CN116693682B - 抗Tau蛋白抗体及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开抗Tau蛋白抗体及其制备方法和用途,该抗体或其抗原结合片段能够与Tau蛋白结合,其含有:具有SEQ ID NO.:11‑13所示氨基酸序列的抗原互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区;和/或具有SEQ ID NO.:14‑16所示氨基酸序列的抗原互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区。本发明的抗体能够结合Tau蛋白,从而实现Tau蛋白的各种修饰的特异性检测,本发明的抗体对于Tau蛋白相关疾病的诊断或检测具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物免疫治疗技术领域,具体地涉及抗Tau蛋白抗体及其制备方法和用途。
背景技术
Tau蛋白是一种微管相关蛋白,在神经细胞中大量存在。在健康人群中Tau蛋白一般存在很少或没有翻译后修饰。例如,正常的Tau蛋白上一般有两到三个位点的氨基酸进行磷酸化。Tau蛋白的非正常修饰与神经疾病密切相关。已知Tau蛋白的修饰主要是过度磷酸化。当Tau蛋白发生过度磷酸化后,就会从微管上解聚,解聚下来的过度磷酸化的Tau蛋白非常容易聚集形成神经元纤维缠结(NFTs),进而发展为老年性痴呆(AD)。近年来还研究发现,在慢性创伤性脑病(TBI)患者的脑中存在tau蛋白乙酰化的增加(参见Shin et al.,Reducing tau acetylation is neuroprotective in brain injury,2021,Cell 184,1-18.)。如何特异性的检测Tau蛋白的各种修饰,特别是乙酰化修饰对于疾病的诊断或检测具有重要意义。
背景技术中的信息仅仅在于说明本发明的总体背景,不应视为承认或以任何形式暗示这些信息构成本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
为解决现有技术中的技术问题,本发明提供一种能够结合人Tau蛋白的抗体,具体地,本发明包括以下内容。
本发明的第一方面,提供一种分离的抗体或其抗原结合片段,其中,所述抗体或其抗原结合片段能够与Tau蛋白结合,所述抗体或其抗原结合片段含有:
(1)具有SEQ ID NO.:11-13所示氨基酸序列的抗原互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区;和/或
(2)具有SEQ ID NO.:14-16所示氨基酸序列的抗原互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区。
在某些实施方案中,根据本发明所述的分离的抗体或其抗原结合片段,其中,其包括(I)、(II)或(III)所示的氨基酸序列中的任意一种氨基酸序列:
(I)SEQ ID NO:8所示的重链可变区氨基酸序列和/或SEQ ID NO:10所示的轻链可变区氨基酸序列;
(II)与SEQ ID NO.:8和10所示的氨基酸序列具有至少90%,优选至少95%,还优选至少98%,最优选至少99%同源性的氨基酸序列;
(III)与SEQ ID NO.:8和10所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多于一个氨基酸获得的氨基酸序列。
在某些实施方案中,根据本发明所述的分离的抗体或其抗原结合片段,其中,所述抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或双特异性抗体中的至少一种。
在某些实施方案中,根据本发明所述的分离的抗体或其抗原结合片段,其中,所述抗原结合片段包括Fab片段、Fab’、F(ab’)2片段、单链可变片段scFv、scFv-Fc片段或单链抗体ScAb中的至少一种。
本发明的第二方面,提供一种分离的核酸分子,其中,该核酸分子编码根据第一方面所述的抗体或其抗原结合片段。
本发明的第三方面,提供一种载体,其中,该载体包含第二方面所述的核酸分子。
本发明的第四方面,提供一种宿主细胞,其中,该宿主细胞包含第二方面所述的核酸分子或第三方面所述的载体。
本发明的第五方面,提供一种制备根据第一方面所述的分离的抗体或其抗原结合片段的方法,其特征在于,所述方法包括在适于产生所述抗体或其抗原结合片段的条件下培养包含编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸的细胞的步骤。
