CN117024586B - 一种抗体组合物及应用于检测血液中ykl-40浓度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种抗体组合物及应用于检测血液中YKL‑40浓度的方法。本发明经过大量筛选，获得一种针对YKL‑40的抗体。实验表明，本发明的抗体可以有效结合并鉴定YKL‑40，检测步骤简洁，检测时间短，灵敏度高，分辨效果好，检测结果稳定。因此，更适合用于检测YKL‑40的方法及试剂盒的制备。
Description
技术领域
本申请涉及生物领域，具体的涉及一种抗体组合物及应用于检测血液中YKL-40浓度的方法。
背景技术
YKL-40是一种40kda肝素和几丁质结合的糖蛋白,也被称为人软骨糖蛋白39(PC-GPC39)。简称YKL-40的依据是前三种n-端基氨基酸、酪氨酸(Y)、赖氨酸(K)和亮氨酸(L)的一个字母编码和YKL-40的表观分子量。人类YKL-40基因位于染色体1Q31-Q32上高度保守的区域以及YKL-40的晶体结构已被描述。YKL-40属于由不同种类的几丁质酶组成的糖基水解酶的18个家族,但YKL-40没有任何酶的特性。
YKL-40是分泌的体外的由多种细胞产生,似乎特别涉及到固有免疫系统的激活和细胞外基质重塑的细胞过程。YKL-40诱导单核细胞成熟为巨噬细胞,由分化后期的巨噬细胞和激活的巨噬细胞分泌。研究表明,CD14+单核细胞向CD14、CD16+巨噬细胞的分化和成熟过程中,CD16+巨噬细胞表达YKL-40。YKL-40也被证明是血管细胞的粘附和迁移因子,并被分化血管平滑肌细胞(VSMCS)切断。YKL-40蛋白表达于人类外膜血管内的VsmCS以及在不同组织的巨噬细胞和VSMCS亚群中,炎症和细胞外基质重塑与动脉粥样硬化斑块中相同。有关YKL-40调节其作用的生理功能和机制的知识仍然很少。对不同类型的正常人体组织的免疫组织化学研究表明,具有高细胞活性的细胞。高水平的代谢活动和/或增殖,尤其具有高水平的YKL-40表达。
两性血清或血浆YKL-40水平无差异。在血清中,健康人的血清YKL-40浓度没有明显的日变化、周变化或长期变化。同样,血清YKL-40的浓度不受体育锻炼的影响。在糖尿病、肥胖或房颤患者的研究中,YKL-40与HSCRP之间似乎没有或只有微弱的相关性在明显冠心病患者的研究中,YKL-40与HSCRP呈正相关。相反的CRP是一种系统性炎症标记物,主要由肝细胞分泌,以应对诸如ILL-6、YKL-40等炎症原介质。然而,所有调查YKL-40与IL-6之间关系的研究均发现两者之间存在正相关。此外,在病态肥胖患者中发现单核细胞化学反应蛋白-1(McP-1)和YKL-40之间存在紧密联系。McP-1与脂肪组织中单核细胞贩运和巨噬细胞浸润有关它也是心血管死亡的重要预测因子。病态肥胖患者的YKL-40水平升高,但尽管YKL-40与巨噬细胞成熟和活化之间存在明显的联系,但没有研究发现YKL-40与体重指数之间的联系。YKL-40已经成为心血管疾病的一个有希望的标志。它对筛查有用,因为它可以在早期亚临床疾病中检测到,而且它似乎也有可能成为心血管事件和死亡率的预测者。
此外研究表明,YKL-40在乳腺癌和结肠癌细胞中的异位表达分别导致肿瘤的形成并形成广泛的血管生成表型,重组YKL-40蛋白促进血管内皮细胞的生成,而YKL-40抑制肿瘤的血管生成。此外,对人类乳腺癌的免疫组化分析显示,YKL-40的表达与血管密度有关。因此,在高分化和晚期癌症和复发性癌症中,高水平的YKL-40可以用YKL-40在血管生成和纤维化生成中的作用来解释,因为高分化肿瘤的特征是高血管化和细胞外基质的高周转。在患有各种类型的高度分化和晚期癌症以及复发性癌症的患者中也观察到YKL-40水平升高。因此，通过检测YKL-40成为癌症检测的一个重要的标志物。
