WO2021049830A1 - Ykl-40 표적 인간 단일클론항체 - Google Patents

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WO2021049830A1
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cancer
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monoclonal antibody
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김대영
강경재
김윤지
이세라
홍진태
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재단법인 오송첨단의료산업진흥재단
충북대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention is a monoclonal antibody specifically binding to YKL-40, a nucleic acid molecule encoding the same, a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the monoclonal antibody, and for diagnosis of cancer comprising the monoclonal antibody It relates to the composition.
  • Antibodies are immune proteins that bind to specific antigens. In most mammals, including humans and mice, antibodies are formed by pairing heavy and light chain polypeptides. Each chain consists of two regions called the variable region (Fv) and the constant region (Fc). The light and heavy chain variable regions contain the antigen-binding determinant of the molecule and are involved in binding to the target antigen.
  • the constant region defines a group of antibodies (or the same reference sample type) (e.g., IgG) and is involved in the binding of a number of Fc receptors and Fc ligands, conferring a series of important functional properties called effector action. do. Antibodies are used as potent therapeutics because of the properties of several important antibodies, such as, for example, specificity for the target, the ability to mediate immune mechanisms, and long serum half-life.
  • Phage display technology was first developed in 1990 by the Medical Research Council in the UK.A human antibody library was prepared and expressed on the surface of bacteriophage in the form of antibody fragments (Fab, ScFv) to select antibody clones for specific antigens. It is a skill to do. The possibility of screening almost all types of human recombinant monoclonal antibodies that specifically react with antigens from a single pot antibody library system has been proposed, and this is a variety of antibodies that can be applied to in vivo diagnosis or treatment when phage display antibody technology is used. Fragments (Fab or ScFv form) can be obtained.
  • An object of the present invention is to provide a monoclonal antibody that specifically binds to YKL-40.
  • Another object of the present invention is to provide a nucleic acid molecule encoding the monoclonal antibody.
  • Another object of the present invention is to provide a recombinant expression vector containing the nucleic acid molecule.
  • Another object of the present invention is to provide a transformant transformed with the recombinant expression vector.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the monoclonal antibody as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for diagnosis of cancer comprising the monoclonal antibody as an active ingredient.
  • the present invention provides a monoclonal antibody that specifically binds to YKL-40.
  • the monoclonal antibody comprises (a) CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5; CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6; And a heavy chain variable region comprising CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7; And (b) a CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11; CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12; And a light chain variable region comprising a CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, or (a) a CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8; CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9; And a heavy chain variable region comprising a CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10; And (b) CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, and CDR2 consisting of the amino acid sequence of the amino acid sequence of SEQ
  • the monoclonal antibody comprises (a) a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; And (b) a light chain variable region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, or (a) a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; And (b) a light chain variable region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the monoclonal antibody may be a humanized antibody.
  • the present invention provides a nucleic acid molecule encoding the monoclonal antibody.
  • the nucleic acid molecule is (a) CDR1 consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21; CDR2 consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 22; And a heavy chain variable region comprising a CDR3 consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 23; And (b) CDR1 consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 27; CDR2 consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 28; And a light chain variable region comprising a CDR3 consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 29, or (a) a CDR1 consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 24; CDR2 consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 25; And a heavy chain variable region comprising a CDR3 consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 26; And (b) CDR1 consisting of the nu
  • the nucleic acid molecule comprises: (a) a heavy chain variable region consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17; And (b) a light chain variable region consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 19, or (a) a heavy chain variable region consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 18; And (b) a light chain variable region consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 20.
  • the present invention provides a recombinant expression vector containing the nucleic acid molecule.
  • the present invention provides a transformant transformed with the recombinant expression vector.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the monoclonal antibody as an active ingredient.
  • the cancer is breast cancer, colon cancer, lung cancer, stomach cancer, liver cancer, blood cancer, bone cancer, pancreatic cancer, skin cancer, brain cancer, uterine cancer, nasopharyngeal cancer, laryngeal cancer, head and neck cancer, colon cancer, ovarian cancer, rectal cancer , Colon cancer, vaginal cancer, small intestine cancer, endocrine cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, ureteral cancer, urethral cancer, prostate cancer, bronchial cancer, bladder cancer, kidney cancer, and bone marrow cancer.
  • the present invention provides a composition for diagnosis of cancer comprising the monoclonal antibody as an active ingredient.
  • the cancer is breast cancer, colon cancer, lung cancer, stomach cancer, liver cancer, blood cancer, bone cancer, pancreatic cancer, skin cancer, brain cancer, uterine cancer, nasopharyngeal cancer, laryngeal cancer, head and neck cancer, colon cancer, ovarian cancer, rectal cancer , Colon cancer, vaginal cancer, small intestine cancer, endocrine cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, ureteral cancer, urethral cancer, prostate cancer, bronchial cancer, bladder cancer, kidney cancer, and bone marrow cancer.
  • YKL-40 of the present invention is related to the proliferation and metastasis of cancer, and the monoclonal antibody specifically binding to YKL-40 has the effect of inhibiting the proliferation and metastasis of cancer. It can be usefully used in the diagnosis, prevention or treatment of.
  • Figure 1a is a schematic diagram showing the process of selecting an antibody showing significant binding ability with human YKL-40 through phage display
  • 1b to 1d are panning titration results for Fab-I, Fab-II and scFv, respectively Is shown.
  • 2A and 2B show antibodies against 7 human YKL-40 selected from phage display.
  • Figure 3a is a schematic diagram showing the process of selecting an antibody showing significant binding ability to mouse YKL-40 through phage display
  • 3b to 3d are panning titration results for Fab-I, Fab-II and scFv, respectively Is shown.
  • Figure 4 shows antibodies against 6 mouse YKL-40 selected from phage display.
  • 5A to 5C show SDS-PAGE results and measurement results of IgG production in order to confirm IgG production from six clones (H1, H2, H4, H5, H6 and H7) having a human YKL-40 antibody. .
  • 6A and 6B show the results of size exclusion chromatography (SEC) for six human YKL-40 antibodies.
  • 8A and 8B show SDS-PAGE results and measurement results of IgG production in order to confirm IgG production from four clones (M2, M3, M4 and M5) having a mouse YKL-40 antibody.
  • 9A and 9B show the results of size exclusion chromatography (SEC) for four mouse YKL-40 antibodies.
  • FIG. 10 shows the results of measuring EC50 values for four mouse YKL-40 antibodies through ELISA.
  • 11A and 11B show whether the human YKL-40 antibody 3A10-F1 (H1) and the mouse YKL-40 antibody 4E3-F2 (M3) clone cross-link to the human YKL-40 antigen and the mouse YKL-40 antigen. It shows the results confirmed through ELISA.
  • Figures 12a to 12c are human YKL-40 antibody 3A10-F1 (H1) and mouse YKL-40 antibody 4E3-F2 (M3) to measure the antigen affinity of the human YKL-40 antigen and mouse YKL-40 antigen It shows one result.
  • 13A to 13D show the results of measuring the migrated cell number after treating the human YKL-40 antibodies H1, H2, H4, H5, H6 and H7 as candidate antibodies to the A549 cell line and the H460 cell line. Is shown.
  • 14A to 14D show the results of measuring the number of migrated cells after treatment with the mouse YKL-40 antibodies M2, M3, M4 and M5 as candidate antibodies on the A549 cell line and the H460 cell line.
  • antibody includes immunoglobulin molecules immunologically reactive with a specific antigen, and includes both polyclonal antibodies and monoclonal antibodies.
  • the term includes forms produced by genetic engineering such as chimeric antibodies (eg, humanized murine antibodies) and heterologous antibodies (eg, bispecific antibodies).
  • monoclonal antibody refers to a highly specific antibody directed against a single antigenic site as a term known in the art. Typically, unlike polyclonal antibodies, which contain different antibodies directed against different epitopes (antigen determinants), monoclonal antibodies are directed against a single determinant on the antigen. Monoclonal antibodies have the advantage of improving the selectivity and specificity of diagnostic and analytical assays using antigen-antibody binding, and also have another advantage of not being contaminated by other immunoglobulins because they are synthesized by hybridoma culture. .
  • immunoglobulins have a heavy and light chain, each of which comprises a constant region and a variable region (the region is also known as a “domain”).
  • the light chain variable region and the heavy chain variable region include three variable regions called “complementarity determining region” (hereinafter referred to as "CDR") and four "framework regions”.
  • CDRs mainly play a role in binding to the epitope of the antigen.
  • the CDRs of each chain typically start from the N-terminus and are sequentially referred to as CDR1, CDR2, and CDR3, and are also identified by the chain in which the specific CDR is located.
