，J．Biol．Chem．263:3 758-3764); 及びペントシジン(Sell & Monnier，1989,“ヒト細胞外マトリック スからのセネッセンス架橋の構造解明”，J．Biol．Chem．264:21597-602)が同 定された。 疾患におけるＡＧＥの役割の知識に基づいて、本発明者らは、βＡＰの凝集を 高める因子を同定すること、更に重要なことにその因子の作用を阻害し、例えば 、アルツハイマー病及び他のアミロイド疾患におけるアミロイドーシスを予防す る物質及び方法を同定することを探究した。更に詳細には、本発明は、前進性グ リコシル化終末産物の形成とアミロイドーシス間の関係を発見することを探究す るものである。本発明の以前には、アミロイドーシスと前進性グリコシル化終末 産物形成間の関係は評価されなかった。 本明細書中の参考文献の引用は、それが本発明に対する従来技術であることを 認めるものとして解釈されるべきでない。 発明の要約 本発明は、広範囲には、アミロイドーシスポリペプチドのＡＧＥ修飾の種類及 びアミロイドーシスと関連のある疾患又は障害の病状及び治療に対するその修飾 の結果についての発見に関する。 特に、本発明者らは、ＡＧＥ−アミロイドポリペプチド、特にＡＧＥ−βアミ ロイドペプチド（βＡＰ）がアミロイドポリペプチドの凝集をそのアミロイドポ リペプチドがＡＧＥ修飾されていてもされていなくても更に促進することを発見 した。 本発明者らは、更に、この発見をアミリン（ＡＧＥ修飾されていてもされてい なくても）の凝集を促進し膵臓組織のアミロイドーシス及び膵島細胞の死を引き 起こすＡＧＥアミリンポリペプチドの能力の増大に関係させた。 即ち、本発明は、ＡＧＥ−アミロイドポリペプチドの形成を制御することによ り哺乳動物においてＡＧＥ−アミロイドポリペプチド仲介アミロイドーシスをモ ジュレートする方法に関する。本発明の個々の態様においては、βＡＰ及びアミ リンの凝集はβＡＰ又はアミリンのグリコシル化反応によって高められて本明細 書で定義されるＡＧＥ−βＡＰ又はＡＧＥ−アミリンを形成することが求められ た。従って、本発明は、特に、ＡＧＥ−βＡＰの形成及び存在を制御することに よりβＡＰの生体内凝集及び付随した神経変性アミロイドーシスをモジュレート する方法に関する。本発明は、特に、ＡＧＥ−アミリンの形成及び存在を制御す ることによりアミリンの生体内凝集及び付随した膵島細胞アミロイドーシスをモ ジュレートする方法に関する。 また、アミロイド原性疾患に罹患している個体がその疾患に特有のアミロイド プラークを形成するアミロイドポリペプチドと関連のあるＡＧＥが多いことを発 見した。ＡＧＥ−アミロイドポリペプチドの存在及びレベルは、アミロイドポリ ペプチドの全体の体内の負担及びそれらの加齢を反映するものである。特に、ア ルツハイマー病に罹った患者は、同じ年齢の正常な個体よりβＡＰと関連のある ＡＧＥが多く、II型糖尿病に罹った患者は、正常な個体よりアミリンと関係のあ るＡＧＥが多いものである。ＡＤ及び正常な個体の絶対レベルがほぼ同じである ので、ＡＧＥ−βＡＰの存在はＡＤを表すか又は予想することができる。 対応する診断用途は、本明細書で定義されるＡＧＥ−アミロイドポリペプチド 及び特に本明細書で定義されるＡＧＥ−βＡＰ及びＡＧＥ−アミリンの存在及び 量を測定することによりアミロイドーシスの過程及び程度を測定することを含ん でいる。本発明のＡＧＥ−アミロイドポリペプチドを用いてＡＧＥ−アミロイド ポリペプチドの存在を特徴とする病態を同定する分析が含まれる。更に、その分 析は、治療を監視し、ＡＧＥ−アミロイドポリペプチドの存在を特徴とする所定 の病態に対する投薬用法を調整するために用いられる。個々の実施態様において は、本発明の診断分析は、ＡＧＥ−βＡＰ又はＡＧＥ−アミリンの存在又はレベ ルを監視するために用いられる。 上で述べたように、ＡＧＥ−アミロイドポリペプチドは、アミロイドポリペプ チドレベルの変動が機能障害又は病状の存在又は発症を反映することができる種 々の症状のマーカーとして有効である。更に、ＡＧＥ−アミロイドポリペプチド は、単独で及び既知の担体及び送達伝達体、例えばリポソームと共に、ある場合 にはＡＧＥ部分を含む治療物質及び他の物質を膜及び上皮層、例えば、特に血液 能関門を横切って治療する患者の特定の部位に輸送するために有効である。問題 の特定部位は、ＡＧＥ−アミロイドポリペプチド、例えば、ＡＧＥ−βＡＰ又は ＡＧＥ−アミリン又はその一部を認識するアミロイドプラークであることができ る。 アミロイド原性疾患におけるＡＧＥ−アミロイドポリペプチドの高レベルの存 在は、そのポリペプチドの正常なクリアランス機序が不完全であることを示して いる。従って、更に態様において、本発明は、動物におけるＡＧＥ−アミロイド の認識及び除去の機序を促進又は誘導する組成物及び方法を提供する。即ち、本 発明は、アミロイドプラークを除去する動物体内のスカベンジャー系の活性化を 企図している。そのスカベンジャー系としては、食作用細胞、例えば、マクロフ ァージ及び神経組織内のミクログリア細胞が含まれる。 従って、本発明は、前進性グリコシル化終末産物、担体に結合したＡＧＥ、担 体に結合した蛍光発色団２−（２−フロイル）−４（５）−（２−フラニル）− １Ｈ−イミダゾール（ＦＦＩ）、動物における食作用細胞を刺激してＡＧＥ−ア ミロイド及びその混合物を認識及び除去する活性を高めるモノカイン（例えば、 リンホカイン又はサイトカイン）を含むがこれらに限定されない促進剤を投与す ることによる天然スカベンジャー系の促進又は活性化を提供する。個々の態様に おいて、ＡＧＥはＡＧＥ−アミロイドポリペプチドである。 従って、本発明は、ＡＧＥ−アミロイドポリペプチド、特にＡＧＥ−βＡＰ又 はＡＧＥ−アミリンの調製方法であって、前進性グリコシル化終末産物又は前進 性グリコシル化終末産物を形成する化合物と前記ＡＧＥ−アミロイドポリペプチ ド、例えば、ＡＧＥ−βＡＰ又はＡＧＥ−アミリンを形成するのに十分な時間、 インキュベートすることを特徴とする方法を提供するものである。 ＡＧＥ−アミロイドポリペプチドを薬学的に許容しうる担体と組合わせて含む 医薬組成物も開示される。その医薬組成物としては、ある場合には追加の活性剤 が含まれ、経口、非経口又は局所、例えば、経皮、舌下、バッカル又は経粘膜送 達用に調製され用いられる。述べたように、医薬組成物はある場合にはリポソー ムの形であることができる。 一般的には、本発明の治療法は、アミロイドポリペプチド及びアミロイド前駆 体ポリペプチドのいずれか又は全部を含む前進性グリコシル化終末産物の形成を 阻害する物質又はその物質もしくは複数のその物質を含む医薬組成物を投与する ことによる生体内アミロイド凝集及びその生体内凝集を受ける物質の阻害を企図 する。かかる物質は、前進性グリコシル化の拮抗薬を含み、ＡＧＥに対する抗体 、ＡＧＥ−アミロイドポリペプチドに対する抗体、特にＡＧＥ−βＡＰ及びＡＧ Ｅ−アミリン並びに前記抗原を結合及び中和する他のリガンドを含んでいる。適 切な物質は、また、初期グリコシル化産物の活性カルボニル部分と反応性のある 物質より選ばれ、好ましくはアミノグアニジン、α−ヒドラジノヒスチジン、ア ミノグアニジンの類縁体及び前記のもの、本明細書で詳細に挙げた全てのいずれ かを含む医薬組成物より選ばれる。本明細書に示される本発明は、追加の物質の 発見を企図し、類似の方法及び類似の目的に用いられる。 従って、本発明の主な目的は、前進性グリコシル化終末産物（ＡＧＥ）及び特 にアミロイドポリペプチドを含むＡＧＥの形成を制御することにより、アミロイ ドーシスを生じるアミロイドーシスポリペプチドの生体内凝集をモジュレート及 び制御することである。 更に、本発明の目的は、ＡＧＥ−アミロイドポリペプチドの形成の存在及び程 度を検出及び測定することにより、異常なアミロイド蓄積が特徴である症状の予 後、監視及び／又は診断方法を提供することである。 また更に、本発明の目的は、アミロイドーシスと関連のある疾患の診断及び治 療方法を提供することである。本発明の具体的な目的は、ＡＧＥ−βＡＰの形成 を測定及び阻害することにより、アミロイドーシスと関連のある神経変性疾患、 特にアルツハイマー病を診断、監視及び治療する方法を提供することである。他 の具体的な目的は、ＡＧＥ−アミリンの形成を測定及び阻害することによりII型 糖尿病を診断、監視及び治療する方法を提供することである。 また更に、本発明の目的は、１態様においてはＡＧＥ−アミロイドポリペプチ ド、特にＡＧＥ−βＡＰ又はＡＧＥ−アミリンを含む分析を用いることにより、 異常なアミロイドポリペプチド凝集を治療することができる新規な薬剤及び対応 する物質を同定する方法を提供することである。 また、本発明の他の目的は、被検者の体内でＡＧＥ−アミロイドの認識及び除 去の機序を活性化することにより被検者に形成された及び直接又は間接に病状の 原因であるアミロイドプラークを除去することを提供することである。 また別の目的は、アミロイドーシスと関連のある全身性又は神経変性疾患、特 に各々アルツハイマー病及びII型糖尿病を治療するためにＡＧＥ−アミロイドポ リペプチド、特にＡＧＥ−βＡＰ及びＡＧＥ−アミリンを用いることである。 また更に、本発明の目的は、ＡＧＥ−アミロイドタンパク質を同定すること及 びこれらのＡＧＥ−アミロイドタンパク質の存在又は生物活性が宿主生物に有害 であるか又は宿主生物における病状の存在を表す症例又は病状においてその形成 を阻害する方法である。 他の目的及び利点は、次の説明的図面について進める次の詳細な説明を考慮す ることから明らかになるであろう。 図面の簡単な説明 図１は、合成βＡＰで形成された蛍光凝集体が可溶性ポリペプチドの初期濃度 及び時間に依存することを示すグラフである。合成βＡＰ１〜２８を０.１M酢酸 ナトリウム、ｐＨ７.２とインキュベートした。チオフラビン−Ｔの存在下に蛍 光を測定するためにいろいろな時間で分割量を取り出した。３測定値の平均±標 準誤差をβＡＰの６００μM（ひし形）、３００μM（円形）及び１５０μM（四 角形）濃度についてプロットする。 図２は、蛍光凝集体形成が核形成依存性速度論を示すグラフである。合成βＡ Ｐの安定な凝集体をグルコースの存在下又は不在下に形成して“ＡＧＥ−βＡＰ 種子”及び“βＡＰ種子”を生成した。種子を３００μMの可溶性βＡＰに加え 、いろいろな時間でインキュベートした。３回のチオフラビン−Ｔ蛍光測定の平 均±標準誤差を“ＡＧＥ−βＡＰ種子”＋βＡＰ（円形）及び“βＡＰ種子”＋ βＡＰ（ひし形）について時間の関数としてプロットする。対照インキュベーシ ョンとしては、“ＡＧＥ−βＡＰ種子”単独（三角形）、“βＡＰ種子”(四角 形)及び種子のない可溶性βＡＰ（十字形）が含まれる。 図３は、“ＡＧＥ−βＡＰ種子”がβＡＰの生理的濃度で“βＡＰ種子”より 凝集の核を形成することを示すグラフである。１０nM¹²⁵Ｉ−βＡＰ１〜４０を 種子なし（四角形）、“βＡＰ種子”（ひし形）又は“ＡＧＥ−βＡＰ種子”( 円形)と混合し、３７℃で指示した時間、インキュベートした。４回の測定の平 均±標準誤差をプロットする。 図４は、グルコースが蛍光凝集体形成の速度論を変化させることを示すグラフ である。０.１Mリン酸塩、ｐＨ７.０中可溶性βＡＰ(４００μM βＡＰ１〜２８ )、０.１M酢酸ナトリウムを０.１Mグルコース（ひし形）、０.０５Mアミノグア ニジン（ＡＧ、三角形）又はグルコースとアミノグアニジン（円形）と混合した 。３回のチオフラビン−Ｔ蛍光測定値の平均±標準誤差をこのグラフにプロット する。 図５は、アルツハイマー病の前頭葉前方皮質のアミロイドプラークを多く含ん だ画分が年齢の釣り合った痴呆でない対照の等価に調製された画分よりタンパク 質１mgに対してＡＧＥ付加物を多く含むことを示すデータである。各々の対照患 者は円形で表され、ＡＤ患者は三角形で表される。各記号は、各患者の試料に対 して免疫反応性ＡＧＥ付加物の少なくとも４回の独立した測定の平均を表し、各 患者群の平均は十字形で印が付けられている。 図６は、神経変性疾患スクラピーに見られる海綿様脳症に特有のアミロイド沈 着物を含むＡＧＥとプリオンタンパク質（ＰｒＰ）関連病変のＰｒＰの共局在化 を示す写真である。脳組織切片をハムスタースクラピー株に頭蓋内感染した３０ ０日齢ハムスターから得、対照又は特定のポリクローナルウサギ抗血清、次に第 ２アルカリ性ホスファターゼ複合抗ウサギ抗体と反応させてウサギ抗体を検出し た。（Ａ）１：５００に希釈したウサギ抗ＲＮａｓｅ（対照）；(Ｂ)１：５００ に希釈したウサギ抗ＰｒＰ;(Ｃ)１：５００に希釈したウサギ抗ＡＧＥＲＮａｓ ｅ（Makitaら，1992，J．Biol．Chem．267:5133-38）。類似の構造が（Ｂ）及び （Ｃ）においてウサギ抗血清によって装飾されることに留意されたい。 図７は、チオフラビン−Ｔ−アマドリ産物複合体と繊維原β−アミロイドペプ チドとの試験管内結合に関する吸収スペクトルデータである。（Ａ）繊維原β− アミロイドペプチドの沈降後のチオフラビンの２００〜６５０nmの吸収スペクト ル。（Ｂ）沈降前のチオフラビン−Ｔの吸収スペクトル。（Ｃ）沈降後のジチオ ニトロベンゼンの吸収スペクトル。（Ｄ）沈降前のジチオニトロベンゼンの吸収 スペクトル。 発明の詳細な説明 本発明は、アミロイドーシスと関連のある全身性、局所性又は神経性変性疾患 の予防及び治療に関する。 １態様においては、本発明はアミロイドーシスに関係するＡＧＥ修飾タンパク 質の形成又は架橋を予防する組成物及び方法を提供する。具体的な実施態様にお いては、本発明は、前進性グリコシル化終末産物（ＡＧＥ）修飾βＡＰの形成を 阻害することによるβ−アミロイドペプチド（βＡＰ）のアミロイドーシスの予 防に関する。βＡＰは、アルツハイマー病（ＡＤ）及び他のアミロイド原性変性 神経性疾患と関連のあるアミロイドプラークの成分である。他の実施態様におい ては、本発明は、前進性グリコシル化終末産物（ＡＧＥ）修飾アミリンの形成を 阻害することによるアミリンのアミロイドーシスの予防に関する。アミリンは、 II型糖尿病と関連のある膵島細胞と共に見られるアミロイド原繊維の成分である 。他の実施態様においては、本発明は、多発性骨髄腫によって産生された免疫グ ロブリンのＡＧＥモジュレートアミロイドーシス、血清アミロイドＡペプチドと 関連のあるアミロイドーシス及び種々の海綿様脳症の１つと関連のあるタンパク 質、 即ち、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）又はスクラピー関連原繊維（ＳＡＦ）タン パク質のアミロイドーシスに関する。 別の態様においては、本発明は、ＡＧＥレセプターを表す常在性食作用細胞を 活性化すること、プラークのＡＧＥ含量を高めること又はその両方によるアミロ イドプラークのクリアランスを提供するものである。 本発明は、ＡＤ患者からの脳試料に見られるＡＧＥレベルが年齢の釣り合った 対照被検者からの同様に調製された試料より著しく大きいという発見に基づくも のである。本発明の一部基礎をなす追加の証拠は、ＡＧＥエピトープがハムスタ ー適応マウススクラピー、海綿様脳症の形態におけるアミロイドプラークに位置 するという所見である。本発明は、更に、βＡＰのＡＧＥ修飾がβＡＰ凝集の効 率を高めると共にＡＧＥ形成、特にアミノグアニジン（ＡＧ）のインヒビターが βＡＰのＡＧＥ増強凝集を阻害することができることを示す実験に部分的に基づ いている。 使用される用語を単純化すると共に本発明の理解をより容易にするために、多 数の略語及び用語が本明細書で用いられる。 “アミロイド”、“アミロイドプラーク”及び“アミロイド原繊維”という語 は、一般的には、不溶性タンパク質性物質を意味し、タンパク質又はその物質に 見られる他の分子の組成とは無関係な特定の物理的特徴を有している。アミロイ ドは、その無定形構造、好酸球染色及び均一な外観によって同定される。アミロ イドのタンパク質又はペプチド成分は、本明細書では“アミロイドポリペプチド ”と呼ばれ、βＡＰ；スクラピータンパク質前駆体又はプリオンタンパク質；骨 髄腫によって産生されるκ又はλ軽鎖又は重鎖を含む免疫グロブリン又はその断 片；血清アミロイドＡ；β₂−ミクログロブリン；ａｐｏＡ１；ゲルソリン；シ スタチンＣ；（プロ）カルシトニン；心房性ナトリウム利尿因子；アミリンとし ても既知の島アミロイドポリペプチド（Westermarkら，1987，Proc．Natl．Acad ．Sci．USA 84:3881-85; Westermarkら，1987，Am．J．Physiol．127:414-417; Cooperら，1987，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:8628-32; Cooperら，1988，P roc．Natl．Acad．Sci．USA 85:7763-66; Amiel，1993，Lancet 341:1249-50参 照）等が挙げられるがこれらに限定されない。ヒト及びネコアミリンがアミロイ ド原性ペプチドでありかつ試験管内で自然に凝集して不溶性原線維を形成するが 、６個のアミノ酸残基でヒトアミリンと異なるラットアミリンは非アミロイド原 性でありかつ原線維を形成しないことは留意されなければならない(Lorenzoら， 1994，Nature 368:756-760参照)。個々の態様においては、本明細書中で用いら れる“アミロイド”という語は、βＡＰ、スクラピータンパク質又はアミリンを 含有する物質を意味する。“アミロイドーシス”は、タンパク質を生体内で沈着 又は凝集してアミロイドプラーク又は原線維を形成することを意味する。 本明細書で用いられる“ＡＧＥ−”という語は、前進性グリコシル化終末産物 或いはＡＧＥを形成する化合物とそのように修飾されるβＡＰ又はアミリン部分 のような化合物の反応生成物として修飾する化合物を意味する。ＡＧＥ−アミロ イドポリペプチドは、アミロイド原性ポリペプチド又は本明細書で定義されるア ミロイドとＡＧＥ−βＡＰ又はＡＧＥ−アミリンのようなＡＧＥと又は還元糖の ような化合物、例えば、グルコースとをそのペプチドが修飾されてＡＧＥペプチ ドを形成するまで反応させることにより試験管内又は生体内で形成される。 本明細書で用いられる“グリコシル化”という語は、ＡＧＥの形成をもたらす 還元糖とβＡＰのようなアミロイドポリペプチドについての求核基、特にアミン 基との非酵素的反応を意味する。これらのプロセスは、上記のように当該技術に おいて周知である。よく使用されてきたこのプロセスの代わりの用語は、“グリ ケーション”である。 免疫グロブリン（抗体）又はＴ細胞抗原レセプターのような免疫系の抗原認識 分子と特異的に相互作用することができるときの分子は“抗原”である。抗原ペ プチドは、少なくとも約５個、好ましくは少なくとも約１０個のアミノ酸を含有 する。分子の抗原部分は、抗体又はＴ細胞レセプター認識に対して免疫優性であ る部分であることができ、免疫化のために抗原部分を大きな免疫原性キャリヤー 分子に結合することによりその分子に対する抗体を生成するために用いられる部 分であることもできる。抗原である分子は、それ自体免疫原性である必要はない 。即ち、かかるキャリヤーにカップリングせずに免疫応答を誘発することができ る必要はない。 “Ａ”（“Ａ”は単一タンパク質又はポリペプチド、ＤＮＡ分子、ベクター、 組 換え宿主細胞等である。）を含む組成物は、その組成物中そのタンパク質又はポ リペプチド、ＤＮＡ、ベクター（ＡとＢが属する種の部門に関係する）の少なく とも約７５重量％が“Ａ”である場合には実質的に“Ｂ”（“Ｂ”は１種以上の 混入タンパク質又はポリペプチド、ＤＮＡ分子、ベクター等を含む。）を含まな い。“Ａ”は組成物中Ａ＋Ｂ物質の好ましくは少なくとも約９０重量％、最も好 ましくは少なくとも約９９重量％を含む。また、組成物は実質的に混入を含まず 、通常、かかる組成物は問題の物質の活性又は特徴を有する単一分子量物質のみ 含有することが好ましい。 “薬学的に許容しうる”という語は、生理的に許容されかつ典型的にはヒトに 投与した場合に胃の不調、めまい等のアレルギー又は類似の都合の悪い反応を生 じない分子物質及び組成物を意味する。好ましくは、“薬学的に許容しうる”と いう語は、連邦政府又は州政府の調整機関によって認可されたか又は米国薬局方 又は動物、更に詳細にはヒトに有用な他の一般に認知された薬物に載せられたこ とを意味する。この組合わせにおいて“担体”という語は、化合物が投与される 希釈剤、アジュバント、賦形剤又は伝達体を意味する。薬学的に許容しうる担体 は、水のような無菌液体及び落花生油、大豆油、鉱油、ごま油等の石油、動物、 植物又は合成起原のものを含む油であることができる。水又は食塩水及びデキス トロース及びグリセロール水溶液を担体として、特に注射用液として用いること が好ましい。適切な医薬担体は、E.W.Martinによる“Remington's Pharmaceutic al Sciences”に記載されている。 “アジュバント”という語は、抗原に対する免疫応答を高める化合物又は混合 物を意味する。アジュバントは、抗原を徐々に放出する組織蓄積質として及び免 疫応答を非特異的に高めるリンパ系活性化因子としても役立つことができる(Hoo dら，Immunology，Second Ed.,1984，Benjamin/Cummings: メンロパーク、カリ フォルニア、p.384)。たいてい、アジュバントの存在しないときの抗原単独によ る一次抗原投与は、体液性又は細胞性免疫応答を誘発しないであろう。アジュバ ントとしては、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、 サポニン、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、リゾレシチンのような表 面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油又は炭 化水素エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン及びＢＣＧ（bacille Calmette-Guerin)及びコリネバクテリウム・パルブム(Corynebacterium parvum) のような潜在的に有効なヒトアジュバントが挙げられるが、これらに限定されな い。このアジュバントは薬学的に許容しうることが好ましい。 疾患又は障害は、アミロイド沈着物又はアミロイドプラークがその疾患を罹患 した組織に又はそれに接近して見られる場合に又はその疾患が不溶性であるか又 は不溶性になることができるタンパク質の過剰生産を特徴とする場合にアミロイ ドーシスと関連がある。アミロイドプラークは、既知又は未知の機序によって直 接又は間接に病理作用を刺激することができる。アミロイド疾患の例としては、 慢性炎症疾患、多発性骨髄腫、マクログロブリン血症、家族性アミロイド多発ニ ューロパチー(Portuguese)及び心筋症(Danish)、全身性老年アミロイドーシス、 家族性アミロイド多発ニューロパチー(Iowa)、家族性アミロイドーシス(Finnish )、ゲルストマン・ストレウスラー・シェインカー症候群、じんま疹及び難聴に よる家族性アミロイドニューロパチー（ムックル・ウェルス症候群）、甲状腺の 髄様がん、孤立性心房アミロイド及び血液透析関連アミロイドーシス（ＨＡＡ） のような全身性疾患；及び神経変性疾患が挙げられるが、これらに限定されない 。 II型糖尿病は、膵臓、特にインスリンを産生する島細胞のアミロイド原線維と 関連がある。アルツハイマー病アミロイドプラークについてのように、原線維の アミロイドプラークは病理作用を刺激する。特に、原線維が形成するヒトアミリ ンの濃度は、ヒト及びラット膵島インスリン産生β細胞に毒性がある(Lorenzoら ，1994，Nature 368:758-760）。従って、個々の実施態様においては、本発明は II型糖尿病アミロイドーシスに関する。 特発性家族性地中海熱、ムックル・ウェルス症候群、慢性マラリア感染症等の 慢性炎症疾患は、血清アミロイドＡの発現を引き起こすことができ、その急性相 タンパク質は更にプロセシングを受けかつアミロイド沈着物及びプラークを形成 する。例えば、発展途上国においては、慢性マラリアは個体の脾臓及び／又は肝 臓のアミロイドーシスを招くことがある。生じた臓器不全は、最後には死に至る 。多発性骨髄腫は、免疫グロブリンの過剰生産と関連があり、免疫グロブリン又 はその断片は循環系と接触した臓器又は組織にアミロイド沈着物及びプラークを 形 成することができる。トランスチレチンは、家族性アミロイド多発ニューロパチ ー(Portuguese)、家族性アミロイド心筋症(Danish)又は全身性老年アミロイドー シスを引き起こすことができる。血液透析関連アミロイドーシスは、長期血液透 析患者の中の合併症であり、β₂-ミクログロブリンがアミロイド原線維のタンパ ク質主成分である（Drueeke，1991，Miner．Electroyte Metab．17:261-272; Ge yjoら，1985，Biochem．Biophys．Res．Commun．129:701-706; Gorevicら，1986 ，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 83:7908-12; Shirahamaら，1985，Lab．Invest ．53:705-709）。 上で述べたように、全身性アミロイドーシスのほかに、本発明は特にアミロイ ドーシスを含む神経変性疾患に関する。“神経変性疾患”という語は、特に脳を 含む神経系の疾患又は障害を意味し、脳又は神経機能障害に特有の症状、例えば 、短期又は長期記憶喪失又は欠損、痴呆、認知障害、平衡及び協調問題並びに情 緒及び行動障害を表す。かかる疾患は、かかる症状を示す被検者からの脳組織の 組織病理学的（生検）試料がアミロイドプラーク形成を示す場合に“アミロイド ーシスと関連がある”。脳、特にヒト脳からの生検試料は生存している被検者か ら非常な困難を伴って入手されるか又は少しも得られないので、たいていアミロ イドーシスによる神経変性疾患の症状又は症状群の連想されるものは生検試料に おけるプラーク又は原線維のようなアミロイド沈着物の存在以外の基準に基づく 。 個々の実施態様においては、本発明のアミロイドーシスと関連のある神経変性 疾患はアルツハイマー病である。他の実施態様においては、アミロイド前駆体タ ンパク質のβＡＰ部分のアミノ末端近傍のＡＰＰにおけるＫＭのＮＬへの二重突 然変異を特徴とするまれなスウェーデン病であることができる（Levyら，1990， Science 248:1124-26)。その他の疾患は、アミロイドーシスによる遺伝性脳出血 （ＨＣＨＡ又はＨＣＨＷＡ）−オランダ型である（Rozemullerら，1993，Am．J. Pathol．１42:1449-57; Roosら，1991，Ann．N.Y．Acad．Sci．640:155-60; Tim mersら，1990，Neurosci．Lett．118:223-6; Haanら，1990，Arch．Neurol．47: 965-7）。当該技術において既知の及び本発明の範囲内のその他の疾患としては 、散在性脳アミロイドアンギオパチー、遺伝性脳アミロイドアンギオパチー、ダ ウン症候群、グアムのパーキンソン・痴呆及び加齢と関係した無症候性アミロ イドアンギオパチー（例えば、Haan & Roos，1990，Clin．Neurol．Neurosurg． 92:305-310; Glenner & Murphy，1989，N．Neurol．Sci．94:1-28; Frangione， 1989，Ann．Med．21:69-72; Haanら，1992，Clin．Neuro．Neurosurg．94:317-8 ; Fraserら，1992，Biochem．31:10716-23; Coriaら，1988，Lab．Invest．58:4 54-8参照）が挙げられるが、これらに限定されない。これらの疾患の各々に関係 するβＡＰの実際のアミノ酸組成及びサイズは、当該技術において既知であるよ うに異なってもよい（上記及びWisniewskiら，1991，Biochem．Biophys．Res．C ommun．179:1247-54と1991，Biochem．Biophys．Res．Commun．180:1528[誤植]; Prelliら，1990，Biochem．Biophys．Res．Commun．170:301-307; Levyら，199 0，Science 248:1124-26参照）。 更に態様においては、神経変性疾患は亜急性海綿様脳症であり、例えば、スク ラピー、クロイツフェルド・ヤコブ病、ゲルストマン・ストレウスラー病、クー ルー、ミュールジカ及びヘラジカの慢性消耗性疾患、ウシのウシ海綿様脳症及び ミンク伝染性脳症であるが、これらに限定されない。 本発明は、動物、好ましくはヒトを含む哺乳動物及びイヌ、ネコ、ウマ、ウシ 、ブタ、モルモット、マウス及びラットのような哺乳動物の治療を企図している 。 ＡＧＥを阻害することによる神経変性アミロイドーシスの治療 １態様においては、本発明は、疾患又は障害、例えば、神経変性疾患、特にア ルツハイマー病と関連のあるアミロイドーシスの予防又は阻害のための治療法を 提供する。広範囲の態様においては、本発明の治療法は、前進性グリコシル化終 末産物の生産、形成又は蓄積を制御することができる物質の投与を含む。かかる 物質としては、前進性グリコシル化終末産物に対する抗体、前進性グリコシル化 終末産物に結合し中和することができるＡＧＥレセプター及びその活性断片を含 むリガンド及び前進性グリコシル化終末産物の形成を阻害することができる化合 物が含まれるが、これらに限定されない。特に、本発明は、その治療を必要とし ていると考えられる被検者の脳に対するグリコシル化のインヒビター、好ましく はＡＧＥ形成のインヒビターに関する。かかる物質は、本明細書中で“ＡＧＥの 形成を阻害することができる”或いは“ＡＧＥ形成のインヒビター”、“前進性 グリコシル化のインヒビター”又は“前進性グリコシル化を阻害する物質”と呼 ばれる。 本発明は、更に、アミノグアニジンのような前進性グリコシル化を阻害する物 質が生体内ＡＧＥ−アミロイドポリペプチド形成、その結果生じるアミロイドポ リペプチド凝集開始、プラーク形成及びアミロイドーシスを阻害し；かつ進行中 のアミロイドグリコシル化の副産物と反応してこれらの副産物とタンパク質、特 に他のアミロイドポリペプチドとの反応を防止しアミロイドプラークにおいてタ ンパク質分解的に抵抗する架橋を生じるように投与される二重治療方法を企図し ている。 本発明の治療（及び下で述べられる診断）法は、ＡＧＥ−アミロイドの形成に 影響を与える物質の使用を企図している。これらの物質の中で、ＡＧＥに対する 抗体及び他のリガンドが調製及び使用される。 