另外，采用ELISA方法共检测112例肝硬化患者以及114例健康者血清中YKL-40蛋白水平，并进一步分析其在肝硬化中的诊断价值及其与肝硬化患者肝功能和现有肝纤维化指标的相关性。肝硬化组血清YKL-40蛋白水平高于正常对照组(P＜0.001)；将肝硬化组和对照组作比较，ROC曲线分析血清YKL-40蛋白对肝硬化的诊断效能，曲线下面积为0.934，YKL-40在cutoff值为92.5ng/ml时，敏感度为81.3％，特异度为90.4％；通过相关性分析发现血清YKL-40蛋白水平与肝功能Child-Pugh分级和FIB-4指数正相关。YKL-40对肝硬化具有良好的诊断效力，能辅助诊断肝硬化并有助于判断肝硬化的严重程度。
但是目前，针对YKL-40的单克隆抗体的开发还不够成熟，提供的可选的特别是高活性的特异性结合YKL-40的单克隆抗体还不够多，有待于进一步的研究。
发明内容
本发明针对现有技术的需要，提供了一种针对YKL-40的单克隆抗体及其应用方法。
具体的，所述的YKL-40单克隆抗体命名为YKL-40-3C8，其重链可变区序列如SEQID NO：1所示，轻链可变区序列如SEQ ID NO：2所示。
在一些实施方案中，所述抗YKL-40抗体部分包含a)VH和b)VL，并且VH包含：SEQ IDNO:1的氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NO:1具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)的序列同一性；以及VL包含：SEQ IDNO:2的氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NO:2具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)的序列同一性。
在一些实施方案中，提供了具有一个或多个氨基酸替换的抗体变体。替代性诱变的目的位点包括HVR(或CDR)和FR。保守替换可以将氨基酸替换引入目的抗体中，并筛选具有所需活性的产品，例如，保留/改善的抗原结合，降低的免疫原性，或改善的ADCC或CDC。具体的可根据常见的侧链特性对氨基酸进行分组：(1)疏水性：正亮氨酸、Met,Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)碱性：His、Lys、Arg；(5)影响链方向的残基：Gly、Pro；(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。非保守替换将需要把这些类别中一个类别的成员替换为另一个类别的成员。
一种类型的替换变体涉及替换亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步研究的所得变体，相对于亲本抗体将具有特定生物学特性的一些修饰(例如改善)(例如提高的亲和力、降低的免疫原性)，和/或将基本上保留亲本抗体的某些生物学特性。示例性的替换变体是亲和力成熟的抗体，其可以方便地产生。
本文中还提供了特异性识别YKL-40的抗体。这些抗体和源自其的抗体部分可以整合到方法中。合适的抗体部分，包括但不限于：scFv、Fab和与Fc片段融合的scFv(以下也称为“scFv-Fc”)。
在一些实施方案中，所述抗体部分与YKL-40结合的KD为：约10-7M至约10-12M，约10- 7M至约10-8M，约10-8M至约10-9M，约10-9M至约10-10M，约10-10M至约10-11M，约10-11M至约10-12M，约10-7M至约10-12M，约10-8M至约10-12M，约10-9M至约10-12M，约10-10M至约10-12M，约10-7M至约10-11M，约10-8M至约10-11M，约10-9M至约10-11M，约10-7M至约10-10M，约10-8M至约10-10M，或约10-7M至约10-10M。