本发明的第六方面,提供试剂在用于制备检测来自受试者的生物样品中Tau蛋白的试剂盒中的用途,其中,所述试剂包括第一方面所述的分离的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中,根据本发明所述的用途,其中,所述检测包括以下步骤:
a.使所述生物样品与根据第一方面所述的抗体或抗原结合片段接触的步骤;和
b.检测所述抗体或其抗原结合片段与来自所述受试者的所述样品中Tau蛋白的结合的步骤。
在某些实施方案中,根据本发明所述的用途,其中,所述生物样品包括血液、尿液或脑脊髓液样品。
本发明的第七方面,提供一种用于Tau蛋白检测的试剂盒,其中,该试剂盒包括第一方面所述的分离的抗体或其抗原结合片段。
本发明的抗体能够结合Tau蛋白,从而实现Tau蛋白的各种修饰的特异性检测,本发明的抗体对于Tau蛋白相关疾病的诊断或检测具有重要意义。
附图说明
图1为示例性的Tau蛋白抗原的分子结构示意图。
图2示出了本发明的抗体能够识别TauC14-ac,而不识别TauC14、筛选抗原1和筛选抗原2。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式,该详细说明不应认为是对本发明的限制,而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。实施例中未注明具体技术或条件的,按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著,黄培堂等译的《分子克隆实验指南》,第三版,科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式,并非用于限制本发明。另外,对于本发明中的数值范围,应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其它陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明,否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料,但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入,用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时,以本说明书的内容为准。
抗体
本文中,术语“Tau蛋白”是指由441个氨基酸组成野生型蛋白,即2N4R,其氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示。
本发明中,“抗Tau蛋白抗体”和“结合Tau蛋白的抗体”是指能够以足够亲和力结合Tau蛋白的抗体,使得所述抗体适用于靶向Tau蛋白的诊断剂。
本发明中,抗体的重链可变区和轻链可变区通常包括3个互补决定区CDR和4个骨架区FR。互补决定区之间通过骨架区连接,在识别抗体时,FR分子卷曲使CDR分子相互靠近。互补决定区为抗体或抗原结合片段与抗原的结合部位,因此,互补决定区的序列决定了抗体的特异性。如本领域所理解,抗体是包含通过二硫键互连的至少两个重(H)链和两个轻(L)链的糖蛋白或其抗原结合部分。重链包含重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)。轻链包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)。重链和轻链的可变区包含框架区(FR)和互补决定区(CDR)。四个FR是相对保守的,而CDR区域(CDR1、CDR2和CDR3)包含高变区。
本文中的“抗原结合片段”是指多肽片段,其包含完整抗体的一部分,诸如完整抗体的抗原结合区或可变区,并且具有能够特异性靶向Tau蛋白的特性。优选地,其含有抗体重链可变区和/或轻链可变区的至少一个CDR;还优选地,其可以含有重链可变区的CDR1-3和/或轻链可变区的CDR1-3。抗原结合片段可以通过多种技术制备,包括但不限于将完整的抗体蛋白水解消化,或由包含抗原结合片段的宿主细胞表达产生。
本发明提供了上述靶向Tau蛋白的抗体或其抗原结合片段,所述抗体或其抗原结合片段具有良好的靶向性。在没有限定或理论约束的情况下,本发明的抗体或其抗原结合片段的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3和轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3的序列可在下述范围内随机选择:具有SEQ ID NO.:11-13所示氨基酸序列的抗原互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区;和具有SEQ ID NO.:14-16所示氨基酸序列的抗原互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区。
