CN102596999B

CN102596999B - 识别淀粉样蛋白β的转角结构的抗体

Info

Publication number: CN102596999B
Application number: CN201080046483.9A
Authority: CN
Inventors: 入江一浩; 村上一马; 增田裕一; 清水孝彦; 白泽卓二; 清藤勉
Original assignee: Kyoto University; Immuno Biological Laboratories Co Ltd; Tokyo Metropolitan Geriatric Hospital and Institute of Gerontology (TMGHIG)
Current assignee: Kyoto University; Immuno Biological Laboratories Co Ltd; Tokyo Metropolitan Geriatric Hospital and Institute of Gerontology (TMGHIG); Kyoto University NUC
Priority date: 2009-10-16
Filing date: 2010-10-18
Publication date: 2014-12-24
Anticipated expiration: 2030-10-18
Also published as: US20120219552A1; JPWO2011045945A1; WO2011045945A1; EP2489675A1; CN102596999A; EP2489675A4; US8710193B2

Abstract

本发明提供仅以具有Aβ的特定的转角结构的Aβ作为靶标的治疗方法。具体地，本发明提供特异性识别22位和23位的氨基酸具有转角结构的淀粉样蛋白β的抗体。此外，本发明涉及含有特异性识别淀粉样蛋白β的毒性构象异构体的抗体作为有效成分的药物组合物、或淀粉样蛋白β的毒性构象异构体的测定试剂盒或者阿尔茨海默病的诊断试剂等。

Description

识别淀粉样蛋白β的转角结构的抗体

技术领域

本发明涉及22位和23位的氨基酸具有转角结构的淀粉样蛋白β的测定方法、阿尔茨海默病的诊断方法和治疗方法。

背景技术

阿尔茨海默病(以下称“AD”)一般以老年斑中淀粉样蛋白的蓄积为特征。淀粉样蛋白主要由40以及42残基的淀粉样蛋白β蛋白质(以下分别称“Aβ40”以及“Aβ42”)构成。这些蛋白质是淀粉样蛋白前体蛋白质(APP)被β-以及γ-分泌酶这两种蛋白酶分解而生成的。可以认为：在AD的发病中，Aβ42因其凝集倾向、神经毒性而承担着比Aβ40更为重要的作用。最近的研究表明，氧化应激对与AD关联的神经变性做出贡献。自由基的形成介导的Aβ42的神经毒性与伴随活性氧种子的生成的10位的酪氨酸以及35位的甲硫氨酸的自由基化密切相关。另一方面，有证据显示，Aβ寡聚物的积累通过突触毒性诱导AD。

若对阿尔茨海默病模型小鼠接种Aβ凝集体作为疫苗，则减少脑内的Aβ沉积，抑制认知功能障碍，因而可以认为利用Aβ赋予免疫是有希望的AD治疗方法。但是，用Aβ42免疫AD患者的临床试验(AN1792)因过度的免疫活化这种严重的副作用而中止。作为该问题的理由之一，可以认为是无意识地除去了生理性Aβ42。因此，可以认为，对有效地抑制AD患者中淀粉样蛋白斑块的形成、认知功能障碍的进展而言，区分生理性Aβ42与有毒性的Aβ42是必须的。

通过组合应用系统脯氨酸取代法与固体NMR法的研究，将Aβ42的22位以及23位具有转角结构的毒性构象异构体与Aβ42的25位以及26位具有转角结构的生理构象异构体相区分(非专利文献1、专利文献1)。有报告称，前一种构象异构体显示强凝集能力和神经毒性。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：特开2006-265189

非专利文献

非专利文献1：K.Murakami等(2005)J.Am.Chem.Soc.，127：15168-15174

发明内容

本发明人等为了有效地识别Aβ的转角结构的差异、或提供仅以具有特定转角结构的Aβ作为靶标的治疗方法进行了试错试验。Aβ42的22位和23位具有转角结构的毒性构象异构体可逆性地转换为Aβ42的25位和26位具有转角结构的生理性构象异构体，其立体结构并不固定，因而使用野生型Aβ42制作特异性识别Aβ42的22位和23位具有转角结构的毒性构象异构体的抗体是困难的。因而，本发明人等为了解决上述结构的不稳定性引起的问题，尝试了通过将22位的谷氨酸取代成脯氨酸，使用该部位的转角结构固定的抗原来制作特异性识别Aβ42的22位和23位的氨基酸具有转角结构的毒性构象异构体的抗体。一般地，抗体严密地识别、区分氨基酸的差异，在使用在目的抗体识别的部位(22位以及23位)中导入氨基酸突变而成的突变体蛋白质(22位为脯氨酸的Aβ42)作为抗原的情况下，获得识别导入突变前的野生型蛋白质(22位为谷氨酸的Aβ42)的抗体是困难的。但是，本发明人等进行了仔细的筛选实验，结果从使用所述突变型抗原得到的抗体中发现了特异性识别野生型、且22位和23位的氨基酸具有转角结构的Aβ42的毒性构象异构体的抗体，从而完成了本发明。

即，本发明涉及特异性识别22位和23位的氨基酸具有转角结构的Aβ的毒性构象异构体的抗体及其利用，具体地涉及以下发明。

(1)特异性识别22位和23位的氨基酸具有转角结构的Aβ(以下称作“22-23转角Aβ”)的抗体。

(2)含有与22-23转角Aβ特异性结合的物质作为有效成分的药物组合物。

(3)(2)所述的药物组合物，其是阿尔茨海默病治疗药物。

(4)22-23转角Aβ的测定试剂盒，其具备与22-23转角Aβ特异性结合的物质。

(5)阿尔茨海默病的诊断试剂，其具备与22-23转角Aβ特异性结合的物质。

(6)被检物中的22-23转角Aβ水平的测定方法，其具备使被检物和与22-23转角Aβ特异性结合的物质相接触的工序。

(7)阿尔茨海默病的诊断方法，其具备检测被检物中的22-23转角Aβ的步骤。

(8)阿尔茨海默病的诊断方法，其具备以下步骤：

a)制备被测试者来源的试样的步骤；

b)使该试样与至少一种特异性识别22-23转角Aβ的抗体接触的步骤；

c)检测该抗体对22-23转角Aβ的结合，测定22-23转角Aβ的水平的步骤；以及

d)将22-23转角Aβ的水平与被测试者中的阿尔茨海默病的有无或程度相关联的步骤。

(9)测定被检物中的、相对于总淀粉样蛋白β的22-23转角Aβ的比例的方法，其具备：

测定被检物中的总淀粉样蛋白β水平的步骤；

测定被检物中的22-23转角Aβ水平的步骤；以及

计算相对于测定得到的总淀粉样蛋白β水平的22-23转角Aβ水平的比例的步骤。

(10)阿尔茨海默病的诊断方法，其包括：

测定被检物中的总淀粉样蛋白β水平的步骤；

测定被检物中的22-23转角Aβ水平的步骤；

计算相对于测定得到的总淀粉样蛋白β水平的22-23转角Aβ水平的比例的步骤；以及

将相对于总淀粉样蛋白β水平的22-23转角Aβ水平的比例与阿尔茨海默病的有无或程度相关联的步骤。

在本说明书中，某抗体或物质“特异性结合”或“特异性识别”是指：该抗体或物质以与对其他氨基酸序列、立体结构的亲和性相比、实质上高的亲和性与22-23转角Aβ结合。这里，“实质上高的亲和性”是指如下程度的高亲和性：通过希望的测定装置或方法能够将其特定氨基酸序列、立体结构与其他氨基酸序列、立体结构区分开来进行检测。作为以实质上高的亲和性结合时的结合常数(K_a)，例如是至少10⁷M^-1，优选至少10⁸M^-1，更优选至少10⁹M^-1。作为这样的结合常数，更优选10¹⁰M^-1、10¹¹M^-1、10¹²M^-1或更高，例如10¹³M^-1或更高。

本发明涉及特异性识别22-23转角Aβ的抗体。此外，本发明的特异性识别22-23转角Aβ的抗体只要特异性识别22位和23位的氨基酸具有转角结构的Aβ即可，对其识别部位没有限制，优选识别Aβ的22位和/或23位的氨基酸、和/或其相邻的(优选距22位和/或23位的氨基酸数残基以内的)氨基酸的抗体。例如，本发明的抗体可以是特异性识别22-23转角Aβ、且识别Aβ的22位和23位的氨基酸中的至少一个氨基酸的抗体。更优选，本发明的抗体是特异性识别Aβ的22位和23位的氨基酸形成的转角结构的立体结构的抗体，例如，本发明的抗体可以是特异性识别Aβ的22位和23位的氨基酸形成的转角结构的立体结构，且识别Aβ的22位和23位的氨基酸中的至少一个氨基酸的抗体。

作为本发明的抗体等识别的22-23转角Aβ，没有特殊限制，“22位和23位的氨基酸具有转角结构”即可，优选22-23转角Aβ40或22-23转角Aβ42，更优选22-23转角Aβ42。此外，本发明的抗体等识别的22-23转角Aβ包含22位和23位的氨基酸具有转角结构、且具有与野生型Aβ实质上相同的氨基酸序列的多肽。作为本发明的抗体等识别的22-23转角Aβ，优选22位和23位的氨基酸具有转角结构的野生型Aβ。

在本说明书中，与特定多肽或蛋白质“具有实质上相同的氨基酸序列的多肽或蛋白质”是指：与22-23转角Aβ该特定的多肽或蛋白质具有实质上等同的生物学性质的多肽或蛋白质，且上述多肽或蛋白质是具有取代、缺失和/或修饰该特定多肽或蛋白质的氨基酸序列中的多个氨基酸、优选1～10个氨基酸、更优选1～数个(例如1～5个、1～4个、1～3个、1～2个)氨基酸而得到的氨基酸序列的突变多肽或蛋白质，或者是具有在该氨基酸序列中添加或插入多个氨基酸、优选1～10个氨基酸、更优选1～数个(例如、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个)氨基酸而得到的氨基酸序列的突变多肽或蛋白质。此外，具有实质上相同的氨基酸序列的多肽或蛋白质可以是具有所述取代、缺失、修饰和添加中的多个突变的突变多肽或蛋白质。优选“具有实质上相同的氨基酸序列的多肽或蛋白质”具有与该特定多肽或蛋白质等同的生物学活性。

本发明的抗体可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体，优选是单克隆抗体。在本发明中，“单克隆抗体”对抗原是高度特异的，其识别单一抗原。而且，本发明的抗体包括非人动物的抗体、具有非人动物的抗体的氨基酸序列和人来源的抗体的氨基酸序列的抗体、以及人抗体。作为非人动物的抗体，可以列举出例如小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、犬、猴、绵羊、山羊、鸡、鸭等的抗体，优选能够制作杂交瘤的动物的抗体，更优选小鼠的抗体。作为具有非人动物的抗体的氨基酸序列和人来源的抗体的氨基酸序列的抗体，可以列举出人型嵌合抗体、人化抗体。在上述中，“嵌合抗体”是非人动物来源的、其中对与22-23转角Aβ特异性结合的抗体的恒定区进行了基因工程修饰使之具有与人的抗体相同的恒定区而得到的抗体，优选是人-小鼠-嵌合抗体(参照欧洲专利公开公报EP0125023)。“人化抗体”是非人动物来源的、其中将与22-23转角Aβ特异性结合的抗体的H链和L链的互补识别区(CDR)以外的一级结构基因工程修饰成对应于人的抗体的一级结构而得到的抗体。这里，CDR可以依据Kabat等(“Sequences of Proteins of Immunological Interest”，Kabat，E.等，U.S.Department of Health and Human Services，1983)或Chothia等(Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.，196：901-917)任何一个中的定义。“人抗体”是指作为完全的人来源的抗体基因的表达产物的人抗体，可以列举例如使用导入了参与人的抗体产生的基因的转基因动物制作的单克隆抗体(参照欧洲专利公开公报EP0546073)等。例如，在将本发明的抗体应用于治疗、预防、或通过体内施用而使用的诊断的情况下，作为本发明的抗体，优选是人-非人动物嵌合抗体、人化抗体、或人抗体。

