CN113308439B - 分泌人淀粉样蛋白-β单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

分泌人淀粉样蛋白-β单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于免疫检测领域，公开了二种分泌抗人源淀粉样蛋白‑β1‑42位氨基酸单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，用于分泌抗hAβ1‑42单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号分别为CCTCC NO C2020131、CCTCC NO C2020132。本发明通过提供2株分泌抗新型hAβ1‑42单克隆抗体的杂交瘤细胞株，能够制备获得特异性识别人源淀粉样蛋白‑β单体、人源淀粉样蛋白‑β突变体单体、低分子量人源淀粉样蛋白‑β、低分子量人源淀粉样蛋白‑β突变体、人源淀粉样蛋白‑β原纤维、人源淀粉样蛋白‑β突变体原纤维的单克隆抗体，有效解决市场现有的hAβ1‑42单克隆抗体质量水平参差不齐、严重限制试剂盒质量等问题。

Description

分泌人淀粉样蛋白-β单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
技术领域
本发明属于免疫检测领域，更具体地，涉及两种分泌抗人源淀粉样蛋白-β1-42位氨基酸(human amyloid beta peptide 1-42,hAβ1-42)单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，尤其涉及两株能够分泌抗hAβ1-42单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
背景技术
随着社会的老龄化，引起痴呆的阿兹海默症发病率逐年升高。目前，我国痴呆症的患病数量显著高出世界平均水平。阿兹海默病(Alzheimer's disease,AD)，又译为阿尔茨海默病，俗称的老年痴呆症，是发生在老年期及老年前期的一种原发性退行性脑病，指的是一种持续性高级神经功能活动障碍，即在没有意识障碍的状态下，记忆、思维、分析判断、视空间辨认、情绪等方面的障碍。其特征性病理变化为大脑皮层萎缩，并伴有β-淀粉样蛋白沉积，神经原纤维缠结，大量记忆性神经元数目减少，以及老年斑的形成。目前尚无特效治疗或逆转疾病进展的治疗药物。
目前中国有老年痴呆患者500万人之多，占世界总病例数的四分之一，而且每年平均有30万新发病例。目前中国老年痴呆的患病率已随着年龄的升高呈显著增长趋势：75岁以上达8.26％，80岁以上高达11.4％；老年痴呆的患者女性多于男性，60岁以上妇女患老年痴呆，通常是相匹配男性的2到3倍。
阿兹海默症仍然缺乏有效的早期诊断方法和治疗手段，给患者家庭和社会都带来极大的经济负担。因此，早期诊断阿尔茨海默病(AD)是极其需要的。此外，临床需要大量的生物标志物来识别MCI患者的早期AD。而脑脊液生物标志物淀粉样蛋白的42个氨基酸残基，证明有足够高诊断准确性，以满足这一挑战。人源淀粉样蛋白-β1-42位氨基酸(即，human Aβ1-42,hAβ1-42，由42个特定的氨基酸组成)是一种特定的蛋白，然而，目前针对Aβ1–42的检测方法相对匮乏。
