WO2010038831A1 - 細胞増殖を伴う糖尿病合併症の検査のための方法、組成物およびキット - Google Patents

細胞増殖を伴う糖尿病合併症の検査のための方法、組成物およびキット Download PDF

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WO2010038831A1
WO2010038831A1 PCT/JP2009/067169 JP2009067169W WO2010038831A1 WO 2010038831 A1 WO2010038831 A1 WO 2010038831A1 JP 2009067169 W JP2009067169 W JP 2009067169W WO 2010038831 A1 WO2010038831 A1 WO 2010038831A1
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WO
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fragment
antibody
polypeptide
cell proliferation
amino acid
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PCT/JP2009/067169
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岩田岳
松野聖
棚橋一裕
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独立行政法人国立病院機構
参天製薬株式会社
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/16—Ophthalmology
    • G01N2800/164—Retinal disorders, e.g. retinopathy

Definitions

  • the present invention relates to a test method for diabetic complications accompanied by cell proliferation.
  • the examination method includes a method for determining or identifying the complication.
  • the present invention also relates to a composition and kit useful for diagnosis and / or detection of diabetic complications associated with cell proliferation.
  • the retina is a thin membrane at the back of the eyeball, consisting of many cells, and numerous fine blood vessels. If the state of high blood glucose continues for a long time due to diabetes or the like, the fine blood vessels of the retina are damaged little by little, and microcirculatory disturbance occurs.
  • oxygen supply to tissues is stagnated and an ischemic state is formed in the retina.
  • this new blood vessel destroys normal tissue and the formed blood vessel is an immature blood vessel.
  • the cell-to-cell connection between cells forming blood vessels is insufficient, and blood components flow into the tissue from that portion.
  • this disease is a disease that leads to decreased visual acuity, it is very important to make an early diagnosis.
  • the fundus examination is mainly performed, and the patient applies eye drops to open the pupil before the examination, or a fluorescent dye that stains the blood vessels of the retina is applied to the arm. After injection into a vein, a doctor observes the retina directly with a fundus mirror or fundus camera.
  • the pupil is left open by eye drops, the dull and invisible state may continue for about 3 hours, which is a temporary burden for the patient.
  • Diagnostic method using diagnostic markers is one of objective and high-throughput methods. So far, a diagnostic method for diabetic retinopathy using an antibody that specifically recognizes the ED-B domain of fibronectin (Non-patent Document 1) and a diagnostic method using VEGF in plasma have been disclosed (Non-patent Document 2). ). These methods are unable to determine diabetic retinopathy with these markers with relatively high specificity, and are currently at the research level.
  • Non-patent Document 3 a method for diagnosing diabetic retinopathy using a highly reliable protein marker for diabetic retinopathy and a protein marker in the blood of diabetic retinopathy patients has not yet been known. If a marker capable of diagnosing diabetic retinopathy and a method capable of diagnosing using the marker can be created, it can be expected to expand to the diagnosis of diabetic complications accompanied by cell proliferation.
  • markers and marker candidates are generally not clinically used because of their poor specificity and / or sensitivity and their efficient detection methods from biological samples have not been established. Markers of proliferative diabetic retinopathy with high specificity and sensitivity are eagerly desired. In addition, a high-throughput inspection method with a low patient burden that can more objectively and quantitatively indicate the degree of progression of the patient's pathological condition and the temporal change after surgery is desired.
  • the present invention provides a composition or kit useful for diagnosis of diabetic complications involving cell proliferation, particularly proliferative diabetic retinopathy, and a method for examining proliferative diabetic retinopathy using the composition or kit. Objective.
  • the present inventors conducted proteomic analysis of vitreous specimens of patients with diabetic complications associated with cell proliferation such as proliferative diabetic retinopathy and patients with other eye diseases, thereby proliferating cell proliferation such as proliferative diabetic retinopathy.
  • the present inventors have found a protein marker in a living body that is specifically detected by a patient with diabetic complications, and invented a method for examining diabetic complications associated with cell proliferation using the protein marker.
  • the present invention has the following features.
  • an antibody or a fragment thereof or a chemically modified derivative thereof which specifically binds to at least one of a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 to 26 in the sequence listing, a variant thereof or a fragment thereof
  • a fragment that binds to an antibody or an antigen thereof, or a chemistry thereof that specifically binds to at least one of the polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1-26 in the sequence listing, a variant thereof, or a fragment thereof A kit for the diagnosis and / or detection of diabetic complications associated with cell proliferation, comprising one or more of the modified derivatives.
  • a fragment that binds specifically to at least one of the polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1-26 in the sequence listing, a variant thereof, or a fragment thereof, or that binds to an antibody or an antigen thereof, or a chemistry thereof Use of one or more of the modified derivatives in the manufacture of a kit for the diagnosis and / or detection of diabetic complications associated with cell proliferation.
  • the variant of the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1-26 in the sequence listing in this specification is one or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1-26 in the sequence listing or a partial sequence thereof.
  • % identity generally refers to an amino acid residue or position when aligned (aligned) with or without introducing a gap between two amino acid sequences. The percentage of the number of identical amino acid residues or positions shared by the sequence relative to the total number.
  • the identity of two amino acid sequences can be determined using a mathematical algorithm, examples of such algorithms are described in Karlin and Altshul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990, 87: 2264 and its improved versions, Karlin and Altshul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993, 90: 5873-5877. This type of algorithm is incorporated in BLASTN, BLASTX, etc. (Altshul et al., J. Mol. Biol.
  • gap introduction BLAST gap introduction BLAST (gapped BLAST) (Altshul et al., Nucleic Acid Res. 1997, 25: 3389) can be used.
  • the term “several” refers to any integer less than or equal to 10, ie, approximately 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 or 2 integers.
  • chemically modified derivative as used herein is not limited to the following, for example, a labeled derivative such as an enzyme, a fluorescent substance, a dye, a radioisotope, or the like, or biotinylation, acetylation , Means derivatives containing chemical modifications such as glycosylation, phosphorylation, ubiquitination, sulfation.
  • composition for diagnosis and / or detection refers to a diabetic complication associated with cell proliferation such as proliferative diabetic retinopathy.
  • Candidates useful for diagnosing and / or detecting the presence or absence, degree of morbidity or improvement or degree of improvement, or prevention, amelioration or treatment of diabetic complications with cell proliferation such as proliferative diabetic retinopathy A substance that can be used directly or indirectly to screen a substance.
  • the “biological sample” to be detected and / or diagnosed in the present specification contains a target polypeptide that appears as a result of the development of diabetic complications associated with cell proliferation such as proliferative diabetic retinopathy, Suspected samples collected from living organisms, such as cells, tissues (such as vitreous), or body fluids (blood, lymph, urine, tears, vitreous fluid, etc.).
  • telomere binding means that an antibody or a fragment thereof forms an antigen-antibody complex only with a target polypeptide, a variant or a fragment thereof, which is a diabetic retinopathy marker in the present invention
  • the other peptidic or polypeptide substance means that it does not substantially form an antigen-antibody complex.
  • substantially does not form means that non-specific complex formation can occur to a small extent.
  • Markers of diabetic complications with cell proliferation such as proliferative diabetic retinopathy in the present invention are found in biological samples such as blood of proliferative diabetic retinopathy patients, but other markers such as diabetic macular edema and macular hole Since it is rarely or not found in eye diseases, it is possible to easily detect proliferative diabetic retinopathy by simply using the presence or amount of the marker as an index, for example, using blood. Has an effect.
  • retinopathy marker is a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 to 26 in the sequence listing, a variant thereof or a fragment thereof.
  • polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1-26 in the sequence listing of the present invention is represented by the following table together with its protein number (UniProtKB / Swiss-Prot Release 52.2 registered name and registration number) and their characteristics. It is shown in 1. These polypeptides are specifically detected in the vitreous of patients with proliferative diabetic retinopathy and are not detected in the vitreous of patients with diabetic macular edema and macular hole, or compared to the vitreous of diabetic retinopathy patients The detection frequency was significantly reduced.
  • the amino acid sequences of these polypeptides can be obtained by accessing a data bank such as UniProtKB / Swiss-Prot.
  • any of the above target polypeptides for detection of diabetic complications accompanied by cell proliferation can be detected only in biological samples such as vitreous from patients with proliferative diabetic retinopathy, or diabetic macular edema and macular hole. Characterized by significantly or exceptionally high in patients with proliferative diabetic retinopathy compared to Here, “significantly” indicates a statistically significant value, and is a term used when the risk factor (p) is less than 0.05.
  • any one, preferably two or more of the diabetic complication marker polypeptides with cell proliferation in a biological sample of a subject is at a significant level compared to the comparative control. If detected, it can be determined that the patient has proliferative diabetic retinopathy.
  • the polypeptide in the present invention can be produced by, for example, chemical synthesis (peptide synthesis, automatic DNA / RNA synthesis, etc.) or DNA recombination technology, which is a technique commonly used in the art.
  • chemical synthesis peptide synthesis, automatic DNA / RNA synthesis, etc.
  • DNA recombination technology which is a technique commonly used in the art.
  • the use of DNA recombination technology is preferred from the viewpoint of procedure and ease of purification.
  • a polynucleotide sequence encoding a partial sequence of the polypeptide of the present invention is chemically synthesized using an automatic DNA synthesizer.
  • the phosphoramidite method is used for this synthesis, and single-stranded DNA of up to about 100 bases can be automatically synthesized by this method.
  • Automatic DNA synthesizers are commercially available from, for example, Polygen and ABI.
  • RNA extracted from a living tissue such as an eye tissue in which the target gene is expressed by a known cDNA cloning, specifically, using an oligo dT cellulose column.