  • heavy chain refers to a full-length heavy chain comprising a variable region domain V H and three constant region domains C H1 , C H2 and C H3 comprising an amino acid sequence having a sufficient variable region sequence to confer antigen specificity. And fragments thereof.
  • light chain refers to both a full-length light chain including a variable region domain V L and a constant region domain C L comprising an amino acid sequence having a sufficient variable region sequence to confer antigen specificity and a fragment thereof.
  • variable is used to refer to that the sequence of a specific region is significantly different between antibodies and is used to indicate the binding specificity of each specific antibody for a specific antigen.
  • the variability of an antibody is not uniformly distributed throughout the variable domain of the antibody, but rather is concentrated in the CDRs.
  • the heavy and light chains of a monoclonal antibody each have three CDRs, and these regions form an antigen-antibody complex by recognizing the surface antigen of acne bacteria.
  • Each of these CDRs has a characteristic sequence for each monoclonal antibody, and some or all of these six CDRs may interact in order for one monoclonal antibody to recognize a specific epitope.
  • phage display technology refers to a technique for selecting antibodies that exhibit antigen-binding ability by selecting only phages that exhibit significant binding ability with a target antigen from a phage library.
  • panning refers to a peptide having the property of binding to a target molecule (antibody, enzyme, cell surface receptor, etc.) from a phage library that displays the peptide on the coat of the phage. It refers to the process of selecting only the phages that are present. By repeating this process 3 to 10 times, an antibody that exhibits significant binding ability to a target antigen can be selected, and the selected antibody can be prepared as a humanized monoclonal antibody.
  • the monoclonal antibody of the present invention may include a variant of the amino acid sequence described in the appended sequence listing within a range capable of specifically binding to YKL-40.
  • the amino acid sequence of the monoclonal antibody can be changed to improve the binding affinity and/or other biological properties of the monoclonal antibody.
  • Such modifications include, for example, deletions, insertions and/or substitutions of amino acid sequence residues of monoclonal antibodies.
  • These amino acid variations are made based on the relative similarity of amino acid side chain substituents, such as hydrophobicity, hydrophilicity, charge, size, and the like.
  • arginine, lysine and histidine are all positively charged residues; Alanine, glycine and serine have similar sizes; It can be seen that phenylalanine, tryptophan and tyrosine have similar shapes. Thus, based on these considerations, arginine, lysine and histidine; Alanine, glycine and serine; And phenylalanine, tryptophan and tyrosine are biologically functional equivalents. In introducing mutations, the hydropathy index of amino acids can be considered.
  • Each amino acid is assigned a hydrophobicity index according to its hydrophobicity and charge: isoleucine (+4.5); Valine (+4.2); Leucine (+3.8); Phenylalanine (+2.8); Cysteine/cysteine (+2.5); Methionine (+1.9); Alanine (+1.8); Glycine (-0.4); Threonine (-0.7); Serine (-0.8); Tryptophan (-0.9); Tyrosine (-1.3); Proline (-1.6); Histidine (-3.2); Glutamate (-3.5); Glutamine (-3.5); Aspartate (-3.5); Asparagine (-3.5); Lysine (-3.9); And arginine (-4.5).
  • the hydrophobic amino acid index is very important in imparting an interactive biological function of a protein.
  • the most commonly occurring exchanges are amino acid residues Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/ It is an exchange between Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly.
  • the monoclonal antibody of the present invention or a nucleic acid molecule encoding the same is interpreted to include a sequence showing substantial identity to the sequence listed in the Sequence Listing.
  • the actual identity of the above is at least 61% when the sequence of the present invention and any other sequence described above are aligned to correspond as much as possible, and the aligned sequence is analyzed using an algorithm commonly used in the art. It means a sequence that exhibits homology, more preferably 70% homology, even more preferably 80% homology, and most preferably 90% homology.
  • nucleic acid molecule has a meaning that comprehensively includes DNA (gDNA and cDNA) and RNA molecules, and the nucleotide, which is the basic structural unit in the nucleic acid molecule, is not only a natural nucleotide, but also a sugar or base moiety. Also includes modified analogues (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York (1980); Uhlman and Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584 (1990)). The base sequence of the nucleic acid molecule encoding the heavy chain variable region and the light chain variable region of the monoclonal antibody of the present invention may be modified. Such modifications include additions, deletions or non-conservative substitutions or conservative substitutions of nucleotides.
  • the vector produced in the present invention is constructed to be able to express a desired gene in a host cell.
  • promoters and terminators operably linked to upstream and downstream of the vector are located, respectively.
  • promoter refers to a DNA sequence that controls the expression of a coding sequence or functional RNA.
  • the target nucleotide sequence is operably linked to the promoter.
  • operatively linked refers to a functional linkage between a nucleic acid expression control sequence (eg, a promoter sequence, a signal sequence, or an array of transcriptional regulatory factor binding sites) and another nucleic acid sequence. Means, whereby the control sequence controls the transcription and/or translation of the other nucleic acid sequence.
  • a nucleic acid expression control sequence eg, a promoter sequence, a signal sequence, or an array of transcriptional regulatory factor binding sites
  • the vector system of the present invention can be constructed through various methods known in the art, and specific methods for this are disclosed in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001).
  • the vectors of the present invention can typically be constructed as vectors for expression.
  • the method of transporting the vector of the present invention into a transformant host cell is a heat shock method, a CaCl 2 method (Cohen, SN et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114 (1973)). , Hanahan method (Cohen, SN et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114 (1973); And Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580 ( 1983)) and an electroporation method (Dower, WJ et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145 (1988)).
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutically acceptable means exhibiting properties that are not toxic to cells or humans exposed to the composition.
  • the carrier may be used without limitation as long as it is known in the art such as a buffering agent, a preservative, a painless agent, a solubilizing agent, an isotonic agent, a stabilizer, a base agent, an excipient, and a lubricant.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is formulated in the form of oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc., external preparations, suppositories, and sterile injectable solutions according to a conventional method.
  • oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc.
  • external preparations suppositories
  • sterile injectable solutions according to a conventional method.
  • it may be used in the form of an ointment, lotion, spray, patch, cream, powder, suspension, gel or gel for external skin.
  • Carriers, excipients and diluents that may be included in the composition of the present invention include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, Cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oils.
  • diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants that are usually used.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and such solid preparations include at least one excipient, such as starch, calcium carbonate, in the Cycotria rubra extract, It is prepared by mixing sucrose or lactose, gelatin, and the like. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc are also used.
  • Liquid preparations for oral use include suspensions, liquid solutions, emulsions, syrups, etc.In addition to water and liquid paraffin, which are commonly used simple diluents, various excipients such as wetting agents, sweetening agents, fragrances, and preservatives may be included. have.
  • Formulations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, lyophilized formulations, and suppositories.
  • non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, and injectable ester such as ethyl oleate may be used.
  • injectable ester such as ethyl oleate
  • a base for suppositories witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin paper, glycerogelatin, and the like may be used.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • administration means introducing a predetermined substance to an individual by an appropriate method, and the route of administration of the composition may be administered through any general route as long as it can reach the target tissue.
  • Intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, oral administration, topical administration, intranasal administration, intrapulmonary administration, and rectal administration may be administered, but are not limited thereto.
  • the term "individual” refers to all animals including humans, such as rats, mice, and domestic animals. Preferably, it may be a mammal including a human.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment and not cause side effects, and the effective dose level is the sex, age, and Weight, health condition, type of disease, severity, activity of the drug, sensitivity to the drug, method of administration, time of administration, route of administration, and rate of excretion, duration of treatment, factors including drugs used in combination or concurrently, and other fields of medicine. It can be readily determined by a person skilled in the art according to well-known factors. Administration may be administered once a day at the recommended dosage, or may be divided several times.
  • YKL-40 (Chitinase-3-like protein 1) is a secreted glycoprotein of about 40 kDa encoded by the CHI3L1 gene, and is known to be expressed and secreted in various cells such as macrophages.
  • YKL-40 plays an important role in the proliferation, survival, and metastasis of cancer cells.
  • Antibodies against YKL-40 were selected for antibodies exhibiting significant binding ability with human YKL-40 (hYKL-40) through phage display technology (FIGS. 1A to 1D ). The binding ability with hYKL-40 was confirmed through ELISA for hYKL-40 phage. Briefly, hYKL-40 antigen was fixed at 30 ng per well, and the antigen-fixed well was blocked with MPBS (5% skim milk in PBS), and then reacted by adding hYKL-40 phage and mYKL-40 phage. .
  • clones having 7 antibodies against hYKL-40 were selected from the Fab-I library and the Fab-II library, and no clones were formed in the scFv library (FIGS. 2A and 2B ).