後グリコシル化工程、即ち、その存在がグリコシル化の逆の結果と関連しこれ を生じる蛍光発色団及び／又は分子架橋の形成を遮断する物質を使用することで ある。理想的な物質は、ＡＧＥ関連発色団及び／又はアミロイドプラークにおい てタンパク質を架橋する架橋及び他のタンパク質上に共有結合で捕捉するタンパ ク質の形成を防止するものである。 本発明は、グルコースとタンパク質アミノ基との反応を防止する物質を使用す ることはほとんど不可能であるので、最初のタンパク質グリコシル化反応を防止 する試みではない。最初のグリコシル化を防止することができる物質は非常に毒 性があると考えられ、最初のグリコシル化が約３週間で平衡になるので、この目 的を達成するのに用いうる時間は不適当である。代わりに、理想的な物質がアミ ロイドーシスと関連のある病状の直接原因である最後の前進性グリコシル化終末 産物の形成を生じる長時間後グリコシル化段階を防止又は阻害する。 更に本発明の態様においては、ＡＧＥ形成のインヒビターは、初期のグリコシ ル化産物のカルボニル部分と反応する化合物が含まれる。代表的な前進性グリコ シル化インヒビターは、アミノグアニジン、リシン及びα−ヒドラジノヒスチジ ンである。個々の実施態様においては、インヒビターはアミノグアニジン（ＡＧ ）及びその誘導体である。ＡＧ及びその誘導体を含む医薬組成物及び方法は、周 知であり、1988年７月19日発行の米国特許第4,758,538号; 1990年３月13日発行 の 同第4,908,446号; 1991年１月８日発行の同第4,983,604号; 1990年３月31日発行 の同第5,100,919号; 1992年４月21日発行の同第5,106,877号; 1992年５月19日発 行の同第5,114,943号; 1992年７月７日発行の同第5,128,360号; 1992年７月14日 発行の同第5,130,324号; 1992年７月14日発行の同第5,130,337号; 1992年８月11 日発行の同第5,137,916号; 1992年８月18日発行の同第5,140,048号; 1992年12月 29日発行の同第5,175,192号; 1993年６月８日発行の同第5,218,001号; 1993年６ 月22日発行の同第5,221,683号; 1993年８月24日発行の同第5,238,963号; 1993年 ９月７日発行の同第5,243,071号; 及び1993年10月19日発行の同第5,254,593号に 記載されている。ＡＧＥ形成の他のインヒビターは、1991年２月８日出願の米国 出願第07/652,575号；1992年３月27日出願の米国出願第07/889,141号；1992年５ 月15日出願の米国出願第07/896,854号；1992年12月８日出願の米国出願第07/986 ,661号；1992年12月８日出願の米国出願第07/986,662号；1993年３月５日出願の 米国出願第08/027,086号；1993年７月20日出願の米国出願第08/095,095号に記載 されている。前述の特許及び特許出願の各々を参考として全て詳細に引用する。 ＡＧＥ形成のかかるインヒビターは、脳又は脳脊髄液に直接、例えば、直接頭蓋 注射又は直接頭室内注射により投与されるか又は非経口注射、経口投与、皮膚吸 収等による投与により血液脳関門を通過することができる。 従って、かかる化合物としては、例えば、下記一般式を有する種々のヒドラジ ン誘導体及びその薬学的に許容しうる酸付加塩が含まれる。 （式中、Ｒは下記式の基であり、 Ｒ₁は水素又は炭素原子１〜６個を有する低級アルキル基、ヒドロキシエチル基 であるか又はＲ₂と一緒に炭素原子２〜４個を有する低級アルキレン橋であって もよい；Ｒ₂は水素又は炭素原子１〜６個を有する低級アルキル基であるか又は Ｒ₁又はＲ₂と一緒に炭素原子２〜４個を有する低級アルキレン橋、アミノ基、ヒ ドロキシ基又は下記式を有するアミノアルキレン基である； 式中、ｎは２〜７の整数であり、Ｒ₆及びＲ₇は独立して炭素原子１〜６個を有す る低級アルキル基であるか又は一緒にヘテロ原子１〜２個、そのうち少なくとも １個は窒素である、を有するシクロアルキル環又は複素環の一部を形成する；及 び前記ヘテロ原子の２番目は窒素、酸素及びイオウからなる群より選ばれる；但 し、該複素環の前記ヘテロ原子の２番目が窒素でありかつピラジン環を形成する 場合には該ピラジン環の第１窒素上にその化合物の部分と同じである置換基で置 換されていてもよい；Ｒ₃は水素、炭素原子１〜６個を有する低級アルキル基で あるか又はＲ₂又はＲ₄と一緒に炭素原子２〜４個を有する低級アルキレン橋であ る；Ｒ₄は水素、炭素原子１〜６個を有する低級アルキル基であるか又はＲ₃と一 緒に炭素原子２〜４個を有する低級アルキレン橋又はアミノ基である；Ｒ₅は水 素又は炭素原子１〜６個を有する低級アルキル基である；但し、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃ 、Ｒ₄又はＲ₅の少なくとも１つは水素以外である；又はＲはアシル基又は炭素原 子１０個までを有する低級アルキルスルホニル基であり、Ｒ₁は水素である。） アミロイドーシスと関係のある疾患が神経変性疾患である具体的な態様におい ては、ＡＧＥ形成のインヒビターが血液脳関門を横切ることができるものである ことが好ましい。脳アミロイドーシスに罹っている被検者の血液脳関門はたいて い低下した症状で見られ、これはその関門を横切る非経口的に投与された物質の 効力を促進する。他の実施態様においては、ＡＧＥ形成のインヒビターは血液脳 関門上にレセプターがあるトランスフェリンのような標的分子と結合することが できる。更に実施態様においては、疎水性の大きい（極性の小さい）物質の方が 血液脳関門を容易に横切るので、低下した極性又は増大した疎水性を有するよう にインヒビターを修飾することができる。更に実施態様においては、ＡＧＥ形成 の疎水性（非極性）インヒビターが選ばれ用いられる。また他の実施態様におい ては、前進性グリコシル化のインヒビターはリポソーム、特に血液脳関門を標的 にしたリポソームで投与される。医薬物質のリポソームでの投与は既知である(L anger，1990，Science 249:1527-1533; Treatら，感染症とがんの治療における リポソーム，Lopez-Berestein & Fidler(eds.)，Liss,ニューヨーク，pp.353-36 5(1989); Lopez-Berestein 同書，pp.317-327参照; 通常は同書参照)。 治療物質が血液脳関門を横切るためのこれらの及び他の方策は、当該技術にお いて既知であり、本発明によって企図される。 他の実施態様においては、ＡＧＥのインヒビターは抗体であることができる。 抗体は、ＡＧＥ修飾アミロイドポリペプチドに結合し、そのクリアランスを不活 性化又は仲介することができる。本発明の１態様においては、Makitaら(1992，J .Biol．Chem．267:5133-38)に記載されている抗体が用いられる。本発明は、更 にＡＧＥ−アミロイドポリペプチドのＡＧＥエピトープに対する抗体の生成を提 供するものである。かかる抗体は、当該技術において周知の技術を用いて調製さ れる。抗体を調製するために用いられる免疫原はＡＧＥ−アミロイドタンパク質 である。個々の態様においては、ＡＧＥ−βＡＰが用いられる。他の実施態様に おいては、ＡＧＥ−アミリンが用いられる。 ＡＧＥ−βＡＰ又はＡＧＥ−アミリンは、それらに対する抗体を産生するため に用いられる。かかる抗体は、周知のハイブリドーマ法を含む標準法により産生 及び単離される。通常、抗体は、動物をこれに限定されないがキーホールリンペ ットヘモシアニン（ＫＬＨ）又はＢＳＡのようなキャリヤータンパク質を含まな い又はこれと結合した、好ましくは上で定義されたアジュバントと混合したＡＧ Ｅ−βＡＰ又はＡＧＥ−アミリンで免疫することにより生産することができる。 “抗体”という語は、特異的エピトープを結合する抗体及びその断片を含む免 疫グロブリンが含まれ、その一般定義は本明細書にあてはまるものである。従っ て、その用語はポリクローナル、モノクローナル及びキメラ抗体を包含し、最後 に述べたものは米国特許第4,816,397号及び同第4,816,567号に更に詳細に記載さ れている。また、“抗体結合部位”は、抗原を特異的に結合する重鎖及び軽鎖可 変領域及び超可変領域から構成された抗体分子のその構造上の部分である。 具体的な抗体としては、無傷免疫グロブリン分子、実質的に無傷の免疫グロブ リン分子及び本明細書に関連した治療法で使用するのに好ましいＦａｂ、Ｆａｂ ′、Ｆ(ａｂ′)₂及びＦ（ｖ）として当該技術において既知の部分を含む活性結 合部位を含む免疫グロブリン分子の部分のような抗体分子が含まれる。 抗体分子のＦａｂ及びＦ(ａｂ′)₂部分は、実質的に無傷の抗体分子上で各々 パパイン及びペプシンを周知の方法によってタンパク質分解反応することにより 調製される。例えば、Theofilopolousらの米国特許第4,342,566参照。Ｆａｂ′ 抗体分子部分も周知であり、Ｆ(ａｂ′)₂からメルカプトエタノールでのように ２つの重鎖部分を結合するジスルフィド結合を還元し、次に得られたタンパク質 メルカプタンをヨードアセトアミドのような試薬でアルキル化することにより生 産される。 文法上種々の形での“モノクローナル抗体”という語は、特定の抗原と免疫反 応することができる唯一の種の抗体結合部位を有する抗体を意味する。即ち、モ ノクローナル抗体は、典型的には、免疫反応する抗原に対して単一結合親和性を 示す。各々が種々の抗原に免疫特異的な複数の抗体結合部位を有する抗体、例え ば、二重特異性（キメラ）抗体が調製される。 静脈内注射は非経口投与の非常に効果的な形態であるが、脳室内、筋肉内、腹 腔内、動脈内及び皮下注射並びに経口、経鼻及び局所投与を含むがこれらに限定 されない他の方法を用いることができる。脳室内注射は神経変性疾患の治療に好 ましいものである。静脈内注射は、全身性アミロイドーシス又はII型糖尿病と関 連のあるアミロイドーシスを治療するのに好ましいものである。 好ましくは、治療は、可溶性βＡＰ又は可溶性アミリン及びＡＧＥ−アミロイ ドポリペプチドのような非ＡＧＥ修飾アミロイドポリペプチドの凝集を促進する ことができるアミロイド種子の初期形成を防止するために予防的に行われる。具 体的な実施態様においては、上記のように血液脳関門を横切ることができるＡＧ Ｅ形成のインヒビターは、初期段階で疾患の発症又は進行を抑制するためにアル ツハイマー病又はアミロイドーシスを伴う他の神経変性疾患の危険が高いと考え られる被検者に投与される。他の実施態様においては、ＡＧＥ形成のインヒビタ ーはII型糖尿病の危険が高いと考えられる被検者、例えば、肥満症に罹っている 人又はII型糖尿病と関連のある他の症状の人において腹腔内又は静脈内に注射さ れる。例えば、ＡＤ又はII型糖尿病に対して遺伝的素因のある被検者は予防的に 治療される。そのような予防のための実際の用量及び治療法は、慣用の医療手順 及び実施に従って、投与経路、患者の年齢及び体重並びに患者が治療を受けてい る具体的な病態及びその段階、及び勿論、インヒビターの副作用、インヒビター の効能を考慮して通常の医師が容易に決定することができる。 本発明は、更に、ＡＧＥ形成インヒビターがアミロイドーシスを伴う疾患の治 療に他の治療と共に投与されることを企図する。例えば、神経変性疾患、特にア ルツハイマー病の治療の場合、ＡＧＥ形成インヒビターは、1993年９月７日発行 のGandyらの米国特許第5,242,932号; 1993年５月13日公開のWagnerらの国際特許 出願第WO93/09233号; 及び1991年11月21日公開のBuxbaumらの欧州特許出願第045 7295 A2号に記載されているようなβＡＰの生産を阻害するように設計された治 療法と共に投与される。II型糖尿病の治療の他の実施例においては、ＡＧＥ形成 インヒビターの投与は１種以上のスルホニルウレア（インスリン産生レベルを高 める薬剤）、インスリン、高血圧症の投薬の投与並びにダイエット及び運動計画 の課題と共に行われる。 ＡＧＥクリアランスを高めることによるアミロイドーシスの治療 本発明によれば、前進性グリコシル化終末産物の認識及び親和性を高めるため に動物の体内を刺激することによりその動物におけるアミロイドーシスの抑制及 び治療のための方法及び関連物質が開示される。特に、単球、マクロファージ及 び／又はミクログリア細胞のような食細胞はその食細胞がＡＧＥ修飾アミロイド プラークを認識及び除去する活性を高めることができる物質で処理される。 本発明の物質は、単独又はキャリヤーに結合した天然又は合成前進性グリコシ ル化終末産物を含む１種以上の促進剤化合物を含み、前記キャリヤーは炭水化物 、タンパク質、合成ポリペプチド、脂質、生物適合性天然及び合成樹脂、抗原及 びその混合物が含まれる。促進剤化合物としては、糖と他の高分子間の反応から 調製される他の前進性グリコシル化終末産物及び前進性グリコシル化終末産物に 対して活性を高めるために食細胞を刺激するモノカインが含まれる（1990年２月 13日発行のVlassaraらの米国特許第4,900,747号参照、この特許を参考として全 て 本明細書に引用する）。 従って、促進剤化合物は、アルブミンのようなタンパク質に結合した化合物Ｆ ＦＩを含むことができる。また、促進剤化合物は、例えば、グルコース又はグル コース−６−ホスフェートとアルブミンとの反応により調製される合成的に誘導 された前進性グリコシル化終末産物を含むことができる。この反応産物は、単独 で又はＦＦＩアルブミン複合体と同じ方法でキャリヤーと共に用いられる。個々 の態様においては、促進剤化合物はＡＧＥ−アミロイドポリペプチドである。 促進剤化合物として作用するモノカインは、本発明者らの一員によって発見及 び単離され“カケクチン”と名付けられた腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）として既知の タンパク質を含む。この物質は、単独で又は他の促進剤化合物と共に投与される 。 更に、本発明の促進剤化合物は“共促進剤”として下で同定された物質と共に 投与される。促進剤化合物と共促進剤化合物とを同時投与すると、前者の活性を 増強することが判明した。適切な共促進剤としては、インターロイキン−１（I Ｌ−１）及びγ−インターフェロンのようなモノカインが含まれる。 本発明の方法の別の実施態様及び上記方法と独立して又は組合わせて実施され るものは、食細胞を促進剤化合物に曝す生体外処理である。例えば、患者は体外 血液処理され、その血液は動脈及び静脈系から体外へ出されかつ血液内の食細胞 と接触するように適切に配置された促進剤化合物及び／又は共促進剤を含む部材 中に進められる。促進剤化合物及び／又は共促進剤は固定化されるか又は体液の 流れに入れることができる。 本方法が促進剤化合物及び／又は共促進剤の生体内投与を含む場合には、その 投与は経口方法及び皮内、皮下、静脈内又は腹腔内注射のような非経口方法、カ テーテル挿入法又は他の慣用の手段を含む既知の方法によって達成される。促進 剤化合物又はそれらの混合物は、そのような投与に適切な医薬組成物で調製され る。 個々の実施態様においては、ＡＧＥ修飾アミロイドポリペプチドは、アミロイ ド沈着物又はプラークを代謝させることができるマクロファージのような食細胞 の組織を活性化するのに有効である。かかるアミロイドポリペプチドは、未変性 アミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有してもよく、非酵素的グリケーション及び ＡＧＥ形成のために１種以上の追加部位を含むように修飾されてもよい。