免疫学检测由于其灵敏度高，速度快的优势，得到越来越广泛的应用。人源淀粉样蛋白-β免疫学检测试剂盒质量的最主要制约因素就是生物活性原材料的质量。从方法学上来说，hAβ1-42检测试剂盒大多采用双抗体夹心法，其生物活性原材料就是hAβ1-42单克隆抗体。而市场现有的hAβ1-42单克隆抗体质量水平参差不齐，绝大部分与Aβ1-40或者其他形式的Aβ发生交叉反应，严重限制了试剂盒的质量。鉴于此，有必要开发出高质量的hAβ1-42单克隆抗体，以满足试剂盒的质量要求。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明的目的在于提供分泌抗hAβ1-42单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，通过提供二株新型分泌抗hAβ1-42单克隆抗体的杂交瘤细胞株，利用该杂交瘤细胞株能够制备获得能特异性识别hAβ1-42、hAβ1-42-E22G、LMW-hAβ1-42、LMW-hAβ1-42-E22G、Protofribril-hAβ1-42、Protofribril-hAβ1-42-E22G的单克隆抗体，并可进一步对这些hAβ1-42单克隆抗体进行后续应用，能够有效解决市场现有的hAβ1-42单克隆抗体质量水平参差不齐、严重限制试剂盒质量等问题。其中，人源淀粉样蛋白-β1-42位氨基酸单体简写成hAβ1-42，人源淀粉样蛋白-β1-42位氨基酸第22位氨基酸由谷氨酸突变成甘氨酸简写成hAβ1-42-E22G；人源淀粉样蛋白-β1-42位氨基酸单体通过相互折叠，得到的分子量小于20kDa的低分子量人源淀粉样蛋白-β简写成LMW-hAβ1-42(此时，42位人源淀粉样蛋白-β经过了折叠后，Aβ1-42的结合可以包括氨基酸两两结合、三三结合甚至是四四结合)；人源淀粉样蛋白-β1-42位氨基酸第22位氨基酸由谷氨酸突变成甘氨酸的突变体单体，通过相互折叠得到的分子量小于20kDa的低分子量人源淀粉样蛋白-β突变体简写成LMW-hAβ1-42-E22G(此时，42位人源淀粉样蛋白-β突变体单体经过了折叠后，Aβ1-42的结合可以包括氨基酸两两结合、三三结合甚至是四四结合)；人源淀粉样蛋白-β1-42位氨基酸单体经过折叠对应形成的纤维状原纤维简写成Protofribril-hAβ1-42(当然，Protofribril-hAβ1-42也可能由单体先折叠形成LMW-hAβ1-42，再由LMW-hAβ1-42折叠得到)；人源淀粉样蛋白-β1-42位氨基酸第22位氨基酸由谷氨酸突变成甘氨酸后的单体经过折叠对应形成的纤维状原纤维简写成Protofribril-hAβ1-42-E22G(当然，Protofribril-hAβ1-42-E22G也可能由单体hAβ1-42-E22G先折叠形成LMW-hAβ1-42-E22G，再由LMW-hAβ1-42-E22G折叠得到)。本发明制备获得的单克隆抗体具有特异性强、效价高、稳定性好的特点，能应用于制备hAβ1-42检测试剂中，并可以作为基础开发用于治疗老年痴呆的抗体药物及相关疫苗。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种用于分泌抗hAβ1-42单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO C2020131；其中，hAβ1-42代表人源淀粉样蛋白-β1-42位氨基酸单体。
按照本发明的另一方面，提供了一种用于分泌抗hAβ1-42单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO C2020132；其中，hAβ1-42代表人源淀粉样蛋白-β1-42位氨基酸单体。
按照本发明的又一方面，本发明提供了上述用于分泌抗hAβ1-42单克隆抗体的杂交瘤细胞株在制备抗hAβ1-42单克隆抗体中的应用。
按照本发明的又一方面，本发明提供了上述用于分泌抗hAβ1-42单克隆抗体的杂交瘤细胞株在制备hAβ1-42、hAβ1-42-E22G、LMW-hAβ1-42、LMW-hAβ1-42-E22G、Protofribril-hAβ1-42、或Protofribril-hAβ1-42-E22G检测试剂中的应用；其中，