  • Two clones in the Fab-I library were described as 3A10-F1 (H1) and 3B12-F1 (H2), and the five clones in the KFab-II library were 3A11-F2 (H3), 3B7-F2 (H4), respectively. It was described as 3D12-F2 (H5), 3E12-F2 (H6) and 3G7-F2 (H7).
  • mYKL-40 antibodies showing significant binding ability with mouse YKL-40 (mYKL-40) were selected (FIGS. 3A to 3D ), and the binding ability with mYKL-40 was confirmed through ELISA for mYKL-40 phage, simply mYKL- 40 antigens were fixed at 30 ng per well, and the wells to which the antigens were fixed were subjected to blocking treatment with MPBS (5% skim milk in PBS), followed by addition of hYKL-40 phage and mYKL-40 phage to react. In order to detect bound phage, after washing 4 times with PBST (0.05% Tween20 in PBS), Anti-M13-HRP (1:5,000) was added and reacted.
  • MPBS 5% skim milk in PBS
  • TMB (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine) substrate was added to induce a color development reaction, and 2N H2SO4 was added to terminate the reaction, and the absorbance of each well was measured at a wavelength of 450 nm. I did. As a result, 6 antibodies were selected from the Fab-II library, and no clones were formed in the Fab-I or scFv library (Fig. 4).
  • the six clones in the Fab-II library were 4A12-F2 (M1), 4E12-F2 (M2), 4E3-F2 (M3), 4D10-F2 (M4), 4A7-F2 (M5) and 4A1-F2 (M6), respectively. ).
  • the present inventors performed an experiment to convert the selected YKL-40 phage into an IgG form of a human antibody and verify it. Briefly, the selected YKL-40 phage were transfected into the Expi293 cell line and then cultured, and IgG was purified from 300 ml of the cell culture solution of the cultured Expi293 cell line. Purified IgG was confirmed for molecular weight and pure separation through SDS-PAGE.
  • IgG was produced from 6 clones with hYKL-40 antibody, and 0.237 mg of IgG was finally produced in 3A10-F1 (H1), and 1.84 mg of IgG was finally produced in 3B12-F1 (H2).
  • 3B7-F2 (H4) 6.5 mg of IgG was finally produced, 0.3 mg of IgG was produced in 3D12-F2 (H5), and 0.8 mg of IgG was finally produced in 3E12-F2 (H6).
  • 3G7-F2 (H7) 5.3 mg of IgG was finally produced (FIGS. 5A to 5C ).
  • the present inventors confirmed the presence of a single antibody through size-exclusion chromatography (SEC), and performed an experiment to measure antigen affinity through an EC50 value for each antibody through ELISA.
  • SEC size-exclusion chromatography
  • 3A10-F1 (H1), 3B12-F1 (H2), 3B7-F2 (H4), 3D12-F2 (H5), 3E12-F2 (H6) and 3G7-F2 (H7) are all single peaks in SEC. (peak) was found to be all monoantibodies (FIGS. 6A and 6B).
  • the EC50 value in 3A10-F1 (H1) was 582 pM (0.582 nM), which was confirmed as the lowest EC50 value (FIG. 7).
  • the present inventors performed the same experiment on the selected mouse YKL-40 phage. As a result, 1.6 mg of IgG was finally produced in 4E12-F2 (M2), 3.6 mg of IgG was finally produced in 4E3-F2 (M3), and 6.3 mg of IgG was finally produced in 4D10-F2 (M4). Was produced, and finally 0.7 mg of IgG was produced in 4A7-F2 (M5) (FIGS. 8A and 8B ).
  • the present inventors to determine whether the clones 3A10-F1 (H1) and 4E3-F2 (M3), which showed the lowest EC50 values for hYKL-40 and mYKL-40, respectively, cross-link to hYKL-40 and mYKL-40.
  • ELISA was performed using the Fab protein of each antibody.
  • 3A10-F1 (H1) was found to bind only to hYKL-40
  • 4E3-F2 (M3) was found to cross-link to hYKL-40 and mYKL-40 (FIGS. 11A and 11B ).
  • the present inventors conducted an experiment to confirm whether there is an effect of inhibiting cancer metastasis when the candidate antibodies against YKL-40 are treated with a lung cancer cell line. Briefly, migration of the human lung cancer cell line A549 cell line and H460 cell line was quantitatively performed in a permeable insert (8 ⁇ m pore trans-well; Corning Inc.).
  • HYKL-40 antibodies as candidate antibodies 3A10-F1 (H1), 3B12-F1 (H2), 3B7-F2 (H4), 3D12-F2 (H5), 3E12-F2 (H6) and 3G7-F2 (H7); And mYKL-40 antibodies 4E12-F2 (M2), 4E3-F2 (M3), 4D10-F2 (M4) and 4A7-F2 (M5) at a concentration of 1 ⁇ g/ml in the lung cancer cell lines A549 and H460 cells After treatment with, the A549 and H460 cells treated with the candidate antibodies were put so as to be 2.0 x 10 4 cells per well, respectively, and incubated for 17 hours in a humidified incubator at 37°C and 5% CO 2 conditions.
  • the cells were fixed with 3.7% formaldehyde for 2 minutes, and then washed twice with 1x PBS. Thereafter, the cells were permeated with 100% methanol for 15 minutes and stained with trypan blue for 20 minutes. Unmigrated cells inside the wells were removed with a cotton swab, and images captured with an optical microscope (Olympus) at x 200 magnification were analyzed using NIH ImageJ software.
  • the present inventors performed an experiment to confirm whether there is an effect of inhibiting cancer metastasis when the five candidate antibodies selected in the cell line experiment were treated in an animal model of lung metastasis. Briefly, B16F10 mouse melanoma cells (3.75x104 cells) per mouse were put in a tail vein injection method for lung metastasis, and then once a week for a total of 3 weeks, hYKL-40 antibody 3A10-F1 ( H1), 3B12-F1 (H2) and 3B7-F2 (H4); And mYKL-40 antibodies 4E12-F2 (M2) and 4E3-F2 (M3) were administered at 0.5 mg/kg. Three weeks after the administration of melanoma cells, the lungs were excised and the tumor area on the lung surface was measured.
  • 3A10-F1 (H1) and 4E3-F2 (M3) increased the number of experimental animals to confirm whether there is an effect of inhibiting cancer metastasis.
  • the experiment was carried out.
  • both 3A10-F1 (H1) and 4E3-F2 (M3) reduced the number of tumor nodules on the surface of the lung tissue compared to the control group, thereby inhibiting the metastasis of lung cancer.
  • 3A10-F1 It was confirmed that the (H1) antibody has the most remarkable effect of suppressing the number of tumor nodules (FIGS. 16A to 16C ).
  • the present inventors analyzed the sequences of the 3A10-F1 (H1) antibody and 4E3-F2 (M3) antibody that are effective in inhibiting cancer.
  • the amino acid sequence of the heavy chain variable region for the 3A10-F1 (H1) antibody and the 4E3-F2 (M3) antibody is shown in Table 1 below, and the amino acid sequence of the light chain variable region is shown in Table 2.
  • the amino acid sequences of CDR1 to CDR3 in the heavy chain variable region are shown in Table 3 below, and the amino acid sequences of CDR1 to CDR3 in the light chain variable region are shown in Table 4 below.
  • the base sequence of the heavy chain variable region for the nucleic acid molecule encoding the antibody is shown in Table 5 below, and the base sequence of the light chain variable region is shown in Table 6 below.
  • the nucleotide sequences encoding CDR1 to CDR3 in the heavy chain variable region are shown in Table 7 below, and the nucleotide sequences encoding CDR1 to CDR3 in the light chain variable region are shown in Table 8.