对于本发明的抗体所识别的氨基酸得数目，没有特殊限制，只要是抗体能够与22-23转角Aβ结合的数目即可。在将抗体作为治疗药物使用的情况下，优选识别能够抑制22-23转角Aβ的功能的数目的氨基酸。抗体或其片段所识别的氨基酸得数目优选至少1个，更优选至少3个。此外，对本发明的抗体的免疫球蛋白类别没有特殊限制，可以是IgG、IgM、IgA、IgE、IgD、IgY中的任何免疫球蛋白类别，优选IgG。此外，本发明的抗体还包含任何的同种型的抗体。

此外，特异性识别22-23转角Aβ的抗体的片段也包含在本发明的特异性识别22-23转角Aβ的抗体中。这里，“抗体的片段”是指：抗体的一部分(部分片段)，其能够保持抗体对抗原的作用。作为这样的抗体的片段，可以列举出例如包含F(ab’)₂、Fab’、Fab、单链Fv(以下也称“scFv”)、二硫键Fv(以下也称“dsFv”)或者它们的聚合物、二聚体化V区域(以下也称“双抗体”)、或CDR的肽。F(ab’)₂是将IgG用蛋白水解酶胃蛋白酶处理而得到的片段中、分子量约10万的具有抗原结合活性的抗体片段。Fab’是将该F(ab’)的铰链区的二硫键切断而得到的分子量约5万的具有抗原结合活性的抗体片段。sdFv是将1条VH和1条VL用肽接头连接而得到的具有抗原结合活性的多肽。dsFv是VH和VL中的被取代成半胱氨酸残基的氨基酸残基通过二硫键结合的具有抗原结合活性的片段。双抗体是scFv二聚体化而得到的片段。本发明的双抗体可以是单特异性，也可以是双特异性(多特异性抗体)。二聚体化的scFv可以相同，也可以不同。

而且，包含特异性识别22-23转角Aβ的抗体的一部分的肽也包含在本发明的特异性识别22-23转角Aβ的抗体之中。这里，“包含抗体的一部分的肽”是指：具备构成抗体的氨基酸序列的一部分氨基酸序列的肽，且其保持抗体对抗原的作用。在本说明书中，“抗体对抗原的作用”是指：抗体对22-23转角Aβ的结合作用，特别是在将本发明的特异性识别22-23转角Aβ的抗体用作治疗药物或预防药物的情况下，是指抗体的抑制Aβ的神经毒性的作用和/或抑制Aβ的凝集的作用。包含抗体的一部分的肽可以包含非抗体来源的氨基酸序列。作为包含特异性识别22-23转角Aβ的抗体的一部分的肽，优选包含特异性识别22-23转角Aβ的抗体的CDR序列的肽。这里，包含CDR序列的肽是指：包含选自重链可变区的CDR1、CDR2以及CDR3以及轻链可变区的CDR1、CDR2以及CDR3中的至少一种CDR的氨基酸序列的肽。作为包含特异性识别22-23转角Aβ的抗体的一部分的肽，更优选包含重链可变区的CDR3和/或轻链可变区的CDR3的氨基酸序列的肽。

在本说明书的全部中，作为“特异性识别22位和23位的氨基酸具有转角结构的Aβ(22-23转角Aβ)的抗体”，优选保藏于独立行政法人产业技术综合研究所、专利生物保藏中心(日本国茨城县筑波市东1-1-1筑波中心中央第6)的杂交瘤Amyloidβ HybridomaIBL-101(保藏微生物的保藏日为2009年10月14日，保藏号为FERM BP-11290)所产生的IBL-101单克隆抗体。例如，本发明的抗体是具有与IBL-101单克隆抗体实质上相同的氨基酸序列、且保持抗体对抗原的作用(例如结合作用、作为治疗药物或预防药物使用的情况下优选抗体抑制Aβ的神经毒性的作用和/或抑制Aβ的凝集的作用)的多肽或抗体，可以是具有IBL-101单克隆抗体的可变区和人来源的抗体的恒定区的嵌合抗体(以下也称“IBL-101嵌合抗体”)、具有IBL-101单克隆抗体的H链和L链的互补识别区(CDR)的抗体(以下也称“IBL-101人化抗体”)(以下将这些抗体统称为“基于IBL-101单克隆抗体制作的抗体”)。作为IBL-101人化抗体，可以是例如具有IBL-101单克隆抗体的H链的CDR1(以下也称“CDRH1”)、CDRH2和/或CDRH3、和/或、IBL-101单克隆抗体的L链的CDR1(以下也称“CDRL1”)、CDRL2和/或CDRL3的抗体，优选具有IBL-101单克隆抗体的CDRH1、CDRH2以及CDRH3、以及、IBL-101单克隆抗体的CDRL1、CDRL2以及CDRL3的抗体。此外，本发明的抗体可以是前述的IBL-101单克隆抗体或基于其制作的抗体的片段(F(ab’)₂、Fab’、Fab、scFv、dsFv或者它们的聚合物、双抗体、或包含CDR的肽等)。除本段落、实施例、以及附图说明外，在本说明书中提及“IBL-101单克隆抗体”时，除了指前述的杂交瘤AmyloidβHybridoma IBL-101产生的抗体外，还包括基于IBL-101单克隆抗体制作的抗体、以及它们的片段。

此外，在其他实施方案中，本发明涉及含有与22-23转角Aβ特异性结合的物质作为有效成分的药物组合物。在本说明书中，对于“与22-23转角Aβ特异性结合的物质”没有特殊限制，只要是与22-23转角Aβ特异性结合的物质即可，优选与Aβ的22位和23位的氨基酸形成的转角结构的立体结构特异性结合的物质，更优选抑制22-23转角Aβ的功能和/或凝集的物质。作为这样的物质，可以列举出例如适体、与22-23转角Aβ结合的多肽、或上述的与22-23转角Aβ特异性结合的抗体。

“适体”是指：与蛋白质等物质结合的核酸。适体可以是RNA，也可以是DNA。核酸的形态可以是双链，也可以是单链。对适体的长度没有特殊限制，只要与靶标分子特异性结合即可，例如10～200个核苷酸、优选10～100个核苷酸、更优选15～80个核苷酸、更优选15～50个核苷酸。本领域技术人员可以使用公知方法来选择适体，例如可以采用SELEX法(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)(Tuerk，C.and Gold，L.(1990)Science，249：505-510)。

“与22位和23位的氨基酸具有转角结构的Aβ(22-23转角Aβ)结合的多肽”是指：与与22-23转角Aβ结合的蛋白质结合的多肽，通过与该多肽结合，22-23转角Aβ无法凝集和/或无法实现本来的功能(神经毒性等)。本说明书中的实验结果显示，22-23转角Aβ彼此结合形成三聚体，因此，作为与22-23转角Aβ结合的多肽，可以列举出例如22-23转角Aβ的突变体、类似物(例如P3-Aβ42、E22P-Aβ42以及Aβ-内酰胺)或其部分肽。例如，通过制作这样的突变体、类似物或部分肽，并选择与22-23转角Aβ结合的物质，可以得到与22-23转角Aβ结合的多肽。此外，这些肽可以适宜修饰，以提高稳定性或促进抑制活性。

本发明的药物组合物可以采用任何制剂，只要是能够施用于患者的制剂即可，作为用于非口服施用的组合物，可以列举出例如注射剂、滴鼻剂、栓剂、贴剂、软膏等。优选注射剂。本发明的药剂的剂型可以列举出例如液剂或冻干制剂。在将本发明的药剂作为注射剂使用的情况下，视需要可以加入丙二醇、乙二胺等增溶剂、磷酸盐等缓冲剂、氯化钠、甘油等等渗化剂、亚硫酸盐等稳定剂、苯酚等防腐剂、利多卡因等去痛剂等添加剂(参照“医薬品添加物事典”药事日报社，“Handbook of Pharmaceutical Excipients Fifth Edition”APhA Publications公司)。此外，在将本发明的治疗药物或预防药物作为注射剂使用的情况下，作为保存容器，可以列举出安瓿、管形瓶、预装针、笔式注射筒、以及点滴用袋等。

本发明的药物组合物可以作为因22-23转角Aβ而发病或恶化的疾病的治疗药物使用。作为这样的疾病，可以列举出例如阿尔茨海默病。

此外，在其他实施方案中，本发明涉及具备与22-23转角Aβ特异性结合的物质的22-23转角Aβ的测定试剂盒。例如，本发明的测定试剂盒可以基于使用抗体分子的公知方法。作为这样的方法，可以列举出例如ELISA、免疫染色、放射性免疫测定、免疫组织化学方法或Western印迹等。作为本测定试剂盒的被检物，例如可以使用作为活检从被测试者采集的组织试样或液体。对所使用的活检没有特殊限制，只要能够作为本发明的免疫学测定的对象即可，可以列举出例如组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿、浆膜腔液、髓液、关节液、房水、泪液、唾液或其分级物或者处理物，优选组织(特别是脑组织)或血液。利用本预测试剂盒进行的分析可以定性地、定量地或半定量地进行。

优选地，本发明的测定试剂盒中的与22-23转角Aβ特异性结合的物质是与22-23转角Aβ特异性结合的抗体，更优选是IBL-101单克隆抗体。只要与22-23转角Aβ结合即可，不论其结构、大小、免疫球蛋白类别、来源等。此外，本发明的测定试剂盒可以包含编码与22-23转角Aβ特异性结合的抗体的氨基酸序列的分离的核酸、包含该核酸的载体、携带该载体的细胞。

此外，与22-23转角Aβ特异性结合的物质可以与³²P、³H、¹²⁵I、¹⁴C等放射性标记；β半乳糖苷酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、醇氧化酶、单胺氧化酶、辣根过氧化物酶等酶；FAD、FMN、ATP、生物素、卟啉等辅酶或辅基；荧光素衍生物(荧光素异硫氰酸酯(FITC)、Fluorescein thioflubamyl等)、罗丹明衍生物(四甲基罗丹明、三甲基罗丹明(RITC)、TEXAS RED、罗丹明110等)、Cy色素(Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7)、Cy-铬、SpectrumGreen、Spectrum Orange、碘化丙啶、别藻蓝蛋白(APC)、R-藻红蛋白(R-PE)等荧光标记；萤光素酶等生物发光标记；或者、鲁米诺、异鲁米诺、N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺酯等鲁米诺衍生物、N-甲基吖啶酯、N-甲基吖啶酰基磺酰胺酯等吖啶衍生物、光泽精、金刚烷基二氧杂环丁烷、吲哚酚衍生物、钌络合物等化学发光标记；金胶体等金属等可检测的标记结合。

