CN115850497A - 一种ykl-40单克隆抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种YKL‑40单克隆抗体及其制备方法和应用，涉及生物医药技术领域。本发明提供的单克隆抗体10F1效价良好。本发明分别将所述单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区插入不同的基础载体，并将两种重组载体混合后共同转染基础细胞，从而得到可表达单克隆抗体10F1的重组细胞。本发明得到的单克隆抗体载体易于保存，易于抗体生产过程质量控制；可以识别YKL‑40蛋白，具有生物学活性。本发明所述单克隆抗体可用于YKL‑40抗原检测等其它科学研究，具有非常好的应用价值和非常重要科研指导意义。

Description

一种YKL-40单克隆抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种YKL-40单克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术

YKL-40属于几丁质酶样蛋白(Chitinase-Like Proteins，CLPs)中的一种，又叫几丁质酶-3样蛋白1(CHI3L1)。YKL-40是由分子量约为40kDa的肝素和具有高度保守结构域的几丁质结合的糖蛋白组成，因其N端又具有酪氨酸-赖氨酸-亮氨酸的YKL序列，故被命名为YKL-40。哺乳动物不合成几丁质，但可产生两种几丁质酶及几种CLPs，其中包括YKL-40。该蛋白可由巨噬细胞、软骨细胞、成纤维细胞样滑膜细胞、血管平滑肌细胞和肝星状细胞等多种细胞表达和分泌。YKL-40作为人体糖基水解酶18家族的糖蛋白成员之一，不具有酶活性，故缺乏降解几丁质的能力，但仍显示寡糖结合能力。现代研究发现YKL-40在代谢性疾病、心血管疾病、急慢性炎症、癌症等以炎症和组织重建为特点的疾病中水平升高。

神经系统相关研究表明，YKL-40能够促进原代星形胶质细胞的迁移。该蛋白的缺失可以改变胶质细胞炎症反应，促进星形胶质细胞和小胶质细胞Aβ吞噬，减轻淀粉样斑块形成，并影响阿尔兹海默症(AD)的疾病进展；在创伤性脑损伤(TBI)相关的神经炎症反应的发生发展过程中，它的缺失会引发更严重的神经病理学现象和更显著的胶质细胞病变进程；此外，YKL-40的高表达同样可促使主动脉粥样硬化斑块病程加速发展。随着研究的进一步深入，YKL-40可能成为中枢神经系统相关病的诊断标志和治疗的新靶标。但是目前对于YKL-40单克隆抗体的研究较为浅显，无法直接应用于医疗研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种YKL-40单克隆抗体及其制备方法和应用，所述单克隆抗体效价好，并且基于得到所述单克隆抗体构建得到的表达载体和重组细胞，易于保存和改造。

本发明提供了一种特异性识别YKL-40的单克隆抗体10F1，所述单克隆抗体10F1的重链的可变区包括3个互补决定区，氨基酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示；

所述单克隆抗体10F1的轻链可变区包括3个互补决定区，氨基酸序列如SEQ IDNO.4～SEQ ID NO.6所示。

优选的，所述单克隆抗体10F1的重链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

本发明还提供了一种表达上述述单克隆抗体10F1的重组载体，所述重组载体的基础载体包括携带编码重链可变区核苷酸序列的pFUSE-CHIg-m2a，和携带编码轻链可变区核苷酸序列的pFUSE2ss-CLIg-mk。