  • a cDNA library is prepared from the poly A (+) RNA obtained by the treatment by RT-PCR, and the target cDNA clone is obtained from this library by screening such as hybridization screening, expression screening, and antibody screening. If necessary, the cDNA clone can be further amplified by PCR. As a result, cDNA corresponding to the target gene can be obtained.
  • Probes or primers can be selected from, for example, continuous sequences in the range of 15 to 100 bases based on the polypeptide sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 26 in the sequence listing and synthesized as described above.
  • the cDNA cloning technique is described in, for example, Sambrook, J. et al. And Russel, D .; Authors, Molecular Cloning, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Volume 1, July 14, 2001, Volumes 7.42-7.45, Volumes 8.9-8.17, Ausubel et al., Current. Protocols in Molecular Biology, 1994, John Wiley & Sons.
  • the cDNA clone obtained as described above is incorporated into an expression vector, and a prokaryotic or eukaryotic host cell transformed or transfected with the vector is cultured, so that the target polymorph is obtained from the cell or the culture supernatant. Peptides can be obtained.
  • the mature polypeptide can be secreted out of the cell by flanking the nucleotide sequence encoding the secretory signal sequence at the 5 'end of the DNA encoding the target mature polypeptide.
  • Vectors and expression systems are available from Novagen, Takara Shuzo, Daiichi Chemicals, Qiagen, Stratagene, Promega, Roche Diagnostics, Invitrogen, Genetics Institute, Amersham Bioscience, and the like.
  • host cells include prokaryotic cells such as bacteria (eg, E. coli, Bacillus subtilis), yeast (eg, Saccharomyces cerevisiae), insect cells (eg, Sf cells), mammalian cells (eg, COS, CHO, BHK, NIH3T3, etc.) Can be used.
  • Vectors in addition to the DNA encoding the polypeptide, regulatory elements such as promoters (e.g.
  • lac promoter lac promoter, trp promoter, P L promoter, P R promoter, SV40 viral promoter, 3-phosphoglycerate kinase promoter, glycolytic System enzyme promoters), enhancers, polyadenylation signals and ribosome binding sites, replication origins, terminators, selectable markers (for example, drug resistance genes such as ampicillin resistance genes and tetracycline resistance genes; auxotrophic complementary markers such as LEU2 and URA3) ) And the like.
  • selectable markers for example, drug resistance genes such as ampicillin resistance genes and tetracycline resistance genes; auxotrophic complementary markers such as LEU2 and URA3
  • an expression product can be generated in the form of a fusion polypeptide in which a labeled peptide is bound to the C-terminus or N-terminus of the polypeptide.
  • Representative labeled peptides include 6-10 residue histidine repeats (His tag), FLAG, myc peptide, GST (glutathione S-transferase) polypeptide, etc., but the labeled peptides are not limited to these. Absent.
  • examples of the purification method include a method by ion exchange chromatography.
  • a method combining gel filtration, hydrophobic chromatography, isoelectric point chromatography, high performance liquid chromatography (HPLC), electrophoresis, ammonium sulfate fractionation, salting out, ultrafiltration, dialysis and the like may be used.
  • a labeled peptide such as histidine repeat, FLAG, myc, or GST
  • a method by affinity chromatography suitable for each labeled peptide generally used can be mentioned.
  • an expression vector that facilitates isolation and purification may be constructed.
  • an expression vector is constructed so that it is expressed in the form of a fusion polypeptide of a polypeptide and a labeled peptide, and the polypeptide is genetically engineered, isolation and purification are easy.
  • Nucleic acid can be purified by a purification method using agarose gel electrophoresis, a DNA-binding resin column, or the like. Moreover, since an automatic nucleic acid purification apparatus, a nucleic acid purification kit, etc. are marketed, nucleic acid purification can also be performed using these.
  • the variant of the polypeptide of the present invention is a deletion of one or more, preferably one or several amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1-26 in the sequence listing or a partial sequence thereof. About 80% or more, about 85% or more, preferably about 90% or more, more preferably about 95% or more, about 97% or more with a mutant comprising deletion, substitution, addition or insertion, or the amino acid sequence or a partial sequence thereof , A variant consisting of an amino acid sequence having% identity of about 98% or more and about 99% or more.
  • Such mutants include, for example, homologues of mammalian species different from humans, natural variants such as mutants based on polymorphic variation between the same mammalian species (for example, race), splice variants, mutants, etc. Variants are included.
  • the term “subject” is intended to include not only humans but also other mammals.
  • the polypeptide fragment comprises at least 7, at least 8, at least 10, at least 15, preferably at least 20, at least 25, more preferably at least 30, of the amino acid sequence of the polypeptide. Consists of at least 40, at least 50, at least 100, at least 150, or at least 200 to a total number of consecutive amino acid residues and retains one or more epitopes. Such a fragment is capable of immunospecifically binding to the antibody of the present invention or a fragment thereof. For example, when the polypeptide is present in blood, it is assumed that the polypeptide is present by being cleaved and fragmented by an enzyme such as protease or peptidase.
  • the present invention relates to an antibody or fragment thereof, or a chemically modified derivative thereof, which specifically binds to a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 to 26 in the sequence listing, a variant thereof or a fragment thereof.
  • Diagnosis and / or detection of diabetic complications with cell proliferation comprising one or more of, preferably 3 or more, more preferably 5 or more, even more preferably 10 or more, most preferably 26 different antibodies
  • a composition for is provided.
  • composition refers not only to a mixture of a plurality of antibodies, fragments thereof, and / or chemically modified derivatives thereof, but also to a plurality of antibodies, fragments thereof, and / or chemically modified derivatives thereof. It is intended to include combinations.
  • An antibody that recognizes a polypeptide that is a marker for proliferative diabetic retinopathy, a variant thereof, or a fragment thereof can specifically bind to the polypeptide, a variant thereof, or a fragment thereof via an antigen-binding site of the antibody It is.
  • the antibody that can be used in the present invention is conventionally used by using a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1-26 in the sequence listing, a variant thereof, a fragment thereof, or a fusion polypeptide thereof as one or a plurality of immunogens. It can produce by the technique of.
  • polypeptides, fragments, variants or fusion polypeptides contain epitopes that elicit antibody formation, but these epitopes may be linear or higher order (intermittent). Epitopes capable of binding to an antibody are generally considered to be present on the hydrophilic surface of the polypeptide structure.
  • the antibody that can be used in the present invention includes any type, class, and subclass.
  • Such antibodies include, for example, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, IgY, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2.
  • antibodies of all aspects are induced by the polypeptide according to the present invention. If all or part of the polypeptide or epitope is isolated, both polyclonal and monoclonal antibodies can be prepared using conventional techniques. Methods include, for example, the methods listed in Kennet et al. (Supervised), Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyzes, Pleumnum Press, New York, 1980.
  • Polyclonal antibodies can be produced by immunizing animals such as birds (for example, chickens) and mammals (for example, rabbits, goats, horses, sheep, mice, etc.) with the polypeptide of the present invention.
  • the target antibody can be purified from the blood of an immunized animal by appropriately combining techniques such as ammonium sulfate fractionation, ion exchange chromatography, affinity chromatography and the like.
  • Monoclonal antibodies can be obtained by techniques including producing hybridoma cell lines that produce monoclonal antibodies specific for each polypeptide in mice by conventional techniques.
  • One method for producing such hybridoma cell lines is to immunize an animal with a polypeptide according to the invention, collect spleen cells from the immunized animal, fuse the spleen cells to a myeloma cell line, Generating hybridoma cells and identifying a hybridoma cell line that produces a monoclonal antibody that binds to the polypeptide.
  • Monoclonal antibodies can be recovered by conventional techniques.
  • A. Preparation of monoclonal antibody (1) Immunization and collection of antibody-producing cells The immunogen obtained as described above is administered to mammals such as rats, mice (for example, Balb / c of inbred mice), rabbits, and the like. . A single dose of the immunogen is appropriately determined according to the type of animal to be immunized, the route of administration, etc., and is about 50 to 200 ⁇ g per animal. Immunization is performed mainly by injecting an immunogen subcutaneously or intraperitoneally. Further, the immunization interval is not particularly limited, and after the initial immunization, booster immunization is performed 2 to 10 times, preferably 3 to 4 times at intervals of several days to several weeks, preferably at intervals of 1 to 4 weeks.
  • the antibody titer in the serum of the immunized animal is repeatedly measured by ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) method, etc.
  • ELISA Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay
  • the immunogen is intravenously or intraperitoneally Inject and give final immunization.
  • antibody-producing cells are collected 2 to 5 days, preferably 3 days after the last immunization. Examples of antibody-producing cells include spleen cells, lymph node cells, peripheral blood cells, etc., but spleen cells or local lymph node cells are preferred.
  • Hybridoma cell lines that produce monoclonal antibodies specific for each protein can be produced and identified by conventional techniques.
  • One method for producing such a hybridoma cell line is to immunize an animal with a polypeptide of the invention, collect spleen cells from the immunized animal, and fuse the spleen cells to a myeloma cell line, thereby Generating hybridoma cells and identifying a hybridoma cell line producing a monoclonal antibody that binds to the enzyme.
  • a myeloma cell line to be fused with an antibody-producing cell a generally available cell line of an animal such as a mouse can be used.
  • the cell line used has drug selectivity and cannot survive in a HAT selection medium (including hypoxanthine, aminopterin, and thymidine) in an unfused state, but can survive only in a state fused with antibody-producing cells. Those having the following are preferred.
  • the cell line is preferably derived from an animal of the same species as the immunized animal. Specific examples of myeloma cell lines include P3X63-Ag., which is a hypoxanthine / guanine / phosphoribosyltransferase (HGPRT) deficient cell line derived from Balb / c mice. 8 strains (ATCC TIB9).
  • cell fusion is performed between the myeloma cell line and antibody-producing cells.