在本发明中，所述检测YKL-40蛋白的单克隆抗体上可以连接有可检测的标记分子。
在本发明中，所述试剂盒或检测试剂中还可以包含能够与检测YKL-40蛋白的抗体，该抗体也可以连接有可检测的标记分子。
在本发明中，所述可检测的标记分子例如可以为酶、荧光素、金属离子或同位素等。
更优选的，根据本发明，所述标记可以选自本领域中常用于标记抗原或抗体的示踪标记物，例如金刚烷、鲁米诺及其衍生物、异鲁米诺及其衍生物、吖啶酯、碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶，尤其优选为N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺(ABEI)。
本发明还涉及上述单克隆抗体或杂交瘤细胞在制备免疫诊断检测试剂盒中的应用。
本发明还涉及一种免疫检测诊断试剂盒，其中含有上述的单克隆抗体或由杂交瘤细胞制备的单克隆抗体。
前面任一项所述的单克隆抗体或杂交瘤细胞在制备用于辅助诊断肝硬化，癌症，尤其是肝癌或消化道癌症患者的试剂盒中的应用。
本发明还涉及一种用于辅助诊断癌症，尤其是肝癌或消化道癌症患者的试剂盒，其中含有前面任一项所述的单克隆抗体或杂交瘤细胞制备的抗体。
前面任一项所述的应用或试剂盒，其中所述肝癌为肝细胞癌，所述的消化道癌症为结直肠癌。
前面所述的应用或试剂盒，其中所述试剂盒用于血浆样品的检测。
进一步而言地，前面所述的试剂盒为化学发光免疫试剂盒、酶联免疫检测试剂盒、胶体金免疫试剂盒、荧光免疫试剂盒。
优选的，为ELISA检测试剂盒。
更优选的，本发明提供了一种全血一步法YKL-40胶体金检测试剂盒，包括盒座、盒盖和试剂条，所述试剂条固定于所述盒座与所述盒盖之间，所述盒盖设有观察孔，盒盖与盒座之间的边侧设有加样孔，可用于直接指尖取血或加样检测。所述试剂条分为上层与底层，底层为塑料薄膜，上层依次头尾相接排列有玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜一、塑料保护膜、硝酸纤维素膜二。所述玻璃纤维膜上设有兔IgG胶体金，所述硝酸纤维素膜一为设有YKL-40胶体金的桥接膜，所述硝酸纤维素膜二上设有抗YKL-40单克隆抗体、羊抗兔IgG。
本发明进一步的还提供一种检测血液中YKL-40浓度的方法，所述方法包括使用权利要求1所述的单克隆抗体制备的ELISA检测试剂盒，所述方法非疾病诊断方法。
有益效果：本发明人经过大量筛选，获得一种针对YKL-40的抗体。实验表明，本发明的抗体可以有效结合并鉴定YKL-40，检测步骤简洁，检测时间短，灵敏度高，分辨效果好，检测结果稳定。因此，更适合用于检测YKL-40的方法及试剂盒的制备。
附图说明
图1单克隆抗体YKL-40-3C8westernblot检测结果图
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其它优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明。
实施例1YKL-40的单克隆抗体的制备
将重组人YKL-40蛋白(ab182706)蛋白用于2只BALB/c小鼠免疫，免疫蛋白剂量为100μg/只，即按每只100μg蛋白，稀释至100μl，再加入等体积佐剂乳化混匀后免疫小鼠，共免疫3次(首次免疫使用完全弗氏佐剂，第2次、第3次免疫使用非完全弗氏佐剂)，免疫时间间隔为2周。