所述hAβ1-42为人源淀粉样蛋白-β1-42位氨基酸单体，即分子量为4.5kDa的人源淀粉样蛋白-β单体；
所述hAβ1-42-E22G为人源淀粉样蛋白-β1-42位氨基酸第22位氨基酸由谷氨酸突变成甘氨酸后对应得到的分子量为4.5kDa的人源淀粉样蛋白-β突变体单体；
所述LMW-hAβ1-42为人源淀粉样蛋白-β1-42位氨基酸单体通过相互折叠对应得到的分子量小于20kDa的低分子量人源淀粉样蛋白-β；
所述LMW-hAβ1-42-E22G为人源淀粉样蛋白-β1-42位氨基酸第22位氨基酸由谷氨酸突变成甘氨酸对应得到的人源淀粉样蛋白-β突变体单体，通过相互折叠对应得到的分子量小于20kDa的低分子量人源淀粉样蛋白-β突变体；
所述Protofribril-hAβ1-42为人源淀粉样蛋白-β1-42位氨基酸单体经过折叠形成的纤维状原纤维；
所述Protofribril-hAβ1-42-E22G为人源淀粉样蛋白-β1-42位氨基酸第22位氨基酸由谷氨酸突变成甘氨酸后对应得到的人源淀粉样蛋白-β突变体单体，经过折叠形成的纤维状原纤维。
按照本发明的再一方面，本发明提供了上述用于分泌抗hAβ1-42单克隆抗体的杂交瘤细胞株在制备hAβ1-42、hAβ1-42-E22G、LMW-hAβ1-42、LMW-hAβ1-42-E22G、Protofribril-hAβ1-42、或Protofribril--hAβ1-42-E22G检测试剂盒中的应用；其中，
所述hAβ1-42为人源淀粉样蛋白-β1-42位氨基酸单体，即分子量为4.5kDa的人源淀粉样蛋白-β单体；
所述hAβ1-42-E22G为人源淀粉样蛋白-β1-42位氨基酸第22位氨基酸由谷氨酸突变成甘氨酸后对应得到的分子量为4.5kDa的人源淀粉样蛋白-β突变体单体；
所述LMW-hAβ1-42为人源淀粉样蛋白-β1-42位氨基酸单体通过相互折叠对应得到的分子量小于20kDa的低分子量人源淀粉样蛋白-β；
所述LMW-hAβ1-42-E22G为人源淀粉样蛋白-β1-42位氨基酸第22位氨基酸由谷氨酸突变成甘氨酸对应得到的人源淀粉样蛋白-β突变体单体，通过相互折叠对应得到的分子量小于20kDa的低分子量人源淀粉样蛋白-β突变体；
所述Protofribril-hAβ1-42为人源淀粉样蛋白-β1-42位氨基酸单体经过折叠形成的纤维状原纤维；
所述Protofribril-hAβ1-42-E22G为人源淀粉样蛋白-β1-42位氨基酸第22位氨基酸由谷氨酸突变成甘氨酸后对应得到的人源淀粉样蛋白-β突变体单体，经过折叠形成的纤维状原纤维。
按照本发明的最后一方面，本发明提供了上述用于分泌抗hAβ1-42单克隆抗体的杂交瘤细胞株在制备用于治疗老年痴呆抗体药物中的应用。
作为本发明的进一步优选，所述用于治疗老年痴呆抗体药物具体是用于抑制人源淀粉样蛋白-β单体或者低分子量人源淀粉样蛋白-β折叠成人源淀粉样蛋白-β纤维、或是用于清除淀粉样斑块；其中，
所述低分子量人源淀粉样蛋白-β为人源淀粉样蛋白-β1-42位氨基酸单体通过相互折叠对应得到的分子量小于20kDa的低分子量人源淀粉样蛋白-β。
通过本发明所构思的以上技术方案，本发明利用现有技术已知方法合成的人源淀粉样蛋白-β42个氨基酸突变体(Aβ1-42-E22G)，该蛋白较于普通的人源淀粉样蛋白-β，如，42位人源淀粉样蛋白-β(简写成hAβ1-42，本领域公认由42个特定的氨基酸组成)，40位人源淀粉样蛋白-β40个氨基酸(简写成hAβ1-40，本领域公认由40个特定的氨基酸组成)，38位人源淀粉样蛋白-β(简写成hAβ1-38，本领域公认由38个特定的氨基酸组成)，更容易形成人源淀粉样蛋白原纤维(Protofribril-Aβ)。而Protofribril-Aβ已经被证明是在导致老年痴呆疾病中毒性最高的物质，并且以Aβ1-42-E22G制备的抗体能够在一定程度上避免与Aβ1-40等其他形式的Aβ发生交叉反应。基于上述优点，本发明采用Aβ1-42-E22G作为抗原四次免疫Balb/c小鼠后，再用进行尾静脉加强免疫；将针对Aβ1-42-E22G效价最高的小鼠取脾细胞，与SP2/0骨髓细胞进行融合，共筛选获得2株抗Aβ1-42-E22G杂交瘤细胞株1F12，2C6。用本发明方法制备获得的2株单克隆抗体具有特异性强、效价高、稳定性好等特点，可应用于制备hAβ1-42检测试剂中。