本发明中,抗体或其抗原结合片段具有(I)、(II)或(III)所示的氨基酸序列中的任意一个氨基酸序列:(I)SEQ ID NO:8所示的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO:10所示的轻链可变区氨基酸序列;(II)与SEQ ID NO.:8和10所示的氨基酸序列具有至少90%,优选至少95%,还优选至少98%,最优选至少99%同源性的氨基酸序列;(III)与SEQ ID NO.:8和10所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多于一个氨基酸获得的氨基酸序列,需要说明的是上述同源性(本文有时也称为“同一性”)序列不会改变抗原与抗体结合特性,即具有上述的氨基酸序列的变体依然保留针对Tau蛋白的抗体的活性。
在一个优选的实施方案中,所述重链可变区的编码序列如SEQ ID NO:7所示,所述轻链可变区的编码序列如SEQ ID NO:9所示。
优选地,所述抗体包括单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体中的至少一种;所述抗原结合片段为Fab、F(ab’)、F(ab’)2、Fd、单链抗体scFv、二硫键连接的Fv(sdFv)、或单域抗体中的至少一种。还优选地,所述抗体或其抗原结合片段是人源化的。
本发明的抗体还包括抗体恒定区,所述抗体恒定区为选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD中的任意一者的恒定区。优选地,所述抗体恒定区的重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4中任意一者的重链恒定区,优选为IgG4的重链恒定区;所述抗体恒定区的轻链恒定区为κ或λ。
本发明的抗体可包含Fc区,所述Fc区来自IgG,例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
本文所用术语“单克隆抗体”,有时也称为“单抗”或“mAb”,其是指从一纯系细胞得到的免疫球蛋白,具有相同的结构和化学特性,对单一抗原决定簇有特异性。单克隆抗体与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同,各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外,单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤或重组工程细胞培养获得,不会混杂有其它免疫球蛋白。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性,是从均一的抗体群中获得的,但这不应被解释成需要用任何特殊或特定的方法来生产所述抗体。
变体抗体也都被包括在本发明的范围内。在本发明对变体的序列不特别限定,只要其具有靶向Tau蛋白抗原的结合特性,或具有提高的亲和力的抗体即可,具有这样序列的其它变体可以使用本领域已知的方法得到,并都包括在本发明的范围内。本领域技术人员利用用于生产变体多肽的重组方法和/或合成化学技术可以修改多肽的氨基酸序列。例如,可以使用氨基酸置换得到具有进一步提高的亲和力的抗体。可选地,可以使用核苷酸序列的密码子优化来提高在用于生产抗体的表达系统中的翻译效率。这样的变体抗体序列与在本发明中列举的序列具有80%或更高的(即,85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大)序列同一性。相对于在本发明中列举的序列,计算所述序列同一性。或进行最佳比对时,如通过程序GAP或使用默认值间隙权重的BESTFIT。
本发明的抗体可以具有氨基酸修饰,本文所用术语“修饰”是指氨基酸修饰不会显著影响或改变含有该氨基酸序列的抗体的结合特征。此类修饰包括氨基酸的取代、添加和缺失。优选地,不相同的残基位置因保守氨基酸取代而不同。本发明的抗体可包括糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割或非天然发生的氨基酸修饰等。