  • antibody-producing cells and myeloma cell lines are mixed at a ratio of about 1: 1 to 20: 1 in animal cell culture media such as serum-free DMEM and RPMI-1640 media, and cell fusion is performed.
  • the fusion reaction is performed in the presence of an accelerator.
  • an accelerator As a cell fusion promoter, polyethylene glycol having an average molecular weight of 1500 to 4000 daltons can be used at a concentration of about 10 to 80%.
  • an auxiliary agent such as dimethyl sulfoxide may be used in combination in order to increase the fusion efficiency.
  • antibody-producing cells and myeloma cell lines can be fused using a commercially available cell fusion device utilizing electrical stimulation (for example, electroporation).
  • the target hybridoma is selected from the cells after cell fusion treatment.
  • the cell suspension is appropriately diluted with, for example, fetal bovine serum-containing RPMI-1640 medium, and then plated on a microtiter plate at about 2 million cells / well, and a selective medium is added to each well. Cultivate by changing the selective medium.
  • the culture temperature is 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C.
  • myeloma cells are of HGPRT-deficient strain or thymidine kinase-deficient strain
  • a selective medium HAT medium
  • hypoxanthine, aminopterin, and thymidine containing hypoxanthine, aminopterin, and thymidine. Only those hybridomas can be selectively cultured and propagated. As a result, cells that grow from about 14 days after the start of culture in the selective medium can be obtained as hybridomas.
  • Hybridoma screening is not particularly limited, and may be carried out according to ordinary methods. For example, a part of the culture supernatant contained in a well grown as a hybridoma is collected and subjected to enzyme immunoassay (EIA: Enzyme Immuno Assay and ELISA), radioimmunoassay (RIA: Radio Immuno Assay), etc. Can do. Cloning of the fused cells is performed by limiting dilution or the like, and finally a hybridoma that is a monoclonal antibody-producing cell is established. The hybridoma is stable in culture in a basic medium such as RPMI-1640 and DMEM, and produces and secretes a monoclonal antibody that specifically reacts with the polypeptide diabetic retinopathy marker of the present invention.
  • EIA Enzyme Immuno Assay and ELISA
  • RIA Radio Immuno Assay
  • Monoclonal antibodies can be recovered by conventional techniques. That is, as a method for collecting a monoclonal antibody from the established hybridoma, a normal cell culture method or ascites formation method can be employed. In the cell culture method, the hybridoma is cultured in an animal cell culture medium such as RPMI-1640 medium containing 10% fetal bovine serum, MEM medium, or serum-free medium under normal culture conditions (eg, 37 ° C., 5% CO 2 concentration). Cultivate for 2-10 days and obtain antibody from the culture supernatant.
  • an animal cell culture medium such as RPMI-1640 medium containing 10% fetal bovine serum, MEM medium, or serum-free medium under normal culture conditions (eg, 37 ° C., 5% CO 2 concentration).
  • hybridomas In the case of the ascites formation method, about 10 million hybridomas are administered into the abdominal cavity of a myeloma cell-derived mammal and the same type of animal, and the hybridomas are proliferated in large quantities. Ascites fluid or serum is collected after 1-2 weeks.
  • an antigen-binding fragment of the above antibody can also be used.
  • antigen-binding fragments that can be produced by conventional techniques include, but are not limited to, fragments such as Fab and F (ab ′) 2 , Fv, scFv, dsFv.
  • antibody fragments and derivatives that can be produced by genetic engineering techniques.
  • Such antibodies include, for example, synthetic antibodies, recombinant antibodies, multispecific antibodies (including bispecific antibodies), single chain antibodies, and the like.
  • the antibody of the present invention can be used in an assay for detecting the presence of a polypeptide or a (poly) peptide fragment thereof in the present invention, both in vitro and in vivo.
  • the use of monoclonal antibodies is preferred to allow specific detection in the assay, but even polyclonal antibodies can be identified by the so-called absorption method, which involves binding the antibody to an affinity column to which the purified polypeptide is bound.
  • Antibodies can be obtained.
  • composition of the present invention preferably comprises at least one antibody or fragment thereof that can specifically bind to a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1-26 in the sequence listing, a variant thereof, or a fragment thereof, Can include multiple types (two or more, three or more, etc.), more preferably all types.
  • the composition of the present invention is in the form of a kit.
  • a kit includes a container for accommodating antibodies or fragments thereof that can specifically bind to each of the above polypeptides, either separately or as a mixture.
  • the antibody or fragment thereof may be attached or bound on a solid phase carrier such as a multi-well plate made of polystyrene, a spherical carrier such as latex beads or magnetic beads.
  • the antibody or fragment thereof used in the present invention may be bound with a label, for example, a fluorophore, an enzyme, a radioisotope, or the like, if necessary, or such a label may be bound to a secondary antibody. Also good.
  • a label for example, a fluorophore, an enzyme, a radioisotope, or the like, if necessary, or such a label may be bound to a secondary antibody. Also good.
  • Fluorophores include, for example, fluorescein and its derivatives (such as FITC), rhodamine and its derivatives (such as tetramethylrhodamine), dansyl chloride and its derivatives, umbelliferone, and the like.
  • Enzymes include, for example, horseradish peroxidase, alkaline phosphatase and the like.
  • the radioactive isotopes such as iodine (131 I, 125 I, 123 I, 121 I), phosphorus (32 P), sulfur (35 S), metals (e.g. 68 Ga, 67 Ga, 68 Ge , 54 Mn, 99 Mo, 99 Tc, 133 Xe, etc.).
  • luminescent substances such as luminol
  • bioluminescent substances such as luciferase and luciferin.
  • an avidin-biotin system or a streptavidin-biotin system can be used.
  • biotin can be bound to the antibody of the present invention or a fragment thereof.
  • composition of the present invention further comprises an antibody or an antigen-binding fragment thereof that specifically binds to at least one of a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 1-26 in the sequence listing, a variant thereof, or a fragment thereof.
  • kits for the diagnosis or / and detection of diabetic complications associated with cell proliferation comprising one or more of these chemically modified derivatives.
  • the kit comprises, for example, different containers (for example, vials) containing the above-described antibodies or nucleic acids for detecting a marker of diabetic complications accompanied by cell proliferation individually or appropriately mixed.
  • the antibodies can preferably be contained in a container in lyophilized form.
  • the kit of the present invention comprises an antibody or antigen-binding fragment thereof that can specifically bind to each of the above polypeptides, such as a multi-well plate, an array, a microtiter plate, a test strip (or test strip), a latex bead. Or a solid support such as a spherical support such as a magnetic bead or a covalently bonded (covalent or non-covalent) bond.
  • the kit may further contain a buffer, a secondary antibody, an instruction manual, etc. for use in the assay method of the present invention.
  • the present invention further provides a fragment that binds to an antibody or an antigen thereof that specifically binds to at least one of a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1-26 in the sequence listing, a variant thereof or a fragment thereof.
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1-26 in the sequence listing, a variant thereof or a fragment thereof.
  • the use of one or more of these chemically modified derivatives, in the manufacture of a kit for the diagnosis and / or detection of diabetic complications associated with cell proliferation is provided.
  • a substance that can bind to the marker the polypeptide represented by SEQ ID NO: 1-26 in the sequence listing in a biological sample derived from a subject, a variant or fragment thereof, or the polypeptide
  • a diabetic complication associated with cell proliferation eg, proliferative diabetic retina
  • a method comprising measuring in vitro the amount or presence of one or more of the nucleic acids encoding the variant or fragment thereof Disease, traction retinal detachment, fibrous proliferation, iris neovascularization, preretinal hemorrhage, vitreous hemorrhage, etc.).
  • a proliferative diabetic retinopathy marker is detected by the method of the present invention, or when it is determined that the gene expression level is significantly higher than the control, the subject develops diabetic complications associated with cell proliferation and proliferative It can be diagnosed as having diabetic retinopathy.
  • the proliferative diabetic retinopathy marker may be detected by a single marker, but is preferably performed for a plurality of markers, for example, 2 or more, 3 or more, 4 or more, or 5 or more and 26 or less. Is good. This is to improve the accuracy of disease detection by using a plurality of markers.
  • composition or kit of the present invention is useful for diagnosing, determining or detecting diabetic complications accompanied by cell proliferation, that is, diagnosing the presence or absence of morbidity and the degree of morbidity.
  • diagnosis of proliferative diabetic retinopathy the presence or amount of the proliferative diabetic retinopathy marker in the biological sample of the subject is detected by comparing with a negative control such as normal cells, tissues or body fluids. Or, if the amount difference is significant, the subject is suspected of having proliferative diabetic retinopathy.
  • Specimen samples used in the method of the present invention are biological samples such as blood, serum, plasma, urine, body fluid such as tears or vitreous humor, or tissues such as vitreous.
  • the substance capable of binding to the proliferative diabetic retinopathy marker includes, in addition to the antibody or antigen-binding fragment thereof, for example, aptamer, Affibody (trademark) (Affibody), each proliferative diabetic retinopathy marker receptor, Including a specific action inhibitor of a proliferative diabetic retinopathy marker, a specific action activator of each proliferative diabetic retinopathy marker, and the like, preferably an antibody or a fragment thereof, or a chemically modified derivative thereof.
  • the measurement is performed by contacting an antibody or fragment optionally labeled with a conventional enzyme or fluorophore with a tissue section or homogenized tissue or body fluid, qualitatively or with an antigen-antibody complex.
  • a step of quantitatively measuring can be included.
  • Detection is, for example, a method for measuring the presence and level of a target polypeptide by immunoelectron microscopy, an enzyme antibody method (for example, ELISA), a fluorescent antibody method, a radioimmunoassay method, a homogeneous method, a heterogeneous method, a solid phase method, a sandwich method Or the like by a method of measuring the presence or level of the target polypeptide by a conventional method.