对本发明的测定试剂盒没有特殊限制，包含与22-23转角Aβ特异性结合的物质即可。例如、本发明的测定试剂盒中包含的试剂可以是固体状、凝胶状或液状。此外，与22-23转角Aβ特异性结合的物质可以包含或固定于树脂、膜、薄膜、容器等，或者可以溶解在溶剂中。此外，本发明的试剂盒视需要可以包含生色试剂、反应终止用试剂、标准抗原试剂、样品前处理用试剂、封闭试剂等。此外，本发明的试剂盒可以具备例如含有硝基纤维素、Sepharose、尼龙、维纶、聚酯、丙烯酸类、聚烯烃、聚氨酯、人造丝、Polynosic、CUPRO、Lyocell、醋酸纤维、聚偏氟乙烯、硅橡胶、乳胶、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、聚偏氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙酸乙烯酯、氟加工树脂、ABS树脂、AS树脂、丙烯酸类树脂、高分子合金、玻璃纤维、碳纤维、玻璃、明胶、多氨基酸和/或磁感应性材料等的平板、管、芯片(例如蛋白芯片、实验室芯片等)、珠、膜、吸收体和/或粒子等。

例如、作为本发明的试剂盒，可以列举出例如：具备固定化有与22-23转角Aβ特异性结合的抗体的平板、生物素标记抗Aβ兔多克隆抗体溶液、链霉菌抗生物素蛋白POD溶液、洗涤液、TMB试剂、2M HCl、E22P-Aβ42的试剂盒、或者具备与22-23转角Aβ特异性结合的抗体、抗Aβ小鼠单克隆抗体结合金胶体、兔免疫球蛋白结合金胶体以及测试平板的试剂盒。

此外，本发明涉及具备与22-23转角Aβ特异性结合的物质(优选与22-23转角Aβ特异性结合的抗体、更优选IBL-101单克隆抗体)的阿尔茨海默病的诊断试剂。例如，在于生物体外使用的情况下，本发明的诊断试剂可以基于上述的具备与22-23转角Aβ特异性结合的物质的22-23转角Aβ的测定试剂盒来构成。此外，本发明的诊断试剂还可以用作图像诊断用。在将本发明的诊断试剂用作图像诊断用的情况下，与22-23转角Aβ特异性结合的物质可以含有标记物质或与标记物质结合。作为标记物质，可以使用例如放射性同位素等本领域技术人员公知的物质，优选正电子释放放射性同位素或γ线放射性同位素，可以列举出例如¹³¹I、¹²³I、¹²⁴I、⁸⁶Y、⁶²Cu、⁶⁴Cu、¹¹¹In、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁹⁹mTc、^94mTc、¹⁸F、¹¹C、¹³N、¹⁵O和⁷⁵Br，但不限于此。在用作图像诊断用的情况下，本发明的诊断试剂所含有的与22-23转角Aβ特异性结合的物质优选是与22-23转角Aβ结合的多肽、或与22-23转角Aβ特异性结合的抗体(更优选嵌合抗体、人化抗体或人抗体)，更优选是IBL-101单克隆抗体。在用作图像诊断用的情况下，本发明的诊断试剂可以是适于对人施用的医药上可接受的形态，可以包含生理学可接受的添加剂、例如药学可接受的稀释剂、缓冲剂、可溶化剂、去痛剂、溶剂、稳定化剂或抗氧化剂。本发明的诊断试剂的施用量可以根据对象部位、采用的图像诊断方法、患者的年龄、性别及其他条件、疾病的程度适宜选择。

在本说明书中，“XNY”(X和Y是氨基酸单字母符号；N是自然数)表示N位的氨基酸X被氨基酸Y取代，“Aβp-q”(p和q是自然数)表示由Aβ的p位的氨基酸到q位的氨基酸组成的肽。例如，E22P-Aβ42表示由22位的谷氨酸被脯氨酸取代的Aβ42，G9C、E22P-Aβ9-35表示9位的甘氨酸被半胱氨酸取代、22位的谷氨酸被脯氨酸取代的Aβ的9位-35位的氨基酸组成的肽。

发明的效果

本发明的抗体能够与22-23转角Aβ特异性结合，因而能够特异性地检测22-23转角Aβ，或者能够抑制22-23转角Aβ的作用。因此，能够在以22-23转角Aβ的表达量作为指标的诊断中加以利用，还能够作为22-23转角Aβ的表达对发病或恶化有贡献的疾病的治疗药物或预防药物使用。

附图说明

[图1]图1是模式地表示Aβ42的立体结构(转角结构)的图。

[图2]图2是表示22位以及23位具有转角的Aβ42的构象固定类似物Aβ-内酰胺(K22-E23)的结构、以及将3个位置的能够形成转角结构的部位用脯氨酸残基取代而得到的三重Aβ突变体(P3-Aβ42)的取代部位的图。

[图3]图3是显示采用ELISA法测定单克隆抗体IBL-101和单克隆抗体4G8对Aβ42的结合活性的结果的图。左图表示IBL-101，右图表示4G8。图中，纵轴表示OD492的吸光度，横轴表示固定化的各单克隆抗体的浓度。图中，黑圈表示Aβ42，白圈表示Aβ40，黑三角表示E22P-Aβ42，白三角表示E22V-Aβ42，白四边形表示0.1％(w/v)BSA。

[图4]图4是显示采用ELISA法测定单克隆抗体IBL-101对Aβ42、Aβ-内酰胺(22K-23E)以及P3-Aβ42的结合活性的结果的图。图中，纵轴表示OD492的吸光度，横轴表示固定化的IBL-101的浓度。图中，黑圈表示Aβ42，黑四边形表示Aβ-内酰胺(22K-23E)，白倒三角表示P3-Aβ42。

[图5]图5是显示对PC12细胞的Aβ42和E22P-Aβ42的神经细胞毒性、以及IBL-101对该神经毒性的抑制效果的图表。图中，纵轴表示细胞生存率(％)。星号表示p＜0.05。

[图6]图6示出了将AD患者(案例1以及案例2)的海马区域切片用IBL-101单克隆抗体或4G 8单克隆抗体进行染色而得到的照片。图中，箭头符号表示确认到细胞内染色的部位。标尺表示50μm。

[图7]图7示出了将AD患者(案例1以及案例2)以及非AD患者(案例3以及案例4)的额叶区域切片用IBL-101单克隆抗体进行染色而得到的照片。

[图8]图8示出了在用免疫原进行前处理后、对AD患者脑切片进行染色(抑制测定)而得到的照片。图中，箭头符号表示确认了细胞内染色的部位。标尺表示50μm。“+Vehicle”表示用不含免疫原的溶液进行了前处理的抗体(对照)，“+Immunogen”表示用免疫原进行了前处理的抗体。

[图9]图9示出了将两种转基因小鼠(Tg2576以及J20)的脑用IBL-101单克隆抗体进行染色而得到的照片。右边的照片是左边的照片中用四边形围起的部分的放大照片。左边的照片中，标尺表示500μm，右的照片中，标尺表示50μm。

[图10]图10A，B以及D是显示对于AD患者的脑的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.6)(TBS)可溶性级分(Soluble fr.)用IBL-101单克隆抗体(Anti-turn)、4G8单克隆抗体(4G8)、82E1单克隆抗体(82E1)以及抗APP-C末端抗体(Anti-APP(C))进行Western印迹的结果的照片。图10C是显示对于重组体人APP用IBL-101单克隆抗体(Anti-turn)以及抗APP-N末端抗体(APP(N))进行Western印迹的结果的照片。图10C中，CBB表示将膜用考马斯亮蓝进行染色的结果。图10E是显示对于AD患者的脑的TBS不溶性级分(Insoluble fr.)用IBL-101单克隆抗体(Anti-turn)和4G8单克隆抗体(4G8)进行Western印迹的结果的照片。图10E中，“High-molecular weight-aggregates”表示Aβ的高分子量的凝集物，“Monomer”表示Aβ的单体。在图10中的所有图中，各照片右侧的值表示分子质量(kDa)。

发明的具体实施方案

1.特异性识别22-23转角Aβ的抗体的制作

本发明的抗体可以通过例如将22-23转角Aβ视需要与免疫刺激剂(例如、矿物油或铝沉淀物和加热处理得到的死菌或者脂多糖、弗氏完全佐剂、或弗氏不完全佐剂等)一起免疫非人哺乳动物或鸟类来制作。

作为免疫原，优选E22P-Aβ42、Aβ-内酰胺(22K-23E)以及P3-Aβ42，更优选E22P-Aβ42。免疫原可以以将编码该物质的基因DNA、优选cDNA导入细菌、酵母、动物细胞等细胞株中并进行表达而得到的重组蛋白质或合成蛋白质的形式获得。

例如，本发明的抗体的制作中使用的免疫原可以通过将包含编码免疫原的cDNA的表达载体导入大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞等并进行表达而得到。此外，免疫原还可以采用Fmoc法或Boc法等通过化学合成来制作。例如，通过反复进行下述工序，可以得到具有希望的氨基酸序列的肽：将免疫原的C末端的氨基酸固定化于聚苯乙烯承载体，通过利用二异丙基碳二亚胺(DIC)等缩合剂使9-芴甲氧基羰基(Fmoc基)或叔丁氧基羰基(Boc基)保护的氨基酸进行反应来进行结合，并洗涤、脱保护。此外，免疫原还可以使用自动肽合成仪来合成。作为这样的肽合成仪，可以列举出例如PSSM-8(岛津制作所)；模型433A肽合成仪(AppliedBiosystems公司)；ACT396Apex(Advanced Chem Tech公司)等。

此外，在将与Aβ具有实质上相同的氨基酸序列的多肽作为免疫原使用的情况下，可以采用例如合成寡核苷酸部位突变导入法(gapped duplex法)、通过亚硝酸或者亚硫酸处理随机导入点突变的方法、利用Ba131酶等制作缺失突变体的方法、盒突变法、接头扫描法、错误掺入法、错配引物法、DNA片段合成法等。

对于被免疫的动物，免疫原可以单独或者与承载体、稀释剂一起施用于通过施用能够产生抗体的部位。在施用时，为了提高抗体产生能力，可以施用完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂。作为免疫动物，没有特殊限制，可以是小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、犬、猴、绵羊、山羊、鸡、鸭等能够制作杂交瘤的动物，优选小鼠或大鼠，更优选小鼠。

对动物施用免疫原可以通过例如皮下注射、腹腔内注射、静脉内注射、皮内注射、肌肉内注射或足跖注射来进行，优选皮下注射或腹腔内注射。使用的免疫原的量不受限制，只要是能够产生抗体的量即可，优选0.1至1000微克，更优选1至500微克，进一步更优选10至100微克。免疫可以实施一次，或者以适当的间隔实施数次。通常，间隔1～6周进行1次免疫并合计进行2～10次左右，优选1～5周进行1次免疫并合计进行2～5次，更优选3周进行1次免疫并合计进行3次。在最后的免疫1～2周后，从免疫的动物的眼窝或尾静脉进行采血，并使用其血清进行抗体效价的测定。抗体效价的测定可以采用本领域技术人员公知的方法进行。例如，可以列举出放射性同位素免疫定量法(RIA法)、固相酶免疫定量法(ELISA法)、荧光抗体法和被动血细胞凝集反应法，优选ELISA法。可以通过对显示足够抗体效价的动物的血清进行纯化来获得本发明的抗体。

单克隆抗体可以通过培养从按照上述方法免疫的免疫化动物获得的抗体生成细胞与骨髓瘤细胞融合而得到的杂交瘤来生成。此类融合方法可以是例如Milstein等人的方法(Galfre，G.&Milstein，C.(1981)Methods Enzymol.，73：3-46)。