例えば 、ヒスチジン、アルパラギン又はグルタミン残基（即ち、極性又はカチオン残基 ）はリシンで置換される。 上で述べたように、ＡＧＥ修飾アミロイドポリペプチドを投与すると、食細胞 の組織の食作用機序を活性化することができる。アミロイドを食作用により捕食 するほかに、かかる食細胞はアミロイドを分解する酵素を分泌することもでき、 アミロイドの除去に援助することができる他の細胞を回復することができる。 更に具体的な態様においては、本発明のＡＧＥ−βＡＰ又は他のＡＧＥ神経ア ミロイドポリペプチドは、ＡＧＥ及び／又はＡＧＥ修飾ポリペプチド、即ちアミ ロイドを除去するミクログリアを活性化するために神経食細胞、特にミクログリ アの活性化の刺激剤として用いられる。かかる食細胞は、特定の化学構造を認識 しかつ結合するそれらの表面上のレセプターによって異常高分子を認識及び除去 することができる。このようにして異常高分子が認識されると、食細胞は高分子 を吸収することができ、次にそれを分解することができる。ある場合には、食細 胞は更に酵素及びそれが吸収することができない場合に細胞外で分子又は粒子を 分解するのを援助するか又はその分解に関与する他の細胞を誘導する他の因子を 分泌することができる。アミロイドが除去された後、罹患した領域の正常な機能 は回復することができる。 他の個々の態様においては、本発明は、II型糖尿病と関連のある膵臓アミロイ ドプラーク又は原線維を除去するために体内吸収機序を活性化するためにＡＧＥ −アミリンを投与することを企図する。 本発明は、食細胞を前進性グリコシル化終末産物に対する認識及び親和性並び に分解能についてこれらの細胞の能力を増強する促進剤化合物に曝すことにより 活性化することができることを企図する。特に、これらの細胞をある種の促進剤 化合物に曝すと、これらの細胞上に生じたレセプター数を増大し、もって、前進 性グリコシル化終末産物の認識及び分解についてこれらの細胞の能力及び効率を 高めることが判明した。即ち、個々の態様においては、本発明のＡＧＥ−βＡＰ 又はＡＧＥ−アミリンは食細胞仲介ＡＧＥ特異的活性を促進することが既知の他 の化合物のように促進剤化合物として作用することができる（1987年５月12日発 行の米国特許第4,665,192号及び1990年２月13日発行の同第4,900,747号並びに19 92年５月５日出願の同時継続米国出願第07/878,837号参照）。 従って、本発明の方法は、通常は、脳組織をＡＧＥ−アミロイドポリペプチド に曝すか又は膵組織をＡＧＥ−アミリンに曝すことを含み、前進性グリコシル化 を受けたアミロイドの認識及び除去の増大に対する機序の活性化をもたらすこと ができる。 更に、被検者が上記のように特に神経変性の痴呆又は成人発症型糖尿病を含む アミロイドーシスと関連のある疾患の症状を現在発現している場合の実施態様に おいては、本発明は、ＡＧＥレベルを高めるためにアミロイドプラークを修飾し てＡＧＥ修飾分子の認識及び除去の経路による、特に食細胞の活性化による分解 の標的としてプラークの利用可能性を高めることを企図する。例えば、アミロイ ドを結合するのに親和性を示すコンゴレッド及びチオフラビン（1994年１月４日 発行のCaugheyらの米国特許第5,276,059号参照、この特許を参考として全て引用 する）のようなその誘導体及び類縁体を含むアミロイド標的物質はＡＧＥ又はＡ ＧＥ前駆体（以後、ＡＧＥ及びＡＧＥ前駆体修飾標的物質は共に“ＡＧＥ”修飾 標的物質と呼ばれる）を有するように修飾され、前記ＡＧＥ又はＡＧＥ前駆体を アミロイド沈着物に対して標的にするように投与される。チオフラビンＴ及びコ ンゴレッドの構造を下記に示す。 本発明のＡＧＥ−アミロイド標的物質は、いかなる経路でも、例えば、静脈内 、腹腔内、筋肉内、脳室内、頭蓋内、経口、経鼻、皮膚貼付を介して等で投与す る ことができる。個々の態様においては、これらの物質は血液脳関門を横切ること ができるように修飾され、そのように修飾された物質は神経変性疾患と関連のあ るアミロイドプラークについてＡＧＥレベルを高める魅力的な候補物質である。 アマドリ化合物のようなＡＧＥ又はＡＧＥ前駆体は、アミロイドのＡＧＥ修飾 レベルを高めるのに有用なアミロイド標的物質に結合される。かかるＡＧＥ又は ＡＧＥ前駆体の例としては、ＦＦＩ、フルクトピラノース及びその誘導体等が挙 げられるが、これらに限定されない。下記の個々の実施態様においては、チオフ ラビンは下記の実施例で示される６−アミノ（１−デオキシ−β−Ｄ−フルクト ピラノス−１−イル）又は６−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ（１−デオキシ−β−Ｄ −フルクトピラノス−１−イル）基のようなアマドリ化合物と結合してＡＧＥチ オフラビン（ＡＧＥ−ＴＦ）を形成する。他の実施態様においては、コンゴレッ ドはアマドリ化合物、例えば、次のスキームＩに示されるように結合される。 チオフラビン又はコンゴレッド部分はアミロイドプラーク及び原線維に対する アマドリ化合物を標的にしてそのアミロイドプラーク又は原線維の又はそれと直 接関連のあるアマドリ産物によって仲介されるＡＧＥ形成を誘導し、ＡＧＥ修飾 アミロイドの形成を引き起し、もって、アミロイドプラーク又は原線維の局部的 な又は回復した食細胞による摂取確度を高める。 個々の実施態様においては、ＡＧＥ−ＴＦはＡＤと関連のあるβＡＰアミロイ ドプラークにおけるＡＧＥ形成を誘導するためにＡＤに罹っている個体に投与さ れる。高レベルのアミロイドのＡＧＥ修飾は、中枢神経系のミクログリア又は回 復した末梢単球又はその両方による摂取確度を高め、アミロイドの除去を促進す る。 他の個々の実施態様においては、ＡＧＥ−ＴＦ又はＡＧＥ−コンゴレッドはII 型糖尿病と関連のあるアミリン−アミロイドプラークのＡＧＥ形成を誘導するた めにII型糖尿病に罹っている個体に投与される。高レベルのアミロイドのＡＧＥ 修飾は、局部的又は回復した食細胞による摂取確度を高め、アミロイドの除去を 促進する。 ＡＧＥ−ＴＦ又はＡＧＥ−コンゴレッドのようなＡＧＥ担持標的物質の有効性 について、アミロイドのＡＧＥ修飾の効能を試験管内及び生体内で試験される。 このＡＧＥ修飾は、標的物質とアミロイドの結合による非共有結合又はアミロイ ド上の部位に固有のＡＧＥ又はＡＧＥ前駆体の反応性による共有結合であること ができる。下記実施例においては、アミロイドポリペプチドβＡＰ及びアミロイ ド標的物質チオフラビン（ＴＦ）が便宜上記載される。しかしながら、本発明の 開示は、任意のアミロイドモデル系及び任意のアミロイド特異的標的物質と同一 又は類似分析の実施を企図し、下記実施例に限定されるものではない。 試験管内分析は、不溶性又は凝集したβＡＰ又はアミリンをＡＧＥ修飾するＡ ＧＥ−ＴＦの能力を求めるために用いられる。例えば、ＡＧＥ−ＴＦは不溶性β ＡＰ又は不溶性アミリンとインキュベートしてＡＧＥ修飾した不溶性又は凝集し たβＡＰ又はアミリンを生成することができる。ＡＧＥ修飾レベルは、例えば、 抗ＡＧＥ抗体を用いるＥＬＩＳＡにより求められ、非修飾チオフラビンで処理さ れた対照と比較される。更に、ＡＧＥ修飾不溶性βＡＰのクリアランスのための 試験は、マウス腹膜マクロファージ、誘発マクロファージ、ＲＡＷ２６４.７セ ルライン、ヒト末梢単球又はミクログリアもしくはアストログリア一次細胞又は セルラインのような培養食細胞とインキュベートすることにより行われる。 食細胞によるＡＧＥレセプター仲介摂取の関係は、標準結合分析で評価される 。不溶性又は凝集した標識βＡＰ（下で述べられるような当該技術において既知 の標的手段が用いられるが、例えば、¹²⁵Ｉ−βＡＰ）をＡＧＥ−ＴＦ又はＴＦ 単独（対照）と接触させ、標準拮抗剤として増加濃度の冷却ＡＧＥ−ＢＳＡの存 在下に１ウェルにつき約１０⁶細胞とインキュベートする。次に、相対するＡＧ Ｅ−ＢＳＡの不在下に結合した標識βＡＰ又はアミリン量を種々の濃度のＡＧＥ −ＢＳＡの存在下の量と比べる。次に、細胞上のＡＧＥ修飾アミロイド結合部位 の数、親和性及び結合速度論を誘導するために標準法が用いられる。βＡＰ又は アミリンが標識部分であることを確実にするために、ＡＧＥ−ＴＦ処理によるＡ ＧＥ修飾の前にβＡＰ又はアミリンを標識しなければならない。更に、対照は未 処理βＡＰ又はアミリン単独が含まれる。 摂取分析も行われる。摂取分析においては、細胞を対照（例えば、標識βＡＰ 又はアミリン単独、ＴＦ単独及び／又はＴＦ処理標識βＡＰ又はアミリン）に対 してＡＧＥ−ＴＦ処理、不溶性又は凝集した標識βＡＰ又はアミリンを含む媒体 と３７℃で１〜４８時間の範囲の種々の時間、例えば、１、２、４、２４及び４ ８時間インキュベートする。インキュベートした後、細胞を培養液から分離する 。細胞画分及び培養液画分中の標識の含量を、例えば、標識化合物に対するＴＣ Ａ沈降により測定する。また、ウェルを可溶性或いは不溶性凝集形態の標識試験 化合物及び対照化合物で前被覆し、細胞とインキュベートし、ウェルに被覆され た化合物の摂取による化合物の分解を表す細胞培養液中の標識化合物の存在を分 析することができる。標識は、好ましくは¹²⁵Ｉ又はＦＩＴＣ、更に好ましくは^{1 25} Ｉである。摂取分析は、クリアランス分析に用いたものと同じ細胞で行われる 。 本発明は、また、アミロイドのＡＧＥ修飾を示す生体内分析の使用を企図する 。１実施態様においては、ＡＧＥ−ＴＦ又はＡＧＥ−コンゴレッドは、生後約１ 年以内に肝臓、脾臓及び腎臓にアミロイドーシスを発生し(雄のハムスターより 非常に短い寿命をきたす；例えば、Coe & Ross，1985，J．Clin．Invest．76:66 -74)、ジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）がこのアミロイドーシスを促進す る雌のシリアハムスターに投与される。ＡＧＥ−ＴＦ又はＡＧＥ−コンゴレッド の影響を求めるために、３ヵ月齢にＤＥＳで処理した６〜１２ヵ月齢ハムスター のグループ（ｎ＝４〜１０）を緩衝食塩水のような適切な担体中約０.１〜約１m gのＡＧＥ−ＴＦ又はＡＧＥ−コンゴレッドの１週間あたり１〜２回腹腔内注射 で種々の期間処理する。対照ハムスターは、担体、ＡＧＥ単独及びＴＦ又はコン ゴレッド単独を注射する。アミロイド沈着物のＡＧＥ修飾の存在及びレベルは、 種々の期間、例えば、１ヵ月、２ヵ月及び４ヵ月後、組織押しつぶし法(Coe & R oss，1990，J．Exp．Med．171:1257-67)及びＥＬＩＳＡ（本明細書に記載される ）で試験される。 スクラピーを腹腔内又は頭蓋内に接種したマウス又はハムスターについて、同 様の生体内分析が行われる。スクラピーを感染した約１〜１２ヵ月、好ましくは １〜約６ヵ月後に、動物はＡＧＥ−ＴＦ又はＡＧＥ−コンゴレッドで例えば、毎 週又は隔週に約０.１〜約１mgのＡＧＥ−ＴＦ又はＡＧＥ−コンゴレッドの腹腔 内又は頭蓋内注射で処理される。罹患臓器の組織試料又は切片（腹腔内注射の場 合脾臓又は頭蓋内注射の場合脳）が得られる。脾臓又は脳におけるアミロイドの 存在は、組織学的に又は免疫化学的に検出される（抗ＰｒＰ抗体を用いて免疫組 織学的に又はＥＬＩＳＡで）。組織のＡＧＥ修飾レベルは、例えば、本明細書に 記載される抗ＡＧＥ−ＲＮａｓｅ抗体を用いて免疫組織学的に又はＥＬＩＳＡで 検出される。 かかる実験は、また、II型糖尿病症状を生じるように遺伝的に罹りやすくする か又は処理されるネコ、ラット又はマウスで行われる。糖尿病発症の約１〜１２ ヵ月、好ましくは１〜約６ヵ月後に、動物はＡＧＥ−ＴＦ又はＡＧＥ−コンゴレ ッドで例えば、毎週又は隔週に約０.１〜約１mgのＡＧＥ−ＴＦ又はＡＧＥ−コ ンゴレッドの腹腔内又は頭蓋内注射で処理される。膵臓の組織試料又は切片、特 に島細胞を含む面が得られる。アミロイドの存在は、組織学的に又は免疫化学的 に（免疫組織学的に又はＥＬＩＳＡで）検出される。組織のＡＧＥ修飾レベルは 、例えば、本明細書に記載される抗ＡＧＥ−ＲＮａｓｅ抗体を用いて免疫組織学 的に又はＥＬＩＳＡで検出される。 アミロイドの除去を誘導するのにアミロイドのＡＧＥ修飾の有効性は、罹患組 織のアミロイド量を検出すると共にその量を種々の期間後の対照動物の量と比べ ることにより求められる。本発明のこの態様によれば、病状及び治療の時間経過 はアミロイドーシス、アミロイドのＡＧＥ修飾及びＡＧＥ修飾アミロイドのクリ アランスを含むことができる。即ち、アミロイドの存在及びアミロイドのＡＧＥ 修飾のレベルは、試料が試験用に得られる時間経過内の時点に左右されるであろ う。時間経過は、種々の時間で試料を得て分析することにより容易に求められる 。 更に実施態様においては、アミロイドのＡＧＥ修飾を誘導する方法は、ＡＧＥ 修飾アミロイドプラークの認識及びクリアランスの機序を活性化するための上記 で述べた方法と組合わせられる。 診断法 本発明は、また、アミロイドーシスと関連のある疾患又は障害の存在を検出す るか又は過程を監視する方法であって、かかる疾患に特有のアミロイドプラーク に見られるＡＧＥ−アミロイドポリペプチドの存在を検出する工程又はそのレベ ル又は量を測定する工程を含む方法に関する。ＡＧＥ−アミロイドポリペプチド の存在を検出すると、病態の存在が示されるので、かかる疾患の診断に単独で又 は他の基準と共に有効である。初期の被検者に検出されたレベル又は正常な個体 に見られるレベルと比べてＡＧＥ−アミロイドポリペプチドのレベルの上昇は、 疾患の進行を示すことができ、初期の被検者のレベル又は正常な個体に見られる レベルと比べてレベルの低下は、疾患の退行を示すことができる。 個々の態様においては、本発明は、ＡＧＥ−βＡＰの対応する存在及び量又は レベルを測定することにより哺乳動物においてアミロイドーシスと関連のある神 経変性疾患の過程を診断又は監視することを提供するものである。ＡＧＥ−βＡ Ｐは、血漿、血清、尿、脳脊髄液等の生物液で検出される。また、試料は生検又 は組織試料のような組織病理学的試料とすることができる。 他の実施態様においては、本発明は、ＡＧＥ−アミリンの対応する存在又は量 又はレベルを測定することによりII型糖尿病の存在を検出するか又は過程を監視 する方法に関する。ＡＧＥ−アミリンは、血液、血漿、血清、尿、腹腔液等の生 物液に検出されるが、これらに限定されない。また、試料は生検又は組織試料の ような組織病理学的試料とすることができる。 ＡＧＥの存在又はレベルは、本明細書に示されたＡＧＥ−アミロイドポリペプ チドに結合するパートナーの少なくとも１種の適切に標識された量の使用によっ て本明細書で述べられたような分析法で直接続けられる。また、ＡＧＥは、ＡＧ Ｅの存在及び量について試験する媒体に標識及び導入される結合パートナー又は 拮抗体を高め、その媒体が抜き取られる宿主の状態を評価するために用いられる 。 “リガンド”という語は、ＡＧＥ−アミロイドペプチド結合パートナーに結合 するような物質が含まれ、ＡＧＥ−βＡＰ又はＡＧＥ−アミリンとアビジン又は ビオチンとの反応によって調製されるような物質又はβＡＰ又はアミリンとグル コース、グルコース−６−ホスフェート（Ｇ−６−Ｐ）、フルクトース又はリボ ースのような糖との反応から調製される合成ＡＧＥ−βＡＰ又はＡＧＥ−アミリ ン誘導体の標品及びペプチド、タンパク質及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、 アビジン、ビオチン誘導体及びアルカリホスファターゼのような酵素とのＡＧＥ −βＡＰ又はＡＧＥ−アミリン複合体が含まれる。