本发明还提供了一种表达上述单克隆抗体10F1的重组细胞，所述重组细胞的基础细胞包括真核细胞。

本发明还提供了上述重组细胞的构建方法，包括以下步骤：将编码单克隆抗体10F1重链可变区的基因序列插入pFUSE-CHIg-m2a中，得10F1m2a；

将编码单克隆抗体10F1轻链可变区的基因序列插入pFUSE2ss-CLIg-mk中，得10F1mk；

将10F1m2a和10F1mk的质粒混合后转染真核细胞，得重组细胞。

优选的，将编码单克隆抗体10F1重链可变区的基因序列插入pFUSE-CHIg-m2a的EcoRI和NheI之间；

将编码单克隆抗体10F1轻链可变区的基因序列插入pFUSE2ss-CLIg-mk的EcoRI和NheI之间。

本发明还提供了一种制备上述单克隆抗体10F1的方法，包括以下步骤：培养上述重组细胞48h，收集上清液，上清液中包含所述单克隆抗体10F1。

本发明还提供了表达上述单克隆抗体10F1的杂交瘤细胞。

本发明还提供了上述单克隆抗体10F1在制备检测YKL-40的试剂中的应用。

本发明还提供了上述单克隆抗体10F1在制备神经系统疾病诊断和/或预后判断的试剂中的应用。

有益效果：本发明提供了一种特异性识别YKL-40的单克隆抗体10F1，效价良好。本发明分别将所述单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区插入不同的基础载体，并将两种重组载体混合后共同转染基础细胞，从而得到可表达单克隆抗体10F1的重组细胞。本发明得到的单克隆抗体载体易于保存，易于抗体生产过程质量控制；也方便对抗体做一系列的改造，更深入的研究，更广泛的应用。经实施例验证，本发明所述的单克隆抗体10F1或利用重组细胞生产得到的单克隆抗体10F1，可以识别YKL-40蛋白，具有生物学活性。所述单克隆抗体均可用于YKL-40抗原检测等其它科学研究，具有非常好的应用价值和非常重要科研指导意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为CBA法检测免疫小鼠血清抗体效价结果图；

图2为CBA法筛选阳性杂交瘤细胞结果图；

图3为纯化后单克隆抗体考马斯亮蓝染色结果图；

图4为单克隆抗体亚型鉴定结果图，图中每组数据从左到右依次表示IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、kappa和lambda；

图5为单克隆抗体抗体效价测定结果图；

图6为免疫荧光验证单克隆抗体抗原表位分布情况；(a)该抗体识别位点位于氨基酸序列的293-383区间；(b)更具体的说明抗体识别位点位于293-310氨基酸片段上；

图7为WB验证重组单克隆抗体10F1作用特性结果图。

具体实施方式

本发明提供了一种特异性识别YKL-40的单克隆抗体10F1，所述单克隆抗体10F1的重链的可变区包括3个互补决定区，氨基酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示；

所述单克隆抗体10F1的轻链可变区包括3个互补决定区，氨基酸序列如SEQ IDNO.4～SEQ ID NO.6所示。

本发明所述单克隆抗体10F1，其重链属于IgG1，轻链为kappa，并且重链和轻链的可变区均包括3个互补决定区，序列如下所示。

其中，重链可变区互补决定区：

CDR1(SEQ ID NO.1)：SGYWN；

CDR2(SEQ ID NO.2)：FISYSGNTYYNPSLKS；

CDR3(SEQ ID NO.3)：KGDYDGAWFAY；

轻链可变区互补决定区：

CDR1(SEQ ID NO.4)：RASGNIHNYLA；

CDR2(SEQ ID NO.5)：NAKTLAD；

CDR3(SEQ ID NO.6)：QHFWSTPLT。

本发明所述单克隆抗体10F1重链可变区的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.7所示(MMVLSLLYLLTALPGILSEVQLQESGPSLVKPSQTLSLSCSVTGDSITS GYWNWIRKFPGNKLEYMGFISYSGNTYYNPSLKSRISITRDTSKNQYFLQLNS VTTEDTATYYCVRKGDYDGAWFAYWGQGTLVTVSA)；其对应的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示(ATGATGGTGTTAAGTCTTCTGTACCTGTT GACAGCCCTTCCGGGTATCCTGTCAGAGGTGCAGCTTCAGGAGTCAGGACCTAGCCTCGTGAAACCTTCTCAGACTCTGTCCCTCTCCTGTTCTGTCACTGGCGACTCCATCACCAGTGGTTACTGGAACTGGATCCGGAAATTCCCAGGGAATAAACTTGAGTACATGGGGTTCATAAGCTACAGTGGTAACACTTACTACAATCCATCTCTCAAAAGTCGAATCTCCATCACTCGAGACACATCCAAGAACCAGTACTTCCTGCAGTTGAATTCTGTGACTACTGAGGACACAGCCACATATTACTGTGTAAGAAAAGGGGATTACGACGGGGCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA)；单克隆抗体10F1的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示(MSVLTQVLALLLLWLTGARCDIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVP SRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWSTPLTFGAGTKLELK)；轻链可变区对应的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示(ATGAGTGTGCT CACTCAGGTCCTGGCGTTGCTGCTGCTGTGGCTTACAGGTGCCAGATGTGACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCCTCCCTATCTGCATCTGTGGGAGAAACTGTCACCATCACATGTCGAGCAAGTGGGAATATTCACAATTATTTAGCATGGTATCAGCAGAAACAGGGAAAATCTCCTCAGCTCCTGGTCTATAATGCAAAAACCTTAGCAGATGGTGTGCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGAACACAATATTCTCTCAAGATCAACAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGGGAGTTATTACTGTCAACATTTTTGGAGTACTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA)。