所使用的抗体生成细胞可以从经过上述方法免疫且在血清中显示足够抗体效价的小鼠或大鼠的下述部位收集：脾、胰、淋巴结和外周血，优选脾。

所使用的骨髓瘤细胞不受限制，只要该细胞衍生自哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、家兔或人，并且可以在体外增殖即可。此类细胞可以包括例如P3-X 63Ag8(X63)(Nature，256，495，1975)、P3/NS1/1-Ag4-1(NS1)(Eur.J.Immunol.，6，292，1976)、P3X63Ag8U1(P3U1)(Curr.Top.Microbiol.Immunol.，81，1，1978)、P3X63Ag8.653(653)(J.Immunol.，123，1548，1979)、Sp2/0-Ag14(Sp2/O)(Nature，276，269，1978)、Sp2/O/FO-2(FO-2)(J.Immunol.Methods，35，1，1980)等。优选与抗体生成细胞同种动物来源的细胞，更优选与抗体生成细胞同系统的动物来源的细胞。例如，作为小鼠来源的骨髓瘤细胞，优选P3U1或P3X63-Ag8-653。骨髓瘤细胞可以冻存，或者可以用添加有马、兔或牛胎儿血清的一般培养基进行传代来维持。此外，作为用于细胞融合的骨髓瘤细胞，优选对数增殖期的细胞。

作为将抗体生成细胞和骨髓瘤细胞融合来形成杂交瘤的方法，可以列举出使用聚乙二醇(以下也称“PEG”)等的方法(PEG法)、使用仙台病毒的方法、使用电融合装置的方法等。

例如，在PEG法中，将按照上述方法得到的抗体生成细胞以及骨髓瘤细胞用培养基、PBS等洗涤后，在含30～60％的PEG(平均分子量1000～6000)等细胞凝集性媒介的适当培养基或缓冲液中，以脾细胞比骨髓瘤细胞为1∶2～10∶1(优选5∶1～10∶1)的混合比进行悬浮，在温度约25～37℃、pH6～8的条件下，反应约30秒～3分钟左右。反应结束后，除去PEG溶液，重悬于培养基中，并播种于CELLWELL平板中继续培养。

产生单克隆抗体的杂交瘤细胞的选择可以按照公知或者基于此的方法来进行。通常，通过用添加有HAT(次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷)的动物细胞用培养基进行选择性增殖，可以进行杂交瘤细胞的选择。作为选择和育种用培养基，只要杂交瘤细胞能够生长即可，可以使用任何培养基。例如，可以使用包含1～20％、优选10～20％的胎牛血清的RPMI 1640培养基、含1～10％的胎牛血清的GIT培养基(和光纯药工业(株))或者杂交瘤培养用无血清培养基(SFM-101、日水制药(株))等。培养温度通常是20～40℃、优选约37℃。培养时间通常是5日～3周、优选1周～2周。培养通常在5％CO2下进行。

培养后，采集培养上清，通过ELISA等选择与抗原蛋白质特异性结合、但与非抗原蛋白质的结合弱的克隆。对于这样的克隆重复极限稀释法1～5次、优选2～4次来进行单细胞化，能够选择出稳定地显示高抗体效价的细胞。本发明的与22-23转角Aβ特异性结合的抗体可以这样获得：以对处于在22位以及23位采取β-转角结构的倾向的Aβ突变体(E22Q-Aβ42、E22G-Aβ42、E22K-Aβ42、E22P-Aβ42、以及D23N-Aβ42)(K.Murakami等(2003)J.Biol.Chem.，278：46179-46187)(图1)的结合能力作为指标，反复进行选择对全部的突变体的结合能力高的克隆的筛选。例如，识别22-23转角Aβ的抗体可以这样获得：测定22-23转角Aβ与通过前期方法得到的抗体等之间的结合活性、并选择结合活性高的抗体等。作为本发明的与22-23转角Aβ特异性结合的抗体与22-23转角Aβ的结合中的结合常数(K_a)，例如是至少10⁷M^-1，优选至少10⁸M^-1，更优选至少10⁹M^-1。作为这样的结合常数，更优选10¹⁰M^-1、10¹¹M^-1、10¹²M^-1或更高，例如10¹³M^-1或更高。与22-23转角Aβ特异性结合的抗体可以这样获得：从通过所述方法得到的识别22-23转角Aβ的抗体等中，采用本领域技术人员公知的方法选择不识别22位和23位的氨基酸不具有转角结构的Aβ的抗体等。

此外，产生本发明的抗体的杂交瘤可以从保藏于独立行政法人产业技术综合研究所、专利生物保藏中心(茨城县筑波市东1-1-1筑波中心中央第6)的杂交瘤AmyloidβHybridoma IBL-101(保藏微生物的保藏日2009年10月14日、保藏号FERM BP-11290)获得。

可以通过在体外培养通过上述方法获得的杂交瘤，然后纯化培养物来获得本发明的单克隆抗体。或者，可以通过将杂交瘤移植给先前向腹腔内施用了角鲨烷的同基因动物或免疫缺陷动物，制备腹水，然后收集腹水进行纯化来获得本发明的单克隆抗体。

所得抗体可以纯化至均一。抗体的分离、纯化可以使用对通常的蛋白质使用的分离、纯化方法。例如，通过适宜选择、组合亲和色谱等色谱柱、滤膜、超滤、盐析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点电泳等，能够分离、纯化抗体(Antibodies：ALaboratory Manual.Ed Harlow and David Lane，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)。作为用于亲和色谱的柱子，可以列举出例如蛋白A柱、蛋白G柱。例如，作为蛋白A柱，可以列举出Hyper D，POROS，Sepharose F.F.(Amersham Biosciences公司)。此外，对于IgY和IgM，可以使用以巯基吡啶作为配体的柱子。而且，不论抗体的类别，还可以使用E22P-Aβ42固定化柱、离子交换色谱、疏水相互作用色谱等。单克隆抗体的纯化可以通过例如在离心分离后、使用蛋白A柱或蛋白G柱等回收IgG级分来进行。

2.人型嵌合抗体、人化抗体、人抗体的制作

(1)人型嵌合抗体

本发明的人型嵌合抗体可以这样获得：制备编码与22-23转角Aβ结合、抑制22-23转角Aβ的功能的非人动物来源单克隆抗体的VH和VL的DNA，将其与人来源免疫球蛋白的恒定区cDNA结合并导入表达载体，然后将该载体导入适当的宿主细胞进行表达(Morrison，S.L.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，6851-6855，1984)。

编码非人动物来源单克隆抗体的VH和VL的DNA例如可以通过下述方法获得。从产生该单克隆抗体的动物B细胞抽提mRNA。mRNA的抽提可以采用本领域技术人员公知的方法进行，例如通过采用胍-超离心法(Chirgwin，J.M.等，Biochemistry，18，5294-5299，1979)、AGPC法(Chomczynski，P等，Analytical Biochemistry，162，156-159，1987)等制备RNA后，再用mRNA纯化试剂盒(Purification Kit)(Pharmacia公司制、TAKARABio公司制)等进行纯化来进行。使用寡dT引物从抽提的mRNA制作cDNA，并导入载体。使用非人动物来源单克隆抗体的一部分作为探针，从导入载体的cDNA中分离编码非人动物来源单克隆抗体的cDNA。通过测定分离出的cDNA的碱基序列，能够得到编码目的VH和VL的DNA序列。

此外，作为获得编码非人动物来源单克隆抗体的VH和VL的DNA其他方法，可以列举出下述方法。将用上述方法获得的cDNA用能够扩增VH或VL的引物(例如在利用小鼠作为非人动物的情况下，与小鼠H链恒定区(C区域)杂交的引物以及与小鼠L链γ链恒定区的保守序列杂交的引物等(R.Orlandi等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，3833)通过PCR法进行扩增，或者从产生单克隆抗体的动物B细胞抽提mRNA、在用能够扩增该VH或VL的引物通过RT-PCR法扩增该VH或VL。从所得的PCR产物抽提目的DNA片段。目的DNA片段的抽提可以通过例如琼脂糖凝胶电泳后切出显示目的DNA大小的条带、并从该凝胶切片抽提DNA来进行。将该载体以及抽提的DNA用限制酶处理后，将抽提的DNA导入载体，通过测定导入的DNA所编码的DNA序列，能够得到编码目的VH和VL的DNA序列。

作为人型嵌合抗体的人抗体CH以及CL，可以使用任意的人抗体的CH以及CL。可以列举出例如人γ1、γ2的CH以及人κ的CL。作为编码人抗体的CH以及CL的基因，可以使用染色体DNA或cDNA。通过上述的方法得到的编码非人动物来源单克隆抗体的VH和VL的DNA例如分别与编码人抗体的CH以及CL的DNA结合、并导入动物细胞用表达载体，从而能够制作表达本发明的嵌合抗体的载体。

作为人型嵌合抗体的表达中使用的增强子以及启动子，可以列举出免疫球蛋白基因自身的增强子以及启动子或非免疫球蛋白用增强子以及启动子。例如，在使用小鼠作为非人动物的情况下，免疫球蛋白基因的表达调节机制在小鼠与人之间是共通的，因而也可以以包含存在于J基因与C基因间的小鼠或人的增强子序列的形式制作重组DNA。

作为动物细胞用表达载体，可以使用例如pSV2-gpt(R.C.Mulligan and P.Berg(1980)Science，209，1422)。通过上述方法制作的编码本发明的人型嵌合抗体的H链以及L链的基因可以导入相同载体，也可以导入不同载体。

(2)人化抗体

本发明的人化抗体可以这样获得：构建下述DNA，并将构建的DNA与人来源免疫球蛋白的恒定区cDNA结合，导入表达载体，将该载体导入适当的宿主细胞中进行表达；其中，所述DNA编码将编码与22-23转角Aβ特异性结合的非人动物来源单克隆抗体的VH和VL的CDR的氨基酸序列移植到人抗体的VH和VL的FR上而得到的V区域(参照L.Rieohmann等(1988)Nature，332，323；Kettleborough，C.A.等(1991)Protein Eng.，4，773-783；Clark M.，(2000)Immunol.Today.，21，397-402)。

对于非人动物来源单克隆抗体的CDR而言，将从编码通过上述方法得到的非人动物来源单克隆抗体(例如IBL-101单克隆抗体)的VH和VL的DNA序列预测的氨基酸序列与已知的抗体的VH和VL的全氨基酸序列进行比较，可以获得各CDR的氨基酸序列。已知的抗体的氨基酸序列可以通过例如登录于蛋白数据银行等数据库的抗体的氨基酸序列来获得。

此外，作为人抗体的FR，移植后的抗体只要能够实现本发明的效果即可，没有特殊限制，优选使人化抗体的V区域成为与非人动物来源单克隆抗体的V区域类似的立体结构的人抗体的FR、或与使用的非人动物来源单克隆抗体的FR的氨基酸序列同源性高的人抗体FR。选择出的具有人抗体的FR的人化抗体的V区域是否成为与非人动物来源单克隆抗体的V区域类似的立体结构，例如可以这样判断：基于选择出的含人抗体的FR的V区域的DNA序列信息通过计算机模建预测立体结构，并与使用的非人动物来源单克隆抗体的V区域的立体结构进行比较。使用的非人动物来源单克隆抗体的FR的氨基酸序列可以利用从采用上述方法得到的编码VH和VL的DNA序列预测的氨基酸序列以及CDR的氨基酸序列的信息来获得。此外，为了获得使人化抗体的V区域成为与非人动物来源单克隆抗体的V区域类似的立体结构的人抗体的FR、或与使用的非人动物来源单克隆抗体的FR的氨基酸序列同源性高的人抗体FR，可以在所得的人抗体的FR的氨基酸序列中引入适宜突变。