  • a proliferative diabetic retinopathy is determined if the target polypeptide is present in a body fluid or tissue or cell, preferably blood, or if the level of the target polypeptide is significantly increased or high compared to a negative control .
  • a method using mass spectrometry is included. Specifically, this method can be performed by the technique described in the examples. That is, a biological sample such as serum or plasma is filtered to remove impurities, diluted with a buffer solution (for example, pH of about 8) and adjusted to a concentration of about 10 mg / ml to about 15 mg / ml, and then a molecular weight of 5 Molecular weight fractionation is performed through a hollow fiber filter (Reference Example (1) below) or a centrifugal flat membrane filter capable of removing more than 10,000 proteins, and the fraction is treated with protease (for example, trypsin) to be peptideized, and mass spectrometry is performed.
  • a buffer solution for example, pH of about 8
  • a molecular weight fractionation is performed through a hollow fiber filter (Reference Example (1) below) or a centrifugal flat membrane filter capable of removing more than 10,000 proteins, and the fraction is treated with protease (for example, trypsin) to be peptid
  • ⁇ Reference example> Production of hollow fiber filter 100 polysulfone hollow fibers having a pore size of about 50,000 on the membrane surface are bundled, and both ends are fixed to a glass tube with an epoxy potting agent so as not to block the hollow part of the hollow fiber. And created a mini-module.
  • the minimodule (module A) is used to remove high molecular weight proteins in serum or plasma, and has a diameter of about 7 mm and a length of about 17 cm.
  • a minimodule (module B) used for concentration of low molecular weight proteins was prepared using a membrane having a pore size of about 3,000 for the molecular weight cut off.
  • the mini module has an inlet connected to the hollow fiber lumen at one end, and an outlet at the opposite end.
  • the hollow fiber inlet and outlet are closed circulation system flow paths using silicon tubes, and the liquid is driven and circulated through the flow path by a peristaltic pump.
  • the glass tube of the hollow fiber mantle is provided with a port for discharging the liquid leaking from the hollow fiber, and one module set is configured.
  • Modules were connected by T-shaped connectors in the middle of the flow path, and three modules A and one module B were connected in tandem to form one hollow fiber filter.
  • the hollow fiber filter was washed with distilled water and filled with an aqueous solution of PBS (phosphate buffer containing 0.15 mM NaCl, pH 7.4).
  • PBS phosphate buffer containing 0.15 mM NaCl, pH 7.4
  • the fraction raw material serum or plasma is injected from the flow channel inlet of the hollow fiber filter, and is discharged from the flow channel outlet after fractionation and concentration. Serum or plasma injected into the hollow fiber filter is subjected to molecular sieving with a molecular weight of about 50,000 for each module A, and components having a molecular weight lower than 50,000 are concentrated and prepared in module B. Yes.
  • Example 1 Protein identification of proliferative diabetic retinopathy, macular hole, and diabetic macular edema 16 proliferative diabetic retinopathy patients with an average age of 61, 16 macular hole patients of the same age, 16 diabetic macular edema patients Vitreous bodies were obtained from each and measured for each. The vitreous was centrifuged to remove contaminants. This vitreous was combined into 16 samples for each disease. The vitreous sample was further diluted in a 300 mM ammonium bicarbonate solution, and fractionated by molecular weight using the hollow fiber filter shown in Reference Example (1). 300 ⁇ g of protein was used per fractionation, and this was repeated 8 times. Eight fraction collection solutions were combined again.
  • the vitreous sample after fractionation (8 fractions collected: 13.6 mL in total, containing up to 600 ⁇ g of protein) is separated into 3 fractions by reverse phase chromatography using AKTA explorer 10s (GE Healthcare Biosciences) Each fraction was lyophilized and redissolved in 100 mM ammonium bicarbonate buffer. This sample was treated with DTT / iodoacetamide and digested with trypsin in an amount of 1/50 of the protein overnight at 37 ° C. for peptideization. The peptides of each fraction were further fractionated into 8 fractions by an ion exchange column. Each fraction was further fractionated on a reverse phase column, and the eluted peptide was measured using a mass spectrometer LCQ Deca XP plus (Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.) linked online. .
  • Phenix conducts searches taking into account isoform-specific amino acid sequences due to alternative splicing of the same protein, changes in mass due to post-translational modifications, etc., and therefore identifies peptides that cannot be identified by Bioworks There is a case. Under these conditions, proteins identified only in Phenix were also listed.
  • proteins listed in each disease a protein detected in proliferative diabetic retinopathy patients but not detected in macular hole and diabetic macular edema patients was found as a vitreous marker protein.
  • These proteins are polypeptides comprising amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 26 in the sequence listing shown in Table 1 (above) and the sequence listing, and therefore proliferative diabetic retinopathy as a marker for proliferative diabetic retinopathy It has been found useful in the detection of diabetic complications with cell proliferation such as and in diagnosis during treatment.
  • the present invention is particularly useful in the pharmaceutical and pharmaceutical industries because it can provide a composition for diagnosing diabetic complications associated with cell proliferation such as proliferative diabetic retinopathy with excellent specificity and sensitivity. .

Abstract

　この発明は、被験者由来の生体試料中の配列表の配列番号１～２６で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、その変異体またはその断片のいずれか１つまたは複数を測定することを含む、増殖性糖尿病網膜症などの細胞増殖を伴う糖尿病合併症を検出する方法、ならびに、増殖性糖尿病網膜症などの細胞増殖を伴う糖尿病合併症を診断および／または検出するための組成物またはキットに関する。

Description

細胞増殖を伴う糖尿病合併症の検査のための方法、組成物およびキット
　本発明は、細胞増殖を伴う糖尿病合併症の検査方法に関する。該検査方法には該合併症の判定方法または同定方法も含まれる。
　本発明は、また細胞増殖を伴う糖尿病合併症の診断および／または検出に有用な組成物およびキットに関する。
　網膜は眼球後部にある薄い膜で、多くの細胞からなり、無数の細かい血管が張り巡らされている。糖尿病などにより血糖の高い状態が長く続くと、網膜の細い血管は少しずつ損傷を受け、微小循環障害が発生する。体内で循環障害が起こると組織への酸素供給が滞り、網膜においても虚血状態を形成することになる。この虚血状態に対して生体側は新たな血管を新生させて酸素を供給しようとするが、この新生血管は正常な組織を破壊するともに、形成される血管は未熟な血管であるために、血管を形成する細胞と細胞の細胞間結合が不十分でその部分から血液内成分が組織内にも流入することになる。さらに、この組織内に流入した血液成分によって、周辺細胞が異常に増殖し、硝子体内ではたとえば線維芽細胞が増殖膜を形成し、重篤な状態になると、著しい視力低下、さらには失明に至る。我国(日本)では、近年の急激な高齢者人口の増加や食の欧米化に伴い、糖尿病患者数も増加の一途をたどっており、その合併症である糖尿病網膜症も増加する傾向にある。
　本疾患は視力低下につながる疾患であるため、早期に診断を行うことが非常に重要である。従来、糖尿病網膜症の診断においては、眼底検査が中心に行われており、患者が検査の前に瞳孔を開くための点眼薬をさすか、あるいは、網膜の血管を染色する蛍光色素を腕の静脈に注射した後に、眼底鏡や眼底カメラで医師が直接、網膜を観察している。しかしながら、点眼薬によって瞳孔が開きっぱなしの状態になるため、まぶしくて見えない状態が約３時間程度続くことがあり、一時的ではあるものの患者にとって負担となる。また、蛍光色素を静注した後に悪心、嘔吐、ショックなどの副作用を引き起こす可能性が全くないとは言えないのが現状である。さらに、医師による網膜の直接観察は、必ずしも客観的な診断方法とはいえず、一人一人の患者について医師が対応しなければならないために大勢の被験者を扱う集団検診などへの展開が難しい。このように、患者の病態の進行度合いや治療中の経時変化をより客観的および定量的に示すことのできる、患者負担の少ないハイスループットな診断方法が望まれている。
　診断マーカーを用いた診断方法は客観的でハイスループットな方法の一つである。これまでにフィブロネクチンのＥＤ－Ｂドメインを特異的に認識する抗体を用いた糖尿病網膜症の診断法（非特許文献１）や、血漿中のＶＥＧＦによる診断方法が開示されている（非特許文献２）。これらの手法は、これらのマーカーをもって相対的に高い特異性で糖尿病網膜症を判定することはできず、研究レベルにとどまっているのが現状である。
　近年のゲノム解析またはプロテオーム解析の進歩に伴い、様々な新規のマーカー候補が報告されている。糖尿病網膜症においても、眼組織を用いたプロテオーム解析により、様々な新規のマーカー候補が報告されている（非特許文献３）。しかしながら、信頼性の高い糖尿病網膜症のタンパク質マーカーや、糖尿病網膜症患者の血液中のタンパク質マーカーを用いて糖尿病網膜症を診断する方法については未だ知られていない。糖尿病網膜症を診断できるマーカー、およびそのマーカーを用いて診断できる方法を創出できれば、細胞増殖を伴う糖尿病合併症の診断にも拡大展開できることが期待される。
Khan ZA, Chan BM, Uniyal S, Barbin YP, Farhangkhoee H, Chen S, Chakrabarti S., Angiogenesis.2005,8(3):183-96. EDB fibronectin and angiogenesis -- a novel mechanistic pathway. Malik RA, Li C, Aziz W, Olson JA, Vohra A, McHardy KC, Forrester JV, Boulton AJ, Wilson PB, Liu D, McLeod D, Kumar S., J Cell Mol Med. 2005 Jul-Sep, 9(3):692-7. Elevated plasma CD105 and vitreous VEGF levels in diabetic retinopathy. Ahn BY, Song ES, Cho YJ, Kwon OW, Kim JK, Lee NG., Proteomics. 2006 Feb, 6(4):1200-9. Identification of an anti-aldolase autoantibody as a diagnostic marker for diabetic retinopathy by immunoproteomic analysis.