同様に、酵素及び前進性グリ コシル化を受けた他の担体もまた、本発明の分析のいずれかにリガンドとして役 に立つことができる。従って、炭水化物、タンパク質、合成ポリペプチド、脂質 及び生物適合性天然及び合成樹脂及びその混合物のような担体は、前進性グリコ シル化終末産物を形成するために糖と反応させることでき、もって、本発明の方 法に有効なものである。本発明の診断法は、その範囲内で前述の物質の全てを企 図するものである。 “ＡＧＥ結合パートナー”という語は、抗ＡＧＥ抗体及び他の細胞ＡＧＥ結合 タンパク質又はＡＧＥに対するレセプターまで及ぶものであり、ＡＧＥはペプチ ド、分子及び細胞上に見られる。特定のＡＧＥ結合パートナーは、ウサギにおい て高められ本明細書で企図される使用に単離された抗ＡＧＥ抗体である。 即ち、調製されるＡＧＥ−βＡＰ又はＡＧＥ−アミリンと結合パートナーは共 に、例えば、標識されていないか或いは例えば、放射性付加又は¹²⁵Ｉ標識によ って標識されるレセプター又はＡＧＥに対する他のリガンドを用いるラジオイム ノアッセイのようなイムノアッセイを含む種々の診断法と共に用いることができ る。 イムノアッセイでは、ＡＧＥ−βＡＰ又はＡＧＥ−アミリンに対する結合パー トナーの対照特性が調製され、場合によっては酵素、蛍光を発する化合物及び／ 又は放射性元素で標識され、次に哺乳動物の組織又は液体試料に導入される。標 識物質又はその結合パートナーが試料内の部位と反応する機会があった後、得ら れた物質は結合標識の種類で異なってよい既知の手法で試験される。 これらの研究に最も普通に用いられる標識は、紫外線等に曝された場合に蛍光 を発する放射性元素、酵素、化学薬品である。 放射性元素の適切な例としては、³Ｈ、¹⁴Ｃ、³²Ｐ、³⁵Ｓ、³⁶Ｃｌ、⁵¹Ｃｒ、^{5 7} Ｃｏ、⁵⁸Ｃｏ、⁵⁹Ｆｅ、⁹⁰Ｙ、¹²⁵I、¹³¹I及び¹⁸⁶Rｅが挙げられる。上記同位 元素の１つで調製される放射性標識が用いられる場合には、現在既知の有効計数 手順が用いられる。 標識が酵素である場合には、検出は当該技術において既知の現在用いられてい る比色法、分光光度法、蛍光分光光度法、温度測定法、電流測定法又は気体定量 法のいずれかによって達成される。酵素は、カルボジイミド、ジイソシアネート 、グルタルアルデヒド等の架橋分子と反応させることにより前進性グリコシル化 終末産物、その結合パートナー又は担体分子に結合される。 これらの手順に用いられる多くの酵素は、既知であり用いることができる。ペ ルオキシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−ガ ラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ＋ペルオキシダーゼ、ヘ キソキナーゼ＋ＧＰＤａｓｅ、ＲＮＡｓｅ、グルコースオキシダーゼ＋アルカリ ホスファターゼ、ＮＡＤオキシドレダクターゼ＋ルシフェラーゼ、ホスホフルク トキナーゼ＋ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ、アスパルテートアミ ノトランスフェラーゼ＋ホスホエノールピルベートデカルボキシラーゼ及びアル カリホスファターゼが好ましい。米国特許第3,654,090号；同第3,850,752号；及 び同第4,016,043号には、別の標識物質及び方法の開示が例によって言及されて いる。具体的な酵素検出物質は、ヤギにおいて調製されかつイソチオシアネート を介してアルカリホスファターゼと結合された抗ウサギ抗体である。 多数の蛍光物質が既知であり、標識として使用される。これらは、例えば、フ ルオレセイン、ローダミン及びオーラミンが含まれる。具体的な蛍光検出物質は 、ヤギにおいて調製されかつイソチオシアネートを介してアルカリホスファター ゼと結合された抗ウサギ抗体である。 治療使用のほかに、本発明の抗体はアミロイド又は溶液中のＡＧＥ−アミロイ ドポリペプチドを検出するために用いられる。特に、本発明の抗体は、哺乳動物 体内のアミロイドプラークにおけるＡＧＥの量及び位置を求めるために用いられ る。便宜上、本明細書ではＡＧＥに対する抗体をＡｂ₁及びＡｂ₁と反応性のある 抗体をＡｂ₂と呼ぶ。 生物液中のＡＧＥ−アミロイドポリペプチドの量又はアミロイドプラークにお ける前進性グリコシル化の程度は、その定量に適用できる通常の免疫学的手順に よって確認される。多数の有効な手順が既知である。特に有効な３つの手順は、 検出可能な標識で標識されたＡＧＥ−アミロイドポリペプチド、検出可能な標識 で標識された抗体Ａｂ₁或いは検出可能な標識で標識された抗体Ａｂ₂を用いる。 手順及びその応用は、当業者に全てよく知られており、従って本発明の範囲内で 用いられる。“競合的”手順の例は、米国特許第3,654,090号及び同第3,850,752 号に記載されている。“サンドイッチ”手順の例は、米国特許第ＲＥ31,006号及 び同第4,016,043号に記載されている。なお“二重抗体”、または“ＤＡＳＰ” 法のような他の手順が既知である。 各場合において、ＡＧＥ修飾物質は１種以上の抗体又は結合パートナーと複合 体を形成し、その複合体の一部が検出可能な標識で標識される。複合体が形成さ れた事実、及び場合によってはその量は、標識の検出に適用できる既知の方法に よって求められる。 Ａｂ₂の特性がＡｂ₁と反応することであることは上記のことからわかる。これ は、Ａｂ₁を高めた哺乳動物種で高められた抗体が抗体Ａｂ₂を高める抗原として 別の種で用いられたためである。例えば、Ａｂ₁はウサギで高められ、Ａｂ₂は抗 原としてウサギＡｂを用いてヤギで高められる。従って、Ａｂ₂はヤギで高めら れた抗ウサギ抗体である。 従って、下記のものを含む、試料中のＡＧＥ−アミロイドポリペプチドを証明 するための試験キットが調製される。 （ａ）ＡＧＥ−アミロイドポリペプチド又はＡＧＥ結合パートナーを検出可能 な標識に直接又は間接に結合することによって得られた少なくとも１種の標識さ れた免疫化学的に反応性のある成分の所定量； （ｂ）他の試薬；及び （ｃ）前記キットを使用するための説明書。 さらに詳細には、診断試験キットは下記のものが含まれる。 （ａ）通常固相に結合して免疫吸着剤を形成するか又は代わりに適切な標識に 結合したＡＧＥ−ＢＳＡ、ＡＧＥ−βＡＰ又はＡＧＥ−アミリン（又はその結合 パートナー）のようなＡＧＥ又はその複数の成分等（又はその結合パートナー） の各々の１つの既知量； （ｂ）場合によっては他の試薬；及び （ｃ）前記試験キットを使用するための説明書。 例によって、固相分析システム又はキットは、結合した結合パートナー及び標 識したＡＧＥ−アミロイドポリペプチド或いは結合したＡＧＥ−アミロイドポリ ペプチド及び標識した結合パートナーを有する固体基質を含むことができる。次 に、分析されるべき試料は結合した試薬及び結合されていない試薬と接触させて 配置される。試料中標識されている物質と標識されていない結合パートナーとの 間の競合的反応は、固体基質上に前者の依存量が保持され、そのときに正確に定 量的に確認される。特定の競合的分析システムの前記説明は、本発明の権利を与 える開示を示す義務の実施において具体的な説明のためだけに本明細書に示され る。本発明がその真意及び範囲内で種々の診断プロトコールを企図することは理 解されるべきである。 本発明の好適態様においては、Makitaら(1992，J．Biol．Chem．267:5133-38) に記載されているＡＧＥ分析は、組織試料、特にアミロイドを含む試料中のＡＧ Ｅ−アミロイドの存在を検出しかつその量又は試料中に存在するＡＧＥ−βＡＰ 、ＡＧＥスクラピータンパク質又はＡＧＥ−アミリンの量を定量するために用い られる。 下記個々の実施態様においては、ＡＧＥと反応性のある抗体は、正常な個体に 比べて高いレベルのＡＤと診断された個体からの脳組織におけるＡＧＥタンパク 質を検出するために用いられる。 他の個々の実施態様においては、ＰｒＰに対する抗体（スクラピー又はプリオ ンタンパク質；例えば、Kascsakら，1987，J．Virol．61:3688-3693）及びＡＧ Ｅに対する抗体は、組織試料におけるこれらのエピトープの共局在化を示すため に用いられる。例えば、スクラピーに感染したハムスター又はマウスからの脳切 片はウサギポリクローナル抗ＰｒＰ、抗ＡＧＥ−ＲＮａｓｅ及び対照抗ＲＮａｓ ｅで免疫組織化学的に染色される。スクラピー（亜急性海綿様脳症）では、特有 の海綿様脳症はＰｒＰ関連病変を特徴とし、アミロイド沈着物を含んでいる。こ れらの免疫化学的研究により、単一のスクラピー罹患脳内にＰｒＰ及びＡＧＥが これらの病変のアミロイドに共局在化することが示される。 本発明は、本発明の具体的な個々の実施態様としてのみ示される次の限定され ない実施例によって更に完全に理解される。 実施例１：アルツハイマー病における加齢アミロイド アルツハイマー病（ＡＤ）は、脳及び脳血管系内の凝集したβアミロイドペプ チド（βＡＰ）の沈着物を特徴とする。試験管内インキュベーション中の濃度依 存性遅滞期間の後、合成βＡＰの可溶性標品は天然アミロイドに似ている原線維 凝集体を徐々に形成し、沈降又はチオフラビン−Ｔによる蛍光で測定可能である 。これらの試験管内分析における可溶性βＡＰの凝集は、少量の前凝集βアミロ イド“種子”物質を加えることにより高められる。これらの種子は、また、タン パク質を化学的に架橋する前進性グリコシル化終末産物（ＡＧＥ）の形成を生じ るグルコースとタンパク質アミノ基間の天然に存在する反応を用いて調製された 。ＡＧＥ修飾βＡＰ核形成種子は、非修飾“種子”物質に比べて可溶性βＡＰの 凝集を更に促進した。時間が経つにつれて、非酵素的前進性グリコシル化は、ま た、生体内の長命タンパク質上に一組の後翻訳共有結合付加物を徐々に蓄積する ことをもたらす。標準化競合的ＥＬＩＳＡ分析を用いて、ＡＤ脳のプラーク画分 が健康な年齢の釣り合った対照からの類似標品に見られるものより１mgあたり約 ３倍のＡＧＥ付加物を含むことが判明した。これらの結果は、βアミロイドの生 体内半減期がＡＤにおいて延長され、ＡＧＥ修飾の蓄積が多くなり、追加アミロ イドの蓄積を促進するように作用することができることを示している。 材料及び方法 凝集及び種入れ反応。 ４２アミノ酸βＡＰの最初の２８（βＡＰ１〜２８） 及び最初の４０アミノ酸（βＡＰ１〜４０）を表す合成のＨＰＬＣ精製ペプチド をBachem（トーランス、カリフォルニア）から入手した。種々の濃度の可溶性β ＡＰ１〜２８又はβＡＰ１〜４０の凝集を、指定ｐＨ（４.７〜７.５）の０.１M 酢 酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）を加えることにより開始し、指定した時間続けた。 ミリモル未満のβＡＰ濃度を有する定量的凝集体形成を、LeVine(1992，Protein Science 2:404-410)の方法を用いて検出した。簡単に言えば、１０μMチオフラ ビン−Ｔ(Aldrich)/５０mMリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６.０に加えた凝集体の 蛍光を、Perkin Elmer LS-50B分光蛍光計により４５０±５nmの励起及び４８２ ±１０nmの発光検出で測定した。指示された場合に、少量の前形成凝集体又は“ 核形成種子”を可溶性βＡＰに加え、凝集を０.１M酢酸ナトリウムで開始した。 “種子”の生成。 可溶性βＡＰ１〜４０(２５０μM)及び０.２Mリン酸ナト リウム緩衝液、ｐＨ７.５を１Mグルコースを存在させて又は存在させずに３７℃ でインキュベートして“ＡＧＥ−βＡＰ種子”又は“βＡＰ種子”を各々呼ばれ るＡＧＥ−βＡＰの前形成凝集体を生成した。インキュベーション後、種子標品 のタンパク質濃度を測定し、１５０μM最終濃度に緩衝液で調整した。競合的Ｅ ＬＩＳＡ（上記Makitaら）を用いて、ＡＧＥ−βＡＰ種子は５０ＡＧＥ単位／mg タンパク質を有し、βＡＰ種子は０.５ＡＧＥ単位／mgタンパク質未満を有した 。βＡＰの位置１６及び２８のリシンは、第一アミンを含み、還元糖と反応して ＡＧＥの前進性グリコシル化終末産物を生成することができる。グルコース及び ／又はアミノグアニジン、前進性グリコシル化及び架橋形成の強力なインヒビタ ー(Brownleeら，1986，Science 232:1629-1632)の指示量を、ある実験において は酢酸ナトリウムの前にβＡＰ溶液に加えた。 低（生理的）濃度におけるβＡＰの凝集をBurdickら(1992，J．Biol．Chem．2 67:546-554)の方法で定量した。βＡＰ１〜４０の合成標品を¹²⁵I（ＮＥＮ）及 びクロラミン−Ｔ(Sigma)で１分間標識した後、その反応物を１０mMチロシン及 びメタ重亜硫酸ナトリウムで急冷した。０.５×リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ） 、ｐＨ７.４で平衡にしたセファデックスG-10カラムでろ過することにより、取 込まれない標識を除去した。¹²⁵I標識βＡＰ(およその比活性３×１０⁶cpm／μg )を種々の“種子”、指示濃度のグルコース及び／又はアミノグアニジンの存在 下に５nM最終濃度まで直ちに希釈した。３７℃で種々のインキュベーション時間 の後、凝集反応物の下にインキュベーション混合液と同じｐＨの２０％スクロー ス／０.１M酢酸ナトリウムをしき、５０,０００×ｇで３０分間遠心し、液体窒 素で凍 結した。各ミクロフュージ管を切断し、スクロースクッションを介して沈降した 凝集沈降性画分を示す底の５mmをγカウンターで計数した。残りの管と液体も計 数した。形成凝集体の量は、％＝（沈降物のカウント数／管（沈降物＋残部）あ たりの総カウント数）×１００として算出した。 競合的ＥＬＩＳＡによるＡＧＥの測定。 行動的に及び神経病理学的に確認さ れたＡＤに罹った又は罹っていない患者からの凍結前頭葉前方皮質（ブロドマン 領野９及び１０）の分割量を２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）／０.１M β−メルカプトエタノール（ＭＥ）の含水重量あたり１０容量に再懸濁し、ダウ ンスホモジェナイズした。そのホモジェネートを１０分間煮沸し、次に１０,０ ００×ｇで１０分間遠心した。上清を吸引し、得られた沈降物をＰＢＳで１０, ０００×ｇにおいて１０分間３回洗浄した。ある実験では、この粗プラーク画分 を４M尿素で２回及びＰＢＳで２回以上洗浄し、その後プロテアーゼ消化した。 ＰＢＳ洗浄沈降物をＰＢＳ及び０.１％プロテイナーゼ-Ｋ(Boehringer Mannheim )の最初のホモジェネート容量の１／１０に再懸濁し、３７℃で一晩消化させ、 ７５℃で３時間加熱不活性化した。プラーク含有沈降物画分の４ずつの５、１０ 及び２０μl分割量について、ＡＧＥ修飾ウシ血清アルブミン（ＡＧＥ−ＢＳＡ ）の標準化標品に対して競合的ＥＬＩＳＡ(Makitaら，1992，J．Biol．Chem．26 7:5133-38)を用いてＡＧＥ含量を分析した。標準曲線の直線範囲値だけを分析に 含めた。 タンパク質量を、ミクロＢＣＡキット(Pierce)及びフルオレスカミン（Bohlen ら，1973，Arch．Biochem．Biophys．155:213-220)で定量した。