本发明还提供了一种表达上述述单克隆抗体10F1的重组载体，所述重组载体的基础载体包括携带编码重链可变区核苷酸序列的pFUSE-CHIg-m2a，和携带编码轻链可变区核苷酸序列的pFUSE2ss-CLIg-mk。

本发明所述pFUSE-CHIg-m2a和pFUSE2ss-CLIg-mk优选均购自invivogen公司，并在构建所述重组载体时，优选将SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列插入所述pFUSE-CHIg-m2a的EcoRI、NheI位点，形成重组载体10F1m2a；将SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列插入所述pFUSE2ss-CLIg-mk的EcoRI、NheI位点，形成重组载体10F1mk。本发明对外源基因插入载体的方法并没有特殊限定，优选包括双酶切法。

本发明还提供了一种表达上述单克隆抗体10F1的重组细胞，所述重组细胞的基础细胞包括真核细胞。

本发明所述真核细胞优选包括哺乳动物细胞，更优选包括293T细胞、CHO细胞或者其它哺乳动物细胞等，在本发明实施例中，以购自ATCC细胞库的293T细胞为例进行说明，但是不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。

本发明还提供了上述重组细胞的构建方法，包括以下步骤：将编码单克隆抗体10F1重链可变区的基因序列插入pFUSE-CHIg-m2a中，得10F1m2a；

将编码单克隆抗体10F1轻链可变区的基因序列插入pFUSE2ss-CLIg-mk中，得10F1mk；

将10F1m2a和10F1mk的质粒混合后转染真核细胞，得重组细胞。

本发明所述重组载体10F1m2a和10F1mk的构建方法优选与上述相同，在此不再赘述。本发明优选提取对应重组载体的质粒后，将其进行混合，所述混合的比例优选为1:1。本发明对所述转染的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规方法进行即可。

本发明还提供了一种制备上述单克隆抗体10F1的方法，包括以下步骤：培养上述重组细胞48h，收集上清液，上清液中包含所述单克隆抗体10F1。

本发明所述培养优选包括在37℃和5％CO₂环境中培养48h，离心，收集细胞培养的上清液，上清液中包含所述单克隆抗体10F1。

利用本发明所述方法制备得到的单克隆抗体10F1具有生物活性，可特异性识别并结合YKL-40，且可被单克隆抗体10F1识别的抗体表位氨基酸片段的核苷酸序列优选如SEQID NO.18所示。

本发明还提供了表达上述单克隆抗体10F1的杂交瘤细胞。

本发明对所述杂交瘤细胞的构建方法并没有特殊限定，优选包括构建包含人YKL-40基因序列(NM_001276.4，SEQ ID NO.16)的原核表达载体，并将所述原核表达载体转化至TOP10感受态细胞中，挑取单克隆，提取质粒后转入大肠杆菌BL21(DE3)表达感受态细胞中，挑取单克隆培养并离心收集上清，经纯化得到纯化抗原；将所述纯化抗原免疫小鼠后，取免疫效果较好的小鼠的脾脏制备脾细胞；将所述脾细胞与杂交瘤细胞融合，筛选ELISA检测阳性杂交瘤细胞。

在本发明中，对于利用所述杂交瘤细胞生产单克隆抗体10F1的方法同样没有特殊限定，优选包括利用腹水制备，纯化后得所述单克隆抗体10F1。

本发明还提供了上述单克隆抗体10F1在制备检测YKL-40的试剂中的应用。

本发明所述检测YKL-40的方法优选包括ELISA法，CBA法和/或Western Blot法。

本发明还提供了上述单克隆抗体10F1在制备神经系统疾病诊断和/或预后判断的试剂中的应用。

本发明所述神经系统疾病优选包括阿尔兹海默症和胶质细胞病变相关疾病的发生、发展和预后判断，因此本发明所述单克隆抗体10F1可用于制备相关的试剂。所述检测方法优选包括ELISA法，CBA法和/或Western Blot法。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种YKL-40单克隆抗体及其制备方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1YKL-40蛋白制备