利用本发明中的2株杂交瘤细胞株，可用于分泌制备抗hAβ1-42单克隆抗体，得到的特异性识别hAβ1-42、hAβ1-42-E22G、LMW-hAβ1-42、LMW-hAβ1-42-E22G、Protofribril-hAβ1-42、Protofribril-hAβ1-42-E22G的单克隆抗体可进一步应用于制备hAβ1-42检测试剂(如不同形式hAβ1-42检测试剂盒等)，也可用于抑制人源淀粉样蛋白-β单体或者低分子量人源淀粉样蛋白-β折叠成人源淀粉样蛋白-β纤维、制备抗体药物以清除淀粉样斑块，治疗老年痴呆。
附图说明
图1中的A为合成人源淀粉样蛋白-β突变体Aβ1-42(E22G)的SDS-PAGE结果；图1中的B为细胞融合后，融合成功的杂交瘤细胞上清ELISA检测结果；图1中的C为单克隆抗体亚型检测结果；图1中的D为2株抗人源淀粉样蛋白-β小鼠腹水的ELISA活性检测结果。对于图1中的D，横坐标轴上自左向右依次代表1F12、Control(1F12)、2C6、Control(2C6)。
图2中的A为制备的LMW-Aβ1-42，LMW-Aβ1-42(E22G)，Protofribril-Aβ1-42，Protofribril-Aβ1-42(E22G)的透射电镜结果；图2中的B为1F12，2C6检测LMW-Aβ1-42，LMW-Aβ1-42(E22G)，Protofribril-Aβ1-42，Protofribril-Aβ1-42(E22G)的Western blot结果；图2中的C为单抗1F12，2C6特异性检测结果；图2中的D为单抗1F12，2C6 APP/PS1鼠脑中Aβ蛋白的免疫荧光结果。对于图2中的C，不论1F12还是2C6，横坐标轴上自左向右依次均代表Aβ1-42(E22G)、Tau396,404、Cis-Tau、Trans-tau、ZIKV-NS1、Skimed milk、BAS、Control。
图3为1F12单抗腹水及2C6单抗腹水的效价图；其中，图3中的A为1F12单抗腹水的效价；图3中的B为2C6单抗腹水的效价。
图4中的A为1F12对LMW-Aβ1-42亲和力检测结果；图4中的B为1F12对LMW-Aβ1-42(E22G)亲和力检测结果；图4中的C为1F12对Protofribril-Aβ1-42亲和力检测结果；图4中的D为1F12对Protofribril-Aβ1-42(E22G)亲和力检测结果。
图5中的A为2C6对LMW-Aβ1-42亲和力检测结果；图5中的B为2C6对LMW-Aβ1-42(E22G)亲和力检测结果；图5中的C为2C6对Protofribril-Aβ1-42亲和力检测结果；图5中的D为2C6对Protofribril-Aβ1-42(E22G)亲和力检测结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1：抗人源淀粉样蛋白-β特异性单克隆抗体的制备
为便于下文指代，现将主要缩写的含义解释如下：
hAβ1-42：1-42位人源淀粉样蛋白-β单体(本领域公认由42个特定的氨基酸组成)。
hAβ1-42-E22G，也记为hAβ1-42(E22G)：hAβ1-42第22位氨基酸由谷氨酸突变成甘氨酸的突变体单体(本领域公认由42个特定的氨基酸组成)。