　上記の既存マーカー、およびマーカー候補は特異性および／または感受性に乏しいことや、生体試料からのその効率的な検出方法が確立していないことから一般に臨床上の利用は行われておらず、より特異性および感受性が高い増殖性糖尿病網膜症のマーカーが切望されている。また、患者の病態の進行度合いや術後の経時変化をより客観的および定量的に示すことのできる、患者負担の少ないハイスループットな検査方法が望まれている。
　本発明は、細胞増殖を伴う糖尿病合併症、とりわけ増殖性糖尿病網膜症の診断に有用な組成物またはキット、および該組成物またはキットを用いた増殖性糖尿病網膜症の検査方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、増殖性糖尿病網膜症などの細胞増殖を伴う糖尿病合併症をもつ患者と他の眼疾患患者の硝子体検体をプロテオーム解析することによって、増殖性糖尿病網膜症などの細胞増殖を伴う糖尿病合併症をもつ患者に特異的に検出される生体中タンパク質マーカーを見出し、そのタンパク質マーカーを用いた、細胞増殖を伴う糖尿病合併症の検査方法を発明するに至った。
＜発明の概要＞
　本発明は、以下の特徴を有する。
（１）被験者由来の生体試料中に含まれる配列表の配列番号１～２６で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、その変異体またはその断片のいずれか１つまたは複数を定量的もしくは定性的に測定および／または検出することを含む、細胞増殖を伴う糖尿病合併症の検査方法。
（２）糖尿病網膜症が増殖性糖尿病網膜症である、上記（１）に記載の検定方法。
（３）上記ポリペプチド、その変異体またはその断片の測定および／または検出を、質量分析法を用いて行う、上記（１）または（２）に記載の方法。
（４）上記測定および／または検出を、上記ポリペプチド、その変異体またはその断片と結合可能な物質を用いて行う、上記（３）に記載の方法。
（５）上記結合可能な物質が抗体またはその断片である、上記（４）に記載の方法。
（６）上記抗体またはその断片が、酵素、蛍光物質、色素または放射性同位体のいずれかで標識されている、上記（５）に記載の方法。
（７）上記抗体またはその断片が、モノクローナルまたはポリクローナル抗体、あるいはその断片である、上記（５）または（６）に記載の方法。
（８）上記生体試料が、血液、血漿、血清、尿、涙液、硝子体または硝子体液である、上記（１）～（７）のいずれかに記載の方法。
（９）配列表の配列番号１～２６で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、その変異体またはその断片の少なくとも１つと特異的に結合する、抗体もしくはその断片またはそれらの化学修飾誘導体、のうちの１つまたは複数の物質を含む、細胞増殖を伴う糖尿病合併症の診断または／および検出のための組成物。
（１０）配列表の配列番号１～２６で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、その変異体またはその断片の少なくとも１つと特異的に結合する、抗体もしくはその抗原に結合する断片またはそれらの化学修飾誘導体、のうちの１つまたは複数の物質を含む、細胞増殖を伴う糖尿病合併症の診断および／または検出のためのキット。
（１１）配列表の配列番号１～２６で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、その変異体またはその断片の少なくとも１つと特異的に結合する、抗体もしくはその抗原に結合する断片またはそれらの化学修飾誘導体、のうちの１つまたは複数の物質の、細胞増殖を伴う糖尿病合併症の診断および／または検出のためのキットの製造における使用。
＜定義＞
　本明細書中で使用する用語は、以下の定義を有する。
　本明細書における配列表の配列番号１～２６で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの変異体は、配列表の配列番号１～２６で表されるアミノ酸配列またはその部分配列おいて１もしくは複数、好ましくは１もしくは数個、のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入を含む変異体、あるいは該アミノ酸配列またはその部分配列と約８０％以上、約８５％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上、約９７％以上、約９８％以上、約９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる変異体を意味する。
　本明細書で使用される「％同一性」という用語は、一般に、２つのアミノ酸配列にギャップを導入して、またはギャップを導入しないで、整列化（アラインメント）したとき、アミノ酸残基または位置の総数に対する、配列が共有する同一のアミノ酸残基または位置の数の割合（％）を意味する。２つのアミノ酸配列の同一性は、数学的アルゴリズムを用いて決定することが可能であり、そのようなアルゴリズムの例は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｈｕｌ，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　１９９０，　８７：２２６４および、その改良版であるＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｈｕｌ，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　１９９３，　９０：５８７３－５８７７である。この種のアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸなどに組み込まれている（Ａｌｔｓｈｕｌら，　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　１９９０，　２１５：４０３）。本発明の、配列表の配列番号１～２６で表されるポリペプチドの各アミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を得るためには、ＢＬＡＳＴの蛋白質検索を、例えばスコア＝５０、ワード長＝３としたＢＬＡＳＴプログラムを用いて実行する。また、ギャップを導入したアラインメントを得るためには、ギャップ導入ＢＬＡＳＴ（ｇａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｈｕｌら，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．　１９９７，　２５：３３８９）を利用することができる。
　本明細書で使用される「数個」という用語は、１０以下のいずれかの整数、すなわち、約１０、９、８、７、６、５、４、３または２個の整数を指す。
　本明細書で使用される「化学修飾誘導体」という用語は、以下のものに限定されないが、例えば、酵素、蛍光物質、色素、放射性同位元素などのラベルによるラベル化誘導体、あるいはビオチン化、アセチル化、グリコシル化、リン酸化、ユビキチン化、硫酸化などの化学修飾を含む誘導体を意味する。
　本明細書で使用される「診断および／または検出のための組成物」または「診断および／または検出のためのキット」という用語は、増殖性糖尿病網膜症などの細胞増殖を伴う糖尿病合併症の罹患の有無、罹患の程度もしくは改善の有無や改善の程度を診断および／または検出するために、あるいは増殖性糖尿病網膜症などの細胞増殖を伴う糖尿病合併症の予防、改善または治療に有用な候補物質をスクリーニングするために、直接的または間接的に使用しうるものをいう。
　本明細書において検出および／または診断対象となる「生体試料」とは、増殖性糖尿病網膜症などの細胞増殖を伴う糖尿病合併症の発生にともない出現する標的ポリペプチドを含有する、あるいはその含有が疑われる、生体から採取された試料、例えば細胞、組織（硝子体など）、または体液（血液、リンパ液、尿、涙液、硝子体液など）の試料をいう。
　本明細書において「特異的に結合する」とは、抗体またはその断片が、本発明における糖尿病網膜症マーカーである標的ポリペプチド、その変異体またはその断片とのみ抗原-抗体複合体を形成し、他のペプチド性またはポリペプチド性物質とは抗原－抗体複合体を実質的に形成しないことを意味する。ここで、「実質的に形成しない」とは、程度は小さいが非特異的な複合体形成が起こり得ることを意味する。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2008-257691号の明細書に記載される内容を包含する。
　本発明における増殖性糖尿病網膜症などの細胞増殖を伴う糖尿病合併症のマーカーは、増殖性糖尿病網膜症患者の血液などの生体試料中に見出されるが、糖尿病黄斑浮腫や黄斑円孔などの他の眼疾患にはほとんど、または全く見出されないため、単に該マーカーの存在または量を指標にすることによって、例えば血液を用いて、容易に増殖性糖尿病網膜症を検出することができるという格別の作用効果を有する。
　以下に本発明をさらに具体的に説明する。
＜細胞増殖を伴う糖尿病合併症マーカー＞
　本発明の増殖性糖尿病網膜症などの細胞増殖を伴う糖尿病合併症の診断、または検出のための組成物またはキットを使用して増殖性糖尿病網膜症を診断および／または検出するための増殖性糖尿病網膜症マーカーは、配列表の配列番号１～２６で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、その変異体またはその断片である。
　本発明の、配列表の配列番号１～２６で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを、そのタンパク質番号（UniProtKB/Swiss-Prot Release 52.2登録名および登録番号）、ならびにそれらの特性とともに下記の表１に示す。これらのポリペプチドは、増殖性糖尿病網膜症患者硝子体中に特異的に検出され、糖尿病黄斑浮腫および黄斑円孔の患者の硝子体には検出されないか、または糖尿病網膜症患者硝子体に比べて検出頻度が有意に減少していた。なお、これらのポリペプチドのアミノ酸配列は、UniProtKB/Swiss-Prot等のデータバンクにアクセスすることによって入手可能である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本発明において細胞増殖を伴う糖尿病合併症の検出のための上記標的ポリペプチドはいずれも、増殖性糖尿病網膜症患者の硝子体などの生体試料中にしか検出されないか、糖尿病黄斑浮腫および黄斑円孔の患者と比べて増殖性糖尿病網膜症患者において有意にまたは格別に高いことによって特徴付けられる。ここで「有意に」とは、統計学的に有意であることを示し、危険率（ｐ）が０．０５未満である場合に使用される用語である。
　したがって、被験者（すなわち、検査対象者）の生体試料中に上記細胞増殖を伴う糖尿病合併症マーカーポリペプチドのいずれか１つ、好ましくは２つまたはそれ以上が上記比較対照と比べて有意のレベルで検出される場合、増殖性糖尿病網膜症であると判定することができる。
　本発明におけるポリペプチドは、例えば当業界で慣用の技術である化学合成（ペプチド合成、ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成など）またはＤＮＡ組換え技術によって作製することができる。手順や精製の簡易さの点で、ＤＮＡ組換え技術の使用が好ましい。
　簡単に説明すると、はじめに、本発明におけるポリペプチドの部分配列をコードするポリヌクレオチド配列を、ＤＮＡ自動合成装置を用いて化学的に合成する。この合成には一般にホスホアミダイト法が使用され、この方法によって約１００塩基までの一本鎖ＤＮＡを自動合成することができる。ＤＮＡ自動合成装置は、例えばＰｏｌｙｇｅｎ社、ＡＢＩ社などから市販されている。