ＡＧＥ単位をＡ ＧＥ−ＢＳＡの標準希釈曲線から内挿し、試料のタンパク質濃度で除してmgタン パク質あたりのＡＧＥ単位を得た。スチューデントの検定を用いる統計分析は、 マッキントッシュパーソナルコンピュータ(Apple Computer，Inc.)を用いてマッ キントッシュ用StatWorksプログラムで行った。 結果 βＡＰ凝集は、核形成依存性速度論を示す。 合成βＡＰの凝集を試験管内で 分析し、可溶性βＡＰの凝集速度が主にｐＨと初期濃度に依存することが判明し た。凝集速度論を経験的に求めた。６００μM βＡＰ１〜２８は、チオフラビン −Ｔ蛍光凝集体をｐＨ７.２で数分以内に自発的に及び急速に形成した（図１） 。しかしながら、３００μMよりも低い濃度のβＡＰは非常にゆっくりと凝集し 、かなり遅れて蛍光凝集体が測定できた。 βＡＰの低濃度の測定可能な凝集の前の遅滞期間は、結晶化反応を思い出させ るものであり、タンパク質溶液は非常にゆっくりと単一コンホメーションをとり かつ明瞭な分子充填配列で凝集する(Jarrettら，1993，Biochemistry 32:4693-4 697; Jarrett & Lansbury，1993，Cell 73:1055-1058; Comeら，1993，Proc．Na tl．Acad．Sci．USA 90:5959-5963)。多くの場合のかかる凝集速度論は、前形成 凝集体又は“種子”材料を追加の凝集体形成のための核形成中心として加えるこ とにより著しく促進される。安定な“βＡＰ種子”材料を、２５０μM βＡＰ１ 〜４０を３７℃で４ヵ月間インキュベートすることにより調製した。３００μM 可溶性βＡＰ又は７５μM“βＡＰ種子”を別個に対照標品中でインキュベート した場合に測定された蛍光凝集体の少量と比べて、可溶性βＡＰ＋“βＡＰ種子 ”のコインキュベーションは大量の蛍光凝集体の累進的蓄積をもたらした（図２ ）。 ＡＧＥ修飾βＡＰ種子は、また、可溶性βＡＰを１Mグルコース／ｐＨ７.５リ ン酸塩緩衝液中３７℃で４ヵ月間インキュベートすることにより調製した(“Ａ ＧＥ−βＡＰ種子”)。ＡＧＥ形成は競合的EＬＩＳＡで確認され、“βＡＰ種子 ”は０.５ＡＧＥ単位／mgタンパク質未満を有し、“ＡＧＥ−βＡＰ種子”はＡ Ｄ脳からのプラークのＡＧＥ含量に桁の範囲内で匹敵する５０ＡＧＥ単位／mgタ ンパク質を有した（下記参照）。７５μM“ＡＧＥ−βＡＰ種子”を３００μM可 溶性βＡＰとコインキュベートした場合、修飾されていない“βＡＰ種子”と可 溶性βＡＰによる平行インキュベーションより非常に多くの蛍光凝集体を検出し た（図２）。“βＡＰ種子”についてのように、“ＡＧＥ−βＡＰ種子”単独の 別個のインキュベーションは少量の蛍光凝集体の経時変化をもたらさなかった。 この種入れ現象が生体内で典型的に見られるβＡＰ濃度で起こるかを試験する ために、凝集を測定する沈降分析を用いた。０.１M酢酸ナトリウム、ｐＨ７.０ 中可溶性¹²⁵I標識合成βＡＰ１〜４０の１０nM溶液の凝集は、２日間のインキュ ベーションで徐々に増加する（図３）。１０nM標識βＡＰを２００nM無標識“β Ａ Ｐ種子”材料とコインキュベートした場合には、沈降可能な標識の量は無種子可 溶性βＡＰのみの曲線と同じであった。対照的に、１０nM可溶性βＡＰを２００ nM“ＡＧＥ−βＡＰ種子”とコインキュベートすると、“βＡＰ種子”及び無種 子の実験項目と比べて沈降可能な標識の量が増加した。即ち、可溶性βＡＰと“ ＡＧＥ−βＡＰ種子”のコインキュベーションで認められた沈降可能な凝集体と 関連のある標識βＡＰの量は、ｐＨ及び可溶性βＡＰ濃度が生理的である条件下 に“βＡＰ種子”又は無種子とのコインキュベーションで形成されたものより大 きい。 グルコースは凝集の速度論を修飾する。 前進性グリコシル化のプロセスに おいては、グルコースとタンパク質アミノ基間のシッフ塩基の形成の次にアマド リ産物のＡＧＥ修飾βＡＰへの成熟が続く。アミノグアニジンは、タンパク質ア ミンとの最初のグルコース反応に続くＡＧＥ形成を防止する化合物である(Brown leeら，1986，Science 232:1629-1632)。０.１M酢酸ナトリウム、ｐＨ７.０中４ ００μM βＡＰ１〜２８と１００mMグルコースとのコインキュベーションは、可 溶性βＡＰ、可溶性βＡＰ＋ＡＧ又は可溶性βＡＰ＋ＡＧ＋グルコースの平行イ ンキュベーションと比べた場合、蛍光凝集体形成を促進する（図４）。グルコー ス又はＡＧを別個にインキュベートすると、検出可能な蛍光シグナルは生じなか った。 脳画分のＡＧＥ含量。 平均して、１０のＡＤ脳の前頭葉前方皮質の試料か ら単離したプラークを多く含んだ画分は、７の健康な対照からの対応する標品よ りＡＧＥ修飾を著しく有した（８.９±１.４対２.７±０.５ＡＧＥ単位／mgタン パク質、ｐ＝０.００２、図５参照）。ＡＤ及び対照グループの年代順平均年齢 は７７歳であった。ＡＤと正常な脳からの同じ頭頂皮質画分中にもＡＧＥの存在 が認められた（データは示さず）。ＡＤ及び対照脳からのＳＤＳ可溶性タンパク 質の上清画分は、通常、０.１ＡＧＥ単位／mgタンパク質未満を有した。 検討 前進性グリコシル化付加物は生体内で自然に形成するが、その蓄積は緩慢であ りかつ長命組織成分上で時間が経つにつれて最も顕著になる。時間及び感受性の あるタンパク質アミノ基の利用可能性と共に、周囲のグルコースはＡＧＥ形成の 主要な決定因子である。即ち、標準化血糖条件下の単一タンパク質種のＡＧＥ修 飾度の定量的分析により、生体内タンパク質半減期指数が得られる。ＡＤ脳試料 から単離したプラークを多く含んだ画分が年齢の釣り合った対照脳から調製され た匹敵しうる画分より約３倍多くＡＧＥ修飾を含むことが判明し、βＡＰ半減期 がＡＤにおいて延長されることが示される。ＡＤにおいて長時間半減期を示すそ のアミロイド成分は、また、ＡＤ脳から単離されたβＡＰの位置１及び７で生じ るアスパルチル残基の時間依存性非酵素的異性化を証明した実験により支持され る(Roherら，1993，J．Biol．Chem．268:3072-3083)が、後者のこの実験は正常 な対照を含まなかった。 ＡＤは、進行性痴呆及び健康な年齢の釣り合った対照に比べてアミロイドプラ ーク数及び量の増加を特徴とする。進行した痴呆とプラーク数間の原因となる関 係はわかっていないが、漸進的な症状の発症はβ−アミロイドの進行的沈着に平 行すると考えられる。試験管内実験から、可溶性βＡＰのミリモル濃度は核形成 依存機序に従って原線維アミロイド構造に自然に凝集することは明らかである。 低濃度における核形成は実質的な遅滞期間の導入が必要であり、凝集核を形成す るためにこの時間のほとんどをなお必要とするβＡＰ溶液は“１次元結晶”に急 速に凝集及び成長しようとしているものと区別できない(Jarrett & Lansbury，1 993，Cell 73:1055-1058)。この濃度依存性核形成の影響は、可溶性βＡＰ濃度 を６倍に高める家族性ＡＤのスウェーデン型のＡＰＰ突然変異を示す発表された 計算(Caiら，1992，Science 259:514-516; Citronら，1992，Nature 360:672-67 4）が凝集体成長が起こる前の遅滞時間を１００年から約３時間に減じる(Jarret tら，1993，Biochem．32:4693-4697)ことに示されるように極端である。ＡＤ患 者における可溶性βＡＰの脳脊髄液濃度が年齢の釣り合った対照と同じであるの で（Oosawaら，1993，Soc．Neurosci．Abs．19:1038; Shojiら，1992，Science 258:126，129）、アミロイドの形成及び沈着量によって反映されるように核の濃 度依存性自己形成速度も同じであると予想される。この後者の類似性が認められ ずかつＡＤ脳が罹患していない相対物より実質的に多くの凝集βＡＰの沈着物を 形成するので、罹患脳組織内に存在するアミロイドの増加量は健康な脳実質に生 じるより効率のよい核形成凝集に少なくとも一部起因することが考えら れる。 本発明の操作及び発見を明らかにするためであるが、この説明によって特定の 理論又は仮説に限定されるものではなく、核形成種子はβＡＰの構造として不溶 性βＡＰ凝集体の成長をもたらす追加の可溶性βＡＰの急速な付着を促進する特 定のホンホメーションを有することが考えられる。核の自然形成は熱力学的に好 ましくないので（前記、Jarrettら，1993）、生体内でタンパク質を化学的に架 橋することが既知のプロセスは核形成特性を有するβＡＰの特定のコンホメーシ ョンを安定化するように働く。前進性グリコシル化は、細胞外で容易に起こるタ ンパク質の共有後翻訳修飾の天然に存在するプロセスである。他の組合わせにお けるＡＧＥは、生体内及び試験管内タンパク質−タンパク質架橋剤として周知で あり、マトリックスタンパク質上のＡＧＥ蓄積はタンパク質分解に対する高い抵 抗と関連がある（Bucalaら，1992，Post-Translational Modifications of Prot eins，Hardingら，Eds.,CRC Press，Boca Raton 2:53-79)。 試験管内生理的濃度及びｐＨにおいて、βＡＰ凝集体はゆっくりと凝集する。 ＡＧＥ修飾βＡＰの前形成凝集体を添加すると、修飾されていないβＡＰの前形 成凝集体の２日間インキュベーションより可溶性βＡＰのnM溶液の著しく急速な 凝集が促進されることは周知である。正常なｐＨ、可溶性βＡＰの生理的濃度及 びＡＤプラーク画分に見られるものに匹敵するＡＧＥ修飾の量を含有する種子で この促進が生じたことは、同様のプロセスが生体内で起こることを示している。 グリケーション付加物は、種々の転位、縮合及び脱離反応によって化学的にゆ っくりと発生する産物の構造上不均一なファミリーを含んでいる。核形成を高め る特定のＡＧＥ種は未知のままであるが、これらはグルコースがグルコース及び アミノグアニジン、ＡＧＥ形成の特定のインヒビターの存在下の凝集と比べて蛍 光βＡＰ凝集体形成の速度を促進した経過によって明らかなように、比較的初期 のグリコシル化産物であることができる。プラーク数がＡＤにおける神経の退行 変性及び認知低下と関連して増加しかつ凝集されているが可溶性でないβＡＰが 能動的に神経毒性であることを認識すること（Pikeら，1991，Eur．J．Pharm．2 07:367-368; Pikeら，1993，J．Neuroscience 13:1676-1687）、ＡＧＥ形成がβ ＡＰ凝集を促進するプロセスを妨害することは、ＡＤと関連のある病理生理学 的変化を減じる新規な治療を与えることができる。 実施例２：ＡＧＥ及びプリオンタンパク質の共局在化 ハムスターにハムスター適応マウススクラピー種を脳内注射することにより感 染させた。３００日後、ハムスターを犠牲にし、脳の切片を作り、その切片を顕 微鏡スライド上に固定した。その固定した切片を７０％ギ酸で１０分間処理し、 洗浄した。次に、スライドをＲＮａｓｅに特異的なウサギ抗血清（対照抗血清） 、プリオンタンパク質（ＰｒＰ; Kascsakら，1987，J．Virol．61:3688-93）及 びＡＧＥ（抗ＡＧＥ−ＲＮａｓｅ抗血清、Makitaら，1992，J．Biol．Chem．267 :5133-38に記載されている）と反応させた。各血清を１：５００に希釈した後に 組織試料とインキュベートした。反応液を４℃で一晩インキュベートした。ウサ ギ抗血清と反応させた後、その試料をＰＢＳで洗浄し、アルカリ性ホスファター ゼ（ＡＰ）結合抗ウサギ抗体と反応させた。この試料を、赤色を生じるフスシン ＡＰ基質(Dako)で現像した。 この実験の結果を図６に示す。組織学的スライドは、抗ＰｒＰ抗血清で同定さ れたＰｒＰ関連プラークの領域を示す（図６Ｂ）。ＰｒＰは、病原体として作用 しかつ罹患被検者におけるアミロイド沈着と関連のある精製スクラピータンパク 質である。ＡＧＥ−ＲＮａｓｅに対して作成した抗ＡＧＥ抗血清は、また、アミ ロイドプラークを装飾した。対照抗血清（抗ＲＮａｓｅ）は、組織学的試料と反 応しなかった。 これらの結果は、ＡＧＥが海綿様脳症に特有のアミロイドプラークに存在する ことを示している。スクラピーアミロイドプラークが形成するにつれて、抗体に よって検出可能なＡＧＥ修飾を得る。スクラピーアミロイドプラークのＡＧＥ修 飾は、可溶性ＰｒＰ又はアミロイドプラーク自体のＡＧＥ修飾を介して又は両方 の機序によって生じることができる。 実施例３：ＡＧＥ修飾チオフラビン ＡＧＥ−チオフラビンＡ、３ ２−（４−アミノフェニル）−６−メチルベンゾチアゾール（０.４８ｇ、Ald rich Chemical社）をビス（トリクロロメチル）カーボネート（０.２２ｇ）とキ シレン（１０ml）中で混合し、その混合液を３時間加熱還流することにより、 ２−（４−[([(６−アミノヘキシル)アミノ]カルボニル)アミノ]フェニル）−６ −メチルベンゾタゾール、１を調製した。透明でない橙色の上清を不溶性物質か ら傾瀉し、冷却し、２−（４−イソシアナトフェニル）−６−メチルベンゾチア ゾールの橙色懸濁液を得た。この懸濁液にジクロロメタン（１０ml）中６−（ｔ −ブトキシカルボニルアミノ）−１−ヘキシルアミン（０.４０g）を加えた。こ の混合液を室温（ＲＴ）で２時間攪拌し、淡黄色懸濁液を生成した。この懸濁液 をろ過し、固形物をジクロロメタン及びｔ−ブチルメチルエーテルで洗浄して１ をオフホワイトの粉末として得た、m.p.１６４〜１６５℃。この物質（３００mg ）を３mlの１：１トリフルオロ酢酸：ジクロロメタンに溶解し、室温で４時間攪 拌した。溶媒を除去し、固形物を水性０.１N ＮａＯＨとジクロロメタンに分配 した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮した。残留物をｔ−ブチ ルメチルエーテルで摩砕し、ろ過して０.１９７ｇの１を白色粉末として得た、m .p.３２０℃。 １（０.１９６ｇ）と２,３：４,５−ビス−Ｏ−（１−メチルエチリデン）ア ルデヒド−β−アラビノ−ヘキソス−２−ウロ−２,６−ピラノース（０.３０ｇ 、1987，Carbohydrate Research 167:123-130参照）を８：１のメタノール：水 （４.５ml）に溶解し、その混合液をナトリウムシアノボロヒドリド（０.０６３ ｇ）及び酢酸（０.０４０ml）で処理することにより、（４−[([(６−[(１−デ オキシ−２,４：４,５−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−β−Ｄ−フルクトピラノス −１−イル)アミノ]ヘキシル)アミノ]カルボニル)アミノ]フェニル）−６−メチ ルベンゾタゾール、２を調製した。得られた溶液をオープンフラスコ中７０℃で ６時間攪拌した。冷却時に白色固形物が分離した。ろ過して０.２７６ｇの２を 白色固形物として得た、m.p.１４４−１４６℃。 ２（０.１０g）を１,４−ジオキサン（４ml）に溶解し、その溶液を水（４ml ）及び濃塩酸（０.５ml）で室温で２４時間攪拌しながら処理することにより、 （４−[([(６−[(１−デオキシ−β−Ｄ−フルクトピラノス−１−イル)アミノ] ヘキシル)アミノ]カルボニル)アミノ]フェニル）−６−メチルベンゾチアゾール 、３を調製した。次に、その黄色溶液にトリエチルアミン（１ml）を加え、濁っ た無色の混合液を得、これを摩砕し、４０℃で貯蔵した。得られた白色粉末沈殿 をろ別し、２,３−モノアセトニドとして確認した。このモノアセトニド（０.０ ２５g）を１.１mlの１.２N ＨＣｌに溶解し、５５℃で２４時間攪拌した。