步骤一、YKL-40原核表达载体构建

1.从GenBank序列数据库中查得人YKL-40基因序列(SEQ ID NO.16)，序列号为NM_001276.4，合成该基因序列到pET-32a载体的NdeI和NotI之间，同时将目的基因YKL-40连接到pGEX 4t-1载体的EcoRI和NotI之间；

2.设计好引物，PCR扩增出目的条带。

上游引物YKL-40-F(SEQ ID NO.11)：ggatctggttccgcgtggatccccggaattcatgggtgtgaaggcgtctc；

下游引物YKL-40-R(SEQ ID NO.12)：atgcactcgctgcaacgtaggcggccgcatcgtgactgactgacgatctg。

配置PCR扩增体系(50μL)：模板50ng、YKL-40-F(10μM)1μL、YKL-40-R(10μM)1μL、FastPfu DNAPolymerase(2.5units)1μL、5×FastPfubuffer 10μL、2.5mM dNTP 4μL和Nuclease-free Water补足50μL。

PCR扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性20s，58℃退火20s，72℃延伸40s，35循环；72℃延伸5min；4℃保存。

3.将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，分别将目的片段和载体用相应的限制性内切酶酶切，回收；

4.将目的片段和载体用同源重组酶连接，50℃连接15min；

5.将连接产物转化至TOP10感受态细胞，37℃培养箱过夜培养；

6.挑取单克隆至相应Amp抗性的LB培养基，37℃摇床过夜培养；

7.提取质粒，测序，比对结果。

步骤二、YKL-40蛋白表达及纯化

1.将构建好且测序正确的质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)表达感受态细胞中；

2.挑取单克隆接于LB培养基中，37℃摇菌至OD值0.5～1，加IPTG诱导，16℃过夜表达；

3.收集菌体，超声破碎，离心后收集上清，pET-32a表达的YKL-40蛋白利用Ni柱亲和层析纯化，纯化的蛋白记为YKL-40-6his；pGEX4t-1表达的YKL-40蛋白进行纯化，纯化的蛋白记为YKL-40-strep；

纯化后的蛋白经过透析、浓缩，得到高浓度的YKL-40-6his蛋白作为抗原备用，YKL-40-strep蛋白用于包被ELISA板检测YKL-40抗体。

实施例2杂交瘤细胞的获得

步骤一、YKL-40抗原免疫小鼠

将40μg纯化好的YKL-40-6his抗原与完全氟氏佐剂1:1混合；取15只6～8周龄的雌性Balb/c小鼠，左侧后小腿肌肉注射100μL(含40μg抗原)混合好的抗原；三周后进行第二次免疫，40μg抗原与不完全氟氏佐剂1:1混合，右侧后小腿肌肉注射100μL(含40μg抗原)混合好的抗原；

步骤二、检测免疫小鼠抗体产生情况

对小鼠进行二次免疫，三周后，采集鼠尾血，离心收集血清，检测小鼠抗体产生的情况，具体实施如下：

1.ELISA法检测小鼠抗体效价：用纯化好的YKL-40-strep蛋白包被ELISA板，100ng/孔，4℃过夜包被(包被液为25mL碳酸盐缓冲液，pH9.6，其中Na₂CO₃0.03975g，NaHCO₃0.07325g，KH₂PO₄0.00625g)；次日，用PBST溶液洗3次，每次3min，每次拍干；加入2％BSA满孔封闭，于37℃条件下孵育1h；孵育完成后用PBST洗3次，每次3min，每次均需拍板除去多余水分；将血清用PBST进行倍比稀释，每孔加入稀释好的血清100μL，37℃孵育1h，用PBST洗涤3次，每次3min，每次拍干；将羊抗鼠IgG-HRP二抗按1：5000比例稀释，加入板中，37℃孵育30min；孵育完成后，用PBST洗涤3次，拍干，加入TMB显色10min，2M H₂SO₄终止，450nm测得吸光值。筛选效价好的6号小鼠进行后续实验，其抗体ELISA效价为218.7万。