在最后1针免疫后2周，对小鼠进行眼眶静脉采血，挑选ELISA检测效价较高的1号小鼠进行50μg/只的脾免加强，取加强免疫后的小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行融合，具体的融合方法是：将4瓶形态良好的SP2/0细胞，用DMEM悬浮，全部转移50mL离心管中，1000r/min，15min，弃上清，1mLDMEM重悬细胞，取细胞计数(5×106个/mL)，其余细胞置于培养箱中备用；按细胞计数结果，将脾细胞稀释；比例为SP2/0细胞：脾细胞等于1:8，轻轻混合于另一50mL离心管中；1000r/min，10min，弃液体；并将沉淀细胞轻弹至松散状态；在1min内均匀向离心管中滴加1mL已预热PEG融合剂，培养箱静置10min；用DMEM终止融合反应，方法为：第1个1min内均匀滴加1mLDMEM，第2个1min内均匀滴加2mLDMEM，第3个1min内均匀滴加3mLDMEM，第4个1min内均匀滴加4mLDMEM，第5个1min内均匀滴加5mLDMEM；滴加液体结束后，管内液体用DMEM定容至40mL，1000r/min，5min，弃液体，再缓慢加2mLHAT培养液，轻轻重悬细胞；将重悬后的细胞按每孔100μL加入铺好饲养细胞的96孔板中。细胞每隔3d半量换HAT液，显微镜观察，在第12d成簇杂交瘤细胞出现，做标记；取100μL标记孔培养液，以重组人YKL-40蛋白为抗原，SP2/0上清液为阴性对照，间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞孔共计58个，鉴定结果为阳性孔，再次进行标记，并半液换HT培养基培养。每隔3d再次重复测定阳性孔。选取阳性反应最强的5个阳性孔细胞铺满孔底约1/2时进行亚克隆，共进行3次，筛选得到最稳定的一株抗YKL-40的单克隆抗体命名为YKL-40-3C8。
实施例2单克隆抗体的制备及效价鉴定
向12周龄的BALB/c雌鼠腹腔注射0.3mL不完全弗氏佐剂，1周后，取3×106个对数増殖期的单克隆杂交瘤细胞YKL-40-3C8进行腹腔注射，当小鼠腹腔明显胀大时,使用注射器收集腹水。收获的腹水用ProteinG柱子进行纯化，参照ProteinG柱子说明书进行。纯化后的腹水通过SDS-PAGE分析,经考马斯亮蓝染色鉴定其纯度。通过BCA法测定纯化的抗体浓度。
采用碳酸盐缓冲液稀释重组人YKL-40蛋白至1μg/ml，以100μl/孔添加至96孔板，37℃孵育2h，洗液洗涤1次，甩干后加入3％的BSA封闭液，37℃孵育1h，洗液洗涤1次并甩干。将前述收集的腹水加入包被蛋白的96孔板中，37℃孵育1h，洗液洗涤5次并甩干，随后每孔加入稀释后的二抗孵育1h，洗涤5次并甩干，加入显色液进行显色，37℃孵育5min后加入终止液终止显色反应，酶标仪读取吸光度值(OD)，检测OD450值，以≥2.1OD450(阴性对照)的最高稀释倍数为抗血清效价。计算腹水效价。
表2单抗的浓度及效价
| 抗体名称 | 纯化后浓度 | 腹水效价 |
| YKL-40-3C8 | 3.56 | 1:219 |
抗体经过纯化后，经SDS-PAGE分析发现得到了较为纯净的单抗，通过BCA定量纯化的单抗的浓度为3.56g/mL。腹水通过效价分析发现其为1:219具有较好的效果。
实施例3单克隆抗体YKL-40-3C8亲和力鉴定
通过ForteBioOctetRED96测量单克隆抗体YKL-40-3C8结合重组人YKL-40蛋白的亲和力。具体的，样品均在PBS缓冲液(pH＝7.4)中制备。将生物素标记的重组人YKL-40蛋白以预定的加载阈值加载到SA传感器上。将单克隆抗体YKL-40-3C8以1nM-50nM的浓度梯度应用于传感器。减去背景值以校正传感器漂移。使用ForteBio的数据分析软件，将数据拟合至1∶1结合模型，以获得缔合(Kon)和解离(Koff)速率。根据Koff/Kon计算KD值。以LSBio的YKL-40单克隆抗体，货号：LS-C204807，作为阳性对照。
表2抗体的结合亲和力分析结果
从表2可以看出，本发明的单克隆抗体YKL-40-3C8亲和力较好，比阳性对照的亲和活性要强。
实施例4单克隆抗体YKL-40-3C8特异性鉴定