　得られたポリヌクレオチドをプローブまたはプライマーとして用いて、周知のｃＤＮＡクローニングによって、具体的には、標的である上記遺伝子が発現される眼組織などの生体組織から抽出した全ＲＮＡをオリゴｄＴセルロースカラムで処理して得られるポリＡ（＋）ＲＮＡからＲＴ－ＰＣＲ法によってｃＤＮＡライブラリーを作製し、このライブラリーからハイブリダイゼーションスクリーニング、発現スクリーニング、抗体スクリーニングなどのスクリーニングによって、目的のｃＤＮＡクローンを得る。必要に応じて、ｃＤＮＡクローンをさらにＰＣＲ法によって増幅することもできる。これによって目的の遺伝子に対応するｃＤＮＡを得ることができる。
　プローブまたはプライマーは、配列表の配列番号１～２６に示されるポリペプチド配列に基づいて、例えば１５～１００塩基の範囲の連続する配列の中から選択し、上記のようにして合成しうる。また、ｃＤＮＡクローニング技術は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．および Ｒｕｓｓｅｌ，Ｄ．著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、２００１年１月１５日発行、の第１巻７．４２～７．４５、第２巻８．９～８．１７、Ａｕｓｕｂｅｌら，　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　１９９４年，　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓに記載されている。
　次に、上記のようにして得られたｃＤＮＡクローンを発現ベクターに組み込み、該ベクターによって形質転換またはトランスフェクションされた原核または真核宿主細胞を培養することによって該細胞または培養上清から目的のポリペプチドを得ることができる。このとき、目的の成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡの５’末端に、分泌シグナル配列をコードするヌクレオチド配列をフランキングすることによって細胞外に成熟ポリペプチドを分泌させることができる。
　ベクターおよび発現系はＮｏｖａｇｅｎ社、宝酒造、第一化学薬品、Ｑｉａｇｅｎ社、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｉｔｉｃｓ社、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社、Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社などから入手可能である。宿主細胞としては、細菌などの原核細胞（例えば大腸菌、枯草菌）、酵母（例えばサッカロマイセス・セレビシアエ）、昆虫細胞（例えばＳｆ細胞）、哺乳動物細胞（例えばＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＮＩＨ３Ｔ３など）などを用いることができる。ベクターには、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの他に、調節エレメント、例えばプロモーター（例えばｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ＰLプロモーター、ＰRプロモーター、ＳＶ４０ウイルスプロモーター、３－ホスホグリセレートキナーゼプロモーター、解糖系酵素プロモーターなど）、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルおよびリボソーム結合部位、複製開始点、ターミネーター、選択マーカー（例えばアンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子；ＬＥＵ２、ＵＲＡ３などの栄養要求性相補マーカーなど）などを含むことができる。
　また、ポリペプチドの精製を容易にするために、標識ペプチドをポリペプチドのＣ末端またはＮ末端に結合させた融合ポリペプチドの形態で発現産物生成させることもできる。代表的な標識ペプチドには、６～１０残基のヒスチジンリピート（Ｈｉｓタグ）、ＦＬＡＧ、ｍｙｃペプチド、ＧＳＴ（グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ）ポリペプチドなどが挙げられるが、標識ペプチドはこれらに限られるものではない。
　標識ペプチドを付けずに本発明に係るポリペプチドを生産した場合には、その精製法として例えばイオン交換クロマトグラフィーによる方法を挙げることができる。またこれに加えて、ゲルろ過や疎水性クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、電気泳動、硫安分画、塩析、限外ろ過、透析などを組み合わせる方法でもよい。さらにまた、該ポリペプチドにヒスチジンリピート、ＦＬＡＧ、ｍｙｃ、ＧＳＴといった標識ペプチドを付けている場合には、一般に用いられるそれぞれの標識ペプチドに適したアフィニティークロマトグラフィーによる方法を挙げることができる。この場合、単離・精製が容易となるような発現ベクターを構築するとよい。特にポリペプチドと標識ペプチドとの融合ポリペプチドの形態で発現するように発現ベクターを構築し、遺伝子工学的に当該ポリペプチドを調製すれば、単離・精製も容易である。
　核酸の精製は、アガロースゲル電気泳動、ＤＮＡ結合性樹脂カラムなどを使用した精製法によって行うことができる。また、自動核酸精製装置や核酸精製キットなどが市販されているので、これらを使用して、核酸精製を行うこともできる。
　本発明における上記ポリペプチドの変異体は、上記定義のとおり、配列表の配列番号１～２６で表されるアミノ酸配列またはその部分配列おいて１以上、好ましくは１もしくは数個、のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入を含む変異体、あるいは該アミノ酸配列またはその部分配列と約８０％以上、約８５％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上、約９７％以上、約９８％以上、約９９％以上の％同一性を有するアミノ酸配列からなる変異体である。このような変異体には、例えば、ヒトと異なる哺乳動物種のホモログ、同種の哺乳動物(例えば人種)間での多型性変異に基づく変異体、スプライス変異体、突然変異体などの天然変異体が含まれる。
　本発明における「被験者」なる用語には、ヒトのみならず、他の哺乳動物も含むことが意図されている。
　本発明における上記ポリペプチドの断片は、該ポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２０個、少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも１５０個、または少なくとも２００個から全数までの連続するアミノ酸残基からなり、１個または複数のエピトープを保持する。このような断片は、本発明に関わる抗体またはその断片と免疫特異的に結合することができるものである。上記ポリペプチドが、例えば血液中に存在する場合には、そこに存在するプロテアーゼやペプチダーゼなどの酵素によって切断され断片化されて存在することが想定される。
＜細胞増殖を伴う糖尿病合併症の診断または検出のための組成物またはキット＞
　本発明は、配列表の配列番号１～２６で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、その変異体またはその断片と特異的に結合する、抗体もしくはその断片、またはそれらの化学修飾誘導体、のうちの１つまたは複数、好ましくは３種以上、より好ましくは５種以上、更に好ましくは１０種以上、最も好ましくは２６種の異なる抗体を含む、細胞増殖を伴う糖尿病合併症の診断および／または検出のための組成物を提供する。
　本発明において、組成物なる用語は、複数の抗体、その断片、および／またはそれらの化学修飾誘導体、の単なる混合のみならず、複数の抗体、その断片、および／またはそれらの化学修飾誘導体、の組合せも含むことを意図している。
　増殖性糖尿病網膜症マーカーであるポリペプチド、その変異体またはその断片を認識する抗体は、抗体の抗原結合部位を介して、該ポリペプチド、その変異体またはその断片に特異的に結合し得るものである。本発明で使用しうる抗体は、配列表の配列番号１～２６のアミノ酸配列を含むポリペプチド、その変異体、またはその断片、あるいはその融合ポリペプチドを１または複数の免疫原として使用して慣用の技術によって作製することができる。これらのポリペプチド、断片、変異体または融合ポリペプチドは、抗体形成を引き出すエピトープを含むが、これらエピトープは、直鎖でもよいし、より高次構造（断続的）でもよい。抗体と結合可能なエピトープは、一般に、ポリペプチド構造の親水性表面上に存在すると考えられる。
　本発明で使用しうる抗体は、いずれのタイプ、クラス、サブクラスも含まれるものとする。そのような抗体には、例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＹ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２などが含まれる。
　さらにまた、本発明に係るポリペプチドによってあらゆる態様の抗体が誘導される。該ポリペプチドの全部もしくは一部またはエピトープが単離されていれば、慣用技術を用いてポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のいずれも作製可能である。方法には例えば、Ｋｅｎｎｅｔら（監修），Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：　 Ａ　Ｎｅｗ　 Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅ ｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９８０に挙げられた方法がある。
　ポリクローナル抗体は、鳥類(例えば、ニワトリなど)、哺乳動物(例えば、ウサギ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ネズミなど)などの動物に本発明に係るポリペプチドを免疫することによって作製することができる。目的の抗体は、免疫された動物の血液から、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの手法を適宜組み合わせて精製することができる。
　モノクローナル抗体は、各ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を、慣用技術によってマウスにおいて産生することを含む手法によって得ることができる。こうしたハイブリドーマ細胞株を産生するための１つの方法は、動物を本発明に係るポリペプチドで免疫し、免疫された動物から脾臓細胞を採取し、該脾臓細胞を骨髄腫細胞株に融合させ、それによりハイブリドーマ細胞を生成し、そして該ポリペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定することを含む。モノクローナル抗体は、慣用技術によって回収可能である。
　モノクローナルおよびポリクローナル抗体の作製について以下に詳しく説明する。
Ａ．モノクローナル抗体の作製
（１）免疫および抗体産生細胞の採取