使用的编码人化抗体的V区域的DNA序列设计成与将非人动物来源单克隆抗体的CDR的氨基酸序列与人抗体的FR的氨基酸序列结合而成的氨基酸序列对应的DNA序列。编码人化抗体的V区域的DNA可以基于设计的DNA序列、采用本领域技术人员公知的方法制作。例如，可以基于设计的DNA以合成DNA的形式化学合成100bp左右长度的DNA片段，通过用PCR进行扩增来获得该DNA片段。此外，通过将该100bp左右的DNA片段使用连接酶等酶进行结合，设计的编码编码人化抗体的V区域的DNA序列的两末端的序列的引物进行PCR，并抽提希望的长度的DNA片段来获得。而且，PCR中使用的编码人化抗体的V区域的DNA也可以通过作为CDR移植已知的方法来获得。此外，使用的编码人化抗体的V区域的DNA还可以通过利用定点突变将编码CDR的DNA导入人抗体的V区域的DNA来获得。定点突变例如可以使用GeneTailor^TMSite Directed Mutagenesis System(Invitrogen公司)、Transformers定点诱变试剂盒(Clontech公司)、Site Directed Mutagenesis System(TAKARABio公司)等，按照该试剂盒的说明来进行。

作为人化抗体的人抗体CH以及CL，可以使用任意的人抗体的CH以及CL。可以列举出例如人γ1、γ2的CH以及人κ的CL。作为编码人抗体的CH以及CL的基因，可以使用染色体DNA或cDNA。通过上述的方法得到的编码人化抗体的V区域的DNA例如分别与编码人抗体的CH以及CL的DNA结合、并导入动物细胞用表达载体，从而能够制作表达本发明的人化抗体的载体。

作为人化抗体的表达中使用的增强子以及启动子，可以列举出免疫球蛋白基因自身的增强子以及启动子或非免疫球蛋白用增强子以及启动子。例如，在使用小鼠作为非人动物的情况下，免疫球蛋白基因的表达调节机制在小鼠与人之间是共通的，因而也可以以包含存在于J基因与C基因间的小鼠或人的增强子序列的形式制作重组DNA。

作为动物细胞用表达载体，可以使用例如pSV2-gpt(R.C.Mulligan and P.Berg(1980)Science，209，1422)。通过上述方法制作的编码本发明的人化抗体的H链以及L链的基因可以导入相同载体，也可以导入不同载体。

而且，对于上述的人型嵌合抗体、人化抗体的制作中使用的非人动物来源单克隆抗体没有特殊限制，只要是与22-23转角Aβ特异性结合的抗体即可，优选小鼠单克隆抗体。

(3)人抗体

人抗体可以通过例如利用人抗体噬菌体文库或产生人抗体的转基因小鼠来获得(富塚等((1997))NATURE Genet.，15，146-156)。

人抗体噬菌体文库是通过从具有人B细胞来源的各种序列的抗体基因池将VH基因以及VL基因导入噬菌体基因，而以融合蛋白质的形式在表面展示人抗体的Fab或scFv等的噬菌体的文库。作为这样的人抗体噬菌体文库，可以列举出：从外周血淋巴细胞等对正常的人具有的抗体的VH基因以及VL基因通过RT-PCR进行扩增、并文库化而得到的幼稚-非免疫文库(Cambridge Antibody Technology公司；Medical Research Council；Dyax公司等)；选择人B细胞内的功能性的特定抗体基因、将V基因片段的CDR3区域等抗原结合区域的部分用编码适当长度的随机的氨基酸序列的寡核苷酸取代、并文库化而得到的合成文库(BioInvent公司；Crucell公司；MorphoSys公司)、以及从癌症、自身免疫性疾病或传染病患者或作为疫苗接种过对象抗原的人的淋巴细胞创建的免疫文库。

例如，幼稚人抗体噬菌体文库可以采用以下的方法来制作。从人的外周血制备mRNA，使用对免疫球蛋白的γ、μ、κ、λ链的恒定区特异的引物合成V基因的cDNA，使用对V基因家族特异的DNA引物组合成各V基因，将它们用编码(Gly4Ser)₃等接头肽的接头DNA通过PCR进行连接，合成scFv基因。将合成的scFv基因在两侧使用载体导入用限制酶位点插入pCANTAb5E等噬菌体载体，用该载体转化大肠杆菌，利用辅助噬菌体进行拯救。

在利用人抗体噬菌体文库的情况下，例如，通过将作为靶标的E22P-Aβ42固定化于固相，使噬菌体抗体文库进行反应，洗涤除去未结合的噬菌体后，回收结合的噬菌体，能够得到希望的克隆(淘选)。此外，通过对所得噬菌体进行扩增、并对扩增得到的文库进一步重复进行淘选，能够提高得到的克隆的精度。通过对所得克隆的VH基因和VL基因进行解析，也能够制作具有这些基因序列的完整人抗体。

人抗体产生转基因小鼠是在敲除了内因性免疫球蛋白(Ig)基因的小鼠中导入人抗体的Ig基因而得到的小鼠。产生人抗体的转基因小鼠例如可以通过以下方法获得。将人-小鼠杂合细胞用秋水仙酰胺(纺锤丝形成抑制剂)处理48小时，形成1～数条染色体被核膜包被而成的结构体——微细胞。将在细胞松弛素B存在下分离的微细胞与染色体受体细胞(小鼠ES细胞)用聚乙二醇进行融合，制作微细胞杂合ES细胞，并注入小鼠胚中。

通过以人抗体产生转基因小鼠作为免疫动物，按照上述的抗体制作方法免疫免疫原，可以得到与22-23转角Aβ特异性结合的抗体。

3.抗体片段的制作

本发明的抗体的片段(F(ab’)₂、Fab’、Fab、scFv、dsFv或者它们的聚合物、双抗体、或、含CDR的肽)可以采用以下方法来制作。

本发明的F(ab’)₂片段可以通过将与22-23转角Aβ特异性结合的IgG抗体用蛋白水解酶胃蛋白酶进行处理、切断H链的234位的氨基酸残基，以分子量约10万的具有抗原结合活性的抗体片段的形式得到。此外，本发明的F(ab’)₂片段可以通过使后述的Fab’硫醚键或二硫键化来获得。

本发明的Fab’片段可以通过将通过上述方法得到的与22-23转角Aβ特异性结合的F(ab’)₂用作为还原剂的二硫苏糖醇进行处理而得到。此外，本发明的Fab’片段可以通过将编码本发明的与22-23转角Aβ特异性结合的抗体的Fab’的DNA插入表达载体，并将该载体导入宿主细胞进行表达来获得。

本发明的Fab片段可以通过将本发明的与22-23转角Aβ特异性结合的抗体用蛋白水解酶木瓜蛋白酶进行处理，切断H链的224位的氨基酸残基，以H链的N末端侧的约一半区域与L链的整个区域通过二硫键结合而成的分子量约5万的具有抗原结合活性的抗体片段的形式来获得。此外，本发明的Fab片段可以通过将编码本发明的与22-23转角Aβ特异性结合的抗体的Fab的DNA插入表达载体，并将该载体导入宿主细胞进行表达来获得。

本发明的scFv可以通过取得编码本发明的与22-23转角Aβ特异性结合的抗体的VH和VL的cDNA，在这些基因之间插入编码接头序列的DNA，构建编码scFv的DNA，并将该DNA插入表达载体，将该载体导入宿主细胞进行表达来获得。对接头的长度没有特殊限制，只要是VH与VL能够合在一起的长度即可，优选10～20个残基，更优选15个残基。此外，对于接头的序列没有特殊限制，只要不抑制VH和VL这两个结构域的多肽链的折叠即可，优选由甘氨酸和/或丝氨酸组成的接头，更优选GGGGS(G：甘氨酸、S：丝氨酸)或其重复序列。

本发明的dsFv可以通过采用定点突变将VH和VL中的各1个氨基酸残基取代成半胱氨酸残基，并将VH和VL用该半胱氨酸残基间的二硫键连接来获得。对取代的氨基酸没有特殊限制，只要是基于其立体结构对抗原结合无影响的氨基酸残基即可。

本发明的双抗体可以通过在编码上述的scFv的DNA中，将接头的氨基酸序列构建成8个残基以下(优选5个残基)，并将该DNA插入表达载体，将该载体导入宿主细胞进行表达来获得。双特异性的双抗体可以通过将不同的2种scFv的VH和VL的DNA组合，制作scFv来获得。

本发明的含CDR的肽可以通过构建本发明的编码与22-23转角Aβ特异性结合的抗体的VH或VL的CDR的氨基酸序列的DNA，并将该DNA插入表达载体，将该载体导入宿主细胞进行表达来获得。

4.药物组合物

通过上述方法得到的抗体等在根据需要进行纯化后，可以按常规方法制剂化，作为各种疾病等的预防和/或治疗剂使用。例如，注射剂包括静脉注射剂、皮下注射剂、皮内注射剂、肌肉注射剂、点滴注射剂等剂型。这样的注射剂可以通过众所周知的方法来制备，例如可以通过在常规用于注射剂的无菌水性介质或油性介质中溶解、悬浮或乳化上述抗体等来制备。作为供注射用的水性介质，有例如生理盐水、含有葡萄糖、蔗糖、甘露醇、其它辅助剂的等张溶液等，其可以与合适的增溶剂诸如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非离子型表面活性剂[例如聚山梨酯80、聚山梨酯20、HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加合物)]、等组合使用。作为油性介质，可以使用例如芝麻油、大豆油等，可以与增溶剂诸如苯甲酸苄酯、苯甲醇等组合使用。通常可以将所制备的注射液充填在适当的安瓿、管形瓶、注射器中。用于直肠施用的栓剂可以通过将上述抗体混合在常规滴鼻剂用基质、栓剂用基质中来制备。

此外，上述抗体也可以通过添加适当的赋形剂，制备冻干制剂，在使用时用注射用水、生理盐水等溶解，来作为注射液。而且，一般地，抗体等蛋白质的口服施用会被消化器官分解，因而是困难的，但是通过在抗体片段、修饰抗体片段及剂型方面下功夫，也存在口服施用的可能性。作为口服施用的制剂，可以列举出例如胶囊剂、片剂、糖浆剂、颗粒剂等。

上述的非口服用药物组合物优选制备成适合于活性成分的施用量的给药单位的剂型。作为这样的给药单位的剂型，可以示例出注射剂(安瓿、管形瓶、预装针)、滴鼻剂、栓剂等，每个各给药单位剂型通常可以含有5～500mg的上述抗体等，优选地，注射剂可以含有5～100mg，其他剂型可以含有10～250mg。

对本发明的药物组合物的施用方法没有特殊限制，只要是能够获得希望的治疗效果或预防效果的方法即可，作为施用部位，可以列举出例如口服施用、口腔内施用、气管内施用、皮下施用、肌肉内施用、血管内(静脉内)施用等，优选能够血管内(例如静脉内、冠动脉内)施用。作为本发明的药剂的施用方法，可以列举出通过注射或静脉点滴注射进行的静脉内施用。此外，本发明的药物组合物可以一过性施用，也可以持续或断续施用。例如，本发明的药剂的施用也可以是1分钟～2周的持续施用。对本发明的药物组合物的施用量没有特殊限制，只要是能够获得希望的治疗效果或预防效果的施用量即可，可以根据症状、性别、年龄等适宜确定。本发明的治疗药物或预防药物的施用量例如可以以AD的治疗效果或预防效果作为指标来确定。例如，在用于AD患者的预防和/或治疗的情况下，作为1次量，本发明的药物组合物适合的是通过静脉注射施用通常0.01～20mg/kg体重左右、优选0.1～10mg/kg体重左右、更优选0.1～5mg/kg体重左右，1月1～10次左右，优选1月1～5次左右。其他非口服施用和口服施用的情况下，可以参照此量施用。在症状特别严重的情况下，可以根据其症状增量或增加施用次数。