2.CBA法检测小鼠抗体效价：将YKL-40(YKL-40-6his)构建在真核表达载体pcDNA3.1上，大提质粒备用；将玻片铺在10cm细胞培养皿里，多聚赖氨酸处理后，将293T细胞均匀的种在皿里，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱过夜培养；转染YKL-40-6his至上述准备好的293T细胞，48h后，弃掉培养液后用丙酮固定30min，培养箱干燥后备用；将血清用PBST溶液按比例稀释，按1：100、1：1000、1：10000、1：100000稀释，分别用按照上述比例稀释好的血清孵育上述片子，室温孵育1h；PBST洗涤3次，二抗孵育30min；PBST洗涤3次，显微镜观察结果，6号小鼠免疫荧光信号结果如图1所示，其抗体CBA效价约为1000。

步骤三、细胞融合

1.骨髓瘤细胞的准备：复苏SP2/0细胞，用DMEM培养基，15％FBS传代培养一周。选对数生长期的骨髓瘤细胞准备进行细胞融合。

2.脾细胞的制备：筛选出免疫效果好的6号小鼠，摘除眼球法采血，离心分离血清；脱颈椎法处死小鼠，75％(v/v)酒精中浸泡5min消毒；转移至超净台内进行后续处理，固定好小鼠，取出脾脏，除去粘连细胞的脂肪组织和结缔组织；获取的脾脏用无血清培养液冲洗干净后，置于细胞滤网上，用注射器内芯轻轻研磨，并用无血清培养液轻柔冲洗滤网，收集冲洗后的液体；将收集到的脾细胞悬液500g离心5min，收集细胞沉淀，洗涤细胞3次，弃掉上清液，细胞沉淀用无血清DMEM培养液悬浮，计数备用。

3.细胞融合：超净台内提前紫外灭菌水浴锅，将水浴锅调节至37℃备用，将上述准备好的SP2/0细胞和脾细胞按1:10比例加入50mL离心管中，混匀。500g离心10min，轻柔吸出弃去上清液，轻弹离心管底部，使细胞沉淀略松动；在90s内缓慢滴入预温至37℃的45％PEG1450溶液1mL；并不断地轻轻摇晃离心管；整个过程保持离心管在37℃水浴中进行；然后向上述PEG1450细胞混合溶液按下述速率逐渐加入DMEM培养基，即：第1min逐滴滴入lmL，第2min加2mL，第3min加3mL，第4min加4mL，第5min加5mL，在37℃水浴中边加边摇。随后37℃孵育15min，500g离心5min，弃上清；向收集到的细胞沉淀中加入5mL含有HAT的DMEM培养基，轻轻悬浮沉淀细胞，最后补充含有HAT的DMED培养基至总体积100mL左右。按100μL/孔分置于已铺巨噬细胞的96孔细胞培养板中，然后将培养板置于37℃，5％CO₂培养箱培养。

步骤四、阳性杂交瘤细胞筛选

1.ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞

用pGEX4t-1载体表达的YKL-40蛋白包被ELISA板，100ng/孔，4℃过夜包被。

观察杂交瘤细胞的生长情况，七天后待细胞培养上清变黄时，取适量培养上清进行ELISA检测相应抗体，进行第一次亚克隆筛选，结果如表1所示，位于第10块板F1位置的孔吸光度值高，选做进一步筛选。

表1第一次ELISA法筛选阳性单克隆实验结果

YKL-40	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
													A	0.074	0.058	0.056	0.057	0.059	0.077	0.061	0.052	0.129	0.061	0.053	0.066
B	0.07	0.312	0.133	0.578	0.156	0.504	0.398	0.151	0.081	0.376	0.136	0.066
													C	0.071	0.129	0.204	0.178	0.382	0.475	0.304	0.294	0.6	0.066	0.406	0.097
D	0.064	0.509	0.481	0.289	0.486	0.28	0.184	0.095	0.159	0.5	0.052	0.061
													E	0.063	0.179	0.201	0.112	0.302	0.442	0.312	0.438	0.37	0.079	0.386	0.131
F	0.905	0.083	0.094	0.302	0.192	0.185	0.338	0.121	0.312	0.278	0.888	0.061
													G	0.059	0.078	0.628	0.145	0.577	0.286	0.161	0.903	0.338	0.217	0.068	0.395
H	0.073	0.092	0.053	0.055	0.066	0.052	0.052	0.075	0.161	0.053	0.061	0.082