  • Antibody Amino acid sequence of heavy chain variable region of antibody (CDR: underlined) 3A10-F1 (H1) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS NYAMS WVRQAPGKGLEWVS GISGSGGTTYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAG VGTFDV WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 1) 4E3-F2 (M3) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFS SYDIH WVRQAPGQGLEWMG IISPYLGITIYAQKFQG RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR RYFYYQSEAFDY WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 2)
  • Antibody Amino acid sequence of antibody light chain variable region (CDR: underlined) 3A10-F1 (H1) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQTISSWLN WYQQKPGKAPKLLIY AASRLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQSYSTPLT FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 3) 4E3-F2 (M3) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSISNYLN WYQQKPGKAPKLLIY AASTLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQSYSFPLT FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 4)
  • Antibody CDRH1 CDRH2 CDRH3 3A10-F1 NYAMS (SEQ ID NO: 5) GISGSGGTTYYADSVKG (SEQ ID NO: 6) VGTFDV (SEQ ID NO: 7) 4E3-F2 (M3) SYDIH (SEQ ID NO: 8) IISPYLGITIYAQKFQG (SEQ ID NO: 9) RYFYYQSEAFDY (SEQ ID NO: 10)
  • Antibody CDRL1 CDRL2 CDRL3 3A10-F1 H1 RASQTISSWLN (SEQ ID NO: 11) AASRLQS (SEQ ID NO: 12) QQSYSTPLT (SEQ ID NO: 13) 4E3-F2 (M3) RASQSISNYLN (SEQ ID NO: 14) AASTLQS (SEQ ID NO: 15) QQSYSFPLT (SEQ ID NO: 16)
  • Antibody Base sequence of heavy chain variable region of antibody (CDR: underlined) 3A10-F1 (H1) GAAGTACAGTTGGTCGAAAGTGGCGGTGGCCTCGTGCAACCGGGTGGTTCACTGCGTCTGAGCTGCGCCGCCTCGGGTTTTACTTTCTCT AATTATGCAATGTCT TGGGTTCGTCAGGCGCCGGGCAAGGGTCTCGAATGGGTTTCA GGTATCTCTGGTTCTGGTGGTACTACTTACTATGCCGATTCAGTGAAGGGT CGCTTTACCATTTCCCGTGACAACTCTAAGAATACTCTGTATCTGCAGATGAACTCGCTGCGTGCCGAAGACACGGCCGTCTATTATTGCCGGT GTTGGTACTTTCGATGTT TGGGGTCAGGGCACTTTAGTGACCGTCTCATCG (SEQ ID NO: 17) 4E3-F2 (M3) CAAGTTCAGCTGGTCCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGCAGTTCTGTTAAGGTTTCCTGCAAAGCCTCAGGCG
  • Antibody Base sequence of the light chain variable region of the antibody (CDR: underlined) 3A10-F1 (H1) GACATTCAAATGACGCAGAGTCCCTCCTCACTGAGTGCTAGCGTGGGCGATCGTGTGACAATTACTTGT CGCGCTAGCCAGACTATCTCTTCTTGGCTGAAC TGGTATCAGCAGAAACCGGGCAAGGCGCCAAAATTGCTGATTTAC GCAGCATCCCGTCTGCAGTCT GGTACCGTCCCGTTTCTCTGGCAGCGGTTCTGGTACGGATTTTACCCTGACCATCTCAAGCCTCCAGCCTGAAGATTTTGCCACCTATTATTGT CAGCAATCTTACTCTACTCCGCTGACG TTCGGGCAGGGAACTAAAGTGGAAATTAAA (SEQ ID NO: 19) 4E3-F2 (M3) GACATTCAAATGACGCAGAGTCCCTCCTCACTGAGTGCTAGCGTGGGCGATCGTGTGACAATTACTTGT CGCGCTAGCCAGTCTATCTAATTACCTGA
  • Antibody CDRH1 CDRH2 CDRH3 3A10-F1 H1
  • AATTATGCAATGTCT SEQ ID NO: 21
  • GGTATCTCTGGTTCTGGTGGTACTACTTACTATGCCGATTCAGTGAAGGGT SEQ ID NO: 22
  • GTTGGTACTTTCGATGTT SEQ ID NO: 23
  • 4E3-F2 M3
  • TCTTACGATATCCAT SEQ ID NO: 24
  • ATCATTTCTCCATACCTGGGTATCACCATCTATGCACAAAAATTCCAAGGC SEQ ID NO: 25
  • CGTTACTTCTACTACCAGTCTGAAGCATTCGATTAC SEQ ID NO: 26
  • Antibody CDRL1 CDRL2 CDRL3 3A10-F1 H1 CGCGCTAGCCAGACTATCTCTTCTTGGCTGAAC (SEQ ID NO: 27) GCAGCATCCCGTCTGCAGTCT (SEQ ID NO: 28) CAGCAATCTTACTCTACTCCGCTGACG (SEQ ID NO: 29) 4E3-F2 (M3) CGCGCTAGCCAGTCTATCTCTAATTACCTGAAC (SEQ ID NO: 30) GCAGCATCCACTCTGCAGTCT (SEQ ID NO: 31) CAGCAATCTTACTCTTTTCCGCTGACG (SEQ ID NO: 32)

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Abstract

본 발명은 YKL-40에 특이적으로 결합하는 단일클론항체에 관한 것으로서, 상기 YKL-40의 발현이 높은 경우 암의 증식 및 전이와 관련이 있고, YKL-40에 대한 단일클론항체는 암의 증식 및 전이를 억제하는 효과가 있어, 본 발명의 단일클론항체는 암의 진단, 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

YKL-40 표적 인간 단일클론항체
본 발명은 YKL-40 에 특이적으로 결합하는 단일클론항체, 이를 코딩하는 핵산분자, 상기 단일클론항체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 및 상기 단일클론항체를 포함하는 암의 진단용 조성물에 관한 것이다.
항체는 특정 항원과 결합하는 면역 단백질이다. 인간과 마우스를 비롯한 대부분의 포유동물에 있어서, 항체는 중쇄 폴리펩티드와 경쇄 폴리펩티드가 쌍을 이루어 형성된다. 각각의 사슬은 가변 영역 (Fv) 및 불변 영역 (Fc)이라 불리는 2개의 영역으로 이루어져 있다. 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 분자의 항원 결합 결정기를 포함하며, 표적 항원과의 결합에 관여한다. 불변 영역은 항체의 군(또는 동 기준 표본형)을 한정하며 (예를 들어, IgG), 효과기 작용이라 불리는 일련의 중요한 기능상의 특성들을 부여하는, 다수의 Fc 수용체 및 Fc 리간드와의 결합에 관여한다. 예를 들어, 표적에 대한 특이성, 면역 작용기 기작을 매개하는 능력 및 긴 혈청 반감기와 같은 몇몇 중요한 항체의 특성으로 말미암아 항체는 강력한 치료제로서 사용되고 있다.
파지 디스플레이 기술은 영국의 Medical Research Council에서 1990년 처음 개발된 것으로, 인간 항체 라이브러리(library)를 제조하여 항체절편(Fab, ScFv)의 형태로 박테리오파지의 표면에 발현시켜 특정 항원에 대한 항체 클론들을 선별하는 기술이다. 항원과 특이적으로 반응하는 거의 모든 종류의 인간 재조합 단일클론항체를 단일 pot 항체 라이브러리 시스템으로부터 선별해낼 수 있는 가능성이 제안되었으며, 이는 파지 디스플레이 항체 기술을 활용할 경우 체내 진단이나 치료에 응용할 수 있는 다양한 항체 단편들(Fab 또는 ScFv 형태)을 획득할 수 있다.
관련 선행기술문헌으로는 미국등록특허 제7,670,599호가 있다.
본 발명의 목적은 YKL-40 에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단일클론항체를 코딩하는 핵산분자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산분자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단일클론항체를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단일클론항체를 유효성분으로 포함하는 암의 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 YKL-40 에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 단일클론항체는 (a) 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1; 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 CDR2; 및 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 (b) 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1; 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 CDR2; 및 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 것이거나, (a) 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1; 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 CDR2; 및 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 (b) 서열번호 14의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1, 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어진 CDR2; 및 서열번호 16의 아미노산 서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 단일클론항체는 (a) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역; 및 (b) 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역을 포함하는 것이거나, (a) 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역; 및 (b) 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 단일클론항체는 인간화 항체인 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 단일클론항체를 코딩하는 핵산분자를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 핵산분자는 (a) 서열번호 21의 염기서열로 이루어진 CDR1; 서열번호 22의 염기서열로 이루어진 CDR2; 및 서열번호 23의 염기서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 (b) 서열번호 27의 염기서열로 이루어진 CDR1; 서열번호 28의 염기서열로 이루어진 CDR2; 및 서열번호 29의 염기서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 것이거나, (a) 서열번호 24의 염기서열로 이루어진 CDR1; 서열번호 25의 염기서열로 이루어진 CDR2; 및 서열번호 26의 염기서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 (b) 서열번호 30의 염기서열로 이루어진 CDR1; 서열번호 31의 염기서열로 이루어진 CDR2; 및 서열번호 32의 염기서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 핵산분자는 (a) 서열번호 17의 염기서열로 이루어진 중쇄 가변영역; 및 (b) 서열번호 19의 염기서열로 이루어진 경쇄 가변영역을 포함하는 것이거나, (a) 서열번호 18의 염기서열로 이루어진 중쇄 가변영역; 및 (b) 서열번호 20의 염기서열로 이루어진 경쇄 가변영역을 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 핵산분자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단일클론항체를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 암은 유방암, 대장암, 폐암, 위암, 간암, 혈액암, 골암, 췌장암, 피부암, 뇌암, 자궁암, 비인두암, 후두암, 두경부암, 결장암, 난소암, 직장암, 대장암, 질암, 소장암, 내분비암, 갑상선암, 부갑상선암, 요관암, 요도암, 전립선암, 기관지암, 방광암, 신장암 및 골수암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 단일클론항체를 유효성분으로 포함하는 암의 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 암은 유방암, 대장암, 폐암, 위암, 간암, 혈액암, 골암, 췌장암, 피부암, 뇌암, 자궁암, 비인두암, 후두암, 두경부암, 결장암, 난소암, 직장암, 대장암, 질암, 소장암, 내분비암, 갑상선암, 부갑상선암, 요관암, 요도암, 전립선암, 기관지암, 방광암, 신장암 및 골수암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
본 발명의 YKL-40은 암의 증식 및 전이와 관련이 있고, YKL-40에 특이적으로 결합하는 단일클론항체는 암의 증식 및 전이를 억제하는 효과가 있어, 본 발명의 단일클론항체는 암의 진단, 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1a는 파지 디스플레이를 통해 인간 YKL-40과 유의적인 결합능을 나타내는 항체를 선별하는 과정을 나타내는 모식도이고, 1b 내지 1d는 각각 Fab-I, Fab-II 및 scFv 에 대한 패닝 적정 (panning titration) 결과를 나타낸 것이다.