　上記のようにして得られた免疫原を、哺乳動物、例えばラット、マウス（例えば近交系マウスのＢａｌｂ／ｃ）、ウサギなどに投与する。免疫原の１回の投与量は、免疫動物の種類、投与経路などにより適宜決定されるものであるが、動物１匹当たり約５０～２００μｇとされる。免疫は主として皮下、腹腔内に免疫原を注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、初回免疫後、数日から数週間間隔で、好ましくは１～４週間間隔で、２～１０回、好ましくは３～４回追加免疫を行う。初回免疫の後、免疫動物の血清中の抗体価の測定をＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ｓｏｒｂｅｎｔ　Ａｓｓａｙ）法などにより繰り返し行い、抗体価がプラトーに達したときは、免疫原を静脈内または腹腔内に注射し、最終免疫とする。そして、最終免疫の日から２～５日後、好ましくは３日後に、抗体産生細胞を採取する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞または局所リンパ節細胞が好ましい。
（２）細胞融合
　各タンパク質に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株は、慣用的技術によって産生し、そして同定することが可能である。こうしたハイブリドーマ細胞株を産生するための１つの方法は、動物を本発明のポリペプチドで免疫し、免疫された動物から脾臓細胞を採取し、該脾臓細胞を骨髄腫細胞株に融合させ、それによりハイブリドーマ細胞を生成し、そして該酵素に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定することを含む。抗体産生細胞と融合させる骨髄腫細胞株としては、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。また株化細胞は、免疫動物と同種系の動物に由来するものが好ましい。骨髄腫細胞株の具体例としては、Ｂａｌｂ／ｃマウス由来のヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）欠損細胞株であるＰ３Ｘ６３－Ａｇ．８株（ＡＴＣＣ　ＴＩＢ９）などが挙げられる。
　次に、上記骨髄腫細胞株と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、血清を含まないＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ－１６４０培地などの動物細胞培養用培地中で、抗体産生細胞と骨髄腫細胞株とを約１：１～２０：１の割合で混合し、細胞融合促進剤の存在下にて融合反応を行う。細胞融合促進剤として、平均分子量１５００～４０００ダルトンのポリエチレングリコール等を約１０～８０％の濃度で使用することができる。また場合によっては、融合効率を高めるために、ジメチルスルホキシドなどの補助剤を併用してもよい。さらに、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞と骨髄腫細胞株とを融合させることもできる。
（３）ハイブリドーマの選別およびクローニング
　細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、細胞懸濁液を、例えばウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ－１６４０培地などで適当に希釈後、マイクロタイタープレート上に２００万個/ウェル程度まき、各ウェルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。培養温度は、２０～４０℃、好ましくは約３７℃である。ミエローマ細胞がＨＧＰＲＴ欠損株またはチミジンキナーゼ欠損株のものである場合には、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジンを含む選択培地（ＨＡＴ培地）を用いることにより、抗体産生能を有する細胞と骨髄腫細胞株のハイブリドーマのみを選択的に培養し、増殖させることができる。その結果、選択培地で培養開始後、約１４日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
　次に、増殖してきたハイブリドーマの培養上清中に、目的とする抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウェルに含まれる培養上清の一部を採取し、酵素免疫測定法（ＥＩＡ：Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ａｓｓａｙ、およびＥＬＩＳＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ：Ｒａｄｉｏ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ａｓｓａｙ）等によって行うことができる。融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行い、最終的にモノクローナル抗体産生細胞であるハイブリドーマを樹立する。ハイブリドーマは、ＲＰＭＩ－１６４０、ＤＭＥＭ等の基本培地中での培養において安定であり、本発明のポリペプチド性糖尿病網膜症マーカーと特異的に反応するモノクローナル抗体を産生、分泌するものである。
（４）抗体の回収
　モノクローナル抗体は、慣用的技術によって回収可能である。すなわち樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法または腹水形成法等を採用することができる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを１０％ ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ－１６４０培地、ＭＥＭ培地または無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件（例えば３７℃、５％ＣＯ2濃度）で２～１０日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。腹水形成法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマを約１０００万個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、１～２週間後に腹水または血清を採取する。
　上記抗体の採取方法において、抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜に選択して、またはこれらを組み合わせることにより、精製された本発明のモノクローナル抗体を得ることができる。
Ｂ．ポリクローナル抗体の作製
　ポリクローナル抗体を作製する場合は、前記と同様に動物を免疫し、最終の免疫日から６～６０日後に、酵素免疫測定法（ＥＩＡおよびＥＬＩＳＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）等で抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血し、抗血清を得る。その後は、抗血清中のポリクローナル抗体の反応性をＥＬＩＳＡ法などで測定する。
　また本発明においては、上記抗体の抗原結合断片も使用しうる。慣用的技術によって産生可能な抗原結合断片の例には、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）2、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖなどの断片が含まれるが、これらに限定されない。遺伝子工学技術によって産生可能な抗体断片および誘導体もまた含まれる。そのような抗体には、例えば合成抗体、組換え抗体、多重特異性抗体（二重特異性抗体を含む）、単鎖抗体などが含まれる。
　本発明の抗体は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏのいずれにおいても、本発明において、ポリペプチドまたはその（ポリ）ペプチド断片の存在を検出するためのアッセイに使用可能である。アッセイにおける特異的検出を可能にするために、モノクローナル抗体の使用が好ましいが、ポリクローナル抗体であっても、精製ポリペプチドを結合したアフィニティーカラムに抗体を結合させることを含む、いわゆる吸収法によって、特異抗体を得ることができる。
　したがって、本発明の組成物は、配列表の配列番号１～２６のアミノ酸配列を含むポリペプチド、その変異体、またはその断片と特異的に結合可能な抗体またはその断片を少なくとも１つ含む、好ましくは複数種（２種以上、３種以上など）、より好ましくは全ての種類を含むことができる。
　好ましくは、本発明の組成物はキットの形態である。このようなキットにおいては、上記の各ポリペプチドに特異的に結合可能な抗体またはその断片を、それぞれ別個に、あるいは混合物として、収容する容器を含む。抗体またはその断片は、例えばポリスチレン製などのマルチウエルプレート、ラテックスビーズ、磁性ビーズなどの球状担体などの固相担体上に付着または結合させてもよい。
　本発明で使用される抗体またはその断片には、必要に応じてラベル、例えば蛍光団、酵素、放射性同位元素などを結合させてもよいし、あるいは二次抗体にこのようなラベルを結合してもよい。
　蛍光団には、例えばフレオレセインとその誘導体（ＦＩＴＣなど）、ローダミンとその誘導体（テトラメチルローダミンなど）、ダンシルクロリドとその誘導体、ウンベリフェロンなどが含まれる。
　酵素には、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどが含まれる。
　放射性同位元素には、例えばヨウ素（131Ｉ、125Ｉ、123Ｉ、121Ｉ）、リン（32Ｐ）、イオウ（35Ｓ）、金属類（例えば68Ｇａ、67Ｇａ、68Ｇｅ、54Ｍｎ、99Ｍｏ、99Ｔｃ、133Ｘｅなど）などが含まれる。
　その他のラベルには、例えばルミノールなどの発光物質、ルシフェラーゼ、ルシフェリンなどの生物発光物質などが含まれる。
　また、必要に応じて、アビジン－ビオチン系またはストレプトアビジン－ビオチン系を利用することも可能であり、この場合、本発明の抗体またはその断片に例えばビオチンを結合することもできる。
　本発明の組成物はさらに、配列表の配列番号１～２６で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、その変異体またはその断片の少なくとも１つと特異的に結合する、抗体もしくはその抗原結合断片またはそれらの化学修飾誘導体、のうちの１つまたは複数の物質を含む、細胞増殖を伴う糖尿病合併症の診断または／および検出のためのキットを提供する。
　該キットは、例えば、細胞増殖を伴う糖尿病合併症のマーカーを検出するための上記の抗体類または核酸類を個別に、または適宜混合して、収容した異なる容器（例えばバイアルなど）からなる。抗体類は、好ましくは、凍結乾燥形態で容器に収容されうる。
　あるいは、本発明のキットは、上記の各ポリペプチドに特異的に結合可能な抗体またはその抗原結合断片を、例えばマルチウエルプレート、アレイ、マイクロタイタープレート、試験片（もしくは、テストストリップ）、ラテックスビーズや磁性ビーズなどの球状担体などの固相担体上に付着または（共有もしくは非共有）結合させたものからなってもよい。
　キットにはさらに、本発明の検定方法に使用するためのバッファー、二次抗体、使用説明書などが含まれてもよい。
　したがって、本発明はさらに、配列表の配列番号１～２６で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、その変異体またはその断片の少なくとも１つと特異的に結合する、抗体もしくはその抗原に結合する断片またはそれらの化学修飾誘導体、のうちの１つまたは複数の物質の、細胞増殖を伴う糖尿病合併症の診断および／または検出のためのキットの製造における使用を提供する。
＜細胞増殖を伴う糖尿病合併症の検出＞