5.测定试剂盒·诊断试剂

本发明的抗体等能够与22-23转角Aβ特异性结合，因而能够用于被检液中的22-23转角Aβ的测定。22-23转角Aβ与AD的发病以及恶化相关联，因而本发明的与22-23转角Aβ特异性结合的物质能够用作AD病的诊断试剂。

在生物体外进行测定或诊断的情况下，作为测定方法，可以列举出酶免疫测定法(EIA法)、简易EIA法、酶联免疫吸附测定法(ELISA法)、放射性免疫测定法(RIA法)、荧光免疫测定法(FIA法)等标记化免疫测定法；Western印迹法等免疫印迹法；金胶体凝集法等免疫染色法；离子交换色谱法、亲和色谱法等色谱法；比浊法(TIA法)；散射测浊法(NIA法)；比色法；乳胶凝集法(LIA法)；粒子计数法(CIA法)；化学发光测定法(CLIA法、CLEIA法)；沉降反应法；表面等离子体共振法(SPR法)；共振镜检测器法(resonant mirror detector，RMD法)；比较干涉法等。

此外，在生物体内施用与22-23转角Aβ特异性结合的物质的情况下，可以通过图像诊断来进行诊断。

在利用EIA法进行测定的情况下，通过在使与22-23转角Aβ特异性结合的物质与被测试者的样品中的22-23转角Aβ反应后，使识别与标记的22-23转角Aβ结合的物质的抗体结合，除去非结合抗体后，采用适于标记物质的方法进行测定，能够测定复合体的形成。例如，作为EIA法，在使用生物素标记抗体检测22-23转角Aβ的情况下，可以这样进行测定：将通过稀释被测试者的体液而制备的样品或E22P-Aβ42、以及生物素标记抗体溶液加入固定化有与22-23转角Aβ特异性结合的抗体的96孔平板的各孔中，室温进行反应后，将各孔用洗涤液进行洗涤，加入底物液(TMB)于室温进行反应后，加入反应终止液(2M HCl)，用读板器测定450nm的吸光度。样品中的22-23转角Aβ的浓度可以利用用标准液制作的标准曲线来进行计算。在利用免疫染色法进行测定的情况下，可以这样进行检测：使样品与标记抗体结合后，进行利用了硝基纤维素膜的毛细管现象的色谱，使固定化的抗原特异的抗体结合。而且，在免疫染色法中，通过利用金胶体作为标记，也能够目测确认固定化抗体与样品/标记抗体复合体的结合。此外，例如，在作为化学发光测定法采用CLIA法的情况下，在使鲁米诺衍生物或吖啶衍生物标记的特异性识别22-23转角Aβ的抗体与被测试者的样品中的22-23转角Aβ进行反应后，分离出非结合的抗体，然后通过使吸附于固相的化学发光性的标记体进行发光来进行检测。

在利用图像诊断进行测定的情况下，本发明的诊断方法例如通过施用与22-23转角Aβ特异性结合的物质、以及对于所述物质使用图像诊断装置(例如闪烁造影术、PET或SPECT模态)生成所述物质的一部分以上的图像，能够测定生物体内有无22-23转角Aβ的存在、存在的位置、和/或存在量。本发明的诊断试剂的施用可以局部进行，也可以全身进行。对施用方法没有特殊限制，可以口服或非口服施用。作为非口服的施用途径，可以列举出对皮下、腹腔内、血中(静脉内或者动脉内)或脊髓液的注射或点滴等，优选对血中施用。

6.诊断方法以及收集用于诊断的信息的方法

与22-23转角Aβ结合的物质(特别是本发明的抗体)可以用于基于22-23转角Aβ的疾病的诊断方法、提供用于诊断基于22-23转角Aβ的疾病的信息的方法、监测基于22-23转角Aβ的疾病的状态或进行的方法、以及针对基于22-23转角Aβ的疾病的治疗药物的治疗效果的判定方法(以下统称为“基于22-23转角Aβ的疾病的诊断方法等”)。基于22-23转角Aβ的疾病优选是阿尔茨海默病。

本发明的基于22-23转角Aβ的疾病的诊断方法等具备检测被检物中的22-23转角Aβ的步骤，可以以22-23转角Aβ的生成量为指标来进行诊断。

更具体地，本发明的基于22-23转角Aβ的疾病的诊断方法可以通过以下步骤来进行：

a)制备被测试者来源的试样的步骤、

b)使该试样与至少一种特异性识别22-23转角Aβ的抗体接触的步骤、

c)检测针对22-23转角Aβ的该抗体或其片段的结合、测定22-23转角Aβ的水平的步骤、以及、

d)将22-23转角Aβ的水平与被测试者中的基于22-23转角Aβ的疾病的有无或程度相关联的步骤。

例如，上述方法可以通过ELISA法或免疫染色法来进行。

此外，本发明的基于22-23转角Aβ的疾病的诊断方法可以通过以下步骤来进行：

a)制备被测试者来源的试样的步骤、

b)分离22-23转角Aβ的步骤、

c)检测分离的22-23转角Aβ的步骤、

例如，上述方法可以通过组合使用色谱和质谱来进行。

此外，在上述中，“将22-23转角Aβ的水平与被测试者中的基于22-23转角Aβ的疾病的有无或程度相关联的步骤”可以包括将22-23转角Aβ的量大的被测试者判定为正罹患基于22-23转角Aβ的疾病或罹患的程度高的患者。

此外，本发明的基于22-23转角Aβ的疾病的诊断方法等具备检测被检物中的22-23转角Aβ的步骤，可以以22-23转角Aβ的生成量的比作为指标来进行诊断。作为这样的比，例如可以利用相对于总Aβ量的22-23转角Aβ的比例、或相对于22位和23位的氨基酸不具有转角结构的Aβ的22-23转角Aβ的比例。

被检物中的22-23转角Aβ水平的比例，作为相对于总Aβ的22-23转角Aβ的比例，例如可以通过以下方法来测定，所述方法具备下述步骤：

测定被检物中的总Aβ水平的步骤、

测定被检物中的22-23转角Aβ水平的步骤、以及、

计算相对测定的总Aβ水平的22-23转角Aβ水平的比例的步骤。

因此，本发明的诊断方法例如可以是具备以下步骤的阿尔茨海默病的诊断方法，所述方法包括：

测定被检物中的总Aβ水平的步骤、

测定被检物中的22-23转角Aβ水平的步骤、

计算相对于测定的总Aβ水平的22-23转角Aβ水平的比例的步骤、以及、

将相对于总Aβ水平的22-23转角Aβ水平的比例与阿尔茨海默病的有无或程度相关联的步骤。

更具体地，基于22-23转角Aβ的疾病的诊断方法可以通过以下步骤来进行：

a)制备被测试者来源的试样的步骤、

b)使该试样与特异性识别22-23转角Aβ的抗体接触的步骤、

c)测定22-23转角Aβ的水平的步骤、

d)使该试样与识别22位和23位的氨基酸不具有转角结构的Aβ的抗体或识别Aβ的抗体接触的步骤、

e)测定22位和23位的氨基酸不具有转角结构的Aβ或Aβ的水平的步骤、

f)计算22-23转角Aβ的量与22位和23位的氨基酸不具有转角结构的Aβ或Aβ的量之比的步骤、以及、

g)将计算出的比与被测试者中的基于22-23转角Aβ的疾病的有无或程度相关联的步骤。

在上述中，识别Aβ的抗体优选能够与所有的Aβ结合的抗体，不论转角结构的有无。

在上述中，“将计算出的值与被测试者中的基于22-23转角Aβ的疾病的有无或程度相关联的步骤”可以通过将22-23转角Aβ的量对识别22位和23位的氨基酸不具有转角结构的Aβ的抗体或Aβ的量的比大的被测试者判定为正罹患基于22-23转角Aβ的疾病或罹患的程度高的患者来进行。

本发明的基于22-23转角Aβ的疾病的诊断方法等可以组合已经用作阿尔茨海默病的指标的其他指标来进行。

作为本发明的方法中使用的患者来源的被检物，没有特殊限制，只要是能够检测生物标记的表达的被检物即可，例如可以使用作为活检从被测试者采集的组织试样或液体。对使用的被检物没有特殊限制，能够作为本发明的测定的对象即可，可以列举出例如组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿、浆膜腔液、髓液(例如、脑髓液)、关节液、房水、泪液、唾液或其分级物或者处理物，优选脑组织或血液(包括血浆或血清)。此外，本发明的方法中使用的患者来源的试样可以在测定试验之前进行前处理，也可以直接使用从患者采集的被检物。此外，利用本发明的诊断方法进行分析的定性、定量或半定量地进行。此外，在本发明的诊断方法中，基于22-23转角Aβ的疾病优选阿尔茨海默病。在上述中，基于22-23转角Aβ的疾病的诊断方法可以是提供用于基于22-23转角Aβ的疾病的诊断的信息的方法、或监测基于22-23转角Aβ的疾病的状态或进行的方法。

在本说明书中，为了诊断基于22-23转角Aβ的疾病、而在测定的22-23转角Aβ与基于22-23转角Aβ的疾病的有无或程度的关系中使用的“进行关联”这一术语是指：将被测试者中的22-23转角Aβ的存在、水平、或存在比与基于22-23转角Aβ的疾病的患者或已知可能是基于22-23转角Aβ的疾病的患者、或者不是基于22-23转角Aβ的疾病的患者或可认为不是基于22-23转角Aβ的疾病的患者中的22-23转角Aβ的存在、水平、或存在比进行比较。作为比较对象的患者中的22-23转角Aβ的水平或比例如，可以根据本发明的内容，或者通过测定业已判明基于22-23转角Aβ的疾病或其程度的患者来源的被检物中的22-23转角Aβ的水平来进行评价，或者与利用其他基于22-23转角Aβ的疾病的指标的评价组合来进行评价。利用22-23转角Aβ的水平或比。可以判定患者正在罹患基于22-23转角Aβ的疾病的可能性或罹患的程度。22-23转角Aβ的水平或比与基于22-23转角Aβ的疾病的关联，可以通过统计学分析进行。统计学的显著性可以通过对2个以上的集团进行比较、确定置信区间和/或p值来确定(Dowdyand Wearden，Statistics for Research，John Wiely&Sons，New Yord，1983)。本发明的置信区间可以是例如90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或99.99％。此外，本发明的p值可以是例如0.1、0.05、0.025、0.02、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0002或0.0001。

优选地，22-23转角Aβ可以通过其存在量或存在比与基于22-23转角Aβ的疾病或其程度相关联。例如，可以针对22-23转角Aβ的水平，设定作为罹患基于22-23转角Aβ的疾病的指标的阈值水平或对应作为罹患该疾病的程度的指标的各程度的阈值水平，通过将患者来源的试样中的22-23转角Aβ的水平与阈值水平进行比较来进行关联。作为这样的阈值水平，例如可以设定成灵敏度为50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、或98％以上。此外，阈值水平的特异度可以设定成40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、或98％以上。此外，可以针对22-23转角Aβ与其他Aβ(例如22位和23位的氨基酸不具有转角结构的Aβ或总Aβ)的比率，设定作为罹患基于22-23转角Aβ的疾病的指标的阈值水平或对应作为罹患该疾病的程度的指标的各程度的阈值水平，通过将患者来源的试样中的对其他Aβ的22-23转角Aβ的比与阈值水平相比较来进行关联。作为这样的阈值水平，例如可以设定成灵敏度为50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、或98％以上。此外，阈值水平的特异度可以设定成40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、或98％以上。