固体 のＮａＨＣＯ₃を黄色が消失するまで加えた。ジクロロメタン（１ml）を加え、 混合液を白色粉末が分離するまで攪拌した。ろ過して１５mgの３を得た。 ＡＧＥ−チオフラビンＢ、８ ２−（４−アミノフェニル）−６−メチルベンゾチアゾール（０.１３９ｇ） 及びＮ−（４−ブロモブチル）フタルイミド（０.０８２ｇ）をジメチルホルア ミド（ＤＭＦ、５ml）に溶解し、窒素下で４時間加熱還流することにより、２− ［４−（４−フタルイミドブチル）アミノフェニル］−６−メチルベンゾチアゾ ール、４を調製した。この溶液を冷却し、５mlの水で処理した。黄色の沈殿をろ 別し、ジクロロメタンから再結晶して０.０９０ｇの４を得た、m.p.１６９−１ ７０℃。 ４（０.２０ｇ）をヒドラジン水和物（０.１５ml）とエタノール（２０ml）中 ６０℃で４時間加熱することにより、２−［４−（４−アミノブチル）アミノフ ェニル］−６−メチルベンゾチアゾール、５を調製した。塩酸（１ml）を加え、 この溶液を１時間加熱還流した。冷却後、フタルヒドラジドをろ別し、ろ液を濃 縮し、水で希釈し、ＮａＨＣＯ₃で中和した。沈殿をろ過し、乾燥して５を定量 的収量で得た、m.p.１３７−１３８℃。 ５及び２,３：４,５−ビス−Ｏ−（１−メチルエチリジン）アルデヒド−β− Ｄ−アラビノ−ヘキソス−２−ウロ−２,６−ピラノース（１.０ｇ）をメタノー ル中で３時間還流することにより、（４[(４−[(１−デオキシ−２,３：４,５− ジ−Ｏ−イソプロピリデン−β−Ｄ−フルクトピラノス−１−イル)アミノ]ブチ ル)アミノ]フェニル）−６−メチルベンゾチアゾール、６を調製した。この溶液 を冷却し、ナトリウムシアノボロヒドリド（０.１１ｇ）を加えた。次に、この 混合液を２時間還流した。冷却後、溶媒を蒸発し、残留物を水とジクロロメタン に分配した。有機層を水洗し、硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発した。残留物をジ クロロメタン中２０％酢酸エチルを用いてシリカゲルによりクロマトグラフィー 処理した。生成物画分をゴム状物に濃縮し、メタノールで摩砕することにより結 晶化 した。ろ過して０.４４５ｇの６を白色固形物として得た、m.p.１２９℃。 ７（０.０２５ｇ）を１.３ml濃塩酸を含む８mlの１：１メタノール／水に溶解 し、窒素下室温で２４時間攪拌することにより、（４−［Ｎ−（４−［Ｎ−（１ −デオキシ−β−Ｄ−フルクトピラノス−１−イル）アミノ］ブチル）アミノ］ フェニル）−６−メチルベンゾチアゾールクロリド、６ａを調製した。この溶液 を水性ＮａＨＣＯ₃で中和し、２mlに濃縮し、ろ過して沈殿した塩を除去し、水 中７０〜１００％メタノールの勾配を用いて分取用Ｃ−１８逆相シリカゲルカラ ムによるＨＰＬＣで精製した。化合物６ａを保持時間２３.１分のピークに集め た。プロトンNMR（CD₃OD）δ1.66(br，CH₂CH₂CH₂NHCH₂)，2.46(s，CH₃Ar)，2.68 (m，CH₂CH₂NHCH₂)，約2.84(2d，CH₂CH₂NHCH₂)，3.8(t，ArNHCH₂)，3.55-4.05(い くつかのm，5H,炭水化物C3-C6プロトン)，6.70（d，２アリールH NHに対してオ ルト)，7.28（d，ベンゾチアゾールC5-H)，7.71（s,ベンゾチアゾールC7-H)，7. 76（d,ベンゾチアゾールC4-H)，7.80（d，2アリールH NHに対してメタ）。 ６（０.０２０ｇ）をＫＨＣＯ₃(８mg)含有アセトン（２ml）に溶解し、この溶 液をヨウ化メチル（０.２００ml）で室温において一晩処理することにより、（ ４−「Ｎ−（４−「Ｎ−（１−デオキシ−２,３：４,５−ジ−Ｏ−イソプロピリ デン −β−Ｄ−フルクトピラノス−１−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニオ］ブチ ル）アミノ］フェニル）−６−メチルベンゾチアゾールヨーダイド、７を調製し た。この混合液をろ過し、ろ液を蒸発して７を黄色固形物として定量的収量で得 た。ジクロロメタン／エーテルから再結晶して黄色結晶を得た、m.P.１４２℃。 ７（０.０５０ｇ）を３.５ml濃塩酸含有２０mlの１：１メタノール／水に溶解 し、窒素下５０℃で１８時間加熱することにより、（４−［Ｎ−（４−［Ｎ−（ １−デオキシ−β−Ｄ−フルクトピラノス−１−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアン モニオ］ブチル）アミノ］フェニル）−６−メチルベンゾチアゾールクロリド、 ８を調製した。この溶液を水性ＮａＨＣＯ₃で中和し、５mlに濃縮し、ろ過して 沈殿した塩を除去した。このうち２mlを水中７０〜１００％メタノールの勾配を 用いて分取用Ｃ−１８逆相シリカゲルカラムによるＨＰＬＣで精製した。化合物 ８を保持時間１３.５分のピークに集めた。プロトンNMR δ 1.72(m，CH₂CH₂CH₂N HCH₂),1.95(m，CH₂CH₂NHCH₂)，2.46(s，CH₃Ar)， 約3.34(s，-N⁺(CH₃)₂-)，3.4 -4.1 (いくつかのm，9H,炭水化物C3-C6プロトン及びCH₂NCH₂)，6.70（d，2アリ ールH NHに対してオルト)，7.28(d，ベンゾチアゾールC5-H)，7.71(s，ベンゾチ アゾールC7-H)，7.76(d，ベンゾチアゾールC4-H)，7.80(d，２アリールH NHに対 してメタ）。 実施例４：チオフラビン−Ｔアマドリ産物はアミロイドを結合する 本実施例は、アマドリ産物が結合したチオフラビン−Ｔが試験管内でβ−アミ ロイドと共沈することを示すものである。この所見は、アミロイド沈着物を標的 にするチオフラビン−Ｔにアマドリ産物又はＡＧＥを結合する実行可能性を示す ものである。 前記化合物８の標品を本分析に用いた。可溶性β−アミロイドペプチドは、リ ン酸塩緩衝液、化合物８又はジチオニトロベンゼン及び前記実施例１に記載され た種々の化合物の存在下に凝集した。ジチオニトロベンゼンを含む試料は、発色 団小分子と沈殿β−アミロイドペプチドとの非特異的結合の対照である。更に、 リン酸塩緩衝液と種々の化合物を含むが、β−アミロイドペプチドを欠く対照試 料を調製した。一晩インキュベートした後、試験管を１５,０００×ｇで３０分 間遠心し、上清の１／２を除去し、キュベットに加え、２００〜６００nmから上 清の吸収スペクトルを得た。凝集分析インキュベーションの化合物８と凝集沈降 性β−アミロイド成分間の結合のないときの約３５０nmに最大吸光度を有する化 合物８は上清に残っており、その存在及び濃度を容易に求めることができる。ま た、化合物８と沈殿β−アミロイドペプチドとの結合は３５０nmにおける吸光度 の低下をもたらす。即ち、３５０nmにおける吸光度の低下は、化合物８が前記実 施例１に示されるこれらの条件下で遠心中に沈降する原線維β−アミロイドに結 合することを示している。対照の試験管では、その化合物が可溶性のままである ので吸光度の低下は予想されない。 図７Ａは，溶液中に存在する原線維β−アミロイドペプチドが沈降すると沈降 前の吸光度（図７Ｂ）に比べて化合物８を含む上清液の３５０nmにおける吸光度 が低下することを示している。対照的に、凝集したβ−アミロイドペプチド沈着 物に結合することが報告されていないジチオニトロベンゼンの吸光度は対照に比 べてβ−アミロイドペプチド試料の上清が低下しない（図７C--沈降物形成--図 ７Ｄ--沈降物の形成なしと比較）。これらのデータは、化合物８が不溶性凝集β −アミロイドペプチド沈降物と特異的に結合すことを示している。 実施例５：II型糖尿病におけるＡＧＥ−アミロイド II型糖尿病は、膵臓において凝集したアミリンペプチドの沈着物を特徴とする 。 試験管内インキュベーション中の濃度依存性遅滞期間後、合成アミリンの可溶性 標品は天然アミロイドに似ている原線維凝集体を徐々に形成し(Lorenzoら，1994 ,Nature 368:756-760）、電子顕微鏡又は偏光によるコンゴレッド複屈折で測定 可能である(Fraserら，1991，Biophys．J．90:1194-1201)。これらの試験管内分 析において可溶性アミリンの凝集は、少量の前凝集アミリン“種子”材料を加え ることにより高められることが予想される。これらの種子は、また、タンパク質 を化学的に架橋する前進性グリコシル化終末産物（ＡＧＥ）の形成をもたらすグ ルコースとタンパク質アミノ基間の天然に存在する反応を用いて調製した。ＡＧ Ｅ修飾アミリン核形成種子は、非修飾“種子”材料に比べて可溶性アミリンの凝 集を更に促進すると予想される。時間が経つにつれて、アミリンのリシン−１で 起こると考えられかつアルギニン−１０で起こることができる非酵素的前進性グ リコシル化により、生体内長命タンパク質に一組の後翻訳共有結合付加物が徐々 に蓄積される。標準化競合的ＥＬＩＳＡ分析を用いて、II型膵島細胞のプラーク 画分は健康な年齢の釣り合った対照からの類似標品に見られるものよりタンパク 質１ｇあたり多くのＡＧＥ付加物を含むことが見られると予想される。これらの 結果は、アミリンの生体内半減期がII型糖尿病で延長され、ＡＧＥ修飾の多くの 蓄積をきたし、追加のアミロイドの蓄積を促進するように作用することができる ことを示している。 材料及び方法 凝集及び種入れ反応。 ３７アミノ酸ヒト又はネコ島アミロイドポリペプチド 又はアミリンを表す合成ＨＰＬＣ精製ペプチドは、合成で得られるか又はBachem （トーランス、カリフォルニア）又はPeninsula Laboratories等から市販で入手 される。ミリモル未満のアミリン濃度による定量的凝集体形成は、LeVine(1992, Protein Science 2:404-410)の方法を用いて検出される。簡単に言えば、１０μ Mチオフラビン−Ｔ(Aldrich)/５０mMリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６.０に加えた 凝集体の蛍光をPerkin Elmer LS-50B分光蛍光計で４５０±５nmの励起及び４８ ２±１０nmの発光検出により測定される。また、偏光下でのコンゴレッド複屈折 は、凝集を検出するために用いられる（前記Fraserら）。少量の前形成凝集体又 は“核形成種子”を可溶性アミリンに加え、凝集を例えば、０.１M酢酸ナトリ ウムで開始する。 “種子”の生成。 可溶性アミリン（２５０μM)及び０.２Mリン酸ナトリウム 緩衝液、ｐＨ７.５と１Mグルコースを存在させて又はさせずに３７℃でインキュ ベートして各々“ＡＧＥ−アミリン種子”又は“アミリン種子”と呼ばれるＡＧ Ｅ−アミリンの前形成凝集体を生成する。インキュベーション後、種子標品のタ ンパク質濃度を測定し、緩衝液で１５０μM最終濃度に調整する。競合的ＥＬＩ ＳＡ（前記Makitaら）を用いて、ＡＧＥ−アミリン種子及びアミリン種子のＡＧ Ｅ含量が求められる。また、ある実験では酢酸ナトリウムの前に、グルコース及 び／又はアミノグアニジン、前進性グリケーション及び架橋形成の強力なインヒ ビター(Brownleeら，1986，Science 232:1629-1632)をアミリンの溶液に加えて これらのＡＧＥインヒビターが種子の形成を阻害するかを評価する。 低（生理的）濃度のアミリンの凝集は、Burdickら(1992，J．Biol．Chem．267 :546-554)の方法で定量される。アミリンの合成標品を¹²⁵Ｉ(NEN)及びクロラミ ン−Ｔ(Sigma)で１分間標識した後、反応物を１０mMチロシン及びメタ重亜硫酸 ナトリウムで急冷した。取込まれない標識を、０.５×リン酸塩食塩水（ＰＢＳ ）緩衝食塩水、ｐＨ７.４で平衡化したSEPHADEX G-10カラムでろ過することによ り除去する。¹²⁵I標識アミリンを、直ちに指示濃度の種々の“種子”、グルコー ス及び／又はアミノグアニジンの存在下に５nM最終濃度まで希釈する。３７℃で いろいろな時間インキュベートした後、凝集反応物の下にインキュベーション混 合物と同じｐＨの２０％スクロース／０.１M酢酸ナトリウムをしき、５０,００ ０×ｇで３０分間遠心し、液体窒素で凍結する。各ミクロフュージ管を切断し、 スクロースクッションを介して沈降した凝集沈降性画分を表す底の５mmをγカウ ンターで計数する。管と液体の残りも計数する。形成した凝集体量を％＝（沈降 物中のカウント数／管（沈降物＋残り）あたりの合計カウント数）×１００とし て算出する。 競合的ＥＬＩＳＡによるＡＧＥの測定。 II型糖尿病に罹った及び罹っていな い患者からのアミロイド原線維を含む膵臓の分割量を、２％ドデシル硫酸ナトリ ウム（ＳＤＳ）／０.１M β−メルカプトエタノール（ＭＥ）に懸濁し、ダウン スホモジェナイズする。ホモジェネートを１０分間煮沸し、次に１０,０００× ｇで １０分間遠心する。上清を吸引し、得られた沈降物をＰＢＳで３回１０,０００ ×ｇで１０分間洗浄する。この粗プラーク画分は更に４M尿素で２回及びＰＢＳ で２回以上洗浄され、その後プロテアーゼ消化される。ＰＢＳ洗浄沈降物をＰＢ Ｓ及びプロテアーゼ-Ｋ(Boehringer Mannheim)に懸濁し、３７℃で一晩消化し、 ７５℃で３時間加熱不活性化する。種々の量のプラーク含有沈降物画分の４重の 分割量について、ＡＧＥ修飾ウシ血清アルブミン（ＡＧＥ−ＢＳＡ）の標準化標 品に対する競合的ＥＬＩＳＡ（Makitaら，1992，J．Biol．Chem．267:5133-38） を用いてＡＧＥ含量を分析する。標準曲線の直線範囲値のみ分析物に含めなけれ ばならない。 また、組織試料又はアミロイド原線維抽出物は(Westermarkら，1986，Biochem ．Biophys．Res．Commun．140:827-831; Westermarkら，1987，Proc．Natl．Aca d．Sci．USA 84:3881-85; Westermarkら，1987，Am．J．Physiol．127:414-417; Cooperら，1987，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:8628-32)に記載されている ように調製される。 タンパク質量は、ミクロＢＣＡキット及びフルオレスカミンを用いて定量され る(Bohlenら，1973，Arch．Biochem．Biophys．155:213-220)。ＡＧＥ単位は、 ＡＧＥ−ＢＳＡの標準希釈曲線から内挿され、試料タンパク質濃度で除してタン パク質１mMあたりのＡＧＥ単位を得る。スチューデントの検定を用いる統計分析 は、マッキントッシュパーソナルコンピュータ(Apple Computer Inc.)を用いて マッキントッシュ用StatWorksプログラムで行われる。 結果 本実験は、ＡＧＥ修飾アミリンを含むＡＧＥ−アミロイド種子がアミリン凝集 速度を高めることを示すことが予想される。同様に、可溶性ＡＧＥ−アミリンは 、可溶性アミリンより容易に凝集することが予想される。これらの結果は、アル ツハイマー病におけるβＡＰ凝集について前記実施例１で述べたように、アミリ ンのＡＧＥ修飾がII型糖尿病と関連のある病原性アミロイドーシスに役割を果た していることを示すであろう。 本発明は、その真意又は本質的な特性から逸脱することなく他の形態で具体的 に示されるか又は他の方法で実施される。従って、本発明の開示は、全ての点で 例示としてみなされるべきであり、限定としてみなされるべきでなく、本発明の 範囲は下記請求の範囲によって示され、等価物の意味及び範囲内に入る全ての変 化がこの中に包含されるものである。 