도 2a 및 도 2b는 파지 디스플레이로부터 선별된 7 개의 인간 YKL-40에 대한 항체를 나타낸 것이다.
도 3a는 파지 디스플레이를 통해 마우스 YKL-40과 유의적인 결합능을 나타내는 항체를 선별하는 과정을 나타내는 모식도이고, 3b 내지 3d는 각각 Fab-I, Fab-II 및 scFv 에 대한 패닝 적정 (panning titration) 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 파지 디스플레이로부터 선별된 6 개의 마우스 YKL-40에 대한 항체를 나타낸 것이다.
도 5a 내지 도 5c는 인간 YKL-40 항체를 가지는 6 개의 클론 (H1, H2, H4, H5, H6 및 H7)으로부터 IgG 생산을 확인하기 위하여 SDS-PAGE 결과 및 IgG 생산량을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6a 및 도 6b는 6 개의 인간 YKL-40 항체에 대한 SEC (size exclusion chromatography) 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 6 개의 인간 YKL-40 항체에 대하여 ELISA를 통해 EC50 값을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 8a 및 도 8b는 마우스 YKL-40 항체를 가지는 4 개의 클론 (M2, M3, M4 및 M5)으로부터 IgG 생산을 확인하기 위하여 SDS-PAGE 결과 및 IgG 생산량을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 9a 및 도 9b는 4 개의 마우스 YKL-40 항체에 대한 SEC (size exclusion chromatography) 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 4 개의 마우스 YKL-40 항체에 대하여 ELISA를 통해 EC50 값을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 11a 및 도 11b는 인간 YKL-40 항체인 3A10-F1 (H1) 및 마우스 YKL-40 항체인 4E3-F2 (M3) 클론이 인간 YKL-40 항원 및 마우스 YKL-40 항원에 교차 결합하는지 여부를 ELISA를 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 12a 내지 도 12c는 인간 YKL-40 항체인 3A10-F1 (H1) 및 마우스 YKL-40 항체인 4E3-F2 (M3)의 인간 YKL-40 항원 및 마우스 YKL-40 항원에 대한 항원 친화도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 13a 내지 도 13d는 후보 항체로서 인간 YKL-40 항체인 H1, H2, H4, H5, H6 및 H7 를 A549 세포주 및 H460 세포주에 처리한 후 이동된 세포수(migrated cell number)를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 14a 내지 도 14d는 후보 항체로서 마우스 YKL-40 항체인 M2, M3, M4 및 M5 를 A549 세포주 및 H460 세포주에 처리한 후 이동된 세포수(migrated cell number)를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 15a 및 도 15b는 후보 항체로서 인간 YKL-40 항체인 H1, H2 및 H4; 및 마우스 YKL-40 항체인 M2 및 M3 를 폐 전이 동물모델에 처리한 후 폐 표면의 종양 넓이 (tumor area)를 측정한 결과를 나타낸 것이다 (n=3).
도 16a 내지 도 16c는 인간 YKL-40 항체인 H1 및 마우스 YKL-40 항체인 M3 를 폐 전이 동물모델에 처리한 후 폐 조직에서 종양 결절 (tumor nodule)의 수를 측정한 결과를 나타낸 것이다 (n=8).
본 발명에서의 용어, "항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하며, 다클론항체 및 단일클론항체를 모두 포함하는 개념이다. 또한, 상기 용어는 키메라 항체(예를 들면, 인간화 뮤린 항체) 및 이종결합항체(예를 들면, 양특이성 항체)와 같은 유전공학에 의해 생산된 형태를 포함한다.
본 발명에서의 용어, "단일클론항체"란 당해 분야에 공지된 용어로서 단일 항원성 부위에 대해서 지시되는 고도의 특이적인 항체를 의미한다. 통상적으로, 상이한 에피토프(항원결정기)들에 대해 지시되는 상이한 항체들을 포함하는 다클론 항체와는 다르게, 단일클론항체는 항원상의 단일 결정기에 대해서 지시된다. 단일클론항체는 항원-항체 결합을 이용하는 진단 및 분석학적 분석법의 선택성과 특이성을 개선시키는 장점이 있으며, 또한, 하이브리도마 배양에 의해 합성되기 때문에 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는 또 다른 장점을 갖는다.
전형적으로, 면역글로불린은 중쇄 및 경쇄를 가지며, 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변 영역 및 가변 영역 (상기 부위는 "도메인"으로 또한 알려져 있음)을 포함한다. 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역은, "상보성 결정 영역"(complementarity determining region, 이하, "CDR"이라 함)이라고 불리는 3 개의 가변 영역 및 4 개의 "구조 영역" (framework region)을 포함한다. 상기 CDR은 주로 항원의 에피토프(epitope)에 결합하는 역할을 한다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3로 불리고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다.
상기 용어, "중쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VH 및 3개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3를 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 상기 용어, "경쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.
본 발명에서의 용어, "가변"이란 항체들 간에 특정 영역의 서열이 크게 상이하고 특정 항원에 대해 각각의 특정 항체의 결합 특이성을 나타내는데 사용된다는 것을 일컫기 위해 사용된다. 항체의 가변성은 항체의 가변 도메인 전체에 걸쳐 균일하게 분포하는 것이 아니라 CDR에 집중된다. 단클론 항체의 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR을 가지며 이들 영역이 여드름균의 표면 항원를 인식함으로써 항원-항체 복합체를 형성한다. 이러한 CDR은 각각의 단일클론항체마다 특징적인 서열을 가지며, 하나의 단일클론항체가 특정 에피토프를 인식하기 위해 이들 6 개의 CDR의 일부 또는 모두가 상호작용할 수 있다.
본 발명에서의 용어, "파지 디스플레이 기술"은 파지 라이브러리로부터 표적 항원과 유의적인 결합능을 나타내는 파지만을 선별하는 것을 통해, 항원과의 결합능을 나타내는 항체를 선별하는 기술을 나타낸다. 상기 기술에서, "패닝(panning)"은 파지의 외벽(coat)에 펩타이드를 발현(display)하는 파지 라이브러리로부터 표적 분자(항체, 효소, 세포표면 리셉터 등)와 결합하는 성질을 지닌 펩타이드를 표면에 발현하고 있는 파지만을 선택해 내는 과정을 일컫는다. 이러한 과정을 3 내지 10회 반복하여, 표적 항원에 대하여 유의적인 결합능을 나타내는 항체를 선별할 수 있고, 선별된 항체를 인간화 단일클론항체로 제조할 수 있다.
본 발명의 단일클론항체는 YKL-40 에 특이적으로 결합할 수 있는 범위 내에서 첨부한 서열목록에 기재된 아미노산 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 단일클론항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선시키기 위하여 단일클론항체의 아미노산 서열에 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 단일클론항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다. 변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스(hydropathy index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신 (+4.5); 발린 (+4.2); 루이신 (+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글라이신 (-0.4); 쓰레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 타이로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5). 단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ㅁ 2 이내, 보다 바람직하게는 ㅁ 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ㅁ 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.
한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌 (+3.0); 라이신 (+3.0); 아스팔테이트(+3.0ㅁ 1); 글루타메이트 (+3.0 1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글라이신 (0); 쓰레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5 ㅁ 1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 루이신 (-1.8); 아이소루이신 (-1.8); 타이로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4). 친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ㅁ 2 이내, 보다 바람직하게는 ㅁ 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ㅁ 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 단일클론항체 또는 이를 코딩하는 핵산분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 61％의 상동성, 보다 바람직하게는 70％의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80％의 상동성, 가장 바람직하게는 90％의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다.