取重组的YKL-40蛋白和正常未免疫小鼠血清，经SDS-PAGE电泳后湿转印至聚偏二氟乙烯膜(PVDF),室温条件下，用5％脱脂奶封闭2h,PBST洗涤3次后，加入制备的单克隆抗体YKL-40-3C8(1:1000稀释)于4C孵育12h；PBST洗涤3次后，加入HRP标记的山羊抗鼠IgG(用5％脱脂奶按15000稀释)；PBST洗涤3次后，显影曝光结果如图1所示。
从图1可以看出，单克隆抗体YKL-40-3C8特异性较好，只能识别重组的YKL-40蛋白，而不与小鼠血清反应。
实施例5单克隆抗体YKL-40-3C8交叉反应性鉴定
以单克隆抗体YKL-40-3C8为第一抗体(1:1000)加在肝硬化血清、正常人血清、大肠杆菌裂解液、小鼠血清、重组YKL-40蛋白上,保持各组蛋白定量相同，37℃湿盒孵育45min,PBS(0.01mol/L,pH7.4)浸洗3次,每次5min。加第二抗体(FITC标记的羊抗小鼠IgG,1∶1000),37℃避光湿盒孵育45min,PBS浸洗3次。甘油封片,荧光显微镜观察。结果如表2所示。
表2单抗与各组分的交叉反应结果
| 组别 | 反应情况 |
| 肝硬化血清 | +++ |
| 正常人血清 | + |
| 大肠杆菌裂解液 | - |
| 小鼠血清 | - |
| 重组YKL-40蛋白 | +++ |
注：+++强阳性；++阳性；+弱阳性；-阴性
从表2可以看出，本发明的单克隆抗体能够与肝硬化血清、正常人血清和重组YKL-40蛋白表现出强烈的交叉反应现象，而与大肠杆菌裂解液和小鼠血清均无交叉反应特性。这说明了本发明的单克隆抗体具有非常好的特异性。
实施例6单克隆抗体YKL-40-3C8的可变区序列分析
取对数生长期的YKL-40-3C8杂交瘤细胞(1×106)，用QIAGEN公司的试剂盒RNeasyMiniKit提取总RNA，反转录cDNA，用特异引物扩增抗YKL-40抗体基因的轻链或重链可变区。将含有相应重链可变区或轻链可变区片段的PCR反应产物经1％琼脂糖凝胶电泳，切胶分离目的片段。通过胶回收试剂盒纯化目的产物后，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定目的片段的纯度。之后，将回收得到的相应重链可变区和轻链可变区克隆至测序载体，送上海生工测序，测序结果显示，重链可变区序列如SEQ ID NO：1所示，轻链可变区序列如SEQ ID NO：2所示。
虽然本发明已作了详细描述，但对本领域技术人员来说，在本发明精神和范围内的修改将是显而易见的。此外，应当理解的是，本发明记载的各方面、不同具体实施方式的各部分、和列举的各种特征可被组合或全部或部分互换。在上述的各个具体实施方式中，那些参考另一个具体实施方式的实施方式可适当地与其它实施方式组合，这是将由本领域技术人员所能理解的。此外，本领域技术人员将会理解，前面的描述仅是示例的方式，并不旨在限制本发明。
Claims (7)
1.一种靶向YKL-40蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO：1所示，轻链可变区序列如SEQ ID NO：2所示。
2.一种试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的单克隆抗体和检测试剂。
3.如权利要求1所述的单克隆抗体在制备用于检测样品中YKL-40是否存在的试剂盒中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述检测样品中YKL-40是否存在采用的检测方法为免疫化学方法。
5.权利要求3或4任一项所述的应用，其中所述单克隆抗体带有可检测的标记。
6.如权利要求2所述的试剂盒或者权利要求3或4所述的应用，其中所述试剂盒还含有缓冲液及显色剂。
7.一种检测血液中YKL-40浓度的方法，所述方法包括使用权利要求1所述的单克隆抗体进行检测，所述方法非疾病诊断方法。
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