保守氨基酸取代指的是具有类似侧链的残基的可互换性。例如,具有脂肪族侧链的氨基酸组为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸;具有脂肪族-羟基侧链的氨基酸组为丝氨酸及苏氨酸;具有含酰胺侧链的氨基酸组为天冬酰胺和谷氨酰胺;具有芳香族侧链的氨基酸组为苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸;具有碱性侧链的氨基酸组为赖氨酸、精氨酸和组氨酸;以及具有含硫侧链的氨基酸组为半胱氨酸及甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代组为:缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸缬氨酸、谷氨酸-天门冬酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。因此,可以用来自同一侧链家族的其它氨基酸残基替换本发明抗体CDR区中的一个或多个氨基酸残基。
另一类可能存在的可变区修饰是突变VH和/或VL的CDR1、CDR2和/或CDR3区中的氨基酸残基以改进目的抗体的一种或多种结合特性(例如亲和力)。可以通过定点诱变或PCR介导的诱变来导入突变。优选导入(如上所述的)保守修饰。突变可以是氨基酸的取代、添加或缺失,但优选为取代。此外,CDR区中残基变化通常不超过一个、两个、三个、四个或五个。
本发明提供了一种分离的核酸,其编码如前所述的抗体或其抗原结合片段。
本发明提供了一种载体,其包括本发明所述的分离的核酸。载体可以为表达载体或克隆载体。在一些实施方案中,载体为病毒载体。病毒载体包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、牛痘载体、单纯疱疹病毒载体及其衍生物。
本发明提供了一种宿主细胞,其包括上述的载体。用于克隆或表达DNA的合适宿主细胞是原核细胞、酵母细胞或高等真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。
本发明提供了一种抗人Tau蛋白抗体的制备方法,其包括培养上述的宿主细胞。优选地,所述制备方法的培养条件足以使宿主细胞能够表达抗人Tau蛋白。
本发明提供了一种经标记的抗体,其包含本文所描述的抗体和可检测标记。
用途
本发明提供试剂在用于制备检测来自受试者的生物样品中Tau蛋白的试剂盒中的用途。除非另外说明,否则本文中的“Tau蛋白”是指来自任何脊椎动物来源,包括哺乳动物,诸如灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)的任何Tau蛋白。在一个优选的实施方案中,Tau蛋白包括Tau蛋白变体,特别是在其第274位赖氨酸和第280位赖氨酸具有乙酰化修饰的Tau蛋白。
本发明的抗体适用于例如诊断和检测“Tau蛋白”相关的神经退化性疾病。如本文所用的术语“检测”涵盖定量或定性检测。在某些实施方案中,生物样本包含细胞或组织,诸如脑脊髓液、大脑细胞组织(例如大脑皮质或海马区)或血液。
在一些实施方案中,本发明提供一种用于诊断或检测方法中的抗Tau蛋白抗体。在一些实施方案中,本发明提供一种检测Tau蛋白在生物样本中的存在的方法。在某些实施方案中,所述方法包括使生物样本与如本文所描述的抗Tau抗体在允许抗Tau抗体结合Tau的条件下接触,和检测在抗Tau抗体与Tau之间是否形成复合物。此类方法可为活体外或活体内方法。此外,可将形成于抗Tau抗体与测试生物样本中的Tau之间的复合物与形成于对照生物样本(例如来自一个或多个健康受试者的生物样本)中的复合物相比较。还可对形成于抗Tau抗体与测试生物样本中的Tau之间的复合物的量进行量化,并且将其与形成于对照生物样本(例如来自一个或多个健康受试者的生物样本)中的复合物的量或与已知形成于健康受试者中的复合物的平均量相比较。
在一些实施方案中,抗Tau抗体用于检测受试者是否具有Tau蛋白疾病或病症,或受试者是否具有患Tau蛋白疾病或病症的高风险(或倾向)。
可使用本发明的抗体诊断的例示性疾病或病症包括Tau蛋白相关疾病或病症,和由神经原纤维缠结或神经纤维网线的形成造成或与其相关联的疾病或病症。在一些实施方案中,可使用本发明的抗体诊断的疾病或病症包括在认知功能的障碍或丧失中显现出的Tau蛋白相关疾病或病症,所述认知功能包括推理、形势判断、记忆能力、学习和/或特殊导航。特定来说,可使用本发明的抗体诊断的疾病或病症包括tau蛋白病,诸如神经退化性tau蛋白病。可使用本发明的抗体诊断的例示性疾病或病症包括(但不限于)阿兹海默氏病、与tau聚集或沉积相关联的疾病是阿尔茨海默病、唐氏综合征、轻度认知障碍、原发性年龄相关性tau蛋白病、脑炎后帕金森病、创伤后痴呆或拳击员痴呆、皮克氏病、C型尼曼-皮克病、核上性麻痹、额颞痴呆、额颞叶变性、嗜银颗粒病、球状胶质tau蛋白病、关岛肌萎缩性侧索硬化/帕金森痴呆复征、皮质基底节变性(CBD)、路易体痴呆、阿尔茨海默病的路易体变异(LBVAD)、慢性创伤性脑病(CTE)、球状胶质tau蛋白病(GGT),或进行性核上麻痹(PSP)。