본 발명에서의 용어, "핵산분자"는 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)). 본 발명의 단일클론항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산분자의 염기서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.
본 발명에서 제작되는 벡터는 숙주 세포에서 원하는 유전자를 발현할 수 있도록 구축된다. 일반적으로, 상기 벡터의 업스트림(upstream) 및 다운스트림(downstream)에 각각 작동적으로 결합된 프로모터 및 터미네이터가 위치한다.
본 발명에서의 용어, "프로모터"는 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 본 발명의 재조합 벡터에서 목적 염기서열은 상기 프로모터에 작동적으로 연결된다.
본 발명에서의 용어, "작동적으로 결합된(operatively linked)"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터 서열, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 조절하게 된다.
본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있다. 본 발명의 벡터는 전형적으로 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다.
본 발명의 벡터를 형질전환체인 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, 열쇼크 방법, CaCl2 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법(Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다. 상기 담체는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제, 기제, 부형제, 윤활제 등 당업계에 공지된 것이라면 제한없이 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 나아가, 연고제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 크림제, 산제, 현탁제, 겔제 또는 젤의 형태의 피부 외용제의 형태로 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 싸이코트리아 루브라 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명의 용어 "투여"란 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 용어, "개체"란 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 동물을 의미한다. 바람직하게는, 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.
상기 용어, "약학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 성별, 연령, 체중, 건강 상태, 질병의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로, 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 투여는 상기 권장 투여량을 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 파지 디스플레이 라이브러리 패닝 (Phage display library panning)
YKL-40 (Chitinase-3-like protein 1)은 CHI3L1 유전자에 의해 코딩되는 약 40 kDa의 분비 당단백질(secreted glycoprotein)로서, 대식세포(macrophage) 등의 다양한 세포에서 발현되고 분비되는 것으로 알려져 있다. 또한, 최근 연구에 따르면, YKL-40은 암세포의 증식, 생존 및 전이에서 중요한 역할을 하는 것으로 추정되고 있다. 더욱이, 선행 연구에서 YKL-40은 49 개의 질병 중 38 개가 암과 관련되어 발현이 억제되고, 이 중 8 개가 폐암과 관련되어 있음을 확인하였다. 이에 본 발명자들은 YKL-40의 발현을 억제할 수 있는 항체를 발굴하기 위한 실험을 수행하였다.
YKL-40에 대한 항체는 파지 디스플레이(phage display) 기술을 통해 인간 YKL-40 (hYKL-40)과 유의적인 결합능을 나타내는 항체를 선별하였다 (도 1a 내지 도 1d). hYKL-40 와의 결합능은 hYKL-40 파지에 대한 ELISA를 통해 확인하였다. 간단히, hYKL-40 항원은 well 당 30 ng씩 고정되었고, 항원이 고정된 well은 MPBS (5% skim milk in PBS)로 블로킹 처리한 뒤, hYKL-40 파지 및 mYKL-40 파지를 첨가하여 반응시켰다. 결합된 파지를 검출하기 위해 PBST (0.05% Tween20 in PBS)로 4 회 세척 후에 Anti-M13-HRP (1:5,000)를 첨가하여 반응시켰다. 마지막으로 PBST로 4 회 세척 후에 TMB (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine) 기질을 첨가하여 발색 반응을 유도하였고 2N H2SO4를 첨가하여 반응을 종결시킨 뒤, 파장 450 nm에서 각 well의 흡광도를 측정하였다.
그 결과, Fab-I 라이브러리 및 Fab-II 라이브러리에서 7 개의 hYKL-40에 대한 항체를 가진 클론이 선별되었고, scFv 라이브러리에서는 클론이 형성되지 않았다 (도 2a 및 도 2b). Fab-I 라이브러리에서 2 개의 클론은 3A10-F1 (H1) 및 3B12-F1 (H2) 으로 기재하였고, KFab-II 라이브러리에서 5 개의 클론은 각각 3A11-F2 (H3), 3B7-F2 (H4), 3D12-F2 (H5), 3E12-F2 (H6) 및 3G7-F2 (H7) 로 기재하였다.
또한, 마우스 YKL-40 (mYKL-40)과 유의적인 결합능을 나타내는 항체를 선별하였으며 (도 3a 내지 도 3d), mYKL-40 와의 결합능은 mYKL-40 파지에 대한 ELISA를 통해 확인하였는데, 간단히 mYKL-40 항원은 well 당 30 ng씩 고정되었고, 항원이 고정된 well은 MPBS (5% skim milk in PBS)로 블로킹 처리한 뒤 hYKL-40 파지 및 mYKL-40 파지를 첨가하여 반응시켰다. 결합된 파지를 검출하기 위해 PBST (0.05% Tween20 in PBS)로 4회 세척 후에 Anti-M13-HRP (1:5,000)를 첨가하여 반응시켰다. 마지막으로 PBST로 4회 세척 후에 TMB (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine) 기질을 첨가하여 발색 반응을 유도하였고 2N H2SO4를 첨가하여 반응을 종결시킨 뒤 파장 450nm에서 각 well의 흡광도를 측정하였다. 그 결과, Fab-II 라이브러리에서 6 개의 항체가 선별되었고, Fab-I 또는 scFv 라이브러리에서는 클론이 형성되지 않았다 (도 4). Fab-II 라이브러리에서 6 개의 클론은 각각 4A12-F2 (M1), 4E12-F2 (M2), 4E3-F2 (M3), 4D10-F2 (M4), 4A7-F2 (M5) 및 4A1-F2 (M6) 로 기재하였다.
실시예 2. IgG 생산 및 특성 분석
본 발명자들은 선별된 YKL-40 파지를 인간 항체의 IgG 형태로 전환시키고 이를 검증하는 실험을 수행하였다. 간단히, 선별된 YKL-40 파지는 Expi293 세포주에 형질감염시킨 후 배양하였고, 배양된 Expi293 세포주의 세포배양액 300 ml로부터 IgG를 정제하였다. 정제된 IgG는 SDS-PAGE를 통해 분자량 및 순수 분리도를 확인하였다.
그 결과, hYKL-40 항체를 가지는 6 개의 클론에서 IgG를 생산하였는데, 3A10-F1 (H1) 에서는 최종적으로 0.237 mg의 IgG가 생산되었고, 3B12-F1 (H2) 에서는 최종적으로 1.84 mg의 IgG가 생산되었으며, 3B7-F2 (H4) 에서는 최종적으로 6.5 mg의 IgG가 생산되었고, 3D12-F2 (H5) 에서는 0.3 mg의 IgG가 생산되었으며, 3E12-F2 (H6) 에서는 최종적으로 0.8 mg의 IgG가 생산되었고, 3G7-F2 (H7) 에서는 최종적으로 5.3 mg의 IgG가 생산되었다 (도 5a 내지 도 5c).
또한, 본 발명자들은 SEC (size-exclusion chromatography)를 통해 단일항체 여부를 확인하였고, ELISA 를 통해 각 항체에 대한 EC50 값을 통해 항원 친화도 (affinity) 를 측정하는 실험을 수행하였다. 그 결과, 3A10-F1 (H1), 3B12-F1 (H2), 3B7-F2 (H4), 3D12-F2 (H5), 3E12-F2 (H6) 및 3G7-F2 (H7)은 모두 SEC 에서 단일 피크(peak)로 나타나 모두 단일항체인 것으로 확인되었다 (도 6a 및 도 6b). ELISA 결과에서는 3A10-F1 (H1) 에서 EC50 값이 582 pM (0.582 nM)로서 가장 낮은 EC50 값으로 확인되었다 (도 7).
본 발명자들은 선별된 마우스 YKL-40 파지에 대해서도 동일한 실험을 수행하였다. 그 결과, 4E12-F2 (M2) 에서는 최종적으로 1.6 mg의 IgG가 생산되었고, 4E3-F2 (M3) 에서는 최종적으로 3.6 mg의 IgG가 생산되었으며, 4D10-F2 (M4) 에서는 최종적으로 6.3 mg의 IgG가 생산되었고, 4A7-F2 (M5) 에서는 최종적으로 0.7 mg의 IgG가 생산되었다 (도 8a 및 도 8b).
또한, SEC 결과에서 4E12-F2 (M2), 4E3-F2 (M3), 4D10-F2 (M4) 및 4A7-F2 (M5) 는 모두 단일 피크를 나타내어 모두 단일항체인 것으로 확인되었다 (도 9a 및 도 9b). ELISA 결과에서 4E3-F2 (M3) 에서 EC50 값이 67 pM (0.067 nM)로서 가장 낮은 EC50 값으로 확인되었다 (도 10).