以下，为更具体地对本发明进行说明而给出实施例，但本发明不受其限制。而且，整个本说明书中引用的全部文献通过参考直接并入本说明书中。此外，本申请所主张的优先权日本国专利申请2009-239542通过引用全文直接并入本申请中。

(实施例1)针对Aβ42的22位和23位具有转角结构的毒性构象异构体的抗体的制作以及酶免疫测定

在实施例1的实验中，小鼠的维持以及实验按照免疫生物研究所动物保护委员会认可的规程进行。G9C、E22P-Aβ9-35以及E22P-Aβ9-35的分子量用MALDI-TOF-MS进行了确认(K.Irie等(1998)J.A m.Chem.Soc.，120：9159-9167)。

(1)与Aβ42的毒性构象异构体结合的抗体的取得

按照已经报告的方法(K.Murakami等(2002)Biochem.Biophys.Res.Commun.，294：5-10；K.Murakami等(2007)ChemBioChem，8：2308-2314)，合成G9C、E22P-Aβ9-35肽(CYEVHHQKLVFFAPDVGSNKGAIIGLM：SEQ ID NO：1)，作为免疫原使用。在N末端添加半胱氨酸来替代9位的甘氨酸，使之与作为载体蛋白的牛甲状腺球蛋白结合(Y.Horikoshi等(2004)Biochem.Biophys.Res.Commun.，319：733-737)。将BALB/c小鼠(日本Charles River株式会社、日本)用50mg/小鼠的G9C、E22P Aβ9-35肽融合体每周1次免疫1个月。将所得克隆在用50mg/mL的各种抗体突变体包被的96孔Maxisorp平板(Nunc公司、丹麦)中与室温培养1小时后，用辣根过氧化物酶结合抗小鼠IgG抗体(Sigma公司、圣路易斯、密苏里州、美国)进行处理，用3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(Pierce公司、ROCK FIELD、伊利诺伊州、美国)或邻苯二胺二盐酸碱底物(Sigma公司)进行定量。对于所得45个克隆，筛选对处于22位以及23位取β-转角结构的倾向中的Aβ突变体(E22Q-Aβ42、E22G-Aβ42、E22K-Aβ42、E22P-Aβ42、以及D23N-Aβ42)(K.Murakami等(2003)J.Biol.Chem.，278：46179-46187)(图1)的结合能力高的克隆，对选择出的7个克隆进行了亚克隆。重复进行筛选，排除阳性率低或假阳性的克隆。对于所得7个克隆，通过Western印迹进一步进行筛选，得到了克隆IBL-101(未图示)。该杂交瘤作为“AmyloidβHybridoma IBL-101”保藏于独立行政法人产业技术综合研究所、专利生物保藏中心(茨城县筑波市东1-1-1筑波中心中央第6)。保藏微生物的保藏日是2009年10月14日，保藏号是FERM BP-11290。

(2)克隆IBL-101对E22P-Aβ42、Aβ42、Aβ40、以及E22V-Aβ42的结合能力的测定

通过酶免疫测定测定了所得单克隆抗体IBL-101对E22P-Aβ42、Aβ42、Aβ40、以及E22V-Aβ42的结合能力。有报告称，E22V-Aβ42通过在22位导入缬氨酸而难以形成转角结构(P.Y.Chou等(1977)J.Mol.Biol.，115：135-175)。作为对照抗体，使用了Aβ序列的18-22残基(非转角结构部分)具有表位的单克隆抗体4G8(H.M.Wisniewski等(1989)Acta.Neuropathol.，78：22-27)。在用0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL、或1.0m g/mL的各抗体(IBL-101或4G8)包被的96孔平板中添加E22P-Aβ42、Aβ42、Aβ40、E22V-Aβ42、或作为对照的0.1％(w/v)BSA。

(3)克隆IBL-101对22K-23E以及P3-Aβ42的结合能力的测定

像实施例1(2)那样，针对通过22位以及23位的侧链共价结合而在22位以及23位具有转角的Aβ42的构象固定类似物Aβ-内酰胺(22K-23E)(Y.Masuda等(2009)ChemBioChem.，10：287-295)、以及将3个位置的可形成转角结构的部位用脯氨酸残基取代而得到的三重Aβ突变体(P3-Aβ42)(A.Morimoto等(2004)J.Biol.Chem.，279：52781-52788)(图2)，测定了单克隆抗体IBL-101的结合能力。

(4)结果

对E22P-Aβ42、Aβ42、Aβ40、以及E22V-Aβ42的结合能力的测定结果如图3所示。IBL-101对E22P-Aβ42、Aβ42以及Aβ40显示强免疫反应性，但对E22V-Aβ42则显示低亲和性。另一方面，对照抗体4G8对E22P-Aβ42的反应弱，对E22V-Aβ42的结合与Aβ42以及Aβ40等同。E22V-Aβ42难以在22位以及23位形成转角结构(K.Murakami等(2003)J.Biol.Chem.，278：46179-46187)，因而这些结果提示，IBL-101特异性识别具有转角结构的Aβ42、以及4G8不能识别22位和23位具有转角结构的Aβ42。此外，IBL-101不仅与E22P-Aβ42结合，而且还与Aβ42结合，这表明，22位的脯氨酸残基不是特异性的，而与使用将构成作为识别部位的转角结构的22位取代成脯氨酸的突变体作为免疫原无关。

这样，IBL-101是转角结构特异性的，IBL-101对Aβ42以及Aβ40的结合表明，存在22位和23位具有转角结构的Aβ42以及Aβ40。

此外，对22K-23E以及P3-Aβ42的结合能力的测定结果如图4所示。IBL-101对这些突变体也像对Aβ42那样，显示容量依赖性的结合。因此，这些结果也显示IBL-101特异性识别Aβ42的转角结构。

(实施例2)单克隆抗体IBL-101对Aβ42诱导神经细胞毒性的效果

为了确定单克隆抗体IBL-101是否能抑制Aβ42的细胞毒性，通过MTT测定评价了PC12细胞中的Aβ42诱导神经细胞毒性(K.Murakami等(2003)J.Biol.Chem.，278：46179-46187)。将1μM的Aβ42或E22P-Aβ42单独或与0.36μM的单克隆抗体IBL-101一起添加至细胞，37℃培养48小时。使用的Aβ的浓度是接近野生型Aβ42的IC50值得10-6M。

结果如图5所示。用1μM的Aβ42处理后的PC12细胞与对照细胞相比，显示低的生存能力。通过添加0.36μM的单克隆抗体IBL-101，Aβ42的细胞毒性得到了抑制。此外，与野生型Aβ42相比形成Aβ42的毒性构象异构体的倾向强的E22P-Aβ42引起的神经毒性也同样被IBL-101所抑制。因此，这表明，单克隆抗体IBL-101抑制Aβ42以及Aβ42的毒性构象异构体引起的细胞毒性。

(实施例3)人AD患者脑以及APP转基因小鼠的脑的免疫组织化学染色

(1)人脑的制备

在从患者家属获得的书面知情同意下，将AD患者7人、非疾病对照个体6人、以及其他疾病的患者2人(案例14：循环器官疾病；案例15：脊髓灰质炎后综合征)的脑的海马区域切片以及额叶区域切片用于实验。该知情同意以及解剖检查得到了东京都老人综合研究所以及东京都老人医疗中心病院的伦理委员会的许可。各个体的神经病理学的诊断结果如以下表1所示。本实验中的AD的确定诊断基于海马体以及新皮质中的神经原纤维变化以及老年斑的存在而进行。

(2)转基因小鼠脑的制备

解剖从2种APP转基因小鼠——Tg2576(K.Hsiao等(1996)Science，274：99-102)以及J20(L.Mucke等(2000)J.Neurosci.，20：4050-4058)得到的脑，在4％多聚甲醛(和光纯药工业株式会社、大阪、日本)中固定化3～5天，包埋于石蜡中，按常规方法在切片机上切割成5μm厚。本实验中使用的小鼠按照东京都老人综合研究所的动物委员会认可的规程进行维持以及实验。

从切片除去石蜡，进行水合，用磷酸缓冲生理盐水(PBS)洗涤后，用甲酸进行短时间处理。为了防止内因性过氧化，在含有3％过氧化氢的甲醇中静置后，用含有10％正常山羊血清的PBS封闭切片，与第一抗体IBL-101(1：540)或4G8(1：1000)(Signet公司、Dedham、马萨诸赛州、美国)一起于4℃静置过夜。然后，与生物素化第二抗体(Vector Laboratories、Burlingame、加利福尼亚州、美国)一起于室温静置30分钟。免疫反应性按照生产商的规程使用ABC elite试剂盒(Vector Laboratories公司)进行可视化。使用3，3’-二氨基联苯胺(Sigma公司)作为色原体。切片用苏木精进行了对比染色。

(3)抑制测定

通过使IBL-101单克隆抗体与以摩尔数计为200倍以上的免疫原(G9C、E22P-Aβ9-35肽)接触来进行前处理，用于AD患者(案例5)的脑的染色。

(4)结果

将AD患者(案例1以及案例2)的海马区域切片用IBL-101单克隆抗体或4G8单克隆抗体进行染色而得到的结果如图6所示，将AD患者(案例1以及案例2)以及非AD患者(案例3以及案例4)的额叶区域切片用IBL-101单克隆抗体进行染色而得到结果如图7所示。如图6所示，两抗体与典型的淀粉样蛋白斑块反应，而仅在使用IBL-101单克隆抗体的情况下，才确认到数个细胞内染色(箭头符号)。如图7所示，利用IBL-101单克隆抗体进行的该染色在非AD患者的脑中未明显确认。

进行了实验的全部案例中的利用IBL-101单克隆抗体进行染色的结果如以下的表1所示。“IBL-101”的柱的“SP”表示老年斑的染色，“IA”表示细胞内淀粉样蛋白的染色。考察了IBL-101对细胞内淀粉样蛋白的反应性，结果是：AD患者7人中有6人确认了中等程度或以上的染色，而对照个体中确认了温和或少的染色。这表明，细胞内的淀粉样蛋白(特别是Aβ42的22位和23位具有转角结构的Aβ)参与AD的发病。由于细胞内Aβ的蓄积比细胞外Aβ的凝集先发生(Y.Ohyagi等(2008)Curr.Alzheimer Res.，5：555-561)，所以本实验的结果表明，细胞内Aβ的蓄积可以用于AD的诊断、评价。

[表1]

CDR：临床痴呆等级；Braak：Braak分级；SP：老年斑；IA：细胞内淀粉样蛋白；NP diagnosis 神经病理诊断；AD：阿尔茨海默病；+：弱反应性；++：中度反应性；+++：强反应性；-：未检出；N/A：不可用

此外，抑制测定的结果如图8所示。通过用免疫原进行前处理，AD患者脑切片不能被染色。在对照实验中，4G8对IBL-101的免疫原全无反应。这些结果表明，IBL-101特异性识别细胞内以及老年斑的Aβ、特别是22位和23位具有转角结构的Aβ。