在某些实施方案中,提供标记的抗Tau抗体。标记包括(但不限于)直接检测的标记或部分(诸如荧光、发色、电子致密、化学发光和放射性标记),以及例如通过酶反应或分子相互作用间接检测的部分(诸如酶或配体)。示例性标记包括但不限于放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I;荧光团,诸如稀土螯合物或荧光素和其衍生物;如罗丹明和其衍生物;丹酰基;伞酮;荧光素酶,例如荧火虫荧光素酶和细菌荧光素酶;荧光素;2,3-二氢酞嗪二酮;辣根过氧化酶(HRP);碱性磷酸酶;β-半乳糖苷酶;葡糖淀粉酶;溶菌酶;糖氧化酶,例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶;杂环氧化酶,诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶,其与采用过氧化氢使染料前驱物氧化的酶(诸如HRP、乳过氧化酶或微过氧化酶)偶合;生物素/抗生物素蛋白;自旋标记;噬菌体标记;稳定自由基和其类似标记。标记可以是荧光标记、顺磁性标记或放射性标记中的至少一种。
实施例1
一、乙酰化Tau蛋白抗原的制备
取Tau蛋白序列中第268位至280位氨基酸片段(记作TauC14,在其N端添加半胱氨酸,序列如SEQ ID NO:1所示)作为抗原,将其对应的基因序列(SEQ ID NO:2)通过IRES序列(SEQ ID NO:3)串联连接,得到TauC14-IRES-TauC14-IRES-TauC14结构的核酸序列(SEQ IDNO:4),如图1所示。将该核酸序列插入YAC载体构建表达载体,转入宿主酵母菌AB1380中表达。在18小时后,将培养物以3500rpm离心30分钟。然后,去除上清液,并将剩余的沉淀在-20℃的温度下冷冻。
将冷冻沉淀物以25ml/g的浓度重悬于裂解缓冲液(20mM Tris-HCl,1mM苯甲基磺酰氟,pH 8.0)中。超声波裂解细胞30分钟。将产物在4℃的温度和15000rpm的条件下离心20分钟,并将上清液用0.45μm过滤器过滤。将滤液用缓冲液A(20mM Tris-HCl,pH 8.0)平衡的5mL His-Trap SP柱过滤。用5倍柱体积(CV)的缓冲液A进行的洗涤,然后用10CV的缓冲液B(20mM Tris-HCl,pH 8.0,300mM NaCl)以0M至1M NaCl的浓度梯度洗脱。收集含抗原片段的级分,用缓冲液C(20mM Tris-HCl,pH 8.0,300mM NaCl,50mM咪唑)平衡的5mL Hi-Trap SP柱过滤。用10CV的缓冲液C进行洗涤。此后,用20CV的缓冲液D(20mM Tris-HCl,pH8.0,300mMNaCl,100mM咪唑)洗脱。使用10kDa分子量的离心过滤器浓缩洗脱液,得到纯化的抗原片段TauC14。
使含有(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES,10mM,pH 7.4)、50mM的NaCl、1.5mM的MgCl2、0.5mM的二硫苏糖醇(DTT)、2.5mM的EGTA、0.1mM的EDTA的乙酰化缓冲液与8μM浓度的抗原片段TauC14、125μM浓度的乙酰辅酶A和0.5μg的P300酶在30℃的温度反应3小时,得到乙酰化抗原片段TauC14-ac。
使用ReadiLinkTM KLH偶联试剂盒根据说明书操作使乙酰化抗原片段TauC14-ac通过N端Cys残基与载体蛋白KLH偶联,得到抗原KLH-TauC14-ac。
以类似方法制备筛选抗原1和筛选抗原2。其中,筛选抗原1的氨基酸序列如SEQ IDNO:5所示,即没有TauC14两端各一个氨基酸,并经乙酰化处理。筛选抗原2的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示,并经乙酰化处理。
二、抗体制备
以偶联得到的抗原KLH-TauC14-ac作为免疫原免疫小鼠。对免疫小鼠进行尾血检测和单克隆抗体筛选。
1.小鼠的免疫及免疫反应评价
将KLH-TauC14-ac与佐剂CFA和AD11.15混合,免疫BALB/c小鼠,免疫后在第14天抽取小鼠尾血,使用如下间接ELISA方法进行血清中抗体效价的评价:
(1)在酶标板中,每孔加入TauC14-ac 100μL(浓度1μg/mL),4℃过夜反应;
(2)使用PBS溶液洗板3次,使用5% Milk-PBS在室温封闭1小时;
(3)使用PBS溶液洗板1次,加入使用5%milk-PBS溶液梯度稀释的小鼠尾血,室温反应1小时;
(4)使用PBS溶液洗板3次,并进行拍干后,加入1:2000稀释的HRP标记的羊抗小鼠IgG(Fc)二抗,室温反应1小时;