LMW-hAβ1-42：hAβ1-42经氨基酸结合(如氨基酸两两结合、三三结合甚至是四四结合)对应得到的分子量小于20kDa的低分子量人源淀粉样蛋白-β。
LMW-hAβ1-42-E22G，也记为LMW-hAβ1-42(E22G)：hAβ1-42第22位氨基酸由谷氨酸突变成甘氨酸的突变体单体，经氨基酸结合(如氨基酸两两结合、三三结合甚至是四四结合)对应得到的分子量小于20kDa的低分子量人源淀粉样蛋白-β突变体。
Protofribril-hAβ1-42：由hAβ1-42对应形成的纤维状原纤维(既可能由hAβ1-42单体折叠得到，也可能由LMW-hAβ1-42折叠得到)。
Protofribril-hAβ1-42-E22G，也记为Protofribril-hAβ1-42(E22G)：由hAβ1-42第22位氨基酸由谷氨酸突变成甘氨酸的突变体对应形成的纤维状原纤维(既可能由hAβ1-42-E22G单体折叠得到，也可能由LMW-hAβ1-42-E22G折叠得到)。
1、抗原的制备
将采用现有技术已知方法合成的人源淀粉样蛋白-β(hAβ1-42(E22G))，溶于10mMNaOH，并用PBS稀释至终浓度为50μM。结果：SDS-PAGE结果表明，合成的多肽纯度良好，电泳条带均一。
2、小鼠单克隆抗体的制备
2.1、小鼠的免疫
取100μL制备好的抗原与等体积的弗氏完全佐剂进行混合后进行第一次免疫；第一次免疫14天后进行第二次免疫，取100μL制备好的抗原与等体积的弗氏不完全佐剂进行混合后免疫；第三次免疫与第二次相同，间隔14天。第三次免疫后，取100μL制备好的抗原进行尾静脉加强免疫。
3.2、细胞融合筛选阳性克隆
加强免疫3天后，收集小鼠的脾细胞与SP2/0细胞进行融合，用含有20％血清的HAT培养基培养融合的细胞，一周后半量更换HT培养基；细胞融合12后天进行第一次ELISA检测，取阳性孔进行第一次亚克隆；第一次亚克隆14天，进行第二次ELISA检测，取阳性孔进行第二次亚克隆；第二次亚克隆14天，进行第三次ELISA检测；如果经过3次亚克隆后，ELISA检测结果均为阳性，则说明已经成为单克隆，扩大培养后冻存于液氮中。
3.3、制备及纯化腹水
取3只6-7周龄的雌性Balb/c小鼠腹腔注射0.5mL的无菌液体石蜡，一周后每只小鼠腹腔注射108个杂交瘤细胞；一周后，进行腹水的收集；利用protein A Sepharose柱进行腹水的纯化。
结果：细胞融合后，将融合成功的孔进行ELISA检测，检测结果如图1中的B所示；经过3轮亚克隆，成功筛选出2株抗Aβ1-42的单抗细胞株命名为1F12，2C6。将它们分别保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其中，1F12株的保藏编号为：CCTCC No C2020131，分类命名为：Hustabomab-1F12(杂交瘤细胞株)，保藏时间为：2020年9月14日；2C6株的保藏编号为：CCTCC No C2020132，分类命名为：Hustabomab-2C6(杂交瘤细胞株)，保藏时间为：2020年9月14日；保藏单位均为：中国典型培养物保藏中心；保藏地址是：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心。
3.4、单克隆抗体的生物学特性的鉴定
3.4.1、单抗亚型的鉴定
按Sigma公司的Mouse mab Isotyping Test Kit(10assay kit)的说明书进行。
结果：2株抗体亚型检测结果如图1中的C，确定1F12，2C6单克隆抗体经鉴定为IgG2a(κ)。
3.4.2、单抗活性的鉴定
3.4.2.1ELISA检测
①包被抗原：将抗原用PBS稀释至10μg/mL，然后每孔加入100μL的抗原于4℃包被过夜；