또한, 본 발명자들은 hYKL-40 및 mYKL-40 에 대해 각각 가장 낮은 EC50 값을 보인 3A10-F1 (H1) 과 4E3-F2 (M3) 클론이 hYKL-40 와 mYKL-40 에 교차 결합하는지를 알아보기 위해 각 항체의 Fab 단백질을 이용한 ELISA를 수행하였다. 그 결과, 3A10-F1 (H1) 은 hYKL-40 에만 결합하는 것으로 나타났고, 4E3-F2 (M3) 는 hYKL-40 와 mYKL-40 에 교차 결합하는 것으로 확인되었다 (도 11a 및 도 11b).
ELISA 얻어진 EC50 값을 재확인하기 위해 Octet 장비를 사용하여 4E3-F2 (M3)와 3A10-F1 (H1)에 대한 항원 친화도 측정을 수행하였다. 두 항체에 대하여 hYKL-40 와 mYKL-40 를 사용하여 교차 결합 실험을 진행하였다. AR2G (Amine Reactive 2nd Generation) sensor를 사용하여 각 항원 단백질을 고정하고, 각 항체를 농도별 (0 ~ 1 μM)로 결합시키는 direct immobilization method를 사용하였다. 그 결과, 4E3-F2 (M3)의 경우에는 mYKL-40 및 hYKL-40에 대해서 각각 6.7ㅧ10-8 M 및 5.7ㅧ10-8 M 의 K D 값으로 확인되어 마우스와 인간 항원 단백질 모두 유사한 수준으로 결합하는 것을 확인하였다. 3A10-F1 (H1)의 경우에는 mYKL-40 와는 결합하지 않는 것을 확인하였고, hYKL-40 에서는 5.0ㅧ10-11 M의 K D 값을 확인하였다 (도 12a 내지 도 12c).
실시예 3. 시험관 내( in vitro )에서 후보 항체의 항암 효능 분석
본 발명자들은 YKL-40 에 대한 후보 항체들을 폐암세포주에 처리한 경우 암전이를 억제하는 효과가 있는지 확인하는 실험을 수행하였다. 간단히, 인간 폐암 세포주인 A549 세포주 및 H460 세포주의 이동을 투과성 삽입물 (8 μm pore trans-well; Corning Inc.) 에서 정량적으로 수행하였다. 후보 항체로서 hYKL-40 항체인 3A10-F1 (H1), 3B12-F1 (H2), 3B7-F2 (H4), 3D12-F2 (H5), 3E12-F2 (H6) 및 3G7-F2 (H7); 및 mYKL-40 항체인 4E12-F2 (M2), 4E3-F2 (M3), 4D10-F2 (M4) 및 4A7-F2 (M5)를 각각 폐암세포주인 A549 세포주 및 H460 세포주에 1 μg/ml의 농도로 처리한 다음, 후보 항체로 처리된 A549 및 H460 세포를 각각 well 당 2.0 x 104 세포가 되도록 넣고 가습 인큐베이터에서 37 ℃, 5 % CO2 조건으로 17 시간 동안 배양하였다. 배양 후, 세포를 3.7 % 포름알데히드로 2 분 동안 고정시킨 후, 1ㅧ PBS 로 2 회 세척하였다. 이후, 세포를 15 분 동안 100 % 메탄올로 투과시키고 20 분 동안 트리판 블루로 염색하였다. 웰 내부의 이동하지 않은 세포를 면봉으로 제거하고, ㅧ 200 배율에서 광학 현미경 (Olympus) 으로 캡처 한 이미지를 NIH ImageJ 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
그 결과, hYKL-40 에 대한 6 개의 항체를 처리한 경우 A549 세포주 및 H460 세포주 모두에서 대조군에 비해 이동된 세포수가 감소되었음을 확인하였고, 특히, 3A10-F1 (H1), 3B12-F1 (H2) 및 3B7-F2 (H4) 항체를 처리한 경우에는 현저하게 이동된 세포수가 감소되었음을 확인하였다 (도 13a 내지 도 13d). 마찬가지로, mYKL-40 에 대한 4 개의 항체를 처리한 경우 A549 세포주 및 H460 세포주 모두에서 대조군에 비해 이동된 세포수가 감소되었음을 확인하였고, 특히, 4E12-F2 (M2) 및 4E3-F2 (M3) 항체를 처리한 경우에는 현저하게 이동된 세포수가 감소되었음을 확인하였다 (도 14a 내지 도 14d).
상기 결과로부터, 선별된 3A10-F1 (H1), 3B12-F1 (H2), 3B7-F2 (H4), 4E12-F2 (M2) 및 4E3-F2 (M3) 항체의 경우 YKL-40 단백질을 억제하여 폐암세포의 전이를 억제하는 효과가 있음을 확인하였다.
실시예 4. 동물실험(in vivo)에서 후보 항체의 항암 효능 분석
본 발명자들은 세포주 실험에서 선별된 5 개의 후보 항체를 폐 전이 동물모델에 처리한 경우 암전이를 억제하는 효과가 있는지 확인하는 실험을 수행하였다. 간단히, 마우스 당 B16F10 마우스 흑색종 세포 (3.75ㅧ104 cells)를 꼬리 정맥 주사(tail vein injection) 방식으로 넣어 폐 전이를 시킨 후 일주일에 1번씩 총 3주간 마우스에 hYKL-40 항체인 3A10-F1 (H1), 3B12-F1 (H2) 및 3B7-F2 (H4); 및 mYKL-40 항체인 4E12-F2 (M2) 및 4E3-F2 (M3)를 0.5 mg/kg씩 투여하였다. 흑색종 세포를 투여한지 3주 후 폐를 적출하여 폐 표면에 존재하는 종양의 넓이(tumor area)를 측정하였다.
그 결과, hYKL-40 항체 중 3A10-F1 (H1) 및 mYKL-40 항체 중 4E3-F2 (M3) 를 처리한 경우 대조군에 비해 현저하게 폐 표면의 종양의 넓이가 감소되었음을 확인하였다 (도 15a 및 도 15b). 이는 세포주에서의 EC50 값을 측정한 결과와 일관된 결과로서, H1 및 M3 항체가 폐암의 전이를 억제하는 효과가 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명자들은 상기 결과로부터 선별된 YKL-40 항체인 3A10-F1 (H1) 및 4E3-F2 (M3) 에 대한 검증을 위하여 실험동물의 수를 증가시켜 암전이를 억제하는 효과가 있는지 확인하는 실험을 수행하였다. 그 결과, 3A10-F1 (H1) 및 4E3-F2 (M3) 모두 대조군에서 비해 폐 조직의 표면에서 종양결절(tumor nodule)의 수가 감소되어 폐암의 전이를 억제하는 효과가 있었고, 특히, 3A10-F1 (H1) 항체가 가장 현저하게 종양결절의 수를 억제하는 효과가 있는 것을 확인하였다 (도 16a 내지 도 16c).
상기 결과로부터, YKL-40 에 대한 3A10-F1 (H1) 항체는 폐암을 억제하는 현저한 효과가 있음을 확인하였다.
실시예 5. 항체 서열 분석
본 발명자들은 상기 결과로부터 암을 억제하는 효과가 있는 3A10-F1 (H1) 항체 및 4E3-F2 (M3) 항체의 서열을 분석하였다. 3A10-F1 (H1) 항체 및 4E3-F2 (M3) 항체에 대한 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 하기 표 1와 같고, 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 표 2와 같다. 중쇄 가변 영역 중 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열은 하기 표 3과 같고, 경쇄 가변 영역 중 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열은 하기 표 4와 같다.
또한, 상기 항체를 코딩하는 핵산분자에 대한 중쇄 가변 영역의 염기서열은 하기 표 5와 같고, 경쇄 가변 영역의 염기서열은 하기 표 6과 같다. 중쇄 가변 영역 중 CDR1 내지 CDR3을 코딩하는 염기서열은 하기 표 7과 같고, 경쇄 가변 영역 중 CDR1 내지 CDR3을 코딩하는 염기서열은 표 8과 같다.