(5)PBS溶液洗板5次后,拍干,加入等体积的A液和B液,避光、室温条件下反应20min;
(6)加入50μL终止液,混匀后在酶标仪上读取OD450值。
根据OD450值取抗体效价达到1:10000以上的小鼠进行后续细胞融合实验。
2.细胞融合及杂交瘤细胞株的筛选
在小鼠免疫后第21天取小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合。融合后第10天挑取358个单克隆细胞在96孔板中进行培养,培养7天后,按照步骤1所述的间接ELISA方法对96孔板中的单克隆细胞培养上清进行评价,筛选能够分泌识别TauC14-ac,而不识别TauC14、筛选抗原1和筛选抗原2的单克隆抗体的杂交瘤细胞株TAC2(图2),得到一种特异性阳性克隆株。杂交瘤细胞株于2023年5月11日保藏于中国广东省微生物菌种保藏中心,其保藏号为GDMCC No:63395。
接下来,采用步骤1所述的间接ELISA方法,对该编号为TAC2的杂交瘤细胞株的扩大培养后的上清再次进行确认实验,结果如表1所示。
表1.阳性克隆的ELISA重复确认
TAC2 | TAC2 | NC | NC | PC | PC |
2.402 | 2.321 | 0.194 | 0.250 | 2.431 | 2.395 |
注:NC为阴性对照5%Milk-PBS;PC为阳性对照小鼠心脏血,1:500稀释使用。
由表1的结果可知,杂交瘤细胞株TAC2的细胞上清与Tau蛋白的TauC14-ac片段产生强烈反应。
3.杂交瘤细胞株TAC2产生的单克隆抗体可变区的克隆与测序
培养TAC2杂交瘤细胞株,收集细胞,提取RNA,采用RT-PCR法获得编码抗TauC14-ac的单克隆抗体的cDNA序列,通过PCR方法克隆重链和轻链的可变区并将PCR产物连接到T-载体上,测序获得抗TauC14-ac抗体的重链可变区VH和轻链可变区VL的序列,并进一步通过Uniprot数据库进行序列比对和确认。
下表2示出了所得的单克隆抗体对应的VH和VL的核苷酸序列及由其编码的氨基酸序列。
表2.单克隆抗体可变区序列
进一步对所得VH和VL的氨基酸序列进行分析,确定了互补决定区(CDR),结果如表3所示。
表3.单克隆抗体的VH和VL结构域的CDR分析
实施例2
本实施例提供一种试剂盒,其用于检测皮层和海马组织中Tau蛋白第274位赖氨酸和第280位赖氨酸的乙酰化水平。
本实施例的试剂盒的规格可设计为96人份/盒,其中包含如下组分:
(1)抗Tau蛋白抗体包被板。包被板通过如下方法制备得到:在例如96孔酶标板上按2μg/ml的浓度包被抗人Tau蛋白抗体,在2-8℃孵育16小时以上;去除酶标板里的包被液,用磷酸盐缓冲液洗1遍,加入封闭液,在2-8℃孵育16小时以上;去除酶标板里的封闭液,干燥后于2-8℃保存。
(2)Tau校准品(每个试剂盒中,0.5mL×8瓶)。Tau校准品可通过基因工程在大肠杆菌中表达得到,并经乙酰化得到。如使含有(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES,10mM,pH7.4)、50mM的NaCl、1.5mM的MgCl2、0.5mM的二硫苏糖醇(DTT)、2.5mM的EGTA、0.1mM的EDTA的乙酰化缓冲液与8μM浓度的表达产物、125μM浓度的乙酰辅酶A和0.5μg的P300酶在30℃的温度反应3小时得到。加入0.02M磷酸盐缓冲液,配制特定浓度的工作校准品溶液。
(3)Tau蛋白酶结合物(每个试剂盒中,12mL×1瓶)。将实施例1中的单克隆抗体原液,采用过碘酸盐氧化法使其与辣根过氧化物酶结合,获得酶标抗体,并用酶结合物稀释液将其配置成特定的浓度,2-8℃避光保存。
(4)浓缩洗涤液(20×)(每个试剂盒中,50mL×1瓶),其中包含0.4M磷酸盐缓冲液以及吐温-20。
(5)单组份TMB显色液(每个试剂盒中,12mL×1瓶)。
(6)终止液(每个试剂盒中,7mL×1瓶),其成分为2M硫酸。
(7)封板膜(每个试剂盒中,3张)。
试剂盒于2-8℃保存,有效期12个月。
实施例3
本实施例提供利用实施例2的试剂盒检测皮层或海马组织中Tau蛋白第274位赖氨酸和第280位赖氨酸的乙酰化水平的方法。
1.样本采集:取皮层或海马组织在RIPA缓冲液中超声处理,RIPA缓冲液含有蛋白酸和磷酸酶抑制剂、1mM苯基甲基磺酰氟和组蛋白去乙酰化酶抑制剂、1μM曲古抑菌素A。将裂解液在4℃下于170000g离心15分钟,然后4℃下于18000g离心10分钟。然后通过双氯氰胺酸检测(Thermo Scientific,A53225)上清的蛋白浓缩物。为了确保检测结果准确,尽可能使用新鲜样本,避免反复冻融;新鲜样本在2-8℃可保存7天,在-20℃保存期不超过3个月,若长期保存,应置于-80℃,不得超过2年。