七到十天后再进行第二次亚克隆筛选，ELISA检测抗体，选取第一次筛选中OD值高的F1克隆，铺96孔板，使每孔约1个细胞，培养七到十天后再进行ELISA检测抗体，实验结果如表2所示，位于G8位置的细胞克隆OD值最高，记为10F1-G8，选作进一步筛选；

表2第二次ELISA法筛选阳性单克隆实验结果

选取第二次筛选中OD值高的克隆进行第三次亚克隆筛选，铺96孔板，使每孔约1个细胞。选取OD值高的克隆，最终筛选出1个阳性克隆细胞10F1-G8-D9，命名为10F1。实验结果如表3所示。

表3第三次ELISA法筛选阳性单克隆实验结果

10F1G8	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
													A	0.901	0.053	0.889	0.085	0.889	0.169	0.936	0.092	0.054	0.714	0.053	0.081
B	0.086	0.053	0.594	0.046	0.594	0.799	0.999	0.219	0.075	0.8	0.047	1.026
													C	0.817	0.05	0.078	0.598	0.078	0.592	0.992	0.093	0.053	0.342	0.08	0.181
D	0.823	0.06	0.189	0.032	0.189	0.992	0.944	0.239	1.136	0.764	0.061	1.058
													E	0.799	0.047	0.822	0.05	0.822	0.903	0.148	0.995	0.062	0.738	0.049	1.078
F	0.606	0.056	0.256	0.056	0.256	0.358	0.96	1.043	0.06	0.683	0.053	0.644
													G	1.048	0.047	0.099	0.059	0.099	0.92	1.015	0.621	0.053	0.747	0.061	1.032
H	0.996	0.048	0.135	0.054	0.135	0.28	0.854	1.018	0.047	0.181	0.064	0.274

2.CBA法验证阳性杂交瘤细胞筛选结果

将YKL-40(YKL-40-6his)构建在真核表达载体pcDNA3.1上，大提质粒备用；将玻片铺在10cm细胞培养皿里，多聚赖氨酸处理后，将293T细胞均匀的种在皿里，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱过夜培养；转染YKL-40-6his至上述准备好的293T细胞，48h后，弃掉培养液后用丙酮固定30min，培养箱干燥后备用；分别用筛选出的杂交瘤细胞培养上清液孵育上述片子，室温孵育1h；PBST洗涤3次，二抗孵育30min；PBST洗涤3次，显微镜观察结果，其中阳性信号结果如图2所示。

实施例3腹水制备单克隆抗体及单克隆抗体纯化

步骤一、腹水制备单克隆抗体

1.注射300μL腹水佐剂至12周龄Balb/c小鼠腹腔。

2.两周后将杂交瘤细胞培养至细胞活性状态最佳，将细胞数量调至约1×10⁶个/100μL，接种100μL杂交瘤细胞到已注射腹水佐剂的小鼠腹腔。

3.7-10天后收集腹水。

步骤二、单克隆抗体纯化

1.腹水用PBS pH7.4稀释，离心取上清，用protein G亲和层析进行纯化。

2.平衡：用0.4M PB缓冲液(pH 7.0)平衡纯化柱子；

3.上柱：将稀释后的腹水上清缓慢过柱，保证抗体更好的结合在protein G柱子上；

4.洗涤：再用平衡缓冲液洗涤柱子；

5.洗脱：用0.1M甘氨酸缓冲液(pH 2.7)洗脱结合在柱子上的抗体，并加入1MTris-HCl(pH 8.0)中和甘氨酸，使pH保持为适合抗体保存的中性。分别取纯化后的单克隆抗体和对照血清进行SDS-PAGE电泳，结果如图3所示，可清晰的看到抗体的重链和轻链。