②封闭：包被完成后，弃孔中液体，PBS-T洗涤3次后，每孔加入200μL的封闭液，于37℃封闭2h；
③加入一抗：封闭完成后，弃孔中液体，PBS-T洗涤3次后，每孔加入100μL用脱脂奶稀释的单抗(1:1000)，于37℃反应2h；
④加入酶标二抗：反应结束后，弃孔中液体，PBS-T洗涤3次后，每孔加入100μL用封闭液稀释的山羊抗小鼠的酶标二抗(1:6000)，于37℃反应1h；
⑤显色：反应结束后，弃孔中液体，PBS-T洗涤3次后，每孔加入100μL TMB，于37℃反应15min；
⑥终止：每孔加入50μL 2M H2SO4终止，然后在酶标仪上读取OD450；
结果：所制备的单抗腹水进行ELISA活性检测；ELISA结果显示(图1中的D)，2株单抗腹水均能与Aβ1-42反应。
3.4.2.2不同类型Aβ1-42的合成
3.4.2.2.1LMW-Aβ1-42，LMW-Aβ1-42(E22G)的合成
将合成的Aβ1-42和Aβ1-42(E22G)多肽溶于10mM NaOH，用2×PBS稀释到终浓度为50μM，-20℃储存。
3.4.2.2.2Protofribril-Aβ1-42，Protofribril-Aβ1-42(E22G)的合成
将合成的Aβ1-42溶于10mM NaOH，用10×PBS稀释到终浓度为443μM，37℃孵育过夜，然后用1×PBS稀释到终浓度为50μM，-20℃储存。将合成的Aβ1-42(E22G)溶于10mM NaOH，用2×PBS稀释到终浓度为50μM，37℃孵育1h，-20℃储存。
结果：成功制备出LMW-Aβ1-42，LMW-Aβ1-42(E22G)，Protofribril-Aβ1-42，Protofribril-Aβ1-42(E22G)，其透射电镜结果如图2中的A。此外，在制备Protofribril-Aβ1-42过程中我们发现Aβ1-42(E22G)合成的速度远远快于Aβ1-42。
3.4.2.3Western blot检测
(1)上样：配制12％SDS-PAGE，每孔上样1μg不同类型Aβ1-42。
(2)转膜：跑胶结束后，取下玻璃板，用超纯水清洗凝胶。然后按照“三明治”结构，在正极白色垫板上放置海绵垫-滤纸-NC膜-凝胶-滤纸-海绵垫-黑色海垫板。
(3)封闭：转膜结束后，用干净的镊子小心取出NC膜，加入一定体积的PBS-T，80转/分钟，洗涤5min。清洗后，加入10mL封闭液，于37℃封闭2h。加入PBS-T洗涤三次，每次5min。
(4)加一抗：弃掉封闭液，加入单抗腹水(1:1000)，37℃，孵育2h。
(5)加二抗：将一抗回收后用PBS-T在水平摇床上80转/分钟，洗膜5次，每次5min。然后加入HRP标记的山羊抗小鼠IgG(1:5000),37℃，80转/分钟孵育1h。
(6)显色：将二抗回收后，用PBS-T在水平摇床上80转/分钟，洗膜5次，每次5min。然后加入等体积ECL A液和B液，混匀后，均匀的滴加到膜上，在成像仪下显色发光观察结果。
结果：所制备的单抗腹水进行Western blot检测；Western blot结果显示(图2中的B)，2株单抗腹水均能与合成的不同类型hAβ1-42反应。
3.4.2.3IFA检测
(1)样品制备：取一只6月龄的APP/PS1小鼠的大脑，进行冰冻切片。
(2)透膜：选择合适的玻片，用PBS洗涤3次，用0.2％Triton-PBS 4℃过夜透膜。
(3)封闭：用3％BSA-PBS室温封闭2h。
(4)加入一抗：弃去封闭液，用PBS洗涤3次后，加入100μL抗体，4℃孵育2h。
(5)加入荧光二抗：弃去一抗，PBS洗涤3次后，每孔加入100μL的二抗，室温2h。
结果：所制备的单抗腹水进行IFA活性检测；IFA结果显示(图2中的D)，2株单抗腹水均能与天然的hAβ反应。
3.4.3、单抗特异性鉴定
3.4.3.1ELISA检测