항체 항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열 (CDR: 밑줄)
3A10-F1 (H1) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS NYAMS WVRQAPGKGLEWVS GISGSGGTTYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAG VGTFDV WGQGTLVTVSS (서열번호 1)
4E3-F2 (M3) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFS SYDIH WVRQAPGQGLEWMG IISPYLGITIYAQKFQG RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR RYFYYQSEAFDY WGQGTLVTVSS (서열번호 2)
항체 항체의 경쇄 가변영역의 아미노산 서열 (CDR: 밑줄)
3A10-F1 (H1) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQTISSWLN WYQQKPGKAPKLLIY AASRLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQSYSTPLT FGQGTKVEIK (서열번호 3)
4E3-F2 (M3) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSISNYLN WYQQKPGKAPKLLIY AASTLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQSYSFPLT FGQGTKVEIK (서열번호 4)
항체 CDRH1 CDRH2 CDRH3
3A10-F1 (H1) NYAMS(서열번호 5) GISGSGGTTYYADSVKG (서열번호 6) VGTFDV(서열번호 7)
4E3-F2 (M3) SYDIH(서열번호 8) IISPYLGITIYAQKFQG (서열번호 9) RYFYYQSEAFDY (서열번호 10)
항체 CDRL1 CDRL2 CDRL3
3A10-F1 (H1) RASQTISSWLN(서열번호 11) AASRLQS(서열번호 12) QQSYSTPLT(서열번호 13)
4E3-F2 (M3) RASQSISNYLN(서열번호 14) AASTLQS(서열번호 15) QQSYSFPLT(서열번호 16)
항체 항체의 중쇄 가변영역의 염기 서열 (CDR: 밑줄)
3A10-F1 (H1) GAAGTACAGTTGGTCGAAAGTGGCGGTGGCCTCGTGCAACCGGGTGGTTCACTGCGTCTGAGCTGCGCCGCCTCGGGTTTTACTTTCTCT AATTATGCAATGTCT TGGGTTCGTCAGGCGCCGGGCAAGGGTCTCGAATGGGTTTCA GGTATCTCTGGTTCTGGTGGTACTACTTACTATGCCGATTCAGTGAAGGGT CGCTTTACCATTTCCCGTGACAACTCTAAGAATACTCTGTATCTGCAGATGAACTCGCTGCGTGCCGAAGACACGGCCGTCTATTATTGCGCCGGT GTTGGTACTTTCGATGTT TGGGGTCAGGGCACTTTAGTGACCGTCTCATCG (서열번호 17)
4E3-F2 (M3) CAAGTTCAGCTGGTCCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGCAGTTCTGTTAAGGTTTCCTGCAAAGCCTCAGGCGGGACTTTTAGT TCTTACGATATCCAT TGGGTGCGGCAGGCGCCCGGCCAGGGTCTCGAATGGATGGGG ATCATTTCTCCATACCTGGGTATCACCATCTATGCACAAAAATTCCAAGGC CGCGTAACTATTACCGCCGACGAATCAACCTCCACCGCCTACATGGAACTCAGCTCTCTGAGGTCAGAAGACACGGCCGTCTATTATTGCGCCAGA CGTTACTTCTACTACCAGTCTGAAGCATTCGATTAC TGGGGTCAGGGTACTCTGGTTACCGTCTCATCG (서열번호 18)
항체 항체의 경쇄 가변영역의 염기 서열 (CDR: 밑줄)
3A10-F1 (H1) GACATTCAAATGACGCAGAGTCCCTCCTCACTGAGTGCTAGCGTGGGCGATCGTGTGACAATTACTTGT CGCGCTAGCCAGACTATCTCTTCTTGGCTGAAC TGGTATCAGCAGAAACCGGGCAAGGCGCCAAAATTGCTGATTTAC GCAGCATCCCGTCTGCAGTCT GGTGTACCGTCCCGTTTCTCTGGCAGCGGTTCTGGTACGGATTTTACCCTGACCATCTCAAGCCTCCAGCCTGAAGATTTTGCCACCTATTATTGT CAGCAATCTTACTCTACTCCGCTGACG TTCGGGCAGGGAACTAAAGTGGAAATTAAA (서열번호 19)
4E3-F2 (M3) GACATTCAAATGACGCAGAGTCCCTCCTCACTGAGTGCTAGCGTGGGCGATCGTGTGACAATTACTTGT CGCGCTAGCCAGTCTATCTCTAATTACCTGAAC TGGTATCAGCAGAAACCGGGCAAGGCGCCAAAATTGCTGATTTAC GCAGCATCCACTCTGCAGTCT GGTGTACCGTCCCGTTTCTCTGGCAGCGGTTCTGGTACGGATTTTACCCTGACCATCTCAAGCCTCCAGCCTGAAGATTTTGCCACCTATTATTGT CAGCAATCTTACTCTTTTCCGCTGACG TTCGGGCAGGGAACTAAAGTGGAAATTAAA (서열번호 20)
항체 CDRH1 CDRH2 CDRH3
3A10-F1 (H1) AATTATGCAATGTCT(서열번호 21) GGTATCTCTGGTTCTGGTGGTACTACTTACTATGCCGATTCAGTGAAGGGT(서열번호 22) GTTGGTACTTTCGATGTT(서열번호 23)
4E3-F2 (M3) TCTTACGATATCCAT (서열번호 24) ATCATTTCTCCATACCTGGGTATCACCATCTATGCACAAAAATTCCAAGGC(서열번호 25) CGTTACTTCTACTACCAGTCTGAAGCATTCGATTAC(서열번호 26)
항체 CDRL1 CDRL2 CDRL3
3A10-F1 (H1) CGCGCTAGCCAGACTATCTCTTCTTGGCTGAAC(서열번호 27) GCAGCATCCCGTCTGCAGTCT(서열번호 28) CAGCAATCTTACTCTACTCCGCTGACG(서열번호 29)
4E3-F2 (M3) CGCGCTAGCCAGTCTATCTCTAATTACCTGAAC(서열번호 30) GCAGCATCCACTCTGCAGTCT(서열번호 31) CAGCAATCTTACTCTTTTCCGCTGACG(서열번호 32)

Claims (17)

  1. YKL-40 에 특이적으로 결합하는 단일클론항체.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 단일클론항체는 하기의 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론항체:
    (a) 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1; 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 CDR2; 및 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및
    (b) 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1; 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 CDR2; 및 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 단일클론항체는 하기의 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론항체:
    (a) 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1; 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 CDR2; 및 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및
    (b) 서열번호 14의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1, 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어진 CDR2; 및 서열번호 16의 아미노산 서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 단일클론항체는 하기의 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론항체:
    (a) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역; 및
    (b) 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 단일클론항체는 하기의 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론항체:
    (a) 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역; 및
    (b) 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 단일클론항체는 인간화 항체인 것을 특징으로 하는 단일클론항체.
  7. 제 1 항의 단일클론항체를 코딩하는 핵산분자.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 핵산분자는 하기의 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산분자.
    (a) 서열번호 21의 염기서열로 이루어진 CDR1; 서열번호 22의 염기서열로 이루어진 CDR2; 및 서열번호 23의 염기서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및
    (b) 서열번호 27의 염기서열로 이루어진 CDR1; 서열번호 28의 염기서열로 이루어진 CDR2; 및 서열번호 29의 염기서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역.
  9. 제 7 항에 있어서,
    상기 핵산분자는 하기의 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산분자.
    (a) 서열번호 24의 염기서열로 이루어진 CDR1; 서열번호 25의 염기서열로 이루어진 CDR2; 및 서열번호 26의 염기서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및
    (b) 서열번호 30의 염기서열로 이루어진 CDR1; 서열번호 31의 염기서열로 이루어진 CDR2; 및 서열번호 32의 염기서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역.
  10. 제 7 항에 있어서,
    상기 핵산분자는 하기의 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산분자.
    (a) 서열번호 17의 염기서열로 이루어진 중쇄 가변영역; 및
    (b) 서열번호 19의 염기서열로 이루어진 경쇄 가변영역.
  11. 제 7 항에 있어서,
    상기 핵산분자는 하기의 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산분자.
    (a) 서열번호 18의 염기서열로 이루어진 중쇄 가변영역; 및
    (b) 서열번호 20의 염기서열로 이루어진 경쇄 가변영역.
  12. 제 7 항의 핵산분자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
  13. 제 12 항의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체.
  14. 제 1 항의 단일클론항체를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 암은 유방암, 대장암, 폐암, 위암, 간암, 혈액암, 골암, 췌장암, 피부암, 뇌암, 자궁암, 비인두암, 후두암, 두경부암, 결장암, 난소암, 직장암, 대장암, 질암, 소장암, 내분비암, 갑상선암, 부갑상선암, 요관암, 요도암, 전립선암, 기관지암, 방광암, 신장암 및 골수암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조성물.
  16. 제 1 항의 단일클론항체를 유효성분으로 포함하는 암의 진단용 조성물.
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 암은 유방암, 대장암, 폐암, 위암, 간암, 혈액암, 골암, 췌장암, 피부암, 뇌암, 자궁암, 비인두암, 후두암, 두경부암, 결장암, 난소암, 직장암, 대장암, 질암, 소장암, 내분비암, 갑상선암, 부갑상선암, 요관암, 요도암, 전립선암, 기관지암, 방광암, 신장암 및 골수암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조성물.
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