2.加样:分别在相应孔中加入50μl校准品和组织提取物样本(空白孔不加),充分振荡混匀30s。
3.温育:用封板膜封板后置于37℃恒温水浴箱温育30min。
4.洗涤:小心揭掉封板膜,用洗板机洗涤6遍,每次每孔应加入至少300μl洗涤液,最后一遍洗涤后在干净吸水纸上扣干。
5.加酶结合物:每孔加入100μl酶结合物(空白孔不加),振荡混匀30s。
6.重复步骤3和4。
7.显色:每孔加入单组份TMB显色液100μl,振荡30s,用封板膜封板后置于37℃避光温育10min。
8.测定:每孔加入50μl终止液,振荡混匀30s,使用酶标仪在450nm波长处测量各孔吸光度值(OD值)。酶标仪无需空白孔调零点。需在终止反应后10min内进行测定。
9.数据处理:应用双对数log-log线性拟合方法处理数据。以各校准品浓度的对数为纵坐标(Y轴),各校准品OD值(需减去S0的OD值)的对数为横坐标(X轴)作图,建立标准曲线。单波长(450nm)酶标仪测得样本的OD值,需减去空白孔的OD值再取对数,从标准曲线上计算出样本中Tau蛋白乙酰化水平。双波长(450nm和630nm)酶标仪测得样本的OD值直接取对数,从标准曲线上计算出样本中Tau蛋白的乙酰化水平。
尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述,但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下,可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。
Claims (11)
1. 一种分离的抗体或其抗原结合片段,其特征在于,所述抗体或其抗原结合片段能够与Tau蛋白结合,所述抗体或其抗原结合片段含有:
(1) SEQ ID NO.: 11-13所示氨基酸序列的抗原互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区;和
(2) SEQ ID NO.: 14-16所示氨基酸序列的抗原互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区。
2. 根据权利要求1所述的分离的抗体或其抗原结合片段,其特征在于,其包括SEQ IDNO.8所示的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO.10所示的轻链可变区氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段,其特征在于,所述抗体选自单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或双特异性抗体中的至少一种;所述抗原结合片段选自Fab片段、Fab’、F(ab’)2片段、单链可变片段scFv、scFv-Fc片段或单链抗体ScAb中的至少一种。
4.一种分离的核酸分子,其特征在于,其编码根据权利要求1-3任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
5.一种载体,其特征在于,其包含权利要求4所述的分离的核酸分子。
6.一种宿主细胞,其特征在于,其包含根据权利要求4所述的分离的核酸分子或根据权利要求5所述的载体。
7.一种制备根据权利要求1-3中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段的方法,其特征在于,所述方法包括在适于产生所述抗体或其抗原结合片段的条件下培养包含编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸的细胞的步骤。
8.试剂在用于制备检测来自受试者的生物样品中Tau蛋白的试剂盒中的用途,其特征在于,所述试剂包括权利要求1-3中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段。
9. 根据权利要求8所述的用途,其特征在于,所述检测包括以下步骤:
a. 使所述生物样品与根据权利要求1至3中任一项所述的抗体或抗原结合片段接触的步骤;和
b. 检测所述抗体或其抗原结合片段与来自所述受试者的所述样品中Tau蛋白的结合的步骤。
10.根据权利要求9所述的用途,其特征在于,所述生物样品包括血液、尿液或脑脊髓液样品。
11.一种用于Tau蛋白检测的试剂盒,其特征在于,包括权利要求1-3中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段。
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