①包被抗原：将Aβ、Tau396,404、Cis-Tau、Trans-Tau、ZIKV-NS1、BSA、脱脂奶用PBS稀释至10μg/mL，然后每孔加入100μL的抗原于4℃包被过夜；
②封闭：包被完成后，弃孔中液体，PBS-T洗涤3次后，每孔加入200μL的封闭液，于37℃封闭2h；
③加入一抗：封闭完成后，弃孔中液体，PBS-T洗涤3次后，每孔加入100μL用脱脂奶稀释的单抗(1:1000)，于37℃反应2h；
④加入酶标二抗：反应结束后，弃孔中液体，PBS-T洗涤3次后，每孔加入100μL用封闭液稀释的山羊抗小鼠的酶标二抗(1:6000)，于37℃反应1h；
⑤显色：反应结束后，弃孔中液体，PBS-T洗涤3次后，每孔加入100μL TMB，于37℃反应15min；
结果：所制备的单抗腹水只特异性的与Aβ反应，与其他对照抗原均不反应；ELISA特异性检测结果如图2中的C所示。
3.4.4、单抗效价检测
(1)包被抗原：将抗原用包被液稀释至10μg/mL，以100μL/孔加入酶标板于4℃包被过夜。
(2)封闭：包被完成后，弃孔中液体，PBS-T洗涤3次后，每孔加入200μL的封闭液，于37℃封闭2h。
(3)加入一抗：封闭完成后，弃孔中液体，PBS-T洗涤3次后，每孔加入100μL用封闭液梯度稀释的抗体(1:100-1:409600)，将96孔板置于37℃孵育2h。
(4)加入酶标二抗：2h后，弃孔中液体，PBS-T洗涤3次后，每孔加入100μL HRP标记的山羊抗小鼠IgG二抗(1:5000)。将96孔板置于37℃反应1h。
(5)显色：1h后，弃孔中液体，PBS-T洗涤3次后，每孔加入100μL可溶性TMB底物显色液，于37℃反应20min。
(6)终止：每孔加入50μL 2M H2SO4终止，然后通过酶标仪测量OD450值。
结果：1F12单抗效价为1:204800(图3中的A)；2C6单抗效价为1:102400(图3中的B)。
3.4.5、单抗亲和力检测
(1)包被抗原：将不同形式的hAβ1-42用包被液稀释至10μg/mL，以100μL/孔加入酶标板于4℃包被过夜。
(2)封闭：包被完成后，弃孔中液体，PBS-T洗涤3次后，每孔加入200μL的封闭液，于37℃封闭2h。
(3)加入抗血清：封闭完成后，弃孔中液体，PBS-T洗涤3次后，每孔加入100μL用封闭液梯度稀释的抗体(10-20000ng)，将96孔板置于37℃孵育2h。
(4)加入酶标二抗：2h后，弃孔中液体，PBS-T洗涤3次后，每孔加入100μL HRP标记的山羊抗小鼠IgG二抗(1:5000)。将96孔板置于37℃反应1h。
(5)显色：1h后，弃孔中液体，PBS-T洗涤3次后，每孔加入100μL可溶性TMB底物显色液，于37℃反应20min。
(6)终止：每孔加入50μL 2M H2SO4终止，然后通过酶标仪测量OD450值。
结果如下：1F12对LMW-hAβ1-42的Kd值为0.91±0.052nM(图4中的A)，1F12对LMW-hAβ1-42(E22G)的Kd值为0.42±0.035nM(图4中的B)，1F12对Protofribril-hAβ1-42的Kd值为0.77±0.041nM(图4中的C)，1F12对Protofribril-hAβ1-42(E22G)的Kd值为0.38±0.035nM(图4中的D)。2C6对LMW-hAβ1-42的Kd值为3.93±0.17nM(图5中的A)，2C6对LMW-hAβ1-42(E22G)的Kd值为1.74±0.13nM(图5中的B)，2C6对Protofribril-hAβ1-42的Kd值为1.8±0.14nM(图5中的C)，2C6对Protofribril-hAβ1-42(E22G)的Kd值为0.84±0.041nM(图5中的D)。
本发明未详细说明之处(如所采用的试剂、进行的处理操作等)，均可直接参照相关现有技术