实施例4单克隆抗体分型鉴定

用pGEX 4t-1载体表达的YKL-40包被ELISA板，100ng/孔，过夜；用PBST洗涤包被好的ELISA板3次，用2％BSA满孔封闭1小时；加杂交瘤细胞上清100μL，37℃孵育1h；用PBST洗涤3次；孵育HRP标记的二抗(IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgG kappa chain、lambda)，37℃孵育30min。PBST洗涤3次，TMB显色，450nm测得吸光值。实验结果如图4所示，10F1单克隆抗体重链为IgG1，轻链为kappa。

实施例5单克隆抗体序列测定

用实施例2培养好的杂交瘤细胞提取RNA；用5’RACE方法扩增出抗体重链和轻链可变区片段；将扩增出的片段连接到pEASY-Blunt载体上，提取质粒，测序；轻链和重链核苷酸序列见SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10，对应氨基酸序列见SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；使用Kabat方法标记出抗体氨基酸序列的CDR区(SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6)。

实施例6重组单克隆抗体及其作用效果

步骤一、重组单克隆抗体的制备

将测序确定的单克隆抗体10F1重链可变区(SEQ ID NO.9)和轻链可变区(SEQ IDNO.10)分别连接到抗体表达载体pFUSE-CHIg-m2a、pFUSE2ss-CLIg-mk上，记为10F1m2a、10F1mk。测序正确后大量提取质粒，用于细胞转染制备抗体。

将玻片铺在10cm细胞培养皿里，多聚赖氨酸处理后，将293T细胞均匀的种在皿里，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱过夜培养；将构建好的重组抗体表达质粒10F1m2a和10F1mk转入上述准备好的293T细胞，37℃、5％CO₂培养48h。收集上述培养好的细胞上清，离心取上清备用。

步骤二、重组单克隆抗体效价检测

用纯化好的YKL-40-strep蛋白包被ELISA板，100ng/孔，4℃过夜包被(包被液为25mL碳酸盐缓冲液，pH9.6)；次日，用PBST溶液洗3次，每次3min，每次拍干；加入2％BSA满孔封闭，于37℃条件下孵育1h；孵育完成后用PBST洗3次，每次3min，每次均需拍板除去多余水分；将上述收集的上清液用稀释液进行倍比稀释，稀释比例分别按1:3、1:9、1:27、1:81、1:243、1:729、1:2187、1:6561，每孔加入100μL上述稀释液，37℃孵育1h，用PBST洗涤3次，每次3min，每次拍干；将羊抗鼠IgG-HRP二抗按1：5000比例稀释，加入板中，37℃孵育30min；孵育完成后，用PBST洗涤3次，拍干，加入TMB显色10min，2M H₂SO₄终止，450nm测得吸光值如下表4所示：

表4重组单克隆抗体效价检测实验结果(OD₄₅₀)

结果如图5所示。

步骤三、重组单克隆抗体特性检验

1.免疫荧光验证重组单克隆抗体的表位

将YKL-40(YKL-40-6his)、YKL-40前段((YKL-40-22-111-6his，SEQ ID NO.13)、YKL-40中前段(YKL-40-112-201-6his，SEQ ID NO.14)、YKL-40中后段(YKL-40-202-292-6his，SEQ ID NO.15)、YKL-40后段(YKL-40-293-383-6his，SEQ ID NO.17)；分别构建在真核表达载体pcDNA3.1上，大提质粒备用；将玻片铺在10cm细胞培养皿里，多聚赖氨酸处理后，将293T细胞均匀的种在皿里，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱过夜培养；分别转染YKL-40-6his、YKL-40-22-111-6his、YKL-40-112-201-6his、YKL-40-202-292-6his、YKL-40-293-383-6his至上述准备好的293T细胞；转染细胞48h后，弃掉培养液后用丙酮固定30min，培养箱干燥后备用；分别用步骤一中收集的重组单克隆细胞上清液孵育上述片子，室温孵育1h；PBST洗涤3次，二抗孵育30min；PBST洗涤3次，显微镜观察结果。