本明細書の中に種々の文献が引用されており、各々の全てを参考として本明細 書に引用する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 31/72 ＡＡＭ 9284−4Ｃ Ａ６１Ｋ 31/72 ＡＡＭ 38/00 9284−4Ｃ 39/395 ＡＥＤＤ 38/16 8615−4Ｃ 45/00 ＡＢＮ 39/395 ＡＥＤ 8615−4Ｃ Ｃ０７Ｈ 15/26 45/00 ＡＢＮ 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/68 Ｃ０７Ｈ 15/26 9283−4Ｃ Ｃ０７Ｄ 277/82 Ｇ０１Ｎ 33/68 9053−4Ｃ 417/12 ２０９ // Ｃ０７Ｄ 277/82 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 417/12 ２０９ 9051−4Ｃ 37/04 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ， ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，Ｅ Ｅ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 セラミ アントニー アメリカ合衆国 ニューヨーク州 11964 シェルター アイランド ラム アイラ ンド ドライヴ （番地なし) (72)発明者 ブカラ リチャード ジェイ アメリカ合衆国 ニューヨーク州 10021 ニューヨーク イースト シックスティ サード ストリート 504 アパートメン ト 33−オー (72)発明者 ウルリッチ ピーター シー アメリカ合衆国 ニュージャージー州 07675 オールド ターパン デウォルフ ロード 148 (72)発明者 ヴラッサラ ヘレン アメリカ合衆国 ニューヨーク州 11964 シェルター アイランド ラム アイラ ンド ドライヴ （番地なし) (72)発明者 ツァン シーニ アメリカ合衆国 ニューヨーク州 11753 ジェリコ フェアヘヴン ドライヴ 150 アパートメント ディー１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．哺乳動物においてアミロイドポリペプチド仲介アミロイドーシスをモジュレ ートする方法であって、哺乳動物に前記哺乳動物において前進性グリコシル化終 末産物（ＡＧＥ）−アミロイドポリペプチドの形成を制御することができる物質 の前記哺乳動物においてＡＧＥ−アミロイドポリペプチド仲介アミロイドーシス をモジュレートするのに有効な量を投与することを特徴とする方法。 ２．前記物質が前記ＡＧＥの形成及び蓄積を阻害することができる請求項１記載 の方法。 ３．前記ＡＧＥ−アミロイドポリペプチドがＡＧＥ−β−アミロイドペプチド（ βＡＰ）又はＡＧＥ−アミリンを含む請求項１又は２記載の方法。 ４．前記ＡＧＥ−βＡＰがβＡＰ又はアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）か ら形成される請求項３記載の方法。 ５．前記ＡＧＥ−アミリンがアミリンから形成される請求項３記載の方法。 ６．神経変性疾患の予防又は治療方法を含む請求項２記載の方法。 ７．該神経変性疾患が、アルツハイマー病、アミロイドーシスオランダ型を伴う 遺伝性脳出血、散在性脳アミロイドアンギオパチー、遺伝性脳アミロイドアンギ オパチー、ダウン症候群、グァムのパーキンソン・痴呆及び無症候性アミロイド アンギオパチー、海綿様脳症、スクラピー、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲル ストマン・ストレウスラー症候群及びクールーからなる群より選ばれる請求項６ 記載の方法。 ８．該神経変性疾患がアルツハイマー病である請求項６記載の方法。 ９．II型糖尿病の予防又は治療方法を含む請求項２記載の方法。 10．前記物質が、前進性グリコシル化終末産物に対する抗体、前進性グリコシル 化終末産物を結合又は中和することができるリガンド、前進性グリコシル化終末 産物に対するレセプター及び前進性グリコシル化終末産物の形成を阻害すること ができる化合物からなる群より選ばれる請求項１記載の方法。 11．前進性グリコシル化終末産物の形成を阻害することができる前記化合物が、 初期グリコシル化産物の活性カルボニル部分と反応することができる請求項10記 載の方法。 12．前記化合物が、アミノグアニジン、α−ヒドラジノヒスチジン、リシン、ア ミノグアニジンの類縁体及びその混合物からなる群より選ばれる請求項11記載の 方法。 13．前記類縁体が下記式のヒドラジン誘導体及びその薬学的に許容しうる酸付加 塩からなる群より選ばれる請求項12記載の方法。 （式中、Ｒは下記式の基であり、 Ｒ₁は水素又は炭素原子１〜６個を有する低級アルキル基、ヒドロキシエチル 基であるか又はＲ₂と一緒に炭素原子２〜４個を有する低級アルキレン橋であっ てもよい；Ｒ₂は水素又は炭素原子１〜６個を有する低級アルキル基であるか又 はＲ₁又はＲ₃と一緒に炭素原子２〜４個を有するアルキレン橋、アミノ基、ヒド ロキシ基又は下記式を有するアミノアルキレン基である、 式中、ｎは２〜７の整数であり、Ｒ₅及びＲ₇は独立して炭素原子１〜６個を有 する低級アルキル基であるか又は一緒にヘテロ原子１〜２個、そのうちの少なく とも１個が窒素である、を含むシクロアルキル環又は複素環の一部を形成する； 及び前記ヘテロ原子の２番目は窒素、酸素及びイオウからなる群より選ばれる； 但し、該複素環の前記ヘテロ原子の２番目が窒素でありかつピペラジン環を形成 する場合には、該ピペラジン環の第１窒素上にその化合物の部分と同じである置 換基によって任意に置換されていてもよい；Ｒ₃は水素、炭素原子１〜６個を有 する低級アルキル基であるか又はＲ₂又はＲ₄と一緒に炭素原 子２〜４個を有する低級アルキレン橋である；Ｒ₄は水素、炭素原子１〜６個を 有する低級アルキル基であるか又はＲ₃と一緒に炭素原子２〜４個を有する低級 アルキレン橋又はアミノ基である；Ｒ₅は水素又は炭素原子１〜６個を有する低 級アルキル基である；但し、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄又はＲ₅の少なくとも１つは水 素以外である；又はＲはアシル基又は炭素原子１０個までの低級アルキルスルホ ニル基であり、Ｒ₁は水素である。） 14．前進性グリコシル化終末産物の形成を阻害することができる前記化合物が血 液脳関門を横切ることができる請求項13記載の方法。 15．前記化合物が脳室内、頭蓋内、腹腔内、静脈内又は経口的に投与される請求 項12又は13記載の方法。 16．前記化合物が静脈内、動脈内、経口又は経鼻経路により投与される請求項14 記載の化合物。 17．哺乳動物膵臓におけるＡＧＥ−アミリン仲介アミロイドーシスの予防方法で あって、ＡＧＥ−アミリン仲介アミロイドーシスの疑いのある哺乳動物に前記哺 乳動物においてＡＧＥ−アミリンの形成を阻害することができる物質の前記哺乳 動物においてＡＧＥ−アミリンアミロイドの形成を阻害するのに有効な量を投与 することを特徴とする方法。 18．該アミロイドーシスがII型糖尿病と関連のある請求項17記載の方法。 19．前記物質が、前進性グリコシル化終末産物に対する抗体、前進性グリコシル 化終末産物を結合又は中和することができるリガンド、前進性グリコシル化終末 産物に対するレセプター及び前進性グリコシル化終末産物の形成を阻害すること ができる化合物からなる群より選ばれる請求項17記載の方法。 20．前進性グリコシル化終末産物の形成を阻害することができる前記化合物が、 初期グリコシル化産物の活性カルボニル部分と反応することができる請求項19記 載の方法。 21．前記化合物が、アミノグアニジン、α−ヒドラジノヒスチジン、リシン、ア ミノグアニジンの類縁体及びその混合物からなる群より選ばれる請求項20記載の 方法。 22．前記類縁体が下記式のヒドラジン誘導体及びその薬学的に許容しうる酸付加 塩からなる群より選ばれる請求項21記載の方法。 （式中、Ｒは下記式の基であり、 Ｒ₁は水素又は炭素原子１〜６個を有する低級アルキル基、ヒドロキシエチル 基であるか又はＲ₂と一緒に炭素原子２〜４個を有する低級アルキレン橋であっ てもよい；Ｒ₂は水素又は炭素原子１〜６個を有する低級アルキル基であるか又 はＲ₁又はＲ₃と一緒に炭素原子２〜４個を有するアルキレン橋、アミノ基、ヒド ロキシ基又は下記式を有するアミノアルキレン基である、 式中、ｎは２〜７の整数であり、Ｒ₆及びＲ₇は独立して炭素原子１〜６個を有 する低級アルキル基であるか又は一緒にヘテロ原子１〜２個、そのうちの少なく とも１個が窒素である、を含むシクロアルキル環又は複素環の一部を形成する； 及び前記ヘテロ原子の２番目は窒素、酸素及びイオウからなる群より選ばれる； 但し、該複素環の前記ヘテロ原子の２番目が窒素でありかつピペラジン環を形成 する場合には、該ピペラジン環の第１窒素上にその化合物の部分と同じである置 換基によって任意に置換されていてもよい；Ｒ₃は水素、炭素原子１〜６個を有 する低級アルキル基であるか又はＲ₂又はＲ₄と一緒に炭素原子２〜４個を有する 低級アルキレン橋である；Ｒ₄は水素、炭素原子１〜６個を有する低級アルキル 基であるか又はＲ₃と一緒に炭素原子２〜４個を有する低級アルキレン橋又はア ミノ基である；Ｒ₅は水素又は炭素原子１〜６個を有する低級アルキル基である ；但し、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄又はＲ₅の少なく とも１つは水素以外である；又はＲはアシル基又は炭素原子１０個までの低級ア ルキルスルホニル基であり、Ｒ₁は水素である。） 23．前記化合物が静脈内、腹腔内、経鼻的又は経口的に投与される請求項22記載 方法。 24．哺乳動物におけるアミロイドーシスの過程及び程度を推定する方法であって 、前記哺乳動物からの生物試料中のＡＧＥ−アミロイドポリペプチドの存在及び 量を測定することを特徴とする方法。 25．該生物試料が、血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）及び腹腔液から なる群より選ばれる請求項24記載の方法。 26．該ＡＧＥ−アミロイドポリペプチドがＡＧＥ−βＡＰ、ＡＧＥ−アミリン又 はＡＧＥ−血清アミロイドＡを含む請求項25記載の方法。 27．前記ＡＧＥ−アミロイドポリペプチドが試験管内手順によって測定される請 求項24記載の方法。 28．ａ．前記ＡＧＥ−アミロイドポリペプチドが存在する疑いのある前記哺乳動 物から採取された生物試料と該ＡＧＥ−アミロイドポリペプチドに対する結合パ トナーとを結合を生じる条件下で接触させる工程； ｂ．前記試料を前記結合パートナーと前記結合パートナーが前記試料中に存在 するＡＧＥ−アミロイドポリペプチドに結合されるのに十分な時間インキュベー トする工程；及び ｃ．生じた結合量を測定する工程； を含む、結合量が試料中に存在するＡＧＥ−アミロイドポリペプチド量に対応 する請求項27記載の方法。 29．前記結合パートナーが、ＡＧＥに対するレセプター及び前記ＡＧＥ−アミロ イドポリペプチドと反応性のある抗体又はそれに結合することができる抗体から なる群より選ばれる請求項28記載の方法。 30．前記ＡＧＥ−アミロイドポリペプチドに対する前記抗体が、ポリクローナル 抗体、モノクローナル抗体及びキメラ抗体からなる群より選ばれる請求項29記載 の方法。 31．前記ＡＧＥ−アミロイドポリペプチドが、ＡＧＥ−βＡＰ及びＡＧＥ−アミ リンからなる群より選ばれる請求項28記載の方法。 32．II型糖尿病の可能性又は発症を診断するか又はその過程及び重篤度を監視す る方法であって、かかる疾患の疑いのある哺乳動物からの生物試料中のＡＧＥ− アミリンレベルの増加を検出することを特徴とする方法。 33．化合物のＡＧＥモジュレートアミロイドーシス阻害能を試験する方法であっ て、適切な媒体中にアミロイドポリペプチドの量を配置する工程、同時に前記ア ミロイドポリペプチド上にＡＧＥを形成することができる物質の量及び試験を受 ける該化合物を加える工程、及びその後に形成されるとすればＡＧＥアミロイド ポリペプチドの量を測定する工程を含む方法。 34．精製ＡＧＥ−βＡＰ。 35．該前進性グリコシル化終末産物又は前進性グリコシル化終末産物を形成する 化合物が還元糖であるか又はそれに由来する請求項34記載のＡＧＥ−βＡＰ。 36．前進性グリコシル化終末産物を形成する該化合物が、グルコース、フルクト ース、リボース及びグルコース−６−ホスフェートからなる群より選ばれる請求 項35記載のＡＧＥ−βＡＰ。 37．精製ＡＧＥ−アミリン。 38．該前進性グリコシル化終末産物又は前進性グリコシル化終末産物を形成する 化合物が還元糖であるか又はそれに由来する請求項37記載のＡＧＥ−アミリン。 39．前進性グリコシル化終末産物を形成する該化合物が、グルコース、フルクト ース、リボース及びグルコース−６−ホスフェートからなる群より選ばれる請求 項37記載のＡＧＥ−アミリン。 40．ＡＧＥ−アミロイドポリペプチドの調製方法であって、アミロイドポリペプ チドを前進性グリコシル化終末産物又は前進性グリコシル化終末産物を形成する 化合物とインキュベートすることを特徴とする方法。 41．ＡＧＥ−アミロイドポリペプチド及び薬学的に許容しうる担体を含む医薬組 成物。 42．哺乳動物におけるアミロイドーシスと関連のある疾患又は障害の治療方法で あって、ＡＧＥ−アミロイドの形成を含むアミロイドーシスと関連のある疾患又 は障害に罹っていると思われる哺乳動物に該哺乳動物においてＡＧＥ−アミ ロイドの認識及び除去の機序を促進又は誘導することができる物質の哺乳動物に おいて該ＡＧＥ−アミロイドの認識及び除去を促進又は誘導するのに有効な量を 投与することを特徴とする方法。 43．食細胞が該ＡＧＥ−アミロイドの認識及び除去を仲介する請求項42記載の方 法。 44．組織が膵臓であり、該物質がＡＧＥ−アミリンである請求項43記載の方法。 45．該食細胞が単球又はマクロファージである請求項44記載の方法。 46．哺乳動物におけるＡＧＥ−アミリンアミロイドプラーク形成と関連のあるII 型糖尿病の治療方法であって、ＡＧＥ−アミリンアミロイドプラーク形成と関連 のあるII型糖尿病に罹っていると思われる哺乳動物に該哺乳動物においてＡＧＥ −アミリンアミロイドの認識及び除去の機序を促進又は誘導することができる物 質のＡＧＥ−アミリンアミロイドの認識及び除去を促進又は誘導するのに有効な 量を投与することを特徴とする方法。 47．食細胞が該ＡＧＥ−アミリンの認識及び除去を仲介する請求項46記載の方法 。 48．該食細胞が単球又はマクロファージである請求項47記載の方法。 49．該物質がＡＧＥ−アミリンである請求項46記載の方法。 50．哺乳動物の組織からアミロイドの除去を促進させる方法であって、アミロイ ドがあると思われる哺乳動物にＡＧＥを形成することができる化合物を投与して ＡＧＥ修飾アミロイドを形成することを特徴とする方法。 51．ＡＧＥを形成することができる該化合物が、修飾コンゴレッド及び修飾チオ フラビンからなる群より選ばれる請求項50記載の方法。 52．ＡＧＥを形成することができる該化合物が脳室内、頭蓋内、静脈内、動脈内 、経口又は経鼻経路により投与される請求項51記載の方法。