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种用于分泌抗hAβ1-42单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO C2020131；其中，hAβ1-42代表人源淀粉样蛋白-β1-42位氨基酸单体。
2.一种用于分泌抗hAβ1-42单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO C2020132；其中，hAβ1-42代表人源淀粉样蛋白-β1-42位氨基酸单体。
3.如权利要求1或2所述用于分泌抗hAβ1-42单克隆抗体的杂交瘤细胞株在制备抗hAβ1-42单克隆抗体中的应用。
4.如权利要求1或2所述用于分泌抗hAβ1-42单克隆抗体的杂交瘤细胞株在制备hAβ1-42、hAβ1-42-E22G、LMW-hAβ1-42、LMW-hAβ1-42-E22G、Protofribril-hAβ1-42、或Protofribril-hAβ1-42-E22G检测试剂中的应用；其中，
所述hAβ1-42为人源淀粉样蛋白-β1-42位氨基酸单体，即分子量为4.5kDa的人源淀粉样蛋白-β单体；
所述hAβ1-42-E22G为人源淀粉样蛋白-β1-42位氨基酸第22位氨基酸由谷氨酸突变成甘氨酸后对应得到的分子量为4.5kDa的人源淀粉样蛋白-β突变体单体；
所述LMW-hAβ1-42为人源淀粉样蛋白-β1-42位氨基酸单体通过相互折叠对应得到的分子量小于20kDa的低分子量人源淀粉样蛋白-β；
所述LMW-hAβ1-42-E22G为人源淀粉样蛋白-β1-42位氨基酸第22位氨基酸由谷氨酸突变成甘氨酸对应得到的人源淀粉样蛋白-β突变体单体，通过相互折叠对应得到的分子量小于20kDa的低分子量人源淀粉样蛋白-β突变体；
所述Protofribril-hAβ1-42为人源淀粉样蛋白-β1-42位氨基酸单体经过折叠形成的纤维状原纤维；
所述Protofribril-hAβ1-42-E22G为人源淀粉样蛋白-β1-42位氨基酸第22位氨基酸由谷氨酸突变成甘氨酸后对应得到的人源淀粉样蛋白-β突变体单体，经过折叠形成的纤维状原纤维。
5.如权利要求1或2所述用于分泌抗hAβ1-42单克隆抗体的杂交瘤细胞株在制备hAβ1-42、hAβ1-42-E22G、LMW-hAβ1-42、LMW-hAβ1-42-E22G、Protofribril-hAβ1-42、或Protofribril-hAβ1-42-E22G检测试剂盒中的应用；其中，
所述hAβ1-42为人源淀粉样蛋白-β1-42位氨基酸单体，即分子量为4.5kDa的人源淀粉样蛋白-β单体；
所述hAβ1-42-E22G为人源淀粉样蛋白-β1-42位氨基酸第22位氨基酸由谷氨酸突变成甘氨酸后对应得到的分子量为4.5kDa的人源淀粉样蛋白-β突变体单体；
所述LMW-hAβ1-42为人源淀粉样蛋白-β1-42位氨基酸单体通过相互折叠对应得到的分子量小于20kDa的低分子量人源淀粉样蛋白-β；
所述LMW-hAβ1-42-E22G为人源淀粉样蛋白-β1-42位氨基酸第22位氨基酸由谷氨酸突变成甘氨酸对应得到的人源淀粉样蛋白-β突变体单体，通过相互折叠对应得到的分子量小于20kDa的低分子量人源淀粉样蛋白-β突变体；
所述Protofribril-hAβ1-42为人源淀粉样蛋白-β1-42位氨基酸单体经过折叠形成的纤维状原纤维；
所述Protofribril-hAβ1-42-E22G为人源淀粉样蛋白-β1-42位氨基酸第22位氨基酸由谷氨酸突变成甘氨酸后对应得到的人源淀粉样蛋白-β突变体单体，经过折叠形成的纤维状原纤维。
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