将上述YKL-40后段(YKL-40-293-383-6his，SEQ ID NO.17)每18个氨基酸一段，划分为YKL-40-293-310(SEQ ID NO.18)、YKL-40-311-328(SEQ ID NO.19)、YKL-40-329-346(SEQ ID NO.20)、YKL-40-347-364(SEQ ID NO.21)、YKL-40-365-383(SEQ ID NO.22)五个片段，分别缺失各个片段(表示为：Q YKL-40-氨基酸位置区间-6his)后构建在真核表达载体pcDNA3.1上，大提质粒备用；将玻片铺在10cm细胞培养皿里，多聚赖氨酸处理后，将293T细胞均匀的种在皿里，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱过夜培养；分别转染Q YKL-40-293-310-6his、Q YKL-40-311-328-6his、Q YKL-40-329-346-6his、Q YKL-40-347-364-6his、QYKL-40-365-383-6his至上述准备好的293T细胞；转染细胞48h后，弃掉培养液后用丙酮固定30min，培养箱干燥后备用；分别用步骤一中收集的重组单克隆细胞上清液孵育上述片子，室温孵育1h；PBST洗涤3次，二抗孵育30min；PBST洗涤3次，显微镜观察结果。

实验结果如图6所示，重组10F1单克隆抗体在293T细胞中成功表达，并且成功分泌于细胞上清。该重组单克隆抗体可以识别YKL-40，具有生物学活性，且该抗体识别位点位于氨基酸序列的293-383区间(图6中(a))；除缺失氨基酸区间293-310组以外，其余分段组别均依旧可被YKL-40抗体识别，说明抗体识别位点位于293-310氨基酸片段上(图6中(b))。

2.WB验证重组单克隆抗体作用特征

取纯化后的YKL-40蛋白作为WesternBlot上样样品进行SDS-PAGE电泳，验证重组单克隆抗体作用特性；电泳完成后，使用湿法转膜，转膜条件为200mA，60min；5％的脱脂奶粉室温封闭1h；重组单克隆细胞上清做一抗，市售YKL-40抗体做对照组一抗，室温孵育2h；TBST洗3次，每次5min；加入HRP标记的羊抗鼠二抗(1:5000稀释)，室温孵育1h；TBST洗3次，每次5min；加入化学发光液显色拍照，观察结果，实验结果如图7所示，重组单克隆抗体10F1与市售YKL-40抗体均可与YKL-40蛋白结合产生信号，可知重组单克隆抗体10F1可识别线性结构，可用作Western Blot实验。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种特异性识别YKL-40的单克隆抗体10F1，其特征在于，所述单克隆抗体10F1的重链的可变区包括3个互补决定区，氨基酸序列如SEQ IDNO.1～SEQ ID NO.3所示；

所述单克隆抗体10F1的轻链可变区包括3个互补决定区，氨基酸序列如SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.6所示。

2.根据权利要求1所述单克隆抗体10F1，其特征在于，所述单克隆抗体10F1的重链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

3.一种表达权利要求1或2所述单克隆抗体10F1的重组载体，其特征在于，所述重组载体的基础载体包括携带编码重链可变区核苷酸序列的pFUSE-CHIg-m2a，和携带编码轻链可变区核苷酸序列的pFUSE2ss-CLIg-mk。

4.一种表达权利要求1或2所述单克隆抗体10F1的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞的基础细胞包括真核细胞。

5.权利要求4所述重组细胞的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将编码单克隆抗体10F1重链可变区的基因序列插入pFUSE-CHIg-m2a中，得10F1m2a；

将编码单克隆抗体10F1轻链可变区的基因序列插入pFUSE2ss-CLIg-mk中，得10F1mk；

将10F1m2a和10F1mk的质粒混合后转染真核细胞，得重组细胞。

6.根据权利要求5所述构建方法，其特征在于，将编码单克隆抗体10F1重链可变区的基因序列插入pFUSE-CHIg-m2a的EcoRI和NheI之间；

将编码单克隆抗体10F1轻链可变区的基因序列插入pFUSE2ss-CLIg-mk的EcoRI和NheI之间。

7.一种制备权利要求1或2所述单克隆抗体10F1的方法，其特征在于，包括以下步骤：培养权利要求4所述重组细胞48h，收集上清液，上清液中包含所述单克隆抗体10F1。

8.表达权利要求1或2所述单克隆抗体10F1的杂交瘤细胞。

9.权利要求1或2所述单克隆抗体10F1在制备检测YKL-40的试剂中的应用。

10.权利要求1或2所述单克隆抗体10F1在制备神经系统疾病诊断和/或预后判断的试剂中的应用。

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