　本発明によれば、上記マーカーと結合可能な物質を用いて、被験者由来の生体試料中の配列表の配列番号１～２６で表されるポリペプチド、その変異体またはその断片、あるいは該ポリペプチド、その変異体またはその断片をコードする核酸、のうちの１つまたは複数について、その量もしくは存在をインビトロで測定することを含む方法によって、細胞増殖を伴う糖尿病合併症（例えば、増殖性糖尿病網膜症、牽引製網膜剥離、繊維性増殖、虹彩血管新生、網膜前出血、硝子体出血など）を検出することができる。本発明の方法によって増殖性糖尿病網膜症マーカーが検出されるか、または対照と比べて遺伝子発現レベルが有意に高いと判定されるときには、被験者は細胞増殖を伴う糖尿病合併症が進行し、増殖性糖尿病網膜症に罹患していると診断しうる。
　本発明の方法では、上記増殖性糖尿病網膜症マーカーの検出は、単一のマーカーでもよいが、好ましくは複数、例えば２以上、３以上、４以上、または５以上から２６以下のマーカーについて行うのがよい。これは、複数のマーカーを用いることによって疾患の検出精度を向上するためである。
　本発明の組成物またはキットは、細胞増殖を伴う糖尿病合併症の診断、判定または検出、すなわち罹患の有無や罹患の程度の診断、のために有用である。増殖性糖尿病網膜症の診断においては、正常な細胞、組織または体液などの陰性対照との比較を行い、被験者の生体試料中の上記増殖性糖尿病網膜症マーカーの存在または量を検出し、その存在または量の差が有意であれば、被験者について増殖性糖尿病網膜症の罹患が疑われる。
　本発明方法で用いられる検体試料としては、血液、血清、血漿、尿、涙液または硝子体液などの体液、または硝子体などの組織に代表される生体試料である。
　上記増殖性糖尿病網膜症マーカーと結合可能な物質は、上記抗体またはその抗原結合断片の他、例えばアプタマー、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（商標）（Ａｆｆｉｂｏｄｙ社）、それぞれの増殖性糖尿病網膜症マーカーの受容体、それぞれの増殖性糖尿病網膜症マーカーの特異的作用阻害物質、それぞれの増殖性糖尿病網膜症マーカーの特異的作用活性化物質などを含み、好ましくは抗体もしくはその断片、またはそれらの化学修飾誘導体である。
　本発明の実施形態において、測定は、慣用の酵素または蛍光団で必要により標識した抗体または断片と、組織切片またはホモゲナイズした組織または体液とを接触させる工程、抗原－抗体複合体を定性的にまたは定量的に測定する工程を含むことができる。検出は、例えば免疫電顕により標的ポリペプチドの存在とレベルを測定する方法、酵素抗体法(例えばＥＬＩＳＡ)、蛍光抗体法、放射性免疫測定法、均一法、不均一法、固相法、サンドイッチ法などの慣用法によって標的ポリペプチドの存在またはレベルを測定する方法などによって行うことができる。体液または組織もしくは細胞、好ましくは血液、において、標的ポリペプチドが存在する場合、あるいは陰性対照と比較して標的ポリペプチドのレベルが有意に増大または高い場合、増殖性糖尿病網膜症であると決定する。
　免疫学的方法に代わる測定方法として、質量分析法を用いる方法が含まれる。この方法は、具体的には実施例に記載される手法で行うことができる。すなわち、生物試料、例えば血清または血漿をフィルターでろ過して夾雑物を除き、緩衝液（例えばｐＨ約８）で希釈して約１０ｍｇ／ｍｌ～約１５ｍｇ／ｍｌの濃度に調整したのち、分子量５万以上のタンパク質を除去可能な中空糸フィルター（下記参考例（１））または遠心型平膜フィルターを通して分子量分画し、画分をプロテアーゼ（例えばトリプシン）で処理してペプチド化し、これを質量分析計（マトリックス支援レーザー脱離イオン化法、またはエレクトロスプレーイオン化法を利用したタイプ）に掛けて、目的のポリペプチド由来の特定ピークの質量／荷電数と強度に基づいて、増殖性糖尿病網膜症患者と、健常人または他の眼疾患の間における試料中のポリペプチドの存在量の差異を測定することができる。
　本発明を以下の実施例によってさらに具体的に説明する。しかし、本発明の範囲は、この実施例によって制限されないものとする。
＜参考例＞
（１）中空糸フィルターの作製
　分画分子量約５万の孔径を膜表面に有するポリスルホン中空糸を１００本束ね、中空糸中空部を閉塞しないようにエポキシ系ポッティング剤で両末端をガラス管に固定し、ミニモジュールを作成した。該ミニモジュール（モジュールＡ）は血清または血漿中の高分子量タンパク質の除去に用いられ、その直径は約７ｍｍ、長さは約１７ｃｍである。同様に低分子量タンパク質の濃縮に用いられるミニモジュール（モジュールＢ）を分画分子量約３千の孔径の膜を用いて作成した。ミニモジュールは片端に中空糸内腔に連結する入口があり、反対側の端は出口となる。中空糸入口と出口はシリコンチューブによる閉鎖循環系流路であり、この流路内を液体がペリスタポンプに駆動されて循環する。また、中空糸外套のガラス管には、中空糸から漏出してきた液体を排出するポートを備え、１つモジュールセットが構成される。流路途中にＴ字のコネクターによって、モジュールを連結し、モジュールＡ３本と、モジュールＢ１本をタンデムに連結してひとつの中空糸フィルターとした。この中空糸フィルターを蒸留水にて洗浄し、ＰＢＳ（０．１５ｍＭ ＮａＣｌを含むリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）水溶液を充填した。分画原料の血清または血漿は該中空糸フィルターの流路入口から注入され、分画・濃縮後に流路出口から排出される。該中空糸フィルターに注入された血清または血漿は、モジュールＡ毎に分子量約５万で分子篩いがかかり、分子量５万よりも低分子の成分はモジュールＢで濃縮され、調製されるようになっている。
＜実施例１＞
（１）増殖性糖尿病網膜症、黄斑円孔、および糖尿病黄斑浮腫のタンパク質同定
　平均年齢61歳の増殖性糖尿病網膜症患者16名、および同年代の黄斑円孔患者16名、糖尿病黄斑浮腫患者16名から硝子体を得て、それぞれについて測定を行った。硝子体を遠心分離して夾雑物質を取り除いた。この硝子体を疾患ごとに、16検体分を1つにまとめた。硝子体サンプルは、さらに300ｍＭ重炭酸アンモニウム溶液に希釈し、参考例（１）に示した中空糸フィルターによって分子量による分画を行った。タンパク質は分画操作1回あたり300μgを用い、これを８回繰り返した。８回分の分画回収液は再び1つにまとめた。分画後の硝子体サンプル（分画回収液8回分：全量13.6ｍＬ、最大600μｇのタンパク質を含む）はAKTA explorer 10s（GEヘルスケア バイオサイエンス株式会社）による逆相クロマトグラフィーで３分画に分離し、それぞれのフラクションを凍結乾燥した後、100mM重炭酸アンモニウムバッファーに再溶解した。このサンプルをDTT・ヨードアセトアミド処理後に、タンパク質の５０分の１量のトリプシンで３７℃、一晩、消化し、ペプチド化を行った。各分画のペプチドをさらにイオン交換カラムによって8分画化した。その各々の分画を、逆相カラムでさらに分画し、溶出されてきたペプチドについて、オンラインで連結された質量分析計LCQ Deca XP plus（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を用いて、測定した。
（２）黄斑円孔、糖尿病黄斑浮腫、および増殖性糖尿病網膜症の硝子体のタンパク質発現比較
　上記（１）において測定したデータを、タンパク質同定ソフトウェアであるBioworks（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）およびPhenyx(GENE BIO社)を用いて解析することにより、網羅的にタンパク質同定を行った。同定されたタンパク質の中から、２種類のソフトウエアで、共に同定されたタンパク質をリストアップし、各疾患の患者硝子体サンプルから検出されたタンパク質とした。これは、アルゴリズムの異なる二種類のソフトウエアを組み合わせることで、一方のソフトウエアの解析結果に含まれる擬陽性のタンパク質を排除するために行った。しかし、Phenyxは、Bioworksと異なり、同じタンパク質のオルタナティブスプライシングによるアイソフォーム特異的なアミノ酸配列や、翻訳後修飾による質量の変化等を考慮に加えて検索を行うため、Bioworksで同定できないペプチドを同定する場合がある。このような条件で、Phenyxでのみ同定されたタンパク質についても、リストアップした。
　各疾患でリストアップされたタンパク質のうち、増殖性糖尿病網膜症患者で検出され、黄斑円孔、糖尿病黄斑浮腫患者では全く検出されていないタンパク質を硝子体マーカータンパク質として見いだした。これらのタンパク質は、表１（上記）および配列表に示した配列表の配列番号１～２６で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、故に増殖性糖尿病網膜症マーカーとして増殖性糖尿病網膜症などの細胞増殖を伴う糖尿病合併症の検出および治療中の診断において有用であることが判明した。
　本発明は、特異性および感受性に優れた、増殖性糖尿病網膜症などの細胞増殖を伴う糖尿病合併症の診断のための組成物を提供することができるため、特に製薬および医薬産業上有用である。
　本明細書で引用した全ての刊行物等をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (11)

  1. 　被験者由来の生体試料中に含まれる配列表の配列番号１～２６で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、その変異体またはその断片のいずれか１つまたは複数を定量的もしくは定性的に測定および／または検出することを含む、細胞増殖を伴う糖尿病合併症の検査方法。
  2. 　細胞増殖を伴う糖尿病合併症が増殖性糖尿病網膜症である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記ポリペプチド、その変異体またはその断片の測定および／または検出を、質量分析法を用いて行う、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　前記測定および／または検出を、前記ポリペプチド、その変異体またはその断片と結合可能な物質を用いて行う、請求項３に記載の方法。
  5. 　前記結合可能な物質が抗体またはその断片である、請求項４に記載の方法。
  6. 　前記抗体またはその断片が、酵素、蛍光物質、色素または放射性同位元素のいずれかで標識されている、請求項５に記載の方法。
  7. 　前記抗体またはその断片が、モノクローナルまたはポリクローナル抗体、あるいはその断片である、請求項５または６に記載の方法。
  8. 　前記生体試料が血液、血漿、血清、尿、涙液、硝子体または硝子体液である、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　配列表の配列番号１～２６で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、その変異体またはその断片の少なくとも１つと特異的に結合する、抗体もしくはその断片またはそれらの化学修飾誘導体、のうちの１つまたは複数の物質を含む、細胞増殖を伴う糖尿病合併症の診断または／および検出のための組成物。
  10. 　配列表の配列番号１～２６で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、その変異体またはその断片の少なくとも１つと特異的に結合する、抗体もしくはその抗原に結合する断片またはそれらの化学修飾誘導体、のうちの１つまたは複数の物質を含む、細胞増殖を伴う糖尿病合併症の診断および／または検出のためのキット。
  11. 　配列表の配列番号１～２６で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、その変異体またはその断片の少なくとも１つと特異的に結合する、抗体もしくはその抗原に結合する断片またはそれらの化学修飾誘導体、のうちの１つまたは複数の物質の、細胞増殖を伴う糖尿病合併症の診断および／または検出のためのキットの製造における使用。
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