将两种转基因小鼠的脑用IBL-101单克隆抗体进行染色而得到的结果如图9所示。在转基因小鼠的脑中，未确认到IBL-101引起的细胞内染色。

(实施例4)Western印迹

为了确认IBL-101抗体是否识别人的脑中的Aβ的寡聚物，进行了Western印迹。

(1)组织的制备

将额叶组织加入添加有0.7μg/mL的抑肽素A(肽研究所、大阪、日本)以及1mM的苯甲磺酰氟(Sigma公司)的150mM NaCl、蛋白酶抑制剂混合液(Complete EDTA-free、Roche-diagnostics、Indianapolis、印第安那州、美国)、以及含有磷酸酶抑制剂混合液(Phos STOP、Roche-diagnostics)的50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.6)(TBS)10倍量(w/v)中，进行了匀浆。匀浆是使用Optima TL ultracentrifuge以及TLA100.4转子(Beckman公司、Palo Alto、加利福尼亚州、美国)于4℃、186，000g进行30分钟离心，然后采集上清以及沉淀物。将所得上清作为可溶性级分(solubule fr.)使用。沉淀物在含有蛋白酶抑制剂的70％甲酸中进行超声波处理，使之溶解(Saido，T.C.等，(1995)Neuron 14，457-466)。将可溶化的沉淀物于4℃、186，000g离心30分钟，将所得上清用1∶20(v/v)量的1M Tris碱(pH11)进行中和，作为非可溶性级分(Insoluble fr.)使用。此外，为了评价IBL-101抗体对AP P的交叉反应性，使用了含蛋白酶Nexin II的重组体人APP(R&D、Minneapolis、明尼苏达州、美国)。

(2)Western印迹

将2μg/μL的可溶性级分、非可溶性级分以及重组体APP上样于使用10-20％Tricine凝胶(Invitrogen、Gaithersburg、马里兰州、美国)的Western印迹，转印于PVDF膜(孔大小0.2μm)(Bio-Rad、Hercules、加利福尼亚州、美国)上。使用微波炉在PBS中将膜加热1分钟，用TBS-T(含0.01％Tween-20以及2.5％脱脂牛乳的TBS)封闭后，与第一抗体(IBL-101：5μg/mL、4G8：1μg/mL、82E1：1μg/mL、抗APP-N末端抗体、以及抗APP-C末端抗体：1μg/mL、抗肌动蛋白抗体(Sigma)：1μg/m L、抗核纤层蛋白抗体(ImQuest)：1μg)于4℃反应过夜。在抗原性的确认实验中，将第一抗体(IBL-101)预先用200倍摩尔过量的抗原(G9C、E22P-Aβ9-35肽)进行了处理。然后，用TBS-T洗涤，与第二抗体于室温反应1小时。显影使用增强化学发光(enhancedchemiluminescence)ECL试剂(GE Health care公司、Buckinghamshire、英国)进行，定量使用LAS-3000(富士Film株式会社、东京、日本)来进行。此外，为了确认蛋白质的存在，使用了考马斯亮蓝。

(3)结果

结果如图10所示。图10A显示了对于从AD患者的脑得到的可溶性级分、使用IBL-101抗体、4G8抗体、以及82E1抗体进行Western印迹而得到的结果。图10B显示了对于从AD患者的脑得到的可溶性级分、使用抗APP-C末端抗体、抗肌动蛋白抗体、以及抗核纤层蛋白抗体进行Western印迹而得到的结果。抗肌动蛋白抗体以及抗核纤层蛋白抗体作为内部对照使用。图中，(a)表示核纤层蛋白(70kDa)，(b)表示β-肌动蛋白(42kDa)，(c)表示APP的C末端片段。

不结合APP而仅结合Aβ的82E1抗体(参照国际公开公报WO2005/080435、图4、以及Horikoshi，Y.等、(2004)Biochem.Biophys.Res.Commun.319，733-737)与4G 8抗体得到了相同模式的结果，由此可以认为被染色的蛋白质是Aβ。此外，由实施例1的结果等可以认为，被用Anti-turn(IBL-101)染色的蛋白质是Aβ42的22位和23位具有转角结构的Aβ；被用4G8染色的蛋白质是未形成转角结构的Aβ。这支持AD患者中特别多地存在具有转角结构的Aβ的事实。使用IBL-101抗体的结果(图10A Anti-turn)显示，识别作为12～17kDa附近的条带确认到的Aβ的寡聚物(Low-molecularwight-oligomers，低分子量寡聚物)(特别是三聚体)。该条带在使用以Aβ的N末端作为表位的4G8抗体以及82E1抗体(Horikoshi，Y.等、(2004)Biochem.Biophys.Res.Commun.319，733-737)进行检测时(图10A 4G8以及82E1)，未能确认。4G8抗体以及82E1抗体主要与Aβ的单体(图10A中箭头所示)强烈反应。该结果与Aβ的寡聚物容易因采取转角结构而形成的事实相一致。

而且，在高分子量区域中，IBL-101抗体显示出了与4G8抗体和82E1抗体中的任何一个均明显不同的条带模式(图10A)。抗APP-C末端抗体的条带模式与IBL-101抗体的不同(图10B)。抗APP-C末端抗体与APP的3个同种型(APP 695、APP 751以及APP 770)反应，但不与分别进行α切断以及β切断而得到的分泌的APPα以及APPβ反应(Selkoe，D.J.(1994)Annu.Rev.Neurosci.17，489-517)。

对IBL-101抗体是否与重组体APP反应进行确认的结果如图10C所示。由该结果可以确认，抗APP-N末端抗体确实与APP反应，但IBL-101抗体不与重组体APP反应。在同一实验中，采用考马斯亮蓝染色也确认了蛋白质(APP)的存在。由这些结果可以确认：用IBL-101抗体检测到的高分子量条带来源于Aβ的凝集物，而不是APP。

为了确认IBL-101抗体的抗原性，进行了使用抗原的吸附实验(图10D)。其结果如图10D所示，通过与抗原进行前处理，基本上得不到低分子量寡聚物的条带。另一方面，在高分子量方面确认到弱条带。这些结果提示，IBL-101抗体对低分子量的寡聚物具有更优选的免疫反应性。

图10E显示了对从AD患者的脑得到的非可溶性级分、使用IBL-101抗体以及4G8抗体进行Western印迹的结果。IBL-101抗体除了单体(图10E中箭头所示)之外，与显示各种分子量的高分子的凝集物反应。另一方面，利用4G8抗体，与高分子量的凝集物相比，更明确地检测到了单体。Aβ的单体因甲酸而高度变性，因而，本实验的结果显示，IBL-101抗体对未变性的Aβ、特别是Aβ的凝集物中存在的Aβ的结构是特异性的。

以上结果显示，IBL-101抗体特异性识别Aβ的凝集物的特征性结构，特别是特异性识别Aβ的22位和23位的氨基酸中的转角结构。

此外，可以确认，相对于用4G8检测到的Aβ，用IBL-101检测到的Aβ寡聚物的量多。这表明：在AD患者的脑中，不仅是Aβ42的22位和23位具有转角结构的Aβ的量的简单增加，相对于不具有转角结构的Aβ的量而言的具有转角结构的Aβ的量的比也大。因此这表明，通过测定不具有转角结构的Aβ量与具有转角结构的Aβ量的比，能够进行AD的诊断。

Claims

1.特异性地识别22位和23位的氨基酸具有转角结构的淀粉样蛋白β的抗体，或者所述抗体的保持该抗体对抗原的作用的片段，其中所述抗体是由保藏号为FERM BP-11290的杂交瘤所产生的，且其中所述片段选自下组：F(ab’)2、Fab’、Fab、单链Fv、二硫键Fv或它们的聚合物，以及二聚体化Ｖ区域。

2.含有权利要求1所述的抗体或其片段作为有效成分的药物组合物。

3.根据权利要求2所述的药物组合物，其是阿尔茨海默病治疗药物。

4.一种22位和23位的氨基酸具有转角结构的淀粉样蛋白β的测定试剂盒，其具有权利要求1所述的抗体或其片段。

5.阿尔茨海默病的诊断试剂，其具有权利要求1所述的抗体或其片段。

6.权利要求1所述的抗体或其片段用于制备用于测定被检物中的22位和23位的氨基酸具有转角结构的淀粉样蛋白β水平的试剂的用途，所述试剂用于被检物中的22位和23位的氨基酸具有转角结构的淀粉样蛋白β水平的测定方法，所述方法具备使被检物和权利要求1所述的抗体或其片段接触的工序。

7.权利要求1所述的抗体或其片段用于制备用于提供诊断阿尔茨海默病的信息的试剂的用途，其中所述提供诊断阿尔茨海默病的信息包括使权利要求1所述的抗体或其片段与被检物接触，检测被检物中的22位和23位的氨基酸具有转角结构的淀粉样蛋白β的步骤。

8.权利要求1所述的抗体或其片段用于制备用于提供诊断阿尔茨海默病的信息的试剂的用途，其中所述提供诊断阿尔茨海默病的信息包括以下步骤：

a)制备被测试者来源的试样的步骤；

b)使该试样与权利要求1所述的抗体或其片段接触的步骤；

c)检测该抗体或其片段对22位和23位的氨基酸具有转角结构的淀粉样蛋白β的结合，测定22位和23位的氨基酸具有转角结构的淀粉样蛋白β的水平的步骤；以及

d)将22位和23位的氨基酸具有转角结构的淀粉样蛋白β的水平与被测试者中阿尔茨海默病的有无或程度相关联的步骤，

其中将在22位和23位的氨基酸具有转角结构的淀粉样蛋白β的量大的被测试者判定为正罹患阿尔茨海默病或罹患阿尔茨海默病程度高的患者。

9.权利要求1所述的抗体或其片段用于制备用于测定被检物中相对于总淀粉样蛋白β的22位和23位的氨基酸具有转角结构的淀粉样蛋白β的比例的试剂的用途，所述试剂用于测定被检物中相对于总淀粉样蛋白β的22位和23位的氨基酸具有转角结构的淀粉样蛋白β的比例的方法，所述方法具备:

测定被检物中的总淀粉样蛋白β水平的步骤；

通过使被检物和权利要求1所述的抗体或其片段接触，测定被检物中的22位和23位的氨基酸具有转角结构的淀粉样蛋白β水平的步骤；以及

计算相对于测定得到的总淀粉样蛋白β水平的22位和23位的氨基酸具有转角结构的淀粉样蛋白β水平的比例的步骤。

10.权利要求1所述的抗体或其片段用于制备用于提供诊断阿尔茨海默病的信息的试剂的用途，其中所述提供诊断阿尔茨海默病的信息包括:

测定被检物中的总淀粉样蛋白β水平的步骤；

通过使被检物和权利要求1所述的抗体或其片段接触，测定被检物中的22位和23位的氨基酸具有转角结构的淀粉样蛋白β水平的步骤；

计算相对于测定得到的总淀粉样蛋白β水平的22位和23位的氨基酸具有转角结构的淀粉样蛋白β水平的比例的步骤；以及

将相对于总淀粉样蛋白β水平的22位和23位的氨基酸具有转角结构的淀粉样蛋白β水平的比例与阿尔茨海默病的有无或程度相关联的步骤，

其中将在22位和23位的氨基酸具有转角结构的淀粉样蛋白β的量相对于淀粉样蛋白β的量的比例较高的被测试者判定为正罹患阿尔茨海默病或罹患阿尔茨海默病程度高的患者。

11.权利要求6或9的用途，其中所述被检物是脑组织或血液被检物。

12.权利要求7、8或10的用途，其中所述被检物是脑组织或血液被检物。